TWI516593B - 一種聚核苷酸用以製備減緩疼痛藥物之用途 - Google Patents

Description

一種聚核苷酸用以製備減緩疼痛藥物之用途

本發明係關於一種經分離之聚核苷酸，特別是可誘發干擾素反應，達到止痛效果之聚核苷酸。

干擾素(interferons；INFs)為細胞遭受病毒或其他病原體感染所產生的傳訊粒子，可抑制病毒複製，降低細胞增生的能力，以減少鄰近細胞遭該病毒或其他病原體進一步感染的機會。

目前在人類發現的干擾素可分為兩種類型：第一型係以α型干擾素(IFN-α)及β型干擾素(IFN-β)為主，分別係由淋巴細胞及纖維母細胞分泌，主要係對抗病原菌在細胞內的作用，另有ω型干擾素(IFN-ω)、τ型干擾素(IFN-τ)、δ型干擾素(IFN-δ)、κ型干擾素(IFN-κ)及ε型干擾素(IFN-ε)；第二型則包含γ型干擾素(IFN-γ)，係由中樞神經系統的星狀細胞(astrocyte)分泌，該γ型干擾素的過度表現可誘發產生神經性的疼痛。

其中，α型干擾素除抗病毒外，尚有抑制癌細胞生長和增強免疫力的功能。而習用技術已成功運用生物工程之技術製造並量產α型干擾素，並且廣泛地應用於各種臨床醫療領域，以改善多種由病毒或癌症所引發的病症。此外，該α型干擾素另可誘發μ型鴉片類受體(Wang et al.,μ-but not δ-and κ-opioid receptor mediates the nucleus submedius interferon-α-evoked antinociception in the rat. 2006.Neuroscience Letters 397,254-258)，而使周邊及中樞神經系統產生可逆性的疼痛抑制效果(Jiang et al.,Analgesic effect of interferon-alpha via mu opioid receptor in the rat.2000.Neurochemistry International 36,193-196)，而可應用於臨床止痛或鎮痛劑之開發，用以緩解各種疼痛。

然而，長期使用該α型干擾素可能衍生種種副作用，例如：發燒、發冷、肌肉骨骼酸痛、失眠、食慾不振、體重減輕與疲累等，雖不至於對患者造成嚴重的影響或後遺症，但終究會使患者感到不適，對日常生活造成不便，以致該α型干擾素於臨床止痛或鎮痛之應用因而受限。

本發明之主要目的係提供一種減緩疼痛之醫藥組合物，係可以誘發生物體內α型干擾素之表現，在不產生副作用之前提下達到止痛或鎮痛之作用。

本發明之又一目的係提供一種減緩疼痛之醫藥組合物，係可以用於臨床之止痛或鎮痛。

為達到前述發明目的，本發明所運用之技術手段包含有：一種減緩疼痛之醫藥組合物，包含一聚核苷酸，該聚核苷酸包含18至70個鹼基對之雙股RNA；以及至少一種醫藥上相容之載劑；其中該聚核苷酸於該醫藥組合物中之劑量為10微克(μg)至40微克(μg)，且該載劑係選自由聚乙烯胺、轉染試劑lipofectamine及iFect所組成之群組。

本發明減緩疼痛之醫藥組合物，其中該雙股RNA之序列中，鳥糞嘌呤與尿嘧啶之鹼基數達40%以上。

本發明減緩疼痛之醫藥組合物，其中該雙股RNA之序列包含如SEQ ID NO：1及2所示之序列。

本發明減緩疼痛之醫藥組合物，其中該雙股RNA之序列包含如SEQ ID NO：3及4所示之序列。

本發明減緩疼痛之醫藥組合物，其中該聚核苷酸與該載劑係以每微克(μg)聚核苷酸混合0.18微升(μl)之聚乙烯胺溶劑之比例混合。

本發明減緩疼痛之醫藥組合物，其中該聚核苷酸係以化學方法合成。

本發明減緩疼痛之醫藥組合物，其中該聚核苷酸係以一病毒系統表現。

本發明減緩疼痛之醫藥組合物，其中該聚核苷酸係以一巨細胞病毒載體表現。

本發明減緩疼痛之醫藥組合物，其中該聚核苷酸係以一慢病毒載體-pGIPZ表現。

本發明減緩疼痛之醫藥組合物，其中該醫藥組合物係由脊椎腔注射而送至一個體。

本發明減緩疼痛之醫藥組合物，其中該個體係小鼠或人體。

本發明減緩疼痛之醫藥組合物，其中該聚核苷酸係小段干擾RNA(siRNA)、髮夾RNA(shRNA)或微小RNA(miRNA)。

本發明減緩疼痛之醫藥組合物，係應用於全身性的止痛或鎮痛。

本發明減緩疼痛之醫藥組合物，係應用於腰椎、四肢或下半部的止痛。

為了讓本發明之上述和其他目的、特徵和優點能更明確被了解，下文將特舉本發明較佳實施例，並配合所附圖式，作詳細說明如下。

本發明係提供一種醫藥組合物包含一經分離的聚核苷酸，該聚核苷酸為一雙股RNA，且該雙股RNA包含與生物體基因同源或不同源之核苷酸序列，該聚核苷酸係具有18至70個鹼基對，較佳為18至25個鹼基對，或是40至60個鹼基對，以誘導α型干擾素之產生。該聚核苷酸係與一藥理上可接受之載體共同使用，如聚乙烯胺(Polyethyleneimine；PEI)、轉染試劑lipofectamine及iFect，較佳係利用聚乙烯胺作為載體，使本發明之聚核苷酸可成功穿透神經細胞，而傳送至中樞神經系統神經細胞進行作用。

擬將本發明之聚核苷酸送入一個體(如小鼠或人類)，可引發該個體產生高量的α型干擾素，抑制細胞中第二傳訊者cAMP的表現量，進一步活化μ型鴉片類受體(μ-opioid receptor)，最後使周邊及中樞神經系統產生可逆性的疼痛抑制效果。

此外，該聚核苷酸施用於該個體的使用劑量為10微 克(μg)以上，較佳為10微克(μg)至40微克(μg)，以誘發產生較佳的疼痛抑制效果。又，該聚核苷酸較佳係包含帶有高量鳥糞嘌呤與尿嘧啶的雙股RNA，更佳係使鳥糞嘌呤與尿嘧啶之總數佔總鹼基數之40%以上，以便誘發產生更高量的α型干擾素，使中樞神經系統產生達到較佳的疼痛抑制效果。

請參照第1表所示，本發明較佳實施例之醫藥組成物係包含如SEQ ID NO：1及2、3及4所示之聚核苷酸。擬將本發明較佳實施例之醫藥組成物送入一個體，如小鼠或人體，可引發該個體產生高量的α型干擾素，使細胞中第二傳訊者cAMP的表現量受到抑制，進而活化μ型鴉片類受體(μ-opioid receptor)，使周邊及中樞神經系統產生可逆性的疼痛抑制反應。本發明已經由實驗證實，包含第1表所示序列之聚核苷酸，可發揮前述之功效，而可作為鎮痛劑或止痛劑之用，係可以應用於全身性的止痛，特別係腰椎、四肢或下半部的止痛。

該較佳實施例之聚核苷酸可以由一小段干擾RNA、髮夾RNA或微小RNA的形式呈現，並且由該技術領域 適用之各種方法進行合成，包含利用合適的表現系統以重組RNA之方式合成或以化學方法合成。前述之表現系統可為熟知該技術領域者所慣用之真核系統，如酵母菌；原核系統，如大腸桿菌(E.coli)；病毒系統，如巨細胞病毒(CMV)載體，特別係pSilencer 4.1-cytomegalomavirus(CMV)hygro vector(Ambion,Austin,TX)，或慢病毒載體(lentivirus)載體，如pGIPZ載體(Expresstion Arrest^TM GIPZ lentiviral shRNAmir,Open Biosystems,cat no.RHS4349)；或是其他載體表現系統。然而，該聚核苷酸也可以另以標準化的化學方法進行合成，包含設計本發明之聚核苷酸，使該聚核苷酸具有18至70個鹼基對、，以及鳥糞嘌呤與尿嘧啶之總數佔總鹼基數之40%以上等特點，再採用一商用小段干擾RNA製備套組(Ambion,Austin,TX)進行合成。

本發明較佳實施例之醫藥組合物係經由脊椎腔注射而送至一個體，較佳係注射至第5至6節脊柱之間，以將該醫藥組合物送至腦脊髓液中。該醫藥組合物含有本發明之聚核苷酸的劑量為10微克以上，更佳為10微克(μg)至40微克(μg)。該醫藥組合物可另搭配醫藥學上可接受之賦形劑、鹽類或其他營養成分等而組合一複合物，而製成易於注射的劑型，如溶劑、注射劑等。該醫藥組合物可作為鎮痛劑或止痛劑之用，係可以應用於全身性的止痛、鎮痛，特別係腰椎、四肢或下半部的止痛。

下段為本發明之聚核苷酸的功效驗證。

置備複數隻重達200至260公克(g)之雄性實驗白鼠(Sprague-Dawley rats)；該實驗白鼠於試驗期間所接受之照料係符合哈佛醫學院動物管理委員會之規定(Animal Care Committee of Harvard Medical School,Boston,Messachusetts,USA)，以確保該實驗白鼠生理狀態正常。

利用小段干擾RNA製備套組(Ambion,Austin,TX)合成本發明之聚核苷酸(包含A及B)，該聚核苷酸係分別具有第1表所示之序列。另外，以5%葡萄糖溶液配製聚乙烯胺，而獲得一聚乙烯胺溶劑。

請參照第2表所示，本試驗係將前述之實驗白鼠隨機分配至數組，再分別進行兩次注射，第一次注射為脊椎腔內注射，係分別將40微升(μl)食鹽水溶液(saline)、1.8微升(μl)聚乙烯胺溶劑、10微克(μg)聚核苷酸A、以及聚乙烯胺溶劑與本發明聚核苷酸之混合物，以30G的針頭注射至各組實驗白鼠的第L5至L6節脊柱之間，其中，該聚乙烯胺溶劑與本發明聚核苷酸係於注射前以每微克(μg)聚核苷酸混合0.18微升(μl)之聚乙烯胺溶劑之比例進行混合；第二次注射則晚於該第一次注射一天，係將100微升(μl)之佛氏佐劑(complete Freund’s adjuvant；CFA)注射至各組之實驗白鼠的後腳。本試驗係於第二次注射後6小時及1天後檢視並紀錄各組實驗白鼠的疼痛閾值。

由該第2表結果，聚乙烯胺溶劑及聚核苷酸A的單獨注射皆不影響實驗白鼠的疼痛閾值；然而，該聚核苷酸A及聚乙烯胺溶劑的合併注射卻明顯使實驗白鼠的疼痛閾值提升，並且該聚核苷酸A的注射劑量與實驗白鼠的疼痛閾值提升係成正相關。另外，聚核苷酸B與聚乙烯胺溶劑的合併注射同樣具有提升實驗白鼠的疼痛閾值的效果，據此，本發明之聚核苷酸確實具有抑制疼痛反應之功效。

請參照第1圖，係兩組實驗白鼠分別經1.8微升(μl)聚乙烯胺溶劑或聚核苷酸A與聚乙烯胺溶劑之合併注射(脊椎腔內注射)，一天後進行第二次注射，將100微升(μl)之佛氏佐劑(complete Freund’s adjuvant；CFA)注射至各組之實驗白鼠的後腳，再於第二次注射後6小時、1天、2天及3天所紀錄各組實驗白鼠足爪回縮的頻率。

由該第1圖可知，該聚核苷酸A及聚乙烯胺溶劑的合併注射可同樣減緩由佛氏佐劑注射而引發的熱痛敏反應(heat hypersensitivity)。

請參照第2圖，係前述兩組實驗白鼠於第二次注射後迅速切頭，取第L4至L5節脊柱間之檢體，進行西方墨點法分析的結果。

該兩組實驗白鼠係先麻醉(腹腔內注射鎮靜麻醉劑-pentobarbital，注射劑量為每公斤個體注射120毫克)，再迅速採檢其脊髓檢體(第L4至L5節脊柱間之檢體)。取得之檢體以一定比例(較佳係1：20)稀釋於一商用組織蛋白質抽取溶劑(T-PER Tissue Protein Extraction Reagent；Pierce,Rockford,IL,USA)，進行均質處理，再由一商用蛋白質定量套組(Bio-Rad DC Protein Assay Kit；Bio-Rad Laboratories,Hercules,CA,USA)分析由各組實驗白鼠之皮膚檢體所抽取的蛋白質總量，取等量蛋白質，以5至10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯膠體電泳(sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis)分析，將分析結果轉移至商用聚二氟乙烯膜(Immobilon-P,Millpore,Bedford,MA,USA)，再依序以5%脫脂奶粉培置1小時、與商用抗α型干擾素抗體(polyclonal antibody against IFN-α,1：500；R&D Syetems Inc.,NC,USA)及商用抗微管蛋白(mouse monoclonal anti-β-tubulin,1：2000；Santa Cruz Biochemicals,Inc.,Santa Cruz,CA,USA)共培置於4℃過夜、再利用商用抗山羊免疫球蛋白G(horseradish peroxidase-conjugated donkey anti-goat immunoglobulin G,1：5000；Jackson ImmunoResearch West Grove,PA,USA)及抗小鼠免疫球蛋白G(horseradish peroxidase-linked sheep anti-mouse IgG,1：5000；Amersham Biosciences,Arlington Heights,IL,USA)做為二抗，共同於室溫下培置1小時，最後再與一商用化學冷光劑(Immobilon Westrn Chemiluminescen HRP Substrate；Millipore,Billerica,MA,USA)反應，以便在一凝膠成像系統(UVP BioSpecturm 500 Imaging System；UVP,Upland,CA,USA)下顯像。

由該第2圖結果，經該聚核苷酸A及聚乙烯胺溶劑的合併注射之實驗白鼠，其檢體中α型干擾素的蛋白表現量明顯增加。該第3圖為該兩組實驗白鼠之檢體中，α型干擾素的蛋白表現關係圖，藉此，可得知經該聚核苷酸A及聚乙烯胺溶劑的合併注射之實驗白鼠，其檢體中α型干擾素的蛋白表現量為接受聚乙烯胺溶劑之實驗白鼠的4倍以上。

因此，由以上二試驗可得知，本發明之聚核苷酸在注射至一個體後，的確可引發該個體產生高量的α型干擾素，進而該個體的中樞神經系統產生可逆性的疼痛抑制反應，提高該個體對刺激物的疼痛閾值，減緩刺激物引起的熱痛敏反應。

請參照第4圖所示，係兩組實驗白鼠於兩次注射後0.5、1、3小時及1天後，所測得各組實驗白鼠足爪回縮的疼痛閾值。其中，第一次注射為脊椎腔內注射，該兩組實驗白鼠之注射物與注射劑量如第3表所示，第二次注射則晚於該第一次注射一天，係將100微升(μl)之佛氏佐劑注射至各組之實驗白鼠的後腳。

該第4圖結果顯示，由本發明之聚核苷酸所誘導產生的疼痛抑制反應，可被抗α型干擾素抗體所反轉，因此可知，本發明聚核苷酸所引導之疼痛抑制反應與α型干擾素明顯相關。

請參照第4表所示，本試驗係將該實驗白鼠隨機分配至4組，再分別進行兩次注射，第一次注射為脊椎腔內注射，係分別將100微克(μg)α型干擾素及本發明之聚核苷酸A(事先與聚乙烯胺溶劑以每微克(μg)聚核苷酸搭配0.18微升(μl)之聚乙烯胺溶劑之比例混合)注射至各組實驗白鼠的第L5至L6節脊柱之間，其中，第ii及iv組實驗白鼠另注射20奈米莫耳(nmole)嗎啡拮抗劑-naloxone；第二次注射則晚於該第一次注射一天，係將100微升(μl)之佛氏佐劑注射至各組之實驗白鼠的後腳。本試驗係於第二次注射後30分鐘、1小時、2小時、4小時及1天後檢視並紀錄各組實驗白鼠的疼痛閾值。

由第5圖所示，α型干擾素及本發明之聚核苷酸均可誘發產生實驗白鼠的疼痛抑制反應，提高該實驗白鼠的疼痛閾值，然而，由該α型干擾素或該聚核苷酸所引導之疼痛抑制反應均會受嗎啡拮抗劑的影響，因此可知，本發明聚核苷酸所引導之疼痛抑制反應與鴉片類受體(opioid receptors)有關。

由以上兩試驗可證實，本發明之聚核苷酸在注射至一個體後，係引發該個體產生高量的α型干擾素使細胞中第二傳訊者cAMP的表現量受到抑制，進而活化鴉片類受體，而使中樞神經系統產生可逆性的疼痛抑制反應，有效減緩該個體因受外在刺激所導致的痛覺敏感或疼痛閾值降低等反應，達到止痛、鎮痛之效果。

本發明之聚核苷酸，係可以誘發生物體內α型干擾素之表現，將該聚核苷酸送至一個體，使該個體內α型干擾素的大量表現，誘發中樞神經產生可逆性的疼痛抑制效果，可避免直接使用α型干擾素所造成的副作用，使該個體在不受之副作用困擾之前提下達到止痛或鎮痛之功效。

本發明之減緩疼痛之醫藥組合物，係組合前述之聚 核苷酸與聚乙烯胺使本發明之聚核苷酸可成功穿透神經細胞，而傳送至中樞神經系統，誘發中樞神經產生可逆性的疼痛抑制效果，具有應用於臨床止痛或鎮痛之用的功效。

雖然本發明已利用上述較佳實施例揭示，然其並非用以限定本發明，任何熟習此技藝者在不脫離本發明之精神和範圍之內，相對上述實施例進行各種更動與修改仍屬本發明所保護之技術範疇，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。

第1圖：各組實驗白鼠之足爪回縮頻率示意圖。

第2圖：各組實驗白鼠之西方墨點法分析結果圖。

第3圖：各組實驗白鼠之α型干擾素表現關係圖。

第4圖：各組實驗白鼠之疼痛閾值示意圖。

第5圖：各組實驗白鼠之疼痛閾值示意圖。

<110> 義守大學

<120> 一種聚核苷酸用以製備減緩疼痛藥物之用途

<130> PK12466

<160> 4

<210> 1

<211> 21

<212> RNA

<213> Non-targeting siRNA

<400> 1

<210> 2

<211> 21

<212> RNA

<213> Non-targeting siRNA

<400> 2

<210> 3

<211> 19

<212> RNA

<213> GU-rich siRNA

<400> 3

<210> 4

<211> 19

<212> RNA

<213> GU-rich siRNA

<400> 4

Claims (5)

1. 一種聚核苷酸用以製備減緩疼痛藥物之用途，該聚核苷酸係包含18至70個鹼基對之雙股RNA，該聚核苷酸係投予一所需個體，該聚核苷酸投予該所需個體之劑量係為每次每200~260克該所需個體之體重投予10~40毫克，且該聚核苷酸係誘發高量α型干擾素，抑制細胞中第二傳訊者cAMP表現量，活化μ型鴉片類受體，以應用於全身性的止痛或鎮痛，或應用於腰椎、四肢或下半部的止痛；其中該雙股RNA之序列包含如SEQ ID NO：1及2所示之序列。
2. 一種聚核苷酸用以製備減緩疼痛藥物之用途，該聚核苷酸係包含18至70個鹼基對之雙股RNA，該聚核苷酸係投予一所需個體，該聚核苷酸投予該所需個體之劑量係為每次每200~260克該所需個體之體重投予10~40毫克，且該聚核苷酸係誘發高量α型干擾素，抑制細胞中第二傳訊者cAMP表現量，活化μ型鴉片類受體，以應用於全身性的止痛或鎮痛，或應用於腰椎、四肢或下半部的止痛；其中該雙股RNA之序列包含如SEQ ID NO：3及4所示之序列。
3. 如申請專利範圍第1或2項所述之一種聚核苷酸用以製備減緩疼痛藥物之用途，其中該聚核苷酸係由脊椎腔注射而送至一個體。
4. 如申請專利範圍第3項所述之一種聚核苷酸用以製備減緩疼痛藥物之用途，其中該個體係小鼠或人體。
5. 如申請專利範圍第1或2項所述之一種聚核苷酸用以製備減緩疼痛藥物之用途，其中該聚核苷酸係小段干擾RNA(siRNA)、髮夾RNA(shRNA)或微小RNA(miRNA)。