DE60130583T2

DE60130583T2 - Kleine rns moleküle, die rns-interferenz vermitteln

Info

Publication number: DE60130583T2
Application number: DE60130583T
Authority: DE
Inventors: Thomas New York TUSCHL; Sayda Cambridge ELBASHIR; Winfried Lendeckel; Matthias Wilm; Reinhard Lührmann
Original assignee: Europaisches Laboratorium fuer Molekularbiologie EMBL; Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Current assignee: Europaisches Laboratorium fuer Molekularbiologie EMBL; Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Priority date: 2000-12-01
Filing date: 2001-11-29
Publication date: 2008-06-12
Anticipated expiration: 2021-11-30
Also published as: US20110070162A1; JP2007111053A; US20050234006A1; KR100909681B1; CY1119062T1; HK1139181A1; US8372968B2; US20110027883A1; PT1407044E; JP2010131031A; BRPI0115814B1; IL155991A0; AU2010212438A1; DK1407044T4; US20070093445A1; BR0115814A; LTPA2021005I1; JP4095895B2; KR100872437B1; US20130125259A1

Description

Die Erfindung betrifft Sequenzmerkmale sowie strukturelle Merkmale von doppelsträngigen (ds)RNA-Molekülen, welche zur Vermittlung zielspezifischer RNA-Interferenz nötig sind.
Der Begriff „RNA-Interferenz" (RNAi) wurde nach der Entdeckung geprägt, dass die Injektion von dsRNA in den Nematoden C. elegans zur spezifischen Inaktivierung (silencing) von Genen führt, welche hinsichtlich ihrer Sequenz zur abgegebenen dsRNA hoch homolog sind (Fire et al., 1998). RNAi wurde anschließend auch in Insekten, Fröschen (Oelgeschlager et al., 2000) und anderen Tieren umfassend Mäuse (Svoboda et al., 2000; Wianny und Zernicka-Goetz, 2000) beobachtet und es ist wahrscheinlich, dass sie auch in Menschen vorkommt. RNAi ist eng verknüpft mit dem post-transkriptionalen Geninaktivierungs(PTGS)-Coexpressionsmechanismus in Pflanzen sowie Quelling in Pilzen (Catalanotto et al., 2000; Cogoni und Macino, 1999; Dalmay et al., 2000; Ketting und Plasterk, 2000; Mourrain et al., 2000; Smardon et al., 2000) und einige Komponenten des RNAi-Mechanismus sind auch für post-transkriptionale Inaktivierung durch Cosuppression notwendig (Catalanotto et al., 2000; Dernburg et al., 2000; Ketting und Plasterk, 2000). Zu diesem Thema wurden kürzlich auch Übersichtsartikel erstellt (Bass, 2000; Bosher und Labouesse, 2000; Fire, 1999; Plasterk und Ketting, 2000; Sharp, 1999; Sijen und Kooter, 2000), siehe auch die vollständige Ausgabe von Plant Molecular Biology, Bd. 43, Ausgabe 2/3 (2000).
In Pflanzen können eingeführte Transgene, zusätzlich zu PTGS, auch zu transkriptionaler Geninaktivierung mittels RNA-gelenkter DNA-Methylierung von Cytosinen führen (siehe Referenzen in Wassenegger, 2000). Genomische Ziele mit einer Länge von knapp 30 bp werden in Pflanzen in einer RNA-gelenkten Art und Weise methyliert (Pelissier, 2000). DNA-Methylierung kommt auch in Säugern vor.
Die natürliche Funktion von RNAi und Cosuppression scheint im Schutz des Genoms gegenüber einer Invasion durch mobile genetische Elemente zu liegen, wie beispielsweise Retrotransposons und Viren, welche anormale RNA oder dsRNA in der Wirtszelle erzeugen wenn sie aktiv werden (Jensen et al., 1999; Ketting et al., 1999; Ratcliff et al., 1999; Tabara et al., 1999). Spezifischer mRNA-Abbau beugt einer Transposon- und Virusreplikation vor, obwohl einige Viren in der Lage sind, durch Expression von Proteinen, welche PTGS unterdrücken, diesen Prozess zu überstehen oder ihm vorzubeugen (Lucy et al., 2000; Voinnet et al., 2000).
DsRNA löst den spezifischen Abbau von homologen RNAs nur innerhalb der Identitätsregion mit der dsRNA aus (Zamore et al., 2000; Brenda L. Bass, 2000; Yang et al., 2000; Elbashir et al., 2001; WO 01/75164 ). Die dsRNA wird in 21-23 nt RNA-Fragmente prozessiert und die Ziel-RNA-Spaltungsstellen sind in regelmäßigen Abständen 21-23 nt voneinander getrennt. Es wurde deshalb vorgeschlagen, dass die 21-23 nt Fragmente, die Guide-RNAs zur Zielerkennung sind (Zamore et al., 2000). Diese kurzen RNAs wurden auch in Extrakten detektiert, welche aus D. melanogaster Schneider 2-Zellen präpariert worden waren, welche kurz vor der Zelllyse mit dsRNA transfiziert worden waren (Hammond et al., 2000), wobei aber die Fraktionen, welche eine sequenzspezifische Nukleaseaktivität zeigten, auch eine große Fraktion übriger dsRNA enthielten. Die Rolle der 21-23 nt Fragmente bei der Steuerung der mRNA-Spaltung wird ferner durch die Beobachtung unterstützt, dass 21-23-nt Fragmente, welche aus prozessierter dsRNA isoliert werden, zu einem gewissen Maß in der Lage sind, spezifischen mRNA-Abbau zu vermitteln (Zamore et al., 2000). RNA-Moleküle mit ähnlicher Größe akkumulieren auch in Pflanzengewebe, welches PTGS zeigt (Hamilton und Baulcombe, 1999).
Hierin verwenden wir das etablierte in vitro Drosophila-System (Tuschl et al., 1999; Zamore et al., 2000), um den RNAs-Mechanismus weiter zu erforschen. Wir zeigen, dass kurze 21- und 22-nt RNAs, wenn sie mit 3'-überhängenden Enden basengepaart sind, als Guide-RNAs für sequenzspezifischen mRNA-Abbau wirken. Kurze 30 bp dsRNAs können in diesem System keine RNAs vermitteln, da sie nicht weiter zu 21- und 22-nt RNAs prozessiert werden. Darüber hinaus definierten wir die Ziel-RNA-Spaltungsstellen relativ zu den 21- und 22-nt kurzen interferierenden (short interfering) RNAs (siRNAs) und beweisen, dass die Richtung von dsRNA-Prozessierung bestimmt, ob eine Sense- oder eine Antisense-Ziel-RNA durch den erzeugten siRNP-Endonukleasekomplex gespalten werden kann. Darüber hinaus können die siRNAs auch für transkriptionale Modulierung ein wichtiges Werkzeug darstellen, z.B. Inaktivierung von Säugergenen durch Steuern von DNA-Methylierung.
Weitere Experimente in humanen in vivo-Zellkultursystemen (HeLa-Zellen) zeigen, dass doppelsträngige RNA-Moleküle mit einer Länge von vorzugsweise von 19-23 Nukleotiden RNAi-Aktivität aufweisen.
Die der vorliegenden Erfindung zugrunde liegende Aufgabe ist es, neue Mittel bereitzustellen, welche zielspezifische RNA-Interferenz vermitteln können, wobei diese Mittel im Vergleich zu Mitteln aus dem Stand der Technik eine verbesserte Effizienz und Sicherheit aufweisen.
Die Lösung dieses Problems wird bereitgestellt durch ein isoliertes doppelsträngiges RNA-Molekül, wobei jeder RNA-Strang eine Länge von 19-23 Nukleotiden aufweist und wobei wenigstens ein Strang einen 3'-Überhang von 1-3 Nukleotiden aufweist, wobei das RNA-Molekül in der Lage ist, RNA-Interferenz zu vermitteln. Wenigstens ein Strang weist einen 3'-Überhang von 1-3 Nukleotiden und am stärksten bevorzugt von 2 Nukleotiden auf. Der andere Strang kann ein glattes Ende aufweisen oder weist einen 3'-Überhang mit bis zu 6 Nukleotiden auf.
Das RNA-Molekül ist vorzugsweise ein synthetisches RNA-Molekül, welches im Wesentlichen frei von Kontaminanten ist, welche in Zellextrakten vorkommen, z.B. von Drosophila-Embryos. Darüber hinaus ist das RNA-Molekül vorzugsweise im Wesentlichen frei von jeglichen nicht-zielspezifischen Kontaminanten, insbesondere nicht-zielspezifischen RNA-Molekülen, z. B. von Kontaminanten, welche in Zellextrakten vorkommen.
Darüber hinaus betrifft die Erfindung die Verwendung von isolierten doppelsträngigen RNA-Molekülen, wobei jeder RNA-Strang eine Länge von 19-23 Nukleotiden aufweist und wobei wenigstens ein Strang einen 3'-Überhang von 1-3 Nukleotiden aufweist, zum Vermitteln von RNAi in Säugerzellen, insbesondere in humanen Zellen.
Überraschenderweise wurde herausgefunden, dass synthetische kurze doppelsträngige RNA-Moleküle mit überhängenden 3'-Enden sequenzspezifische Vermittler von RNAi sind und eine effiziente Ziel-RNA-Spaltung vermitteln, wobei die Spaltungsstellen nahe der Mitte der Region lokalisiert sind, welcher von der kurzen Guide-RNA überspannt wird.
Vorzugsweise weist jeder Strang des RNA-Moleküls eine Länge von 20-22 Nukleotiden auf, wobei die Länge eines jeden Strangs gleich oder verschieden sein kann. Die Länge des 3'-Überhangs reicht von 1-3 Nukleotiden, wobei die Länge des Überhangs für jeden Strang gleich oder verschieden sein kann. Die RNA-Stränge weisen vorzugsweise 3'-Hydroxylgruppen auf. Der 5'-Terminus umfasst vorzugsweise eine Phosphat-, Diphosphat-, Triphosphat- oder Hydroxylgruppe. Die effektivsten dsRNAs sind zusammengesetzt aus zwei 21-nt Strängen, welche so gepaart sind, dass 1-3, insbesondere 2-nt 3'-Überhänge an beiden Enden der dsRNA vorliegen.
Die Ziel-RNA-Spaltungsreaktion, welche durch siRNAs gesteuert wird, ist in hohem Maße sequenzspezifisch. Jedoch tragen nicht alle Positionen der siRNA in gleicher Weise zur Zielerkennung bei. Fehlpaarungen in der Mitte der siRNA-Duplex sind am kritischsten und heben die Ziel-RNA-Spaltung entscheidend auf. Im Gegensatz dazu trägt das 3'-Nukleotid des siRNA-Strangs (z.B. Position 21), welches zur einzelsträngigen Ziel-RNA komplementär ist, nicht zur Spezifität der Zielerkennung bei. Darüber hinaus ist die Sequenz des ungepaarten 2-nt 3'-Überhangs des siRNA-Strangs mit der gleichen Polarität wie die Ziel-RNA für die Ziel-RNA-Spaltung nicht kritisch, da nur der Antisense-siRNA-Strang die Zielerkennung steuert. Daher braucht von den einzelsträngigen überhängenden Nukleotiden nur die vorletzte Position der Antisense-siRNA (z.B. Position 20) mit der als Ziel gesetzten Sense-mRNA übereinstimmen.
Überraschenderweise zeigen die doppelsträngigen RNA-Moleküle der vorliegenden Erfindung eine hohe in vivo-Stabilität in Serum oder in Wachstumsmedium für Zellkulturen. Um die Stabilität weiter zu steigern, können die 3'-Überhänge gegenüber Abbau stabilisiert werden, z.B. können sie so ausgewählt werden, dass sie aus Purin-Nukleotiden bestehen, insbesondere Adenosin- oder Guanosin-Nukleotiden. Alternativ wird eine Substitution von Pyrimidin-Nukleotiden durch modifizierte Analoga, z.B. Substitution von Uridin 2-nt 3'-Überhängen durch 2'-Deoxythymidin, toleriert und beeinflusst die Effizienz der RNA-Interferenz nicht. Das Fehlen eines 2'-Hydroxyls erhöht die Nukleaseresistenz des Überhangs in Gewebekulturmedium signifikant.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann das RNA-Molekül wenigstens ein modifiziertes Nukleotidanalogon enthalten. Die Nukleotidanaloga können an Positionen lokalisiert sein, an welchen die zielspezifische Aktivität, z.B. die RNAi-vermittelnde Aktivität, nicht wesentlich beeinflusst wird, z.B. in einer Region am 5'-Ende und/oder dem 3'-Ende des doppelsträngigen RNA-Moleküls. Insbesondere können die Überhänge durch Einbau modifizierter Nukleotidanaloga stabilisiert werden.
Bevorzugte Nukleotidanaloga sind aus Zucker- oder Rückgrat-modifizierten Ribonukleotiden ausgewählt. Es sollte aber erwähnt werden, dass auch Nukleobasen-modifizierte Ribonukleotide, d.h. Ribonukleotide, welche eine nicht-natürlich vorkommende Nukleobase anstelle einer natürlich vorkommenden Nukleobase enthalten, wie beispielsweise Uridine oder Cytidine, die an der 5-Position modifiziert sind, z.B. 5-(2-Amino)propyluridin, 5-Bromuridin; Adenosine und Guanosine, welche an der 8-Position modifiziert sind, z.B. 8-Brom-guanosin; Deazanukleotide, z.B. 7-Deaza-adenosin; O- und N-alkylierte Nukleotide, z.B. N6-Methyladenosin, geeignet sind. In bevorzugten Zucker-modifizierten Ribonukleotiden ist die 2'-OH-Gruppe ersetzt durch eine Gruppe ausgewählt aus H, OR, R, Halogen, SH, SR, NH₂, NHR, NR₂ oder CN, wobei R C₁-C₆-Alkyl, Alkenyl oder Alkinyl ist und Halogen F, Cl, Br oder I ist. In bevorzugten Rückgrat-modifizierten Ribonukleotiden ist die Phosphoestergruppe, welche benachbarte Ribonukleotide verbindet, durch eine modifizierte Gruppe ersetzt, z.B. eine Phosphothioatgruppe. Es sollte erwähnt werden, dass die vorausgehend beschriebenen Modifikationen kombiniert werden können.
Die Sequenz des doppelsträngigen RNA-Moleküls der vorliegenden Erfindung muss mit einem Nukleinsäurezielmolekül eine ausreichende Identität aufweisen, um zielspezifische RNAi zu vermitteln. Vorzugsweise weist die Sequenz eine Identität von wenigstens 70% mit dem gewünschten Zielmolekül im doppelsträngigen Abschnitt des RNA-Moleküls auf. Stärker bevorzugt beträgt die Identität wenigstens 85% und am stärksten bevorzugt sogar 100% im doppelsträngigen Abschnitt des RNA-Moleküls. Die Identität eines doppelsträngigen RNA-Moleküls mit einem vorbestimmten Nukleinsäurezielmolekül, z.B. einem mRNA-Zielmolekül, kann wie im Folgenden beschrieben bestimmt werden: I = nL × 100wobei I die Identität in Prozent ist, n die Zahl der identischen Nukleotide im doppelsträngigen Abschnitt der dsRNA und des Ziels ist und L die Länge der Sequenzüberlappung des doppelsträngigen Abschnitts der dsRNA und des Ziels ist.
Alternativ kann die Identität des doppelsträngigen RNA-Moleküls zur Zielsequenz auch definiert werden umfassend den 3'-Überhang, insbesondere einen Überhang mit einer Länge von 1-3 Nukleotiden. In diesem Fall beträgt die Sequenzidentität vorzugsweise wenigstens 70% und stärker bevorzugt wenigstens 85% zur Zielsequenz. Beispielsweise können die Nukleotide vom 3'-Überhang und bis zu 2 Nukleotide vom 5'- und/oder 3'-Terminus des Doppelstrangs ohne entscheidenden Aktivitätsverlust modifiziert werden.
Das erfindungsgemäße doppelsträgige RNA-Molekül kann hergestellt werden durch ein Verfahren umfassend die Schritte:

(a) Synthetisieren zweier RNA-Stränge, wobei jeder eine Länge von 19 bis 23 Nukleotiden aufweist und wenigstens einer einen 3'-Überhang von 1 bis 3 Nukleotiden aufweist, wobei die RNA-Stränge ein doppelsträngiges RNA-Molekül bilden können,
(b) Vereinigen der synthetisierten RNA-Stränge unter Bedingungen, unter welchen ein doppelsträngiges RNA-Molekül gebildet wird, welches in der Lage ist, zielspezifische RNA-Interferenz zu vermitteln.

Verfahren zum Synthetisieren von RNA-Molekülen sind im Fachbereich bekannt. In diesem Zusammenhang wird insbesondere auf die chemischen Syntheseverfahren verwiesen, wie sie von Verma und Eckstein (1998) beschrieben werden.
Die einzelsträngigen RNAs können auch durch enzymatische Transkription von synthetischen DNA-Matrizen oder von DNA-Plasmiden hergestellt werden, welche aus rekombinanten Bakterien isoliert worden sind. Typischerweise werden Phagen-RNA-Polymerasen verwendet, wie beispielsweise T7-, T3- oder SP6-RNA-Polymerase (Milligan und Uhlenbeck (1989)).
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein in vitro-Verfahren zum Vermitteln zielspezifischer RNA-Interferenzen in einer Zelle oder einem Organismus, umfassend die Schritte:

(a) Inkontaktbringen der Zelle oder des Organismus mit dem doppelsträngigen RNA-Molekül der Erfindung unter Bedingungen, unter welchen zielspezifische RNA-Interferenzen auftreten können, und
(b) Vermitteln einer zielspezifischen RNA-Interferenz, welche durch die doppelsträngige RNA gegenüber einer Zielnukleinsäure bewirkt wird, die einen Sequenzteil aufweist, der im Wesentlichen der doppelsträngigen RNA entspricht.

Vorzugsweise umfasst der Schritt des Inkontaktbringens (a) Einführen des doppelsträngigen RNA-Moleküls in eine Zielzelle, z.B. eine isolierte Zielzelle, z.B. in einer Zellkultur, in einen einzelligen Mikroorganismus oder in eine Zielzelle oder mehrere Zielzellen in einem mehrzelligen Organismus. Vorzugsweise umfasst der Schritt des Einführens ein Träger-vermitteltes Zuführen, z.B. durch liposomale Träger oder durch Injektion.
Das in vitro-Verfahren der Erfindung kann verwendet werden zur Bestimmung der Funktion eines Gens in einer Zelle oder einem Organismus oder auch zum Modulieren der Funktion eines Gens in einer Zelle oder einem Organismus, wobei es in der Lage ist, RNA-Interferenz zu vermitteln. Die Zelle ist vorzugsweise eine eukaryotische Zelle oder eine Zelllinie, z.B. eine Pflanzenzelle oder eine tierische Zelle, wie beispielsweise eine Säugerzelle, z.B. eine embryonale Zelle, eine pluripotente Stammzelle, eine Tumorzelle, z.B. eine Teratokarzinomzelle oder eine Virus-infizierte Zelle. Der Organismus ist vorzugsweise ein eukaryotischer Organismus, wie beispielsweise eine Pflanze oder ein Tier, wie beispielsweise ein Säuger, insbesondere ein Mensch.
Das Zielgen, an welches das RNA-Molekül der Erfindung gelenkt wird, kann mit einem pathologischen Zustand assoziiert sein. Beispielsweise kann das Gen ein pathogen-assoziiertes Gen sein, z.B. ein virales Gen, ein Tumor-assoziiertes Gen oder ein Gen, welches mit einer Autoimmunerkrankung assoziiert ist. Das Zielgen kann auch ein heterologes Gen sein, welches in einer rekombinanten Zelle oder einem genetisch veränderten Organismus exprimiert wird. Durch Bestimmen oder Modulieren, insbesondere Hemmen, der Funktion eines derartigen Gens, können wertvolle Informationen und therapeutische Vorteile auf dem Gebiet der Landwirtschaft oder in der Medizin oder dem Gebiet der Tiermedizin erhalten werden.
Ein anderer Aspekt der Erfindung betrifft die Verwendung eines doppelsträngigen RNA-Moleküls, wie es in einem der Ansprüche 1 bis 8 definiert ist, zur Herstellung eines Medikaments zur Modulation der Funktion eines pathogen-assoziierten Gens. In besonders bevorzugten Ausführungsformen ist das pathogen-assoziierte Gen ein virales Gen, ein Tumor-assoziiertes Gen oder ein Gen, welches mit einer Autoimmunerkrankung assoziiert ist.
Die dsRNA wird üblicherweise als pharmazeutische Zusammensetzung verabreicht. Die Verabreichung kann durch bekannte Verfahren durchgeführt werden, bei welchen eine Nukleinsäure in eine gewünschte Zielzelle in vitro oder in vivo eingeführt wird. Üblicherweise verwendete Gentransfertechniken umfassen Calciumphosphat, DEAE-Dextran, Elektroporation und Mikroinjektion sowie virale Verfahren (Graham, F. L. und van der Eb, A. J. (1973) Virol. 52, 456; McCutchan, J. H. und Pagano, J. S. (1968), J. Natl. Cancer Inst. 41, 351; Chu, G. et al. (1987), Nucl. Acids Res. 15, 1311; Fraley, R. et al. (1980), J. Biol. Chem. 255, 10431; Capecchi, M. R. (1980), Cell, 22, 479). Zu diesem Arsenal an Techniken zur Einführung von DNA in Zellen kam kürzlich die Verwendung von kationischen Liposomen hinzu (Felgner, P. L. et al. (1987), Proc. Natl. Acad. Sci USA 84, 7413). Kommerziell erhältliche kationische Lipidformulierungen sind beispielsweise Tfx 50 (Promega) oder Lipofectamin2000 (Life Technologies).
Deshalb betrifft die Erfindung auch eine pharmazeutische Zusammensetzung, welche als Wirkstoff wenigstens ein doppelsträngiges RNA-Molekül, wie es vorausgehend beschrieben ist, und einen pharmazeutischen Träger enthält. Die Zusammensetzung kann für diagnostische und für therapeutische Anwendungen in der Humanmedizin oder der Veterinärmedizin verwendet werden.
Für diagnostische oder therapeutische Anwendungen kann die Zusammensetzung in Form einer Lösung vorliegen, z.B. einer injizierbaren Lösung, einer Creme, einer Salbe, einer Tablette, einer Suspension oder dergleichen. Die Zusammensetzung kann auf beliebige Art und Weise verabreicht werden, z.B. durch Injektion, orale, topische, nasale, rektale Applikation etc. Der Träger kann ein beliebiger geeigneter pharmazeutischer Träger sein. Vorzugsweise wird ein Träger verwendet, welcher die Effizienz der RNA-Moleküle, in die Zielzellen einzutreten, erhöhen kann. Geeignete Beispiele für derartige Träger sind Liposome, insbesondere kationische Liposome. Ein weiteres bevorzugtes Verabreichungsverfahren ist Injektion.
Eine weitere bevorzugte Anwendung des RNAi-Verfahrens ist eine funktionale Analyse eukaryotischer Zellen oder eukaryotischer nicht-humaner Organismen, vorzugsweise von Säugerzellen oder Säugerorganismen und am stärksten bevorzugt humanen Zellen, z.B. Zelllinien, wie beispielsweise HeLa oder 293 oder Nager, wie beispielsweise Ratten und Mäuse. Durch Transfektion mit geeigneten doppelsträngigen RNA-Molekülen, welche zu einem vorbestimmten Zielgen homolog sind oder mit DNA-Molekülen, welche ein geeignetes doppelsträngiges RNA-Molekül kodieren, kann ein spezifischer Knock-Out-Phänotyp in einer Zielzelle erhalten werden, z.B. in Zellkultur oder in einem Zielorganismus. Überraschenderweise wurde herausgefunden, dass das Vorliegen von kurzen doppelsträngigen RNA-Molekülen nicht zu einer Interferonreaktion der Wirtszelle oder des Wirtsorganismus führt.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist deshalb eine eukaryotische Zelle oder ein eukaryotischer nicht-humaner Organismus, welcher mit einem RNA-Molekül der Erfindung oder einem DNA-Molekül, welches das RNA-Molekül kodiert, transfiziert ist. Es sollte erwähnt werden, dass die vorliegende Erfindung aufgrund der Spezifität von RNAi ein zielspezifisches Knock-Out von mehreren verschiedenen endogenen Genen ermöglicht.
Die vorliegende Erfindung wird ferner durch die folgenden Figuren und Beispiele ausführlich erklärt.
Legenden der Figuren
1: Doppelsträngige RNA mit nicht mehr als 38 bp kann RNAi vermitteln.

(A) Graphische Darstellung von dsRNAs, welche zum Targeting von Pp-luc mRNA verwendet wurden. Es wurden drei Serien von dsRNAs mit glatten Enden hergestellt, welche einen Bereich von 29 bis 504 bp abdeckten. Die Position des ersten Nukleotids des Sense-Strangs der dsRNA ist relativ zum Startkodon von Pp-luc mRNA (p1) gezeigt.
(B) RNA-Interferenzassay (Tuschl et al., 1999). Die Verhältnisse von Ziel-Pp-luc- zu Kontroll-Rr-luc-Aktivität wurden hinsichtlich einer Pufferkontrolle normalisiert (schwarzer Balken). DsRNAs (5 nM) wurden in Drosophila-Lysat für 15 Min bei 25°C vor der Zugabe von mit einer 7-Methylguanosin-Kappe versehenen Pp-luc- und Rr-luc-mRNAs (~50 pM) vorinkubiert. Die Inkubation wurde für eine weitere Stunde fortgesetzt und anschließend durch den Dual-Luciferaseassay analysiert (Promega). Die Daten stellen den Durchschnitt aus wenigstens vier unabhängigen Experimenten ± Standardabweichung dar.

2: Eine 29 pb dsRNA wird nicht mehr zu 21-23-nt Fragmenten prozessiert. Zeitverlauf von 21-23-mer Bildung durch Prozessierung von intern ³²P-markierten dsRNAs (5 nM) im Drosophila-Lysat. Die Länge und die Quelle der dsRNA sind angegeben. Ein RNA-Größenmarker (M) wurde auf der linken Spur aufgetragen und es sind die Fragmentgrößen angegeben. Doppelbanden zum Zeitpunkt Null liegen aufgrund unvollständig denaturierter dsRNA vor.
3: Kurze dsRNAs spalten das mRNA-Ziel nur einmal.

(A) Denaturierende Gelelektrophorese der stabilen 5'-Spaltungsprodukte, welche erzeugt wurden durch 1 Stunde Inkubation von 10 nM Sense- oder Antisense-RNA, welche an der Kappe ³²P-markiert war, mit 10 nM dsRNAs der p133-Serie in Drosophila-Lysat. Die Längenmarker wurden durch partiellen Nuklease-T1-Verdau und partielle alkalische Hydrolyse (OH) der Kappen-markierten Ziel-RNA erzeugt. Die Regionen, welche durch die dsRNAs als Ziel gesetzt wurden, sind auf beiden Seiten als schwarze Balken gezeigt. Der 20-23 nt Abstand zwischen den vorwiegenden Spaltungsstellen für die 111 bp lange dsRNA ist gezeigt. Der horizontale Pfeil zeigt unspezifische Spaltung an, welche nicht auf RNAi zurückzuführen ist.
(B) Position der Spaltungsstellen auf Sense- und Antisense-Ziel-RNAs. Die Sequenzen der mit einer Kappe versehenen 177-nt Sense- und 180-nt Antisense-Ziel-RNAs sind in antiparalleler Orientierung so dargestellt, dass komplementäre Sequenzen einander gegenüberliegen. Die Regionen, welche durch die verschiedenen dsRNAs als Ziel gesetzt werden, sind durch verschieden gefärbte Balken angezeigt, die zwischen den Sense- und Antisense-Zielsequenzen positioniert sind. Spaltungsstellen sind durch Kreise angezeigt: große Kreise für starke Spaltung, kleine Kreise für schwache Spaltung. Die ³²P-radiomarkierte Phosphatgruppe ist mit einem Sternchen gekennzeichnet.

4: 21- und 22-nt RNA-Fragmente werden durch einen RNase III-artigen Mechanismus erzeugt.

(A) Sequenzen von ~21-nt RNAs nach dsRNA-Prozessierung. Die ~21-nt RNA-Fragmente, welche durch dsRNA-Prozessierung erzeugt wurden, wurden gerichtet kloniert und sequenziert. Oligoribonukleotide, welche vom Sense-Strang der dsRNA stammen, sind als blaue Linien angezeigt, solche, welche vom Antisense-Strang stammen, als rote Linien. Dicke Balken werden verwendet, wenn die gleiche Sequenz in mehreren Klonen vorlag, wobei die Zahl rechts die Häufigkeit angibt. Die Ziel-RNA-Spaltungsstellen, welche durch die dsRNA vermittelt werden, sind als orange Kreise gezeigt, wobei große Kreise für starke Spaltung, kleine Kreise für schwache Spaltung stehen (siehe 3B). Kreise am oberen Ende des Sense-Strangs zeigen Spaltungsstellen innerhalb des Sense-Ziels und Kreise am unteren Ende der dsRNA zeigen Spaltungsstellen im Antisense-Ziel. Es wurden bis zu fünf zusätzliche Nukleotide in ~21-nt Fragmenten identifiziert, welche von den 3'-Enden der dsRNA abgeleitet waren. Diese Nukleotide sind Zufallskombinationen aus überwiegend C-, G- oder A-Resten und wurden höchstwahrscheinlich während der T7-Transkription, der die dsRNA-bildenden Stränge ohne Verwendung einer Matrize hinzugefügt.
(B) Zwei-dimensionale TLC-Analyse der Nukleotidzusammensetzung von ~21-nt RNAs. Die ~21-nt RNAs wurden erzeugt durch Inkubation von intern radiomarkierter 504 bp Pp-luc-dsRNA in Drosophila-Lysat, gelgereinigt und anschließend mit Nuklease D1 (obere Reihe) oder Ribonuklease T2 (untere Reihe) zu Mononukleotiden verdaut. Die dsRNA wurde intern radiomarkiert durch Transkription in Gegenwart von einem der angegebenen α-³²P- Nukleosidtriphosphate. Die Radioaktivität wurde durch Phosphorimaging detektiert. Nukleosid-5'-Monophosphate, Nukleosid-3'-Monophosphate, Nukleosid-5',3'-Diphosphate und anorganisches Phosphat sind angegeben als pN, Np, pNp bzw. p_i. Schwarze Kreise zeigen UV-absorbierende Stellen von nicht-radioaktiven Trägernukleotiden. Die 3',5'-bis-Phosphate (rote Kreise) wurden durch Comigration mit radiomarkierten Standards identifiziert, welche hergestellt wurden durch 5'-Phosphorylierung von Nukleosid-3'-monophosphaten mit T4-Polynukleotidkinase und γ-³²P-ATP.

5: Synthetische 21- und 22-nt RNAs vermitteln Ziel-RNA-Spaltung.

(A) Graphische Darstellung von 52 bp dsRNA-Kontrolle und synthetischen 21- und 22-nt dsRNAs. Der Sense-Strang von 21- und 22-nt kurzen interferierenden RNAs (siRNAs) ist blau gezeigt, der Antisense-Strang in Rot. Die Sequenzen der siRNAs wurden aus den klonierten Fragmenten von 52 und 111 bp dsRNAs (4A) abgeleitet, mit Ausnahme des 22-nt Antisense-Strangs von Duplex 5. Die siRNAs in Duplex 6 und 7 waren auf die 111 bp dsRNA-Prozessierungsreaktion beschränkt. Die zwei 3'-überhängenden Nukleotide, welche in Grün gezeigt sind, liegen in der Sequenz des synthetischen Antisense-Strangs der Duplexe 1 und 3 vor. Beide Stränge der 52 bp dsRNA-Kontrolle wurden durch in vivo-Transkription hergestellt und eine Fraktion von Transkripten kann eine 3'-Nukleotidaddition ohne Verwendung einer Matrize enthalten. Die Ziel-RNA-Spaltungsstellen, welche durch die siRNA-Duplexe gelenkt werden, sind als orange Kreise gezeigt (siehe Legende von 4A) und wurden wie in 5B bestimmt.
(B) Position der Spaltungsstellen auf Sense- und Antisense-Ziel-RNAs. Die Ziel-RNA-Sequenzen sind wie in 3B beschrieben. 52 bp dsRNA-Kontrolle (10 nM) oder 21- und 22-nt RNA-Duplexe 1-7 (100 nM) wurden mit Ziel-RNA für 2,5 Stunden bei 25°C in Drosophila-Lysat inkubiert. Die stabilen 5'-Spaltungsprodukte wurden auf dem Gel aufgetrennt. Die Spaltungsstellen sind in 5A gezeigt. Der Bereich, welcher durch die 52 bp dsRNA als Ziel gesetzt wurde oder die Sense(s)- oder Antisense(as)-Stränge sind durch die schwarzen Balken auf der Seite des Gels gezeigt. Die Spaltungsstellen sind alle innerhalb der Region mit Identität der dsRNAs lokalisiert. Für eine genaue Bestimmung der Spaltungsstellen des Antisense-Strangs wurde ein niederprozentiges Gel verwendet.

6: Lange 3'-Überhänge an kurzen dsRNAs hemmen RNAi.

(A) Graphische Darstellung von 52 bp dsRNA-Konstrukten. Die 3'-Verlängerungen von Sense- und Antisense-Strängen sind in Blau bzw. Rot gezeigt. Die beobachteten Spaltungsstellen auf den Ziel-RNAs sind in Analogie zu 4A als orange Kreise dargestellt und wurden wie in 6B gezeigt bestimmt.
(B) Position der Spaltungsstellen auf Sense- und Antisense-Ziel-RNAs. Die Ziel-RNA-Sequenzen sind wie in 3B beschrieben. DsRNA (10 nM) wurde mit Ziel-RNA für 2,5 Stunden bei 25°C in Drosophila-Lysat inkubiert. Die stabilen 5'-Spaltungsprodukte wurden auf dem Gel aufgetrennt. Die Hauptspaltungsstellen sind mit einem horizontalen Pfeil gekennzeichnet und sind auch in 6A dargestellt. Die Region, welche durch die 52 bp dsRNA als Ziel gesetzt wurde, ist auf beiden Seiten des Gels als schwarzer Balken dargestellt.

7: Für RNAi vorgeschlagenes Modell.
Es wird vorhergesagt, dass RNAi mit der Prozessierung von dsRNA (Sense-Strang in Schwarz, Antisense-Strang in Rot) zu überwiegend 21- und 22-nt kurzen interferierenden RNAs (siRNAs) beginnt. Kurze überhängende 3'-Nukleotide, falls sie an der dsRNA vorliegen, können für eine Prozessierung kurzer dsRNAs günstig sein. Die dsRNA-prozessierenden Proteine, welche noch zu charakterisieren sind, werden als grüne und blaue Ovale dargestellt und sind an der dsRNA in asymmetrischer Art und Weise zusammengesetzt. In unserem Modell wird dies durch Binden eines hypothetischen blauen Proteins oder einer Proteindomäne mit dem siRNA-Strang in 3'- zu 5'-Richtung gezeigt, während das hypothetische grüne Protein oder die Proteindomäne immer an den gegenüberliegenden siRNA-Strang gebunden ist. Diese Proteine oder ein Teil davon bleiben mit der siRNA-Duplex assoziiert und erhalten eine Orientierung, wie bestimmt durch die Richtung der dsRNA-Prozessierungsreaktion. Nur die siRNA-Sequenz, welche mit dem blauen Protein assoziiert ist, kann die Ziel-RNA-Spaltung leiten. Der Endonukleasekomplex wird als kleiner interferierender Ribonukleoproteinkomplex oder siRNP bezeichnet. Es wird hier angenommen, dass die Endonuklease, welche die dsRNA spaltet, auch die Ziel-RNA spalten kann, wahrscheinlich durch vorübergehendes Verdrängen des passiven siRNA-Strangs, welcher nicht zur Zielerkennung verwendet wird. Die Ziel-RNA wird anschließend in der Mitte der Region gespalten, welche durch die sequenz-komplementäre Guide-siRNA erkannt wird.
8: Reporterkonstrukte und siRNA-Duplexe.

(a) Es sind die Glühwürmchen-(Pp-luc)- und Seeanemone-(Rr-luc)-Luciferasereportergenbereiche der Plasmide pGL2-Control, pGL-3-Control und pRL-TK (Promega) gezeigt. SV40 regulatorische Elemente, der HSV-Thymidinkinasepromotor und zwei Introns (Linien) sind gezeigt. Die Sequenz von GL3-Luciferase ist zu 95% identisch zu GL2, aber RL steht in keinerlei Bezug zu beiden. Die Luciferase-Expression von pGL2 ist in transfizierten Säugerzellen etwa 10-fach niedriger als die von pGL3. Die von den siRNA-Duplexen als Ziel gesetzte Region ist als schwarzer Balken unter der kodierenden Region der Luciferasegene gezeigt. (b) Die Sense-(oben) und Antisense-(unten)Sequenzen der siRNA-Duplexe, welche GL2-, GL3- und RL-Luciferase als Ziel setzen, sind gezeigt. Die GL2- und GL3-siRNA-Duplexe unterscheiden sich nur durch 3 Einzelnukleotidsubstitutionen (umgeben von einem grauen Rechteck). Als unspezifische Kontrolle wurde eine Duplex mit der invertierten GL2-Sequenz, invGL2, synthetisiert. Der 2-nt 3'-Überhang von 2'-Deoxythymidin ist als TT angegeben; uGL2 ist zu GL2 siRNA ähnlich, enthält aber Ribo-Uridin 3'-Überhänge.

9: RNA-Interferenz durch siRNA-Duplexe.
Die Verhältnisse von Zielkontrollluciferase wurden hinsichtlich einer Pufferkontrolle (bu, schwarze Balken) normalisiert; graue Balken zeigen die Verhältnisse von Photinus pyralis (Pp-luc) GL2- oder GL3-Luciferase zu Renilla reniformis (Rr-luc) RL-Luciferase (linke Achse) an, weiße Balken zeigen RL zu GL2- oder GL3-Verhältnisse an (rechte Achse). Die Panele a, c, e, g und i beschreiben Experimente, welche mit der Kombination von pGL2-Control und pRL-TK-Reporterplasmiden durchgeführt wurden, die Panele b, d, f, h und j mit pGL3-Control und pRL-TK-Reporterplasmiden. Die Zelllinie, welche für das Interferenzexperiment verwendet wurde, ist am oberen Ende eines jeden Plots angegeben. Die Verhältnisse von Pp-luc/Rr-luc für die Pufferkontrolle (bu) variierten vor der Normalisierung und zwischen den verschiedenen untersuchten Zelllinien zwischen 0,5 und 10 für pGL2/pRL bzw. zwischen 0,03 und 1 für pGL3/pRL. Die aufgetragenen Daten wurden aus drei unabhängigen Experimenten ± S.D. gemittelt.
10: Effekte von 21-nt siRNA, 50 bp und 500 bp dsRNAs auf Luciferaseexpression in HeLa-Zellen.
Die genaue Länge von langen dsRNAs ist unterhalb der Balken angegeben. Die Panele a, c und e beschreiben Experimente, welche mit pGL2-Control und pRL-TK-Reporterplasmiden geführt wurden, die Panele b, d und f mit pGL3-Control und pRL-TK-Reporterplasmiden. Die Daten wurden aus zwei unabhängigen Experimenten ± S.D. gemittelt. (a), (b) Absolute Pp-luc-Expression, aufgetragen in frei gewählten Lumineszenzeinheiten. (c), (d) Rr-luc-Expression, aufgetragen in frei gewählten Lumineszenzeinheiten. (e), (f) Verhältnisse von normalisierter Ziel-zu-Kontrollluciferase. Die Verhältnisse der Luciferaseaktivität für siRNA-Duplexe wurden hinsichtlich einer Pufferkontrolle (bu, schwarze Balken) normalisiert; die Lumineszenzverhältnisse für 50 oder 500 bp dsRNAs wurden hinsichtlich der entsprechenden Verhältnisse, welche für 50 und 500 bp dsRNA von humanisiertem GFP (hG, schwarze Balken) beobachtet wurden, normalisiert. Es sollte erwähnt werden, dass die Gesamtunterschiede hinsichtlich der Sequenzen zwischen den 49 und 484 bp dsRNAs, welche GL2 und GL3 als Ziel setzen, nicht ausreichend sind, um Spezifität zwischen GL2- und GL3-Zielen zu verleihen (43 nt ununterbrochene Identität im 49 bp Segment, 239 nt längste ununterbrochene Identität im 484 bp Segment).
11: Variation des 3'-Überhangs von Duplexen von 21 nt siRNAs.

(A) Entwurf der experimentellen Strategie. Es ist die mit einer Kappe versehene und polyadenylierte Sense-Ziel-mRNA dargestellt und es sind die relativen Positionen der Sense- und Antisense-siRNAs gezeigt. Es wurden acht Duplex-Serien entsprechend den acht verschiedenen Antisense-Strängen hergestellt. Die siRNA-Sequenzen und die Zahl der überhängenden Nukleotide wurden in 1 nt Schritten verändert.
(B) Normalisierte relative Lumineszenz von Zielluciferase (Photinus pyralis, Pp-luc) gegenüber Kontrollluciferase (Renilla reniformis, Rr-luc) in D. melanogaster- Embryolysat in Gegenwart von 5 nM dsRNAs mit glatten Enden. Die in Gegenwart von dsRNA bestimmten Lumineszenzverhältnisse wurden hinsichtlich eines Verhältnisses normalisiert, welches für eine Pufferkontrolle erhalten wurde (bu, schwarzer Balken). Normalisierte Verhältnisse von weniger als 1 zeigen spezifische Interferenz an.
(C-J) Normalisierte Interferenzverhältnisse für acht Serien von 21-nt siRNA-Duplexen. Die Sequenzen von siRNA-Duplexen sind über den Balkengraphen dargestellt. Jedes Panel zeigt das Interferenzverhältnis für einen Satz von Duplexen, der mit einer gegebenen Antisense-Guide-siRNA und 5 verschiedenen Sense-siRNAs gebildet wurde. Die Zahl an überhängenden Nukleotiden (3'-Überhang, positive Zahlen; 5'-Überhänge, negative Zahlen) ist auf der X-Achse angegeben. Die Datenpunkte wurden aus wenigstens 3 unabhängigen Experimenten gemittelt, Fehlerbalken zeigen die Standardabweichungen an.

12: Variation der Länge des Sense-Strangs von siRNA-Duplexen.

(A) Graphische Darstellung des Experiments. Drei 21-nt Antisense-Stränge wurden mit acht Sense-siRNAs gepaart. Die siRNAs wurden hinsichtlich ihrer Länge am 3'-Ende verändert. Der 3'-Überhang der Antisense-siRNA war 1-nt (B), 2-nt (C) oder 3-nt (D), während der Sense-siRNA-Überhang für jede Serie variiert wurde. Es sind die Sequenzen der siRNA-Duplexe und die entsprechenden Interferenzverhältnisse angegeben.

13: Variation der Länge von siRNA-Duplexen mit konservierten 2-nt 3'-Überhängen.

(A) Graphische Darstellung des Experiments. Die 21-nt siRNA-Duplex ist identisch zu der Sequenz, welche in 11H oder 12C gezeigt ist. Die siRNA-Duplexe werden an der 3'-Seite der Sense-siRNA (B) oder der 5'-Seite der Sense-siRNA (C) verlängert. Es sind die siRNA-Duplexsequenzen und die entsprechenden Interferenzverhältnisse angegeben.

14: Substitution der 2'-Hydroxylgruppen der siRNA-Ribosereste.
Die 2'-Hydroxylgruppen (OH) in den Strängen der siRNA-Duplexe wurden ersetzt durch 2'-Deoxy (d) oder 2'-O-Methyl (Me). 2-nt- und 4-nt 2'-Deoxy-Substitutionen an den 3'-Enden sind als 2-nt d bzw. 4-nt d angegeben. Uridinreste wurden durch 2'-Deoxythymidin ersetzt.
15: Kartierung von Sense- und Antisense-Ziel-RNA-Spaltung durch 21-nt siRNA-Duplexe mit 2-nt 3'-Überhängen.

(A) Graphische Darstellung von Sense- und Antisense-Ziel-RNAs mit 32P (Sternchen)-markierter Kappe und siRNA-Duplexen. Die Position von Sense- und Antisense-Ziel-RNA-Spaltung ist durch Dreiecke oberhalb bzw. unterhalb der siRNA-Duplexe angegeben.
(B) Kartierung von Ziel-RNA-Spaltungsstellen. Nach 2 Stunden Inkubation von 10 nM Ziel mit 100 nM siRNA-Duplex in D. Melanogaster-Embryolysat wurden das mit einer 5'-Kappe markierte Substrat und die 5'-Spaltungsprodukte auf Sequenzierungsgelen aufgetrennt. Längenmarker wurden durch partiellen RNase T1-Verdau (T1) und partielle alkalische Hydrolyse (OH-) der Ziel-RNAs erzeugt. Die dicken Linien links der Abbildungen zeigen die Region, welche durch die siRNA-Stränge 1 und 5 mit der gleichen Orientierung wie das Ziel abgedeckt ist.

16: Das 5'-Ende einer Guide-siRNA definiert die Position von Ziel-RNA-Spaltung.

(A, B) Graphische Darstellung der experimentellen Strategie. Die Antisense-siRNA war in allen siRNA-Duplexen die gleiche, aber der Sense-Strang wurde zwischen 18 bis 25 nt durch Verändern des 3'-Endes (A) oder zwischen 18 bis 23 nt durch Verändern des 5'-Endes variiert (B). Die Position von Sense- und Antisense-Ziel-RNA-Spaltung ist angezeigt durch Dreiecke oberhalb bzw. unterhalb der siRNA-Duplexe.
(C, D) Analyse von Ziel-RNA-Spaltung unter Verwendung von Sense-(oberes Panel) oder Antisense-(unteres Panel)Ziel-RNAs mit markierter Kappe. Es sind nur die 5'-Spaltungsprodukte mit markierter Kappe gezeigt. Es sind die Sequenzen der siRNA-Duplexe gezeigt und die Länge der Sense-siRNA-Stränge ist am oberen Ende des Panels angegeben. Die Kontrollspur, welche in Panel (C) mit einem Gedankenstrich gekennzeichnet ist, zeigt Ziel-RNA, welche ohne siRNAs inkubiert wurde. Die Marker waren wie in 15 beschrieben. Die Pfeile in (D), unteres Panel, zeigen die Ziel-RNA-Spaltungsstellen, welche sich um 1 nt unterscheiden.

17: Sequenzvariation des 3'-Überhangs von siRNA-Duplexen.
Der 2-nt 3'-Überhang (NN, in Grau) wurde hinsichtlich der Sequenz und Zusammensetzung wie angegeben verändert (T, 2'-Deoxythymidin, dG, 2'-Deoxyguanosin; Sternchen, Wildtyp-siRNA-Duplex). Es wurden normalisierte Interferenzverhältnisse wie in 11 beschrieben bestimmt. Die Wildtyp-Sequenz ist die gleiche Sequenz wie die in 14 dargestellte.
18: Sequenzspezifität von Zielerkennung.
Es sind die Sequenzen fehlgepaarter siRNA-Duplexe gezeigt, wobei modifizierte Sequenzsegmente oder modifizierte Einzelnukleotide grau unterlegt sind. Die Referenzduplex (ref) und die siRNA-Duplexe 1 bis 7 enthalten 2'-Deoxythymidin 2-nt Überhänge. Die Inaktivierungseffizienz der Thymidin-modifizierten Referenzduplex war mit der der Wildtyp-Sequenz vergleichbar (17). Normalisierte Interferenzverhältnisse wurden wie in 11 beschrieben bestimmt.
19: Variation der Länge von siRNA-Duplexen mit konservierten 2-nt 3'-Überhängen.
Die siRNA-Duplexe wurden an der 3'-Seite der Sense-siRNA (A) oder der 5'-Seite der Sense-siRNA (B) verlängert. Die siRNA-Duplexsequenzen und die entsprechenden Interferenzverhältnisse sind angegeben. Für HeLa SS6-Zellen wurden siRNA-Duplexe (0,84 μg), welche GL2-Luciferase als Ziel setzen, zusammen mit pGL2-Control und pRL-TK-Plasmiden transfiziert. Zum Vergleich sind die in vitro-RNAi-Aktivitäten von siRNA-Duplexen, welche in D. melanogaster-Lysat untersucht wurden, gezeigt.
Beispiel 1
RNA-Interferenz vermittelt durch kleine synthetische RNAs
1.1. Experimentelle Arbeitsverfahren
1.1.1 In vitro-RNAi
Die Herstellung von in vitro-RNAi- und Lysatpräparationen wurde wie kürzlich beschrieben durchgeführt (Tuschl et al., 1999; Zamore et al., 2000). Für eine optimale ATP-Regeneration ist es entscheidend, frisch gelöste Kreatinkinase (Roche) zu verwenden. Die RNAi-Translationsassays (1) wurden durchgeführt mit dsRNA-Konzentrationen von 5 nM und einem verlängerten Vorinkubationszeitraum von 15 Min bei 25°C vor der Zugabe von in vitro-transkribierten, mit einer Kappe versehenen und polyadenylierten Pp-luc- und Rr-luc-Reporter-mRNAs. Die Inkubation wurde für 1 Stunde fortgeführt und die relative Menge an Pp-luc- und Rr-luc-Protein wurde unter Verwendung des Dual-Luciferaseassays (Promega) und eines Moonlight 3010C-Luminometers (PharMingen) analysiert.
1.1.2 RNA-Synthese
Es wurden Standardarbeitsverfahren zur in vitro-Transkription von RNA von PCR-Matrizen, welche T7- oder SP6-Promotorsequenzen tragen, verwendet, siehe beispielsweise (Tuschl et al., 1998). Synthetische RNA wurde unter Verwendung von Expedite RNA-Phosphoramiditen (Proligo) hergestellt. Das 3'-Adapter-Oligonukleotid wurde synthetisiert unter Verwendung von Dimethoxytrityl-1,4-benzendimethanol-succinyl-aminopropyl-CPG. Die Oligoribonukleotide wurden in 3 ml 32% Ammoniak/Ethanol (3/1) für 4 h bei 55°C (Expedite RNA) oder 16 h bei 55°C (3'- und 5'-Adapter-DNA/RNA-chimäre Oligonukleotide) entschützt und anschließend desilyliert und gelgereinigt, wie kürzlich beschrieben (Tuschl et al., 1993). RNA-Transkripte für dsRNA-Präparation umfassend lange 3'-Überhänge wurden aus PCR-Matrizen erzeugt, welche einen T7-Promotor in Sense-Richtung und einen SP6-Promotor in Antisense-Richtung enthielten. Die Transkriptionsmatrize für Sense- und Antisense-Ziel-RNA wurde PCR-amplifiziert mit GCGTAATACGACTCACTATAGAACAATTGCTTTTACAG (unterstrichen, T7-Promotor) als 5'-Primer und ATTTAGGTGACACTATAGGCATAAAGAATTGAAGA (unterstrichen, SP6-Promotor) als 3'-Primer und dem linearisierten Pp-luc-Plasmid (pGEM-luc-Sequenz) (Tuschl et al., 1999) als Matrize; die T7-transkribierte Sense-RNA war 177 nt lang mit der Pp-luc-Sequenz zwischen Pos. 113-273 relativ zum Startkodon und anschließenden 17 nt des Komplements der SP6-Promotorsequenz am 3'-Ende. Transkripte zur Bildung von dsRNA mit glattem Ende wurden hergestellt durch Transkription von zwei verschiedenen PCR-Produkten, welche nur eine einzelne Promotorsequenz enthielten.
DsRNA-Anlagerung (annealing) wurde unter Verwendung einer Phenol/Chloroformextraktion durchgeführt. Es wurde eine äquimolare Konzentration an Sense- und Antisense-RNA (50 nM bis 10 μM, in Abhängigkeit von der Länge und der zur Verfügung stehenden Menge) in 0,3 M NaOAc (pH 6) für 30 s bei 90°C inkubiert und anschließend bei Raumtemperatur mit einem gleichen Volumen Phenol/Chloroform extrahiert, wobei sich eine Chloroform-Extraktion anschloss, um restliches Phenol zu entfernen. Die sich ergebende dsRNA wurde durch Zugabe von 2,5-3 Volumen Ethanol präzipitiert. Das Pellet wurde in Lysepuffer (100 mM KCl, 30 mM HEPES-KOH, pH 7,4, 2 mM Mg(OAc)₂) gelöst und die Menge der dsRNA wurde durch Standard-Agarosegelelektrophorese in 1 X TAE-Puffer überprüft. Die 52 bp dsRNAs mit den 17 nt und 20 nt 3'-Überhängen (6) wurden angelagert durch Inkubation für 1 Min bei 95°C, anschließend schnell auf 70°C abgekühlt mit nachfolgendem langsamen Abkühlen auf Raumtemperatur über einen 3 h-Zeitraum (50 μl Anlagerungsreaktion, 1 μM Strangkonzentration, 300 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 7,5). Die dsRNAs wurden anschließend Phenol/Chloroform extrahiert, Ethanol-präzipitiert und in Lysepuffer gelöst.
Die Transkription von intern ³²P-radiomarkierter RNA, welche zur dsRNA-Präparation verwendet wurde (2 und 4), wurde unter Verwendung von 1 mM ATP, CTP, GTP, 0,1 oder 0,2 mM UTP und 0,2-0,3 μM-³²P-UTP (3000 Ci/mmol) durchgeführt oder dem entsprechenden Verhältnis für andere radiomarkierte Nukleosidtriphosphate als UTP. Die Markierung der Kappe für die Ziel-RNAs wurde wie vorher beschrieben durchgeführt. Die Ziel-RNAs wurden nach der Kappen-Markierung gelgereinigt.
1.1.3 Kartierung von Spaltungsstellen
Es wurden Standard-RNAi-Reaktionen durch Vorinkubation von 10 nM dsRNA für 15 Min durchgeführt, wobei sich Zugabe von 10 nM Ziel-RNA mit markierter Kappe anschloss. Die Reaktion wurde nach weiteren 2 h (2A) oder 2,5 h Inkubation (5B und 6B) durch Proteinase K-Behandlung gestoppt (Tuschl et al., 1999). Die Proben wurden anschließend auf 8 oder 10 Sequenzierungsgelen analysiert. Die 21 und 22 nt synthetischen RNA-Duplexe wurden bei 100 nM Endkonzentration verwendet (5B).
1.1.4 Klonierung von ~21 nt RNAs
Die 21 nt RNAs wurden erzeugt durch Inkubation von radiomarkierter dsRNA in Drosophila-Lysat in Abwesenheit von Ziel-RNA (200 μl Reaktion, 1 h Inkubation, 50 nM dsP111, oder 100 nM dsP52 oder dsP39). Das Reaktionsgemisch wurde anschließend mit Proteinase K behandelt (Tuschl et al., 1999) und die dsRNA-Prozessierungsprodukte wurden auf einem denaturierendem 15% Polyacrylamidgel getrennt. Eine Bande umfassend einen Größenbereich von wenigstens 18 bis 24 nt wurde ausgeschnitten, über Nacht in 0,3 M NaCl bei 4°C und in silanisierten Röhrchen eluiert. Die RNA wurde durch Ethanol-Präzipitation gewonnen und dephosphoryliert (30 μl Reaktion, 30 Min, 50°C, 10 U alkalische Phosphatase, Roche). Die Reaktion wurde durch Phenol/Chloroformextraktion gestoppt und die RNA wurde Ethanol-präzipitiert. Das 3'-Adapter-Oligonukleotid (pUUUaaccgcatccttctcx: Großschrift, RNA; Kleinschrift, DNA; p, Phosphat; x, 4-Hydroxymethylbenzyl) wurde anschließend an die dephosphorylierte ~21 nt RNA ligiert (20 μl Reaktion, 30 Min, 37°C, 5 μm 3'-Adapter, 50 mM Tris-HCl, pH 7,6, 10 mM MgCl₂, 0,2 mM ATP, 0,1 mg/ml acetyliertes BSA, 15% DMSO, 25 U T4-RNA-Ligase, Amersham-Pharmacia) (Pan und Uhlenbeck, 1992). Die Ligationsreaktion wurde gestoppt durch Zugabe eines gleichen Volumens von 8 M Harnstoff/50 mM EDTA-Stoppgemisch und direkt auf ein 15%-Gel aufgeladen. Die Ligationsausbeuten waren größer als 50%. Das Ligationsprodukt wurde vom Gel zurückgewonnen und 5'-phosphoryliert (20 μl Reaktion, 30 Min, 37°C, 2 mM ATP, 5 U T4-Polynukleotidkinase, NEB). Die Phosphorylierungsreaktion wurde gestoppt durch Phenol/Chloroformextraktion und die RNA wurde durch Ethanolpräzipitation gewonnen. Als nächstes wurde der 5'-Adapter (tactaatacgactcactAAA: Großschrift, RNA; Kleinschrift, DNA) an das phosphorylierte Ligationsprodukt wie oben beschrieben ligiert. Das neue Ligationsprodukt wurde gelgereinigt und aus dem Gelstück in Gegenwart von Primer zur reversen Transkription (GACTAGCTGGAATTCAAGGATGCGGTTAAA: dick gedruckt, Eco RI-Stelle), welcher als Träger verwendet wurde, eluiert. An die reverse Transkription (15 μl Reaktion, 30 Min, 42°C, 150 U Superscript II reverse Transkriptase, Life Technologies) schloss sich PCR an, wobei CAGCCAACGGAATTCATACGACTCACTAAA (dick gedruckt, Eco RI-Stelle) als 5'-Primer und der 3'-Primer-RT verwendet wurde. Das PCR-Produkt wurde durch Phenol/Chloroformextraktion gereinigt und Ethanol-präzipitiert. Das PCR-Produkt wurde anschließend mit Eco RI (NEB) verdaut und konkatamerisiert unter Verwendung von T4 DNA-Ligase (hohe Konz., NEB). Konkatamere mit einer Größe im Bereich von 200 bis 800 bp wurden auf einem niedrig-schmelzenden Agarosegel getrennt, durch ein Standardschmelz- und Phenolextraktionsarbeitsverfahren aus dem Gel gewonnen und Ethanol-präzipitiert. Die ungepaarten Enden wurden durch Inkubation mit Taq-Polymerase unter Standardbedingungen für 15 Min bei 72°C aufgefüllt und das DNA-Produkt wurde direkt in den pCR2.1-TOPO-Vektor ligiert, wobei der TOPO TA-Klonierungskit (Invitrogen) verwendet wurde. Kolonien wurden unter Verwendung von PCR- und M13-20 und M13 Revers-Sequenzierungsprimern durchmustert. Die PCR-Produkte wurden direkt zur kundenspezifischen Sequenzierung eingereicht (Sequence Laboratories Göttingen GmbH, Deutschland). Durchschnittlich wurden vier bis fünf 21-mer Sequenzen pro Klon erhalten.
1.1.5 2D-TLC-Analyse
Nuklease P1-Verdau von radiomarkierten, gelgereinigten siRNAs und 2D-TLC wurden wie beschrieben durchgeführt (Zamore et al., 2000). Nuklease T2-Verdau wurde in 10 μl Reaktionen für 3 h bei 50°C in 10 mM Ammoniumacetat (pH 4,5) durchgeführt, wobei 2 μg/μl Träger tRNA und 30 U Ribonuklease T2 (Life Technologies) verwendet wurden. Die Wanderung von nicht-radioaktiven Standards wurde durch UV-Shadowing bestimmt. Die Identität von Nukleosid-3',5'-Diphosphaten wurde bestätigt durch Comigration der T2-Verdauungsprodukte mit Standards, welche hergestellt wurden durch 5'-³²P-Phosphorylierung von handelsüblichen Nukleosid-3'-Monophosphaten unter Verwendung von γ-32P-ATP und T4-Polynukleotidkinase (Daten nicht gezeigt).
1.2 Ergebnisse und Diskussion
1.2.1 Längenerfordernisse zur Prozessierung von dsRNA zu 21 und 22 nt RNA-Fragmenten
Lysat, welches aus synzytialen D. melanogaster Embryos hergestellt wurde, rekapituliert RNAi in vitro, wodurch ein neues Werkzeug zur biochemischen Analyse des RNAi-Mechanismus bereitgestellt wird (Tuschl et al., 1999; Zamore et al., 2000). In vitro- und in vivo-Analysen der Längenerfordernisse hinsichtlich der dsRNA für RNAi haben erkennen lassen, dass kurze dsRNA (< 150 bp) beim Abbau von Ziel-mRNA weniger effektiv sind als lange dsRNAs (Caplen et al., 2000; Hammond et al., 2000; Ngo et al., 1998); Tuschl et al., 1999). Die Gründe für die Erniedrigung der mRNA-Abbaueffizienz sind unbekannt. Wir untersuchten deshalb das genaue Längenerfordernis hinsichtlich dsRNA für Ziel-RNA-Abbau unter optimierten Bedingungen im Drosophila-Lysat (Zamore et al., 2000). Es wurden mehrere Serien dsRNAs synthetisiert und gegen Glühwürmchenluciferase (Pp-luc)-Reporter-RNA gerichtet. Die spezifische Suppression von Ziel-RNA-Expression wurde durch den Dual-Luciferaseassay verfolgt (Tuschl et al., 1999) (1A und 1B). Wir detektierten spezifische Hemmung von Ziel-RNA-Expression für dsRNAs mit nicht mehr als 38 bp, aber dsRNAs mit 29 bis 36 bp waren bei diesem Prozess nicht effektiv. Der Effekt war unabhängig von der Zielposition und der Grad der Hemmung von Pp-luc-mRNA-Expression korrelierte mit der Länge der dsRNA, d.h. lange dsRNAs waren effektiver als kurze dsRNAs.
Es wurde vorgeschlagen, dass die 21-23 nt RNA-Fragmente, welche durch die Prozessierung von dsRNAs erzeugt werden, Mediatoren von RNA-Interferenz und Cosuppression sind (Hamilton und Baulcombe, 1999; Hammond et al., 2000; Zamore et al., 2000). Wir analysierten deshalb die Rate der 21-23 nt Fragmentbildung für einen Teil der dsRNAs, deren Größe in einem Bereich zwischen 501 bis 29 bp lag. Die Bildung von 21-23 nt Fragmenten in Drosophila-Lysat (2) war leicht detektierbar für 39 bis 501 bp lange dsRNAs, war aber für die 29 bp dsRNA signifikant gehemmt. Diese Beobachtung ist konsistent mit einer Rolle von 21-23 nt Fragmenten bei der Steuerung von mRNA-Spaltung und stellt eine Erklärung für das Fehlen von RNAi durch 30 bp dsRNAs bereit. Es ist wahrscheinlich, dass die Längenabhängigkeit von 21-23-mer Bildung einen biologisch relevanten Kontrollmechanismus zur Vorbeugung einer unerwünschten Aktivierung von RNAi durch kurze intramolekulare basengepaarte Strukturen von regulären zellulären RNAs widerspiegelt.
1.2.2 39 bp dsRNA vermittelt zielspezifische RNA-Spaltung an einer einzigen Stelle
Die Zugabe von dsRNA und Ziel-RNA mit 5'-Kappe zu dem Drosophila-Lysat führt zu sequenzspezifischem Abbau der Ziel-RNA (Tuschl et al., 1999). Die Ziel-mRNA wird nur innerhalb der Region mit Identität mit der dsRNA gespalten und viele der Zielspaltungsstellen waren durch 21-23 nt getrennt (Zamore et al., 2000). Es wurde deshalb erwartet, dass die Zahl der Spaltungsstellen für eine gegebene dsRNA grob mit der Länge der dsRNA geteilt durch 21 korrespondiert. Wir kartierten die Zielspaltungsstellen auf einer Sense- und einer Antisense-Ziel-RNA, welche an der Kappe 5'-radiomarkiert war (Zamore et al., 2000) (3A und 3B). Stabile 5'-Spaltungsprodukte wurden auf einem Sequenzierungsgel getrennt und es wurde die Position der Spaltung durch Vergleich mit einer partiellen RNase T1 und einer alkalischen Hydrolyseleiter aus der Ziel-RNA bestimmt.
In Übereinstimmung mit der vorherigen Beobachtung (Zamore et al., 2000) waren alle Ziel-RNA-Spaltungsstellen innerhalb der Region mit Identität zu der dsRNA lokalisiert. Das Sense- oder das Antisense-Ziel wurde nur einmal durch 39 bp dsRNA gespalten. Jede Spaltungsstelle war 10 nt vom 5'-Ende der Region lokalisiert, welche durch die dsRNA abgedeckt war (3B). Die 52 bp dsRNA, welche mit der 39 bp dsRNA das gleiche 5'-Ende teilt, erzeugt die gleiche Spaltungsstelle auf dem Sense-Ziel, lokalisiert 10 nt vom 5'-Ende der Region mit Identität mit der dsRNA, sowie zusätzlich zwei schwächere Spaltungsstellen 23 und 24 nt stromaufwärts von der ersten Stelle. Das Antisense-Ziel wurde nur einmal gespalten, wiederum 10 nt vom 5'-Ende der Region, welche durch die entsprechende dsRNA abgedeckt wird. Eine Kartierung der Spaltungsstellen für die 38 bis 49 bp dsRNAs, welche in 1 gezeigt ist, zeigte, dass die erste und hauptsächliche Spaltungsstelle immer 7 bis 10 nt stromaufwärts der Region lokalisiert war, welche von der dsRNA abgedeckt wird (Daten nicht gezeigt). Dies legt nahe, dass der Punkt der Ziel-RNA-Spaltung bestimmt wird durch das Ende der dsRNA und könnte bedeuten, dass eine Prozessierung zu 21-23-meren von den Enden der Duplex her beginnt.
Spaltungsstellen auf dem Sense- und Antisense-Ziel für die längere 111 bp dsRNA waren sehr viel häufiger als erwartet und die meisten von ihnen traten gehäuft auf, wobei die Häufungen durch 20 bis 23 nt getrennt waren (3A und 3B). Wie bei den kürzeren dsRNAs ist die erste Spaltungsstelle auf dem Sense-Ziel 10 nt vom 5'-Ende der Region entfernt, welche von der dsRNA umfasst ist; und die erste Spaltungsstelle auf dem Antisense-Ziel ist 9 nt vom 5'-Ende der Region lokalisiert, welche von der dsRNA abgedeckt ist. Es ist unklar, was diese gestörte Spaltung verursacht, aber eine Möglichkeit könnte darin liegen, dass längere dsRNAs nicht nur von den Enden her prozessiert werden, sondern auch intern, oder dass es einige Spezifitätsdeterminanten für dsRNA-Prozessierung gibt, welche wir noch nicht verstanden haben. Einige Unregelmäßigkeiten hinsichtlich des 21-23 nt Abstands wurden auch zuvor beschrieben (Zamore et al., 2000). Um die molekulare Grundlage von dsRNA-Prozessierung und Ziel-RNA-Erkennung besser zu verstehen, beschlossen wir, die Sequenzen der 21-23 nt Fragmente zu analysieren, welche durch Prozessierung von 39, 52 und 111 bp dsRNAs im Drosophila-Lysat erzeugt worden waren.
1.2.3 dsRNA wird durch einen RNase III-artigen Mechanismus zu 21 und 22 nt RNAs prozessiert
Um die 21-23 nt RNA-Fragmente zu charakterisieren, untersuchten wir die 5'- und 3'-Termini der RNA-Fragmente. Periodatoxidation Gel-gereinigter 21-23 nt RNAs mit anschließender β-Eliminierung zeigte das Vorliegen von 2'- und 3'-Hydroxylgruppen. Die 21-23-mere sprachen auch auf alkalische Phosphatasebehandlung an, wodurch das Vorliegen einer 5'-terminalen Phosphatgruppe gezeigt wird. Das Vorliegen von 5'-Phosphat und 3'-Hydroxyltermini legt nahe, dass die dsRNA durch eine enzymatische Aktivität prozessiert werden könnte, welcher der von E. coli RNase III ähnlich ist (hinsichtlich Übersichtsartikeln siehe (Dunn, 1982; Nicholson, 1999; Robertson, 1990; Robertson, 1982)).
Es wurde eine gerichtete Klonierung der 21-23 nt RNA-Fragmente durchgeführt durch Ligation eines 3'- und 5'-Adapteroligonukleotids an die gereinigten 21-23-mere, wobei T4 RNA-Ligase verwendet wurde. Die Ligationsprodukte wurden revers transkribiert, PCR-amplifiziert, konkatamerisiert, kloniert und sequenziert. Es wurden über 220 kurze RNAs aus dsRNA-Prozessierungsreaktionen der 39, 52 und 111 bp dsRNAs sequenziert (4A). Wir fanden die folgende Längenverteilung: 1% 18 nt, 5% 19 nt, 12% 20 nt, 45% 21 nt, 28% 22 nt, 6% 23 nt und 2% 24 nt. Sequenzanalyse des 5'-terminalen Nukleotids der prozessierten Fragmente zeigte, dass Oligonukleotide mit einem 5'-Guanosin unterrepräsentiert waren. Diese Tendenz wurde höchstwahrscheinlich durch T4 RNA-Ligase eingeführt, welche 5'-phosphoryliertes Guanosin als Donoroligonukleotid benachteiligt; am 3'-Ende wurde keine signifikante Sequenztendenz festgestellt. Viele der ~21 nt Fragmente, welche von den 3'-Enden des Sense- oder Antisense-Stranges der Duplexe abgeleitet sind, umfassen 3'-Nukleotide, welche sich aus einer Matrizefreien Addition von Nukleotiden während der RNA-Synthese unter Verwendung von T7 RNA-Polymerase herleiten. Interessanterweise wurde auch eine signifikante Zahl endogener Drosophila ~21 nt RNAs kloniert, wobei einige von diesen aus LTR- und nicht-LTR-Retrotransposons stammen (Daten nicht gezeigt). Dies steht mit einer möglichen Rolle für RNAi bei der Transposoninaktivierung im Zusammenhang.
Die ~21 nt RNAs treten in gehäuften Gruppen auf (4A), welche die vollständigen dsRNA-Sequenzen abdecken. Offensichtlich schneidet die Prozessierungsreaktion die dsRNA durch Zurücklassen von versetzten 3'-Enden, wobei es sich um ein weiteres Kennzeichnen von RNase III-Spaltung handelt. Für die 39 bp dsRNA wurden zwei Häufungen von ~21 nt RNAs für jeden dsRNA-bildenden Strang gefunden, umfassend überhängende 3'-Enden, wobei jedoch nur eine Spaltungsstelle auf den Sense- und dem Antisense-Ziel detektiert wurde (3A und 3B). Wenn die ~21 nt Fragmente als einzelsträngige Guide-RNAs in einem Komplex vorliegen würden, welcher mRNA-Abbau vermittelt, könnte angenommen werden, dass wenigstens zwei Zielspaltungsstellen existieren, aber dies war nicht der Fall. Dies legt nahe, dass die ~21 nt RNAs im Endonukleasekomplex in einer doppelsträngigen Form vorliegen können, aber dass nur einer der Stränge zur Ziel-RNA-Erkennung und -spaltung verwendet werden kann. Die Verwendung von nur einem der ~21 nt Stränge zur Zielspaltung kann einfach bestimmt werden durch die Orientierung, in welcher der ~21 nt Duplex an den Nukleasekomplex gebunden ist. Diese Orientierung ist definiert durch die Richtung, in welcher die ursprüngliche dsRNA prozessiert wurde.
Die ~21-mer-Cluster für die 52 bp und 111 bp dsRNA sind im Vergleich zur 39 bp dsRNA weniger gut definiert. Die Cluster sind über Bereiche von 25 bis 30 nt verteilt, wobei dies höchstwahrscheinlich mehrere verschiedene Subpopulationen von ~21 nt Duplexen darstellt, und deshalb eine Steuerung von Zielspaltung an mehreren benachbarten Stellen. Diese Spaltungsregionen sind noch immer hauptsächlich durch 20 bis 23 nt Intervalle getrennt. Die Regeln, welche festlegen, wie regelmäßig dsRNA zu ~21 nt Fragmenten prozessiert werden kann, sind bis jetzt nicht verstanden, aber es wurde kürzlich beobachtet, dass der ungefähre 21-23 nt Abstand der Spaltungsstellen durch eine Serie von Uridinen abgeändert werden konnte (Zamore et al., 2000). Die Spezifität von dsRNA-Spaltung durch E. coli RNase III scheint hauptsächlich durch Antideterminanten kontrolliert zu werden, d.h. unter Ausnahme einiger spezifischer Basenpaare an gegebenen Positionen relativ zur Spaltungsstelle (Zhang und Nicholson, 1997).
Um zu untersuchen, ob Zucker-, Basen- oder Kappen-Modifikationen in den prozessierten ~21 nt RNA-Fragmenten vorlagen, inkubierten wir radiomarkierte 505 bp Pp-luc dsRNA in Lysat für 1 Stunde, isolierten die ~21 nt Produkte und verdauten sie mit P1- oder T2-Nuklease zu Mononukleotiden. Das Nukieotidgemisch wurde anschließend durch 2D-Dünnschichtchromatographie analysiert (4B). Keines der vier natürlichen Ribonukleotide war wie durch P1- oder T2-Verdau gezeigt modifiziert. Wir haben kürzlich eine Adenosin-zu-Inosin-Umwandlung in den ~21 nt Fragmenten (nach einer 2 h Inkubation) analysiert und detektierten Deaminierung in einem geringen Ausmaß (< 0,7%) (Zamore et al., 2000); eine kürzere Inkubation in Lysat (1 h) verringerte diese Inosinfraktion auf gerade noch detektierbare Mengen. RNase T2, welche 3' der Phosphodiesterverknüpfung spaltet, erzeugte Nukleosid-3'-Phosphat und Nukleosid-3',5'-Diphosphat, wodurch das Vorliegen eines 5'-terminalen Monophosphats gezeigt wird. Alle vier Nukleosid-3',5'-Diphosphate wurden detektiert und legen nahe, dass die Internukleotidverknüpfung mit geringer oder keiner Sequenzspezifität gespalten wurde. Zusammenfassend sind die ~21 nt Fragmente nicht modifiziert und wurden so aus dsRNA erzeugt, dass 5'-Monophosphate und 3'-Hydroxyle am 5'-Ende vorlagen.
1.2.4 Synthetische 21 und 22 nt RNAs vermitteln Ziel-RNA-Spaltung
Eine Analyse der Produkte von dsRNA-Prozessierung zeigte, dass die 21 nt-Fragmente durch eine Reaktion erzeugt werden, welche alle Kennzeichen einer RNase III-Spaltungsreaktion aufweist (Dunn, 1982; Nicholson, 1999; Robertson, 1990; Robertson, 1982). RNase III erzeugt zwei versetzte Schnitte in beide Stränge der dsRNA, wobei ein 3'-Überhang von etwa 2 nt zurückbleibt. Wir synthetisierten chemisch 21 und 22 nt RNAs, welche hinsichtlich der Sequenz zu einigen der klonierten ~21 nt Fragmente identisch waren und testeten sie hinsichtlich ihrer Fähigkeit, Ziel-RNA-Abbau zu vermitteln (5A und 5B). Die 21 und 22 nt RNA-Duplexe wurden bei 100 nM-Konzentrationen im Lysat inkubiert, 10-fach höhere Konzentrationen als die 52 bp-Kontroll-dsRNA. Unter diesen Bedingungen ist Ziel-RNA-Spaltung auf einfache Art und Weise zu detektieren. Eine Verringerung der Konzentration von 21 und 22 nt Duplexen von 100 auf 10 nM führt noch immer zu Ziel-RNA-Spaltung. Eine Erhöhung der Duplexkonzentration von 100 nM auf 1000 nM steigert die Zielspaltung nicht weiter, wobei dies wahrscheinlich an einem limitierend wirkenden Proteinfaktor im Lysat liegt.
Im Gegensatz zu 29 oder 30 bp dsRNAs, welche keine RNAi vermittelten, vermittelten die 21 und 22 nt dsRNAs mit überhängenden 3'-Enden von 2 bis 4 nt einen effizienten Abbau von Ziel-RNA (Duplexe 1, 3, 4, 6, 5A und 5B). 21 oder 22 nt dsRNAs mit glatten Enden (Duplexe 2, 5 und 7, 5A und 5B) waren hinsichtlich ihrer Fähigkeit, das Ziel abzubauen, eingeschränkt und zeigen, dass überhängende 3'-Enden zur Rekonstitution des RNA-Proteinnukleasekomplexes entscheidend sind. Die einzelsträngigen Überhänge können für eine Bindung des ~21 nt Duplex mit hoher Affinität an die Proteinkomponenten notwendig sein. Ein 5'-terminales Phosphat, obwohl es nach dsRNA-Prozessierung vorliegt, war zur Vermittlung von Ziel-RNA-Spaltung nicht erforderlich und fehlte bei den kurzen synthetischen RNAs.
Die synthetischen 21 und 22 nt Duplexe steuerten sowohl die Spaltung von Sense- als auch von Antisense-Zielen innerhalb der Region, welche durch die kurze Duplex abgedeckt wird. Dies stellt ein wichtiges Ergebnis dar, wenn man bedenkt, dass eine 39 bp dsRNA, welche zwei Clusterpaare von ~21 nt Fragmenten (2) bildet, Sense- oder Antisense-Ziel nur einmal und nicht zweimal spaltete. Wir interpretieren dieses Ergebnis, indem wir vorschlagen, dass nur einer der beiden Stränge, welche in der ~21 nt Duplex vorliegen, in der Lage ist, Ziel-RNA-Spaltung zu steuern und dass die Orientierung der ~21 nt Duplex im Nukleasekomplex durch die anfängliche Führung der dsRNA-Prozessierung bestimmt wird. Die Präsentation einer bereits perfekt prozessierten ~21 nt Duplex gegenüber einem in vitro-System ermöglicht aber die Bildung des aktiven sequenzspezifischen Nukleasekomplexes mit zwei möglichen Orientierungen der symmetrischen RNA-Duplex. Dies führt sowohl zur Spaltung des Sense- als auch des Antisense-Ziels innerhalb der Identitätsregion mit der 21 nt RNA-Duplex.
Die Ziel-Spaltungsstelle ist 11 oder 12 nt stromabwärts des ersten Nukleotids lokalisiert, welches komplementär ist zur 21 oder 22 nt-Steuer(guide)sequenz, d.h. die Spaltungsstelle befindet sich nahe der Mitte der Region, welche durch die 21 oder 22 nt RNAs abgedeckt ist (4A und 4B). Ein Versetzen des Sense-Strangs einer 22 nt Duplex um zwei Nukleotide (vergleiche Duplexe 1 und 3 in 5A) versetzte nur die Spaltungsstelle des Antisense-Ziels um zwei Nukleotide. Ein Versetzen sowohl des Sense- als auch des Antisense-Strangs um 2 Nukleotide verschob beide Spaltungsstellen um zwei Nukleotide (vergleiche Duplexe 1 und 4). Wir sagen voraus, dass es möglich sein wird, ein Paar von 21 oder 22 nt RNAs zu konstruieren, um eine Ziel-RNA in nahezu jeder beliebigen gegebenen Position zu spalten.
Die Spezifität von Ziel-RNA-Spaltung, welche durch 21 und 22 nt RNAs gesteuert wird, scheint ausgezeichnet zu sein, da keine abweichenden Spaltungsstellen detektiert werden (5B). Es sollte jedoch angemerkt werden, dass die Nukleotide, welche im 3'-Überhang der 21 und 22 nt RNA-Duplex vorliegen, weniger zur Substraterkennung beitragen könnten, als die Nukleotide nahe der Spaltungsstelle. Dies basiert auf der Beobachtung, dass das am weitesten 3'-ständige Nukleotid im 3'-Überhang der aktiven Duplexe 1 oder 3 (5A) zum Ziel nicht komplementär ist. Eine ausführliche Analyse der Spezifität von RNAi kann nun unter Verwendung synthetischer 21 und 22 nt RNAs auf einfache Art und Weise durchgeführt werden.
Aufgrund Grundlage des Beweises, dass synthetische 21 und 22 nt RNAs mit überhängenden 3'-Enden RNA-Interferenz vermitteln, schlagen wir vor, die ~21 nt RNAs als "kurze interferierende RNAs" ("short interfering RNAs)" oder siRNAs und den entsprechenden RNA-Proteinkomplex als "kleinen interferierenden Ribonukleoprotein-Partikel" ("small interfering ribonucleoprotein particle") oder siRNP zu bezeichnen.
1.2.5 20 nt 3'-Überhänge an kurzen dsRNAs hemmen RNAi
Wir haben gezeigt, dass kurze dsRNAs mit glatten Enden von den Enden der dsRNA her prozessiert zu werden scheinen. Während unserer Untersuchung der Längenabhängigkeit von dsRNA bei RNAi haben wir auch dsRNAs mit 17 bis 20 nt überhängenden 3'-Enden analysiert und zu unserer Überraschung herausgefunden, dass sie weniger wirksam waren als dsRNAs mit glatten Enden. Die hemmende Wirkung von langen 3'-Enden war insbesondere für dsRNAs mit bis zu 100 bp ausgeprägt, war aber für längere dsRNAs weniger dramatisch. Basierend auf Analyse nativer Gele trat dieser Effekt nicht aufgrund mangelhafter dsRNA-Bildung auf (Daten nicht gezeigt). Wir untersuchten, ob der hemmende Effekt von langen überhängenden 3'-Enden als Werkzeug verwendet werden könnte, um dsRNA-Prozessierung zu nur einem der zwei Enden einer kurzen RNA-Duplex zu lenken.
Wir synthetisierten vier Kombinationen der 52 bp Modell-dsRNA, mit glatten Enden, 3'-Verlängerung nur am Sense-Strang, 3'-Verlängerung nur am Antisense-Strang und Doppel-3'-Verlängerung an beiden Strängen, und kartierten die Ziel-RNA-Spaltungsstellen nach Inkubation in Lysat (6A und 6B). Die erste und vorwiegende Spaltungsstelle des Sense-Ziels ging verloren, wenn das 3'-Ende des Antisense-Strangs der Duplex verlängert wurde, und umgekehrt ging die starke Spaltungsstelle des Antisense-Strangs verloren, wenn das 3'-Ende des Sense-Stranges der Duplex verlängert wurde. 3'-Verlängerungen an beiden Enden machten die 52 bp dsRNA nahezu inaktiv. Eine Erklärung für diese dsRNA-Inaktivierung durch ~20 nt 3'-Verlängerungen könnte die Assoziierung Einzelstrang-RNA-bindender Proteine sein, welche die Assoziierung eines der dsRNA-prozessierenden Faktoren an diesem Ende beeinträchtigen könnte. Dieses Ergebnis steht auch in Übereinstimmung mit unserem Modell, in welchem nur einer der Stränge der siRNA-Duplex im zusammengesetzten siRNP in der Lage ist, Ziel-RNA-Spaltung zu steuern. Die Orientierung des Stranges, welcher RNA-Spaltung steuert, ist definiert durch die Richtung der dsRNA-Prozessierungsreaktion. Es ist wahrscheinlich, dass das Vorliegen von 3'-versetzten Enden den Zusammenbau des Prozessierungskomplexes erleichtern kann. Ein Block am 3'-Ende des Sense-Strangs erlaubt dsRNA-Prozessierung nur vom gegenüberliegenden 3'-Ende des Antisense-Strangs. Dies erzeugt wiederum siRNP-Komplexe, von welchen nur der Antisense-Strang der siRNA-Duplex Sense-Ziel-RNA-Spaltung steuern kann. Das gleiche gilt für die umgekehrte Situation.
Der weniger ausgeprägte hemmende Effekt von langen 3'-Verlängerungen im Falle langer dsRNAs (≥ 500 bp, Daten nicht gezeigt) legt für uns nahe, dass lange dsRNAs auch interne dsRNA-Prozessierungssignale enthalten können oder aufgrund der Assoziierung mehrerer Spaltungsfaktoren cooperativ prozessiert werden können.
1.2.6 Modell für dsRNA-gelenkte mRNA-Spaltung
Die neuen biochemischen Daten aktualisieren das Modell, wie dsRNA mRNA als Ziel zur Zerstörung setzt (7). Doppelsträngige RNA wird zuerst prozessiert zu kurzen RNA-Duplexen mit einer überwiegenden Länge von 21 und 22 nt und mit versetzten 3'-Enden in einer ähnlichen Art und Weise wie eine RNase III-artige Reaktion (Dunn, 1982; Nicholson, 1999; Robertson, 1982). Auf Grundlage der Länge von 21-23 nt der prozessierten RNA-Fragmente wurde bereits spekuliert, dass eine RNase III-artige Aktivität bei RNAi eine Rolle spielen könnte (Bass, 2000). Diese Hypothese wird weiter gestützt durch das Vorliegen von 5'-Phosphaten und 3'-Hydroxylen an den Termini der siRNAs, wie es bei RNase III-Reaktionsprodukten beobachtet wird (Dunn, 1982; Nicholson, 1999). Von bakterieller RNase III und den eukaryotischen Homologen Rnt1p in S. cerevisiae und Pac1p in S. pombe wurde gezeigt, dass sie sowohl bei der Prozessierung von ribosomaler RNA als auch von snRNA und snoRNAs wirken (siehe beispielsweise Chanfreau et al., 2000).
Über die Biochemie von RNase III-Homologen aus Pflanzen, Tieren oder Menschen ist wenig bekannt. Es wurden zwei RNase III-Enzymfamilien hauptsächlich durch Datenbank-gesteuerte Sequenzanalyse oder Klonierung von cDNAs identifiziert. Die erste RNase III-Familie wird durch das 1327 Aminosäuren lange D. melanogaster-Protein Drosha (Acc. AF116572) repräsentiert. Der C-Terminus ist zusammengesetzt aus zwei RNase III und einer dsRNA-Bindungsdomäne und die Funktion des N-Terminus ist nicht bekannt. Enge Homologe werden auch gefunden in C. elegans (Acc. AF160248) und Mensch (Acc. AF189011) (Filippov et al., 2000; Wu et al., 2000). Die Drosha-artige humane RNase III wurde kürzlich kloniert und charakterisiert (Wu et al., 2000). Das Gen wird in menschlichen Geweben und Zelllinien allgegenwärtig exprimiert und das Protein ist im Nukleus und dem Nukleolus der Zelle lokalisiert. Auf Grundlage von Ergebnissen, welche aus Antisense-Hemmungsstudien abgeleitet wurden, wurde eine Rolle des Proteins bei der rRNA-Prozessierung vorgeschlagen. Die zweite Klasse wird repräsentiert durch das C. elegans-Gen K12H4.8 (Acc. S44849), welches für ein 1822 Aminosäure langes Protein kodiert. Dieses Protein weist ein N-terminales RNA-Helikasemotiv auf, woran sich 2 RNase III katalytische Domänen und ein dsRNA-Bindungsmotiv anschließen, ähnlich zu der Drosha-RNase III-Familie. Es gibt Homologe in S. pombe (Acc. QO9884), A. thaliana (Acc. AF187317), D. melanogaster (Acc. AE003740) und Mensch (Acc. AB028449) (Filippov et al., 2000; Jacobsen et al., 1999; Matsuda et al., 2000). Möglicherweise ist die K12H4.8 RNase III/Helikase der wahrscheinliche Kandidat um bei RNAi eine Rolle zu spielen.
Genetische Durchmusterungen in C. elegans identifizierten rde-1 und rde-4 als wesentlich zur RNAi-Aktivierung ohne Effekt auf Transposonmobilisierung oder -cosuppression (Dernburg et al., 2000; Grishok et al., 2000; Ketting und Plasterk, 2000; Tabara et al., 1999). Dies führt zu der Hypothese, dass diese Gene zur dsRNA-Prozessierung wichtig sind, aber bei mRNA-Zielabbau keine Rolle spielen. Die Funktion beider Gene ist bis jetzt unbekannt, das rde-1-Genprodukt ist ein Mitglied einer Familie von Proteinen, welche zum Kaninchenprotein eIF2C ähnlich sind (Tabara et al., 1999) und die Sequenz von rde-4 wurde bis jetzt nicht beschrieben. Eine weitere biochemische Charakterisierung dieser Proteine sollte ihre molekulare Funktion enthüllen.
Die Prozessierung zu den siRNA-Duplexen scheint von den Enden sowohl von dsRNAs mit glatten Enden als auch von dsRNAs mit kurzen (1-5 nt) 3'-Überhängen zu beginnen und vollzieht sich in etwa 21-23 nt Schritten. Lange (~20 nt) 3'-versetzte Enden an kurzen dsRNAs unterdrücken RNAi möglicherweise aufgrund von Wechselwirkung mit einzelsträngigen RNA-Bindungsproteinen. Die Suppression von RNAi durch einzelsträngige Regionen, welche kurze dsRNA flankieren und das Fehlen von siRNA-Bildung von kurzen 30 bp dsRNAs könnte erklären, warum strukturierte Regionen, welche in mRNAs häufig auftreten, nicht zur Aktivierung von RNAi führen.
Ohne dass es erwünscht ist, durch diese Theorie gebunden zu sein, nehmen wir an, dass die dsRNA-prozessierenden Proteine oder ein Teil dieser Proteine nach der Prozessierungsreaktion mit der siRNA-Duplex assoziiert verbleiben. Die Orientierung des siRNA-Duplex relativ zu diesen Proteinen bestimmt, welcher der zwei komplementären Stränge bei der Steuerung von Ziel-RNA-Abbau wirkt. Chemisch synthetisierte siRNA-Duplexe steuern sowohl Spaltung von Sense- als auch von Antisense-Ziel-RNA an, da sie mit den Proteinkomponenten in beiden der zwei möglichen Orientierungen assoziieren können.
Die bemerkenswerte Feststellung, dass synthetische 21 und 22 nt siRNA-Duplexe zum effizienten mRNA-Abbau verwendet werden können, stellt neue Werkzeuge zur sequenzspezischen Regulation von Genexpression sowohl zur funktionellen Genomik als auch für biochemische Studien bereit. Die siRNAs können in Säugersystemen effektiv sein, worin lange dsRNAs aufgrund der Aktivierung der PKR-Antwort nicht verwendet werden können (Clemens, 1997). Deshalb stellen die siRNA-Duplexe eine neue Alternative zur Antisense- oder Ribozymtherapeutik dar.
Beispiel 2
RNA-Interferenz in menschlichen Gewebekulturen
2.1 Verfahren
2.1.1 RNA-Präparation
21 nt RNAs wurden chemisch synthetisiert, wobei Expedite RNA Phosphoramidite und Thymidinphosphoramidit verwendet wurde (Proligo, Deutschland). Die synthetischen Oligonukleotide wurden entschützt und Gelgereinigt (Beispiel 1), woran sich eine Reinigung mittels Sep-Pak C18-Kartusche (Waters, Milford, MA, USA) anschloss (Tuschl, 1993). Die siRNA-Sequenzen, welche GL2 (Acc. X65324) und GL3-Luciferase (Acc. U47296) als Ziel setzen, entsprachen den kodierenden Regionen 153-173 relativ zum ersten Nukleotid des Startkodons, siRNAs, welche RL (Acc. AF025846) als Ziel setzen entsprachen der Regioen 119-129 nach dem Startkodon. Längere RNAs wurden transkribiert mit T7 RNA-Polymerase von PCR-Produkten, wobei sich Gel- und Sep-Pak-Reinigung anschloss. Die 49 und 448 bp GL2 oder GL3 dsRNAs entsprachen Position 113-161 bzw. 113-596 relativ zum Translationsstart; die 50 und 501 bp RL dsRNAs entsprachen Position 118-167 bzw. 118-618. PCR-Matrizen zur dsRNA-Synthese, welche humanisiertes GFP (hG) als Ziel setzen, wurden von pAD3 (Kehlenbach, 1998) amplifiziert, wobei 50 und 501 bp hG dsRNA den Positionen 118-167 bzw. 118-618 zum Startkodon entsprach.
Zum Anlagern von siRNAs wurden 20 μM Einzelstränge in Anlagerungspuffer (100 mM Kaliumacetat, 30 mM HEPES-KOH bei pH 7,4, 2 mM Magnesiumacetat) für 1 Min bei 90°C inkubiert, wobei sich 1 h bei 37°C anschloss. Der 37°C-Inkubationsschritt wurde für die 50 und 500 bp dsRNAs über Nacht verlängert und diese Anlagerungsreaktionen wurden bei 8,4 μM bzw. 0,84 μM Strangkonzentrationen durchgeführt.
2.1.2 Zellkultur
S2-Zellen wurden fortgepflanzt in Schneiders Drosophila-Medium (Life Technologies), welches supplementiert war mit 10% FBS, 100 Einheiten/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin bei 25°C. 293, NIH/3T3, HeLa S3, COS-7-Zellen wurden aufgezogen bei 37°C in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium, welches supplementiert war mit 10% FBS, 100 Einheiten/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin. Die Zellen wurden regelmäßig passagiert, um exponentielles Wachstum aufrecht zu erhalten. 24 Stunden vor der Transfektion bei etwa 80% Konfluenz wurden die Säugerzellen trypsinisiert und 1:5 verdünnt mit frischem Medium ohne Antibiotika (1-3 × 10⁶ Zellen/ml) und auf 24-Well-Platten (500 μl/Well) überführt. S2-Zellen wurden vor dem Teilen nicht trypsinisiert. Die Transfektion wurde ausgeführt mit Lipofectamin 2000-Reagens (Life Technologies), wie es vom Hersteller für anhaftende Zelllinien beschrieben wird. Pro Well wurden 1,0 μg pGL2-Control (Promega) oder pGL3-Control (Promega), 0,1 μg pRL-TK (Promega) und 0,28 μg siRNA-Duplex oder dsRNA formuliert in Liposomen aufgebracht; das Endvolumen betrug 600 μl pro Well. Die Zellen wurden nach der Transfektion 20 Stunden inkubiert und schienen danach gesund zu sein. Nachfolgend wurde die Luciferaseexpression mit dem Dual-Luciferaseassay (Promega) überwacht. Die Transfektionseffizienzen wurden durch Fluoreszenzmikroskopie für Säugerzelllinien nach Cotransfektion von 1,1 μg hGFP-kodierendem pAD3 und 0,28 μg invGL2 inGL2 siRNA bestimmt und betrugen 70-90%. Reporterplasmide wurden in XL-1 Blue (Stratagene) amplifiziert und gereinigt, wobei der Qiagen EndoFree Maxi Plasmid Kit verwendet wurde.
2.2 Ergebnisse und Diskussion
Um zu untersuchen, ob siRNAs auch RNAi in Gewebekultur vermitteln können, synthetisierten wir 21 nt siRNA-Duplexe mit symmetrischen 2 nt 3'-Überhängen, welche gegen Reportergene gerichtet waren, welche kodierten für Seeanemone(Renilla reniformis)- und zwei Sequenzvarianten von Glühwürmchen-(Photinus pyralis, GL2 und GL3)Luciferasen (8a, b). Die siRNA-Duplexe wurden cotransfiziert mit den Reporterplasmidkombinationen pGL2/pRL oder pGL3/pRL in D. melanogaster Schneider S2-Zellen oder Säugerzellen, wobei kationische Liposome verwendet wurden. Die Luciferaseaktivitäten wurden 20 h nach Transfektion bestimmt. In allen untersuchten Zelllinien beobachteten wir eine spezifische Reduktion der Expression der Reportergene bei Vorliegen von verwandten siRNA-Duplexen (9A-j). Bemerkenswerterweise waren die absoluten Luciferaseexpressionsmengen durch nicht verwandte siRNAs nicht betroffen, wodurch ein Fehlen schädlicher Nebenwirkungen von 21 nt RNA-Duplexen gezeigt wird (z.B. 10a-d für HeLa-Zellen). In D. melanogaster S2-Zellen (9a, b) war die spezifische Hemmung der Luciferasen vollständig. In Säugerzellen, in welchen die Reportergene 50-100-fach stärker exprimiert wurden, war die spezifische Suppression weniger vollständig (9c-j). Die GL2-Expression war in Reaktion auf die verwandten siRNAs 3-12-fach verringert, die GL3-Expression 9-25-fach und die RL-Expression 1-3-fach. Für 293 Zellen war ein Targeting von RL-Luciferase durch RL-siRNAs nicht effektiv, obwohl die GL2- und GL3-Ziele spezifisch reagierten (9i, j). Das Fehlen einer Verringerung von RL-Expression in 293 Zellen kann an ihrer 5- bis 20-fachen Expression im Vergleich zu allen anderen untersuchten Säugerzellen liegen und/oder an der beschränkten Zugänglichkeit der Zielsequenz aufgrund von RNA-Sekundärstruktur oder assoziierten Proteinen. Trotzdem zeigte spezifisches Targeting von GL2- und GL3-Luciferase durch verwandte siRNA-Duplexe, dass RNAi auch in 293 Zellen wirkt.
Der 2 nt 3'-Überhang in allen siRNA-Duplexen, außer für uGL2, war aus (2'-Deoxy)-thymidin zusammengesetzt. Die Substitution von Uridin durch Thymidin im 3'-Überhang wurde im D. melanogaster-in vitro-System gut toleriert und die Sequenz des Überhangs war für die Zielerkennung unkritisch. Der Thymidinüberhang wurde gewählt, da angenommen wird, dass er die Nukleaseresistenz von siRNAs in Gewebekulturmedium und in transfizierten Zellen erhöht. Tatsächlich war die Thymidin-modifizierte GL2-siRNA etwas wirksamer als die nicht-modifizierte uGL2-siRNA in allen getesteten Zelllinien (9a, c, e, g, i). Es ist denkbar, dass weitere Modifikationen der 3'-überhängenden Nukleotide weitere günstige Wirkungen auf die Abgabe und Stabilität von RNA-Duplexen bereitstellen können.
In Cotransfektionsexperimenten wurden 25 nM siRNA-Duplexe in Bezug auf das Endvolumen an Gewebekulturmedium verwendet (9, 10). Eine Erhöhung der siRNA-Konzentration auf 100 nM steigerte die spezifischen Inaktivierungseffekte nicht, begann aber aufgrund von Konkurrenz zwischen Plasmid-DNA und siRNA hinsichtlich der Liposomverkapselung die Transfektionseffizienzen zu beeinflussen (Daten nicht gezeigt). Eine Erniedrigung der siRNA-Konzentration auf 1,5 nM reduzierte den spezifischen Inaktivierungseffekt nicht (Daten nicht gezeigt), obwohl die siRNAs nun nur 2- bis 20-fach stärker konzentriert waren als die DNA-Plasmide. Dies zeigt, dass siRNAs außerordentlich leistungsfähige Reagenzien zum Vermitteln von Geninaktivierung sind und dass siRNAs bei Konzentrationen effektiv sind, welche mehrere Größenordnungen unterhalb der Konzentrationen liegen, welche in herkömmlichen Antisense- oder Ribozymgentargetingexperimenten eingesetzt werden.
Um den Effekt längerer dsRNAs auf Säugerzellen zu überwachen, wurden 50 und 500 bp dsRNAs, welche zu den Reportergenen verwandt waren, hergestellt. Als nicht-spezifische Kontrolle wurden dsRNAs von humanisiertem GFP (hG) (Kehlenbach, 1998) verwendet. Wenn dsRNAs cotransfiziert wurden, in identischen Mengen (nicht Konzentrationen) zu den siRNA-Duplexen, wurde die Reportergenexpression stark und unspezifisch reduziert. Dieser Effekt ist für HeLa-Zellen als repräsentatives Beispiel illustriert (10a-d). Die absoluten Luciferaseaktivitäten wurden unspezifisch 10- bis 20-fach durch 50 bp dsRNA- bzw. 20- bis 200-fach durch 500 bp dsRNA-Cotransfektion erniedrigt. Ähnliche unspezifische Effekte wurden für COS-7 und NIH/3T3-Zellen beobachtet. Für 293 Zellen wurde eine 10- bis 20-fache unspezifische Reduktion nur für 500 bp dsRNAs beobachtet. Eine unspezifische Reduktion hinsichtlich der Reportergenexpression durch dsRNA > 30 bp wurde als Teil der Interferonreaktion erwartet.
Überraschenderweise detektierten wir trotz der starken unspezifischen Abnahme hinsichtlich der Reportergenexpression reproduzierbar zusätzliche genspezifische, dsRNA-vermittelte Inaktivierung (Silencing). Die spezifischen Inaktivierungseffekte waren jedoch nur sichtbar, wenn die relativen Reportergenaktivitäten hinsichtlich der hG dsRNA-Kontrollen normalisiert wurden (10e, f). Es wurde eine 2- bis 10-fache spezifische Reduktion in Reaktion auf verwandte dsRNA beobachtet, so wie auch in den anderen drei untersuchten Säugerzelllinien (Daten nicht gezeigt). Spezifische Inaktivierungseffekte mit dsRNAs (356-1662 bp) wurden kürzlich in CHO-K1-Zellen beschrieben, aber die dsRNA-Mengen, welche nötig waren, um eine 2- bis 4-fache spezifische Reduktion zu detektieren, waren in etwa 20-mal höher als in unseren Experimenten (Ui-Tei, 2000). Auch scheinen CHO-K1-Zellen hinsichtlich der Interferonreaktion defizient zu sein. In einem anderen Report wurden 293, NIH/3T3 und BHK-21-Zellen hinsichtlich RNAi untersucht, wobei Luciferase/lacZ-Reporterkombinationen und 829 bp spezifische lacZ- oder 717 bp unspezifische GFP-dsRNA verwendet wurde (Caplen, 2000). Der Misserfolg bei der Detektion von RNAi in diesem Fall kann im weniger sensitiven Luciferase/lacZ-Reporterassay und in den Längenunterschieden von Ziel- und Kontroll-dsRNA begründet liegen. Zusammengenommen zeigen unsere Ergebnisse, dass RNAi in Säugerzellen aktiv ist, aber dass der Inaktivierungseffekt schwierig zu detektieren ist, wenn das Interferonsystem durch dsRNA > 30 bp aktiviert wird.
Zusammenfassend haben wir erstmals siRNA-vermittelte Geninaktivierung in Säugerzellen gezeigt. Die Verwendung von kurzen siRNAs ist hinsichtlich einer Inaktivierung von Genfunktionen in humaner Gewebekultur und der Entwicklung von genspezifischen Therapeutika sehr vielversprechend.
Beispiel 3
Spezifische Hemmung der Genexpression durch RNA-Interferenz
3.1 Material und Verfahren
3.1.1 RNA-Präparation und RNAi-Assay
Die chemische RNA-Synthese, Anlagerung und Luciferase-basierende RNAi-Assays wurden wie in den Beispielen 1 oder 2 oder in vorausgegangenen Publikationen beschrieben (Tuschl et al., 1999; Zamore et al., 2000) durchgeführt. Alle siRNA-Duplexe waren gegen Glühwürmchenluciferase gerichtet und die Luciferase-mRNA-Sequenz war abgeleitet aus pGEM-luc (GenBank-Acc. X65316) wie beschrieben (Tuschl et al., 1999). Die siRNA-Duplexe wurden inkubiert in D. melanogaster RNAi/Translationsreaktion für 15 Min. vor der Zugabe von mRNAs. Die auf Translation basierenden RNAi-Assays wurden wenigstens dreifach durchgeführt.
Zur Kartierung von Sense-Ziel-RNA-Spaltung wurde ein 177-nt Transkript erstellt, entsprechend der Glühwürmchenluciferasesequenz zwischen den Positionen 113-273 relativ zum Startkodon, wobei sich das 17-nt Komplement der SP6-Promotorsequenz anschloss. Zur Kartierung einer Antisense-Ziel-RNA-Spaltung wurde ein 166-nt Transkript von einer Matrize erzeugt, welche von einer Plasmidsequenz durch PCR amplifiziert wurde, wobei der 5'-Primer TAATACGACTCACTATAGAGCCCATATCGTTTCATA (T7-Promotor unterstrichen) und der 3'-Primer AGAGGATGGAACCGCTGG verwendet wurden. Die Zielsequenz entspricht dem Komplement der Glühwürmchenluciferasesequenz zwischen den Positionen 50-215 relativ zum Startkodon. Es wurde eine Guanylyl-Transferasemarkierung wie kürzlich beschrieben durchgeführt (Zamore et al., 2000). Zur Kartierung von Ziel-RNA-Spaltung wurden 100 nM siRNA-Duplex mit 5 bis 10 nM Ziel-RNA in D. melanogaster-Embryolysat unter Standardbedingungen (Zamore et al., 2000) für 2 h bei 25°C inkubiert. Die Reaktion wurde gestoppt durch die Zugabe von 8 Volumen Proteinase K-Puffer (200 mM Tris-HCl pH 7,5, 25 mM EDTA, 300 mM NaCl, 2% w/v Natriumdodecylsulfat). Es wurde Proteinase K (E. M. Merck, gelöst in Wasser) bis zu einer Endkonzentration von 0,6 mg/ml zugegeben. Die Reaktionen wurden anschließend für 15 Min bei 65°C inkubiert, mit Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (25:24:1) extrahiert und mit 3 Volumen Ethanol präzipitiert. Die Proben wurden auf 6% Sequenzierungsgelen lokalisiert. Längenstandards wurden durch partiellen RNase T1-Verdau und partielle basische Hydrolyse der Kappen-markierten Sense- oder Antisense-Ziel-RNAs erzeugt.
3.2 Ergebnisse
3.2.1 Variation des 3'-Überhangs in Duplexen von 21-nt siRNAs
Wie oben beschrieben waren 2 oder 3 ungepaarte Nukleotide am 3'-Ende von siRNA-Duplexen effizienter beim Ziel-RNA-Abbau als die entsprechenden Duplexe mit glatten Enden. Um eine umfassendere Analyse der Funktion der terminalen Nukleotide durchzuführen, synthetisierten wir fünf 21-nt Sense-siRNAs, wobei in jeder ein Nukleotid relativ zur Ziel-RNA ersetzt war und acht 21-nt-Antisense-siRNAs, wobei in jeder ein Nukleotid relativ zum Ziel ersetzt war (11A). Durch Kombinieren von Sense- und Antisense-siRNAs wurden acht Serien von siRNA-Duplexen mit synthetischen überhängenden Enden erzeugt, welche einen Bereich von 7-nt 3'-Überhang bis 4-nt 5'-Überhang abdeckten. Die Interferenz von siRNA-Duplexen wurde unter Verwendung des Dual-Luciferaseassaysystems gemessen (Tuschl et al., 1999; Zamore et al., 2000). Die siRNA-Duplexe waren gegen Glühwürmchenluciferase-mRNA gerichtet und es wurde Seeanemonenluciferase-mRNA als interne Kontrolle verwendet. Das Lumineszenzverhältnis von Ziel- zu Kontrollluciferaseaktivität wurde in Gegenwart von siRNA-Duplex bestimmt und wurde hinsichtlich des Verhältnisses normalisiert, welches in Abwesenheit von dsRNA beobachtet wurde. Zum Vergleich sind die Interferenzverhältnisse von langen dsRNAs (39 bis 504 bp) in 11B gezeigt. Die Interferenzverhältnisse wurden bestimmt bei Konzentrationen von 5 nM für lange dsRNAs (11A) und bei 100 nM für siRNA-Duplexe (11C-J). Die 100 nM Konzentrationen für siRNAs wurden gewählt, da eine vollständige Prozessierung von 5 nM 504 bp dsRNA zu 120 nM Gesamt-siRNA-Duplexen führen würde.
Die Fähigkeit von 21-nt siRNA-Duplexen, RNAi zu vermitteln, ist von der Zahl der überhängenden Nukleotide oder den gebildeten Basenpaaren abhängig. Duplexe mit vier bis sechs 3'-überhängenden Nukleotiden konnten keine RNAi vermitteln (11C-F), so wie Duplexe mit zwei oder mehr 5'-überhängenden Nukleotiden (11G-J). Die Duplexe mit 2-nt 3'-Überhängen waren bei der Vermittlung von RNA-Interferenz am effizientesten, obgleich die Inaktivierungseffizienz ebenfalls sequenzabhängig war, und es wurden bis zu 12-fache Unterschiede für verschiedene siRNA-Duplexe mit 2-nt 3'-Überhängen beobachtet (vergleiche 11D-H). Duplexe mit glatten Enden, 1-nt 5'-Überhang oder 1- bis 3-nt 3'-Überhängen waren manchmal funktional. Der schwache Inaktivierungseffekt, welcher für die siRNA-Duplex mit 7-nt 3'-Überhang beobachtet wurde (11C) kann eher aufgrund eines Antisense-Effekts des langen 3'-Überhangs als aufgrund von RNAi auftreten. Ein Vergleich der Effizienz von RNAi zwischen langen dsRNAs (11B) und den effektivsten 21-nt siRNA- Duplexen (11E, G, H) zeigt, dass eine einzelne siRNA-Duplex bei 100 nM Konzentration so effektiv sein kann wie 5 nM 504 bp dsRNA.
3.2.2 Längenvariation der Sense-siRNA gepaart mit einer unveränderlichen 21-nt Antisense-siRNA
Um den Effekt der Länge von siRNA auf RNAi zu untersuchen, stellten wir 3 Serien von siRNA-Duplexen her, wobei drei 21-nt Antisense-Stränge mit acht, 18- bis 25-nt-Sense-Strängen kombiniert wurden. Der 3'-Überhang der Antisense-siRNA wurde auf 1, 2 oder 3 nt in jeder siRNA-Duplexserie fixiert, während die Sense-siRNA an ihrem 3'-Ende variiert wurde (12A). Unabhängig von der Länge der Sense-siRNA fanden wir heraus, dass Duplexe mit 2-nt 3'-Überhang von Antisense-siRNA (12C) aktiver waren als solche mit 1- oder 3-nt 3'-Überhang (12B, D). In der ersten Serie mit 1-nt 3'-Überhang der Antisense-siRNA waren Duplexe mit 21- und 22 nt Sense-siRNAs, welche einen 1- bzw. 2-nt 3'-Überhang der Sense-siRNA tragen, am effektivsten. Duplexe mit 19- bis 25-nt Sense-siRNAs konnten auch RNA ermitteln, aber zu einem niedrigeren Maß. Auf ähnliche Art und Weise war in der zweiten Serie, mit 2-nt Überhang der Antisense-siRNA, die 21-nt siRNA-Duplex mit 2-nt 3'-Überhang am aktivsten und jede andere Kombination mit den 18- bis 25 nt Sense-siRNAs war zu einem signifikanten Grad aktiv. In der letzten Serie mit 3-nt Antisense-siRNA 3'-Überhang war nur die Duplex mit einer 20-nt Sense-siRNA und dem 2-nt Sense-3'-Überhang in der Lage, Ziel-RNA-Expression zu reduzieren. Zusammenfassend zeigen diese Ergebnisse, dass sowohl die Länge der siRNA als auch die Länge des 3'-Überhangs wichtig ist und dass Duplexe aus 21-nt siRNAs mit 2-nt 3-Überhang für RNAi optimal sind.
3.2.3 Längenvariation von siRNA-Duplexen mit konstantem 2-nt 3'-Überhang
Wir untersuchten anschließend den Effekt einer gleichzeitigen Veränderung der Länge beider siRNA-Stränge unter Beibehaltung symmetrischer 2-nt 3'-Überhänge (13A). Es wurden zwei Serien von siRNA-Duplexen umfassend die 21-nt siRNA-Duplex gemäß 11H als Referenz hergestellt. Es wurde die Länge der Duplexe zwischen 20 bis 25 bp variiert durch Verlängern des basengepaarten Segments am 3'-Ende der Sense-siRNA (13B) oder dem 3'-Ende der Antisense-siRNA (13C). Duplexe mit 20 bis 23 bp führten zu einer spezifischen Repression von Zielluciferaseaktivität, wobei die 21-nt siRNA-Duplex aber wenigstens 8-mal effektiver war als jede andere Duplex. 24- und 25-nt siRNA-Duplexe führten nicht zu einer detektierbaren Interferenz. Sequenzspezifische Effekte waren gering, da Variationen an beiden Enden der Duplex ähnliche Effekte erzeugten.
3.2.4 2'-Deoxy- und 2'-O-Methyl-modifizierte siRNA-Duplexe
Um die Bedeutung der siRNA-Ribosereste für RNAi zu bewerten, wurden Duplexe mit 21-nt siRNAs und 2-nt 3'-Überhängen mit 2'-Deoxy- oder 2'-O-Methyl-modifizierten Strängen untersucht (14). Eine Substitution der 2-nt 3'-Überhänge durch 2'-Deoxy-Nukleotide hatte keinen Effekt und auch der Austausch von zwei zusätzlichen Ribonukleotiden benachbart zu den Überhängen in der gepaarten Region erzeugte signifikant aktive siRNAs. Deshalb wurden 8 von 42 nt einer siRNA-Duplex durch DNA-Reste ohne Verlust von Aktivität ausgetauscht. Eine vollständige Substitution von einem oder beiden siRNA-Strängen durch 2'-Deoxy-Reste hob die RNAi hingegen auf, wie es auch eine Substitution durch 2'-O-Methylreste tat.
3.2.5 Definition von Ziel-RNA-Spaltungsstellen
Ziel-RNA-Spaltungsstellen wurden vorausgehend für 22-nt siRNA-Duplexe und für eine 21-nt/22-nt Duplex bestimmt. Es wurde herausgefunden, dass die Position der Ziel-RNA-Spaltung in der Mitte der Region lokalisiert ist, welche durch den siRNA-Duplex abgedeckt wird, 11 oder 12 nt stromabwärts des ersten Nukleotids, welches komplementär war zu der 21- oder 22-nt-siRNA-Guidesequenz. Es wurden fünf verschiedene 21-nt siRNA-Duplexe mit 2-nt 3'-Überhang (5A) mit 5'-Kappen-markierter Sense- oder Antisense-Ziel-RNA in D. melanogaster-Lysat inkubiert (Tuschl et al., 1999; Zamore et al., 2000). Die 5'-Spaltungsprodukte wurden auf Sequenzierungsgelen aufgetrennt (15B). Die Menge an Sense-Ziel-RNA, welche gespalten wurde, korrelierte mit der Effizienz der siRNA-Duplexe, welche im Assay auf Translationsbasis bestimmt wurde, und die siRNA-Duplexe 1, 2 und 4 (15B und 11H, G, E) spalten Ziel-RNA schneller als die Duplexe 3 und 5 (15B und 11F, D). Es ist bemerkenswert, dass die Summe an Radioaktivität des 5'-Spaltungsprodukts und der eingesetzten Ziel-RNA über die Zeit nicht konstant war und dass die 5'-Spaltungsprodukte nicht akkumuliert wurden. Vermutlich werden die Spaltungsprodukte, sobald sie vom siRNA-Endonukleasekomplex freigesetzt worden sind, aufgrund des Fehlens entweder des Poly(A)-Schwanzes oder der 5'-Kappe schnell abgebaut.
Die Spaltungsstellen für beide, Sense- und Antisense-Ziel-RNAs, wurden in der Mitte der Region lokalisiert, welche durch die siRNA-Duplexe überspannt wird. Die Spaltungsstellen für jedes Ziel, welche durch die 5 verschiedenen Duplexe erzeugt wurden, variierten um 1-nt entsprechend der 1-nt Versetzung der Duplexe entlang den Zielsequenzen. Die Ziele wurden präzise 11 nt stromabwärts der Zielposition komplementär zu dem am weitesten 3'-ständigen Nukleotid der Sequenz-komplementären Guide-siRNA gespalten (15A, B).
Um zu bestimmen, ob das 5'- oder das 3'-Ende der Guide-siRNA einen Regler für die Ziel-RNA-Spaltung anlegt, entwickelten wir die experimentelle Strategie, welche in 16A und B dargelegt ist. Eine 21-nt Antisense-siRNA, welche für diese Untersuchung unveränderlich gehalten wurde, wurde mit Sense-siRNAs gepaart, welche an einem von ihren 5'- oder 3'-Enden modifiziert waren. Die Position von Sense- und Antisense-Ziel-RNA-Spaltung wurde wie oben beschrieben bestimmt. Veränderungen hinsichtlich des 3'-Endes der Sense-siRNA, verfolgt für 1-nt 5'-Überhang bis zu 6-nt 3'-Überhang, beeinflussten weder die Position der Sense- noch der Antisense-Ziel-RNA-Spaltung (16C). Veränderungen hinsichtlich des 5'-Endes der Sense-siRNA beeinflussten nicht die Sense-Ziel-RNA-Spaltung (16D, oberes Panel), wobei dies erwartet worden war, da die Antisense-siRNA unverändert war. Jedoch wurde die Antisense-Ziel-RNA-Spaltung beeinflusst und war stark abhängig vom 5'-Ende der Sense-siRNA (16D, unteres Panel). Das Antisense-Ziel wurde nur gespalten, wenn die Sense-siRNA 20 oder 21 nt groß war und die Position der Spaltung war um 1-nt unterschiedlich, wodurch nahe gelegt wird, dass das 5'-Ende der zielerkennenden siRNA einen Regler zur Ziel-RNA-Spaltung anlegt. Die Position ist lokalisiert zwischen Nukleotid 10 und 11, wenn in Stromaufwärts-Richtung von dem Zielnukleotid aus gezählt wird, welches mit dem am weitesten 5'-ständigen Nukleotid der Guide-siRNA gepaart ist (siehe auch 15A).
3.2.6 Sequenzeffekte und 2'-Deoxysubstitutionen im 3'-Überhang
Ein 2-nt 3'-Überhang ist für die siRNA-Funktion bevorzugt. Wir wollten wissen, ob die Sequenz der überhängenden Nukleotide zur Zielerkennung beiträgt oder ob es sich nur um ein Merkmal handelt, welches zur Rekonstitution des Endonukleasekomplexes (RISC oder siRNP) notwendig ist. Wir synthetisierten Sense- und Antisense-siRNAs mit AA-, CC-, GG-, UU- und UG 3'-Überhängen und berücksichtigten die 2'-Deoxy-Modifikationen TdG und TT. Die Wildtyp-siRNAs enthielten AA im Sense-3'-Überhang und UG im Antisense-3'-Überhang (AA/UG). Alle siRNA-Duplexe waren funktional im Interferenzassay und verringerten Zielexpression wenigstens um das 5-fache (17). Die effizientesten siRNA-Duplexe, welche die Zielexpression um mehr als das 10-fache reduzierten, waren vom Sequenztyp NN/UG, NN/UU, NN/TdG und NN/TT (N, beliebiges Nukleotid). siRNA-Duplexe mit einem Antisense-siRNA-3'-Überhang von AA, CC oder GG waren im Vergleich zu der Wildtyp-Sequenz UG oder der Mutante UU um einen Faktor 2 bis 4 weniger aktiv. Diese Reduzierung hinsichtlich der RNAi-Effizienz kommt wahrscheinlich aufgrund eines Beitrags des vorletzten 3'-Nukleotids zu Sequenz-spezifischer Zielerkennung zustande, da das 3'-terminale Nukleotid von G zu U ohne Effekt verändert wurde.
Veränderungen in der Sequenz des 3'-Überhangs der Sense-siRNA enthüllten keinerlei sequenzabhängige Effekte, wobei dies erwartet worden war, da die Sense-siRNA nicht zur Sense-Ziel-mRNA-Erkennung beitragen darf.
3.2.7 Sequenzspezifität von Zielerkennung
Um die Sequenzspezifität der Zielerkennung zu untersuchen führten wir Sequenzveränderungen in die gepaarten Segmente von siRNA-Duplexen ein und bestimmten die Inaktivierungseffizienz. Sequenzveränderungen wurden eingeführt, durch Invertieren kurzer Segmente mit 3- oder 4-nt Länge oder als Punktmutationen (18). Die Sequenzveränderungen in einem siRNA-Strang wurden im komplementären siRNA-Strang kompensiert, um eine Störung der basengepaarten siRNA-Duplexstruktur zu vermeiden. Die Sequenz aller 2-nt 3'-Überhänge war TT (T, 2'-Deoxythymidin) um die Synthesekosten zu verringern. Die TT/TT-Referenz-siRNA-Duplex war hinsichtlich RNAi vergleichbar zur Wildtyp-siRNA-Duplex AA/UG (17). Die Fähigkeit, Reporter-mRNA- Zerstörung zu vermitteln, wurde quantifiziert unter Verwendung des auf Translation basierenden Lumineszenzassays. siRNA-Duplexe mit invertierten Sequenzsegmenten zeigten im Hinblick auf den Glühwürmchenluciferasereporter eine dramatisch reduzierte Targetingfähigkeit (18). Die Sequenzveränderungen, welche zwischen dem 3'-Ende und der Mitte der Antisense-siRNA lokalisiert wurde, hoben die Ziel-RNA-Erkennung vollständig auf, aber Mutationen nahe dem 5'-Ende der Antisense-siRNA zeigten ein geringes Maß an Inaktivierung. Eine Transversion des A/U-Basenpaares, welches direkt gegenüber der vorausgesagten Ziel-RNA-Spaltungsstelle lokalisiert ist oder ein Nukleotid weiter weg von der vorausgesagten Stelle, verhinderte eine Ziel-RNA-Spaltung, wodurch angezeigt wird, dass eine einzelne Mutation in der Mitte einer siRNA-Duplex zwischen fehlgepaarten Zielen unterscheidet.
3.3 Diskussion
siRNAs stellen wertvolle Reagenzien zur Inaktivierung von Genexpression dar, nicht nur in Insektenzellen, sondern auch in Säugerzellen mit einem großen Potenzial zur therapeutischen Anwendung. Wir haben systematisch die strukturellen Determinanten von siRNA-Duplexen analysiert, welche erforderlich sind, um einen effiziente Ziel-RNA-Abbau in D. melanogaster-Embryolysat zu fördern, wodurch Regeln für die Konstruktion der wirksamsten siRNA-Duplexe bereitgestellt werden. Eine perfekte siRNA-Duplex ist in der Lage, Genexpression mit einer Effizienz zu inaktivieren, welche vergleichbar zu einer 500 bp-dsRNA ist, vorausgesetzt, dass vergleichbare Mengen an Gesamt-RNA verwendet werden.
3.4 siRNA-Anwenderleitfaden
Effizient inaktivierend wirkende siRNA-Duplexe sind vorzugsweise zusammengesetzt aus 21-nt Antisense-siRNAs und sollten so ausgewählt sein, dass sie eine 19 bp Doppelhelix mit 2-nt 3'-überhängenden Enden bilden. 2'-Deoxy-Substitutionen der 2-nt 3'-überhängenden Enden hatten keinen Einfluss auf RNAi, helfen aber, die Kosten der RNA-Synthese zu reduzieren und können die RNase-Resistenz von siRNA-Duplexen erhöhen. Ausgedehntere 2'-Deoxy- oder 2'-O-Methyl-Modifikationen reduzieren jedoch die Fähigkeit von siRNAs, RNAi zu vermitteln, wahrscheinlich durch Beeinträchtigung der Proteinassoziierung bei der siRNAP-Zusammensetzung.
Zielerkennung ist ein in hohem Maße sequenzspezifischer Prozess, vermittelt durch die zum Ziel komplementäre siRNA. Das am weitesten 3'-ständige Nukleotid der Guide-RNA trägt nicht zur Spezifität von Zielerkennung bei, während das vorletzte Nukleotid des 3'-Überhangs Ziel-RNA-Spaltung beeinflusst und eine Fehlpaarung RNAi 2- bis 4-fach verringert. Das 5'-Ende einer Guide-siRNA scheint im Vergleich zum 3'-Ende auch toleranter hinsichtlich fehlgepaarter Ziel-RNA-Erkennung zu sein. Nukleotide in der Mitte der siRNA, lokalisiert gegenüber der Ziel-RNA-Spaltungsstelle, sind wichtige Determinanten für die Spezifität und auch einzelne Nukleotidveränderungen verringern RNAi auf ein nicht detektierbares Maß. Dies legt nahe, dass siRNA-Duplexe in der Lage sein können, mutierte oder polymorphe Allele in Gentargetingexperimenten zu erkennen, wobei dies ein wichtiges Merkmal für zukünftige therapeutische Entwicklungen werden kann.
Es wurde vorgeschlagen, dass Sense- und Antisense-siRNAs, wenn sie mit den Proteinkomponenten des Endonukleasekomplexes oder seinem Commitment-Komplex assoziiert werden, unterschiedliche Rollen spielen; die relative Orientierung des siRNA-Duplex in diesem Komplex definiert, welcher Strang zur Zielerkennung verwendet werden kann. Synthetische siRNA-Duplexe weisen im Hinblick auf die doppelhelikale Struktur, aber nicht im Bezug auf die Sequenz, Dyadsymmetrie auf. Die Assoziierung von siRNA-Duplexen mit den RNAi-Proteinen in D. melanogaster-Lysat führt zur Bildung von zwei asymmetrischen Komplexen. In derartigen hypothetischen Komplexen ist die chirale Umgebung für Sense- und Antisense-siRNA und deshalb ihre Funktion unterschiedlich. Die Vorhersage gilt offensichtlich nicht für palindromische siRNA-Sequenzen oder für RNAi-Proteine, welche zu Homodimeren assoziieren können. Um Sequenzeffekte zu minimieren, welche das Verhältnis von Sense- und Antisense-Targeting-siRNPs beeinflussen könnten, schlagen wir vor, siRNA-Sequenzen mit identischen 3'-überhängenden Sequenzen zu verwenden. Wir empfehlen die Sequenz des Überhangs der siRNA zu der des Antisense-3'-Überhangs anzupassen, da die Sense-siRNA in typischen Knock-Down-Experimenten kein Ziel aufweist. Asymmetrie bei der Rekonstitution von Sense- und Antisense-spaltenden siRNPs könnte (partiell) verantwortlich sein für die Variation in der RNAi-Effizienz, welche für verschiedene 21-nt siRNA-Duplexe mit 2-nt 3'-Überhängen beobachtet wurde, welche in dieser Untersuchung verwendet wurden (14). Alternativ kann die Nukleotidsequenz an der Zielstelle und/oder die Zugänglichkeit der Ziel-RNA-Struktur für die Variation hinsichtlich der Effizienz dieser siRNA-Duplexe verantwortlich sein.
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Claims

Isoliertes doppelsträngiges RNA-Molekül, worin jeder RNA-Strang eine Länge von 19 bis 23 Nukleotiden aufweist und worin wenigstens ein Strang einen 3'-Überhang von 1 bis 3 Nukleotiden aufweist, wobei das RNA-Molekül zu zielspezifischer RNA-Interferenz in der Lage ist.
RNA-Molekül nach Anspruch 1, worin jeder Strang eine Länge von 20 bis 22 Nukleotiden aufweist.
RNA-Molekül nach einem der Ansprüche 1 oder 2, worin der 3'-Überhang gegenüber Abbau stabilisiert ist.
RNA-Molekül nach einem der Ansprüche 1 bis 3, welches wenigstens ein modifiziertes Nukleotidanalogon enthält.
RNA-Molekül nach Anspruch 4, worin das modifizierte Nukleotidanalogon ausgewählt ist aus Zucker- oder Rückgrat-modifizierten Ribonukleotiden.
RNA-Molekül nach Anspruch 4 oder 5, worin das Nukleotidanalogon ein Zucker-modifiziertes Ribonukleotid ist, worin die 2'-OH-Gruppe ersetzt ist durch eine Gruppe, welche ausgewählt ist aus H, OR, R, Halogen, SH, SR, NH₂, NHR, NR₂ oder CN, wobei R C₁-C₆ Alkyl, Alkenyl oder Alkinyl ist und Halogen F, Cl, Br oder I ist.
RNA-Molekül nach Anspruch 4 oder 5, worin das Nukleotidanalogon ein Rückgrat-modifiziertes Ribonukleotid ist, welches eine Phosphothioat-Gruppe enthält.
RNA-Molekül nach einem der Ansprüche 1 bis 7, welches eine Sequenz mit wenigstens 70 Prozent Identität zu einem vorbestimmten mRNA-Zielmolekül aufweist.
Verfahren zur Herstellung eines doppelsträngigen RNA-Moleküls nach einem der Ansprüche 1 bis 8, umfassend die Schritte: (a) Synthetisieren von zwei RNA-Strängen, wobei jeder RNA-Strang eine Länge von 19 bis 23 Nukleotiden aufweist und wobei wenigstens ein RNA-Strang einen 3'-Überhang von 1 bis 3 Nukleotiden aufweist, wobei die RNA-Stränge ein doppelsträngiges RNA-Molekül bilden können, (b) Vereinigen der synthetisierten RNA-Stränge unter Bedingungen, unter welchen ein doppelsträngiges RNA-Molekül gebildet wird, welches zu zielspezifischer RNA-Interferenz in der Lage ist.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei die RNA-Stränge chemisch synthetisiert werden.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei die RNA-Stränge enzymatisch synthetisiert werden.
In vitro Verfahren zum Vermitteln zielspezifischer RNA-Interferenzen in einer Zelle oder einem Organismus, umfassend die Schritte: (a) Inkontaktbringen der Zelle oder des Organismus mit dem doppelsträngigen RNA-Molekül nach einem der Ansprüche 1 bis 8 unter Bedingungen, unter welchen zielspezifische RNA-Interferenzen auftreten können, und (b) Vermitteln einer zielspezifischen RNA-Interferenz, welche durch die doppelsträngige RNA gegenüber einer Zielnukleinsäure bewirkt wird, die einen Sequenzteil aufweist, der im Wesentlichen der doppelsträngigen RNA entspricht.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei das Inkontaktbringen umfasst, Einführen des doppelsträngigen RNA-Moleküls in eine Zielzelle, in welcher die zielspezifische RNA-Interferenz auftreten kann.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei das Einführen ein Träger-vermitteltes Zuführen oder eine Injektion umfasst.
Verwendung des in vitro Verfahrens nach einem der Ansprüche 12 bis 14 zur Bestimmung der Funktion eines Gens in einer Zelle oder einem Organismus.
Verwendung des in vitro Verfahrens nach einem der Ansprüche 12 bis 14 zur Modulierung der Funktion eines Gens in einer Zelle oder einem Organismus.
Verwendung nach Anspruch 15 oder 16, wobei das Gen mit einem pathologischem Zustand assoziiert ist.
Verwendung eines doppelsträngigen RNA-Moleküls nach einem der Ansprüche 1 bis 8 zur Herstellung eines Medikaments zur Modulierung der Funktion eines Pathogen-assoziierten Gens.
Verwendung nach Anspruch 18, wobei das Pathogen-assoziierte Gen ein virales Gen ist.
Verwendung eines doppelsträngigen RNA-Moleküls nach einem der Ansprüche 1 bis 8 zur Herstellung eines Medikaments zur Modulierung der Funktion eines Tumor-assoziierten Gens
Verwendung eines doppelsträngigen RNA-Moleküls nach einem der Ansprüche 1 bis 8 zur Herstellung eines Medikaments zur Modulierung der Funktion eines Gens, welches mit einer Autoimmunerkrankung assoziiert ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend als ein wirksames Mittel wenigstens ein doppelsträngiges RNA-Molekül nach einem der Ansprüche 1 bis 8 und einen pharmazeutischen Träger.
Zusammensetzung nach Anspruch 22 für diagnostische Anwendungen.
Zusammensetzung nach Anspruch 22 für therapeutische Anwendungen.
Eukaryotische Zelle oder ein eukaryotischer nicht humaner Organismus, welche/welcher mit einem RNA-Molekül nach einem der Ansprüche 1 bis 8 oder einem DNA-Molekül, welches das RNA-Molekül kodiert, transfiziert ist.