CN101550428B

CN101550428B - 一种诱导的多潜能干细胞的制备方法

Info

Publication number: CN101550428B
Application number: CN2009101342039A
Authority: CN
Inventors: 肖磊; 廖婧; 吴昭
Original assignee: Shanghai Institutes for Biological Sciences SIBS of CAS
Current assignee: Shanghai Institutes for Biological Sciences SIBS of CAS
Priority date: 2008-04-01
Filing date: 2009-04-01
Publication date: 2013-04-10
Anticipated expiration: 2029-04-01
Also published as: CN101250502A; CN101550428A

Abstract

本发明提供一种诱导的多潜能干细胞的制备方法，包括步骤：A)构建携带转录因子的病毒载体，所述转录因子选自：Oct4、Sox2、c-Myc、Klf4，Lin28和Nanog；B)分别转染步骤A)的病毒载体，得到含有转录因子的病毒液；C)将步骤B)所得含有转录因子的病毒液以组合形式感染细胞，挑选形态类似人胚胎干细胞的克隆传代培养，通过筛选符合人胚胎干细胞特性的细胞克隆，得到诱导的多潜能干细胞。采用本发明方法制备类胚胎干细胞，效率高，可以避免排斥反应，并在特定条件下分化为不同的组织细胞，具有广泛的应用前景。

Description

一种诱导的多潜能干细胞的制备方法

技术领域

本发明属于生物医学领域，具体涉及制备诱导的多潜能干细胞(Induced pluripotentstem cell，简称iPS细胞)的方法。

背景技术

人类胚胎干细胞具有分化成人体各种类型细胞的潜能，并为再生医疗提供了应用的可能性(Thomson JA.，Itskovitz-Eldor J.，Shapiro SS.，et al.Science.Nov 6 1998；282(5391)：1145-1147)。然而，免疫排斥反应对于人类胚胎干细胞的移植治疗有很大影响。为了能够培养出病人特异性的多能干细胞来消除免疫排斥的影响，人们已经尝试过很多的方法，比如成体细胞的核移植(又称为治疗性克隆)，成体细胞与人体胚胎干细胞的融合等，但是都没有获得成功。通过转入特定的转录因子从成体细胞诱导产生类似人胚胎干细胞的诱导多能干细胞(iPS cell)，建立了取得病人特异性的类似人类胚胎干细胞的诱导的多能干细胞的可能性。

最近，几个实验室通过将特定的转录因子转入人的已经分化的细胞，成功的将它们重编程成为类似的人胚胎干细胞的多能的干细胞，他们采用了以下三种表达特定转录因子的病毒组合，a.Oct4，Sox2，C-myc，Klf4(Takahashi K，Tanabe K，Ohnuki M，et al.Induction ofpluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.Cell.Nov 302007；131(5)：861-872)；b.Oct4，Sox2，Nanog，Lin28(Yu J，Vodyanik MA，Smuga-Otto K，et al.Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells.Science.Dec 212007；318(5858)：1917-1920)；c.Oct4，Sox2，c-Myc，KLF4，hTert，SV40 large T(Park IH，ZhaoR，West JA，et al.Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors.Nature.Jan 10 2008；451(7175)：141-146)。用以上转录因子的组合感染人类成纤维细胞，把人类纤维细胞重编程成为类似胚胎干细胞的多潜能干细胞，并且证明这些多潜能干细胞表达未分化的人类胚胎干细胞的表面标志物，并且能够分化成人类胚胎的内中外三个胚层的细胞。这些实验结果使得利用人类成体细胞产生个人特异性的胚胎干细胞，再次分化为需要类型的细胞，从而对一些疾病进行移植治疗提供了强有力的支持，基本消除了免疫排斥的风险。三个实验室报道的效率基本相同。效率大约为从十万个起始细胞获得十个诱导的人类多潜能干细胞，此效率还比较低。低效率会严重影响其应用和推广。

因此，本领域迫切需要研究出高效的诱导已分化细胞转化成类似胚胎干细胞的多潜能干细胞的方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种诱导的多潜能干细胞的制备方法。

本发明的另一目的是提供一种通过该制备方法获得的诱导的多潜能干细胞。

本发明的再一个目的是提供一种用于感染细胞的病毒液组合物。

本发明的第一方面提供一种诱导的多潜能干细胞的制备方法，其特征在于，包括步骤：

A)构建携带转录因子的病毒载体，所述转录因子选自：Oct4、Sox2、c-Myc、Klf4，Lin28和Nanog；

B)分别转染步骤A)的病毒载体，得到含有转录因子的病毒液；

C)将步骤B)所得含有转录因子的病毒液以组合形式感染细胞，挑选形态类似人胚胎干细胞的克隆传代培养，通过筛选符合人胚胎干细胞特性的细胞克隆，得到诱导的多潜能干细胞。

上述转录因子可以以DNA、蛋白质或mRNA的形式被转移进细胞。

上述载体为病毒载体或质粒。所述载体为慢病毒载体、逆转录病毒载体或腺病毒载体，即上述转录因子先被包装成病毒。优选的，上述载体为慢病毒载体。

根据本发明所述的制备方法，所述病毒液的组合形式为含有Oct4、Sox2、c-Myc、Klf4、Lin28和Nanog。

较佳的，上述细胞为灵长类动物细胞。上述灵长类动物为人。上述细胞包括干细胞、分化细胞或干细胞和分化细胞的混合物。上述细胞为人的细胞。

上述人的细胞选自上皮细胞、神经细胞、表皮细胞、角质化细胞、造血细胞、黑素细胞、软骨细胞、淋巴细胞、有核红细胞、巨噬细胞、单核细胞、成纤维细胞、心肌细胞中的一种。优选的，上述细胞为人成纤维细胞。

根据本发明所述的制备方法，所述步骤C)的筛选是筛选碱性磷酸酶染色呈阳性的细胞。

根据本发明所述的制备方法，还包括步骤D)诱导的多潜能干细胞的干细胞多能性鉴定，所述步骤D)包括检测以下指标：

1)碱性磷酸酶表达呈阳性；

2)干细胞特异标记SSEA-3、SSEA-4、Tra-1-60、Tra-1-81表面抗原中2项以上呈阳性。

本发明的第二方面提供一种上述方法制备的诱导的多潜能干细胞。所述诱导的多潜能干细胞可以在相应条件下诱导分化为各种分化细胞，以治疗各种疾病。

上述诱导的多潜能干细胞可以表达碱性磷酸酶和SSEA-3，SSEA-4，Tra-1-60，Tra-1-81这些表面抗原中2种以上的抗原。

本发明的第三方面提供了一种用于感染细胞的病毒液组合物，所述病毒液组合物含有以下转录因子Oct4、Sox2、c-Myc、Klf4、Lin28和Nanog。

上述诱导的多潜能干细胞具有多能性，处于未分化或低分化状态。

本发明所述“转录因子”包括蛋白质、DNA和RNA形式。DNA包括cDNA、基因组DNA和人工合成DNA。因此对分化细胞的诱导可以采用直接导入6种转录因子的蛋白质或者mRNA，也可以将转录因子的编码序列分别克隆到载体上，然后将6种载体转化入分化细胞中。

为了达到本发明目的，发明人参考了先行者的一些实验方法，鉴于他们的实验中各采用了4种因子，有两种是重叠的，因此一共使用了六种因子。(Takahashi K，Tanabe K，Ohnuki M，et al.Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by definedfactors.Cell.Nov 30 2007；131(5)：861-872；Yu J，Vodyanik MA，Smuga-Otto K，et al.Inducedpluripotent stem cell lines derived from human somatic cells.Science.Dec 212007；318(5858)：1917-1920.)。发明人在实验中综合了他们采用的转录因子，在已分化的细胞中转入了6种转录因子Oct4，Nanog，Sox2，Lin28，c-myc和Klf4，因为Yamnaka实验室和Thomson实验室的效率基本相同，因此我们仅采用Thomson实验室中的4种转录因子同时转入已分化的细胞作为对照，诱导iPS细胞的产生。实验取得成功，且转入6种转录因子诱导得到iPS的效率是只转入4种转录因子的10.4倍。

该发明的优点在于效率高，所获得的诱导的多潜能干细胞(类胚胎干细胞)具有分化潜能，这为治疗有关疾病和应用于移植治疗中产生病人特异性的细胞类型提供了更多的便利。

人类胚胎干细胞能够特异性的表达碱性磷酸酶和SSEA-3，SSEA-4，Tra-1-60，Tra-1-81这些表面抗原；表达碱性磷酸酶和SSEA-3，SSEA-4，Tra-1-60，Tra-1-81这些表面抗原是判断细胞具有类似未分化的人类胚胎干细胞的标准。判断细胞具有多能性的标准是：当细胞分化为胚状体(EB)后，能够形成人类胚胎的三个胚层的细胞，表达三个胚层所特有的基因。

因此在本发明的实验中，发明人在已分化的人细胞中转入6种转录因子Oct4，Nanog，Sox2，Lin28，c-myc和Klf4，使已分化的细胞重新具有了胚胎干细胞的形态之后，对它们的碱性磷酸酶活性，以及SSEA-3，SSEA-4，Tra-1-60，和Tra-1-81等表面抗原进行了检测，而检测的结果也充分表明发明人得到的克隆类似于人胚胎干细胞。当我们把获得的细胞形成胚状体时，三个胚层所特有的基因都有表达，说明此细胞具有形成人类胚胎的三个胚层的多能性。

胚胎干细胞具有发育全能性，可以分化成机体的任何一种细胞。在特定的诱导条件下，胚胎干细胞可以向某一系、类或一种细胞分化。本发明获得的类胚胎干细胞也具有上述特性。目前，已经成功的从胚胎干细胞定向分化成了多种细胞，如造血细胞(Ronald，et al.PNAS，1995，92：7530-7534)，神经细胞(J Dinsmore，et al.Theriogenology，1998，49：145-151)，肌肉细胞(Benjamin E，et al，Nature Biotechnology，2000，18 April：399-406)，脂肪细胞(DaniC Smith，et al.J.cell Sci.，1997，Jun，110：1279-1285)，内皮细胞(Dniel Vittet，et al.Blood，1996，88(9)：3424-3442)等。因此，取得病人的成体细胞，通过感染携带6种因子的载体，诱导其转化为胚胎干细胞或者类胚胎干细胞，可以将他们在体外诱导分化成病人所需的细胞，由于所获得的细胞和组织与病人的基因完全一致，在细胞或组织移植治疗中属于自体移植，不会被病人的免疫系统所排斥。

本发明所述“类胚胎干细胞”、“类似胚胎干细胞的多潜能干细胞”、“iPS细胞”“诱导的多潜能干细胞”等可以互换使用，是指由成体细胞诱导产生的，具有胚胎干细胞形态和分化潜能的细胞。所述类胚胎干细胞可以表达碱性磷酸酶和SSEA-3，SSEA-4，Tra-1-60，Tra-1-81这些表面抗原中2种以上的抗原。

本发明所述胚胎干细胞条件可以采用市售的胚胎干细胞培养基培养或者其他可以保持胚胎干细胞未分化状态的培养条件(Thomson JA.，Itskovitz-Eldor J.，Shapiro SS.，et al.Science.Nov 6 1998；282(5391)：1145-1147；Xu，C.，et al.Nat Biotechnol.2001，19(10)：971-4.)。优选的培养条件为先用胚胎干细胞的标准培养基培养成体细胞5-15天，然后换成成纤维细胞的条件培养基培养(根据文献Xu，C.，et al.Nat Biotechnol.2001，19(10)：971-4.制备)上述细胞至形成胚胎干细胞形态的细胞。本领域技术人员可以根据细胞培养的具体情况，使用不同的细胞培养基，调节细胞培养天数。

本发明所述的成体细胞包括成体的干细胞、成体的分化细胞或成体的干细胞和成体的分化细胞的混合物。

本发明中的成体细胞，优选成纤维细胞。通过公知的技术可以获得人的成体细胞。可用于本发明的成体细胞包括但不限于上皮细胞、神经细胞、表皮细胞、角质化细胞、造血细胞、黑素细胞、软骨细胞、淋巴细胞、有核红细胞、巨噬细胞、单核细胞、成纤维细胞、心肌细胞和其他肌细胞等。

本发明所述成体细胞可来源于不同的种属，包括但不限于人类、大猩猩、猴子、牛、马、羊、猪、狗、猫、豚鼠、大鼠、小鼠、金鱼、非洲蟾蜍和斑纹鱼等。本发明所述成体细胞可以从上述物种分离得到或者从相关的细胞库购买。优选人的成体细胞。

本发明所述载体包括病毒载体和质粒。目前，质粒已经有很成熟的商品供应。如pBR322，长度为4.3kb，含有氨苄青霉素和四环素的抗性基因(Ampr和Tetr)。在氨节青霉素和四环素的抗性基因中间有限制性内切酶位点，便于外源基因的插入和筛选。pUC系列质粒，全长2.6kb，由pBR322的氨苄青霉素抗性基因、复制起始位点以及大肠杆菌lac Z基因片段构成，lac Z基因片段包括8-半乳糖苷酶基因的调控序列和该酶头146个氨基酸的编码序列。在lac Z基因中加入了多克隆位点，供外源基因的插入，可以进行颜色筛选。pUC系列不同成员的区别在于多克隆位点的核苷酸序列不同，以便供不同的限制性内切酶切割和外源基因的插入。此外，还有pSP系列。质粒一般只能容纳小于10kb的外源DNA片段，主要用做亚克隆载体。所述病毒载体包括慢病毒载体、逆转录病毒载体和腺病毒。这些载体可以从Invitrogen或者Clontech等公司购买。

本发明插入的转录因子序列为Oct4，Nanog，Sox2，Lin28，c-myc和Klf4的开放阅读框的序列。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室指南(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

附图说明

图1、转入特定因子后的碱性磷酸酶阳性克隆的计数结果。

横坐标依次为0.1×10⁶个起始人包皮纤维原细胞分别用GFP慢病毒，含4种因子Oct4，Nanog，Sox2和Lin28的慢病毒组合和含6种因子Oct4，Nanog，Sox2，Lin28，c-Myc和Klf4的慢病毒组合感染17天后，对其中碱性磷酸酶阳性克隆的计数结果。

纵坐标为类胚胎干细胞碱性磷酸酶阳性克隆的计数。

图2、3种人细胞的形态

从左向右依次为人胚胎干细胞(HuES17)、人包皮纤维原细胞(Foreskin fibroblast)、转入6种因子形成的人iPS细胞(iPS-S)。

图3、3种人细胞碱性磷酸酶活性测定结果。

说明同图2。

图4、3种人细胞特异性表面抗原测定结果。

从左向右依次为人胚胎干细胞(HuES17)、人包皮纤维原细胞(Foreskin fibroblast)、转入6种转录因子形成的人iPS细胞(iPS-S)；从上至下依次为SSEA3、SSEA4、Tra-1-60、Tra-1-81的测定结果。

图5、iPS-S细胞具有分化成胚胎三个胚层的多能性。

采用RT-PCR检测。

HuES17：人ES细胞；FSF：人包皮纤维原细胞；iPS-S：转入6种转录因子的人iPS细胞；HuES17/EB：人胚胎干细胞来源的胚状体；iPS-S/EB：人iPS细胞来源的胚状体。

纵坐标为变化倍数，图5B纵坐标10倍与60倍间有切断，因此第四根柱也有切断。

图6、发明人构建的GFP慢病毒载体

外源基因为增强型绿色荧光蛋白(EGFP)。

图7、Oct4慢病毒载体。

插入Oct4的慢病毒载体；其他慢病毒载体，只要将Oct4处替换为Nanog、Sox2、、Klf4、C-myc或Lin28即可，故省略其他载体图。

具体实施方式

实施例1类胚胎干细胞的制备

从人类总cDNA中多聚酶链式反应(PCR)扩增出特定基因(Oct4，Nanog，Sox2，Lin28，c-myc和Klf4)的编码区，使用通用的分子克隆技术，连接入慢病毒载体(结构如图7所示，Invitrogen公司)，使之能够被产生的慢病毒带入细胞表达。Oct-4(也称Oct-3，Pou5F1)，GenBank序列号为NM_002701；Nanog，GenBank序列号为NP_079141；Sox2，GenBank序列号为NP_003097；Lin28，GenBank序列号为NP_078950；c-Myc，GenBank序列号为NP_002458；Klf4，GenBank序列号为NP_004226。扩增引物见表1：

表1

引物名称	引物序列
		lin28 5’引物SEQ ID NO：1	atgggctccgtgtccaaccag
lin28 3’引物SEQ ID NO：2	tcaattctgtgcctccgggag
		C-myc 5’引物SEQ ID NO：3	atgcccctcaacgttagcttca
C-myc 3’引物SEQ ID NO：4	ttacgcacaagagttccgtagc
		klf4 5’引物SEQ ID NO：5	atgaggcagccacctggcgag
klf4 3’引物SEQ ID NO：6	ttaaaaatgcctcttcatgtg
		nanog 5’引物SEQ ID NO：7	atgagtgtggatccagcttgtc
nanog 3’引物SEQ ID NO：8	tcacacgtcttcaggttgcatg
		Oct4 5’引物SEQ ID NO：9	atggcgggacacctggcttc
Oct4 3’引物SEQ ID NO：10	tcagtttgaatgcatgggag
		Sox2 5’引物SEQ ID NO：11	atgtacaacatgatggagacgg
Sox2 3’引物SEQ ID NO：12	tcacatgtgtgagaggggcag

克隆的形成

一、目的：通过转入特定的转录因子使已经分化的细胞重编程形成类胚胎干细胞克隆

二、方法

1、用构建的慢病毒感染0.5×10⁶个新生儿包皮纤维原细胞(购自ATCC，目录号为CRL-2097)，实验分为3组：

a.空白对照组：携带有绿色荧光蛋白(GFP)的慢病毒；

b.实验组1：包含4种因子的慢病毒组合，Oct4，Nanog，Sox2和Lin28；

c.实验组2：包含6种因子的慢病毒组合，Oct4，Nanog，Sox2，Lin28，c-Myc和Klf4，

2、24小时后，将这些细胞用胰酶消化并转移至铺好小鼠胚胎成纤维细胞的培养瓶中，起初用标准的人类胚胎干细胞的培养基培养，10天后换为条件培养基。小鼠胚胎成纤维细胞根据文献(Thomson JA.，Itskovitz-Eldor J.，Shapiro SS.，et al.Science.Nov 6 1998；282(5391)：1145-1147及Xu，C.，et al.Nat Biotechnol.2001，19(10)：971-4.)制备。人胚胎干细胞的培养基，具体组成为：80％ DMEM/F12培养液(购买自Invitrogen，目录号：11330057)；20％的血清替代物(购买自Invitrogen，目录号：10828028)；1mM L-谷氨酸；0.1mM β-巯基乙醇；1％的非必需氨基酸(购买自Invitrogen，目录号：11140050)。人胚胎干细胞系HuES17来自哈佛大学；通用的细胞培养产品均购自Invitrogen公司，条件培养基(Conditioned media，缩写为CM)根据文献(Xu，C.，et al.Nat Biotechnol.2001，19(10)：971-4.)制备。

三、结果

空白对照组中没有克隆的形成，在转入4种因子的实验中，12天后可以看到克隆形成。而在转入6种因子的实验中，7天后就可以看到克隆形成。4种因子诱导0.1×10⁶个起始人包皮纤维原细胞形成16±3个iPS细胞集落，6种因子诱导0.1×10⁶个起始人包皮纤维原细胞形成166±6个iPS细胞集落(见图1)。iPS细胞集落的形态与我们实验室中正常的人胚胎干细胞(hESCs)HuES17没有区别，与人包皮纤维原细胞完全不同(见图2)。

四、结论

转入特定的因子确实可以使已经分化的细胞重编程形成类胚胎干细胞克隆。

6种因子比4种因子效率高10.4倍。

实施例2碱性磷酸酶的测定

一、目的：通过检测碱性磷酸酶的活性来鉴定形成的克隆是否具有胚胎干细胞的特性，并对两个实验组的结果进行比较

二、方法

对实施例1中转入4个因子的实验组在第26天时挑取克隆；而转入6个因子的实验组则在第17天就挑取了克隆，称为iPS-S。挑取的克隆分别种在小鼠胚胎成纤维细胞滋养层上使用标准的人胚胎干细胞培养的培养基和方法进行培养(Thomson JA，Itskovitz-Eldor J，Shapiro SS，et al.Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.Science.Nov 6 1998；282(5391)：1145-1147)为了量化重编程的效率，我们在每组实验中选取了一瓶细胞在第17天的时候固定，并检测其碱性磷酸酶的表达。

三、结果

在转入4种因子的实验组中，0.1×10⁶个起始纤维原细胞中有16±3个克隆呈碱性磷酸酶阳性；在转入6种因子的实验组中，0.1×10⁶个起始纤维原细胞中有166±6个克隆呈碱性磷酸酶阳性；而只感染了GFP慢病毒的细胞中没有克隆的形成(见图1)。

四、结论

形成的克隆多具有胚胎干细胞的特性，并表达碱性磷酸酶(见图3)，H17和iPS-S均表达碱性磷酸酶。

实施例3特异性表面抗原的测定

一、目的：通过检测得到的克隆是否具有胚胎干细胞所特有的表面抗原来进一步鉴定它是否具有胚胎干细胞的特性。

二、方法

利用文献(Thomson JA，Itskovitz-Eldor J，Shapiro SS，et al.Embryonic stem cell linesderived from human blastocysts.Science.Nov 6 1998；282(5391)：1145-1147以及Xiao L，YuanX，Sharkis SJ.Activin A maintains self-renewal and regulates fibroblast growth factor，Wnt，andbone morphogenic protein pathways in human embryonic stem cells.Stem Cells.Jun2006；24(6)：1476-1486)中所记载的方法，用免疫荧光法分别检测实施例1所得到的克隆中SSEA-3，SSEA-4，Tra-1-60，和Tra-1-81这些胚胎干细胞特有的表面抗原的表达情况。

三、结果

本实验产生的iPS细胞SSEA-3，SSEA-4，Tra-1-60和Tra-a-81抗原的检测呈阳性，而包皮成纤维细胞没有这种情况的出现(见图4)。

四、结论

进一步证明本实验产生的iPS细胞具有人类胚胎干细胞的特性，即表达胚胎干细胞的特异标志物。

实施例4胚状体中三个胚层标志基因的表达鉴定

一、目的：用胚状体中三个胚层标志基因的表达来验证得到的克隆具有多组织的分化能力。

二、方法

为了验证iPS-S细胞的多能性，我们使之自然分化形成胚状体(EB)并用实时定量PCR的方法检测三个胚层不同标记基因的表达。

三、结果

我们发现iPS-S细胞能够分化形成胚状体中所有三个胚层，因为它能够表达内胚层的alpha-feto蛋白，中胚层的Bra基因和外胚层的Sox1基因(图5)。

四、结论

进一步证明形成的克隆多具有胚胎干细胞的特性，具有分化成不同的组织细胞的潜能。

总之，我们的研究表明转入6个特定因子能够比转入4个特定因子能更有效更快的形成人iPS细胞。转入6个特定因子形成的iPS-S细胞能够表达未分化的人胚胎干细胞的一些标记，而且具有分化为三个不同胚层的潜能。

序列表

<110>中国科学院上海生命科学研究院

<120>一种诱导的多潜能干细胞的制备方法

<130>P5091015

<160>12

<170>PatentIn version 3.4

<210>1

<211>21

<212>DNA

<213>lin28 5’引物

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(21)

<223>人工序列

<400>1

atgggctccg tgtccaacca g 21

<210>2

<211>21

<212>DNA

<213>lin28 3’引物

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(21)

<223>人工序列

<400>2

tcaattctgt gcctccggga g 21

<210>3

<211>22

<212>DNA

<213>C-myc 5’引物

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(22)

<223>人工序列

<400>3

atgcccctca acgttagctt ca 22

<210>4

<211>22

<212>DNA

<213>C-myc 3’引物

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(22)

<223>人工序列

<400>4

ttacgcacaa gagttccgta gc 22

<210>5

<211>21

<212>DNA

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<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(21)

<223>人工序列

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<210>6

<211>21

<212>DNA

<213>klf4 3’引物

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(21)

<223>人工序列

<400>6

ttaaaaatgc ctcttcatgt g 21

<210>7

<211>22

<212>DNA

<213>nanog 5’引物

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(22)

<223>人工序列

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atgagtgtgg atccagcttg tc 22

<210>8

<211>22

<212>DNA

<213>nanog 3’引物

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(22)

<223>人工序列

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tcacacgtct tcaggttgca tg 22

<210>9

<211>20

<212>DNA

<213>Oct4 5’引物

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(20)

<223>人工序列

<400>9

atggcgggac acctggcttc 20

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<211>20

<212>DNA

<213>Oct4 3’引物

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(20)

<223>人工序列

<400>10

tcagtttgaa tgcatgggag 20

<210>11

<211>22

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<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(22)

<223>人工序列

<400>11

atgtacaaca tgatggagac gg 22

<210>12

<211>21

<212>DNA

<213>Sox2 3’引物

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(21)

<223>人工序列

<400>12

tcacatgtgt gagaggggca g 21

Claims

1.一种诱导的多潜能干细胞的制备方法，其特征在于，包括步骤：

从人类总cDNA中多聚酶链式反应扩增出特定基因Oct4，Nanog，Sox2，Lin28，c-myc和K1f4的编码区，使用通用的分子克隆技术，连接入慢病毒载体，使之能够被产生的慢病毒带入细胞表达，扩增引物序列如下：Lin285’引物如SEQIDNO：1所示；Lin283’引物如SEQ ID NO：2所示；c-myc 5’引物如SEQ ID NO：3所示；c-myc 3’引物如SEQID NO：4所示；K1f45’引物如SEQ ID NO：5所示；K1f43’引物如SEQ IDNO：6所示；Nanog 5’引物如SEQ IDNO：7所示；Nanog 3’引物如SEQIDNO：8所示；Oct45’引物如SEQ ID NO：9所示；Oct43’引物如SEQ IDNO：10所示；Sox25’引物如SEQIDNO：11所示；Sox23’引物如SEQ IDNO：12所示；用上述构建的6种因子的慢病毒组合感染新生儿包皮纤维原细胞，24小时后，将这些细胞用胰酶消化并转移至铺好小鼠胚胎成纤维细胞的培养瓶中，起初用标准的人类胚胎干细胞的培养基培养，10天后换为条件培养基，人胚胎干细胞的培养基具体组成为：80％DMEM/F12培养液、20％的血清替代物、1mM L-谷氨酸、0.1mM β-巯基乙醇、1％的非必需氨基酸。