PL218876B1

PL218876B1 - Wyizolowana cząsteczka dwuniciowego RNA, sposób wytwarzania cząsteczki dwuniciowego RNA, zastosowanie cząsteczki dwuniciowego RNA do wytwarzania leku do modulowania działania genu związanego z patogenem, genu związanego z nowotworem, oraz genu związanego z chorobą autoimmunologiczną, sposób in vitro kierowania miejscowo specyficznymi interferencjami RNA w komórce, zastosowanie sposobu in vitro do ustalania działania genu w komórce oraz do modulowania działania genu w komórce, środek farmaceutyczny, komórka eukariotyczna transfekowana cząsteczką RNA lub cząsteczką DNA kodującą tę cząsteczkę RNA, oraz zastosowanie komórki eukariotycznej w procedurach analitycznych oraz w procedurach preparatywnych

Info

Publication number: PL218876B1
Application number: PL365784A
Authority: PL
Inventors: Thomas Tuschl; Sayda Elbashir; Winfried Lendeckel; Matthias Wilm
Original assignee: Europaisches Lab Für Molekularbiologie Embl; Max Planck Ges Zur Förderung Der Wissenschaften E V
Priority date: 2000-12-01
Filing date: 2001-11-29
Publication date: 2015-02-27
Also published as: RU2007131270A; US8372968B2; HK1110631A1; US20110027883A1; HU230458B1; RU2322500C2; EP1873259B1; AU2007203385B2; AU2010212438A2; ATE373724T2; JP6189576B2; JP4494392B2; US20110065773A1; IL155991A; US20110020234A1; US8933044B2; AU2010212438B2; NZ525888A; ES2215494T1; US20100292456A1

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku są wyizolowana cząsteczka dwuniciowego RNA, sposób wytwarzania cząsteczki dwuniciowego RNA, zastosowanie cząsteczki dwuniciowego RNA do wytwarzania leku do modulowania działania genu związanego z patogenem, genu związanego z nowotworem, oraz genu związanego z chorobą autoimmunologiczną, sposób in vitro kierowania miejscowo specyficznymi interferencjami RNA w komórce, zastosowanie sposobu in vitro do ustalania działania genu w komórce, oraz do modulowania działania genu w komórce, środek farmacetyczny, komórka eukariotyczna transfekowana cząsteczką RNA lub cząsteczką DNA kodującą tę cząsteczkę RNA, oraz zastosowanie komórki eukariotycznej w procedurach analitycznych oraz w procedurach preparatywnych.

Określenie „interferencja RNA (RNAi) stworzono po odkryciu, że po wstrzyknięciu dsRNA do nicienia C. elegans prowadzi do specyficznego wyciszania genów o sekwencji w wysokim stopniu homologicznej do wprowadzonego dsRNA (Fire i in., 1998). Następnie RNAi obserwowano u owadów, żab (Oelgeschlager i in., 2000) oraz innych zwierząt włącznie z myszami (Svoboda i in., 2000; Wianny i Zernicka-Goetz, 2000) i prawdopodobnie występuje ona także u ludzi. RNAi jest ściśle związana z mechanizmem posttranskrypcyjnego wyciszania genów (PTGS) w kosupresji w roślinach oraz tłumieniu u grzybów (Catalanotto i in., 2000; Cogoni i Macino, 1999; Dalmay i in., 2000; Ketting i Plasterk, 2000; Mourrain i in., 2000; Smardon i in., 2000), a niektóre składniki maszynerii RNAi są także potrzebne do posttranskrypcyjnego wyciszania przez kosupresję (Catalanotto i in., 2000; Dernburg i in., 2000; Ketting i Plasterk, 2000). Temat ten omawiano także ostatnio w pracach przeglądowych (Bass, 2000; Bosher i Labouesse, 2000; Fire, 1999; Plasterk i Ketting, 2000; Sharp, 1999; Sijen i Kooter, 2000), patrz także cały numer Plant Molecular Biology, tom 43, numer 2/3, (2000).

W roślinach, oprócz PTGS, wprowadzone transgeny mogą także prowadzić do transkrypcyjnego wyciszania genów w wyniku kierowanej przez RNA metylacji cytozyn w DNA (patrz pozycje literaturowe w Wassenegger, 2000). Docelowe miejsca w genomie zaledwie o 30 pz są metylowane w roślinach w sposób kierowany przez RNA (Pelissier, 2000). Metylacja DNA zachodzi także u ssaków.

Naturalną funkcją RNAi i kosupresji wydaje się być ochrona genomu przed inwazją mobilnych elementów genetycznych, takich jak retrotranspozony i wirusy, które, gdy stają się aktywne, wytwarzają obarczony aberacjami RNA lub dsRNA w komórce gospodarzu (Jensen i in., 1999; Ketting i in., 1999; Ratcliff i in., 1999; Tabara i in., 1999). Specyficzna degradacja mRNA przeciwdziała replikacji transpozonów i wirusów, jednakże niektóre wirusy są zdolne do przezwyciężenia tego procesu lub zapobiegania mu przez ekspresję białek hamujących PTGS (Lucy i in., 2000; Voinnet i in., 2000).

DsRNA uruchamia specyficzną degradację homologicznych RNA tylko w regionie identyczności z dsRNA (Zamore i in., 2000). DsRNA ulega obróbce do fragmentów RNA o 21- do 23-nt i docelowe miejsca cięcia RNA są regularnie oddzielone od siebie przez 21- do 23-nt. Zasugerowano zatem, że 21- do 23-nt fragmenty są kierującymi RNA w rozpoznawaniu miejsca docelowego (Zamore i in., 2000). Te krótkie RNA wykryto także w ekstraktach otrzymanych z komórek D. melanogaster Schneider 2, które były transfekowane dsRNA przed lizą komórek (Hammond i in., 2000), jednakże frakcje wykazujące specyficzną względem sekwencji aktywność nukleazową zawierały także dużą frakcję resztkowych dsRNA. Rola 21- - 23-nt fragmentów w kierowaniu cięciem mRNA została ponadto potwierdzona przez obserwację, że 21- - 23-nt fragmenty wyizolowane z poddanego obróbce dsRNA są zdolne, w pewnym stopniu, kierować degradacją mRNA (Zamore i in., 2000). Cząsteczki RNA podobnych wielkości także gromadzą się w tkance roślinnej wykazującej PTGS (Hamilton i Baulcombe, 1999).

Zastosowano ustalony in vitro układ Drosophila (Tuschl i in., 1999; Zamore i in., 2000), aby dokładniej zbadać mechanizm RNAi. Wykazano, że krótkie 21- i 22-nt RNA, gdy zostaną sparowane zasadami z jednoniciowymi wiszącymi 3'-końcami, działają jako RNA kierujące specyficzną względem sekwencji degradacją mRNA. Krótkie dsRNA o długości 30 pz nie są zdolne do kierowania RNAi w tym układzie, gdyż nie ulegają one już obróbce do 21- i 22-nt RNA. Ponadto zdefiniowano docelowe miejsca rozszczepiania RNA względem 21- i 22-nt krótkich interferujących RNA (siRNA) oraz dostarczono dowodu, że skierowanie obróbki dsRNA decyduje o tym, czy sensowny czy też antysensowny RNA może zostać pocięty przez wytworzenie kompleksu endonukleazowego siRNP. Ponadto siRNA mogą być także istotnymi narzędziami do modulacji transkrypcji, np. wyciszania genów ssaczych przez kierowanie metylacją DNA.

Dalsze doświadczenia w układach in vivo hodowli komórek ludzkich (komórki HeLa) wykazują, że cząsteczki dwuniciowego RNA o długości korzystnie 19-23 nukleotydów wykazują aktywność RNAi.

PL 218 876 B1

Celem leżącym u podstaw wynalazku jest dostarczenie nowych środków zdolnych do kierowania miejscowo specyficzną interferencją RNA, które to środki mają ulepszoną skuteczność i bezpieczeństwo w porównaniu z istniejącymi dotychczas środkami.

Rozwiązanie tego problemu zapewnia poniżej określona wyizolowana cząsteczka dwuniciowego RNA.

Tak więc wynalazek dotyczy wyizolowanej cząsteczki dwuniciowego RNA, w której każda nić RNA ma długość 19-23 nukleotydów, oraz w której co najmniej jedna nić ma jednoniciowy wiszący 3'-koniec o długości 1-3 nukleotydów, przy czym ta cząsteczka RNA jest zdolna do miejscowo specyficznej interferencji RNA.

Korzystnia jest cząsteczka RNA, w której każda nić ma długość 20-22 nukleotydów.

Korzystna jest cząsteczka RNA, w której jednoniciowy wiszący 3'-koniec jest stabilizowany względem degradacji.

Korzystna jest cząsteczka RNA, która zawiera co najmniej jeden zmodyfikowany analog nukleotydu.

Korzystnie zmodyfikowany analog nukleotydu jest wybrany spośród rybonukleotydów ze zmodyfikowaną resztą cukrową lub szkieletem.

Korzystniej analog nukleotydu jest rybonukleotydem ze zmodyfikowaną resztą cukrową, przy czym grupa 2'-OH jest zastąpiona grupą wybraną spośród H, OR, R, atomu chlorowca, SH, SR, NH2, NHR, NR2 i CN, gdzie R oznacza C1-C6 alkil, C1-C6 alkenyl lub C1-C6 alkinyl, a atom chlorowca oznacza F, Cl, Br lub I.

Ponadto korzystniej analog nukleotydu jest rybonukleotydem ze zmodyfikowanym szkieletem zawierającym grupę tiofosforanową.

Korzystna jest cząsteczka RNA mająca sekwencję o identyczności co najmniej 70% z wcześniej ustaloną docelową cząsteczką mRNA.

Wynalazek dotyczy także sposobu wytwarzania określonej powyżej cząsteczki dwuniciowego RNA, który charakteryzuje się tym, że (a) syntetyzuje się dwie nici RNA, każda o długości 19-23 nukleotydów, a ponadto co najmniej jedna nić ma jednoniciowy wiszący 3'-koniec o długości 1-3 nukleotydów, przy czym te nici RNA są zdolne do utworzenia cząsteczki dwuniciowego RNA, oraz (b) łączy się zsyntetyzowane nici RNA w warunkach, w których tworzona jest cząsteczka dwuniciowego RNA, zdolna do miejscowo specyficznej interferencji RNA.

Korzystnie w sposobie według wynalazku nici RNA syntetyzuje się chemicznie.

Ponadto korzystnie w sposobie według wynalazku nici RNA syntetyzuje się enzymatycznie.

Wynalazek dotyczy także zastosowania określonej powyżej cząsteczki dwuniciowego RNA do wytwarzania leku do modulowania działania genu związanego z patogenem.

Korzystnie w odniesieniu do powyższego zastosowania gen związany z patogenem jest genem wirusowym.

Wynalazek dotyczy także zastosowania określonej powyżej cząsteczki dwuniciowego RNA do wytwarzania leku do modulowania działania genu związanego z nowotworem.

Wynalazek dotyczy także zastosowania określonej powyżej cząsteczki dwuniciowego RNA do wytwarzania leku do modulowania działania genu związanego z chorobą autoimmunologiczną.

Ponadto wynalazek dotyczy sposobu in vitro kierowania miejscowo specyficznymi interferencjami RNA w komórce, który charakteryzuje się tym, że (a) kontaktuje się tę komórkę z określoną powyżej cząsteczką dwuniciowego RNA w warunkach, w których mogą zachodzić miejscowo specyficzne interferencje RNA, oraz (b) kieruje się miejscowo specyficzną interferencją RNA wywieraną przez dwuniciowy RNA na docelowym kwasie nukleinowym zawierającym część sekwencji zasadniczo odpowiadającą dwuniciowemu RNA.

Korzystnie w sposobie według wynalazku kontaktowanie obejmuje wprowadzenie tej cząsteczki dwuniciowego RNA do docelowej komórki, w której może zajść miejscowo specyficzna interferencja RNA.

Korzystnie w sposobie według wynalazku wprowadzenie obejmuje dostarczenie z użyciem nośnika lub iniekcję.

Ponadto wynalazek dotyczy zastosowania określonego powyżej sposobu in vitro kierowania miejscowo specyficznymi interferencjami RNA w komórce, do ustalania działania genu w komórce.

PL 218 876 B1

Ponadto wynalazek dotyczy zastosowania określonego powyżej sposobu in vitro kierowania miejscowo specyficznymi interferencjami RNA w komórce do modulowania działania genu w komórce.

Korzystnie w odniesieniu do powyższych zastosowań sposobu in vitro gen jest związany ze stanem patologicznym.

Ponadto wynalazek dotyczy środka farmaceutycznego zawierającego substancję czynną oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik, którego cechą jest to, że jako substancję czynną zawiera co najmniej jedną określoną powyżej cząsteczkę dwuniciowego RNA.

Korzystnie środek farmaceutyczny według wynalazku jest przeznaczony do zastosowań diagnostycznych.

Korzystnie środek farmaceutyczny według wynalazku jest przeznaczony do zastosowań terapeutycznych.

Wynalazek ponadto dotyczy komórki eukariotycznej transfekowanej określoną powyżej cząsteczką RNA lub cząsteczką DNA kodującą tę cząsteczkę RNA.

Korzystnie komórka eukariotyczna według wynalazku jest komórką ssaczą.

Korzystnie komórka eukariotyczna według wynalazku jest komórką ludzką.

Korzystnie komórka eukariotyczna według wynalazku jest transfekowana ponadto co najmniej jednym egzogennym docelowym kwasem nukleinowym kodującym docelowe białko lub wariant lub zmutowaną postać docelowego białka, przy czym ten egzogenny docelowy kwas nukleinowy różni się od endogennego genu docelowego na poziomie kwasu nukleinowego, tak że ekspresja egzogennego docelowego kwasu nukleinowego jest zasadniczo mniej hamowana przez cząsteczkę dwuniciowego RNA niż ekspresja endogennego genu docelowego.

Korzystnie w odniesieniu do komórki eukariotycznej według wynalazku egzogenny docelowy kwas nukleinowy jest zfuzowany z kolejną sekwencją kwasu nukleinowego kodującą wykrywalny peptyd lub polipeptyd.

Wynalazek dotyczy także zastosowania określonej powyżej komórki eukariotycznej w procedurach analitycznych.

Korzystne jest zastosowanie określonej powyżej komórki eukariotycznej do analizy profili ekspresji genów.

Korzystnie jest zastosowanie określonej powyżej komórki eukariotycznej do analizy proteomu.

Korzystnie w odniesieniu do określonych powyżej zastosowań komórki eukariotycznej prowadzi się analizę wariantu lub zmutowanej postaci docelowego białka kodowanego przez egzogenny docelowy kwas nukleinowy.

Korzystniejsze jest zastosowanie określonej powyżej komórki eukariotycznej do identyfikacji domen funkcjonalnych docelowego białka.

Korzystnie w odniesieniu do określonych powyżej zastosowań komórki eukariotycznej prowadzi się porównanie co najmniej dwóch komórek, wybranych spośród:

(i) kontrolnej komórki bez zahamowania docelowego genu;

(ii) komórki z zahamowaniem docelowego genu oraz (iii) komórki z zahamowaniem docelowego genu oraz komplementacją docelowego genu przez egzogenny docelowy kwas nukleinowy.

Korzystnie w odniesieniu do określonych powyżej zastosowań komórki eukariotycznej analiza obejmuje analizę funkcjonalną i/lub fenotypową.

Korzystne jest zastosowanie komórki eukariotycznej do wyodrębniania białek lub kompleksów białkowych z komórek eukariotycznych.

Jeszcze korzystne jest zastosowanie komórki eukariotycznej do wyodrębniania wysokocząsteczkowych kompleksów białkowych, które mogą dodatkowo zawierać kwasy nukleinowe.

Wynalazek dotyczy także zastosowania określonej powyżej komórki eukariotycznej w procedurach preparatywnych.

W odniesieniu do określonych powyżej zastosowań korzystne jest zastosowanie komórki eukariotycznej w procedurze identyfikacji i/lub charakteryzacji środków farmakologicznych.

Jak podano powyżej, co najmniej jedna nić ma jednoniciowy wiszący 3'-koniec o długości 1-3 nukleotydów, a korzystnie o długości dwóch nukleotydów. Druga nić może mieć tępe końce lub mieć jednoniciowy wiszący 3'-koniec o długości do sześciu nukleotydów. Także, jeżeli obie nici dsRNA mają długość dokładnie 21- lub 22-nt, możliwe jest obserwowanie pewnej interferencji RNA gdy oba końce są tępe (0 nt w jednoniciowym wiszącym 3' końcu). Cząsteczka RNA jest korzystnie syntetyczną cząsteczką RNA zasadniczo wolną od zanieczyszczeń występujących w ekstraktach komórkowych,

PL 218 876 B1 np. z embrionów Drosophila. Ponadto cząsteczka RNA jest korzystnie zasadniczo wolna od jakichkolwiek nie miejscowo specyficznych zanieczyszczeń, w szczególności nie miejscowo specyficznych cząsteczek RNA np. od zanieczyszczeń występujących w ekstraktach komórkowych.

Wyizolowane cząsteczki dwuniciowego RNA, w których każda nić RNA ma długość 19 - 23 nukleotydów, oraz w których co najmniej jedna nić ma jednoniciowy wiszący 3'-koniec o długości 1 - 3 nukleotydów, stosuje się do kierowania RNAi, w komorkach ssaczych, w szczególności w komórkach ludzkich.

Nieoczekiwanie stwierdzono, że syntetyczne krótkie cząsteczki dwuniciowego RNA, z jednoniciowym wiszącym 3'-końcem, są specyficznymi względem sekwencji mediatorami RNAi i pośredniczą w wydajnym rozszczepianiu docelowego RNA, przy czym miejsce rozszczepienia jest umiejscowione w pobliżu środka regionu obejmującego krótki kierujący RNA.

Korzystnie każda nić cząsteczki RNA ma długość 20 - 22 nukleotydów (lub 20 - 23 nukleotydów w komórkach ssaczych), przy czym długość każdej nici może być taka sama lub różna. Długość jednoniciowego wiszącego 3'-końca wynosi 1-3 nukleotydy, przy czym długość jednoniciowego wiszącego końca może być taka sama lub różna dla każdej nici. Nici RNA korzystnie zawierają grupy 3'-hydroksylowe. Na 5'-końcu korzystnie znajduje się grupa fosforanowa, difosforanowa, trifosforanowa lub hydroksylowa. Najskuteczniejsze dsRNA składają się z dwu nici 21-nt, które są sparowane tak, że 1 - 3, w szczególności 2-nt jednoniciowe wiszące 3'-końce są obecne na obu końcach dsRNA.

Reakcja rozszczepiania docelowego RNA kierowana przez siRNA jest wysoce specyficzna względem sekwencji. Jednakże, nie wszystkie pozycje siRNA w równym stopniu uczestniczą w rozpoznawaniu docelowego RNA. Błędnie sparowane zasady w centrum dupleksu siRNA mają decydujące znaczenie i zasadniczo znoszą rozszczepianie docelowego RNA. W odróżnieniu od tego, 3' nukleotyd nici siRNA (np. pozycja 21), który jest komplementarny do jednoniciowego docelowego RNA, nie wpływa na specyficzność rozpoznania docelowego RNA. Ponadto sekwencja niesparowanego 2-nt jednoniciowego wiszącego 3'-końca nici siRNA o tej samej polarności, co docelowy RNA, nie jest wymagana do rozszczepiania docelowego RNA, gdyż tylko antysensowna nić siRNA pośredniczy w rozpoznaniu docelowego RNA. Zatem z nukleotydów jednoniciowego wiszącego końca tylko przedostatnia pozycja antysensownego siRNA (np. pozycja 20) wymaga dopasowania z docelowym sensownym mRNA.

Nieoczekiwanie, cząsteczki dwuniciowego RNA według wynalazku wykazują wysoką stabilność in vivo w surowicy lub w podłożu hodowlanym dla hodowli komórkowych. W celu dalszego wzmocnienia stabilności, jednoniciowe wiszące 3'-końce można stabilizować przed degradacją, np. można je wybrać tak, by składały się one z nukleotydów purynowych, w szczególności nukleotydów adenozynowych lub guanozynowych. Alternatywnie, podstawienie nukleotydów pirymidynowych zmodyfikowanymi analogami, np. podstawienie urydyny w 2-nt jednoniciowych wiszących 3'-końcach 2'-deoksytymidyną jest tolerowane i nie wpływa na wydajność interferencji RNA. Brak grupy 2'-hydroksylowej w istotny sposób zwiększa odporność na nukleazę jednoniciowego końca w podłożu do hodowli tkankowych.

Jak podano powyżej, cząsteczka RNA może zawierać co najmniej jeden zmodyfikowany analog nukleotydu. Analogi nukleotydu mogą być umiejscowione w pozycjach, w których nie wpływa to zasadniczo na miejscowo specyficzną aktywność, np. aktywność kierującą RNAi, np. w regionie 5'-końca i/lub 3'-końca cząsteczki dwuniciowego RNA. W szczególności jednoniciowe wiszące końce mogą być stabilizowane przez wprowadzenie analogów nukleotydów.

Korzystne analogi nukleotydów wybiera się spośród rybonukleotydów ze zmodyfikowaną resztą cukrową lub szkieletem. Należy zauważyć, że odpowiednie są także rybonukleotydy ze zmodyfikowaną zasadą nukleinową, tj. rybonukleotydy zawierające nie występującą naturalnie zasadę nukleinową zamiast naturalnie występującej zasady nukleinowej, takie jak urydyny lub cytydyny zmodyfikowane w pozycji 5, np. 5-(2-amino)propylourydyna, 5-bromourydyna; adenozyny i guanozyny zmodyfikowane w pozycji 8, np. 8-bromoguanozyna; deazanukleotydy, np. 7-deazaadenozyna; O- i N-alkilowane nukleotydy, np. N6-metyloadenozyna. W korzystnych rybonukleotydach ze zmodyfikowaną resztą cukrową grupa 2'-OH jest zastąpiona grupą wybraną spośród H, OR, R, atomu chlorowca, SH, SR, NH2, NHR, NR2 i CN, przy czym R oznacza C1-C6 alkil, C1-C6 alkenyl lub C1-C6 alkinyl, a atom chlorowca oznacza F, Cl, Br lub I. W korzystnych rybonukleotydach ze zmodyfikowanym szkieletem grupa fosfoestrowa łącząca przyległe rybonukleotydy jest zastąpiona zmodyfikowaną grupą, np. grupą tiofosforanową. Należy zauważyć, że powyższe modyfikacje mogą być połączone.

PL 218 876 B1

Sekwencja cząsteczki dwuniciowego RNA według wynalazku wykazuje wystarczającą identyczność z docelową cząsteczką kwasu nukleinowego aby kierowała ona miejscowo specyficzną RNAi. Korzystnie sekwencja wykazuje co najmniej 70% identyczność z wymaganą docelową cząsteczką w dwuniciowej części cząsteczki RNA. Korzystniej identyczność wynosi co najmniej 85%, a najkorzystniej 100% w dwuniciowej części cząsteczki RNA. Identyczność cząsteczki dwuniciowego RNA z wyznaczoną wcześniej docelową cząsteczką kwasu nukleinowego, np. docelową cząsteczką mRNA, można wyznaczyć w następujący sposób.

I = - x 100

L gdzie I oznacza procent identyczności, n oznacza liczbę identycznych nukleotydów w dwuniciowej części dsRNA i docelowej sekwencji, a L oznacza długość pokrywających się sekwencji dwuniciowej części dsRNA i docelowej sekwencji.

Alternatywnie identyczność cząsteczki dwuniciowego RNA z docelową sekwencją można także zdefiniować z uwzględnieniem jednoniciowych wiszących 3'-końców, w szczególności jednoniciowego wiszącego końca o długości 1-3 nukleotydów. W tym przypadku identyczność sekwencji z sekwencją docelową wynosi co najmniej 70%, a korzystniej co najmniej 85%. Przykładowo, nukleotydy od jednoniciowego wiszącego 3'-końca oraz do 2 nukleotydów z 5'- i/lub 3'-końca dwuniciowego fragmentu mogą być zmodyfikowane bez istotnej utraty aktywności.

Cząsteczkę dwuniciowego RNA według wynalazku można wytwarzać sposobem obejmującym etapy:

(a) syntezy dwu nici RNA, każdej o długości 19-23 nukleotydów, a ponadto co najmniej jedna nić ma wiszący jednoniciowy 3'-koniec o długości 1-3 nukleotydów, przy czym te nici RNA są zdolne do utworzenia cząsteczki dwuniciowego RNA, (b) połączenia zsyntetyzowanych nici RNA w warunkach, w których tworzona jest cząsteczka dwuniciowego RNA, która jest zdolna do pośredniczenia w miejscowo specyficznej interferencji RNA.

Sposoby syntezy cząsteczek RNA są znane. W tym kontekście odnoszą się one szczególnie do metod syntezy chemicznej opisanych w Verma i Eckstein (1998).

Jednoniciowe RNA można także wytwarzać przez enzymatyczną transkrypcję z syntetycznych matryc DNA lub z plazmidów DNA wyizolowanych ze zrekombinowanych bakterii. Zazwyczaj stosuje się fagowe polimerazy RNA, takie jak polimeraza RNA T7, T3 lub SP6 (Milligan i Uhlenbeck (1989)).

Jak podano powyżej, sposób in vitro kierowania miejscowo specyficznymi interferencjami RNA w komórce, polega na tym, że:

(a) kontaktuje się komórkę z cząsteczką dwuniciowego RNA według wynalazku w warunkach, w których mogą wystąpić miejscowo specyficzne interferencje RNA oraz (b) kieruje się miejscowo specyficzną interferencją RNA wywołaną przez dwuniciowy RNA na docelowym kwasie nukleinowym mającym część sekwencji zasadniczo odpowiadającą dwuniciowemu RNA.

Korzystnie etap kontaktowania (a) obejmuje wprowadzenie cząsteczki dwuniciowego RNA do docelowej komórki, np. wyizolowanej komórki docelowej, np. w hodowli komórkowej, do organizmu jednokomórkowego lub komórki docelowej lub większej liczby komórek docelowych w organizmie wielokomórkowym. Korzystniej, etap wprowadzenia obejmuje dostarczanie z użyciem nośnika, np. przez nośniki liposomowe, albo przez iniekcję.

Sposób in vitro według wynalazku można stosować do ustalania funkcji genu w komórce lub organizmie lub nawet do modulowania funkcji genu w komórce lub organizmie, przez zdolność pośredniczenia w interferencji RNA. Komórka jest korzystnie komórką eukariotyczną lub linią komórkową, np. komórką roślinną lub komórką zwierzęcą, taką jak ssacza komórka, np. komórka embrionalna, macierzysta komórka pluripotentna, komórka nowotworowa, np. komórka potworniaka złośliwego lub komórka zakażona wirusem. Organizm jest korzystnie organizmem eukariotycznym, np. rośliną lub zwierzęciem, takim jak ssak, w szczególności człowiek.

Docelowy gen, do którego skierowana jest cząsteczka RNA według wynalazku, może być związany ze stanem patologicznym. Przykładowo, gen może być genem związanym z patogenem, np. genem wirusowym, genem związanym z nowotworem lub genem związanym z chorobą autoimmunologiczną. Docelowy gen może także być genem heterologicznym wyrażanym w zrekombinowanej komórce lub genetycznie zmienionym organizmie. Przez ustalenie lub modulację, w szczególności zahamowanie działania takiego genu, można uzyskać cenne informacje oraz korzyści terapeutyczne w dziedzinie rolnictwa lub medycyny albo weterynarii.

PL 218 876 B1 dsRNA zazwyczaj podaje się jako środek farmaceutyczny. Podawanie można prowadzić znanymi sposobami, w których kwas nukleinowy wprowadza się do żądanej komórki docelowej in vitro lub in vivo. Często stosowane techniki transferu obejmują zastosowanie fosforanu wapnia, DEAEdekstranu, elektroporację oraz mikroiniekcję i metody wirusowe (Graham, F. L. i van der Eb, A. J. (1973) Virol. 52, 456; McCutchan, J. H. i Pagano, J. S. (1968), J. Natl. Cancer Inst. 41, 351; Chu, G. i in. (1987), Nucl. Acids Res. 15, 1311; Fraley, R. i in. (1980), J. Biol. Chem. 255, 10431; Capecchi, M. R. (1980), Cell 22, 479). Niedawnym dodatkiem do tego arsenału technik wprowadzania DNA do komórek jest zastosowanie kationowych liposomów (Felgner, P. L. i in. (1987), Proc. Natl. Acad. Sci USA 84, 7413). Dostępnymi w handlu preparatami kationowych lipidów są np. Tfx 50 (Promega) lub Lipofectamin 2000 (Life Technologies).

Jak podano powyżej, środek farmaceutyczny zawiera jako substancję czynną co najmniej jedną cząsteczkę dwuniciowego RNA, jak opisano powyżej, oraz nośnik farmaceutyczny. Środek można stosować w celach diagnostycznych i terapeutycznych w medycynie ludzi oraz w weterynarii.

Do zastosowań diagnostycznych i terapeutycznych, środek może być w postaci roztworu, np. roztworu do iniekcji, kremu, maści, tabletki, zawiesiny, itp. Środek można podawać w jakikolwiek odpowiedni sposób, np. drogą iniekcji, doustnie, miejscowo, donosowo, doodbytniczo, itp. Nośnikiem może być jakikolwiek odpowiedni nośnik farmaceutyczny. Korzystnie, stosuje się nośnik, który jest zdolny do zwiększenia wydajności wchodzenia cząsteczek RNA do komórek docelowych. Odpowiednimi przykładami takich nośników są liposomy, w szczególności kationowe liposomy. Kolejny korzystny sposób podawania stanowi iniekcja.

Kolejnym korzystnym zastosowaniem sposobu RNAi jest funkcjonalna analiza komórek eukariotycznych lub organizmów eukariotycznych, z wyjątkiem ludzi, korzystnie ssaczych komórek lub organizmów, a najkorzystniej komórek ludzkich, np. linii komórkowych, takich jak HeLa lub 293, albo gryzoni, np. szczurów i myszy. Przez transfekcję odpowiednich cząsteczek dwuniciowego RNA, które są homologiczne do wcześniej wyznaczonego genu docelowego lub cząsteczek DNA kodujących odpowiednią cząsteczkę dwuniciowego RNA, można uzyskać specyficzny fenotyp nokaut w komórce docelowej, np. w hodowli komórkowej lub w organizmie docelowym. Nieoczekiwanie stwierdzono, że obecność krótkich cząsteczek dwuniciowego RNA nie wywołuje odpowiedzi interferonowej z komórki gospodarza lub organizmu gospodarza.

Komórka eukariotyczna według wynalazku wykazuje fenotyp nokaut specyficzny dla docelowego genu, obejmujący co najmniej częściowy niedobór ekspresji co najmniej jednego endogennego genu docelowego, przy czym ta komórka jest transfekowana co najmniej jedną cząsteczką dwuniciowego RNA, zdolną do hamowania ekspresji co najmniej jednego endogennego docelowego genu, lub DNA kodującym co najmniej jedną cząsteczkę dwuniciowego RNA zdolną do hamowania ekspresji co najmniej jednego endogennego docelowego genu. Należy podkreślić, że wynalazek pozwala na miejscowo specyficzny nokaut kilku różnych endogennych genów ze względu na specyficzność RNAi.

Genowo specyficzne znokautowane fenotypy komórek, w szczególności komórek ludzkich, można stosować w procedurach analitycznych, np. w funkcjonalnej i/lub fenotypowej analizie złożonych procesów fizjologicznych, takich jak analiza profili ekspresji genów i/lub proteomów. Przykładowo, można otrzymać znokautowane fenotypy ludzkich genów w hodowlach komórkowych, co do których uważa się, że są regulatorami procesu alternatywnego składania. Pośród tych genów są szczególnie członkowie rodziny czynnika splicingowego SR, np. ASF/SF2, SC35, SRp20, SRp40 lub SRp55. Ponadto, można analizować wpływ białek SR na profile mRNA wcześniej ustalonych alternatywnie złożonych genów, takich jak CD44. Korzystnie analizę prowadzi się metodami o dużej rozdzielczości stosując chipy oparte na oligonukleotydach.

Przy zastosowaniu technologii nokaut opartych na RNAi, można zahamować ekspresję endogennego genu docelowego w komórce docelowej lub organizmie docelowym. Endogenny gen może zostać skomplementowany przez egzogenny docelowy kwas nukleinowy kodujący docelowe białko lub wariant albo zmutowaną postać docelowego białka, np. gen lub cDNA, który może być dodatkowo zfuzowany z kolejną sekwencją kwasu nukleinowego kodującą wykrywalny peptyd lub polipeptyd, np. znacznik powinowactwa, w szczególności wielokrotny znacznik powinowactwa. Warianty lub zmutowane postacie docelowego genu różnią się od endogennego docelowego genu tym, że kodują one produkt genu, który różni się od endogennego produktu genu na poziomie aminokwasowym przez podstawienia, insercje i/lub delecje jednego lub większej liczby aminokwasów. Warianty lub zmutowane postacie mogą mieć taką samą aktywność biologiczną jak endogenny gen docelowy. Z drugiej strony, wariant lub zmutowany gen docelowy może także wykazywać aktywność biologiczną, która

PL 218 876 B1 różni się od aktywności biologicznej endogennego genu docelowego, np. częściowo zniesioną aktywność, całkowicie zniesioną aktywność lub podwyższoną aktywność itd.

Komplementację można osiągnąć przez koekspresję polipeptydu kodowanego przez egzogenny kwas nukleinowy, np. białka fuzyjnego zawierającego białko docelowe i znacznik powinowactwa oraz cząsteczki dwuniciowego RNA w celu nokautu endogennego genu w komórce docelowej. Taką koekspresję można osiągnąć przez zastosowanie odpowiedniego wektora ekspresyjnego, wyrażającego zarówno polipeptyd kodowany przez egzogenny kwas nukleinowy, np. białko docelowe zmodyfikowane znacznikiem, jak i cząsteczkę dwuniciowego RNA, albo wariantowo przez zastosowanie połączenia wektorów ekspresyjnych. Białka i kompleksy białkowe, które są syntetyzowane de novo w komórce docelowej, będą zawierać produkt egzogennego genu, np. zmodyfikowane białko fuzyjne. Aby zapobiec tłumieniu ekspresji produktu egzogennego genu przez cząsteczkę dupleksową RNAi, sekwencja nukleotydowa kodująca egzogenny kwas nukleinowy może zostać zmieniona na poziomie DNA (z lub bez wywoływania mutacji na poziomie aminokwasowym) w części sekwencji, która jest homologiczna z cząsteczką dwuniciowego RNA. Alternatywnie, endogenny gen docelowy może zostać skomplementowany przez odpowiednie sekwencje nukleotydowe z innych gatunków, np. z myszy.

Korzystnym zastosowaniem dla komórki według wynalazku jest analiza profili ekspresji genów i/lub proteomów. W szczególnie korzystnej postaci prowadzi się analizę wariantu lub zmutowanej postaci jednego lub kilku docelowych białek, przy czym te warianty lub zmutowane postacie ponownie wprowadza się do komórki przez egzogenny docelowy kwas nukleinowy, jak opisano powyżej. Połączenie nokautu endogennego genu i ratunku przez zastosowanie zmutowanego, np. częściowo wydeletowanego egzogennego docelowego kwasu nukleinowego ma zalety w porównaniu z zastosowaniem komórki nokaut. Sposób ten jest ponadto szczególnie odpowiedni do identyfikacji funkcjonalnych domen docelowego białka. W kolejnej korzystnej postaci przeprowadza się porównanie, np. profili ekspresji genów i/lub proteomów i/lub charakterystyki fenotypowej co najmniej dwóch komórek wybranych spośród:

(i) kontrolnej komórki bez zahamowania docelowego genu, (ii) komórki z zahamowaniem docelowego genu oraz (iii) komórki z zahamowaniem docelowego genu oraz komplementacją genu docelowego przez egzogenny docelowy kwas nukleinowy.

Sposób i komórka według wynalazku są także odpowiednie w procedurze identyfikacji i/lub charakteryzacji środków farmakologicznych, np. identyfikacji nowych środków farmakologicznych ze zbioru badanych substancji i/lub charakteryzacji mechanizmów działania i/lub skutków ubocznych znanych środków farmakologicznych.

Ponadto metodę nokautu komplementacji RNA można stosować do celów preparatywnych, np. do oczyszczania przez powinowactwo białek lub kompleksów białkowych z komórek eukariotycznych, w szczególności komórek ssaczych, a zwłaszcza komórek ludzkich. W tej postaci wynalazku, egozgenny docelowy kwas nukleinowy korzystnie koduje białko docelowe, które jest zfuzowane ze znacznikiem powinowactwa.

Metodę preparatywną można stosować do oczyszczania kompleksów białkowych o dużej masie cząsteczkowej, które korzystnie mają masę > 150 kD, korzystniej > 500 kD, oraz które ewentualnie mogą zawierać kwasy nukleinowe, takie jak RNA. Konkretne przykłady stanowi heterotrimeryczny kompleks białkowy składający się z białek 20 kD, 60 kD i 90 kD cząstki U4/U6 snRNP, czynnik składania SF3b z 17S U2 snRNP składający się z pięciu białek o masach cząsteczkowych 14, 49, 120, 145 i 155 kD oraz cząstka tri-snRNP 25S U4/U6/U5, zawierająca cząsteczki U4, U5 i U6 snRNA, oraz około 30 białek, które mają masę cząsteczkową około 1,7 MD.

Metoda ta jest odpowiednia do funkcjonalnej analizy proteomu w komórkach ssaczych, w szczególności w komórkach ludzkich.

Wynalazek jest dokładniej wyjaśniony na poniższych figurach i w przykładach.

Opisy figur

Figura 1: Dwuniciowy RNA o zaledwie 38 pz może kierować RNAi (A) Graficzne przedstawienie dsRNA stosowanego do skierowania do Pp-luc mRNA. Otrzymano trzy serie dsRNA o tępych końcach pokrywających zakres 29-504 pz. Pozycję pierwszego nukleotydu w nici sensownej dsRNA wskazano względem kodonu start Pp-luc mRNA (p1).

(B) Test interferencji RNA (Tuschl i in., 1999). Stosunek aktywności docelowej Pp-luc do kontrolnej Rr-luc normalizowano względem kontrolnego buforu (czarny słupek). DsRNA (5 nM) wstępnie inkubowano w lizacie Drosophila przez 15 minut w 25°C przed dodaniem mRNA Pp-luc i Rr-luc z czaPL 218 876 B1 peczką z 7-metyloguanozyny (~50 pM). Inkubację kontynuowano przez kolejną godzinę, a następnie analizowano za pomocą podwójnego testu lucyferazy (Promega). Dane stanowią średnie z co najmniej czterech niezależnych doświadczeń ± odchylenie standardowe.

Figura 2: dsRNA o długości 29 pz nie ulega obróbce do 21- do 23-nt fragmentów

Przebieg w czasie powstawania 21- do 23-meru przez obróbkę wewnętrznie znakowanych ³²P dsRNA (5 nM) w lizacie Drosophila. Wskazano długość i źródło dsRNA. Znacznik wielkości RNA (M) naniesiono w lewej ścieżce i wskazano wielkości fragmentów. Podwójne prążki w czasie zero wynikają z niecałkowicie zdenaturowanego dsRNA.

Figura 3: Krótkie dsRNA rozszczepiają docelowy mRNA tylko raz (A) Elektroforeza na żelu denaturującym stabilnych 5' produktów rozszczepiania wytworzonych w ciągu 1 godzinnej inkubacji 10 nM sensownego lub antysensownego RNA znakowanego w cza32 peczce ³²P z użyciem 10 nM dsRNA serii p133 w lizacie Drosophila. Znaczniki długości wytworzono przez częściowe trawienie nukleazą T1 i częściową hydrolizę zasadową (OH) znakowanego w czapeczce RNA. Regiony do których skierowano dsRNA wskazano przez czarne paski na obu stronach. Wskazano 20- do 23-nt rozdzielające dominujące miejsca rozszczepiania dla dsRNA o długości 111 pz. Pozioma strzałka wskazuje niespecyficzne rozszczepianie nie wynikające z RNAi.

(B) Pozycja miejsc rozszczepiania na sensownym i antysensownym docelowym RNA. Sekwencje 177-nt sensownych i 180-nt antysensownych docelowych RNA z czapeczką przedstawiono w antyrównoległej orientacji, tak, że sekwencje komplementarne są naprzeciw siebie. Regiony, do których były skierowane różne dsRNA, wskazano jako słupki o różnej barwie, umiejscowione pomiędzy seksowną i antysensowną sekwencją docelową. Miejsca rozszczepiania wskazano kółkami: duże kółka dla silnego rozszczepiania, małe kółka dla słabego rozszczepiania. Grupę fosforanową znakowaną 32 radioaktywnie ³²P wskazano gwiazdką.

Figura 4: Fragmenty RNA o długości 21- i 22-nt wytwarza się według mechanizmu podobnego do działania RNazy III (A) Sekwencje RNA o długości ~21-nt po obróbce dsRNA.

Fragmenty RNA o długości ~21-nt wytworzone przez obróbkę dsRNA bezpośrednio sklonowano i zsekwencjonowano. Oligorybonukleotydy pochodzące z nici sensownej dsRNA wskazano jako niebieskie linie, pochodzące z nici antysensownej wskazano jako czerwone linie. Grube słupki zastosowano, gdy te same sekwencje były obecne w wielu klonach, a numer po prawej stronie wskazuje częstość. Miejsca rozszczepiania docelowego RNA kierowanego przez dsRNA wskazano jako pomarańczowe kółka, duże kółka dla silnego rozszczepiania, małe kółka dla słabego rozszczepiania (patrz fig. 3B). Kółka na górze nici sensownej oznaczają miejsca rozszczepiania w sensownej nici docelowej, a kółka na dole dsRNA wskazują miejsca rozszczepiania w antysensownej nici docelowej. W ~21-nt fragmentach pochodzących z 3'-końców dsRNA zidentyfikowano do pięciu dodatkowych nukleotydów. Nukleotydy te były losowymi kombinacjami głównie reszt C, G lub A i najprawdopodobniej zostały dodane w sposób niezależny od matrycy podczas transkrypcji T7 nici stanowiących dsRNA.

(B) Dwuwymiarowa analiza TLC składu nukleotydowego ~21-nt RNA. ~21-nt RNA wytworzono przez inkubację wewnętrznie znakowanego radioaktywnie dsRNA Pp-luc o długości 504 pz w lizacie

Drosophila, oczyszczono na żelu, a następnie strawiono do mononukleotydów z użyciem nukleazy P1 (górny rząd) lub rybonukleazy T2 (dolny rząd). dsRNA był wewnętrznie znakowany radioaktywnie 32 przez transkrypcję w obecności jednego ze wskazanych a- p trifosforanów nukleozydów. Radioaktywność wykrywano metodą luminescencyjnego obrazowania. 5'-Monofosforany nukleozydów, 3'-monofosforany nukleozydów, 5',3'-difosforany nukleozydów oraz nieorganiczny fosforan wskazano odpowiednio jako pN, Np, pNp, i pi. Czarne kółka wskazują plamy absorbujące w UV z nie radioaktywnych nukleotydów nośnikowych. 3',5'-Bisfosforany (czerwone kółka) zidentyfikowano przez wspólną migrację ze znakowanymi radioaktywnie wzorcami otrzymanymi przez 5'-fosforylację 3'-mono-fosforanów nukleozydów kinazą polinukleotydową T4 i γ^- p-ATP.

Figura 5: Syntetyczne RNA o długości 21- i 22-nt pośredniczą w rozszczepianiu docelowego

RNA (A) Graficzne przedstawienie kontrolnego dsRNA o długości 52 pz i syntetycznych dsRNA o długości 21- i 22-nt. Nić sensowną krótkich interferujących RNA (siRNA) o długości 21 i 22-nt zaznaczono na niebiesko, a nić antysensowną na czerwono. Sekwencje siRNA wyprowadzono ze sklonowanych fragmentów dsRNA o długości 52 i 111 pz (fig. 4A), z wyjątkiem antysensownej nici o długości 22 nt dupleksu 5. siRNA w dupleksie 6 i 7 były unikalne dla reakcji obróbki dsRNA o długości 111 pz. Dwa nukleotydy wiszące w postaci jednoniciowego 3'-końca zaznaczone na zielono są obecne

PL 218 876 B1 w sekwencjach syntetycznych nici antysensownych dupleksów 1 i 3. Obie nici kontrolnego dsRNA o długości 52 pz otrzymano przez transkrypcję in vitro i frakcja transkryptów może zawierać nie zależną od matrycy addycję nukleotydu na 3'-końcu. Miejsca rozszczepiania docelowego. RNA kierowanego przez dupleksy siRNA wskazano jako pomarańczowe kółka (patrz legenda do fig. 4A) i wyznaczono je w sposób przedstawiony na fig. 5B.

(B) Pozycja miejsc rozszczepiania na sensownym i antysensownym docelowym RNA. Docelowe sekwencje RNA opisano jak na fig. 3B. Kontrolny dsRNA o długości 52 pz (10 nM) lub dupleksy RNA 1-7 o długości 21 i 22 nt (100 nM) inkubowano z docelowym RNA przez 2,5 godziny w 25°C w lizacie Drosophila. Stabilne 5'-produkty rozszczepiania rozdzielono na żelu. Miejsca rozszczepiania wskazano na fig. 5A. Region, do którego skierowany był dsRNA o długości 52 pz albo sensowna (s) lub antysensowna (as) nić, zaznaczono jako czarne słupki z boku żelu. Wszystkie miejsca rozszczepiania są zlokalizowane w regionie identyczności dsRNA. Do precyzyjnego wyznaczenia miejsc rozszczepiania nici antysensownej zastosowano żel o niższym stężeniu procentowym.

Fig. 6: Długie jednoniciowe wiszące 3'-końce na krótkich dsRNA hamują RNAi (A) Graficzne przedstawienie konstruktów dsRNA o długości 52 pz. Wydłużenia 3'-końca nici sensownej i antysensownej zaznaczono odpowiednio kolorem niebieskim i czerwonym. Obserwowane miejsca rozszczepiania na docelowych RNA przedstawiono jako pomarańczowe kółka analogicznie do fig. 4A, przy czym wyznaczono je jak pokazano na fig. 6B.

(B) Pozycja miejsc rozszczepiania na sensownym i antysensownym docelowym RNA. Docelowe sekwencje RNA opisano jak na fig. 3B. DsRNA (10 nM) inkubowano z docelowym RNA przez

2,5 godziny w 25°C w lizacie Drosophila. Stabilne 5'-produkty rozszczepiania rozdzielono na żelu. Główne miejsca rozszczepiania wskazano poziomą strzałką oraz przedstawiono je także na fig. 6A. Region, do którego skierowany był dsRNA o długości 52 pz wskazano jako czarne słupki po obu stronach żelu.

Figura 7: Proponowany model RNAi

Przewiduje się, że RNAi zaczyna się od obróbki dsRNA (nić sensowna na czarno, nić antysensowna na czerwono) głównie do krótkich interferujących RNA (siRNA) o długości 21 i 22 nt. Krótkie jednoniciowe wiszące 3'-końcowe nukleotydy, gdy są obecne na dsRNA, mogą być korzystne dla obróbki krótkich dsRNA. Białka obróbki dsRNA, które nie zostały scharakteryzowane, przedstawiono jako zielone i niebieskie owalne kształty i są one złożone na dsRNA w sposób asymetryczny. W tym modelu, jest to zilustrowane przez wiązanie hipotetycznego niebieskiego białka lub domeny białkowej z nicią siRNA w kierunku 3' do 5', podczas gdy hipotetyczne zielone białko lub domena białkowa zawsze jest związana z przeciwległą nicią siRNA. Te białka lub podzestawy pozostają związane z dupleksem siRNA i zabezpieczają jego orientację wyznaczoną przez kierunek reakcji obróbki dsRNA. Tylko sekwencja siRNA związana z niebieskim białkiem jest zdolna do kierowania rozszczepianiem docelowego RNA. Kompleks endonukleazowy jest określany jako kompleks małej interferującej rybonukleoproteiny lub siRNP. Przypuszcza się tutaj, że endonukleaza rozszczepiająca dsRNA może także rozszczepić docelowy RNA, prawdopodobnie przez tymczasowe przemieszczenie biernej nici siRNA nie wykorzystywanej do rozpoznania docelowej sekwencji. Następnie docelowy RNA jest rozszczepiany w centrum rozpoznanego regionu przez komplementarny do sekwencji kierujący siRNA.

Figura 8: Konstrukty reporterowe i dupleksy siRNA (a) Przedstawiono regiony genów reporterowych lucyferazy ze świetlika (Photinus pyralis) (Ppluc) lub Renilla reniformis (Rr-luc) z plazmidów pGL2-Control, pGL-3-Control i pRL-TK (Promega). Wskazano elementy regulatorowe SV40, promotor kinazy tymidynowej HSV oraz dwa introny (linie). Sekwencja lucyferazy GL3 jest w 95% identyczna z GL2, ale RL jest całkowicie niepodobna do obydwu z nich. Ekspresja lucyferazy z pGL2 jest około dziesięciokrotnie niższa niż z pGL3 w transfekowanych komórkach ssaczych. Region do którego skierowane były dupleksy siRNA wskazano jako czarny słupek poniżej regionu kodującego genów lucyferazy.

(b) Przedstawiono sekwencje sensowną (górna) i antysensowną (dolna) dupleksów siRNA skierowanych do GL2, GL3 i RL lucyferazy. Dupleksy GL2 i GL3 siRNA różnią się tylko trzema jednonukleotydowymi podstawieniami (zaznaczonymi na szaro). W celu niespecyficznej kontroli zsyntetyzowano dupleks z odwróconą sekwencją GL2, invGL2. Dwunukleotydowy jednoniciowy wiszący 3'-koniec 2'-deoksytymidyny wskazano jako TT; uGL2 jest podobna do GL2 siRNA, ale zawiera rybourydynowe jednoniciowe wiszące 3'-końce.

PL 218 876 B1

Figura 9: Interferencja RNA przez dupleksy siRNA

Stosunek docelowej do kontrolnej lucyferazy normalizowano względem kontroli buforowej (bu, czarne słupki); szare słupki wskazują stosunek lucyferazy Photinus pyralis (Pp-luc) GL2 lub GL3 do lucyferazy Renilla reniformis (Rr-luc) RL (lewa oś), białe słupki wskazują stosunek RL do GL2 lub GL3 (prawa oś). Panele a, c, e, g oraz i opisują doświadczenia przeprowadzone z połączeniem plazmidów reporterowych pGL2-Control i pRL-TK, panele b, d, f, h oraz j z plazmidami reporterowymi pGL3Control i pRL-TK. Linię komórkową zastosowaną do doświadczenia interferencji wskazano na górze każdego wykresu. Stosunki Pp-luc/Rr-luc dla kontroli buforowej (bu) wahały się odpowiednio pomiędzy 0,5 a 10 dla pGL2/pRL oraz pomiędzy 0,03 a 1 dla pGL3/pRL, przed normalizacją oraz pomiędzy różnymi badanymi liniami komórkowymi. Wykreślone dane są średnią z trzech niezależnych doświadczeń ± S.D.

Figura 10: Wpływ 21-nt siRNA, 50-pz i 500-pz dsRNA na ekspresję lucyferazy w komórkach

HeLa

Dokładną długość długich dsRNA wskazano poniżej słupków. Panele a, c i e opisują doświadczenia wykonane z plazmidami reporterowymi pGL2-Control i pRL-TK, panele b, d i f z plazmidami reporterowymi pGL3-Control i pRL-TK. Dane są średnią z dwóch niezależnych doświadczeń ± S.D. (a), (b) Absolutna ekspresja Pp-luc, wykreślona w jednostkach umownych luminescencji (skrót j.u.).

(c), (d) ekspresja Rr-luc, wykreślona w arbitralnych jednostkach luminescencji. (e), (f) Stosunek normalizowanej docelowej do kontrolnej lucyferazy. Stosunki aktywności lucyferazy dla dupleksów siRNA normalizowano względem kontroli buforowej (bu, czarne słupki); stosunki luminescencji dla 50- lub 500-pz dsRNA normalizowano względem odpowiednich stosunków obserwowanych dla 50- i 500-pz dsRNA z humanizowanym GFP (hG, czarne słupki). Należy podkreślić, że ogólne różnice sekwencji dsRNA o długości pomiędzy 49 a 484 pz skierowanych do GL2 i GL3 są niewystarczające do nadania specyficzności pomiędzy celami GL2 i GL3 (43-nt nieprzerwana identyczność w segmencie 49 pz, 239-nt najdłuższa nieprzerwana identyczność w segmencie 484 pz).

Figura 11: Zmienność jednoniciowych wiszących 3'-końców w dupleksach 21-nt siRNA (A) Zarys strategii doświadczalnej. Przedstawiono sensowny docelowy mRNA z czapeczką i poliadenylowany oraz przedstawiono względne pozycje sensownych i antysensownych siRNA. Otrzymano osiem serii dupleksów, zgodnie z ośmioma różnymi nićmi antysensownymi. Sekwencje siRNA oraz liczbę nukleotydów jednoniciowego wiszącego końca zmieniano w etapach jednonukleotydowych. (B) Normalizowana względna luminescencja docelowej lucyferazy (Photinus pyralis, Pp-luc) do kontrolnej lucyferazy (Renilla reniformis, Rr-luc) w lizacie embrionów D. melanogaster w obecności 5 nM dsRNA o tępych końcach. Stosunki luminescencji wyznaczone w obecności dsRNA normalizowano względem stosunku uzyskanego dla kontroli buforowej (bu, czarny słupek). Normalizowane stosunki niższe niż 1 wskazują specyficzną interferencję. (C-J) Normalizowane stosunki interferencji dla ośmiu serii 21-nt dupleksów siRNA. Sekwencję dupleksów siRNA przedstawiono powyżej wykresów słupkowych. Każdy wykres przedstawia stosunek interferencji dla zestawu dupleksów utworzonych przed dany wiodący antysensowny siRNA i 5 różnych sensownych siRNA. Liczbę nukleotydów jednoniciowego wiszącego końca (jednoniciowy wiszący 3'-koniec, liczby dodatnie; jednoniciowy wiszący 5'-ko-niec, liczby ujemne) wskazano na osi x. Punkty danych są średnią z co najmniej trzech niezależnych doświadczeń, słupki błędów przedstawiają odchylenia standardowe.

Figura 12: Zmienność długości nici sensownej w dupleksach siRNA (A) Graficzne przedstawienie doświadczenia. Trzy antysensowne nici o długości 21 nt sparowano z ośmioma sensownymi siRNA. siRNA różniły się długością na 3'-końcu. Jednoniciowy wiszący 3'-koniec antysensownego siRNA miał długość 1 nt (B), 2 nt (C) lub 3 nt (D), podczas gdy jednoniciowy wiszący koniec sensownego siRNA różnił się dla każdej serii. Wskazano sekwencje dupleksów siRNA i odpowiadające im stosunki interferencji.

Figura 13: Zmienność długości dupleksów siRNA z zachowanymi dwunukleotydowymi jednoniciowymi wiszącymi 3'-końcami (A) Graficzne przedstawienie doświadczenia. Dupleks siRNA o długości 21-nt ma sekwencję identyczną do przedstawionej na fig. 11H lub 12C. Dupleksy siRNA były wydłużone na 3'-stronie sensownego siRNA (B) lub 5'-stronie sensownego siRNA (C). Wskazano sekwencje dupleksów siRNA i odpowiadające im stosunki interferencji.

Figura 14: Podstawienie grup 2'-hydroksylowych reszt rybozy w siRNA

PL 218 876 B1

Grupy 2'-hydroksylowe (OH) w niciach dupleksów siRNA zostały zastąpione przez 2'-deoksy (d) lub 2'-O-metyl (Me). Dwu i czteronukleotydowe podstawienia 2'-deoksy na 3'-końcach wskazano odpowiednio jako 2-nt d i 4-nt d. Reszty urydyny zastąpiono 2'-deoksytymidyną.

Figura 15: Mapowanie rozszczepiania sensownego i antysensownego RNA przez dupleksy siRNA o długości 21-nt z jednoniciowymi wiszącymi 3'-końcami o długości 2-nt (A) Graficzne przedstawienie znakowanych w czapeczce 32p (gwiazdka) sensownych i antysensownych docelowych RNA oraz dupleksów siRNA. Pozycję rozszczepiania sensownego i antysensownego docelowego RNA wskazano przez trójkąty odpowiednio na górze i poniżej dupleksów siRNA. (B) Mapowanie miejsc rozszczepiania docelowego RNA. Po dwóch godzinach inkubacji 10 nM docelowego RNA z 100 nM dupleksu siRNA w lizacie embrionów D. melanogaster, znakowany w 5'-czapeczce substrat i 5'-produkty rozszczepiania rozdzielono na żelu do sekwencjonowania. Znaczniki długości wytworzono przez częściowe strawienie RNazą T1 (T1) i częściową hydrolizę zasadową (OH-) docelowych RNA. Grube linie po lewej stronie obrazów wskazują region pokrywany przez nici siRNA 1 i 5 o tej samej orientacji co docelowa.

Figura 16: 5'-koniec kierującego siRNA definiuje pozycję rozszczepiania docelowego RNA (A, B) Graficzne przedstawienie strategii doświadczalnej. Antysensowny siRNA był taki sam we wszystkich dupleksach siRNA, ale nić sensowna różniła się od 18- do 25-nt przez zmiany na 3'-końcu (A) lub od 18- do 23-nt przez zmiany na 5'-końcu (B). Pozycję rozszczepiania sensownego i antysensownego docelowego RNA wskazano trójkątami odpowiednio nad i poniżej dupleksów siRNA. (C, D) Analiza rozszczepiania docelowego RNA przy zastosowaniu znakowanych w czapeczce sensownych (górny panel) lub antysensownych (dolny panel) docelowych RNA. Pokazano tylko 5'-produkty rozszczepiania znakowane w czapeczce. Przedstawiono sekwencje dupleksów siRNA oraz długość sensownych nici siRNA oznaczono na górze panelu. Linia kontrolna oznaczona kreską w panelu (C) przedstawia docelowy RNA inkubowany przy braku siRNA. Znaczniki opisano dla fig. 15. Strzałki w (D), dolny panel, wskazują miejsca rozszczepiania docelowego RNA różniące się o 1 nt.

Figura 17: Zmienność sekwencji jednoniciowych wiszących 3'-końców dupleksów siRNA

Zmieniano sekwencję i skład dwunukleotydowego jednoniciowego wiszącego 3'-końca (NN, szary) jak wskazano (T, 2'- deoksytymidyna, dG, 2'-deoksyguanozyna; gwiazdka, dupleks siRNA typu dzikiego). Normalizowane stosunki interferencji wyznaczono jak opisano dla fig. 11. Sekwencja typu dzikiego jest taka sama jak przedstawiona na fig. 14.

Figura 18: Specyficzność rozpoznawania docelowej sekwencji

Przedstawiono sekwencje błędnie sparowanych dupleksów siRNA, zmodyfikowane segmenty sekwencji lub pojedyncze nukleotydy wyróżniono na szaro. Dupleks referencyjny (ref.) oraz dupleksy siRNA od 1 do 7 zawierały dwunukleotydowe jednoniciowe wiszące końce 2'-deoksytymidyny. Wydajność wyciszania przez zmodyfikowany tymidyną dupleks referencyny była porównywalna z sekwencją typu dzikiego (fig. 17). Normalizowane stosunki interferencji wyznaczono w sposób opisany dla fig. 11.

Figura 19: Zmienność długości dupleksów siRNA z ustalonymi 2-nt jednoniciowymi wiszącymi 3'-końcami

Dupleksy siRNA wydłużano po 3'-stronie sensownego siRNA (A) lub 5'-stronie sensownego siRNA (B). Wskazano sekwencje dupleksów siRNA i odpowiednie stosunki interferencji. Dla komórek HeLa SS6, dupleksy siRNA (0,84 μg) skierowane do GL2 lucyferazy transfekowano razem z plazmidami pGL2-Control i pRL-TK. Dla porównania przedstawiono aktywności RNAi in vitro dupleksów siRNA badane w lizacie D. melanogaster.

P r z y k ł a d 1

Interferencja RNA pośredniczona przez małe syntetyczne cząsteczki RNA

1.1. Procedury doświadczalne

1.1.1 RNAi in vitro

RNAi in vitro i preparaty lizatów wykonano w sposób wcześniej opisany (Tuschl i in., 1999; Zamore i in., 2000). Dla optymalnej regeneracji ATP krytyczne jest zastosowanie świeżo rozpuszczonej kinazy kreatynowej (Roche). Testy translacji RNAi (fig. 1) prowadzono z dsRNA w stężeniu 5 nM oraz przy wydłużonym czasie wstępnej inkubacji 15 minut w 25°C przed dodaniem transkrybowanych in vitro, z czapeczką i poliadenylowanych reporterowych mRNA Pp-luc i Rr-luc. Inkubację kontynuowano przez 1 godzinę i względną ilość białka Pp-luc i IB Rr-luc analizowano za pomocą podwójnego testu lucyferazy (Promega) w luminometrze Monolight 3010C (PharMingen).

PL 218 876 B1

1.1.2 Synteza RNA

Do transkrypcji in vitro RNA z matryc PCR niosących sekwencje promotorowe T7 lub SP6 zastosowano znane procedury, patrz przykładowo (Tuschl i in., 1998). Syntetyczny RNA otrzymano stosując fosforoamidyny Expedite RNA (Proligo). 3'-adaptorowy oligonukleotyd zsyntetyzowano stosując dimetoksytritylo-1,4-benzenodimetanolo-sukcynylo-aminopropylo-CPG. Oligorybonukleotydy odbezpieczano w 3 ml mieszaniny 32% amoniak/etanol (3/1) przez 4 godziny w 55°C (Expedite RNA) lub 16 godzin w 55°C (3'- i 5'-adaptorowe DNA/RNA chimeryczne oligonukleotydy), a następnie desililowano i oczyszczono na żelu jak wcześniej opisano (Tuschl i in., 1993). Transkrypty RNA do otrzymywania dsRNA zawierające jednoniciowe wiszące 3'-końce wytworzono z matryc PCR, które zawierały promotor T7 w sensownym kierunku i promotor SP6 w antysensownym kierunku. Matrycę do transkrypcji dla sensownego i antysensownego docelowego RNA amplifikowano metodą PCR z użyciem GCGTAATACGACTCACTATAGAACAATTGCTTTTACAG (podkreślony promotor T⁷) jako startera 5' i ATTTAGGTGACACTATAGGCATAAAGAATTGAAGA (podkreślony promotor SP6) jako startera 3', oraz linearyzowanego plazmidu Pp-luc (sekwencja pGEM-luc) (Tuschl i in., 1999) jako matrycy; transkrybowany z T7 sensowny RNA miał długość 177 nt z sekwencją Pp-luc pomiędzy pozycjami 113-273 względem kodonu start oraz 17-nt dopełnieniem sekwencji promotora SP6 na 3'-końcu. Transkrypty do wytworzenia dsRNA z tępymi końcami otrzymano przez transkrypcję z dwóch różnych produktów PCR, które zawierały tylko pojedynczą sekwencję promotorową.

Hybrydyzację dsRNA przeprowadzono stosując ekstrakcję mieszaniną fenol/chloroform. Sensowny i antysensowny RNA w równomolowych stężeniach (50 nM do 10 μM, zależnie od długości dostępnej ilości) w 0,3 M NaOAc (pH 6) inkubowano przez 30 sekund w 90°C, a następnie wyekstrahowano w temperaturze pokojowej równą objętością mieszaniny fenol/chloroform, po czym wyekstrahowano chloroformem w celu usunięcia pozostałego fenolu. Powstały dsRNA wytrącono przez dodanie 2,5-3 objętości etanolu. Osad rozpuszczono w buforze lizującym (100 mM KCl, 30 mM HEPESKOH, pH 7,4, 2 mM Mg(OAc)2) i jakość dsRNA weryfikowano znaną metodą elektroforezy na żelu agarozowym w buforze 1 x TAE. DsRNA o długości 52 pz z 17-nt i 20-nt jednoniciowym wiszącym 3'-końcem (fig. 6) hybrydyzowano drogą inkubacji przez 1 minutę w 95°C, a następnie szybkie ochłodzenie do 70°C i powolne chłodzenie do temperatury pokojowej przez okres trzech godzin (reakcja hybrydyzacji w objętości 50 μ!, stężenie nici 1 pM, 300 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 7,5). Następnie dsRNA wyekstrahowano mieszaniną fenol/chloroform, wytrącano etanolem i rozpuszczano w buforze lizującym.

Transkrypcję wewnętrznie znakowanych ³²P RNA stosowanych do otrzymywania dsRNA (fig. 2 i 4) prowadzono stosując 1 mM ATP, CTP, GTP, 0,1 lub 0,2 mM UTP oraz 0,2-0, 3 μM-³²p-UTP (3000 Ci/mmol) lub w odpowiednim stosunku znakowane radioaktywnie trójfosforany nukleozydów, inne niż UTP. Znakowanie czapeczki w docelowych RNA prowadzono jak opisano poprzednio. Docelowe RNA były oczyszczane na żelu po znakowaniu czapeczki.

1.1.3 Mapowanie miejsc rozszczepiania

Znane reakcje RNAi prowadzono przez wstępną inkubację 10 nM dsRNA przez 15 minut, a następnie dodawano 10 nM znakowanego w czapeczce docelowego RNA. Reakcję zatrzymywano po godz. (fig. 2A) lub 2,5 godz. inkubacji (fig. 5B i 6B) przez podziałanie proteinazą K (Tuschl i in., 1999). Następnie próbki analizowano w 8 lub 10% żelach do sekwencjonowania. 21- i 22-nt syntetyczne dupleksy RNA zastosowano w końcowym stężeniu 100 nM (fig. 5B).

1.1.4 Klonowanie ~21-nt RNA

21-nt RNA otrzymano przez inkubację znakowanego radioaktywnie dsRNA w lizacie Drosophila przy braku docelowego RNA (reakcja 200 μ!, 1 godz. inkubacji, 50 nM dsP111 lub 100 nM dsP52 lub dsP39). Następnie mieszaninę reakcyjną potraktowano proteinazą K (Tuschl i in., 1999) i produkty obróbki dsRNA rozdzielono w 15% denaturującym żelu poliakrylamidowym. Wycięto prążek zawierający zakres wielkości co najmniej 18 do 24 nukleotydów, wyeluowano w 0,3 M NaCl przez noc w 4°C w silikonowanych probówkach. RNA odzyskano przez wytrącanie etanolem i defosforylowano (reakcja 30 μΧ 30 minut, 50°C, 10 U fosfatazy alkalicznej, Roche). Reakcję zatrzymano przez ekstrakcję mieszaniną fenol/chloroform i RNA wytrącono etanolem. Następnie 3'-adaptorowy oligonukleotyd (pUUUaaccgcatccttctcx: duże litery, RNA; małe litery, DNA; p, fosforan; x, 4-hydroksymetylobenzyl) zligowano z defosforylowanym ~21-nt RNA (reakcja 20 μ^ 30 minut, 37°C, 5 μΜ 3'-adapter, 50 mM Tris-HCl, pH 7,6, 10 mM MgCl2, 0,2 mM ATP, 0,1 mg/ml acetylowana BSA, 15% DMSO, 25 U ligazy RNA T4, Amersham-Pharmacia) (Pan i Uhlenbeck, 1992). Reakcję ligacji zatrzymano przez dodanie równej objętości mieszaniny zatrzymującej 8 M mocznik/50 mM EDTA i bezpośrednio naniesiono na

PL 218 876 B1

15% żel. Wydajności ligacji były wyższe niż 50%. Produkt ligacji odzyskano z żelu i 5'-fosforylowano (reakcja 20 μ|, 30 minut, 37°C, 2 mM ATP, 5 U kinazy polinukleotydowej T4, NEB). Reakcje fosforylacji zatrzymano przez ekstrakcję mieszaniną fenol/chloroform i RNA odzyskano przez wytrącenie etanolem. Następnie 5'-adapter (tactaatacgactcactAAA: duże litery, RNA; małe litery, DNA) zligowano z fosforylowanym produktem ligacji jak opisano powyżej. Nowy produkt ligacji oczyszczono w żelu i wyeluowano z bloczku żelu w obecności startera do odwrotnej transkrypcji (GACTAGCTGGAATTCAAGGATGCGGTTAAA: wytłuszczono miejsce dla Eco RI) zastosowanego jako nośnik. Po odwrotnej transkrypcji (reakcja 15 μ|, 30 minut, 42°C, 150 U odwrotnej transkryptazy Super-script II, Life Technologies) przeprowadzono PCR stosując jako starter 5' CAGCCAACGGAATTCATACGACTCACTAAA (wytłuszczono miejsce dla Eco RI) oraz starter 3' RT. Produkt PCR oczyszczono przez ekstrakcję mieszaniną fenol/chloroform i wytrącono etanolem. Następnie produkt PCR strawiono Eco RI (NEB) i konkatameryzowano z użyciem ligazy DNA T4 (wysokie stężenie, NEB). Konkatamery o wielkości z zakresu 200-800 pz rozdzielono w żelu agarozowym o niskim punkcie topnienia, odzyskano z żelu przez zwykłą procedurę rozpuszczenia i ekstrakcji fenolem oraz wytrącono etanolem. Niesparowane końce wypełniono przez inkubację z polimerazą Taq w zwykłych warunkach przez 15 minut w 72°C i produkt DNA bezpośrednio wligowano do wektora pCR2. 1-TOPO stosując zestaw do klonowania TOPO TA (Invitrogen). Kolonie przeszukiwano metodą PCR z użyciem odwrotnych starterów do sekwencjonowania M13-20 i M13. Produkty PCR bezpośrednio zsekwencjonowano w zwykły sposób (Sequence Laboratories Gottingen GmbH, Niemcy). Średnio otrzymano cztery do pięciu 21-merowych sekwencji na klon.

1.1.5 Analiza 2D-TLC

Trawienie nukleazą P1 znakowanych radioaktywnie, oczyszczonych na żelu siRNA i 2D-TLC prowadzono w opisany sposób (Zamore i in., 2000). Trawienie nukleazą T2 przeprowadzono w 10 μl reakcjach przez 3 godziny w 50°C w 10 mM octanie amonu (pH 4,5) stosując 2 μ9^ nośnikowego tRNA i 30 U rybonukleazy T2 (Life Technologies). Migrację nie radioaktywnych wzorców wyznaczono przez cieniowanie UV. Tożsamość nukleozydo-3',5'-disfosforanów potwierdzono przez wspólną migrację produktów trawienia T2 z wzorcami otrzymanymi przez 5'-32p-fosforylację dostępnych w han_32 _ dlu 3'-monofosforanów nuklezydów z użyciem γ_ p_ATP i kinazy polinukelotydowej T4 (dane nie prezentowane).

1.2 Wyniki i dyskusja

1.2.1 Długość wymagana do obróbki dsRNA do 21- i 22-nt fragmentów RNA

Lizaty otrzymane z syncytialnych embrionów D. melanogaster przeprowadzają RNAi in vitro dostarczając nowe narzędzie do biochemicznej analizy mechanizmu RNAi (Tuschl i in., 1999; Zamore i in., 2000). In vitro i in vivo analiza długości dsRNA wymaganej do RNAi ujawniła, że krótkie dsRNA (< 150 pz) są mniej skuteczne niż dłuższe dsRNA w degradacji docelowego mRNA (Caplen i in., 2000; Hammond i in., 2000; Ngo i in., 1998); Tuschl i in., 1999). Powody zmniejszenia wydajności degradacji mRNA nie są zrozumiałe. Zatem zbadano dokładne wymagania długości dsRNA do degradacji RNA w optymalizowanych lizatach Drosophila (Zamore i in., 2000). Zsyntetyzowano kilka serii dsRNA i skierowano je przeciw reporterowemu RNA lucyferazy świetlika (Pp-luc). Specyficzną supresję ekspresji docelowego RNA monitorowano w podwójnym teście lucyferazy (Tuschl i in., 1999) (fig. 1A i 1B). Stwierdzono specyficzne zahamowanie ekspresji docelowego RNA dla dsRNA zaledwie o 38 pz, ale dsRNA o 29-36 pz nie były skuteczne w tym procesie. Efekt ten był niezależny od pozycji docelowej sekwencji i stopień hamowania ekspresji mRNA Pp-luc był skorelowany z długością dsRNA, tj. długie dsRNA były skuteczniejsze niż krótkie dsRNA.

Zasugerowano, że 21- do 23-nt fragmenty RNA wytworzone przez obróbkę dsRNA pośredniczą w interferencji RNA i kosupresji (Hamilton i Baulcombe, 1999; Hammond i in., 2000; Zamore i in., 2000). Zanalizowano zatem szybkość tworzenia 21- do 23-nt fragmentów dla grupy dsRNA o wielkości w zakresie 501-29 pz. Tworzenie 21- - 23-nt fragmentów w lizacie Drosophila (fig. 2) było łatwo wykrywalne dla dsRNA o długości 39 - 501 pz, ale było istotnie opóźnione dla dsRNA o długości 29 pz. Ta obserwacja zgadza się z rolą 21- - 23-nt fragmentów w kierowaniu rozszczepianiem mRNA i dostarcza wyjaśnienie dla braku RNAi przez dsRNA o długości 30 pz. Zależność tworzenia 21- - 23-merów od długości prawdopodobnie odzwierciedla istotny biologicznie mechanizm kontrolny zapobiegający niepożądanej aktywacji RNAi przez krótkie struktury wewnątrzcząsteczkowe ze sparowanymi zasadami normalnych komórkowych RNA.

1.2.2 DsRNA o długości 39 pz pośredniczy w rozszczepianiu docelowego RNA w pojedynczym miejscu

PL 218 876 B1

Dodanie dsRNA i docelowego RNA z 5'-czapeczką do lizatu Drosophila wywołuje specyficzną dla sekwencji degradację docelowego RNA (Tuschl i in., 1999). Docelowy mRNA jest rozszczepiany tylko w regionie identyczności dsRNA i wiele z docelowych miejsc rozszczepiania było rozdzielonych przez 21-23 nt (Zamore i in., 2000). Zatem oczekiwano, że liczba miejsc rozszczepiania dla danego dsRNA mniej więcej odpowiada długości dsRNA podzielonej przez 21. Zmapowano docelowe miejsca rozszczepiania na sensownym i antysensownym docelowym RNA, który był znakowany radioaktywnie w 5'-czapeczce (Zamore i in., 2000) (fig. 3A i 3B). Trwałe 5'-produkty rozszczepiania rozdzielono na żelu do sekwencjonowania i pozycję rozszczepiania wyznaczono przez porównanie z drabinką z częściowego trawienia RNazą T1 i alkalicznej hydrolizy docelowego RNA.

Zgodnie z wcześniejszą obserwacją (Zamore i in., 2000), wszystkie docelowe miejsca rozszczepiania RNA były umiejscowione w regionie identyczności dsRNA. Sensowny i antysensowny docelowy RNA był rozszczepiany tylko raz przez dsRNA o długości 39 pz. Każde miejsce rozszczepiania było umiejscowione 10 nt od 5'-końca regionu pokrytego przez dsRNA (fig. 3B). DsRNA o długości 52 pz, który dzieli taki sam 5'-koniec z dsRNA o długości 39 pz, wytwarza to samo miejsce rozszczepiania na nici sensownej, umiejscowione 10 nt od 5'-końca regionu identyczności z dsRNA, dodatkowo do dwóch słabszych miejsc rozszczepiania 23 i 24 nt w dół od pierwszego. Nić antysensowna była rozszczepiana tylko raz, również 10 nt od 5'-końca regionu pokrytego przez odpowiadający mu dsRNA. Mapowanie miejsc rozszczepiania dla dsRNA o długości 38-49 pz przedstawione na fig. 1 pokazuje, że pierwsze i dominujące miejsce rozszczepiania było zawsze umiejscowione 7- do 10-nt w dół regionu pokrytego przez dsRNA (dane nie prezentowane). Sugeruje to, że punkt rozszczepiania docelowego RNA jest zdeterminowany przez koniec dsRNA i może sugerować, że obróbka do 0 21- do 23merów zaczyna się od końców dupleksu.

Miejsca rozszczepiania na sensownym i antysensownym docelowym RNA dla dłuższego dsRNA o długości 111 pz były znacznie częstsze niż przewidywane i większość z nich występowała w zgrupowaniach rozdzielonych przez 20- do 23-nt (fig. 3A i 3B). Tak jak dla krótszych dsRNA, pierwsze miejsce rozszczepiania na docelowej nici sensownej było umiejscowione 10 nt od 5'-końca regionu pokrytego przez dsRNA, a pierwsze miejsce rozszczepiania na nici docelowej antysensownej było umiejscowione 9 nt od 5'-końca regionu pokrytego przez dsRNA. Nie jest jasne co powoduje to nieuporządkowane rozszczepianie, ale możliwe jest, że dłuższe dsRNA mogą być obrabiane nie tylko od końców, ale także wewnętrznie lub istnieją pewne determinanty specyficzności dla obróbki dsRNA, które jeszcze nie zostały zrozumiane. Pewne nieregularności odległości 21- do 23-nt zostały wcześniej zauważone (Zamore i in., 2000). Aby lepiej zrozumieć molekularne podstawy obróbki dsRNA i rozpoznawania RNA, zdecydowano się zanalizować sekwencje fragmentów 21- do 23-nt wytworzonych przez obróbkę dsRNA o długości 39, 52 i 111 pz w lizacie Drosophila.

1.2.3 dsRNA ulega obróbce do RNA o długości 21 i 22 nt według mechanizmu typu RNazy III

Aby scharakteryzować fragmenty 21-23-nukleotydowe RNA zbadano 5'- i 3'-końce fragmentów RNA. Utlenienie nadjodanem oczyszczonych w żelu 21- do 23-nt RNA, a następnie β-eliminacja ujawniły obecność końcowych grup 2' i 3'-hydroksylowych. 21- do 23-mery odpowiadały także na traktowanie fosfatazą alkaliczną, co wskazywało na obecność 5'-końcowej grupy fosforanowej. Obecność końców 5'-fosforanowego i 3'-hydroksylowego sugeruje, że dsRNA może ulegać obróbce z wykorzystaniem aktywności enzymatycznej podobnej do RNazy III E. coli (prace przeglądowe, patrz (Dunn, 1982; Nicholson, 1999; Robertson, 1990; Robertson, 1982)).

Bezpośrednie klonowanie 21- do 23-nt fragmentów RNA przeprowadzono przez ligację 3'- i 5'-adapterowego oligonukleotydu do oczyszczonych 21- do 23-merów z użyciem ligazy RNA T4. Produkty ligacji poddano odwrotnej trankrypcji, amplifikowanej PCR, konkatameryzowano, sklonowano i zsekwencjonowano. Ponad 220 krótkich RNA zsekwencjonowano z reakcji obróbki dsRNA o długości 39, 52 i 111 pz (fig. 4A). Stwierdzono następujący rozkład długości: 1% 18 nt, 5% 19 nt, 12% 20 nt, 45% 21 nt, 28% 22 nt, 6% 23 nt i 2% 24 nt. Analiza sekwencji 5'-końcowego nukleotydu obrabianych fragmentów wykazała, że oligonukleotydy z 5'-guanozyną były mniej reprezentowane. To odchylenie zostało najprawdopodobniej wprowadzone przez ligazę RNA T4, która odróżnia 5'-fosforylowaną guanozynę jako oligonukleotyd donorowy; nie zaobserwowano istotnych odchyleń na 3'-końcu. Wiele z ~21-nt fragmentów pochodziło z 3'-końców sensownej lub antysensownej nici dupleksów, włącznie z 3'-nukleotydami pochodzącymi z niezależnej od matrycy addycji nukleotydów podczas syntezy RNA z użyciem polimerazy RNA T7. Należy podkreślić, że sklonowano także istotną liczbę endogennych RNA ~21 nt Drosophila, niektóre z LTR i nie-LTR retrotranspozonów (dane nie prezentowane). Jest to zgodne z możliwą rolą RNAi w wyciszaniu transpozonów.

PL 218 876 B1 ~21 nt RNA występują w zebranych grupach (fig. 4A), które pokrywają całe sekwencje dsRNA. Najwidoczniej reakcja obróbki przecina dsRNA zostawiając lepkie 3'-końce, co jest inną charakterystyczną cechą rozszczepiania RNazą III. W przypadku dsRNA o długości 39 pz znaleziono dwa skupiska ~21 nt RNA dla każdej nici stanowiącej dsRNA-włącznie z jednoniciowymi wiszącymi 3'-końcami, ale tylko jedno miejsce rozszczepiania wykryto na sensownej i antysensownej nici docelowej (fig. 3A i 3B). Gdyby ~21 nt fragmenty były obecne jako jednoniciowy kierujący RNA w kompleksie pośredniczącym w degradacji mRNA, możnaby założyć, że istnieją co najmniej dwa docelowe miejsca rozszczepiania, ale to nie występowało. Sugeruje to, że ~21 nt RNA mogą być obecne w formie dwuniciowej w kompleksie endonukleazowym, ale że tylko jedna z nici może być użyta do rozpoznania i rozszczepiania docelowego RNA. Używanie tylko jednej z ~21 nt nici do rozszczepiania docelowego RNA można łatwo wyznaczyć przez orientację, w której ~21 nt dupleks jest związany z kompleksem nukleazowym. Orientacja ta jest definiowana przez kierunek, w którym jest obrabiany oryginalny dsRNA.

~21-merowe skupiska dla dsRNA o długości 52 pz i 111 pz są znacznie gorzej zdefiniowane w porównaniu z dsRNA o długości 39 pz. Skupiska są rozrzucone w obszarach 25- do 30-nt, najprawdopodobniej reprezentujących kilka różnych subpopulacji ~21 nt dupleksów, a zatem pośredniczącym w rozszczepianiu docelowego RNA w kilku sąsiadujących miejscach. Te regiony nadal są głównie rozdzielone przez przerwy 20 do 23 nt. Reguły decydujące o tym, jak normalne dsRNA mogą być obrabiane do ~21-nt fragmentów, nie są dotychczas dobrze rozumiane, ale wcześniej obserwowano, że około 21- do 23-nt przerwa pomiędzy miejscami rozszczepiania może zostać zmieniona przez serię urydyn (Zamore i in., 2000). Specyficzność rozszczepiania dsRNA przez RNazę III z E. coli wydaje się być głównie kontrolowana przez antydeterminanty, tj. wykluczanie pewnych specyficznych par zasad w danych pozycjach względem miejsca rozszczepiania (Zhang i Nicholson, 1997).

Aby zbadać czy w obrabianych ~21-nt fragmentach były obecne modyfikacje cukru, zasady lub czapeczki, inkubowano znakowany radioaktywnie dsRNA Ppluc o długości 505 pz w lizacie przez 1 godzinę, wyizolowano produkty ~21-nt i strawiono nukleazami P1 lub T2 do mononukleotydów. Następnie mieszaninę nukleotydową analizowano metodą cienkowarstwowej chromatografii 2D (fig. 4B). Żaden z czterech naturalnych rybonukleotydów nie był modyfikowany, co wskazało trawienie P1 lub T2. Wcześniej analizowano przeprowadzanie adenozyny w inozynę w -21-nt fragmentach (po 2 godzinach inkubacji) i wykryto niewielki stopień (< 0,7%) deaminacji (Zamore i in., 2000); krótsza inkubacja w lizacie (1 godzina) zmniejszyła tą frakcję inozyny do ledwie wykrywalnych poziomów. RNaza T2, która rozszczepia 3' stronę wiązania fosfodiestrowego, wytwarza 3'-fosforan i 3',5'-difosforan nukleozydu, co wskazuje na obecność 5'-końcowego monofosforanu. Wykryto wszystkie cztery 35'-difosforany nukleozydu, co wskazuje na to, że wiązanie międzynukleotydowe zostało rozszczepione z niewielką specyficznością dla sekwencji lub przy braku tej specyficzności. W skrócie, -21-nt fragmenty były niezmodyfikowane i wytwarzane z dsRNA, tak, że 5'-monofosforany i 3'-hydroksyle były obecne na 5'- końcu.

1.2.4 Syntetyczne 21- i 22-nt RNA pośredniczą w rozszczepianiu docelowego RNA

Analiza produktów obróbki dsRNA wskazała, że ~21-nt fragmenty są wytwarzane w reakcji o wszystkich cechach charakterystycznych dla reakcji rozszczepiania RNazą III (Dunn, 1982; Nicholson, 1999; Robertson, 1990; Robertson, 1982). RNaza III wykonuje dwa nierównomierne cięcia w obu niciach dsRNA, zostawiając jednoniciowe wiszące 3'-końce o długości około 2 nt. Chemicznie zsyntetyzowano 21- i 22-nt RNA, o sekwencji identycznej z pełnymi sklonowanymi fragmentami -21-nt i zbadano ich zdolność do kierowania degradacją docelowego RNA (fig. 5A i 5B). 21- i 22-nt dupleksy RNA inkubowano w stężeniach 100 nM w lizacie, dziesięciokrotnie wyższych stężeniach niż dla kontrolnego dsRNA o długości 52 pz. W tych warunkach rozszczepianie docelowego RNA było łatwo wykrywalne. Obniżenie stężenia 21- i 22-nt dupleksów z 100 do 10 nM nadal wywoływało rozszczepianie docelowego RNA. Jednakże podwyższenie stężenia dupleksu z 100 nM do 1000 nM nie zwiększało dalej rozszczepiania docelowego RNA, prawdopodobnie ze względu na limitujący czynnik białkowy w lizacie.

W odróżnieniu od dsRNA o długości 29 lub 30 pz, które nie kierowały RNAi, 21- i 22-nt dsRNA z jednoniciowymi wiszącymi 3'-końcami o długości 2 do 4 nt kierowały wydają degradacją docelowego RNA (dupleksy 1, 3, 4, 6, fig. 5A i 5B). 21- lub 22-nt dsRNA z tępymi końcami (dupleksy 2, 5 i 7, fig. 5A i 5B) miały obniżoną zdolność degradacji docelowego RNA, co wskazuje, że jednoniciowe wiszące 3'-końce są krytyczne do rekonstytucji kompleksu RNA-nukleaza białkowa. Jednoniciowe wiszące końce mogą być niezbędne do wiązania z wysokim powinowactwem ~21-nt dupleksu ze składPL 218 876 B1 nikami białka. Pomimo, że 5'-końcowy fosforan był obecny po obróbce dsRNA, nie był on wymagany do kierowania rozszczepianiem docelowego RNA i brak go było w krótkich syntetycznych RNA.

Syntetyczne 21- i 22-nt dupleksy pośredniczą w rozszczepianiu sensownych, a także antysensownych docelowych RNA w regionie pokrywanym przez krótki dupleks. Jest to ważny wynik, jeśli się weźmie pod uwagę, że dsRNA o długości 39 pz, który tworzy dwie pary podzbiorów fragmentów ~21-nt (fig. 2), rozszczepiał sensowny i antysensowny docelowy RNA tylko raz, a nie dwa razy. Zinterpretowano ten wynik sugerując, że tylko jedna z dwóch nici obecna w dupleksie ~21-nt jest zdolna do pośredniczenia w rozszczepianiu docelowego RNA, oraz że orientacja ~21-nt dupleksu w kompleksie nukleazowym jest wyznaczona przez początkowy kierunek obróbki dsRNA. Jednakże obecność perfekcyjnie obrobionego ~21-nt dupleksu w systemie in vitro pozwala na wytworzenie aktywnego, specyficznego dla sekwencji kompleksu nukleazowego z dwoma możliwymi orientacjami symetrycznego dupleksu RNA. Powoduje to rozszczepianie sensownego, a także antysensownego docelowego RNA w regionie identyczności z 21-nt dupleksem RNA.

Docelowe miejsce rozszczepiania jest umiejscowione 11 lub 12 nt w dół od pierwszego nukleotydu, który jest komplementarny do 21- lub 22-nt sekwencji kierującej, tj. miejsce rozszczepiania leży w pobliżu centrum regionu pokrytego przez 21- lub 22-nt RNA (fig. 4A i 4B). Przesunięcie nici sensownej dupleksu 22-nt o dwa nukleotydy (porównaj dupleksy 1 i 3 na fig. 5A) przesuwało miejsce rozszczepiania tylko antysensownego docelowego RNA o dwa nukleotydy. Przesunięcie obu nici sensownej i antysensownej o dwa nukleotydy przesuwało obydwa miejsca rozszczepiania o dwa nukleotydy (porównaj dupleksy 1 i 4). Przewiduje się, że możliwe będzie zaprojektowanie pary 21- lub 22-nt RNA tak, aby rozszczepić docelowy RNA w prawie dowolnej danej pozycji.

Specyficzność rozszczepiania docelowego RNA kierowanego przez 21- i 22-nt RNA wydaje się być bardzo dobra, gdyż nie wykryto nieprawidłowych miejsc rozszczepiania (fig. 5B). Należy jednak zauważyć, że nukleotydy obecne w jednoniciowym wiszącym 3'-końcu 21- i 22-nt dupleksu RNA mogą uczestniczyć w mniejszym stopniu w rozpoznaniu substratu niż nukleotydy w pobliżu miejsca rozszczepiania. Jest to oparte na obserwacji, że najbliższy 3'-końca nukleotyd w jednoniciowym wiszącym 3' końcu aktywnych dupleksów 1 lub 3 (fig. 5A) nie jest komplementarny do docelowego RNA. Można teraz łatwo wykonać szczegółową analizę specyficzności RNAi z użyciem syntetycznych 21- i 22-ny RNA.

W oparciu o potwierdzenie, że syntetyczne 21- i 22-nt RNA z jednoniciowymi wiszącymi 3'-końcami pośredniczą w interferencji RNA, zaproponowano nazwanie ~21-nt RNA „krótkimi interferującymi RNA lub siRNA, a odpowiedni kompleks RNA-białko „cząstką małej interferującej rybonukleoproteiny lub siRNP.

1.2.5 Jednoniciowe wiszące 3'-końce o długości 20 nt na krótkich dsRNA hamują RNAi

Wykazano, że krótkie dsRNA o tępych końcach wydają się ulegać obróbce od końców dsRNA. Podczas badania zależności RNAi od długości dsRNA, zanalizowano także dsRNA z jednoniciowymi wiszącymi 3'-końcami o 17- do 20-nt i stwierdzono z zaskoczeniem, że były one słabsze niż dsRNA z tępymi końcami. Hamujące działanie długich 3'-końców było szczególnie widoczne w przypadku dsRNA o długości do 100 pz, ale był mniej dramatyczny dla dłuższych dsRNA. Efekt ten nie wynikał z wadliwego tworzenia dsRNA, co stwierdzono na podstawie analizy w żelu natywnym (dane nie prezentowane). Zbadano, czy działanie hamujące długich jednoniciowych wiszących 3'-końców może być wykorzystane jako narzędzie do skierowania obróbki dsRNA do tylko jednego z dwóch końców krótkiego dupleksu RNA.

Zsyntetyzowano cztery kombinacje modelowego dsRNA o długości 52 pz, z tępymi końcami, z wydłużeniem 3'-końca tylko na nici sensownej, z wydłużeniem 3'-końca tylko na nici antysensownej oraz z dwoma wydłużeniami 3'-końca na obu niciach, po czym zmapowano miejsca rozszczepiania docelowego RNA po inkubacji w lizacie (fig. 6A i 6B). Pierwsze i dominujące miejsce rozszczepiania docelowej nici sensownej było tracone, gdy 3'-koniec nici antysensownej dupleksu był wydłużany i na odwrót, silne miejsce rozszczepiania docelowej nici antysensownej było tracone, gdy 3'-koniec nici sensownej dupleksu był wydłużany. Wydłużenia 3'-końca na obu niciach sprawiały, że dsRNA o długości 52 pz był praktycznie nieaktywny. Jednym wytłumaczeniem inaktywacji dsRNA przez ~20-nt wydłużenia na 3'-końcach może być asocjacja białek wiążących jednoniciowy RNA, która może zakłócać asocjację jednego z czynników obróbki dsRNA na tym końcu. Wynik ten zgadza się także z modelem, w którym tylko jedna nić dupleksu siRNA w złożonym siRNP jest zdolna do kierowania rozszczepianiem docelowego RNA. Orientacja nici kierującej rozszczepianiem RNA jest zdefiniowana przez kierunek reakcji obróbki dsRNA. Jest prawdopodobne, że obecność lepkich 3'-końców może ułatwiać

PL 218 876 B1 składanie kompleksu obróbki. Blok na 3'-końcu nici sensownej pozwala tylko na obróbkę dsRNA z przeciwstawnego 3'-końca nici antysensowej. Powoduje to z koleji tworzenie kompleksów siRNP, w których tylko nić antysensowna dupleksu siRNA jest zdolna do kierowania rozszczepianiem sensownego docelowego RNA. To samo dotyczy odwrotnej sytuacji.

Słabiej wyrażony efekt hamujący długich wydłużeń 3'-końca w przypadku dłuższych dsRNA (> 500 pz, dane nie prezentowane) sugeruje, że długie dsRNA mogą także zawierać wewnętrzne sygnały obróbki dsRNA lub mogą wspólnie ulegać obróbce ze względu na połączenie wielu czynników rozszczepiających.

1.2.6 Model kierowanego dsRNA rozszczepiania mRNA

Nowe dane biochemiczne uaktualniają model, zgodnie z którym dsRNA skierowuje mRNA do rozłożenia (fig. 7). Dwuniciowy RNA ulega najpierw obróbce do krótkich dupleksów RNA głównie o długości 21 i 22 nt oraz z lepkimi 3'-końcami podobnie do reakcji typu RNazy III (Dunn, 1982; Nicholson, 1999; Robertson, 1982). W oparciu o 21- do 23-nt długość fragmentów obrabianego RNA wcześniej przypuszczano, że aktywność typu RNazy III może uczestniczyć w RNAi (Bass, 2000). Ta hipoteza jest dalej potwierdzona przez obecność 5'-fosforanów i 3'-hydroksyli na końcu siRNA, co obserwowano dla produktów reakcji RNazy III (Dunn, 1982; Nicholson, 1999). Wykazano, że bakteryjna RNaza III i eukariotyczne homologi Rnt1p z S. cerevisiae i Pac1p z S. pombe działają w obróbce rybosomalnego RNA, a także snRNA i snoRNA (patrz np. Chanfreau i in., 2000).

Niewiele wiadomo na temat biochemii homologów RNazy III z roślin, zwierząt lub ludzi. Zidentyfikowano dwie rodziny enzymów RNazy III, głównie przez analizę sekwencji z użyciem baz danych lub klonowanie cDNA. Pierwsza rodzina RNazy III jest reprezentowana przez białko drosha z D. melanogaster o długości 1327 (Acc. AF116572). C-koniec składa się z dwóch domen RNazy III i jednej domeny wiążącej dsRNA, a N-koniec ma nieznaną funkcję. Bliskie homologi znaleziono także w C. elegans (Acc. AF160248) i u ludzi (Acc. AF189011) (Filippov i in., 2000; Wu i in., 2000). Ludzką RNazę III typu drosha ostatnio sklonowano i scharakteryzowano (Wu i in., 2000). Gen ten jest wszechobecnie eksprymowany w tkankach ludzkich i liniach komórkowych, a białko jest umiejscowione w jądrze i jąderku komórki. W oparciu o wyniki wywnioskowane z badań z hamowaniem antysensownym zaproponowano rolę tego białka w obróbce rRNA. Druga klasa jest reprezentowana przez gen K12H4.8 C. elegans (Acc. S44849) kodujący białko o długości 1822 aminokwasów. Białko to ma N-końcowy motyw helikazy RNA, po którym występują dwie domeny katalityczne RNazy III i motyw wiązania dsRNA, podobny do rodziny drosha RNazy III. Istnieją bliskie homologi S. pombe (Acc. Q09884), A. thaliana (Acc. AF187317), D. melanogaster (Acc. AE003740) i ludzki (Acc. AB028449) (Filippov i in., 2000; Jacobsen i in., 1999; Matsuda i in., 2000). Możliwe, że K12H4.8 RNaza III/helikaza jest prawdopodobnym kandydatem białka związanego z RNAi.

Genetyczne przeszukiwanie C. elegans zidentyfikowało rde-1 i rde-4 jako istotne dla aktywacji RNAi bez efektu uruchomienia transpozonów lub kosupresji (Dernburg i in., 2000; Grishok i in., 2000; Ketting i Plasterk, 2000; Tabara i in., 1999). Doprowadziło to do hipotezy, że te geny są istotne do obróbki dsRNA, ale nie są związane z degradacją docelowego mRNA. Funkcja obu genów jak dotychczas nie jest znana, produkt genu rdel jest członkiem rodziny białek podobnych do króliczego białka eIF2C (Tabara i in., 1999), a sekwencji rde-4 jak dotychczas nie opisano. Wykonana w przyszłości biochemiczna charakteryzacja tych białek powinna wyjaśnić ich molekularną funkcję.

Obróbka dupleksów siRNA wydaje się zaczynać od końców zarówno dsRNA z tępymi końcami, jak i dsRNA z krótkimi (1-5 nt) jednoniciowymi wiszącymi 3'-końcami i postępuje w około 21- do 23-nt. Długie (-20 nt) lepkie 3'-końce na krótkich dsRNA hamują RNAi, prawdopodobnie przez oddziaływanie z białkami wiążącymi jednoniciowy RNA. Zahamowanie RNAi przez jednoniciowe regiony flankujące krótkie dsRNA oraz brak tworzenia siRNA z krótkich dsRNA o długości 30 pz może wyjaśniać dlaczego regiony tworzące struktury często znajdywane w mRNA nie prowadzą do uaktywnienia RNAi.

Bez wiązania się z teorią sądzi się, że białka obróbki dsRNA, lub ich podzbiór, pozostają związane z dupleksem siRNA po reakcji obróbki. Orientacja dupleksu siRNA względem tych białek determinuje, która z dwóch komplementarnych nici działa w kierowaniu degradacją docelowego RNA. Chemicznie syntetyzowane dupleksy siRNA kierują rozszczepianiem zarówno sensownego, jak i antysensownego RNA, gdyż są one zdolne do związania się z czynnikami białkowymi w którejkolwiek z dwóch możliwych orientacji.

Niezwykłe odkrycie, że 21- i 22-nt syntetyczne dupleksy siRNA można stosować do wydajnej degradacji mRNA, dostarcza nowych narzędzi do specyficznej dla sekwencji regulacji ekspresji genów w genomice funkcjonalnej, a także w badaniach biomedycznych. siRNA mogą być skuteczne w ukłaPL 218 876 B1 dach ssaczych, gdzie długie dsRNA nie mogą być stosowane ze względu na aktywację odpowiedzi PKR (Clemens, 1997). Jako takie, dupleksy siRNA stanowią nową alternatywę dla terapii sekwencjami antysensownymi lub rybozymami.

P r z y k ł a d 2

Interferencja RNA w ludzkich hodowlach tkankowych

2.1 Metody

2.1.1 Otrzymywanie RNA

21-nt RNA zsyntetyzowano stosując amidofosforyny Expedite RNA i amidofosforyn tymidyny (Proligo, Niemcy). Syntetyczne oligonukleotydy odbezpieczono i oczyszczono na żelu (przykład 1), następnie oczyszczano na kolumnach Sep Pak C18 (Wate rs , Milord, MA, USA) (Tuschl, 1993). Sekwencje siRNA skierowane do lucyferazy GL2 (Acc. X65324) i GL3 (Acc. U47296) odpowiadały regionom kodującym 153-173 względem pierwszego nukleotydu kodonu start, siRNA skierowane do RL (Acc. AF025846) odpowiadały regionowi 119-129 po kodonie start. Dłuższe RNA były transkrybowane polimerazą RNA T7 z produktów PCR, następnie oczyszczane na żelu i na kolumnach Sep-Pak. dsRNA GL2 lub GL3 o długości 49 i 484 pz odpowiadały odpowiednio pozycjom 113-161 i 113-596, względem startu translacji; dsRNA RL o długości 50 i 501 pz odpowiadały odpowiednio pozycjom 118-167 i 118-618. Matryce do PCR do syntezy dsRNA skierowanych do humanizowanego GFP (hG) zamplifikowano z pAD3 (Kehlenbach, 1998), przy czym dsRNA hG o długości 50 i 501 pz odpowiadały odpowiednio pozycjom 118-167 i 118-618 względem kodonu start.

Do hybrydyzacji siRNA 20 μΜ pojedyncze nici inkubowano w buforze do hybrydyzacji (100 mM octan potasu, 30 mM HEPESKOH, pH 7,4, 2 mM octan magnezu) przez 1 minutę w 90°C, a następnie przez 1 godzinę w 37°C. Etap inkubacji w 37°C przedłużono na noc w przypadku dsRNA o długości 50 i 500 pz, a te reakcje hybrydyzacji przeprowadzano przy stężeniach nici odpowiednio 8,4 μM i 0,8 4 μM.

2.1.2 Hodowla komórkowa

Komórki S2 namnażano w podłożu Schneider'a Drosophila (Life Technolgies) uzupełnionym 10% FBS, 100 jednostek/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny w 25°C. Komórki 293, NIH/3T3, HeLa S3, COS-7 hodowano w 37°C w podłożu Eagla w modyfikacji Dulbecco, uzupełnionym 10% FBS, 100 jednostek/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny. Komórki regularnie pasażowano aby utrzymać wzrost wykładniczy. 24 godziny przed transfekcją przy około 80% konfluencji, komórki ssa₅ cze trypsynizowano i rozcieńczono 1:5 w świeżym podłożu bez antybiotyków (1-3 x 10⁵ komórek/ml) i przeniesiono do 24-studzienkowych płytek (500 μl/studzienkę). Komórki S2 nie były trypsynizowane przed podzieleniem. Transfekcję przeprowadzono z użyciem odczynnika Lipofectamine 2000 (Life Technologies), w sposób opisany przez producenta dla linii komórkowych przylegających. Na studzienkę dodano 1,0 μg pGL2-Control (Promega) lub pGL3-Control (Promega), 0,1 μg pRL-TK (Promega) i 0,28 μg dupleksu siRNA lub dsRNA, formułowanych w liposomach; końcowa objętość wynosiła 600 μl na studzienkę. Komórki inkubowano 20 godzin po transfekcji i miały one wtedy zdrowy w ygląd. Następnie monitorowano ekspresję lucyferazy za pomocą podwójnego testu lucyferazy (Promega). Wydajności transfekcji wyznaczono metodą mikroskopii fluorescencyjnej dla ssaczych linii komórkowych po kotransfekcji 1,1 μg pAD3 kodującego hGFP i 0,28 μg invGL2 w GL2 siRNA i wynosiły one 70-90%. Plazmidy reporterowe amplifikowano w XL-1 Blue (Stratagene) i oczyszczono z użyciem zestawu Qiagen EndoFree Maxi Plasmid.

2.2 Wyniki i dyskusja

Aby zbadać czy siRNA są także zdolne do kierowania RNAi w hodowli komórkowej, zsyntetyzowano 21-nt dupleksy siRNA z symetrycznymi 2-nt jednoniciowymi wiszącymi 3'-końcami skierowane przeciw genom reporterowym lucyferaz Renilla reniformis i dwu wariantom sekwencji ze świetlika (Photinus pyralis, GL2 i GL3) (fig. 8a, b). Dupleksy siRNA kotransfekowano z połączeniami plazmidów reporterowych pGL2/pRL lub pGL3/pRL do komórek D. melanogaster Schneider S2 lub ssaczych komórek z użyciem kationowych liposomów. Aktywności lucyferazy oznaczono 20 godzin po transfekcji. We wszystkich zbadanych liniach komórkowych zaobserwowano specyficzne obniżenie ekspresji genów reporterowych w obecności ich pokrewnych dupleksów siRNA (fig. 9a-j). Co ciekawe, absolutne poziomy ekspresji lucyferazy nie były zmienione przez nie spokrewnione siRNA, co wskazywało na brak szkodliwych skutków ubocznych 21-nt dupleksów RNA (np. fig. 10a-d dla komórek HeLa). W komórkach D. melanogaster S2 (fig. 9a, b), specyficzne zahamowanie lucyferaz było całkowite. W komórkach ssaczych, gdzie geny reporterowe były 50- do 100-krotnie silniej wyrażane, specyficzna supresja była mniej pełna (fig. 9c-j). Ekspresja GL2 była obniżona 3- do 12-krotnie, ekspresja GL39- do

PL 218 876 B1

25-krotnie, a ekspresja RL 1- do 3-krotnie, w odpowiedzi na ich pokrewne siRNA. Dla komórek 293, hamowanie lucyferazy RL przez siRNA RL było nieskuteczne, jednakże docelowe geny GL2 i GL3 odpowiadały specyficznie (fig. 9i, j). Brak zmniejszenia ekspresji RL w komórkach 293 może wynikać z jego 5- do 20-krotnie wyższej ekspresji w porównaniu z jakąkolwiek inną badaną ssaczą linią komórkową i/lub z ograniczonej dostępności sekwencji docelowej ze względu na drugorzędową strukturę RNA lub związane białka. Niemniej jednak, specyficzne zahamowanie lucyferazy GL2 i GL3 przez ich pokrewne dupleksy siRNA wskazywało, że RNAi działa także w komórkach 293.

Dwunukleotydowy jednoniciowy wiszący 3'-koniec we wszystkich dupleksach siRNA, z wyjątkiem uGL2, składał się z (2'-deoksy)tymidyny. Podstawienie urydyny tymidyną w jednoniciowym wiszącym 3'-końcu było dobrze tolerowane w in vitro systemie D. melanogaster, a sekwencja jednoniciowego wiszącego końca nie była krytyczna dla rozpoznania docelowego RNA. Tymidynowy jednoniciowy wiszący koniec wybrano, gdyż uważa się, że zwiększa on odporność siRNA na nukleazę w podłożu do hodowli tkankowych oraz w transfekowanych komórkach. Faktycznie, GL2 siRNA zmodyfikowany tymidyną był nieznacznie silniejszy niż niezmodyfikowany uGL2 siRNA we wszystkich badanych liniach komórkowych (fig. 9a, c, e, g, i). Niewykluczone, że dalsze modyfikacje nukleotydów jednoniciowego wiszącego 3'-końca mogą dostarczyć dodatkowe korzystne efekty względem dostarczania i stabilności dupleksów siRNA.

W doświadczeniach kotransfekcji zastosowano 25 nM dupleksy siRNA, w odniesieniu do końcowej objętości podłoża do hodowli tkankowych (fig. 9, 10). Podwyższenie stężenia siRNA do 100 nM nie wzmocniło efektów specyficznego wyciszania, ale zaczęło wpływać na wydajność transfekcji ze względu na współzawodnictwo w zamykaniu w liposomie pomiędzy plazmidowym DNA i siRNA (dane nie prezentowane). Obniżenie stężenia siRNA do 1,5 nM nie obniżyło specyficznego efektu wyciszania (dane nie prezentowane), pomimo, że siRNA były wtedy tylko 2- do 20- krotnie bardziej stężone niż plazmidy DNA. Oznacza to, że siRNA są nadzwyczaj silnymi czynnikami pośredniczącymi w wyciszaniu genów oraz, że siRNA są skuteczne w stężeniach, które są kilka rzędów wielkości niższe niż stężenia stosowane w zwykłych doświadczeniach kierowania do genów sekwencji antysensownych lub rybozymów.

Aby monitorować wpływ dłuższych dsRNA na komórki ssacze, otrzymano dsRNA o długości 50 i 500 pz, pokrewne genom reporterowym. Jako niespecyficzną kontrolę zastosowano dsRNA z humanizowanego GFP (hG) (Kehlenbach, 1998). Gdy dsRNA kotransfekowano w identycznych ilościach (nie stężeniach) z dupleksami siRNA, ekspresja genu reporterowego była silnie i niespecyficznie obniżona. Efekt ten przedstawiono dla komórek HeLa jako reprezentatywnego przykładu (fig. 10a-d). Absolutne aktywności lucyferazy były obniżone niespecyficznie odpowiednio 10- do 20-krotnie przez kotransfekcję dsRNA o długości 50 pz i 20- do 200-krotnie przez kotransfekcję dsRNA o długości 500 pz. Podobne niespecyficzne efekty obserwowano dla komórek COS-7 i ŃIH/3T3. Dla komórek 293 obserwowano 10- do 20-krotne niespecyficzne obniżenie tylko dla dsRNA o długości 500 pz. Niespecyficzne obniżenie ekspresji genu reporterowego przez dsRNA > 30 pz przewidywano jako część odpowiedzi interferonowej.

Zaskakująco, pomimo silnego niespecyficznego obniżenia ekspresji genu reporterowego, powtarzalnie wykryto specyficzne dla sekwencji wyciszanie kierowane dsRNA. Jednakże efekty specyficznego wyciszania były widoczne tylko gdy względne aktywności genu reporterowego normalizowano względem kontroli hG dsRNA (fig. 10e, f). Zaobserwowano 2- do 10-krotne specyficzne obniżenie w odpowiedzi na pokrewny dsRNA, także w trzech innych badanych liniach komórek ssaczych (dane nie prezentowane). Efekty specyficznego wyciszania dsRNA (356-1662 pz) wcześniej opisano w komórkach CHO-K1, ale ilości dsRNA wymagane do wykrycia 2- do 4-krotnego specyficznego obniżenia, były około 20-krotnie wyższe niż w naszych doświadczeniach (Ui-Tei, 2000). Także komórki CHO-K1 wydają się wykazywać niedobór odpowiedzi interferonowej. W innej pracy komórki 293, NIH/3T3 i BHK-21 badano pod względem RNAi stosując połączenia reporterowe lucyferaza/lacZ i dsRNA specyficzny lacZ o długości 829 pz lub niespecyficzny GFP o długości 717 pz (Caplen, 2000). Niemożność wykrycia RNAi w tym przypadku może wynikać z mniejszej czułości testu reporterowego lucyferaza/lacZ oraz różnic długości pomiędzy docelowym i kontrolnym dsRNA. Reasumując, wyniki te wskazują, że RNAi jest aktywna w komórkach ssaczych, że efekt wyciszania jest trudny do wykrycia, gdy system interferonu jest aktywowany przez dsRNA > 30 pz.

W skrócie, po raz pierwszy wykazano wyciszanie genów kierowane siRNA w komórkach ssaczych. Zastosowanie krótkich siRNA niesie wielką nadzieję inaktywacji funkcji genu w hodowli komórek ludzkich oraz opracowania genowo specyficznych środków terapeutycznych.

PL 218 876 B1

P r z y k ł a d 3

Specyficzne hamowanie ekspresji genu przez interferencję RNA

3.1 Materiały i Metody

3.1.1 Otrzymywanie RNA i test RNAi

Chemiczną syntezę RNA, hybrydyzację i testy RNAi oparte na lucyferazie przeprowadzono w sposób opisany w przykładach 1 lub 2 lub wcześniejszych publikacjach (Tuschl i in., 1999; Zamore i in., 2000). Wszystkie dupleksy siRNA były skierowane przeciw lucyferazie świetlika, a sekwencja mRNA lucyferazy pochodziła z pGEM-luc (GenBank nr dostępu X65316) jak opisano (Tuschl i in.,

1999). Dupleksy siRNA inkubowano w reakcji D. melanogaster RNAi/translacja przez 15 minut przed dodaniem mRNA. Oparte na translacji testy RNAi przeprowadzono co najmniej w trzech powtórzeniach.

W celu zmapowania rozszczepiania sensownego docelowego RNA wytworzono 177-nt transkrypt odpowiadający sekwencji lucyferazy świetlika pomiędzy pozycjami 113-273 względem kodonu start, a dalej 17-nt dopełnienie sekwencji promotora SP6. W celu zmapowania rozszczepiania antysensownego docelowego RNA wytworzono 166-nt transkrypt z matrycy, którą amplifikowano z sekwencji plazmidu metodą PCR z zastosowaniem 5'-startera TAATACGACTCACTATAGAGCCCATATCGTTTCATA (podkreślony promotor T7) i 3'-startera AGAGGATGGAACCGCTGG. Sekwencja docelowa odpowiada dopełnieniu sekwencji lucyferazy świetlika pomiędzy pozycjami 50-215 względem kodonu start. Znakowanie transferazy guanylanowej przeprowadzono w sposób wcześniej opisany (Zamore i in., 2000). W celu zmapowania rozszczepiania docelowego RNA 100 nM dupleksu siRNA inkubowano z 5 do 10 nM docelowego RNA w lizacie embrionów D. melanogaster w zwykłych warunkach (Zamore i in., 2000) przez 2 godziny w 25°C. Reakcję zatrzymano przez dodanie 8 objętości buforu proteinazy K (200 mM Tris-HCl pH 7,5, 25 mM EDTA, 300 mM NaCl, 2% wag./obj. dodecylosiarczan sodu). Proteinazę K (E. M. Merck, rozpuszczoną w wodzie) dodano do końcowego stężenia 0,6 mg/ml. Następnie reakcje inkubowano przez 15 minut w 65°C, wyekstrahowano mieszaniną fenol/chloroform/alkohol izoamylowy (25:24:1) i wytrącono trzema objętościami etanolu. Próbki umieszczonej na 6% żelach do sekwencjonowania. Wzorce wielkości wytworzono przez częściowe rozszczepianie RNazą T1 i częściową hydrolizę zasadową znakowanych w czapeczce sensownych lub antysensownych docelowych RNA.

3.2 Wyniki

3.2.1 Zmienność jednoniciowych wiszących 3'-końców w dupleksach 21-nt siRNA

Jak opisano powyżej, dupleksy siRNA mające 2 lub 3 niesparowane nukleotydy na 3'-końcu są bardziej skuteczne w kierowaniu degradacją docelowego RNA niż odpowiednie dupleksy z tępymi końcami. Aby przeprowadzić pełniejszą analizę funkcji końcowych nukleotydów zsyntetyzowano pięć 21-nt sensownych siRNA, z których każdy był dłuższy o jeden nukleotyd względem docelowego RNA oraz osiem 21-nt antysensownych siRNA, z których każdy był dłuższy o jeden nukleotyd względem docelowego RNA (fig. 11A). Przez połączenie sensownych i antysensownych siRNA, otrzymano osiem serii dupleksów siRNA z syntetycznymi jednoniciowymi wiszącymi końcami pokrywającymi zakres od 7-nt jednoniciowego wiszącego 3'-końca do 4-nt jednoniciowego wiszącego 5'-końca. Interferencję dupleksów siRNA zmierzono z użyciem podwójnego układu testowego lucyferazy (Tuschl i in., 1999; Zamore i in., 2000). Dupleksy siRNA były skierowane przeciw mRNA lucyferazy świetlika, a mRNA lucyferazy Renilla reniformis zastosowano jako wewnętrzną kontrolę. Stosunek luminescencji aktywności lucyferazy docelowej do kontrolnej wyznaczono w obecności dupleksu siRNA i normalizowano względem stosunku obserwowanego przy braku dsRNA. Dla porównania, stosunki interferencji dla długich dsRNA (39-504 pz) przedstawiono na fig. 11B. Stosunki interferencji wyznaczono w stężeniach 5 nM dla dłuższych dsRNA (fig. 11A) i 100 nM dla dupleksów siRNA (fig. 11C-J). Wybrano 100 nM stężenia siRNA, H gdyż całkowita obróbka 5 nM dsRNA o długości 504 pz wytworzy całkowite 120 nM stężenie dupleksów siRNA.

Zdolność 21-nt dupleksów siRNA do kierowania RNAi zależy od liczby nukleotydów jednoniciowego wiszącego końca lub tworzonych par zasad. Dupleksy z czterema do sześciu nukleotydami jednoniciowego wiszącego 3'-końca nie były zdolne do kierowania RNAi (fig. 11C-F), tak jak dupleksy z dwoma lub większą liczbą nukleotydów jednoniciowego wiszącego 5'-końca (fig. 11G-J). Dupleksy z 2-nt jednoniciowymi wiszącymi 3'-końcami były najskuteczniejsze w kierowaniu interferencją RNA, jednak wydajność wyciszania była także zależna od sekwencji i obserwowano do 12-krotne różnice dla różnych dupleksów siRNA z 2-nt jednoniciowymi wiszącymi 3'-końcami (porównaj fig. 11D-H). Dupleksy z tępymi końcami, z 1-nt jednoniciowym wiszącym 5'-końcem lub 1- do 3-nt jednoniciowym

PL 218 876 B1 wiszącym 3'-końcem były czasami funkcjonalne. Niewielki efekt wyciszania obserwowany dla dupleksu siRNA z 7-nt jednoniciowym wiszącym 3'-końcem (fig. 11C) może wynikać raczej z efektu antysensownego długiego jednoniciowego wiszącego 3'-końca niż z RNAi. Porównanie wydajności RNAi pomiędzy długimi dsRNA (fig. 11B) i najskuteczniejszymi 21-nt dupleksami siRNA (fig. 11E, G, H) wskazuje, że pojedynczy dupleks siRNA w stężeniu 100 nM może być tak skuteczny jak 5 nM dsRNA o długości 504 pz.

3.2.2 Zmienność długości sensownego siRNA sparowanego z niezmiennym 21-nt antysensownym siRNA

Aby zbadać wpływ długości siRNA na RNAi otrzymano trzy serie dupleksów siRNA przez połączenie trzech 21-nt nici antysensownych z ośmioma 18- do 25-nt nićmi sensownymi. Jednoniciowy wiszący 3'-koniec antysensownego siRNA miał ustaloną długość 1, 2 lub 3 nt dla każdej serii dupleksów siRNA, podczas gdy sensowny siRNA różnił się na swoim 3'-końcu (fig. 12A). Niezależnie od długości sensownego siRNA stwierdzono, że dupleksy z 2-nt w jednoniciowym wiszącym 3'-końcu antysensownego siRNA (fig. 12C) były bardziej aktywne niż te z 1- lub 3-nt jednoniciowym wiszącym 3'-końcem (fig. 12B, D). W pierwszej serii z 1-nt jednoniciowym wiszącym 3'-końcem antysensownego siRNA, dupleksy z 21- i 22-nt sensownymi siRNA, niosące odpowiednio 1- i 2-nt wiszący 3'-koniec sensownego siRNA, były najbardziej aktywne. Dupleksy z 19-25-nt sensownymi siRNA były także zdolne do kierowania RNAi, ale w mniejszym stopniu. Podobnie, w drugiej serii z 2-nt jednoniciowym wiszącym końcem antysensownego siRNA, 21-nt dupleks siRNA z 2-nt jednoniciowym wiszącym 3'-końcem był najbardziej aktywny i jakiekolwiek inne połączenie z 18- do 25-nt sensownym siRNA było aktywne w istotnym stopniu. W ostatniej serii z 3-nt jednoniciowym wiszącym 3'-końcem antysensownego siRNA, tylko dupleks z 20-nt sensownym siRNA i 2-nt sensownym jednoniciowym wiszącym 3'-końcem był zdolny do zmniejszenia ekspresji docelowego RNA. Reasumując, wyniki te wskazują, że ważne są długość siRNA, a także długość jednoniciowego wiszącego 3'-końca oraz, że dupleksy 21-nt siRNA z 2-nt jednoniciowym wiszącym 3'-końcem są optymalne dla RNAi.

3.2.3 -Zmienność długości dupleksów siRNA ze stałym dwunukleotydowym jednoniciowym wiszącym 3'-końcem.

Następnie zbadano wpływ równoczesnego zmieniania długości obu nici siRNA przez utrzymanie symetrycznych 2-nt jednoniciowych wiszących 3'-końców (fig. 13A). Otrzymano dwie serie dupleksów siRNA zawierające 21-nt dupleks siRNA z fig. 11H jako odniesienie. Długość dupleksów zmieniano w zakresie 20-25 pz przez wydłużanie sparowanego segmentu na 3'-końcu sensownego siRNA (fig. 13B) lub 3'-końcu antysensownego siRNA (fig. 13C). Dupleksy o długości 20-23 pz wywoływały specyficzną represję aktywności docelowej lucyferazy, ale 21-nt dupleks siRNA był co najmniej ośmiokrotnie bardziej wydajny niż którykolwiek z innych dupleksów. 24- i 25-nt dupleksy siRNA nie wywołały jakiejkolwiek wykrywalnej interferencji. Efekty specyficzne dla sekwencji były mniejsze, gdyż zmiany na obu końcach dupleksu wywołały podobne efekty.

3.2.4 2'-Deoksy- i 2'-O-metylo-modyfikowane dupleksy siRNA

Aby ocenić istotność reszt rybozy w siRNA dla RNAi, zbadano 21-nt dupleksy siRNA z 2-nt jednoniciowymi wiszącymi 3'-końcami z 2'-deoksy- lub 2'-O-metylo-modyfikowanymi nićmi (fig. 14). Podstawienie 2-nt jednoniciowych wiszących 3'-końców przez 2'-deoksynukleotydy nie wywołało żadnego efektu, a nawet w wyniku zastąpienia dwóch dodatkowych rybonukleotydów przyległych do jednoniciowych wiszących końców w regionie sparowanym uzyskano znacząco aktywne siRNA. Zatem 8 z 42 nt dupleksu siRNA zastąpiono przez reszty DNA bez utraty aktywności. Jednakże całkowite podstawienie jednej lub obu nici siRNA przez reszty 2'-deoksy zniosło RNAi, tak jak podstawienie resztami 2'-O-metylowanymi.

3.2.5 Definicja miejsc rozszczepiania docelowego RNA

Pozycje rozszczepiania docelowego RNA wcześniej wyznaczono dla 22-nt dupleksów siRNA oraz dupleksu 21-nt/22-nt. Stwierdzono, że pozycja rozszczepiania docelowego RNA była umiejscowiona w centrum regionu pokrytego przez dupleks siRNA, 11 lub 12 nt w dół od pierwszego nukleotydu komplementarnego do 21- lub 22-nt kierującej sekwencji siRNA. Pięć różnych 21-nt dupleksów siRNA z 2-nt jednoniciowym wiszącym 3'-końcem (fig. 15A) inkubowano ze znakowanym w 5'-czapeczce sensownym lub antysensownym docelowym RNA w lizacie D. melanogaster (Tuschl i in., 1999; Zamore i in., 2000). 5'-produkty rozszczepiania rozdzielano na żelach do sekwencjonowania (fig. 15B). Ilość rozszczepionego sensownego docelowego RNA korelowała z wydajnością dupleksów siRNA wyznaczoną w teście opartym na translacji, a dupleksy siRNA 1, 2 i 4 (fig. 15B i 11H, G, E) rozszczepiały docelowy RNA szybciej niż dupleksy 3 i 5 (fig. 15B i 11F, D). Warto zauważyć, że suma radioakPL 218 876 B1 tywności 5'-produktu rozszczepiania i wejściowego docelowego RNA nie były stałe w czasie oraz 5'-produkty rozszczepiania nie nagromadzały się. Przypuszczalnie produkty rozszczepiania, gdy zostaną już uwolnione z kompleksu siRNA-endonukleaza, są szybko rozkładane ze względu na brak zarówno ogona poli(A), jak i 5'-czapeczki.

Miejsca rozszczepiania dla obydwu sensownego i antysensownego docelowego RNA były umiejscowione w środku regionu pokrytego przez dupleksy siRNA. Miejsca rozszczepiania dla każdego docelowego dupleksu wytworzone przez pięć różnych dupleksów różniły się o 1-nt zgodnie z 1-nt przesunięciem dupleksów wzdłuż docelowych sekwencji. Docelowe sekwencje były rozszczepiane precyzyjnie 11-nt w dół od pozycji docelowej komplementarnej do najbliższego 3'-końca nukleotydu komplementarnego do sekwencji kierującego siRNA (fig. 15A, B).

Aby stwierdzić, czy 5'- czy 3'-koniec kierującego siRNA kieruje rozszczepianiem docelowego RNA opracowano strategię doświadczalną wyjaśnioną na fig. 16A i B. 21-nt antysensowny siRNA, który w tym badaniu był niezmienny, sparowano z sensownymi siRNA, które były zmodyfikowane na swoich 5' - lub 3'-końcach. Pozycję rozszczepiania sensownego lub antysensownego docelowego RNA wyznaczono w sposób opisany powyżej. Zmiany 3'-końca sensownego siRNA, monitorowane dla

1- nt jednoniciowego wiszącego 5'-końca do 6-nt jednoniciowego wiszącego 3'-końca nie wpłynęły na pozycję rozszczepiania ani sensownego ani antysensownego RNA (fig. 16C). Zmiany na 5'-końcu sensownego siRNA nie wpłynęły na rozszczepianie docelowego sensownego RNA (fig. 16D, górna część), co przewidywano, gdyż antysensowny siRNA nie był zmieniony. Jednakże rozszczepianie antysensownego docelowego RNA było zmieniane i silnie zależało od 5'-końca sensownego siRNA (fig. 16D, dolna część). Antysensowny docelowy RNA był rozszczepiany tylko wtedy, gdy sensowny siRNA miał długość 20- lub 21-nt oraz pozycja rozszczepiania różniła się o 1-nt, co sugerowało, że 5'-koniec siRNA rozpoznającego docelowy RNA kieruje rozszczepianiem docelowego RNA. Pozycja była umiejscowiona pomiędzy 10 a 11 nukleotydem licząc w górę od docelowego nukleotydu sparowanego z najbliższym 5'-końca nukelotydem kierującego siRNA (patrz także fig. 15A).

3.2.6 Efekty sekwencji i podstawienia 2'-deoksy w jednoniciowym wiszącym 3'-końcu

Dwunukleotydowy jednoniciowy wiszący 3'-koniec jest korzystny dla działania siRNA. Próbowano stwierdzić, czy sekwencja nukleotydowa jednoniciowego wiszącego końca wpływa na rozpoznanie docelowego RNA lub czy jest to tylko cecha wymagana do odtworzenia kompleksu endonukleazy (RISC lub siRNP). Zsyntetyzowano sensowne i antysensowne siRNA z AA, CC, GG, UU i UG jednoniciowymi wiszącymi 3'-końcami i włączono modyfikacje 2'-deoksy TdG i TT. SiRNA typu dzikiego zawierały AA w sensownym jednoniciowym wiszącym 3'-końcu i UG w antysensownym jednoniciowym wiszącym 3'-końcu (AA/UG). Wszystkie dupleksy siRNA były funkcjonalne w teście interferencji i obniżały ekspresję docelowego RNA co najmniej pięciokrotnie (fig. 17). Najskuteczniejsze dupleksy siRNA, które obniżały ekspresję docelowego RNA ponad dziesięciokrotnie, miały sekwencje typu NN/UG, NN/UU, NN/TdG, i NN/TT (N, dowolny nukleotyd). Dupleksy siRNA z antysensownym siRNA zawierającym jednoniciowy wiszący 3'-koniec AA, CC lub GG były dwu- do czterokrotnie mniej aktywne w porównaniu z sekwencją typu dzikiego UG lub zmutowaną UU. To obniżenie wydajności RNAi prawdopodobnie wynika z wpływu przedostatniego nukleotydu 3' na zależne od sekwencji rozpoznanie docelowego RNA, gdyż zmiana 3'-końcowego nukleotydu z G do U nie wywołała żadnego efektu.

Zmiany sekwencji jednoniciowego wiszącego 3'-końca sensownego siRNA nie ujawniły jakichkolwiek efektów zależnych od sekwencji, co przewidywano, gdyż sensowny siRNA nie może U wpływać na rozpoznanie sensownego docelowego mRNA.

3.2.7 Specyficzność rozpoznawania docelowej sekwencji

Aby zbadać specyficzność rozpoznawania docelowej sekwencji wprowadzono zmiany w sekwencji sparowanych segmentów dupleksów siRNA i wyznaczono wydajność wyciszania. Zmiany w sekwencji wprowadzono przez odwrócenie krótkich segmentów o długości 3- lub 4-nt lub przez mutacje punktowe (fig. 18). Zmiany w sekwencji jednej nici siRNA kompensowano w komplementarnej nici siRNA aby zapobiec zaburzeniom sparowanej struktury dupleksu siRNA. Sekwencją wszystkich

2- nt jednoniciowych wiszących 3'-końców było TT (T, 2'-deoksytymidyna), w celu zmniejszenia kosztów syntezy. Dupleks siRNA referencyjny TT/TT był porównywalny w RNAi z dupleksem siRNA typu dzikiego AA/UG (fig. 17). Zdolność do kierowania rozkładem reporterowego mRNA oznaczono za pomocą opartego na translacji testu luminescencji. Dupleksy siRNA z odwróconymi segmentami sekwencji wykazały radykalnie obniżoną zdolność rozszczepiania docelowego reporterowego mRNA lucyferazy świetlika (fig. 18). Zmiany sekwencji umiejscowione pomiędzy 3'-końcem i środkiem antysensownego siRNA całkowicie znosiły rozpoznawanie docelowego RNA, ale mutanty w pobliżu

PL 218 876 B1

5'-końca antysensownego siRNA wykazywały niewielki stopień wyciszania. Transwersja A/U pary zasad umiejscowionej bezpośrednio naprzeciw przewidywanego miejsca rozszczepiania docelowego RNA lub jeden nukelotyd od przewidywanego miejsca przeciwdziałała rozszczepianiu docelowego RNA, co wskazywało, że pojedyncza mutacja w centrum dupleksu siRNA rozróżnia pomiędzy błędnie sparowanymi docelowymi sekwencjami.

3.3 Dyskusja siRNA są cennymi czynnikami do inaktywacji ekspresji genów, nie tylko w komórkach owadzich, ale także w komórkach ssaczych, z dużymi możliwościami zastosowań terapeutycznych. Systematycznie zanalizowano determinanty strukturalne dupleksów siRNA wymaganych do wywoływania wydajnego rozkładania docelowego RNA w lizacie embrionów D. melanogaster, co dostarcza zasad projektowania najsilniejszych dupleksów siRNA. Perfekcyjny dupleks siRNA jest zdolny wyciszyć ekspresję genu z wydajnością porównywalną do dsRNA o długości 500 pz, pod warunkiem, że stosuje się porównywalne ilości całkowitego RNA.

3.4 Wskazówki dla użytkownika siRNA

Skutecznie wyciszające dupleksy siRNA korzystnie składają się z 21-nt antysensownych siRNA i powinny być wybrane tak by tworzyły podwójną helisę o długości 19 pz z 2-nt jednoniciowymi wiszącymi 3'-końcami. Podstawienia 2'-deoksy rybonukleotydów w 2-nt jednoniciowym wiszącym 3'-koń-cu nie wpływają na RNAi, ale pomagają zmniejszyć koszty syntezy RNA i mogą zwiększyć odporność na RNAzę dupleksów siRNA. Jednakże bardziej rozległe modyfikacje 2'-deoksy lub 2'-O-metylo zmniejszają zdolność siRNA do kierowania RNAi, prawdopodobnie przez interferencję z wiązaniem białka przy składaniu siRNAP.

Rozpoznanie docelowego RNA jest procesem wysoce specyficznym względem sekwencji, kierowanym przez siRNA komplementarny do docelowego RNA. Najbliższy 3'-końca nukelotyd kierującego siRNA nie wpływa na specyficzność rozpoznania docelowego RNA, podczas gdy przedostatni nukleotyd jednoniciowego wiszącego 3'-końca wpływa na rozszczepianie docelowego RNA i błędne sparowanie ogranicza RNAi dwu- do czterokrotnie. Koniec 5' kierującego siRNA także wydaje się być bardziej skłonny do rozpoznania docelowego RNA przy błędnym parowaniu, w porównaniu z 3'-końcem. Nukleotydy w centrum siRNA, umiejscowione naprzeciw miejsca rozszczepiania docelowego RNA, są ważnymi determinantami specyficzności oraz nawet pojedyncze zmiany nukleotydowe zmniejszają RNAi do niewykrywalnego poziomu. Sugeruje to, że dupleksy siRNA mogą być zdolne do rozróżniania pomiędzy zmutowanymi lub polimorficznymi allelami w doświadczeniach skierowania do genu, co może się stać istotną cechą do przyszłych zastosowań terapeutycznych.

Zasugerowano, że sensowne i antysensowne siRNA, gdy są związane ze składnikami białkowymi kompleksu endonukleazy lub kompleksu w który jest on zaangażowany, odgrywają różne role; względna orientacja dupleksu siRNA w tym kompleksie wyznacza, która nić może być użyta do rozpoznania docelowego RNA. Syntetyczne dupleksy siRNA wykazują podwójną symetrię w odniesieniu do podwójnie-helikalnej struktury, ale nie w odniesieniu do sekwencji. Związanie dupleksów siRNA z białkami RNAi w lizacie D. melanogaster prowadzi do wytworzenia dwóch asymetrycznych kompleksów. W takich hipotetycznych kompleksach, środowisko chiralne różni się dla sensownego i antysensownego siRNA, podobnie jak ich funkcja. Przewidywania tego oczywiście nie stosuje się do palindromicznych sekwencji siRNA lub do białek RNAi, które mogą wiązać się jako homodimery. Aby zminimalizować efekty sekwencyjne, które mogą wpływać na stosunek sensownych i antysensownych skierowanych siRNP, sugeruje się zastosowanie sekwencji siRNA z identycznymi sekwencjami jednoniciowych wiszących 3'-końców. Zaleca się dostosowanie sekwencji jednoniciowego wiszącego końca sensownego siRNA do antysensownego jednoniciowego wiszącego 3'-końca, gdyż sensowny siRNA nie ma docelowego RNA w typowych doświadczeniach wyciszania. Asymetria w odtwarzaniu sensownych i antysensownych rozszczepiających siRNP może być (częściowo) odpowiedzialna za zmienność wydajności RNAi obserwowaną dla różnych 21-nt dupleksów siRNA z 2-nt jednoniciowymi wiszącymi 3'-końcami, stosowanych w tym badaniu (fig. 14). Alternatywnie, sekwencja nukleotydowa w miejscu docelowym i/lub dostępność struktury docelowego RNA może odpowiadać za zmienność wydajności tych dupleksów siRNA.

PL 218 876 B1

Literatura

Bass, B. L. (2000). Double-stranded RNA as a template for gene silencing. Cell 101, 235-238.

Bosher, J. M. i Labouesse, M. (2000). RNA interference: genetic wand and genetic watchdog. Nat. Cell Biol. 2, E31-36.

Caplen, N. J., Fleenor, J., Fire, A. i Morgan, R. A. (2000). dsRNA-mediated gene silencing in cultured Drosophila cells: a tissue culture model for the analysis of RNA interference. Gene 252, 95-105.

Catalanotto, C., Azzalin, G., Macino, G. i Cogoni, C. (2000). Gene silencing in worms and fungi.

Nature 404, 245.

Chanfreau, G., Buckie, M. i Jacquier, A. (2000). Recognition of a conserved class of RNA tetraloops by Saccharomyces cerevisiae RNase III. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 3142-3147.

Clemens, M. J. (1997). PKR-a protein kinase regulated by double-stranded RNA. Int. J. Biochem. Cell Biol. 29, 945-949.

Cogoni, C. i Macino, G. (1999). Homology-dependent gene silencing in plants and fungi: a number of variations on the same theme. Curr. Opin. Microbiol. 2, 657-662.

Dalmay, T., Hamilton, A., Rudd, S., Angell, S. i Baulcombe, D. C. (2000). An RNA-dependent RNA polymerase gene in Arabidopsis is required for posttranscriptional gene silencing mediated by a transgene but not by a virus. Cell 101, 543-553.

Dernburg, A. F., Zalevsky, J., Colaiacovo, M. P. i Villeneuve, A. M. (2000). Transgene-mediated cosuppression in the C. elegans germ line. Genes & Dev. 14, 1578-1583.

Dunn, J. J. (1982). Ribonuclease III. W The enzymes, tom 15, część B, P. D. Boyer, red. (New York: Academic Press), str. 485-499.

Filippov, V., Solovyev, V., Filippova, M. i Gill, S. S. (2000). A novel type of RNase III family proteins in eukaryotes. Gene 245, 213-221.

Fire, A. (1999). RNA-triggered gene silencing. Trends Genet. 15, 358-363.

Fire, A., Xu, S., Montgomery, M. K., Kostas, S. A., Driver, S. E. i Mello, C. C. (1998). Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature 391, 806-811.

Grishok, A., Tabara, H. i Mello, C. C. (2000). Genetic requirements for inheritance of RNAi in

C. elegans. Science 287, 2494-2497.

Hamilton, A. J. i Baulcombe, D. C. (1999). A species of smali anti-sense RNA in posttranscriptional gene silencing in plants. Science 286, 950-952.

Hammond, S. M., Bernstein, E., Beach, D. i Hannon, G. J. (2000). An RNA-directed nuclease mediates post-transcriptional gene silencing in Drosophila cells. Nature 404, 293-296.

Jacobsen, S. E., Running, M. P. i M., M. E. (1999). Disruption of an RNA helicase/RNase III gene in Arabidopsis causes unregulated cell division in floral meristems. Development 126, 5231-5243.

Jensen, S., Gassama, M. P. i Heidmann, T. (1999). Taming of trans-posable elements by homology-dependent gene silencing. Nat. Genet. 21, 209-212.

Kehlenbach, R. H., Dickmanns, A. & Gerace, L. (1998). Nucleocytoplasmic shuttling factors including Ran and CRM1 mediate nuclear export of NFAT In vitro. J. Cell Biol. 141, 0 863-874.

Kennerdell, J. R. i Carthew, R. W. (1998). Use of dsRNA-mediated genetic interference to demonstrate that frizzled and frizzled 2 act in the wingless pathway. Cell 95, 1017-1026.

Ketting, R. F., Haverkamp, T. H., van Luenen, H. G. I Plasterk, R. H. (1999). Mut-7 of C. elegans, required for transposon silencing and RNA interference, is a homolog of Werner syndrome helicase and RNaseD. Cell 99, 133-141.

Ketting, R. F. i Plasterk, R. H. (2000). A genetic link between co-suppression and RNA interference in C. elegans. Nature 404, 296-298.

Lucy, A. P., Guo, H. S., Li, W. X. i Ding, S. W. (2000). Suppression of post-transcriptional gene silencing by a plant viral protein localized in the nucleus. EMBO J. 19, 1672-1680.

Matsuda, S., Ichigotani, Y., Okuda, T., Irimura, T., Nakatsugawa, S. i Hamaguchi, M. (2000). Molecular cloning and characterization of a novel human gene (HERNA) which encodes a putative RNA-helicase. Biochim. Biophys. Acta 31, 1-2.

Milligan, J.F. i Uhlenbeck, O.C. (1989). Synthesis of small RNAs using T7 RNA polymerase. Methods Enzymol. 180, 51-62.

Mourrain, P., Beclin, C., Elmayan, T., Feuerbach, F., Godon, C., Morel, J. B., Jouette, D., Lacombe, A. M., Nikic, S., Picault, N., Remoue, K., Sanial, M., Vo, T. A. i Vaucheret, H. (2000). Arabidopsis

PL 218 876 B1

SGS2 and SGS3 genes are required for posttranscriptional gene silencing and natural virus resistance. Cell 101, 533-542.

Ngo, H., Tschudi, C., Gull, K. i Ullu, E. (1998). Double-stranded RNA induces mRNA degradation in Trypanosoma brucei. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 14687-14692.

Nicholson, A. W. (1999). Function, mechanism and regulation of bacterial ribonucleases. FEMS Microbiol. Rev. 23, 371-390.

Oelgeschlager, M., Larrain, J., Geissert, D. i De Robertis, E. M. (2000). The evolutionary conserved BMP-binding protein Twisted gastrulation promotes BMP signalling. Nature 405, 757-763.

Pan, T. i Uhlenbeck, O. C. (1992). In vitro selection of RNAs that undergo autolytic cleavage with Pb²⁺. Biochemistry 31, 3887-3895.

Pelissier, T. i Wassenegger, M. (2000). A DNA target of 30 bp is sufficient for RNA-directed methylation. RNA 6, 55-65.

Plasterk, R. H. i Ketting, R. F. (2000). The silence of the genes. Curr. Opin. Genet. Dev. 10, 562-567.

Ratcliiff, F. G., MacFarlane, S. A. i Baulcombe, D. C. (1999). Gene Silencing without DNA. RNA-mediated crossprotection between viruses. Plant Cell 11, 1207-1216.

Robertson, H. D. (1990). Escherichia coli ribonuclease III. Methods Enzymol. 181, 189-202.

Robertson, H. D. (1982). Escherichia coli ribonuclease III cleavage sites. Cell 30, 669-672.

Romaniuk, E., McLaughlin, L. W., Neilson, T. i Romaniuk, P. J. (1982). The effect of acceptor oligoribonucleotide sequence on the T4 RNA ligase reaction. Eur J Biochem 125, 639-643.

Sharp, P. A. (1999). RNAi and double-strand RNA. Genes & Dev. 13, 139-141.

Sijen, T. i Kooter, J. M. (2000). Post-transcriptional gene-silencing: RNAs on the attack or on the defense? Bioessays 22, 520-531.

Smardon, A., Spoerke, J., Stacey, S., Klein, M., Mackin, N. i Maine, E. (2000). EGO-1 is related to RNA-directed RNA polymerase and functions in germ-line development and RNA interference in C.

elegans. Curr. Biol. 10, 169-178.

Svoboda, P., Stein, P., Hayashi, H. i Schultz, R. M. (2000). Selective reduction of dormant maternal mRNAs in mouse oocytes by RNA interference. Development 127, 4147-4156.

Tabara, H., Sarkissian, M., Kelly, W. G., Fleenor, J., Grishok, A., Timmons, L., Fire, A. i Mello, C. C. (1999). The rde-1 gene, RNA interference, and transposon silencing in C. elegans. Cell 99,

123-132.

Tuschl, T., Ng, M. M., Pieken, W., Benseler, F. i Eckstein, F. (1993). Importance of exocyclic base functional groups of central core guanosines for hammerhead ribozyme activity. Biochemistry 32,

11658-11668.

Tuschl, T., Sharp, P. A. i Bartel, D. P. (1998). Selection in vitro of novel ribozymes from a partially randomized U2 and U6 snRNA library. EMBO J. 17, 2637-2650.

Tuschl, T., Zamore, P. D., Lehmann, R. , Bartel, D. P. i Sharp, P. A. (1999). Targeted mRNA degradation by doublestranded RNA in vitro. Genes & Dev. 13, 3191-3197.

Ui-Tel, K., Zenno, S., Miyata, Y. & Saigo, K. (2000). Sensitive assay of RNA interference in Drosophila and Chinese hamster cultured cells using firefly luciferase gene as target. FEBS Letters 479, 79-82.

Verma, S. i Eckstein, F. (1999). Modified oligonucleotides: Synthesis and strategy for users. Annu. Rev. Biochem. 67, 99-134.

Voinnet O., Lederer, C. i Baulcombe, D. C. (2000). A viral movement protein prevents spread of the gene silencing signal in Nicotiana benthamiana. Cell 103, 157-167.

Wassenegger, M. (2000). RNA-directed DMA methylation. Plant Mol. Biol. 43, 203-220.

Wianny, F. i Zernicka-Goetz, M. (2000). Specific interference with gene function by doublestranded RNA in early mouse development. Nat. Cell Biol. 2, 70-75.

Wu, H., Xu, H., Miraglia, L. J. i Crooke, S. T. (2000). Humań RNase III is a 160 kDa Protein Involved in Preribosomal RNA Processing. J. Biol. Chem. 17, 17.

Yang, D., Lu, H. and Erickson, J.W. (2000) Evidence that processed small dsRNAs may mediate sequence-specific mRNA degradation during RNAi in drosophilia embryos. Curr. Biol., 10, 1191-1200.

Zamore, P. D., Tuschl, T., Sharp, P. A. i Bartel, D. P. (2000). RNAi: Double-stranded RNA directs the ATP-dependent cleavage of mRNA at 21 to 23 nucleotide intervals. Cell 101, 25-33.

Zhang, K. i Nicholson, A. W. (1997). Regulation of ribonuclease III processing by double-helical sequence antideter- minants. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 13437-13441.

Claims

1. Wyizolowana cząsteczka dwuniciowego RNA, w której każda nić RNA ma długość 19-23 nukleotydów, oraz w której co najmniej jedna nić ma jednoniciowy wiszący 3'-koniec o długości 1-3 nukleotydów, przy czym ta cząsteczka RNA jest zdolna do miejscowo specyficznej interferencji RNA.

2. Cząsteczka RNA według zastrz. 1, w której każda nić ma długość 20 - 22 nukleotydów.

3. Cząsteczka RNA według zastrz. 1 albo 2, w której jednoniciowy wiszący 3'-koniec jest stabilizowany względem degradacji.

4. Cząsteczka RNA według zastrz. 1-3, która zawiera co najmniej jeden zmodyfikowany analog nukleotydu.

5. Cząsteczka RNA według zastrz. 4, w której zmodyfikowany analog nukleotydu jest wybrany spośród rybonukleotydów ze zmodyfikowaną resztą cukrową lub szkieletem.

6. Cząsteczka RNA według zastrz. 4 albo 5, w której analog nukleotydu jest rybonukleotydem ze zmodyfikowaną resztą cukrową, przy czym grupa 2'-OH jest zastąpiona grupą wybraną spośród H, OR, R, atomu chlorowca, SH, SR, NH2, NHR, NR2 i CN, gdzie R oznacza C1-C6 alkil, C1-C6 alkenyl lub C1-C6 alkinyl, a atom chlorowca oznacza F, Cl, Br lub I.

7. Cząsteczka RNA według zastrz. 4 albo 5, w której analog nukleotydu jest rybonukleotydem ze zmodyfikowanym szkieletem zawierającym grupę tiofosforanową.

8. Cząsteczka RNA według zastrz. 1-7, mająca sekwencję o identyczności co najmniej 70% z wcześniej ustaloną docelową cząsteczką mRNA.

9. Sposób wytwarzania cząsteczki dwuniciowego RNA określonej w zastrz. 1-8, znamienny tym, że (a) syntetyzuje się dwie nici RNA, każda o długości 19-23 nukleotydów, a ponadto co najmniej jedna nić ma jednoniciowy wiszący 3'-koniec o długości 1-3 nukleotydów, przy czym te nici RNA są zdolne do utworzenia cząsteczki dwuniciowego RNA, oraz (b) łączy się zsyntetyzowane nici RNA w warunkach, w których tworzona jest cząsteczka dwuniciowego RNA, zdolna do miejscowo specyficznej interferencji RNA.

10. Sposób według zastrz. 9, znamienny tym, że nici RNA syntetyzuje się chemicznie.

11. Sposób według zastrz. 9, znamienny tym, że nici RNA syntetyzuje się enzymatycznie.

12. Zastosowanie cząsteczki dwuniciowego RNA określonej w zastrz. 1-8 do wytwarzania leku do modulowania działania genu związanego z patogenem.

13. Zastosowanie według zastrz. 12, w którym gen związany z patogenem jest genem wirusowym.

14. Zastosowanie cząsteczki dwuniciowego RNA określonej w zastrz. 1-8 do wytwarzania leku do modulowania działania genu związanego z nowotworem.

15. Zastosowanie cząsteczki dwuniciowego RNA określonej w zastrz. 1-8 do wytwarzania leku do modulowania działania genu związanego z chorobą autoimmunologiczną.

16. Sposób in vitro kierowania miejscowo specyficznymi interferencjami RNA w komórce, znamienny tym, że (a) kontaktuje się tę komórkę z cząsteczką dwuniciowego RNA określoną w zastrz. 1-8 w warunkach, w których mogą zachodzić miejscowo specyficzne interferencje RNA, oraz (b) kieruje się miejscowo specyficzną interferencją RNA wywieraną przez dwuniciowy RNA na docelowym kwasie nukleinowym mającym część sekwencji zasadniczo odpowiadającą dwuniciowemu RNA.

17. Sposób według zastrz. 16, znamienny tym, że kontaktowanie obejmuje wprowadzenie tej cząsteczki dwuniciowego RNA do docelowej komórki, w której może zajść miejscowo specyficzna interferencja RNA.

18. Sposób według zastrz. 17, znamienny tym, że wprowadzenie obejmuje dostarczenie z użyciem nośnika lub iniekcję.

19. Zastosowanie sposobu in vitro określonego w zastrz. 16-18, do ustalania działania genu w komórce.

20. Zastosowanie sposobu in vitro określonego w zastrz. 16-18, do modulowania działania genu w komórce.

21. Zastosowanie według zastrz. 19 albo 20, w którym gen jest związany ze stanem patologicznym.

PL 218 876 B1

22. Środek farmaceutyczny zawierający substancję czynną oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik, znamienny tym, że jako substancję czynną zawiera co najmniej jedną cząsteczkę dwuniciowego RNA określoną w zastrz. 1-8.

23. Środek według zastrz. 22, znamienny tym, że jest przeznaczony do zastosowań diagnostycznych.

24. Środek według zastrz. 22, znamienny tym, że jest przeznaczony do zastosowań terapeutycznych.

25. Komórka eukariotyczna transfekowana cząsteczką RNA określoną w zastrz. 1-8 lub cząsteczką DNA kodującą tę cząsteczkę RNA.

26. Komórka według zastrz. 25, będąca komórką ssaczą.

27. Komórka według zastrz. 26, będąca komórką ludzką.

28. Komórka według zastrz. 25-27, transfekowana ponadto co najmniej jednym egzogennym docelowym kwasem nukleinowym kodującym docelowe białko lub wariant lub zmutowaną postać docelowego białka, przy czym ten egzogenny docelowy kwas nukleinowy różni się od endogennego genu docelowego na poziomie kwasu nukleinowego, tak że ekspresja egzogennego docelowego kwasu nukleinowego jest zasadniczo mniej hamowana przez cząsteczkę dwuniciowego RNA niż ekspresja endogennego genu docelowego.

29. Komórka według zastrz. 28, gdzie egzogenny docelowy kwas nukleinowy jest zfuzowany z kolejną sekwencją kwasu nukleinowego kodującą wykrywalny peptyd lub polipeptyd.

30. Zastosowanie komórki eukariotycznej określonej w zastrz. 25-29 w procedurach analitycznych.

31. Zastosowanie według zastrz. 30, do analizy profili ekspresji genów.

32. Zastosowanie według zastrz. 30, do analizy proteomu.

33. Zastosowanie według zastrz. 30-32, w którym prowadzi się analizę wariantu lub zmutowanej postaci docelowego białka kodowanego przez egzogenny docelowy kwas nukleinowy.

34. Zastosowanie według zastrz. 33 do identyfikacji domen funkcjonalnych docelowego białka.

35. Zastosowanie według zastrz. 30-34, w którym prowadzi się porównanie co najmniej dwóch komórek wybranych spośród:

(i) kontrolnej komórki bez zahamowania docelowego genu;

36. Zastosowanie według zastrz. 30-35, w którym analiza obejmuje analizę funkcjonalną i/lub fenotypową.

37. Zastosowanie według zastrz. 36 do wyodrębniania białek lub kompleksów białkowych z komórek eukariotycznych.

38. Zastosowanie według zastrz. 37 do wyodrębniania wysokocząsteczkowych kompleksów białkowych, które mogą dodatkowo zawierać kwasy nukleinowe.

39. Zastosowanie komórki eukariotycznej określonej w zastrz. 25-29 w procedurach preparatywnych.

40. Zastosowanie według zastrz. 30-39 w procedurze identyfikacji i/lub charakteryzacji środków farmakologicznych.