CN115404204A - Notch信号通路激活剂在促进肌肉干细胞体外增殖中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了Notch信号通路激活剂在促进肌肉干细胞体外增殖中的应用，属于干细胞培养及细胞培养肉技术领域。通过考察不同浓度的Notch信号通路激活剂对肌肉干细胞增殖的影响，发现Notch信号通路激活剂可明显提高肌肉干细胞的扩增倍数，将Notch信号通路激活剂用于肌肉干细胞培养，可以有效促进肌肉干细胞的快速增殖，缩短了细胞培养的时间，同时降低了FBS的使用量，从而大大降低了肌肉干细胞的培养成本，有利于肌肉干细胞的快速制备以及细胞培养肉产业的发展。
Description
技术领域
本发明涉及Notch信号通路激活剂在促进肌肉干细胞体外增殖中的应用，属于干细胞培养及细胞培养肉技术领域。
背景技术
随着社会的发展和人们对生活水平质量要求的提高，人们对肉类产品的需求日益增加，只依靠传统的养殖业很难满足市场需求，而且传统养殖业带来的环境和资源问题也日益突出，因此亟需找到一种更加环保、高效、可持续的肉类生产方式来补充肉制品消费市场。细胞培养肉(Cultured Meat，亦称为培养肉或培育肉)作为2018年全球十大突破和新兴科技之一，依据动物肌肉组织生长和修复的原理，利用其干细胞在体外进行人工培养和诱导分化而获得的肉类，只需要少量动物组织来获取细胞即可生产大量肉类，避免了大规模的动物养殖，与传统肉类生产方式相比，培养肉可以减少7％～45％的能源消耗，降低78％～96％的温室气体排放量，降低99％的土地使用，减少82％～96％的用水量等。
根据肌肉细胞的生物学过程以及肌肉的理化、加工特性，细胞培养肉生产的第一要务就是产生大量的肌肉细胞(肌纤维)以提供蛋白质等营养成分。肌肉干细胞(MuscleStem Cell，又称肌卫星细胞，Satellite Cell)是骨骼肌中具有分化增殖潜能的肌源性干细胞，当受到外界刺激如肌肉受损、坏死或负荷过重时，该细胞被激活，开始增殖有丝分裂、分化功能蛋白的表达并融合成多核，最后形成肌纤维，常作为细胞培养肉的首选种子细胞。但是，肌肉干细胞在体内含量极少，从动物组织中分离后需要在体外进行大量的扩增，再进行诱导分化产生肌纤维。但是，肌肉干细胞体外的增殖能力有限，随着体外培养时间的延长，细胞的增殖倍数显著降低，分化成肌管的能力也大幅下降。因此，亟需寻找能够有效促进肌肉干细胞增殖的物质和简便高效提高肌肉干细胞体外增殖效率的方法，使其在短时间内大量扩增，对细胞培养肉的制造尤为重要。
发明内容
本发明针对目前体外培养肌肉干细胞时增殖速度慢、扩增倍数少等问题，将Notch信号通路激活剂加入肌肉干细胞的体外培养体系中，以促进细胞的增殖、提高细胞增殖效率。
本发明提供的具体技术方案如下：
本发明的第一个目的是提供一种促进肌肉干细胞体外增殖的方法，所述方法是将肌肉干细胞在含有Notch信号通路激活剂的体系中培养。
在一种实施方式中，所述Notch信号通路激活剂包括丙戊酸、丙戊酸衍生物、丙戊酸水合物、丙戊酸类似物、丙戊酸异构体、Jagged1蛋白或NF-κB蛋白。
在一种实施方式中，所述肌肉干细胞来源于动物肌肉组织，所述动物包括但不限于人、鼠、猪、牛、鱼。
在一种实施方式中，所述Notch信号通路激活剂的浓度为1-500μM；所述体系中还含有基础培养基、体积百分比为5％-10％的胎牛血清、体积百分比为1％-5％的青链霉素。
在一种实施方式中，所述基础培养基为DMEM、DMEM/F12或F10培养基。
在一种实施方式中，将肌肉干细胞在37℃、5％CO2下培养。
本发明的第二个目的是提供一种使肌肉干细胞增殖的培养基，所述培养基中含有Notch信号通路激活剂。
在一种实施方式中，所述培养基以DMEM、DMEM/F12或F10为基础培养基，并含有胎牛血清和青链霉素；Notch信号通路激活剂的含量为1-500μM。
在一种实施方式中，所述胎牛血清的体积百分为5％-10％，青链霉素的体积百分比为1％-5％。
在一种实施方式中，Notch信号通路激活剂的含量为100μM。
在一种实施方式中，胎牛血清的体积百分比为5％。
本发明的第三个目的是提供Notch信号通路激活剂在培养肌肉干细胞中的应用。
在一种实施方式中，所述Notch信号通路激活剂包括丙戊酸、丙戊酸衍生物、丙戊酸水合物、丙戊酸类似物、丙戊酸异构体、Jagged1蛋白或NF-κB蛋白。
在一种实施方式中，所述肌肉干细胞来源于哺乳动物肌肉组织。
在一种实施方式中，所述动物包括但不限于人、鼠、猪、牛、鱼。
本发明的有益效果：
本发明创造性地发现Notch信号通路激活剂在体外大量扩增肌肉干细胞中的用途，可以有效促进肌肉干细胞的快速增殖，同时大大降低了肌肉干细胞的培养成本，有利于肌肉干细胞的快速制备以及细胞培养肉产业的发展。
相较于未添加Notch信号通路激活剂的普通培养基(DMEM、5％FBS和1％青霉素-链霉素双抗)，本发明提供的含Notch信号通路激活剂的培养基能够促进肌肉干细胞的快速增殖生长，同时进行培养后，肌肉干细胞形态相似未发生变化，细胞数量明显增加。此外，利用含有Notch信号通路激活剂的培养基扩增肌肉干细胞后，细胞仍能够分化为肌管，具有成肌分化的潜能；同时，添加Notch信号通路激活剂的培养基中仅含有2％～5％的FBS，大大降低了FBS的使用量，培养及成本大大降低。因此证明本发明提供的Notch信号通路激活剂可以有效促进肌肉干细胞增殖生长，大大缩短了细胞的培养时间，且降低了FBS的使用量，为细胞培养肉产业种子细胞和肌肉干细胞的研究提供充足的细胞来源。
附图说明
图1为不同浓度Notch信号通路激活剂对肌肉干细胞增殖的影响图。
图2为MTT法检测不同浓度Notch激活剂作用下肌肉干细胞的数量图。
图3为空白组与实验组Pax7表达情况图；注：图为10×视野，A为空白组Pax7免疫荧光染色情况图；B为添加Notch激活剂的实验组Pax7免疫荧光染色；C为空白组和实验组中Pax7+细胞比例图。
图4为空白组与实验组MyoD表达情况图；注：图为10×视野，A为空白组MyoD免疫荧光染色情况图；B为添加Notch激活剂的实验组MyoD免疫荧光染色情况图；C为空白组和实验组中MyoD+细胞比例图。
图5为空白组与实验组Desmin免疫荧光染色情况图；注：图为10×视野，A为空白组；B为添加Notch激活剂的实验组。
图6为空白组与实验组α-Actin免疫荧光染色情况图；注：图为10×视野，A为空白组；B为添加Notch激活剂的实验组。
具体实施方式
下面结合具体实例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。
下述实施例中的方法未经特别说明均为常规方法。
下述实例中所用仪器和试剂未经特别说明均为可通过商业途径获得的常规仪器和试剂。
下述实例中所用细胞为新鲜猪肌肉组织中分选并经过流式细胞仪纯化后得到的猪肌肉干细胞。
实施例1不同浓度Notch信号通路激活剂对肌肉干细胞体外增殖的影响
取新鲜猪肌肉组织进行分离，消化后通过流式细胞仪获得CD31-CD45-CD56+CD29+细胞，即肌肉干细胞，培养于预先用胶原蛋白包被的培养瓶中。
空白组培养基：在DMEM(Gibco)中添加5％(v/v)FBS和1％青链霉素。
实验组培养基：在空白组培养基基础上分别添加1、50、100、200、500μM的Notch激活剂(丙戊酸)。
将等量的肌肉干细胞接种于胶原蛋白包被的48孔板中(每孔接种1.5×104个)，分别加入空白组培养基以及含不同浓度Notch激活剂的实验组培养基，于37℃、5％CO2培养箱中培养。培养48h后，观察细胞形态，并通过MTT方法检测活细胞数量。
细胞显微照片如图1所示，培养相同时间后，添加不同浓度Notch激活剂的实验组细胞均明显多于空白组，空白组和实验组的细胞形态相似。MTT检测情况如图2，结果显示，空白组在490nm处的吸光值为0.245，添加不同浓度的Notch激活剂后培养48h，实验组490nm处的吸光值明显高于空白组，在添加浓度为100μM时具有最高吸光值，为0.3865，提高了57.76％，其余浓度下吸光值也提高了18.37％～47.76％，说明活细胞数均明显增多，证明添加Notch激活剂可以有效促进肌肉干细胞的增殖。
实施例2肌肉干细胞特征因子表达情况鉴定
以免疫荧光的方式考察空白组及添加Notch激活剂中肌肉干细胞特征因子PAX7和MYOD的表达情况，具体方法如下：
在共聚焦小皿中分别接种等量(2.0×104个)的实验组和对照组的肌肉干细胞(共聚焦小皿中含有DMEM(Gibco)、5％(v/v)FBS和1％青链霉素，培养6-8h后，用PBS缓冲液清洗细胞，加入4％(4g/100mL)多聚甲醛(4℃预冷)固定，室温下通透15min后除去多聚甲醛，用PBS缓冲液小心清洗；加入0.5％(体积百分比)Triton x-100处理15min，用PBS缓冲液小心清洗；加入封闭液(1％BSA、22.52mg/mL甘氨酸的PBST(PBS+0.1％Tween 20))，室温孵育30min后用PBS缓冲液小心清洗，得到固定后的细胞。
将空白组和实验组分别分成两组，一组中加入在1％牛血清白蛋白(BSA)的PBS中稀释的PAX7抗体(1：100)，另一组中加入在1％牛血清白蛋白(BSA)的PBS中稀释的MYOD抗体(1：100)，分别室温孵育1h后4℃过夜处理。过夜处理后，放至室温1h后，用PBS清洗3次，加入在1％BSA的PBS溶液中1：200稀释的荧光标记的二抗，室温避光孵育1-1.5h；用PBS清洗后，加入20μM DAPI，室温避光孵育10min，用PBS清洗后，加入抗淬灭封片剂，在荧光显微镜下观察拍照。
空白组与实验组的PAX7和MYOD免疫荧光染色及阳性细胞比例情况如图3和图4所示，可以看出两组肌肉干细胞均能正常表达PAX7和MYOD，空白组和实验组PAX7+细胞比例分别为86.86％和84.6％，无显著性差异；空白组和实验组MYOD+细胞比例分别为89.2％和89.76％，无显著性差异，表明添加Notch激活剂对肌肉干细胞特异性标志物PAX7和MYOD的表达无影响，经Notch激活剂扩增后的肌肉干细胞仍为成肌细胞，Notch激活剂未影响细胞的谱系特异性。
实施例3肌肉干细胞分化能力免疫荧光方法鉴定
肌肉干细胞在进入分化阶段后，会自发融合形成肌管，并表达特征蛋白。因此通过免疫荧光的方法，对肌肉干细胞特征蛋白Desmin和α-Actin进行鉴定，具体方法如下：
在共聚焦小皿中分别接种等量(2.0×104个)的肌肉干细胞，当细胞增长至70％-90％汇合度时，用PBS缓冲液清洗细胞，加入分化培养基(97％DMEM培养基、2％马血清、1％青霉素-链霉素双抗，均为体积百分比)，培养3天左右后，对小皿中的细胞利用显微镜进行观察，显微镜下见到细长状多核肌管。吸弃培养基，PBS清洗后，加入4％(质量体积比)多聚甲醛(4℃预冷)固定，室温下通透15min后除去多聚甲醛，用PBS缓冲液小心清洗；加入0.5％(体积百分比)Triton x-100处理15min，用PBS缓冲液小心清洗；加入封闭液(1％BSA、22.52mg/mL甘氨酸的PBST(PBS+0.1％Tween 20))，室温孵育30min后用PBS缓冲液小心清洗，得到细胞。向细胞中分别加入在1％牛血清白蛋白(BSA)的PBS中稀释的Desmin抗体(1：100)、α-Actin(1：100)，室温孵育1h后4℃过夜处理。过夜处理后，室温放置1h后，用PBS清洗3次，向细胞中加入在1％BSA的PBS溶液中1：200稀释的荧光标记的二抗，室温避光孵育1-1.5h；用PBS清洗后，加入20μM DAPI，室温避光孵育10min，用PBS清洗后，加入抗淬灭封片剂，在荧光显微镜下观察拍照。
空白组与实验组Desmin和α-Actin免疫荧光染色情况如图5和图6所示，经Notch激活剂扩增后的肌肉干细胞，诱导分化后仍可以融合为多核肌管，表达肌管特异性标志物Desmin和α-Actin，表明添加Notch激活剂扩增肌肉干细胞不影响其分化能力，仍然具有肌源性分化的能力。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (10)
1.一种促进肌肉干细胞体外增殖的方法，其特征在于，将肌肉干细胞在含有Notch信号通路激活剂的体系中培养。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述Notch信号通路激活剂包括丙戊酸、丙戊酸衍生物、丙戊酸水合物、丙戊酸类似物、丙戊酸异构体、Jagged1蛋白或NF-κB蛋白。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述肌肉干细胞来源于动物肌肉组织；所述动物包括但不限于人、鼠、猪、牛、鱼。
4.根据权利要求1～3任一项所述的方法，其特征在于，所述Notch信号通路激活剂的浓度为1-500μM；所述体系中还含有基础培养基、体积百分比为5％-10％的胎牛血清、体积百分比为1％-5％的青链霉素；所述基础培养基为DMEM、DMEM/F12或F10培养基。
5.根据权利要求1～4任一项所述的方法，其特征在于，将肌肉干细胞在35～40℃、1～5％CO2的条件下培养。
6.一种使肌肉干细胞增殖的培养基，其特征在于，所述培养基中含有Notch信号通路激活剂。
7.根据权利要求6所述的培养基，其特征在于，所述培养基以DMEM、DMEM/F12或F10为基础培养基，并含有胎牛血清；Notch信号通路激活剂的含量为1-500μM。
8.Notch信号通路激活剂在培养肌肉干细胞中的应用。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述Notch信号通路激活剂包括丙戊酸、丙戊酸衍生物、丙戊酸水合物、丙戊酸类似物、丙戊酸异构体、Jagged1蛋白或NF-κB蛋白。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述肌肉干细胞来源于动物肌肉组织，所述动物包括但不限于人、鼠、猪、牛、鱼。
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