CN102453693B

CN102453693B - 骨形成蛋白在诱导诱导式多能性干细胞过程中的应用

Info

Publication number: CN102453693B
Application number: CN201010510485.0A
Authority: CN
Inventors: 裴端卿
Original assignee: Guangzhou Institute of Biomedicine and Health of CAS
Current assignee: Guangzhou Institute of Biomedicine and Health of CAS
Priority date: 2010-10-18
Filing date: 2010-10-18
Publication date: 2014-05-14
Anticipated expiration: 2030-10-18
Also published as: CN102453693A

Abstract

本发明公开了骨形成蛋白在诱导诱导式多能性干细胞过程中的应用，其中骨形成蛋白取代KLF(Krueppel-like factor)家族蛋白作为诱导诱导式多能性干细胞的诱导因子。本发明通过在诱导诱导式多能性干细胞过程中使用骨形成蛋白，提供了一种高效率、少因子(如缺失KLF家族蛋白，仅使用其中的Oct4和Sox2)的重编程诱导体系，对研究关键转录因子，阐明重编程机理有着重要作用。

Description

骨形成蛋白在诱导诱导式多能性干细胞过程中的应用

技术领域

本发明涉及骨形成蛋白在诱导分化的体细胞重新编程为诱导式多能性干细胞过程中的应用。

背景技术

2006年，日本科学家Yamanaka及其同事用四个转录因子（Oct4，KLF4，Sox2，c-Myc）成功的将小鼠的成纤维细胞重编程为胚胎干细胞，这一技术被称为诱导式多能性干细胞（iPS）技术。其后，人及其他物种如大鼠，猴，猪的成纤维细胞也被成功的重编程，这项技术被认为是再生医学中最为重要的突破。近年来，iPS技术发展迅速，首先是四个转率因子中c-Myc被证明是非必须的，尽管去除c-Myc后，重编程效率变得极低；其次，一系列促进重编程的小分子化合物被发现，如组蛋白去乙酰化酶抑制剂：VPA、TSA，丁酸钠，DNA甲基化酶抑制剂：5-AZA;TGF-β抑制剂：A83-01及SB431542,组蛋白甲基转移酶抑制剂:BIX01294,维生素C（抗坏血酸）等。这些小分子化合物的发现，极大的加速了iPS进程，将重编程效率从起初的约0.01%提高到接近1%的水平。此外，无血清以及化学成分限定培养条件的采用，将三因子的重编程效率提高到10%左右，同时也解决了血清培养体系中血清批次差异导致的实验重复性差的问题，为重编程研究提供了非常好的平台。然而，对转录因子诱导重编程过程机理的揭示进展依旧缓慢，其主要受限于如下两个瓶颈：1、基于四因子（Sox2/KLF4/Oct4/c-Myc）或三因子(Sox2/KLF4/Oct4)的重编程模型转录调控网络复杂，不利于区分各因子的功能。2、少因子（指两个或两个以下的重编程因子）重编程体系效率极其低下，很难满足机理分析的要求。因此，开发一种高效率、少因子的重编程诱导体系，对研究关键转录因子，阐明重编程机理有着重要作用。

发明内容

本发明的目的是提供骨形成蛋白在诱导式多能性干细胞技术中的应用，尤其涉及将骨形成蛋白作为诱导因子的应用。

为实现上述目的，本发明的骨形成蛋白在诱导诱导式多能性干细胞过程中的应用，其中骨形成蛋白取代KLF（Krueppel-like factor）家族蛋白，尤其是KLF4作为诱导诱导式多能性干细胞的诱导因子。

所述骨形成蛋白（BMPs）为转化生长因子(TGF-β)超家族的一个亚族，具体成员包括BMP2、BMP4、BMP5、BMP6、BMP7、BMP9等20多个成员。

本发明的骨形成蛋白包括天然存在的骨形成蛋白，重组表达的骨形成蛋白。所述的骨形成蛋白与体细胞共培养。

本发明的骨形成蛋白包括外源转导入体细胞的带有骨形成蛋白编码序列的DNA片段或RNA片段在体细胞中表达的骨形成蛋白。所述的带有骨形成蛋白编码序列的DNA片段或RNA片段转导入体细胞中。

本发明中骨形成蛋白可以选取骨形成蛋白中的至少一种，尤其是骨形成蛋白-2（BMP2）、骨形成蛋白-4（BMP4）、骨形成蛋白-6（BMP6）、骨形成蛋白-7（BMP7）、骨形成蛋白-9（BMP9），其中特别优选骨形成蛋白-4（BMP4）。

以上的骨形成蛋白的基因序列可以由GeneBank中获得，部分骨形成蛋白在GeneBank中的序列编号为：BMP2，NM_080708；BMP4，NM_007554；BMP6，NM_007556；BMP7，NM_007557；BMP9，NM_019506。

本发明的诱导因子还包括Oct4和Sox2的基因产物。对于现有技术中的Oct4，KLF4，Sox2，c-Myc四个诱导因子，本发明可以仅使用其中的Oct4和Sox2。也就是，可以在缺失KLF家族蛋白的情况下诱导重编程过程，形成诱导式多能性干细胞。

本发明还提供了一种用于在未添加KLF家族蛋白条件下诱导诱导式多能性干细胞的完全培养基，其含有骨形成蛋白。该培养基中还包括基础培养基以及血清或代血清添加剂。所述的代血清添加剂包含抗坏血酸（维生素C），受体酪氨酸激酶和胰岛素。每毫升该培养基中含有0.1-100纳克骨形成蛋白。其中优选，每毫升该培养基中含有10纳克骨形成蛋白-4。

本文中使用的“高效培养基iCD1”是本发明人在先申请的专利，其含有除诱导因子外的，诱导诱导式多能性干细胞所需的各种物质，如基础培养基组分、抗坏血酸（维生素C），受体酪氨酸激酶和胰岛素等。在使用的时候根据需要向其中加入诱导因子即可。但是本发明不限于使用与高效培养基iCD1相同的培养基，任何其他含有基础培养基以及血清或代血清添加剂并能够添加骨形成蛋白满足在无KLF家族诱导因子存在下诱导诱导式多能性干细胞的培养基均落入本发明的保护范围内。

综上所述，本发明通过在诱导诱导式多能性干细胞过程中使用骨形成蛋白，提供了一种高效率、少因子（如缺失KLF家族蛋白，仅使用其中的Oct4和Sox2）的重编程诱导体系，对研究关键转录因子，阐明重编程机理有着重要作用。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明：

图1是Oct4和KLF4或Oct4和Sox2病毒感染的小鼠胚胎成纤维细胞在高效培养基iCD1培养条件下重编程效率统计的图。将Oct4和KLF4或Oct4和Sox2病毒感染后的小鼠胚胎成纤维细胞培养在高效培养基iCD1培养基中，在感染后的第12天、第16天或第20天分别统计重编程克隆数。

图2是Oct4和KLF4或Oct4和Sox2病毒感染的小鼠胚胎成纤维细胞在高效培养基iCD1和高效培养基iCD1添加BMP条件下重编程效率比较的图。Oct4和KLF4或Oct4和Sox2病毒感染小鼠胚胎成纤维细胞后，分别培养在高效培养基iCD1和高效培养基iCD1添加BMP条件下感染后的不同天数计算重编程克隆数。

图3是Oct4和KLF4或Oct4和Sox2病毒感染小鼠胚胎成纤维细胞后第14天，其在高效培养基iCD1和高效培养基iCD1添加BMP条件下得到的重编程效率比较的图。

图4是Oct4和Sox2病毒感染小鼠胚胎成纤维细胞后第12天，在高效培养基iCD1和高效培养基iCD1添加BMP条件下细胞状态的图。

图5是由Oct4和Sox2病毒感染的小鼠胚胎成纤维细胞得到的重编程克隆注射囊胚并移植到代孕母鼠后产生的嵌合体小鼠的图。

图6是Oct4病毒感染的小鼠胚胎成纤维细胞在高效培养基iCD1和高效培养基iCD1添加BMP条件下重编程效率比较的图。

图7是Oct4病毒感染的小鼠胚胎成纤维细胞在高效培养基iCD1添加BMP条件下得到的原始重编程克隆和传代克隆的图。

图8是Oct4病毒感染的小鼠尾尖成纤维细胞在高效培养基iCD1添加BMP条件下得到的重编程克隆的统计图。

图9是Oct4病毒感染的小鼠尾尖成纤维细胞在高效培养基iCD1添加BMP条件下得到的原始重编程克隆和传代克隆的图。

图10是不同因子诱导得到的重编程克隆的基因插入鉴定图。

图11是由Oct4病毒感染的小鼠尾尖成纤维细胞得到的重编程克隆的核型图。

图12是采用免疫荧光方法检测Oct4病毒感染的小鼠尾尖成纤维细胞得到的重编程克隆中的多能性分子标记Nanog、Rex-1、SSEA-1的表达状况的图。

图13是由Oct4病毒感染的小鼠尾尖成纤维细胞得到的重编程克隆注射囊胚并移植到代孕母鼠后产生的嵌合体小鼠的图。

图14是由Oct4病毒感染的小鼠尾尖成纤维细胞得到的重编程克隆注射囊胚并移植到代孕母鼠后产生的嵌合体小鼠的图。

图15是Oct4和Sox2病毒感染小鼠胚胎成纤维细胞后，分别在高效培养基iCD1和高效培养基iCD1添加BMP4、BMP7、BMP9条件下培养，在感染后的不同天数统计重编程克隆数的统计图。

图16是Oct4病毒感染小鼠胚胎成纤维细胞后，分别在高效培养基iCD1和高效培养基iCD1添加BMP4、BMP7、BMP9条件下培养，在感染后的不同天数统计重编程克隆数的统计图。

图17是Oct4和Sox2病毒感染的小鼠胚胎成纤维细胞在分别在高效培养基iCD1和高效培养基iCD1添加BMP4、BMP7、BMP9的条件下得到的原始重编程克隆的图。

图18是Oct4和Sox2病毒感染的小鼠胚胎成纤维细胞在分别在高效培养基iCD1和高效培养基iCD1添加BMP2、BMP6的条件下，在感染后的14天统计重编程克隆数的统计图。

图中，Oct4和Sox2病毒感染的细胞以“OS”表示；Oct4和KLF4病毒感染的细胞以“OK”表示；Oct4病毒感染的细胞以“O”表示。

具体实施方式

为详细说明本发明的技术内容、构造特征、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图详予说明。

定义和技术

除非另外指明，本发明的实践将使用分子生物学、微生物学、细胞生物学、免疫学和重组DNA的传统技术，其属于本领域技术范围。参见例如，，分子克隆实验指南，第3版(2002)，Sambrook，Fritsch和Maniatis等人编著；CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULARBIOLOGY(F.M.Ausubel等人编著(1987))；丛书METHODS INENZYMOLOGY(Academic Press，Inc.)：PCR2：A PRACTICALAPPROACH(1995)，M.J.MacPherson，B.D.Hames和G.R.Taylor等人编著，ANTIBODIES(1988)，Harlow和Lane等人编著，A LABORATORYMANUAL and ANIMAL CELL CULTURE(1987)，R.I.Freshney等人编著；HANDBOOK OF STEM CELLS，卷2，W.French Anderson等人编著。

除非另外说明，本文中所用的术语均具有本领域技术人员常规理解的含义，为了便于理解本发明，将本文中使用的一些术语进行了下述定义。

在说明书和权利要求书中使用的，单数型“一个”，和“这个”包括复数参考，除非上下文另有清楚的表述。例如，术语“一个细胞”包括复数的细胞，包括其混合物。

本文所述的“诱导式多能性干细胞（iPS细胞）”是这样的细胞，其来源是体细胞通过诱导体细胞重编程变化而成，其在胚胎干细胞培养条件下，与胚胎干细胞在细胞形态、生长特性、表面标志物表达、移植到皮下可形成包含3个胚层组织细胞结构的畸胎瘤等方面与小鼠胚胎干细胞非常相似，而且在DNA甲基化方式、基因表达谱、染色质状态、形成嵌合体动物等方面也与小鼠胚胎干细胞几乎完全相似。

本文中所用的术语“体细胞”是相对于“生殖细胞”以及“胚胎干细胞”而言的概念，其是由“胚胎干细胞”分化产生的不再具有多能性，而是具有某一具体功能的细胞，其是由“胚胎干细胞”分化或内细胞团继续发育产生的不再具备多能性，一般具有具体功能的细胞，其一般从发育阶段位于囊胚期（在小鼠中具体为受精后3.5天）之后的胎鼠或成鼠取材，取材时一般避免取到可能具有多能性的生殖细胞及其来源（如精原干细胞、生殖嵴干细胞等）。本文中所用的体细胞优选来源于哺乳动物，更优选来源于人、猴、狗、猫、大鼠或小鼠，最优选地，来源于小鼠。本文中的体细胞可以是机体内任何类型的体细胞，优选为成纤维细胞。

本文所述的术语“诱导”（也称“诱导重编程”）是指将体细胞去分化为多能性干细胞的过程。优选地，通过将维持干细胞多能性所需的多能性因子cDNA导入体细胞可以诱导体细胞去分化成为多能性干细胞（Takahashi K,Yamanaka S.Cell.2006;126:663–676；Wernig M,MeissnerA,Foreman R,等人，Nature.2007;448:318-324；Yu J,Vodyanik MA,Smuga-Otto K等人Science.2007;318:1917-1920）。

本文所述的术语“重编程”：指将已分化的细胞去分化，重新回复到多能性细胞的状态。本发明中的重编程指将成体细胞逆分化为胚胎干细胞的状态。

将所述干细胞多能性因子cDNA导入体细胞的方法可以是本领域技术人员熟知的多种技术，包括病毒感染、脂质体转染、转座子介导的插入表达、穿膜蛋白、药物诱导、电穿孔、粒子轰击等各种将DNA转入细胞的方法。优选地，使用包含cDNA的病毒载体进行转染，所述病毒载体包括慢病毒载体、逆转录病毒载体等多种病毒载体。优选地逆转录病毒载体（例如pMX载体）。

本文中所述的“病毒感染”即指的是上述将干细胞多能性因子cDNA导入体细胞的方法。本文中的“Sox2/KLF4/Oct4/c-Myc”即指的是上述干细胞多能性因子cDNA或带有这些cDNA的病毒载体，干细胞多能性因子cDNA可由“病毒感染”导入体细胞中，其在体细胞等表达体系中，可以翻译合成基因产物。

本文中“OS”表示的是Oct4和Sox2病毒感染的细胞；“OK”表示的是Oct4和KLF4病毒感染的细胞；“O”表示的是Oct4病毒感染的细胞。

本文所述的“骨形成蛋白”，是转化生长因子（TGFbeta）蛋白超家族下的一个蛋白家族，能通过结合异源的受体对，通过受体上激酶活性的传递，磷酸化Smad1/5/8等重要的细胞内信使蛋白，从而与Smad4结合进入细胞核，调控下游基因表达。

本文中细胞的培养方法是常规的细胞培养方法及条件，包括一些适宜各个具体细胞系，但是不影响细胞基本性质的修饰，各种细胞类型的培养方法以及培养条件，可参见W.French Anderson等人，HANDBOOKOF STEM CELLS，卷2。

本文中iPS细胞的鉴别采用了报告基因的方法，所述的报告基因是指能够指示细胞通过外加诱导已经转变为类似胚胎干细胞的阶段，包括利用转基因或同源重组手段加入一段表达荧光蛋白（如本文中的GFP）或者抗性的序列，这段序列处在胚胎干细胞特异表达的一些基因的启动子的控制下，故而可以在细胞到达胚胎干细胞状态时激活这段荧光蛋白或抗性基因的表达，从而使这个细胞具有某些可以被检测的性状特征（如发出绿光）而区别于其他未重编程至该状态的细胞。本领域技术常用的报告基因包括绿色荧光蛋白，抗性基因例如氨苄青霉素抗性基因等。本领域的技术人员可以根据细胞的培养条件和用途选择适合于各种实施方案的报告基因。参考例如Young II Yeom等人，Germline regulatoryelement of Oct-4specific for the totipotent cycle of embryonal cells,Development122,000-000(1996)，Printed in Great Britain,The company ofBiologists Limited1996,881-894页；Shin-ya Hatano等人，Pluripotentialcompetence of cells associated with Nanog activation,Mechanisms ofDevelopment122(2005),67-79。

本文所述的检测细胞多能性的方法是本领域技术人员熟知的，参见例如Yamanaka,S.Strategies and new developments in the generation ofpatient-specific pluripotent stem cells.Cell Stem Cell1,39-49(2007)等。所述方法包括鉴定多能性分子标记的表达、细胞的甲基化状态检测、胚胎小体EB的形成、畸胎瘤的形成以及施用经诱导的多能性干细胞形成嵌合鼠等等。

本文所述的“嵌合鼠”是通过本领域普通技术人员熟知的“嵌合鼠”技术实施的。是指将胚胎干细胞或通过本文技术获得的iPS细胞注射入小鼠囊胚中，使得其与所注射入小鼠的囊胚中的胚胎细胞混合，共同在代孕母鼠中的子宫内生长发育，小鼠出生后全身上下的各个组织即由两种胚胎细胞共同混合组成，如马赛克拼图样，这样的小鼠被称为嵌合鼠（Evans M J,等人;The ability of EK cell to form chimeras after selectionof clones in G418and some observation on the intergration of retroviralvector proviral DNA into EK cells[M];Cold Spring Harbor Symposia onQuantitative Biology;1985年；Xian MW,Wu BY,Hu XL,Shang KG,WuHL,1996.Construction of chimeric mice of ES cells by microinjectionmethod.Hereditas18(1):7-10）。使用iPS能否形成嵌合鼠是检验iPS是否与胚胎干细胞具有类似性质的最直接和最关键的证据。

本文所述的“高效培养基iCD1”为本发明人在先申请的专利技术，是一种高效的重编程培养基。申请号为201010167062.3，PCT/CN2010/075551；其中包含基础培养基的成分，抗坏血酸（维生素C），受体酪氨酸激酶和胰岛素。其中所述的维生素Ｃ包括抗坏血酸及其衍生物如抗坏血酸钠盐，维生素C稳定形式2-磷酸-抗坏血酸。其中优选形式为2-磷酸-抗坏血酸。维生素Ｃ工作浓度为0-100微克/毫升,但不限于以上浓度，其中优选浓度为50微克每毫升。所述受体酪氨酸激酶包括碱性成纤维生长因子（bFGF）、表皮生长因子（EGF）、血管内皮生长因子（VEGF），血小板生长因子（PDGF）、胰岛素样生长因子（IGF）和肝生长因子（HGF）中的至少一种。其中优选药物为碱性成纤维生长因子,工作浓度范围为0-100钠克/毫升,优选浓度为5纳克/毫升。所述胰岛素包括提取和人工重组合成的各种来源的具有生物活性的胰岛素，其中优选胰岛素为人重组胰岛素（SIGMA公司），工作浓度为0-50微克/毫升，但不限于以上浓度，其中优选浓度为20微克/毫升。

使用的时候，只需要向高效培养基iCD1中加入相应的诱导因子即可，高效培养基iCD1的三因子SKO诱导重编程效率可达10%左右。

本文所述的“基础培养基”为人工制备的含有糖类、氨基酸、无机盐、维生素、脂质等细胞生长所需营养物质的培养品。本发明所述基础培养基包括Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium(DMEM),MinimalEssential Medium(MEM),Basal Medium Eagle(BME),F-10,F-12,RPMI1640,Glasgow’s Minimal Essential Medium(GMEM),αMinimalEssential Medium(αMEM),Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium和M199等,但不仅限于上述基础培养基，其中优选的基础培养基为高糖DMEM基础培养基。

实施例

下列实施例举例了发明人的标准实验室实践，用于示例本发明的模式，而不应将本发明理解为限定于这些实施例的范围。这些实施例。根据本文公开和本领域技术人员的普遍水平，技术人员将理解下列仅用于示例，可以在不超过本发明的范围内进行各种变动、修饰和改造。其中所涉及的技术，除非特别说明，均是本领域技术人员熟知的分子生物学、细胞生物学、生物化学等各个领域的常规技术。

本发明中所用技术概述：

除了特别说明，本文中提及的各种物质均来自英杰生命科学公司（Invitrogen）

细胞培养：

小鼠胚胎成纤维细胞来自含Oct-GFP转基因等位基因小鼠e13.5的胚，并且培养在下述成纤维细胞培养基中：高葡萄糖DMEM，补充有10%FBS，L-谷氨酰胺和NEAA。iPS和胚胎干细胞均在包括血清的培养基（mES）和无血清的培养基（mKSR）中的MEF饲养层上培养。iPS诱导过程采用发明专利（申请号201010167062.3,PCT/CN2010/075551）公开的高效培养基iCD1。所述高效培养基iCD1成分如下表1所示：

表1

无机离子	毫克/升	氨基酸	毫克/升
				氯化锂	2.12E+02	L-精氨酸	8.40E+01
氯化钙	2.00E+02	L-丙氨酸	8.90E+00
				九水硝酸铁	1.00E-01	L-天冬酰胺	1.32E+01
氯化钾	4.00E+02	L-天冬氨酸	1.33E+01
				硫酸镁	9.77E+01	L-半胱氨酸	6.30E+01
氯化钠	6.40E+03	甘氨酸	4.50E+01
				碳酸氢钠	3.70E+03	L-谷氨酸	1.47E+01
一水磷酸二氯钠	1.25E+02	L-组氨酸	4.20E+01
				微量元素		L-异亮氨酸	1.05E+02
偏钒酸铵	3.00E-04	L-亮氨酸	1.05E+02
				硫酸铜	1.25E-03	L-赖氨酸	1.46E+02
氯化锰	5.00E-05	L-甲硫氨酸	3.00E+01
				硒	1.60E-02	L-苯丙氨酸	6.60E+01
亚硒酸钠	1.04E-02	L-脯氨酸	1.15E+01
				能量物质		L-丝氨酸	6.30E+01
葡萄糖	4.50E+03	L-苏氨酸	9.50E+01

丙酮酸钠	1.10E+02	L-色氨酸	1.60E+01
				半乳糖	1.50E+01	L-酪氨酸	1.04E+02
脂质		L-缬氨酸	9.40E+01
				花生四烯酸	2.00E+00	维生素
胆固醇	2.20E+02	抗坏血酸	5.00E+01
				亚油酸	1.00E+01	维生素E	1.00E+00
亚麻酸	1.00E+01	乙酰维生素E	1.00E+00
				肉豆蔻酸	1.00E+01	生物素	1.00E-01
油酸	1.00E+01	泛酸	4.00E+00
				棕榈油酸	1.00E+01	氯化胆碱	4.00E+00
棕榈酸	1.00E+01	叶酸	4.00E+00
				聚醚F-18	1.00E+05	肌醇	7.20E+00
硬脂酸	1.00E+01	烟酰胺	4.00E+00
				吐温80	2.20E+03	维生素B6	4.00E+00
生长因子/蛋白		核黄素	4.00E-01
				重组人胰岛素	2.00E+01	硫胺	4.00E+00
含铁离子转铁蛋白	1.00E+02	维生素A	1.00E-01
				清蛋白水解物	1.00E+03	维生素B12	1.40E+00
过氧化氢酶	2.50E+00	其他物质
				还原型谷胱苷肽	1.50E+00	腐胺	3.22E+01
超氧化物岐化酶	2.50E+00	左旋肉碱	2.00E+00
				三碘代甲状腺原氨酸	2.00E-03	乙醇胺	1.00E+00

肾上腺酮	2.00E-02	酚红	1.50E+01
				孕酮	1.26E-02	CHIR99021	1.40E+00
碱性成纤维细胞生长因子	5.00E-03	巯基乙醇	8.17E+00
				小鼠白细胞抑制因子	1.00E-03

反转录病毒生产以及产生iPS细胞

从Addgene公司购置包含小鼠Oct4、Sox2、KLF4和c-Myc的DNA的反转录病毒载体（pMXs）。按照现有技术进行病毒的产生和感染（Qin,D.,Li,W.,Zhang,J.&Pei,D.Direct generation of ES-like cells fromunmodified mouse embryonic fibroblasts by Oct4/Sox2/Myc/KLF4.Cellresearch17,959-962(2007)；Qin,D.等人Mouse meningiocytes expressSox2and yield high efficiency of chimeras after nuclear reprogrammingwith exogenous factors.J Biol Chem283,33730-33735(2008).）简言之，利用常规方法将这些质粒转染到PlatE细胞中。然后收集病毒上清液并且过滤48小时，以感染MEF，其中补充有1,5-二甲基-1,5-二氮十一亚甲基聚甲溴化物。在第二天重复相同的步骤。移除病毒上清液的当天被定义为感染后0天。将病毒感染后（即已经转染了Oct4、Sox2、KLF4和/或c-Myc，下文中，如无特殊说明，3因子感染代表用Oct4、Sox2、KLF4感染，4因子感染代表用Oct4、Sox2、KLF4和c-Myc感染，单因子代表Oct4感染）的成纤维细胞培养在本发明的培养基中，在感染后适当天数挑取iPS集落，这是基于Oct-GFP（即在荧光显微镜下发射荧光的集落）和典型的ES形态来挑取的。随后如胚胎干细胞样延展和保持挑取的集落（如上所述Qin,D.,Li,W.,Zhang,J.&Pei,D，2007；以及Qin,D.等人，2008）。

重编程效率的定量

用于定量重编程效率的主要方法是Oct4-GFP阳性重编程克隆计数统计。基于重编程进程的快慢程度，在感染后不同天数在倒置荧光显微镜下直接统计绿色荧光集落数。

iPS细胞的表征：

进行碱性磷酸酶和免疫荧光染色（如上所述Qin,D.,Li,W.,Zhang,J.&Pei,D，2007；以及Qin,D.等人，2008）。使用下列一抗：小鼠抗Rex1（自制）、小鼠抗-SSEA1(Abcam公司),小鼠抗-Nanog(Abcam公司)。

实验例1：骨形成蛋白提高OS重编程效率

将小鼠成纤维细胞消化后，以每孔3万细胞种植到12孔细胞培养皿内。用所述方法分别制备Oct4,Sox2,KLF4病毒，用OK或OS分别并感染小鼠成纤维细胞。两轮感染后分别用iCD1或iCD1添加BMP的条件下培养。在感染后的不同天数计算重编程克隆数。

在化学成分限定的高效培养基iCD1中，分别采用Oct4/Sox2或Oct4/KLF4两种病毒组合可将小鼠成纤维细胞重编程为多能性干细胞，但其效率相对低下。

如图1所示，Oct4和KLF4或Oct4和Sox2病毒感染的小鼠胚胎成纤维细胞在高效培养基iCD1培养条件下培养，实验重复三次，分别在感染后12天、16天和20天进行观察，重编程克隆数量少，变化不大，说明其重编程效率相对低下。

如图2所示，Oct4/KLF4和Oct4/Sox2感染小鼠成纤维细胞后，分别用iCD1培养基和iCD1培养基添加10纳克/毫升BMP4条件培养，在感染后不同时间点统计重编程克隆数。结果表明，在iCD1添加BMP4条件下，OS感染后的第11天即可出现重编程克隆，BMP4对促进Oct4/Sox2重编程效率的提高有显著影响。

如图2、3所示，OS感染后第14天，在iCD1添加BMP4条件下,每3万个初始细胞可出现60个重编程克隆，感染后的17天可达到140个重编程克隆，而OK的重编程效率提高不明显。

如图4所示，OS感染后第12天，在iCD1培养条件下，细胞呈扁平状，没有重编程克隆出现。而在iCD1添加BMP4条件下，则有大量隆起的细胞团，荧光显微镜下观察发现细胞团均发出绿色荧光，表明这些克隆内源的Oct4基因已经被激活，与小鼠胚胎干细胞类似。

如图5所示，重编程克隆可以形成嵌合体小鼠，进一步说明该重编程克隆与胚胎干细胞类似。

实验例1证明BMP4对OS的重编程形成诱导式多能性干细胞具有促进作用。

实验例2：BMP提高Oct4单因子重编程效率

将小鼠成纤维细胞消化后，以每孔3万细胞种植到12孔细胞培养皿内。用所述方法分别制备Oct4病毒并感染小鼠成纤维细胞。两轮感染后分别用iCD1或iCD1添加BMP4的条件下培养。在感染后的不同天数计算重编程克隆数。

分别将Oct4感染后的小鼠胚胎成纤维细胞培养在iCD1和iCD1添加10纳克/毫升的BMP4的条件下，在感染后的不同天数观察重编程克隆的出现情况。

如图6所示，Oct4感染后的小鼠胚胎成纤维细胞在iCD1添加BMP4培养条件下，感染后第16天出现了重编程克隆。在感染后的第24天，每3万个小鼠成纤维细胞可得到14个重编程克隆。

如图7所示，在iCD1添加BMP4培养条件下，由Oct4重编程小鼠胚胎成纤维细胞形成的重编程克隆展现出典型的胚胎干细胞形态，绿色荧光得到表达，表明其内源多能性基因Oct4已经激活。将克隆挑去出继续传四代，克隆依旧表现出于与胚胎干细胞类似的增殖速率与细胞形态，且未见有分化现象。

相对小鼠胚胎成纤维细胞而言，小鼠尾尖成纤维细胞（TTF）是更严格的终末分化细胞，是公认的成体细胞。

如图8所示，Oct4单因子在iCD1添加BMP4的条件下可成功将小鼠尾尖成纤维细胞重编程。而在iCD1条件下则没有出现任何重编程克隆。

如图9所示，在iCD1添加BMP4培养条件下，由Oct4重编程小鼠尾尖成纤维细胞形成的重编程克隆展现出典型的胚胎干细胞形态，绿色荧光得到表达，表明其内源多能性基因Oct4已经激活。将克隆挑去出继续传四代，克隆依旧表现出于与胚胎干细胞类似的增殖速率与细胞形态，且未见有分化现象。

如图10所示，重编程克隆的插入鉴定图表明这些重编程克隆不是病毒污染所致。

如图11所示，Oct4经诱导得到的小鼠尾尖成纤维细胞的单因子重编程克隆表现出正常的核型。

如图12所示，Oct4经诱导得到的重编程克隆均表达Nanog、Rex1、SSEA-1等多能性分子标记，证明这些重编程克隆为诱导式多能性干细胞。

如图13所示，Oct4经诱导得到的重编程克隆可以形成嵌合体小鼠，说明该重编程克隆与胚胎干细胞类似。

实验例2证明BMP4对Oct4的重编程形成诱导式多能性干细胞具有促进作用。

实验例3：BMP家族成员对重编程的促进作用

骨形成蛋白BMP为转化生长因子超家族中的一个亚族，成员有BMP2、BMP4、BMP6、BMP7、BMP9等等。为了验证是否所有的BMP家族的成员都能提高重编程效率，BMP4、BMP7、BMP9被用于OS和O的诱导重编程过程。其中，BMP4使用终浓度为10纳克/毫升，BMP7使用终浓度为50纳克/毫升，BMP9使用终浓度为10纳克/毫升。

如图14所示，OS感染小鼠成纤维细胞后分别在iCD1和iCD1添加BMP4、BMP7、BMP9的培养基中培养，BMP4、BMP7、BMP9均能提高OS的重编程效率。

如图15所示，将Oct4感染后的小鼠成纤维细胞分别在iCD1和iCD1添加BMP4、BMP7、BMP9的培养基中培养，BMP4、BMP7、BMP9均能提高O的重编程效率。

如图16、17所示，OS和O分别在iCD1和iCD1添加BMP4、BMP7、BMP9培养条件下的原始重编程克隆的图片，由OS或O重编程小鼠胚胎成纤维细胞形成的重编程克隆展现出典型的胚胎干细胞形态，绿色荧光得到表达，这表明其内源多能性基因已经激活。

如图18所示，OS感染小鼠成纤维细胞后分别在iCD1和iCD1添加BMP2、BMP6的培养基中培养，其中，BMP2使用终浓度为100钠克/毫升，BMP6使用终浓度为100纳克/毫升。BMP2、BMP6均能提高OS的重编程效率。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims

1.骨形成蛋白在诱导成纤维细胞形成诱导式多能性干细胞过程中的应用，其中诱导成纤维细胞形成诱导式多能性干细胞过程中使用的培养基为高效培养基iCD1，所述高效培养基iCD1成分如下表所示：

无机离子毫克/升氨基酸毫克/升氯化锂 2.12E+02L-精氨酸8.40E+01 氯化钙 2.00E+02L-丙氨酸8.90E+00 九水硝酸铁 1.00E-01L-天冬酰胺1.32E+01 氯化钾 4.00E+02L-天冬氨酸1.33E+01 硫酸镁 9.77E+01L-半胱氨酸6.30E+01 氯化钠 6.40E+03甘氨酸4.50E+01 碳酸氢钠 3.70E+03L-谷氨酸1.47E+01 一水磷酸二氯钠 1.25E+02L-组氨酸4.20E+01 微量元素 L-异亮氨酸1.05E+02 偏钒酸铵 3.00E-04L-亮氨酸1.05E+02 硫酸铜 1.25E-03L-赖氨酸1.46E+02 氯化锰 5.00E-05L-甲硫氨酸3.00E+01 硒 1.60E-02L-苯丙氨酸6.60E+01 亚硒酸钠 1.04E-02L-脯氨酸1.15E+01 能量物质 L-丝氨酸6.30E+01 葡萄糖 4.50E+03L-苏氨酸9.50E+01 丙酮酸钠 1.10E+02L-色氨酸1.60E+01 半乳糖 1.50E+01L-酪氨酸1.04E+02

脂质 L-缬氨酸 9.40E+01 花生四烯酸 2.00E+00 维生素胆固醇 2.20E+02 抗坏血酸 5.00E+01 亚油酸 1.00E+01 维生素E 1.00E+00 亚麻酸 1.00E+01 乙酰维生素E 1.00E+00 肉豆蔻酸 1.00E+01 生物素 1.00E-01 油酸 1.00E+01 泛酸 4.00E+00 棕榈油酸 1.00E+01 氯化胆碱 4.00E+00 棕榈酸 1.00E+01 叶酸 4.00E+00 聚醚F-18 1.00E+05 肌醇 7.20E+00 硬脂酸 1.00E+01 烟酰胺 4.00E+00 吐温80 2.20E+03 维生素B6 4.00E+00 生长因子/蛋白核黄素 4.00E-01 重组人胰岛素 2.00E+01 硫胺 4.00E+00 含铁离子转铁蛋白 1.00E+02 维生素A 1.00E-01 清蛋白水解物 1.00E+03 维生素B12 1.40E+00 过氧化氢酶 2.50E+00 其他物质还原型谷胱苷肽 1.50E+00 腐胺 3.22E+01 超氧化物岐化酶 2.50E+00 左旋肉碱 2.00E+00 三碘代甲状腺原氨酸 2.00E-03 乙醇胺 1.00E+00 肾上腺酮 2.00E-02 酚红 1.50E+01 孕酮 1.26E-02 CHIR99021 1.40E+00

碱性成纤维细胞生长因子 5.00E-03 巯基乙醇 8.17E+00 小鼠白细胞抑制因子 1.00E-03

其中骨形成蛋白取代KLF家族蛋白作为诱导诱导式多能性干细胞的诱导因子。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的骨形成蛋白包括天然存在的骨形成蛋白或者重组表达的骨形成蛋白。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述的重组表达的骨形成蛋白为带有骨形成蛋白编码序列的DNA或RNA转导入细胞后，细胞表达的骨形成蛋白。

4.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于：所述的骨形成蛋白与体细胞共培养。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的诱导因子还包括Oct4的基因产物。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述的诱导因子还包括Sox2的基因产物。

7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的骨形成蛋白为骨形成蛋白-2、骨形成蛋白-4、骨形成蛋白-6、骨形成蛋白-7、骨形成蛋白-9中的至少一种。

8.一种用于在未添加KLF家族蛋白条件下诱导成纤维细胞形成诱导式多能性干细胞的完全培养基，所述完全培养基为权利要求1所述高效培养基iCD1，其特征在于：其含有权利要求7中所述的骨形成蛋白。

9.一种用于在未添加KLF家族蛋白条件下诱导成纤维细胞形成诱导式多能性干细胞的完全培养基，所述完全培养基为权利要求1所述高效培养基iCD1，其特征在于：其含有权利要求1、2或3中所述的骨形成蛋白。

10.根据权利要求9所述的培养基，其特征在于：每毫升该培养基中含有0.1-100纳克骨形成蛋白。

11.根据权利要求10所述的培养基，其特征在于：每毫升该培养基中含有10纳克骨形成蛋白-4。