KR20070083828A - Ｎａｖ１．８의 짧은 간섭 핵산 억제를 위한 조성물 및방법 - Google Patents

Ｎａｖ１．８의 짧은 간섭 핵산 억제를 위한 조성물 및방법 Download PDF

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사미어 고레가오커
토니 프리스틀리
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쉐링 코포레이션
캔지, 인크.
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Abstract

본 발명은 Nav 1.8 나트륨 채널 유전자로부터 mRNA의 RNAi-유도된 분해를 유발하는, 일본쇄 또는 이본쇄의 짧은 간섭 핵산; 이러한 짧은 간섭 핵산을 포함하는 약제학적 조성물; 이러한 짧은 간섭 핵산을 포함하는 재조합 벡터; mRNA의 해독을 억제하는 방법; 폴리펩타이드의 발현을 억제하는 방법; 세포내에서 막 전위를 차단시키는 방법; 세포내에서 나트륨 전류를 차단시키는 방법; 및 만성 통증을 억제하는 방법을 제공한다.
짧은 간섭 핵산, Ｎａｖ１.８ 나트륨 채널 유전자, 나트륨 전위, 만성 통증 억제

Description

Ｎａｖ１．８의 짧은 간섭 핵산 억제를 위한 조성물 및 방법{Compositions and methods for short interfering nucleic acid inhibition of Nav1.8}
관련 출원의 교차 참조
본 출원은 이의 기재 내용 전체가 본원에 참조로 인용된, 2004년 10월 27일자로 출원된 미국 가특허원 제60/622,484호의 35 USC 119(e)하의 우선권의 이익을 청구한다.
본 발명은 Nav1.8 나트륨 채널 유전자로부터의 mRNA의 RNAi-유도된 분해를 유발하는 일본쇄(sigle-stranded) 또는 이본쇄의 짧은 간섭 핵산(short interfering nucleic acid); 이러한 짧은 간섭 핵산을 포함하는 약제학적 조성물; 이러한 짧은 간섭 핵산을 포함하는 재조합 벡터; mRNA의 해독을 억제하는 방법; 폴리펩타이드의 발현을 억제하는 방법; 세포에서 막 전위를 차단하는 방법; 세포에서 나트륨 전류를 차단하는 방법; 및 만성 통증을 억제하는 방법을 제공한다.
만성 통증은 AIDS, 암 화학치료요법, 당뇨병에 의해 유발되거나, 또는 말초 신경에 대한 직접적인 물리적 외상에 의해 유발되는 것에 상관없이 말초 신경병증(neuropathy)의 주요 증상이다. 이러한 신경병증성 통증(neuropathic pain)은 흔히 고도로 쇠약하게 만들며 치료학적 중재에 대해 내성이다.
신경병증성 통증의 동물 모델은, 신경병증 상태의 유지에 있어서의 현저한 특징은 손상후 말초 신경내 감각 구심 뉴우런(sensory afferent neuron)의 비정상적이고, 지속적인 과다흥분성이다. 또한, 일반적인 임상적 발견은, 리도카인과 같은 광범위한 스펙트럼의 나트륨 채널 차단제가 신경병증성 통증을 실제로 제어할 수 있다는 것이다. 그러나, 신경병증성 통증에서 개개인의 나트륨 채널 아형의 상대적 기여는 명확하지 않다.
전압-작동(voltage-gated) 나트륨 채널은 뉴우런에서 작동 전위의 개시 및 전파에 중요하다. 또한, 이들 채널은 뉴우런 흥분성(excitability)의 조절에 관여되어 있다. 따라서, 전압-작동 나트륨 채널은 말초 및 중추 신경계 둘 다를 통해 침해수용(nociceptive) 정보를 전파하는데 있어 중요한 역활을 담당한다. 말초 신경 손상은 손상 부위 주변에 주요 구심의 막내에 나트륨 채널이 축적되도록 한다. 이는 반복 발사, 및 손상된 구심 및 이들의 손상되지 않은 이웃 둘 다의 흥분성에 있어서의 증가를 초래한다. 흥분성에 있어서의 이러한 증가는 신경병증성 통증의 발현을 위해 중요한 것으로 여겨진다.
나트륨 채널의 10개 이상의 상이한 동형이 뇌, 뉴우런 및 가로무늬근에서 확인되었다. 나트륨 채널의 주요 성분은 채널의 구멍을 형성하는 260kDa α-소단위이다. α-소단위는 이종 도메인인, DI, DII, DIII 및 DIV로 구성되어 있으며, 이 들 각각은 6개의 전이막 분획인 S1 내지 S6으로 구성되어 있다. 대부분의 나트륨 채널은 보조 β-소단위인, β1 내지 β4와 연합되어 있으며, 이들의 평균 분자량은 30 kDa이다. β-소단위는 이들 채널의 발현 수준 및 동기(gating)를 조절한다.
3개의 나트륨 채널 동형인, Nav1.7, Nav1.8 및 Nav1.9는 PNS에서 주로 발현된다. Nav1.7은 말초 신경계에 널리분포하므로, 이는 모든 유형의 후근 신경절 뉴우런, 신경집 세포 및 신경내분비 세포내에서 존재한다. Nav1.7는 나노몰량의 테트로도톡신에 대해 민감성이다. Nav1.8은 감각 구심 신경 및 후근 신경절 및 삼차 신경절의 뉴우런에서만 발견된다. Nav1.8 채널은 테트로도톡신에 대해 고도로 내성이며, 이의 IC50은 50μM 이상이다. Nav1.9는 또한 후근 신경절과 삼차 신경절의 소 섬유에서 발현되며 또한 나노몰 농도의 테트로도톡신에 대해 내성이지만, ~40μM의 테트로도톡신에 의해 최대로 차단된다.
통증의 치료시 치료학적 표적을 탐색하는데 있어서의 최근의 관심은 이의 명백한 분획이 통증을 느끼는 '통각수용기'로 알려진, 성인 후근 신경절 뉴우런에서 발견된 테트로도콕신 내성 나트륨 채널에 초점을 맞춰왔다. 하나의 이러한 나트륨 채널은 Nav1.8이며, 이는 이전에 PN3 또는 말초 신경 나트륨 채널 제3형으로 공지되었다. 당해 채널은 만성 통증 상태에서 후근 신경절에서 상향조절되는 것으로 밝혀졌다. 또한, Nav1.8의 생물리학적 특성은, 당해 채널이 손상후 말초 뉴우런의 지 속적인 반복 발사를 유지하기 위한 유사 후보물이 되도록 한다. 더우기, Nav1.8의 발현이 후근 신경절의 감각 뉴우런에 있어서 말초로 한정된다는 사실은, 당해 채널의 차단으로 신경병증성 통증으로부터 최소의 부작용으로 완화시킬 수 있음을 제안한다. 그러나, 이러한 가능성은, 현재 유용한 나트륨 채널 차단제가 나트륨 채널 아형 사이에 구별되지 않으므로, 약력학적으로 시험할 수 없다.
신경병증성 통증의 동물 모델에서 Nav1.8 발현의 안티센스 올리고데옥시뉴클레오타이드 표적화를 사용하여 이러한 채널의 선택적으로 약화된 발현이 신경병증성 통증으로부터 완화되도록 하는지를 시험하였다[참조: Porreca et al., "A comparison of the potential role of the tetrodotoxin-insensitive sodium channels, PN3/SNS and NaN/SNS2, in rat models of chronic pain", Proc. Nat. Acad. ScL, vol. 96 , pp. 7640-7644 (1999)]. 안티센스 데옥시올리고뉴클레오타이드를 사용한 Nav1.8 발현의 억제는 또한 다른 동물 통증 모델에서 만성 통증을 억제하는 것으로 밝혀졌다[참조: Yoshimura et al., "The involvement of the tetrodotoxin-resistant sodium channel Nav1.8 (PN3/SNS) in a rat model of visceral pain", J. Neuroscience, vol. 21 , pp. 8690-8696 (2001); and Khasar et al., "A tetrodotoxin-resistant sodium current mediates inflammatory pain in the rat", Neuroscience Letters, vol. 256, no. 1 , pp. 17-20 (1998)]. 추가의 데이타는, Nav1.8에 대한 특정한 안티센스 올리고데옥시뉴클레오타이드에 의한 후근 신경절 뉴우런내 Nav1.8 단백질의 선택적인 녹-다운(knock-down)이 척수신경 연결 손상에 의해 유발된 통각과민 및 무해자극통증을 방지하였음을 나타낸다[참조: Kim et al., "An experimental model for peripheral neuopathy produced by segmental spinal nerve ligation in the rat", Pain, vol. 50, pp. 355-363 (1992)]. 상기 데이타는, 몇몇 말초 신경병증 및 염증 상태에서 Nav1.8에 대한 병리생리학적 역활을 제안한다.
그러나, 치료제로서 안티센스 올리고데옥시뉴클레오타이드의 사용은 '오프-표적(off-target)' 효과를 생성하는 이들의 경향 및 이들의 제한된 효능에 의해 및 생체내 이들의 불안정성에 의해 제한된다. Nav1.8을 특이적으로 차단할 수 있는 작은 분자가 확인되지 않았으므로, 통증의 치료시 Nav1.8을 조절하는 대체 방법이 지속적으로 요구된다.
본 발명은 짧은 간섭 핵산 및 siRNA를 제공함으로써 Nav1.8의 발현을 특이적으로 녹-다운함으로써 상기 요구도를 충족시킨다. 짧은 간섭 RNA 또는 작은 간섭 RNA를 나타내는 siRNA는 RNA 간섭(RNA interference: RNAi)의 형태이다. RNAi는 세포내에서 특이적인 mRNA 표적을 분해함으로써 암호화된 단백질의 수준을 녹-아웃시기거나 또는 녹-다운시키는 유전자 기능을 시험하기 위해 사용된 기술이다. siRNA의 작용 메카니즘은 다-단계 과정을 포함하는 것으로 고려된다. 우선, 이본쇄 RNA(dsRNA)는 RNase III과 구성원에 의해 인지되며 21 내지 23개의 뉴클레오타 이드의 siRNA로 분해된다. 다음에, siRNA는 RNA-유도된 사일런싱 착물(RISC)로 불리는 RANi 표적화 착물로 혼입된다. RISC는 이중 기능 헬리카제이며 표적 mRNA를 인지하는 RNase이다. 표적 mRNA를 인지한 후, RISC는 mRNA에 결합하여 siRNA를 풀고, 이러한 풀림은 siRNA의 안티센스 쇄가 상보성 염기쌍[왓슨-크릭 염기쌍(Watson-Crick base pairing)]을 통해 표적 mRNA에 결합하도록 한다. 이는 mRNA의 가수분해 및 파괴를 유발하여, 감소된 단백질 발현을 초래한다. 또한, siRNA는 명백하게 재순환함으로써 하나의 siRNA 분자가 대략 1000개의 mRNA 분자의 분해를 유도할 수 있다. 따라서, siRNA-매개된 RNAi는 표적 유전자의 발현을 억제하기 위한 다른 현재 유용한 기술보다 더욱 효과적이다.
본원에 기술된 모든 참고 문헌, 공보, 특허원 및 특허는 이들의 전문이 참조로 인용되어 있다.
발명의 간단한 요약
본 발명은 Nav1.8 나트륨 채널 유전자로부터 mRNA를 특이적으로 표적화하고 RNAi-유도된 분해를 유발하는 짧은 간섭 핵산, 및 이러한 짧은 간섭 핵산을 사용하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 양태는 서열 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 및 11로 이루어진 그룹 중에서 선택된 뉴클레오타이드 서열, 또는 이의 유사체를 포함하는 분리되거나, 또는 재조합의 짧은 간섭 핵산을 제공한다. 이러한 분리되거나 또는 재조합의 짧은 간섭 핵산은 또한 3' 오우버행(overhang)을 포함할 수 있다. 또한, 상기 짧은 간섭 핵산중 어느 것 하나 이상과 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다.
본 발명의 다른 양태는 서열 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 및 11로 이루어진 그룹 중에서 선택된 뉴클레오타이드 서열, 또는 이의 유사체를 포함하고, 추가로 이에 대한 상보성 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 분리되거나 또는 재조합의 짧은 간섭 핵산을 제공한다. 분리되거나 또는 재조합의 짧은 간섭 핵산은 또한 3' 오우버행을 추가로 포함할 수 있다. 또한, 상기 짧은 간섭 핵산 중의 하나 이상과 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다.
다른 양태는 서열 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 및 11로 이루어진 그룹 중에서 선택된 뉴클레오타이드 서열, 또는 이의 유사체를 포함하고, 추가로 이에 대한 상보성 뉴클레오타이드 서열을 포함하며, 여기서, 뉴클에오타이드 서열 및 상보성 뉴클레오타이드 서열은 하이브리드화되어 이본쇄를 형성하는, 분리되거나, 또는 재조합의 짧은 간섭 핵산을 제공한다. 뉴클레오타이드 서열 및 상보성 뉴클레오타이드 서열은 각각 추가로 3' 오우버행을 포함할 수 있다. 또한, 상기 이본쇄중 하나 이상과 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다.
추가의 양태는 센스 쇄 및 안티센스 쇄를 포함하며, 여기서, 센스 쇄 및 안티센스 쇄는 하이브리드화하여 이본쇄를 형성하고, 여기서, 센스 쇄는 표적 서열과 실질적으로 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 여기서, 표적 서열은 서열 12 내지 577로 이루어진 그룹 중에서 선택되는, 분리되거나 또는 재조합의 짧은 간섭 핵산을 제공한다. 센스 쇄 및 안티센스 쇄는 각각 3' 오우버행을 추가로 포함할 수 있다. 또한 상기 이본쇄중 하나 이상과 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다.
본 발명의 양태는 서열 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 및 11로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이의 유사체를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
다른 양태는 Nav1.8 mRNA를 발현할 수 있는 세포를, 서열 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 및 11로 이루어진 그룹 중에서 선택된 뉴클레오타이드 서열, 또는 이의 유사체를 포함하는, 하나 이상의 분리되거나, 또는 재조합의 짧은 간섭 핵산과 접촉시킴을 포함하여 mRNA의 폴리펩타이드로의 해독을 억제하는 방법을 제공한다.
대안적인 양태는 Nav1.8 폴리펩타이드를 발현할 수 있는 세포를, 서열 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 및 11로 이루어진 그룹 중에서 선택된 뉴클레오타이드 서열, 또는 이의 유사체를 포함하는, 하나 이상의 분리되거나, 또는 재조합의 짧은 간섭 핵산과 접촉시킴을 포함하여, 폴리펩타이드의 발현을 억제하는 방법을 제공한다.
다른 대안적인 양태는 Nav1.8 폴리펩타이드를 발현하는 세포를, 서열 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 및 11로 이루어진 그룹 중에서 선택된 뉴클레오타이드 서열, 또는 이의 유사체를 포함하는, 하나 이상의 분리되거나 또는 재조합의 짧은 간섭 핵산과 접촉시킴을 포함하여, 세포내에서 Nav1.8 기원한 막 전위를 차단시키는 방법을 제공한다.
추가의 양태는 Nav1.8 폴리펩타이드를 발현하는 세포를, 서열 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 및 11로 이루어진 그룹 중에서 선택된 뉴클레오타이드 서열, 또는 이의 유사체를 포함하는, 하나 이상의 분리되거나, 또는 재조합의 짧은 간섭 핵산과 접촉시킴을 포함하여, 세포에서 Nav1.8 기원한 나트륨 이온 유출(flux)을 차단시키는 방법을 제공한다.
추가의 양태는 서열 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 및 11로 이루어진 그룹 중에서 선택된 뉴클레오타이드 서열, 또는 이의 유사체를 포함하는, 하나 이상의 분리되거나 또는 재조합의 짧은 간섭 핵산과 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 유효량의 약제학적 조성물을 만성 통증의 억제가 요구되는 대상체에게 투여함을 포함하여, 만성 통증을 억제하는 방법을 제공한다. 상기한 분리되거나, 또는 재조합의 짧은 간섭 핵산은 3' 오우버행을 추가로 포함할 수 있다.
본원에 인용된 모든 공보는, 이의 전문이 참조로 인용되어 있다.
정의
본원에 사용된 것으로서, 용어 "안티센스 쇄"는 센스 쇄에 대해 상보성인 핵산 서열을 의미한다.
본원에 사용된 것으로서, 용어 "만성 통증"은 장기간 동안 지속되는 통증으로 정의된다.
본원에 정의된 것으로서, 용어 "상보성"은 다른 뉴클레오타이드 서열과 쌍을 이루는 왓슨-크릭 염기 쌍을 나타내는 뉴클레오타이드 서열, 즉, 피리딘에 결합하는 퓨린을 의미한다. 예를 들어, 뉴클레오타이드 서열은 센스 쇄를 나타낼 수 있는 반면 이에 대한 상보성 뉴클레오타이드 서열은 안티센스 쇄를 나타낼 수 있다.
본원에 사용된 것으로서, 용어 "이본쇄"는 센스 쇄 및 안티센스 쇄와 같이, 하이브리드화된 2개의 상보성 핵산 서열을 의미한다.
본원에 사용된 것으로서, 용어 "발현하다(express, expresses)", 및 "발현(expression)"은 핵산의 전사 및 해독으로 폴리펩타이드를 생성하는 분자 생물학적 과정, 즉, 유전 정보가 유전자로부터 단백질로 이동하여 유전자의 효과가 입증되는 과정을 의미한다.
용어 "상동성" 및 "상동의"는 2개의 핵산 서열간의 비교를 말하며, 서열을 정렬시키거나 비교하는 경우, 이들이 유사성을 나타내는 것을 의미한다. 2개의 핵산 서열간의 상동성은 서열 비교에 의해 측정할 수 있으며 하이브리드화 조건을 기준으로 한다. 뉴클레오타이드 서열 상동성은, 뉴클레오타이드 삽입 또는 결실에 대해 계산하기 위해 임의 정렬시키는 경우 2개의 서열(또는 이들의 상보성 쇄)내 뉴클레오타이드 잔기에 있어서 동질성이 있는 경우 관측된다. 상동성은 또한 하나의 뉴클레오타이드 서열이 선택적인 하이브리드화 조건하에서 다른 서열로 하이브리드화될 경우에 존재한다. 상동성을 확립하기 위해 하이브리드화시 사용된 조건의 엄격성(stringency)은 염 농도, 온도, 유기 용매의 존재 및 기타 매개변수와 같은 인자에 의존적이다.
본원에 사용된 것으로서, 용어 "녹-다운"은 mRNA의 발현 수준을 감소시킴으로써 mRNA가 단백질로 해독되는 것을 감소시키는 것을 의미한다.
본원에 정의된 것으로서, 용어 "녹-아웃"은 mRNA의 발현을 방지함으로써 mRNA의 단백질로의 해독이 일어나지 않도록 하는 것을 의미한다.
본원에 사용된 것으로서, 용어 "mRNA"는 전령 RNA를 의미한다.
본원에 사용된 것으로서, 용어 "막 전위"는 세포막의 양쪽 측면을 가로지르는 전기 전하에 있어서의 변화를 의미한다.
본원에 사용된 것으로서, 용어 "통증"은 일반적으로 질병, 손상 또는 스트레스, 또는 마음의 불안, 정신적 스트레스, 고통, 흥분 또는 애도와 같은 정신적 통증의 결과인, 약한 불안으로부터 극도의 고민 또는 고문에 이르는, 신체내 불편한 기분과 같은 육체적 통증을 의미한다.
본원에 사용된 것으로서, 용어 "RNAi"는 세포 또는 유기체내에서 특정의 mRNA 표적을 분해함으로써 암호화된 단백질의 수준을 녹-아웃시키거나 또는 녹-다운시키는 유전자 기능을 시험하는데 사용된 기술인 RNA 간섭을 의미한다. 이는 또한 RNA 사일런싱(silencing)으로 언급된다.
본원에 사용된 것으로서, 용어 "센스 쇄"는 핵산의 암호화 쇄를 의미한다.
본원에 사용된 것으로서, 용어 "siRNA"는 RNA 간섭의 RNA 사일런싱 메카니즘의 유형중 하나인, 짧거나 또는 작은 간섭 리보핵산을 의미한다.
본원에 사용된 것으로서, 용어 "짧은 간섭 핵산"은 데옥시리보핵산(DNA), 리보핵산(RNA) 또는 이들 둘다의 조합의 짧은 간섭 핵산 신장을 의미한다. 당해 용어는 또한 핵산 및 비-전통 염기에 대한 변형을 포함한다. 바람직하게는, 짧은 간섭 핵산은 siRNA이다.
본원에 사용된 것으로서, 용어 "나트륨 전류"는 나트륨 이온의 효과로 인한 것인, 세포의 막 전위의 일부를 의미한다.
용어 "대상체"는 사람 및 비-사람 동물 둘 다를 의미한다.
본원에 사용된 것으로서, 용어 "형질감염"은 바이러스의 사용을 통해서와 같은, 세포내로 핵산을 도입시킴을 의미한다.
본원에 정의된 것으로서, 용어 "전사"는, 일본쇄 RNA가 이본쇄 DNA로부터 합성되는 분자 생물학적 과정을 의미한다.
본원에 사용된 것으로서, 용어 "해독"은, 폴리펩타이드가 mRNA로부터 합성되는 분자 생물학적 과정을 의미한다.
본원에 정의된 것으로서, 용어 "치료"는 질병 또는 질환의 하나 이상의 증상, 퇴행, 지연 또는 진행의 중지를 포함하나, 이에 한정되지 않는 어떠한 임상적으로 바람직하거나 또는 유익한 효과를 가져오는 질병 또는 질환에 대한 치료학적, 예방학적 또는 억제형 방법을 의미한다.
Na v 1 .8 특성화
Nav1.8 나트륨 채널은 알파 소단위 및 하나 이상의 베타 소단위를 포함한다. Nav1.8의 완전한 개방 판독 프레임의 뉴클레오타이드 서열 및 상응하는 아미노산 서열은 당해 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 랫트 Nav1.8 에 대한 핵산 및 아미노산 서열 둘다는 각각 미국 특허 제6,451,554호의 서열 1 및 2에서 찾을 수 있다. Nav1.8 및 이의 소단위에 대한 핵산 서열 및 아미노산 서열은 또한 하기 표 1에 나타낸 바와 같이 GenBank® 데이타베이스에서 찾을 수 있다.
종 핵산 서열에 대한 GenBank® 번호 아미노산 서열에 대한 GenBank® 번호
랫트 NM017247 NP058943
사람 AF117907 AAD 30863
사람 Nav1.8 유전자는 랫트 Nav1.8 유전자와 대략 82%의 고도 상동성을 지닌다. 따라서, 랫트 Nav1.8 나트륨 채널을 녹-다운시킬 수 있는 랫트 Nav1.8 짧은 간섭 핵산에 상응하는 사람 Nav1.8 짧은 간섭 핵산은 사람 Nav1.8 나트륨 채널의 녹-더운에 효과적일 것으로 여겨진다.
핵산
Nav1.8 mRNA에 대해 표적화된 짧은 간섭 핵산을 포함하는 조성물 및 방법을 유리하게 사용하여 만성 통증을 치료하기 위한 Nav1.8 나트륨 채널의 발현을 녹-다운시키거나 또는 녹-아웃시킬 수 있다. 상세하게는, 본 발명의 짧은 간섭 핵산은 Nav1.8 mRNA의 RNAi-매개된 파괴를 유발한다.
Nav1.8 나트륨 채널은 만성 통증 상태에서 후근 신경절에서 상향조절된다. 따라서, Nav1.8 mRNA 및 Nav1.8 기능을 녹-다운 또는 녹-아웃시킬 수 있는 짧은 간섭 핵산 서열은 만성 통증을 차단하거나 또는 치료하는데 유용할 수 있다.
따라서, 본 발명은 분리되거나 또는 재조합의 짧은 간섭 핵산을 제공한다. 본원에 사용된 것으로서, 용어 "분리되거나(분리된)"는 세포 또는 재조합체 발현 시스템에서 일반적으로 발견되는 다른 성분들로부터 실질적으로 분리된 RNA 또는 DNA 분자, 또는 혼합된 중합체와 같은 핵산을 의미한다. 이들 성분은 리보소옴, 폴리머라제, 혈청 성분 및 플랭킹(flanking) 게놈 서열을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 따라서, 당해 용어는 이의 천연적으로 존재하는 환경으로부터 제거된 짧은 간섭 핵산을 포괄하며, 재조합체 또는 클로닝된 짧은 간섭 핵산 분리물 및 화학적으로 합성된 유사체 또는 이종 시스템에 의해 생물학적으로 합성된 유사체를 포함한다.
분리된 핵산은 일반적으로 분자의 이종 조성물일 수 있을 것이나, 일부 양태에서, 약간의 이질성(heterogeneity)을 함유한다. 이러한 이질성은 통상적으로 서열을 암호화하는 핵산의 말단, 또는 바람직한 생물학적 기능 또는 활성에 중요하지 않은 영역내에서 발견된다.
"재조합"의 짧은 간섭 핵산은 이의 제조 방법 또는 구조로 정의된다. 따라서, 일부 재조합 핵산은 조작 또는 선택에 의해 사람 중재를 포함하는 재조합 DNA 기술을 사용하여 제조한다. 다른 것들은 서로 천연적으로 연속하고 있지 않은 2개의 단편을 융합시켜 제조한다. 가공된 벡터, 및 어떠한 합성 올리고뉴클레오타이드 과정을 사용하여 기원한 서열을 포함하는 핵산도 포함된다.
짧은 간섭 핵산은 일본쇄 또는 이본쇄일 수 있다. 일본쇄의 짧은 간섭 핵산은 센스 쇄를 포함하는 반면 이본쇄의 짧은 간섭 핵산은 센스 쇄 및 안티센스 쇄 둘다를 포함한다. 바람직하게는, 이본쇄의 짧은 간섭 핵산내 센스 및 안티센스 쇄는 표준 왓슨-크릭 염기-쌍 상호작용으로 하이브리드화되어 이본쇄를 형성하거나 일본쇄 헤어핀(hairpin) 부위에 의해 연결된다. 후자 유형의 siRNA 분자의 헤파린 영역은 "다이서(Dicer)" 단백질, 또는 이의 등량체에 의해 세포내적으로 분리되어 2개의 개개 염기-쌍 RNA 분자의 siRNA를 형성한다.
짧은 간섭 핵산은 17 내지 29개 뉴클레오타이드, 바람직하게는 19 내지 25개 뉴클레오타이드, 더욱 바람직하게는 21 내지 23개 뉴클레오타이드, 및 가장 바람직하게는 21개 뉴클레오타이드의 길이 범위일 수 있다.
바람직하게는, 짧은 간섭 핵산은 siRNA이다. 즉, 서열내 모든 뉴클레오타이드는 리보뉴클레오타이드 염기이다.
그러나, 본 발명은 또한 작은 간섭 핵산의 유사체를 포함한다. 짧은 간섭 핵산의 유사체는 하나 이상의 뉴클레오타이드 염기의 추가, 결실, 대체, 치환 또는 변형을 함유한다. 예를 들어, 짧은 간섭 핵산은 변경되거나, 치환되거나, 또는 변형되어 하나 이상의 데옥시리보뉴클레오타이드 염기 또는 비-전통적 염기 또는 이들의 어떠한 조합도 함유할 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 짧은 간섭 핵산의 1개 또는 둘다의 쇄는 3' 오우버행을 포함한다. 본원에 사용된 것으로서, "3' 오우버행"은 짧은 간섭 핵산 쇄의 3'-말단으로부터 연장되는 하나 이상의 쌍을 이루지 않은 뉴클레오타이드를 말한다. 3' 오우버행은 1 내지 6개의 뉴클레오타이드(이는 리보뉴클레오타이드 또는 데옥시리보뉴클레오타이드를 포함한다), 바람직하게는 1 내지 5개의 뉴클레오타이드, 더욱 바람직하게는 1 내지 4개의 뉴클레오타이드, 특히 바람직하게는 2 내지 4개의 뉴클레오타이드, 및 가장 바람직하게는 2개의 뉴클레오타이드의 범위일 수 있다.
본 발명의 다른 양태에서, 이본쇄의 센스 및 안티센스 쇄 둘다는 3' 오우버행을 포함한다. 오우버행의 길이는 이본쇄의 각각의 쇄에 대해 동일하거나 또는 상이할 수 있다. 가장 바람직하게는, 3' 오우버행은 이본쇄의 쇄 둘다에 존재하고, 각각의 쇄에 대한 오우버행은 길이가 2개 뉴클레오타이드이다. 예를 들어, 이본쇄의 각각의 쇄는 디티미딜산("tt") 또는 디우리딜산("uu")을 포함할 수 있다.
짧은 간섭 핵산의 안정성을 증진시키기 위하여, 3' 오우버행은 또한 분해에 대해 안정할 수 있다. 하나의 양태에서, 3' 오우버행은 아데노신 또는 구아노신 뉴클레오타이드와 같은 푸린 뉴클레오타이드를 포함함으로써 안정화시킨다. 달리는, 피리미딘 뉴클레오타이드를 변형된 유사체로 치환시키는 것, 예를 들면, 3' 오우버행내 우리딘 뉴클레오타이드를 2'-데옥시티미딘으로 치환시키는 것은 허용되며 RNAi 분해의 효능에 영향을 미치지 않는다. 특히, 2'-데옥시티미딘내 2' 하이드록실의 부재는 조직 배양 배지에 3' 오우버행의 뉴클레아제 내성을 현저히 증진시킨다.
짧은 간섭 핵산은 Nav1.8 표적 mRNA에 대해 표적화된다. 본원에 사용된 것으로서, "Nav1.8 표적 mRNA에 대해 표적화된"은, 센스 쇄가 표적 mRNA의 것과 동일하거나 또는 실질적으로 동일하고 mRNA의 RNAi-매개된 분해를 유도할 수 있는 일본쇄 또는 이본쇄의 짧은 간섭 핵산을 의미한다. 물론, 이본쇄 siRNA의 안티센스 쇄는 siRNA의 센스 쇄 및 표적 mRNA 둘다에 대해 상보적인 서열을 지닐 것이다.
본원에 사용된 것으로서, 표적 서열에 대해 "실직적으로 동일한" 짧은 간섭 핵산은 1 내지 4개의 뉴클레오타이드가 표적 서열과는 상이한 핵산 서열이다. 예를 들어, 짧은 간섭 핵산은, 표적 mRNA의 RNAi-매개된 분해가 짧은 간섭 핵산에 의해 유도되는 한, 표적 서열과는 1개, 2개, 3개 또는 4개의 뉴클레오타이드가 상이한 센스 쇄를 포함할 수 있다.
본원에 사용된 것으로서, "표적 mRNA" 또는 "표적 서열"은 사람 Nav1.8 mRNA, Nav1.8 mRNA의 돌연변이체 또는 대안적인 스플라이스 형태, 또는 동계 Nav1.8 유전자로부터의 mRNA를 의미한다. 본원에 사용된 것으로서, 용어 "돌연변이체"는 뉴클레오타이드 삽입, 뉴클레오타이드 결실, 뉴클레오타이드 치환 또는 뉴클레오타이드 변형을 지님으로써 표적 mRNA와 상이한 짧은 간섭 핵산을 의미한다. 이러한 변형은 예를 들면, 짧은 간섭 핵산의 말단 또는 짧은 간섭 핵산의 하나 이상의 내부 뉴클레오타이드에 대해서와 같이, 비-뉴클레오타이드 물질의 첨가; 뉴클레아제 분해에 대해 내성인 짧은 간섭 핵산을 제조하는 변형; 또는 짧은 간섭 핵산내 하나 이상의 뉴클레오타이드의 데옥시리보뉴클레오타이드로를 사용한 치환을 포함한다. 본원에 사용된 것으로서, 용어 "동계"는 다른 포유동물 종으로부터의 핵산을 의미한다. 사람 Nav1.8 mRNA는 이들 각각의 동계 또는 돌연변이체와 함께 표적 서열을 함유할 수 있는 것으로 이해된다. 따라서, 이러한 일반적인 표적 서열을 포함하는 단일의 짧은 간섭 핵산은 일반적인 표적 서열을 함유하는 상이한 RNA 유형의 RNAi-매개된 분해를 유도할 수 있다.
본 발명의 짧은 간섭 핵산은 어떠한 표적 mRNA 서열내에서도 대략 19 내지 25개의 접촉하는 뉴클레오타이드의 어떠한 신장에도 표적화될 수 있다. 짧은 간섭 핵산에 대한 표적 서열을 선택하는 기술은 당해 분야에 공지되어 있다. 또한, 표적 mRNA상의 표적 서열을 표적 mRNA에 상응하는 제공된 cDNA 서열로부터, 바람직하게는 하부방향으로, 즉, 출발 코돈으로부터 3' 방향으로 50 내지 100개 뉴클레오타이드로부터 개시하여 선택할 수 있다. 그러나, 표적 서열은 5' 또는 3'의 해독되지 않은 영역, 또는 출발 코돈에 근접한 영역내에 위치할 수 있다. Nav1.8 cDNA 서열내의 적합한 표적 서열은 실시예 1에 제공된다.
본 발명의 짧은 간섭 핵산은 부분적으로 정제된 핵산, 실질적으로 순수한 핵산, 합성 핵산 또는 재조합적으로 제조된 핵산을 포함할 수 있다. 용어 "실질적으로 순수한"은 본원에서 다른 오염 단백질, 핵산, 및 원래의 유기체 또는 재조합체 DNA 발현 시스템으로부터 기원한 기타 생물학적 제제가 없는 짧은 간섭 핵산을 의미하는 것으로 정의된다. 순도는 표준 방법으로 검정할 수 있으며 통상적으로 약 50% 이상, 바람직하게는 약 75% 이상, 더욱 바람직하게는 약 90% 이상, 및 가장 바람직하게는 약 95% 이상의 순도일 것이다. 순도 평가는 질량 또는 몰 기준으로 수행할 수 있다.
본 발명의 짧은 간섭 핵산은 당해 분야의 숙련가에게 공지된 다수의 기술중 하나를 사용하여 수득할 수 있다. 또한, 짧은 간섭 핵산은 또한 2개의 별개의, 상보성 핵산 분자, 또는 단일의 핵산 분자와 2개의 상보성 영역으로 합성할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 짧은 간섭 핵산은 적절하게 보호된 리보뉴클레오사이드 포스포르아미디트 및 통상의 DNA/RNA 합성기 또는 기타 잘 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성한다. 또한, 짧은 간섭 핵산은 프롤리고(Proligo)(독일 함브르크 소재), 다마콘 리서치(Dharmacon Research)(미국 커넥팃컷주 라파예트 소재), 피어스 케미칼(Pierce Chemical)(미국 일리노이주 록포드 소재의 퍼비오 사이언스(Perbio Science)의 일부], 글렌 리서치(Glen Research)(미국 버지니아주 스터를링 소재), 켐진스(ChemGenes)(미국 매사츄세츠주 애쉬랜드 소재) 및 크루아켐(Cruachem)(영국 글라스고우 소재)와 같은 시판 업자에 의해 제조될 수 있다.
달리는, 짧은 간섭 핵산은 또한 어떠한 적합한 프로모터를 사용하여 원형 또는 선형 DNA 플라스미드와 같은 재조합 발현 벡터로부터 발현시킬 수 있다. 재조합 발현 벡터는 전형적으로 상용성 숙주 세포내 핵산의 발현을 조절할 수 있는 적합한 유전 조절 성분에 작동적으로 연결된 짧은 간섭 핵산중 하나를 암호화하는 핵산을 포함하는 통상적으로 자가-복제하는 DNA 또는 RNA 작제물이다. 유전 조절 성분은 원핵 프로모터 시스템 또는 진핵 프로모터 발현 조절 시스템을 포함할 수 있으며, 전형적으로, 전사 프로모터, 전사의 개시를 조절하는 임의의 작동자, mRNA 발현 수준을 상승시키기 위한 전사 증진인자, 적합한 리보소옴 결합 부위를 암호화하는 서열, 해독 개시 부위, 폴리아데닐화 부위, 전사 및 해독을 종결시키는 서열을 포함할 수 있다. 발현 벡터는 또한, 벡터가 숙주 세포, 또는 선택 유전자, 예를 들면 항생제에 대한 내성을 부여하는 유전자와는 독립적으로 복제하도록 하는 복제 오리진(origin)을 함유할 수 있다.
본 발명에 사용될 수 있는 벡터는 미생물 플라스미드, 바이러스, 박테리오파아지, 통합가능한 DNA 단편, 및 숙주의 게놈내로 핵산을 용이하게 통합시킬 수 있는 기타 비히클을 포함한다. 플라스미드는 벡터의 일반적으로 사용된 형태이나, 동등한 기능을 제공하고 당해 분야에 공지되어 있거나 또는 공지되어질 모든 다른 유형의 벡터가 본원에서 사용하기에 적합하다[참조: Pouwels et al., Cloning Vectors: A Laboratory Manual, 1985 and Supplements, Elsevier, N.Y., and Rodriguez et al., (eds.), Vectors: A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses, 1988, Buttersworth, Boston, MA].
플라스미드로부터 본 발명의 짧은 간섭 핵산을 발현시키기에 적합한 프로모터는 예를 들면, U6 프로모터, H1 RNA pol III 프로모터, 및 사이토메갈로바이러스 프로모터를 포함한다. 다른 적합한 프로모터의 선택은 당해 분야의 기술내에 있다. 본 발명의 재조합체 플라스미드는 또한 특정 조직 또는 특정 세포내 환경에서 짧은 간섭 핵산을 발현시키기 위한 유도가능한 또는 조절가능한 프로모터를 포함할 수 있다.
재조합체 플라스미드로부터 발현된 짧은 간섭 핵산은 표준 기술에 의해 배양된 세포 발현 시스템으로부터 분리될 수 있거나, 또는 세포내에서 발현될 수 있다. 본 발명의 짧은 간섭 핵산은 2개의 분리된 상보 RNA 분자로서, 또는 단일의 RNA 분자와 2개의 상보성 영역으로서 재조합체 플라스미드로부터 발현시킬 수 있다. 본 발명의 짧은 간섭 핵산을 발현시키기에 적합한 플라스미드, 짧은 간섭 핵산을 발현시키기 위해 핵산 서열을 플라스미드내로 삽입시키기 위한 방법, 및 재조합체 플라스미드를 목적 세포로 전달하는 방법의 선택은 당해 분야의 기술내에 있다[참조: 예를 들면, Tuschl, Nat. Biotechnol, vol. 20, pp. 446-448 (2002); Brummelkamp et al., Science, vol. 296, pp. 550-553 (2002); Miyagishi et al., Nat. Biotechnol., vol. 20, ppl. 497-500 (2002); Paddison et al., Genes Dev., vol. 16, pp. 948-958 (2002); Lee et al., Nat. Biotechnol., vol. 20, pp. 500-505 (2002); Paul et ai, Nat. Biotechnol., vol. 20, pp. 505-508 (2002); and Sui et al .. Proc . Natl. Acad . Sci vol 99, 2002, pp5515 -5520)].
예로서, 플라스미드는 사람 U6 RNA 프로모터의 조절하에 폴리T 종결 서열과 작동적으로 연결된 센스 RNA 쇄 암호화 서열, 및 사람 U6 RNA 프로모터의 조절하에 폴리T 종결 서열과 작동적으로 연결된 안티센스 RNA 쇄 암호화 서열을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 것으로서, "와 작동적으로 연결된"은, 센스 또는 안티센스 쇄를 암호화하는 핵산 서열이 다른 서열에 근접함을 의미한다. 바람직하게는, 센스 또는 안티센스 쇄를 암호화하는 서열은 5' 방향으로 폴리 T 종결 시그날에 밀접하게 근접하여 있다. 따라서, 플라스미드로부터 센스 또는 안티센스 서열의 전사 동안, 폴리T 종결 시그날이 작동하여 전사를 종결시킨다.
본원에 사용된 것으로서, "프로모터의 조절하에"는, 센스 또는 안티센스 쇄를 암호화하는 핵산 서열이 프로모터의 3'에 위치함으로써 프로모터가 센스 또는 안티센스 암호화 서열의 전사를 개시할 수 있도록 함을 의미한다.
짧은 간섭 핵산의 발현은 원핵 세포 또는 진핵 세포내에서 통상의 방법으로 수행할 수 있다. 원핵 세포는 그람 음성 및 양성 유기체, 예를 들면, 이. 콜라이(E. coli) 및 비. 서브틸리스(B. subtilis) 둘다를 포함한다. 고등 진핵세포는 둘다 비-포유동물 기원, 예를 들면, 곤충 세포, 및 조류, 및 포유동물 기원, 예를 들면, 사람, 영장류 및 설치류 둘다의 동물 세포로부터의 확립된 조직 배양 세포주를 포함한다. 많은 적합한 숙주 세포는 당해 분야에 공지되어 있다. 바람직한 숙주 세포는 HEK293 세포 및 신경모세포종/DRG 세포주 ND7/23이다.
본 발명의 짧은 간섭 핵산은 또한 재조합체 바이러스 벡터로부터 발현될 수 있다. 본 발명의 재조합체 바이러스 벡터는 본 발명의 짧은 간섭 핵산을 암호화하는 서열 및 이러한 짧은 간섭 핵산 서열을 발현시키기에 적합한 어떠한 프로모터도 포함한다. 바이러스 벡터로부터 짧은 간섭 핵산을 발현시키기에 적합한 프로모터는, 예를 들면, U6 프로모터, H1 RNA pol III 프로모터 및 사이토메갈로바이러스 프로모터를 포함한다. 다른 적합한 프로모터의 선택은 당해 분야의 기술내에 있다. 본 발명의 재조합체 바이러스 벡터는 또한 특정 조직 또는 특정 세포내 환경에서 짧은 간섭 핵산을 발현시키기 위한 유도가능하거나 또는 조절가능한 프로모터를 포함할 수 있다. 본 발명의 짧은 간섭 핵산을 생체내에서 세포로 전달하기 위한 재조합체 바이러스 벡터의 사용은 실시예 5에서 더욱 상세히 논의한다.
본 발명의 짧은 간섭 핵산은 2개의 별개의, 상보성 핵산 분자로서, 또는 단일의 핵산 분자와 2개의 상보성 영역으로서 재조합체 바이러스 벡터로부터 발현될 수 있다.
발현될 짧은 간섭 핵산 분자(들)에 대한 암호화 서열을 수용할 수 있는 어떠한 바이러스 벡터, 예를 들면, 아데노바이러스(AV), 아데노-관련 바이러스(AAV), 레트로바이러스, 헤르페스 바이러스 등으로부터 기원한 벡터도 사용할 수 있다. 또한, 바이러스 벡터의 향성(tropism)은 또한 벡터를 엔벨로프 단백질, 또는 다른 바이러스로부터의 기타 표면 항원으로 tb도타이핑(pseudotyping)함으로써 변형시킬 수 있다.
본 발명에서 사용하기에 적합한 재조합체 바이러스 벡터의 선택, 짧은 간섭 핵산을 발현시키기 위해 핵산 서열을 벡터내로 삽입시키는 방법, 및 바이러스 벡터를 목적 세포내로 전달하는 방법은 당해 분야의 기술내에 있다[참조: 예를 들면,Domburg, Gene Therap., vol. 2, pp. 301-310 (1995); Eglitis, Biotechniqυes, vol. 6, pp. 608-614 (1988); Miller, Hum Gene Therap., vol. 1 , pp. 5-14 (1990); and Anderson, Nature, vol. 392, pp. 25-30 (1998)].
바람직한 바이러스 벡터는 아데노바이러스 및 아데노-관련 바이러스로부터 기원한 것들이다. 특히 바람직한 양태에서, 본 발명의 짧은 간섭 핵산은 U6 프로모터를 포함하는 재조합체 아데노바이러스 벡터로부터 일본쇄 핵산 분자로서 발현된다. 바람직한 바이러스 벡터는 또한 헤르페스 바이러스 벡터이다[참조: 예를 들면, Burton, E.A. et al., (2005) Curr. Opin. Mol. Ther.. Aug: 7(4):326-36 and Yeomans D.D. et al.(2005)- Hum Gene Therap Feb:16(2):271-7]. 실시예의 예로서, 그러나 이에 한정되지 않고, 발현된 일본쇄 핵산 분자는 일본쇄 헤어vls 영역에 의해 연결된 2개의 상보성 영역을 포함할 수 있다. 일본쇄 핵산 분자는 추가로 3' 오우버행을 포함할 수 있다.
시험관내 및 생체내 방법
표적 mRNA를 RNAi-매개된 분해를 유발시키기 위한 짧은 간섭 핵산의 능력은 세포내 RNA 또는 단백질의 수준을 측정하기 위한 표준 기술을 사용하여 평가할 수 있다. 예를 들어, 짧은 간섭 핵산은 배양된 세포로 전달될 수 있으며, 표적 mRNA의 수준은 노던 블롯, 점-블로팅 기술(dot-blotting technique), 또는 정량적 RT-PCR에 의해 측정할 수 있다. 달리는, 배양된 세포에서 Nav1.8 단백질의 수준은 ELISA 또는 웨스턴 블롯으로 측정할 수 있다. 표적 mRNA 또는 단백질 수준에 있어서 본 발명의 짧은 간섭 핵산의 효과를 측정하기에 적합한 세포 배양 시스템은 하기 실시예 2에 기술되어 있다.
상기 논의한 바와 같이, 본 발명의 짧은 간섭 핵산은 Nav1.8 mRNA, 또는 대안적인 스플라이스(splice) 형태, 이의 돌연변이체 또는 동계의 RNAi-매개된 분해를 표적화하고 유발한다. 본 발명의 짧은 간섭 핵산에 의한 표적 mRNA의 분해는 Nav1.8 유전자로부터 기능성 유전자 생성물의 생산을 감소시킨다. 따라서, 본 발명은 mRNA의 해독을 억제하는 방법, 폴리펩타이드의 발현을 억제하는 방법, 세포내에서 Nav1.8 기원한 막 전위를 차단하는 방법, 및 세포에서 Nav1.8 기원한 나트륨 전위를 차단하는 방법을 제공한다. 본 발명의 방법에서, 차단은 Nav1.8 기원한 나트륨 전위 또는 Nav1.8 기원한 막 전류에서의 폐지 또는 감소를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 비록 이들 방법들이 실시예에 더욱 상세히 기술되어 있다고 해도, 이들 모두는 일부 공통적인 특징을 공유한다.
상기 방법들 각각의 단계는 세포를 짧은 간섭 핵산과 접촉시킴을 포함한다. 생체내에서, 접촉 단계는 약제학적 조성물중 짧은 간섭 핵산을 대상체에게 투여함을 포함한다. 시험관내에서, 접촉 단계는 세포 및 짧은 간섭 핵산을 물리적으로 근접하게 함으로써 세포와 짧은 간섭 핵산이 서로 접촉할 수 있도록 한다. 이러한 접촉 단계는 짧은 간섭 핵산이 세포내로 도입되어 Nav1.8 나트륨 채널 유전자로부터 mRNA의 RNAi-유도된 분해를 유발하도록 한다.
바람직하게는, 접촉 단계는 서열 1 내지 11의 짧은 간섭 핵산을 이용한다. 서열 1, 2, 3, 5, 10 및 11의 짧은 간섭 핵산이 더욱 바람직하다. 서열 2 및 5의 짧은 간섭 핵산이 보다 바람직하다. 서열 1 및 3의 짧은 간섭 핵산이 가장 바람직하다. 서열 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 및 11의 짧은 간섭 핵산중 하나 이상을 또한 본 발명의 방법에서 이용할 수 있다. 예로서 및 이에 제한되지는 않지만, 서열 1, 2, 3, 5, 10 및 11의 짧은 간섭 핵산을 본 발명의 방법에 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 방법을 실시하는데 있어서, 본 발명의 하나 이상의 짧은 간섭 핵산을 세포 또는 환자에게 동시에 또는 연속적으로 투여할 수 있음이 이해된다. 본 발명은 하나 이상의 단백질 및/또는 표적 핵산과 착화된 본 발명의 짧은 간섭 핵산, 및 본 발명의 하나 이상의 짧은 간섭 핵산을 추가로 포함하는 세포를 제공한다.
약제학적 조성물
본 발명의 짧은 간섭 핵산 및 siRNA는 만성 통증을 치료하기 위해 치료학적으로 사용될 수 있다. 본 발명의 각종 화합물은 약제학적 조성물내로 혼입시킬 수 있다. 예를 들어, 약제학적 조성물은 일본쇄의 짧은 간섭 핵산, 3' 오우버행을 지닌 일본쇄의 짧은 간섭 핵산, 이본쇄의 짧은 간섭 핵산, 또는 각각의 쇄가 3' 오우버행을 지닌 이본쇄의 짧은 간섭 핵산을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 약제학적 조성물은 서열 1 내지 11의 짧은 간섭 핵산을 포함한다. 서열 2 및 서열 5의 짧은 간섭 핵산이 더욱 바람직한 반면, 서열 1 및 3의 짧은 간섭 핵산이 가장 바람직하다. 서열 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 및 11의 짧은 간섭 핵산중 하나 이상을 또한 본 발명의 약제학적 조성물에 이용할 수 있다. 예로서 및 이에 한정되지 않고, 서열 1, 2, 3, 5, 10 및 11의 하나 이상의 짧은 간섭 핵산을 본 발명의 약제학적 조성물에 사용할 수 있다.
이러한 물질의 치료학적 투여를 위한 대표적인 프로토콜은 당해 분야에 잘 공지되어 있다. 비록 본 발명의 조성물을 단순한 용액으로 투여할 수 있다고 해도, 이들은 통상적으로 담체, 바람직하게는 약제학적으로 허용되는 담체와 같은 다른 물질과 함께 투여된다. 용어 "약제학적으로 허용되는 담체"는 본 발명의 조성물을 대상체에게 전달하기에 적합한 어떠한 혼화성의 비-독성 물질을 의미한다. 예를 들어, 멸균수, 알코올, 지방, 왁스 및 불활성 고체가 담체에 포함될 수 있다. 완충제 및 분산제와 같은 약제학적으로 허용되는 부형제를 또한 약제학적 조성물에 혼입시킬 수 있다. 일반적으로, 이러한 약물을 비경구 투여하는데 유용한 조성물은 잘 공지되어 있다[참조: 예를 들면, Remington's Pharmaceutical Science, 17th Ed. (Mack Publishing Company, Easton, PA, 1990)].
치료학적 제형은 투여될 수 있다. 제형은 전형적으로 하나 이상의 활성 성분을 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 포함한다. 제형은 경구, 직장, 비강, 경피내 또는 비경구(피하, 근육내, 정맥내 및 피내 포함) 투여에 적합한 것들을 포함할 수 있다. 제형은 편리하게는 단일 용량형으로 존재할 수 있으며 약제 분야에 잘 공지된 어떠한 방법으로도 제조할 수 있다[참조: 예를 들면, Gilman et al. (eds.) (1990), The Pharmacological Bases of Therapeutics, 8th Ed., Pergamon Press; and Remington's Pharmaceutical Sciences, supra, Easton, Penn.; Avis et al. (eds.) (1993) Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications Dekker, New York; Lieberman et al. (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets Dekker, New York; and Lieberman et al. (eds.) (1990), Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems Dekker, New York].
예로써, 본 발명의 어떠한 짧은 간섭 핵산 또는 벡터도 경피적으로 전달할 수 있다. 경피 조성물은 크림제, 로션제, 에어로졸제 및/또는 유제의 형태를 취할 수 있고 당해 목적을 위해 당해 분야에 통상적인 매트릭스 또는 저장기 유형의 경피 패취 속에 포함될 수 있다[참조: 예를 들면, Remington's Pharmaceutical Science, 17th Ed. (Mack Publishing Company, Easton, PA, 1990)].
치료학적 적용에 포함된 용량 섭생은 치료학적 물질의 작용을 개질시킬 수 있는 각종 인자, 예를 들면, 환자의 상태, 체중, 성별 및 식이, 특정한 감염의 중증도, 투여 시간 및 기타 임상 인자를 고려하여 주치의가 결정할 것이다. 흔히, 치료 용량은 안정성 및 효능을 최적화시키기위해 낮은 수준에서 높은 수준으로 적정한다. 일반적으로, 1일 용량은 체중 kg당 100 내지 500㎍의 범위 이내일 것이다. 통상적으로, 용량 범위는 체중 kg당 150 내지 250㎍일 것이다. 바람직하게는, 당해 용량은 체중 kg당 200㎍일 것이다. 용량은 보다 작은 분자 크기 및 투여후 가능하게 감소되는 반감기(청소 시간)에 대해 고려하여 조절할 수 있다. 본 발명의 조성물의 "유효량"은 환자에서 만성 통증을 완화시킬 양이다.
만성 통증은 하나 이상의 다음 특징들을 포함할 수 있다: 통증이 약 3개월 이상 존재하고, 통증이 통상의 의학적 관리에 의해 완전하게 완화되지 않거나, 또는 통증이 정상적인 회복 기간을 초과하여 지속되는 경우. 만성 통증의 예는 만성 신경병성 통증 및 만성 염증성 통증을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 만성 신경병증성 및/또는 만성 염증성 상태의 예는 후-헤르페스 신경통, 통증이 있는 당뇨병성 신경병증, 신경근병증, 신경 압박 손상(예: 손목굴 증후군, 삼차 신경통, 종양-관련 신경 압박), 상부 및 하부 등 통증(예: 추간판탈출증, 강직척추염 또는 알려지지 않은 병리학으로부터 유발), 복합국소동통증후군 제I형 및 제II형, 신경 외상 통증(예: 환상지통증, 사지 절단으로부터 초래되는 기타 통증 상태), 신경근 찢김 손상, HIV-관련 통증, 화학치료적 방법으로부터 유발된 신경병증, 망막병증, 엉덩뼈신경통, 통각과민, 진행성 작열통(예: 수술후 통증을 포함하나, 이에 한정되지 않는 상처-관련 통증), 관절 통증, 류마티스 및 골관절 통증, 섬유근육통, 화상 통증, 신경염, 엉덩뼈신경통, 건염, 골 통증, 편두통 통증, 비뇨생식기 통증 및 방광 과다반사에 기여하는 신경병성 상태를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명은 본 발명의 예로써 제공되는 하기 비-제한적 실시예를 참조로 더욱 잘 이해될 수 있다. 다음 실시예는 본 발명을 더욱 완전히 설명하기 위해 설명하며, 어떠한 방식으로든 본 발명의 광범위한 영역을 제한하는 것으로 고려되지 않는다. 달리 제시하지 않는 한, 퍼센트는 각각 고체 혼합물중 고체, 및 액체중 액체, 액체중 고체에 대한 하기 제공된 퍼센트는 wt/wt, vol/vol 및 wt/vol 기준이다. 멸균 상태가 세포 배양 동안 일반적으로 유지되었다.
물질 및 일반적인 방법
표준 분자 생물학적 방법을 문헌[참조: 예를 들면, Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1982, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press; Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (2d ed.), Vols 1-3, 1989, Cold Spring Harbor Press, NY; Ausubel et al., Biology, Greene Publishing Associates, Brooklyn, NY; 또는 Ausubel, et al. (1987 and Supplements), Current Protocols in Molecular Biology, Greene/Wiley, New York; and Innis et al. (eds.) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, 1990, Academic Press, N.Y.]에 기술한 바와 같이 사용하였다.
실시예 1
당해 실시예는 Nav1.8에 대한 siRNA의 설계를 나열한다. 랫트 및 사람 Nav1.8 암호화 서열에 대한 추정되는 siRNA 서열은 투스슐의 예견 법칙(Tuschl's prediction rule)을 사용하여 확인하였다[참조: Tuschl et al., "Targeted mRNA degradation by double-stranded RNA in vitro", Genes Dev ., vol. 13, no. 24, pp. 3191-3197 (Dec. 15, 1999); 및 Elbashir et al., "Duplexes of 21- nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells", Nature, vol. 411 , pp. 494-498 (2001)]. 표 2는 사람 Nav1.8 암호화 서열에 대한 추정되는 siRNA 서열을 확인한다. 또한 표적 서열, 유전자내 각각의 표적 서열의 위치, 및 표적 서열내 구아닌/사이토신의 퍼센트를 나타낸다. 표 3은 랫트 Nav1.8 암호화 서열에 대한 추정되는 siRNA 서열을 확인한다. 또한 표적 서열 및 유전자내 각각의 표적 서열의 위치를 나타낸다.
Figure 112007031886524-PCT00001
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Figure 112007031886524-PCT00014
상기한 siRNA 서열 중에서, 5개를 Nav1.8 발현 및 기능을 시험관내에서 녹-다운시키는 이들의 능력을 시험하기 위해 선택하였다. 5개의 siRNA를 선택하여 전체 5874개 뉴클레오타이드 Nav1.8 암호화 서열의 상이한 영역을 포함하도록 하였다. 각각의 서열이 게놈내에 위치한 뉴클레오타이드 위치를 포함하는 5개의 siRNA 서열을 하기 표 4에 나타낸다:
Figure 112007031886524-PCT00015
실시예 2
상기한 5개의 선택된 siRNA 서열인, 서열 1 내지 5를 퀴아겐 인코포레이티드(Qiagen Inc.; 캘리포니아주 발렌시아 소재)에 의해 합성하였다. 이후에, 본 발명자들은 Nav1.8 cDNA를 pcDNA3.1 포유동물 발현 플라스미드[인비트로젠(Invitrogen); 캘리포니아주 칼스바드 소재]내로 클로닝시켜 pcDNA-Nav1.8 대조군 발현 플라스미드를 생성시켰다. 대조군 플라스미드를 HEK293 세포[마이크로빅스 바이소시스템스(Microbix Biosystems, Inc.), 캐나다 M8Z3A8 온타리오 소재]내로 형질감염시키는 경우, 세포는 높은 수준의 Nav1.8 RNA 및 단백질 발현을 나타내었다. Nav1.8 RNA 발현을 Taqman® 정량적 RT-PCR[어플라이드 바이오시스템스(Applied Biosystems), 캘리포니아주 포스터 시티 소재]에 의해 제조업자의 지시에 따라 검출하였다. HEK293 세포내에서 Nav1.8 단백질 발현은 Nav1.8 특이적인 펩타이드 항체인, SOD1[아나스펙(AnaSpec) 제조원, 캘리포니아주 산 호세 소재]을 사용하여 웨스턴면역블롯 분석으로 검출하였다. 공개된 펩타이드 서열을 SOD1 항체를 제조하는데 사용하였다[참조: Novakovic et al., "Distribution of the tetrodotoxin-resistant sodium channel PN3 in rat sensory neurons in normal and neuropathic conditions, J. Neuroscience, vol. 18, no. 6, pp. 2174- 2187 (1998)].
Na v 1 .8 RNA의 녹-다운
5개의 화학적으로 합성된 siRNA, 서열 1 내지 5를 pcDNA-Nav1.8 대조군 발현 플라스미드와 함께 HEK293 세포내로 개별적으로 공-형질감염시켰다. 형질감염된 세포내 최종 siRNA 농도를 25nM에서 유지시켰다. 형질감염시킨지 24시간 후, 세포를 분해하고, 총 RNA를 RNAeasy 미니컬럼[퀴아겐(Qiagen) 제조원, 캘리포니아주 발렌시아 소재]을 사용하여 제조업자의 지시에 따라 정제하였다. 개개의 siRNA 또는 대조군 세포로 공-형질감염시킨 세포로부터 정제된 총 RNA를 랫트 Nav1.8 특이적인 Taqman® 프라이머 및 프로브 셋트[어플라이드 바이오시스템스(Applied Biosystems) 제조원, 캘리포니아주 포스터 시티 소재]를 사용하여 정량적 RT-PCR 분석에 사용하였다. 어떠한 랫트 Nav1.8 특이적인 프라이머도 이와 관련하여 작업하여야 한다. PCR 프라이머의 설계는 당해 분야에 공지되어 있다.
siRNA 형질감염된 세포내 Nav1.8 RNA의 발현 수준을 대조군 세포내 RNA 발현과 비교하였다. pcDNA3.1-Nav1.8 대조군 발현 플라스미드로 형질감염시킨 대조군 세포는 100%의 상대적인 rNav1.8 RNA 발현 수준을 나타내었다. pcDNA3.1-Nav1.8 대조군 발현 플라스미드 및 서열 1의 siRNA로 공-형질감염시킨 siRNA 1 세포는 20%의 상대적인 rNav1.8 RNA 발현 수준을 나타내었다. pcDNA3.1-Nav1.8 대조군 발현 플라스미드 및 서열 2의 siRNA로 공-형질감염시킨 siRNA 2 세포는 65%의 상대적인 rNav1.8 RNA 발현 수준을 나타내었다. pcDNA3.1-Nav1.8 대조군 발현 플라스미드 및 서열 3의 siRNA로 공-형질감염시킨 siRNA 3 세포는 30%의 상대적인 rNav1.8 RNA 발현 수준을 나타내었다. pcDNA3.1-Nav1.8 대조군 발현 플라스미드 및 서열 4의 siRNA로 공-형질감염시킨 siRNA 4 세포는 115%의 상대적인 rNav1.8 RNA 발현 수준을 나타내었다. pcDNA3.1-Nav1.8 대조군 발현 플라스미드 및 서열 5의 siRNA로 공-형질감염시킨 siRNA 5 세포는 70%의 상대적인 rNav1.8 RNA 발현 수준을 나타내었다.
siRNA 1 또는 siRNA 3으로 공-형질감염시킨 세포는 높은 수준의 Nav1.8 RNA 사일런싱(silencing)을 나타낸 반면 siRNA 2 및 siRNA 5로 공-형질감염시킨 세포는 중간 수준의 RNA 사일런싱을 나타내었다. Nav1.8 RNA 발현에서 녹-다운은 siRNA 4로 형질감염시킨 세포에서 관측되지 않았다.
Na v 1 .8 단백질의 녹-다운
5개의 화학적으로 합성된 siRNAs, 서열 1 내지 5를 HEK293 세포내로 pcDNA-Nav1.8 대조굼 발현 플라스미드와 함께 개별적으로 공-형질감염시켰다. 형질감염된 세포에서 최종 siRNA 농도를 25 nM에서 유지하였다. 형질감염시킨 지 24시간 후, 세포를 변성 분해 완충액속에서 분해하고, 분해물을 변성 12% TBE 겔[인비트로겐(Invitrogen) 제조원, 캘리포니아주 칼스바드 소재]상에서 작동시켰다. 겔을 니트로셀룰로즈 시이트(sheet)상에 블롯팅하고 Nav1.8 특이적인 항체-SOD1[아나스펙(AnaSpec) 제조원, 캘리포니아주 산 호세 소재]으로 프로빙(probing)하였다.
pcDNA-Nav1.8 대조군 발현 플라스미드로 형질감염된 세포로부터의 분해물은 높은 수준의 Nav1.8 단백질 발현을 나타내었다. pcDNA-Nav1.8 대조군 발현 플라스미드 및 siRNA 1 또는 siRNA 3로 공-형질감염시킨 세포로부터의 분해물은 거의 완전한 Nav1.8 단백질 발현의 폐지를 나타내었다. pcDNA- Nav1.8 대조군 발현 플라스미드 및 siRNA 또는 siRNA 5로 공-형질감염시킨 세포로부터의 분해물은 중간 수준의 Nav1.8 단백질 발현을 나타내었다. pcDNA-Nav1.8 대조군 발현 플라스미드 및 siRNA 4로 공-형질감염시킨 세포로부터의 분해물은 Nav1.8 단백질 발현에 있어 감소를 나타내지 않았다.
실시예 3
이후에, 본 발명자는 siRNA가 Nav1.8 나트륨 채널을 기능적으로 녹-다운할 수 있는지를 측정하였다. 당해 측정은 FlexStation® 검정[몰레귤러 디바이스(Molecular Devices) 제조원, 캘리포니아주 서니베일 소재] 및 전압 클램프 측정을 사용하여 수행하였다. 본 발명자는 레트로바이러스 통합에 의해 신경모세포종/DRG 융합 세포주 ND7/23[유러피언 콜렉션 오브 셀 컬쳐(European Collection of Cell Cultures), 영국 윌트셔 소재]에서 Nav1.8 암호화 서열을 안정하게 발현시켰다. ND7/23 세포주는 마우스 신경모세포종, 및 유러피언 콜렉션 오브 셀 컬쳐 제92090903호로 확인된 랫트 뉴우런 하이브리드이다. 당해 ND7/23-Nav1.8 세포주는 FlexStation® 막 전위 검정 및 전 세포 전압 클램프 측정 둘 다에서 지속적이고 높은 수준의 Nav1.8 나트륨 전류를 나타내었다.
FlexStation ® 검정
본 발명자는 상기한 5개의 선택된 siRNA 서열, 서열 1 내지 5 각각을 ND7/23-Nav1.8 세포주내로 개별적으로 형질감염시켰다. siRNA에 의한 Nav1.8의 기능적 녹-다운을 FlexStation®에서 제조업자의 지시에 따라 막 전위 검정을 사용하여 확인하였다. FlexStation® 상에서의 판독은 개개의 siRNA로 형질감염시킨지 1일째에 취하였다.
대조군 세포의 화학발광 수준을 siRNAs 1 내지 5로 개별적으로 형질감염시킨 세포의 것과 비교하였다. 모든 세포를 Nav1.8 암호화 서열로 형질감염시켰다. 대조군 세포는 175,000 단위의 화학발광 수준을 나타내었다. 서열 1의 siRNA로 연속적으로 형질감염시킨 siRNA 1 세포는 48,000 단위의 화학발광을 나타내었다. 서열 2의 siRNA로 후속적으로 형질감염시킨 siRNA 2 세포는 70,000 단위의 화학발광 수준을 나타내었다. 서열 3의 siRNA로 후속적으로 형질감염시킨 siRNA 3 세포는 45,000의 화학발광 수준을 나타내었다. 서열 4의 siRNA로 후속적으로 형질감염시킨 siRNA 4 세포는 151,000의 화학발광 수준을 나타내었다. 서열 5의 siRNA로 후속적으로 형질감염시킨 siRNA 5 세포는 80,000의 화학발광 수준을 나타내었다.
siRNA 1 및 3은 Nav1.8 기원한 막 전위를 차단한 반면, siRNA 2 및 5는 막 전위에 있어서 중간 수준의 차단을 나타내었다. siRNA 4는 막 전위에 있어 최소의 차단을 나타내거나 또는 차단을 나타내지 않았다. 개개의 siRNA에 의한 막 전위에 있어서의 차단 수준은 HEK293 시스템에서 siRNA에 의한 단백질 및 RNA 스플라이싱 둘 다의 수준과 유사하였다. 당해 실험의 다른 예에서, 대조군 세포는 198,698 단위의 화학발광 수준을 나타내었다. 서열 1의 siRNA로 후속적으로 형질감염된 siRNA 1 세포는 46,068 단위(대조군 시그날의 23%에 해당)의 화학발광 수준을 나타내었다. 서열 2의 siRNA로 후속적으로 형질감염된 siRNA 2 세포는 71,523 단위(대조군의 36%에 해당)의 화학발광 수준을 나타내었다. 서열 3의 siRNA로 후속적으로 형질감염시킨 siRNA 3 세포는 42,422 단위(대조군의 21%에 상응)의 화학발광 수준을 나타내었다. 서열 4의 siRNA로 후속적으로 형질감염시킨 siRNA 4 세포는 151,067 단위(대조군의 76%에 상응)의 화학발광 수준을 나타내었다. 서열 5의 siRNA로 후속적으로 형질감염시킨 siRNA 5 세포는 80,567 단위(대조군의 41%에 해당)의 화학발광 수준을 나타내었다.
전압 캠프 측정
Nav1.8 나트륨 전류의 기능적 녹-다운을 추가로 확인하기 위하여, 본 발명자는 siRNA 1로 후속적으로 형질감염시킨 ND7/23-Nav1.8 대조군 세포에서 전체 세포 전압 클램프 측정을 수행하였다. 요약하면, ND7/23-Nav1.8 세포는 비-사일런싱 siRNA, 대조군 세포로 모의 형질감염시키거나, 또는 siRNA1, siRNA 1 세포로 형질감염시켰다. siRNA 1 농도는 25nM로 유지하였다. 녹색 형광성 단백질(GFP)[클론테크(Clontech) 제조원, 캘리포니아주 팔로알토 소재]로 공-형질감염시켜 확인한, 성공적으로 형질감염된 세포를 전체 세포 전압 클램프 측정에 사용하였다. 형질감염후 24시간 및 48시간 둘 다에서 측정하였다.
형질감염시킨지 24시간 후, 대조군 세포는 -900의 피크 진폭을 나타낸 반면, siRNA 1 세포는 -175의 피크 진폭을 나타내었다. 형질감염시킨지 48시간 후, 대조군 세포는 -775의 피크 진폭을 나타낸 반면 siRNA 1 세포는 -175의 피크 진폭을 나타내었다. 따라서, 본 발명자는 siRNA 1으로 형질감염된 세포에서 나트륨 전류에 있어서의 거의 모든 차단을 관측하였다. 실제로, 당해 차단은 85% 이상이었다. 또한, Nav1.8 차단의 특이성은, 테트로도톡신-민감성 전류에서의 차단이 siRNA 1 처리된 ND7/23-Nav1.8 세포에서 관측되지 않았다는 관측으로 확인하였다.
다른 예에서, 형질감염시킨지 24시간 후, 대조군 세포(샘플 크기 = 10)는 -912pA의 평균 피크 전체-세포 Nav1.8 전류 진폭을 나타낸 반면, siRNA 1 세포(샘플 크기 = 11)는 -169pA의 평균 피크 진폭을 나타내었다. 따라서, 형질감염시킨지 24시간 후, siRNA1은 대조군의 18.5%까지 NaV1.8 전류 진폭을 감소시켰다. 또한, 의도되는 테트로도톡신-내성 Nav1.8 나트륨 채널에 대한 siRNA 효과의 특이성은, 배경 테트로도톡신-민감성 나트륨 전류의 진폭에 있어서의 감소가 형질감염후 24시간 또는 48시간 후에 siRNA 1 처리된 ND7/23-Nav1.8 세포에서 관측되지 않았다는 관측에 의해 확인되었다.
실시예 4
Nav1.8 녹-다운의 높은 수준을 나타내는 백업 siRNA를 확인하기 위하여, 본 발명자는 siRNA 1 및 siRNA 3을 포괄하는 Nav1.8 암호화 서열의 영역내에서 6개의 추가의 siRNA, 서열 6 내지 11을 설계하였다. 이들 6개의 추가의 siRNA를 실시예 1에 요약한 바와 동일한 과정을 사용하여 설계하였으며, 하기 표 5에 나타낸 바와 같이 다음 서열을 지닌다:
Figure 112007031886524-PCT00016
모든 6개의 추가의 siRNA, 서열 6 내지 11을 ND7/23 세포내에서 Nav1.8 기원한 막 전위를 녹-다운시키는 이들의 능력에 대해 스크리닝하였다. 실시예 3에서와 유사한 과정을 사용하여, 대조군 세포의 화학발광 수준을 siRNA 6 내지 11로 개별적으로 형질감염시킨 세포의 것과 비교하였다. 대조군 세포는 175,000 단위의 화학발광 수준을 나타내었다. 서열 6의 siRNA로 후속적으로 형질감염된 siRNA 6 세포는 85,000 단위의 화학발광 수준을 나타내었다. 서열 7의 siRNA로 후속적으로 형질감염된 siRNA 7 세포는 50,000 단위의 화학발광 수준을 나타내었다. 서열 8의 siRNA로 후속적으로 형질감염된 siRNA 8 세포는 45,000 단위의 화학발광 수준을 나타내었다. 서열 9의 siRNA로 후속적으로 형질감염된 siRNA 9 세포는 43,000 단위의 화학발광 수준을 나타내었다. 서열 10의 siRNA로 후속적으로 형질감염된 siRNA 10 세포는 10,000 단위의 화학발광 수준을 나타내었다. 서열 11의 siRNA로 후속적으로 형질감염된 siRNA 11 세포는 35,000 단위의 화학발광 수준을 나타내었다. 실시예 2 및 3의 것과 유사한 과정을 사용하여, 본 발명자들은 모든 6개의 siRNA가 또한 Nav1.8 발현 및 기능을 차단할 수 있어서 유효한 siRNA를 수집하였음을 측정하였다.
다른 예에서, 대조군 세포는 198,698 단위의 화학발광 수준을 나타내었다. 서열 6의 siRNA로 후속적으로 형질감염시킨 siRNA 6 세포는 86,105 단위(대조군 세포의 43%)의 화학발광 수준을 나타내었다. 서열 7의 siRNA로 후속적으로 형질감염시킨 siRNA 7 세포는 50,237 단위(대조군 세포의 25%)의 화학발광 수준을 나타내었다. 서열 8의 siRNA로 후속적으로 형질감염시킨 siRNA 8 세포는 44,038 단위(대조군 세포의 22%)의 화학발광 수준을 나타내었다. 서열 9의 siRNA로 후속적으로 형질감염시킨 siRNA 9 세포는 46,917 단위(대조군 세포의 24%)의 화학발광 수준을 나타내었다. 서열 10의 siRNA로 후속적으로 형질감염시킨 siRNA 10 세포는 21,847 단위(대조군 세포의 7%)의 화학발광 수준을 나타내었다. 서열 11의 siRNA로 후속적으로 형질감염시킨 siRNA 11 세포는 30,587 단위(대조군 세포의 15%)의 화학발광 수준을 나타내었다.
실시예 5
Nav1 .8 siRNA 의 아데노바이러스 전달
세포내로의 장기간의 siRNA 전달 및 Nav1.8 기능의 녹-다운을 위하여, 본 발명자들은 siRNA 발현을 구동시키기 위한 아데노바이러스 벡터를 설계하였다. 요약하면, 작제물을 설계하여 U6 프로모터 카세트의 조절하에서 siRNA 3(서열 3)을 발현시켰다. 이후에, siRNA 3 발현 카세트를 E1-결실된 pTG4213 아데노바이러스 골격[트랜스젠 에스에이(Transgene SA) 제조원, 프랑스 소재]내로 클로닝하였다.
실시예 3으로부터의 ND7/23-Nav1.8 세포를 상기 siRNA 3 아데노바이러스 벡터 작제물을 사용하여 1e9 입자/ml의 농도로 감염시켰다. 대조군 세포를 U6 프로모터 카세트를 함유하는 대조군 아데노바이러스로 동일한 농도에서 감염시켰다. 감염된 세포를 총 RNA 정제를 위해 분해하여 Taqman® 검정 또는 FlexStation® 검정을 수행하였다.
Taqman® 검정의 경우, 감염된 세포를 감염(dpi)후 6, 8 및 10일 째에 분해하고, 분해물로부터 정제된 RNA를 사용하여 정량적 RT-PCR 분석으로 Nav1.8 RNA 발현을 측정하였다. 감염후 6일째에, 비-사일런싱 아데노바이러스 siRNA의 퍼센트로서 나타낸, Nav1.8 RNA 발현율은 18%이었다. 감염후 8일째에, 비-사일런싱 아데노바이러스 siRNA의 퍼센트로 나타낸 Nav1.8 RNA 발현율은 22%이었다. 감염후 10일 째에, 비-사일런싱 아데노바이러스 siRNA의 퍼센트로 나타낸 Nav1.8 RNA 발현율은 30%이었다.
FlexStation® 검정을 위해, 감염된 세포를 사용하여 감염(dpi)후 2, 4, 6, 8 및 10일째에 FlexStation® 상에서 Nav1.8 기원한 막 전위를 측정하였다. 각각의 싯점에서, siRNA 3 아데노바이러스 벡터 작제물로 감염된 세포에서 막 전위에 있어서의 녹-다운을 대조군 아데노바이러스로 감염된 세포에서의 막 전위와 비교하였다. 감염 후 2일 째에, 비-사일런싱 아데노바이러스 siRNA와 비교한 것으로서 나트륨 전류 퍼센트는 45%이었다. 감염 후 4일 째에, 비-사일런싱 아데노바이러스- siRNA와 비교한 것으로서 나트륨 전위 퍼센트는 15%이었다. 감염 후 6일 째에, 비-사일런싱 아데노바이러스-siRNA와 비교한 것으로서 나트륨 전류 퍼센트는 8%이었다. 감염 후 10일 째에, 비-사일런싱 아데노바이러스-siRNA와 비교한 것으로서 나트륨 전류 퍼센트는 4%이었다.
바이러스-siRNA 작제물을 사용하여 관측된 RNA 발현에 있어서의 감소가 NaV1.8 나트륨 채널 활성 기능에 있어서의 약화를 나타내는지를 추가로 확인하기 위햐여, 본 발명자는 다수의 전-세포 전압 클램프 시험을 수행하여 감염후 다양한 싯점에서 NaV1.8-매개된 전류를 직접 측정하였다. 각각의 이들 시험에서, 전류 진폭을 대조군의 비-사일런싱 siRNA 작제물 또는 아데노바이러스-siRNA 3 작제물로 이미 감염시킨 ND7/23-NaV1.8 세포의 샘플에서 측정하였다. 비-사일런싱 바이러스 작제물로 감염시킨 후 4일 째에 총 평균(샘플링된 10개 세포) 전 세포 NaV1.8 전류는 821pA인 반면, siRNA3-바이러스로 감염된 세포에서 측정된 것은 -101pA(대조군의 12.3%에 상응)였다. 비-사일런싱 바이러스 작제물로 감염시킨 후 6일 째에 총 평균(샘플링된 10개 세포) 전 세포 NaV1.8 전류는 -932pA인 반면, siRNA3-바이러스로 감염된 세포에서 측정된 것은 -247.7pA(대조군의 26.6%에 상응)였다. 비-사일런싱 바이러스 작제물로 감염시킨 후 10일 째에 총 평균(샘플링된 10개 세포) 전 세포 NaV1.8 전류는 -976.7pA인 반면, siRNA3-바이러스로 감염된 세포에서 측정된 것은 -542.7pA(대조군의 55.6%에 상응)였다.
따라서, Taqman® 및 FlexStation® 및 전압-클램프 검정은 8dpi 이상 동안 지속된 Nav1.8 RNA 발현 및 Nav1.8 기원한 막 전위의 녹-다운을 나타내었다. siRNA 발현 아데노바이러스에 의한 감염은 80% 이상의 Nav1.8 발현 및 기능의 녹-다운을 초래하였다. 따라서, 고 수준의 지속된 Nav1.8 차단은 siRNA 전달용 바이러스 벡터를 사용하여 입증되었다.
실시예 6
만성 통증의 랫트 모델에서 Na v 1 .8 siRNA 의 효과
Nav1.8-siRNA의 효과를 siRNA 3을 사용하여 만성 통증의 랫트 모델에서 조사하였다. 뒷발 촉각 민감성(hind paw tactile sensitivity)을 등급화된 폰-프레이 마이크로필라멘트(graded von-Frey microfilament)(= 기본선 민감도)를 사용하여 랫트의 코호트(cohort)에서 측정하였다. 이후에, 동일한 랫트를 외과 수술하여 중간 넙다리 수준에서 좌측의 좌골 신경이 노출되도록 한 후 표준 봉합재를 사용하여 느슨한 결찰 손상을 입혔다. 상처를 봉합하여 동물이 후속적인 행위의 평가 전까지 1주일 이상의 기간 동안 수술로부터 회복되도록 하였다. 수술로부터 생성된 신경 외상은 촉각 무해자극통증으로 언급되는 상태인, 좌측 뒷발에서의 과민감성 촉각을 초래하였다. 무해자극통증의 정도는 수술일로부터 13일후에 수행되는 기본선 측정에 사용된 것과 동일한 폰-프레이 필라멘트 과정을 사용하여 용이하게 정량화한다. 무해자극통증에서 siRNA 3(서열 3)의 효과를 평가하기 위하여, siRNA를 이본쇄로서 영구적인 수막공간내 카테터(intrathecal catheter)를 통해 척수주변의 수막 공간내로 전달하였다. 2㎍의 siRNA 3의 2회의 별도의 주사를 3일의 기간에 걸쳐 매일 수행하고, 대조군 랫트에게는 동시 프로토콜만을 사용하여 비히클을 동일하게 주사하였다.
당해 실험에 사용된 랫트의 기본선 뒷발 민감성은 13 내지 15 그램 힘(gram force)의 범위이었다. 신경 외상 손상후 13일째에 뒷발 민감성을 각각의 랫트에 대해 재-측정하였으며 siRNA 그룹을 지정한 코호트에서 1.2±0.4g의 범위이고 대조군 코호트(코호트 크기 = 약물-처리된 그룹에서 6마리 랫트 및 대조군 그룹에서 5마리 랫트)에서 2.1±0.4g의 범위인 것으로 밝혀졌다. 따라서, 신경 손상은 만성 신경병증성 통증 상태를 초래하는 손상으로 고생하는 사람 환자에서 관측된 것중 대표적인 매우 고통스러운 촉각 고민감성(무해자극통증)을 초래하였다. 정규 평가는, 비히클만 주사한 랫트의 대조군 코호트에서 13 내지 21일에 걸쳐 고통스런 무해자극통증 상태가 유지되었음(통상적으로 < 2.1g)을 나타내었다. 대조적으로, 이들의 13일 평가 직후 개시하여 3일 동안 siRNA 3을 주사한 랫트는 이들의 고통스런 무해자극통증이 명백히 역전된 것으로 나타났다(16일째 평가시 8.1±2.1g). siRNA 3으로 처리한 랫트는, 대조군과 비교하여, 측정이 수행되는 동안의 후속적인 수일에 걸쳐, 통증 점수가 지속적으로 개선(예를 들면, 시험적으로-유도된 만성 통증 상태의 완화)된 것으로 나타났다.
SEQUENCE LISTING <110> Schering Corporation Canji, Inc. <120> Compositions and Methods for Short Interfering Nucleic Acid Inhibition of Nav1.8 <130> CJ06243WI <150> 60/622,484 <151> 2004-10-27 <160> 577 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> siRNA sense strand <400> 1 aaaagcagga ccauuuccag a 21 <210> 2 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> siRNA sense strand <400> 2 aaagugucug uccauuccug g 21 <210> 3 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> siRNA sense strand <400> 3 aacuacacca gcuuugauuc c 21 <210> 4 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> siRNA sense strand <400> 4 aaauccaucu gccucauccu c 21 <210> 5 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> siRNA sense strand <400> 5 aauaaguacc aaggcuucgu g 21 <210> 6 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> siRNA sense strand <400> 6 aagaaggcca gaaccaagca c 21 <210> 7 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> siRNA sense strand <400> 7 aaguucuaug gugagcuccc a 21 <210> 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DNA <213> Rattus norvegicus <400> 347 aacggaacag atccccacaa g 21 <210> 348 <211> 21 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 348 aacagatccc cacaaggctg a 21 <210> 349 <211> 21 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 349 aaggctgaca acctctcatc t 21 <210> 350 <211> 21 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 350 aacctctcat ctgaaatggc a 21 <210> 351 <211> 21 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 351 aaatggcaga atacatcttc a 21 <210> 352 <211> 21 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 352 aatacatctt catcaagcct g 21 <210> 353 <211> 21 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 353 aagcctggta ctacggatcc c 21 <210> 354 <211> 21 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 354 aatgggtctg atgctggtca c 21 <210> 355 <211> 21 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 355 aaaactcctg acaacccgga t 21 <210> 356 <211> 21 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 356 aactcctgac aacccggatt t 21 <210> 357 <211> 21 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 357 aacccggatt ttaactacac c 21 <210> 358 <211> 21 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 358 aactacacca gctttgattc c 21 <210> 359 <211> 21 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 359 aaaatgtaca tggtcttttt c 21 <210> 360 <211> 21 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 360 aatgtacatg gtctttttcg t 21 <210> 361 <211> 21 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 361 aatttgatct tggccgtggt c 21 <210> 362 <211> 21 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 362 aagagcagag ccaggcaaca a 21 <210> 363 <211> 21 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 363 aacaattgca gaaatcgaag c 21 <210> 364 <211> 21 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 364 aattgcagaa atcgaagcca a 21 <210> 365 <211> 21 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 365 aaatcgaagc caaggaaaaa a 21 <210> 366 <211> 21 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 366 aagccaagga aaaaaagttc c 21 <210> 367 <211> 21 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 367 aaggaaaaaa agttccagga a 21 <210> 368 <211> 21 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 368 aaaaaaagtt ccaggaagcc c 21 <210> 369 <211> 21 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 369 aaaaagttcc aggaagccct t 21 <210> 370 <211> 21 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 370 aaagttccag gaagcccttg a 21 <210> 371 <211> 21 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 371 aagcccttga ggtgctgcag a 21 <210> 372 <211> 21 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 372 aaggaacagg aggtgctggc a 21 <210> 373 <211> 21 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 373 aacaggaggt gctggcagcc c 21 <210> 374 <211> 21 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 374 aaaaacgcca atgagagaag a 21 <210> 375 <211> 21 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 375 aaacgccaat gagagaagac c 21 <210> 376 <211> 21 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 376 aatgagagaa gacccagggt g 21 <210> 377 <211> 21 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 377 aagacccagg gtgaaatcaa g 21 <210> 378 <211> 21 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 378 aaatcaaggg tgtcagaggg c 21 <210> 379 <211> 21 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 379 aagggtgtca gagggctcca c 21 <210> 380 <211> 21 <212> DNA <213> Rattus norvegicus 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DNA <213> Rattus norvegicus <400> 447 aagaggaagg atagccctca g 21 <210> 448 <211> 21 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 448 aaggatagcc ctcaggtccc t 21 <210> 449 <211> 21 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 449 aaatcctgag gaagatcccc g 21 <210> 450 <211> 21 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 450 aagatccccg agctggcaga t 21 <210> 451 <211> 21 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 451 aaggctgcac tcgccgctgt c 21 <210> 452 <211> 21 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 452 aacgtgaata ctagcaagtc t 21 <210> 453 <211> 21 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 453 aatactagca agtctccttg g 21 <210> 454 <211> 21 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 454 aagtctcctt gggccacagg c 21 <210> 455 <211> 21 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 455 aagacctgct accgcatcgt g 21 <210> 456 <211> 21 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 456 aactacctgg aagagaaacc c 21 <210> 457 <211> 21 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 457 aagagaaacc ccgagtgaag t 21 <210> 458 <211> 21 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 458 aaaccccgag tgaagtccgt g 21 <210> 459 <211> 21 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 459 aagtccgtgc tggagtacac t 21 <210> 460 <211> 21 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 460 aagtgggtag cctatggctt c 21 <210> 461 <211> 21 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 461 aaaaagtatt tcaccaatgc c 21 <210> 462 <211> 21 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 462 aaagtatttc accaatgcct g 21 <210> 463 <211> 21 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 463 aatgcctggt gctggctgga c 21 <210> 464 <211> 21 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 464 aacatctccc tgacaagcct c 21 <210> 465 <211> 21 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 465 aagcctcata gcgaagatcc t 21 <210> 466 <211> 21 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 466 aagatccttg agtattccga c 21 <210> 467 <211> 21 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 467 aaagcccttc ggactctccg t 21 <210> 468 <211> 21 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 468 aaggcatgag ggtagtggtg g 21 <210> 469 <211> 21 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 469 aacgtcctcc tcgtctgcct c 21 <210> 470 <211> 21 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 470 aacctcttcg ccgggaaatt t 21 <210> 471 <211> 21 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 471 aaattttcga agtgcgtcga c 21 <210> 472 <211> 21 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 472 aagtgcgtcg acaccagaaa t 21 <210> 473 <211> 21 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 473 aaataaccca ttttccaacg t 21 <210> 474 <211> 21 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 474 aacccatttt ccaacgtgaa t 21 <210> 475 <211> 21 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 475 aacgtgaatt cgacgatggt g 21 <210> 476 <211> 21 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 476 aattcgacga tggtgaataa c 21 <210> 477 <211> 21 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 477 aataacaagt ccgagtgtca c 21 <210> 478 <211> 21 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 478 aacaagtccg agtgtcacaa t 21 <210> 479 <211> 21 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 479 aagtccgagt gtcacaatca a 21 <210> 480 <211> 21 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 480 aatcaaaaca gcaccggcca c 21 <210> 481 <211> 21 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 481 aaaacagcac cggccacttc t 21 <210> 482 <211> 21 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 482 aacagcaccg gccacttctt c 21 <210> 483 <211> 21 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 483 aacgtcaaag tcaacttcga c 21 <210> 484 <211> 21 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 484 aaagtcaact tcgacaacgt c 21 <210> 485 <211> 21 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 485 aacttcgaca acgtcgctat g 21 <210> 486 <211> 21 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 486 aacgtcgcta tgggctacct c 21 <210> 487 <211> 21 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 487 aaccttcaaa ggctggatgg a 21 <210> 488 <211> 21 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 488 aaaggctgga tggacataat g 21 <210> 489 <211> 21 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 489 aatgtatgca gctgttgatt c 21 <210> 490 <211> 21 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 490 aacagtcagc ctaactggga g 21 <210> 491 <211> 21 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 491 aactgggaga acaacttgta c 21 <210> 492 <211> 21 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 492 aacaacttgt acatgtacct g 21 <210> 493 <211> 21 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 493 aacttgtaca tgtacctgta c 21 <210> 494 <211> 21 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 494 aatctctttg ttggggtcat a 21 <210> 495 <211> 21 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 495 aatcgacaac ttcaaccaac a 21 <210> 496 <211> 21 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 496 aacttcaacc aacagaaaaa a 21 <210> 497 <211> 21 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 497 aaccaacaga aaaaaaagct a 21 <210> 498 <211> 21 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 498 aacagaaaaa aaagctagga g 21 <210> 499 <211> 21 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 499 aaaaaaaagc taggaggcca g 21 <210> 500 <211> 21 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 500 aaaaaagcta ggaggccagg a 21 <210> 501 <211> 21 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 501 aaaagctagg aggccaggac a 21 <210> 502 <211> 21 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 502 aagctaggag gccaggacat c 21 <210> 503 <211> 21 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 503 aagagcagaa gaagtactac a 21 <210> 504 <211> 21 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 504 aagaagtact acaatgccat g 21 <210> 505 <211> 21 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 505 aagtactaca atgccatgaa g 21 <210> 506 <211> 21 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 506 aatgccatga agaagctggg c 21 <210> 507 <211> 21 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 507 aagaagctgg gctccaagaa a 21 <210> 508 <211> 21 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 508 aagctgggct ccaagaaacc c 21 <210> 509 <211> 21 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 509 aagaaacccc agaagcccat c 21 <210> 510 <211> 21 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 510 aaaccccaga agcccatccc a 21 <210> 511 <211> 21 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 511 aagcccatcc cacggcccct g 21 <210> 512 <211> 21 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 512 aataagtacc aaggcttcgt g 21 <210> 513 <211> 21 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 513 aagtaccaag gcttcgtgtt t 21 <210> 514 <211> 21 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 514 aaggcttcgt gtttgacatc g 21 <210> 515 <211> 21 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 515 aagcctttga catcatcatc a 21 <210> 516 <211> 21 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 516 aacatgatca ccatgatggt g 21 <210> 517 <211> 21 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 517 aagacgaagg ttctgggcag a 21 <210> 518 <211> 21 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 518 aaggttctgg gcagaatcaa c 21 <210> 519 <211> 21 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 519 aatcaaccag ttctttgtgg c 21 <210> 520 <211> 21 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 520 aaccagttct ttgtggccgt c 21 <210> 521 <211> 21 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 521 aagatgttcg ccctgcgaca g 21 <210> 522 <211> 21 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 522 aacggctgga acgtgttcga c 21 <210> 523 <211> 21 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 523 aacgtgttcg acttcatagt g 21 <210> 524 <211> 21 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 524 aatccttaag tcactggaaa a 21 <210> 525 <211> 21 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 525 aagtcactgg aaaactactt c 21 <210> 526 <211> 21 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 526 aaaactactt ctccccgacg c 21 <210> 527 <211> 21 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 527 aactacttct ccccgacgct c 21 <210> 528 <211> 21 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 528 aaggggattc gcacgctgct c 21 <210> 529 <211> 21 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 529 aacatcggcc tcctcctctt c 21 <210> 530 <211> 21 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 530 aacgtcgtgg acgaggccgg c 21 <210> 531 <211> 21 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 531 aacttcaaga cctttggcaa c 21 <210> 532 <211> 21 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 532 aagacctttg gcaacagcat g 21 <210> 533 <211> 21 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 533 aacagcatgc tgtgcctgtt c 21 <210> 534 <211> 21 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 534 aacacggggc ctccctactg c 21 <210> 535 <211> 21 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 535 aacctgccca acagcaacgg c 21 <210> 536 <211> 21 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 536 aacagcaacg gctcccgggg g 21 <210> 537 <211> 21 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 537 aacggctccc gggggaactg c 21 <210> 538 <211> 21 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 538 aactgcggga gcccggcggt g 21 <210> 539 <211> 21 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 539 aacatgtaca tcgcagtgat t 21 <210> 540 <211> 21 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 540 aacttcaacg tggccaccga g 21 <210> 541 <211> 21 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 541 aacgtggcca ccgaggagag c 21 <210> 542 <211> 21 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 542 aagttcgacc cggaggccac c 21 <210> 543 <211> 21 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 543 aatccccaaa cccaaccaga a 21 <210> 544 <211> 21 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 544 aaacccaacc agaatatatt a 21 <210> 545 <211> 21 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 545 aaccagaata tattaatcca g 21 <210> 546 <211> 21 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 546 aatatattaa tccagatgga c 21 <210> 547 <211> 21 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 547 aatccagatg gacctgccgt t 21 <210> 548 <211> 21 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 548 aagatccact gtctggacat c 21 <210> 549 <211> 21 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 549 aaagaacgtc ttgggagaat c 21 <210> 550 <211> 21 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 550 aacgtcttgg gagaatccgg g 21 <210> 551 <211> 21 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 551 aatccgggga gttggactcc c 21 <210> 552 <211> 21 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 552 aagaccaata tggaagagaa g 21 <210> 553 <211> 21 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 553 aatatggaag agaagtttat g 21 <210> 554 <211> 21 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 554 aagagaagtt tatggcgacc a 21 <210> 555 <211> 21 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 555 aagtttatgg cgaccaatct c 21 <210> 556 <211> 21 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 556 aatctctcca aagcatccta t 21 <210> 557 <211> 21 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 557 aaagcatcct atgaaccaat a 21 <210> 558 <211> 21 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 558 aaccaatagc caccaccctc c 21 <210> 559 <211> 21 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 559 aatagccacc accctccggt g 21 <210> 560 <211> 21 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 560 aagcaggaag acctctcagc c 21 <210> 561 <211> 21 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 561 aagacctctc agccacagtc a 21 <210> 562 <211> 21 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 562 aaaaggccta ccggagctac a 21 <210> 563 <211> 21 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 563 aaggcctacc ggagctacat g 21 <210> 564 <211> 21 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 564 aacaccctgc atgtgcccag g 21 <210> 565 <211> 21 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 565 aaggctacgt tacattcatg g 21 <210> 566 <211> 21 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 566 aaacagtgga ctcccggaca a 21 <210> 567 <211> 21 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 567 aaatcagaaa ctgcctctgc t 21 <210> 568 <211> 21 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 568 aaactgcctc tgctacgtct t 21 <210> 569 <211> 21 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 569 aacattaacc catctagctc a 21 <210> 570 <211> 21 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 570 aacccatcta gctcaatgca a 21 <210> 571 <211> 21 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 571 aatgcaaaat gaagatgagg t 21 <210> 572 <211> 21 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 572 aaaatgaaga tgaggtcgct g 21 <210> 573 <211> 21 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 573 aatgaagatg aggtcgctgc t 21 <210> 574 <211> 21 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 574 aagatgaggt cgctgctaag g 21 <210> 575 <211> 21 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 575 aaggaaggaa acagccctgg a 21 <210> 576 <211> 21 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 576 aaggaaacag ccctggacct c 21 <210> 577 <211> 21 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 577 aaacagccct ggacctcagt g 21

Claims (20)

  1. 서열 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 및 11로 이루어진 그룹 중에서 선택된 뉴클레오타이드 서열, 또는 이의 유사체를 포함하는, 분리되거나 또는 재조합의 짧은 간섭 핵산.
  2. 제1항에 있어서, 서열 1, 2, 3, 5, 9 및 10으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 분리되거나 또는 재조합의 짧은 간섭 핵산.
  3. 제1항에 있어서, 3' 오우버행(overhang)을 추가로 포함하는, 분리되거나 또는 재조합의 짧은 간섭 핵산.
  4. 제1항 또는 제3항에 따른 짧은 간섭 핵산, 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
  5. 제1항 또는 제3항에 있어서, 이에 대한 상보성 뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함하는, 분리되거나 또는 재조합의 짧은 간섭 핵산.
  6. 제5항에 있어서, 3' 오우버행을 추가로 포함하는 상보성 뉴클레오타이드 서열.
  7. 제5항 또는 제6항에 따른 짧은 간섭 핵산 및 상보성 뉴클레오타이드 서열, 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
  8. 제5항에 있어서, 뉴클레오타이드 서열 및 상보성 뉴클레오타이드 서열이 하이브리드화하여 이본쇄를 형성하는, 분리되거나 또는 재조합의 짧은 간섭 핵산.
  9. 제8항에 있어서, 뉴클레오타이드 서열이 3' 오우버행을 추가로 포함하고, 상보성 뉴클레오타이드 서열이 3' 오우버행을 추가로 포함하는 이본쇄.
  10. 제8항 또는 제9항에 따른 이본쇄, 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
  11. 서열 12 내지 577로 이루어진 그룹 중에서 선택된 표적 서열과 실질적으로 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 센스 쇄, 및 안티센스 쇄를 포함하며, 여기서, 센스 쇄 및 안티센스 쇄가 하이브리드화하여 이본쇄를 형성하는, 분리되거나 또는 재조합의 짧은 간섭 핵산.
  12. 제11항에 있어서, 센스 쇄가 3' 오우버행을 추가로 포함하고 안티센스 쇄가 3' 오우버행을 추가로 포함하는 이본쇄.
  13. 제11항 또는 제12항에 따른 이본쇄, 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
  14. 제1항 또는 제3항에 따른 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터.
  15. Nav1.8 mRNA를 발현할 수 있는 세포와 제1항 또는 제3항에 따른 짧은 간섭 핵산을 접촉시킴을 포함하여, mRNA가 폴리펩타이드로 해독되는 것을 억제하는 방법.
  16. Nav1.8 mRNA 폴리펩타이드를 발현할 수 있는 세포와 제1항 또는 제3항에 따른 짧은 간섭 핵산을 접촉시킴을 포함하여, 폴리펩타이드의 발현을 억제하는 방법.
  17. Nav1.8 폴리펩타이드를 발현하는 세포와 제1항 또는 제3항에 따른 짧은 간섭 핵산을 접촉시킴을 포함하여, 세포내에서 막 전위를 차단시키는 방법.
  18. Nav1.8 폴리펩타이드를 발현하는 세포와 제1항 또는 제3항에 따른 짧은 간섭 핵산을 접촉시킴을 포함하여, 세포내에서 나트륨 전류를 차단시키는 방법.
  19. 만성 통증의 억제가 요구되는 대상체에게 제4항, 제7항, 제10항 및 제13항 중 어느 한 항에 따른 유효량의 약제학적 조성물을 투여함을 포함하여, 만성 통증을 억제하는 방법.
  20. 만성 통증 억제용 약제를 제조하는데 있어서, 제1항 또는 제3항에 따른 하나 이상의 짧은 간섭 핵산의 용도.
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Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2006311725B2 (en) * 2005-11-04 2011-11-24 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of NAV1.8 gene
US8183221B2 (en) 2007-09-05 2012-05-22 Medtronic, Inc. Suppression of SCN9A gene expression and/or function for the treatment of pain
SI2310012T1 (sl) 2008-06-30 2015-06-30 Janssen Pharmaceutica N.V. Postopek za pripravo substituiranih pirimidinskih derivatov
EA023375B1 (ru) * 2011-10-26 2016-05-31 Пфайзер Лимитед Производные (4-фенилимидазол-2-ил)этиламина в качестве модуляторов натриевых каналов
TWI516593B (zh) * 2012-06-11 2016-01-11 義守大學 一種聚核苷酸用以製備減緩疼痛藥物之用途
RU2618628C1 (ru) 2013-04-17 2017-05-05 Пфайзер Инк. Производные N-пиперидин-3-илбензамида для лечения сердечно-сосудистых заболеваний
WO2016183123A1 (en) * 2015-05-11 2016-11-17 Alcyone Lifesciences, Inc. Drug delivery systems and methods
CN114887153A (zh) 2016-12-21 2022-08-12 亚克安娜治疗学有限公司 药物递送系统和方法

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB9513180D0 (en) 1995-06-28 1995-08-30 Univ London Ion channel
US6506559B1 (en) * 1997-12-23 2003-01-14 Carnegie Institute Of Washington Genetic inhibition by double-stranded RNA
WO2001068836A2 (en) * 2000-03-16 2001-09-20 Genetica, Inc. Methods and compositions for rna interference
NZ553687A (en) * 2000-03-30 2010-03-26 Whitehead Biomedical Inst RNA sequence-specific mediators of RNA interference
PT1407044E (pt) * 2000-12-01 2008-01-02 Max Planck Ges Zur Forderung W Moléculas curtas de arn que medeiam a interferência de arn
GB0120238D0 (en) * 2001-08-20 2001-10-10 Univ College Of London Sodium channel regulators and modulators
EP1551424B1 (en) 2002-09-04 2015-07-01 Arrowhead Research Corporation Treatment of chronic neuropathic pain by admistration of dsrna
GB2400103A (en) 2003-04-02 2004-10-06 Ionix Pharmaceuticals Ltd Cell lines expressing VGSC, Nav1.8
EP3604537B1 (en) * 2003-06-13 2021-12-08 Alnylam Europe AG Double-stranded ribonucleic acid with increased effectiveness in an organism
US7341835B2 (en) * 2004-01-13 2008-03-11 Affymetrix, Inc. Methods of analysis of alternative splicing in mouse

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