JP2010528041A - ヒドロキシメチル置換rnaオリゴヌクレオチドおよびrna複合体 - Google Patents
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Abstract
Description
siRNA二本鎖または一本鎖RNAの形態のRNA複合体は、細胞における標的核酸の様々な改変を媒介することができる。この工程では、複合体のアンチセンス鎖は、アンチセンス鎖への配列相補性の拡張を有する標的核酸にハイブリダイズすることができるため、ガイドとして作用する。
本発明の好ましい一実施形態においては、1個または複数個のヒドロキシメチル改変ヌクレオチドモノマーを含むRNA複合体は、一本鎖アンチセンス分子として作用することによって遺伝子発現を阻害することができる一本鎖RNA構築物である。
一実施形態においては、本発明のsiRNA複合体のアンチセンス鎖およびパッセンジャー鎖の両方は、1個または複数個のヒドロキシメチル改変ヌクレオチドモノマーを含有する。
さらに別の好ましい実施形態においては、RNA複合体は、アンチセンス鎖の5’末端から位置番号3〜8の1つに取り込まれる、本発明の1個のヒドロキシメチル置換モノマーを有する。
本発明の別の態様は、中核二本鎖領域を含むRNA複合体が形成される条件下で、アンチセンス鎖をパッセンジャー鎖とともに培養することを含む、本発明の二本鎖RNA複合体を調製する方法であって、このRNA複合体は、対応する細胞RNAのRNA干渉を媒介することが可能である。
本発明のさらに別の態様は、以下のステップを含む、細胞または生物における標的核酸の核酸改変を媒介する方法である。
a.標的核酸の改変を生じることができる条件下で、細胞または生物を本発明のRNA複合体に接触させるステップ、
b.それにより、標的核酸の改変を媒介するステップ。
本発明の別の態様は、以下のステップを含む、細胞または生物における遺伝子の機能を検査する方法である。
a.この遺伝子に対応する本発明のRNA複合体を細胞または生物に導入することによって、被検細胞または被検生物を産生するステップ、
b.標的核酸の改変を生じることができる条件下で、被検細胞または被検生物を維持するステップ、
c.ステップbにおいて産生された被検細胞または被検生物の表現型を観察し、任意で、観察した表現型を適切な対照細胞または対照生物の表現型と比較することによって、遺伝子の機能に関する情報を提供するステップ。
本発明の別の態様は、以下のステップを含む、薬剤が遺伝子産物に作用するかを評価する方法である。
a.この遺伝子に対応する本発明のRNA複合体を細胞または生物に導入することによって、被検細胞または被検生物を産生するステップ、
b.標的核酸の改変を生じる条件下で、被検細胞または被検生物を維持するステップ、
c.この薬剤を被検細胞または被検生物に導入するステップ、
d.ステップcにおいて産生された被検細胞または生物の表現型を観察し、任意で、観察した表現型を適切な対照細胞または対照生物の表現型と比較することによって、この薬剤が遺伝子産物に作用するかどうかに関する情報を提供するステップ。
本発明のさらに別の態様は、RNA複合体および医薬的に許容可能な希釈剤、担体、またはアジュバントである。本発明のRNA複合体が特定の遺伝子または遺伝子産物を標的とするように設計することができることは、当業者にとって明らかである。RNA複合体は、タンパク質ではなく、DNA配列またはRNA配列を標的とすることが理解されよう。しかしながら、タンパク質等の遺伝子産物のレベルは、そのmRNAまたは非コードRNAが、例えば、RNA分解または翻訳阻害によって改変される場合、間接的に影響を受ける場合がある。また、タンパク質をコードする遺伝子の発現は、例えば、DNAメチル化のために影響を受ける場合がある。
したがって、別の態様は、薬物としての使用のための本発明のRNA複合体である。RNA複合体の特異性は、アンチセンス鎖の配列内のみにあるため、治療標的が確認されると、当業者は、標的のレベルおよび活性に影響を与えるRNA複合体を設計することができる。連続的パッセンジャー鎖を有する天然型RNA複合体に対しては、ガイド配列として作用するパッセンジャー鎖のため、オフターゲット効果に関連する問題が残る。
本発明の態様は、本発明のヒドロキシメチル置換モノマーの取り込みに適切なモノマー、および容易に入手可能な出発物質からのそれらの調製のための方法である。本発明のヒドロキシメチル置換モノマーのチミン−1−イル誘導体は、DNA鎖へ取り込まれ、自動DNA/RNA合成に対するそれらのホスホラミダイト基本要素の調製のための手順が報告されている[K.D.Nielsenら,Bioorg.Med.Chem.1995,3,1493;H.Thraneら,Tetrahedron 1995,51,10389;P.Nielsenら,Bioorg.Med.Chem.1995,3,19]。
本発明の第9の態様は、非環式ヌクレオチドモノマーを含むオリゴヌクレオチドである。詳細な説明および実施例のセクションから明らかであるように、そのようなオリゴヌクレオチドは、様々な用途および利点を有する。
本発明の第10の態様は、本発明による第1のオリゴヌクレオチド、および第2のオリゴヌクレオチドを含むRNA二本鎖である。
参考文献
(実施例1)
本発明のRNA複合体の合成
本発明のRNA複合体のヒドロキシメチル置換モノマーの自動DNA/RNA合成のためのホスホラミダイト基本要素の調製のための手順が報告されている[チミン誘導体;K.D.Nielsenら,Bioorg.Med.Chem.1995,3,1493;H.Thraneら,Tetrahedron 1995,51,10389;P.Nielsenら,Bioorg.Med.Chem.1995,3,19]。アデニン、グアニン、シトシン、およびウラシルの例となるホスホラミダイト誘導体の調製のための手順の開示に関しては、実施例11を参照されたい。
−上付き文字の「MeL」は、残基が5−メチルシトシン塩基を有するLNAヌクレオチドであることを示す。
−太字、下線付きのTは、ヒドロキシメチル置換ヌクレオチドモノマーである。本実施例においては、それは、C4’−分枝RNAモノマーCのチミン−1−イル誘導体である(図1参照)。
−太字、下線付きのCは、ヒドロキシメチル置換ヌクレオチドモノマーである。本実施例においては、それは、C4’−分枝RNAモノマーCの5−メチルシトシン(5−methylcytosin)−1−イル誘導体である(図1参照)。
−太字、下線付きのXは、ヒドロキシメチル置換非環式ヌクレオチドモノマーである。上記の配列においては、それは、2’,3’−セコ−RNAモノマーDのウラシル−1−イル誘導体である(図1参照)。他の実施例および図においては、ウラシル以外の他の塩基改変体が含まれる。
本発明のsiRNA複合体のためのアニーリングおよびトランスフェクションの手順
細胞は、6ウェルプレートにプレーティングさせ(plated)、40〜60%コンフルエンスになるまで増殖させた。トランスフェクションの直前に、細胞は、1ウェルあたり1mLの完全増殖培地を再度プレーティングさせた。センスおよびアンチセンス鎖は、各20μMの濃度でアニーリング緩衝液(10mM Tris−HCl、pH7.3、50mM NaCl)に混合し、95℃で1分間、および37℃で1時間インキュベートした。6−ウェルプレートの1ウェルあたり、次の溶液を調製した:150μLの無血清RPMI培地中の4μLのTransIT−TKO。アニールされたsiRNA複合体を添加し、注意して混合し、室温で20分間インキュベートし、細胞上に注入した。最終RNA複合体濃度は、50nMであった。37℃で24時間のインキュベーション後、培地を交換し、細胞を37℃でさらに24時間インキュベートした。細胞をトリプシン処理で除去し、次のRNAおよびフロー分析のために半分に分割した。
遺伝子サイレンシング
mRNAおよびタンパク質定量化のための手順。eGFPタンパク質の発現を、フローサイトメトリー分析によって分析した。ウエスタンブロット法を以下のように行った。細胞を、PBSで2回洗浄し、同量の細胞を90℃で10分間を2回、2×SDS試料緩衝液[4%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、20%グリセロール、125mM Tris/HCl、pH6.8、0.01mg/mLのブロモフェノールブルー、10%2−メルカプトエタノール]中で溶解し(lysed)、ゆっくりとしたピペット操作によって分離した。タンパク質を、8%SDS−アクリルアミドゲル中で分離し、PVDF膜(Immobilon)上で一晩エレクトロブロットした。フィルタは、10%w/vのミルクを含有するPBSで1時間ブロックした。EGFPタンパク質は、ウサギポリクローナルEGFP抗体(Santa Cruz Biotechnology)の1:1000希釈を使用して検出された。マウスhnRNP C1抗体は、Seraphin Pinol−Romaから寄贈された。西洋ワサビペルオキシダーゼ(hrp)結合した二次抗体(DAKO)を、可視化のためのECL試薬(Amersham Biosciences)と共に使用した。eGFPmRNAを、標準手順に従い、ノーザンブロット法によって分析した。
免疫刺激
ヒドロキシメチル置換モノマーを含有する本発明のRNA複合体は、対応する未改変RNA複合体に対して化学的改変がなされるため、対応する未改変RNA複合体より低い免疫刺激活性を示す。
オフターゲット効果
ヒドロキシメチル置換モノマーを含有する本発明のRNA複合体は、アンチセンス鎖改変siRNA複合体が不活性であるように、調節することができるため、オフターゲット効果がより低い遺伝子サイレンシングの構築が、本発明により可能になる。要所は、センス鎖がアンチセンス鎖として機能できないように、センス鎖をヒドロキシメチル置換モノマーで改変することである。これは、例えば、ヒドロキシメチル置換モノマーをセンス鎖の5’末端に対して取り込むことによって達成することができる。
官能化したおよび結合したヒドロキシメチルモノマーを含有する本発明のRNA複合体の合成
本発明のヒドロキシメチル置換モノマーのヒドロキシメチル置換基は、共役基によって官能化される。共役基は、本明細書において、本発明のRNA複合体の化学的、生物物理学的、または生物学的特性を調節、拡大、または改善する基として定義される。そのような基は、細胞分布、臓器分布、組織分布、融解温度、標的親和性、生物学的安定性、ハイブリダイゼーションのシグナル伝達等を調節するために有用であり得る。
官能化および結合ヒドロキシメチルモノマーを含有する本発明のRNA複合体による遺伝子サイレンシング
遺伝子サイレンシングは、官能化および結合ヒドロキシメチルモノマー(例えば、図2または実施例6参照)を含有する本発明のRNA複合体により効率的である。
である場合、効率的な遺伝子サイレンシングと共に達成される。これは、人体における循環時間の改善、すなわち、腎臓を介するクリアランスの低減をもたらす。
ヒドロキシメチル置換RNA複合体の生物学的安定性
安定性試験のための実験手順 ヒドロキシメチル置換RNA複合体は、D−MEM(Gibco)で希釈した10%ウシ胎仔血清(Gibco)において37℃でインキュベートした。5μLのサンプルを指示された時点で収集し、ドライアイス上で、直ちに15μLの1.33×TBE/10%グリセロール充填緩衝液中に凍結させ、15%ゲル上で非変性PAGEを行った。RNAは、SYBRゴールド(Invitrogen)で可視化した。
遺伝子サイレンシングに対する構造Dのモノマーの強力な能力を証明する一連の遺伝子サイレンシング実験
前の実験に記載される手順を使用して、遺伝子サイレンシング研究を、より初期に記載の配列のsiRNA二本鎖、およびさらなる配列のsiRNA二本鎖を使用して行った(本実施例の研究に含まれる配列に関しては、図4〜9を参照)。これらの実験は、モノマーX(モノマーXの記載に関しては、実施例1を参照)の1個または複数個の取り込みを含有する配列を含んだ。モノマーXは、本明細書において、構造の例としてのみ使用され、例えば、モノマーE、モノマーF、モノマーG、モノマーI、およびモノマーJ(図1および図2参照)のような誘導体に対して、同様の結果が予測される。上付き文字のLが付いた、太字、下線付きのモノマーは、LNAモノマーである。本実施例においては、図4〜9は、CL=CMeL=5−メチルシトシン(5−methylcytosin)−1−イルLNAモノマーを含んでいる。
−遺伝子サイレンシング官能基を示すヒドロキシメチル置換およびLNAモノマーの両方を含有する鎖から成るsiRNA二本鎖を設計することは可能である。
−遺伝子サイレンシング官能基を示す、センス鎖におけるミスマッチモノマーXを有する鎖から成るsiRNA二本鎖を設計することは可能である。
−完全RNAアンチセンス鎖(3’末端に対する2個のLNAモノマーを除く)は、耐容性良好である。
−単一Xモノマーは、アンチセンス鎖において耐容性良好である(W123、W125、またはW126)。
−いくつかのXモノマーは、耐容性であるが、アンチセンス鎖としてW123、W125、またはW126によるよりか、W186およびW187による方が、効率性がより低い遺伝子サイレンシングが見られる。
−W188では、有意な遺伝子サイレンシング活性が見られるが、このアンチセンス鎖は、6個のLNAモノマーを含有し、アンチセンス鎖の中央に位置するモノマーXは、モノマーXが、対応するRNAモノマーで置換される状況と比較して、遺伝子サイレンシングを改善することができることを示す。
−完全RNAアンチセンス鎖(3’末端に対する2個のLNAモノマーを除く)は、耐容性良好である。
−単一Xモノマーは、アンチセンス鎖において耐容性良好であり得る(W123)。
−単一Xモノマーは、未改変対照(siRNA−EGFP)と比較して、同様に良好なまたはさらに改善された遺伝子サイレンシングにつながり得る(W125またはW126)。
−いくつかのXモノマーは、むしろ耐容性良好である(アンチセンス鎖として、W186、W187、またはW281)。
−W188では、有意な遺伝子サイレンシング活性が見られるが、このアンチセンス鎖は、6個のLNAモノマーを含有し、アンチセンス鎖の中央に位置するモノマーXは、モノマーXが、対応するRNAモノマーで置換される状況と比較して、遺伝子サイレンシングを改善することができることを示す。
−LNAモノマーの共存がない状況において、アンチセンス鎖におけるモノマーXのいくつかの置換により、有意な遺伝子サイレンシングが見られる(W281)。
−完全RNAアンチセンス鎖(3’末端に対する2個のLNAモノマーを除く)は、耐容性良好である。
−単一Xモノマーは、アンチセンス鎖において耐容性良好であり得、未改変対照(siRNA−EGFP)と比較して、同様に良好なまたはさらに改善された遺伝子サイレンシングが観察される3’末端に対して、最もそのように明白であり得る(W123、W125、W126)。
−いくつかのXモノマーは、むしろ耐容性良好である。(アンチセンス鎖として、W186、W187、またはW281)
−W188では、有意な遺伝子サイレンシング活性が見られるが、このアンチセンス鎖は、6個のLNAモノマーを含有し、アンチセンス鎖の中央に位置するモノマーXは、モノマーXが、対応するRNAモノマーで置換される状況と比較して、遺伝子サイレンシングを改善することができ、センス鎖が、いくつかのXモノマーを含有する場合も遺伝子サイレンシングを改善することができることを示す。
−LNAモノマーの共存がない状況においても、アンチセンス鎖におけるモノマーXのいくつかの置換により、遺伝子サイレンシングが見られる(W281)。
−単一Xモノマーは、アンチセンス鎖において耐容性良好であり得る(W123)。
−単一Xモノマーは、未改変対照(siRNA−EGFP)と比較して、同様に良好なまたはさらに改善された遺伝子サイレンシングにつながり得る(W125またはW126)。
−いくつかのXモノマーは、むしろ耐容性良好である(アンチセンス鎖として、W186、W187、またはW281)。
−W188では、有意な遺伝子サイレンシング活性が見られるが、このアンチセンス鎖は、6個のLNAモノマーを含有し、アンチセンス鎖の中央に位置するモノマーXは、モノマーXが、対応するRNAモノマーで置換される状況と比較して、遺伝子サイレンシングを改善することができることを示す。
−LNAモノマーの共存がない状況においても、アンチセンス鎖におけるモノマーXのいくつかの置換により、有意な遺伝子サイレンシングが見られる(W281)。
−単一Xモノマーは、アンチセンス鎖において耐容性良好である(W123、W125、またはW126)。
−いくつかのXモノマーは、むしろ耐容性良好である(アンチセンス鎖として、W186、W187、またはW281)。
−W188では、有意な遺伝子サイレンシング活性が見られるが、このアンチセンス鎖は、6個のLNAモノマーを含有し、アンチセンス鎖の中央に位置するモノマーXは、モノマーXが、対応するRNAモノマーで置換される状況と比較して、遺伝子サイレンシングを改善することができることを示す。
−LNAモノマーの共存がない状況においても、アンチセンス鎖におけるモノマーXのいくつかの置換により、有意な遺伝子サイレンシングが見られる(W281)。
−完全RNAアンチセンス鎖(3’末端に対する2個のLNAモノマーを除く)は、耐容性良好である。
−単一Xモノマーは、アンチセンス鎖において耐容性良好であり得、未改変対照(siRNA−EGFP)と比較して、改善された遺伝子サイレンシングにつながり得る(W123、W125、またはW126)。
−いくつかのXモノマーは、むしろ耐容性良好である(アンチセンス鎖として、W186、W187、またはW281)。
−W188では、有意な遺伝子サイレンシング活性が見られるが、このアンチセンス鎖は、6個のLNAモノマーを含有し、アンチセンス鎖の中央に位置するモノマーXは、モノマーXが、対応するRNAモノマーで置換される状況と比較して、遺伝子サイレンシングを改善することができることを示す。
−LNAモノマーの共存がない状況において、アンチセンス鎖におけるモノマーXのいくつかの置換により、有意な遺伝子サイレンシングが見られる(W281)。
種(seed)改変は、オフターゲット効果を削減する
50nM濃度のsiRNA二本鎖におけるセンス鎖として、アンチセンス鎖W124およびW207(5’−GAC GUA AAC GGC CAC AAG UTLCMeL)(配列番号)を使用して、本発明者らは、モノマーXが、アンチセンス鎖のいわゆる種領域に存在する場合、より低いオフターゲット効果をもたらす選択性増強効果を有することを示した。したがって、実験の設定により、siRNA効果(鎖開裂を伴う遺伝子サイレンシング)とmiRNA効果(翻訳抑制;種領域の一致のみから成る4つの標的領域を有する、プラスミドに基づくオフターゲットセンサ)との識別を可能にした。上記の組み合わせを使用すると、siRNA効果は、未改変siRNA対照と同様であったが、一方、miRNA効果は、有意に低下した。同様の効果は、siDharma(アンチセンス鎖の5’末端からの位置番号2に取り込まれる2’−O−Me−RNAモノマーを有する市販品)に対して得られた。以上のように、これは、アンチセンス鎖のいわゆる種領域に存在するヒドロキシメチル置換モノマー(例えば、モノマーD)が、好ましい効果(すなわち、オフターゲット効果の低下または排除)をもたらすことを示す。そのため、RNA複合体のオフターゲット効果を低下または排除するための方法は、RNA複合体に1個または複数個のヒドロキシメチル置換モノマー(例えば、モノマーD)を取り込む工程、または1個または複数個のヒドロキシメチル置換モノマー(例えば、モノマーD)を含有するRNA複合体を調製する工程を含む。遺伝子サイレンシング(すなわち、「siRNA効果」)およびオフターゲット効果(すなわち、「miRNA効果)の結果に関しては、以下の表を参照されたい。これらのデータは、1個または複数個のヒドロキシメチル置換モノマー(例えば、モノマーD)を含有するRNA複合体が、オフターゲット効果を最小限にしながら、標的の発現を削減することを示す。
アンチセンス鎖改変としてのヒドロキシメチル改変モノマーDは、オフターゲット効果を低下させ、遺伝子サイレンシングの有効性を増加させる。
ホスホラミダイトモノマー基本要素の合成
以下のスキームは、モノマーアミダイト(=ホスホラミダイト)基本要素の合成を例示するために行われた手順を示す。
収率:8.53g(82%)
Rf:0.2(CH2Cl2中の10%MeOH)
1H NMR(DMSO−d6):δ11.34(br s,NH),7.62(d,1H,J=8.05Hz,H6),7.45−7.15(m,9H,ar),6.85(d,4H,ar),5.80(t,1H,J=6.2Hz,H1’),5.52(d,1H,J=8.05Hz,H5),5.12(t,1H,J=5.86Hz,2’OH),4.74(t,1H,J=5.49Hz,3’OH),3.72(s,6H,OCH3),3.55−3.47(m,3H,H2’/H4’),3.40(t,2H,J=5.13Hz,H3’),3.01−2.90(m,2H,H5’)
13C NMR(DMSO−d6):δ163.2,157.9,151.4,144.8,141.1(C5),135.4,129.5(ar),127.7,127.5(ar),126.5(ar),113.0,101.6(C6),85.3,83.6(C1’),79.3(C2’/C4’),63.5(C5’),61.1,60.5(C2’/C4’),54.9(−OCH3)
ESI−HiRes(mNa+):m/z:571.1743 calc.:571.2051。
収率:3.44g(79%)
Rf:0.3(CH2Cl2中の5%MeOH)
1H NMR(DMSO−d6):δ11.43(s,1H,NH,ex),7.93−7.87(m,2H,ar),7.80(d,1H,J=8.05Hz,H6),7.70−7.63(m,1H),7.56−7.48(m,2H,ar),7.35−7.17(m,10H,ar),6.89−6.81(m,4H,ar),6.20(t,1H,J=5.49Hz,H1’),5.56(d,1H,J=8.05Hz,H5),4.83(t,1H,0H−3’,ex),4.58(dq,2H,H2’),3.73(s,7H−OCH3),3.70−3.62(m,1H,H4’),3.45(t,2H,H3’),3.11−2.96(m,2H,H5’)
13C NMR(DMSO−d6):δ164.92,162.98,157.89,151.00,144.67,140.51,135.45,135.35,133.54,129.49,129.45,129.13,129.02,128.92,128.74,128.61,127.65,127.51,126.49,113.16,113.01,102.06,85.35,80.84,79.57,71.8,71.8,63.4,60.5,54.9,54.8
ESI−HiRes(mNa+):m/z:675.1949 calc.:675.2313
2’−O−ベンゾイル−3’−O−(2−シアノエトキシ(ジイソプロピルアミノ)ホスフィノ)−5’−O−(4,4’−ジメトキシトリチル)−2’,3’−セコウリジン(104−U)
収率:600mg(68%)
Rf:0.6(トルエン中の50%EtOAc)
31P NMR(MeCN):δ147.8
ESI−HiRes(mNa+):m/z:875.2946 calc.:875.3391
6−N−ベンゾイル−5’−O−(4,4’−ジメトキシトリチル)−2’,3’−セコアデノシン(102−A)
収率:6.07g(86%)
Rf:0.22(DCM中の5%i−PrOH)
1H NMR(DMSO−d6):δ11.23(br s,1H,N6H),8.76(s,1H,アデニン(adenin)C8/C2),8.68(s,1H,アデニン(adenin)C8/C2),8.07(d,2H,J=6.96Hz,Ar),7.69−7.50(m,3H,Ar),7.25−6.91(m,9H,Ar),6.79(dd,4H,Ar),6.06(t,1H,H1’),5.29(t,1H,2’OH),4.84(t,1H,3’OH),4.19−4.02(m,2H,H2’),3.90−3.80(m,1H,H4’),3.69(s,6H,2×−OCH3),3.49(t,2H,H3’),2.93−2.74(m,2H,H5’)
13C NMR(DMSO−d6):δδ165.6,157.9,152.8,151.6(アデニン(adenin)CH),150.2,144.6,143.1(アデニン(adenin)CH),135.7,135.4,132.4(Ar),129.4(Ar),128.5(Ar),128.4(Ar),127.7(Ar),127.5(Ar),126.4(Ar),125.2,113.0(Ar),85.0,84.5(1’C),79.6(4’C),63.6(5’C),61.4(2’C),60.9(3’C),54.9(−OCH3)
6−N−ベンゾイル−2’−O−ベンゾイル−5’−O−(4,4’−ジメトキシトリチル)−2’,3’−セコアデノシン(103−A)
収率:1.69g(73%)
Rf:0.49(EtOAc)
1H NMR(DMSO−d6):δ11.28(s,1H,NH),8.82(s,1H,アデニン CH),8.76(s,1H,アデニン CH),8.06(d,2H,Ar),7.79(d,2H,Ar),7.55−7.40(m,6H,Ar),7.25−6.89(m,10,Ar),6.77(dd,4H,Ar),6.51(t,1H,H1’),4.99(m,2H,H2’),4.91(t,1H,3’OH),3.89(ap.s,1H,H4’),3.72(s,6H,2×−OCH3),3.54(m,2H,H3’),2.81(m,2H,H5’)
13C NMR(DMSO−d6):δ165.0,157.9,152.4,150.5,144.6,142.9(アデニンCH),135.6,133.6(Ar),132.4(Ar),129.0(Ar),128.8(Ar),128.4(Ar),127.5(Ar),125.2(Ar),113.0(Ar),85.1,81.5(C1’),79.9(C4’),63.8(C2’),63.5,54.9(−OCH3)
ESI−HiRes(mNa+):m/z:802.2848 calc.:802.2847
6−N−ベンゾイル−2’−O−ベンゾイル−3’−O−(2−シアノエトキシ(ジイソプロピルアミノ)ホスフィノ)−5’−O−(4,4’−ジメトキシトリチル)−2’,3’−セコアデノシン(104−A)
収率:1.52g(71%)
Rf:0.75(DCM中の5%MeOH)
31P NMR(MeCN):δ148.9
ESI−HiRes(mNa+):m/z:1002.3885 calc.:1002.3926
4−N−アセチル−5’−O−(4,4’−ジメトキシトリチル)−2’,3’−セコシチジン(102−C)
収率:17.24g(71%)
Rf:0.19(CHCl3中の5%MeOH)
1H NMR(DMSO−d6):δ10.94(s,1H,NH),8.08(d,1H,J=7.32Hz,シチジンCH),7.31−7.12(m,12H,Ar/シチジンCH),6.85(d,4H,Ar),5.96(t,1H,H1’),5.13(t,1H,2’OH),4.74(t,1H,3’OH),3.73(s,6H,2×−OCH3),3.63(m,3H,H2’/H4’),3.43(m,2,H3’),3.00(m,2H,H5’),2.13(s,3H−CH3)
13C NMR(DMSO−d6):δ170.9,162.3,158.0,155.4,146.1(シチジンC5/C6),144.6,135.6,129.6(ar),127.7(ar),126.6(ar),113.1(ar),95.4(シチジンC5/C6),85.5,84.7(C1’),79.4(C2’/C4’),63.8(C5’),61.7(C2’/C4’),60.5(C3’),55.0(−OCH3),24.3(−CH3)
ESI−HiRes(mNa+):m/z:612.2298 calc.:612.2316
4−N−アセチル−2’−O−ベンゾイル−5’−O−(4,4’−ジメトキシトリチル)−2’,3’−セコシチジン(103−C)
収率:2.08g(64%)
Rf:0.24(CHCl3中の5%MeOH)
1H NMR(DMSO−d6):δ10.97(s,1H,NH),8.25(d,1H,シチジンCH),7.91(d,2H,Ar),7.65(ap.t,1H,Ar)7.32−7.12(m,12H,Ar/シチジンCH),6.83(d,4H,Ar),6.34(t,1H,H1’),4.84(t,1H,3’OH),4.58(dq,2H,H2’),3.74(s,6H,2×−OCH3),3.70−3.64(m,1H,H4’),3.48(m,2H,H3’),3.07(m,2H,H5’),2.14(s,3H−CH3)
13C NMR(DMSO−d6):δ171.0,165.0,162.5,157.1,145.5(シチジンC5/C6),144.6,135.48,133.6,129.6(Ar),128.8(Ar),127.7(Ar),127.6(Ar),126.6(Ar),113.1(Ar),95.8(シチジンC5/C6),85.6,82.0(C1’),79.6(C4’),79.2 63.9(C2’),63.7,60.5(C3’),54.9(−OCH3),24.3(−CH3)
ESI−HiRes(mNa+):m/z:716.2589 calc.:716.2759
4−N−アセチル−2’−O−ベンゾイル−3’−O−(2−シアノエトキシ(ジイソプロピルアミノ)ホスフィノ)−5’−O−(4,4’−ジメトキシトリチル)−2’,3’−セコシチジン(104−C)
収率:940mg(44%)
Rf:0.42(DCM中の5%MeOH)
31P NMR(MeCN):δ148.8
ESI−HiRes(mNa+):m/z:916.3622 calc.:916.3657
5’−O−(4,4’−ジメトキシトリチル)−2−N−イソブチリル−2’,3’−セコグアノシン(102−G)
収率:8.02g(68%)
Rf:0.24(CH2Cl2中の7%MeOH)
13C NMR(DMSO−d6):δ180.2,157.9,154.9,147.8,144.7,135.4,129.3(Ar),127.5(Ar),127.4(Ar),126.4(Ar),120.4,113.0(Ar),85.2,85.1(C1’),79.9(C4’),63.5(C5’),61.7(C2’),61.1(C3’),54.9(−OCH3),34.7(第四級i−Pr),18.9(i−Pr),18.8(i−Pr)
MALDI−HiRes(mNa+):m/z:680.2679 calc.:680.2691
2’−O−ベンゾイル−5’−O−(4,4’−ジメトキシトリチル)−2−N−イソブチリル−2’,3’−セコグアノシン(103−G)
収率:1.49g(63%)
Rf:0.47(CH2Cl2中の7%MeOH)
1H NMR(DMSO−d6):δ12.10(s,1H,NH),11.72(s,1H,NH),8.32(s,1H,グアニジンH8),7.85−7.79(m,2H,Ar),7.65−7.63(m,1H,Ar),7.51−7.45(m,2H,Ar),7.26−6.97(m,11H,Ar),6.79(m,4H,Ar),6.18(t,1H,H1’),5.04−4.82(m,3H,H2’/3’OH),3.82(m,1H,H4’),3.72(s,6H,2×−OCH3),3.49(t,2H,H3’),3.03−2.74(m,3H,H5’/第四級i−Pr),1.11(ap.t,6H,2×−CH3)
13C NMR(DMSO−d6):δ180.1,164.9,157.8,154.8,148.6,147.9,144.6,138.4,135.5,135.3,133.6,129.3(Ar),129.0(ar),128.8(ar),128.7(ar),127.6(ar),127.4(ar),126.3(ar),120.6,112.9(ar),85.1,82.0(C1’),80.1(C4’),63.7,63.3(C5’),61.0(C3’),54.8(−OCH3),34.6(第四級i−Pr),18.8(−CH3),18.6(−CH3)
ESI−HiRes(mNa+):m/z:784.2943 calc.:784.2953
2’−O−ベンゾイル−3’−O−(2−シアノエトキシ(ジイソプロピルアミノ)ホスフィノ)−5’−O−(4,4’−ジメトキシトリチル)−2−N−イソブチリル−2’,3’−セコグアノシン(104−G)
収率:607mg(33%)
Rf:0.3(1:3 アセトン:トルエン)
31P NMR(MeCN):δ148.6
ESI−HiRes(mNa+):m/z:984.4028 calc.:984.4031。
ピペラジノ−官能化モノマー基本要素の合成
実施例は、モノマーのC2’位置に付加するアミノ官能基を有するモノマーアミダイト基本要素の合成、すなわち、化合物105、106、107、108、109、および110を介してヌクレオシド103−Uから開始するC2’−ピペラジノ−官能化モノマー基本要素111(アミダイトJ;塩基=ウラシル)の合成を例示するために行われた手順を説明する。
ヌクレオシド103−U(328mg,0.50mmol)を無水ピリジン(2mL)に溶解し、室温で攪拌した。TBDMSCl(113mg,0.75mmol)を反応混合物に添加し、19時間攪拌した。その後、水(1mL)を添加し、さらに15分攪拌し続け、それから、反応混合物をDCM(50mL)で希釈し、飽和NaHCO3水溶液(2×25mL)およびブライン(25mL)で洗浄した。有機相をNa2SO4で乾燥させ、ろ過し、減圧下で乾燥するまで蒸発させた。残渣を、溶離液としてDCM中のMeOH(0〜8%)を使用してシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、白色固形物としてヌクレオシド105を得た。収率294mg(78%).1H NMR(300MHz,DMSO−d6)δ11.46(s,1H,NH),7.95−7.79(m,3H),7.71−7.63(m,1H),7.57−7.48(m,2H),7.37−7.13(m,9H),6.84(d,J=8.8Hz,4H),6.22(t,J=5.7Hz,1H,H1’),5.58(d,J=8.0Hz,1H,H5),4.69−4.45(m,2H,H2’),3.80−3.64(m,8H,2×OMeおよびH4’),3.54(t,J=4.7Hz,1H,H3’),3.09−2.97(m,2H,H5’),0.73(s,9H,3×Me),−0,07および−0,09(2×s,6H,2×Me).13C NMR(75.5MHz,DMSO−d6):δ165.0,163.1,158.0,151.1,144.7,140.6,135.5,135.4,133.7,129.6,129.1,129.0,128.8,127.8,127.6,126.6,113.1,102.3,85.5,81.1,79.2,63.4,63.1,62.1,55.0,25.6,17.7,2×−5.7.ESI−HRMS:m/z789.3147([M+Na]+,C43H50N2O9Si・Na calc.789.3178)
NaOH(845mg,21.1mmol)を無水MeOH(200mL)と混合し、得られた混合物を0℃まで冷却した。ヌクレオシド105(3.10g,4.05mmol)を無水MeOH(40mL)に溶解し、得られた混合物を上記の混合物に添加し、得られた反応混合物を2.5時間攪拌した。飽和NH4Cl水溶液(10mL)を添加し、さらに10分間攪拌し続けた。それから、水(100mL)を添加し、DCM(4×200mL)を使用して抽出を行った。有機相を減圧下で乾燥するまで蒸発させ、その後、残渣を無水ピリジン(10mL)で同時蒸発させた。残渣を、溶離液としてDCM中のMeOH(5〜10%)を使用してシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、白色固形物としてヌクレオシド106を得た。収率2.54g(95%).1H NMR(300MHz,DMSO−d6):δ11.35(s,1H,NH),7.66(d,J=7.6Hz,1H,H6),7.33−7.14(m,9H),6.88−6.82(m,4H),5.82(t,J=6.0Hz,1H,H1’),5.53(d,J=8Hz,1H,H5),5.11(t,J=5.8Hz,1H,2’−OH),3.73(s,6H,2×OMe),3.69−3.45(m,5H,H2’,H4’およびH3’),3.01−2.93(m,2H,H5’),0.76(s,9H,3×Me),−0.03および−0.05(2×s,6H,2×Me).13C NMR(75.5MHz,DMSO−d6):δ163.2,158.0,151.6,144.8,135.6,135.4,129.6,127.7,127.6,126.6,113.1,101.8,85.4,83.5,78.5,63.3,61.8,61.0,55.0,25.6,17.7,2×−5.6.ESI−HRMS:m/z685.2885([M+Na]+,C36H46N2O8Si・Na calc.685.2916)
ヌクレオシド106(927mg,1.40mmol)を無水ピリジン(20mL)に溶解し、得られた混合物を0℃で攪拌した、MsCl(220μL,2.83mmol)を滴下し、得られた混合物を室温で3時間攪拌した。EtOH(2mL)を添加し、さらに10分間攪拌し続けた。その後、混合物を乾燥するまで蒸発させ、残渣を、溶離液としてDCM中のMeOH(0〜7%)を使用してシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、白色発泡体としてヌクレオシド107を得た。収率834mg(81%).1H NMR(300MHz,DMSO−d6):δ11.49(s,1H,NH),7.77(d,J=8.2Hz,1H,H6),7.35−7.14(m,9H),6.86(d,J=8.5Hz,4H),6.11(t,J=5.7Hz,1H,H1’),5.60(d,J=8.1Hz,1H,H5),4.49(d,J=5.5Hz,2H,H2’),3.77−3.48(m,9H,2×OMe,H4’およびH3’),3.22(s,3H,Me),3.10−2.89(m,2H,H5’),0.77(s,9H,3×Me),−0.02および−0.04(2×s,6H,2×Me).13C NMR(75.5MHz,DMSO−d6):δ163.1,158.0,151.7,144.7,140.5,135.5,135.3,129.6,127.8,127.6,126.6,113,1,102.4,85.5,80.6,79.1,67.8,63.1,61.8,55.0,36.8,25.6,17.7,−5.6,−5.7.ESI−HRMS:m/z763.2662([M+Na]+,C37H48N2O10SSi・Na calc.763.2692)
ヌクレオシド107(276mg,0.373mmol)を無水ピリジン(3mL)に溶解し、ピペラジン(3.21g,37.3mmol)を室温で攪拌下しながら添加した。その後、反応混合物を150℃まで加熱し、1時間攪拌し、その後、室温まで冷却した。反応混合物を飽和NaHCO3水溶液(200mL)で希釈し、それから、クロロホルム(7×100mL)を使用して抽出を行った。有機相をNa2SO4で乾燥させ、ろ過し、乾燥するまで蒸発させた。残渣を、溶離系として、まずDCM中のMeOH(0〜5%)、その後、DCM中の半飽和メタノールアンモニア(5%)を使用して、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、白色固形物としてヌクレオシド108を得た。収率182mg(67%).1H NMR(300MHz,DMSO−d6):δ7.64(d,J=8.1Hz,1H,H6),7.34−7.13(m,9H),6.85(d,J=7.8Hz,4H),5.98(t,J=6.0Hz,1H,H1’),5.53(d,J=8.1Hz,1H,H5),3.72(s,6H,2×OMe),3.68−3.51(m,3H,H4’およびH3’),3.04−2.90(m,2H,H5’),2.77−2.54(m,6H,H2’,ピペラジノ),2.48−2.27(m,4H,ピペラジノ),0.77,(s,9H,3×Me),−0.02および−0.04(2×s,6H,2×Me).13C NMR(75.5MHz,DMSO−d6):δ163.2,158.0,151,3,144.8,141.1(C6),135.6,135.4,129.5,127.7,127.6,126.6,113.1,113.1,101.8(C5),85.4,81.3(C1’),78.3,63.1,62.1,60.1,55.0(OMe),55.0(OMe),53.8,45.3,25.7(Me),17.8,−5.5(Me),−5.6(Me).ESI−HRMS:m/z731.3859([M+H]+,C40H54N4O7Si・H calc.731.3834)
ヌクレオシド108(102mg,0.14mmol)を無水MeOH(2mL)に溶解し、得られた混合物を室温で攪拌した。DMAP(10mg,0.08mmol)およびトリフルオロ酢酸エチル(22μL,0.184mmol)を添加し、16時間攪拌し続けた。その後、混合を減圧下で乾燥するまで蒸発させ、残渣を、溶離液としてDCM中のMeOH(0〜2%)を使用してシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、白色固形体としてヌクレオシド109を得た。収率100mg(86%).1H NMR(300MHz,DMSO−d6):δ11.37(s,1H,NH),7.66(d,J=7.8Hz,1H,H6),7.38−7.12(m,9H),6.93−6.80(m,4H),6.00(t,J=5.9Hz,1H,H1’),5.54(d,J=7.8Hz,1H,H5),3.73(s,6H,2×OMe),3.70−3.40(m,7H,H3’,H4’およびピペラジノ),3.08−2.92(m,2H,H5’),2.90−2.52(m,6H,H2’およびピペラジノ),0.77(s,9H,3×Me),0.00および−0.04(2×s,6H,2×Me).13C NMR(75.5MHz,DMSO−d6):δ163.2,158.0,151.3,144.8,140.8,135.6,135.4,129.5,127.7,127.6,126.6,113.1,102.0,85.5,81.0,78.2,63.1,62.0,58.9,55.0,52.6,52.0,45.4,43.0,25.6,17.8,−5.6,−5.6.ESI−HRMS:m/z849.3452([M+Na]+,C42H53F3N4O8Si・Na calc.849.3477)
ヌクレオシド109(251mg,0.304mmol)を無水THF(2×5mL)で同時蒸発させ、その後、無水THF(10mL)に溶解した。THF中の1M TBAF(606μl,0.606mmol)を、攪拌しながら室温で1時間の間、この混合物に滴下し、その後、室温で21時間攪拌し続けた。反応混合物を減圧下で乾燥するまで蒸発させ、その後、残渣をEtOAc(40mL)に溶解した。得られた混合物を飽和NaHCO3水溶液(3×10mL)および水(3×10mL)で洗浄し、分離した有機相をNa2SO4で乾燥させ、ろ過し、減圧下で乾燥するまで蒸発させた。残渣を、溶離液として石油エーテル中のEtOAc(60〜100%)を使用してシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、白色固形体としてヌクレオシド110を得た。収率111mg(51%).1H NMR(300MHz,DMSO−d6):δ11.36(s,1H,NH),7.66(d,J=8.1Hz,1H,H6),7.34−7.27(m,4H),7.24−7.14(m,5H),6.92−6.82(m,4H),5.98(t,J=6.1Hz,1H,H1’),5.53(d,J=7.3Hz,1H,H5),4.80(t,J=5.3Hz,1H,3’−OH),3.73(s,6H,2×OMe),3.63−3.38(m,8H,H4’,H3’およびピペラジノ),3.07−2.89(m,2H,H5’),2.77(t,J=5.8Hz,2H,H2’),2.66−2.54(m,3H,ピペラジノ).13C NMR(75.5MHz,DMSO−d6):δ163.2,158.0,151.2,144.8,140.9,135.6,135.5,129.6,129.6,127.8,127.6,126.6,113.1,101.9,85.4,81.3,79.2,63.5,60.7,59.1,55.0,52.7,52.1,45.4,42.9.ESI−HRMS:m/z735.2585([M+Na]+,C36H39F3N4O8・Na calc.735.2612)
ヌクレオシド110(91mg,0.128mmol)を無水DCM(2×5mL)で同時蒸発させ、その後、無水DCM(2.5mL)で溶解した。DIPEA(111μL,0.64mol)を、攪拌しながら室温で混合物に添加し、それから、2−シアノエチルN,N−ジイソプロピルホスホラミドクロリダイト(57μL,0.256mmol)を滴下した。室温で1時間攪拌し続け、それから、EtOH(0.5mL)を添加し、その後、さらに10分間攪拌した。DCM(40mL)を添加し、その後、飽和NaHCO3水溶液(20mL)で洗浄した。分離した有機相をNa2SO4で乾燥させ、ろ過し、減圧下で乾燥するまで蒸発させた。残渣を、溶離液として石油エーテル中のEtOAc(60〜80%)を使用してシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、白色固形体としてアミダイト111を得た。収率106mg(91%)。31P NMR(CDCl3)δ150.0および149.5。ESI−HRMS:m/z913.3841([M+H]+,C45H56F3N6O9P・H calc.913.3871)
(実施例13)
ピペラジノ官能化モノマー基本要素を含有するオリゴヌクレオチドの合成
実施例1に記載される方法を使用することによって、ピペラジノ部分における遊離末端NHを有するモノマーJの効率的な取り込みが、RNAアミダイト類およびアミダイト111を使用して遂行される。このアミダイトの収率を合わせると、95%を上回る。
Claims (24)
- 非環式ヌクレオチドモノマーを含むオリゴヌクレオチド。
- 前記非環式ヌクレオチドモノマーは、2’−3’−セコ−ヌクレオチドモノマーである、請求項2に記載のオリゴヌクレオチド。
- 15〜40個のヌクレオチドモノマーを含む、請求項1〜3のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
- 1〜5個の非環式ヌクレオチドモノマーを含む、請求項1〜5のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
- 4個未満の連続的DNAモノマーを含む、請求項1〜5のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
- 50%を上回るRNAモノマーを含む、請求項1〜6のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
- 2’−O−アルキル−RNAモノマー、2’−アミノ−DNAモノマー、2’−フルオロ−DNAモノマー、LNAモノマー、PNAモノマー、HNAモノマー、ANAモノマー、FANAモノマー、CeNAモノマー、ENAモノマー、DNAモノマー、およびINAモノマーから成る群より選択されるヌクレオチド類似体をさらに含む、請求項1〜7のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
- 少なくとも2つのLNAヌクレオチド類似体を含む、請求項1〜8のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
- ホスホロチオエート結合またはボラノホスフェート結合を含む、請求項1〜9のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記オリゴヌクレオチドは、該オリゴヌクレオチドに相補的な標的mRNAのRISC依存性翻訳抑制または分解を媒介することが可能である、請求項1〜10のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
- 請求項1〜11のいずれかに記載の少なくとも1つのオリゴヌクレオチドを含む、RNA二本鎖。
- 15〜40個の多数の塩基対を含む、請求項12に記載のRNA二本鎖。
- 14〜26個の多数の塩基対を含む、請求項12に記載のRNA二本鎖。
- 少なくとも1つの突出を含む、請求項12〜14のいずれかに記載のRNA二本鎖。
- 前記突出の長さは、1〜14個のヌクレオチドである、請求項15に記載のRNA二本鎖。
- 少なくとも1つの3’突出を含む、請求項12〜15のいずれかに記載のRNA二本鎖。
- 前記少なくとも1つの3’突出の長さは、1〜14個のヌクレオチドである、請求項17に記載のRNA二本鎖。
- 少なくとも1つの平滑末端を含む、請求項12に記載のRNA二本鎖。
- 前記RNA二本鎖は、標的mRNAに相補的なヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドを含み、ここで、該RNA二本鎖は、該標的mRNAの発現を低減させる、請求項12〜19のいずれかに記載のRNA二本鎖。
- 前記RNA二本鎖は、非環式モノマーの代わりに天然RNAモノマーを有する同一のRNA二本鎖と比較して、オフターゲット効果を低下させる、請求項12〜20のいずれかに記載のRNA二本鎖。
- 前記RNA二本鎖は、非環式モノマーの代わりに天然RNAモノマーを有する同一のRNA二本鎖と比較して、有効性を増大または持続させる、請求項12〜21のいずれかに記載のRNA二本鎖。
- 前記RNA二本鎖は、非環式モノマーの代わりに天然RNAモノマーを有する同一のRNA二本鎖と比較して、安定性を改善させる、請求項12〜22のいずれかに記載のRNA二本鎖。
- 前記RNA二本鎖は、非環式モノマーの代わりに天然RNAモノマーを有する同一のRNA二本鎖と比較して、免疫刺激を低減させる、請求項12〜23のいずれかに記載のRNA二本鎖。
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