KR101330229B1 - 암세포 특이적 세포증식 억제제 - Google Patents

Abstract

RecQ 헬리카아제 패밀리 유전자인 RecQ1의 유전자의 발현을 억제함으로써, 암세포에 있어서 세포 증식 억제 효과가 관찰되긴 하지만, 이러한 효과는 정상 세포인 인간 TIG3 세포(정상 2배체 선유아 세포주)에서는 인정되지 않는 것을 발견했다. 즉, 본 발명자는 RecQ1 유전자에 대한 siRNA가, 해당 유전자의 발현 억제를 통해 암세포 특이적인 세포 증식 억제 작용을 갖는 것을 발견했다.

Description

암세포 특이적 세포증식 억제제{Cancer cell-specific cell proliferation inhibitors}

본 발명은 RecQ1 유전자의 발현을 억제하는 화합물, 특히 해당 유전자의 발현 억제 효과를 가진 siRNA를 함유한 세포 증식 억제제에 관한 것이다.

RecQ DNA 헬리카아제 패밀리 유전자는 대장균과 같은 원핵 생물에서부터 인간을 포함하는 고등 진핵 생물에까지 널리 존재하며, 진화 과정에서 보존되며 다세포화에 따라 다양화된 유전자이다. 대장균에서의 RecQ 유전자가 RecQ 패밀리 유전자의 최초의 발견이며, 접합 재조합, UV상해 복원 RecF 경로에서 기능하는 유전자로서 동정되며(비특허문헌 1 참조), 잘못된 재조합을 억제하는 기능을 가진 것으로 개시되어 있다(비특허문헌 2 참조). 출아 효모에서는 SGS1 유전자가, 분열 효모에서는 Rqh1 유전자가 각각 유일한 RecQ 호모로그로 알려지고, 모두 재조합에 대해 주로 억제적으로 작용하며, 게놈의 안정화에 중요한 역할을 다하고 있다(비특허문헌 3 및 4 참조). 한편, 고등 진핵 생물에서는 복수개의 RecQ 호모로그가 존재하며, 인간에서는 본 발명자들이 동정한 RTS 유전자(비특허문헌 5, 특허문헌 1 및 2 참조)와 RecQL5 유전자(비특허문헌 5, 특허문헌 3 참조)를 포함하여 5개의 RecQ 패밀리 유전자, RecQL1(비특허문헌 6 참조), BLM, WRN, RTS, 그리고 RecQL5 유전자가 알려져 있다. 이들 중 BLM, WRN, 그리고 RTS 유전자는 각각 블룸 증후군(비특허문헌 7 참조), 워너 증후군(비특허문헌 8 참조), 로스문트 톰슨 증후군(비특허문헌 9 참조)의 원인 유전자이며, 이들은 모두 세포의 게놈 안정성에 중요한 작용을 하고 있다.

워너 증후군의 환자에서 유래한 선유아 세포나 림프구계 세포주에서는, 게놈 불안정성을 나타내는 염색체의 전좌나 결실이 높은 빈도로 일어나는 것이 보고되고 있다( 비특허문헌 10 참조). 블룸 증후군의 환자에서 유래한 세포에서는, 염색체의 절단이나 자매염색 분체 교환(SCE)이 빈번하게 보인다(비특허문헌 11 참조). 또 로스문트 톰슨 증후군의 환자에서 유래한 림프구에 있어서는, 2번 염색체나 8번 염색체의 트리소미가 높은 빈도로 인정된다(비특허문헌 12 참조). 이러한 사실은 이들 3개의 유전병의 원인 유전자가 각각 코드하는 WRN 헬리카아제, BLM 헬리카아제, 그리고 RTS 헬리카아제가 세포의 게놈 안정화에 중요한 역할을 하고 있는 것을 나타낸다.

워너 증후군의 환자에서 유래한 림프구계 세포주에서는, 건강한 사람에게서 유래한 세포주와 비교하여 텔로미어 길이의 이상이 인정된다(비특허문헌 13 참조). 또, 건강한 사람에게서 유래한 림프구계 세포주를 계속 이으면, 15% 정도의 비율로 불사화(不死化)되는데 비해, 워너 증후군의 환자에서 유래한 세포주에서는 세포의 불사화가 인정되지 않았다(비특허문헌 14 참조). 이러한 사실은 WRN 헬리카아제가 텔로미어의 구조유지에 작용하며, 림프구계 세포주의 불사화(암화)에 필수임을 나타낸다.

WRN 헬리카아제는 DNA 상해제에 반응하여 핵 내에서 초점을 형성하고, WRN 결합 단백질의 하나로 1쇄 DNA 결합 단백질인 RPA, 및 재조합 복원 인자 RAD51의 포커스와 국재(局在)가 일치하는 점에서, 상동 재조합을 통한 복원 반응에 관여하는 것이 시사되어 있다(비특허문헌 15 참조). 또 WRN 헬리카아제는 DNA 의존성 단백 키나아제 복합체(DNA-PK) 및 플랩 앤드 뉴클레아제1(FEN-1)와 결합하는 것이 알려져 있다. WRN 헬리카아제는 DNA-PK와 결합함으로써 비상동 말단 결합 복원 경로에 있어서 DNA 2중쇄 절단 말단의 프로세싱에 중요한 역할을 한다(비특허문헌 16 참조). 한편, WRN 헬리카아제는 FEN-1에 결합하여 활성화하고, 오카자키 프래그먼트(Okazaki fragment)를 프로세싱하면서, 상동 재조합에 의한 복제 분기점(replication fork)의 재구축을 정확하게 수행하는 장소를 제공한다고 여겨지고 있다(비특허문헌 17 참조). 이상에서 말한 것은 WRN 헬리카아제가 DNA 복제기에서의 DNA 복원에 중요한 역할을 한다는 것을 시사한다.

BLM 헬리카아제는 핵 내에 보이는 특이적인 구조체 PML body에 국재하며, 토포아이소머라아제 III와 결합한다(비특허문헌 18 참조). 또 텔로미어 유지에도 작용한다고 생각되고 있으며, G-quadruplex 구조를 되감는 활성을 가진다(비특허문헌 19 참조). 또 Holliday juction을 풀고 Rad51 단백질과 상호작용하는 것이 보고되고 있다(비특허문헌 20 참조). 이러한 식견에서 BLM 헬리카아제도 다른 DNA 대사 효소와 협조적으로 기능하며, DNA 재조합 복원이나 텔로미어 유지에 중요한 역할을 한다고 생각된다.

인간의 5개의 RecQ DNA 헬리카아제 패밀리, RecQ1, BLM, WRN, RTS, RecQ5 중에 제지기(制止期)에 있는 세포에서는 RecQ1, BLM, WRN, RTS는 대부분 발현하지 않고, 한편 바이러스로 형질전환하며, 증식이 촉진된 세포주에 자주 발현하고 있다(비특허문헌 21 참조). 또 제지기의 세포에 발암 프로모터인 TPA를 첨가하면 세포분열의 유도에 따라 RecQ1, BLM, WRN, RTS의 발현이 유도된다(비특허문헌 21 참조). 이러한 사실은 RecQ DNA 헬리카아제 패밀리의 세포 증식에서의 중요성을 시사하고 있다.

이상을 종합하면, RecQ DNA 헬리카아제 패밀리는 세포의 게놈을 복원하고(BLM, WRN, RTS), 한편 텔로미어의 구조 유지에도 관여하고 있으며(BLM, WRN), 또 어떤 종류의 세포의 불사화에 중요한 역할을 하고(WRN), 나아가 세포분열에 따라 발현이 유도되는(RecQ1, BLM, WRN, RTS) 점에서, 제암(制癌)의 표적으로 유력한 분자라고 생각된다.

그렇지만, 암세포의 증식을 억제할 수 있는 화합물이라도, 정상 세포에 대해 똑같이 증식 억제 효과를 가지는 경우, 해당 화합물은 유용한 항암제로 기대할 수 없다. RecQ1 유전자의 발현을 억제하는 화합물이 정상 세포에 대해 어떻게 작용하는지, 혹은, 해당 화합물이 암세포 특이적으로 세포 증식 억제 효과를 갖는지에 관해서는, 지금까지도 전혀 알려져 있지 않다.

특허문헌 1: 특원평 9-200387호

특허문헌 2: 특원평 11-11218호

특허문헌 3: 특원평 10-81492호(특개평 11-276173호)

비특허문헌 1: Nakayama H, Nakayama K, Nakayama R, Irino N, Nakayama Y, Hanawalt PC 저, 「Isolation and genetic characterization of a thymineless death-resistant mutant of Escherichia coli K12 : identification of a new mutation(recQ1) that blocks the RecF recombination pathway.」, Mol Gen Genet., 1984년, Vo1.195, p.474-480.

비특허문헌 2: Hanada K, Ukita T, Kohno Y, Saito K, Kato J, Ikeda H 저, 「RecQ DNA helicase is a suppressor of illegitimate recombination in Escherichia coli.」, Proc Natl Acad Sci USA., 1997년, Vo1.94, p.3860-3865

비특허문헌 3: Myung K, Datta A, Chen C, Kolodner RD 저, 「SGS1, the Saccharomyces cerevisiae homologue of BLM and WRN, suppresses genome instability and homeologous recombination.」NatGenet., 2001년, Vo1.27, p.113-116

비특허문헌 4: Doe CL, Dixon J, Osman F,Whitby MC 저, 「Partial suppression of the fission yeast rqh1(-) phenotype by expression of a bacterial Holliday junction resolvase.」, EMBO J., 2000년, Vo1.19, p.2751-2762

비특허문헌 5: Kitao S, Ohsugi I, Ichikawa K, Goto M, Furuichi Y, Shimamoto A 저, 「C1oning of two new human helicase genes of the RecQ family: biological significance of multiple species in higher eukaryotes.」, Genomics., 1998년, Vo1.54, p.443-452

비특허문헌 6: Seki,M., Miyazawa,H., Tada,S., Yanagisawa,J., Yamaoka,T., Hoshino,S., Ozawa,K., Eki,T., Nogami,M.,, Okumura K.,등 저, 「Molecular cloning of cDNA encoding human DNA helicase Q1 which has homology to Escherichia coli RecQ helicase and localization of the gene at chromosome 12 p12.」, Nucleic Acids Res, 1994년, Vo1.22, No.22, p.4566-4573

비특허문헌 7: Ellis NA, Groden J, Ye TZ, Straughen J, Lennon DJ, Ciocci S, Proytcheva M, German J 저,「The Bloom's syndrome gene product is homologous to RecQ helicases.」, Cel1, 1995년, Vo1.83, p.655-666

비특허문헌 8: Yu CE, Oshima J, Fu YH, Wijsman EM, Hisama F, Alisch R, Matthews S, Nakura J, Miki T, Ouais S, Martin GM, Mulligan J, Schellenberg GD 저, 「Positional cloning of the Werner's syndrome gene.」, Science, 1996년, Vo1.272, p.258-262

비특허문헌 9: Kitao S, Shimamoto A, Goto M, Miller RW, Smithson WA, Lindor NM, Furuichi Y 저, 「Mutations in RECQL4 cause a subset of cases of Rothmund-Thomson syndrome.」, Nat Genet., 1999년, Vo1.22, p.82-84

비특허문헌 10: Goto M 저, 「Hierarchical deterioration of body systems in Werner's syndrome: implications for normal ageing.」, Mech. Ageing Dev., 1997년, Vo1.98, p.239-254

비특허문헌 11: Ellis NA, German J 저, 「Molecular genetics of Bloom's syndrome.」, Hum Mol Genet., 1996년, Vo1.5, p.1457-1463

비특허문헌 12: Lindor NM, Devries EM, Michel VV, Schad CR, Jalal SM, Donovan KM, Smithson WA, Kvols LK, Thibodeau SN, Dewald GW 저, 「Rothmund-Thomson syndrome insiblings: evidence for acquired in vivo mosaicism.」, Clin Genet., 1996년, Vo1.49, p.124-129

비특허문헌 13: Tahara H, Tokutake Y, Maeda S, Kataoka H, Watanabe T, Satoh M, Matsumoto T, Sugawara M, Ide T, Goto M, Furuichi Y, Sugimoto M 저, 「Abnormal telomere dynamics of B-lymphoblastoid cell strains from Werner's syndrome patients transformed by Epstein-Barrvirus.」, Oncogene, 1997년, Vo1.15, p.1911-1920

비특허문헌 14: Sugimoto M, Furuichi Y, Ide T, Goto M 저, 「Incorrect us of "immortalization" for B-lymphoblastoid cell lines transformed by Epstein-Barrvirus.」, Viro1, 1999년, Vo1.73, p.9690-9691

비특허문헌 15: Sakamoto S, Nishikawa K, Heo SJ, Goto M, Furuichi Y, Shimamoto A 저, 「Werner helicase relocates into nuclear foci in response to DNA damaging agents and co-localizes with RPA and Rad51.」, Genes Cells., 2001년, Vo1.6, p.421-430

비특허문헌 16: Yannone SM, Roy S, Chan DW, Murphy MB, Huang S, Campisi J, Chen DJ 저, 「Werner syndrome protein is regulated and phosphorylated by DNA-dependent protein kinase.」, J Biol Chem., 2001년, Vo1.276, p.38242-38248

비특허문헌 17: Brosh RM Jr, von Kobbe C, Sommers JA, Karmakar P, Opresko PL, Piotrowski J, Dianova I, Dianov GL, Bohr VA 저, 「Werner syndrome protein interacts with human flap endonuclease 1 and stimulates its cleavage activity.」, EMBO J., 2001년, Vo1.20, p.5791-5801

비특허문헌 18: Johnson FB, Lombard DB, Neff NF, Mastrangelo MA, Dewolf W, Ellis NA, Marciniak RA, Yin Y, Jaenisch R, Guarente L 저, 「Association of the Bloom syndrome protein with topoisomerase III alpha in somatic and meiotic cells.」, Cancer Res., 2000년, Vo1.60, p.1162-1167

비특허문헌 19: Mohaghegh P, Karow JK, Brosh Jr RM Jr, Bohr VA, Hickson ID 저, 「The Bloom's and Werner's syndrome proteins are DNA structure-specific helicases」, Nucleic Acids Res., 2001년, Vo1.29, p.2843-2849

비특허문헌 20: Wu L, Davies SL, Levitt NC, Hickson ID 저, 「Potential role for the BLM helicase in recombinational repair via a conserved interaction with RAD51.」, J Biol Chem., 2001년, Vo1.276, p.19375-19381

비특허문헌 21: Kawabe,T., Tsuyama,N., Kitao,S., Nishikawa,K., Shimamoto,A., Shiratori,M., Matsumoto,T., Anno,K., Sato,T., Mitsui,Y., Seki,M., Enomoto,T., Goto,M., Ellis,N.A., Ide,T., Furuichi,Y., and Sugimoto,M. 저, 「DiHbrential regulation of human RecQ family helicases in cell transformation and cell cycle.」, Oncogene., 2000년, Vo1.19, No.41, p.4764-4772.

본 발명은 이와 같은 상황을 감안하여 이뤄진 것으로, RecQ1 헬리카아제 유전자의 발현 억제를 목표로 하는 암세포 특이적인 세포 증식 억제제의 제공을 과제로 한다.

과제를 해결하기 위한 수단

종양 세포에 있어서, RecQ DNA 헬리카아제 패밀리의 발현이 두드러지게 높은 것이 발견되며, RecQ DNA 헬리카아제 패밀리 유전자의 발현 억제를 지표로 한 종양의 증식을 억제하는 화합물의 스크리닝 방법이 알려져 있다. 또, RecQ 헬리카아제 유전자의 발현을 억제하는 화합물은 암세포의 증식을 억제한다는 가능성이 시사되고 있다(특허문헌 「특개2000-166600호」 참조).

그렇지만, RecQ1 유전자의 발현 억제와 암세포 특이적인 세포 증식 억제와의 관계는 지금까지 알려져 있지 않았다.

어느 화합물에 대해 암세포 증식 억제 작용을 갖는 것을 알았던 경우라도, 정상 세포에 대한 증식 억제 작용의 유무가 명확하지 않은 화합물은 효과적인 의약품은 되지 않는다. 해당 화합물이 정상 세포에 대해서도 증식 억제 작용을 보이는 경우, 부작용의 위험을 수반하기 때문이다. 실제로 지금까지 다양한 항암제가 부작용을 갖는 것을 나타낸다고 보고되고 있다(예를 들어, Komarov P.G.et al., Science Vol.285, 1733-1737, 1999; Kamarova E.A. and Gudkov A.V. Biochemistry(Moscow) Vol.65, 41-48, 2000; Botchkarev V.A. Cancer Research Vol.60, 5002-5006, 2000). 세포 증식 억제 작용이 암세포 특이적인 것이며, 정상 세포에는 작용하지 않는 약제를 개발할 수 있다면, 부작용이 적은 아주 유용한 항암제가 될 것으로 기대된다.

본 발명자들은 상기 과제를 해결하기 위해 예의 연구를 했다. RecQ DNA 헬리카아제 패밀리 유전자는 종양 세포계(예를 들어, 암세포 등)에 있어서 발현이 상승하고 있는 것이 알려져 있다. 본 발명자들은 인간의 RecQ 헬리카아제 패밀리 유전자에 속하는 RecQ1 유전자에 대해, 그 발현 억제 효과를 가진 siRNA를 이용하여 RecQ1 유전자의 발현 억제가 암세포의 증식에 미치는 영향을 검토했다. 그 결과, 본 발명자들은 RecQ1 유전자의 발현을 억제함으로써 암 세포에 있어서 세포 증식의 억제 효과가 관찰되긴 하지만, 이러한 효과는 정상 세포인 인간 TIG3 세포(정상 2배체 선유아 세포주)에서는 인정되지 않는 것을 발견했다. 즉, 본 발명자들은 RecQ1 유전자의 발현을 억제함으로써 암 세포 특이적인 세포 증식 억제 작용이 보이는 것을 처음으로 발견했다. 따라서, RecQ1 유전자는 아주 뛰어난 부작용이 적은 제암제(制癌劑)의 타겟 분자라고 생각된다. 또, 본 발명자들은 암 세포에 대해 특이적으로 세포 증식 억제 효과를 갖는 siRNA 분자를 발견하는데 성공했다. 해당 분자를 포함하는 약제는 암 치료에 있어서 부작용이 적은 유효한 의약이 될 것으로 기대된다.

상술한 바와 같이, 기존 항암제의 대부분은 부작용을 가진 것이므로, 본원의 RecQ1 유전자에 관한 siRNA 분자와 같이, 암 세포 증식 억제 작용을 가진 분자가 정상 세포에는 작용하지 않는다는 것을 미리 예상하는 것은 아주 어려운 일이라고 할 수 있다. 즉, 본 발명에 의해 제공되는 siRNA 분자는 당업자라도 예측할 수 없는 유리한 효과(정상 세포에는 작용하지 않고, 암세포 특이적인 세포 증식 억제 효과)를 가진다.

즉, 본 발명은 RecQ1 헬리카아제 유전자의 발현을 타겟으로 하는 암세포 특이적인 세포 증식 억제제, 특히, RecQ1 유전자 발현 억제 효과를 가진 siRNA를 함유하는 암세포 특이적 세포 증식 억제제에 관한 것이며, 보다 구체적으로는,

[1] RecQ1 유전자의 발현을 RNAi 효과에 의해 억제할 수 있는 RNA로, 서열 번호:1∼32, 또는, 서열 번호:40∼43 중 어느 하나에 기재된 염기 서열로 이루어지는 RNA와, 해당 RNA와 상보적인 서열로 이루어지는 RNA가 혼성화된 구조를 포함하는 이중가닥 RNA.

[2] 말단에서 1 또는 복수개의 DNA 또는 RNA가 오버행(overhang)한 구조를 가진 [1]에 기재된 이중가닥 RNA.

[3] 서열 번호: 1∼32 또는 서열 번호: 40∼43 중 어느 하나에 기재된 염기 서열로 이루어지는 RNA를 발현할 수 있는 DNA 벡터.

[4] [1] 또는 [2]에 기재된 RNA, 또는 [3]에 기재된 DNA를 함유하는 암세포 특이적 세포 증식 억제제.

[5] [4]에 기재된 암세포 특이적 세포 증식 억제제를 유효성분으로 함유하는 항암제를 제공하는 것이다. 또한, 상기 암세포는, 바람직하게는 인간의 암세포(인간에서 유래한 암세포)를 가리킨다.

나아가, 본 발명은,

[6] [1] 또는 [2]에 기재된 RNA, 또는 [3]에 기재된 DNA를, 개체(대상자, 피검자, 환자 등)에 투여하는 공정을 포함하는 암세포 특이적으로 세포의 증식을 억제하는 방법(암의 치료 방법),

[7] [1] 또는 [2]에 기재된 RNA, 또는 [3]에 기재된 DNA의 암세포 특이적 항암제(암세포 특이적 세포 증식 억제제)의 제조에서의 사용,

에 관한 것이다.

발명을 실시하기 위한 최량의 형태

본 발명자들에 의해 RecQ DNA 헬리카아제 패밀리 유전자에 속하는 RecQ1 유전자의 발현을 억제함으로써 암세포(종양 세포) 특이적으로 세포 증식이 억제되는 것이 발견되었다. 또 본 발명자들은 RecQ1 유전자의 발현을 RNAi 효과에 의해 억제함으로써 효과적으로 암세포 특이적으로 세포 증식 억제 작용을 가진 RNA분자를 발견했다.

따라서, 본 발명은 우선, RecQ1 유전자의 발현을 RNAi 효과에 의해 억제할 수 있는 RNA(siRNA, shRNA)를 제공한다. 해당 RNA는 암세포 특이적인 세포 증식 억제 작용을 가진다. 본 발명에 있어서 「암세포 특이적」이란, 암 세포에 대해 작용하지만, 정상 세포에 대해서는 실질적으로 작용하지 않는(효과적인 작용을 나타내지 않는) 것을 말한다. 정상 세포에 대한 작용이 암세포에 대한 작용보다도 두드러지게 낮은 경우도 본 발명에서의 「암세포 특이적」에 포함된다.

본 발명의 RecQ1 유전자의 염기 서열에 관한 정보는 당업자에 있어서는, 공공의 유전자 데이터베이스(예를 들어, GenBank 등)로부터 쉽게 취득할 수 있다. 상기 유전자의 GenBank의 액세션 번호의 일 예를 이하에 나타낸다.

RecQ1 유전자: NM-002907(서열 번호:33), NM-032941(서열 번호:34), BC001052(서열 번호:35), D37984(서열 번호:36), L36140(서열 번호:37)

또, 본 발명의 RecQ1 유전자에 의해 코드되는 단백질의 아미노산 서열의 일 예를 서열 번호:38에 나타낸다.

또, 본 발명의 RecQ1 유전자는 특별히 제한되는 것은 아니지만, 통상, 동물에서 유래하며, 더 바람직하게는 포유동물에서 유래하며, 가장 바람직하게는 인간에서 유래하는 것이다.

본 발명의 RecQ1 유전자의 발현을 RNAi(RNA interferance; RNA간섭) 효과에 의해 억제할 수 있는 RNA(본 명세서에 있어서, 간략히 「본 발명의 siRNA」로 기재하는 경우가 있다)는 더욱 구체적으로는 서열 번호:1∼32 중 어느 하나에 기재된 염기 서열을 포함하는 RNA를 들 수 있다. 또, 본 발명의 siRNA의 더 바람직한 태양에서는, 서열 번호:1∼32 중 어느 하나에 기재된 염기 서열로 이루어지는 RNA를 한 쪽의 사슬로 하는 이중가닥 RNA(siRNA)를 들 수 있다.

본 발명은 RecQ1 유전자의 발현을 RNAi 효과에 의해 억제할 수 있는 RNA(siRNA)로, 서열 번호:1∼32 중 어느 하나에 기재된 염기 서열로 이루어지는 RNA와, 해당 RNA와 상보적인 서열로 이루어지는 RNA가 혼성화된 구조를 포함하는 이중가닥 RNA를 제공한다.

예를 들어, 서열 번호:1에 기재된 염기 서열(5'-cuacggcuuuggagauaua-3')을 포함하는 것을 특징으로 하는 본 발명의 siRNA란, 이하와 같은 구조의 RNA 분자를 예시할 수 있다.

(상기 'I'는 수소 결합을 나타낸다.)

또한, 상기 RNA분자에 있어서 한 쪽의 끝이 닫힌 구조의 분자, 예를 들어, 헤어핀 구조를 가진 siRNA(shRNA)도 본 발명에 포함된다. 즉, 분자내에서 이중가닥 RNA구조를 형성할 수 있는 분자도 또한 본 발명에 포함된다.

예를 들어, 5'-cuacggcuuuggagauaua(서열 번호:1)(xxxx)n uauaucuccaaagccguag(서열 번호:39)-3'과 같은 분자도 또한 본 발명에 포함된다.(상기「(xxxx)n」은 임의 염기 및 서열수로 이루어지는 폴리뉴클레오티드를 나타낸다.)

본 발명에서의 siRNA의 바람직한 태양에 있어서는, RecQ1 유전자의 발현을 RNAi 효과에 의해 억제할 수 있는 RNA(siRNA)로, 서열 번호:1∼32 중 어느 하나에 기재된 염기 서열로 이루어지는 RNA와, 해당 RNA와 상보적인 서열로 이루어지는 RNA가 혼성화된 구조로 이루어지는 이중가닥 RNA를 적합하게 나타낼 수 있다. 단, 이 이중가닥 RNA의 말단에서, 예를 들어, 1 또는 복수개의 RNA가 부가 또는 빠진 구조의 이중가닥 RNA도 또한 본 발명에 포함된다. 그 경우, 이중가닥을 형성하는 RNA는 RecQ1 유전자의 부분 서열과 상동성을 갖는 것이 바람직하다. 본 발명의 siRNA에 있어서, 이중가닥을 형성하는 영역의 RNA의 길이는, 통상 15∼30bp의 길이이고, 바람직하게는 15∼27bp 정도의 길이이며, 더 바람직하게는 19∼21bp의 길이이고, 가장 바람직하게는 19bp(예를 들어, 서열 번호 1∼32 중 어느 하나에 기재된 RNA를 한쪽의 사슬로 하는 siRNA)의 길이인데, 반드시 이러한 길이에 한정되는 것은 아니다.

또, 본 발명에서의 siRNA는 반드시 모든 뉴클레오티드가 리보뉴클레오티드(RNA)가 아니어도 상관없다. 즉, 본 발명에 있어서, siRNA를 구성하는 1 또는 복수개의 리보뉴클레오티드는 대응하는 데옥시리보뉴클레오티드일 수도 있다. 여기서「대응한다」라는 것은 당 부분의 구조는 다르지만, 동일한 염기종(아데닌, 구아닌, 시토신, 티민(우라실)) 임을 가리킨다. 예를 들어, 아데닌을 가진 리보뉴클레오티드에 대응하는 데옥시리보뉴클레오티드란, 아데닌을 가진 데옥시리보뉴클레오티드를 말한다. 또 상기 「복수」란, 특별히 제한되지 않지만, 바람직하게는 2∼5개 정도의 소수를 가리킨다.

일반적으로 RNAi란, 표적 유전자의 mRNA 서열과 상동인 서열로 이루어지는 센스 RNA 및 이와 상보적인 서열로 이루어지는 안티센스 RNA로 이루어지는 이중가닥 RNA를 세포 내에 도입함으로써 표적 유전자 mRNA의 파괴를 유도하고, 표적 유전자의 발현이 저해되는 현상을 말한다. RNAi의 상세한 시스템에 관해서는 아직까지 불분명한 부분도 있지만, DICER라고 불리는 효소(RNase III 핵산 분해 효소 패밀리의 일종)가 이중가닥 RNA와 접촉하고, 이중가닥 RNA가 small interfering RNA 또는 siRNA라고 불리는 작은 단편으로 분해되는 것으로 생각되고 있다. 본 발명에서의 RNAi 효과를 가진 이중가닥 RNA란, 바람직하게는 이 siRNA를 가리킨다.

본 발명의 바람직한 태양에 있어서는, RecQ1 유전자의 발현을 RNAi 효과에 의해 억제할 수 있는 RNA로, 서열 번호:1∼32 중 어느 하나에 기재된 염기 서열로 이루어지는 RNA와, 해당 RNA와 상보적인 서열로 이루어지는 RNA가 혼성화된 구조를 가진 이중가닥 RNA이다.

나아가, 본 발명의 siRNA(이중가닥 RNA)를 발현할 수 있는 DNA도 또한 본 발명에 포함된다. 즉 본 발명은 본 발명의 이중가닥 RNA를 발현할 수 있는 DNA(벡터)를 제공한다. 본 발명의 상기 이중가닥 RNA를 발현할 수 있는 DNA(벡터)는 통상 해당 이중가닥 RNA의 한 쪽의 사슬을 코드하는 DNA, 및 해당 이중가닥 RNA의 다른 쪽의 사슬을 코드하는 DNA가 각각 발현할 수 있도록 프로모터와 연결된 구조를 가진 DNA이다. 본 발명의 상기 DNA는 당업자에 있어서는, 일반적인 유전자 공학 기술에 의해 쉽게 제작할 수 있다. 더욱 구체적으로는 본 발명의 RNA를 코드하는 DNA를 공지의 다양한 발현 벡터에 적당히 삽입함으로써, 본 발명의 발현 벡터를 제작하는 것이 가능하다.

일반적으로, RNAi 효과를 가진 이중가닥 RNA는 발현을 억제하고 싶은 표적 유전자의 mRNA에서의 연속하는 RNA 영역과 상동인 서열로 이루어지는 센스 RNA, 및 해당 센스 RNA에 상보적인 서열로 이루어지는 안티센스 RNA로 이루어지는 이중가닥 RNA이다.

또한 통상 말단에 수염기의 오버행을 가진 이중가닥 RNA는 RNAi 효과가 높은 점에서, 본 발명의 이중가닥 RNA는 말단에 수염기의 오버행을 갖는 것이 바람직하다. 이 오버행을 형성하는 염기의 길이 및 서열은 특별히 제한되는 것은 아니다. 또 이 오버행은 DNA 및 RNA 중 어느 것이라도 상관없다. 바람직하게는 2 염기의 오버행을 예시할 수 있다. 본 발명에 있어서는, 예를 들어, TT(티민이 2개), UU(우라실이 2개), 기타 염기의 오버행을 가진 이중가닥 RNA(가장 바람직하게는 19 염기의 이중가닥 RNA와 2 염기(TT)의 오버행을 가진 분자)를 적절히 이용할 수 있다. 본 발명의 이중가닥 RNA에는 이와 같이 오버행을 형성하는 염기가 DNA인 것 같은 분자도 포함된다.

예를 들어, 오버행 부분의 염기가 TT인 경우에는, 본 발명의 siRNA 분자로는,

와 같은 분자(3'측에 TT가 부가된 분자)를 예시할 수 있다.

본 발명의 상기「RecQ1 유전자에 대해 RNAi 효과를 가진 이중가닥 RNA」는, 당업자에 있어서는, 본 명세서에 의해 개시된 염기 서열을 토대로 적절히 제작할 수 있다. 구체적으로는 서열 번호:1∼32 중 어느 하나에 기재된 염기 서열을 토대로, 본 발명의 이중가닥 RNA를 제작할 수 있다. 한쪽의 사슬(예를 들어, 서열 번호:1∼32 중 어느 하나에 기재된 염기 서열)이 판명되었으면, 당업자로서는 쉽게 다른 쪽 사슬(상보쇄)의 염기 서열을 알 수 있다. 본 발명의 siRNA는 당업자로서는 시판되는 핵산 합성기를 이용하여 적절히 제작하는 것이 가능하다. 또한 원하는 RNA의 합성에 대해서는, 일반적인 합성수탁 서비스를 이용하는 것이 가능하다.

본 발명의 siRNA(예를 들어, 서열 번호:1∼32 중 어느 하나에 기재된 염기 서열을 한 쪽의 사슬로 하는 이중가닥 RNA 분자)는 암세포 특이적인 세포 증식 억제 작용을 가지므로, 본 발명은 본 발명의 siRNA를 유효성분으로 함유하는 암세포 특이적 세포 증식 억제제를 제공한다.

본 발명에 있어서, 암세포에서의 세포 증식 억제 작용이 아폽토시스의 유도에 기인하는 경우에는, 본 발명의 siRNA는 암세포 특이적인 아폽토시스 유도제가 되는 것으로 기대된다.

아폽토시스란 일반적으로 생리적 조건하에 세포 스스로가 적극적으로 일으키는 세포사(細胞死)를 말한다. 아폽토시스의 형태로는, 예를 들어, 세포 핵의 염색체 응집, 세포핵의 단편화, 세포 표층 미세융모의 소실, 세포질의 응집 등을 들 수 있다. 따라서, 본 발명에서의 아폽토시스 유도 작용이란, 예를 들어, 세포에 있어서 상기한 아폽토시스의 형태를 유도하는 작용을 가리키는데, 반드시 상기한 형태의 유도에만 한정되는 것은 아니다. 당업자에 있어서는, 세포의 아폽토시스 유도가 일어나고 있는지 아닌지에 대해 적절히 판단하는 것이 가능하다.

본 발명의 암세포 특이적인 아폽토시스 유도제는, 예를 들어, 아폽토시스 유도 작용을 매커니즘으로 하는 항암제(제암제)가 되는 것이 기대된다.

또한 본 발명은 본 발명의 암세포 특이적인 세포 증식 억제제를 유효성분으로 하여 함유하는 항암제(암치료를 위한 의약 조성물)를 제공한다.

본 발명의 약제는 약학적으로 허용되는 담체과 혼합된 상태로 제공되는 것도 가능하다. 이들 약학적으로 허용되는 담체로, 예를 들어, 계면 활성제, 부형제, 착색료, 착향료, 보존료, 안정제, 완충제, 현탁제, 등장화제, 결합제, 붕해제, 활택제, 유동성 촉진제, 교미제 등을 들 수 있는데, 이들에 제한되지 않고 기타 통상적으로 사용되는 담체를 적절히 사용할 수 있다.

본 발명의 약제의 제제화에 있어서는, 통상적인 방법에 따르며, 필요에 따라 상기 담체를 첨가할 수 있다. 구체적으로는 경질 무수규산, 유당, 결정 셀룰로오스, 만니톨, 전분, 카르멜로오스 칼슘, 카르멜로오스 나트륨, 히드록시프로필 셀룰로오스, 히드록시프로필메틸 셀룰로오스, 폴리비닐아세탈 디에틸아미노아세테이트, 폴리비닐 피롤리돈, 젤라틴, 중쇄 지방산 트리글세라이드, 폴리옥시에틸렌 경화피마자유60, 백설탕, 카로복시메틸 셀룰로오스, 옥수수 전분, 무기염류 등을 들 수 있다.

상기 약제의 제형의 종류로는, 예를 들어, 경구제로 정제, 분말제, 환제, 산제, 과립제, 세립제, 연ㆍ경 캡슐제, 필름 코팅제, 펠렛제, 설하제, 페이스트제 등, 비경구제로 주사제, 좌제, 경피제, 연고제, 경고제, 외용액제 등을 들 수 있어, 당업자로서는 투여 경로나 투여 대상 등에 따른 최적의 제형을 선택할 수 있다.

RecQ1 유전자를 억제하는 본 발명의 siRNA를 발현하는 DNA를 생체 내에 투여하는 경우, 레트로 바이러스, 아데노 바이러스, 센다이 바이러스 등의 바이러스 벡터나 리포솜 등의 비바이러스 벡터를 이용할 수 있다. 또 RecQ1 유전자를 억제하는 본 발명의 합성 siRNA를 생체 내에 투여하는 경우, 리포솜, 고분자 미셀, 양이온성 캐리어 등의 비바이러스 벡터를 이용할 수 있다. 투여 방법으로는, 예를 들어 in vivo법 및 ex vivo법을 들 수 있다.

본 발명에는 암세포 특이적 세포 증식 억제 작용을 가진 상기한 의약 조성물도 포함된다. 본 발명의 약제 또는 의약 조성물의 투여량은, 제형의 종류, 투여 방법, 환자의 연령이나 체중, 환자의 증상 등을 고려하고, 최종적으로는 의사의 판단에 의해 적절히 결정할 수 있다.

또한, 본 발명에 있어서 세포 증식 억제 효과가 기대되는 암의 종류는 특별히 제한되는 것은 아니지만, 예를 들어, 유방암, 폐암, 골육종, 자궁경부암, 섬유 육종, 난소의 기형암, 태생기암, 방광암, 만성 골수성 백혈병, 급성 림프아구성 백혈병,신경교아세포종, 간암, 교아세포종, 흑색종, 신장암, 췌장암, 위암, 전립선암 등을 예시할 수 있다.

또 본 발명은 본 발명의 RNA 또는 DNA, 또는 본 발명의 약제를 개체(예를 들어, 환자 등) 또는 세포 조직(암세포 조직 등)에 투여하는 공정을 포함하는, 암세포 특이적으로 세포의 증식을 억제하는 방법, 및 암세포 특이적으로 암을 억제하는 방법(암세포 특이적인 암치료 방법)에 관한 것이다.

본 발명의 방법에서의 개체란, 바람직하게는 인간이지만, 특별히 제한되지 않고, 인간이 아닌 동물일 수도 있다.

개체로의 투여는, 일반적으로는, 예를 들어 동맥내 주사, 정맥내 주사, 피하 주사 등 당업자에게 공지의 방법에 의해 수행할 수 있다. 투여량은 대상자(환자 등)의 체중이나 연령, 투여 방법 등에 따라 변동하는데, 당업자라면 적절한 투여량을 적절히 선택하는 것이 가능하다.

나아가, 본 발명은 본 발명의 RNA 또는 DNA, 또는 본 발명의 약제에 대한 암세포 특이적 세포 증식 억제제 또는 항암제의 제조에서의 사용에 관한 것이다.

또한 본 명세서에 있어서 인용된 모든 선행 기술 문헌은 참조로서 본 명세서에 통합된다.

도 1은 실시예에서 이용한 RecQ1 유전자에 대한 siRNA의 염기 서열을 기재한 도면이다. 모든 서열은 RNA이고, 모든 siRNA의 오버행 서열은 데옥시뉴클레오티드의 TT이다.
도 2는 RecQ1 유전자에 대한 siRNA를 도입한 HeLa 세포에서의 RecQ1 유전자의 발현량을 나타내는 도면이다.
도 3은 RecQ1 유전자에 대한 siRNA를 도입한 HeLa 세포에서의 96시간후의 생존율을 나타내는 도면이다.
도 4는 RecQ1 유전자에 대한 siRNA를 TIG3 세포에 도입하고, 48시간후의 mRNA의 발현을 반정량 RT-PCR에 의해 정량한 결과를 나타내는 그래프이다. NS는 대조군 siRNA이다. 15와 24는 도 1에 나타내는 siRNA의 서열 번호가다. 비사일렌싱(non-silencing) siRNA를 도입했을 때의 유전자 발현을 100%로 했다.
도 5는 RecQ1 유전자에 대한 siRNA를 도입한 TIG3 세포에서의 96시간후의 생존율을 나타내는 그래프이다. NS는 대조군 siRNA이다. 15와 24는 도 1에 나타내는 siRNA의 서열 번호가다. 비사일렌싱 siRNA를 도입했을 때의 세포수를 100%로 했을 때의 세포수를 나타낸다.
도 6은 RecQ1 유전자에 대한 siRNA의 약효평가의 결과를 나타내는 도면이다. NT는 미처리 담암 마우스를 가리킨다.

이하, 실시예에 의해 본 발명을 구체적으로 설명하는데, 본 발명은 이에 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1] 세포 배양

인간 암세포로서 HeLa 세포(인간 자궁경부암 세포)를 인간 정상 세포로서 TIG3 세포(정상 이배체 선유아(線維牙) 세포)를 사용했다. HeLa 세포 및 TIG3 세포를 10% 우태아 혈청, 50μg/ml 겐타마이신을 포함하는 둘베코 변형 이글 배지를 이용하여 37도, 5% CO₂조건하에서 배양했다.

[실시예 2] siRNA의 설계

RecQ1 유전자에 대한 32개의 siRNA를, Elbasher 등의 방법(Elbasher, M.S.et al. Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells. Nature 411, 494-498(2001).) 및 Reynolds 등의 방법(Reynolds A.et al., Rational siRNA design for RNA interference. Nat Biotechnol. 3, 326-30. (2004).)에 따라 설계했다. 각각의 siRNA 서열을 도 1에 나타낸다. siRNA를 Qiagen사에서 합성했다.

[실시예 3] RecQ1 유전자 발현 억제에 의한 암세포 특이적인 세포 증식 억제 효과

(1) siRNA에 의한 RecQ1 유전자의 발현 억제

트랜스펙션을 수행하기 24시간 전에, 세포를 0.8-1.5×10⁴개/웰의 밀도로 24웰 플레이트에 파종하고, 20-50% 컨플루언트의 상태에서 siRNA를 트랜스펙션했다. 1웰당 10pmo1의 siRNA를, Oligofectamine(Invitrogen) 혹은, Lipofectoamine 2000(Invitrogen)을 사용하여 제조자의 프로토콜에 따라 트랜스펙션했다. siRNA 도입 24시간 후의 RecQ1 유전자의 mRNA 발현을 Taqman PCR에 의해 정량했다. 상세하게는, siRNA를 트랜스펙션후 24시간의 세포에서부터, RNeasy MiniKit(Qiagen)을 이용하여 전RNA를 추출했다. 정량적 PCR에는, ABI PRISM 7000 Sequence Detection System(Applied Biosystems)을 이용했다. RecQ1 유전자 및 β-액틴 유전자의 RT- PCR용 프라이머 및, TaqMan 프로브를, Applied Biosystems으로부터 구입했다. RT-PCR 반응을, QuantiTect Probe RT-PCR Kit(Qiagen)을 이용하여 그 메뉴얼에 따라 수행했다. RecQ1 mRNA의 발현을, β-액틴을 표준으로 이용하여 정량 비교했다. RecQ1의 유전자 발현에 영향을 주지 않는 대조군 siRNA를 도입한 세포에서의, RecQ1 유전자의 mRNA의 발현량을 100%로 하여, 각각의 siRNA를 도입한 세포에서의 RecQ1 mRNA의 발현을 비교했다.

(2) 세포 증식 시험

상기한 조건과 마찬가지로 siRNA를 트랜스펙션하여 96시간후에, 생세포를 생세포수 측정시약 SF(나카라이 테스크)를 이용하여 측정했다. N=3에서 실험을 하고, 그 평균값을 산출했다. RecQ1 유전자의 발현에 영향을 나타내지 않는 대조군 siRNA를 도입한 세포의 생세포수를 100%로 하여, 각각의 siRNA를 도입한 세포의 생세포수를 산출했다.

(3) 결과

인간 자궁경부암 세포인 HeLa 세포를 사용하여 siRNA에 의한 RecQ1 유전자의 발현 억제가 세포의 증식에 미치는 영향을 조사했다. RecQ1 유전자에 대한 32종류의 siRNA를 각각 HeLa 세포에 도입한 결과, 모든 siRNA에 70% 이상의 유전자 발현 억제 효과가 관찰되었다(도 2). 이 조건하에서, 96시간 후의 HeLa 세포의 생세포수를 NS-siRNA 처리군과 비교한 바, 모든 siRNA 처리군에서 30% 이상의 증식 억제가 관찰되었다(도 3).

이어, TIG3 세포를 이용하여 정상 세포의 증식에 대한 영향을 조사했다. HeLa 세포에서 강한 증식 억제 효과를 나타낸 서열 번호 15와 24의 siRNA를, 각각 TIG3 세포에 도입한 바, RecQ1 유전자의 발현을 각각 거의 70% 억제했다(도 4). 이 조건 하에서, 96시간 후의 TIG3 세포의 생세포수를 NS-siRNA 처리군과 비교한 바, TIG3 세포의 증식에는 영향이 인정되지 않았다(도 5).

이러한 결과로부터, RecQ1-siRNA는 암세포의 증식을 강하게 저해하고, 정상 세포의 증식에는 대부분 영향을 나타내지 않는 것이 증명되었다.

[실시예 4] 담암 동물 모델에서의 siRNA에 의한 종양 세포의 증식 저해

동물 시험에 이용한 siRNA 및 27 mer dsRNA 서열을 이하에 나타낸다.

상기 기재한 RecQ1-siRNA로 처리한 HeLa 세포의 RecQ1 유전자의 발현량은 이하와 같다.

	유전자발현량
33	3%
34	19%
35	18%
36	6%
NS	100%

RecQ1 헬리카아제의 siRNA에 의한 종양 세포의 증식 저해가 담암 동물 모델에서도 일어나는지를 검증했다. 상기에 나타낸 RecQ1 유전자에 대한 siRNA와 27 mer dsRNA를 사용했다.

웅성 BALB/cA 누드 마우스를 일본 크레아(CLEA Japan,Inc)로부터 구입했다. A549세포(5×10⁶개/0.1ml)을 누드 마우스(생후 7주)의 배부에 피하 이식했다. siRNA의 투여는 종양세포의 이식 후 8일째 개시했다. RecQ1-siRNA에 관해 5'말단이 인산화형의 22μg siRNA를 50μl의 생리 식염수중에서 5μg의 폴리에틸렌이민(분자량 10,000, Wako)과 혼합했다. 이 혼합물을 고형 종양의 최상부에 3일마다 6회(8, 11, 14, 17, 20, 23일째) 피하 주사했다. 종양 부피는 노기스에 의해 측정했다. 종양 부피를 산출하기 위한 식은 L×W²/로 했다.여기서, L은 종양의 긴 지름이고, W는 짧은 지름이다. t검정을 이용함으로써 종양 부피의 통계학적 유의성에 대해 해석했다.

그 결과, 모든 RecQ1-siRNA는 종양의 증식을 억제했지만, 폴리에틸렌이민과 같이 혼합한 NS-siRNA(인간 및 마우스의 유전자 발현에 영향을 미치지 않는 siRNA)는 효과가 없고, 종양의 부피는 증가했다(도 6). RecQ1-siRNA와 폴리에틸렌이민의 혼합물을 투여한 마우스는 비담암 마우스와 비교하여 체중 감소는 인정되지 않으며, 이 처리에 의한 중요한 부작용은 없는 것으로 나타났다.

본 발명자의 연구에서, RecQ1 헬리카아제의 발현 사일렌싱(silenecing)이 담암 동물 모델의 종양 억제를 일으키는 것이 명백해졌다.

어떤 화합물에 대해 암 세포 증식 억제 작용을 갖는 것을 안 경우라도, 정상 세포에 대한 증식 억제 작용의 유무가 분명하지 않은 화합물은, 의약품으로 사용하기는 어렵다. 해당 화합물이 정상 세포에 있어서도 세포 증식 억제 작용을 보이는 경우, 부작용의 위험을 수반하기 때문이다. 즉, 세포 증식 억제 작용이 암세포 특이적인 것이 아니면, 실제로 의약품으로 사용하는 것은 일반적으로 곤란하다. 본 발명의 약제(RNAi 효과를 가진 핵산)는 세포 증식 억제 작용이 암세포 특이적인 점에서 아주 실용적이고 실효성 높은 약제라고 할 수 있다.

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Claims (5)

1. RecQ1 유전자의 발현을 RNAi 효과에 의해 억제할 수 있는 RNA로, 서열 번호:40에 기재된 염기 서열로 이루어지는 RNA와, 해당 RNA와 상보적인 서열로 이루어지는 RNA가 혼성화된 구조를 포함하는 이중가닥 RNA.
2. 제1항에 있어서,
   말단에 있어서, 1 또는 복수개의 DNA 또는 RNA가 오버행(overhang) 구조를 갖는 것을 특징으로 하는 이중가닥 RNA.
3. 서열 번호:40에 기재된 염기 서열로 이루어지는 RNA를 발현할 수 있는 DNA 벡터.
4. 제1항 또는 제2항의 이중가닥 RNA 또는 제3항의 DNA 벡터를 함유한 암세포특이적 세포 증식 억제제.
5. 제4항의 암세포 특이적 세포 증식 억제제를 유효성분으로 포함하는 항암제.

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