CN101679978B

CN101679978B - 羟甲基取代的rna寡核苷酸和rna复合物

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Publication number: CN101679978B
Application number: CN200880016977.5A
Authority: CN
Inventors: 耶斯佩·温格尔
Original assignee: MDRNA Inc
Current assignee: Marina Biotech Inc
Priority date: 2007-05-22
Filing date: 2008-05-21
Publication date: 2016-05-04
Anticipated expiration: 2028-05-21
Also published as: JP2010528041A; EP2162538B1; US20160168567A1; US20130096289A1; JP6174001B2; IL202040A0; CN101679978A; US20180237780A1; US9297009B2; BRPI0811170B1; MX2009012568A; AU2008256871B2; US20100056768A1; EP2162538A2; BRPI0811170B8; IL202040A; US20150232849A1; KR20150080027A; HK1138322A1; BRPI0811170A2

Abstract

本发明涉及RNA寡核苷酸或RNA寡核苷酸的复合物，本文统称为RNA复合物，其含有至少一个、但任选地多于一个羟甲基取代的核苷酸单体。羟甲基取代的核苷酸单体理解为含有羟甲基基团(其可为未取代的、O-取代的例如以共轭基团O-取代的、或转变为任选地取代的或共轭的氨甲基基团)的核苷酸单体。该羟甲基基团不参与形成核苷酸间键合且不是天然RNA单体的羟甲基基团(含有5’-羟基基团)。本发明的RNA复合物可用在治疗应用、诊断应用或研究应用。该复合物包括含有反义链和连续或不连续过客链(“有义链”)的能够调节基因表达的短干扰RNA复合物(siRNA双链体)。这些链中至少一条、可能这些链中多于一条被一个或多个本发明的羟甲基取代的核苷酸单体修饰，所述核苷酸单体可位于3’-末端、5’-末端或内部。本发明的RNA复合物还可为以至少一个、但任选地多于一个羟甲基取代的核苷酸单体修饰的单链RNA寡核苷酸(“RNA链”)。无论何时在本专利申请中使用该术语RNA复合物，均认为包括这种单链RNA链。本发明的复合物相对于包括完全天然RNA单体的相应复合物展示对溶核降解增强的稳定性。

Description

羟甲基取代的RNA寡核苷酸和RNA复合物

序列表

本申请包括序列表，其经由EFS-Web以2009年11月2日创建的名为MD0807PC.txt的ASCII文件提交，大小是30,642字节，据此通过引用将其全部内容并入本文。

背景

RNA干扰(RNAi)近年吸引了大量注意，因为它提供沉默靶基因表达的手段。它为基础研究提供研究遗传和生化途径、和单独基因和基因产物功能的方法。因此，RNA干扰已成为在制药行业中验证靶的关键工具。而且，本着开发可用作药物的能够介导RNA干扰复合物的RNA复合物的目标，已进行了大量的研究。

RNAi用于治疗的吸引力在于其敏感性和序列特异性。然而，已经产生了关于序列特异性的担忧，如由于RNA复合物的错误链可能指导对错误的靶核酸响应。而且，某种大小的RNA复合物诱导非特异性干扰素依赖性响应，这也是不期望的。

专利申请US2003/0108923描述能够介导RNAi的包含反义链和过客链的RNA复合物，其中各链长度是21-23个核苷酸。提议将该RNA复合物用于治疗应用。

类似地，专利申请US2005/0234007描述能够介导RNAi的包含反义链和过客链的RNA复合物，其中复合物包括3'-悬端(3’-overhang)。提议将该RNA复合物用于治疗应用。

WO2005/073378描述含有化学修饰的核苷酸、能够介导RNAi、包含反义链和过客链的RNAi复合物。该说明书中所述的RNA复合物包括LNA残基，且指出在靠近一条链5'末端处并入LNA残基可控制哪条链并入RISC复合物，因为在5-末端形成最弱碱基对的链并入RISC复合物。

RNAi只是使用包括本发明的RNA复合物的寡核苷酸介导基因表达抑制的许多策略之一。包括RNA酶H介导的RNA裂解、立体封闭RNA结合、DNA酶或核酶介导的RNA裂解和siRNA方法的这些不同策略已连同与生物活性相容的所选的化学修饰的核苷酸的性质描述于文献中[J.Kurreck,Eur.J.Biochem.2003,270,1628]。

本发明的羟甲基取代的单体B-E已经被并入DNA链，且因此已报道制备其用于自动DNA/RNA合成的亚磷酰胺结构单元的程序[K.D.Nielsen等人,Bioorg.Med.Chem.1995,3,1493；H.Thrane等人,Tetrahedron1995,51,10389；P.Nielsen等人,Bioorg.Med.Chem.1995,3,19]。已被并入DNA链的胸腺嘧啶单体是独有的。这些羟甲基取代的单体此前都还未被并入RNA链。

在一项报道中，一个或两个2'-开环尿苷被并入DNA寡核苷酸并观察到对RNA酶H介导的RNA降解的积极效应(MangosMM,MinKL,ViazovkinaE,GalarneauA,ElzagheidMI,ParniakMA,DamhaMJ.,JAmChemSoc.2003Jan22；125(3):654-61.)。

概述

本发明提供具有并入RNA链的一个或多个羟甲基取代的单体、将在关于RNA-引导的基因调节或基因分析、尤其是RNA干扰的情况下使用的RNA复合物。因此，本发明的一个目的是提供与通常使用的RNA复合物相比具有减少的脱靶效应的RNA复合物。另一目的是提供诱导减少的干扰素应答的RNA复合物。又另一目的是提供在细胞培养物中或体内关于对酶促降解的稳定性具有改善特性的RNA复合物。又另一目的是提供相对于未修饰的RNA复合物，在细胞培养物中或体内展示增强的基因调节功能如基因沉默效应的RNA复合物。又另一目的是提供靶向特定器官或组织并能够穿透细胞膜的RNA复合物。本发明还提供适于将羟甲基取代的单体并入寡核苷酸的单体和其合成方法。

附图简述

图1

显示并入RNA复合物的羟甲基取代的核苷酸的不同构造的示例。为了比较显示单体A，其是具有其核糖支架的天然RNA单体。包括在本发明的RNA复合物中的单体B-E的特征是其包含为羟甲基基团(“自由羟甲基基团”)的取代基，且因此本发明题为“羟甲基取代的RNA寡核苷酸和RNA复合物”。自由羟甲基基团例如连接在环状核糖支架的C4'原子或基于无环的核糖的支架的C1'原子。本发明的羟甲基取代的核苷酸含有各自连接于磷原子并因此参与形成核苷酸间键合的其它氧原子(参见图1)。这些其它氧原子中的一个或多个可为羟基基团的一部分，这是当本发明的RNA复合物的羟甲基取代的核苷酸中的一个或多个位于RNA链的3'-或5'-末端时的情形。当本发明的RNA复合物的羟甲基取代的核苷酸中的一个位于RNA链的3'-末端和/或5'-末端时，该单体的羟基基团可被磷酸化，如对任何位于末端的天然RNA单体的情形一样。向本发明的羟甲基取代的核苷酸连接核碱基如尿嘧啶、胸腺嘧啶、胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、腺嘌呤、鸟嘌呤或任何其它已知的天然或合成的核碱基或核碱基类似物(图1中标为“碱基”)。

图2

显示羟甲基取代的单体的衍生化、官能化和共轭变体。作为实例显示羟甲基取代的2',3'-开环-RNA单体D的衍生化、官能化和共轭变体(参见图1)。单体F含有经由醚键合连接的基团R。单体G含有经由硫醚键合连接的基团R。单体H含有经由酰胺键合连接的基团R。单体I含有经由氨基键合连接的基团R。单体J含有经由哌嗪基单元连接的基团R。通过将这种单体中的一个或若干个并入本发明的RNA复合物，可调节RNA复合物的特性。例如可引入增加的生物稳定性、增加的RNA靶向能力或特异性递送特性、并为了检测目的可连接荧光基团。

图3

两个羟甲基取代的单体(单体C和单体D)的结构，它们可为寡核苷酸或RNA复合物的单体。

图4

含有“单体X”(即2',3'-开环-RNA单体D)的本发明的siRNA复合物的基因沉默结果。结果以含有具有尿嘧啶作为核碱基的单体D(显示为W130有义链中的‘X’)的W130有义链(参见图4的核苷酸序列)获得。用于本研究的反义链的核酸序列列在该图下部(反义序列中所有X单体是具有尿嘧啶作为核碱基的单体D)。具有上标“L”的单体代表锁核酸(例如，T^L表示胸腺嘧啶锁核酸或LNA)。图4按出现的顺序分别公开了SEQIDNO:44-52。

图5

含有“单体X”(即2',3'-开环-RNA单体D)的本发明的siRNA复合物的基因沉默结果。结果以含有具有尿嘧啶作为核碱基的单体D(显示为W131有义链中的‘X’)的W131有义链(参见图5的核苷酸序列)获得。用于本研究的反义链的核酸序列列在图4下部(反义序列中所有X单体是具有尿嘧啶作为核碱基的单体D)。图5公开了SEQIDNO:53。

图6

含有“单体X”(即2',3'-开环-RNA单体D)的本发明的siRNA复合物的基因沉默结果。这些结果以含有具有胞嘧啶(sC，从W282序列5'-末端的第一个X)、腺嘌呤(sA，从W282序列5'-末端的第二个X)和胞嘧啶(sC，从W282序列3'-末端的最后一个X)作为核碱基的单体D的W282有义链(参见图6的核苷酸序列)获得。用于本研究的反义链的核酸序列列在图4下部(反义序列中所有X单体是具有尿嘧啶作为核碱基的单体D)。图6公开了SEQIDNO：11。图6公开了SEQIDNO:11。

图7

含有“单体X”(即2',3'-开环-RNA单体D)的本发明的siRNA复合物的基因沉默结果。这些结果以W194有义链(参见图7的核苷酸序列)获得。用于本研究的反义链的核酸序列列在图4下部(反义序列中所有X单体是具有尿嘧啶作为核碱基的单体D)。具有上标“L”的单体代表锁核酸(例如，T^L表示胸腺嘧啶锁核酸或LNA)。图7公开了SEQIDNO:55。

图8

含有“单体X”(即2',3'-开环-RNA单体D)的本发明的siRNA复合物的基因沉默结果。这些结果以W181有义链(参见图8的核苷酸序列)获得。用于本研究的反义链的核酸序列列在图4下部(反义序列中所有X单体是具有尿嘧啶作为核碱基的单体D)。具有上标“L”的单体代表锁核酸(例如，T^L表示胸腺嘧啶锁核酸或LNA)。图8公开了SEQIDNO:56。

图9

含有“单体X”(即2',3'-开环-RNA单体D)的本发明的siRNA复合物的基因沉默结果。这些结果以含有具有尿嘧啶作为核碱基的单体D(显示为W129有义链中的‘X’)的W129有义链(参见图9的核苷酸序列)获得。本研究中包括的反义链列在图4下部(反义序列中所有X单体是具有尿嘧啶作为核碱基的单体D)。具有上标“L”的单体代表锁核酸(例如，T^L表示胸腺嘧啶锁核酸或LNA)。图9公开了SEQIDNO:57。

详述

在本发明一方面描述的具体特征也适用于本发明的其它方面。例如，在适当时，关于第一方面的RNA复合物描述的特征也适用于第九方面的寡核苷酸和第十方面的RNA双链体。

第一方面，RNA复合物

siRNA双链体或单链RNA形式的RNA复合物可介导细胞中对靶核酸的各种修饰。这个过程中，复合物的反义链作为向导，因为反义链可杂交于具有与该反义链互补的序列段的靶核酸。

靶向靶核酸之前，反义链通常被并入RNA引导的蛋白复合物(RGPC)，这可对靶核酸起作用。RNA引导的蛋白复合物的一个实例是RNA诱导的沉默复合物(RISC)。认为存在其它这种RGPC且本发明的RNA复合物将也有益处，当与这些其它RGPC一起使用或甚至不与任何RGPC相互作用时。

本发明的一个目的是使RNA复合物对生物介质(血清、体内、细胞培养物中)中的溶核降解稳定。

本发明的另一个目的是改善双链RNA复合物的基因沉默效应。该改善可例如涉及增加的效力、减少的脱靶效应、减少的免疫刺激、增加的储存稳定性、在生物介质如血清等中增加的稳定性、增加的作用持续时间和改善的药代动力学特征，所有这些均是相对于天然未修饰的RNA复合物而言。

本发明的又另一个目的是改善单链RNA寡核苷酸的基因沉默效应。该改善可例如涉及增加的效力、减少的脱靶效应、减少的免疫刺激、增加的储存稳定性、在生物介质如血清等中增加的稳定性、增加的作用持续时间和改善的药代动力学特征，所有这些均是相对于天然未修饰的RNA复合物而言。

本发明的一个目的是确保只有本发明siRNA复合物的反义链而不是过客链将介导对靶核酸的修饰。这一目的的实现将提供具有较少脱靶效应的RNA复合物。

本发明的另一个目的是确保RNA复合物在生物介质中的足够的稳定性。因此一个目的是提供相对于未修饰的RNA复合物，在细胞培养物中或体内展示增强的基因调节功能如基因沉默效应的RNA复合物。

本发明的基本理念是将一个或多个羟甲基取代的单体并入本发明的RNA复合物。在siRNA的情况中，这可导致优先将复合物的仅一条链并入RISC。将一个或多个羟甲基取代的单体并入RNA复合物的一条(或多条)RNA链将改善RNA复合物在生物介质中和体内的寿命，并因此将导致改善的生物活性，例如改善的基因调节活性。

本发明RNA复合物的RNA链可包括天然的RNA核苷酸、已知与基因沉默活性相容的RNA修饰[Nawrot和Sipa,Curr.TopicsMed.Chem.2006,6,913-925]和羟甲基取代的单体(图1)。磷酸二酯键合(Phosphordiesterlinkage)可连接单独单体，但可改为使用修饰的键合如硫代磷酸酯键合和本领域技术人员已知的其它键合[Nawrot和Sipa,Curr.TopicsMed.Chem.2006,6,913-925]。RNA复合物可包括两条链，它们一起构成包括反义链(反义链本文中也称为引导链)和过客链(过客链本文中也称为有义链)的siRNA双链体，但单链微RNA模拟分子在本文也被认为是本发明的RNA复合物，如例如可用于靶向微RNA的单链反义分子。

在本发明实施方案中，RNA复合物包括一个或多个羟甲基修饰的核苷酸单体(参见图1)。依此作为一个这种实例的是无环的核苷酸单体，更优选地选自单体D-J组成的组的无环的单体。因此，在第一方面关于羟甲基修饰的核苷酸单体所述的实施方案将适用于关于无环的核苷酸单体的其它实施方案。

出于多种原因，使用羟甲基修饰的核苷酸单体可为有利的。羟甲基修饰的核苷酸单体可例如用于增加RNA复合物的基因沉默效应，且将一个或多个羟甲基修饰的核苷酸单体并入例如RNA复合物末端诱导对溶核降解的显著稳定性。羟甲基修饰的核苷酸单体还可用于减少siRNA复合物过客链的基因沉默效应，从而减少脱靶效应的数目。

在本发明的一个优选实施方案中，包含一个或多个羟甲基修饰的核苷酸单体的RNA复合物是单链RNA构建体。

在本发明的一个优选实施方案中，包含一个或多个羟甲基修饰的核苷酸单体的RNA复合物是能够通过作为单链反义分子抑制基因表达的单链RNA构建体。

在本发明的一个优选实施方案中，包含一个或多个羟甲基修饰的核苷酸单体的RNA复合物是功能上模拟微RNA的单链RNA构建体。

在本发明的一个优选实施方案中，包含一个或多个羟甲基修饰的核苷酸单体的RNA复合物是siRNA构建体。

因此，在一个实施方案中，siRNA构建体的反义链包括一个或多个羟甲基修饰的核苷酸单体。

在另一个实施方案中，siRNA构建体的过客链包括一个或多个羟甲基修饰的核苷酸单体。在又另一个实施方案中，siRNA构建体的带切口的过客链的第一和第二RNA分子各含有一个或多个羟甲基修饰的核苷酸单体。

在本发明一个实施方案中，反义链中羟甲基修饰的核苷酸单体的数目是10。在本发明其它实施方案中，反义链中羟甲基修饰的核苷酸单体的数目分别是9、8、7、6、5、4、3、2或1。

在另一个实施方案中，反义链的所有核苷酸是羟甲基修饰的核苷酸单体。

在优选实施方案中，反义链中所有羟甲基修饰的核苷酸单体存在于位置1-8，其中位置从5'末端计数。甚至更优选地，反义链中羟甲基修饰的核苷酸单体存在于对应于微RNA的所谓种子区(seedregion)的位置2-7。因此，在前述区域中存在羟甲基修饰的核苷酸单体将阻止反义链作为微RNA起作用，这减少当反义链意为作为siRNA起作用时的脱靶效应。

在优选实施方案中，至少一个羟甲基修饰的核苷酸单体存在于位置9-16之一，其中位置从5'末端计数。甚至更优选地是，2、3、4、5或6个羟甲基修饰的核苷酸单体存在于位置9-16，且在另一实施方案中，反义链中的羟甲基修饰的核苷酸单体存在于位置9-16的所有位置。在一个实施方案中，羟甲基修饰的核苷酸单体仅存在于区域9-16且不存在于反义链的其余部分。

甚至更优选地，反义链中羟甲基修饰的核苷酸单体存在于位置9-11，且优选地不存在于寡核苷酸的其余部分。在前述区域中存在羟甲基修饰的核苷酸单体将诱导反义链作为微RNA起作用，即确保siRNA效应将最小且微RNA效应更高。该效应可能来自于因存在无环的羟甲基取代的单体例如单体D导致亲和力减少而向全长结合的趋势的减少。

类似地，在本发明另一实施方案中，本发明siRNA复合物过客链中羟甲基修饰的核苷酸单体的数目是10。在本发明其它实施方案中，本发明siRNA复合物过客链中羟甲基修饰的核苷酸单体的数目分别是9、8、7、6、5、4、3、2或1。

在另一个实施方案中，本发明siRNA复合物过客链的所有核苷酸是羟甲基修饰的核苷酸单体。

在一个实施方案中，本发明siRNA复合物的反义链和过客链含有一个或多个羟甲基修饰的核苷酸单体。

一方面，本发明提供能够介导对靶核酸的核酸修饰的RNA复合物。这种RNA复合物可例如为siRNA、微RNA或微RNA前体(前-微RNA，pre-microRNA)。

本发明siRNA复合物的RNA复合物包括含有反义链和杂交于反义链的过客链的核心双链区。

本文上下文中所指的靶核酸是对复合物反义链具有显著的互补性的核酸。优选地，互补性对若干个核苷酸的段是完全的。

因此，在一个实施方案中，互补性对25个核苷酸的段是完全的。

在其它实施方案中，互补性分别对24个核苷酸、23个核苷酸、22个核苷酸、21个核苷酸、20个核苷酸、19个核苷酸、18个核苷酸、17个核苷酸、16个核苷酸、15个核苷酸、14个核苷酸、13个核苷酸、12个核苷酸、11个核苷酸、10个核苷酸、9个核苷酸、8个核苷酸、7个核苷酸或6个核苷酸的段是完全的。

在一个实施方案中，互补性段包括1个错配。在其它实施方案中，互补性段分别包括2个错配、3个错配或4个错配。1个错配是互补性段中的一个区域，其中不能形成碱基对，例如当G面对A时。当存在更多错配时，它们可能彼此相邻或它们可在互补性段的不同区域中间隔开。

在优选实施方案中，本发明siRNA复合物的RNA复合物包括核心双链区，其是大致双链的区。RNA复合物中的单链区主要与复合物的悬端相关。

因此，在一个实施方案中，本发明siRNA复合物的双链区包括1个错配。在其它实施方案中，双链区分别包括2个错配、3个错配和4个错配。

本文所用的术语“靶核酸”包涵将经受反义链引导的调节诸如靶向裂解或空间阻塞(stericblockage)的任何RNA/DNA。靶RNA/DNA可例如是基因组DNA、基因组病毒RNA、mRNA、前-mRNA或非编码RNA。

本文所用的术语“靶核酸修饰”是指对靶核酸的任何修饰，包括影响靶核酸活性而不影响靶核酸结构的修饰。

本发明优选的靶核酸是mRNA。因此，在一个实施方案中，RNA复合物介导的核酸修饰是RNA干扰(RNAi)。在优选实施方案中，RNAi介导mRNA的降解。在另一优选实施方案中，RNAi介导mRNA的翻译抑制。在另一个实施方案中，RNAi介导mRNA的翻译抑制和降解。

在其它优选实施方案中，靶核酸是非编码RNA，例如tRNA、miRNA、snRNA、snoRNA或rRNA。

在又一个实施方案中，靶核酸是基因组DNA。在这种实施方案中，优选的核酸修饰包括DNA甲基化和DNA缺失。

本发明RNA复合物的大小可改变而仍实现本发明的一个或多个目的。这在例如当具体目的是减少的脱靶效应时适用。

因此，本发明siRNA复合物的核心双链区可包括选自下组的许多碱基对：10个碱基对、11个碱基对、12个碱基对、13个碱基对、14个碱基对、15个碱基对、16个碱基对、17个碱基对、18个碱基对、19个碱基对、20个碱基对、21个碱基对、22个碱基对、23个碱基对、24个碱基对和25个碱基对、26个碱基对、27个碱基对、28个碱基对、29个碱基对、30个碱基对、35个碱基对、40个碱基对、42个碱基对、45个碱基对、50个碱基对、55个碱基对、60个碱基对或62个碱基对。

在一个实施方案中，本发明siRNA复合物的核心双链区包括15至40个碱基对。

在另一优选实施方案中，本发明siRNA复合物的核心双链区包括18-22个碱基对。

在一个实施方案中，本发明siRNA复合物的核心双链区甚至长于40个碱基对，尽管知道在一些细胞引入较长双链RNA复合物可诱导干扰素依赖性非特异性应答。在一个这种实施方案中，预期复合物与RGPC接合之前被加工为较短的双链RNA复合物。RNA酶III样酶诸如切丁酶(Dicer)可进行加工。切丁酶还加工短于40个碱基对的双链RNA，且这种RNA复合物(称为切丁酶底物)与不经加工进入RISC的siRNA相比具有多种益处。因此在一个实施方案中，本发明的RNA复合物是切丁酶底物。

在另一个实施方案中，RNA复合物是单链，并且没有双链区。

在又另一个实施方案中，RNA复合物是单链但折叠以使其含有一个或多个双链区。这种实施方案可用于例如模拟微RNA和其功能。

在又另一个实施方案中，本发明siRNA复合物的核心双链区短于10个碱基对且因此包括一到九个碱基对。

在本发明一个实施方案中，RNA复合物的核心双链区被多于两条RNA链包括。

在本发明一个实施方案中，RNA复合物的核心双链区被三条RNA链包括。

在本发明另一实施方案中，RNA复合物的核心双链区被四条或更多RNA链包括。

在本发明优选实施方案中，本发明siRNA复合物包括悬端。本文上下文中所用的悬端是指跟随双链区之后的短单链区。

在一个实施方案中，本发明siRNA复合物的反义链包括3'-悬端。

在另一个实施方案中，本发明siRNA复合物的过客链包括3'-悬端。

在又另一个实施方案中，本发明siRNA复合物的反义链包括5'-悬端。

在又另一个实施方案中，本发明siRNA复合物的过客链包括5'-悬端。

在优选实施方案中，本发明siRNA复合物的反义链和过客链都包括3'-悬端。

本发明siRNA复合物的悬端可为不同长度，而不干扰复合物的基本功能。因此在一实施方案中，悬端选自长度为1个核苷酸、2个核苷酸、3个核苷酸、4个核苷酸、5个核苷酸、6个核苷酸、7个核苷酸和8个核苷酸的悬端的组。

本发明siRNA复合物的最优选的悬端是长度分别为1、2和3个核苷酸的悬端。

在一个实施方案中，本发明siRNA复合物的反义链的悬端具有与过客链悬端相同的长度。

在另一个实施方案中，本发明siRNA复合物的反义链的悬端不具有与过客链悬端相同的长度。

在本发明siRNA复合物的又另一实施方案中，RNA复合物包括至少一个平端。“平端”是指双链核酸不具有任何突出的核苷酸的末端，即双链核酸的两条链在相同位置终止。

在另一个实施方案中，本发明siRNA复合物在两个末端均是平端的。

本发明的优选RNA复合物总体结构上类似于切丁酶加工较长的双链RNA复合物的产物。在另一个实施方案中，本发明的RNA复合物是如上述的切丁酶底物。

本发明的其它优选的RNA复合物是其中核心双链区包括18-22个碱基对，且其中反义链和过客链各包括1-3个核苷酸的3'-悬端的复合物。

本发明RNA复合物的反义链可具有不同长度，而不干扰复合物的功能。因此在优选实施方案中，反义链分别是8-mer、9-mer、10-mer、11-mer、12-mer、13-mer、14-mer、15-mer、16-mer、17-mer、18-mer、19-mer、20-mer、21-mer、22-mer、23-mer、24-mer、25-mer、26-mer、27-mer、28-mer、29-mer、30-mer、31-mer、32-mer、33-mer、34-mer、35-mer、36-mer、37-mer、38-mer、39-mer、40-mer、41-mer、42-mer、43-mer、44-mer、45-mer、46-mer、47-mer、48-mer、49-mer、50-mer、51-mer、52-mer、53-mer、54-mer、55-mer、56-mer、57-mer、58-mer、59-mer、60-mer、61-mer或62-mer。应理解，例如19-mer是19个单体即19个核苷酸的反义链。

在另一优选实施方案中，RNA复合物的反义链选自下组反义链：15-mer、16-mer、17-mer、18-mer、19-mer、20-mer、21-mer、22-mer和23-mer。在一实施方案中，本发明siRNA复合物的过客链是不连续的。在本发明siRNA复合物的一实施方案中，过客链包括若干个分开的RNA分子。RNA分子的数目可为1、2、3、4、5或6。

在一个实施方案中，本发明siRNA复合物过客链的单独RNA分子的长度是多于4个单体。在其它实施方案中，过客链的单独RNA分子的长度分别是多于5个单体、6个单体、7个单体、8个单体、9个单体、10个单体、11个单体和12个单体。

在其它实施方案中，本发明siRNA复合物过客链的单独RNA分子的长度分别是低于5个单体、6个单体、7个单体、8个单体、9个单体、10个单体、11个单体和12个单体。

在本发明一个实施方案中，本发明siRNA复合物的不连续的过客链包括第一和第二RNA分子，它们一起形成不连续的过客链，其中第一RNA分子杂交于反义链的下游部分，而第二RNA分子杂交于反义链的上游部分。

在一个实施方案中，本发明siRNA复合物的反义链是不连续的。反义链的优选的不连续性与过客链的优选的不连续性相同。

本发明siRNA复合物的一条链的不连续性可以是切口。切口应理解为双链核酸的一条链中因缺少磷酸二酯键但双链核酸却没有缺少核苷酸而导致的不连续性。因此，面对切口的碱基仍将杂交于带切口的链上的碱基。

本发明siRNA复合物的一条链的另一种不连续性是可选的切口，这理解为双链核酸的一条链中因糖-磷酸酯主链上缺少除了磷酸二酯键以外的一个键或多于一个键但双链核酸却没有缺少核碱基而导致的不连续性。因此，面对切口的碱基仍可杂交于带切口的链上的碱基。

当本发明RNA复合物的RNA链可被描述为具有其中双链核酸中缺少至少一个核苷酸或核苷或核碱基的不连续性时，缺口用作命名。

优选地，RNA复合物的5'-末端是磷酸化的或可用于磷酸化。可用于磷酸化是指5'-羟基基团还未被例如通过直接共轭或通过与接近5'-羟基基团的其它基团的其它共轭封闭，这种封闭将阻止5'-羟基基团被磷酸化。

因此在本发明优选实施方案中，RNA复合物的RNA分子包括5'-末端磷酸酯和3'-羟基基团。

在另一个实施方案中，本发明siRNA复合物的第二RNA分子包括5'-末端磷酸酯和3'-羟基基团。

在又另一个实施方案中，反义链包括5'-末端磷酸酯和3'-羟基基团。

在本发明一些实施方案中，RNA复合物包括羟甲基修饰的核苷酸以外的核苷酸类似物是优选的。这种羟甲基修饰的核苷酸以外的核苷酸类似物以下称为“另外修饰的核苷酸”。

出于多种原因，另外修饰的核苷酸的使用可为有利的。它们可例如用于增加本发明siRNA复合物的核心双链区的解链温度。

另外修饰的核苷酸的使用可有利于增加反义链和靶核酸之间形成的双链结构的解链温度。

因此在一个实施方案中，反义链包括另外修饰的核苷酸。

在另一个实施方案中，本发明siRNA复合物的过客链包括另外修饰的核苷酸。

在又另一个实施方案中，本发明siRNA复合物的过客链的第一和第二RNA分子各含有另外修饰的核苷酸。

在本发明一个实施方案中，RNA复合物中另外修饰的核苷酸的数目是10。在本发明其它实施方案中，RNA复合物中核苷酸类似物的数目分别是9、8、7、6、5、4、3、2或1。

在本发明一个实施方案中，反义链中另外修饰的核苷酸的数目是10。在本发明其它实施方案中，反义链中核苷酸类似物的数目分别是9、8、7、6、5、4、3、2或1。

在另一个实施方案中，反义链的所有核苷酸是另外修饰的核苷酸或是另外修饰的核苷酸与羟甲基取代的核苷酸的组合。

类似地，在本发明另一实施方案中，本发明siRNA复合物过客链中核苷酸类似物的数目是10。在本发明其它实施方案中，过客链中核苷酸类似物的数目分别是9、8、7、6、5、4、3、2或1。

在另一个实施方案中，本发明siRNA复合物过客链的所有核苷酸是核苷酸类似物或是另外修饰的核苷酸与羟甲基取代的核苷酸的组合。

在一个实施方案中，本发明siRNA复合物的反义链和过客链都含有另外修饰的核苷酸。

在一个实施方案中，RNA复合物的另外修饰的核苷酸是相同的，即它们例如都是LNA或都是2'-O-Me-RNA。在另一个实施方案中，各种不同的另外修饰的核苷酸用于同一RNA复合物中。

在一个实施方案中，RNA复合物包括硫代磷酸酯键(或称为硫代磷酸酯键合，phosphorothioatelinkage)。

在另一个实施方案中，RNA复合物包括天然磷酸二酯(phosphordiester)和硫代磷酸酯键合的混合物。

本发明的优选的核苷酸类似物是选自下组的核苷酸类似物：2'-O-烷基-RNA单体、2'-氨基-DNA单体、2'-氟-DNA单体、LNA单体、HNA单体、ANA单体、FANA单体、DNA单体、PNA单体和INA单体，但还可使用其它单体[Nawrot和Sipa,Curr.TopicsMed.Chem.2006,6,913-925]。

在一实施方案中，本发明的羟甲基取代的单体的羟甲基取代基被共轭基团官能化。共轭基团是本领域技术人员已知的改变、扩大或改善本发明RNA复合物的特性的基团。这种基团可用于调节细胞分布、器官分布、组织分布、双链体解链温度、靶亲和力、生物稳定性、杂交信号转导等。

在一实施方案中，本发明的羟甲基取代的单体的羟甲基取代基被共轭的基团与羟甲基取代基的亚甲基基团之间的醚键合官能化。参见图2(单体F)。

在一实施方案中，使用本领域技术人员已知的方法，本发明的羟甲基取代的单体的羟甲基取代基在并入本发明RNA复合物之前转变为硫醚官能度。参见图2(单体G)。

在另一实施方案中，使用本领域技术人员已知的方法，本发明的羟甲基取代的单体的羟甲基取代基在并入本发明RNA复合物之前转变为巯甲基官能度。参见图2(单体G，R＝H)。使用本领域技术人员已知的方法，该巯基官能度在RNA合成期间被适当地保护，例如作为其乙酰基衍生物。

在一实施方案中，使用本领域技术人员已知的方法，本发明的羟甲基取代的单体的羟甲基取代基在并入本发明RNA复合物之前转变为胺官能度。参见图2(单体I，R＝H)。使用本领域技术人员已知的方法，该胺官能度在RNA合成期间被适当地保护，例如作为其三氟乙酰基或Fmoc衍生物。

在一实施方案中，本发明的羟甲基取代的单体的羟甲基取代基作为柄(handle)起作用以连接酰胺-连接的共轭基团。这包括羟甲基取代基的羟基单元向胺单元的转变，例如如上所述的，以及使用本领域技术人员已知的方法通过例如共轭基团经由酰胺键形成的该氨基基团的进一步衍生化。使用本领域技术人员已知的方法，这可发生在RNA合成之前或RNA合成之后(图2，单体H)。

在一实施方案中，本发明的羟甲基取代的单体的羟甲基取代基作为柄起作用以连接氨基-连接的共轭基团。这包括羟甲基取代基的羟基单元向胺单元的转变，例如如上所述的，以及使用本领域技术人员已知的方法通过例如共轭基团经由胺键形成的该氨基基团的进一步衍生化。使用本领域技术人员已知的方法，这可发生在RNA合成之前或RNA合成之后(图2，单体I)。

在另一实施方案中，用于共轭的胺基团是氨基基团、哌嗪基基团或二氨基烷基基团。这种单体称为胺-衍生化的单体。这些基团各自可被进一步衍生化或共轭(图2，单体J)。

在一个实施方案中，与天然RNA复合物相比，本发明RNA复合物具有减少的脱靶效应。

在一优选实施方案中，RNA复合物在反义链中具有至少一个本发明的羟甲基取代的单体。

在另一优选实施方案中，RNA复合物具有至少一个并入或围绕反义链的所谓种子区的本发明的羟甲基取代的单体，即该单体在从反义链5'-末端的第1-12号位置的至少一个中。

在又另一优选实施方案中，RNA复合物具有至少一个从反义链5'-末端的第2-10号位置的至少一个中并入的本发明的羟甲基取代的单体。

在又另一优选实施方案中，RNA复合物具有一个从反义链5'-末端的第3-8号位置之一中并入的本发明的羟甲基取代的单体。

在又另一优选实施方案中，RNA复合物具有一个从反义链5'-末端的第7号或第8号位置之一中并入的本发明的羟甲基取代的单体。

在又另一优选实施方案中，RNA复合物具有一个从反义链5'-末端的第7号位置中并入的本发明的羟甲基取代的单体。

在又另一优选实施方案中，RNA复合物具有一个从反义链5'-末端的第9-16号位置中并入的本发明的羟甲基取代的单体。

在又另一优选实施方案中，RNA复合物具有一个从反义链5'-末端的第9-11号位置中并入的本发明的羟甲基取代的单体。

在又另一优选实施方案中，RNA复合物具有一个从反义链'-末端的第9-10号位置中并入的本发明的羟甲基取代的单体。

在另一个实施方案中，本发明的RNA复合物与天然RNA复合物相比产生减少的免疫应答。

在更另一个实施方案中，本发明的RNA复合物与天然RNA复合物相比具有延长的效应。

在又另一个实施方案中，本发明的RNA复合物与天然RNA复合物相比具有增加的效应。因此在优选实施方案中，RNA复合物比天然RNA复合物更有效地介导RNAi，例如通过靶mRNA的更有效地降解或通过靶mRNA的更有效地翻译抑制。

在又另一个实施方案中，本发明的RNA复合物有效地递送于人类或动物的特定器官或组织。

在又另一实施方案中，本发明的RNA复合物能够有效地穿透细胞膜。

在又另一实施方案中，本发明的RNA复合物能够比(that)天然RNA复合物更有效地穿透细胞膜。

在一个实施方案中，本发明的RNA复合物能够结合血浆蛋白，这增加RNA复合物在人体中的滞留。

第二方面，RNA复合物的制备

本发明的另一方面是制备本发明双链RNA复合物的方法，所述方法包括在其中形成包含核心双链区的RNA复合物的条件下温育反义链与过客链，所述RNA复合物能够介导相应细胞RNA的RNA干扰。

在该方面的替代实施方案中，RNA复合物被本发明的RNA双链体代替(第十方面)。

第三方面，介导核酸修饰的方法

本发明的又另一方面是介导细胞或生物体中靶核酸的核酸修饰的方法，其包括以下步骤：

a.在其中可发生靶核酸修饰的条件下将细胞或生物体与本发明的RNA复合物接触，

b.从而介导靶核酸的修饰。

在优选实施方案中，介导靶核酸的核酸修饰的方法在体外进行。

在优选实施方案中，介导靶核酸的核酸修饰的方法在体内进行，即在动物、人类或非人类动物中。

在优选实施方案中，介导靶核酸的核酸修饰的方法在细胞培养物中进行。

在又另一个实施方案中，该方法对分离的细胞进行。

在优选实施方案中，该方法的核酸修饰是RNA干扰，优选的是靶mRNA的降解或靶mRNA的翻译抑制或其它类型RNA例如非编码RNA的抑制。

在另一个实施方案中，该核酸修饰是DNA甲基化。

在该方面的替代实施方案中，该RNA复合物被本发明的寡核苷酸(第九方面)或本发明的RNA双链体(第十方面)代替。

第四方面，检查基因功能的方法

本发明的另一方面是检查细胞或生物体中基因功能的方法，其包括：

a.将对应于所述基因的本发明的RNA复合物引入细胞或生物体，从而产生测试细胞或测试生物体，

b.将测试细胞或测试生物体保持在其中可发生靶核酸修饰的条件下，

c.观察测试细胞或生物体在步骤b中产生的表型并任选地将观察到的表型与合适的对照细胞或对照生物体的表型比较，从而提供关于基因功能的信息。

例如使用所附实施例中列出的转染，本发明的RNA复合物可引入细胞。

可观察生物体或细胞的表型，例如使用蛋白组学来评价蛋白水平或使用微阵列来评价RNA水平。还可使用更精细的表型，例如一种特定基因的表达。

所获得的关于基因功能的信息可用于确定基因产物是否是与特定疾病相关的治疗干预的适合的靶。因此，如果证实某一基因产物在已知在例如具体亚型癌症中受影响的某一生化途径中起作用，那么该基因产物可能是治疗前述亚型癌症的治疗干预的适合的靶。

在检查细胞或生物体中基因功能的方法的优选实施方案中，该方法中的核酸修饰是RNA干扰，优选的是靶mRNA的降解或靶RNA的翻译抑制。

在另一个实施方案中，该核酸修饰是DNA甲基化。

在检查细胞或生物体中基因功能的方法的优选实施方案中，该方法在细胞培养物中、体外或体内进行。

在又另一个实施方案中，该方法对分离的细胞进行。

第五方面，评价药剂的方法

本发明的另一方面是评价一种药剂是否作用于基因产物的方法，其包括以下步骤：

b.将测试细胞或测试生物体保持在其中发生靶核酸修饰的条件下，

c.将药剂引入测试细胞或测试生物体，

d.观察测试细胞或生物体在步骤c中产生的表型，并任选地将观察到的表型与合适的对照细胞或对照生物体的表型比较，从而提供关于药剂是否作用于基因产物的信息。

步骤d中优选的对照是不具有步骤a中引入的RNA复合物的测试细胞或测试生物体。

在评价药剂是否作用于基因或基因产物的方法的优选实施方案中，该方法的核酸修饰是RNA干扰，优选的是靶RNA的降解或靶RNA的翻译抑制。在另一个实施方案中，核酸修饰的修饰是DNA甲基化。

在评价药剂是否作用于基因产物的方法的优选的实施方案中，该方法在细胞培养物中、体外或体内进行。

在又另一个实施方案中，该方法对分离的细胞进行。

第六方面，药物组合物

本发明的又另一方面是RNA复合物和药学上可接受的稀释剂、载体或辅助剂。对技术人员明显的是，本发明的RNA复合物可设计为靶向特定基因和基因产物。应理解的是，该RNA复合物将靶向DNA序列或RNA序列而不是蛋白。然而，基因产物诸如蛋白的水平可被间接影响，如果其mRNA或非编码RNA被例如RNA降解或翻译抑制所修饰。还可影响编码该蛋白的基因的表达，例如因为DNA甲基化。

第七方面，使用药物

因此另一方面是本发明的RNA复合物用作药物。验证治疗靶后，技术人员可设计影响靶水平和活性的RNA复合物，因为RNA复合物的特异性专门地存在于反义链序列中。对于具有连续过客链的天然RNA复合物，由于过客链作为引导序列起作用，因而仍存在脱靶效应的问题。

第八方面，单体

本发明的一个方面是适于并入本发明的羟甲基取代的单体的单体和从易于获得的起始物料制备其的方法。本发明的羟甲基取代的单体的胸腺嘧啶-1-基衍生物已被并入DNA链，且制备其用于自动DNA/RNA合成的亚磷酰胺结构单元的程序已被报道[K.D.Nielsen等人,Bioorg.Med.Chem.1995,3,1493；H.Thrane等人,Tetrahedron1995,51,10389；P.Nielsen等人,Bioorg.Med.Chem.1995,3,19]。

最通常地，本发明的RNA复合物将由如本领域技术人员已知的自动寡核苷酸合成制备。将本发明的羟甲基取代的单体并入本发明的RNA复合物遵循用于a)在自动RNA合成仪上的RNA合成、b)RNA检查、c)RNA纯化和d)RNA分离的标准方法[F.Eckstein,OligonucleotidesandAnalogues(寡核苷酸和类似物),IRLPress,OxfordUniversityPress,1991]。羟甲基取代的RNA寡核苷酸(＝RNA链)和RNA复合物可使用亚磷酰胺衍生物，使用RNA合成的标准技术合成。

在优选实施方案中，制备本发明的羟甲基取代的单体的亚磷酰胺衍生物的方法开始于核糖核苷，例如核糖核苷的O5'-DMT保护的衍生物，对于碱基，腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和5-甲基胞嘧啶含有碱基保护基团，如例如，苯甲酰基、异丁酰基、乙酰基、苯氧乙酰基、叔丁基苯氧乙酰基或本领域技术人员已知的其它标准碱基保护基团。

在优选实施方案中，本发明包括制备具有2',3'-断开的碳-碳键(核糖核苷命名法)的适于并入单体D和E的单体结构单元的方法。

在其它优选实施方案中，本发明包括制备具有2',3'-断开的碳-碳键、适于并入单体如F-J且另外在例如其2'-碳原子(核糖核苷命名法)携带羟基基团以外的官能度或基团的单体结构单元的方法。

在本发明优选实施方案中，制备单体D的亚磷酰胺衍生物的方法的关键步骤中包括2',3'-二醇裂解、所得的中间产物的还原、选择性O2'-保护和O3'-磷酸化(phosphitylation)。

在优选实施方案中，以例如高碘酸钠为试剂使用氧化裂解进行2',3'-二醇裂解。

在另一优选实施方案中，高碘酸钠裂解后中间产物的还原被还原为相应的二醇，以例如硼氢化钠实现。

为了将单体D并入本发明的RNA复合物，保护2'-羟基基团(核糖核苷命名法)是必须的。在本发明的优选实施方案中，这通过苯甲酰化进行。为了优化保护的选择性，即O2'-苯甲酰化相对于O3'-苯甲酰化的量，仅使用略多于一当量的苯甲酰化试剂(苯甲酰氯或例如苯甲酸酐(benzoylanhydride))可为有益的。在一个优选的实施方案中，苯甲酰化在室温以下进行。在另一有用的实施方案中，苯甲酰化在0℃以下或甚至-50℃以下进行。

在另一优选实施方案中，O2'-保护通过乙酰化或通过使用有机合成领域技术人员已知的酰化试剂进行酰化来完成。

在另一优选实施方案中，O2'-保护通过使用有机合成领域技术人员已知的硅烷化试剂和方法硅烷化来进行。优选的硅烷化保护基团是叔丁基二甲基甲硅烷基。

在优选实施方案中，随后的磷酸化(phosphitylation)反应使用所谓“PCl”试剂[PCl(OCH₂CH₂CN)(N(iPr)₂)]或所谓“bis-amidite”试剂[P(OCH₂CH₂CN)(N(iPr)₂)₂]进行。

在制备单体D的亚磷酰胺衍生物的方法的优选实施方案中，起始物料是核糖核苷，例如核糖核苷的O5'-DMT保护的衍生物，对于碱基，腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和5-甲基胞嘧啶含有碱基保护基团如例如苯甲酰基、异丁酰基、乙酰基、苯氧乙酰基、叔丁基苯氧乙酰基或本领域技术人员已知的其它标准碱基保护基团。

在另一优选实施方案中，本发明提供制备单体E的亚磷酰胺衍生物的方法。

在本发明优选实施方案中，制备单体E亚磷酰胺衍生物的方法的关键步骤中包括2',3'-二醇裂解、所得的中间产物的还原、选择性O3'-保护和O2'-磷酸化(phosphitylation)。O3'-保护可例如通过硅烷化或酰化进行，或通过组合如首先O2'-苯甲酰化、然后O3'-硅烷化、之后O2'-脱苯甲酰化进行。如本领域技术人员清楚的，还可施加其它保护基团。

在另外优选实施方案中，制备具有2',3'-断开的碳-碳键、适于并入单体如F-J且另外在其2'-碳原子(核糖核苷命名法)携带羟基基团以外的官能度的单体结构单元的方法的关键步骤中包括开始于核糖核苷(例如O5'-DMT保护的核糖核苷(ribonucleosde))2',3'-二醇裂解、所得的中间产物的还原、选择性O3'-保护、2'-羟基基团的转化、O3'-脱保护和O3'-磷酸化(phosphitylation)。O3'-保护可例如通过硅烷化或酰化进行，或如首先O2'-苯甲酰化、然后O3'-硅烷化、之后O2'-脱苯甲酰化的组合进行。如本领域技术人员清楚的，还可施加其它保护基团。转化2'-羟基基团为另一基团如氨基、酰化氨基、烃化氨基、二烃化氨基、氨甲酰化氨基、哌嗪基、酰化哌嗪基、烃化哌嗪基、氨甲酰化哌嗪基、巯基、酰化巯基、烃化巯基、二硫化物、酰化羟基、烃化羟基、氨甲酰化羟基等，或通过这些基团的取代和/或保护的衍生物，可使用有机合成领域技术人员已知的方法和程序进行。这种方法和程序包括对2'-羟基基团的活化衍生物的取代反应或酰化或氨甲酰化反应。这种方法和程序还包括O2'-烃化反应和并入其它C2'连接基团如氨基或巯基后的烃化反应。又另一种可能性是2'-羟基基团氧化获得醛官能度，其可通过例如与亲核试剂反应进一步修饰，或获得羧基官能度，其可在羧基官能度转化为活化的衍生物如活化酯后通过例如与亲核试剂反应进一步修饰。

在本发明另一实施方案中，制备适于并入单体如F-J、但为“倒置的”(如单体D和E可认为是“倒置的”)以使O2'原子被磷酸化(phosphitylated)且3'-羟基基团转变为另一基团以使C3'原子连接于羟基基团以外的官能度的单体结构单元的方法的关键步骤中包括开始于核糖核苷(例如O5'-DMT保护的核糖核苷(ribonucleosde))2',3'-二醇裂解、所得的中间产物的还原、选择性O2'-保护、3'-羟基基团的转化、O2'-脱保护和O2'-磷酸化(phosphitylation)。O2'-保护可例如通过硅烷化或酰化、或两者的组合来进行。如本领域技术人员清楚的，还可施加其它保护基团。3'-羟基基团转化为另一基团如氨基、酰化氨基、烃化氨基、二烃化氨基、氨甲酰化氨基、哌嗪基、酰化哌嗪基、烃化哌嗪基、氨甲酰化哌嗪基、巯基、酰化巯基、烃化巯基、二硫化物、酰化羟基、烃化羟基、氨甲酰化羟基等，或通过这些基团的取代和/或保护的衍生物，可使用有机合成领域技术人员已知的方法和程序进行。这种方法和程序包括对3'-羟基基团的活化衍生物的取代反应或酰化或氨甲酰化反应。这种方法和程序还包括O3'-烃化反应和并入其它C3'连接基团如氨基或巯基后的烃化反应。又另一种可能性是3'-羟基基团氧化获得醛官能度，其可通过例如与亲核试剂反应进一步修饰，或获得羧基官能度，其可在羧基官能度转化为活化的衍生物如活化酯后通过例如与亲核试剂反应进一步修饰。

在一个实施方案中，2'-C-哌嗪基衍生物通过转化2'-羟基基团为离去基团(例如甲磺酸酯衍生物)、随后与大量过量哌嗪反应而制备。这例如可作为朝向结构AmiditeJ的亚磷酰胺(参见下图)合成的步骤进行。

在又另一个实施方案中，本发明包括制备适于并入本发明的羟甲基取代的单体、在C1'原子(核糖核苷命名法)携带不同于天然核碱基的基团或官能度的单体结构单元的方法。可含有保护基团的这种基团或官能度包括例如天然核碱基以外的芘、苝、荧光团、氢、烷基、反应性基团和杂环。

在又另一个实施方案中，本发明包括制备适于并入本发明的羟甲基取代的单体的单体结构单元的方法，该羟甲基取代的单体构造为H-膦酸酯衍生物而不是亚磷酰胺衍生物。

以下显示本发明关于亚磷酰胺(＝amidite)结构单元的一些优选的实施方案的结构实例(DMT＝4,4'-二甲氧基三苯甲基；碱基＝天然核碱基；CEtO＝氰基乙氧基)：

R＝烷基、胆固醇基衍生物、荧光团、聚胺、脂肪酸、氨基酸、糖类或多肽等。

第九方面，包含无环的寡核苷酸的寡核苷酸

本发明的第九方面是包含无环的核苷酸单体的寡核苷酸。如根据说明和实施例部分明显的，这种寡核苷酸具有多种应用和益处。

在优选实施方案中，该无环的核苷酸单体是2'-3'-开环-核苷酸单体。已经惊讶地发现包含无环的核苷酸单体的本发明的寡核苷酸是RNAi机制的细胞酶底物，且在一些情形中，这些寡核苷酸是甚至比无无环的核苷酸单体的相同寡核苷酸更好的底物。

优选地，该无环的核苷酸单体选自单体E、F、G、H、I或J(参见图1)组成的组。如技术人员清楚的，G、F、H、I和J都可从单体D的合成的前体制备。如图2所示，无环的单体可转化为携带共轭基团的衍生物，所述共轭基团诸如胆固醇基(cholestoryl)衍生物、烷基、荧光团、聚胺、氨基酸、糖类、多肽等。当寡核苷酸用于调节细胞、器官或生物体中的靶mRNA的活性时，这种共轭基团例如对于更好的生物稳定性和/或生物分布可以是有用的。

寡核苷酸的长度优选地从10到40个核苷酸单体。甚至更优选的是从18到30个核苷酸单体的长度。

在优选实施方案中，本发明的寡核苷酸包括少于5个无环的核苷酸单体。在另一优选实施方案中，该寡核苷酸包括每5个核苷酸单体(不同于无环的核苷酸单体)不多于1个的无环的核苷酸单体。甚至更优选的是每8个核苷酸单体(不同于无环的核苷酸单体)不多于1个的无环的单体。如果无环的核苷酸单体的数目达到高，那么本发明的寡核苷酸对互补核酸的结合亲和力会受危害。

因此在另一个实施方案中，该寡核苷酸包括从1到5个无环的核苷酸单体。

在优选实施方案中，无环的核苷酸单体仅存在于寡核苷酸位置1-8的一个或多个且更优选地位置2-7。位置是从寡核苷酸的5'末端计数。这些区域的无环的核苷酸单体将减少或阻止寡核苷酸作为微RNA起作用，因为这些位置对应微RNA的所谓的种子区。这是相关的，例如当寡核苷酸意为作为siRNA引导链起作用时。

在优选实施方案中，反义链中所有羟甲基修饰的核苷酸单体存在于位置9-16，其中位置是从5'末端计数的。甚至更优选地，反义链中羟甲基修饰的核苷酸单体存在于位置9-11。因此，前述区域中羟甲基修饰的核苷酸单体的存在将诱导反义链作为微RNA起作用，即确保siRNA效应将最小且微RNA效应更高。这种效应很可能源于因存在无环的羟甲基取代的单体例如单体D导致的亲和力减少而对全长结合的趋势的减少。

在优选实施方案中，该寡核苷酸不包括多于8个连续的DNA单体的DNA序列。甚至更优选的是不多于6个连续的DNA单体且最优选地不多于4个连续的DNA单体。连续的DNA单体通常将使得寡核苷酸当结合于互补RNA时激活RNA酶H，这导致RNA降解。在本发明一些实施方案中，这是不期望的。因此在进一步实施方案中，该寡核苷酸根本不含有任何DNA单体。

在其它实施方案中，RNA酶H激活是期望的且该寡核苷酸包括多于4个连续的DNA单体，更优选地多于6个DNA单体且最优选地多于8个DNA单体是优选的。

在又另一个实施方案中，该寡核苷酸包括多于50％的RNA单体。高程度的RNA单体将便于与RNA-相互作用蛋白相互作用，例如通过作为对细胞酶诸如RISC的底物或指导(或辅因子)起作用。

因此在另一个实施方案中，多于80％的寡核苷酸单体是RNA单体是优选的。在又另一个实施方案中，多于90％的寡核苷酸单体是RNA单体是优选的。

如将明显的，该寡核苷酸还可包括核苷酸单体类似物。在一个这种实施方案中，无环的核苷酸单体和RNA单体构成多于所有核苷酸单体中的80％。在另一个实施方案中，无环的单体和RNA单体构成多于所有核苷酸单体中的90％。

当该寡核苷酸包括核苷酸单体类似物时，该核苷酸单体类似物选自2'-O-烷基-RNA单体、2'-氨基-DNA单体、2'-氟-DNA单体、LNA单体、PNA单体、HNA单体、ANA单体、FANA单体、CeNA单体、ENA单体、DNA单体和INA单体组成的组是优选的。核苷酸类似物通常用于调节结合亲和力、增加生物稳定性且通常给予寡核苷酸更多的药物样性质。

在一个实施方案中，该寡核苷酸包括至少2个LNA核苷酸类似物。无环的核苷酸单体通常减少本发明的寡核苷酸与互补核酸碱基配对的解链温度(即结合亲和力)，并且LNA核苷酸单体可用于抵消解链温度的这种减少。即在一个实施方案中，无环的核苷酸单体的数目与LNA核苷酸单体的数目相同。

在优选实施方案中，该寡核苷酸仅包括无环的单体和RNA单体。

在另一优选实施方案中，该寡核苷酸仅包括无环的核苷酸单体、RNA单体和LNA核苷酸类似物。

在优选实施方案中，本发明的寡核苷酸包括选自硫代磷酸酯键合(phosophorothioatelinkage)、硼代磷酸酯键合(或称为硼代磷酸酯键，boranophosphatelinkage)、乙基膦酸酯键合(ethylphosphonatelinkage)、氨基磷酸酯键合(phosphoramidatelinkage)和磷酸三酯键合(phosphortriesterlinkage)组成的组的一种或多种键合。最优选的是硫代磷酸酯键合和/或硼代磷酸酯键合。这些键合改善寡核苷酸的生物稳定性并且还已显示对寡核苷酸的生物分布有积极影响。在优选实施方案中，该寡核苷酸包括多于50％的前述核苷酸间键合，甚至更优选地多于75％。在一个实施方案中，所有核苷酸间键合是前述类型。

在优选实施方案中，本发明的寡核苷酸不与互补寡核苷酸碱基配对，即本发明的寡核苷酸是单链。

在又另一个实施方案中，该寡核苷酸能够介导与该寡核苷酸互补的靶mRNA的RISC依赖性翻译阻遏或降解。技术人员将认识到RISC作为RNA诱导的沉默复合物并理解在该实施方案中，该寡核苷酸将作为RISC的引导序列起作用并从而将RISC引导向RNA寡核苷酸，通常是对本发明的寡核苷酸具有部分或完全互补性的mRNA。当寡核苷酸将RISC引导向部分互补性的mRNA靶时，该寡核苷酸可被视为微RNA模拟物，且当寡核苷酸将RISC引导向完全互补性的mRNA靶时；其可被视为单链或双链siRNA。

可通过使用针对编码RISC组件的mRNA的siRNA敲除RISC的组件并评价寡核苷酸在敲除细胞系中的活性，来在细胞系中评价RISC依赖性。这种试验是本领域技术人员熟知的。

第十方面，包含本发明寡核苷酸的RNA双链体

本发明的第十方面是包含根据本发明的第一寡核苷酸和第二寡核苷酸的RNA双链体。

在优选实施方案中，RNA双链体的第二寡核苷酸也是本发明的寡核苷酸。

如将清楚的，在第一方面关于本发明的RNA复合物描述的许多特征也适用于第十方面的RNA双链体。

优选地，本发明的RNA双链体包括从15到40个数目的碱基对，且在优选实施方案中，包括选自下组数目的碱基对：18个碱基对、19个碱基对、20个碱基对、21个碱基对、22个碱基对和23个碱基对。

在又另一个实施方案中，该RNA双链体包括从25到30个数目的碱基对，更优选地从26到28个且最优选地27个碱基对。这种RNA双链体可被称为切丁酶底物RNA。

在优选实施方案中，本发明的RNA双链体包括悬端。

在另一个实施方案中，RNA双链体包括两个悬端。

在又另一个实施方案中，第一寡核苷酸包括3'-悬端。

在又另一个实施方案中，第二寡核苷酸包括3'-悬端。

优选地，悬端的长度从1到8个核苷酸且甚至更优选地，悬端的长度选自具有1个核苷酸、2个核苷酸和3个核苷酸的长度的悬端组成的组。

在另一个实施方案中，RNA双链体包括至少一个平端。

在另一个实施方案中，RNA双链体两个末端都是平端的。

在优选实施方案中，该RNA双链体包括18-22个碱基对的双链区，其中第一寡核苷酸和第二寡核苷酸各包括1-3个核苷酸的3'-悬端。这种RNA双链体将被认可为规范的siRNA(短干扰RNA)。

在一个实施方案中，RNA双链体的一条链是不连续的，如第一方面详述的。

在一个实施方案中，RNA双链体能够介导与RNA双链体的第一或第二寡核苷酸互补的靶mRNA的翻译阻遏或降解。即RNA双链体将作为例如siRNA、微RNA或前-微RNA起作用。

在一个实施方案中，RNA双链体与具有RNA单体而不是无环的单体的相同RNA双链体相比，能够介导靶mRNA的翻译阻遏或降解，同时诱导减少的脱靶效应。减少的脱靶可因为减少的结合亲和力而实现，还可因为第一或第二寡核苷酸可被修饰诸如以使不能够作为RISC的引导链起作用而实现。即可以控制RNA双链体的哪条寡核苷酸作为过客链(有义链)起作用，哪条将作为引导链(反义链)起作用。

在另一个实施方案中，RNA双链体能够介导靶mRNA的翻译阻遏或降解，同时诱导减少的脱靶效应，当特别地无环的单体位于siRNA双链体引导(反义)链的位置5-10时，其中位置从寡核苷酸5'末端计数。

在另一个实施方案中，RNA双链体能够介导靶mRNA的翻译阻遏或降解，同时诱导减少的脱靶效应，当特别地无环的单体位于siRNA双链体的引导(反义)链的位置6-8时。不意为理论所限制，相信在这些位置无环的单体的存在诱导减少的结合亲和力，所述无环的单体导致引导链诱导微RNA-型效应的能力减少。即无环的单体在正确的位置时减少所谓的种子区结合，假定这种结合对于微RNA活性比siRNA活性更重要。

在一个实施方案中，RNA双链体能够介导RNA靶向，例如基因沉默或RNA干扰，与具有RNA单体而不是无环的单体的相同RNA双链体相比有增加的效力。增加的效力可因为RISC反应裂解产物的脱除率(off-rate)增加而实现。脱除率可因为结合亲和力减少而增加。增加的底物柔性还可增加水解率。而且增加的柔性可便于RNA双链体在将引导链装进RISC之前解旋。

在一个实施方案中，RNA双链体能够介导靶mRNA的翻译阻遏或降解，与具有RNA单体而不是无环的单体的相同RNA双链体相比有延长的效力。延长的效力可例如因为RNA双链体的寡核苷酸和双链体本身是外切核酸酶和内切核酸酶的较差的底物并从而增加寡核苷酸和双链体的稳定性而实现。

在一个实施方案中，RNA双链体能够介导靶mRNA的翻译阻遏或降解，其中RNA双链体与具有RNA单体而不是无环的单体的相同RNA双链体相比具有改善的生物稳定性。

在又另一个实施方案中，RNA双链体能够介导靶mRNA的翻译阻遏或降解，其中RNA双链体与具有RNA单体而不是无环的单体的相同RNA双链体相比具有减少的免疫刺激。免疫刺激的一个原因是与识别外来寡核苷酸的Toll-样受体相互作用。由于本发明的RNA双链体是非天然的，它们将更难被Toll-样受体检测。

参考文献

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实验程序和实施例

实施例1.本发明的RNA复合物的合成。

用于自动DNA/RNA合成本发明的RNA复合物的羟甲基取代的单体的亚磷酰胺结构单元的制备程序已被报道[胸腺嘧啶衍生物；K.D.Nielsen等人,Bioorg.Med.Chem.1995,3,1493；H.Thrane等人,Tetrahedron1995,51,10389；P.Nielsen等人,Bioorg.Med.Chem.1995,3,19]。请参见实施例11公开的腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶的示例亚磷酰胺衍生物的制备程序。

将这些羟甲基取代的单体并入本发明的RNA复合物遵循用于a)在自动RNA合成仪上的RNA合成、b)RNA检查、c)RNA纯化和d)RNA分离的标准方法[F.Eckstein,OligonucleotidesandAnalogues(寡核苷酸和类似物),IRLPress,OxfordUniversityPress,1991]。这证实使用已知的亚磷酰胺衍生物、使用RNA合成标准技术可合成羟甲基取代的RNA寡核苷酸(＝RNA链)和RNA复合物。

LNA是含有一个或多个2'-O,4'-C-亚甲基-连接的核糖核苷酸(LNA核苷酸)的寡核苷酸[M.Petersen和J.Wengel,TrendsBiotechnol.2003,21,74-81]。LNA-修饰的siRNA是含有一个或多个LNA单体的siRNA构建体。通过使用可购买获得的LNA亚磷酰胺，已知方法已被用于将LNA核苷酸并入本发明的RNA复合物[Pfundheller,Lomholt,Johansen,Koch和Wengel,J."LockedNucleicAcidSynthesis(锁核酸合成)",MethodsMol.Biol.2004,第288卷(OligonucleotideSynthesis(寡核苷酸合成)),127-145.,P.Herdewijn编辑,HumanaPressInc.]。

羟甲基取代的siRNA(“羟甲基取代的小干扰RNA)是含有一个或多个羟甲基取代的核苷酸单体的siRNA构建体(参见图1的羟甲基取代的核苷酸单体的结构)。示例单体如下所示：

寡核苷酸-siRNA构建体中选择的反义链：

天然RNA5’-ACUUGUGGCCGUUUACGUCGCU(SEQIDNO:1)

JW11035’-ACUUGUGGCCGUUUACGUCU(SEQIDNO:2)

JW11865’-ACUUGGGCCGUUUACGUCU(SEQIDNO:3)

JW11875’-ACUGGGCCGUUACGCU(SEQIDNO:4)

W1235’-ACUUGGGCCGUUUACGUCU

W1245’-ACUGUGGCCGUUUACGUCU

W1255’-ACUUGUGGCCGUUUACGCU

W1265’-ACUUGUGGCCGUUACGUCU

W1275’-ACUUGUGGCCGUUUACGTCGU

W1285’-ACUGUGGCCGUUUACGTCGU

寡核苷酸-siRNA构建体中选择的有义链：

天然RNA5’-GACGUAAACGGCCACAAGUUCU(SEQIDNO:11)

JW11045’-GACGUAAACGGCCACAAGUU(SEQIDNO:12)

JW11065’-GAGUAAAGGCCAAAGUU(SEQIDNO:13)

JW11885’-GACGUAAACGGCCACAAGC(SEQIDNO:14)

W0435’-GACGUAAACGGCCACAAGUU(SEQIDNO:15)

W0445’-GAGAAAGGCAAAGUU(SEQIDNO:16)

JW11895’-GACGAAACGGCCACAAGC(SEQIDNO:17)

W1295’-GACGAAACGGCCACAAGUU

W1305’-GACGAAACGGCCACAAGUU

W1315’-GACGUAAACGGCCACAAGUUU

W1325’-GACGAAACGGCCACAAGUUU

已经合成的其它羟甲基取代的RNA链：

5’-ACUUGUGGCCGUUUACGUGU(SEQIDNO:22)

5’-GAGAAAG(SEQIDNO:23)

5’-GCAAAGUU(SEQIDNO:24)

-上标中的“L”指示该残基是LNA核苷酸。

-上标中的“MeL”指示该残基是具有5-甲基胞嘧啶碱基的LNA核苷酸。

-粗体下划线的是羟甲基取代的核苷酸单体。该实施例中它是C4'-分支-RNA单体C的胸腺嘧啶-1-基衍生物(参见图1)。

-粗体下划线的是羟甲基取代的核苷酸单体。该实施例中它是C4'-分支-RNA单体C的5-甲基胞嘧啶-1-基衍生物(参见图1)。

-粗体下划线的是羟甲基取代的无环的核苷酸单体。以上序列中它是2',3'-开环-RNA单体D的尿嘧啶-1-基衍生物(参见图1)。在其它实施例和附图中包括尿嘧啶以外的其它碱基变体。

所研究的其他序列参见实施例9和10。

已进行细胞研究(表达EGFP的肺癌细胞系)。作为示例本发明的例子，使用了含有两个或三个核苷酸悬端的siRNA双链体。该示例设计仅是示意，而且许多其它构建体包括在本发明中并类似地起作用。因此，例如包括平端的siRNA双链体、比示例的双链体短或长的siRNA双链体、和单链反义链。类似地包括含有反义链和不连续过客链(“过客链”还可称为“有义链”)的RNA复合物。

实施例2.本发明的siRNA复合物的退火和转染程序。

将细胞铺板到6-孔板并生长到40-60％汇合。就在转染前，将细胞重新铺板到每孔1ml完全生长培养基。有义和反义链以各20μM浓度在退火缓冲液(10mMTris-HCl,pH7.3,50mMNaCl)中混合并在95℃温育1min、在37℃温育1h。在6-孔板的每孔中准备以下溶液：150μl无血清的RPMI培养基中4μlTransIT-TKO。加入退火的siRNA复合物，小心混合，在室温温育20min，并倒在细胞上。最终RNA复合物浓度是50nM。在37℃温育24h后，更换培养基并将细胞在37℃再温育24h。通过胰蛋白酶处理除去细胞，并分成两份用于随后的RNA和流式分析。

由于实现了基因沉默(参见下文)，证实含有羟甲基取代的单体的本发明的RNA复合物在标准转染条件下可穿透细胞膜。

实施例3.基因沉默

mRNA和蛋白定量的程序。由流式细胞计数分析来分析eGFP蛋白的表达。蛋白质印迹法如下进行：细胞在PBS中洗涤两次，将等量细胞在2xSDS样品缓冲液[4％十二烷基硫酸钠(SDS)、20％甘油、125mMTris/HClpH6.8,0.01mg/ml溴酚蓝、10％2-巯基乙醇]在90℃裂解2x10min，之间轻柔抽吸。在8％SDS-丙烯酰胺凝胶中分离蛋白，并电印迹到PVDF膜(Immobilon)上过夜。滤液以含有10％w/v奶的PBS封闭1h。使用兔多克隆EGFP抗体(SantaCruzBiotechnology)的1:1000稀释液检测EGFP蛋白。小鼠hnRNPC1抗体是SeraphinPinol-Roma的赠品。辣根过氧化物酶(hrp)共轭的二抗(DAKO)与ECL试剂(AmershamBiosciences)一起用于显像。根据标准程序以RNA印迹法分析eGFPmRNA。

以下是在50mMsiRNA复合物浓度进行的基因沉默实验结果的列表。结果以相对于错配的对照siRNA双链体获得的基因表达水平(设为100％)的百分比提供：

条目1显示未修饰的siRNA复合物有效地沉默GFP基因。

条目2显示LNA-修饰的siRNA复合物有效地沉默GFP基因。该构建体有两个朝向两条RNA链的3'-末端的LNA修饰。

在条目3-8的示例基因沉默实验中研究了含有结构T/C的C4'-分支(branced)-RNA羟甲基取代的单体的siRNA复合物(图3)。

条目3显示在从有义链3'-末端的位置2和3具有羟甲基取代的单体的本发明siRNA复合物对沉默GFP基因是高度功能性的。

条目3的示例和条目4、5、6、13和14的示例是反义链作为LNA-修饰的RNA链的示例，但未修饰的RNA反义链或完全或部分修饰的RNA反义链也将是功能性的。获得的结果显示另外修饰的单体如LNA单体与本发明的羟甲基取代的单体完全相容。

条目4证实在有义链中具有羟甲基取代的单体T/C的本发明siRNA复合物对介导基因沉默是高度有效的。

条目5和6证实有义链中具有羟甲基取代的单体T/C的本发明siRNA复合物对介导基因沉默是高度有效的。

结果显示以具有并入有义链的羟甲基取代的单体的本发明的siRNA复合物实现了非常有效的基因沉默。数据显示了令人惊讶地发现：当与以未修饰的siRNA或LNA-修饰的siRNA实现的基因沉默相比时，以本发明的这些RNA复合物实现了大体上甚至改善的基因沉默。而且，甚至以包含在中心双链体形成核心区中有若干个羟甲基取代的单体的有义RNA链的RNA复合物，沉默也是有效的(条目，W044为实例)。

条目7和8揭示，在复合物反义链中具有羟甲基取代的单体T/C的本发明siRNA复合物能够介导基因沉默。看起来并入反义链的羟甲基取代的单体T/C越多，基因沉默活性就越低。

条目7、8、15、16、17和18的实例中LNA-修饰的有义链用作示例，但未修饰的RNA有义链或完全或部分修饰的RNA有义链也将是功能性的。获得的结果显示另外修饰的单体如LNA单体与本发明的羟甲基取代的单体完全相容。

条目9-18的示例基因沉默实验中研究了含有图3上所示结构X的2',3'-开环-RNA羟甲基取代的单体的本发明siRNA复合物。

条目9证明在两条RNA链的每一条中具有一个羟甲基取代的单体X(朝向两条链的3'-末端)的本发明siRNA复合物介导非常有效的基因沉默到与未修饰的siRNA相当的水平。考虑到羟甲基取代的单体X的核糖单位的非环状性质，这是令人惊讶的。

如果RNA复合物两条链的每一条中具有另外的X单体，基因沉默效力是无效的(条目10)。

条目11与条目10一起揭示靠近反义链5'-末端并入羟甲基取代的单体X减少siRNA复合物的基因沉默效力。

条目12揭示靠近有义链5'-末端并入羟甲基取代的单体X减少siRNA复合物的基因沉默效力，当另一单体X并入有义链3'-末端时。

条目13和14证实靠近有义链5'-末端并入羟甲基取代的单体X减少siRNA复合物的基因沉默效力。结果指示在siRNA构建体有义链的中心部分并入羟甲基取代的单体X既不提高基因沉默活性也不减少。

条目15-18展示以包含LNA-修饰的RNA有义链和具有一个羟甲基取代的单体X的反义链的本发明的siRNA复合物的基因沉默实验结果。

结果显示在反义链中心区含有羟甲基取代的单体X例如W126和W123的本发明的siRNA复合物介导非常有效的基因沉默。令人惊讶的是W127与W131一起介导非常有效的基因沉默，但W127与LNA-修饰的RNA有义链JW1106一起仅诱导中度基因沉默。这强调了观察结果的令人惊讶的方面(条目9)：在两条RNA链的每一条中具有一个羟甲基取代的单体X(朝向两条链的3'-末端)的本发明siRNA复合物介导非常有效的基因沉默到与未修饰的siRNA相当的水平。

以含有具有尿嘧啶、胸腺嘧啶或5-甲基胞嘧啶以外的核碱基的羟甲基取代的单体的本发明的RNA复合物可获得类似上述结果的结果。例如对含有具有腺嘌呤、胞嘧啶或鸟嘌呤作为核碱基的羟甲基取代的单体的本发明的RNA复合物使用类似程序(protecol)可获得相当的基因沉默活性。

实施例4.免疫刺激。

因为含有羟甲基取代的单体的本发明的RNA复合物相对于相应未修饰的RNA复合物是化学修饰的，所以它们将展示比相应未修饰的RNA复合物更少的免疫刺激活性。

实施例5.脱靶效应。

因为含有羟甲基取代的单体的本发明的RNA复合物可被调节以使反义链修饰的siRNA复合物失活，所以本发明使得具有较少脱靶效应的基因沉默成为可能。关键是以羟甲基取代的单体修饰有义链以使有义链不能作为反义链起作用。这可例如通过朝向有义链5'-末端并入羟甲基取代的单体而实现。

以无环的单体X，通过将单体X并入反义链，最优选从反义链5'-末端大约位置6-8，例如在从反义链5'-末端的位置7中，可实现减少的脱靶效应。

实施例6.含有官能化和共轭的羟甲基单体的本发明RNA复合物的合成。

本发明的羟甲基取代的单体的羟甲基取代基通过共轭基团被官能化。共轭基团在本文定义为调节、扩大或改善本发明RNA复合物的化学、生物物理学或生物学特征的基团。这种基团可用于调节细胞分布、器官分布、组织分布、解链温度、靶亲和力、生物稳定性、杂交信号转导等。

已知方法可用于转化羟甲基取代基为多种化学衍生物[Furniss,Hannaford,Smith和Tatchell,Vogel’sTextbookofOrganicChemistry(Vogel有机化学教科书),1989,JohnWiley&Sons]。这可在核苷水平实现，即转化为可用于在自动DNA合成仪上自动合成RNA的亚磷酰胺衍生物之前。羟甲基基团转化为可用的衍生物后，使用标准方法合成自动RNA合成所需的亚磷酰胺衍生物，并随后使用标准方法实现将衍生化或共轭的单体并入RNA寡核苷酸(链)(参见实施例1)。

经由醚键合共轭。本发明的羟甲基取代的单体的羟甲基取代基通过共轭基团与羟甲基取代基的亚甲基基团之间亲核取代反应的醚键合而官能化。该反应包括羟甲基取代基的羟基基团向良好的离去基团的转化，通过例如甲磺酰化或转化为卤化物，和随后经由醇或醇盐衍生物的亲核连接。

经由硫醚键合共轭。本发明的羟甲基取代的单体的羟甲基取代基通过共轭基团与羟甲基取代基的亚甲基基团之间亲核取代反应的硫醚键合而官能化。该反应包括羟甲基取代基的羟基基团向良好的离去基团的转化，通过例如甲磺酰化或转化为卤化物，和随后经由烷基硫醇或硫醇盐衍生物的亲核连接。如果替代地亲核试剂是SH^-，以例如乙酰化保护产生可用于将巯基(SH)基团引入本发明的RNA复合物的亚磷酰胺衍生物。作为将巯基(mearcapto)官能度引入RNA复合物的替代方案，可使用与含有二硫化物的部分的共轭。还原含有二硫化物的RNA复合物后，获得巯基基团官能化的RNA复合物。

衍生化为氨甲基基团。本发明的羟甲基取代的单体的羟甲基取代基可转变为氨甲基基团。该反应包括羟甲基取代基的羟基基团向良好的离去基团的转化，通过例如甲磺酰化或转化为卤化物，和随后经由氨或保护的胺衍生物(如例如苯邻二甲酰亚胺)的亲核连接，其中所述保护的胺衍生物随后被脱保护(例如在RNA合成后)以产生期望的氨基衍生物。三氟乙酰基或Fmoc保护基团是自动RNA合成期间氨基保护的其它选择，在标准寡核苷酸脱保护后释出自由氨基基团。

经由酰胺键合共轭。本发明的羟甲基取代的单体的羟甲基取代基作为柄起作用以连接酰胺-连接的共轭基团。这包括羟甲基取代基的羟基单元向胺单元的转化，例如如上所述的，和使用已知方法通过例如共轭基团经由酰胺键形成而对该氨基基团的进一步衍生化。使用本领域技术人员已知的方法，这可发生在RNA合成之前或RNA合成之后[Bryld,和Wengel,Chem.Commun.2004,1064；Mokhir,Tetzlaff,Herzberger,Mosbacher和Richart,J.Comb.Chem.2001,3,374]。

经由氨基键合共轭。本发明的羟甲基取代的单体的羟甲基取代基还作为柄起作用以连接氨基-连接的共轭基团。这包括羟甲基取代基的羟基单元向胺单元的转化，例如如上所述的，和通过是已知反应的还原性氨化反应由含有例如醛官能度的共轭基团对该氨基基团的进一步衍生化[Furniss,Hannaford,Smith和Tatchell,Vogel’sTextbookofOrganicChemistry(Vogel有机化学教科书),1989,JohnWiley&Sons]。这可发生在RNA合成之前或RNA合成之后。

经由哌嗪基基团或线性二氨基烷基基团共轭。通过进行如所述的反应，哌嗪基基团或线性二氨基烷基基团也用于衍生化[Bryld,和Wengel,Chem.Commun.2004,1064-5]。这些基团将是有用的，由于其它共轭基团可在RNA寡核苷酸合成之前或之后，通过例如酰胺键形成或通过还原性氨化反应连接在例如哌嗪基基团的远端氮原子(参见图2，单体J)[Bryld,和Wengel,Chem.Commun.2004,1064；Mokhir,Tetzlaff,Herzberger,Mosbacher和Richart,J.Comb.Chem.2001,3,374]。以这种方式，例如胆固醇基或脂肪酸单元可经由哌嗪基-甲基取代基连接到本发明的RNA复合物。

使用这些程序，可制备含有例如胆固醇基单元、烷基单元、脂肪酸单元、聚胺衍生物、硫代衍生物、氨基酸、多肽、单糖类衍生物、多糖类衍生物或荧光团的本发明的RNA复合物，它们都经由羟甲基取代基的亚甲基基团连接于本发明的RNA复合物。此处列出的基团仅是使用上述示例的程序可连接的基团的实例。参见图2的共轭的单体的结构实例。

实施例7.经由含有官能化和共轭的羟甲基单体的本发明的RNA复合物的基因沉默。

以含有官能化和共轭的羟甲基单体的本发明的RNA复合物，基因沉默是有效的(参见例如图2或实施例6)。

当这些官能化和共轭的羟甲基单体位于或靠近siRNA复合物两条链的3'-末端时，实现有效的基因沉默。

此外，当这些官能化和共轭的羟甲基单体位于或靠近siRNA复合物有义链的3'-末端和5'-末端时，实现有效的基因沉默。

尤其是当这些官能化和共轭的羟甲基单体位于或靠近siRNA复合物有义链的3'-末端时，实现有效的基因沉默。

此外，当这些官能化和共轭的羟甲基单体位于单链反义RNA寡核苷酸中时，实现有效的基因沉默。

当本发明RNA复合物的基团(图2中的R)是胆固醇基衍生物时，实现药代动力学特征的调节和有效的基因沉默。这导致例如改善的组织分布和细胞摄取，还有增加的生物稳定性。

当本发明RNA复合物的基团(图2中的R)是硫代衍生物时，实现药代动力学特征的调节和有效的基因沉默。这导致人体中的循环时间增加，即减少的经肾的清除。

当本发明RNA复合物的基团(图2中的R)含有氨基基团时，实现药代动力学特征的调节和有效的基因沉默。这导致改善的组织分布。

实施例8.羟甲基取代的RNA复合物的生物稳定性。

稳定性测定的实验程序。将羟甲基取代的RNA复合物在37℃温育在D-MEM(Gibco)中稀释的10％胎牛血清(Gibco)。在所示时间点收集5μl样品并立即在干冰上冷冻于15μl1.33xTBE/10％甘油上样缓冲液，进行15％凝胶上的非变性的PAGE。以SYBR金(Invitrogen)使得RNA可见。

这项实验显示在生物介质中羟甲基取代的RNA复合物的稳定性相对于天然(或“未修饰的”)对照RNA复合物展示改善的稳定性。因此在10％血清中，羟甲基取代的siRNA比普通siRNA显著更稳定。因此可预想，经过多于一小时的温育时期只观察到羟甲基取代的siRNA大小的很小的下降。我们推断，含有羟甲基取代的单体的本发明的RNA复合物在细胞、动物和人类中非常稳定，这一特性有助于其非常有效的基因沉默特征。由于该显著的生物稳定性，含有羟甲基取代的单体的本发明的RNA复合物比其未修饰的相应物展示更长时间的基因沉默。

实施例9.证明结构D的单体对基因沉默的强效力的一系列基因沉默实验。

使用现有实验中描述的程序，使用此前描述序列以及另外的序列的siRNA双链体进行基因沉默研究(本实施例研究中包括的序列参见图4-9)。这些实验包括含有并入的一个或多个单体X的序列(参见实施例1对单体X的描述)。单体X在本文仅作为示例结构使用，并且对衍生物如例如单体E、单体F、单体G、单体I和单体J(参见图1和图2)预测类似结果。带有上标L的粗体和下划线单体是LNA单体。在该实施例包括图4-9中，-甲基胞嘧啶-1-基LNA单体。

结果绘于图4的实验都包括具有并入的两个单体X的有义链(W130)。其显示了：

-设计包括含有羟甲基取代的和LNA单体的链并展示基因沉默功能性的siRNA双链体是可能的；

-设计包括有义链中具有错配的单体X的链并展示基因沉默功能性的siRNA双链体是可能的；

-全RNA反义链(除了朝向3'-末端的两个LNA单体)是良好耐受的；

-反义链中单个X单体是良好耐受的(W123、W125或W126)；

-以W186和W187作为反义链比以W123、W125或W126作为反义链，观察到若干个X单体是耐受的但较不有效的基因沉默；

-以W188观察到显著的基因沉默活性，尽管该反义链含有六个LNA单体，这显示单体X位于反义链中间相对于单体X被相应RNA单体取代的情况能够改善基因沉默。

结果绘于图5的实验都包括具有位于朝向链3'-末端的一个单体X的有义链(W131)。其显示了：

-全RNA反义链(除了朝向3'-末端的两个LNA单体)是良好耐受的；

-反义链中单个X单体可为良好耐受的(W123)；

-单个X单体可能导致相对于未修饰的对照(siRNA-EGFP)同样好的或甚至改善的基因沉默(W125或W126)；

-若干个X单体是相当良好耐受的(W186、W187或W281作为反义链)；

-以W188观察到显著的基因沉默活性，尽管该反义链含有六个LNA单体，这显示单体X位于反义链中间相对于单体X被相应RNA单体取代的情况能够改善基因沉默；

-在没有LNA单体共存在的情况中，反义链中单体X的若干个取代观察到显著的基因沉默(W281)。

结果绘于图6的实验都包括具有沿着有义链散布的三个X单体的有义链(W282)。其显示了：

-全RNA反义链(除了朝向3'-末端的两个LNA单体)是良好耐受的；

-反义链中单个X单体可是良好耐受的，最明显的是朝向3'-末端的，相对于未修饰的对照(siRNA-EGFP)观察到同样好的或甚至改善的基因沉默(W123、W125、W126)；

-若干个X单体是相当良好耐受的(W186、W187或W281作为反义链)；

-以W188观察到显著的基因沉默活性，尽管该反义链含有六个LNA单体，这显示单体X位于反义链中间，以及当有义链含有若干个X单体时，相对于单体X被相应RNA单体取代的情况能够改善基因沉默；

-在没有LNA单体共存在的情况中，反义链中单体X的若干个取代也观察到基因沉默(W281)。

结果绘于图7的实验都包括无单体X的有义链(W194)。其显示了：

-反义链中单个X单体可为良好耐受的(W123)；

-若干个X单体是相当良好耐受的(W186、W187或W281作为反义链)；

-在没有LNA单体共存在的情况中，反义链中单体X的若干个取代也观察到显著的基因沉默(W281)。

结果绘于图8的实验都包括无单体X的有义链(W181)但具有并入双链体形成区段的四个LNA单体(加3'-末端中的两个LNA单体)。其显示了：

-反义链中单个X单体为良好耐受的(W123、W125或W126)；

-若干个X单体是相当良好耐受的(W186、W187或W281作为反义链)；

结果绘于图9的实验都包括具有位于朝向链5'-末端的一个单体X的有义链(W129)。其显示了：

-全RNA反义链(除了朝向3'-末端的两个LNA单体)是良好耐受的；

-反义链中单个X单体可为良好耐受的，并可能导致相对于未修饰的对照(siRNA-EGFP)改善的基因沉默(W123、W125或W126)；

-若干个X单体是相当良好耐受的(W186、W187或W281作为反义链)；

以下显示的数据指示，羟甲基取代的单体与sisiRNA方法相容。作为实例，W123反义链+(W004+W005)有义链的三分子组合的使用导致有效的基因沉默(即，“siRNA效应”具有低值，在siRNA效应是0.24的情形)，这显示单体X可位于sisiRNA复合物的反义链中(与对照相比；读为1.0)。还显示未修饰的siRNA的数据。反义链的设计是重要的，因为W186反义链+(W004+W005)有义链的组合不能诱导基因沉默效应。这显示，羟甲基取代的单体(例如单体D)的数目应当低，最有利地限于一个单体(除了反义链悬端中任选的羟甲基取代的单体之外)。图9所示研究中包括的其它RNA复合物关于基因沉默是等效的。

实施例10.种子修饰减少脱靶效应。

使用反义链W124和W207(5'-GACGUAAACGGCCACAAGU)(SEQIDNO:25)作为50nM浓度的siRNA双链体中的有义链，我们已经显示了当单体X存在于反义链的所谓种子区中时具有选择性增强效应，这将导致较少脱靶效应。因此实验设定允许区别siRNA效应(以链裂解沉默基因)和miRNA效应(翻译阻遏；基于质粒的具有四个包括仅种子区匹配的靶区的脱靶感受子(sensor))。使用上述组合，siRNA效应如同未修饰的siRNA对照，而miRNA效应显著减少。对siDharma(具有从反义链5'-末端第2号位置并入的2'-O-Me-RNA单体的商品)获得类似效应。如上所述，这显示存在于反义链的所谓种子区的羟甲基取代的单体(例如单体D)导致有利的效应(即，减少的脱靶效应或脱靶效应的消除)。因此，减少或消除RNA复合物脱靶效应的方法，该方法包括将一个或多个羟甲基取代的单体(例如单体D)并入RNA复合物或制备含有一个或多个羟甲基取代的单体(例如单体D)的RNA复合物。参见下表基因沉默(即，“siRNA效应”)和脱靶效应(即，“miRNA效应)的结果。这些数据指示，含有一个或多个羟甲基取代的单体(例如，单体D)的RNA复合物减少靶的表达同时使脱靶效应最小。

对于进一步的种子步移研究，我们已经制备了包括RNA单体(rA、rC、rG和rU)和羟甲基修饰的单体(单体D；对腺嘌呤-9-基、胞嘧啶-1-基、鸟嘌呤-9-基和尿嘧啶-1-基衍生物分别标为sA、sC、sG和sU)的如下序列。单体X代表具有核碱基的单体D：

以下显示的前九个寡核苷酸的编号如下(从上端的第1号-第9号)：

通过使用此前实施例中描述的类似实验技术，以寡聚体W313；W314；W315；W316；W317；W123；W318；W319和W320作为基因沉默实验中的反义链和寡聚体JW1104作为有义链显示，含有羟甲基取代的单体D的siRNA构建体的效力相对于未修饰的siRNA或在从反义链5'-末端第2号位置中具有2'-O-Me-RNA单体的市售化学修饰的siRNA产品(Dharma)可被改善。进一步，含有2',3'-开环-RNA单体D的siRNA复合物显示该单体可并入siRNA构建体以使脱靶效应(miRNA效应)相对于参照未修饰的siRNA(SiRNA)减少。

1nM、10nM和100nMRNA复合物的结果描述于以下表格形式(对照；数据调整到1.0)。在所示的不同siRNA双链体的各种浓度，研究经siRNA和miRNA(微RNA)效应的基因沉默。对类似以上显示的专门地含有RNA和无环的2',3'-开环-RNA单体的九条链的链，预计类似结果。

羟甲基修饰的单体D作为反义链修饰减少脱靶效应并增加基因沉默的效力。

该设计是重要的，并且上述系列寡聚体中对siRNA效应最有效的是W318，其在从反义链5'-末端第7号位置处具有羟甲基取代的单体D。相对于未修饰的siRNA或商业产品(Dharma)，W318还导致有利地低的脱靶(miRNA)效应。一般而言，具有并入的羟甲基取代的单体D的以上列出的反义链的使用导致有利地低的脱靶(miRNA)效应。重要和令人惊讶地，使用具有含有羟甲基取代的单体D的反义链的构建体可同时实现高效力和低脱靶效应(参见上表)。尤其是W318的设计是有利的，其显示羟甲基取代的单体D可有利地并入反义链所谓种子区边界(boarder)附近，最有利地从反义链5'-末端第5-10号位置附近，如例如从反义链5'-末端第7号位置。另外，一个或多个羟甲基取代的单体D的并入可在两条链中实现。

此外可注意到，效应可被逆转，如果单体X位于反义链位置9-16附近，其中该位置从5'末端计数。如果例如反义链中单体X存在于从反义链5'-末端的第9号位置中，那么反义链和双链体作为微RNA起作用(siRNA效应将最小，而微RNA效应更高)。该效应可能来自于因存在无环的羟甲基取代的单体X(＝单体D)导致亲和力减少而向全长结合的趋势的减少。

实施例11.亚磷酰胺单体结构单元的合成

以下路线展示已经进行的程序以举例说明单体amidite(＝亚磷酰胺)结构单元的合成：

*获得开环G和开环C的开环步骤在DMT保护后不经纯化即进行，因此所写的产率是这两步骤的总产率。

化合物100是核糖核苷起始物料。化合物102是由氧化裂解反应随后还原制备的二醇。化合物103是通过化合物102的O2'-羟基基团的选择性苯甲酰化制备的O2'-苯甲酰化衍生物。化合物104是通过化合物103的O3'-羟基基团的O3'-磷酸化制备的amidite(＝亚磷酰胺)。包括以下的详细程序和表征数据作为示例程序。

5'-O-(4,4'-二甲氧基三苯甲基)-2',3'-开环尿苷(102-U)

将核苷100-U(5'-O-(4,4'-二甲氧基三苯甲基)尿苷；10.35g,18.94mmol)溶解在二噁烷(250mL)和水(50mL)中。将NaIO₄(4.47g,20.90mmol)溶解在水(50mL)中并加入到溶解的核苷。搅拌混合物1h，在此期间形成白色沉淀。加入另外的二噁烷(200mL)并搅拌悬浮液15min，然后经玻璃滤器过滤悬浮液，并以二噁烷(100mL)洗涤滤饼。合并滤液，加入NaBH₄(797mg,21.1mmol)并搅拌反应混合物30min。以缓冲液(吡啶：AcOH1:1,v/v,～10mL)中和反应混合物。蒸发混合物到大约150mL后加入CH₂Cl₂(100mL)，并以饱和NaHCO₃水溶液(2×100mL)洗涤混合物。分离有机相，以Na₂SO₄干燥，蒸发至干燥，并由柱色谱法(石油醚中40％丙酮)纯化所得的残余物，溶剂蒸发后获得期望的核苷102-U，为白色泡沫。

产量:8.53g(82％).

R_f:0.2(CH₂Cl₂中10％MeOH).

¹HNMR(DMSO-d₆):δ11.34(brs,NH),7.62(d,1H,J＝8.05Hz,H6),7.45-7.15(m,9H,ar),6.85(d,4H,ar),5.80(t,1H,J＝6.2Hz,H1'),5.52(d,1H,J＝8.05Hz,H5),5.12(t,1H,J＝5.86Hz,2'OH),4.74(t,1H,J＝5.49Hz,3'OH),3.72(s,6H,OCH₃),3.55-3.47(m,3H,H2'/H4'),3.40(t,2H,J＝5.13Hz,H3'),3.01-2.90(m,2H,H5').

¹³CNMR(DMSO-d₆):δ163.2,157.9,151.4,144.8,141.1(C5),135.4,129.5(ar),127.7,127.5(ar),126.5(ar),113.0,101.6(C6),85.3,83.6(C1'),79.3(C2'/C4'),63.5(C5'),61.1,60.5(C2'/C4'),54.9(-OCH₃).

ESI-HiRes(mNa⁺):m/z:571.1743计算值:571.2051.

2'-O-苯甲酰基-5'-O-(4,4'-二甲氧基三苯甲基)-2',3'-开环尿苷(103-U)

将核苷102-U(3.01g,5.50mmol)与无水甲苯(15mL)共蒸发。将所得的残余物溶解在无水DCM(150mL)以及无水吡啶(Pyr.)(4.4mL)，并将混合物冷却到-70℃。向反应混合物缓慢加入苯甲酰氯(700μL,6mmol)，且在-70℃搅拌1h。将EtOH(5mL)加入到溶液并随后允许达到室温。以饱和NaHCO₃水溶液(3×100mL)和盐水(100mL)洗涤反应混合物。以CH₂Cl₂(100mL)反萃取合并的水相。合并有机相并蒸发。由柱色谱法(DCM中3.5％MeOH)纯化所得的残余物，溶剂蒸发后获得产物103-U为白色泡沫。

产量:3.44g(79％).

R_f:0.3(CH₂Cl₂中5％MeOH).

¹HNMR(DMSO-d₆):δ11.43(s,1H,NH,ex),7.93-7.87(m,2H,ar),7.80(d,1H,J＝8.05Hz,H6),7.70-7.63(m,1H),7.56-7.48(m,2H,ar),7.35-7.17(m,10H,ar),6.89-6.81(m,4H,ar),6.20(t,1H,J＝5.49Hz,H1'),5.56(d,1H,J＝8.05Hz,H5),4.83(t,1H,OH-3',ex),4.58(dq,2H,H2'),3.73(s,7H,-OCH₃),3.70-3.62(m,1H,H4'),3.45(t,2H,H3'),3.11-2.96(m,2H,H5').

¹³CNMR(DMSO-d₆):δ164.92,162.98,157.89,151.00,144.67,140.51,135.45,135.35,133.54,129.49,129.45,129.13,129.02,128.92,128.74,128.61,127.65,127.51,126.49,113.16,113.01,102.06,85.35,80.84,79.57,71.8,71.8,63.4,60.5,54.9,54.8.

ESI-HiRes(mNa⁺):m/z:675.1949计算值:675.2313.

2'-O-苯甲酰基-3'-O-(2-氰基乙氧基(二异丙基氨基)膦基)-5'-O-(4,4'-二甲氧基三苯甲基)-2',3'-开环尿苷(104-U)

将核苷103-U(679mg,1.04mmol)与DCE(3×6mL)共蒸发并在真空干燥12h。将残余物溶解在20％DIPEA的MeCN(6.5mL)中，并搅拌混合物。将2-氰基乙基-N,N-二异丙基氯亚磷酰胺[P(Cl)(OCH₂CH₂CN)(N(iPr)₂)：0.66mL,3.02mmol]加入反应混合物，并继续搅拌40min。将反应混合物倒入DCE(10mL)，以饱和NaHCO₃水溶液(10mL)洗涤并以DCE(10mL)反萃取水相。汇集有机相并蒸发以获得白色泡沫。由柱色谱法(甲苯中0-20％EtOAc)纯化粗产物以在溶剂蒸发后获得核苷104-U，为白色固体物质。

产量:600mg(68％).

R_f:0.6(甲苯中50％EtOAc).

³¹PNMR(MeCN):δ147.8.

ESI-HiRes(mNa⁺):m/z:875.2946计算值:875.3391.

6-N-苯甲酰基-5'-O-(4,4'-二甲氧基三苯甲基)-2',3'-开环腺苷(102-A)

将6-N-苯甲酰基-5'-O-(4,4'-二甲氧基三苯甲基)腺苷(100-A；7.02g,10.42mmol)溶解在二噁烷(150mL)和水(25mL)中。将NaIO₄(2.73g,11.77mmol)溶解在水(25mL)中并加入溶解的核苷中。搅拌混合物1h，在此期间形成白色沉淀。加入另外的二噁烷(100mL)并搅拌悬浮液15min，然后经玻璃滤器过滤悬浮液，以二噁烷(50mL)洗涤滤饼。合并滤液，加入NaBH₄(435mg,11.5mmol)，并搅拌反应混合物30min。然后加入丙酮以淬灭残留NaBH₄。以缓冲液(吡啶:AcOH1:1,v/v,～10mL)中和反应混合物。减少反应混合物到大约100mL，加入CH₂Cl₂(100mL)，并以饱和NaHCO₃水溶液(2×100mL)洗涤混合物。分离有机相，以Na₂SO₄干燥，蒸发至干燥，并且通过使用DCM和i-PrOH的柱色谱法纯化所得的残余物以在溶剂蒸发后获得产物，为白色固体物质。

产量:6.07g(86％).

R_f:0.22(DCM中5％i-PrOH).

¹HNMR(DMSO-d₆):δ11.23(brs,1H,N6H),8.76(s,1H,腺嘌呤C8/C2),8.68(s,1H,腺嘌呤C8/C2),8.07(d,2H,J＝6.96Hz,Ar),7.69-7.50(m,3H,Ar),7.25-6.91(m,9H,Ar),6.79(dd,4H,Ar),6.06(t,1H,H1'),5.29(t,1H,2'OH),4.84(t,1H,3'OH),4.19-4.02(m,2H,H2'),3.90-3.80(m,1H,H4'),3.69(s,6H,2×-OCH₃),3.49(t,2H,H3'),2.93-2.74(m,2H,H5').

¹³CNMR(DMSO-d₆):δδ165.6,157.9,152.8,151.6(腺嘌呤CH),150.2,144.6,143.1(腺嘌呤CH),135.7,135.4,132.4(Ar),129.4(Ar),128.5(Ar),128.4(Ar),127.7(Ar),127.5(Ar),126.4(Ar),125.2,113.0(Ar),85.0,84.5(1'C),79.6(4'C),63.6(5'C),61.4(2'C),60.9(3'C),54.9(-OCH₃).

6-N-苯甲酰基-2'-O-苯甲酰基-5'-O-(4,4'-二甲氧基三苯甲基)-2',3'-开环腺苷(103-A)

将核苷102-A(2.01g,2.98mmol)与无水MeCN(2×30mL)共蒸发并过夜干燥。将所得的残余物溶解在无水DCM(150mL)以及无水DBU(900mg,5.96mmol)，并且将混合物冷却到-70℃。向反应混合物缓慢加入0.5M苯甲酰氯溶液(6.56mL,3.28mmol)。在-70℃搅拌反应混合物1h，随后允许达到室温然后加入EtOH(5mL)。以饱和NaHCO₃水溶液(3×150mL)和盐水(150mL)洗涤反应混合物。以CH₂Cl₂(100mL)反萃取合并的水相。合并有机相并蒸发。由柱色谱法(石油醚中0-100％EtOAc)纯化所得的残余物，在溶剂蒸发后获得产物核苷103-A，为白色泡沫。

产量:1.69g(73％).

R_f:0.49(EtOAc).

¹HNMR(DMSO-d₆):δ11.28(s,1H,NH),8.82(s,1H,腺嘌呤CH),8.76(s,1H,腺嘌呤CH),8.06(d,2H,Ar),7.79(d,2H,Ar),7.55-7.40(m,6H,Ar),7.25-6.89(m,10,Ar),6.77(dd,4H,Ar),6.51(t,1H,H1'),4.99(m,2H,H2'),4.91(t,1H,3'OH),3.89(ap.s,1H,H4'),3.72(s,6H,2×–OCH₃),3.54(m,2H,H3'),2.81(m,2H,H5').

¹³CNMR(DMSO-d₆):δ165.0,157.9,152.4,150.5,144.6,142.9(腺嘌呤CH),135.6,133.6(Ar),132.4(Ar),129.0(Ar),128.8(Ar),128.4(Ar),127.5(Ar),125.2(Ar),113.0(Ar),85.1,81.5(C1'),79.9(C4'),63.8(C2'),63.5,54.9(-OCH₃).

ESI-HiRes(mNa⁺):m/z:802.2848计算值:802.2847.

6-N-苯甲酰基-2'-O-苯甲酰基-3'-O-(2-氰基乙氧基(二异丙基氨基)膦基)-5’- O-(4,4'-二甲氧基三苯甲基)-2',3'-开环腺苷(104-A)

将核苷103-A(1.69g,2.17mmol)与无水MeCN(2×20mL)共蒸发并在真空干燥12h。将残余物溶解在20％DIPEA的MeCN(40mL)中，且搅拌所得的混合物。加入2-氰基乙基-N,N-二异丙基氯亚磷酰胺[P(Cl)(OCH₂CH₂CN)(N(iPr)₂)；1.0mL]到反应混合物，搅拌反应混合物40min。加入另外的2-氰基乙基-N,N-二异丙基氯亚磷酰胺(0.2mL)并搅拌所得的混合物3小时。加入EtOH(5mL)，以饱和NaHCO₃水溶液(3×50mL)洗涤混合物，并以DCM(50mL)反萃取水相。汇集有机相并蒸发。由柱色谱法(石油醚中0-100％EtOAc)纯化粗产物以在溶剂蒸发后获得白色泡沫。

产量:1.52g(71％).

R_f:0.75(DCM中5％MeOH).

³¹PNMR(MeCN):δ148.9.

ESI-HiRes(mNa⁺):m/z:1002.3885计算值:1002.3926.

4-N-乙酰基-5'-O-(4,4'-二甲氧基三苯甲基)-2',3'-开环胞苷(102-C)

将4-N-乙酰基胞苷(11.75g,41.18mmol)与无水吡啶(50mL)共蒸发。将所得的残余物溶解在无水吡啶(160mL)中。将DMT-Cl(4,4’-二甲氧基三苯甲基氯；16.76g,49.42mmol)作为固体物质加入，且在室温搅拌所得的混合物2小时。以饱和NaHCO₃水溶液(3×50mL)洗涤反应混合物，并蒸发有机相以产生白色泡沫，将其干燥。将该残余物溶解在二噁烷(500mL)和水(100mL)中。将NaIO₄(10.62g,49.5mmol)溶解在水(100mL)中并加入到溶解的核苷中。搅拌混合物1h，在此期间形成白色沉淀。加入另外400mL二噁烷并继续搅拌15min。过滤沉淀并以二噁烷(200mL)洗涤。合并滤液，加入NaBH₄(1720mg,45.5mmol)，并继续搅拌30min。为了中和反应混合物，加入缓冲液(10mL,1:1-AcOH：吡啶)直到达到pH7。将反应混合物蒸发到300mL，并以EtOAc(150mL)萃取。以饱和NaHCO₃水溶液(3×200mL)洗涤有机相并蒸发。由以EtOAc中的梯度MeOH的柱色谱法纯化残余物，以便在溶剂蒸发后获得产物，为白色固体物质。

产量:17.24g(71％).

R_f:0.19(CHCl₃中5％MeOH).

¹HNMR(DMSO-d₆):δ10.94(s,1H,NH),8.08(d,1H,J＝7.32Hz,胞苷CH),7.31-7.12(m,12H,Ar/胞苷CH),6.85(d,4H,Ar),5.96(t,1H,H1'),5.13(t,1H,2'OH),4.74(t,1H,3'OH),3.73(s,6H,2×–OCH₃),3.63(m,3H,H2'/H4'),3.43(m,2,H3'),3.00(m,2H,H5'),2.13(s,3H,-CH₃).

¹³CNMR(DMSO-d₆):δ170.9,162.3,158.0,155.4,146.1(胞苷C5/C6),144.6,135.6,129.6(ar),127.7(ar),126.6(ar),113.1(ar),95.4(胞苷C5/C6),85.5,84.7(C1'),79.4(C2'/C4'),63.8(C5'),61.7(C2'/C4'),60.5(C3'),55.0(-OCH₃),24.3(-CH₃).

ESI-HiRes(mNa⁺):m/z:612.2298计算值:612.2316.

4-N-乙酰基-2'-O-苯甲酰基-5'-O-(4,4'-二甲氧基三苯甲基)-2',3'-开环胞苷 (103-C)

将核苷102-C(3.03g,5.14mmol)与无水甲苯(2×30mL)共蒸发并在真空干燥12h。将所得的残余物溶解在无水DCM(150mL)以及无水DBU(1.5mL,10.3mmol)并将所得的混合物冷却到-70℃。向反应混合物缓慢加入苯甲酰氯(6.56mL,5.65mmol)。在-70℃搅拌反应混合物1h，随后允许达到室温，然后加入EtOH(4mL)。以饱和NaHCO₃水溶液(2×150mL)洗涤反应混合物。合并有机相并蒸发。由柱色谱法(CHCl₃中0-5％MeOH)纯化所得的残余物，在溶剂蒸发后获得产物核苷103-C，为白色泡沫。

产量:2.08g(64％).

R_f:0.24(CHCl₃中5％MeOH).

¹HNMR(DMSO-d₆):δ10.97(s,1H,NH),8.25(d,1H,胞苷CH),7.91(d,2H,Ar),7.65(ap.t,1H,Ar)7.32-7.12(m,12H,Ar/胞苷CH),6.83(d,4H,Ar),6.34(t,1H,H1'),4.84(t,1H,3'OH),4.58(dq,2H,H2'),3.74(s,6H,2×–OCH₃),3.70-3.64(m,1H,H4'),3.48(m,2H,H3'),3.07(m,2H,H5'),2.14(s,3H,-CH₃).

¹³CNMR(DMSO-d₆):δ171.0,165.0,162.5,157.1,145.5(胞苷C5/C6),144.6,135.48,.133.6,129.6(Ar),128.8(Ar),127.7(Ar),127.6(Ar),126.6(Ar),113.1(Ar),95.8(胞苷C5/C6),85.6,82.0(C1'),79.6(C4'),79.263.9(C2'),63.7,60.5(C3'),54.9(-OCH₃),24.3(-CH₃).

ESI-HiRes(mNa⁺):m/z:716.2589计算值:716.2759.

4-N-乙酰基-2'-O-苯甲酰基-3'-O-(2-氰基乙氧基(二异丙基氨基)膦基)-5'-O- (4,4'-二甲氧基三苯甲基)-2',3'-开环胞苷(104-C)

将核苷103-C(1.49g,2.15mmol)与无水MeCN(2×20mL)共蒸发。将残余物溶解在MeCN中的20％DIPEA(20mL)并搅拌混合物。将2-氰基乙基-N,N-二异丙基氯亚磷酰胺[P(Cl)(OCH₂CH₂CN)(N(iPr)₂)；0.8mL]加入到混合物，并继续搅拌40min。加入另外2-氰基乙基-N,N-二异丙基氯亚磷酰胺(0.4mL)并继续搅拌3h。加入EtOH(5mL)，以饱和NaHCO₃水溶液(3×50mL)洗涤所得的混合物，并以DCM(50mL)反萃取水相。汇集有机相并蒸发。由柱色谱法(石油醚中0-100％EtOAc)纯化残余物以在溶剂蒸发后获得核苷104-C，为白色泡沫。

产量:940mg(44％).

R_f:0.42(DCM中5％MeOH).

³¹PNMR(MeCN):δ148.8.

ESI-HiRes(mNa⁺):m/z:916.3622计算值:916.3657.

5'-O-(4,4'-二甲氧基三苯甲基)-2-N-异丁酰基-2',3'-开环鸟苷(102-G)

将2-N-异丁酰基鸟苷(11.68g,17.8mmol)与无水吡啶(50mL)共蒸发。将所得的残余物溶解在无水吡啶(100mL)中。将DMT-Cl(4,4'-二甲氧基三苯甲基氯；7.26g,21.46mmol)作为固体物质加入，并在室温搅拌反应混合物1h。加入DMAP(50mg,0.40mmol)，且再搅拌所得的混合物12h。然后以饱和NaHCO₃水溶液(3×50mL)洗涤反应混合物，并蒸发有机相以产生白色泡沫。将该残余物溶解在二噁烷(250mL)和水(50mL)中。将NaIO₄(4.57g,21.3mmol)溶解在水(50mL)中并加入到溶解的核苷中。搅拌混合物1h，在此期间形成白色沉淀。加入另外200mL二噁烷并继续搅拌15min。过滤沉淀并以二噁烷(100mL)洗涤。收集滤液，加入NaBH₄(748mg,19.77mmol)，并在室温搅拌所得的混合物30min。为了中和，加入缓冲液(10mL,1:1-AcOH：吡啶)直到达到pH7。减少所得的混合物的体积到150mL，并使用EtOAc(150mL)进行萃取。以饱和NaHCO₃水溶液(3×100mL)洗涤有机相并蒸发，由使用DCM中0-10％梯度(1:1MeOH:i-PrOH)的柱色谱法纯化残余物，以在溶剂蒸发后产生产物，为白色固体物质。

产量：8.02g(68％).

R_f:0.24(CH₂Cl₂中7％MeOH).

¹³CNMR(DMSO-d₆):δ180.2,157.9,154.9,147.8,144.7,135.4,129.3(Ar),127.5(Ar),127.4(Ar),126.4(Ar),120.4,113.0(Ar),85.2,85.1(C1'),79.9(C4'),63.5(C5'),61.7(C2'),61.1(C3'),54.9(-OCH₃),34.7(季i-Pr),18.9(i-Pr),18.8(i-Pr).

MALDI-HiRes(mNa⁺):m/z:680.2679计算值:680.2691.

2'-O-苯甲酰基-5'-O-(4,4'-二甲氧基三苯甲基)-2-N-异丁酰基-2',3'-开环鸟苷(103-G)

将核苷102-G悬浮在无水甲苯(2×30mL)中并蒸发。将所得的残余物在真空干燥12h。将残余物溶解在无水DCM(100mL)以及无水DBU(0.9mL,6.1mmol)中，并将所得的混合物冷却到-70℃。缓慢加入苯甲酰氯(390μL,3.36mmol)到反应混合物。在-70℃搅拌反应混合物1h，随后允许达到室温，然后加入EtOH(4mL)。以饱和NaHCO₃水溶液(2×100mL)洗涤所得的混合物，合并有机相并蒸发。由柱色谱法(CHCl₃中0-5％MeOH)纯化所得的残余物，溶剂蒸发后获得核苷103-G，为白色泡沫。

产量:1.49g(63％).

R_f:0.47(CH₂Cl₂中7％MeOH).

¹HNMR(DMSO-d₆):δ12.10(s,1H,NH),11.72(s,1H,NH),8.32(s,1H,胍H8),7.85-7.79(m,2H,Ar),7.65-7.63(m,1H,Ar),7.51-7.45(m,2H,Ar),7.26-6.97(m,11H,Ar),6.79(m,4H,Ar),6.18(t,1H,H1'),5.04-4.82(m,3H,H2'/3'OH),3.82(m,1H,H4'),3.72(s,6H,2×–OCH₃),3.49(t,2H,H3'),3.03-2.74(m,3H,H5'/季i-Pr),1.11(ap.t,6H,2×–CH₃).

¹³CNMR(DMSO-d₆):δ180.1,164.9,157.8,154.8,148.6,147.9,144.6,138.4,135.5,135.3,133.6,129.3(Ar),129.0(ar),128.8(ar),128.7(ar),127.6(ar),127.4(ar),126.3(ar),120.6,112.9(ar),85.1,82.0(C1’),80.1(C4'),63.7,63.3(C5'),61.0(C3'),54.8(-OCH₃),34.6(季i-Pr),18.8(-CH₃),18.6(-CH₃).

ESI-HiRes(mNa⁺):m/z:784.2943计算值:784.2953.

2'-O-苯甲酰基-3'-O-(2-氰基乙氧基(二异丙基氨基)膦基)-5'-O-(4,4'-二甲氧基三苯甲基)-2-N-异丁酰基-2',3'-开环鸟苷(104-G)

将核苷103-G(1.45g,1.9mmol)与无水MeCN(2×20mL)共蒸发。将残余物溶解在MeCN中的20％DIPEA(20mL)并搅拌所得的混合物。将2-氰基乙基-N,N-二异丙基氯亚磷酰胺[P(Cl)(OCH₂CH₂CN)(N(iPr)₂)；0.65mL]加入反应混合物并继续搅拌40min。加入EtOH(5mL)并以饱和NaHCO₃水溶液(3×50mL)洗涤所得的混合物，以DCM(50mL)反萃取水相。汇集有机相并蒸发。从石油醚(从EtOAc中的溶液)沉淀残余物以提供amidite104-G，干燥后为白色固体物质。

产量:607mg(33％).

R_f:0.3(1:3丙酮:甲苯).

³¹PNMR(MeCN):δ148.6.

ESI-HiRes(mNa⁺):m/z:984.4028计算值:984.4031.

实施例12.哌嗪基-官能化的单体结构单元的合成

该实施例描述已经进行的程序以举例说明具有连接在单体C2'-位置的氨基官能度的单体amidite结构单元的合成，即从核苷103-U开始经化合物、105、106、107、108、109和110的C2'-哌嗪基-官能化单体结构单元111(AmiditeJ；碱基＝尿嘧啶)的合成。

2'-O-苯甲酰基-3'-O-叔丁基二甲基(methel)甲硅烷基-5'-O-(4,4'-二甲氧基三苯甲基)-2',3'-开环尿苷(105)

将核苷103-U(328mg,0.50mmol)溶解在无水吡啶(2mL)并在室温搅拌。将TBDMSCl(113mg,0.75mmol)加入反应混合物，搅拌19h。然后加入水(1mL)并再继续搅拌15min，然后以DCM(50mL)稀释反应混合物，并以饱和NaHCO₃水溶液(2×25mL)和盐水(25mL)洗涤。将有机相在Na₂SO₄上干燥，过滤并在减压下蒸发至干燥。由硅胶柱色谱法纯化残余物，使用DCM中的MeOH(0-8％)为洗脱剂，从而获得核苷105，为白色固体物质。产量294mg(78％).¹HNMR(300MHz,DMSO-d₆)δ11.46(s,1H,NH),7.95-7.79(m,3H),7.71-7.63(m,1H),7.57-7.48(m,2H),7.37-7.13(m,9H),6.84(d,J＝8.8Hz,4H),6.22(t,J＝5.7Hz,1H,H1'),5.58(d,J＝8.0Hz,1H,H5),4.69-4.45(m,2H,H2'),3.80-3.64(m,8H,2×Ome和H4'),3.54(t,J＝4.7Hz,1H,H3'),3.09-2.97(m,2H,H5'),0.73(s,9H,3×Me),-0,07和-0,09(2×s,6H,2×Me).¹³CNMR(75.5MHz,DMSO-d₆):δ165.0,163.1,158.0,151.1,144.7,140.6,135.5,135.4,133.7,129.6,129.1,129.0,128.8,127.8,127.6,126.6,113.1,102.3,85.5,81.1,79.2,63.4,63.1,62.1,55.0,25.6,17.7,2×-5.7.ESI-HRMS:m/z789.3147([M+Na]⁺,C₄₃H₅₀N₂O₉Si·Na计算值789.3178)。

3'-O-叔丁基二甲基(methel)甲硅烷基-5'-O-(4,4'-二甲氧基三苯甲基)-2',3'- 开环尿苷(106)

将NaOH(845mg,21.1mmol)与无水MeOH(200mL)混合，并将所得的混合物冷却到0℃。将核苷105(3.10g,4.05mmol)溶解在无水MeOH(40mL)中，将所得的混合物加入到上述混合物，并搅拌所得的反应混合物2.5h。加入饱和NH₄Cl水溶液(10mL)并再继续搅拌10min，然后加入水(100mL)，并使用DCM(4×200mL)进行萃取。将有机相在减压下蒸发至干燥，然后将残余物与无水吡啶(10mL)共蒸发。由硅胶柱色谱法纯化残余物，使用DCM中的MeOH(5-10％)为洗脱剂，从而获得核苷106，为白色固体物质。产量2.54g(95％).¹HNMR(300MHz,DMSO-d₆):δ11.35(s,1H,NH),7.66(d,J＝7.6Hz,1H,H6),7.33-7.14(m,9H),6.88-6.82(m,4H),5.82(t,J＝6.0Hz,1H,H1'),5.53(d,J＝8Hz,1H,H5),5.11(t,J＝5.8Hz,1H,2'-OH),3.73(s,6H,2×OMe),3.69-3.45(m,5H,H2',H4'和H3'),3.01-2.93(m,2H,H5'),0.76(s,9H,3×Me),-0.03和-0.05(2×s,6H,2×Me).¹³CNMR(75.5MHz,DMSO-d₆):δ163.2,158.0,151.6,144.8,135.6,135.4,129.6,127.7,127.6,126.6,113.1,101.8,85.4,83.5,78.5,63.3,61.8,61.0,55.0,25.6,17.7,2×-5.6.ESI-HRMS:m/z685.2885([M+Na]⁺,C₃₆H₄₆N₂O₈Si·Na计算值685.2916)。

3'-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-5'-O-(4,4'-二甲氧基三苯甲基)-2'-O-甲烷磺酰基-2',3'-开环尿苷(107)

将核苷106(927mg,1.40mmol)溶解在无水吡啶(20mL)中，并在0℃搅拌所得的混合物。逐滴加入MsCl(220μL,2.83mmol)，并在室温搅拌所得的混合物3h。加入EtOH(2mL)并再继续搅拌10min。然后将混合物蒸发至干燥，并由硅胶柱色谱法纯化残余物，使用DCM中的MeOH(0-7％)为洗脱剂，从而获得核苷107，为白色泡沫。产量834mg(81％).¹HNMR(300MHz,DMSO-d₆):δ11.49(s,1H,NH),7.77(d,J＝8.2Hz,1H,H6),7.35-7.14(m,9H),6.86(d,J＝8.5Hz,4H),6.11(t,J＝5.7Hz,1H,H1'),5.60(d,J＝8.1Hz,1H,H5),4.49(d,J＝5.5Hz,2H,H2'),3.77-3.48(m,9H,2×OMe,H4'和H3'),3.22(s,3H,Me),3.10-2.89(m,2H,H5'),0.77(s,9H,3×Me),-0.02和-0.04(2×s,6H,2×Me).¹³CNMR(75.5MHz,DMSO-d₆):δ163.1,158.0,151.7,144.7,140.5,135.5,135.3,129.6,127.8,127.6,126.6,113,1,102.4,85.5,80.6,79.1,67.8,63.1,61.8,55.0,36.8,25.6,17.7,-5.6,-5.7.ESI-HRMS:m/z763.2662([M+Na]⁺,C₃₇H₄₈N₂O₁₀SSi·Na计算值763.2692)。

3'-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-2'-脱氧-5'-O-(4,4'-二甲氧基三苯甲基)-2'-哌嗪基-2',3'-开环尿苷(108)

将核苷107(276mg,0.373mmol)溶解在无水吡啶(3mL)中，并在室温搅拌下加入哌嗪(3.21g,37.3mmol)。然后将反应混合物加热到150℃并搅拌1h，随后冷却到室温。以饱和NaHCO₃水溶液(200mL)稀释反应混合物，然后使用氯仿(7×100mL)进行萃取。有机相在Na₂SO₄上干燥、过滤并蒸发至干燥。由硅胶柱色谱法纯化残余物，首先使用DCM中的MeOH(0-5％)，然后是DCM中半饱和甲醇氨(5％)为洗脱剂体系，从而获得核苷108，为白色固体物质。产量182mg(67％).¹HNMR(300MHz,DMSO-d₆):δ7.64(d,J＝8.1Hz,1H,H6),7.34-7.13(m,9H),6.85(d,J＝7.8Hz,4H),5.98(t,J＝6.0Hz,1H,H1'),5.53(d,J＝8.1Hz,1H,H5),3.72(s,6H,2×OMe),3.68-3.51(m,3H,H4'和H3'),3.04-2.90(m,2H,H5'),2.77-2.54(m,6H,H2',哌嗪基),2.48-2.27(m,4H,哌嗪基),0.77,(s,9H,3×Me),-0.02和-0.04(2×s,6H,2×Me).¹³CNMR(75.5MHz,DMSO-d₆):δ163.2,158.0,151,3,144.8,141.1(C6),135.6,135.4,129.5,127.7,127.6,126.6,113.1,113.1,101.8(C5),85.4,81.3(C1'),78.3,63.1,62.1,60.1,55.0(OMe),55.0(OMe),53.8,45.3,25.7(Me),17.8,-5.5(Me),-5.6(Me).ESI-HRMS:m/z731.3859([M+H]⁺,C₄₀H₅₄N₄O₇Si·H计算值731.3834)。

3'-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-2'-脱氧-5'-O-(4,4'-二甲氧基三苯甲基)-2'-(4- N-三氟乙酰基)哌嗪基-2',3'-开环尿苷(109)

将核苷108(102mg,0.14mmol)溶解在无水MeOH(2mL)中，并在室温搅拌所得的混合物。加入DMAP(10mg,0.08mmol)和三氟醋酸乙酯(22μL,0.184mmol)并继续搅拌16h。然后将混合物在减压下蒸发至干燥，并由硅胶柱色谱法纯化残余物，使用DCM中的MeOH(0-2％)为洗脱剂，从而获得核苷109，为白色固体物质。产量100mg(86％).¹HNMR(300MHz,DMSO-d₆):δ11.37(s,1H,NH),7.66(d,J＝7.8Hz,1H,H6),7.38-7.12(m,9H),6.93-6.80(m,4H),6.00(t,J＝5.9Hz,1H,H1’),5.54(d,J＝7.8Hz,1H,H5),3.73(s,6H,2×OMe),3.70-3.40(m,7H,H3',H4'和哌嗪基),3.08-2.92(m,2H,H5'),2.90-2.52(m,6H,H2'和哌嗪基),0.77(s,9H,3×Me),0.00和-0.04(2×s,6H,2×Me).¹³CNMR(75.5MHz,DMSO-d₆):δ163.2,158.0,151.3,144.8,140.8,135.6,135.4,129.5,127.7,127.6,126.6,113.1,102.0,85.5,81.0,78.2,63.1,62.0,58.9,55.0,52.6,52.0,45.4,43.0,25.6,17.8,-5.6,-5.6.ESI-HRMS:m/z849.3452([M+Na]⁺,C₄₂H₅₃F₃N₄O₈Si·Na计算值849.3477)。

2'-脱氧-5'-O-(4,4'-二甲氧基三苯甲基)-2'-(N-三氟乙酰基)哌嗪基-2',3'-开环尿苷(110)

将核苷109(251mg,0.304mmol)与无水THF(2×5mL)共蒸发，然后溶解在无水THF(10mL)中。在室温搅拌下，经1h向该混合物逐滴加入THF中的1MTBAF(606μL,0.606mmol)，然后在室温继续搅拌21h。在减压下将反应混合物蒸发至干燥，然后将残余物溶解在EtOAc(40mL)中。以饱和NaHCO₃水溶液(3×10mL)和水(3×10mL)洗涤所得的混合物，将分离的有机相在Na₂SO₄上干燥，过滤并在减压下蒸发至干燥。由硅胶柱色谱法纯化残余物，使用石油醚中的EtOAc(60-100％)为洗脱剂，从而获得核苷110，为白色固体物质。产量111mg(51％).¹HNMR(300MHz,DMSO-d₆):δ11.36(s,1H,NH),7.66(d,J＝8.1Hz,1H,H6),7.34-7.27(m,4H),7.24-7.14(m,5H),6.92-6.82(m,4H),5.98(t,J＝6.1Hz,1H,H1’),5.53(d,J＝7.3Hz,1H,H5),4.80(t,J＝5.3Hz,1H,3'-OH),3.73(s,6H,2×OMe),3.63-3.38(m,8H,H4',H3'和哌嗪基),3.07-2.89(m,2H,H5’),2.77(t,J＝5.8Hz,2H,H2’),2.66-2.54(m,3H,哌嗪基).¹³CNMR(75.5MHz,DMSO-d₆):δ163.2,158.0,151.2,144.8,140.9,135.6,135.5,129.6,129.6,127.8,127.6,126.6,113.1,101.9,85.4,81.3,79.2,63.5,60.7,59.1,55.0,52.7,52.1,45.4,42.9.ESI-HRMS:m/z735.2585([M+Na]⁺,C₃₆H₃₉F₃N₄O₈·Na计算值735.2612)。

3'-(2-氰基乙氧基(二异丙基氨基)膦基)-2'-脱氧-5'-O-(4,4'-二甲氧基三苯甲基)-2'-(N-三氟乙酰基)哌嗪基-2',3'-开环尿苷(111)

将核苷110(91mg,0.128mmol)与无水DCM(2×5mL)共蒸发，然后溶解在无水DCM(2.5mL)中。在室温搅拌下向该混合物加入DIPEA(111μL,0.64mol)，然后逐滴加入2-氰基乙基N,N-二异丙基氯代亚磷酰胺(2-cyanoethylN,N-diisopropylphosphoramidochloridite)(57μL,0.256mmol)。在室温搅拌继续1h，然后加入EtOH(0.5mL)随后再搅拌10min。加入DCM(40mL)随后以饱和NaHCO₃水溶液(20mL)洗涤。将分离的有机相在Na₂SO₄上干燥，过滤并在减压下蒸发至干燥。由硅胶柱色谱法纯化残余物，使用石油醚中的EtOAc(60-80％)为洗脱剂，从而获得amidite111，为白色固体物质。产量106mg(91％).³¹PNMR(CDCl₃)δ150.0和149.5.ESI-HRMS:m/z913.3841([M+H]⁺,C₄₅H₅₆F₃N₆O₉P·H计算值913.3871)。

实施例13.含有哌嗪基-官能化单体结构单元的寡核苷酸的合成。

通过使用实施例1所述的方法，使用RNAamidite和amidite111实现在哌嗪基部分中具有自由末端NH的单体J的有效并入。该amidite的偶合产率高于95％。

Claims

1.一种寡核苷酸，其包含一个或多个2'-3'-开环-核苷酸单体，其中所述寡核苷酸是具有第一寡核苷酸链和第二寡核苷酸链的RNA双链体，并且其中所述2'-3'-开环-核苷酸单体是：

2.根据权利要求1所述的寡核苷酸，其中所述RNA双链体的一条寡核苷酸链为不连续的过客链。

3.根据权利要求1或2所述的寡核苷酸，其中，所述RNA双链体的每条寡核苷酸链包含15至40个核苷酸单体。

4.根据权利要求1或2所述的寡核苷酸，其中，所述RNA双链体的每条寡核苷酸链包含1至5个无环的核苷酸单体。

5.根据权利要求1或2所述的寡核苷酸，其还包含选自2'-O-烷基-RNA单体、2'-氨基-DNA单体、2'-氟-DNA单体、LNA单体、PNA单体、HNA单体、ANA单体、FANA单体、CeNA单体、ENA单体、DNA单体和INA单体组成的组中的核苷酸类似物。

6.根据权利要求1或2所述的寡核苷酸，其包含硫代磷酸酯键或硼代磷酸酯键。

7.根据权利要求1或2所述的寡核苷酸，其中所述RNA双链体能够介导与所述寡核苷酸互补的靶mRNA的RISC依赖性翻译阻遏或降解。

8.根据权利要求1或2所述的寡核苷酸，其包含14至26个碱基对。

9.根据权利要求1或2所述的寡核苷酸，其中所述RNA双链体包含至少一个悬端。

10.根据权利要求1或2所述的寡核苷酸，其中所述RNA双链体包含至少一个悬端，其中所述悬端的长度是1至14个核苷酸。

11.根据权利要求1或2所述的寡核苷酸，其中所述RNA双链体包含至少一个3'-悬端。

12.根据权利要求1或2所述的寡核苷酸，其中所述RNA双链体包含至少一个3'-悬端，其中所述至少一个3'-悬端的长度是1至14个核苷酸。

13.根据权利要求1或2所述的寡核苷酸，其中所述RNA双链体包含至少一个平端。

14.根据权利要求1或2所述的寡核苷酸，其包含与靶mRNA互补的核苷酸序列，其中所述寡核苷酸减少了所述靶mRNA的表达。

15.根据权利要求1或2所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸与具有天然RNA单体而不是无环单体的相同寡核苷酸相比具有减少的脱靶效应。

16.根据权利要求1或2所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸与具有天然RNA单体而不是无环单体的相同寡核苷酸相比具有增加的或延长的效力。

17.根据权利要求1或2所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸与具有天然RNA单体而不是无环单体的相同寡核苷酸相比具有改善的稳定性。

18.根据权利要求1或2所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸与具有天然RNA单体而不是无环单体的相同寡核苷酸相比具有减少的免疫刺激。

19.一种药物组合物，其包含至少一个权利要求1或2所述的寡核苷酸和药学上可接受的稀释剂、载体或辅助剂。