CN116096889A

CN116096889A - 用于抑制angptl3表达的组合物和方法

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Publication number: CN116096889A
Application number: CN202180036489.6A
Authority: CN
Inventors: B·D·布朗; H·T·杜德克; U·萨克森; M·艾布拉姆斯; A·图拉诺夫
Original assignee: Dicerna Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Dicerna Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2020-03-18
Filing date: 2021-03-18
Publication date: 2023-05-09
Also published as: CL2022002521A1; EP4121536A1; CA3172117A1; JP2023518409A; US20230287425A1; TW202200163A; BR112022018667A2; JP7398007B2; KR20220156880A; JP2024041748A; WO2021188795A1; IL296549A; MX2022011550A; AU2021236674A1

Abstract

本文提供了抑制血管生成素样蛋白3(ANGPTL3)表达的寡核苷酸。还提供了包含所述寡核苷酸的组合物及其用途，特别是关于治疗与ANGPTL3表达相关的疾病、病症和/或疾患的用途。

Description

用于抑制ANGPTL3表达的组合物和方法

相关申请

本申请根据35U.S.C.§119(e)要求2020年3月18日提交的美国临时专利申请号62/991,335的权益，所述专利申请的内容以引用的方式整体并入本文。

技术领域

本公开涉及抑制血管生成素样蛋白3(ANGPTL3)表达的寡核苷酸及其用途，特别是关于治疗与ANGPTL3表达相关的疾病、病症和/或疾患的用途。

对序列表的引用

本公开连同电子格式的序列表一起提交。序列表作为在2021年3月18日创建的标题为400930_182359_SL.txt的文件提供，所述文件的大小为371KB。所述序列表的电子格式中的信息以引用的方式整体并入本文。

背景技术

脂质代谢病症可导致血清脂质(诸如甘油三酯和/或胆固醇)的水平升高。升高的血清脂质与高血压、心血管疾病、糖尿病和其他病理疾患强烈相关联。尽管治疗进展，对治疗心血管疾病和代谢疾病的疗法仍存在极高的未满足的医疗需求。

高甘油三酯血症为脂质代谢病症，其特征在于血液中甘油三酯的异常升高的浓度(例如，>150mg/dL)。高甘油三酯血症一直与心血管疾病(例如，动脉粥样硬化)的发展相关联。严重高甘油三酯血症(例如，>500mg/dL)可引起胰腺炎、发疹性黄瘤或视网膜脂血症。在一些情况下，极高水平的乳糜微粒可引起乳糜微粒血症综合征，其特征在于复发性腹痛、恶心、呕吐和胰腺炎(Pejic和Lee(2006)J.Am.Board.Fam.Med.19:310-316)。高脂血症为另一脂质代谢病症，其特征在于血液中的升高水平的脂质和/或脂蛋白中的任一者或所有。

ANGPTL3为分泌蛋白的血管生成素样家族的成员，所述分泌蛋白调控脂质代谢且主要于肝中表达(Koishi等人(2002)Nat.Genet.30:151-157)。ANGPTL3抑制催化甘油三酯的水解的脂蛋白脂肪酶(LPL)，并且抑制水解高密度脂蛋白(HDL)磷脂的内皮脂肪酶(EL)。

发明内容

本公开的方面涉及用于治疗与ANGPTL3表达相关的疾病、病症和/或疾患的组合物和方法。本发明部分基于选择性地抑制和/或减少ANGPTL3表达的寡核苷酸的发现和开发。

在一些实施方案中，本公开提供一种用于减少ANGPTL3表达的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含具有如SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114和116中任一者中所阐述的序列的反义链。

在一些实施方案中，本发明提供一种用于减少ANGPTL3表达的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含具有如SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113和115中任一者中所阐述的序列的有义链。

在一些实施方案中，用于减少ANGPTL3表达的所述寡核苷酸包含长度为15至30个核苷酸的反义链和长度为15至40个核苷酸的有义链，其中所述反义链具有如SEQ ID NO:125、126、127、118、119、120、121、122、123、124和117中任一者中所阐述的ANGPTL3的靶序列的互补区，并且其中所述互补区长度为至少15个连续核苷酸。

在一些实施方案中，所述反义链长度为19至27个核苷酸或长度为21至27个核苷酸。在一些实施方案中，所述反义链长度为22个核苷酸。

在一些实施方案中，所述有义链长度为19至40个核苷酸。在一些实施方案中，所述有义链长度为36个核苷酸。

在一些实施方案中，用于减少ANGPTL3表达的所述寡核苷酸具有长度为至少19个核苷酸或长度为至少21个核苷酸的双链体区。在一些实施方案中，所述双链体区长度为20个核苷酸。

在一些实施方案中，ANGPTL3的所述互补区长度为至少19个连续核苷酸或长度为至少21个连续核苷酸。

在一些实施方案中，用于减少ANGPTL3表达的所述寡核苷酸在所述有义链上在其3′端处包含阐述为：S1-L-S2的茎-环，其中S1与S2互补，并且其中L在S1与S2之间形成长度为3至5个核苷酸的环。

在一些实施方案中，用于减少ANGPTL3表达的寡核苷酸包含反义链和有义链，其中所述反义链长度为21至27个核苷酸并且具有ANGPTL3的互补区，其中所述有义链在其3′端处包含阐述为：S1-L-S2的茎-环，其中S1与S2互补，并且其中L在S1与S2之间形成长度为3至5个核苷酸的环，并且其中所述反义链和所述有义链形成长度为至少19个核苷酸但不共价连接的双链体结构。

在一些实施方案中，所述环L为四环。在一些实施方案中，L长度为4个核苷酸。在一些实施方案中，L包含序列GAAA。

在一些实施方案中，用于减少ANGPTL3表达的所述寡核苷酸包含长度为27个核苷酸的反义链和长度为25个核苷酸的有义链。在一些实施方案中，所述寡核苷酸包含长度为22个核苷酸的反义链和长度为36个核苷酸的有义链。

在一些实施方案中，具有双链体区的寡核苷酸包含所述反义链上的3′-突出端序列。在一些实施方案中，所述反义链上的3′-突出端序列长度为2个核苷酸。

在一些实施方案中，用于减少ANGTPL3表达的所述寡核苷酸包含长度各自在21至23个核苷酸范围内的反义链和有义链。在一些实施方案中，所述寡核苷酸包含长度在19至21个核苷酸范围内的双链体结构。在一些此类实施方案中，所述寡核苷酸包含长度为一个或多个核苷酸的3′-突出端序列，其中所述3′-突出端序列存在于所述反义链、所述有义链或所述反义链和有义链上。在一些实施方案中，所述3′-突出端序列长度为2个核苷酸，其中所述3′-突出端序列在所述反义链上，并且其中所述有义链长度为21个核苷酸且所述反义链长度为23个核苷酸，使得所述有义链和反义链形成长度为21个核苷酸的双链体。

在一些实施方案中，用于减少ANGTPL3表达的所述寡核苷酸包含至少一个经修饰的核苷酸。在一些实施方案中，所述经修饰的核苷酸包含2′-修饰。在一些实施方案中，所述寡核苷酸的所述核苷酸经修饰，例如利用2′-修饰。

在一些实施方案中，用于减少ANGPTL3表达的所述寡核苷酸包含至少一个经修饰的核苷酸间键联，优选地硫代磷酸酯键联。

在一些实施方案中，所述反义链的5′-核苷酸的糖的4′-碳包含磷酸酯类似物，例如，氧基甲基膦酸酯、乙烯基膦酸酯或丙二酰基膦酸酯。

在一些实施方案中，所述寡核苷酸的至少一个核苷酸与一个或多个靶向配体，诸如碳水化合物、氨基糖、胆固醇、多肽或脂质缀合。在一些实施方案中，所述靶向配体包含N-乙酰基半乳糖胺(GalNAc)部分。在一些实施方案中，所述GalNAc部分包括单价GalNAc部分、二价GalNAc部分、三价GalNAc部分或四价GalNAc部分。

在一些实施方案中，所述靶向配体与所述茎-环的L的一个或多个核苷酸结合。在一些实施方案中，所述茎-环的L的至多4个核苷酸各自与单价GalNAc部分缀合。

在一些实施方案中，用于减少ANGPTL3表达的所述寡核苷酸为RNAi寡核苷酸。

在另一方面中，本公开提供一种通过施用本文中的寡核苷酸来减少细胞、细胞群体或受试者中的ANGPTL3表达的方法。在一些实施方案中，减少细胞、细胞群体或受试者中的ANGPTL3表达的方法包括使所述细胞或所述细胞群体接触或向所述受试者施用有效量的本文中寡核苷酸或其药物组合物的步骤。在一些实施方案中，用于减少ANGPTL3表达的方法包括减少ANGPTL3 mRNA的量或水平，减少ANGPTL3蛋白质的量或水平，或二者。

在一些实施方案中，本公开提供一种通过向受试者施用有效量的本文中寡核苷酸或其药物组合物来减少所述受试者中的甘油三酯(TG)的量或水平的方法。

在一些实施方案中，本公开提供一种通过向受试者施用有效量的本文中寡核苷酸或其药物组合物来减少所述受试者中的胆固醇的量或水平的方法。

在一些实施方案中，用本文中寡核苷酸治疗的受试者患有与ANGPTL3表达相关的疾病、病症或疾患。在一些实施方案中，用于治疗患有与ANGPTL3表达相关的疾病、病症或疾患的受试者的方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的本文中寡核苷酸或其药物组合物，从而治疗所述受试者。

在一些实施方案中，本文中用于施用的寡核苷酸包含长度为15至50个核苷酸的有义链和长度为15至30个核苷酸的反义链，其中所述有义链与所述反义链形成双链体区，其中所述有义链包含如SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113和115中任一者中所阐述的序列，并且其中所述反义链包含选自SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114和116的互补序列，或其药物组合物，从而治疗所述受试者。

在一些实施方案中，用于治疗患有与ANGPTL3表达相关的疾病、病症或疾患的受试者的方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的寡核苷酸，所述寡核苷酸包含选自表5中所阐述的表的行的一对有义链和反义链，或其药物组合物，从而治疗所述受试者。

在一些实施方案中，与ANGPTL3表达相关的所述疾病、病症或疾患选自由以下组成的组：高甘油三酯血症、肥胖症、高脂血症、异常脂质和/或胆固醇代谢、动脉粥样硬化、II型糖尿病、心血管疾病、冠状动脉疾病、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)、纯合子和杂合子家族性高胆固醇血症和他汀耐药性高胆固醇血症。

在一些实施方案中，与ANGPTL3表达相关的所述疾病、病症或疾患为心血管疾病、II型糖尿病、高甘油三酯血症、NASH、肥胖症或它们的组合。

在一些实施方案中，所述寡核苷酸或其药物组合物与第二治疗剂或其组合物组合施用。

在另一方面中，本公开提供本公开的寡核苷酸或其药物组合物中任一者在制造用于治疗与ANGPTL3表达相关的疾病、病症或疾患的药剂中的用途。

在一些实施方案中，本公开的寡核苷酸或本公开的药物组合物用于或适用于治疗与ANGPTL3表达相关的疾病、病症或疾患。

在另一方面中，本公开的寡核苷酸以药盒形式提供以治疗与ANGPTL3表达相关的疾病、病症或疾患。在一些实施方案中，所述药盒包括本文中寡核苷酸，和药学上可接受的载体。在一些实施方案中，所述药盒还包括包含向患有与ANGPTL3表达相关的疾病、病症或疾患的受试者施用的说明的包装插页。

在所述用途或药盒的一些实施方案中，与ANGPTL3表达相关的所述疾病、病症或疾患选自由以下组成的组：高甘油三酯血症、肥胖症、高脂血症、异常脂质和/或胆固醇代谢、动脉粥样硬化、II型糖尿病、心血管疾病、冠状动脉疾病、NASH、NAFLD、纯合子和杂合子家族性高胆固醇血症和他汀耐药性高胆固醇血症。

在所述用途或药盒的一些实施方案中，与ANGPTL3表达相关的所述疾病、病症或疾患为心血管疾病、II型糖尿病、高甘油三酯血症、NASH、肥胖症或它们的组合。

附图说明

图1提供描绘相对于对照模拟处理的细胞中的ANGPTL3 mRNA的％，用指定DsiRNA转染的HuH-7细胞中的ANGPTL3 mRNA的百分比(％)的图。

图2提供描绘相对于对照模拟处理的细胞中的ANGPTL3 mRNA的％，用指定DsiRNA转染的HuH-7细胞中的ANGPTL3 mRNA的百分比(％)的图。

图3提供描绘通用GalNAc缀合的ANGPTL3寡核苷酸的结构和化学修饰模式的示意图。

图4提供描绘相对于用磷酸盐缓冲盐水(PBS)处理的小鼠，来自用指定GalNAc缀合的ANGPTL3寡核苷酸处理的小鼠的肝样品中的ANGPTL3 mRNA的百分比(％)的图。

图5A至5C提供描绘在处理后第28天(图5A)、第56天(图5B)和第84天(图5C)相对于用PBS处理的NHP，来自用指定GalNAc缀合的ANGPTL3寡核苷酸处理的非人灵长类动物(NHP)的肝样品中的ANGPTL3 mRNA的百分比(％)的图。

图6提供描绘相对于用PBS处理的NHP，来自用指定GalNAc缀合的ANGPTL3寡核苷酸处理的NHP的肝样品中的ANGPTL3mRNA随时间推移的平均百分比(％)的图。

图7提供描绘相对于用PBS处理的NHP，来自用指定GalNAc缀合的ANGPTL3寡核苷酸处理的NHP的血清中的ANGPTL3蛋白质随时间推移的平均百分比(％)的图。

具体实施方式

I.定义

如本文所用，如应用于目标一个或多个值的“约”是指与指定参考值相似的值。在某些实施方案中，除非另外指定或从上下文另外明显(除了在此数字将超过可能值的100％的情况下)，否则“约”是指在任一方向(大于或小于)上落入指定参考值的25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更少内的值的范围。

如本文所用，“施用”(administer/administering/administration)等是指以药理上可用方式(例如，用以治疗受试者的疾患)向受试者提供物质(例如，寡核苷酸)。

如本文所用，“ANGPTL3”是指血管生成素样蛋白3，其为分泌多肽的血管生成素样家族的成员。ANGPTL3主要在哺乳动物的肝中表达，并且ANGPTL3蛋白质具有血管生成素的特征结构，包含信号肽、N-末端卷曲螺旋结构域和C-末端纤维蛋白原(FBN)样结构域。出于本发明的目的，“ANGPTL3”是指来自任何脊椎动物或哺乳动物(包括但不限于人、小鼠、灵长类动物、猴、牛、鸡、啮齿动物、大鼠、猪、羊和豚鼠)的ANGPTL3。ANGPTL3还指维持天然ANGPTL3的至少一种体内或体外活性的天然ANGPTL3的片段和变体。ANGPTL3涵盖ANGPTL3的全长未加工的前体形式，以及从信号肽的翻译后裂解产生的成熟形式和从FBN样结构域的蛋白水解加工产生的形式。人ANGPTL3 mRNA转录物的示例性序列公开可用(GenBank登录号GI：41327750(NM_014495.2))且公开于本文中(SEQ ID NO:128)。食蟹猴ANGPTL3 mRNA的示例性序列公开可得(GenBank登录号GI：102136264(XM_005543185.2))且公开于本文中(SEQID NO:129)。小鼠ANGPTL3 mRNA的示例性序列公开可得(GenBank登录号GI：142388354(NM_013913.3))且公开于本文中(SEQ ID NO:130)。大鼠ANGPTL3的示例性序列公开可得(GenBank登录号GI：68163568(NM_001025065.1)且公开于本文中(SEQ ID NO:131)。

如本文中所用，“无唾液酸糖蛋白受体”或“ASGPR”是指由主要48kDa亚基(ASGPR-1)和次要40kDa亚基(ASGPR-2)形成的二分C型凝集素。ASGPR主要在肝细胞的窦状表面上表达且在含有末端半乳糖或GalNAc残基的循环糖蛋白(无唾液酸糖蛋白)的结合、内化和随后清除中具有主要作用。

如本文中所用，“减弱(attenuate/attenuating/attenuation)”等是指减少或有效停止。作为非限制性实例，本文中治疗中的一者或多者可减少或有效停止受试者的血脂异常/高甘油三酯血症/高脂血症的发作或进展。这种减弱可通过以下例示：例如，当另外可预期时，受试者的血脂异常/高甘油三酯血症/高脂血症的一个或多个方面(例如，症状、组织特征和细胞炎性或免疫学活性等)的减少，无血脂异常/高甘油三酯血症/高脂血症的一个或多个方面的可检测的进展(恶化)、或无血脂异常/高甘油三酯血症/高脂血症的可检测的方面。

如本文所用，“互补”是指两个核苷酸(例如，在两个相对核酸上或在单个核酸链的相对区上)之间的结构关系，其允许两个核苷酸彼此形成碱基对。例如，与相对核酸的嘧啶核苷酸互补的一个核酸的嘌呤核苷酸可通过彼此形成氢键一起成碱基对。在一些实施方案中，互补核苷酸可以Watson-Crick方式或以允许形成稳定双链体的任何其他方式成碱基对。在一些实施方案中，两个核酸可具有彼此互补以形成互补区的多个核苷酸的区，如本文中所述。

如本文所用，“脱氧核苷酸”是指当与核糖核苷酸相比时，在其戊糖的2′位置处具有氢代替羟基的核苷酸。经修饰的脱氧核苷酸为除了在2′位置处外具有原子的一个或多个修饰或取代的脱氧核苷酸，包括糖、磷酸酯基或碱基的修饰或取代。

如本文所用，“双链寡核苷酸”或“ds寡核苷酸”是指实质上呈双链体形式的寡核苷酸。在一些实施方案中，ds寡核苷酸的双链体区的互补碱基对在共价单独核酸链的核苷酸的反平行序列之间形成。在一些实施方案中，ds寡核苷酸的双链体区的互补碱基对在共价连接的核酸链的核苷酸的反平行序列之间形成。在一些实施方案中，ds寡核苷酸的双链体区的互补碱基对从单独核酸链形成，所述单独核酸链折叠(例如，经由发夹)以提供成碱基对在一起的核苷酸的互补反平行序列。在一些实施方案中，ds寡核苷酸包含彼此完全成双链体的两个共价单独核酸链。然而，在一些实施方案中，ds寡核苷酸包含部分成双链体(例如，在一端或两端具有突出端)的两个共价单独核酸链。在一些实施方案中，ds寡核苷酸包含部分互补的核苷酸的反平行序列，并且因此，可具有一个或多个错配，其可包括内部错配或末端错配。

如本文所用，提及核酸(例如，寡核苷酸)的“双链体”是指通过核苷酸的两个反平行序列的互补碱基成对形成的结构。

如本文所用，“赋形剂”是指可包含于组合物中(例如)以提供或促进所需稠度或稳定效应的非治疗剂。

如本文所用，“肝细胞(hepatocyte/hepatocytes)”是指肝的薄壁组织的细胞。这些细胞构成肝的质量的约70％至85％和制造血清白蛋白、FBN和凝血因子(除了因子3和4)的凝血酶原组。肝细胞谱系细胞的标志物包括但不限于甲状腺素运载蛋白(Ttr)、谷氨酰胺合成酶(Glul)、肝细胞核因子1a(Hnf1a)和肝细胞核因子4a(Hnf4a)。成熟肝细胞的标志物可包括但不限于细胞色素P450(Cyp3a11)、富马酰基乙酰乙酸水解酶(Fah)、葡萄糖6-磷酸盐(G6p)、白蛋白(Alb)和OC2-2F8。参见，例如，Huch等人(2013)Nature 494:247-250。

如本文所用，“肝毒性剂”是指自身对肝有毒或可经加工以形成对肝有毒的代谢物的化学化合物、病毒或其他物质。肝毒性剂可包括但不限于四氯化碳(CCl₄)、醋氨酚(对乙酰氨基酚)、氯乙烯、砷、氯仿、非固醇类抗炎药物(诸如阿司匹林(aspirin)和苯基丁氮酮(phenylbutazone))。

如本文中所用，“不稳定接头”是指可裂解(例如，通过酸性pH)的接头。“相当稳定接头”是指不可裂解的接头。

如本文所用，“肝炎症”或“肝炎”是指身体状况，其中肝变得肿胀、功能失调和/或疼痛，尤其作为损伤或感染的结果，如可由暴露于肝毒性剂引起。症状可包括黄疸(皮肤或眼睛发黄)、疲劳、乏力、恶心、呕吐、食欲降低和体重损失。如果放任不治疗，则肝发炎可进展为纤维化、硬化、肝衰竭或肝癌。

如本文所用，“肝纤维化(liver fibrosis/fibrosis of the liver)”是指细胞外基质蛋白在肝中的过量累积，所述蛋白质可包括胶原蛋白(I、III和IV)、FBN、粗纤维调节素(undulin)、弹性蛋白、层粘连蛋白、透明质酸和从炎症和肝细胞死亡产生的蛋白多糖。如果放任不治疗，则肝纤维化可进展为硬化、肝衰竭或肝癌。

如本文所用，“环”是指核酸(例如，寡核苷酸)的未配对区，其侧接核酸的两个彼此充分互补的反平行区，使得在适当杂交条件下(例如，在磷酸盐缓冲剂中，在细胞中)，侧接所述未配对区的两个反平行区杂合以形成双链体(称作“茎”)。

如本文所用，“经修饰的核苷酸间键联”是指当与包含磷酸二酯键的参考核苷酸间键联相比时，具有一个或多个化学修饰的核苷酸间键联。在一些实施方案中，经修饰的核苷酸为非天然产生的键联。通常，经修饰的核苷酸间键联对存在经修饰的核苷酸间键联的核酸赋予一种或多种所需性质。例如，经修饰的核苷酸可改善热稳定性、对降解的抗性、核酸酶抗性、溶解度、生物可利用率、生物活性、降低的免疫原性等。

如本文中所用，“经修饰的核苷酸”是指当与选自：腺嘌呤核糖核苷酸、鸟嘌呤核糖核苷酸、胞嘧啶核糖核苷酸、尿嘧啶核糖核苷酸、腺嘌呤脱氧核苷酸、鸟嘌呤脱氧核苷酸、胞嘧啶脱氧核苷酸和胸腺嘧啶脱氧核苷酸的相应参考核苷酸相比时，具有一个或多个化学修饰的核苷酸。在一些实施方案中，经修饰的核苷酸为非天然产生的核苷酸。在一些实施方案中，经修饰的核苷酸在其糖、核碱基和/或磷酸酯基团中具有一个或多个化学修饰。在一些实施方案中，经修饰的核苷酸具有与相应参考核苷酸缀合的一个或多个化学部分。通常，经修饰的核苷酸对存在经修饰的核苷酸的核酸赋予一种或多种所需性质。例如，经修饰的核苷酸可改善热稳定性、对降解的抗性、核酸酶抗性、溶解度、生物可利用率、生物活性、降低的免疫原性等。

如本文所用，“有切口的四环结构”是指拖过分开有义(过客)链和反义(引导)链表征的RNAi寡核苷酸的结构，其中所述有义链具有与所述反义链互补的区，并且其中所述链中的至少一者(通常有义链)具有配置以使至少一个链内形成的相邻茎区稳定的四环。

如本文中所用，“寡核苷酸”是指短核酸(例如，长度小于约100个核苷酸)。寡核苷酸可为单链(ss)或ds。寡核苷酸可具有或可不具有双链体区。作为非限制性实例的集合，寡核苷酸可为但不限于小干扰RNA(siRNA)、微小RNA(miRNA)、短发夹RNA(shRNA)、切丁酶(dicer)底物干扰RNA(dsiRNA)、反义寡核苷酸、短siRNA或ss siRNA。在一些实施方案中，ds寡核苷酸为RNAi寡核苷酸。

如本文所用，“突出端”是指从延伸超出互补链的末端的一个链或区产生的末端非碱基对核苷酸，所述一个链或区与所述互补链形成双链体。在一些实施方案中，突出端包含从ds寡核苷酸的5′端或3′端处的双链体区延伸的一个或多个未配对核苷酸。在某些实施方案中，所述突出端为ds寡核苷酸的反义链或有义链上的3′或5′突出端。

如本文中所用，“磷酸酯类似物”是指模拟磷酸酯基的静电和/或空间性质的化学部分。在一些实施方案中，磷酸酯类似物位于寡核苷酸的5′末端核苷酸处代替经常易受酶促移除的5′-磷酸酯。在一些实施方案中，5′磷酸酯类似物含有磷酸酶抗性键联。磷酸酯类似物的实例包括但不限于5′膦酸酯，诸如5′亚甲基膦酸酯(5′-MP)和5′-(E)-乙烯基膦酸酯(5′-VP)。在一些实施方案中，寡核苷酸在5′-末端核苷酸处在糖的4′-碳位置处具有磷酸酯类似物(称作“4′-磷酸酯类似物”)。4′-磷酸酯类似物的实例为氧基甲基膦酸酯，其中氧基甲基的氧原子结合至糖部分(例如，在其4′-碳处)或其类似物。参见，例如，美国临时专利申请号62/383,207(2016年9月2日提交)和62/393,401(2016年9月12日提交)。已开发针对寡核苷酸的5′端的其他修饰(参见，例如，国际专利申请号WO 2011/133871；美国专利号8,927,513；和Prakash等人(2015)Nucleic Acids Res.43:2993-3011)。

如本文所用，基因(例如，ANGPTL3)的“减少的表达”是指当与适当参考(例如，参考细胞、细胞群体、样品或受试者)比较时，RNA转录物(例如，ANGPTL3 mRNA)或由所述基因编码的蛋白质的量或水平减少和/或所述基因于细胞、细胞群体、样品或受试者中的活性的量或水平减少。例如，当与不用ds寡核苷酸处理的细胞相比时，使细胞与本文中寡核苷酸(例如，包含反义链的寡核苷酸，所述反义链具有与包含ANGPTL3 mRNA的核苷酸序列互补的核苷酸序列)接触的行为可导致ANGPTL3 mRNA、蛋白质和/或活性的量或水平减少(例如，经由ANGPTL3 mRNA通过RNAi途径降解)。相似地，并且如本文所用，“减少表达”是指导致基因(例如，ANGPTL3)的减少的表达的行为。如本文所用，“ANGPTL3表达的减少”是指当与适当参考(例如，参考细胞、细胞群体、样品或受试者)相比时，细胞、细胞群体、样品或受试者中的ANGPTL3 mRNA、ANGPTL3蛋白质和/或ANGPTL3活性的量或水平的减少。

如本文所用，“互补区”是指核酸(例如，ds寡核苷酸)的核苷酸序列，其与核苷酸的反平行序列充分互补以允许核苷酸的两个序列之间在适当杂交条件下(例如，在磷酸盐缓冲剂中，在细胞中等)杂交。在一些实施方案中，本文中寡核苷酸包含具有mRNA靶序列的互补区的靶向序列。

如本文中所用，“核糖核苷酸”是指具有核糖作为其戊糖的核苷酸，所述核糖核苷酸在其2′位置处含有羟基。经修饰的核糖核苷酸为除了在2′位置处外具有原子的一个或多个修饰或取代(包括核糖、磷酸酯基或碱基的修饰或取代)的核糖核苷酸。

如本文中所用，“RNAi寡核苷酸”是指(a)具有有义链(过客)和反义链(引导)的ds寡核苷酸，其中所述反义链或所述反义链的部分通过Argonaute 2(Ago2)核酸内切酶用于靶mRNA的裂解或(b)具有单反义链的ss寡核苷酸，其中所述反义链(或所述反义链的部分)通过Ago2核酸内切酶用于靶mRNA的裂解。

如本文所用，“链”是指通过核苷酸间键联(例如，磷酸二酯键联或硫代磷酸酯键联)连接在一起的核苷酸的单一连续序列。在一些实施方案中，链具有两个游离端(例如，5′端和3′端)。

如本文所用，“受试者”意指任何哺乳动物，包括小鼠、兔和人。在一个实施方案中，受试者为人或NHP。此外，“个体”或“患者”可与“受试者”互换使用。

如本文中所用，“合成”是指经人工合成(例如，使用机器(例如，固态核酸合成器))或另外非源自正常产生分子的天然来源(例如，细胞或生物体)的核酸或其他分子。

如本文中所用，“靶向配体”是指选择性地结合至目标组织或细胞的同源分子(例如，受体)和出于将其他物质靶向目标组织或细胞的目的，可与另一物质缀合的分子(例如，碳水化合物、氨基糖、胆固醇、多肽或脂质)。例如，在一些实施方案中，出于将寡核苷酸靶向目标特定组织或细胞的目的，可将靶向配体与所述寡核苷酸缀合。在一些实施方案中，靶向配体选择性地结合至细胞表面受体。因此，在一些实施方案中，当与寡核苷酸缀合时，靶向配体通过选择性结合至细胞表面上表达的受体和通过包含所述寡核苷酸的靶向配体和受体的复合物的细胞的内体内化促进所述寡核苷酸递送至特定细胞。在一些实施方案中，靶向配体经由接头与寡核苷酸缀合，所述接头在细胞内化后或在细胞内化期间裂解使得寡核苷酸从细胞中的靶向配体释放。

如本文中所用，“四环”是指增加通过核苷酸的侧接序列的杂交形成的相邻双链体的稳定性的环。稳定性增加可检测为相邻茎双链体的解链温度(T_m)的增加，其高于来自由随机选择的核苷酸序列组成的一组可比较长度的环的所期望的相邻茎双链体的平均T_m。例如，四环可在10mM NaHPO₄中对包含长度为至少2个碱基对(bp)的双链体的发夹赋予至少约50℃，至少约55℃，至少约56℃，至少约58℃，至少约60℃，至少约65℃，或至少约75℃的T_m。在一些实施方案中，四环可通过堆积相互作用使相邻茎双链体中的bp稳定。此外，四环中的核苷酸的相互作用包括但不限于非沃森-克里克(Watson-Crick)碱基配对、堆积相互作用、氢键合和接触相互作用(Cheong等人(1990)Nature 346:680-682；Heus和Pardi(1991)Science 253:191-194)。在一些实施方案中，四环包含3至6个核苷酸或由其组成并且通常为4至5个核苷酸。在某些实施方案中，四环包含3、4、5或6个核苷酸或由其组成，其可经修饰或可不经修饰(例如，其可以或可以不与靶向部分缀合)。在一个实施方案中，四环由4个核苷酸组成。任何核苷酸可用于四环中并且可使用此类核苷酸的标准IUPAC-IUB符号，如Cornish-Bowden(1985)Nucleic Acids Res.13:3021-3030中所述。例如，可使用字母“N”意指任何碱基可在所述位置中，可使用字母“R”显示A(腺嘌呤)或G(鸟嘌呤)可在所述位置中，并且可使用“B”显示C(胞嘧啶)、G(鸟嘌呤)或T(胸腺嘧啶)可在所述位置中。四环的实例包括四环的UNCG家族(例如，UUCG)、四环的GNRA家族(例如，GAAA)和CUUG四环(Woese等人(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA87:8467-8471；Antao等人(1991)Nucleic Acids Res.19:5901-5905)。DNA四环的实例包括四环的d(GNNA)家族(例如，d(GTTA))、四环的d(GNRA)家族、四环的d(GNAB)家族、四环的d(CNNG)家族和四环的d(TNCG)家族(例如，d(TTCG))。参见，例如，Nakano等人(2002)Biochem.41:4281-14292；Shinji等人(2000)Nippon KagakkaiKoen Yokoshu 78:731。在一些实施方案中，四环包含在有切口的四环结构内。

如本文中所用，“治疗(treat/treating)”是指出于相对于现有疾患(例如，疾病、病症)改善受试者的健康和/或幸福感或预防或减少疾患发生的可能性的目的，向有需要的受试者提供护理的行为，例如，通过向所述受试者施用治疗剂(例如，本文中寡核苷酸)。在一些实施方案中，治疗涉及降低受试者所经历的疾患(例如，疾病、病症)的至少一种病征、症状或促进因素的频率或严重程度。

II.ANGPTL3表达的寡核苷酸抑制剂

本发明尤其提供抑制ANGPTL3表达的寡核苷酸。在一些实施方案中，本文中抑制ANGPTL3表达的寡核苷酸靶向ANGPTL3 mRNA。

i.ANGPTL3靶序列

在一些实施方案中，所述寡核苷酸靶向包含ANGPTL3 mRNA的靶序列。在一些实施方案中，所述寡核苷酸或其一部分、片段或链(例如，ds寡核苷酸的反义链或引导链)与包含ANGPTL3 mRNA的靶序列结合或重组，从而抑制ANGPTL3表达。在一些实施方案中，出于抑制体内ANGPTL3表达的目的，所述寡核苷酸靶向ANGPTL3靶序列。在一些实施方案中，ANGPTL3表达通过靶向ANGPTL3靶序列的寡核苷酸抑制的量或程度与寡核苷酸的效力相关。在一些实施方案中，ANGPTL3表达通过靶向ANGPTL3靶序列的寡核苷酸抑制的量或程度与用寡核苷酸治疗的患有与ANGPTL3的表达相关的疾病、病症或疾患的受试者或患者中的治疗益处的量或程度相关。

通过检查编码ANGPTL3的mRNA，包括多个不同物种(例如，人、食蟹猴、小鼠和大鼠；参见，例如，实施例1)的mRNA的核苷酸序列和作为体外和体内测试的结果(参见，例如，实施例2和实施例3)，已发现ANGPTL3 mRNA的某些核苷酸序列较其他对于基于寡核苷酸的抑制更适合且因此可用作本文中寡核苷酸的靶向序列。在一些实施方案中，本文中所述(例如，表5中)的寡核苷酸(例如，ds寡核苷酸)的有义链包含ANGPTL3靶序列。在一些实施方案中，本文中所述(例如，表5中)的ds寡核苷酸的有义链的一部分或区域包含ANGPTL3靶序列。在一些实施方案中，ANGPTL3靶序列包含SEQ IDNO:117、118、119、120、121、122、123、124、125、126和127中任一者的序列或由其组成。

ii.ANGPTL3靶向序列

在一些实施方案中，出于靶向细胞中的mRNA和抑制其表达的目的，本文中寡核苷酸具有ANGPTL3 mRNA的互补区(例如，在ANGPTL3 mRNA的靶序列内)。在一些实施方案中，本文中寡核苷酸包含具有互补区的ANGPTL3靶向序列(例如，ds寡核苷酸的反义链或引导链)，所述互补区通过互补(沃森-克里克)碱基配对与ANGPTL3靶序列结合或重组。靶向序列或互补区一般具有适当长度和碱基含量以出于抑制ANGPTL3 mRNA表达的目的使寡核苷酸(或其链)能够与所述ANGPTL3 mRNA结合或重组。在一些实施方案中，所述靶向序列或互补区长度为至少约12个、至少约13个、至少约14个、至少约15个、至少约16个、至少约17个、至少约18个、至少约19个、至少约20个、至少约21个、至少约22个、至少约23个、至少约24个、至少约25个、至少约26个、至少约27个、至少约28个、至少约29个或至少约30个核苷酸。在一些实施方案中，所述靶向序列或互补区长度为约12至约30(例如，12至30、12至22、15至25、17至21、18至27、19至27或15至30)个核苷酸。在一些实施方案中，所述靶向序列或互补区长度为约12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸。在一些实施方案中，所述靶向序列或互补区长度为18个核苷酸。在一些实施方案中，所述靶向序列或互补区长度为19个核苷酸。在一些实施方案中，所述靶向序列或互补区长度为20个核苷酸。在一些实施方案中，所述靶向序列或互补区长度为21个核苷酸。在一些实施方案中，所述靶向序列或互补区长度为22个核苷酸。在一些实施方案中，所述靶向序列或互补区长度为23个核苷酸。在一些实施方案中，所述靶向序列或互补区长度为24个核苷酸。

在一些实施方案中，本文中寡核苷酸包含与ANGPTL3靶序列完全互补的靶向序列或互补区(例如，双链寡核苷酸的反义链或引导链)。在一些实施方案中，所述靶向序列或互补区与ANGPTL3靶序列部分互补。在一些实施方案中，所述寡核苷酸包含与SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113和115中任一者的序列完全互补的靶向序列或互补区。在一些实施方案中，所述寡核苷酸包含与SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113和115中任一者的序列部分互补的靶向序列或互补区。

在一些实施方案中，本文中寡核苷酸包含与包含ANGPTL3mRNA的核苷酸的连续序列互补的靶向序列或互补区，其中所述核苷酸的连续序列长度为约12至约30个核苷酸(例如，长度为12至30个、12至28个、12至26个、12至24个、12至20个、12至18个、12至16个、14至22个、16至20个、18至20个或18至19个核苷酸)。在一些实施方案中，所述寡核苷酸包含与包含ANGPTL3 mRNA的核苷酸的连续序列互补的靶向序列或互补区，其中所述核苷酸的连续序列长度为10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个核苷酸。在一些实施方案中，所述寡核苷酸包含与包含ANGPTL3mRNA的核苷酸的连续序列互补的靶向序列或互补区，其中所述核苷酸的连续序列长度为19个核苷酸。在一些实施方案中，所述寡核苷酸包含与SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113和115中任一者的核苷酸的连续序列互补的靶向序列或互补区，任选地其中所述核苷酸的连续序列长度为19个核苷酸。

在一些实施方案中，与如SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113和115中任一者中所阐述的序列的连续核苷酸互补的寡核苷酸的靶向序列或互补区跨越反义链的整个长度。在一些实施方案中，与如SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113和115中任一者中所阐述的序列的连续核苷酸互补的寡核苷酸的互补区跨越反义链的整个长度的一部分。在一些实施方案中，本文中寡核苷酸包含与以下至少部分(例如，完全)互补的互补区(例如，在ds寡核苷酸的反义链上)：跨越如SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113和115中任一者中所阐述的序列的核苷酸1至20的一连串核苷酸。

在一些实施方案中，本文中寡核苷酸包含具有与相应ANGPTL3靶序列的一个或多个bp错配的靶向序列或互补区。在一些实施方案中，所述靶向序列或互补区可具有与相应ANGPTL3靶序列的至多约1个、至多约2个、至多约3个、至多约4个、至多约5个等错配，只要维持所述靶向序列或互补区在适当杂交条件下与ANGPTL3mRNA结合或重组的能力和/或寡核苷酸抑制ANGPTL3表达的能力即可。或者，所述靶向序列或互补区可具有与相应ANGPTL3靶序列的不超过1个、不超过2个、不超过3个、不超过4个或不超过5个错配，只要维持所述靶向序列或互补区在适当杂交条件下与ANGPTL3 mRNA结合或重组的能力和/或寡核苷酸抑制ANGPTL3表达的能力即可。在一些实施方案中，所述寡核苷酸包含具有与相应靶序列的1个错配的靶向序列或互补区。在一些实施方案中，所述寡核苷酸包含具有与相应靶序列的2个错配的靶向序列或互补区。在一些实施方案中，所述寡核苷酸包含具有与相应靶序列的3个错配的靶向序列或互补区。在一些实施方案中，所述寡核苷酸包含具有与相应靶序列的4个错配的靶向序列或互补区。在一些实施方案中，所述寡核苷酸包含具有与相应靶序列的5个错配的靶向序列或互补区。在一些实施方案中，所述寡核苷酸包含具有与相应靶序列的超过一个错配(例如，2、3、4、5或更多个错配)的靶向序列或互补区，其中所述错配中的至少2者(例如，所有)连续定位(例如，2、3、4、5或更多个错配成一行)，或其中所述错配在整个靶向序列或互补区散布。

iii.寡核苷酸的类型

各种寡核苷酸类型和/或结构可用于在本文中的方法中靶向ANGPTL3，包括但不限于RNAi寡核苷酸、反义寡核苷酸、miRNA等。考虑本文中或其他地方所述的寡核苷酸类型中的任一者用作框架以并入本文中的ANGPTL3靶向序列。

在一些实施方案中，本文中寡核苷酸通过与切丁酶涉及的RNA干扰(RNAi)途径上游或下游接合来抑制ANGPTL3表达。例如，已开发RNAi寡核苷酸，其中各链具有约19至25个核苷酸的大小与1至5个核苷酸的至少一个3′突出端(参见，例如，美国专利号8,372,968)。还已开发更长寡核苷酸，其通过切丁酶加工以产生活性RNAi产物(参见，例如，美国专利号8,883,996)。进一步工作产生延长的ds寡核苷酸，其中至少一个链的至少一个末端延伸出双链体靶向区，所述延长的ds寡核苷酸包括结构，其中所述链中的一者包含热力学稳定四环结构(参见，例如，美国专利号8,513,207和8,927,705，以及国际专利申请公布号WO2010/033225)。此类结构可包括ss延伸(在分子的一侧或两侧)以及ds延伸。

在一些实施方案中，本文中寡核苷酸参与涉及切丁酶(例如，切丁酶裂解)的RNAi途径下游。在一些实施方案中，所述寡核苷酸在有义链的3′端具有突出端(例如，长度1、2或3个核苷酸)。在一些实施方案中，所述寡核苷酸(例如，siRNA)包含为靶RNA反义的21个核苷酸引导链和互补过客链，其中两个链重组以形成19-bp双链体和在任一个或两个3′端的2个核苷酸突出端。更长寡核苷酸设计也可获得，包括具有23个核苷酸的引导链和21个核苷酸的过客链的寡核苷酸，其中在分子右侧(过客链的3′端/引导链的5′端)存在钝端和在分子左侧(过客链的5′端/引导链的3′端)存在两个核苷酸3′-引导链突出端。在此类分子中，存在21bp双链体区。参见，例如，美国专利号9,012,138、9,012,621和9,193,753。

在一些实施方案中，本文中寡核苷酸包含有义链和反义链，所述链长度均在约17至26(例如，17至26、20至25或21至23)个核苷酸的范围内。在一些实施方案中，本文中寡核苷酸包含有义链和反义链，所述链长度均在约19至22个核苷酸的范围内。在一些实施方案中，所述有义链和反义链长度相等。在一些实施方案中，寡核苷酸包含有义链和反义链，使得在有义链或反义链，或有义链和反义链二者上存在3′-突出端。在一些实施方案中，针对具有有义链和反义链(二者长度均在约21至23个核苷酸的范围内)的寡核苷酸，有义链、反义链或有义链和反义链二者上的3′突出端长度为1或2个核苷酸。在一些实施方案中，所述寡核苷酸具有22个核苷酸的引导链和20个核苷酸的过客链，其中在分子右侧(过客链的3′端/引导链的5′端)存在钝端和在分子左侧(过客链的5′端/引导链的3′端)存在两个核苷酸3′-引导链突出端。在此类分子中，存在20bp双链体区。

用于本文中组合物和方法的其他寡核苷酸设计包括：16-聚体siRNA(参见，例如，NUCLEIC ACIDS IN CHEMISTRY AND BIOLOGY.Blackburn(编辑),Royal Society ofChemistry,2006)、shRNA(例如，具有19个bp或更短茎；参见，例如，Moore等人(2010)Methods Mol.Biol.629:141-158)、钝siRNA(例如，长度19个bp；参见，例如，Kraynack和Baker(2006)RNA 12:163-176)、不对称siRNA(aiRNA；参见，例如，Sun等人(2008)Nat.Biotechnol.26:1379-1382)、不对称更短双链体siRNA(参见，例如，Chang等人(2009)Mol.Ther.17:725-732)、叉体siRNA(参见，例如，Hohjoh(2004)FEBS Lett.557:193-198)、ss siRNA(Elsner(2012)Nat.Biotechnol.30:1063)、哑铃状环状siRNA(参见，例如，Abe等人(2007)J.Am.Chem.Soc.129:15108-15109)和小的内部分段干扰RNA(siRNA；参见，例如，Bramsen等人(2007)Nucleic Acids Res.35:5886-5897)。可用于一些实施方案中以减少或抑制ANGPTL3表达的寡核苷酸结构的另外非限制性实例为微小RNA(miRNA)、短发夹RNA(shRNA)和短siRNA(参见，例如，Hamilton等人(2002)EMBO J.21:4671-4679；还参见美国专利申请公布号2009/0099115)。

仍在一些实施方案中，本文中用于减少或抑制ANGPTL3表达的寡核苷酸为ss。此类结构可包括但不限于ss RNAi分子。最近努力已证实ss RNAi分子的活性(参见，例如，Matsui等人(2016)Mol.Ther.24:946-955)。然而，在一些实施方案中，本文中寡核苷酸为反义寡核苷酸(ASO)。反义寡核苷酸为具有核碱基序列的ss寡核苷酸，当以5′至3′方向书写时，所述序列包含特定核酸的靶向区段的反向互补且经适当修饰(例如，作为间隙体)以便诱导其靶RNA在细胞中的RNA酶H介导的裂解或(例如，作为混合聚体(mixmer))以便抑制靶mRNA在细胞中的翻译。本文中使用的ASO可以本领域中已知的任何适当方式修饰，包括，例如，如美国专利号9,567,587中所示(包括例如长度、核碱基(嘧啶、嘌呤)的糖部分和核碱基的杂环部分的更改)。另外，ASO已使用几十年以减少特定靶基因的表达(参见，例如，Bennett等人(2017)Annu.Rev.Pharmacol.57:81-105)。

iv.双链寡核苷酸

本发明提供用于靶向ANGPTL3 mRNA和抑制ANGPTL3表达(例如，经由RNAi途径)的ds寡核苷酸，所述ds寡核苷酸包含有义链(本文中还称作过客链)和反义链(本文中还称作引导链)。在一些实施方案中，所述有义链和反义链为分开链并且不共价连接。在一些实施方案中，所述有义链和反义链共价连接。

在一些实施方案中，所述有义链具有第一区(R1)和第二区(R2)，其中R2包含第一亚区(S1)、四环(L)或三环(triL)和第二亚区(S2)，其中L或triL位于S1与S2之间，并且其中S1和S2形成第二双链体(D2)。D2可具有各种长度。在一些实施方案中，D2长度为约1至6bp。在一些实施方案中，D2长度为2至6、3至6、4至6、5至6、1至5、2至5、3至5或4至5bp。在一些实施方案中，D2长度为1、2、3、4、5或6bp。在一些实施方案中，D2长度为6bp。

在一些实施方案中，有义链的R1和反义链形成第一双链体(D1)。在一些实施方案中，D1长度为至少约15(例如，至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、或至少21)个核苷酸。在一些实施方案中，D1长度在约12至30个核苷酸的范围内(例如，长度为12至30、12至27、15至22、18至22、18至25、18至27、18至30或21至30个核苷酸)。在一些实施方案中，D1长度为至少12个核苷酸(例如，长度为至少12、至少15、至少20、至少25或至少30个核苷酸)。在一些实施方案中，D1长度为12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸。在一些实施方案中，D1长度为20个核苷酸。在一些实施方案中，包含有义链和反义链的D1不跨越所述有义链和/或反义链的整个长度。在一些实施方案中，包含有义链和反义链的D1跨越所述有义链或反义链或二者的整个长度。在一些实施方案中，包含有义链和反义链的D1跨越所述有义链和所述反义链二者的整个长度。

在一些实施方案中，本文中ds寡核苷酸包含具有SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113和115中任一者的序列的有义链和包含选自SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114和116的互补序列的反义链，如表3中所排列。在一些实施方案中，所述有义链包含SEQ IDNO:99的序列并且所述反义链包含SEQ ID NO:100的序列。

在一些实施方案中，本文中ds寡核苷酸包含具有SEQ ID NO:19、25、49、71、73、75、79、99、101、103和113中任一者的序列的有义链和包含选自SEQ ID NO:20、26、50、72、74、76、80、100、102、104和114的互补序列的反义链，如表4中所排列。在一些实施方案中，所述有义链包含SEQ ID NO:99的序列和所述反义链包含SEQ ID NO:100的序列。

应了解，在一些实施方案中，序列表中所呈现的序列可在描述寡核苷酸或其他核酸的结构中提及。在此类实施方案中，当与指定序列相比时，实际寡核苷酸或其他核酸可具有一个或多个替代核苷酸(例如，DNA核苷酸的RNA对应物或RNA核苷酸的DNA对应物)和/或一个或多个经修饰的核苷酸和/或一个或多个经修饰的核苷酸间键联和/或一个或多个其他修饰，同时保留与指定序列基本上相同或相似互补性质。

在一些实施方案中，本文中ds寡核苷酸包含25个核苷酸有义链和27个核苷酸反义链，当通过切丁酶作用时，其导致并入成熟RISC的反义链。在一些实施方案中，所述ds寡核苷酸的有义链长于27个核苷酸(例如，28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个核苷酸)。在一些实施方案中，所述ds寡核苷酸的有义链长于25个核苷酸(例如，26、27、28、29或30个核苷酸)。

在一些实施方案中，本文中寡核苷酸具有一个5′端，当与其他5′端相比时，所述5′端在热力学上更不稳定。在一些实施方案中，提供不对称寡核苷酸，其包含有义链的3′端处的钝端和反义链的3′端处的3′-突出端。在一些实施方案中，所述反义链的3′-突出端长度为约1至8个核苷酸(例如，长度为1、2、3、4、5、6、7或8个核苷酸)。通常，RNAi的寡核苷酸在反义(引导)链的3′端上具有两个核苷酸突出端。然而，其他突出端也是可能的。在一些实施方案中，突出端为3′-突出端，其包含1与6个核苷酸之间的长度，任选地1至5、1至4、1至3、1至2、2至6、2至5、2至4、2至3、3至6、3至5、3至4、4至6、4至5、5至6个核苷酸，或1、2、3、4、5或6个核苷酸。然而，在一些实施方案中，所述突出端为5′-突出端，其包含1与6个核苷酸之间的长度，任选地1至5、1至4、1至3、1至2、2至6、2至5、2至4、2至3、3至6、3至5、3至4、4至6、4至5、5至6个核苷酸，或1、2、3、4、5或6个核苷酸。

在一些实施方案中，反义链的3′端上的两个末端核苷酸经修饰。在一些实施方案中，反义链的3′端上的两个末端核苷酸与靶标互补。在一些实施方案中，反义链的3′端上的两个末端核苷酸不与靶标互补。在一些实施方案中，有切口的四环结构中的寡核苷酸的各3′端上的两个末端核苷酸为GG。通常，寡核苷酸的各3′端上的两个末端GG核苷酸中的一者或二者不与靶标互补。

在一些实施方案中，在有义链与反义链之间存在一个或多个(例如，1、2、3、4或5个)错配。如果在有义链与反义链之间存在超过一个错配，则其可连续定位(例如，2、3或更多个成一行)，或在整个互补区散布。在一些实施方案中，有义链的3′端含有一个或多个错配。在一个实施方案中，两个错配在有义链的3′端处并入。在一些实施方案中，寡核苷酸的有义链的3′端处的片段的碱基错配或去稳定化提高合成双链体于RNAi中的效力，可能通过促进通过切丁酶加工。

a.反义链

在一些实施方案中，本文中所公开的用于靶向ANGPTL3的寡核苷酸包含反义链，所述反义链包含如SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114和116中任一者中所阐述的序列或由其组成。在一些实施方案中，寡核苷酸包含反义链，所述反义链包含如SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114和116中任一者中所阐述的序列的至少约12个(例如，至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个或至少23个)连续核苷酸或由其组成。

在一些实施方案中，ds寡核苷酸包含长度为至多约40个核苷酸(例如，长度为至多40、至多35、至多30、至多27、至多25、至多21、至多19、至多17、或至多12个核苷酸)的反义链。在一些实施方案中，寡核苷酸可具有长度为至少约12个核苷酸(例如，长度为至少12、至少15、至少19、至少21、至少22、至少25、至少27、至少30、至少35、或至少38个核苷酸)的反义链。在一些实施方案中，寡核苷酸可具有长度在约12至约40(例如，12至40、12至36、12至32、12至28、15至40、15至36、15至32、15至28、17至22、17至25、19至27、19至30、20至40、22至40、25至40、或32至40)个核苷酸范围内的反义链。在一些实施方案中，寡核苷酸可具有长度为12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个核苷酸的反义链。

在一些实施方案中，寡核苷酸的反义链可称作“引导链”。例如，如果反义链可与RNA诱导的沉默复合物(RISC)接合和与Argonaute蛋白(诸如Ago2)结合，或与一个或多个相似因子接合或结合，并且指导靶基因的沉默，则可将其称作引导链。在一些实施方案中，与引导链互补的有义链可称作“过客链”。

b.有义链

在一些实施方案中，本文中用于靶向ANGPTL3的寡核苷酸包含如SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113和115中任一者中所阐述的有义链序列或由其组成。在一些实施方案中，寡核苷酸具有有义链，所述有义链包含如SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113和115中任一者中所阐述的序列的至少约12个(例如，至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个或至少23个)连续核苷酸或由其组成。

在一些实施方案中，寡核苷酸包含长度为至多约40个核苷酸(例如，长度为至多40、至多36、至多30、至多27、至多25、至多21、至多19、至多17、或至多12个核苷酸)的有义链(或过客链)。在一些实施方案中，寡核苷酸可具有长度为至少约12个核苷酸(例如，长度为至少12、至少15、至少19、至少21、至少25、至少27、至少30、至少36、或至少38个核苷酸)的有义链。在一些实施方案中，寡核苷酸可具有长度在约12至约40(例如，12至40、12至36、12至32、12至28、15至40、15至36、15至32、15至28、17至21、17至25、19至27、19至30、20至40、22至40、25至40、或32至40)个核苷酸范围内的有义链。在一些实施方案中，寡核苷酸可具有长度为12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个核苷酸的有义链。

在一些实施方案中，有义链在其3′端处包含茎-环结构。在一些实施方案中，有义链在其5′端处包含茎-环结构。在一些实施方案中，茎为长度为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14bp的双链体。在一些实施方案中，茎-环提供分子保护免于降解(例如，酶促降解)且促进用于递送至靶细胞的靶向特征。例如，在一些实施方案中，环提供添加的核苷酸，在其上可进行修饰而不实质上影响寡核苷酸的基因表达抑制活性。在某些实施方案中，本文中寡核苷酸为其中有义链包含(例如，在其3′端处)阐述为：S1-L-S2的茎-环，其中S1与S2互补，并且其中L在S1与S2之间形成长度为至多约10个核苷酸(例如，长度为3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸)的环。图3描绘这种寡核苷酸的非限制性实例。

在一些实施方案中，茎-环的环(F)为四环(例如，在有切口的四环结构中)。四环可含有核糖核苷酸、脱氧核苷酸、经修饰的核苷酸以及它们的组合。通常，四环具有4至5个核苷酸。

v.寡核苷酸修饰

a.糖修饰

在一些实施方案中，经修饰的糖(本文中还称作糖类似物)包括经修饰的脱氧核糖或核糖部分，其中，例如，一个或多个修饰出现在所述糖的2′、3′、4′和/或5′碳位置处。在一些实施方案中，经修饰的糖还可包含非天然替代碳结构，诸如存在于锁核酸(“LNA”；参见，例如，Koshkin等人(1998)Tetrahedon 54:3607-3630)、解锁核酸(“UNA”；参见，例如，Snead等人(2013)Mol.Ther-Nucl.Acids 2:e103)和桥接核酸(“BNA”；参见，例如，Imanishi和Obika(2002)Chem Commun.(Camb)21:1653-1659)中的那些。

在一些实施方案中，糖的核苷酸修饰包括2′-修饰。在一些实施方案中，2′-修饰可为2′-O-炔丙基、2′-O-丙胺、2′-氨基、2′-乙基、2′-氟(2′-F)、2′-氨基乙基(EA)、2′-O-甲基(2′-OMe)、2′-O-甲氧基乙基(2′-MOE)、2′-O-[2-(甲基氨基)-2-氧代乙基](2′-O-NMA)或2′-脱氧-2′-氟-β-d-阿拉伯糖核酸(2′-FANA)。在一些实施方案中，所述修饰为2′-F、2′-OMe或2′-MOE。在一些实施方案中，糖的修饰包括糖环的修饰，其可包括糖环的一个或多个碳的修饰。例如，核苷酸的糖的修饰可包括将糖的2′-氧连接至糖的1′-碳或4′-碳，或经由亚乙基或亚甲基桥将2′-氧连接至1′-碳或4′-碳。在一些实施方案中，经修饰的核苷酸具有缺少2′-碳至3′-碳键的无环糖。在一些实施方案中，经修饰的核苷酸具有硫醇基，例如，在糖的4′位置中。

在一些实施方案中，本文中所述的寡核苷酸包含至少约1个经修饰的核苷酸(例如，至少1个、至少5个、至少10个、至少15个、至少20个、至少25个、至少30个、至少35个、至少40个、至少45个、至少50个、至少55个、至少60个或更多)。在一些实施方案中，所述寡核苷酸的有义链包含至少约1个经修饰的核苷酸(例如，至少1个、至少5个、至少10个、至少15个、至少20个、至少25个、至少30个、至少35个或更多)。在一些实施方案中，所述寡核苷酸的反义链包含至少约1个经修饰的核苷酸(例如，至少1个、至少5个、至少10个、至少15个、至少20个或更多)。

在一些实施方案中，寡核苷酸的有义链的所有核苷酸经修饰。在一些实施方案中，寡核苷酸的反义链的所有核苷酸经修饰。在一些实施方案中，寡核苷酸的所有核苷酸(即，有义链和反义链二者)经修饰。在一些实施方案中，所述经修饰的核苷酸包含2′-修饰(例如，2′-F或2′-OMe、2′-MOE和2′-脱氧-2′-氟-β-d-阿拉伯糖核酸)。在一些实施方案中，所述经修饰的核苷酸包含2′-修饰(例如，2′-F或2′-OMe)。

本公开提供具有不同修饰模式的寡核苷酸。在一些实施方案中，所述经修饰的寡核苷酸包含具有如表3和4(以及图3)中任一者中所阐述的修饰模式的有义链和具有如表3和4(以及图3)中任一者中所阐述的修饰模式的反义链。在一些实施方案中，对于这些寡核苷酸，有义链的位置8、9、10或11中的一者或多者经2′-F基团修饰。在其他实施方案中，对于这些寡核苷酸，有义链的位置1至7和12至20处的核苷酸各者的糖部分经2′-OMe修饰。

在一些实施方案中，本发明提供寡核苷酸，其为或包含选自表A中所列的那些的经修饰或未经修饰的有义链。在一些实施方案中，本发明提供寡核苷酸，其为或包含选自表A中所列的那些的经修饰或未经修饰的反义链。在一些实施方案中，本发明提供选自表A中所列的那些的经修饰或未经修饰的双链寡核苷酸。在一些实施方案中，本发明提供选自表A中所列的那些的有义链修饰模式。在一些实施方案中，本发明提供选自表A中所列的那些的反义链修饰模式。

在一些实施方案中，所述反义链具有在糖部分的2′-位置处经2′-F修饰的3个核苷酸。在一些实施方案中，反义链的位置2、5和14处的糖部分和任选地反义链的位置1、3、7和10处的核苷酸中的至多3者经2′-F修饰。在其他实施方案中，反义链的位置2、5和14处的糖部分在各位置处经2′-F修饰。在其他实施方案中，反义链的位置1、2、5和14处的糖部分在各位置处经2′-F修饰。在仍其他实施方案中，反义链的位置1、2、3、5、7和14处的糖部分在各位置处经2′-F修饰。在又一实施方案中，反义链的位置1、2、3、5、10和14处的糖部分在各位置处经2′-F修饰。在另一实施方案中，反义链的位置2、3、5、7、10和14处的糖部分在各位置处经2′-F修饰。

b.5′末端磷酸酯

在一些实施方案中，寡核苷酸的5′-末端磷酸酯基增强与Ago2的相互作用。然而，包含5′-磷酸酯基的寡核苷酸可易受经由磷酸酶或其他酶的降解，所述降解可限制其于体内生物可利用率。在一些实施方案中，寡核苷酸包含对这种降解具有抗性的5′磷酸酯的类似物。在一些实施方案中，磷酸酯类似物可为氧基甲基膦酸酯、乙烯基膦酸酯或丙二酰基膦酸酯。在某些实施方案中，寡核苷酸链的1′端连接至模拟天然5′-磷酸酯基的静电和空间性质的化学部分(“磷酸酯模拟物”)。

在一些实施方案中，寡核苷酸在糖的4′-碳位置处具有磷酸酯类似物(称作“4′-磷酸酯类似物”)。参见，例如，国际专利申请公布号WO 2018/045317。在一些实施方案中，本文中寡核苷酸在5′-端核苷酸处包含4′-磷酸酯类似物。在一些实施方案中，磷酸酯类似物为氧基甲基膦酸酯，其中所述氧基甲基的氧原子结合至糖部分(例如，在其4′-碳处)或其类似物。在其他实施方案中，4′-磷酸酯类似物为硫代甲基膦酸酯或氨基甲基膦酸酯，其中硫代甲基的硫原子或氨基甲基的氮原子结合至糖部分的4′-碳或其类似物。在某些实施方案中，4′-磷酸酯类似物为氧基甲基膦酸酯。在一些实施方案中，氧基甲基膦酸酯由式-O-CH₂-PO(OH)₂或-O-CH₂-PO(OR)₂表示，其中R独立地选自H、CH₃、烷基、CH₂CH₂CN、CH₂OCOC(CH₃)₃、CH₂OCH₂CH₂Si(CH₃)₃或保护基。在某些实施方案中，所述烷基为CH₂CH₃。更通常地，R独立地选自H、CH₃或CH₂CH₃。

c.经修饰的核苷酸间键联

在一些实施方案中，寡核苷酸可包含经修饰的核苷酸间键联。在一些实施方案中，磷酸酯修饰或取代可导致包含至少约1个(例如，至少1个、至少2个、至少3个或至少5个)经修饰的核苷酸间键联的寡核苷酸。在一些实施方案中，本文中所公开的寡核苷酸中的任一者包含约1至约10(例如，1至10、2至8、4至6、3至10、5至10、1至5、1至3、或1至2)个经修饰的核苷酸间键联。在一些实施方案中，本文中所公开的寡核苷酸中的任一者包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个经修饰的核苷酸间键联。

经修饰的核苷酸间键联可为二硫代磷酸酯键联、硫代磷酸酯键联、磷酸三酯键联、硫代烷基磷酸酯键联、硫代烷基磷酸三酯键联、亚磷酰胺键联、膦酸酯键联或硼烷磷酸酯键联。在一些实施方案中，如本文中所公开的寡核苷酸中的任一者的至少一个经修饰的核苷酸间键联为硫代磷酸酯键联。

在一些实施方案中，本文中所述的寡核苷酸在有义链的位置1和2，反义链的位置1和2，反义链的位置2和3，反义链的位置3和4，反义链的位置20和21，和反义链的位置21和22中的一者或多者之间具有硫代磷酸酯键联。在一些实施方案中，本文中所述的寡核苷酸在有义链的位置1和2，反义链的位置1和2，反义链的位置2和3，反义链的位置20和21，和反义链的位置21和22各者之间具有硫代磷酸酯键联。

d.碱基修饰

在一些实施方案中，本文中寡核苷酸具有一个或多个经修饰的核碱基。在一些实施方案中，经修饰的核碱基(本文中还称作碱基类似物)在核苷酸糖部分的1′位置处连接。在某些实施方案中，经修饰的核碱基为含氮碱基。在某些实施方案中，经修饰的核碱基不含氮原子。参见，例如，美国专利申请公布号2008/0274462。在一些实施方案中，经修饰的核苷酸包含通用碱基。然而，在某些实施方案中，经修饰的核苷酸不含核碱基(无碱基)。

在一些实施方案中，通用碱基为位于经修饰的核苷酸的核苷酸糖部分的1′位置或核苷酸糖部分取代中的等效位置处的杂环部分，当存在于双链体中时，其可与超过一种碱基相反定位而不实质上改变双链体的结构。在一些实施方案中，与同靶核酸完全互补的参考单链核酸(例如，寡核苷酸)相比，含有通用碱基的单链核酸与靶核酸形成双链体，所述双链体具有较与互补核酸形成的双链体更低T_m。然而，在一些实施方案中，当与其中通用碱基经碱基置换以产生单个错配的参考单链核酸相比时，含有通用碱基的单链核酸与靶核酸形成双链体，所述双链体具有比与包含错配碱基的核酸形成的双链体更高的T_m。

通用结合核苷酸的非限制性实例包括但不限于肌酐、1-β-D-呋喃核糖基-5-硝基吲哚和/或1-β-D-呋喃核糖基-3-硝基吡咯(参见，美国专利申请公布号2007/0254362；VanAerschot等人(1995)Nucleic Acids Res.23:4363-4370；Loakes等人(1995)NucleicAcids Res.23:2361-2366；和Loakes和Brown(1994)Nucleic Acids Res.22:4039-4043)。

e.可逆修饰

虽然可进行某些修饰以在到达靶细胞之前保护寡核苷酸免于体内环境，但是一旦其到达靶细胞的细胞溶质，所述修饰可降低寡核苷酸的效力或活性。可进行可逆修饰使得分子保留细胞外部的所需性质，然后在进入细胞的细胞溶质环境后将其移除。可逆修饰可例如通过细胞内酶的作用或通过细胞内部的化学条件(例如，通过通过细胞内谷胱甘肽还原)移除。

在一些实施方案中，经可逆修饰的核苷酸包含谷胱甘肽敏感部分。通常，核酸分子已经环状二硫键部分化学修饰以掩蔽由核苷酸间二磷酸酯键联创建的负电荷并改善细胞摄取和核酸酶抗性。参见美国专利申请公布号2011/0294869，国际专利申请公布号WO2014/088920和WO 2015/188197，和Meade等人(2014)Nat.Biotechnol.32:1256-1263。核苷酸间二磷酸酯键联的这种可逆修饰经设计以通过细胞溶质(例如，谷胱甘肽)的还原环境细胞内裂解。更早实例包括将磷酸三酯修饰中和，所述修饰据报告在细胞内可裂解(参见，Dellinger等人(2003)J.Am.Chem.Soc.125:940-950)。

在一些实施方案中，这种可逆修饰允许在体内施用(例如，通过血液和/或细胞的溶酶体/核内体区室运送)期间保护，其中所述寡核苷酸将暴露于核酸酶和其他苛刻环境条件(例如，pH)。当释放至细胞的细胞溶质时，其中谷胱甘肽的水平与细胞外空间相比更高，修饰逆转，并且结果为经裂解的寡核苷酸。使用可逆谷胱甘肽敏感部分，当与使用不可逆化学修饰可用的选项相比时，可将空间上更大化学基团引入目标寡核苷酸。此是因为这些更大化学基团将在细胞溶质中移除并且因此，应不干扰细胞的细胞溶质内部的寡核苷酸的生物活性。因此，这些更大化学基团可经工程改造以对核苷酸或寡核苷酸赋予各种优点，诸如核酸酶抗性、亲脂性、电荷、热稳定性、特异性和降低的免疫原性。在一些实施方案中，谷胱甘肽敏感部分的结构可经工程改造以修改其释放的动力学。

在一些实施方案中，将谷胱甘肽敏感部分连接至核苷酸的糖。在一些实施方案中，将谷胱甘肽敏感部分连接至经修饰的核苷酸的糖的2′-碳。在一些实施方案中，所述谷胱甘肽敏感部分位于糖的5′-碳处，特别是当经修饰的核苷酸为寡核苷酸的5′-端核苷酸时。在一些实施方案中，所述谷胱甘肽敏感部分位于糖的3′-碳处，特别是当经修饰的核苷酸为寡核苷酸的3′-端核苷酸时。在一些实施方案中，所述谷胱甘肽敏感部分包含磺酰基。参见，例如，2016年8月23日提交的标题为Compositions Comprising Reversibly ModifiedOligonucleotides and Uses Thereof的美国临时专利申请号62/378,635。

vi.靶向配体

在一些实施方案中，期望将本公开的寡核苷酸靶向一个或多个细胞或一个或多个器官。这种策略可帮助避免其他器官中的非所需效应或避免至将不收益于所述寡核苷酸的细胞、组织或器官的寡核苷酸的不当损失。因此，在一些实施方案中，本文中所公开的寡核苷酸经修饰以促进特定组织、细胞或器官的靶向和/或递送(例如，促进寡核苷酸递送至肝)。在某些实施方案中，本文中所公开的寡核苷酸经修饰以促进寡核苷酸递送至肝的肝细胞。在一些实施方案中，寡核苷酸包含与一个或多个靶向配体缀合的至少一个核苷酸(例如，1、2、3、4、5、6或更多个核苷酸)。

在一些实施方案中，所述靶向配体包含碳水化物、氨基糖、胆固醇、肽、多肽、蛋白质或蛋白质的部分(例如，抗体或抗体片段)或脂质。在一些实施方案中，所述靶向配体为适体。例如，靶向配体可为用于靶向肿瘤脉管系统或胶质瘤细胞的RGD肽，靶向肿瘤脉管系统或基质瘤的CREKA肽，靶向在CNS脉管系统上表达的靶转铁蛋白受体的转移乳铁蛋白或适体、或靶向胶质瘤细胞上的EGFR的抗EGFR抗体。在某些实施方案中，所述靶向配体为一个或多个GalNAc部分。

在一些实施方案中，寡核苷酸的一个或多个(例如，1、2、3、4、5或6个)核苷酸各自与单独靶向配体缀合。在一些实施方案中，寡核苷酸的2至4个核苷酸各自与单独靶向配体缀合。在一些实施方案中，靶向配体与有义链或反义链的任一末端处的2至4个核苷酸缀合(例如，靶向配体与有义链或反义链的5′或3′端上的2至4个核苷酸突出端或延伸缀合)，使得靶向配体类似于牙刷的刷毛并且寡核苷酸类似于牙刷。例如，寡核苷酸可在有义链的5′或3′端处包含茎-环并且所述茎的环的1、2、3或4个核苷酸可与靶向配体单独缀合。在一些实施方案中，由本公开提供的寡核苷酸(例如，ds寡核苷酸)在有义链的3′端处包含茎-环，其中所述茎-环的环包括三环或四环，并且其中包含三环或四环的3或4个核苷酸各自与靶向配体单独缀合。

GalNAc为ASGPR的高亲和力配体，其主要在肝细胞的窦状表面上表达并且在结合、内化和随后清除含有末端半乳糖或GalNAc残基的循环糖蛋白(无唾液酸糖蛋白)中起着重要作用。GalNAc部分与本公开的寡核苷酸的缀合(间接或直接)可用于将这些寡核苷酸靶向细胞上表达的ASGPR。在一些实施方案中，本公开的寡核苷酸与至少一个或多个GalNAc部分缀合，其中所述GalNAc部分将寡核苷酸靶向人肝细胞上表达的ASGPR。在一些实施方案中，所述GalNAc部分将寡核苷酸靶向肝。

在一些实施方案中，本公开的寡核苷酸与单价GalNAc直接或间接缀合。在一些实施方案中，所述寡核苷酸与超过一个单价GalNAc直接或间接缀合(即，与2、3或4个单价GalNAc部分缀合，并且通常与3或4个单价GalNAc部分缀合)。在一些实施方案中，寡核苷酸与一个或多个二价GalNAc、三价GalNAc或四价GalNAc部分缀合。

在一些实施方案中，寡核苷酸的1或多个(例如，1、2、3、4、5或6个)核苷酸各自与GalNAc部分缀合。在一些实施方案中，四环的2至4个核苷酸各自与单独GalNAc缀合。在一些实施方案中，三环的1至3个核苷酸各自与单独GalNAc缀合。在一些实施方案中，靶向配体与有义链或反义链的任一端处的2至4个核苷酸缀合(例如，配体与有义链或反义链的5′或3′端上的2至4个核苷酸突出端或延伸缀合)，使得GalNAc部分类似于牙刷的刷毛并且寡核苷酸类似于牙刷。在一些实施方案中，GalNAc部分与有义链的核苷酸缀合。例如，4个GalNAc部分可与有义链的四环中的核苷酸缀合，其中各GalNAc部分与1个核苷酸缀合。

在一些实施方案中，本文中寡核苷酸包含连接至鸟嘌呤核苷酸的单价GalNAc，称作[ademG-GalNAc]或2′-氨基二乙氧基甲醇-鸟嘌呤-GalNAc，如下所述：

在一些实施方案中，本文中寡核苷酸包含连接至腺嘌呤核苷酸的单价GalNAc，称作[ademA-GalNAc]或2′-氨基二乙氧基甲醇-腺嘌呤-GalNAc，如下所述：

以下针对包含5′至3′核苷酸序列GAAA的环显示这种缀合的实例(L＝接头，X＝杂原子)，显示茎连接点。这种环可例如在表5中所列的有义链的位置27至30处存在并且如图3中所示。在所述化学式中，

用于描述寡核苷酸链的连接点。

适当方法或化学(例如，点击化学)可用于连接靶向配体与核苷酸。在一些实施方案中，靶向配体使用点击接头与核苷酸缀合。在一些实施方案中，基于缩醛的接头用于将靶向配体与本文中所述寡核苷酸中的任一者的核苷酸缀合。基于缩醛的接头公开于例如国际专利申请公布号WO 2016/100401中。在一些实施方案中，所述接头为不稳定接头。然而，在其他实施方案中，所述接头是稳定的。以下针对包含5′至3′核苷酸GAAA的环显示实例，其中GalNAc部分使用缩醛接头连接至环的核苷酸。这种环可例如在表5中所列的有义链中的任一者的位置27至30处存在并且如图3中所示。在所述化学式中，

为寡核苷酸链的连接点。

如所提及，各种适当方法或化学合成技术(例如，点击化学)可用于连接靶向配体与核苷酸。在一些实施方案中，靶向配体使用点击接头与核苷酸缀合。在一些实施方案中，基于缩醛的接头用于将靶向配体与本文中所述寡核苷酸中的任一者的核苷酸缀合。基于缩醛的接头公开于例如国际专利申请公布号WO 2016/100401中。在一些实施方案中，所述接头为不稳定接头。然而，在其他实施方案中，所述接头为稳定接头。

在一些实施方案中，在靶向配体(例如，GalNAc部分)与ds寡核苷酸之间提供双链体延伸(例如，长度为至多3、4、5或6bp)。在一些实施方案中，本文中寡核苷酸不具有与其缀合的GalNAc。

III.制剂

已开发各种制剂以促进寡核苷酸使用。例如，可使用制剂将寡核苷酸递送至受试者或细胞环境，所述制剂最小化降解，促进递送和/或摄取，或对制剂中的寡核苷酸提供另一有益性质。在一些实施方案中，寡核苷酸在缓冲溶液(诸如磷酸盐缓冲盐水溶液、脂质体、胶束结构和衣壳)中配制。

寡核苷酸与阳离子脂质的制剂可用于促进寡核苷酸转染至细胞。例如，可使用阳离子脂质(诸如脂质体(lipofectin))、阳离子甘油衍生物和聚阳离子分子(例如，聚赖氨酸)。适当脂质包括Oligofectamine、Lipofectamine(Life Technologies)、NC388(Ribozyme Pharmaceuticals,Inc.,Boulder,Colo.)或FuGene 6(Roche)，其全部可根据制造商的说明使用。

因此，在一些实施方案中，制剂包含脂质纳米粒子。在一些实施方案中，赋形剂包括脂质体、脂质、脂质复合物、微球、微粒、纳米球或纳米粒子，或可以其他方式配制用于向有需要的受试者的细胞、组织、器官或身体施用(参见，例如，Remington:THE SCIENCE ANDPRACTICE OF PHARMACY,第22版,Pharmaceutical Press,2013)。

在一些实施方案中，本文中的制剂包含赋形剂。在一些实施方案中，赋形剂赋予组合物提高的稳定性、改善的吸收、提高的溶解度和/或活性成分的治疗增强。在一些实施方案中，赋形剂为缓冲剂(例如，柠檬酸钠、磷酸钠、tris碱或氢氧化钠)或媒介物(例如，缓冲溶液、矿脂、二甲亚砜或矿物油)。在一些实施方案中，寡核苷酸经冻干以延长其货架期且然后在使用(例如，向受试者施用)之前制成溶液。因此，包含本文中所述寡核苷酸中的任一者的组合物中的赋形剂可为冻干保护剂(例如，甘露醇、乳糖、聚乙二醇或聚乙烯吡咯烷酮)或坍塌温度改性剂(例如，葡聚糖、Ficoll^TM或明胶)。

在一些实施方案中，药物组合物经配制以与其意图施用途径相容。施用途径的实例包括肠胃外(例如，静脉内、肌肉内、腹膜内、皮内、皮下)、口服(例如，吸入)、经皮(例如，局部)、经粘膜和直肠施用。

适用于注射用的药物组合物包括无菌水溶液(在水可溶性的情况下)或分散液和用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。针对静脉内施用，适当载体包括生理盐水、抑菌水、Cremophor EL^TM(BASF,Parsippany,N.J.)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。载体可为溶剂或含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇和类似者)及其适当混合物的分散介质。在许多情况下，其将优选地在组合物中包含等渗剂，例如，糖、多元醇(诸如甘露醇、山梨醇)、氯化钠。无菌可注射溶液可通过将所需量的寡核苷酸并入根据需要具有以上列举的成分中的一者或组合的所选溶剂中，接着无菌过滤来制备。

在一些实施方案中，组合物可含有至少约0.1％的治疗剂或更多，虽然活性成分的百分比可在总组合物的重量或体积的约1％至约80％或更多之间。诸如溶解度、生物可利用率、生物半衰期、施用途径、产品货架期，以及其他药理学考虑的因素将由制备此类药物制剂的本领域技术人员考虑，并且因而，各种剂量和治疗方案可以是所需的。

虽然若干实施方案涉及本文中寡核苷酸中的任一者的肝靶向的递送，但还考虑靶向其他组织。

IV.使用方法

i.减少细胞中的ANGPTL3表达

出于减少ANGPTL3表达的目的，本公开提供使有效量的本文中寡核苷酸中的任一者接触或递送至细胞或细胞群体的方法。所述方法可包括本文中所述的步骤，并且这些可以但不一定以如所述的顺序进行。然而，其他顺序还可设想。此外，单独或多个步骤可在时间上平行和/或重叠和/或单独或在多个重复步骤中进行。此外，所述方法可包括另外未指定步骤。

本文中方法可用于任何适当细胞类型。在一些实施方案中，细胞为表达mRNA的任何细胞(例如，肝细胞、巨噬细胞、源自单核细胞的细胞、前列腺癌细胞、脑细胞、内分泌组织、骨髓、淋巴结、肺、胆囊、肝、十二指肠、小肠、胰腺、肾、胃肠道、膀胱、脂肪和软组织和皮肤)。在一些实施方案中，所述细胞为获自受试者的原代细胞。在一些实施方案中，所述原代细胞经历有限数目的传代使得细胞实质上维持天然表达型性质。在一些实施方案中，递送寡核苷酸的细胞在离体或体外(即，可递送至培养中的细胞或其中细胞驻留的生物体)。

在一些实施方案中，本文中寡核苷酸使用适当核酸递送方法递送，所述方法包括但不限于注射含有寡核苷酸的溶液，通过由寡核苷酸覆盖的粒子轰击，将细胞或细胞群体暴露于含寡核苷酸的溶液中，或在存在寡核苷酸下将细胞膜电穿孔。可使用用于递送寡核苷酸至细胞的其他适当方法，诸如脂质介导的载体转运、化学介导的转运和阳离子脂质体转染(诸如磷酸钙)和其他。

在一些实施方案中，ANGPTL3表达的减少可通过评价与ANGPTL3表达相关的细胞或细胞群体的一种或多种性质或特征的适当测定或技术(例如，使用ANGPTL3表达生物标志物)或通过评价直接指示ANGPTL3表达的分子(例如，ANGPTL3 mRNA或ANGPTL3蛋白质)的测定或技术测定。在一些实施方案中，本文中寡核苷酸减少ANGPTL3表达的程度通过比较与所述寡核苷酸接触的细胞或细胞群体中的ANGPTL3表达与适当对照(例如，不与所述寡核苷酸接触或与对照寡核苷酸接触的适当细胞或细胞群体)来评价。在一些实施方案中，在递送RNAi分子后至蛋白质的mRNA表达的适当对照水平可为预先确定的水平或值，使得对照水平不必每次测量。所述预先确定的水平或值可采用各种形式。在一些实施方案中，预先确定的水平或值可为单一截止值，诸如中值或平均值。

在一些实施方案中，施用本文中寡核苷酸导致细胞或细胞群体中的ANGPTL3表达的减少。在一些实施方案中，当与mRNA的适当对照水平相比时，ANGPTL3表达的减少为约1％或更低、约5％或更低、约10％或更低、约15％或更低、约20％或更低、约25％或更低、约30％或更低、约35％或更低、约40％或更低、约45％或更低、约50％或更低、约55％或更低、约60％或更低、约70％或更低、约80％或更低、或约90％或更低。适当对照水平可为尚未与本文中寡核苷酸接触的细胞或细胞群体中的mRNA表达和/或蛋白质翻译的水平。在一些实施方案中，在有限时期后评估根据本文中方法寡核苷酸递送至细胞的效应。例如，可在寡核苷酸引入细胞后至少约8小时、约12小时、约18小时或约24小时；或至少约1、2、3、4、5、6、7天或甚至至多14天在细胞中分析mRNA水平。

在一些实施方案中，寡核苷酸以转基因的形式递送，所述转基因经工程改造以在胞中表达所述寡核苷酸或包含所述寡核苷酸的链(例如，其有义链和反义链)。在一些实施方案中，寡核苷酸使用经工程改造以表达本文中所公开的任何寡核苷酸的转基因递送。转基因可使用病毒载体(例如，腺病毒、逆转录病毒、疫苗病毒、痘病毒、腺相关病毒或单纯疱疹病毒)或非病毒载体(例如，质粒或合成mRNA)递送。在一些实施方案中，转基因可直接注射至受试者。

ii.医疗用途

本公开还提供用于或适用于治疗受试者(例如，患有与ANGPTL3表达相关的疾病、病症或疾患的人)的寡核苷酸，所述受试者将从减少ANGPTL3表达受益。在一些方面中，本公开提供用于或适用于治疗患有与ANGPTL3表达相关的疾病、病症或疾患的受试者的寡核苷酸。本公开还提供用于或适用于制造用于治疗与ANGPTL3表达相关的疾病、病症或疾患的药剂或药物组合物的寡核苷酸。在一些实施方案中，所述寡核苷酸用于或适用于靶向ANGPTL3mRNA并减少ANGPTL3表达(例如，经由RNAi途径)。在一些实施方案中，所述寡核苷酸用于或适用于靶向ANGPTL3 mRNA并减少ANGPTL3mRNA、ANGPTL3蛋白质和/或ANGPTL3活性的量或水平。

此外，以下方法可包括选择患有与ANGPTL3表达相关的疾病、病症或疾患或易患所述疾病、病症或疾患的受试者。在一些实例中，所述方法可包括选择具有ANGPTL3表达的标志物，诸如升高的TG或胆固醇(或甚至改变的LPL和/或EL活性)或易感于其的受试者。

同样，并且如下详述，所述方法还可包括诸如以下的步骤：测量或获得ANGPTL3表达的标志物的基线值，并且然后比较这种获得的值与一个或多个其他基线值或在施用寡核苷酸后获得的值以评估治疗有效性。

iii.治疗方法

本公开还提供利用本文中寡核苷酸治疗患有、疑似患有疾病、病症或疾患或有发展疾病、病症或疾患的风险的受试者的方法。在一些方面中，本公开提供使用本文中寡核苷酸治疗或减弱与ANGPTL3表达相关的疾病、病症或疾患的发作或进展的方法。在其他方面中，本发明提供使用本文中寡核苷酸在患有与ANGPTL3表达相关的疾病、病症或疾患的受试者中实现一种或多种治疗益处的方法。在本文中方法的一些实施方案中，通过施用治疗有效量的本文中寡核苷酸中的任一者或多者来治疗受试者。在一些实施方案中，治疗包括减少ANGPTL3表达。在一些实施方案中，所述受试者在治疗上进行治疗。在一些实施方案中，所述受试者在预防上治疗。

在本文中方法的一些实施方案中，向患有与ANGPTL3表达相关的疾病、病症或疾患的受试者施用本文中寡核苷酸或包含寡核苷酸的药物组合物使得ANGPTL3表达在受试者中减少，从而治疗受试者。在一些实施方案中，ANGPTL3 mRNA的量或水平在受试者中减少。在一些实施方案中，ANGPTL3蛋白质的量或水平在受试者中减少。在一些实施方案中，ANGPTL3活性的量或水平在受试者中减少。在一些实施方案中，甘油三酯(TG)(例如，一种或多种TG或总TG)的量或水平在受试者中减少。在一些实施方案中，胆固醇(例如，总胆固醇、LDL胆固醇和/或HDL胆固醇)的量或水平在受试者中减少。在一些实施方案中，低密度脂蛋白(LDL)胆固醇的量或水平在受试者中减少。在一些实施方案中，LPL的量或活性在受试者中改变。在一些实施方案中，EL的量或活性在受试者中改变。在一些实施方案中，下列的任何组合在受试者中减少或改变：ANGPTL3表达、ANGPTL3mRNA的量或水平、ANGPTL3蛋白质的量或水平、ANGPTL3活性的量或水平、TG的量或水平、胆固醇的量或水平和/或LPL和/或EL的量或活性。

在本文中方法的一些实施方案中，向患有与ANGPTL3相关的疾病、病症或疾患的受试者施用本文中寡核苷酸或包含寡核苷酸的药物组合物使得当与在施用寡核苷酸或药物组合物之前的ANGPTL3表达相比时，ANGPTL3表达在受试者中减少至少约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约99％或大于99％。在一些实施方案中，当与未接受寡核苷酸或药物组合物或接受对照寡核苷酸、药物组合物或治疗的受试者(例如，参考或对照受试者)中的ANGPTL3表达相比时，ANGPTL3表达在受试者中减少至少约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约99％或大于99％。

在本文中方法的一些实施方案中，向患有与ANGPTL3表达相关的疾病、病症或疾患的受试者施用本文中寡核苷酸或包含寡核苷酸的药物组合物使得当与在施用寡核苷酸或药物组合物之前的ANGPTL3mRNA的量或水平相比时，ANGPTL3 mRNA的量或水平在受试者中减少至少约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约99％或大于99％。在一些实施方案中，当与未接受寡核苷酸或药物组合物或接受对照寡核苷酸、药物组合物或治疗的受试者(例如，参考或对照受试者)中的ANGPTL3 mRNA的量或水平相比时，ANGPTL3 mRNA的量或水平在受试者中减少至少约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约99％或大于99％。

在本文中方法的一些实施方案中，向患有与ANGPTL3表达相关的疾病、病症或疾患的受试者施用本文中寡核苷酸或包含寡核苷酸的药物组合物使得当与在施用寡核苷酸或药物组合物之前的ANGPTL3蛋白质的量或水平相比时，ANGPTL3蛋白质的量或水平在受试者中减少至少约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约99％或大于99％。在一些实施方案中，当与未接受寡核苷酸或药物组合物或接受对照寡核苷酸、药物组合物或治疗的受试者(例如，参考或对照受试者)中的ANGPTL3蛋白质的量或水平相比时，ANGPTL3蛋白质的量或水平在受试者中减少至少约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约99％或大于99％。

在本文中方法的一些实施方案中，向患有与ANGPTL3相关的疾病、病症或疾患的受试者施用本文中寡核苷酸或包含寡核苷酸的药物组合物使得当与在施用寡核苷酸或药物组合物之前的ANGPTL3活性的量或水平相比时，ANGPTL3活性/表达的量或水平在受试者中减少至少约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约99％或大于99％。在一些实施方案中，当与未接受寡核苷酸或药物组合物或接受对照寡核苷酸、药物组合物或治疗的受试者(例如，参考或对照受试者)中的ANGPTL3活性的量或水平相比时，ANGPTL3活性的量或水平在受试者中减少至少约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约99％或大于99％。

在本文中方法的一些实施方案中，向患有与ANGPTL3表达相关的疾病、病症或疾患的受试者施用本文中寡核苷酸或包含寡核苷酸的药物组合物使得当与在施用寡核苷酸或药物组合物之前的TG的量或水平相比时，TG(例如，一种或多种TG或总TG)的量或水平在受试者中减少至少约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约99％或大于99％。在一些实施方案中，当与未接受寡核苷酸或药物组合物或接受对照寡核苷酸、药物组合物或治疗的受试者(例如，参考或对照受试者)中的TG的量或水平相比时，TG的量或水平在受试者中减少至少约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约99％或大于99％。

一般而言，人受试者的正常或所需TG范围为<150mg/dL的血液，其中认为<100mg/dL理想。在一些实施方案中，用于治疗所选或所治疗的受试者被鉴定或测定为具有≥150mg/dL的TG的量或水平。在一些实施方案中，用于治疗所选或所治疗的受试者被鉴定或测定为具有150mg/dL至199mg/dL的范围的TG的量或水平，认为其为高TG水平的边界线。在一些实施方案中，用于治疗所选或所治疗的受试者被鉴定或测定为具有200mg/dL至499mg/dL的范围的TG的量或水平，认为其为高TG水平。在一些实施方案中，用于治疗所选或所治疗的受试者被鉴定或测定为具有500mg/dL或更高(即，≥500mg/dL)的范围的TG的量或水平，认为其为极高TG水平。在一些实施方案中，用于治疗所选或所治疗的受试者被鉴定或测定为具有≥150mg/dL、≥200mg/dL或≥500mg/dL的TG的量或水平。在一些实施方案中，用于治疗所选或所治疗的受试者被鉴定或测定为具有200mg/dL至499mg/dL，或500mg/dL或更高的TG的量或水平。在一些实施方案中，用于治疗所选或所治疗的受试者被鉴定或测定为具有≥200mg/dL的TG的量或水平。

在本文中方法的一些实施方案中，向患有与ANGPTL3表达相关的疾病、病症或疾患的受试者施用本文中寡核苷酸或包含寡核苷酸的药物组合物使得当与在施用寡核苷酸或药物组合物之前的胆固醇的量或水平相比时，胆固醇(例如，总胆固醇、LDL胆固醇和/或HDL胆固醇)的量或水平在受试者中减少至少约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约99％或大于99％。在一些实施方案中，当与未接受寡核苷酸或药物组合物或接受对照寡核苷酸、药物组合物或治疗的受试者(例如，参考或对照受试者)中的胆固醇的量或水平相比时，胆固醇的量或水平在受试者中减少至少约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约99％或大于99％。

一般而言，成年人患者的正常或所需胆固醇范围(总胆固醇)为<200mg/dL的血液。在一些实施方案中，用于治疗所选或所治疗的患者被鉴定或测定为具有≥200mg/dL的胆固醇的量或水平。在一些实施方案中，用于治疗所选或所治疗的患者被鉴定或测定为具有200mg/dL至239mg/dL的范围的胆固醇的量或水平，认为其为高胆固醇含量的边界线。在一些实施方案中，用于治疗所选或所治疗的患者被鉴定或测定为具有240mg/dL和更高(即，≥240mg/dL)的范围的胆固醇的量或水平，认为其为高胆固醇含量。在一些实施方案中，用于治疗所选或所治疗的患者被鉴定或测定为具有200mg/dL至239mg/dL，或240mg/dL或更高的胆固醇的量或水平。在一些实施方案中，用于治疗所选或所治疗的患者被鉴定或测定为具有≥200mg/dL或≥240mg/dL或更高的胆固醇的量或水平。

在本文中方法的一些实施方案中，向患有与ANGPTL3表达相关的疾病、病症或疾患的受试者施用本文中寡核苷酸或包含寡核苷酸的药物组合物使得当与在施用寡核苷酸或药物组合物之前的LDL胆固醇的量或水平相比时，LDL胆固醇的量或水平在受试者中减少至少约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约99％或大于99％。在一些实施方案中，当与未接受寡核苷酸或药物组合物或接受对照寡核苷酸、药物组合物或治疗的受试者(例如，参考或对照受试者)中的LDL胆固醇的量或水平相比时，LDL胆固醇的量或水平在受试者中减少至少约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约99％或大于99％。

一般而言，成年人受试者的正常或所需LDL胆固醇范围为<100mg/dL的血液。在一些实施方案中，用于治疗所选或所治疗的受试者被鉴定或测定为具有≥100mg/dL的胆固醇的量或水平。在一些实施方案中，用于治疗所选或所治疗的受试者被鉴定或测定为具有100mg/dL至129mg/dL的范围的LDL胆固醇的量或水平，认为其在最佳以上。在一些实施方案中，用于治疗所选或所治疗的受试者被鉴定或测定为具有130mg/dL至159mg/dL的范围的LDL胆固醇的量或水平，认为其为高水平的边界线。在一些实施方案中，用于治疗所选或所治疗的受试者被鉴定或测定为具有160mg/dL至189mg/dL的范围的LDL胆固醇的量或水平，认为其为高LDL胆固醇含量。在一些实施方案中，用于治疗所选或所治疗的受试者被鉴定或测定为具有190mg/dL和更高(即，≥190mg/dL)的范围的LDL胆固醇的量或水平，认为其为极高LDL胆固醇含量。在一些实施方案中，用于治疗所选或所治疗的受试者被鉴定或测定为具有≥100mg/dL、≥130mg/dL、≥160mg/dL或≥190mg/dL或更高，优选地≥160mg/dL或≥190mg/dL或更高的LDL胆固醇的量或水平。在一些实施方案中，用于治疗所选或所治疗的受试者被鉴定或测定为具有100mg/dL至129mg/dL、130mg/dL至159mg/dL、160mg/dL至189mg/dL或190mg/dL和更高的LDL胆固醇的量或水平。

用于测定受试者或来自受试者的样品中的ANGPTL3表达、ANGPTL3 mRNA、ANGPTL3蛋白质、ANGPTL3活性、TG和/或LDL胆固醇、LPL和/或EL量或活性的量或水平的方法是本领域中已知的。另外，本文中阐述的实施例说明用于测定ANGPTL3表达的方法。

在一些实施方案中，ANGPTL3表达、ANGPTL3 mRNA、ANGPTL3蛋白质、ANGPTL3活性、TG、LDL胆固醇、LPL蛋白质、LPL活性、EL蛋白质、EL活性或它们的任何组合的量或水平在细胞(例如，肝细胞)、细胞群体或组(例如，类器官)、器官(例如，肝)、血液或其片段(例如，血浆)、组织(例如，肝组织)、样品(例如，肝活组织检查样品)或从受试者获得或分离的任何其他适当生物材料中减少。在一些实施方案中，ANGPTL3表达、ANGPTL3 mRNA、ANGPTL3蛋白质、ANGPTL3活性、TG、LDL胆固醇、LPL蛋白质、LPL活性、EL蛋白质、EL活性或它们的任何组合的量或水平在超过一种细胞(例如，肝细胞和一种或多种其他类型的细胞)、超过一个细胞组、超过一个器官(例如，肝和一个或多个其他器官)、超过一个血液片段(例如，血浆和一个或多个其他血液片段)、超过一种组织(例如，肝组织和一种或多种其他类型的组织)、分离的超过一种样品(例如，肝活组织检查样品和一种或多种其他类型的活组织检查样品)或其他中减少。

与ANGPTL3表达相关的疾病、病症或疾患的实例包括但不限于高甘油三酯血症、肥胖症、高脂血症、异常脂质和/或胆固醇代谢、动脉粥样硬化、II型糖尿病(T2D)、心血管疾病、慢性肾病、冠状动脉疾病、NASH、NAFLD、纯合子和杂合子家族性高胆固醇血症、他汀耐药性高胆固醇血症和其他ANGPTL3相关的代谢相关病症和疾病。本文中特别关注为心血管疾病、T2D、高甘油三酯血症、NASH、肥胖症或其组合。

因为其高特异性，本文中寡核苷酸特异性靶向患病细胞和组织的靶基因的mRNA。在预防疾病中，靶基因可为用于开始或维持疾病所需或已经鉴定为与感染疾病的更高风险相关联者。在治疗疾病中，可使寡核苷酸与展示疾病的细胞或组织接触。例如，可使与与ANGPTL3表达相关的病症或疾患相关的野生型(即，天然)或突变型基因的所有或部分实质上相同的寡核苷酸与目标细胞或组织类型(诸如肝细胞或其他活细胞)接触或引入所述细胞或组织类型中。

在一些实施方案中，靶基因可为来自任何哺乳动物(诸如人)的靶基因。任何基因可根据本文中所述方法沉默。

本文中所述方法通常涉及向受试者施用有效量的寡核苷酸，即，能够产生所需治疗结果的量。治疗上可接受的量可为可治疗上治疗疾病或病症的量。任一受试者的适当剂量将取决于某些因素，包括受试者的大小、身体表面积、年龄、待施用的特定组合物、组合物中的活性成分、施用时间和途径、一般健康和正在同时施用的其他药物。

在一些实施方案中，经肠(例如，经口、通过胃饲管、通过十二指肠饲管、经由胃造口术或经直肠)、肠胃外(例如，皮下注射、静脉内注射或输注、动脉内注射或输注、骨内输注、肌肉内注射、脑内注射、脑室内注射、鞘内)、经局部(例如，表皮、吸入、经由眼药水或通过粘膜)或通过直接注射至靶器官(例如，受试者的肝)向受试者施用本文中组合物中的任一者。通常，本文中寡核苷酸经静脉内或经皮下施用。

作为非限制性实例组，本文中寡核苷酸通常每季度(每三个月一次)、每两月(每两个月一次)、每月或每周施用。例如，所述寡核苷酸可每周或以两周或三周的间隔施用。或者，所述寡核苷酸可每日施用。在一些实施方案中，向受试者施用寡核苷酸的一个或多个负载剂量，接着寡核苷酸的一个或多个维持剂量。

在一些实施方案中，待治疗的受试者为人或非人灵长类动物或其他哺乳动物受试者。其他示例性受试者包括家养动物，诸如狗和猫；家畜，诸如马、牛、猪、绵羊、山羊和鸡；和动物，诸如小鼠、大鼠、豚鼠和仓鼠。

V.药盒

在一些实施方案中，本公开提供药盒，其包括本文中的寡核苷酸和使用说明书。在一些实施方案中，所述药盒包括本文中的寡核苷酸和含有药盒和/或其任何组件的使用说明书的包装插页。在一些实施方案中，所述药盒在合适的容器中包括本文中的寡核苷酸、一个或多个对照和各种缓冲剂、试剂、酶和本领域中熟知的其他标准成分。在一些实施方案中，所述容器包括至少一个小瓶、孔、试管、烧瓶、瓶、注射器或其他容器装置，将寡核苷酸放入其中，并且在一些实例中，适当等分。在一些实施方案中，在提供额外组分的情况下，所述药盒含有额外容器，将这种组分放入所述容器中。此类药盒还可包括严格限制用于商业销售的含有寡核苷酸和任何其他试剂的装置。此类容器可包括注射或吹塑成型塑料容器，所需小瓶保留于其中。容器和/或药盒可包括具有使用说明书和/或警告的标签。

在一些实施方案中，药盒包括本文中的寡核苷酸，和药学上可接受的载体，或包含寡核苷酸的药物组合物和用于治疗有需要受试者的与ANGPTL3表达相关的疾病、病症或疾患或延迟其进展的说明书。

实施例

虽然已参考下列实施例中所阐述的特定实施方案描述本发明，但是本领域技术人员应了解，可作出各种变化，并且等效物可在不背离本发明的真正精神和范围下被取代。另外，下列实施例经由说明的方式提供且不意图以任何方式限制本公开的范围。此外，可针对本公开的目标、精神和范围，配合特定情况、材料、物质的组成、方法、一个或多个方法步骤进行修改。所有此类修改意图在本公开的范围内。利用本领域中熟知的标准技术或以下具体描述的技术。

实施例1：双链RNAi寡核苷酸的制备

寡核苷酸合成和纯化

上述实施例中所述的ds RNAi寡核苷酸使用本文中所述的方法化学合成。一般而言，ds RNAi寡核苷酸使用如针对19至23聚体siRNA所述的固相寡核苷酸合成方法合成(参见，例如，Scaringe等人(1990)Nucleic Acids Res.18:5433-5441和Usman等人(1987)J.Am.Chem.Soc.109:7845-7845；还参见美国专利号5,804,683、5,831,071、5,998,203、6,008,400、6,111,086、6,117,657、6,353,098、6,362,323、6,437,117和6,469,158)。

单独RNA链根据标准方法(Integrated DNA Technologies；Coralville,IA)合成并且经HPLC纯化。例如，RNA寡核苷酸使用固相亚磷酰胺化学合成，使用标准技术脱去保护基并在NAP-5柱(Amersham Pharmacia Biotech；Piscataway,NJ)上脱盐(Damha和Olgivie(1993)Methods Mol.Biol.20:81-114；Wincott等人(1995)Nucleic Acids Res.23:2677-2684)。将寡聚物使用离子交换高效液相色谱法(IE-HPLC)在Amersham Source 15Q柱(1.0cm×25cm；Amersham Pharmacia Biotech)上使用15分钟步进-线性梯度纯化。梯度从90:10缓冲剂A:B变化至52:48缓冲剂A:B，其中缓冲剂A为100mM Tris pH8.5并且缓冲剂B为100mM Tris pH 8.5，1M NaCl。在260nm下监测样品并收集对应于全长寡核苷酸物质的峰，汇集，在NAP-5柱上脱盐，且冻干。

各寡聚物的纯度通过毛细管电泳(CE)在Beckman PACE 5000(Beckman Coulter,Inc.；Fullerton,CA)上测定。CE毛细管具有100μm内径且含有ssDNA 100R凝胶(Beckman-Coulter)。通常，将约0.6nmol的寡核苷酸注射至毛细管，在444V/cm的电场中运行，并在260nm处检测UV吸光度。变性Tris-硼酸盐-7M-脲运行缓冲液购自Beckman-Coulter。获得如通过CE所评估至少90％纯度的寡核糖核苷酸，用于下述实验中。化合物同一性通过基质辅助式激光解吸电离飞行时间(MALDI-TOF)质谱法在Voyager DE^TMBiospectometry工作站(Applied Biosystems；Foster City,CA)上按照制造商的建议方案经验证。获得所有寡聚物的相对分子质量，通常在预期分子质量的0.2％内。

双链体的制备

将ssRNA寡聚物再悬浮(例如，以100μM浓度)于由100mM乙酸钾、30mM HEPES，pH7.5组成的双链体缓冲液中。将互补有义链和反义链以等摩尔量混合以产生例如50μM双链体的最终溶液。针对5′，将样品在RNA缓冲液(IDT)中加热至100℃并允许在使用之前冷却至室温。将ds RNA寡核苷酸储存在-20℃下。将ss RNA寡聚物冻干储存或在无核酸酶水中在-80℃下储存。

实施例2：体外ANGPTL3表达的RNAi寡核苷酸抑制

ANGPTL3靶序列鉴定

为鉴定ANGPTL3表达的RNAi寡核苷酸抑制剂，使用基于计算机的算法以计算方式生成适用于分析ANGPTL3表达由RNAi途径的抑制的ANGPTL3靶序列。所述算法提供与人ANGPTL3 mRNA的适当ANGPTL3靶序列(例如，SEQ ID NO:128；表1)互补的RNAi寡核苷酸引导链序列。人ANGPTL3 mRNA的示例性靶序列于表2中提供。通过所述算法鉴定的引导链序列中的一些还与猴和/或小鼠ANGPTL3 mRNA的对应ANGPTL3靶序列(各自为SEQ ID NO:129和130；表1)互补。生成384种ds RNAi寡核苷酸(形式为DsiRNA寡核苷酸)，各自具有独特引导链，所述引导链具有通过所述算法鉴定的ANGPTL3靶序列的互补区。

表1：人、猴和小鼠ANGPTL3 mRNA的序列

物种	GenBank参考序列号	SEQ ID NO
			人(Hs)	NM_014495.4	128
食蟹猴(Mf)	XM_005543185.2	129
			小鼠(Mm)	NM_013913.4	130
大鼠(Rn)	NM_001025065.1	131

表2：示例性人ANGPTL3 mRNA靶序列

靶序列	SEQ ID NO
		CUCAACAUAUUUGAUCAGU	117
AGAGCCAAAAUCAAGAUUU	118
		CAAAAUCAAGAUUUGCUAU	119
GAGAAGAACUACAUAUAAA	120
		GUAGAAAAACAAGAUAAUA	121
UAGAAAAACAAGAUAAUAG	122
		AGAAAAACAAGAUAAUAGC	123
AACAGCAUAGUCAAAUAAA	124
		UCAAAAUGGAAGGUUAUAC*	125
AAAUGGAAGGUUAUACUCU	126
		GAAGGUUAUACUCUAUAAA	127

体外基于细胞的测定

使用体外基于细胞的测定来测定以上384种DsiRNA中的每一者抑制ANGPTL3表达的能力。简言之，将稳定表达ANGPTL3的HuH-7人肝细胞在多孔细胞培养板的单独孔中用DsiRNA(0.5nM)中的每一者转染。在转染后，将细胞维持24小时，且然后使用基于

的qPCR测定来测定来自经转染细胞的残余ANGPTL3 mRNA的水平。使用两个qPCR测定(3′测定和5′测定)来测定mRNA水平，如各自由HEX和FAM探针所测量。

利用384种DsiRNA的HuH-7基于细胞的测定的结果示于图1和图2中。图1示出利用109种DsiRNA的HuH-7基于细胞的测定的结果，所述DsiRNA具有与人、猴和小鼠ANGPTL3mRNA互补的引导链(“三重共有”)。认为导致当与阴性对照相比时细胞中残余的ANGPTL3mRNA少于或等于35％的三重共有DsiRNA的转染为候选ANGPTL3表达抑制剂(本文中称作“命中”)。图2示出利用275种DsiRNA的HuH-7基于细胞的测定的结果，所述DsiRNA具有与人和猴ANGPTL3 mRNA互补的引导链(“人-猴”)。还认为导致当与阴性对照相比时残余的ANGPTL3mRNA小于或等于30％的人-猴DsiRNA为命中。在图1和图2中，显示3′测定(圆形)和5′测定(菱形)中的每一者的mRNA残余％。

这些结果显示经设计以靶向人ANGPTL3 mRNA的DsiRNA抑制细胞中的ANGPTL3表达(如由经DsiRNA转染细胞中的ANGPTL3mRNA的减少量所测定)并且包含DsiRNA命中的核苷酸序列可用于生成RNAi寡核苷酸以抑制ANGPTL3表达。另外，这些结果证明，多个ANGPTL3靶序列适用于ANGPTL3表达的RNAi介导的抑制。

实施例3：体内ANGPTL3表达的RNAi寡核苷酸抑制

在实施例2中所述的HuH-7基于细胞的测定中筛选的384种DsiRNA中，选择55个DsiRNA命中(表3)的核苷酸序列用于进一步体内评价。简言之，使用55个选定DsiRNA的核苷酸序列生成55个相应双链RNAi寡核苷酸，所述寡核苷酸包含有切口的四环GalNAc缀合的结构(本文中称作“GalNAc缀合的ANGPTL3寡核苷酸”)，所述结构具有36-聚体过客链和22-聚体引导链。另外，包含GalNAc缀合的ANGPTL3寡核苷酸的过客链和引导链的核苷酸序列具有经修饰的核苷酸和硫代磷酸酯键联的独特模式(参见，例如，图3GalNAc缀合的ANGPTL3寡核苷酸的通用结构和化学修饰模式的示意图)。包含四环的三种腺苷核苷酸各自与GalNAc部分(CAS号：14131-60-3)缀合。

表3：在小鼠中评价的GalNAc缀合的ANGPTL3寡核苷酸

小鼠研究

在经工程改造以在肝细胞中短暂表达人ANGPTL3 mRNA的小鼠中评价表3中所列的GalNAc缀合的ANGPTL3寡核苷酸。将三种GalNAc缀合的ANGPTL3寡核苷酸(ANGPTL3-0204-M2、ANGPTL3-0327-M2和ANGPTL3-1327-M2)用作基准对照。简言之，将6至8周龄雌性CD-1小鼠用GalNAc缀合的ANGPTL3寡核苷酸以1mg/kg的剂量水平皮下处理。三天(72小时)后，将小鼠在遍存巨细胞病毒(CMV)启动子序列的控制下用编码全人ANGPTL3基因的DNA质粒流体力学注射。在引入质粒一天后，收集肝样品。使源自这些小鼠的总RNA经受针对ANGPTL3 mRNA的qRT-PCR分析，相对于仅用相同体积的PBS处理的小鼠。使用质粒上所包含的NeoR基因，将值针对转染效率归一化。

如图4中所示，所测试的所有GalNAc缀合的ANGPTL3寡核苷酸抑制ANGPTL3表达，如由来自用寡核苷酸处理的小鼠相对于用PBS处理的小鼠的肝样品中的ANGPTL3 mRNA的减少量所测定。用基准GalNAc缀合的ANGPTL3寡核苷酸ANGPTL3-0327处理的小鼠相对于用PBS处理的小鼠的肝样品中的残余ANGPTL3 mRNA的％以实心棒显示。图4显示所测试的55个GalNAc缀合的ANGPTL3寡核苷酸中的有26个相较于基准GalNAc缀合的ANGPTL3寡核苷酸ANGPTL3-0327在更大程度上抑制ANGPTL3表达。基于这些结果，选择55个GalNAc缀合的ANGPTL3寡核苷酸中的由图4中的箭头所指示和表4中所列的10个用于评价其抑制NHP中ANGPTL3表达的能力。表4中所列的10个GalNAc缀合的ANGPTL3寡核苷酸包含经化学修饰的核苷酸，所述核苷酸具有如图3中所述的模式M1或M2。

表4：在NHP中评价的GalNAc缀合的ANGPTL3寡核苷酸

表A：表3和4中的寡核苷酸的序列信息。

在表A的修饰模式中：

“M”是指经2′-OMe修饰的核苷酸；

“F”是指经2′-F修饰的核苷酸；

“S”是指具有3’-硫代磷酸酯键联的核苷酸；

“{MS}”是指具有3’-硫代磷酸酯键联的经2′-OMe修饰的核苷酸；

“{FS}”是指具有3’-硫代磷酸酯键联的经2′-F修饰的核苷酸；

“[adem-GalNAc]”是指具有2’-GalNAc缀合物：

的核苷酸；

“{Px-MS}”是指具有3’-硫代磷酸酯键联和5’磷酸酯的经2′-OMe修饰的核苷酸。

在表A的经修饰的序列中：

“[mN]”是指经2′-OMe修饰的核苷酸；

“[fN]”是指经2′-F修饰的核苷酸；

“[mNs]”是指具有3’-硫代磷酸酯键联的经2′-OMe修饰的核苷酸；

“[fNs]”是指具有3’-硫代磷酸酯键联的经2′-F修饰的核苷酸；

“[ademG-GalNAc]”是指具有2’-GalNAc缀合物的G核苷酸：

“[ademA-GalNAc]”是指具有2’-GalNAc缀合物的A核苷酸：

“[Me磷酸酯-4O-mUs]”是指具有3’-硫代磷酸酯键联的5’-磷酸酯-4’-氧基-2'-OMe尿苷：

非人灵长类动物(NHP)研究

在食蟹猴(猕猴(Macaca fascicularis))中评价表4中所列的GalNAc缀合的ANGPTL3寡核苷酸。在此研究中，将所述NHP分组使得其平均体重(约5.4kg)在对照组与实验组之间可比较。各组含有两只雄性和三只雌性受试者。在研究第0天，皮下施用GalNAc缀合的ANGPTL3寡核苷酸。在研究第-8天、第-5天和第0天和在给药后每周收集血液样品。在研究第28天、第56天和第84天收集超声引导的芯针肝活组织检查。在各时间点，使源自肝活组织检查样品的总RNA经受qRT-PCR分析以测量用寡核苷酸处理的NHP相对于用可比较体积的PBS处理的NHP的ANGPTL3 mRNA。为将数据归一化，相对于两个参考基因PPIB和18S rRNA的几何平均值进行测量。如图5A(第28天)、图5B(第56天)和图5C(第84天)中所示，利用表4中所列的GalNAc缀合的ANGPTL3寡核苷酸处理NHP抑制肝中的ANGPTL3表达，如由来自用寡核苷酸处理的NHP相对于用PBS处理的NHP的肝样品中的ANGPTL3 mRNA的减少的量所测定。指示经处理的NHP的肝样品中的ANGPTL3 mRNA的平均减少百分比超过各处理组的数据点集和随时间的平均值的曲线图标于图6中。针对所评价的所有时间点，ANGPTL3-1412相较于基准GalNAc缀合的ANGPTL3寡核苷酸ANGPTL3-0327在更大程度上抑制ANGPTL3表达。从相同NHP研究，ANGPTL3表达的抑制还通过ELISA通过测量从剂量前和每周血液样品制备的血清中的ANGPTL3蛋白质来测定。如图7中所示，与用PBS处理的NHP相比，在用GalNAc缀合的ANGPTL3寡核苷酸处理的NHP中观察到血清ANGPTL3蛋白质的显著减少。将来自三个剂量前样品的值取平均值并设置为100％，并将数据报告为与剂量前平均值相比的相对值。总之，这些结果证明，利用GalNAc缀合的ANGPTL3寡核苷酸处理NHP减少肝中的ANGPTL3 mRNA的量且同时减少血清中的ANGPTL3蛋白质的量。

总之，这些结果显示，经设计以靶向人ANGPTL3 mRNA的GalNAc缀合的ANGPTL3寡核苷酸抑制体内ANGPTL3表达(如由经处理动物中的ANGPTL3 mRNA和ANGPTL3蛋白质的量的减少所测定)。

序列表

下列核酸和/或氨基酸序列在以上公开内容中提及且提供于以下用于参考。

表5：ANGPTL3寡核苷酸序列(未经修饰)

Claims

1.一种用于减少ANGPTL3表达的寡核苷酸，所述寡核苷酸包含具有如SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114和116中任一者中所阐述的序列的反义链。

2.如权利要求1所述的寡核苷酸，所述寡核苷酸包含具有如SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113和115中任一者中所阐述的序列的有义链。

3.如权利要求1或2所述的寡核苷酸，其中所述反义链包含如SEQ ID NO:100、102、104、20、26、50、72、74、76、80和114中任一者中所阐述的序列。

4.如权利要求2或3所述的寡核苷酸，其中所述有义链包含如SEQ ID NO:99、101、103、19、25、49、71、73、75、79和113中任一者中所阐述的序列。

5.一种用于减少ANGPTL3表达的寡核苷酸，所述寡核苷酸包含长度为15至30个核苷酸的反义链和长度15至40个核苷酸的有义链，其中所述反义链具有如SEQ ID NO:125、126、127、118、119、120、121、122、123、124和117中任一者中所阐述的ANGPTL3的靶序列的互补区，并且其中所述互补区长度为至少15个连续核苷酸。

6.如权利要求5所述的寡核苷酸，其中所述互补区与ANGPTL3的所述靶序列完全互补。

7.如权利要求1至6中任一项所述的寡核苷酸，其中所述反义链长度为19至27个核苷酸。

8.如权利要求1至7中任一项所述的寡核苷酸，其中所述反义链长度为21至27个核苷酸，任选地其中所述反义链长度为22个核苷酸。

9.如权利要求2至8中任一项所述的寡核苷酸，其中所述有义链与所述反义链形成双链体区。

10.如权利要求9所述的寡核苷酸，其中所述有义链长度为19至40个核苷酸，任选地其中所述有义链长度为36个核苷酸。

11.如权利要求9或10所述的寡核苷酸，其中所述双链体区长度为至少19个核苷酸。

12.如权利要求9至11中任一项所述的寡核苷酸，其中所述双链体区长度为至少21个核苷酸，任选地其中所述双链体区长度为20个核苷酸。

13.如权利要求5至12中任一项所述的寡核苷酸，其中ANGPTL3的所述互补区长度为至少19个连续核苷酸。

14.如权利要求5至13中任一项所述的寡核苷酸，其中ANGPTL3的所述互补区长度为至少21个连续核苷酸。

15.如权利要求5至14中任一项所述的寡核苷酸，其中所述反义链包含如SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114和116中任一者中所阐述的序列。

16.如权利要求5至15中任一项所述的寡核苷酸，其中所述有义链包含如SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113和115中任一者中所阐述的序列。

17.如权利要求5至16中任一项所述的寡核苷酸，其中所述反义链包含如SEQ ID NO:100、102、104、20、26、50、72、74、76、80和114中任一者中所阐述的序列。

18.如权利要求5至17中任一项所述的寡核苷酸，其中所述有义链包含如SEQ ID NO:99、101、103、19、25、49、71、73、75、79和113中任一者中所阐述的序列。

19.如权利要求2至18中任一项所述的寡核苷酸，其中所述有义链在其3′端处包含阐述为：S1-L-S2的茎环，其中S1与S2互补，并且其中L在S1与S2之间形成长度为3至5个核苷酸的环。

20.一种用于减少ANGPTL3表达的寡核苷酸，所述寡核苷酸包含反义链和有义链，

其中所述反义链长度为21至27个核苷酸并且具有ANGPTL3的互补区，其中所述有义链在其3′端处包含阐述为：S1-L-S2的茎环，其中S1与S2互补，并且其中L在S1与S2之间形成长度为3至5个核苷酸的环，并且

其中所述反义链和所述有义链形成长度为至少19个核苷酸的双链体结构，但不共价连接。

21.如权利要求20所述的寡核苷酸，其中所述互补区与ANGPTL3 mRNA的至少19个连续核苷酸完全互补。

22.如权利要求19至21中任一项所述的寡核苷酸，其中L为四环。

23.如权利要求19至22中任一项所述的寡核苷酸，其中L长度为4个核苷酸。

24.如权利要求19至23中任一项所述的寡核苷酸，其中L包含阐述为GAAA的序列。

25.如权利要求5至24中任一项所述的寡核苷酸，其中所述反义链长度为27个核苷酸并且所述有义链长度为25个核苷酸，任选地其中所述反义链长度为22个核苷酸并且所述有义链长度为36个核苷酸。

26.如权利要求25所述的寡核苷酸，其中所述反义链和所述有义链形成长度为25个核苷酸的双链体区，任选地其中所述双链体长度为20个核苷酸。

27.如权利要求20至24中任一项所述的寡核苷酸，所述寡核苷酸在所述反义链上包含长度为2个核苷酸的3′-突出端序列。

28.如权利要求9至18中任一项所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含长度各自在21至23个核苷酸范围内的反义链和有义链。

29.如权利要求28所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含长度在19至21个核苷酸范围内的双链体结构。

30.如权利要求28或29所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含长度为一个或多个核苷酸的3′-突出端序列，其中所述3′-突出端序列存在于所述反义链、所述有义链、或所述反义链和有义链上。

31.如权利要求28或29所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含长度为2个核苷酸的3′-突出端序列，其中所述3′-突出端序列在所述反义链上，并且其中所述有义链长度为21个核苷酸且所述反义链长度为23个核苷酸，使得所述有义链和所述反义链形成长度为21个核苷酸的双链体。

32.如前述权利要求中任一项所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含至少一个经修饰的核苷酸。

33.如权利要求32所述的寡核苷酸，其中所述经修饰的核苷酸包含2′-修饰。

34.如权利要求33所述的寡核苷酸，其中所述2′-修饰为选自2′-氨基乙基、2′-氟、2′-O-甲基、2′-O-甲氧基乙基和2′-脱氧-2′-氟-β-d-阿拉伯糖核酸的修饰。

35.如权利要求32至34中任一项所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸的所有核苷酸均经修饰。

36.如前述权利要求中任一项所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含至少一个经修饰的核苷酸间键联。

37.如权利要求36所述的寡核苷酸，其中所述至少一个经修饰的核苷酸间键联为硫代磷酸酯键联。

38.如前述权利要求中任一项所述的寡核苷酸，其中所述反义链的5′-核苷酸的糖的4′-碳包含磷酸酯类似物。

39.如权利要求38所述的寡核苷酸，其中所述磷酸酯类似物为氧基甲基膦酸酯、乙烯基膦酸酯或丙二酰基膦酸酯。

40.如前述权利要求中任一项所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸的至少一个核苷酸与一个或多个靶向配体结合。

41.如权利要求40所述的寡核苷酸，其中每个靶向配体包含碳水化合物、氨基糖、胆固醇、多肽或脂质。

42.如权利要求40所述的寡核苷酸，其中每个靶向配体包含N-乙酰基半乳糖胺(GalNAc)部分。

43.如权利要求42所述的寡核苷酸，其中所述GalNac部分为单价GalNAc部分、二价GalNAc部分、三价GalNAc部分或四价GalNAc部分。

44.如权利要求19至24中任一项所述的寡核苷酸，其中所述茎-环的L的至多4个核苷酸各自与单价GalNAc部分缀合。

45.如前述权利要求中任一项所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸为RNAi寡核苷酸。

46.一种药物组合物，所述药物组合物包含前述权利要求中任一项所述的寡核苷酸和药学上可接受的载体、递送剂或赋形剂。

47.一种向受试者递送寡核苷酸的方法，所述方法包括向所述受试者施用权利要求46所述的药物组合物。

48.一种用于减少细胞、细胞群体或受试者中的ANGPTL3表达的方法，所述方法包括以下步骤：

i.使所述细胞或所述细胞群体与权利要求1至45中任一项所述的寡核苷酸或权利要求46所述的药物组合物接触；或

ii.向所述受试者施用权利要求1至45中任一项所述的寡核苷酸或权利要求46所述的药物组合物。

49.如权利要求48所述的方法，其中减少ANGPTL3表达包括减少ANGPTL3 mRNA的量或水平，减少ANGPTL3蛋白的量或水平，或二者。

50.一种用于减少受试者中的甘油三酯(TG)的量或水平的方法，所述方法包括向所述受试者施用权利要求1至45中任一项所述的寡核苷酸或权利要求46所述的药物组合物。

51.一种用于减少受试者中的胆固醇的量或水平的方法，所述方法包括向所述受试者施用权利要求1至45中任一项所述的寡核苷酸或权利要求46所述的药物组合物。

52.如权利要求48至51中任一项所述的方法，其中所述受试者患有与ANGPTL3表达相关的疾病、病症或疾患。

53.一种用于治疗患有与ANGPTL3表达相关的疾病、病症或疾患的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的权利要求1至45中任一项所述的寡核苷酸或权利要求46所述的药物组合物，从而治疗所述受试者。

54.一种用于治疗患有与ANGPTL3表达相关的疾病、病症或疾患的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的包含长度为15至50个核苷酸的有义链和长度为15至30个核苷酸的反义链的寡核苷酸，其中所述有义链与所述反义链形成双链体区，其中所述有义链包含如SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113和115中任一者中所阐述的序列，并且其中所述反义链包含选自SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114和116的互补序列，或其药物组合物，从而治疗所述受试者。

55.一种用于治疗患有与ANGPTL3表达相关的疾病、病症或疾患的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的包含选自表5中所阐述成列的一对反义链和有义链的寡核苷酸，或其药物组合物，从而治疗所述受试者。

56.如权利要求52至55中任一项所述的方法，其中与ANGPTL3表达相关的所述疾病、病症或疾患选自由以下组成的组：高甘油三酯血症、肥胖症、高脂血症、异常脂质和/或胆固醇代谢、动脉粥样硬化、II型糖尿病、心血管疾病、冠状动脉疾病、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、非酒精性脂肪性肝病、纯合子和杂合子家族性高胆固醇血症和他汀耐药性高胆固醇血症。

57.如权利要求56所述的方法，其中与ANGPTL3表达相关的所述疾病、病症或疾患为心血管疾病、II型糖尿病、高甘油三酯血症、NASH、肥胖症或它们的组合。

58.如权利要求53至57中任一项所述的方法，其中所述寡核苷酸或药物组合物与第二组合物或治疗剂组合施用。

59.如权利要求1至45中任一项所述的寡核苷酸或如权利要求46所述的药物组合物在制造用于治疗与ANGPTL3表达相关的疾病、病症或疾患的药剂中的用途。

60.如权利要求1-45中任一项所述的寡核苷酸或如权利要求46所述的药物组合物，所述寡核苷酸或所述药物组合物用于或适用于治疗与ANGPTL3表达相关的疾病、病症或疾患。

61.一种药盒，所述药盒包括权利要求1至45中任一项所述的寡核苷酸、任选的药学上可接受的载体和包装插页，所述包装插页包括向患有与ANGPTL3表达相关的疾病、病症或疾患的受试者施用的说明。

62.如权利要求59所述的用途、如权利要求60所述使用的寡核苷酸或药物组合物或如权利要求61所述的药盒，其中与ANGPTL3表达相关的所述疾病、病症或疾患选自由以下组成的组：高甘油三酯血症、肥胖症、高脂血症、异常脂质和/或胆固醇代谢、动脉粥样硬化、II型糖尿病、心血管疾病、冠状动脉疾病、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、非酒精性脂肪性肝病、纯合子和杂合子家族性高胆固醇血症和他汀耐药性高胆固醇血症。

63.如权利要求59所述的用途、如权利要求60所述使用的寡核苷酸或药物组合物或如权利要求61所述的药盒，其中与ANGPTL3表达相关的所述疾病、病症或疾患为心血管疾病、II型糖尿病、高甘油三酯血症、NASH、肥胖症或它们的组合。