CN101402943A - 一种体外诱导和培养多潜能干细胞的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种体外诱导和培养多潜能干细胞的方法，该方法包括如下步骤：将两种转录因子Oct3/4与Nanog转入成体细胞，在无异源饲养层细胞的条件下的细胞诱导培养液中培养，诱导获得多潜能干细胞克隆；将诱导获得的多潜能干细胞克隆在胚胎干细胞培养液中、在无异源饲养层细胞的条件下培养扩增，并维持其多向分化潜能。采用本发明产生的多潜能干细胞可避免移植排斥反应；无异源饲养层条件诱导的多潜能干细胞具有更好的临床应用价值；采用Oct3/4和Nanog两种转录因子基因或直接转入相关蛋白，技术更简洁，生物安全性更高。
Description
技术领域
本发明属于生物医学领域。具体涉及体外诱导和培养多潜能干细胞的方法。
背景技术
胚胎干细胞(embryonic stem cells，ESCs)是来源于胚胎胚泡期内细胞团的多潜能细胞，具有无限增殖能力和多向分化潜能(Evans MJ，1981Martin，1981)。人类胚胎干细胞(humanembryonic stem cells，hESCs)被认为是细胞移植治疗青少年糖尿病、Parkinson’s病与心力衰竭等疾病有前途的供体细胞(Thomson JA，1998)，但是由于组织排斥和涉及到使用人类胚胎，其应用受到限制。
最近，多个研究小组将四种转录因子基因通过病毒载体导入人类成体细胞，然后与小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)共培养，在体外获得再程序化的胚胎干细胞人类多潜能干细胞(Lowryet al.，2008；Mali et al.，2008；Nakagawa et al.，2008；Park et al.，2008；Takahashi et al.，2007b；Yuet al.，2007)。新近的报道证实，通过病毒载体导入Oct3/4和Sox2两种转录因子基因，即可将人成体细胞再程序化为多潜能干细胞(Danwei Huangfu，2008)。这种诱导的多潜能干细胞(iPS细胞)的特性与胚胎干细胞相似，具有向多种组织和细胞分化的潜能，有可能培育出患者特异的多潜能干细胞用于疾病治疗。
但是，上述研究得到的多潜能干细胞均存在以下缺陷：①诱导和培养人类多潜能干细胞的过程均需与小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)共培养，这就可能导致小鼠来源的病原体感染人类iPS细胞，限制了其临床应用。②以病毒为载体的基因转染方式虽然效率高，但是存在生物安全性问题。专利申请号为“200810035462.1”的发明公布了一种多潜能干细胞的制备万法，该万案将6种转录因子基因通过病毒载体导入成体细胞，来诱导多潜能干细胞，旨在提高诱导效率。但该方法仍然存在上述两种缺陷，此外，6种外源基因转入使诱导的多潜能干细胞基因组复杂多变。
因此，要获得具有临床应用潜能的患者自身多潜能干细胞，仍需要探索新的方法。首先，尽量减少转入基因的数目，简化诱导过程。其次，要使整个诱导和培养过程无异源饲养层细胞，无异种血清。再次，要尽量避免采用病毒载体进行基因转导。
发明内容
本发明需要解决的技术问题在于提供一种体外诱导和培养多潜能干细胞的方法。
实现上述技术问题的技术方案如下：
一种体外诱导和培养多潜能干细胞的方法，包括如下步骤
①将两种转录因子Oct3/4与Nanog转入成体细胞，在无异源饲养层细胞条件下的诱导培养液中培养，诱导获得多潜能干细胞克隆；②将诱导获得的多潜能干细胞克隆在胚胎干细胞培养液中、在无异源饲养层细胞的条件下培养扩增，并维持其多向分化潜能。
优选地，所述步骤①中，两种转录因子Oct3/4与Nanog以基因形式与质粒载体连接，扩增纯化后转入成体细胞；或两种转录因子Oct3/4与Nanog以蛋白质形式转入成体细胞。
优选地，所述细胞诱导培养液是以DMEM为基础培养液，添加辅助因子包括终浓度为5-50μg/L的碱性成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor-2，bFGF)、5-50μg/L的激活素A(Activin A)、5-50μg/L的转化生长因子β(transforming growth factorβ，TGFβ)、5-50μg/L的表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)等细胞因子中的一种或多种和DNA甲基化转移酶抑制剂如：0.5-2mmol/L丙戊酸(valproic acid，VPA)或者5-20nmol/L曲枯抑菌素(trichostatin A，TSA)。
优选地，所述辅助因子终浓度为：10μg/L的碱性成纤维细胞生长因子(fibroblast growthfactor-2，bFGF)、10μg/L的激活素A(Activin A)、10μg/L的转化生长因子β(transforming growthfactorβ，TGFβ)、10μg/L的表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)。
优选地，所述DNA甲基化转移酶抑制剂为1mmol/L丙戊酸或20nmol/L曲枯抑菌素。
上述无异源饲养层细胞的培养条件包括：①采用与成体细胞来源一致的自体细胞作为饲养层细胞，如：皮肤成纤维细胞、骨髓间充质干细胞作为饲养层细胞；和/或②在无饲养层培养时，在胚胎干细胞培养液中添加细胞因子，包含：5-50μg/L的胰岛素样生长因子(insulingrowth factor，IGF)、5-50μg/L的激活素A(ActivinA)、5-50μg/L的转化生长因子β(transforminggrowth factorβ，TGFβ)和5-50μg/L的表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)。细胞培养皿/培养板用基质胶(matrigel)或20μg/ml层粘连蛋白(laminin)包被。
本发明说述的成体细胞来源于人或灵长类动物，包括：成纤维细胞、骨髓干细胞、粘膜上皮细胞、淋巴细胞、毛囊细胞等。
本发明所述的胚胎干细胞培养液是由knockout DMEM、20μg/L碱性成纤维细胞生长因子、20μg/L白血病生长抑制因子、2mmol/L glutamax-I、0.055mmol/Lβ-巯基乙醇、非必需氨基酸、10％血清替代物、10％plasmanate(商品化的人类血浆蛋白制剂)以及抗生素组成的培养基。
由本发明所产生的无饲养层来源的多潜能干细胞(no feeder cell conditions derived inducedpluripotent stem cell，NOF-iPS)具有与胚胎干细胞(ES)相似的特性，这些特性包括：增殖能力、表达胚胎干细胞标记、形成包含内、中、外三个胚层的组织和细胞的畸胎瘤。
与现有技术比较，本发明的优点在于：
①仅仅采用Oct3/4与Nanog两种转录因子基因或其蛋白质形式进行诱导，而非病毒载体介导的转基因，即可再程序化成体细胞为多潜能干细胞。
②诱导和培养多潜能干细胞在无异源饲养层细胞条件下进行。
③由本技术获得的自体多潜能干细胞具有更好的生物安全性、能在体外诱导分化为神经细胞、胰岛细胞、心肌细胞等多各种细胞用于细胞替代治疗。
附图说明
图1.无异源饲养层细胞条件下诱导和培养人多潜能干细胞的技术概图；
图2.在无异源饲养层细胞培养条件下细胞生长曲线图；
图3.在无异源饲养层条件下诱导和培养的NOF-hiPS RT-PCR分析示意图；
图4.在无异源饲养层条件下诱导和培养的NOF-hiPS使裸鼠致畸示意图。
具体实施方式
本发明为，在人成体细胞中，通过转染试剂将Oct3/4与Nanog两种转录因子导入细胞，在无异源饲养层细胞条件下，诱导形成人的iPS克隆。当克隆长至足够大时，挑取克隆进一步体外培养扩增。请参见图1。在无异源饲养层细胞条件下，连续传代培养人iPS，通过生长曲线分析表明，无异源饲养层细胞条件诱导的人多潜能细胞(NOF-hiPS)增殖能力与人胚胎干细胞(hES)相似。请参见图2。在无异源饲养层条件下，诱导和培养的NOF-hiPS表达胚胎干细胞相关基因，并产生包含三个胚层的畸胎瘤。请参见图3、图4。
实施例1.
按现有技术，从人细胞样本中提取总RNA，并反转录成cDNA，用PCR技术扩增Oct3/4与Nanog基因。将纯化后的Oct3/4与Nanog基因与质粒载体连接，并转化大肠杆菌，进行扩增。
分离培养人皮肤成纤维细胞，在无饲养层细胞条件下，将纯化后的，分别含10μg Oct3/4与10μg Nanog两种转录因子基因的质粒，用转染试剂lipofectamine2000(Invitrogen公司)转染人成体细胞，在细胞诱导培养液中培养，该细胞诱导培养液以DMEM为基础培养液，添加了终浓度为10μg/L的人碱性成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor-2，bFGF)、终浓度为10μg/L的激活素A(Activin A)、终浓度为10μg/L的转化生长因子β(transforming growth factorβ，TGFβ)、终浓度为10μg/L的表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)等细胞因子和DNA甲基化转移酶抑制剂：终浓度为1mmol/L的丙戊酸(valproic acid，VPA)。
转染后第3天，将细胞消化传代至自体饲养层细胞(与诱导的细胞来源一致的细胞)，再换用胚胎干细胞培养液继续培养。隔日换液，在倒置显微镜下观察细胞，直至多潜能干细胞克隆长出。当诱导的多潜能干细胞克隆长至足够大时，通过形态学筛选，挑取多潜能干细胞克隆至自体饲养层细胞培养扩增。
胚胎干细胞培养液根据现有技术，是由knockout DMEM、20μg/L碱性成纤维细胞生长因子、20μg/L白血病生长抑制因子、2mmol/L glutamax-I、0.055mmol/L β-巯基乙醇、非必需氨基酸、10％血清替代物、10％plasmanate以及抗生素组成的培养基。
筛选形态匀质的克隆，进一步采用免疫细胞化学检测其表面标记(AP、SSEA3/4、TRA-1-60、TRA-1-81)、RT-PCR检测人ES标记基因表达，将其注入免疫缺陷小鼠分析其产生畸胎瘤的能力。通过上述逐步筛选最终得到具有多向分化潜能的、具有临床应用价值的人自身多潜能干细胞。
用Trizol试剂提取NOF-hiPS细胞总RNA，通过RT-PCR分析显示，在无异源饲养层条件下，通过转染Oct3/4与Nanog两种转录因子得到的NOF-hiPS细胞表达FGF4、Rex1、Nanog、Oct3/4、Dax1等人胚胎干细胞标记基因。这些标记基因在未转染Oct3/4与Nanog两种转录因子的人皮肤成纤维细胞中没有表达。参见图3。
在无异源饲养层条件下，诱导和扩增培养的NOF-hiPS注入裸鼠(免疫缺陷小鼠)后，能形成畸胎瘤。通过组织病理切片和免疫组织化学分析显示，NOF-hiPS形成的畸胎瘤包含内、中、外三个胚层的组织和细胞的，表明其具有多向分化潜能。参见图4。
实施例2.
分离培养人成体细胞，在无异源饲养层细胞条件(无饲养层或采用与成体细胞来源一致的自体细胞作为饲养层细胞)下，将市售的，分别含20μg Oct3/4与20μg Nanog两种转录因子蛋白转入人成体细胞，并在诱导培养液中培养。该诱导培养液以DMEM为基础培养液，添加了终浓度为40μg/L人碱性成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor-2，bFGF)、40μg/L激活素A(Activin A)、35μg/L转化生长因子β(transforming growth factorβ，TGFβ)、35μg/L表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)等细胞因子和DNA甲基化转移酶抑制剂如20nmol/L曲枯抑菌素(trichostatin A，TSA)(以上都为终浓度)。
细胞在诱导培养液条件下培养一段时间后，换用胚胎干细胞培养液继续培养。所述胚胎干细胞培养液由knockout DMEM、20μg/L碱性成纤维细胞生长因子、20μg/L白血病生长抑制因子、2mmol/L glutamax-I、0.055mmol/L β-巯基乙醇、非必需氨基酸、10％血清替代物、10％plasmanate以及抗生素组成的培养基。
隔日换液，倒置显微镜下观察细胞，直至多潜能干细胞克隆长出。当诱导的多潜能干细胞克隆长至足够大时，将其全部消化传代至自体饲养层细胞培养扩增。细胞达到足够数量后，再在无饲养层细胞条件下培养。
无饲养层细胞条件为：在胚胎干细胞培养液中添加细胞因子，包含：10μg/L胰岛素样生长因子(insulin growth factor，IGF)、10μg/L激活素A(Activin A)、10μg/L转化生长因子β(transforming growth factorβ，TGFβ)和10μg/L表皮生长因子(以上都为终浓度)，细胞培养皿/培养板用基质胶(matrigel)或20μg/ml层粘连蛋白(laminin)包被。
进一步采用免疫细胞化学检测其表面标记(AP、SSEA3/4、TRA-1-60、TRA-1-81)、RT-PCR检测人ES标记基因表达，将其注入免疫缺陷小鼠分析其产生畸胎瘤的能力。通过上述逐步筛选最终得到具有多向分化潜能的、具有临床应用价值的人自身多潜能干细胞。
实施例3.
分离培养人(或猴)成体细胞，将Oct3/4与Nanog两种转录因子基因或蛋白转染人(或猴)成体细胞。在无饲养层细胞条件(或采用与人成体细胞来源一致的自体细胞作为饲养层细胞)下诱导多潜能干细胞，该细胞诱导培养液以DMEM为基础培养液，添加终浓度为6μg/L碱性成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor-2，bFGF)、6μg/L激活素A(ActivinA)、6μg/L转化生长因子β(transforming growth factor β，TGFβ)、6μg/L表皮生长因子(epidermal growthfactor，EGF)等细胞因子和DNA甲基化转移酶抑制剂如：0.5mmol/L丙戊酸(valproic acid，VPA)或10nmol/L曲枯抑菌素(trichostatin A，TSA)，以上都为终浓度。
转染后第3-5天，细胞换用胚胎干细胞培养液继续培养。隔日换液，在倒置显微镜下观察细胞，直至多潜能干细胞克隆长出。当诱导的多潜能干细胞克隆长至足够大时，通过形态学筛选，挑取多潜能干细胞克隆至无饲养层细胞培养扩增。细胞培养皿/培养板用基质胶(matrigel)或20μg/ml层粘连蛋白(laminin)包被。
所述无饲养层培养时，是指在胚胎干细胞培养液中添加细胞因子条件下培养，细胞因子包含：30μg/L胰岛素样生长因子(insulin growth factor，IGF)、30μg/L激活素A(Activin A)、30μg/L转化生长因子β(transforming growth factorβ，TGFβ)和30μg/L表皮生长因子(epidermalgrowth factor，EGF)，以上都为终浓度。
进一步采用免疫细胞化学检测其表面标记(AP、SSEA3/4、TRA-1-60、TRA-1-81)、RT-PCR检测人ES标记基因表达，将其注入免疫缺陷小鼠分析其产生畸胎瘤的能力。通过上述逐步筛选最终得到具有多向分化潜能的、具有临床应用价值的人自身多潜能干细胞。
本说明书的上述实例仅仅是为了清楚说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。凡是属于本发明的技术方案所引申出的显而易见的变动仍包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种体外诱导和培养多潜能干细胞的方法，其特征是，包括如下步骤：
①将两种转录因子Oct3/4与Nanog转入成体细胞，在无异源饲养层细胞条件下的诱导培养液中培养，诱导获得多潜能干细胞克隆；
②将诱导获得的多潜能干细胞克隆在胚胎干细胞培养液中、在无异源饲养层细胞的条件下培养扩增。
2.根据权利要求1所述的体外诱导和培养多潜能干细胞的方法，其特征是，所述步骤①中，两种转录因子Oct3/4与Nanog以基因形式与质粒载体连接，扩增纯化后转入成体细胞；或两种转录因子Oct3/4与Nanog以蛋白质形式转入成体细胞。
3.根据权利要求1所述的体外诱导和培养多潜能干细胞的方法，其特征是，所述细胞诱导培养液是以DMEM培养基为基础培养液，添加终浓度为5-50μg/L的碱性成纤维细胞生长因子、5-50μg/L的激活素A、5-50μg/L的转化生长因子β、5-50μg/L的表皮生长因子中的一种或多种，以及0.5-2mmol/L丙戊酸或5-20nmol/L曲枯抑菌素。
4.根据权利要求3所述的体外诱导和培养多潜能干细胞的方法，其特征是，添加的碱性成纤维细胞生长因子的终浓度为10μg/L、激活素A的终浓度为10μg/L、转化生长因子β的终浓度为10μg/L、和表皮生长因子的终浓度为10μg/L。
5.根据权利要求3所述的体外诱导和培养多潜能干细胞的方法，其特征是，所述丙戊酸的终浓度为1mmol/L，所述曲枯抑菌素的终浓度为20nmol/L。
6.根据权利要求1-5任一项所述的体外诱导和培养多潜能干细胞的方法，其特征是，所述无异源饲养层细胞的培养条件为：采用与成体细胞来源一致的自体细胞作为饲养层细胞；和/或在步骤②时为无饲养层培养，在胚胎干细胞培养液中添加细胞因子，该细胞因子包括有5-50μg/L胰岛素样生长因子、5-50μg/L激活素A、5-50μg/L转化生长因子β、和5-50μg/L表皮生长因子。
7.根据权利要求1所述的体外诱导和培养多潜能干细胞的方法，其特征是，所述成体细胞为人或灵长类动物的成纤维细胞、骨髓干细胞、粘膜上皮细胞、淋巴细胞、或毛囊细胞。
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| C14 | Grant of patent or utility model | ||
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Granted publication date: 20101013 Termination date: 20171117 |