ES2215494T3 - Moleculas de rna pequeñas que median la interferencia de rna. - Google Patents
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Abstract
Molécula de RNA bicatenario aislada, en la cual cada cadena de RNA tiene una longitud de 19-25 nucleótidos, en la cual cada molécula de RNA es capaz de modificaciones de ácido nucleico específicas en cuanto a la diana.
Description
Moléculas de RNA pequeñas que median la
interferencia de RNA.
La presente invención se refiere a
características de secuencia y estructurales de moléculas de RNA
bicatenario (ds) que se requieren para mediar la interferencia de
RNA específica de la diana.
La expresión "interferencia de RNA" (RNAi)
fue acuñada después del descubrimiento de que la inyección de dsRNA
en el nematodo C. elegans conduce a silenciación específica
de genes altamente homólogos en secuencia al dsRNA administrado
(Fire et al., 1998). Se observó posteriormente también RNAi
en insectos, ranas (Oelgeschlager et al., 2000) y otros
animales con inclusión de ratones (Svoboda et al., 2000;
Wianny y Zernicka-Goetz, 2000) y es probable que
exista también en humanos. La RNAi está ligada estrechamente al
mecanismo post-transcripcional de silenciación de
genes (PTGS) de co-supresión en plantas y muerte en
hongos (Catalanotto et al., 2000; Cogoni y Macino, 1999;
Dalmay et al., 2000; Ketting y Plasterk, 2000; Mourrain et
al., 2000; Smardon et al., 2000) y algunos componentes
de la maquinaria de RNAi son necesarios también para la silenciación
post-transcripcional por
co-supresión (Catalanotto et al., 2000;
Dernburg et al., 2000; Ketting y Plasterk, 2000). El tópico
ha sido revisado también recientemente (Bass, 2000; Bosher y
Labouesse, 2000; Fire, 1999; Plasterk y Ketting, 2000; Sharp, 1999;
Sijen y Kooter, 2000), véase también el ejemplar completo de Plant
Molecular Biology, vol. 43, número 2/3, (2000).
En las plantas, además de la PTGS, los
transgenes introducidos pueden conducir también a silenciación
transcripcional de genes por la vía de la metilación de las
citosinas del DNA dirigida por RNA (véanse referencias en
Wassenegger, 2000). Dianas genómicas tan cortas como 30 pb se
metilan en las plantas de una manera dirigida por RNA (Pelissier,
2000). La metilación de DNA está presente también en los
mamíferos.
La función natural de RNAi y la
co-supresión parece ser la protección del genoma
contra la invasión por elementos genéticos móviles tales como
retro-transposones y virus que producen RNA o dsRNA
aberrantes en la célula hospedadora cuando aquéllos se vuelven
activos (Jensen et al., 1999; Ketting et al., 1999;
Ratcliff et al., 1999; Tabara et al., 1999). La
degradación específica de mRNA previene la replicación de
transposones y virus, aunque algunos virus son capaces de resolver
o prevenir este proceso por expresión de proteínas que suprimen la
PTGS (Lucy et al., 2000; Voinnet et al., 2000).
El dsRNA desencadena la degradación específica
de RNAs homólogos únicamente dentro de la región de identidad con
el dsRNA (Zamore et al., 2000; Brenda L. Ban, 2000; Yang
et al., 2000; Elbashir et al., 2001; WO 01/7516). El
dsRNA se procesa a fragmentos de RNA de 21-23 nt y
los sitios de escisión del RNA diana se espacian regularmente con
distanciamiento de 21-23 nt. Por esta razón se ha
sugerido que los fragmentos de 21-23 nt son los RNAs
guía para reconocimiento de dianas (Zamore et al., 2000).
Estos RNAs cortos se detectaron también en extractos preparados a
partir de células Schneider 2 de D. melanogaster que se
transfectaron con dsRNA antes de la lisis celular (Hammond et
al., 2000); sin embargo, las fracciones que exhibían actividad
de nucleasa específica de la secuencia contenían también una gran
fracción de dsRNA residual. El papel de los fragmentos de
21-23 nt en el guiado de la escisión del mRNA está
respaldado adicionalmente por la observación de que fragmentos de
21-23 nt aislados de dsRNA procesado son capaces, en
cierto grado, de mediar la degradación específica del mRNA (Zamore
et al., 2000). Moléculas de RNA de tamaño similar se acumulan
también en tejido de plantas que exhibe PTGS (Hamilton y Baulcombe,
1999).
En este documento, los autores utilizan el
sistema establecido in vitro de Drosophila (Tuschl et
al., 1999; Zamore et al., 2000) para explorar
adicionalmente el mecanismo de RNAi. Se demuestra que RNAs cortos de
21 y 22 nt, cuando se aparean sus bases con extremos 3' salientes,
actúan como RNAs guía para la degradación de mRNA específica de la
secuencia. Los dsRNAs cortos de 30 pb son incapaces de mediar RNAi
en este sistema debido a que ya no se procesan a RNAs de 21 y 22
nt. Adicionalmente, se definieron los sitios de escisión de RNA
diana con relación a los RNAs de interferencia cortos de 21 y 22 nt
(siRNAs) que proporcionan evidencia de que la dirección del
procesamiento de dsRNA determina si un RNA diana de sentido o
antisentido puede ser escindido por el complejo de endonucleasas
siRNP producido. Adicionalmente, los siRNAs pueden ser también
herramientas importantes para modulación de la transcripción, v.g.
por silenciación de genes de mamífero por metilación del DNA
guía.
Experimentos ulteriores en sistemas de cultivo
de células humanas in vivo (células HeLa) demuestran que
moléculas de RNA bicatenario que tienen una longitud de
preferiblemente 19-23 nucleótidos tienen actividad
RNAi.
El objeto fundamental de la presente invención
es proporcionar nuevos agentes capaces de mediar la interferencia
de RNA específica de la diana, teniendo dichos agentes una eficacia
y seguridad mejoradas en comparación con agentes de la técnica
anterior.
La solución de este problema es proporcionada
por una molécula de RNA bicatenario aislada, en la cual cada cadena
de RNA tiene una longitud de 19-23 nucleótidos y en
la cual al menos una cadena tiene un saliente 3' de
1-3 nucleótidos, siendo dicha molécula de RNA capaz
de mediar la interferencia de RNA. Al menos una cadena tiene un
saliente 3' de 1-3 nucleótidos y muy preferiblemente
2 nucleótidos. La otra cadena puede tener extremos romos o tiene
saliente 3' de hasta 6 nucleótidos.
La molécula de RNA es preferiblemente una
molécula de RNA sintética que está sustancialmente exenta de
contaminantes existentes en extractos de células, v.g. de embriones
de Drosophila. Adicionalmente, la molécula de RNA está con
preferencia sustancialmente exenta de cualesquiera contaminantes no
específicos de la diana, particularmente moléculas de RNA no
específicas de la diana, v.g. de contaminantes existentes en
extractos celulares.
Adicionalmente, la invención se refiere al uso
de moléculas de RNA bicatenario aisladas, en donde cada cadena de
RNA tiene una longitud de 19-23 nucleótidos y en
donde al menos una cadena tiene un saliente 3' de
1-3 nucleótidos para mediar la RNAi en células de
mamífero, particularmente en células humanas.
Sorprendentemente, se ha encontrado que las
moléculas cortas sintéticas de RNA bicatenario con extremos 3'
salientes, son mediadores de RNAi específicas de la secuencia y
median la escisión eficiente del RNA diana, estando localizado el
sitio de escisión cerca del centro de la región abarcada por el RNA
guía corto.
Preferiblemente, cada cadena de la molécula de
RNA tiene una longitud de 20-22 nucleótidos,
pudiendo ser la longitud de cada cadena igual o diferente. La
longitud del saliente 3' alcanza de 1 a 3 nucleótidos, pudiendo ser
la longitud del saliente igual o diferente para cada cadena. Las
cadenas de RNA tienen preferiblemente grupos 3' hidroxilo. El
término 5' comprende preferiblemente un grupo fosfato, difosfato,
trifosfato o hidroxilo. Los dsRNAs más eficaces están compuestos de
cadenas de 21 nt que están apareadas de tal manera que están
presentes en ambos extremos del dsRNA salientes 3' de
1-3, particularmente 2 nt.
La reacción de escisión del RNA diana guiada por
siRNAs es altamente específica de la secuencia. Sin embargo, no
todas las posiciones de un siRNA contribuyen por igual al
reconocimiento de la diana. Los desapareamientos en el centro del
dúplex de siRNA son sumamente críticos y anulan esencialmente la
escisión del RNA diana. En contraste, el nucleótido 3' de la cadena
de siRNA (v.g. la posición 21) que es complementario al RNA diana
monocatenario, no contribuye a la especificidad del reconocimiento
de la diana. Adicionalmente, la secuencia del saliente 3' de 2 nt
no apareado de la cadena de siRNA con la misma polaridad que el RNA
diana no es crítico para la escisión del RNA diana dado que
únicamente la cadena de siRNA antisentido guía el reconocimiento de
la diana. Así pues, de los nucleótidos salientes monocatenarios
únicamente la posición penúltima del siRNA antisentido (v.g., la
posición 20) precisa coincidir con el mRNA de sentido de la
diana.
Sorprendentemente, las moléculas de RNA
bicatenario de la presente invención exhiben una alta estabilidad
in vivo en suero o en medio de crecimiento para cultivos
celulares. Con objeto de mejorar adicionalmente la estabilidad, los
salientes 3' pueden estabilizarse contra la degradación, v.g. pueden
seleccionarse de tal manera que estén constituidos por nucleótidos
de purina, particularmente nucleótidos de adenosina o guanosina.
Alternativamente, la sustitución de los nucleótidos de pirimidina
por análogos modificados, v.g. sustitución de salientes 3' de 2 nt
de uridina por 2'-desoxitimidina es tolerada y no
afecta a la eficiencia de la interferencia de RNA. La ausencia de
un hidroxilo en posición 2' mejora significativamente la resistencia
a las nucleasas del saliente en el medio de cultivo de tejido.
En una realización especialmente preferida de la
presente invención, la molécula de RNA puede contener al menos un
análogo de nucleótido modificado. Los análogos de nucleótidos pueden
estar localizados en posiciones en las cuales la actividad
específica de la diana, v.g. la actividad mediadora de RNAi no se ve
afectada sustancialmente, v.g. en una región en el extremo 5' y/o
el extremo 3' de la molécula de RNA bicatenario. Particularmente,
los salientes pueden estar estabilizados por incorporación de
análogos de nucleótidos modificados.
Los análogos de nucleótidos preferidos se
seleccionan de ribonucleótidos modificados en el azúcar o la cadena
principal. Debe anotarse, sin embargo, que también son adecuados
ribonucleótidos modificados con nucleobases, es decir
ribonucleótidos que contienen una nucleobase no existente
naturalmente en lugar de una nucleobase existente naturalmente
tales como uridinas o citidinas modificadas en la posición 5, v.g.
5-(2-amino)propil-uridina,
5-bromo-uridina; adenosinas y
guanosinas modificadas en la posición 8, v.g.
8-bromo-guanosina;
desaza-nucleótidos, v.g.
7-desaza-adenosina; nucleótidos
alquilados en O y N, v.g.
N6-metil-adenosina. En los
ribonucleótidos preferidos modificados en el azúcar, el grupo
2'-OH está reemplazado por un grupo seleccionado de
H, OR, R, halo, SH, SR, NH_{2}, NHR, NR_{2} o CN, en donde R es
alquilo, alquenilo o alquinilo C_{1}-C_{6} y
halo es F, Cl, Br o I. En los ribonucleótidos preferidos modificados
en la cadena principal, el grupo fosfoéster que está conectado a
los ribonucleótidos adyacentes se reemplaza por un grupo modificado,
v.g. un grupo fosfotioato. Debe indicarse que las modificaciones
anteriores pueden combinarse.
La secuencia de la molécula de RNA bicatenario
de la presente invención debe tener una identidad suficiente con
una molécula diana de ácido nucleico a fin de mediar la RNAi
específica de la diana. Preferiblemente, la secuencia tiene una
identidad de al menos 70% con la molécula diana deseada en la
porción bicatenaria de la molécula de RNA. Más preferiblemente, la
identidad es de al menos 85% y muy preferiblemente 100% en la
porción bicatenaria de la molécula de RNA. La identidad de una
molécula de RNA bicatenario con una molécula diana de ácido
nucleico predeterminada, v.g. una molécula diana de mRNA, puede
determinarse como sigue:
I =
\frac{n}{L} \ \times \
100
donde I es la identidad en
porcentaje, n es el número de nucleótidos idénticos en la porción
bicatenaria del dsRNA y la diana y L es la longitud de la
superposición de secuencias de la porción bicatenaria del dsRNA y
la
diana.
\newpage
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Alternativamente, la identidad de la molécula de
RNA bicatenario respecto a la secuencia diana puede definirse
también incluyendo el saliente 3', particularmente un saliente que
tiene una longitud de 1-3 nucleótidos. En este
caso, la identidad de secuencia es preferiblemente al menos 70% y
más preferiblemente al menos 85% de la secuencia diana. Por
ejemplo, los nucleótidos del saliente 3' y hasta 2 nucleótidos del
término 5' y/o 3' de la doble cadena pueden modificarse sin pérdida
significativa de actividad.
La molécula de RNA bicatenario de la invención
puede prepararse por un método que comprende los pasos:
- (a)
- sintetizar dos cadenas de RNA cada una de las cuales tiene una longitud de 19 a 23 nucleótidos, teniendo al menos una de ellas un saliente 3' de 1 a 3 nucleótidos, siendo dichas cadenas de RNA capaces de formar una molécula de RNA bicatenario,
- (b)
- combinar las cadenas de RNA sintetizadas en condiciones en las cuales se forma una molécula de RNA bicatenario, que es capaz de interferencia de RNA específica de la diana.
Métodos de síntesis de moléculas de RNA se
conocen en la técnica. En este contexto, se hace referencia
particularmente a los métodos de síntesis química que se describen
en Verma y Eckstein (1998).
Los RNAs monocatenarios pueden prepararse
también por transcripción enzimática a partir de moldes de DNA
sintéticos o de plásmidos de DNA aislados de bacterias
recombinantes. Típicamente, se utilizan
RNA-polimerasas de fago tales como
RNA-polimerasa T7, T3 o SP6 (Milligan y Uhlenbeck
(1989)).
Un aspecto adicional de la presente invención se
refiere a un método in vitro de mediación de las
interferencias de RNA específicas de diana en una célula o un
organismo, que comprende los pasos:
- (a)
- poner en contacto dicha célula o dicho organismo con la molécula de RNA bicatenario de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 en condiciones en las cuales pueden ocurrir interferencias de RNA específicas de la diana, y
- (b)
- mediar una interferencia de RNA específica de la diana efectuada por el RNA bicatenario hacia un ácido nucleico diana que tiene una porción de secuencia que corresponde sustancialmente al RNA bicatenario.
Preferiblemente, el paso de puesta en contacto
(a) comprende introducir la molécula de RNA bicatenario en una
célula diana, v.g. una célula diana aislada, v.g. en cultivo de
células, un microorganismo unicelular o una célula diana o una
pluralidad de células diana en un organismo multicelular. Más
preferiblemente, el paso de introducción comprende un suministro
mediado por un portador, v.g. por portadores liposómicos o por
inyección.
El método in vitro de la invención puede
utilizarse para determinar la función de un gen en una célula o un
organismo o incluso para modular la función de un gen en una célula
o un organismo, que es capaz de mediar la interferencia de RNA. La
célula es preferiblemente una célula o una línea de células
eucariota(s), v.g. una célula vegetal o una célula animal,
tal como una célula de mamífero, v.g. una célula embrionaria, una
célula madre pluripotencial, una célula tumoral, v.g. una célula de
teratocarcinoma o una célula infectada por un virus. El organismo
es preferiblemente un organismo eucariota, v.g. una planta o un
animal, tal como un mamífero, particularmente un humano.
El gen diana al que está dirigida la molécula de
RNA de la invención puede estar asociado con una condición
patológica. Por ejemplo, el gen puede ser un gen asociado a un
patógeno, v.g. un gen viral, un gen asociado a un tumor o un gen
asociado a una enfermedad autoinmune. El gen diana puede ser también
un gen heterólogo expresado en una célula recombinante o un
organismo alterado genéticamente. Por determinación o modulación,
particularmente, inhibición de la función de un gen de este tipo
pueden obtenerse información valiosa y beneficios terapéuticos en
el campo de la agricultura o en el campo de la medicina o la
medicina veterinaria.
Otro aspecto de la presente invención se refiere
al uso de una molécula de RNA bicatenario como se define en una de
las reivindicaciones 1 a 8 para la fabricación de un medicamento
para modular la función de un gen asociado a un patógeno. En
realizaciones particularmente preferidas, el gen asociado a un
patógeno es un gen viral, un gen asociado a un tumor o un gen
asociado a una enfermedad autoinmune.
El dsRNA se administra usualmente como una
composición farmacéutica. La administración puede realizarse por
métodos conocidos, en los cuales se introduce un ácido nucleico en
una célula diana deseada in vitro o in vivo. Técnicas
de transferencia de genes utilizadas comúnmente incluyen fosfato de
calcio, DEAE-dextrano, electroporación y
microinyección, y métodos virales (Graham, F.L. y van der Eb, A.J.
(1973) Virol. 52, 456; MeCutchan, J.H. and Pagano, J.S. (1968), J.
Natl. Cancer Inst. 41, 351; Chu, G. et al (1987), Nucl. Acids
Res. 15, 1311; Fraley, R. et al. (1980), J. Biol. Chem. 255,
10431; Capecchi, M.R. (1980), Cell 22, 479). Una adición reciente a
este arsenal de técnicas para introducción de DNA en células es el
uso de liposomas catiónicos (Felgner, P.L. et al., (1987),
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 7413). Formulaciones de lípidos
catiónicos disponibles comercialmente son v.g. Tfx 50 (Promega) o
Lipofectamin 2000 (Life Technologies).
Así pues, la invención se refiere también a una
composición farmacéutica que contiene como agente activo al menos
una molécula de RNA bicatenario como se describe arriba y un
vehículo farmacéutico. La composición puede utilizarse para
aplicaciones de diagnóstico y terapéuticas en medicina humana o en
medicina veterinaria.
\global\parskip1.000000\baselineskip
Para aplicaciones diagnósticas o terapéuticas,
la composición puede encontrarse en forma de una solución, v.g. una
solución inyectable, una crema, un ungüento, una tableta, una
suspensión o análogas. La composición puede administrarse de
cualquier modo adecuado, v.g. por inyección, por aplicación oral,
tópica, nasal, rectal, etc. El vehículo puede ser cualquier
vehículo farmacéutico adecuado. Preferiblemente, se utiliza un
vehículo que es capaz de aumentar la eficacia de las moléculas de
RNA para introducirse en las células diana. Ejemplos adecuados de
vehículos de este tipo son liposomas, particularmente liposomas
catiónicos. Un método de administración particularmente preferido
es la inyección.
Una aplicación preferida adicional del método
RNAi es un análisis funcional de células eucariotas, u organismos
eucariotas no humanos, preferiblemente células u organismos de
mamífero y muy preferiblemente células humanas, v.g. líneas de
células tales como HeLa o 293 o de roedores, v.g. ratas y ratones.
Por transfección con moléculas de RNA bicatenario adecuadas que son
homólogas respecto a un gen diana predeterminado o moléculas de DNA
que codifican una molécula de RNA bicatenario adecuada, puede
obtenerse un fenotipo de desactivación específico en una célula
diana, v.g. en cultivo de células o en un organismo diana.
Sorprendentemente, se ha encontrado que la presencia de moléculas
de RNA bicatenario cortas no da como resultado una respuesta de
interferón por la célula hospedadora o el organismo hospedador.
Así, un objeto adicional de la invención es una
célula eucariota o un organismo eucariota no humano transfectado
con una molécula de RNA de la invención o una molécula de DNA que
codifica dicha molécula de RNA. Debe indicarse que la presente
invención permite una desactivación específica de la diana de varios
genes endógenos diferentes debido a la especificidad de RNAi.
Adicionalmente, la presente invención se explica
con mayor detalle en las figuras y los ejemplos siguientes.
Figura 1: Un RNA bicatenario tan corto como
38 pb puede mediar la RNAi.
(A) Representación gráfica de dsRNAs utilizados
para direccionar mRNA de Pp-luc. Se prepararon tres
series de dsRNAs con extremos romos, que cubrían un intervalo de 29
a 504 pb. La posición del primer nucleótido de la cadena de sentido
del dsRNA se indica con relación al codón de comienzo de mRNA
Pp-luc (p1). (B) Ensayo de interferencia de RNA
(Tuschl et al., 1999). Las relaciones de actividad de
Pp-luc diana a Rr-luc de control se
normalizaron para un tampón de control (barra negra). Los dsRNAs (5
nM) se preincubaron en lisado de Drosophila durante 15 min a 25ºC
antes de la adición de Pp-luc con casquete
7-metil-guanosina y mRNAs
Rr-luc (\sim 50 pM). La incubación se continuó
durante una hora más y se analizó luego por el ensayo dual de
luciferasa (Promega). Los datos son el valor medio de al menos 4
experimentos independientes \pm la desviación estándar.
Figura 2: Un dsRNA de 29 pb ya no se procesa
para dar fragmentos de 21-23 nt. Evolución
temporal de la formulación de 21-23 meros por
procesamiento de dsRNAs marcados internamente con ^{32}P (5 nM) en
el lisado de Drosophila. Se indican la longitud y la fuente del
dsRNA. Se ha cargado un marcador de tamaños de RNA (M) en la pista
de la izquierda y se indican los tamaños de los fragmentos. Las
dobles bandas para tiempo cero se deben a dsRNA incompletamente
desnaturalizado.
Figura 3: Los dsRNAs cortos escinden la diana
de mRNA una sola vez.
(A) Electroforesis en gel desnaturalizador de
los productos estables de escisión en 5' producidos por incubación
durante 1 h de RNA sentido o antisentido marcado con ^{32}P, 10 nM
en el casquete con dsRNAs 10 nM de la serie p133 en lisado de
Drosophila. Se generaron marcadores de longitud por digestión
parcial con nucleasa T1 e hidrólisis alcalina parcial (OH) del RNA
diana marcado en el casquete. Las regiones direccionadas por los
dsRNAs se indican como barras negras en ambos lados. Se muestra el
espaciamiento de 20-23 nt entre los sitios de
escisión predominantes para el dsRNA de 111 pb de longitud. La
flecha horizontal indica escisión inespecífica no debida a RNAi.
(B) Posición de los sitios de escisión en RNAs diana de sentido y
antisentido. Las secuencias de los RNAs diana de sentido de 177 nt
y antisentido de 180 nt con casquete se representan en orientación
antiparalela de tal manera que las secuencias complementarias están
enfrentadas una a otra. La región direccionada por los diferentes
dsRNAs se indica por barras de diferentes colores posicionadas entre
las secuencias diana de sentido y antisentido. Los sitios de
escisión se indican por ciclos: círculo grande para escisión
fuerte, círculo pequeño para escisión débil. El grupo fosfato
radiomarcado con ^{32}P está marcado por un asterisco.
Figura 4: Los fragmentos de RNA de 21 y 22 nt
se generan por un mecanismo semejante al de la RNasa III.
(A) Secuencias de RNAs de \sim21 nt después de
procesamiento de dsRNA. Los fragmentos de RNA de \sim21 nt
generados por procesamiento de dsRNA se clonaron y secuenciaron
direccionalmente. Los oligorribonucleótidos originarios de la
cadena de sentido del dsRNA se indican como líneas azules, y los
originarios de la cadena antisentido como líneas rojas. Se utilizan
barras gruesas si la misma secuencia estaba presente en clones
múltiples, indicando el número a la derecha la frecuencia. Los
sitios de escisión de RNA diana mediados por el dsRNA se indican
como círculos anaranjados, el círculo grande para escisión fuerte y
el círculo pequeño para escisión débil (véase la Figura 3B). Los
círculos situados en la parte superior de la cadena de sentido
indicaban sitios de escisión en el interior de la cadena de sentido
y los círculos en la parte inferior del dsRNA indican sitios de
escisión en la diana antisentido. Hasta cinco nucleótidos
adicionales se identificaron en fragmentos de \sim 21 nt
derivados de los extremos 3' del dsRNA. Estos nucleótidos son
combinaciones aleatorias constituidas predominantemente por
residuos C, G o A, y se añadieron muy probablemente sin molde
durante la transcripción por T7 de las cadenas constitutivas del
dsRNA. (B) Análisis bidimensional por TLC de la composición de
nucleótidos de RNAs de \sim 21 nt. Los RNAs de \sim 21 nt se
generaron por incubación de dsRNA Pp-luc de 504 pb
radiomarcado internamente en lisado de Drosophila, se purificaron
en gel y se digirieron luego a mononucleótidos con nucleasa P1
(fila superior) o ribonucleasa T2 (fila inferior). El dsRNA se
sometió a radiomarcación internamente por transcripción en
presencia de uno de los \alpha-^{32}P
nucleósido-trifosfatos indicados. La radioactividad
se detectó por fosfoluminiscencia. Los
nucleósido-5'-monofosfatos,
nucleósido-3'-monofosfatos,
nucleósido-5',3'-difosfatos, y el
fosfato inorgánico se indican como pN, Np, pNp, y p_{i},
respectivamente. Los círculos negros indican puntos de absorción UV
a partir de nucleótidos portadores no radiactivos. Los
3',5'-bisfosfatos (círculos rojos) se identificaron
por co-migración con patrones radiomarcados
preparados por fosforilación en 5' de nucleósido
3'-monofosfatos de con
polinucleótido-quinasa T4 y
\gamma-^{32}P-ATP.
Figura 5: Los RNAs sintéticos de 21 y 22 nt
median la escisión del RNA diana.
(A) Representación gráfica del dsRNA de control
de 52 pb y los dsRNAs sintéticos de 21 y 22 nt. La cadena de
sentido de RNAs interferentes cortos de 21 y 22 nt (siRNAs) se
representa en color azul, y la cadena antisentido en color rojo.
Las secuencias de los siRNAs se derivaron de los fragmentos clonados
de dsRNAs de 52 y 111 pb (Figura 4A), excepto en lo que respecta a
la cadena antisentido de 22 nt del dúplex 5. Los siRNAs en los
dúplex 6 y 7 eran exclusivos de la reacción de procesamiento de
dsRNA de 111 pb. Los dos nucleótidos 3' salientes indicados en
verde están presentes en la secuencia de la cadena sintética
antisentido de los dúplex 1 y 3. Ambas cadenas del dsRNA de control
de 52 pb se prepararon por transcripción in vitro, y una
fracción de los transcritos puede contener adición de nucleótido 3'
sin molde. Los sitios de escisión de RNA diana dirigidos por los
dúplex de siRNA se indican como círculos anaranjados (véase la
leyenda a la Figura 4A) y se determinaron como se muestra en la
Figura 5B. (B) Posición de los sitios de escisión en los RNAs diana
de sentido y antisentido. Las secuencias de RNA diana son como se
describe en la Figura 3B. El dsRNA de control de 52 pb (10 nM) o los
dúplex de RNA de 21 y 22 nt 1-7 (100 nM) se
incubaron con RNA diana durante 2,5 h a 25ºC en lisado de
Drosophila. Los productos estables de escisión 5' se resolvieron en
el gel. Los sitios de escisión se indican en la Figura 5A. La
región direccionada por el dsRNA de 52 pb o las cadenas de
sentido(s) o antisentido(as) se indican por las
barras negras al lado del gel. Los sitios de escisión están
localizados todos ellos dentro de la región de identidad de los
dsRNAs. Para determinación precisa de los sitios de escisión de la
cadena antisentido, se utilizó un gel de menor concentración.
Figura 6: Los salientes 3' largos en dsRNAs
cortos inhiben la RNAi.
(A) Representación gráfica de constructos de
dsRNA de 52 pb. Las extensiones 3' de la cadena de sentido y
antisentido se indican en azul y rojo, respectivamente. Los sitios
de escisión observados en los RNAs diana se representan como
círculos anaranjados análogamente a la Figura 4A, y se determinaron
como se muestra en la Figura 6B. (B) Posición de los sitios de
escisión en RNAs diana de sentido y antisentido. Las secuencias de
RNA diana son como se describe en la Figura 3B. Se incubó dsRNA (10
nM) con RNA diana durante 2,5 h a 25ºC en lisado de Drosophila. Los
productos de escisión 5' estables se resolvieron en el gel. Los
sitios de escisión principales se indican con una flecha horizontal
y se representan también en la Figura 6A. La región direccionada
por el dsRNA de 52 pb se representa como una barra negra a ambos
lados del gel.
Figura 7: Modelo propuesto para la
RNAi.
Se predice que la RNAi comienza con el
procesamiento de dsRNA (cadena de sentido en negro, cadena
antisentido en rojo) a RNAs interferentes cortos, predominantemente
de 21 y 22 nt (siRNAs). Los nucleótidos 3' salientes cortos, en
caso de estar presentes en el dsRNA, pueden ser beneficiosos para el
procesamiento de los dsRNAs cortos. Las proteínas de procesamiento
de dsRNA, que no están caracterizadas todavía, se representan como
óvalos verdes y azules, y se ensamblan en el dsRNA de manera
asimétrica. En el modelo de los autores, esto se ilustra uniendo
una proteína o un dominio hipotético de proteína azul con la cadena
de siRNA en dirección 3' a 5', en tanto que la proteína o dominio
hipotético de proteína verde se une siempre a la cadena de siRNA
opuesta. Estas proteínas o un subconjunto de las mismas se mantienen
asociadas con el dúplex de siRNA y preservan su orientación como se
determina por la dirección de la reacción de procesamiento del
dsRNA. Únicamente la secuencia de siRNA asociada con la proteína
azul es capaz de guiar la escisión del RNA diana. Se hace referencia
al complejo con endonucleasa como un complejo interferente pequeño
de ribonucleoproteína o siRNT. Se supone aquí, que la endonucleasa
que escinde el dsRNA puede escindir también el RNA diana,
probablemente por desplazamiento temporal de la cadena de siRNA
pasiva no utilizada para el reconocimiento de la diana. El RNA diana
se escinde luego en el centro de la región reconocida por el siRNA
guía complementario de la secuencia.
Figura 8: Constructos informadores y dúplex
de siRNA.
(a) Se ilustran las regiones de genes
informadores de luciferasa de luciérnaga (Pp-luc) y
pensamiento de mar (Rr-luc) de los plásmidos
pGL2-Control,
pGL-3-Control y
pRL-TK (Promega). Se indican los elementos
reguladores de SV40, el promotor HSV de
timidina-quinasa y dos intrones (líneas). La
secuencia de GL3-luciferasa es idéntica en un 95% a
GL2, pero RL no tiene relación alguna con ambas. La expresión de
luciferasa por pGL2 es aproximadamente 10 veces menor que la de
pGL3 en células de mamífero transfectadas. La región direccionada
por los dúplex de siRNA se indica como barra negra bajo la región
codificante de los genes de luciferasa. (b) Se muestran las
secuencias de sentido (arriba) y antisentido (abajo) de los dúplex
de siRNA que direccionan las luciferasas GL2, GL3 y RL. Los dúplex
de siRNA GL2 y GL3 difieren únicamente en 3 sustituciones simples de
nucleótidos (recuadrados en gris). Como control inespecífico, se
sintetizó un dúplex con la secuencia GL2 invertida, invGL2. El
saliente 3' de 2 nucleótidos de la 2'-desoxitimidina
se indica como TT; uGL2 es similar a siRNA de GL2, pero contiene
salientes 3' de ribouridina.
Figura 9: Interferencia de RNA por dúplex
siRNA.
Las relaciones de luciferasa diana de control se
normalizaron a un control de tampón (bu, barras negras); las barras
grises indican relaciones de luciferasa GL2 o GL3 de Photinus
pyralis (Pp-luc) a luciferasa RL de Renilla
reniformes (Rr-luc) (eje de la izquierda), las
barras blancas indican relaciones de RL a GL2 o GL3 (eje de la
derecha). Los paneles a, c, e, g, e i describen experimentos
realizados con la combinación de los plásmidos informadores
pGL2-control y pRL-TK, y los paneles
b, d, f, h y j con los plásmidos informadores
pGL3-Control y pRL-TK. La línea de
células utilizada para el experimento de interferencia se indica en
la parte superior de cada gráfico. Las relaciones de
Pp-luc/Rr-luc para el control de
tampón (bu) variaban entre 0,5 y 10 para pGL2/pRL y entre 0,03 y 1
para pGL3/pRL, respectivamente, antes de normalización y entre las
diversas líneas de células ensayadas. Los datos representados
gráficamente se promediaron a partir de tres experimentos
independientes \pm S.D.
Figura 10: Efectos de sRNA de 21 nt, y dsRNAs
de 50 pb y 500 pb sobre la expresión de luciferasa en células
HeLa.
La longitud exacta de los dsRNAs largos se
indica bajo las barras. Los paneles a, c y e describen experimentos
realizados con los plásmidos informadores
pGL2-Control y pRL-TK, y los paneles
b, d y f con los plásmidos informadores
pGL3-Control y pRL-TK. Se
promediaron los datos de dos experimentos independientes \pm S.D.
(a), (b) Expresión absoluta de Pp-luc, representada
en unidades de luminiscencia arbitrarias. (c), (d) Expresión de
Rr-luc, representada en unidades de luminiscencia
arbitrarias. (e), (f) Relaciones de diana normalizada a luciferasa
de control. Las relaciones de actividad de luciferasa para los
dúplex siRNA se normalizaron a un control de tampón (bu, barras
negras); las relaciones de luminiscencia para los dsRNAs de 50 ó 500
pb se normalizaron a las relaciones respectivas observadas para
dsRNA de 50 y 500 pb a partir de GFP humanizada (hG, barras
negras). Debe indicarse que las diferencias globales en secuencias
entre los dsRNAs de 49 y 484 pb direccionados a GL2 y GL3 no son
suficientes para conferir especificidad entre las dianas GL2 y GL3
(identidad ininterrumpida de 43 nt en segmento de 49 pb, identidad
ininterrumpida máxima de 239 nt en segmento de 484 pb).
Figura 11: Variación del saliente 3' de los
dúplex de siRNAs de 21 nt.
(A) Reseña de la estrategia experimental. Se
representa el mRNA diana de sentido con casquete y poliadenilado y
se muestran las posiciones relativas de los siRNAs de sentido y
antisentido. Se prepararon ocho series de dúplex, de acuerdo con
las ocho cadenas antisentido diferentes. Las secuencias de siRNA y
el número de nucleótidos salientes se cambiaron en pasos de 1 nt.
(B) Luminiscencia relativa normalizada de la luciferasa diana
(Photinus pyralis, Pp-luc) a luciferasa de
control (Renilla reniformes, Rr-luc) en un lisado de
embrión de D. melanogaster en presencia de dsRNAs 5 nM con
extremos romos. Las relaciones de luminiscencia determinadas en
presencia de dsRNA se normalizaron a la relación obtenida para un
control de tampón (bu, barra negra). Las relaciones normalizadas
menores que 1 indican interferencia específica.
(C-J) Relaciones de interferencia normalizadas para
8 series de dúplex de siRNA de 21 nucleótidos. Las secuencias de los
dúplex de siRNA se representan encima de los gráficos de barras.
Cada panel muestra la relación de interferencia para una serie de
dúplex formada con un siRNA guía antisentido dado y 5 siRNAs de
sentido diferentes. El número de nucleótidos salientes (saliente
3', números positivos; salientes 5', números negativos) se indica en
el eje x. Los puntos de datos se promediaron a partir de al menos
tres experimentos independientes, representando las barras de error
las desviaciones estándar.
Figura 12: Variación de la longitud de la
cadena de sentido de los dúplex de siRNA.
(A) Representación gráfica del experimento. Tres
cadenas antisentido de 21 nt se aparearon con 8 siRNAs de sentido.
Los siRNAs se cambiaron en longitud en su extremo 3'. El saliente 3'
del siRNA antisentido era de 1 nt (B), 2 nt (C) o 3 nt (D),
mientras que el saliente de siRNA de sentido variaba para cada
serie. Se indican las secuencias de los dúplex de siRNA y las
relaciones de interferencia correspondientes.
Figura 13: Variación de la longitud de los
dúplex de siRNA con salientes 3' de 2-nt
preservados.
(A) Representación gráfica del experimento. El
dúplex de siRNA de 21 nt es idéntico en secuencia al representado
en la Figura 11H o 12C. Los dúplex de siRNA se extendieron hasta el
lado 3' del siRNA de sentido (B) o el lado 5' del siRNA de sentido
(C). Se indican las secuencias de los dúplex de siRNA y las
respectivas relaciones de interfe-
rencia.
rencia.
Figura 14: Sustitución de los grupos
2'-hidroxilo de los residuos ribosa de
siRNA.
Los grupos 2'-hidroxilo (OH) en
las cadenas de los dúplex de siRNA se reemplazaron por
2'-desoxi (d) o
2'-O-metilo (Me). Las sustituciones
2'-desoxi de 2 nt y 4 nt en los extremos 3' se
indican como 2-nt d y 4-nt d,
respectivamente. Los residuos uridina se reemplazaron por
2'-desoxi-timidina.
\newpage
Figura 15: Mapeado de la escisión de RNA
diana de sentido y antisentido por los dúplex de siRNA de 21 nt con
salientes 3' de 2 nt.
(A) Representación gráfica de RNAs y dúplex de
siRNA diana de sentido y antisentido marcados en el casquete con
32P (asterisco). La posición de la escisión del RNA diana de sentido
y antisentido se indica por triángulos encima y debajo de los
dúplex de siRNA, respectivamente. (B) Mapeado de los sitios de
escisión de RNA diana. Después de 2 h de incubación de la diana 10
mM con dúplex de siRNA 100 nM en lisado de embrión de D.
melanogaster, el sustrato con casquete 5' y los productos de
escisión 5' se resolvieron en geles de secuenciación. Se generaron
marcadores de longitud por digestión parcial con RNasa T1 (T1) e
hidrólisis alcalina parcial (OH-) de los RNAs diana. Las líneas en
negrita a la izquierda de las imágenes indican la región cubierta
por las cadenas de siRNA 1 y 5 de la misma orientación que la
diana.
Figura 16: El extremo 5' de un siRNA guía
define la posición de la escisión del RNA diana.
(A, B) Representación gráfica de la estrategia
experimental. El siRNA antisentido era el mismo en todos los dúplex
de siRNA, pero la cadena de sentido variaba entre 18 y 25 nt por
cambio del extremo 3' (A) o entre 18 y 23 nt por cambio en el
extremo 5' (B). La posición de la escisión del RNA diana de sentido
y antisentido se indica por triángulos encima y debajo de los
dúplex de siRNA, respectivamente. (C, D) Análisis de la escisión
del RNA diana utilizando RNAs diana de sentido (panel superior) o
antisentido (panel inferior) marcados en el casquete. Se muestran
únicamente los productos de escisión 5' marcados en el casquete. Se
indican las secuencias de los dúplex de siRNA, y la longitud de las
cadenas de siRNA de sentido está marcada encima del panel. La línea
de control marcada con un guión en el panel (C) muestra el RNA diana
incubado en ausencia de siRNAs. Los marcadores fueron como se
describe en la Figura 15. Las flechas en (D), panel del fondo,
indican los sitios de escisión del RNA diana que difieren en 1
nt.
Figura 17: Variación de la secuencia del
saliente 3' de los dúplex de siRNA.
El saliente 3' de 2 nt (NN, en gris) se cambió
en secuencia y composición como se indica (T,
2'-desoxitimidina, dG,
2'-desoxiguanosina; asterisco, dúplex de siRNA de
tipo salvaje). Las relaciones de interferencia normalizadas se
determinaron como se describe en la Figura 11. La secuencia de tipo
salvaje es la misma que se representa en la Figura 14.
Figura 18: Especificidad de secuencia de
reconocimiento de diana.
Se muestran las secuencias de los dúplex de
siRNA desapareados, y los segmentos de secuencia modificados o
nucleótidos simples están subrayados en gris. El dúplex de
referencia (ref) y los dúplex de siRNA 1 a 7 contienen salientes
2'-desoxitimidina de 2-nt. La
eficiencia de silenciación del dúplex de referencia modificado con
timidina era comparable a la secuencia de tipo salvaje (Figura 17).
Las relaciones de interferencia normalizadas se determinaron como
se describe en la Figura 11.
Figura 19: Variación de la longitud de los
dúplex de si-RNA con los salientes 3' de 2 nt
preservados.
Los dúplex de siRNA se extendieron al lado 3'
del siRNA de sentido (A) o al lado 5' del siRNA de sentido (B). Se
indican las secuencias de los dúplex de siRNA y las relaciones de
interferencia respectivas. Para las células HeLa SS6, se
transfectaron dúplex de siRNA (0,84 \mug) direccionados a
luciferasa GL2 junto con plásmidos pGL2-Control y
pRL-TK. Para comparación, se indican las actividades
in vitro de RNAi de los dúplex siRNA ensayados en lisado de
D. melanogaster.
Se realizaron preparaciones in vitro de
RNAi y de lisado como se ha descrito anteriormente (Tuschl et
al., 1999; Zamore et al., 2000). Es crítico utilizar
creatina-quinasa recién disuelta (Roche) para
regeneración óptima de ATP. Los ensayos de traducción de RNAi (Fig.
1) se realizaron con concentraciones de dsRNA de 5 nM y un periodo
de pre-incubación prolongado de 15 min a 25ºC antes
de la adición de mRNAs informadores Pp-luc y
Rr-luc transcritos in vitro, con casquete y
poliadenilados. La incubación se continuó durante 1 h y la cantidad
relativa de proteína Pp-luc y Rr-luc
se analizó utilizando el ensayo de luciferasa dual (Promega) y un
luminómetro Monolight 3010C (PharMingen).
Se utilizaron procedimientos estándar para
transcripción in vitro de RNA a partir de moldes de PCR que
llevaban secuencias promotoras T7 o SP6, véase por ejemplo (Tuschl,
et al., 1998). Se preparó RNA sintético utilizando
fosforamiditos de RNA Expedite (Proligo). El nucleótido del
adaptador 3' se sintetizó utilizando
dimetoxitritil-1,4-bencenodimetanol-succinil-aminopropil-CPG.
Los oligorribonucleótidos se desprotegieron en 3 ml de
amoniaco/etanol al 32% (3/1) durante 4 h a 55ºC (RNA Expedite) o 16
h a 55ºC (oligonucleótidos quiméricos DNA/RNA adaptador 3' y 5') y
se desililaron luego y purificaron en gel como se ha descrito
previamente (Tuschl et al., 1993). Se generaron transcritos
de RNA para preparación de dsRNA que incluían salientes 3' largos a
partir de moldes PCR que contenían un promotor T7 en dirección de
sentido y un promotor SP6 en dirección antisentido. El molde de
transcripción para el RNA diana de sentido y antisentido se
amplificó por PCR con
GCGTAATACGACTCACTATAGAACAATTGCTTTTACAG
(subrayado, promotor T7) como iniciador 5' y
ATTTAGGTGACACTATAGGCATAAAGAATTGAAGA
(subrayado, promotor SP6) como iniciador 3' y el plásmido
linealizado Pp-luc (secuencia
pGEM-luc) (Tuschl et al., 1999) como molde;
el RNA de sentido transcrito por T7 tenía una longitud de 17 nt con
la secuencia Pp-luc entre las posiciones 113 y 273
con relación al codón de partida y seguido por 17 nt del
complemento de la secuencia promotora SP6 en el extremo 3'. Se
prepararon transcritos para la formación de dsRNA con extremos
romos por transcripción a partir de dos productos PCR diferentes que
contenían solamente una secuencia de promotor simple.
Se llevó a cabo la reasociación de dsRNA
utilizando una extracción con fenol/cloroformo. Se incubaron
concentraciones equimolares de RNA de sentido y antisentido (50 nM
a 10 \muM, dependiendo de la longitud y cantidad disponibles) en
NaOAc 0,3M (pH 6) durante 30 s a 90ºC y se extrajeron luego a la
temperatura ambiente con un volumen igual de fenol/cloroformo, lo
que fue seguido por una extracción con cloroformo para eliminar el
fenol residual. El dsRNA resultante se precipitó por adición de
2,5-3 volúmenes de etanol. El pelet se disolvió en
tampón de lisis (KCl 100 mM, HEPES-KOH 30 mM, pH
7,4, Mg(OAc)_{2} 2 mM) y la calidad del dsRNA se
comprobó por electroforesis estándar en gel de agarosa en tampón
TAE 1 x. Los dsRNAs de 52 pb con los salientes 3' de 17 nt y 20 nt
(Figura 6) se reasociaron por incubación durante 1 min a 95ºC, se
enfriaron luego rápidamente a 70ºC y se enfriaron a continuación
lentamente hasta la temperatura ambiente durante un periodo de 3 h
(reacción de reasociación de 50 \mul, concentración de la cadena
1 \muM, NaCl 300 mM, Tris-HCl 10 mM, pH 7,5). Los
dsRNAs se extrajeron luego con fenol/cloroformo, se precipitaron con
etanol y se disolvieron en tampón de lisis.
La transcripción del RNA radiomarcado
internamente con ^{32}P utilizado para la preparación del dsRNA
(Figuras 2 y 4) se realizó utilizando ATP, CTP, y GTP 1 mM, UTP
0,1 ó 0,2 mM, y ^{32}P-UTP 0,2-0,3
\muM (3000 Ci/mmol), o la relación respectiva para
nucleósido-trifosfatos radiomarcados distintos de
UTP. La marcación del casquete de los RNAs diana se realizó como se
ha descrito previamente. Los RNAs diana se purificaron en gel
después de la marcación del casquete.
Se llevaron a cabo reacciones RNAi estándar por
pre-incubación de dsRNA 10 nM durante 15 min seguido
por adición de RNA diana 10 nM marcado en el casquete. La reacción
se paró después de 2 horas adicionales (Figura 2A) o incubación
durante 2,5 h (Figura 5B y 6B) por tratamiento con proteinasa K
(Tuschl et al., 1999). Las muestras se analizaron luego en
geles de secuenciación al 8 o al 10%. Los dúplex de RNA sintéticos
de 21 y 22 nt se utilizaron a una concentración final de 100 nM
(Fig. 5B).
Los RNAs de 21 nt se produjeron por incubación
de dsRNA radiomarcado en lisado de Drosophila en ausencia de RNA
diana (reacción de 200 \mul, incubación durante 1 h, dsP111 50 nM,
o dsP52 o dsP39 100 nM). La mezcla de reacción se trató
subsiguientemente con proteinasa K (Tuschl et al., 1999) y
los productos de procesamiento de dsRNA se separaron en un gel de
poliamida desnaturalizante al 15%. Se cortó una banda que incluía un
intervalo de tamaños de al menos 18 a 24 nt, se eluyó en NaCl 0,3M
durante una noche a 4ºC y en tubos siliconizados. El RNA se
recuperó por precipitación con etanol y se desfosforiló (reacción de
30 \mul, 30 min, 50ºC, 10 U de fosfatasa alcalina, Roche). La
reacción se paró por extracción con fenol/cloroformo y el RNA se
precipitó con etanol. El oligonucleótido adaptador 3'
(pUUUaaccgcatccttctcx: mayúsculas, RNA; minúsculas, DNA; p, fosfato;
x, 4-hidroximetilbencilo) se ligó luego al RNA de
\sim 21 nt desfosforilado (reacción de 20 \mul, 30 min, 37ºC,
adaptador 3' 5 \muM, Tris-HCl 50 mM, pH 7,6,
MgCl_{2} 10 mM, ATP 0,2 mM, BSA acetilada 0,1 mg/ml, 15% DMSO, 21
U de RNA-ligasa T4,
Amersham-Pharmacia) (Pan y Uhlenbeck, 1992). La
reacción de ligación se paró por la adición de un volumen igual de
mezcla de parada urea 8M/EDTA 50 mM y se cargó directamente en un
gel al 15%. Los rendimientos de ligación eran mayores que 50%. El
producto de ligación se recuperó del gel y se fosforiló en posición
5' (reacción de 20 \mul, 30 min, 37ºC, ATP 2 mM, 5 U de
polinucleótido-quinasa T4, NEB). La reacción de
fosforilación se paró por extracción con fenol/cloroformo y el RNA
se recuperó por precipitación con etanol. A continuación, se ligó
el adaptador 5' (tactaatacgactcactAAA: mayúsculas, RNA; minúsculas,
DNA) al producto de ligación fosforilado como se ha descrito
arriba. El nuevo producto de ligación se purificó en gel y se eluyó
de la rodaja de gel en presencia del iniciador de transcripción
inversa (GACTAGCTGGAATTCAAGGATGCGGTTAAA; negrita, sitio ecoRI)
utilizado como vehículo. La transcripción inversa (reacción de 15
\mul, 30 min, 42ºC, 150 U de transcriptasa inversa Superscript
II, Life Technologies) fue seguida por PCR utilizando un iniciador
5' CAGCCAACGGAATTCATACGACTCACTAAA (negrita, sitio EcoRI) y el
iniciador 3'-RT. El producto PCR se purificó por
extracción con fenol/cloroformo y se precipitó con etanol. El
producto PCR se digirió luego con EcoRI (NEB) y se concatemerizó
utilizando DNA-ligasa T4 (alta concentración, NEB).
Los concatémeros de un intervalo de tamaños de 200 a 800 pb se
separaron en un gel de agarosa de punto de fusión bajo, se
recuperaron del gel por un procedimiento estándar de fusión y
extracción con fenol, y se precipitaron con etanol. Los extremos no
apareados se rellenaron por incubación con polimerasa Taq en
condiciones estándar durante 15 min a 72ºC, y el producto DNA se
ligó directamente al vector pCR2.1-TOPO utilizando
el kit de clonación TOPO TA (Invitrogen). Se seleccionaron las
colonias utilizando PCR y los iniciadores de secuenciación
M13-20 y M13 Reverse. Los productos PCR se
sometieron directamente a secuenciación especial (Sequence
Laboratories Göttingen GmbH, Alemania). Como promedio, se
obtuvieron por cada clon 4 a 5 secuencias
21-meras.
La digestión con la nucleasa P1 de siRNAs
radiomarcados y purificados en gel y 2D-TLC se llevó
a cabo como se ha descrito (Zamore et al., 2000). La
digestión con nucleasa T2 se realizó en reacciones de 10 \mul
durante 3 h a 50ºC en acetato de amonio 10 mM (pH 4,5) utilizando 2
\mug/\mul de tRNA portador y 30 U de ribonucleasa T2 (Life
Technologies). La migración de los patrones no radiactivos se
determinó por sombreado UV. La identidad de los
nucleósido-3',5'-difosfatos se
confirmó por comigración de los productos de digestión con T2 con
patrones preparados por fosforilación con ^{32}P en posición 5'
de nucleósido-3'-monofosfatos
comerciales utilizando
\gamma-32P-ATP y
polinucleótido-quinasa T4 (datos no
presentados).
Un lisado preparado a partir de embriones
sincitiales de D. melanogaster resume la RNAi in vitro
proporcionando una nueva herramienta para el análisis bioquímico
del mecanismo de la RNAi (Tuschl et al., 1999; Zamore et
al., 2000). El análisis in vitro e in vivo de los
requerimientos de longitud de dsRNA para RNAi ha revelado que los
dsRNA cortos (<150 pb) son menos eficaces que los dsRNAs más
largos en la degradación del mRNA diana (Caplen et al.,
2000; Hammond et al., 2000; Ngo et al., 1998); Tuschl
et al., 1999). Las razones para la reducción en la
eficiencia de la degradación del mRNA no se conocen. Por esta razón
se examinó el requerimiento preciso de longitud de dsRNA para
degradación de RNA diana en condiciones optimizadas en el lisado de
Drosophila (Zamore et al., 2000). Se sintetizaron varias
series de dsRNAs y dirigieron contra el RNA informador de luciferasa
de luciérnaga (Pp-luc). La supresión específica de
la expresión de RNA diana se monitorizó por el ensayo de luciferasa
dual (Tuschl et al., 1999) (Figuras 1A y 1B). Se detectó la
inhibición específica de la expresión de RNA diana para dsRNAs tan
cortos como 38 pb, pero dsRNAs de 29 a 36 pb no eran eficaces en
este proceso. El efecto era independiente de la posición de la
diana y el grado de inhibición de la expresión de mRNA de
Pp-luc estaba en correlación con la longitud del
dsRNA, es decir que los dsRNAs largos eran más eficaces que los
dsRNAs cortos.
Se ha sugerido que los fragmentos de RNA de
21-23 nt generados por el procesamiento de dsRNAs
son los mediadores de la interferencia y cosupresión de RNA
(Hamilton y Baulcombe, 1999; Hammond et al., 2000; Zamore
et al., 2000). Por esta razón se analizó la tasa de
formación de fragmentos de 21-23 nt para un
subconjunto de dsRNAs de tamaño comprendido entre 501 y 29 pb. la
formación de fragmentos de 21-23 nt en lisado de
Drosophila (Figura 2) era ya detectable para dsRNAs de 39 a 501 pb
de longitud pero se retardaba significativamente para el dsRNA de
29 pb. Esta observación es consistente con un papel de los
fragmentos 21-23 nt en el seguimiento de la
escisión del mRNA y proporciona una explicación de la falta de RNAi
para los dsRNAs de 30 pb. La dependencia de la longitud de la
formación de 21-23 meros refleja probablemente un
mecanismo de control biológicamente relevante para prevenir la
activación indeseada de RNAi por estructuras intramoleculares cortas
apareadas en bases de RNAs celulares
regulares.
regulares.
La adición de dsRNA y RNA diana con casquete 5'
al lisado de Drosophila da como resultado una degradación
específica de la secuencia del RNA diana (Tuschl et al.,
1999). El mRNA diana se escinde solamente en la región de identidad
con el dsRNA y muchos de los sitios de escisión diana están
separados por 21-23 nt (Zamore et al.,
2000). Así, se esperaba que el número de sitios de escisión para un
dsRNA dado correspondiera grosso modo a la longitud del dsDNA
dividida por 21. Se mapearon los sitios de escisión diana en un RNA
diana de sentido y antisentido que estaba radiomarcado con 5' en el
casquete (Zamore et al., 2000) (Figuras 3A y 3B). Los
productos estables escindidos en 5' se separaron en un gel de
secuenciación y se determinó la posición de escisión por
comparación con una RNasa T1 parcial y una escalera de hidrólisis
alcalina a partir del RNA diana.
Consistentemente con la observación previa
(Zamore et al., 2000), todos los sitios de escisión del RNA
diana estaban localizados dentro de la región de identidad para el
dsRNA. La diana de sentido o antisentido era escindida una sola vez
por el dsRNA de 39 pb. Cada sitio de escisión estaba localizado a 10
nt del extremo 5' de la región cubierta por el dsRNA (Figura 3B).
El dsRNA de 52 pb, que comparte el mismo extremo 5' con el dsRNA de
39 pb, produce el mismo sitio de escisión en la diana de sentido,
localizado a 10 nt del extremo 5' de la región de identidad con el
dsRNA, además de dos sitios de escisión más débiles situados 23 y 24
nt aguas abajo del primer sitio. La diana antisentido era escindida
una sola vez, de nuevo a una distancia de 10 nt del extremo 5' de
la región cubierta por su dsRNA respectivo. El mapeado de los sitios
de escisión para los dsRNAs de 38 a 49 pb que se muestran en la
Figura 1, demostró que el primer y predominante sitio de escisión
estaba localizado siempre a una distancia de 7 a 10 nt aguas abajo
de la región cubierta por el dsRNA (datos no presentados). Esto
sugiere que el producto de escisión del RNA diana está determinado
por el extremo del dsRNA y podría implicar que el procesamiento a
21-23 meros se inicie a partir de los extremos del
dúplex.
Los sitios de escisión en la diana de sentido y
antisentido para el dsRNA más largo de 111 pb eran mucho más
frecuentes que lo previsto y la mayoría de ellos aparecen en
agrupaciones separadas por 20 a 23 nt (Figuras 3A y 3B). Como en el
caso de los dsRNAs más cortos, el primer sitio de escisión en la
diana de sentido se encuentra a 10 nt del extremo 5' de la región
abarcada por el dsRNA; y el primer sitio de escisión en la diana
antisentido está localizado a 9 nt del extremo 5' de la región
cubierta por el dsRNA. No está claro qué es lo que pueda causar
esta escisión desordenada, pero una posibilidad podría ser que
dsRNAs más largos pueden ser procesados no sólo a partir de los
extremos sino también internamente, o que existen algunos
determinantes de especificidad para procesamiento de dsRNA que no
se conocen todavía. Algunas irregularidades respecto a la
separación de 21 a 23 nt se observaron también previamente (Zamore
et al., 2000). Para comprender mejor la base molecular del
procesamiento del dsRNA y el reconocimiento del RNA diana, se
decidió analizar las secuencias de los fragmentos de
21-23 nt generados por el procesamiento de dsRNAs de
39, 52 y 111 pb en el lisado de Drosophila.
Con objeto de caracterizar los fragmentos de RNA
de 21-23 nt, se examinaron los términos 5' y 3' de
los fragmentos de RNA. La oxidación con peryodato de RNAs de
21-23 nt purificados en gel, seguida por eliminación
en \beta indicó la presencia de grupos hidroxilo terminales 2' y
3'. Los 21-23 meros eran sensibles también al
tratamiento con fosfatasa alcalina, lo que indicaba la presencia de
un grupo fosfato en el terminal 5'. La presencia de términos
5'-fosfato y 3'-hidroxilo sugiere
que el dsRNA podría ser procesado por una actividad enzimática
similar a la RNasa de E. coli (para revisiones, véase Dunn,
1982; Nicholson, 1999; Robertson, 1990; Robertson, 1982)).
La clonación direccional de fragmentos de RNA de
21-23 nt se realizó por ligación de un
oligonucleótido con adaptadores 3' y 5' a los 21-23
meros purificados utilizando RNA-ligasa T4. Los
productos de ligación se transcribieron inversamente, se
amplificaron por PCR, se concatemerizaron, clonaron y secuenciaron.
Más de 220 RNAs cortos se secuenciaron a partir de las reacciones
de procesamiento de dsRNA de los dsRNAs de 39, 52 y 111 pb (Figura
4a). Se encontró la distribución de longitudes siguiente: 1% 18 nt,
5% 19 nt, 12% 20 nt, 45% 21 nt, 28% 22 nt, 6% 23 nt, y 2% 24 nt. El
análisis de la secuencia del nucleótido del terminal 5' de los
fragmentos procesados indicó que los oligonucleótidos con una
guanosina en posición 5' estaban infrarrepresentados. Este sesgo fue
introducido muy probablemente por la RNA-ligasa T4
que discrimina contra la guanosina fosforilada en 5' como
oligonucleótido donante; no se apreció desviación significativa
alguna de la secuencia en el extremo 3'. Muchos de los fragmentos
de \sim21 nt derivados de los extremos 3' de la cadena de sentido
o antisentido de los dúplex incluyen nucleótidos 3' que se derivan
de la adición sin molde de nucleótidos durante la síntesis del RNA
utilizando RNA-polimerasa T7. Es interesante que un
número importante de RNAs endógenos de \sim21 nt procedentes de
Drosophila se clonaron también, algunos de ellos a partir de
retrotransposones LTR y distintos de LTR (datos no presentados).
Esto es consistente con un posible papel para la RNAi en la
silenciación de transposones.
Los RNAs de \sim21 nt aparecen en grupos
arracimados (Figura 4a) que cubren las secuencias de dsRNA enteras.
Aparentemente, la reacción de procesamiento corta el dsRNA dejando
extremos 3' escalonados, otra característica de la escisión por
RNasa III. Para el dsRNA de 39 pb, se encontraron dos racimos de
RNAs de \sim21 nt procedentes de cada cadena constitutiva del
dsRNA, con inclusión de extremos salientes 3', pero se detectó un
solo sitio de escisión en la diana de sentido y antisentido
(Figuras 3A y 3B). Si los fragmentos de \sim21 nt estuvieran
presentes como RNAs de guía monocatenarios en un complejo que media
la degradación de mRNA, podría suponerse que existen al menos dos
sitios de escisión diana, pero este no era el caso. Ello sugiere que
los RNAs de \sim21 nt pueden estar presentes en forma bicatenaria
en el complejo de endonucleasa, pero que solamente una de las
cadenas puede utilizarse para reconocimiento y escisión del RNA
diana. El uso de una sola de las cadenas de \sim21 nt para
escisión de la diana puede determinarse simplemente por la
orientación en la que el dúplex de \sim21 nt está unido al
complejo de nucleasa. Esta orientación está definida por la
dirección en la que se procesó el dsRNA original.
Las agrupaciones de \sim21 meros para el dsRNA
de 52 pb y 111 pb están menos bien definidas en comparación con el
dsRNA de 39 pb. Las agrupaciones se extienden sobre regiones de 25 a
30 nt que representan muy probablemente varias subpoblaciones
distintas de dúplex de \sim21 nt y por consiguiente guían la
escisión de la diana en varios sitios próximos. Estas regiones de
escisión están todavía separadas predominantemente por intervalos de
20 a 23 nt. Las reglas que determinan el grado de regularidad en
que el dsRNA puede procesarse a fragmentos de \sim21 nt no se
conocen todavía, pero se observó previamente que el espaciaciamiento
de aprox. 21-23 nt de los sitios de escisión podría
alterarse por una serie de uridinas (Zamore et al., 2000). La
especificidad de escisión del dsRNA por RNasa III de E. coli
parece estar controlada principalmente por antideterminantes, es
decir por la exclusión de algunos pares de bases específicos en
posiciones dadas con relación al sitio de escisión (Zhang y
Nicholson, 1997).
Para ensayar si estaba presente modificación en
el azúcar, la base o el casquete en los fragmentos de RNA
procesados de \sim21 nt, se incubó dsRNA de Pp-luc
de 505 pb radiomarcado en el lisado durante 1 h, se aislaron los
productos de \sim21 nt, y se digirieron con nucleasa P1 o T2 para
dar mononucleótidos. La mixtura de nucleótidos se analizó luego por
cromatografía en capa fina bidimensional (Figura 4B). Ninguno los
cuatro ribonucleótidos naturales se modificaron, como se indica por
digestión con P1 o T2. Los autores de la invención analizaron
previamente la conversión de adenosina en inosina en los fragmentos
de \sim21 nt (después de una incubación de 2 h) y detectaron un
pequeño grado de desaminación (<0,7%) (Zamore et al.,
2000); una incubación más breve en el lisado (1 h) reducía esta
fracción de inosina hasta niveles apenas detectables. La RNasa T2,
que escinde en posición 3' del enlace fosfodiéster, producía
nucleósido-3'-fosfato y
nucleósido-3',5'-difosfato,
indicando con ello la presencia de un monofosfato en posición
terminal 5'. Los cuatro
nucleósido-3',5'-difosfatos se
detectaron y sugieren que el enlace internucleotídico se escindía
con poca o ninguna especificidad de secuencia. En resumen, los
fragmentos de \sim21 nt no están modificados y se generaron a
partir de dsRNA de tal modo que estaban presentes
5'-monofosfatos y 3'-hidroxilos en
el extremo 5'.
El análisis de los productos del procesamiento
de dsRNA indicaba que los fragmentos de \sim21 nt son generados
por una reacción con todas las características de una reacción de
escisión por la RNasa III (Dunn, 1982; Nicholson, 1999; Robertson,
1990; Robertson, 1982). La RNasa III realiza dos cortes escalonados
en ambas cadenas del dsRNA, dejando un saliente 3' de
aproximadamente 2 nt. Los autores de la invención sintetizaron
químicamente RNAs de 21 y 22 nt, idénticos en secuencia a algunos
de los fragmentos de \sim21 nt clonados, y ensayaron los mismos
respecto a su capacidad para mediar la degradación del RNA diana
(Figuras 5A y 5B). Los dúplex de RNA de 21 y 22 nt se incubaron a
concentraciones 100 nM en el lisado, concentraciones 10 veces
mayores que el dsRNA de control de 52 pb. En estas condiciones, la
escisión del RNA diana es fácilmente detectable. La reducción de la
concentración de dúplex de 21 y 22 nt desde 100 a 10 nM causa
todavía escisión del RNA diana. Sin embargo, el aumento de la
concentración del dúplex desde 100 nM a 1000 nM, no aumenta
ulteriormente la escisión de la diana, debido probablemente a un
factor limitante proteínico existente en el lisado.
En contraste con los dsRNAs de 29 ó 30 pb que no
mediaban la RNAi, los dsRNAs de 21 y 22 nt con extremos 3'
salientes de 2 a 4 nt mediaban la degradación eficiente del RNA
diana (dúplex 1, 3, 4, 6, Figuras 5A y 5B). Los dsRNAs de 21 ó 22
nt con extremos romos (dúplex 2, 5, y 7, Figuras 5A y 5B) se
redujeron en su capacidad para degradar la diana e indicaban que
los extremos salientes 3' son críticos para reconstitución del
complejo RNA-proteína nucleasa. Los salientes
monocatenarios pueden ser necesarios para unión de afinidad alta del
dúplex de \sim21 nt a los componentes proteínicos. Un fosfato
5'-terminal, aunque estaba presente después del
procesamiento con dsRNA, no era necesario para mediar la escisión
del RNA diana y estaba ausente de los RNAs sintéticos cortos.
Los dúplex sintéticos de 21 y 22 nt guiaban la
escisión de las dianas de sentido y antisentido en la región
abarcada por el dúplex corto. Este es un resultado importante
considerando que un dsRNA de 39 pb, que forma dos pares de racimos
de fragmentos de \sim21 nt (Fig. 2), escindía la diana de sentido
o antisentido una sola vez y no dos veces. Los autores interpretan
este resultado sugiriendo que únicamente una de las dos cadenas
presentes en el dúplex de \sim21 nt es capaz de guiar la escisión
del RNA diana y que la orientación del dúplex de \sim21 nt en el
complejo de nucleasa está determinada por la dirección inicial de
procesamiento del dsRNA. Sin embargo, la presentación de un dúplex
de \sim21 nt ya perfectamente procesado al sistema in
vitro, no permite la formación del complejo de nucleasa activo
específico de la secuencia con dos orientaciones posibles del
dúplex de RNA simétrico. Esto da como resultado la escisión de la
diana de sentido y antisentido dentro de la región de identidad con
el dúplex de RNA de 21 nt.
El sitio de escisión de la diana está localizado
11 ó 12 nt aguas abajo del primer nucleótido que es complementario
a la secuencia guía de 21 ó 22 nt, es decir, que el sitio de
escisión está próximo al centro de la región abarcada por los RNAs
de 21 ó 22 nt (Figuras 4A y 4B). El desplazamiento de la cadena de
sentido de un dúplex de 22 nt por dos nucleótidos (compárense los
dúplex 1 y 3 en la Figura 5A) desplazaba el sitio de escisión de la
diana antisentido únicamente por dos nucleótidos. El desplazamiento
tanto de la cadena de sentido como de la cadena antisentido por 2
nucleótidos desplazaba ambos sitios de escisión por dos nucleótidos
(compárense los dúplex 1 y 4). Se predice que sería posible diseñar
un par de RNAs de 21 ó 22 nt para escindir un RNA diana
prácticamente en cualquier posición dada.
La especificidad de la escisión del RNA diana
guiada por RNAs de 21 y 22 nt parece exquisita, dado que no se
detecta sitio aberrante alguno (Figura 5B). Sin embargo, debe
observarse que los nucleótidos presentes en el Saliente 3' del
dúplex de RNA de 21 y 22 nt pueden contribuir menos al
reconocimiento del sustrato que los nucleótidos cercanos al sitio
de escisión. Esto está basado en la observación de que el nucleótido
más próximo a 3' en el saliente 3' de los dúplex activos 1 ó 3
(Figura 5A) no es complementario a la diana. Un análisis detallado
de la especificidad de la RNAi puede emprenderse ahora fácilmente
utilizando RNAs sintéticos de 21 y 22 nt.
Basándose en la evidencia de que los RNAs
sintéticos de 21 y 22 nt con salientes 3' median la interferencia
del RNA, se propuso designar los RNAs de \sim21 nt como "RNAs de
interferencia corta" o siRNAs, y el complejo
RNA-proteína respectivo como una "partícula de
ribonucleoproteína interferente pequeña" o siRNP.
Se ha demostrado que parecen procesarse dsRNAs
cortos con extremos romos a partir de los extremos del dsRNA.
Durante el estudio de la dependencia de la longitud del dsRNA en la
RNAi realizado por los autores de la invención, se han analizado
también dsRNAs con extremos 3' salientes de 17 a 20 nt y se ha
encontrado de modo sorprendente que los mismos eran menos potentes
que los dsRNAs de extremos romos. El efecto inhibidor de los
extremos 3' largos era particularmente pronunciado para dsRNAs de
hasta 100 pb, pero era menos espectacular para los dsRNAs más
largos. El efecto no era debido a una formación imperfecta de dsRNA
basada en el análisis de gel nativo (datos no representados). Se
ensayó si el efecto inhibidor de los extremos 3' salientes largos
podría utilizarse como herramienta para dirigir el procesamiento de
dsRNA a uno solo de los dos extremos de un dúplex de RNA corto.
Se sintetizaron cuatro combinaciones del dsRNA
molde de 52 pb, la extensión 3' con extremos romos solamente en la
cadena de sentido, la extensión 3' solamente en la cadena
antisentido, y la extensión 3' doble en ambas cadenas, y se
mapearon los sitios de escisión del RNA diana después de incubación
en el lisado (Figuras 6A y 6B). El sitio de escisión primero y
predominante de la cadena de sentido se perdió cuando se extendía el
extremo 3' de la cadena antisentido del dúplex, y viceversa, el
sitio de escisión fuerte de la cadena antisentido se perdía cuando
se extendía el extremo 3' de la cadena de sentido del dúplex. Las
extensiones en 3' de ambas cadenas hacían que el dsRNA de 52 pb se
volviera virtualmente inactivo. Una explicación para la
desactivación del dsRNA por las extensiones 3' de \sim20 nt
podría ser la asociación de proteínas de fijación de RNA
monocatenarias que podrían interferir con la asociación de uno de
los factores de procesamiento del dsRNA en este extremo. Este
resultado es consistente también con el modelo de los autores de la
invención en el cual una sola de las cadenas del dúplex de siRNA en
el siRNP ensamblado es capaz de guiar la escisión del RNA diana. La
orientación de la cadena que guía la escisión del RNA está definida
por la dirección de la reacción de procesamiento del dsRNA. Es
probable que la presencia de extremos 3' escalonados pueda facilitar
el ensamblaje del complejo de procesamiento. Un bloque en el
extremo 3' de la cadena de sentido permitirá únicamente el
procesamiento de dsRNA desde el extremo 3' opuesto de la cadena
antisentido. Esto genera a su vez complejos siRNP en los cuales
únicamente la cadena antisentido del dúplex de siRNA es capaz de
guiar la escisión del RNA de sentido diana. Lo mismo es cierto para
la situación recíproca.
El efecto inhibidor menos pronunciado de
extensiones 3' largas en el caso de dsRNAs más largos (\geq500
pb, datos no presentados) sugiere a los autores de la invención que
los dsRNAs largos pueden contener también señales de procesamiento
de dsRNA internas o pueden llegar a ser procesados cooperativamente
debido a la asociación de factores de escisión múltiples.
Los nuevos datos bioquímicos actualizan el
modelo en cuanto al modo en que el dsRNA direcciona el mRNA para su
destrucción (Figura 7). El RNA bicatenario se procesa primeramente a
dúplex de RNA cortos que tienen predominantemente una longitud de
21 y 22 nt y con extremos escalonados 3' similares a una reacción
análoga a la de la RNasa III (Dunn, 1982; Nicholson, 1999;
Robertson, 1982). Basándose en la longitud de 21-23
nt de los fragmentos de RNA procesados, se ha especulado ya que
puede estar implicada una actividad análoga a la de RNasa III en la
RNAi (Bass, 2000). Esta hipótesis se ve respaldada adicionalmente
por la presencia de 5'-fosfatos y
3'-hidroxilos en los términos de los siRNAs tal
como se observa en los productos de reacción de RNasa III (Dunn,
1982; Nicholson, 1999). Se ha demostrado que la RNasa III
bacteriana y los homólogos eucariotas Rnt1p en S. cerevisiae
y Pac1p en S. pombe funcionan en el procesamiento del RNA
ribosómico así como en snRNA y snoRNAs (véase por ejemplo Chanfreau
et al., 2000).
Se sabe poco acerca de la bioquímica de los
homólogos de la RNasa III de plantas, animales o humanos. Dos
familias de enzimas RNasa III han sido identificadas predominante
por análisis de la secuencia guiada por bases de datos o clonación
de cDNAs. La primera familia de RNasa III está representada por la
proteína drosha de 1327 aminoácidos de longitud de D.
melanogaster (Acc. AF116572). El término C se compone de dos
dominios de fijación de RNasa III y un solo dominio de fijación de
dsRNA, y el término N tiene una función desconocida. Se encuentran
también homólogos próximos en C. elegans (Acc. AF160248) y
humanos (Acc. AF18911) (Filippov et al., 2000; Wu et
al., 2000). La RNasa III humana semejante a drosha ha sido
clonada y caracterizada recientemente (Wu et al., 2000). El
gen se expresa ubicuamente en tejidos y líneas de células
humanos(as), y la proteína está localizada en el núcleo y el
nucléolo de la célula. Sobre la base de los resultados deducidos de
estudios de inhibición antisentido, se sugirió un papel de esta
proteína respecto al procesamiento del rRNA. La segunda clase está
representada por el gen K12H4.8 de C. elegans (Acc. S44849)
que codifica una proteína de 1822 aminoácidos de longitud. Esta
proteína tiene un motivo de RNA helicasa N-terminal
que va seguido por dos dominios catalíticos de RNasa III y un
motivo de fijación de dsRNA, similar a la familia de RNasa III de
drosha. Existen homólogos próximos en S. pombe (Acc.
QO9884), A. thaliana (Acc. AF187317), D. melanogaster
(Acc. AE003740) y humanos (Acc. AB028449) (Filippov et al.,
2000; Jacobsen et al., 1999; Matsuda et al. 2000).
Posiblemente, la RNasa III/helicasa K12H4.8 es el candidato
probable que está implicado en la RNAi.
Selecciones genéticas en C. elegans
identificaron rde-1 y rde-4 como
esenciales para la activación de RNAi sin un efecto sobre la
movilización o co-supresión de transposones
(Dernburg et al., 2000; Grishok et al., 2000; Ketting
y Plasterk, 2000; Tabara et al., 1999). Esto condujo a la
hipótesis de que estos genes son importantes para el procesamiento
de dsRNA pero no están implicados en la degradación de la diana
mRNA. La función de ambos genes es todavía desconocida, siendo el
producto del gen rde-1 un miembro de una familia de
proteínas similares a la proteína elF2C de conejo (Tabara et
al., 1999), y no habiéndose descrito todavía la secuencia de
rde-4. La caracterización bioquímica futura de estas
proteínas debería revelar su función molecular.
El procesamiento a los dúplex de siRNA parece
iniciarse desde los extremos de ambos dsRNAs con extremos romos o
dsRNAs con salientes 3' cortos (1-5 nt), y procede
en pasos de aproximadamente 21-23 nt. Los extremos
escalonados 3' largos (\sim20 nt) en dsRNAs cortos suprimen la
RNAi, debido posiblemente a interacción con proteínas de fijación
de RNA monocatenarias. La supresión de la RNAi por regiones
monocatenarias flanqueantes de dsRNA corto y la ausencia de
formación de siRNA a partir de dsRNAs cortos de 30 pb puede explicar
por qué las regiones estructuradas que se encuentran frecuentemente
en los mRNAs no conducen a la activación de la RNAi.
Sin pretender quedar ligados a la teoría, se
supone que las proteínas de procesamiento de dsRNA o un subconjunto
de éstas se mantienen asociadas con el dúplex de siRNA después de la
reacción de procesamiento. La orientación del dúplex de siRNA con
relación a estas proteínas determina cuál de las dos cadenas
complementarias funciona como guía en la degradación del RNA diana.
Los dúplex de siRNA sintetizados químicamente guían la escisión del
RNA diana tanto de sentido como antisentido, dado que son capaces de
asociarse con los componentes proteínicos en cualquiera de las dos
orientaciones posibles.
El notable descubrimiento de que dúplex de siRNA
sintéticos de 21 y 22 nt pueden utilizarse para degradación
eficiente del mRNA proporciona nuevas herramientas para la
regulación específica de secuencia de la expresión génica en
genómica funcional así como en estudios biomédicos. Los siRNAs
pueden ser eficaces en sistemas de mamífero en los que no puede
utilizarse dsRNA largos debido a la activación de la respuesta PKR
(Clemens, 1997). Como tales, los dúplex de siRNA representan una
nueva alternativa a la terapéutica antisentido o con ribozimas.
Se sintetizaron químicamente RNAs de 21 nt
utilizando RNA-fosforamiditos Expedite y
timidina-fosforamidito (Proligo, Alemania). Se
desprotegieron oligonucleótidos sintéticos y se purificaron en gel
(Ejemplo 1), seguido por purificación con un cartucho SepPak C18
(Waters, Milford, MA, EE.UU.) (Tuschl, 1993). Las secuencias de
siRNA direccionadas a GL2 (Acc. X65324) y luciferasa GL3 (Acc.
U47296) correspondían a las regiones codificantes
153-173 con relación al primer nucleótido del codón
de partida, y los siRNAs de direccionamiento de RL (Acc. AF025846)
correspondían a la región 119-129 después del codón
de partida. Los RNas más largos se transcribían con
RNA-polimerasa a partir de productos PCR, seguido
por purificación en gel y SepPak. Los dsRNAs de GL2 o GL3 de 49 y
484 pb correspondían a la posición 113-161 y
113-596, respectivamente, con relación al comienzo
de la traducción; los dsRNAs de RL de 50 y 501 pb correspondían a
las posiciones 118-167 y 118-618,
respectivamente. Los moldes PCR para la síntesis de dsRNA que
direccionaba GFP humanizada (hG) se amplificaron a partir de pAD3
(Kehlenbach, 1998), donde el dsRNA hG de 50 y 501 pb correspondía a
las posiciones 118-167 y 118-618,
respectivamente, con referencia al codón de partida.
Para la reasociación de siRNAs, se incubaron
cadenas simples de 20 \muM en tampón de reasociación (acetato de
potasio 100 mM, HEPES-KOH 30 mM a pH 7,4, acetato de
magnesio 2 mM) durante 1 min a 90ºC seguido por 1 h a 37ºC. El paso
de incubación a 37ºC se prolongó durante una noche para los dsRNAs
de 50 y 500 pb y estas reacciones de reasociación se realizaron
para concentraciones de cadena de 8,4 \muM y 0,84 \muM,
respectivamente.
Se prepararon células S2 en medio
Drosophila de Schneider (Life Technologies) complementado con
10% FBS, 100 unidades/ml de penicilina y 100 \mug/ml de
estreptomicina a 25ºC. Se cultivaron células 293, NIH/3T3, HeLa S3
y COS-7 a 37ºC en medio de Eagle modificado de
Dulbecco complementado con 10% de FDS, 100 unidades/ml de
penicilina y 100 \mug/ml de estreptomicina. Las células se
sometieron a pasadas regularmente a fin de mantener el crecimiento
exponencial. 24 h antes de la transfección a aprox. 80% de la
confluencia, se tripsinizaron células de mamífero y se diluyeron en
relación 1:5 con medio reciente sin antibióticos
(1-3 x 10^{5} células/ml) y se transfirieron a
placas de 24 pocillos (500 \mul/pocillo). Las células S2 no se
tripsinizaron antes de la división. La transfección se llevó a cabo
con reactivo Lipofectamine 2000 (Life Technologies) como ha sido
descrito por el fabricante para líneas de células adherentes. Se
aplicaron por pocillo 1,0 \mug de pGL2-Control
(Promega) o pGL3-Control (Promega), 0,1 \mug de
pRL-TK (Promega) y 0,28 \mug de dúplex de siRNA o
dsRNA, formulado en liposomas; el volumen final era 600 \mul por
pocillo. Las células se incubaron 20 h después de la transfección y
parecían sanas después de ello. La expresión de luciferasa se
monitorizó subsiguientemente con el ensayo de luciferasa Dual
(Promega). Las eficiencias de transfección se determinaron por
microscopía de fluorescencia para líneas de células de mamífero
después de co-transfección de 1,1 \mug hGFP que
codificaba pAD3 y 0,28 \mug de siRNA invGL2 inGL2 y eran
70-90%. Los plásmidos informa-
dores se amplificaron en XL-7 Blue (Stratagene) y se purificaron utilizando el kit Qiagen EndoFree Maxi Plasmid.
dores se amplificaron en XL-7 Blue (Stratagene) y se purificaron utilizando el kit Qiagen EndoFree Maxi Plasmid.
Para ensayar si los siRNAs son capaces también
de mediar la RNAi en cultivo de tejido, se sintetizaron dúplex de
siRNA de 21 nt con salientes 3' simétricos de 2 nt dirigidos contra
los genes informadores que codifican el pensamiento de mar
(Renilla reniformis) y dos variantes de secuencias de
luciferasa de luciérnaga (Photinus pyralis, GL2 y GL3) (Fig.
8a, b). Los dúplex de siRNA se co-transfectaron con
las combinaciones de plásmidos informadores pGL2/pRL o pGL3/pRL en
células S2 Schneider de D. melanogaster o
células de mamífero utilizando liposomas catiónicos. Las
actividades de luciferasa se determinaron 20 h después de la
transfección. En todas las líneas de células ensayadas, se observó
una reducción específica de la expresión de los genes informadores
en presencia de dúplex siRNA cognados (Fig. 9a-j).
Es notable que los niveles de expresión de luciferasa absolutos no
se veían afectados por los siRNAs no cognados, lo que indicaba la
ausencia de efectos secundarios perjudiciales por los dúplex de RNA
de 21 nt (v.g. Fig. 10 a-d para células HeLa). En
las células S2 de D. melanogaster (Fig. 9a, b), la
inhibición específica de las luciferasas era completa. En las
células de mamífero, en las que los genes informadores se
expresaban con intensidad de 50 a 100 veces mayor, la supresión
específica era menos completa (Fig. 9c-j). La
expresión de GL2 se reducía de 3 a 12 veces, la expresión de GL3 de
9 a 25 veces, y la expresión de RL de 1 a 3 veces, en respuesta a
los siRNAs cognados. Para las células 293, el direccionamiento de
RL-luciferasa por los siRNAs RL era ineficaz, aunque
las dianas GL2 y GL3 respondían específicamente (Fig. 9i, j). La
ausencia de reducción de la expresión de RL en las células 293 puede
ser debida a su expresión de 5 a 20 veces mayor comparada con
cualquier otra línea de células de mamífero ensayada y/o a la
accesibilidad limitada de la secuencia diana debido a la estructura
secundaria del RNA o de proteínas asociadas. Sin embargo, el
direccionamiento específico de luciferasa GL2 y GL3 por los dúplex
de siRNA cognados indicaba que la RNAi tiene lugar también en las
células 293.
El saliente 3' de 2 nt en todos los dúplex de
siRNA, excepto en el caso de uGL2, estaba compuesto por
(2'-desoxi)-timidina. La
sustitución de uridina por timidina en el saliente 3' era bien
tolerada en el sistema de D. melanogaster in vitro y
la secuencia del saliente no era crítica para el reconocimiento de
la diana. Se seleccionó el saliente de timidina debido a que se
supone que el mismo aumenta la resistencia de los siRNAs a las
nucleasas en el medio de cultivo de tejidos y dentro de las células
transfectadas. De hecho, el siRNA de GL2 modificado con timidina
era ligeramente más potente que el siRNA uGL2 sin modificar en todas
las líneas de células ensayadas (Fig. 9a, c, e, g, i). Puede
imaginarse que modificaciones ulteriores de los nucleótidos del
saliente 3' puedan proporcionar beneficios adicionales al
suministro y la estabilidad de los dúplex de siRNA.
En experimentos de
co-transfección, se utilizaron dúplex de siRNA de 25
nM con respecto al volumen final de medio de cultivo de tejido
(Fig. 9, 10). El aumento de la concentración de siRNA a 100 nM no
mejoraba los efectos de silenciación específicos, pero comenzaba a
afectar las eficiencias de transfección debido a competencia para
la encapsulación de liposomas entre el DNA plasmídico y el siRNA
(datos no presentados). La disminución de la concentración de siRNA
hasta 1,5 nM no reducía el efecto de silenciación específico (datos
no presentados) aun cuando los siRNAs estaban ahora sólo 2 a 20
veces más concentrados que los plásmidos de DNA. Esto indica que
los siRNAs son reactivos extraordinariamente potentes para mediar la
silenciación de genes y que los siRNAs son eficaces a
concentraciones que son varios órdenes de magnitud menores que las
concentraciones aplicadas en los experimentos convencionales de
direccionamiento de genes antisentido o de ribozima.
Con objeto de monitorizar el efecto de los
dsRNAs más largos sobre las células de mamífero, se prepararon
dsRNAs de 50 y 500 pb cognados a los genes informadores. Como
control inespecífico, se utilizaron dsRNAs de GFP humanizada (hG)
(Kehlenbach, 1998). Cuando se co-transfectaron
dsRNAs, en cantidades (no concentraciones) idénticas a los dúplex
de siRNA, la expresión de los genes informadores se redujo acusada e
inespecíficamente. Este efecto se ilustra para las células HeLa
como ejemplo representativo (Fig. 10a-d). Las
actividades absolutas de luciferasa se redujeron inespecíficamente
de 10 a 20 veces por dsRNA de 50 pb y de 20 a 200 veces por
co-transfección con dsRNA de 500 pb,
respectivamente. Se observaron efectos inespecíficos similares para
las células COS-7 y NIH/3T3. Para las células 293,
se observó únicamente una reducción inespecífica de 10 a 20 veces en
el caso de los dsRNAs de 500 pb. La reducción inespecífica en la
expresión de genes informadores por dsRNA >30 pb era de esperar
como parte de la respuesta de interferones.
Sorprendentemente, a pesar de la fuerte
disminución inespecífica en la expresión de genes informadores, los
autores de la invención detectaron reproduciblemente una
silenciación adicional específica de la secuencia, mediada por
dsRNA. Sin embargo, los efectos de silenciación específicos, eran
sólo aparentes cuando las actividades relativas de los genes
informadores relativas se normalizaron para los controles de dsRNA
hG (Fig. 10e, f). Se observó una reducción específica de 2 a 10
veces en respuesta al dsRNA cognado, al igual que en las otras 3
líneas de células de mamífero ensayadas (datos no presentados). Los
efectos de silenciación específicos con dsRNAs
(356-1662 pb) se consignaron previamente en células
CHO-K1, pero las cantidades de dsRNA requeridas
para detectar una reducción específica de 2 a 4 veces eran
aproximadamente 20 veces mayores que en los experimentos realizados
por los autores (Ui-Tei, 2000). Asimismo, las
células CHO-K1 parecen ser deficientes en la
respuesta de interferones. En otro informe, se ensayaron células
293, NIH/3T3 y BHK-21 respecto a RNAi utilizando
combinaciones de informadores luciferasa/lacZ y 829 pb de dsRNA
lacZ específico o gFP inespecífico de 717 pb (Caplen, 2000). El
fallo en la detección de RNAi en este caso puede ser debido al
ensayo informador luciferasa/lacZ menos sensible y a las
diferencias de longitud del dsRNA diana y de control. Tomados en su
conjunto, los resultados obtenidos por los autores indican que RNAi
es activa en células de mamífero, pero que el efecto de silenciación
es difícil de detectar, si el sistema de interferón está activado
por dsRNA >30 pb.
En suma, se ha demostrado por primera vez la
silenciación de genes mediada por siRNA en células de mamífero. El
uso de siRNAs cortos se considera muy prometedor para la
inactivación de la función de los genes en cultivos de tejido
humanos y el desarrollo de terapéuticas específicas de genes.
Se realizaron ensayos de síntesis química de
RNA, reasociación, y RNAi basada en luciferasa como se describe en
los Ejemplos 1 ó 2 o en publicaciones previas (Tuschl et al.,
1999; Zamore et al., 2000). Todos los dúplex de siRNA
estaban dirigidos contra la luciferasa de luciérnaga, y la secuencia
de mRNA de luciferasa se derivaba de pGEM-luc
(GenBank Acc. X63316) como ha sido descrito (Tuschl et al.,
1999). Los dúplex de siRNA se incubaron en una reacción
RNAi/traducción de D. melanogaster durante 15 min antes de la
adición de mRNAs. Los ensayos de RNAi basados en traducción se
realizaron al menos por triplicado.
Para el mapeado de la escisión del RNA diana de
sentido, se generó un transcrito de 177 nt, correspondiente a la
secuencia de luciferasa de luciérnaga entre las posiciones 113 y 273
con relación al codón de partida, seguido por el complemento de 17
nt de la secuencia promotora SP6. Para el mapeado de la escisión de
RNA diana antisentido, se produjo un transcrito de 166 nt a partir
de un molde, que se amplificó a partir de la secuencia plasmídica
por PCR utilizando el iniciador 5'
TAATACGACTCACTATAGAGCCCATATCGTTTCATA (promotor T7 subrayado)
y el iniciador 3' AGAGGATGGAACCGCTGG. La secuencia diana corresponde
al complemento de la secuencia de luciferasa de luciérnaga entre
las posiciones 50 y 215 con relación al codón de partida. La
marcación con guanilil-transferasa se realizó como
ha sido descrito previamente (Zamore et al., 2000). Para EL
mapeado de la escisión del RNA diana, se incubaron 100 nM de dúplex
de siRNA con RNA diana 5 a 10 nM en lisado de embrión de D.
melanogaster en condiciones estándar (Zamore et al.,
2000) durante 2 h a 25ºC. La reacción se paró por adición de 8
volúmenes de tampón de proteinasa K (Tris-HCl 200
nM, pH 7,5, EDTA 25 mM, NaCl 300 mM, dodecil-sulfato
de sodio 2% p/v). La proteinasa K (E.M. Merck, disuelta en agua) se
añadió a una concentración final de 0,6 mg/ml. Las reacciones se
incubaron luego durante 15 min a 65ºC, se extrajeron con
fenol/cloroformo/alcohol isoamílico (25:24:1) y se precipitaron con
3 volúmenes de etanol. Las muestras se localizaron en geles de
secuenciación al 6%. Los patrones de longitud se generaron por
digestión parcial con RNasa T1 e hidrólisis parcial con base de los
RNAs diana de sentido o antisentido con casquete.
Como se ha descrito arriba, 2 ó 3 nucleótidos no
apareados en el extremo 3' de los dúplex DE siRNA eran más
eficientes en la degradación del RNA diana que los dúplex de
extremos romos respectivos. Para realizar un análisis más
exhaustivo de la función de los nucleótidos terminales, se
sintetizaron 5 siRNAs de sentido de 21 nt, cada uno de los cuales
era presentado por un solo nucleótido con relación al RNA diana, y 8
siRNAs antisentido de 21 nt, cada uno de los cuales era desplazado
por un nucleótido con relación a la diana (Figura 11a). Por
combinación de los siRNAs de sentido y antisentido, se generaron 8
series de dúplex de siRNA con extremos salientes sintéticos, que
abarcaban un intervalo de salientes 3' de 7 nt a salientes 5' de 4
nt. La interferencia de los dúplex de siRNA se midió utilizando el
sistema de ensayo dual de luciferasa (Tuschl et al., 1999;
Zamore et al., 2000). Los dúplex de siRNA se dirigían contra
mRNA de luciferasa de luciérnaga, y se utilizó mRNA de luciferasa
de pensamiento de mar como control interno. La relación de
luminiscencia de la actividad de luciferasa de la diana al control
se determinó en presencia de dúplex de siRNA y se normalizó para la
relación observada en ausencia de dsRNA. Para comparación, se
muestran las relaciones de interferencia de dsRNAs largos (39 a 504
pb) en la Figura 11B. Las relaciones de interferencia se
determinaron para concentraciones de 5 nM para dsRNAs largos
(Figura 11A) y a 100 nM para dúplex de siRNA (Figura
11C-J). Se eligieron las concentraciones 100 nM de
siRNAs debido a que el procesamiento completo del dsRNA 5 nM de 504
pb podría dar como resultado dúplex de siRNA totales de 120 nm.
La capacidad de los dúplex de siRNA de 21 nt
para mediar la RNAi depende del número de nucleótidos salientes o
pares de bases formados. Los dúplex con 4 a 6 nucleótidos salientes
3' eran incapaces de mediar la RNAi (Figura 11C-F),
como lo eran los dúplex con dos o más nucleótidos salientes 5'
(Figura 11G-J). Los dúplex con salientes 3' de 2 nt
eran muy eficientes en la mediación de la interferencia de RNA,
aunque la eficiencia de silenciación era también dependiente de la
secuencia, y se observaron diferencias de hasta 12 veces para
dúplex diferentes de siRNA con salientes 3' de 2 nt (compárense las
Figuras 11D-H). Los dúplex con extremos romos que
tenían salientes 5' de 1 nt o salientes 3' de 1 a 3 nt eran
funcionales en algunos casos. El pequeño efecto de silenciación
observado para dúplex de siRNA con saliente 3' de 7 nt (Figura 11C)
puede ser debido a un efecto antisentido del saliente 3' largo más
bien que a RNAi. La comparación de la eficiencia de RNAi entre
dsRNAs largos (Figura 11B) y los dúplex de siRNA de 21 nt más
efectivos (Fig. 11E, G, H) indica que un solo dúplex de siRNA a
concentración 100 nm puede ser tan eficaz como un dsRNA de 504 pb 5
nM.
Con objeto de investigar el efecto de la
longitud de siRNA sobre la RNAi, se prepararon tres series de dúplex
de siRNA, combinando tres cadenas antisentido de 21 nt con 8
cadenas de sentido de 18 a 25 nt. El saliente 3' del siRNA
antisentido se fijó a 1, 2, ó 3 nt en cada serie de dúplex de siRNA,
mientras que el siRNA de sentido se varió en su extremo 3' (Figura
12A). Independientemente de la longitud del siRNA de sentido, se
encontró que los dúplex con salientes 3' de 2 nt de siRNA
antisentido (Figura 12C) eran más activos que aquéllos que tenían
salientes 3' de 1 ó 3 nt (Figura 12B, D). En la primera serie, con
saliente 3' de 1 nt de siRNA antisentido, los más activos eran los
dúplex con siRNAs de sentido de 21 y 22 nt, que llevaban un saliente
3' de 1 y 2 nt de siRNA de sentido, respectivamente. Los dúplex con
siRNAs de sentido de 19 a 25 nt eran también capaces de mediar RNA,
pero en menor grado. Análogamente, en la segunda serie, con saliente
de 2 nt de siRNA antisentido, el dúplex de siRNA de 21 nt con
saliente 3' de 2 nt era el más activo, y cualquier otra combinación
con siRNAs de sentido de 18 a 25 nt era activa en un grado
significativo. En la último serie, con saliente 3' de siRNA
antisentido de 3 nt, únicamente el dúplex con un siRNA de sentido de
20 nt y el saliente 3' de sentido de 2 nt era capaz de reducir la
expresión del RNA diana. En conjunto, estos resultados indican que
la longitud del siRNA así como la longitud del saliente 3' son
importantes, y que los dúplex de si-RNAs de 21 nt
con saliente 3' de 2 nt son óptimos para RNAi.
Se examinó luego el efecto del cambio simultáneo
de la longitud de ambas cadenas de siRNA por mantenimiento de
salientes 3' simétricos de 2 nt (Figura 13A). Se prepararon dos
series de dúplex de siRNA que incluían el dúplex de siRNA de 21 nt
de la Figura 11H como referencia. La longitud de los dúplex se varió
entre 20 y 25 pb extendiendo el segmento de bases apareadas en el
extremo 3' del siRNA se sentido (Figura 3B) o en el extremo 3' del
siRNA antisentido (Figura 13C). Los dúplex de 20 a 23 pb causaban
represión específica de la actividad de luciferasa diana, pero el
dúplex de siRNA de 21 nt era al menos 8 veces más eficiente que
cualquiera de los otros dúplex. Los dúplex de siRNA de 24 y n25 nt
no daban como resultado interferencia detectable alguna. Los
efectos específicos de la secuencia eran menores, dado que las
variaciones en ambos extremos del dúplex producían efectos
similares.
Para evaluar la importancia de los residuos
ribosa de siRNA para la RNAi, se examinaron dúplex con siRNAs de 21
nt y salientes 3' de 2 nt con cadenas modificadas con
2'-desoxi o
2'-O-metilo (Figura 14). La
sustitución de los salientes 3' de 2 nt por
2'-desoxi-nucleótidos no tenía
efecto alguno, e incluso el reemplazamiento de dos ribonucleótidos
adicionales adyacentes a los salientes en la región apareada,
producía siRNAs significativamente activos. Así, 8 de un total de
42 nt de un dúplex de siRNA se reemplazaron por residuos de DNA sin
pérdida de actividad. Sin embargo, la sustitución completa de una o
ambas cadenas de siRNA por residuos 2'-desoxi,
anulaba la RNAi, como lo hacía la sustitución por residuos
2'-O-metilo.
Se determinaron previamente las posiciones de
escisión del RNA diana para dúplex de siRNA de 22 nt y para un
dúplex de 21 nt/22 nt. Se encontró que la posición de la escisión
del RNA diana estaba localizada en el centro de la región abarcada
por el dúplex de siRNA, 11 ó 12 nt aguas abajo del primer nucleótido
que era complementario a la secuencia guía de siRNA de 21 ó 22 nt.
Se incubaron cinco dúplex de siRNA de 21 nt distintos con saliente
3' de 2 nt (Figura 15a) con RNA diana de sentido o antisentido
marcado en el casquete 5' en lisado de D. melanogaster
(Tuschl et al., 1999; Zamore et al., 2000). Los
productos de escisión 5' se resolvieron en geles de secuenciación
(Figura 15B). La cantidad de RNA diana de sentido escindida está
correlacionada con la eficiencia de los dúplex de siRNA determinada
en el ensayo basado en traducción, y los dúplex de siRNA 1, 2 y 4
(Figura 15B y 11H, G, E) escinden el RNA diana más rápidamente que
los dúplex 3 y 5 (Figura 15B y 11F, D). Es notable que la suma de
radiactividad del producto con escisión 5' y el RNA diana de entrada
no se mantuviera constante a lo largo del tiempo, y los productos
de escisión 5' no se acumulaban. Presumiblemente, los productos de
escisión, una vez liberados del complejo
siRNA-endonucleasa, se degradan rápidamente, debido
a la ausencia de la cola poli(A) del casquete 5'.
Los sitios de escisión para los RNAs diana tanto
de sentido como antisentido estaban localizados en el centro de la
región abarcada por los dúplex de siRNA. Los sitios de escisión para
cada diana producida por los 5 dúplex diferentes variaban en 1 nt
de acuerdo con el desplazamiento de 1 nt de los dúplex a lo largo de
las secuencias diana. Las dianas se escindían con precisión 11 nt
aguas abajo de la posición de la diana complementaria al nucleótido
más próximo a 3' del siRNA guía complementario de la secuencia
(Figura 15A, B).
A fin de determinar si el extremo 5' o el 3' del
siRNA guía establece la pauta para la escisión del RNA diana, se
ideó la estrategia experimental reseñada en la Figura 16A y B. Un
siRNA antisentido de 21 nt, que se mantenía invariable para este
estudio, se apareó con si-RNAs de sentido que se
modificaron en cualquiera de sus extremos 5' o 3'. La posición de
la escisión del RNA diana se sentido y antisentido se determinó
como se ha descrito arriba. Los cambios en el extremo 3' del siRNA
de sentido, monitorizados para el saliente 5' de 1 nt hasta el
saliente 3' de 6 nt, no afectaban a la posición de la escisión del
RNA diana de sentido ni del RNA antisentido (Figura 16C). Los
cambios en el extremo 5' del siRNA de sentido no afectaban a la
escisión del RNA diana de sentido (Figura 16D, panel superior),
como se esperaba, debido a que el siRNA antisentido se mantenía
inalterado. Sin embargo, la escisión del RNA diana antisentido se
veía afectada y era fuertemente dependiente del extremo 5' del
siRNA de sentido (Figura 16D, panel inferior). La diana antisentido
se escindía únicamente cuando el siRNA de sentido tenía un tamaño
de 20 ó 21 nt, y la posición de escisión se diferenciaba en 1 nt, lo
que sugería que el extremo 5' del siRNA que reconoce la diana
establece la pauta para la escisión del RNA diana. La posición está
localizada entre los nucleótidos 10 y 11 cuando se cuenta en
dirección aguas arriba desde el nucleótido diana apareado al
nucleótido más próximo a 5' del siRNA guía (véase también la Figura
15A).
Se prefiere un saliente 3' de 2 nt para la
función de siRNA. Se deseaba conocer si la secuencia de los
nucleótidos salientes contribuye al reconocimiento de la diana, o
si es únicamente una característica requerida para reconstitución
del complejo con endonucleasa (RSIC o siRNP). Se sintetizaron siRNAs
de sentido y antisentido con salientes 3' AA, CC, GG, UU, y UG, e
incluían las modificaciones con 2'-desoxi TdG y TT.
Los siRNAs de tipo salvaje contenían AA en el saliente 3' de
sentido y UG en el saliente 3' antisentido (AA/UG). Todos los dúplex
de siRNA eran funcionales en el ensayo de interferencia y reducían
la expresión de la diana al menos 5 veces (Figura 17). Los dúplex
siRNA más eficientes que reducían la expresión de la diana más de 10
veces, eran del tipo de secuencia NN/UG, NN/UU, NN/TdG, y NN/TT
(donde N es cualquier nucleótido). Los dúplex de siRNA con un
saliente 3' de siRNA antisentido de AA, CC o GG eran menos activos
por un factor de 2 a 4 cuando se comparaban con la secuencia de
tipo salvaje UG o el mutante UU. Esta reducción en la eficiencia de
RNAi es debida probablemente a la contribución del penúltimo
nucleótido 3' para el reconocimiento de la diana específica de la
secuencia, dado que el nucleótido 3'-terminal se
cambió de G a U sin efecto alguno.
Los cambios en la secuencia del saliente 3' del
siRNA de sentido no revelaron efecto alguno dependiente de la
secuencia, como era de esperar, dado que el siRNA de sentido no debe
contribuir a reconocimiento del mRNA diana de sentido.
Con objeto de examinar la especificidad de
secuencia del reconocimiento de la diana, se introdujeron cambios
de secuencia en los segmentos apareados de dúplex de siRNA y se
determinó la eficiencia de silenciación. Los cambios de secuencia
se introdujeron invirtiendo segmentos cortos 3 ó 4 nt de longitud o
como mutaciones puntuales (Figura 18). Los cambios de secuencia en
una cadena de siRNA se compensaban en la cadena de siRNA
complementaria a fin de evitar perturbar la estructura del dúplex
de siRNA de bases apareadas. La secuencia de todos los salientes 3'
de 2 nt era TT (T, 2'-desoxitimidina) para reducir
los costes de síntesis. El dúplex de siRNA de referencia TT/TT era
comparable en RNAi al dúplex de siRNA de tipo salvaje AA/UG (Figura
17). La capacidad para mediar la destrucción del mRNA informador se
cuantificó utilizando el ensayo de luminiscencia basado en
traducción. Los dúplex de siRNAs con segmentos de secuencia
invertidos exhibían una capacidad espectacularmente reducida para
direccionamiento del informador luciferasa de luciérnaga (Figura
18). Los cambios de secuencia localizados entre el extremo 3' y el
centro del siRNA antisentido anulaban por completo el reconocimiento
del RNA diana, pero mutaciones próximas al extremo 5' del siRNA
antisentido exhibían un pequeño grado de silenciación. La
transversión del par de bases A/U localizado directamente opuesto al
sitio de escisión predicho del RNA diana, o un solo nucleótido más
allá del sitio, evitaba la escisión del RNA diana, indicando con
ello que una sola mutación dentro del centro del dúplex de siRNA
discrimina entre las dianas con apareamiento erróneo.
Los siRNAs son reactivos valiosos para la
desactivación de la expresión génica, no sólo en células de insecto,
sino también en células de mamífero, con un gran potencial para
aplicación terapéutica. Se han analizado sistemáticamente los
determinantes estructurales de los dúplex de siRNA requeridos para
promover una degradación eficiente del RNA diana en lisado de
embrión de D. melanogaster, proporcionando así pautas para el
diseño de dúplex de siRNA muy potentes. Un dúplex de siRNA perfecto
es capaz de silenciar la expresión génica con una eficiencia
comparable a un dsRNA de 500 pb, dado que se utilizan cantidades
comparables de RNA total.
Los dúplex siRNA de silenciación eficientes se
componen preferiblemente de siRNAs antisentido de 21 nt, y deberían
seleccionarse para formar una doble hélice de 19 pb con extremos
salientes 3' de 2 nt. Las sustituciones con
2'-desoxi de los ribonucleótidos 3' salientes de 2
nt no afectan a la RNAi, pero contribuyen a reducir los costes de
la síntesis de RNA y pueden mejorar la resistencia a las RNasas de
los dúplex de siRNA. Sin embargo, modificaciones más extensas de
2'-desoxi y
2'-O-metilo, reducen la capacidad de
los siRNAs para mediar la RNAi, probablemente por interferir con la
asociación de proteínas para el ensamblaje de siRNAP.
El reconocimiento de la diana es un proceso
altamente específico de la secuencia, mediado por la
complementariedad de siRNA a la diana. El nucleótido más próximo al
extremo 3' del siRNA guía no contribuye a la especificidad del
reconocimiento de la diana, mientras que el penúltimo nucleótido del
saliente 3' afecta a la escisión del RNA diana, y un
desapareamiento reduce la RNAi 2 a 4 veces. El extremo 5' de un
siRNA guía parece ser también más permisivo para el reconocimiento
del RNA diana desapareado cuando se compara con el extremo 3'. Los
nucleótidos situados en el centro del siRNA, localizados frente al
sitio de escisión del RNA diana, son determinantes importantes de
la especificidad, e incluso cambios simples de nucleótidos reducen
la RNAi a nivel indetectable. Esto sugiere que los dúplex de siRNA
pueden ser capaces de discriminar alelos mutantes o polimórficos en
experimentos de direccionamiento de genes, lo que puede llegar a ser
una característica importante para desarrollos terapéuticos
futuros.
Se ha sugerido que los siRNAs de sentido y
antisentido, cuando se asocian con los componentes proteínicos del
complejo de endonucleasas o su complejo de compromiso, juegan
papeles distintos; la orientación relativa del dúplex siRNA en este
complejo define qué cadena puede utilizarse para reconocimiento de
la diana. Los dúplex de siRNA sintéticos tienen simetría de diada
con respecto a la estructura de la doble hélice, pero no con
respecto a la secuencia. La asociación de dúplex de siRNA con las
proteínas de RNAi en el lisado de D. melanogaster puede
conducir a la formación de dos complejos asimétricos. En tales
complejos hipotéticos, el entorno quiral es distinto para el siRNA
de sentido y antisentido, de lo que se deriva su función.
Evidentemente, la predicción no es aplicable a secuencias de siRNA
palindrómicas, o a proteínas RNAi que podrían asociarse como
homodímeros. Para minimizar los efectos de la secuencia, que pueden
afectar a la relación de los siRNPs de direccionamiento de sentido
y antisentido, los autores de la invención sugieren utilizar
secuencias de siRNA con secuencias salientes 3' idénticas. Se
recomienda ajustar la secuencia del saliente del siRNA de sentido a
la del saliente 3' antisentido, dado que el siRNA de sentido no
tiene una diana en experimentos de silenciación
("knock-down") típicos. La asimetría en la
reconstitución de los siRNPs que se escinden con sentido y
antisentido podría ser (parcialmente) responsable de la variación en
la eficiencia de la RNAi observada para diversos dúplex de siRNA de
21 nt con salientes 3' de 2 nt utilizados en este estudio (Figura
14). Alternativamente, la secuencia de nucleótidos en el sitio
diana y/o la accesibilidad de la estructura del RNA diana puede ser
responsable de la variación en la eficiencia para estos dúplex de
siRNA.
\vskip1.000000\baselineskip
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Claims (25)
1. Molécula de RNA bicatenario aislada, en la
cual cada cadena de RNA tiene una longitud de 19 a 23 nucleótidos y
en la cual al menos una cadena tiene un saliente 3' de 1 a 3
nucleótidos, en donde dicha molécula de RNA es capaz de
interferencia de RNA específica de la diana.
2. La molécula de RNA de la reivindicación 1, en
la cual cada cadena tiene una longitud de 20 a 22 nucleótidos.
3. La molécula de RNA de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 ó 2, en la cual el saliente 3' está estabilizado
contra la degradación.
4. La molécula de RNA de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, que contiene al menos un análogo de
nucleótido modificado.
5. La molécula de RNA de la reivindicación 4, en
la cual el análogo de nucleótido modificado se selecciona de
ribonucleótidos modificados en el azúcar o la cadena principal.
6. La molécula de RNA de acuerdo con la
reivindicación 4 ó 5, en la cual el análogo de nucleótido es un
ribonucleótido modificado en el azúcar, en donde el grupo
2'-OH está reemplazado por un grupo seleccionado de
H, OR, R, halo, SH, SR, NH_{2}, NHR, NR_{2} o CN, en donde R es
alquilo, alquenilo o alquinilo C_{1}-C_{6} y
halo es F, Cl, Br o I.
7. La molécula de RNA de la reivindicación 4 ó
5, en donde el análogo de nucleótido es un ribonucleótido
modificado en la cadena principal que contiene un grupo
fosfotioato.
8. La molécula de RNA de una cualquiera de las
reivindicaciones 1-7, que tiene una secuencia que
tiene una identidad de al menos 70 por ciento con una molécula
diana de mRNA predeterminada.
9. Un método de preparación de una molécula de
RNA bicatenario de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8,
que comprende los pasos:
- (a)
- sintetizar dos cadenas de RNA cada una de las cuales tiene una longitud de 19 a 23 nucleótidos y al menos una que tiene un saliente 3' de 1 a 3 nucleótidos, en donde dichas cadenas de RNA son capaces de formar una molécula de RNA bicatenario,
- (b)
- combinar las cadenas de RNA sintetizadas en condiciones en las cuales se forma una molécula de RNA bicatenario, que es capaz de interferencia de RNA específica de la diana.
10. El método de la reivindicación 9, en donde
las cadenas de RNA se sintetizan químicamente.
11. El método de la reivindicación 9, en donde
las cadenas de RNA se sintetizan enzimáticamente.
12. Un método in vitro de mediación de
interferencias de RNA específicas de la diana en una célula o un
organismo, que comprende los pasos:
- (a)
- poner en contacto dicha célula o dicho organismo con la molécula de RNA bicatenario de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 en condiciones en las cuales pueden ocurrir interferencias de RNA específicas de la diana, y
- (b)
- mediar una interferencia de RNA específica de la diana efectuada por el RNA bicatenario hacia un ácido nucleico diana que tiene una porción de secuencia que corresponde sustancialmente al RNA bicatenario.
13. El método de la reivindicación 12, en donde
dicha puesta en contacto comprende introducir dicha molécula de RNA
bicatenario en una célula diana en la cual puede ocurrir
interferencia de RNA específica de la diana.
14. El método de la reivindicación 13, en donde
la introducción comprende suministro o inyección mediado por un
vehículo.
15. Uso del método in vitro de una
cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14 para determinar la
función de un gen en una célula o un organismo.
16. Uso del método in vitro de una
cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14 para modulación de la
función de un gen en una célula o un organismo.
17. El uso de la reivindicación 15 ó 16, en el
cual el gen está asociado con una condición patológica.
18. El uso de una molécula de RNA bicatenario de
cualquiera de las reivindicaciones 1-8 para la
fabricación de un medicamento para modular la función de un gen
asociado a un patógeno.
19. El uso de la reivindicación 18, en el cual
el gen asociado a un patógeno es un gen viral.
20. El uso de una molécula de RNA bicatenario de
cualquiera de las reivindicaciones 1-8 para la
fabricación de un medicamento para modular la función de un gen
asociado a un tumor.
21. El uso de una molécula de RNA bicatenario de
cualquiera de las reivindicaciones 1-8 para la
fabricación de un medicamento para modular la función de un gen
asociado a una enfermedad autoinmune.
22. Composición farmacéutica que contiene como
agente activo al menos una molécula de RNA bicatenario de una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 y un vehículo
farmacéutico.
23. La composición de la reivindicación 22 para
aplicaciones de diagnóstico.
24. La composición de la reivindicación 22 para
aplicaciones terapéuticas.
25. Una célula eucariota o un organismo
eucariota no humano transfectado con una molécula de RNA de una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 o una molécula de DNA que
codifica dicha molécula de RNA.
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