JP7348185B2 - キラル富化二本鎖ｒｎａ剤 - Google Patents

キラル富化二本鎖ｒｎａ剤 Download PDF

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Description

本発明は、標的遺伝子発現の阻害に有利である部位特異的（例えば、末端の）キラル修飾ヌクレオチド間結合を有するキラル修飾ｄｓＲＮＡ剤、並びに治療的使用に適したｄｓＲＮＡ組成物に関する。さらに、本発明は、例えば様々な疾患の処置のために、これらのキラル修飾ｄｓＲＮＡ剤を投与することにより目的の標的遺伝子の発現を阻害する方法を提供する。
ＲＮＡ干渉又は「ＲＮＡｉ」は、短鎖二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）が遺伝子発現を阻止できるという観察を説明するためにＦｉｒｅ及び同僚によって最初に作成された語である（非特許文献１）。短鎖ｄｓＲＮＡは、脊椎動物を含む様々な生物における遺伝子特異的な翻訳後サイレンシングを誘導し、遺伝子機能の研究の新たなツールを提供する。ＲＮＡｉは、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）、サイレンシングトリガーに相同なメッセンジャーＲＮＡを破壊する配列特異的な多成分ヌクレアーゼによって媒介される。ＲＩＳＣは、二本鎖ＲＮＡトリガーに由来する短鎖ＲＮＡ（約１７～２５ヌクレオチド）を含むことが知られており、標的ＲＮＡを切断するタンパク質成分は、ＲＩＳＣ関連エンドヌクレアーゼであるアルゴノート２（Ａｇｏ２）である。
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）に基づく創薬には、優れた遺伝子サイレンシング特性を有する二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子が必要である。ＲＮＡｉの最初の工程は、ｄｓＲＮＡ二重鎖のセンス鎖の除去を必要とするＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）の活性化である。センス鎖は、二重鎖領域の中央でアルゴノート２によって切断される最初のＲＩＳＣ基質として機能することが知られていた。センス鎖の切断された５’末端及び３’末端断片が除去された直後に、ＲＩＳＣがアンチセンス鎖によって活性化されるようになる（非特許文献１）。
センス鎖の切断及び除去が阻害されると、標的ｍＲＮＡのエンドヌクレアーゼによる切断が阻害されると考えられていた（非特許文献１～３）。Ｌｅｕｓｃｈｎｅｒらは、センス鎖のＡｇｏ２切断部位への２’－Ｏ－Ｍｅリボースの組み込みがＨｅＬａ細胞のＲＮＡｉを阻害することを示した（非特許文献２）。同様の効果がホスホロチオエート修飾で観察され、哺乳動物でもセンス鎖の切断が効率的なＲＮＡｉに必要であることを示した。
また、ヌクレアーゼ活性からｓｉＲＮＡを保護する有効な手段は、それらのホスホジエステル結合をホスホロチオエート（ＰＳ）に交換することであると考えられていた。ＰＳ修飾ｓｉＲＮＡのエピマー混合物は、典型的には、ｉｎ ｖｉｖｏでのヌクレアーゼ活性から保護するために使用することができる。しかしながら、ヌクレアーゼに対するｓｉＲＮＡの安定性は、キラルリン原子の絶対立体化学配置によって影響を受け得る。
Ｒａｎｄ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｃｅｌｌ １２３，６２１ Ｌｅｕｓｃｈｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００６）ＥＭＢＯ Ｒｅｐ．，７，３１４ Ｓｃｈｗａｒｚ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．１４，７８７
従って、ｓｉＲＮＡ遺伝子治療の遺伝子サイレンシング効果を改善するためのｄｓＲＮＡ剤の要望が現在も存在する。本発明はその要望に関する。
本発明は、標的遺伝子発現の阻害に有利である、少なくとも１つのリガンドに任意選択的に結合されたｄｓＲＮＡ剤、及び治療的使用に適したＲＮＡｉ組成物のための効果的な立体化学的解決策を提供する。本発明者らは、修飾ｄｓＲＮＡの末端におけるホスホロチオエート結合のリン原子のキラリティーを選択することにより、ｄｓＲＮＡ剤の各ストランド内のヌクレオチド間ホスホロチオエート主鎖修飾の数が減少すると同時に、ヌクレアーゼに対するｄｓＲＮＡ剤の安定性及び遺伝子サイレンシング能力（ＲＩＳＣローディング）などのｉｎ ｖｉｖｏ薬理特性を維持又は改善することができることを見出した。
一態様では、本発明は、標的遺伝子の発現を阻害することができるキラル修飾二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）剤に関する。キラル修飾ｄｓＲＮＡ剤は、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、各鎖は１４～４０ヌクレオチドを有する。
キラル修飾ｄｓＲＮＡ剤は、（例えば、終端に）３つ以上のキラル修飾ヌクレオチド間結合を含む。キラル修飾ｄｓＲＮＡ剤は、（例えば、終端に）４つ以上のキラル修飾ヌクレオチド間結合を含み得る。キラル修飾ｄｓＲＮＡ剤は、（例えば、終端に）５つ以上のキラル修飾ヌクレオチド間結合を含み得る。キラル修飾ｄｓＲＮＡ剤は、（例えば、終端に）６つ以上のキラル修飾ヌクレオチド間結合を含み得る。キラル修飾ｄｓＲＮＡ剤は、（例えば、終端に）７つ以上のキラル修飾ヌクレオチド間結合を含み得る。キラル修飾ｄｓＲＮＡ剤は、（例えば、終端に）８つ以上のキラル修飾ヌクレオチド間結合を含み得る。ヌクレオチド間結合に対する末端のキラル修飾は、５’末端、３’末端、又は５’末端と３’末端の両方に存在し得る。
キラル修飾ヌクレオチド間結合は、例えば、鎖の末端で部位特異的であり得る。
キラル修飾ｄｓＲＮＡ剤は、アンチセンス鎖の５’末端及び／若しくは３’末端又はセンス鎖の５’末端から１位、２位、３位、又はそれらの組み合わせ、又はｄｓＲＮＡの両方の鎖の前記位置において３つ以上の部位特異的（例えば、末端の）キラル修飾ヌクレオチド間結合を含む。キラル修飾ｄｓＲＮＡ剤は、アンチセンス鎖の５’末端及び／若しくは３’末端又はセンス鎖の５’末端から１位、２位、３位、４位、若しくはそれらの組み合わせ、又はｄｓＲＮＡの両方の鎖の前記位置において４つ以上の部位特異的（例えば、末端の）キラル修飾ヌクレオチド間結合を含み得る。キラル修飾ｄｓＲＮＡ剤は、アンチセンス鎖の５’末端及び／若しくは３’末端又はセンス鎖の５’末端から１位、２位、３位、４位、５位、若しくはそれらの組み合わせ、又はｄｓＲＮＡの両方の鎖の前記位置において５つ以上の部位特異的（例えば、末端の）キラル修飾ヌクレオチド間結合を含み得る。キラル修飾ｄｓＲＮＡ剤は、アンチセンス鎖の５’末端及び／若しくは３’末端又はセンス鎖の５’末端から１位、２位、３位、４位、５位、６位、若しくはそれらの組み合わせ、又はｄｓＲＮＡの両方の鎖の前記位置において６つ以上の部位特異的（例えば、末端の）キラル修飾ヌクレオチド間結合を含み得る。キラル修飾ｄｓＲＮＡ剤は、アンチセンス鎖の５’末端及び／若しくは３’末端又はセンス鎖の５’末端から１位、２位、３位、４位、５位、６位、７位、若しくはそれらの組み合わせ、又はｄｓＲＮＡの両方の鎖の前記位置において７つ以上の部位特異的（例えば、末端の）キラル修飾ヌクレオチド間結合を含み得る。キラル修飾ｄｓＲＮＡ剤は、アンチセンス鎖の５’末端及び／若しくは３’末端又はセンス鎖の５’末端から１位、２位、３位、４位、５位、６位、７位、８位、若しくはそれらの組み合わせ、又はｄｓＲＮＡの両方の鎖の前記位置において８つ以上の部位特異的（例えば、末端の）キラル修飾ヌクレオチド間結合を含み得る。
ヌクレオチド間結合に対する部位特異的キラル修飾は、５’末端、３’末端、又は５’末端及び３’末端の両方に存在し得る。一実施形態では、ヌクレオチド間結合に対する部位特異的キラル修飾は、末端以外の内部の位置にも存在し得る。別の実施形態では、ヌクレオチド間結合に対する部位特異的（例えば、末端の）キラル修飾は、内部、内部と５’末端、内部と３’末端、及びそれらの組み合わせで存在し得る。ヌクレオチド間結合に対するキラル修飾は、センス鎖、アンチセンス鎖、又はセンス鎖及びアンチセンス鎖の両方に存在し得る。キラル純粋リン原子のそれぞれは、Ｒｐ配置又はＳｐ配置のいずれか、及びそれらの組み合わせであり得る。
キラル的に純粋なホスホロチオエート結合が複数存在する場合、ｄｓＲＮＡの所与の鎖、センス鎖又はアンチセンス鎖のいずれかにおいて、リン原子の組み合わせキラル配置は、すべてＲｐ、又はすべてＳｐ、又はすべてＲｐとＳｐの部位特異的組み合わせである。すべてＲｐのセンス鎖は、各鎖のキラル修飾ヌクレオチド間結合の総数によって、アキラル、すべてＲｐ、すべてＳｐ、又はすべてＲｐとＳｐの可能な部位特異的組み合わせのアンチセンス鎖と対合し、逆もしかりである。同様に、すべてＳｐのセンス鎖は、各鎖のキラル修飾ヌクレオチド間結合の総数によって、アキラル、すべてＲｐ、すべてＳｐ、又はすべてＲｐとＳｐの可能な部位特異的組み合わせのアンチセンス鎖と対合し、逆もしかりである。キラル的に純粋なヌクレオチド間結合を含むＲｐとＳｐの部位特異的組み合わせを有するセンス鎖は、各鎖のキラル修飾ヌクレオチド間結合の総数によって、アキラル、すべてＲｐ、すべてＳｐ、又はすべてＲｐとＳｐの可能な部位特異的組み合わせのアンチセンス鎖と対合し、逆もしかりである。
いくつかの実施形態では、センス鎖は、５’末端（例えば、末端）に１つ以上のキラル修飾ヌクレオチド間結合を含む。
一実施形態では、キラル修飾は、センス鎖の５’末端から１番目のヌクレオチド間結合に存在し、結合リン原子はＲｐ配置にある。一実施形態では、キラル修飾は、センス鎖の５’末端から１番目のヌクレオチド間結合に存在し、結合リン原子はＳｐ配置にある。
一実施形態では、キラル修飾は、センス鎖の５’末端から２番目のヌクレオチド間結合に存在し、結合リン原子はＲｐ配置にある。一実施形態では、キラル修飾は、センス鎖の５’末端から２番目のヌクレオチド間結合に存在し、結合リン原子はＳｐ配置にある。
一実施形態では、キラル修飾は、センス鎖の５’末端から３番目のヌクレオチド間結合に存在し、結合リン原子はＲｐ配置にある。一実施形態では、キラル修飾は、センス鎖の５’末端から３番目のヌクレオチド間結合に存在し、結合リン原子はＳｐ配置にある。
一実施形態では、キラル修飾は、センス鎖の５’末端からｎ番目のヌクレオチド間結合に存在し、結合リン原子はＲｐ配置にある。一実施形態では、キラル修飾は、センス鎖の５’末端からｎ番目のヌクレオチド間結合に存在し、結合リン原子はＳｐ配置にある。
いくつかの実施形態では、センス鎖は、（例えば、末端）５’末端に２つ以上のキラル修飾ヌクレオチド間結合を含む。一実施形態では、キラル修飾は、センス鎖の５’末端から１番目及び２番目のヌクレオチド間結合に存在し、結合リン原子はＲｐ配置にある。一実施形態では、キラル修飾は、センス鎖の５’末端から１番目及び２番目のヌクレオチド間結合に存在し、結合リン原子はＳｐ配置にある。別の実施形態では、キラル修飾は、センス鎖の５’末端から１番目及び２番目のヌクレオチド間結合に存在し、結合リン原子の配置は、ＲｐとＳｐの組み合わせ、すなわちＳｐＲｐ配置又はＳｐＳｐ配置である。
一実施形態では、キラル修飾は、センス鎖の５’末端から１番目及びｎ番目のヌクレオチド間結合に存在し、結合リン原子はＲｐ配置にある。一実施形態では、キラル修飾は、センス鎖の５’末端から１番目及びｎ番目のヌクレオチド間結合に存在し、結合リン原子はＳｐ配置にある。別の実施形態では、キラル修飾は、センス鎖の５’末端から１番目及びｎ番目のヌクレオチド間結合に存在し、結合リン原子の配置は、ＲｐとＳｐの組み合わせ、すなわちＳｐＲｐ配置又はＳｐＳｐ配置である。
一実施形態では、キラル修飾は、センス鎖の５’末端から２番目及びｎ番目のヌクレオチド間結合に存在し、結合リン原子はＲｐ配置にある。一実施形態では、キラル修飾は、センス鎖の５’末端から２番目及びｎ番目のヌクレオチド間結合に存在し、結合リン原子はＳｐ配置にある。別の実施形態では、キラル修飾は、センス鎖の５’末端から２番目及びｎ番目のヌクレオチド間結合に存在し、結合リン原子の配置は、ＲｐとＳｐの組み合わせ、すなわちＳｐＲｐ又はＳｐＳｐ配置である。
いくつかの実施形態では、センス鎖は、（例えば、末端）５’末端に３つ以上のキラル修飾ヌクレオチド間結合を含む。一実施形態では、キラル修飾は、センス鎖の５’末端から１番目、２番目、及び３番目のヌクレオチド間結合に存在し、結合リン原子はＲｐ配置にある。一実施形態では、キラル修飾は、センス鎖の５’末端から１番目、２番目、及び３番目のヌクレオチド間結合に存在し、結合リン原子はＳｐ配置にある。別の実施形態では、キラル修飾は、センス鎖の５’末端から１番目、２番目、及び３番目のヌクレオチド間結合に存在し、結合リン配置は、ＲｐとＳｐの組み合わせ、すなわちＲｐＲｐＲｐ配置、ＲｐＳｐＲｐ配置、ＳｐＲｐＲｐ配置、ＳｐＳｐＲｐ配置、ＳｐＲｐＳｐ ＲｐＳｐＳｐ配置、又はＳｐＳｐＳｐ配置である。
一実施形態では、キラル修飾は、センス鎖の５’末端から１番目、２番目、及びｎ番目のヌクレオチド間結合に存在し、結合リン原子はＲｐ配置にある。一実施形態では、キラル修飾は、センス鎖の５’末端から１番目、２番目、及びｎ番目のヌクレオチド間結合に存在し、結合リン原子はＳｐ配置にある。別の実施形態では、キラル修飾は、センス鎖の５’末端から１番目、２番目、及びｎ番目のヌクレオチド間結合に存在し、結合リン配置は、ＲｐとＳｐの組み合わせ、すなわちＲｐＲｐＳｐ配置、ＲｐＳｐＲｐ配置、ＳｐＲｐＲｐ配置、ＳｐＳｐＲｐ配置、ＳｐＲｐＳｐ ＲｐＳｐＳｐ配置、又はＳｐＳｐＳｐ配置である。
一実施形態では、キラル修飾は、センス鎖の５’末端から２番目、３番目、及びｎ番目のヌクレオチド間結合に存在し、結合リン原子はＲｐ配置にある。一実施形態では、キラル修飾は、センス鎖の５’末端から２番目、３番目、及びｎ番目のヌクレオチド間結合に存在し、結合リン原子はＳｐ配置にある。別の実施形態では、キラル修飾は、センス鎖の５’末端から２番目、３番目、及びｎ番目のヌクレオチド間結合に存在し、結合リン配置は、ＲｐとＳｐの組み合わせ、すなわちＲｐＲｐＲｐ配置、ＲｐＳｐＲｐ配置、ＳｐＲｐＲｐ配置、ＳｐＳｐＲｐ配置、ＳｐＲｐＳｐ ＲｐＳｐＳｐ配置、又はＳｐＳｐＳｐ配置である。
いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖は、（例えば、末端）５’末端に１つ又は複数のキラル修飾ヌクレオチド間結合を含む。
一実施形態では、キラル修飾は、アンチセンス鎖の５’末端から１番目のヌクレオチド間結合に存在し、結合リン原子はＲｐ配置にある。一実施形態では、キラル修飾は、アンチセンス鎖の５’末端から１番目のヌクレオチド間結合に存在し、結合リン原子はＳｐ配置にある。
一実施形態では、キラル修飾は、アンチセンス鎖の５’末端から２番目のヌクレオチド間結合に存在し、結合リン原子はＲｐ配置にある。一実施形態では、キラル修飾は、アンチセンス鎖の５’末端から２番目のヌクレオチド間結合に存在し、結合リン原子はＳｐ配置にある。
一実施形態では、キラル修飾は、アンチセンス鎖の５’末端から３番目のヌクレオチド間結合に存在し、結合リン原子はＲｐ配置にある。一実施形態では、キラル修飾は、アンチセンス鎖の５’末端から３番目のヌクレオチド間結合に存在し、結合リン原子はＳｐ配置にある。
一実施形態では、キラル修飾は、アンチセンス鎖の５’末端からｎ番目のヌクレオチド間結合に存在し、結合リン原子はＲｐ配置にある。一実施形態では、キラル修飾は、アンチセンス鎖の５’末端からｎ番目のヌクレオチド間結合に存在し、結合リン原子はＳｐ配置にある。
いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖は、（例えば、末端）５’末端に２つ以上のキラル修飾ヌクレオチド間結合を含む。
一実施形態では、キラル修飾は、アンチセンス鎖の５’末端から１番目及び２番目のヌクレオチド間結合に存在し、結合リン原子はＲｐ配置にある。一実施形態では、キラル修飾は、アンチセンス鎖の５’末端から１番目及び２番目のヌクレオチド間結合に存在し、結合リン原子はＳｐ配置にある。別の実施形態では、キラル修飾は、アンチセンス鎖の５’末端から１番目及び２番目のヌクレオチド間結合に存在し、結合リン原子の配置は、ＲｐとＳｐの組み合わせ、すなわちＳｐＲｐ又はＳｐＳｐ配置である。
一実施形態では、キラル修飾は、アンチセンス鎖の５’末端から１番目及びｎ番目のヌクレオチド間結合に存在し、結合リン原子はＲｐ配置にある。一実施形態では、キラル修飾は、アンチセンス鎖の５’末端から１番目及びｎ番目のヌクレオチド間結合に存在し、結合リン原子はＳｐ配置にある。別の実施形態では、キラル修飾は、アンチセンス鎖の５’末端から１番目及びｎ番目のヌクレオチド間結合に存在し、結合リン原子の配置は、ＲｐとＳｐの組み合わせ、すなわちＳｐＲｐ又はＳｐＳｐ配置である。
一実施形態では、キラル修飾は、アンチセンス鎖の５’末端から２番目及びｎ番目のヌクレオチド間結合に存在し、結合リン原子はＲｐ配置にある。一実施形態では、キラル修飾は、アンチセンス鎖の５’末端から２番目及びｎ番目のヌクレオチド間結合に存在し、結合リン原子はＳｐ配置にある。別の実施形態では、キラル修飾は、アンチセンス鎖の５’末端から２番目及びｎ番目のヌクレオチド間結合に存在し、結合リン原子の配置は、ＲｐとＳｐの組み合わせ、すなわちＲｐＲｐ、ＳｐＲｐ、又はＳｐＳｐ配置である。
いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖は、（例えば、末端）５’末端に３つ以上のキラル修飾ヌクレオチド間結合を含む。
一実施形態では、キラル修飾は、アンチセンス鎖の５’末端から１番目、２番目、及び３番目のヌクレオチド間結合に存在し、結合リン原子はＲｐ配置にある。一実施形態では、キラル修飾は、アンチセンス鎖の５’末端から１番目、２番目、及び３番目のヌクレオチド間結合に存在し、結合リン原子はＳｐ配置にある。別の実施形態では、キラル修飾は、アンチセンス鎖の５’末端から１番目、２番目、及び３番目のヌクレオチド間結合に存在し、結合リン配置は、ＲｐとＳｐの組み合わせ、すなわちＲｐＲｐＲｐ配置、ＲｐＳｐＲｐ配置、ＳｐＲｐＲｐ配置、ＳｐＳｐＲｐ配置、ＳｐＲｐＳｐ ＲｐＳｐＳｐ配置、又はＳｐＳｐＳｐ配置である。
一実施形態では、キラル修飾は、アンチセンス鎖の５’末端から１番目、２番目、及びｎ番目のヌクレオチド間結合に存在し、結合リン原子はＲｐ配置にある。一実施形態では、キラル修飾は、アンチセンス鎖の５’末端から１番目、２番目、及びｎ番目のヌクレオチド間結合に存在し、結合リン原子はＳｐ配置にある。別の実施形態では、キラル修飾は、アンチセンス鎖の５’末端から１番目、２番目、及びｎ番目のヌクレオチド間結合に存在し、結合リン配置は、ＲｐとＳｐの組み合わせ、すなわちＲｐＲｐＲｐ配置、ＲｐＳｐＲｐ配置、ＳｐＲｐＲｐ配置、ＳｐＳｐＲｐ配置、ＳｐＲｐＳｐ ＲｐＳｐＳｐ配置、又はＳｐＳｐＳｐ配置である。
一実施形態では、キラル修飾は、アンチセンス鎖の５’末端から２番目、３番目、及びｎ番目のヌクレオチド間結合に存在し、結合リン原子はＲｐ配置にある。一実施形態では、キラル修飾は、アンチセンス鎖の５’末端から２番目、３番目、及びｎ番目のヌクレオチド間結合に存在し、結合リン原子はＳｐ配置にある。別の実施形態では、キラル修飾は、アンチセンス鎖の５’末端から２番目、３番目、及びｎ番目のヌクレオチド間結合に存在し、結合リン配置は、ＲｐとＳｐの組み合わせ、すなわちＲｐＲｐＲｐ配置、ＲｐＳｐＲｐ配置、ＳｐＲｐＲｐ配置、ＳｐＳｐＲｐ配置、ＳｐＲｐＳｐ ＲｐＳｐＳｐ配置、又はＳｐＳｐＳｐ配置である。
いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖は、（例えば、末端）３’末端に１つ又は複数のキラル修飾ヌクレオチド間結合を含む。
一実施形態では、キラル修飾は、アンチセンス鎖の３’末端から１番目のヌクレオチド間結合に存在し、結合リン原子はＲｐ配置にある。一実施形態では、キラル修飾は、アンチセンス鎖の３’末端から１番目のヌクレオチド間結合に存在し、結合リン原子はＳｐ配置にある。
一実施形態では、キラル修飾は、アンチセンス鎖の３’末端から２番目のヌクレオチド間結合に存在し、結合リン原子はＲｐ配置にある。一実施形態では、キラル修飾は、アンチセンス鎖の３’末端から２番目のヌクレオチド間結合に存在し、結合リン原子はＳｐ配置にある。
一実施形態では、キラル修飾は、アンチセンス鎖の３’末端から３番目のヌクレオチド間結合に存在し、結合リン原子はＲｐ配置にある。一実施形態では、キラル修飾は、アンチセンス鎖の３’末端から３番目のヌクレオチド間結合に存在し、結合リン原子はＳｐ配置にある。
一実施形態では、キラル修飾は、アンチセンス鎖の３’末端からｎ番目のヌクレオチド間結合に存在し、結合リン原子はＲｐ配置にある。一実施形態では、キラル修飾は、アンチセンス鎖の３’末端からｎ番目のヌクレオチド間結合に存在し、結合リン原子はＳｐ配置にある。
いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖は、（例えば、末端）３’末端に２つ以上のキラル修飾ヌクレオチド間結合を含む。
一実施形態では、キラル修飾は、アンチセンス鎖の３’末端から１番目及び２番目のヌクレオチド間結合に存在し、結合リン原子はＲｐ配置にある。一実施形態では、キラル修飾は、アンチセンス鎖の３’末端から１番目及び２番目のヌクレオチド間結合に存在し、結合リン原子はＳｐ配置にある。別の実施形態では、キラル修飾は、アンチセンス鎖の３’末端から１番目及び２番目のヌクレオチド間結合に存在し、結合リン原子の配置は、ＲｐとＳｐの組み合わせ、すなわちＲｐＲｐ配置、ＳｐＲｐ配置、又はＳｐＳｐ配置である。
一実施形態では、キラル修飾は、アンチセンス鎖の３’末端から１番目及びｎ番目のヌクレオチド間結合に存在し、結合リン原子はＲｐ配置にある。一実施形態では、キラル修飾は、アンチセンス鎖の３’末端から１番目及びｎ番目のヌクレオチド間結合に存在し、結合リン原子はＳｐ配置にある。別の実施形態では、キラル修飾は、アンチセンス鎖の３’末端から１番目及びｎ番目のヌクレオチド間結合に存在し、結合リン原子の配置は、ＲｐとＳｐの組み合わせ、すなわちＲｐＲｐ配置、ＳｐＲｐ配置、又はＳｐＳｐ配置である。
一実施形態では、キラル修飾は、アンチセンス鎖の３’末端から２番目及びｎ番目のヌクレオチド間結合に存在し、結合リン原子はＲｐ配置にある。一実施形態では、キラル修飾は、アンチセンス鎖の３’末端から２番目及びｎ番目のヌクレオチド間結合に存在し、結合リン原子はＳｐ配置にある。別の実施形態では、キラル修飾は、アンチセンス鎖の３’末端から２番目及びｎ番目のヌクレオチド間結合に存在し、結合リン原子の配置は、ＲｐとＳｐの組み合わせ、すなわちＲｐＲｐ、ＳｐＲｐ、又はＳｐＳｐ配置である。
いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖は、（例えば、末端）３’末端に３つ以上のキラル修飾ヌクレオチド間結合を含む。
一実施形態では、キラル修飾は、アンチセンス鎖の３’末端から１番目、２番目、及び３番目のヌクレオチド間結合に存在し、結合リン原子はＲｐ配置にある。一実施形態では、キラル修飾は、アンチセンス鎖の３’末端から１番目、２番目、及び３番目のヌクレオチド間結合に存在し、結合リン原子はＳｐ配置にある。別の実施形態では、キラル修飾は、アンチセンス鎖の３’末端から１番目、２番目、及び３番目のヌクレオチド間結合に存在し、結合リン配置は、ＲｐとＳｐの組み合わせ、すなわちＲｐＲｐＲｐ配置、ＲｐＳｐＲｐ配置、ＳｐＲｐＲｐ配置、ＳｐＳｐＲｐ配置、ＳｐＲｐＳｐ ＲｐＳｐＳｐ配置、又はＳｐＳｐＳｐ配置である。
一実施形態では、キラル修飾は、アンチセンス鎖の３’末端から１番目、２番目、及びｎ番目のヌクレオチド間結合に存在し、結合リン原子はＲｐ配置にある。一実施形態では、キラル修飾は、アンチセンス鎖の３’末端から１番目、２番目、及びｎ番目のヌクレオチド間結合に存在し、結合リン原子はＳｐ配置にある。別の実施形態では、キラル修飾は、アンチセンス鎖の３’末端から１番目、２番目、及びｎ番目のヌクレオチド間結合に存在し、結合リン配置は、ＲｐとＳｐの組み合わせ、すなわちＲｐＲｐＲｐ配置、ＲｐＳｐＲｐ配置、ＳｐＲｐＲｐ配置、ＳｐＳｐＲｐ配置、ＳｐＲｐＳｐ ＲｐＳｐＳｐ配置、又はＳｐＳｐＳｐ配置である。
一実施形態では、キラル修飾は、アンチセンス鎖の３’末端から２番目、３番目、及びｎ番目のヌクレオチド間結合に存在し、結合リン原子はＲｐ配置にある。一実施形態では、キラル修飾は、アンチセンス鎖の３’末端から２番目、３番目、及びｎ番目のヌクレオチド間結合に存在し、結合リン原子はＳｐ配置にある。別の実施形態では、キラル修飾は、アンチセンス鎖の３’末端から２番目、３番目、及びｎ番目のヌクレオチド間結合に存在し、結合リン配置は、ＲｐとＳｐの組み合わせ、すなわちＲｐＲｐＳｐ配置、ＲｐＳｐＲｐ配置、ＳｐＲｐＲｐ配置、ＳｐＳｐＲｐ配置、ＳｐＲｐＳｐ ＲｐＳｐＳｐ配置、又はＳｐＳｐＳｐ配置である。
いくつかの実施形態では、キラル修飾ｄｓＲＮＡ剤は：アンチセンス鎖の３’末端から１番目のヌクレオチド間結合に存在するキラル修飾、及び同じアンチセンス鎖の５’末端から１番目のヌクレオチド間結合におけるキラル修飾を含む。一実施形態では、アンチセンス鎖の両末端のキラル修飾は、Ｓｐ配置の結合リン原子を有する。別の実施形態では、アンチセンス鎖の両末端における末端キラル修飾は、Ｒｐ配置にある結合リン原子を有する。別の実施形態では、アンチセンス鎖の両末端における末端キラル修飾は、ＲｐＳｐ配置又はＳｐＲｐ配置のいずれかにある結合リン原子を有する。
いくつかの実施形態では、キラル修飾ｄｓＲＮＡ剤は：アンチセンス鎖の３’末端から２番目のヌクレオチド間結合に存在するキラル修飾、及び同じアンチセンス鎖の５’末端から１番目のヌクレオチド間結合における第２のキラル修飾を含む。一実施形態では、アンチセンス鎖の両末端のキラル修飾は、Ｓｐ配置にある結合リン原子を有する。別の実施形態では、アンチセンス鎖の両末端における末端キラル修飾は、Ｒｐ配置にある結合リン原子を有する。別の実施形態では、アンチセンス鎖の両末端における末端キラル修飾は、ＲｐＳｐ配置又はＳｐＲｐ配置のいずれかにある結合リン原子を有する。
いくつかの実施形態では、キラル修飾ｄｓＲＮＡ剤は：アンチセンス鎖の３’末端から３番目のヌクレオチド間結合に存在するキラル修飾、及び同じアンチセンス鎖の５’末端から１番目のヌクレオチド間結合における第２のキラル修飾を含む。一実施形態では、アンチセンス鎖の両末端のキラル修飾は、Ｓｐ配置にある結合リン原子を有する。別の実施形態では、アンチセンス鎖の両末端における末端キラル修飾は、Ｒｐ配置にある結合リン原子を有する。別の実施形態では、アンチセンス鎖の両末端における末端キラル修飾は、ＲｐＳｐ配置又はＳｐＲｐ配置のいずれかにある結合リン原子を有する。
いくつかの実施形態では、キラル修飾ｄｓＲＮＡ剤は：アンチセンス鎖の３’末端から１番目のヌクレオチド間結合に存在するキラル修飾、及び同じアンチセンス鎖の５’末端から２番目のヌクレオチド間結合における第２のキラル修飾を含む。一実施形態では、アンチセンス鎖の両末端のキラル修飾は、Ｓｐ配置にある結合リン原子を有する。別の実施形態では、アンチセンス鎖の両末端における末端キラル修飾は、Ｒｐ配置にある結合リン原子を有する。別の実施形態では、アンチセンス鎖の両末端における末端キラル修飾は、ＲｐＳｐ配置又はＳｐＲｐ配置のいずれかにある結合リン原子を有する。
いくつかの実施形態では、キラル修飾ｄｓＲＮＡ剤は：アンチセンス鎖の３’末端から２番目のヌクレオチド間結合に存在するキラル修飾、及び同じアンチセンス鎖の５’末端から２番目のヌクレオチド間結合における第２のキラル修飾を含む。一実施形態では、アンチセンス鎖の両末端のキラル修飾は、Ｓｐ配置にある結合リン原子を有する。別の実施形態では、アンチセンス鎖の両末端における末端キラル修飾は、Ｒｐ配置にある結合リン原子を有する。別の実施形態では、アンチセンス鎖の両末端における末端キラル修飾は、ＲｐＳｐ配置又はＳｐＲｐ配置のいずれかにある結合リン原子を有する。
いくつかの実施形態では、キラル修飾ｄｓＲＮＡ剤は：アンチセンス鎖の３’末端から３番目のヌクレオチド間結合に存在するキラル修飾、及び同じアンチセンス鎖の５’末端から２番目のヌクレオチド間結合における第２のキラル修飾を含む。一実施形態では、アンチセンス鎖の両末端のキラル修飾は、Ｓｐ配置にある結合リン原子を有する。別の実施形態では、アンチセンス鎖の両末端における末端キラル修飾は、Ｒｐ配置にある結合リン原子を有する。別の実施形態では、アンチセンス鎖の両末端における末端キラル修飾は、ＲｐＳｐ配置又はＳｐＲｐ配置のいずれかにある結合リン原子を有する。
センス鎖が（例えば、末端）５’末端に１つ以上、２つ以上、又は３つ以上のキラル修飾ヌクレオチド間結合を含むことを論じた上記の実施形態のいずれかは、アンチセンス鎖が（例えば、末端）５’末端及び／又は３’末端に１つ以上、２つ以上、又は３つ以上のキラル修飾ヌクレオチド間結合を含むことを論じた上記の実施形態のいずれかと組み合わせて、複数（例えば、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、又は８つ以上）のキラル修飾ヌクレオチド間結合を含むキラル修飾ｄｓＲＮＡ剤の様々な実施形態を形成することができる。
例えば、いくつかの実施形態では、キラル修飾ｄｓＲＮＡ剤は、Ｓｐ配置にある結合リン原子を有する、アンチセンス鎖の３’末端から１番目のヌクレオチド間結合に存在する末端のキラル修飾、Ｒｐ配置にある結合リン原子を有する、アンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチド間結合に存在する末端のキラル修飾、及びＲｐ配置又はＳｐ配置のいずれかにある結合リン原子を有する、センス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチド間結合に存在する末端のキラル修飾を含む。
いくつかの実施形態では、キラル修飾ｄｓＲＮＡ剤は：Ｓｐ配置にある結合リン原子を有する、アンチセンス鎖の３’末端の１番目及び２番目のヌクレオチド間結合に存在する末端のキラル修飾；Ｒｐ配置にある結合リン原子を有する、アンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチド間結合に存在する末端のキラル修飾；及びＲｐ配置にある結合リン原子を有する、センス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチド間結合に存在する末端のキラル修飾を含む。
いくつかの実施形態では、キラル修飾ｄｓＲＮＡ剤は：Ｓｐ配置にある結合リン原子を有する、アンチセンス鎖の３’末端の１番目、２番目、及び３番目のヌクレオチド間結合に存在する末端のキラル修飾；Ｒｐ配置にある結合リン原子を有する、アンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチド間結合に存在する末端のキラル修飾；及びＲｐ配置にある結合リン原子を有する、センス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチド間結合に存在する末端のキラル修飾を含む。
いくつかの実施形態では、キラル修飾ｄｓＲＮＡ剤は：Ｓｐ配置にある結合リン原子を有する、アンチセンス鎖の３’末端の１番目及び２番目のヌクレオチド間結合に存在する末端のキラル修飾；Ｒｐ配置にある結合リン原子を有する、アンチセンス鎖の３’末端の３番目のヌクレオチド間結合に存在する末端のキラル修飾；Ｒｐ配置にある結合リン原子を有する、アンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチド間結合に存在する末端のキラル修飾；及びＲｐ配置にある結合リン原子を有する、センス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチド間結合に存在する末端のキラル修飾を含む。
いくつかの実施形態では、キラル修飾ｄｓＲＮＡ剤は：Ｓｐ配置にある結合リン原子を有する、アンチセンス鎖の３’末端の１番目及び２番目のヌクレオチド間結合に存在する末端のキラル修飾；Ｒｐ配置にある結合リン原子を有する、アンチセンス鎖の５’末端の１番目及び２番目のヌクレオチド間結合に存在する末端のキラル修飾；及びＲｐ配置にある結合リン原子を有する、センス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチド間結合に存在する末端のキラル修飾を含む。
各末端のキラル修飾ヌクレオチド間結合のキラル結合リン原子に関するキラル純度は、キラル修飾が、少なくとも５０％、例えば、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、又は実質的に１００％である。
キラル修飾ＲＮＡ剤のキラル的に純粋な（又は実質的にキラル的に純粋な）ジアステレオ異性体形態は、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、又は実質的に１００％のキラル純度を有するキラル修飾ＲＮＡ剤の特定のジアステレオ異性体形態を指し得る。
いくつかの実施形態では、１つ又は複数の部位特異的（例えば、末端の）キラル修飾ヌクレオチド間結合は独立に、式Ａ：
Figure 0007348185000001
 の構造を有する。
式Ａでは、Ｐ＊は不斉リン原子であり、且つＲｐ又はＳｐのいずれかである。ＷはＯ、Ｓ、又はＳｅである。Ｘ、Ｙ、及びＺはそれぞれ独立に、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｎ（－Ｌ－Ｒ１）－、－Ｃ（Ｒｍ）（Ｒｍ）－、又はＬである。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのキラル修飾ヌクレオチド間結合において、Ｘは－Ｓ－である。
いくつかの実施形態では、Ｌは、共有結合又は任意選択的に置換された直鎖又は分岐Ｃ１－Ｃ１０アルキレンであり、Ｌの１つ又は複数のメチレン単位は、任意選択的且つ独立に、任意選択的に置換されたＣ１－Ｃ６アルキレン、Ｃ１－Ｃ６アルケニレン、－Ｃ≡Ｃ－、－Ｃ（Ｒ’）２－、－Ｃｙ－、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｓ－Ｓ－、－Ｎ（Ｒ’）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（ＮＲ’）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｓ（Ｏ）－、－Ｓ（Ｏ）２－、－Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）２－、－ＳＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｓ－、－ＯＣ（Ｏ）－、又は－Ｃ（Ｏ）Ｏ－によって置換される。－Ｃｙ－は、フェニレン、カルボシクリレン、アリーレン、ヘテロアリーレン、又はヘテロシクリレンから選択される任意選択的に置換された２価の環である。
いくつかの実施形態では、－Ｌ－Ｒ１は、Ｘに関連する負電荷又は正電荷を表す。
Ｒ１は、ハロゲン、Ｒ、又は任意選択的に置換されたＣ１－Ｃ５０脂肪族であり、１つ又は複数のメチレン単位は、任意選択的且つ独立に、任意選択的に置換されたＣ１－Ｃ６アルキレン、Ｃ１－Ｃ６アルケニレン、－Ｃ≡Ｃ－、－Ｃ（Ｒ’）２－、－Ｃｙ－、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｓ－Ｓ－、－Ｎ（Ｒ’）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（ＮＲ’）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｓ（Ｏ）－、－Ｓ（Ｏ）２－、－Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）２－、－ＳＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｓ－、－ＯＣ（Ｏ）－、又は－Ｃ（Ｏ）Ｏ－によって置換される。
各Ｒ’は独立に、－Ｒ、－Ｃ（Ｏ）Ｒ、－ＣＯ２Ｒ、若しくは－ＳＯ２Ｒであるか；又は、同じ窒素上の２つのＲ’は、それらの間にある原子と一緒に、任意選択的に置換された複素環若しくはヘテロアリール環を形成するか；又は、同じ炭素上の２つのＲ’は、それらの間にある原子と一緒に、任意選択的に置換されたアリール、炭素環、複素環、又はヘテロアリール環を形成する。各Ｒは独立に、水素であるか、又はＣ１－Ｃ６脂肪族、フェニル、カルボシクリル、アリール、ヘテロアリール、若しくはヘテロシクリルから選択される任意選択的に置換された基である。
Figure 0007348185000002
 はそれぞれ独立に、ヌクレオシドとの結合を表す。いくつかの実施形態では、ヌクレオシドとの結合は３’を介し、第２のヌクレオシド結合は５’炭素を介し、逆もしかりである。別の実施形態では、第１のヌクレオシドは３’炭素を介して結合され、第２のヌクレオシドは３’炭素を介して結合される。別の実施形態では、第１のヌクレオシド結合は５’炭素を介し、第２のヌクレオシド結合は５’炭素を介する。別の実施形態では、第１のヌクレオシド結合は２’炭素を介し、第２のヌクレオシド結合は５’炭素を介し、逆もしかりである。別の実施形態では、第１のヌクレオシド結合は２’炭素を介し、第２のヌクレオシド結合は３’炭素を介し、逆もしかりである。別の実施形態では、第１のヌクレオシド結合は２’炭素を介し、第２のヌクレオシド結合は２’炭素を介する。
いくつかの実施形態では、式Ａの１つ又は複数の末端のキラル修飾ヌクレオチド間結合は、式Ａ－１：
Figure 0007348185000003
 の構造を有し、式中、各変数は上で定義した通りである。
いくつかの実施形態では、式Ａの１つ又は複数の末端のキラル修飾ヌクレオチド間結合は、式Ａ－２：
Figure 0007348185000004
 の構造を有し、式中、各変数は上で定義した通りである。
いくつかの実施形態では、式Ａの１つ又は複数の末端のキラル修飾ヌクレオチド間結合は、式Ａ－３：
Figure 0007348185000005
 の構造を有し、式中、各変数は上で定義した通りである。式Ａ－３の例示的な末端のキラル修飾ヌクレオチド間結合は：
Figure 0007348185000006
 である。
いくつかの実施形態では、式Ａの１つ又は複数の末端のキラル修飾ヌクレオチド間結合は、式Ａ－４：
Figure 0007348185000007
 の構造を有し、式中、各変数は上で定義した通りである。
いくつかの実施形態では、式Ａの１つ又は複数の末端のキラル修飾ヌクレオチド間結合は、式Ａ－５：
Figure 0007348185000008
 の構造を有し、式中、各変数は上で定義した通りである。
キラル修飾ヌクレオチド間結合は、ホスホロチオエート結合であり得る。一実施形態では、各部位特異的（例えば、末端の）キラル修飾ヌクレオチド間結合は、ホスホロチオエート結合である。
キラル修飾ｄｓＲＮＡ剤では、ヌクレオチド間結合が２つのヌクレオチドを結合してジヌクレオチドを形成する。部位特異的（例えば、末端の）キラル修飾ヌクレオチド間結合によって結合されたジヌクレオチドの各ヌクレオチドは独立に、非環状ヌクレオチド、ＬＮＡ、ＨＮＡ、ＣｅＮＡ、２’－Ｏ－メトキシアルキル（例えば、２’－Ｏ－メトキシメチル、２’－Ｏ－メトキシエチル、又は２’－Ｏ－２－メトキシプロパニル）、２’－Ｏ－メチル、２’－Ｏ－アリル、２’－Ｃ－アリル、２’－デオキシ、２’－フルオロ、２’－Ｏ－Ｎ－メチルアセトアミド（２’－Ｏ－ＮＭＡ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノエトキシエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＥＯＥ）、２’－Ｏ－アミノプロピル（２’－Ｏ－ＡＰ）、２’－ａｒａ－Ｆ、Ｌ－ヌクレオシド修飾（例えば、２’－修飾Ｌ－ヌクレオシド、例えば、２’－デオキシ－Ｌ－ヌクレオシド）、ＢＮＡ脱塩基糖、脱塩基環状及び開鎖アルキルからなる群から選択される修飾で修飾される。
いくつかの実施形態では、キラル修飾ｄｓＲＮＡ剤のセンス鎖及びアンチセンス鎖は、それぞれ独立に、非環状ヌクレオチド、ＬＮＡ、ＨＮＡ、ＣｅＮＡ、２’－Ｏ－メトキシアルキル（例えば、２’－Ｏ－メトキシメチル、２’－Ｏ－メトキシエチル、又は２’－Ｏ－２－メトキシプロパニル）、２’－Ｏ－メチル、２’－Ｏ－アリル、２’－Ｃ－アリル、２’－デオキシ、２’－フルオロ、２’－Ｏ－Ｎ－メチルアセトアミド（２’－Ｏ－ＮＭＡ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノエトキシエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＥＯＥ）、２’－Ｏ－アミノプロピル（２’－Ｏ－ＡＰ）、２’－ａｒａ－Ｆ、Ｌ－ヌクレオシド修飾（例えば、２’－修飾Ｌ－ヌクレオシド、例えば、２’－デオキシ－Ｌ－ヌクレオシド）、ＢＮＡ脱塩基糖、脱塩基環状及び開鎖アルキルからなる群から選択される修飾で修飾される。
一実施形態では、キラル修飾ｄｓＲＮＡ剤のセンス鎖及びアンチセンス鎖はそれぞれ、上記のように少なくとも２つの異なる修飾を含む。
一実施形態では、キラル修飾ｄｓＲＮＡ剤の１００％、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、又は３０％が修飾される。例えば、キラル修飾ｄｓＲＮＡ剤の５０％が修飾される場合、キラル修飾ｄｓＲＮＡ剤に存在する全ヌクレオチドの５０％が上記のような修飾を含む。
いくつかの実施形態では、キラル修飾ｄｓＲＮＡ剤のセンス鎖及びアンチセンス鎖はそれぞれ、１２～４０ヌクレオチド長を有する。例えば、各鎖は独立に、１４～４０ヌクレオチド、１７～３７ヌクレオチド、２５～３７ヌクレオチド、１５～３０ヌクレオチド、２７～３０ヌクレオチド、１７～２３ヌクレオチド、１７～２１ヌクレオチド、１７～１９ヌクレオチド、１９～３５ヌクレオチド、１９～２５ヌクレオチド、１９～２３ヌクレオチド、１９～２１ヌクレオチド、２１～２５ヌクレオチド、又は２１～２３ヌクレオチドを有し得る。一実施形態では、各鎖は、１９～３５ヌクレオチドを有する。一実施形態では、各鎖は、１８～２３ヌクレオチドを有する。一実施形態では、センス鎖は１９～２２ヌクレオチドを有し、アンチセンス鎖は１９～２５ヌクレオチドを有する。一例では、センス鎖は２１ヌクレオチドを有し、アンチセンス鎖は２３ヌクレオチドを有する。
いくつかの実施形態では、キラル修飾ｄｓＲＮＡ剤の二重鎖領域は、その長さが、１０～３０ヌクレオチド対、例えば１７～２５ヌクレオチド対、１７～２３ヌクレオチド対、１９～２５ヌクレオチド対、１９～２３ヌクレオチド対、又は１９～２２ヌクレオチド対である。
いくつかの実施形態では、キラル修飾ｄｓＲＮＡ剤は、その長さが、１～１０ヌクレオチドの３’及び／又は５’オーバーハング、例えば、１、２、３、４、５、又は６ヌクレオチドのオーバーハングをさらに含む。いくつかの実施形態では、キラル修飾ｄｓＲＮＡ剤はまた、アンチセンス鎖の５’末端（又はセンス鎖の３’末端）に位置する平滑末端を有し得、逆もしかりである。一実施形態では、キラル修飾ｄｓＲＮＡ剤は、アンチセンス鎖の３’末端に３’オーバーハングを含み、任意選択的にアンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を含む。一実施形態では、キラル修飾ｄｓＲＮＡ剤は、センス鎖の５’末端に５’オーバーハングを有し、任意選択的にアンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を有する。一実施形態では、キラル修飾ｄｓＲＮＡ剤は、ｄｓＲＮＡ二重鎖の両端に２つの平滑末端を有する。
一実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ剤は２’－Ｆ修飾を一切含まない。
いくつかの実施形態では、キラル修飾ｄｓＲＮＡ剤におけるアンチセンス鎖の５’末端の１位のヌクレオチドは、Ａ、ｄＡ、ｄＵ、Ｕ、及びｄＴからなる群から選択される。一実施形態では、アンチセンス鎖の５’末端から１番目、２番目、及び３番目の塩基対の少なくとも１つはＡＵ塩基対である。一実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ剤のアンチセンス鎖は、標的ＲＮＡに対して１００％相補的であって、この標的ＲＮＡにハイブリダイズし、その発現をＲＮＡ干渉によって阻害する。別の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ剤のアンチセンス鎖は、標的ＲＮＡに対して少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６５％、少なくとも６０％、少なくとも５５％、又は少なくとも５０％相補的である。
いくつかの実施形態では、キラル修飾ｄｓＲＮＡ剤は、少なくとも１つのＡＳＧＰＲリガンドをさらに含む。ＡＳＧＰＲリガンドは、本開示で以下に記載されるように、１つ又は複数のリンカーを介してキラル修飾ｄｓＲＮＡ剤に付着することができる。一実施形態では、ＡＳＧＰＲリガンドは、本開示で以下に記載されるように、１つ又は複数の切断可能なリンカーを介してキラル修飾ｄｓＲＮＡ剤に付着することができる。例えば、ＡＳＧＰＲリガンドは、１価、２価、又は３価の分岐リンカー、例えば：
Figure 0007348185000009
 を介して付着した１つ又は複数のＧａｌＮＡｃ誘導体である。
一実施形態では、ＡＳＧＰＲリガンドは、センス鎖の３’末端に付着される。一実施形態では、ＡＳＧＰＲリガンドは、センス鎖の５’末端に付着される。一実施形態では、ＡＳＧＰＲリガンドは、センス鎖の３’及び５’の両末端に付着される。一実施形態では、ＡＳＧＰＲリガンドは、センス鎖の任意の位置に付着される。一実施形態では、ＡＳＧＰＲリガンドとセンス鎖との間の結合は、Ｒｐ配置又はＳｐ配置のいずれかのＰ原子キラリティーを伴うキラル結合である。
一実施形態では、ＡＳＧＰＲリガンドは、アンチセンス鎖の３’末端に付着される。一実施形態では、ＡＳＧＰＲリガンドは、アンチセンス鎖の５’末端に付着される。一実施形態では、ＡＳＧＰＲリガンドは、アンチセンス鎖の３’及び５’の両末端に付着される。一実施形態では、ＡＳＧＰＲリガンドは、アンチセンス鎖の任意の位置に付着される。一実施形態では、ＡＳＧＰＲリガンドとアンチセンス鎖との間の結合は、Ｒｐ配置又はＳｐ配置のいずれかのＰ原子キラリティーを伴うキラル結合である。
本発明はまた、下記の化学モチーフを上記のキラル修飾ｄｓＲＮＡ剤に導入することによって上記のキラル修飾ｄｓＲＮＡ剤のための有効なヌクレオチド又は化学モチーフを提供する。
従って、本発明の一態様は、標的遺伝子の発現を阻害するためのキラル修飾二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）剤に関する。キラル修飾ｄｓＲＮＡ剤は、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、各鎖は１４～４０ヌクレオチドを有する。キラル修飾ｄｓＲＮＡ剤は、上記のような３つ以上の部位特異的（例えば、末端の）キラル修飾ヌクレオチド間結合を含む。センス鎖は、５’末端に向いた１つ又は複数の部位特異的（例えば、末端の）キラル修飾ヌクレオチド間結合を含む。アンチセンス鎖は、５’末端に向いた１つ又は複数の部位特異的（例えば、末端の）キラル修飾ヌクレオチド間結合、及びこの鎖の３’末端に向いた１つ又は複数の部位特異的（例えば、末端の）キラル修飾ヌクレオチド間結合を含む。
部位特異的キラル修飾ヌクレオチド間結合に関連するキラル修飾ｄｓＲＮＡ剤の第１の態様における上記の各実施形態は、本発明のこの態様に当てはまる。
いくつかの実施形態では、キラル修飾ｄｓＲＮＡ剤は、アンチセンス鎖の（５’末端から数えて）最初の５つのヌクレオチドに少なくとも２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有する。
いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖は、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、又は１８のリン酸ヌクレオチド間結合によって分離された１つ、２つ、又は３つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の２つのブロックを含む。
いくつかの実施形態では、キラル修飾ｄｓＲＮＡ剤は、少なくとも１つの鎖の１つ又は複数の位置に結合された１つ又は複数の親油性部分を有する。親油性部分の例としては、限定されるものではないが、脂質（飽和又は不飽和Ｃ４－Ｃ３０炭化水素鎖、並びにヒドロキシル、アミン、カルボン酸、スルホン酸塩、リン酸塩、チオール、アジド、及びアルキンからなる基から選択される任意選択の官能基）、コレステロール、レチノイン酸、コール酸、アダマンタン酢酸、１－ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、１，３－ビス－Ｏ（ヘキサデシル）グリセロール、ゲラニルオキシヘキサノール、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メンソール、１，３－プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、Ｏ３－（オレオイル）リトコール酸、Ｏ３－（オレオイル）コレン酸、ジメトキシトリチル、又はフェノキサジンが挙げられる。一実施形態では、親油性部分は、飽和又は不飽和Ｃ６－Ｃ１８炭化水素鎖である。一例では、親油性部分はドコサヘキサエン酸である。
特定の実施形態では、親油性部分は、Ｃ６－Ｃ３０酸（例えば、ヘキサン酸、ヘプタン酸、オクタン酸、ノナン酸、デカン酸、ウンデカン酸、ドデカン酸（ｄｏｄｃａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、トリデカン酸、テトラデカン酸、ペンタデカン酸、ヘキサデカン酸、ヘプタデカン酸、オクタデカン酸、オレイン酸、リノール酸、アラキドン酸、ｃｉｓ－４，７，１０，１３，１６，１９－ドコサヘキサン酸、ビタミンＡ、ビタミンＥ、コレステロールなど）又はＣ６－Ｃ３０アルコール（例えば、ヘキサノール、ヘプタノール、オクタノール、ノナノール、デカノール、ウンデカノール、ドデカノール（ｄｏｄｃａｎｏｌ）、トリデカノール、テトラデカノール、ペンタデカノール、ヘキサデカノール、ヘプタデカノール、オクタデカノール、オレイルアルコール、リノレイルアルコール、アラキドン酸アルコール、ｃｉｓ－４，７，１０，１３，１６，ｌ９－ドコサヘキサノール、レチノール、ビタミンＥ、コレステロールなど）である。
いくつかの実施形態では、キラル修飾ｄｓＲＮＡ剤は、２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％未満の非天然ヌクレオチドを有するか、又は非天然ヌクレオチドを実質的に有さない。非天然ヌクレオチドの例としては、非環状ヌクレオチド、ＬＮＡ、ＨＮＡ、ＣｅＮＡ、２’－Ｏ－メトキシアルキル（例えば、２’－Ｏ－メトキシメチル、２’－Ｏ－メトキシエチル、又は２’－Ｏ－２－メトキシプロパニル）、２’－Ｏ－アリル、２’－Ｃ－アリル、２’－フルオロ、２’－Ｏ－Ｎ－メチルアセトアミド（２’－Ｏ－ＮＭＡ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノエトキシエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＥＯＥ）、２’－Ｏ－アミノプロピル（２’－Ｏ－ＡＰ）、２’－ａｒａ－Ｆ、Ｌ－ヌクレオシド修飾（例えば、２’－修飾Ｌ－ヌクレオシド、例えば、２’－デオキシ－Ｌ－ヌクレオシド）、ＢＮＡ脱塩基糖、脱塩基環状及び開鎖アルキルが挙げられる。
いくつかの実施形態では、キラル修飾ｄｓＲＮＡ剤は、８０％超、８５％超、９０％超、９５％超、又は実質的に１００％の天然ヌクレオチドを有する。これらの実施形態の目的のために、天然ヌクレオチドは、２’－ＯＨ、２’－デオキシ、及び２’－ＯＭｅを有するものを含み得る。
一実施形態では、キラル修飾ｄｓＲＮＡ剤は、それぞれ１５～３０ヌクレオチド長を有するセンス鎖及びアンチセンス鎖；アンチセンス鎖の（５’末端から数えて）最初の５つのヌクレオチドにおける少なくとも２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み；二重鎖領域は、１９～２５（好ましくは１９、２０、２１、又は２２）塩基対であり；キラル修飾ｄｓＲＮＡ剤は、少なくとも１つの鎖の１つ又は複数の位置に結合された１つ又は複数の親油性部分を有し；且つキラル修飾ｄｓＲＮＡ剤は、２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％未満の非天然ヌクレオチドを有するか、又は非天然ヌクレオチドを実質的に有さない。
一実施形態では、キラル修飾ｄｓＲＮＡ剤は、それぞれ１５～３０ヌクレオチド長を有するセンス鎖及びアンチセンス鎖；アンチセンス鎖の（５’末端から数えて）最初の５つのヌクレオチドにおける少なくとも２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み；二重鎖領域は、１９～２５（好ましくは１９、２０、２１、又は２２）塩基対であり；キラル修飾ｄｓＲＮＡ剤は、少なくとも１つの鎖の１つ又は複数の位置に結合された１つ又は複数の親油性部分を有し；且つキラル修飾ｄｓＲＮＡ剤は、８０％超、８５％超、９５％超、又は実質的に１００％の天然ヌクレオチド、例えば、２’－ＯＨ、２’－デオキシ、又は２’－ＯＭｅを有する天然ヌクレオチドを有する。
いくつかの実施形態では、キラル修飾ｄｓＲＮＡ剤は、センス鎖に１２未満、１０未満、８つ未満、６つ未満、４つ未満、２つ未満の２’－Ｆ修飾を有するか、又は２’－Ｆ修飾を一切有さない。いくつかの実施形態では、キラル修飾ｄｓＲＮＡ剤は、アンチセンス鎖に１２未満、１０未満、８つ未満、６つ未満、４つ未満、２つ未満の２’－Ｆ修飾を有するか、又は２’－Ｆ修飾を一切有さない。
いくつかの実施形態では、キラル修飾ｄｓＲＮＡ剤は、センス鎖又はアンチセンス鎖の任意の位置に１つ又は複数の２’－Ｆ修飾を有する。
一実施形態では、キラル修飾ｄｓＲＮＡ剤のセンス鎖配列は、式（Ｉ）：
５’ｎＰ－Ｎａ－（ＸＸＸ）ｉ－Ｎｂ－ＹＹＹ－Ｎｂ－（ＺＺＺ）ｊ－Ｎａ－ｎｑ３’ （Ｉ）
によって表され、
式中：
ｉ及びｊはそれぞれ独立に、０又は１であり；
ｐとｑはそれぞれ独立に、０～６であり；
各Ｎａは独立に、０～２５の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列は、少なくとも２つの異なる修飾ヌクレオチドを含み；
各Ｎｂは独立に、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、又は６つの修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し；
各ｎｐ及びｎｑは独立に、オーバーハングヌクレオチドを表し；
Ｎｂ及びＹは、同じ修飾を有しておらず；
ＸＸＸ、ＹＹＹ、及びＺＺＺはそれぞれ独立に、３つの連続するヌクレオチド上に３つの同一の修飾の１つのモチーフを表す。
いくつかの実施形態では、キラル修飾ｄｓＲＮＡ剤のセンス鎖は、３つの連続するヌクレオチド上に３つの同一の修飾の少なくとも１つのモチーフを含み、モチーフの１つは、センス鎖の切断部位に存在する。例えば、センス鎖は、５’末端から７～１５位以内の３つの連続するヌクレオチド上に３つの２’－Ｆ修飾の少なくとも１つのモチーフを含み得る。
いくつかの実施形態では、キラル修飾ｄｓＲＮＡ剤のアンチセンス鎖は、３つの連続するヌクレオチド上に３つの同一の修飾の少なくとも１つのモチーフを含み、モチーフの１つは、アンチセンス鎖の切断部位又はその近傍に存在する。例えば、アンチセンス鎖は、５’末端から９～１５位以内の３つの連続するヌクレオチド上に３つの２’－Ｏ－メチル修飾の少なくとも１つのモチーフを含み得る。
１７～２３ヌクレオチド長の二重鎖領域を有するｄｓＲＮＡ剤の場合、アンチセンス鎖の切断部位は、典型的には、５’末端から概ね１０～１２位である。従って、３つの同一の修飾のモチーフは、アンチセンス鎖の５’末端から１番目のヌクレオチドから数えて、又はアンチセンス鎖の５’末端から１番目の二重鎖領域内の対合ヌクレオチドから数えて、アンチセンス鎖の９～１１位；１０～１２位；１１～１３位；１２～１４位；又は１３～１５位に存在し得る。アンチセンス鎖の切断部位もまた、５’末端からの二重鎖領域の長さに応じて変化し得る。
いくつかの実施形態では、キラル修飾ｄｓＲＮＡ剤は、それぞれ１４～３０ヌクレオチドを有するセンス鎖及びアンチセンス鎖を含み、このセンス鎖は、３つの連続するヌクレオチド上に３つの同一の修飾の少なくとも２つのモチーフを含み、モチーフの少なくとも１つが、鎖内の切断部位又はその近傍に存在し、モチーフの少なくとも１つが、切断部位のモチーフから少なくともヌクレオチド１つ離れている鎖の別の部分に存在する。一実施形態では、アンチセンス鎖はまた、３つの連続するヌクレオチド上に３つの同一の修飾の少なくとも１つのモチーフを含み、モチーフの少なくとも１つは、鎖内の切断部位又はその近傍に存在する。センス鎖の切断部位又はその近傍に存在するモチーフの修飾は、アンチセンス鎖の切断部位又はその近傍に存在するモチーフの修飾とは異なる。
いくつかの実施形態では、キラル修飾ｄｓＲＮＡ剤は、それぞれ１４～３０ヌクレオチドを有するセンス鎖及びアンチセンス鎖を含み、このセンス鎖は、３つの連続するヌクレオチド上に３つの２’－Ｆ修飾の少なくとも１つのモチーフを含み、モチーフの少なくとも１つは、鎖の切断部位又はその近傍に存在する。一実施形態では、アンチセンス鎖はまた、切断部位又はその近傍の３つの連続するヌクレオチド上に３つの２’－Ｏ－メチル修飾の少なくとも１つのモチーフを含む。
いくつかの実施形態では、キラル修飾ｄｓＲＮＡ剤は、それぞれ１４～３０ヌクレオチドを有するセンス鎖及びアンチセンス鎖を含み、このセンス鎖は、５’末端から９位、１０位、１１位の３つの連続するヌクレオチド上に３つの２’－Ｆ修飾の少なくとも１つのモチーフを含み、このアンチセンス鎖は、５’末端から１１位、１２位、１３位の３つの連続するヌクレオチド上に３つの２’－Ｏ－メチル修飾の少なくとも１つのモチーフを含む。
いくつかの実施形態では、キラル修飾ｄｓＲＮＡ剤は、以下の特徴：
（ａ）（ｉ）１８～２３ヌクレオチド長；
（ｉｉ）７～１５位の３つの連続する２’－Ｆ修飾を有するセンス鎖；並びに
（ｂ）（ｉ）１８～２３ヌクレオチド長；
（ｉｉ）鎖のどこかの少なくとも２’－Ｆ修飾；及び
（ｉｉｉ）（５’末端から数えて）最初の５つのヌクレオチドにおける少なくとも２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有するアンチセンス鎖、をさらに含み；
キラル修飾ｄｓＲＮＡ剤は、少なくとも１つの鎖の１つ又は複数の位置に結合された１つ又は複数の親油性部分を有し、且つ
キラル修飾ｄｓＲＮＡ剤は、アンチセンス鎖の３’末端に２ヌクレオチドのオーバーハング及びアンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を有するか、又は二重鎖の両末端に２つの平滑末端を有する。
いくつかの実施形態では、キラル修飾ｄｓＲＮＡ剤は、以下の特徴：
（ａ）（ｉ）１８～２３ヌクレオチド長；
（ｉｉ）４つ未満の２’－Ｆ修飾を有するセンス鎖；
（ｂ）（ｉ）１８～２３ヌクレオチド長；
（ｉｉ）１２未満の２’－Ｆ修飾；及び
（ｉｉｉ）（５’末端から数えて）最初の５つのヌクレオチドにおける少なくとも２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有するアンチセンス鎖、をさらに含み；
キラル修飾ｄｓＲＮＡ剤は、少なくとも１つの鎖の１つ又は複数の位置に結合された１つ又は複数の親油性部分を有し、且つ
キラル修飾ｄｓＲＮＡ剤は、アンチセンス鎖の３’末端に２ヌクレオチドのオーバーハング及びアンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を有するか、又は二重鎖の両末端に２つの平滑末端を有する。
いくつかの実施形態では、キラル修飾ｄｓＲＮＡ剤は、以下の特徴：
（ａ）（ｉ）１９～３５ヌクレオチド長；
（ｉｉ）４つ未満の２’－Ｆ修飾を有するセンス鎖；
（ｂ）（ｉ）１９～３５ヌクレオチド長；
（ｉｉ）１２未満の２’－Ｆ修飾；及び
（ｉｉｉ）（５’末端から数えて）最初の５つのヌクレオチドにおける少なくとも２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有するアンチセンス鎖、をさらに含み；
二重鎖領域は、１９～２５（好ましくは、１９、２０、２１、又は２２）塩基対である；
キラル修飾ｄｓＲＮＡ剤は、少なくとも１つの鎖の１つ又は複数の位置に結合された１つ又は複数の親油性部分を有し、且つ
キラル修飾ｄｓＲＮＡ剤は、アンチセンス鎖の３’末端に２ヌクレオチドのオーバーハング及びアンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を有するか、又は二重鎖の両末端に２つの平滑末端を有する。
特定の実施形態では、キラル修飾ｄｓＲＮＡ剤は：
（ａ）（ｉ）２１ヌクレオチド長；
（ｉｉ）３価分岐リンカーを介して付着した３つのＧａｌＮＡｃ誘導体を含む、３’末端に付着したＡＳＧＰＲリガンド；
（ｉｉｉ）（５’末端から数えて）３位、５位、７位、９～１１位、１３位、１７位、１９位、及び２１位の２’－Ｆ修飾、及び２位、４位、６位、８位、１２位、１４～１６位、１８位、及び２０位の２’－ＯＭｅ修飾、及び１位の２’－Ｆ又は２’－ＯＭｅのいずれかでの修飾；及び
（ｉｖ）Ｒｐ配置又はＳｐ配置のいずれかにある結合リン原子を有する、５’末端の１番目のヌクレオチド間結合におけるホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有するセンス鎖；並びに
（ｂ）（ｉ）２３ヌクレオチド長；
（ｉｉ）（５’末端から数えて）１位、３位、５位、９位、１１～１３位、１５位、１７位、１９位、２１位、及び２３位の２’－ＯＭｅ修飾、及び２位、４位、６～８位、１０位、１４位、１６位、１８位、２０位、及び２２位の２’Ｆ修飾；及び
（ｉｉｉ）Ｒｐ配置にある結合リン原子を有する、５’末端の１番目のヌクレオチド間結合におけるホスホロチオエートヌクレオチド間結合、及びＳｐ配置にある結合リン原子を有する、３’末端の１番目のヌクレオチド間結合におけるホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有するアンチセンス鎖、を含み；
キラル修飾ｄｓＲＮＡ剤は、アンチセンス鎖の３’末端に２ヌクレオチドのオーバーハング、及びアンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を有する。
別の特定の実施形態では、本発明のキラル修飾ｄｓＲＮＡ剤は：
（ａ）（ｉ）２１ヌクレオチド長；
（ｉｉ）３価分岐リンカーを介して付着した３つのＧａｌＮＡｃ誘導体を含む、３’末端に付着したＡＳＧＰＲリガンド；
（ｉｉｉ）（５’末端から数えて）３位、５位、７位、９～１１位、１３位、１５位、１７位、１９位、及び２１位の２’－Ｆ修飾、及び２位、４位、６位、８位、１２位、１４位、１６位、１８位、及び２０位の２’－ＯＭｅ修飾、及び１位の２’－Ｆ又は２’－ＯＭｅのいずれかでの修飾；及び
（ｉｖ）Ｒｐ配置又はＳｐ配置又はラセミのいずれかにある結合リン原子を有する、５’末端の１番目のヌクレオチド間結合におけるホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有するセンス鎖；並びに
（ｂ）（ｉ）２３ヌクレオチド長；
（ｉｉ）（５’末端から数えて）１位、３位、５位、７位、９位、１１～１３位、１５位、１７位、１９位、及び２１～２３位の２’－ＯＭｅ修飾、及び２位、４位、６位、８位、１０位、１４位、１６位、１８位、及び２０位の２’Ｆ修飾；及び
（ｉｉｉ）Ｒｐ配置にある結合リン原子を有する、５’末端の１番目のヌクレオチド間結合におけるホスホロチオエートヌクレオチド間結合、及びＳｐ配置にある結合リン原子を有する、３’末端の１番目のヌクレオチド間結合におけるホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有するアンチセンス鎖、を含み；
キラル修飾ｄｓＲＮＡ剤は、アンチセンス鎖の３’末端に２ヌクレオチドのオーバーハング、及びアンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を有する。
別の特定の実施形態では、キラル修飾ｄｓＲＮＡ剤は：
（ａ）（ｉ）２１ヌクレオチド長；
（ｉｉ）３価分岐リンカーを介して付着した３つのＧａｌＮＡｃ誘導体を含む、３’末端に付着したＡＳＧＰＲリガンド；
（ｉｉｉ）（５’末端から数えて）１～６位、８位、１０位、及び１２～２１位の２’－ＯＭｅ修飾、７位及び９位の２’－Ｆ修飾、及び１１位のデオキシヌクレオチド（例えば、ｄＴ）；及び
（ｉｖ）Ｒｐ配置又はＳｐ配置又はラセミのいずれかにある結合リン原子を有する、５’末端の１番目のヌクレオチド間結合におけるホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有するセンス鎖；並びに
（ｂ）（ｉ）２３ヌクレオチド長；
（ｉｉ）（５’末端から数えて）１位、３位、７位、９位、１１位、１３位、１５位、１７位、及び１９～２３位の２’－ＯＭｅ修飾、及び２位、４～６位、８位、１０位、１２位、１４位、１６位、及び１８位の２’－Ｆ修飾；及び
（ｉｉｉ）Ｒｐ配置にある結合リン原子を有する、５’末端の１番目のヌクレオチド間結合におけるホスホロチオエートヌクレオチド間結合、及びＳｐ配置にある結合リン原子を有する、３’末端の１番目のヌクレオチド間結合におけるホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有するアンチセンス鎖、を含み；
キラル修飾ｄｓＲＮＡ剤は、アンチセンス鎖の３’末端に２ヌクレオチドのオーバーハング、及びアンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を有する。
別の特定の実施形態では、キラル修飾ｄｓＲＮＡ剤は：
（ａ）（ｉ）２１ヌクレオチド長；
（ｉｉ）３価分岐リンカーを介して付着した３つのＧａｌＮＡｃ誘導体を含む、３’末端に付着したＡＳＧＰＲリガンド；
（ｉｉｉ）１～６位、８位、１０位、１２位、１４位、及び１６～２１位の２’－ＯＭｅ修飾、及び７位、９位、１１位、１３位、及び１５位の２’－Ｆ修飾；及び
（ｉｖ）Ｒｐ配置又はＳｐ配置又はラセミのいずれかにある結合リン原子を有する、５’末端の１番目のヌクレオチド間結合におけるホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有するセンス鎖；並びに
（ｂ）（ｉ）２３ヌクレオチド長；
（ｉｉ）（５’末端から数えて）１位、５位、７位、９位、１１位、１３位、１５位、１７位、１９位、及び２１～２３位の２’－ＯＭｅ修飾、及び２～４位、６位、８位、１０位、１２位、１４位、１６位、１８位、及び２０位の２’－Ｆ修飾；及び
（ｉｉｉ）Ｒｐ配置にある結合リン原子を有する、５’末端の１番目のヌクレオチド間結合におけるホスホロチオエートヌクレオチド間結合、及びＳｐ配置にある結合リン原子を有する、３’末端の１番目のヌクレオチド間結合におけるホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有するアンチセンス鎖、を含み；
キラル修飾ｄｓＲＮＡ剤は、アンチセンス鎖の３’末端に２ヌクレオチドのオーバーハング、及びアンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を有する。
別の特定の実施形態では、キラル修飾ｄｓＲＮＡ剤は：
（ａ）（ｉ）２１ヌクレオチド長；
（ｉｉ）３価分岐リンカーを介して付着した３つのＧａｌＮＡｃ誘導体を含む、３’末端に付着したＡＳＧＰＲリガンド；
（ｉｉｉ）１～９位及び１２～２１位の２’－ＯＭｅ修飾、及び１０位及び１１位の２’－Ｆ修飾：
（ｉｖ）Ｒｐ配置又はＳｐ配置又はラセミのいずれかにある結合リン原子を有する、５’末端の１番目のヌクレオチド間結合におけるホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有するセンス鎖；並びに
（ｂ）（ｉ）２３ヌクレオチド長；
（ｉｉ）（５’末端から数えて）１位、３位、５位、７位、９位、１１～１３位、１５位、１７位、１９位、及び２１～２３位の２’－ＯＭｅ修飾、及び２位、４位、６位、８位、１０位、１４位、１６位、１８位、及び２０位の２’－Ｆ修飾；及び
（ｉｉｉ）Ｒｐ配置にある結合リン原子を有する、５’末端の１番目のヌクレオチド間結合におけるホスホロチオエートヌクレオチド間結合、及びＳｐ配置にある結合リン原子を有する、３’末端の１番目のヌクレオチド間結合におけるホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有するアンチセンス鎖、を含み；
キラル修飾ｄｓＲＮＡ剤は、アンチセンス鎖の３’末端に２ヌクレオチドのオーバーハング、及びアンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を有する。
別の特定の実施形態では、キラル修飾ｄｓＲＮＡ剤は：
（ａ）（ｉ）２１ヌクレオチド長；；
（ｉｉ）３価分岐リンカーを介して付着した３つのＧａｌＮＡｃ誘導体を含む、３’末端に付着したＡＳＧＰＲリガンド；
（ｉｉｉ）３位、５位、７位、９～１１位、及び１３位の２’－Ｆ修飾、及び２位、４位、６位、８位、１２位、及び１４～２１位の２’－ＯＭｅ修飾、及び１位の２’－Ｆ又は２’－ＯＭｅのいずれかでの修飾；及び
（ｉｖ）Ｒｐ配置又はＳｐ配置又はラセミのいずれかにある結合リン原子を有する、５’末端の１番目のヌクレオチド間結合におけるホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有するセンス鎖；並びに
（ｂ）（ｉ）２３ヌクレオチド長；
（ｉｉ）（５’末端から数えて）１位、３位、５～７位、９位、１１～１３位、１５位、１７～１９位、及び２１～２３位の２’－ＯＭｅ修飾、及び２位、４位、８位、１０位、１４位、１６位、及び２０位の２’－Ｆ修飾；及び
（ｉｉｉ）Ｒｐ配置にある結合リン原子を有する、５’末端の１番目のヌクレオチド間結合におけるホスホロチオエートヌクレオチド間結合、及びＳｐ配置にある結合リン原子を有する、３’末端の１番目のヌクレオチド間結合におけるホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有するアンチセンス鎖、を含み；
キラル修飾ｄｓＲＮＡ剤は、アンチセンス鎖の３’末端に２ヌクレオチドのオーバーハング、及びアンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を有する。
別の特定の実施形態では、キラル修飾ｄｓＲＮＡ剤は：
（ａ）（ｉ）２１ヌクレオチド長；
（ｉｉ）３価分岐リンカーを介して付着した３つのＧａｌＮＡｃ誘導体を含む、３’末端に付着したＡＳＧＰＲリガンド；
（ｉｉｉ）１位、２位、４位、６位、８位、１２位、１４位、１５位、１７位、及び１９～２１位の２’－ＯＭｅ修飾、及び３位、５位、７位、９～１１位、１３位、１６位、及び１８位の２’－Ｆ修飾；及び
（ｉｖ）Ｒｐ配置又はＳｐ配置又はラセミのいずれかにある結合リン原子を有する、５’末端の１番目のヌクレオチド間結合におけるホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有するセンス鎖；並びに
（ｂ）（ｉ）２５ヌクレオチド長；
（ｉｉ）（５’末端から数えて）１位、４位、６位、７位、９位、１１～１３位、１５位、１７位、及び１９～２３位の２’－ＯＭｅ修飾、２位、３位、５位、８位、１０位、１４位、１６位、及び１８位の２’－Ｆ修飾、及び２４位及び２５位のデオキシヌクレオチド（例えば、ｄＴ）；並びに
（ｉｉｉ）Ｒｐ配置にある結合リン原子を有する、５’末端の１番目のヌクレオチド間結合におけるホスホロチオエートヌクレオチド間結合、及びＳｐ配置にある結合リン原子を有する、３’末端の１番目のヌクレオチド間結合におけるホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有するアンチセンス鎖、を含み；
キラル修飾ｄｓＲＮＡ剤は、アンチセンス鎖の３’末端に４ヌクレオチドのオーバーハング、及びアンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を有する。
別の特定の実施形態では、キラル修飾ｄｓＲＮＡ剤は：
（ａ）（ｉ）２１ヌクレオチド長；
（ｉｉ）３価分岐リンカーを介して付着した３つのＧａｌＮＡｃ誘導体を含む、３’末端に付着したＡＳＧＰＲリガンド；
（ｉｉｉ）１～６位、８位、１２～２１位の２’－ＯＭｅ修飾、及び７位及び９～１１位の２’－Ｆ修飾；及び
（ｉｖ）Ｒｐ配置又はＳｐ配置又はラセミのいずれかにある結合リン原子を有する、５’末端の１番目のヌクレオチド間結合におけるホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有するセンス鎖；並びに
（ｂ）（ｉ）２３ヌクレオチド長；
（ｉｉ）（５’末端から数えて）１位、３～５位、７位、８位、１０～１３位、１５位、及び１７～２３位の２’－ＯＭｅ修飾、及び２位、６位、９位、１４位、及び１６位の２’－Ｆ修飾；及び
（ｉｉｉ）Ｒｐ配置にある結合リン原子を有する、５’末端の１番目のヌクレオチド間結合におけるホスホロチオエートヌクレオチド間結合、及びＳｐ配置にある結合リン原子を有する、３’末端の１番目のヌクレオチド間結合におけるホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有するアンチセンス鎖、を含み；
キラル修飾ｄｓＲＮＡ剤は、アンチセンス鎖の３’末端に２ヌクレオチドのオーバーハング、及びアンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を有する。
別の特定の実施形態では、キラル修飾ｄｓＲＮＡ剤は：
（ａ）（ｉ）２１ヌクレオチド長；
（ｉｉ）３価分岐リンカーを介して付着した３つのＧａｌＮＡｃ誘導体を含む、３’末端に付着したＡＳＧＰＲリガンド；
（ｉｉｉ）１～６位、８位、及び１２～２１位の２’－ＯＭｅ修飾、及び７位及び９～１１位の２’－Ｆ修飾；及び
（ｉｖ）Ｒｐ配置又はＳｐ配置又はラセミのいずれかにある結合リン原子を有する、５’末端の１番目のヌクレオチド間結合におけるホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有するセンス鎖；並びに
（ｂ）（ｉ）２３ヌクレオチド長；
（ｉｉ）（５’末端から数えて）１位、３～５位、７位、１０～１３位、１５位、及び１７～２３位の２’－ＯＭｅ修飾、及び２位、６位、８位、９位、１４位、及び１６位の２’－Ｆ修飾；及び
（ｉｉｉ）Ｒｐ配置にある結合リン原子を有する、５’末端の１番目のヌクレオチド間結合におけるホスホロチオエートヌクレオチド間結合、及びＳｐ配置にある結合リン原子を有する、３’末端の１番目のヌクレオチド間結合におけるホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有するアンチセンス鎖、を含み；
キラル修飾ｄｓＲＮＡ剤は、アンチセンス鎖の３’末端に２ヌクレオチドのオーバーハング、及びアンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を有する。
別の特定の実施形態では、キラル修飾ｄｓＲＮＡ剤は：
（ａ）（ｉ）１９ヌクレオチド長；
（ｉｉ）３価分岐リンカーを介して付着した３つのＧａｌＮＡｃ誘導体を含む、３’末端に付着したＡＳＧＰＲリガンド；
（ｉｉｉ）１～４位、６位、及び１０～１９位の２’－ＯＭｅ修飾、及び５位及び７～９位の２’－Ｆ修飾；及び
（ｉｖ）Ｒｐ配置又はＳｐ配置又はラセミのいずれかにある結合リン原子を有する、５’末端の１番目のヌクレオチド間結合におけるホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有するセンス鎖；並びに
（ｂ）（ｉ）２１ヌクレオチド長；
（ｉｉ）（５’末端から数えて）１位、３～５位、７位、１０～１３位、１５位、及び１７～２１位の２’－ＯＭｅ修飾、及び２位、６位、８位、９位、１４位、及び１６位の２’－Ｆ修飾；及び
（ｉｉｉ）Ｒｐ配置にある結合リン原子を有する、５’末端の１番目のヌクレオチド間結合におけるホスホロチオエートヌクレオチド間結合、及びＳｐ配置にある結合リン原子を有する、３’末端の１番目のヌクレオチド間結合におけるホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有するアンチセンス鎖、を含む；
キラル修飾ｄｓＲＮＡ剤は、アンチセンス鎖の３’末端に２ヌクレオチドのオーバーハング、及びアンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を有する。
一実施形態では、本明細書に記載のキラル修飾ｄｓＲＮＡ剤は、ｄｓＲＮＡ二重鎖中に少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は少なくとも３つの熱不安定化修飾をさらに含む。一実施形態では、少なくとも１つの熱不安定化修飾は、アンチセンス鎖のシード領域にある。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のキラル修飾ｄｓＲＮＡ剤は、以下の基準の１つ又は複数を含む：
１．低いＧＣ含量、好ましくは約３０～５２％。
２．アンチセンス鎖上のｄｓＲＮＡの１５～１９位にある少なくとも２つ、好ましくは少なくとも３つのＡ又はＵ塩基。
３．センス鎖の１９位のＡ塩基。
４．センス鎖の３位のＡ塩基。
５．センス鎖の１０位のＵ塩基。
６．センス鎖の１４位のＡ塩基。
７．センス鎖の１９位のＣ以外の塩基。
８．センス鎖の１３位のＧ以外の塩基。
９．Ｔｍは、５０℃超、３７℃超、３０℃超、又は２０℃超で不安定であり得る、ｄｓＲＮＡ二重鎖の一方の鎖の分子間又は分子内構造をもたらす内部反復の特性を指す。
１０．センス鎖の５位のＵ以外の塩基。
１１．センス鎖の１１位のＡ以外の塩基。
一実施形態では、キラル修飾ｄｓＲＮＡ剤は、上記の基準の少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、少なくとも１０つ、又はすべてを含む。
本発明の別の態様は、標的遺伝子の発現を阻害することができるキラル修飾ｄｓＲＮＡ剤に関する。キラル修飾ｄｓＲＮＡ剤は、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、各鎖は１４～４０ヌクレオチドを有する。キラル修飾ｄｓＲＮＡ剤は、上記のような３つ以上の部位特異的（例えば、末端の）キラル修飾ヌクレオチド間結合を含む。センス鎖は、５’末端に向いた１つ又は複数の部位特異的（例えば、末端の）キラル修飾ヌクレオチド間結合を含む。アンチセンス鎖は、５’末端に向いた１つ又は複数の部位特異的（例えば、末端の）キラル修飾ヌクレオチド間結合、及び３’末端に向いた１つ又は複数の部位特異的（例えば、末端の）キラル修飾ヌクレオチド間結合を含む。センス鎖及びアンチセンス鎖は、５’末端に向いたキラル結合及び３’末端に向いたキラル結合又はそれらの組み合わせ以外の内部の位置に１つ又は複数のキラル修飾ヌクレオチド間結合を含む。
部位特異的（例えば、末端の）キラル修飾ヌクレオチド間結合に関するキラル修飾ｄｓＲＮＡ剤の第１の態様において上述された各実施形態は、本発明のこの態様に適用される。
一実施形態では、キラル修飾ｄｓＲＮＡ剤のセンス鎖は、センス鎖の切断部位にエンドヌクレアーゼ感受性修飾ヌクレオチドをさらに含む。一例では、エンドヌクレアーゼ感受性修飾ヌクレオチドは、センス鎖の５’末端から１１位にある。
一実施形態では、キラル修飾ｄｓＲＮＡ剤のアンチセンス鎖は、２’－ＯＭｅ修飾の立体バルク（ｓｔｅｒｉｃ ｂｕｌｋ）以下の立体バルクをヌクレオチドに提供する３番目の修飾ヌクレオチドをさらに含み、この３番目の修飾ヌクレオチドは、アンチセンス鎖の５’末端から６～１０位にある。例えば、３番目の修飾ヌクレオチドは、アンチセンス鎖の５’末端から１０位にある。
本発明はさらに、標的遺伝子の発現を阻害するための、本明細書で定義されるキラル修飾ｄｓＲＮＡ剤の使用に関する。一実施形態では、本明細書で定義されるキラル修飾ｄｓＲＮＡ剤は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで標的遺伝子の発現を阻害するために使用される。
本発明はさらに、ｉｎ ｖｉｖｏでの対象における標的遺伝子の発現の阻害に使用するための、本明細書で定義されるキラル修飾ｄｓＲＮＡ剤に関する。対象は、任意の動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはマウス、ラット、ヒツジ、ウシ、イヌ、ネコ、又はヒトであり得る。
一態様では、本発明は、本明細書で定義されるキラル修飾ｄｓＲＮＡ剤、及び薬学的に許容される担体又は賦形剤を含む医薬組成物に関する。
別の態様では、本発明は、対象における標的遺伝子の発現を阻害するための方法を提供し、この方法は、本明細書で定義されるキラル修飾ｄｓＲＮＡ剤を、標的遺伝子の発現を阻害するのに十分な量で対象に投与する工程を含む。キラル修飾ｄｓＲＮＡ剤は、皮下投与又は静脈内投与により投与することができる。
本発明の別の態様は、皮下投与又は静脈内投与によって対象の特定の標的にｄｓＲＮＡ剤を送達するための方法を提供する。
分析ＩＥＸクロマトグラフィーでのセンス鎖及びアンチセンス鎖のＰＳジアステレオマーＤＭＴの分離：（ａ）１ＰＳセンス鎖のＲｐ／Ｓｐ及び２ＰＳアンチセンス鎖の４つすべてのジアステレオマー。 ホスホロチオエート（ＰＳ）ジヌクレオチドジアステレオマーの合成及び分離：（ａ）ホスホラミダイトカップリング、ＰＳ結合への硫化、ホスホロチオエートジヌクレオチドジアステレオマーの分離、及びキラル純粋ＰＳ－ジヌクレオチドホスホラミダイトビルディングブロックの合成、（ｂ）ジアステレオマーの分離後のジヌクレオチドの薄層クロマトグラム：上部スポット＝速く溶出するジアステレオマー、ｍｉｘ＝上部スポットと下部スポットの共スポット、下部スポット＝遅く溶出するジアステレオマー（小文字のｕ、ａ、ｇ＝２’ＯＭｅヌクレオシド、小文字のｓ＝ＰＳ結合、大文字＋ｆ＝２’Ｆ－ヌクレオシド）。 ｍｒＴＴＲ及びＣ５におけるｉｎ ｖｉｔｒｏ自由取り込みＩＣ５０値。 キラル的に純粋な１ＰＳ化合物のＲＩＳＣローディングデータ。ＰＳ番号：ｓｉ１９；Ｒ＠１－２：ｓｉ２０；Ｓ＠１－２：ｓｉ２１；Ｒ＠２２－２３：ｓｉ２２；Ｓ＠２２－２３：ｓｉ２３。 キラル的に純粋な３ＰＳ修飾化合物のＲＩＳＣローディングデータ。 ９量体ＲＮＡ配列５’－ＣＧＵ ＧＡ５Ｃ６Ｕ７Ｃ８Ｕ９－３’を有するｈＡｇｏｌ ＰＡＺの結晶構造。 ｉｎ ｖｉｖｏ ｍｒＴＴＲサイレンシングの結果。 ｉｎ ｖｉｖｏ Ｃ５サイレンシングの結果。 ｓｉＲＮＡ肝臓レベル（ａ）及びＡｇｏ２ローディング（ｂ）。 キラル純粋ホスホロチオエートジヌクレオチドＵＯＭｅ ｓＵＯＭｅの逆相ＨＰＬＣプロフィール（ＴＬＣ上部スポット）；上部：対照：下部：ＳＶＰＤＥとのインキュベーションの４８時間後。 キラル純粋ホスホロチオエートジヌクレオチドＵＯＭｅ ｓＵＦの逆相ＨＰＬＣプロフィール（ＴＬＣ上部スポット）：上部：対照：下部：ＳＶＰＤＥとのインキュベーションの４８時間後。 キラル純粋ホスホロチオエートジヌクレオチドＵＦ ｓＵＯＭｅの逆相ＨＰＬＣプロフィール（ＴＬＣ上部スポット）：上部：対照：下部：ＳＶＰＤＥとのインキュベーションの４８時間後。 キラル純粋ホスホロチオエートジヌクレオチドＡＯＭｅ ｓＡＯＭｅの逆相ＨＰＬＣプロフィール（ＴＬＣ上部スポット）：上部：対照：下部：ＳＶＰＤＥとのインキュベーションの４８時間後。 キラル純粋ホスホロチオエートジヌクレオチドＡＦ ｓＡＯＭｅの逆相ＨＰＬＣプロフィール（ＴＬＣ上部スポット）：上部：対照：下部：ＳＶＰＤＥとのインキュベーションの４８時間後。 キラル純粋ホスホロチオエートジヌクレオチドＡＯＭｅ ｓＵＦの逆相ＨＰＬＣプロフィール（ＴＬＣ上部スポット）：上部：対照：下部：ＳＶＰＤＥとのインキュベーションの４８時間後。 キラル純粋ホスホロチオエートジヌクレオチドＧＯＭｅ ｓＡＯＭｅの逆相ＨＰＬＣプロフィール（ＴＬＣ上部スポット）：上部：対照：下部：ＳＶＰＤＥとのインキュベーションの４８時間後。 キラル純粋ホスホロチオエートジヌクレオチドＵＯＭｅ ｓＵＯＭｅの逆相ＨＰＬＣプロフィール（ＴＬＣ下部スポット）：上部：対照：下部：ＳＶＰＤＥとのインキュベーションの４８時間後。 キラル純粋ホスホロチオエートジヌクレオチドＵＯＭｅ ｓＵＦの逆相ＨＰＬＣプロフィール（ＴＬＣ下部スポット）：上部：対照：下部：ＳＶＰＤＥとのインキュベーションの４８時間後。 キラル純粋ホスホロチオエートジヌクレオチドＵＦ ｓＵＯＭｅの逆相ＨＰＬＣプロフィール（ＴＬＣ下部スポット）：上部：対照：下部：ＳＶＰＤＥとのインキュベーションの４８時間後。 キラル純粋ホスホロチオエートジヌクレオチドＡＯＭｅ ｓＡＯＭｅの逆相ＨＰＬＣプロフィール（ＴＬＣ下部スポット）：上部：対照：下部：ＳＶＰＤＥとのインキュベーションの４８時間後。 キラル純粋ホスホロチオエートジヌクレオチドＵＦ ｓＡＯＭｅの逆相ＨＰＬＣプロフィール（ＴＬＣ下部スポット）：上部：対照：下部：ＳＶＰＤＥとのインキュベーションの４８時間後。 キラル純粋ホスホロチオエートジヌクレオチドＡＯＭｅ ｓＵＦの逆相ＨＰＬＣプロフィール（ＴＬＣ下部スポット）：上部：対照：下部：ＳＶＰＤＥとのインキュベーションの４８時間後。 キラル純粋ホスホロチオエートジヌクレオチドＧＯＭｅ ｓＡＯＭｅの逆相ＨＰＬＣプロフィール（ＴＬＣ下部スポット）：上部：対照：下部：ＳＶＰＤＥとのインキュベーションの４８時間後。 ４８時間の反応時間後のキラル純粋ホスホロチオエートジヌクレオチドＵＯＭｅ ｓＵＯＭｅの逆相ＨＰＬＣプロフィール（ＴＬＣ上部スポット）：上部：対照：下部：ＰＤＩＩとのインキュベーションの４８時間後。 ５日間の反応時間後のキラル純粋ホスホロチオエートジヌクレオチドＵＯＭｅ ｓＵＯＭｅの逆相ＨＰＬＣプロフィール（ＴＬＣ上部スポット）：上部：対照：下部：ＰＤＩＩとのインキュベーションの５日後。 ４８時間の反応時間後のキラル純粋ホスホロチオエートジヌクレオチドＵＯＭｅ ｓＵＦの逆相ＨＰＬＣプロフィール（ＴＬＣ上部スポット）：上部：対照：下部：ＰＤＩＩとのインキュベーションの４８時間後。 ５日間の反応時間後のキラル純粋ホスホロチオエートジヌクレオチドＵＯＭｅ ｓＵＦの逆相ＨＰＬＣプロフィール（ＴＬＣ上部スポット）：上部：対照：下部：ＰＤＩＩとのインキュベーションの５日後。 ４８時間の反応時間後のキラル純粋ホスホロチオエートジヌクレオチドＵＦ ｓＵＯＭｅの逆相ＨＰＬＣプロフィール（ＴＬＣ上部スポット）：上部：対照：下部：ＰＤＩＩとのインキュベーションの４８時間後。 ４８時間の反応時間後のキラル純粋ホスホロチオエートジヌクレオチドＡＯＭｅ ｓＡＯＭｅの逆相ＨＰＬＣプロフィール（ＴＬＣ上部スポット）：上部：対照：下部：ＰＤＩＩとのインキュベーションの４８時間後。 ４８時間の反応時間後のキラル純粋ホスホロチオエートジヌクレオチドＡＦ ｓＡＯＭｅの逆相ＨＰＬＣプロフィール（ＴＬＣ上部スポット）：上部：対照：下部：ＰＤＩＩとのインキュベーションの４８時間後。 ４８時間の反応時間後のキラル純粋ホスホロチオエートジヌクレオチドＡＯＭｅ ｓＵＦの逆相ＨＰＬＣプロフィール（ＴＬＣ上部スポット）：上部：対照：下部：ＰＤＩＩとのインキュベーションの４８時間後。 ４８時間の反応時間後のキラル純粋ホスホロチオエートジヌクレオチドＧＯＭｅ ｓＡＯＭｅの逆相ＨＰＬＣプロフィール（ＴＬＣ上部スポット）：上部：対照：下部：ＰＤＩＩとのインキュベーションの４８時間後。 ５日間の反応時間後のキラル純粋ホスホロチオエートジヌクレオチドＧＯＭｅ ｓＡＯＭｅの逆相ＨＰＬＣプロフィール（ＴＬＣ上部スポット）：上部：対照：下部：ＰＤＩＩとのインキュベーションの５日後。 ４８時間の反応時間後のキラル純粋ホスホロチオエートジヌクレオチドＵＯＭｅ ｓＵＯＭｅの逆相ＨＰＬＣプロフィール（ＴＬＣ下部スポット）：上部：対照：下部：ＰＤＩＩとのインキュベーションの４８時間後。 ５日間の反応時間後のキラル純粋ホスホロチオエートジヌクレオチドＵＯＭｅ ｓＵＯＭｅの逆相ＨＰＬＣプロフィール（ＴＬＣ下部スポット）：上部：対照：下部：ＰＤＩＩとのインキュベーションの５日後。 ４８時間の反応時間後のキラル純粋ホスホロチオエートジヌクレオチドＵＯＭｅ ｓＵＦの逆相ＨＰＬＣプロフィール（ＴＬＣ下部スポット）：上部：対照：下部：ＰＤＩＩとのインキュベーションの４８時間後。 ５日間の反応時間後のキラル純粋ホスホロチオエートジヌクレオチドＵＯＭｅ ｓＵＦの逆相ＨＰＬＣプロフィール（ＴＬＣ下部スポット）：上部：対照：下部：ＰＤＩＩとのインキュベーションの５日後。 ４８時間の反応時間後のキラル純粋ホスホロチオエートジヌクレオチドＵＦ ｓＵＯＭｅの逆相ＨＰＬＣプロフィール（ＴＬＣ下部スポット）：上部：対照：下部：ＰＤＩＩとのインキュベーションの４８時間後。 ４８時間の反応時間後のキラル純粋ホスホロチオエートジヌクレオチドＡＯＭｅ ｓＡＯＭｅの逆相ＨＰＬＣプロフィール（ＴＬＣ下部スポット）：上部：対照：下部：ＰＤＩＩとのインキュベーションの４８時間後。 ４８時間の反応時間後のキラル純粋ホスホロチオエートジヌクレオチドＡＦ ｓＡＯＭｅの逆相ＨＰＬＣプロフィール（ＴＬＣ下部スポット）：上部：対照：下部：ＰＤＩＩとのインキュベーションの４８時間後。 ４８時間の反応時間後のキラル純粋ホスホロチオエートジヌクレオチドＡＯＭｅ ｓＵＦの逆相ＨＰＬＣプロフィール（ＴＬＣ下部スポット）：上部：対照：下部：ＰＤＩＩとのインキュベーションの４８時間後。 ４８時間の反応時間後のキラル純粋ホスホロチオエートジヌクレオチドＧＯＭｅ ｓＡＯＭｅの逆相ＨＰＬＣプロフィール（ＴＬＣ下部スポット）：上部：対照：下部：ＰＤＩＩとのインキュベーションの４８時間後。 ５日間の反応時間後のキラル純粋ホスホロチオエートジヌクレオチドＧＯＭｅ ｓＡＯＭｅの逆相ＨＰＬＣプロフィール（ＴＬＣ下部スポット）：上部：対照：下部：ＰＤＩＩとの反応。 イオン交換分離中の２’－Ｆセンス鎖の異性体溶出プロフィール。Ｒｐ異性体は、ＤＭＴ－オンでのＳｐ異性体よりも後に溶出し（上部）、ＤＭＴが除去されるとこのＳｐよりも早く溶出した（下部）。 イオン交換分離中の２’－ＯＭｅセンス鎖の異性体溶出プロフィール。Ｒｐ異性体は、ＤＭＴ－オンでのＳｐ異性体よりも後に溶出し（上部）、ＤＭＴが除去されるとより早く溶出した（下部）。 ５’末端配置のみが異なる粗ＤＭＴ－オンのアンチセンス鎖の混合物のイオン交換分析の結果。両方の混合化合物の３’末端配置は、Ｒｐ（上部）又はＳｐ（下部）のいずれかであった。最初に溶出した異性体をＳｐと呼ぶことにした。 ５’末端配置のみが異なる粗ＤＭＴ－オフのアンチセンス鎖の混合物のイオン交換分析の結果。両方の混合化合物の３’末端配置は、Ｒｐ（上部）又はＳｐ（下部）のいずれかであった。これらの条件下で異性体を共溶出した。 示されたオリゴヌクレオチドのＳＶＰＤ分解プロフィール。 Ａ－１５６８２０及びＡ－１５６８２１のイオン交換分析の結果。上述の比率で混合した後のイオン交換分析中の精製Ｃ５ ２’ＯＭｅセンス鎖の異性体溶出。 ３’末端配置のみが異なる精製ＤＭＴ－オフのアンチセンス鎖の混合物のイオン交換分析の結果。５’末端配置は、Ｒｐ（上部）又はＳｐ（下部）であった。最初に溶出した異性体をＲｐと呼ぶことにした。 Ｓｐと決定された、５５．０５ｐｐｍに共鳴ピークを示すセンス鎖Ａ－１５６８２０の３１Ｐ－ＮＭＲ。 Ｒｐと決定された、５７．２８ｐｐｍに共鳴ピークを示すセンス鎖Ａ－１５６８２１の３１Ｐ－ＮＭＲ。 Ｒｐ－ＲＰと決定された、アンチセンス鎖Ａ－１５６８２２．Ａ－１５６８２２の３１Ｐ－ＮＭＲ。 Ｒｐ－Ｓｐと決定された、アンチセンス鎖Ａ－１５６８２３の３１Ｐ－ＮＭＲ。 Ｓｐ－ＲＰと決定された、アンチセンス鎖Ａ－１５６８２４の３１Ｐ－ＮＭＲ。 Ｓｐ－Ｓｐと決定された、アンチセンス鎖Ａ－ｌ５６８２５の３１Ｐ－ＮＭＲ。 ＤＭＴ－オフ（左側）及びＤＭＴ－オンの（右側）Ａ－１２２６２５のイオン交換分離の結果。 粗異性体混合物からの異性体の陰イオン交換精製の結果。 イオン交換クロマトグラフィーによるＤＭＴの除去前（左側の列）及び除去後（右側の列）に分析された画分プール。 Ａ－１２２６２５の異性体のＩＥＸ分析。 ＤＭＴ－オンの粗Ａ－１４１３８１及びＡ－１４１３８２のイオン交換クロマトグラム。 Ａ－１４１３８１及びＡ－１４１３８２のＰＳ異性体の分離を示すクロマトグラムの結果。 ｐＨ１１陰イオン交換分析（１６分で３１～５７％、１ｍＬ／分、Ｄｉｏｎｅｘ ＤＮＡＰａｃ ＰＡ２００ ４ｍｍ×２５０ｍｍカラムを使用）による、センス鎖Ａ－１４１３８１の異性体の最終純度。 ｐＨ１１ ＩＥＸ（１６分で３１～５７％、１ｍＬ／分、Ｄｉｏｎｅｘ ＤＮＡＰａｃ ＰＡ２００ ４ｍｍ×２５０ｍｍカラムを使用）によるＡ－１４１３８２の分析。 ＤＭＴ－オフのＡ－１２２６２５のイオン交換分析の結果。 Ａ－１２２６２５の４つのジアステレオマーのピーク分解能を示す、ＤＭＴ－オンのＡ－１２２６２５のイオン交換分析の結果。 異性体２（５’Ｓ－３’Ｓ）の３１Ｐ－ＮＭＲスペクトル。 異性体３（５’Ｒ－３’Ｒ）の３１Ｐ－ＮＭＲスペクトル。 異性体４（５’Ｒ－３’Ｓ）の３１Ｐ－ＮＭＲスペクトル。 ４つすべての異性体を含む混合物の３１Ｐ－ＮＭＲスペクトル。 ＳＶＰＤの存在下での時間の関数としての完全長Ａ－１２２６１５。 ＤＭＴ－オンのＡ－１４１３８１及びＡ－１４１３８２のイオン交換クロマトグラフィーの結果。 Ａ－１４１３８１の異性体の３１Ｐ－ＮＭＲスペクトルの結果。異性体１（ＳＰ）。 Ａ－１４１３８１の異性体の３１Ｐ－ＮＭＲスペクトルの結果。異性体２（Ｒｐ）。 Ａ－１４１３８２の異性体の３１Ｐ－ＮＭＲスペクトル。異性体１（Ｓｐ）。 Ａ－１４１３８２の異性体の３１Ｐ－ＮＭＲスペクトル。異性体２（Ｒｐ）。 ＤＭＴ－オフのＡ－１４１３８１及びＡ－１４１３８２のイオン交換クロマトグラフィーの結果。 ｍｒＴＴＲ ＥＬＦ Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ ＩＣ５０－自由取り込み及びトランスフェクション。３’末端にＳｐＳｐを有する化合物は、ｉｎ ｖｉｖｏの結果と一致して、最高の活性を示す。図面のＲ及びＳの表示は、結合リン原子のＲｐ配置及びＳｐ配置を表し；ラセミを表す。 ｍ／ｒＴＴＲ ＥＬＦ ３ＰＳキラル純粋対照の有効性及び持続時間。Ｒｐ／Ｒｐ－Ｓｐ及びＳｐ／Ｒｐ－Ｓｐは６ＰＳ ｍｉｘと同程度の活性であり、どちらもより良い持続時間を有する。Ｓｐ／Ｒｐ－ＳｐはＲｐ／Ｒｐ－Ｓｐよりも優れている。図面のＲ及びＳの表示は、結合リン原子のＲｐ配置及びＳｐ配置を表し；ｍｉｘはラセミを表す。 内部３’末端ＡＳ位置に追加のキラルＰＳを有する化合物の有効性及び持続時間。３’ＳｐＳｐキラリティーを有するキラル純粋４ＰＳは、６ＰＳ ｍｉｘ及びＲｐ／Ｒｐ－Ｓｐキラル純粋対照よりもかなり活性が高い。内部３’ＡＳ位置にＲｐ配置を追加しても、Ｒｐ／Ｒｐ－Ｓｐを超える改善はなかった。図面のＲ及びＳの表示は、結合リン原子のＲｐ配置及びＳｐ配置を表し；ｍｉｘはラセミを表す。 内部５’末端ＡＳ位置に追加のキラルＰＳを有する化合物の有効性及び持続時間。５’ＲｐＲｐ又はＲｐＳｐキラリティーを有するキラル純粋４ＰＳは、６ＰＳ ｍｉｘ（又はＲｐ／Ｒｐ－Ｓｐキラル純粋対照）を超えて活性を改善しない。図面のＲ及びＳの表示は、結合リン原子のＲｐ配置及びＳｐ配置を表し；ｍｉｘはラセミを表す。 ラットにおけるｍ／ｒＴＴＲ ＥＬＦ ５ＰＳ及び６ＰＳキラル純粋の有効性及び持続時間。キラル純粋４ＰＳ Ｒｐ／Ｒｐ－ＳｐＳｐは、５ＰＳ Ｒｐ／ＲｐＲｐ－ＳｐＳｐと同程度の活性であった。キラル純粋５ＰＳ Ｒｐ／ＲｐＲｐ－ＳｐＳｐは、６ＰＳ ｍｉｘ－ｍｉｘ／ＲｐＲｐ－ＳｐＳｐと同程度の活性であった。図面のＲ及びＳの表示は、結合リン原子のＲｐ配置及びＳｐ配置を表し；ｍｉｘはラセミを表す。 追加の５’末端内部ＰＳ（センス及びアンチセンス上）は、持続時間の改善を示す。ＡＳの内部５’末端におけるＳｐ異性体は効力を維持し、Ｒｐと同様に持続時間を改善した。図面のＲ及びＳの表示は、結合リン原子のＲｐ配置及びＳｐ配置を表し；ｍｉｘはラセミを表す。 ラットにおけるｍ／ｒＴＴＲ ＥＬＦ ４ＰＳ及び５ＰＳキラル純粋の有効性及び持続時間。３’末端ＳｐＳｐを有する両方のキラル純粋化合物は、６ＰＳ ｍｉｘ、Ｒｐ／Ｒｐ－Ｓｐキラル純粋対照、及び４ＰＳ Ｒｐ／Ｒｐ－ＲｐＳｐよりもかなり活性が高い。図面のＲ及びＳの表示は、結合リン原子のＲｐ配置及びＳｐ配置を表し；ｍｉｘはラセミを表す。 キラルＰＳ異性体を含むｓｉＲＮＡ二重鎖の全肝臓レベル。図面のＲ及びＳの表示は、結合リン原子のＲｐ配置及びＳｐ配置を表し；ｍｉｘはラセミを表す。 キラルＰＳ異性体を有するｓｉＲＮＡ二重鎖のＡｇｏ２レベル。図面のＲ及びＳの表示は、結合リン原子のＲｐ配置及びＳｐ配置を表し；ｍｉｘはラセミを表す。 Ａｇｏ２にローディングされたアンチセンス鎖の全肝臓レベルのパーセント。Ｒｐ／ＲｐＲｐ－ＳｐＳｐは、Ａｇｏ２で優れたローディング又は滞留時間の増加を示し得る。図面のＲ及びＳの表示は、結合リン原子のＲｐ配置及びＳｐ配置を表し；ｍｉｘはラセミを表す。 肝臓レベル及びＡｇｏ２ローディング分析を補完するための７日目の遺伝子発現。Ｒｐ－ＳｐＳｐ及びＲｐＲｐ－ＳｐＳｐのアンチセンス鎖はよく似ており、Ｒｐ－Ｓｐよりも強力であり、Ｒｐ－ＲｐＳｐよりもわずかに優れている。７日目では、Ｒｐ－ＳｐＳｐ及びＲｐＲｐ－ＳｐＳｐは同様の効力を有するが、持続時間の点で異なる振る舞いをし得る。図面のＲ及びＳの表示は、結合リン原子のＲｐ配置及びＳｐ配置を表し；ｍｉｘはラセミを表す。 ４９日目までのｉｎ ｖｉｖｏマウス用量反応試験。Ｒｐ／Ｒｐ－ＲｐＳｐ及びＲｐ／Ｒｐ－ＳｐＳｐの設計は、マウスの用量群全体でほぼ同じように振舞っていた（どちらも６ＰＳ ｍｉｘと比較して優れている）。ラットでは、利点はＲｐ／Ｒｐ－ＳｐＳｐ設計（又は３’末端ＳｐＳｐ配置を有する任意の設計）に限定されていた。図面のＲ及びＳの表示は、結合リン原子のＲｐ配置及びＳｐ配置を表し；混合物はラセミを表す。 ラットでのｍ／ｒＴＴＲ経過観察持続時間試験－２１日目のデータ。図面のＲ及びＳの表示は、結合リン原子のＲｐ配置及びＳｐ配置を表し；混合物はラセミを表す。 ｍ／ｒＴＴＲ持続時間試験－３’末端ＳＳＳ及びＲＳＳ異性体。３’末端ＳＳに比べて３’末端ＳＳＳ及びＲＳＳの両方の効力がわずかに向上；既知の３’エキソヌクレアーゼ選択と一致した、この位置における追加のＳ異性体での持続時間の改善。 センス鎖混合物及び単一オーバーハングについてのｍ／ｒＴＴＲ持続時間試験の結果。Ｍｉｘ／Ｒ－ＳＳはＲ／Ｒ－ＳＳに等しい。Ｒ／Ｒ－Ｓ（単一オーバーハング）は、６ＰＳ ｍｉｘ（及びＲ／Ｒ－Ｓ二重オーバーハング）と同じ効力を有し；代謝安定性の結果と一致し：３’末端ＳＳ二重オーバーハングはｉｎ ｖｉｖｏで安定し、効力を大幅に向上させる。 ５’末端Ｓ／ＡＳの１ＰＳ及び２ＰＳ混合物についてのｍ／ｒＴＴＲの結果。Ｍｉｘ／Ｍｉｘ－ＳＳはＲ／Ｒ－ＳＳと同様の効果を有し；５’末端２ＰＳ混合物二重鎖は、それほど強力ではなく、６ＰＳ ｍｉｘに近い。 ＰＳの異性体は、ｈＡｇｏ２で特徴的なＲＩＳＣローディングを示す。センス鎖ローディングは、アッセイ対照ＡＤ－５７７２７で通常見られるよりも低い。３ＰＳ、４ＰＳ、及び５ＰＳ混合二重鎖のローディングは低すぎる。Ｒｐ－ＳｐＳｐアンチセンス配置は、明らかにｈＡＧＯ２ローディングに最適な配置であり、ｉｎ ｖｉｖｏデータと一致している。Ｒｐ－ＲｐＳｐアンチセンスは、Ｒｐ－ＳｐＳｐと比較して大幅に減少したローディングを示した。アンチセンスの３’末端への３番目の異性体の追加により（ＲｐかＳｐかにかかわらず）ローディングが減少した。図面のＲ及びＳの表示は、結合リン原子のＲｐ配置及びＳｐ配置を示し；ｍｉｘ／混合物はラセミを表す。 雌ラットにおけるｍ／ｒＴＴＲ ｓｉＲＮＡ－ＧａｌＮＡｃコンジュゲートセンス鎖及びアンチセンス鎖の１日目のｉｎ ｖｉｖｏ代謝安定性プロフィール。 雌ラットにおけるｍ／ｒＴＴＲ ｓｉＲＮＡ－ＧａｌＮＡｃコンジュゲートセンス鎖及びアンチセンス鎖の７日目のｉｎ ｖｉｖｏ代謝安定性プロフィール。 雌ラットにおけるｍ／ｒＴＴＲ ｓｉＲＮＡ－ＧａｌＮＡｃコンジュゲートセンス鎖及びアンチセンス鎖の１日目及び７日目の相対的ｉｎ ｖｉｖｏ代謝安定性プロフィール。 ＬＣ－ＭＳ（図９８Ｃ）によって測定された内部標準（ＩＳ）に対する鎖シグナル強度によって分析された、１０ｍｇ／ｋｇの単回用量での雌ラット（ｎ＝３）におけるＦ１２ ｓｉＲＮＡ及びそのキラルＰＳ ｓｉＲＮＡ型のセンス鎖及びアンチセンス鎖の１日目（図９８Ａ）及び４日目（図９８Ｂ）の相対的ｉｎ ｖｉｖｏ代謝安定性プロフィール。 図９８－１の続き ＬＣ－ＭＳによって分析された、１０ｍｇ／ｋｇの単回投与時のマウス（ｎ＝１）におけるＦ１２及びＡｎｇｔｐｌ３（ＡＮＧ）ｓｉＲＮＡ及びそれらのキラルＰＳ ｓｉＲＮＡ型のセンス鎖及びアンチセンス鎖の１日目（図９９Ａ）及び７日目（図９９Ｂ）の相対的ｉｎ ｖｉｖｏ代謝安定性プロフィール。 ＬＣ－ＭＳによって分析された、１ｍｇ／ｋｇの単回投与時のＮＨＰ（ｎ＝１）におけるＦ１２ ｓｉＲＮＡ及びそのキラルＰＳ ｓｉＲＮＡ型のセンス鎖及びアンチセンス鎖の１日目及び７日目の相対的ｉｎ ｖｉｖｏ代謝安定性プロフィール。 ＬＣ－ＭＳ（図１０１Ｂ）によって分析された、３ｍｇ／ｋｇの単回投与時のＮＨＰ（ｎ＝１）におけるＡｎｇｐｔｌ３（ＡＮＧ）及びそのキラルＰＳ ｓｉＲＮＡ型のセンス鎖及びアンチセンス鎖の１日目及び７日目の相対的ｉｎ ｖｉｖｏ代謝安定性プロフィール（図１０１Ａ）。 ＬＣ－ＭＳ（図１０２Ｃ）によって分析された、１．５又は０．５ｍｇ／ｋｇの単回投与時のＮＨＰ（ｎ＝１）におけるＦ１２配列１及びそのキラルＰＳ ｓｉＲＮＡ型のセンス鎖及びアンチセンス鎖の１日目（図１０２Ａ）及び７日目（図１０２Ｂ）の相対的ｉｎ ｖｉｖｏ代謝安定性プロフィール。 図１０２－１の続き ＬＣ－ＭＳ（図１０３Ｂ）によって分析された、１ｍｇ／ｋｇの単回投与時のＮＨＰ（ｎ＝１）におけるＦ１２配列２及びそのキラルＰＳ ｓｉＲＮＡ型のセンス鎖及びアンチセンス鎖の１日目及び７日目の相対的ｉｎ ｖｉｖｏ代謝安定性プロフィール（図１０３Ａ）。 ラットにおけるＦ１２ ＥＬＦ及びそのキラルＰＳ ｓｉＲＮＡ型の持続時間試験。図１０４Ａは、使用したＦ１２ ＰＳキラル修飾ｓｉＲＮＡの構成モチーフ、使用した動物及び用量、及び試験期間を含む、持続時間試験の試験デザインを示す。図１０４Ｂは、ラットにおける持続時間試験に使用したＦ１２ ＥＬＦ異性体の一覧を示す。 図１０４Ｃは、５０日目までのＦ１２ ＥＬＦの持続時間試験の結果を示す。 ラットにおけるＦ１２ ＥＬＦ ｓｉＲＮＡ及びそのセンス鎖キラルＰＳ異性体のｉｎ ｖｉｖｏ相対的タンパク質発現レベル。図１０５Ａは、使用したＦ１２ ＰＳキラル修飾ｓｉＲＮＡの構成モチーフ、使用した用量、及び試験期間を含む、持続時間試験の試験デザインを示す。 図１０５Ｂは、ラットにおける持続時間試験に使用したＦ１２ ＥＬＦセンス鎖異性体の一覧を示す。図１０５Ｃは、２８日目までのＦ１２ ＥＬＦセンス鎖異性体の持続時間試験の結果を示す。 マウスにおけるＦ１２ ＥＬＦ ｓｉＲＮＡ及びそのキラルＰＳ ｓｉＲＮＡ型のｉｎ ｖｉｖｏ相対的血漿発現レベル。図１０６Ａは、使用したＦ１２ ＰＳキラル修飾ｓｉＲＮＡの配列変数及び構成モチーフ、使用した用量、及び試験期間を含む試験デザインを示す。図１０６Ｂは、使用したＦ１２ ＥＬＦ異性体の一覧を示す。 図１０６Ｃは、３５日目までのＦ１２ ＥＬＦ相対的血漿発現レベルの結果を示す。 初代マウス肝細胞及び初代カニクイザル肝細胞におけるＦ１２ ＥＬＦ ｓｉＲＮＡ及びそのキラルＰＳ ｓｉＲＮＡ型のｉｎ ｖｉｔｒｏ自由取り込み及びトランスフェクションＩＣ５０の結果。図１０７Ａは、使用したＦ１２ ＥＬＦキラル修飾ｓｉＲＮＡの配列及び構成モチーフの一覧を示す。 図１０７Ｂは、初代マウス及びカニクイザルの肝細胞におけるｉｎ ｖｉｔｒｏ自由取り込みＩＣ５０の結果を示す。図１０７Ｃは、初代マウス及びカニクイザルの肝細胞におけるｉｎ ｖｉｔｒｏトランスフェクションＩＣ５０の結果を示す。 ＮＨＰにおけるＦ１２ ＥＬＦ ｓｉＲＮＡ及びそのキラルＰＳ ｓｉＲＮＡ型の評価。図１０８Ａは、使用したＦ１２ ＥＬＦキラル修飾ｓｉＲＮＡの用量、配列、及び構成モチーフの一覧を示す。図１０８Ｂは、ＮＨＰにおける血漿薬力学（ＰＤ）の結果（Ｆ１２ ＥＬＦ ｓｉＲＮＡ及びそのキラルＰＳ ｓｉＲＮＡ型の相対的血漿レベル）を示す。 図１０８Ｃは、ＮＨＰにおける血漿薬物動態（ＰＫ）の結果を示す。図１０８Ｄは、ＮＨＰにおけるＦ１２ ＥＬＦ ｓｉＲＮＡ及びそのキラルＰＳ ｓｉＲＮＡ型の肝臓レベルを示す。 図１０８Ｅは、ＮＨＰにおけるペプチドによるアルゴノートタンパク質親和性精製（Ａｇｏ－ＡＰＰ）及び肝臓におけるＲＩＳＣにローディングされたアンチセンスの結果を示す。 初代マウス肝細胞及び初代カニクイザル肝細胞におけるＣ５、Ｆ１２、ｈＡＧＴ ｓｉＲＮＡ及びそれらのキラルＰＳ ｓｉＲＮＡ型のｉｎ ｖｉｔｒｏ自由取り込みＩＣ５０の結果。図１０９Ａは、使用したキラル修飾ｓｉＲＮＡの配列及び構成モチーフの一覧を示す。 図１０９Ｂは、初代マウス及びカニクイザル肝細胞におけるｉｎ ｖｉｔｒｏ自由取り込みＩＣ５０の結果を示す。 マウスにおけるＣ５、Ｆ１２、ｈＡＧＴ ｓｉＲＮＡ及びそれらのキラルＰＳ ｓｉＲＮＡ型のｉｎ ｖｉｖｏ活性。図１１０Ａは、使用したキラル修飾ｓｉＲＮＡの構成モチーフ、使用した用量、及び試験期間を含む試験デザインを示す。 図１１０Ｂは、使用したすべての配列の一覧を示す。図１１０Ｃは、２８日目又は４８日目までの相対的発現レベルの結果を示す。 ＮＨＰにおけるＦ１２及びＡｎｇｐｔｌ３（ＡＮＧ）ｓｉＲＮＡ及びそれらのキラルＰＳ ｓｉＲＮＡ型の評価。図１１１Ａは、使用したキラル修飾ｓｉＲＮＡの構成モチーフ、及び使用した動物及び用量の一覧を示す。図１１１Ｂは、使用したすべての配列の一覧を示す。 図１１１Ｃは、ＮＨＰにおけるＦ１２配列１ ｓｉＲＮＡ及びそのキラルＰＳ ｓｉＲＮＡ型の血漿薬力学（ＰＤ）の結果（相対的血漿レベル）を示す。図１１１Ｄは、ＮＨＰにおけるＦ１２配列２及びＡｎｇｐｔｌ３（ＡＮＧ）ｓｉＲＮＡ及びそれらのキラルＰＳ ｓｉＲＮＡ型の血漿薬力学（ＰＤ）の結果（相対的血漿レベル）を示す。
すべての図面において、すべての図面における「Ｒ」及び「Ｓ」の表示は、結合リン原子のＲｐ配置及びＳｐ配置を表し、「ｍｉｘ」の表示は、ラセミ混合物の配置を表す。
本発明は、標的遺伝子発現の阻害に有利である少なくとも１つのリガンドに任意選択により結合されたｄｓＲＮＡ剤、並びに治療的使用に適したＲＮＡｉ組成物のための効果的な立体化学的解決策を提供する。発明者らは、目的のオリゴヌクレオチドの特定の立体異性体である新規な化学物質を発見した。すなわち、本発明は、主鎖キラル中心の特定のパターン（すなわち、キラル結合リン立体化学（Ｒｐ／Ｓｐ）の特定のパターン）を含むｄｓＲＮＡ剤の実質的に純粋な調製物を提供する。
本発明の実施形態は、キラル修飾ｄｓＲＮＡ剤の個々の立体異性体が互いに異なる安定性及び／又は活性を示し得ることを実証する。例えば、オリゴヌクレオチド（例えば、ｄｓＲＮＡ剤）の部位特異的（例えば、末端の）位置にキラル修飾ヌクレオチド間結合を含めることによって達成される安定性の改善は、修飾された主鎖結合、塩基、及び／又は糖の使用によって（例えば、特定のタイプの修飾されたリン酸、２’－修飾、塩基修飾などの使用によって）達成される安定性の改善に匹敵する、又はそれ以上であり得る。また、ｄｓＲＮＡ剤を含めることによって達成される活性の改善は、修飾された主鎖結合、塩基、及び／又は糖の使用によって（例えば、特定のタイプの修飾されたリン酸、２’－修飾、塩基修飾などの使用によって）達成される安定性の改善に匹敵する、又はそれ以上であり得る。
ｄｓＲＮＡ剤は、キラル修飾されている、すなわち、ｄｓＲＮＡ剤は、部位特異的（例えば、末端の）キラル修飾ヌクレオチド間結合を含む。キラル修飾ｄｓＲＮＡ剤は、オリゴヌクレオチドの末端領域におけるキラル修飾ヌクレオチド間結合、例えば、最初の１つ、２つ、３つ、又は４つ、又は５つのヌクレオチド間結合（すなわち、それぞれ１位と２位のジヌクレオチド間のヌクレオチド間結合、２位と３位のジヌクレオチド間のヌクレオチド間結合、３位と４位のジヌクレオチド間のヌクレオチド間結合、４位と５位のジヌクレオチド間のヌクレオチド間結合、又は５位と６位のジヌクレオチド間のヌクレオチド間結合）を有する。ヌクレオチド間結合に対する末端のキラル修飾は、５’末端、３’末端、又は５’末端と３’末端の両方に存在し得る。ヌクレオチド間結合に対する末端のキラル修飾は、センス鎖、アンチセンス鎖、又はセンス鎖とアンチセンス鎖の両方に存在し得る。部位特異的（例えば、末端の）キラル修飾ヌクレオチド間結合におけるキラル結合リン原子のそれぞれは、Ｒｐ配置又はＳｐ配置のいずれかであり得る。
いくつかの実施形態では、ヌクレオチド間結合に対するキラル修飾は、センス鎖及び／又はアンチセンス鎖の５’末端及び／又は３’末端の最初の１つ又は２つのヌクレオチド間結合に存在する。典型的には、センス鎖及びアンチセンス鎖の両方は、部位特異的（例えば、末端の）キラル修飾ヌクレオチド間結合を含む。
一実施形態では、センス鎖は、部位特異的（例えば、末端の）ラセミヌクレオチド間結合を含み、アンチセンス鎖は、部位特異的（例えば、末端の）キラル修飾ヌクレオチド間結合を含む。別の実施形態では、センス鎖は、天然のホスホジエステルヌクレオチド間結合のみを含み、アンチセンス鎖は、部位特異的（例えば、末端の）キラル修飾ヌクレオチド間結合を含む。
本発明は、キラル修飾ｄｓＲＮＡ剤の個々の立体異性体の実質的にキラル的に純粋な調製物を提供する。「キラル的に純粋な」という語句は、キラル中心（例えば、部位特異的（例えば、末端の）キラル修飾ヌクレオチド間結合のキラル結合リン原子）に対して単一のジアステレオマー形態で存在するキラル制御オリゴヌクレオチド（例えば、キラル修飾ｄｓＲＮＡ剤）を説明するために使用される。キラル制御オリゴヌクレオチド（例えば、キラル修飾ｄｓＲＮＡ剤）のキラル純度は、ｄｓ純度（ジアステレオ選択性）、すなわち、ジアステレオマー混合物中の主要なジアステレオマーのパーセンテージによって測定することができる。例えば、キラル結合リン原子に対するキラル修飾ｄｓＲＮＡ剤のキラル純度は、キラル結合リン原子に対するｄｓ純度（ジアステレオ選択性）によって測定することができる。
キラル制御オリゴヌクレオチドのキラル純度を特徴付ける１つの方法は、オリゴヌクレオチドレベルにおいてである。例えば、キラル修飾ｄｓＲＮＡ剤は、３つの部位特異的（例えば、末端の）キラル修飾ヌクレオチド間結合を有し得る：（ｉ）センス鎖の５’末端に向いた１つの部位特異的（例えば、末端の）キラル修飾ヌクレオチド間結合；（ｉｉ）アンチセンス鎖の５’末端に向いた１つの部位特異的（例えば、末端の）キラル修飾ヌクレオチド間結合、及び（ｉｉｉ）アンチセンス鎖の３’末端に向いた１つの部位特異的（例えば、末端の）キラル修飾ヌクレオチド間結合。従って、このｄｓＲＮＡのセンス鎖は、２つのジアステレオマー形態：Ｒ又はＳ（ＲはＲｐ配置を表し、ＳはＳｐ配置を表す）を有し、それぞれは、キラル修飾ヌクレオチド間結合のキラル結合リン原子に対して単一のジアステレオマー形態を示す。例えば、センス鎖のＲジアステレオ異性体が９５％のｄｓ純度を有する場合、これは、このキラル修飾センス鎖のＲジアステレオ異性体の割合が９５％であることを意味する。従って、このｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖は、Ｒ－Ｒ、Ｒ－Ｓ、Ｓ－Ｒ、又はＳ－Ｓの４つのジアステレオマー形態を有し、それぞれは、キラル修飾ヌクレオチド間結合のキラル結合リン原子に対して単一のジアステレオマー形態を示す。例えば、アンチセンス鎖のＲ－Ｒジアステレオ異性体が９５％のｄｓ純度を有する場合、これは、このキラル修飾アンチセンス鎖のＲ－Ｒジアステレオ異性体の割合が９５％であることを意味する。
キラル制御ｄｓＲＮＡ剤のキラル純度はまた、ｄｓＲＮＡレベルで特徴付けることができる。例えば、上記のように同じ３つの部位特異的（例えば、末端の）キラル修飾ヌクレオチド間結合を有するキラル修飾ｄｓＲＮＡ剤は、８つのジアステレオマー形態：Ｒ／Ｒ－Ｒ、Ｒ／Ｒ－Ｓ、Ｒ／Ｓ－Ｒ、Ｒ／Ｓ－Ｓ、Ｓ／Ｒ－Ｒ、Ｓ／Ｒ－Ｓ、Ｓ／Ｓ－Ｒ、又はＳ／Ｓ－Ｓを有し、それぞれは、キラル修飾ヌクレオチド間結合のキラル結合リン原子に対して単一のジアステレオマー形態を示す。この場合、例えば、９５％のｄｓ純度のＲ／Ｒ－Ｓジアステレオ異性体は、このキラル修飾ｄｓＲＮＡ試薬のＲ／Ｒ－Ｓジアステレオ異性体の割合が９５％であることを意味する。
或いは、キラル制御オリゴヌクレオチドのキラル純度は、ジヌクレオチドレベルで特徴付けることができる。例えば、上記のように同じ３つの部位特異的（例えば、末端の）キラル修飾ヌクレオチド間結合を有するキラル修飾ｄｓＲＮＡ剤は、３つの末端位置それぞれにキラル修飾ヌクレオチド間結合を含むジヌクレオチドビルディングブロックを有すると考えることができる。従って、３つのジヌクレオチドビルディングブロックのそれぞれは、２つのジアステレオマー形態：Ｒ又はＳを有し、それぞれがキラル修飾ヌクレオチド間結合のキラル結合リン原子に対して単一のジアステレオマー形態を示す。例えば、ジヌクレオチドビルディングブロックのＲジアステレオ異性体が９５％のｄｓ純度を有する場合、これは、ジヌクレオチドビルディングブロックのＲジアステレオ異性体の割合が９５％であることを意味する。
いくつかの実施形態では、キラル制御オリゴヌクレオチド（例えば、キラル修飾ｄｓＲＮＡ剤）のキラル純度は、その調製プロセスにおける各カップリング工程の立体選択性によって制御することができる。例えば、カップリング工程が６０％の立体選択性（例えば、ジアステレオ選択性）を有する（カップリング工程によって形成された新たなヌクレオチド間結合の６０％が目的の立体化学を有する）場合、そのようなカップリング工程後に形成された新たなヌクレオチド間結合は、６０％のキラル純度を有すると言うことができる。いくつかの実施形態では、各カップリング工程は、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は少なくとも９９．５％の立体選択性を有する。いくつかの実施形態では、各カップリング工程は、実質的に１００％の立体選択制を有する、例えば、分析方法（例えば、ＮＭＲ、ＨＰＬＣなど）によるカップリング工程による実質的にすべての検出可能な産物は目的の立体選択制を有する。
いくつかの実施形態では、キラル修飾ｄｓＲＮＡ剤は、３つの部位特異的（例えば、末端の）キラル修飾ヌクレオチド間結合：（ｉ）センス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチド間結合におけるキラル修飾ヌクレオチド間結合（例えば、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合）；（ｉｉ）アンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチド間結合におけるキラル修飾ヌクレオチド間結合（例えば、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合）、及び（ｉｉｉ）アンチセンス鎖の３’末端の１番目のヌクレオチド間結合におけるキラル修飾ヌクレオチド間結合（例えば、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合）を含む。これらの３つの部位特異的（例えば、末端の）キラル修飾ヌクレオチド間結合を有するキラル修飾ｄｓＲＮＡ剤は、８つのジアステレオマー形態：Ｒ／Ｒ－Ｒ、Ｒ／Ｒ－Ｓ、Ｒ／Ｓ－Ｒ、Ｒ／Ｓ－Ｓ、Ｓ／Ｒ－Ｒ、Ｓ／Ｒ－Ｓ、Ｓ／Ｓ－Ｒ、又はＳ／Ｓ－Ｓを有し、それぞれは、キラル修飾ヌクレオチド間結合のキラル結合リン原子に対して単一のジアステレオマー形態を示す。
例えば、Ｓ／Ｒ－Ｓは、（ｉ）結合リン原子がＳｐ配置にある、センス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチド間結合におけるキラル修飾ヌクレオチド間結合（例えば、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合）、（ｉｉ）結合リン原子がＲｐ配置にある、アンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチド間結合におけるキラル修飾ヌクレオチド間結合（例えば、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合）、及び（ｉｉｉ）結合リン原子がＳｐ配置にある、アンチセンス鎖の３’末端の１番目のヌクレオチド間結合におけるキラル修飾ヌクレオチド間結合（例えば、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合）を有するジアステレオマー形態を表す。
一実施形態では、Ｒ／Ｒ－Ｒジアステレオマー形態のキラル修飾ｄｓＲＮＡ剤が提供され、そのキラル純度は、少なくとも５０％、例えば、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、又は実質的に１００％である。
一実施形態では、Ｒ／Ｒ－Ｓジアステレオマー形態のキラル修飾ｄｓＲＮＡ剤が提供され、そのキラル純度は、少なくとも５０％、例えば、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、又は実質的に１００％である。
一実施形態では、Ｒ／Ｓ－Ｒジアステレオマー形態のキラル修飾ｄｓＲＮＡ剤が提供され、そのキラル純度は、少なくとも５０％、例えば、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、又は実質的に１００％である。
一実施形態では、Ｒ／Ｓ－Ｓジアステレオマー形態のキラル修飾ｄｓＲＮＡ剤が提供され、そのキラル純度は、少なくとも５０％、例えば、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、又は実質的に１００％である。
一実施形態では、Ｓ／Ｒ－Ｒジアステレオマー形態のキラル修飾ｄｓＲＮＡ剤が提供され、そのキラル純度は、少なくとも５０％、例えば、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、又は実質的に１００％である。
一実施形態では、Ｓ／Ｒ－Ｓジアステレオマー形態のキラル修飾ｄｓＲＮＡ剤が提供され、そのキラル純度は、少なくとも５０％、例えば、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、又は実質的に１００％である。
一実施形態では、Ｓ／Ｓ－Ｒジアステレオマー形態のキラル修飾ｄｓＲＮＡ剤が提供され、そのキラル純度は、少なくとも５０％、例えば、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、又は実質的に１００％である。
一実施形態では、Ｓ／Ｓ－Ｓジアステレオマー形態のキラル修飾ｄｓＲＮＡ剤が提供され、そのキラル純度は、少なくとも５０％、例えば、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、又は実質的に１００％である。
いくつかの実施形態では、キラル修飾ｄｓＲＮＡ剤は、４つの末端のキラル修飾ヌクレオチド間結合を含む。一実施形態では、ヌクレオチド間結合に対するキラル修飾（例えば、ホスホロチオエート修飾）は、センス鎖及びアンチセンス鎖の５’末端及び３’の両末端の１番目のヌクレオチド間結合に存在する。一実施形態では、キラル修飾ｄｓＲＮＡ剤は、（ｉ）センス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチド間結合におけるキラル修飾ヌクレオチド間結合（例えば、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合）、（ｉｉ）アンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチド間結合におけるキラル修飾ヌクレオチド間結合（例えば、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合）、（ｉｉｉ）アンチセンス鎖の３’末端の１番目のヌクレオチド間結合におけるキラル修飾ヌクレオチド間結合（例えば、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合）；及び（ｉｖ）センス鎖の５’末端、アンチセンス鎖の５’末端、及びアンチセンス鎖の３’末端のうちの１つの２番目のヌクレオチド間結合におけるキラル修飾ヌクレオチド間結合（例えば、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合）を有する。
４つの部位特異的（例えば、末端の）キラル修飾ヌクレオチド間結合を含むキラル修飾ｄｓＲＮＡ剤についてのこれらの実施形態では、各キラル結合リン原子は、Ｒｐ配置又はＳｐ配置のいずれかであり得る。一実施形態では、アンチセンス鎖の３’末端の１番目のヌクレオチド間結合における結合リン原子はＳｐ配置を有し；アンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチド間結合における結合リン原子はＲｐ配置を有し；且つセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチド間結合における結合リン原子は、Ｒｐ配置又はＳｐ配置のいずれかを有する。
いくつかの実施形態では、キラル修飾ｄｓＲＮＡ剤は、５つの部位特異的（例えば、末端の）キラル修飾ヌクレオチド間結合を含む。一実施形態では、キラル修飾ｄｓＲＮＡ剤は、（ｉ）センス鎖及びアンチセンス鎖の５’末端及び３’の両末端の１番目のヌクレオチド間結合に存在するヌクレオチド間結合に対するキラル修飾（例えば、ホスホロチオエート修飾）；及び（ｉｉ）センス鎖の５’末端、アンチセンス鎖の５’末端、及びアンチセンス鎖の３’末端の１つの２番目のヌクレオチド間結合におけるキラル修飾ヌクレオチド間結合（例えば、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合）を有する。一実施形態では、キラル修飾ｄｓＲＮＡ剤は、（ｉ）センス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチド間結合におけるキラル修飾ヌクレオチド間結合（例えば、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合）；（ｉｉ）アンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチド間結合におけるキラル修飾ヌクレオチド間結合（例えば、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合）、（ｉｉｉ）アンチセンス鎖の３’末端の１番目のヌクレオチド間結合におけるキラル修飾ヌクレオチド間結合（例えば、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合）；及び（ｉｖ）センス鎖の５’末端、アンチセンス鎖の５’末端、及びアンチセンス鎖の３’末端のうちの２つの２番目のヌクレオチド間結合における２つのキラル修飾ヌクレオチド間結合（例えば、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合）を有する。
５つの部位特異的（例えば、末端の）キラル修飾ヌクレオチド間結合を含むキラル修飾ｄｓＲＮＡ剤についてのこれらの実施形態では、キラル結合リン原子のそれぞれは、Ｒｐ配置又はＳｐ配置のいずれかであり得る。一実施形態では、アンチセンス鎖の３’末端の１番目のヌクレオチド間結合における結合リン原子はＳｐ配置を有し；アンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチド間結合における結合リン原子はＲｐ配置を有し；且つセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチド間結合における結合リン原子は、Ｒｐ配置又はＳｐ配置のいずれかを有する。
いくつかの実施形態では、キラル修飾ｄｓＲＮＡ剤は、６つの部位特異的（例えば、末端の）キラル修飾ヌクレオチド間結合を含む。一実施形態では、キラル修飾ｄｓＲＮＡ剤は、（ｉ）センス鎖の５’末端の１番目及び２番目のヌクレオチド間結合における２つのキラル修飾ヌクレオチド間結合（例えば、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合）、（ｉｉ）アンチセンス鎖の５’末端の１番目及び２番目のヌクレオチド間結合における２つのキラル修飾ヌクレオチド間結合（例えば、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合）；及び（ｉｉｉ）アンチセンス鎖の３’末端の１番目及び２番目のヌクレオチド間結合における２つのキラル修飾ヌクレオチド間結合（例えば、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合）を有する。
６つの部位特異的（例えば、末端の）キラル修飾ヌクレオチド間結合を含むキラル修飾ｄｓＲＮＡ剤のこれらの実施形態では、キラル結合リン原子のそれぞれは、Ｒｐ配置又はＳｐ配置のいずれかであり得る。一実施形態では、アンチセンス鎖の３’末端の１番目のヌクレオチド間結合における結合リン原子はＳｐ配置を有し；アンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチド間結合における結合リン原子はＲｐ配置を有し；且つセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチド間結合における結合リン原子は、Ｒｐ配置又はＳｐ配置のいずれかを有する。
いくつかの実施形態では、キラル修飾ｄｓＲＮＡ剤は、７つの部位特異的（例えば、末端の）キラル修飾ヌクレオチド間結合を含む。
いくつかの実施形態では、キラル修飾ｄｓＲＮＡ剤は、８つの部位特異的（例えば、末端の）キラル修飾ヌクレオチド間結合を含む。
オリゴヌクレオチド合成の一般的な参考文献：キラル修飾ｄｓＲＮＡ剤のヌクレオチドは、固相合成を用いるオリゴリボヌクレオチドを調製する一般的な方法を使用して調製することができる。例えば、“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ”，Ｅｄ．Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，１９８４；“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ”，Ｅｄ．Ｆ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ， ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，１９９１（ｅｓｐｅｃｉａｌｌｙ Ｃｈａｐｔｅｒ １，Ｍｏｄｅｒｎ ｍａｃｈｉｎｅ－ａｉｄｅｄ ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｃｈａｐｔｅｒ ２， Ｏｌｉｇｏｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｃｈａｐｔｅｒ ３，２’－Ｏ－Ｍｅｔｈｙｌｏｌｉｇｏｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ－ ｓ：ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｃｈａｐｔｅｒ ４，Ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，Ｃｈａｐｔｅｒ ５，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｄｉｔｈｉｏａｔｅｓ，Ｃｈａｐｔｅｒ ６，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｏｌｉｇｏ－２’－ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ｍｅｔｈｙｌｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅｓ，ａｎｄ．Ｃｈａｐｔｅｒ ７，Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｂａｓｅｓ．）を参照されたい。他の特に有用な合成手順、試薬、ブロッキング基、及び反応条件は、Ｍａｒｔｉｎ，Ｐ．，Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，１９９５，７８，４８６－５０４；Ｂｅａｕｃａｇｅ，Ｓ．Ｌ．ａｎｄ Ｉｙｅｒ，Ｒ．Ｐ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，１９９２，４８，２２２３－２３１１ ａｎｄ Ｂｅａｕｃａｇｅ，Ｓ．Ｌ．ａｎｄ Ｉｙｅｒ，Ｒ．Ｐ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，１９９３，４９，６１２３－６１９４、又は本明細書で言及される参考文献に記載されている。オリゴヌクレオチドの化学修飾は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第００／４４８９５号パンフレット、同第０１／７５１６４号パンフレット、及び同第０２／４４３２１号パンフレットに記載されている。オリゴヌクレオチドのさらなる合成方法及びそれらの化学修飾は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第８，１０６，０２２号明細書で確認することができる。
リン酸基合成の参考文献：ホスフィネートオリゴリボヌクレオチドの調製は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第５，５０８，２７０号明細書に記載されている。アルキルホスホネートオリゴリボヌクレオチドの調製は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第４，４６９，８６３号明細書に記載されている。ホスホラミダイトオリゴリボヌクレオチドの調製は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第５，２５６，７７５号明細書及び同第５，３６６，８７８号明細書に記載されている。ホスホトリエステルオリゴリボヌクレオチドの調製は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第５，０２３，２４３号明細書に記載されている。ボラノホスフェートオリゴリボヌクレオチドの調製は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第５，１３０，３０２号明細書及び同第５，１７７，１９８号明細書に記載されている。３’－デオキシ－３’－アミノホスホラミダイトオリゴリボヌクレオチドの調製は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第５，４７６，９２５号明細書に記載されている。３’－デオキシ－３’－メチレンホスホネートオリゴリボヌクレオチドは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ａｎ，Ｈ，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．２００１，６６，２７８９－２８０１に記載されている。硫黄架橋ヌクレオチドの調製は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｓｐｒｏａｔ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ １９８８，７，６５１ ａｎｄ Ｃｒｏｓｓｔｉｃｋ ｅｔ ａｌ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．１９８９，３０，４６９３に記載されている。
糖基合成の参考文献：２’修飾の修飾は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｖｅｒｍａ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９８，６７，９９－１３４で確認することができる。リボースの特定の修飾は以下の文献で確認することができる：参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、２’－ｆｌｕｏｒｏ（Ｋａｗａｓａｋｉ ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，１９９３，３６，８３１－８４１），２’－ＭＯＥ（Ｍａｒｔｉｎ，Ｐ．Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ １９９６，７９，１９３０－１９３８），“ＬＮＡ”（Ｗｅｎｇｅｌ，Ｊ．Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．１９９９，３２，３０１－３１０）。
末端修飾の参考文献：末端修飾は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｍａｎｏｈａｒａｎ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２，１０３－１２８（２００２）に記載されている。
塩基合成の参考文献：Ｎ－２置換プリンヌクレオシドアミダイトは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第５，４５９，２５５号明細書に記載されているように調製することができる。３－デアザプリンヌクレオシドアミダイトは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第５，４５７，１９１号明細書に記載されているように調製することができる。５，６－置換ピリミジンヌクレオシドアミダイトは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第５，６１４，６１７号明細書に記載されているように調製することができる。５－プロピニルピリミジンヌクレオシドアミダイトは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第５，４８４，９０８号明細書に記載されているように調製することができる。
キラル制御オリゴヌクレオチドのキラル的に純粋な（又は実質的にキラル的に純粋な）ジアステレオ異性体形態を調製する一般的な方法は、参照によりその全体が組みこまれる米国特許出願公開第２０１７／００３７３９９号明細書で確認することができる。
単一のジアステレオマー形態のキラル修飾ｄｓＲＮＡ剤は、オリゴヌクレオチドレベルで、又はジヌクレオチドビルディングブロックのジアステレオマー形態をカップリングすることによって調製することができる。
オリゴヌクレオチドレベルでキラル修飾ｄｓＲＮＡ剤の単一のジアステレオマー形態を調製する場合、センス鎖及びアンチセンス鎖のそれぞれは、上記の一般的なオリゴヌクレオチド合成方法に従って合成することができ、例えば上記のリン酸基合成方法に基づいて、キラル修飾ヌクレオチド間結合（例えば、所望の位置のホスホロチオエートヌクレオチド間結合）が組み込まれる。得られるエピマー混合物は、当業者に公知の方法によって個々のジアステレオマーに分離することができる。次いで、キラル修飾ＲＮＡ剤のキラル的に純粋な（又は実質的にキラル的に純粋な）ジアステレオ異性体形態は、キラル修飾センス鎖の単一のジアステレオ異性体形態をキラル修飾アンチセンス鎖の単一のジアステレオ異性体形態とアニーリングすることによって調製することができる。
ジヌクレオチドビルディングブロックレベルでキラル修飾ｄｓＲＮＡ剤の単一のジアステレオマー形態を調製する場合、ｄｓＲＮＡ剤を、上記の一般的なオリゴヌクレオチド合成方法に従って合成することができる。望ましい部位特異的（例えば、末端の）キラル修飾ヌクレオチド間結合（例えば、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合）のそれぞれを、キラル修飾ヌクレオチド間結合を含む対応するジヌクレオチドビルディングブロックをカップリングすることによってｄｓＲＮＡ剤に導入することができる。ジヌクレオチドビルディングブロックのそれぞれを、例えば、上記のリン酸基合成法に基づいて、ジヌクレオチド間にキラル修飾ヌクレオチド間結合（例えば、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合）を組み込むことで合成することができる。得られたエピマー混合物を、当業者に公知の方法により個々のジアステレオマーに分離することができる。次いで、キラル修飾ＲＮＡ剤のキラル的に純粋な（又は実質的にキラル的に純粋な）ジアステレオ異性体形態を、ジヌクレオチドビルディングブロックのそれぞれの単一のジアステレオ異性体形態をｄｓＲＮＡ剤の所望の位置にカップリングすることによって調製することができる。
キラル修飾ＲＮＡ剤のキラル的に純粋な（又は実質的にキラル的に純粋な）ジアステレオ異性体形態の調製についてのさらなる詳細は、実施例で確認することができる。
本発明者らはまた、アンチセンス鎖の５’末端のヌクレオチド２位及び１４位に２’－ＯＭｅ修飾を有すると、ｄｓＲＮＡ剤の遺伝子サイレンシング活性を抑制することを見出した。アンチセンス鎖及び／又はセンス鎖の特定の位置の２’－ＯＭｅ修飾よりも立体的嵩高さが小さい化学修飾を非リボース、非環状、又は主鎖における２’位又は同等の位置に導入することにより、ｄｓＲＮＡ剤は、遺伝子サイレンシング活性を取り戻すことができた。本発明者らはまた、アンチセンス鎖のｓｅｅｄ領域（即ち、アンチセンス鎖の５’末端の２位～８位）の反対側の部位でセンス鎖に熱不安定化ヌクレオチドを導入すると、遺伝子サイレンシング活性が改善されと断定した。
キラル修飾ｄｓＲＮＡ剤のセンス鎖及びアンチセンス鎖は完全に修飾することができる。キラル修飾ｄｓＲＮＡ剤は、任意選択により、例えばセンス鎖上のアシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰＲ）リガンドとコンジュゲートする。得られるキラル修飾ｄｓＲＮＡ剤は、効果的なｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子サイレンシング活性を示す。
従って、本発明は、標的遺伝子の発現を阻害することができるキラル修飾二本鎖ＲＮＡｉ（ｄｓＲＮＡ）剤を提供する。キラル修飾ｄｓＲＮＡ剤は、センス鎖及びアンチセンス鎖を含む。各鎖は、１２～４０のヌクレオチド長さの範囲とすることができる。例えば、各鎖は、１４～４０のヌクレオチド長さ、１７～３７のヌクレオチド長さ、２５～３７のヌクレオチド長さ、２７～３０のヌクレオチド長さ、１７～２３のヌクレオチド長さ、１７～２１のヌクレオチド長さ、１７～１９のヌクレオチド長さ、１９～２５のヌクレオチド長さ、１９～２３のヌクレオチド長さ、１９～２１のヌクレオチド長さ、２１～２５のヌクレオチド長さ、又は２１～２３のヌクレオチド長さの範囲とすることができる。
センス鎖及びアンチセンス鎖は、二重鎖ｄｓＲＮＡを形成する。二重鎖領域は、１２～４０のヌクレオチド対の長さとすることができる。例えば、二重鎖領域は、１４～４０のヌクレオチド対の長さ、１７～３０のヌクレオチド対の長さ、２５～３５のヌクレオチド対の長さ、２７～３５のヌクレオチド対の長さ、１７～２３のヌクレオチド対の長さ、１７～２１のヌクレオチド対の長さ、１７～１９のヌクレオチド対の長さ、１９～２５のヌクレオチド対の長さ、１９～２３のヌクレオチド対の長さ、１９～２１のヌクレオチド対の長さ、２１～２５のヌクレオチド対の長さ、又は２１～２３のヌクレオチド対の長さとすることができる。別の例では、二重鎖領域は、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、及び２７のヌクレオチド対の長さから選択される。
一実施形態では、キラル修飾ｄｓＲＮＡ剤は、鎖の３’末端、５’末端、又は両末端に１つ以上のオーバーハング領域及び／又はキャッピング基を含む。オーバーハングは、１～１０のヌクレオチド長さ、１～６のヌクレオチド長さ、例えば、２～６のヌクレオチド長さ、１～５のヌクレオチド長さ、２～５のヌクレオチド長さ、１～４のヌクレオチド長さ、２～４のヌクレオチド長さ、１～３のヌクレオチド長さ、２～３のヌクレオチド長さ、又は１～２のヌクレオチド長さとすることができる。オーバーハングは、一方の鎖が他方の鎖よりも長い結果、又は同じ長さの２本の鎖がシフトした結果として起こり得る。オーバーハングは、標的ｍＲＮＡとのミスマッチを形成し得る、又はオーバーハングは、標的とされる遺伝子配列に相補的であっても良いし、若しくは他の配列であっても良い。第１の鎖と第２の鎖は、例えば、ヘアピンを形成する追加の塩基によって、又は他の非塩基リンカーによって接続することができる。
一実施形態では、キラル修飾ｄｓＲＮＡ剤のオーバーハング領域におけるヌクレオチドはそれぞれ独立して、限定されるものではないが、２’－糖修飾、例えば、２－Ｆ、２’－Ｏ－メチル、チミジン（Ｔ）、２’－Ｏ－メトキシエチル－５－メチルウリジン（Ｔｅｏ）、２’－Ｏ－メトキシエチルアデノシン（Ａｅｏ）、２’－Ｏ－メトキシエチル－５－メチルシチジン（ｍ５Ｃｅｏ）、及びこれらの任意の組み合わせを含め、修飾されたヌクレオチドであっても良いし、又は非修飾ヌクレオチドであっても良い。例えば、ＴＴは、いずれかの鎖のいずれかの末端のオーバーハング配列とすることができる。オーバーハングは、標的ｍＲＮＡとのミスマッチを形成し得る、又はオーバーハングは、標的とされる遺伝子配列に相補的であっても良いし、若しくは他の配列であっても良い。
キラル修飾ｄｓＲＮＡ剤のセンス鎖、アンチセンス鎖、又は両方の鎖における５’又は３’オーバーハングは、リン酸化されても良い。一部の実施形態では、オーバーハング領域は、間にホスホロチオエートを有する２つのヌクレオチドを含み、この２つのヌクレオチドは、同じヌクレオチドでも良いし、異なるヌクレオチドでも良い。一実施形態では、オーバーハングは、センス鎖、アンチセンス鎖、又は両方の鎖の３’末端に存在する。一実施形態では、この３’オーバーハングは、アンチセンス鎖に存在する。一実施形態では、この３’オーバーハングは、センス鎖に存在する。
キラル修飾ｄｓＲＮＡ剤は、全体の安定性に影響を与えずに、キラル修飾ｄｓＲＮＡの干渉活性を高めることができる１つのオーバーハングのみを含み得る。例えば、一本鎖オーバーハングは、センス鎖の３’末端、或いはアンチセンス鎖の３’末端に位置する。ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の５’末端（又はセンス鎖の３’末端）に位置する平滑末端を有しても良いし、又はこの逆であっても良い。一般に、アンチセンス鎖は、３’末端のヌクレオチドオーバーハングを有し、５’末端は平滑である。理論に拘束されるものではないが、非対称な、アンチセンス鎖の５’末端の平滑末端とアンチセンス鎖の３’末端オーバーハングは、ＲＩＳＣプロセスに付加されるガイド鎖を好む。例えば、１つのオーバーハングは、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０ヌクレオチド長を有する。
一実施形態では、キラル修飾ｄｓＲＮＡ剤はまた、ｄｓＲＮＡ二重鎖の両末端に２つの平滑末端を有し得る。
一実施形態では、キラル修飾ｄｓＲＮＡ剤は、１９ヌクレオチド長の平滑末端二本鎖（ｄｏｕｂｌｅ ｅｎｄｅｄ ｂｌｕｎｔｍｅｒ）であり、センス鎖は、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドを含み、この少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドは、アンチセンス鎖のｓｅｅｄ領域（即ち、アンチセンス鎖の５’末端の２位～８位）の反対側の部位又はその近傍に存在する。例えば、熱不安定化ヌクレオチドは、センス鎖の５’末端の１４位～１７位の間に存在する。アンチセンス鎖は、立体的要求の高い２’－ＯＭｅよりも小さい少なくとも２つの修飾核酸を含み；好ましくは、立体的要求の高い２’－ＯＭｅよりも小さいこの２つの修飾核酸は、アンチセンス鎖の５’末端の２位及び１４位にある。
一実施形態では、キラル修飾ｄｓＲＮＡ剤は、２０ヌクレオチド長の平滑末端二本鎖であり、センス鎖は、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドを含み、この少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドは、アンチセンス鎖のｓｅｅｄ領域（即ち、アンチセンス鎖の５’末端の２位～８位）の反対側の部位又はその近傍に存在する。例えば、熱不安定化ヌクレオチドは、センス鎖の５’末端の１４位～１７位の間に存在する。アンチセンス鎖は、立体的要求の高い２’－ＯＭｅよりも小さい少なくとも２つの修飾核酸を含み；好ましくは、立体的要求の高い２’－ＯＭｅよりも小さいこの２つの修飾核酸は、アンチセンス鎖の５’末端の２位及び１４位にある。
一実施形態では、キラル修飾ｄｓＲＮＡ剤は、２１ヌクレオチド長の平滑末端二本鎖であり、センス鎖は、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドを含み、この少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドは、アンチセンス鎖のｓｅｅｄ領域（即ち、アンチセンス鎖の５’末端の２位～８位）の反対側の部位又はその近傍に存在する。例えば、熱不安定化ヌクレオチドは、センス鎖の５’末端の１４位～１７位の間に存在する。アンチセンス鎖は、立体的要求の高い２’－ＯＭｅよりも小さい少なくとも２つの修飾核酸を含み；好ましくは、立体的要求の高い２’－ＯＭｅよりも小さいこの２つの修飾核酸は、アンチセンス鎖の５’末端の２位及び１４位にある。
一実施形態では、キラル修飾ｄｓＲＮＡ剤は、２１ヌクレオチド（ｎｔ）のセンス鎖及び２３ヌクレオチド（ｎｔ）のアンチセンス鎖を含み、センス鎖は、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドを含み、この少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドは、アンチセンス鎖のｓｅｅｄ領域（即ち、アンチセンス鎖の５’末端の２位～８位）の反対側の部位又はその近傍に存在する。例えば、熱不安定化ヌクレオチドは、センス鎖が２１ヌクレオチド長である場合は、センス鎖の５’末端の１４位～１７位の間に存在する。アンチセンス鎖は、立体的要求の高い２’－ＯＭｅよりも小さい少なくとも２つの修飾核酸を含み；好ましくは、立体的要求の高い２’－ＯＭｅよりも小さいこの２つの修飾核酸は、アンチセンス鎖の５’末端の２位及び１４位にあり、ｄｓＲＮＡの一端は平滑であるが、他端は、２ヌクレオチドのオーバーハングを含む。好ましくは、２ヌクレオチドのオーバーハングは、アンチセンスの３’末端にある。任意選択により、ｄｓＲＮＡは、リガンド（好ましくは、受容体リガンド、即ち、ＡＳＧＰＲリガンド）をさらに含む。
一実施形態では、キラル修飾ｄｓＲＮＡ剤は、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み：センス鎖は、２５～３０ヌクレオチド残基長であり、５’末端のヌクレオチド（１位）から始まり、前記センス鎖の１位～２３位は、少なくとも８つのリボヌクレオチドを含み；アンチセンス鎖は、３６～６６のヌクレオチド残基の長さであり、３’末端のヌクレオチドから始まり、少なくとも８つのリボヌクレオチドが、センス鎖の１位～２３位と対合して二重鎖を形成する位置にあり；アンチセンス鎖の少なくとも３’末端のヌクレオチドが、センス鎖と対合せず、最大６つの連続した３’末端のヌクレオチドがセンス鎖と対合せず、これにより１～６ヌクレオチドの３’一本鎖オーバーハングが形成され；アンチセンス鎖の５’末端は、センス鎖と対合しない１０～３０の連続したヌクレオチドを含み、これにより１０～３０のヌクレオチドの一本鎖５’オーバーハングが形成され；少なくともセンス鎖の５’末端及び３’末端のヌクレオチドが、センス鎖及びアンチセンス鎖が最大の相補性が得られるように整列されたときにアンチセンス鎖のヌクレオチドと塩基対合し、これによりセンス鎖とアンチセンス鎖との間にかなりの二重鎖領域が形成され；そして前記二本鎖核酸が哺乳動物細胞に導入されたときに標的遺伝子の発現が減少するように、アンチセンス鎖が、アンチセンス鎖の長さの少なくとも１９のリボヌクレオチドに沿って標的ＲＮＡに対して十分に相補的であり；そしてセンス鎖が、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドを含み、この少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドが、アンチセンス鎖のｓｅｅｄ領域（即ち、アンチセンス鎖の５’末端の２位～８位）の反対側の部位又はその近傍に存在する。例えば、熱不安定化ヌクレオチドは、センス鎖の５’末端の１４位～１７位の間に存在する。アンチセンス鎖は、立体的要求の高い２’－ＯＭｅよりも小さい少なくとも２つの修飾核酸を含み；好ましくは、立体的要求の高い２’－ＯＭｅよりも小さいこの２つの修飾核酸は、アンチセンス鎖の５’末端の２位及び１４位にある。
一実施形態では、キラル修飾ｄｓＲＮＡ剤は、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、前記キラル修飾ｄｓＲＮＡ剤は、少なくとも２５、最大で２９のヌクレオチド長を有するセンス鎖、及び最大で３０のヌクレオチド長を有するアンチセンス鎖を含み、このセンス鎖は、５’末端の１１位に酵素分解されやすい修飾ヌクレオチドを含む。アンチセンス鎖は、立体的要求の高い２’－ＯＭｅよりも小さい２つの修飾核酸を含み、この２つの修飾核酸は、アンチセンス鎖の５’末端の２位及び１４位にあり；前記センス鎖の前記３’末端と前記アンチセンス鎖の前記５’末端が平滑末端を形成し、前記アンチセンス鎖が、その３’末端でセンス鎖よりも１～４ヌクレオチド長く、二重鎖領域が少なくとも２５ヌクレオチド長であり、前記キラル修飾ｄｓＲＮＡ剤が哺乳動物細胞に導入されたときに標的遺伝子の発現が減少するように、前記アンチセンス鎖が、前記アンチセンス鎖の長さの少なくとも１９のヌクレオチドに沿って標的ｍＲＮＡに対して十分に相補的であり、前記キラル修飾ｄｓＲＮＡのダイサー切断が、前記アンチセンス鎖の前記３’末端を含むｓｉＲＮＡに優先的に生じ、これにより哺乳動物での標的遺伝子の発現が減少する。任意選択により、キラル修飾ｄｓＲＮＡ剤は、リガンドをさらに含む。
一実施形態では、センス鎖は、５’末端の１１位に酵素分解されやすい修飾ヌクレオチドを含む。アンチセンス鎖は、立体的要求の高い２’－ＯＭｅよりも小さい２つの修飾核酸を含み、この２つの修飾核酸は、アンチセンス鎖の５’末端の２位及び１４位にある。
一実施形態では、アンチセンス鎖は、立体的要求の高い２’－ＯＭｅよりも小さい２つの修飾核酸を含み、この２つの修飾核酸は、アンチセンス鎖の５’末端の２位及び１４位にある。
一実施形態では、キラル修飾ｄｓＲＮＡ剤のセンス鎖及びアンチセンス鎖における各ヌクレオチドを修飾しても良い。各ヌクレオチドは、同じ又は異なる修飾で修飾しても良く、この修飾は、非結合リン酸酸素及び／又は１つ以上の結合リン酸酸素の一方又は両方の１つ以上の変更；リボース糖の成分、例えば、リボース糖の２’ヒドロキシルの変更；リン酸部分の「脱リン酸」リンカー（“ｄｅｐｈｏｓｐｈｏ”ｌｉｎｋｅｒ）での大量の置換；天然の塩基の修飾又は置換；及びリボース－リン酸骨格の置換又は修飾を含み得る。
核酸がサブユニットの重合体であるため、多くの修飾、例えば、塩基、リン酸部分、又はリン酸部分の非結合Ｏの修飾は、核酸内の繰り返される位置に存在する。場合によっては、修飾は、核酸内の全ての目的の位置に存在するが、多くの場合はそうではない。一例として、修飾は、３’又は５’末端位置のみに存在しても良く、末端領域、例えば、末端ヌクレオチドの位置又は鎖の最後の２つ、３つ、４つ、５つ、又は１０のヌクレオチドのみに存在しても良い。修飾は、二本鎖領域、一本鎖領域、又は両方に存在し得る。修飾は、ＲＮＡの二本鎖領域のみに存在しても良いし、又はＲＮＡの一本鎖領域のみに存在しても良い。例えば、非結合酸素位置でのホスホロチオエート修飾は、一方若しくは両方の末端のみに存在しても良いし、末端領域、例えば、末端ヌクレオチドのある位置、又は鎖の最後の２つ、３つ、４つ、５つ、若しくは１０のヌクレオチドのみに存在しても良いし、或いは二本鎖領域及び一本鎖領域、特に末端に存在しても良い。５’末端又は両末端は、リン酸化されても良い。
例えば、安定性を高めること、オーバーハングに特定の塩基を含めること、或いは一本鎖オーバーハング、例えば、５’若しくは３’オーバーハング、又は両方のオーバーハングに修飾ヌクレオチド若しくはヌクレオチド代用物を含めることが可能であろう。例えば、オーバーハングにプリンヌクレオチドを含めることが望ましい場合もある。一部の実施形態では、３’又は５’オーバーハングの全て又は一部の塩基を、例えば、本明細書に記載される修飾で修飾しても良い。修飾は、例えば、当分野で公知の修飾を用いたリボース糖の２’位での修飾の使用、例えば、核酸塩基のリボ糖ではなくデオキシリボヌクレオチド、２’－デオキシ－２’－フルオロ（２’－Ｆ）、又は２’－Ｏ－メチル修飾の使用、及びリン酸基の修飾、例えば、ホスホチオエート修飾を含み得る。オーバーハングは、標的配列と相同である必要はない。
一実施形態では、センス鎖及びアンチセンス鎖の各残基は独立に、非環状ヌクレオチド、Ｌ－ヌクレオチド、２’－修飾Ｌ－ヌクレオチド、ＬＮＡ、ＨＮＡ、ＣｅＮＡ、２’－Ｏ－メトキシアルキル（例えば、２’－Ｏ－メトキシメチル、２’－Ｏ－メトキシエチル、又は２’－Ｏ－２－メトキシプロパニル）、２’－Ｏ－メチル、２’－Ｏ－アリル、２’－Ｃ－アリル、２’－デオキシ、又は２’－フルオロで修飾される。鎖は、１つ以上の修飾を含み得る。一実施形態では、センス鎖及びアンチセンス鎖の各残基は独立に、２’－Ｏ－メチル又は２’－フルオロで修飾される。
少なくとも２つの異なる修飾が、典型的には、センス鎖及びアンチセンス鎖に存在する。これらの２つの修飾は、２’－デオキシ、２’－Ｏ－メチル若しくは２’－フルオロ、非環状核酸、又は他のものであっても良い。
一実施形態では、センス鎖及びアンチセンス鎖はそれぞれ、２’－Ｏ－メチル又は２’－デオキシから選択される２つの異なって修飾されたヌクレオチドを含む。
一実施形態では、センス鎖及びアンチセンス鎖の各残基は独立して、２’－Ｏ－メチルヌクレオチド、２’－デオキシヌクレオチド、２’－デオキシフルオロヌクレオチド、２’－Ｏ－Ｎ－メチルアセトアミド（２’－Ｏ－ＮＭＡ）ヌクレオチド、２’－Ｏ－ジメチルアミノエトキシエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＥＯＥ）ヌクレオチド、２’－Ｏ－アミノプロピル（２’－Ｏ－ＡＰ）ヌクレオチド、又は２’－ａｒａ－Ｆヌクレオチドで修飾される。
一実施形態では、部位特異的にキラル修飾ｄｓＲＮＡの各鎖の未修飾ヌクレオチドを含む前記ヌクレオチド修飾は、各鎖の５’末端から始まる任意のランダムな順序の不特定のパターン、任意の順序の１つ又は複数のパターンのストレッチに置かれる／配置される。このようなヌクレオチドパターン、ストレッチ、及び／又はパターンのストレッチにおける部位特異的キラル修飾結合は、すべての実験的細胞培養及びすべての動物において、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、及びｉｎ ｖｉｖｏでのｄｓＲＮＡの効力を調節する。前記ｄｓＲＮＡは、ヒト及び目的の他の動物において意図された疾患の兆候を処置するための医薬組成物を構成する。
一実施形態では、キラル修飾ｄｓＲＮＡ剤は、二重鎖内の標的との不一致又はそれらの組み合わせを含む。ミスマッチは、オーバーハング領域、又は二重鎖領域で生じ得る。塩基対は、解離又は融解（例えば、特定の対合の結合又は解離の自由エネルギーに対してであり、最も単純なアプローチは、個々の塩基対ベースで塩基対を評価することであるが、類縁又は同様の分析を用いることもできる）を促進する傾向に基づいてランク付けすることができる。解離の促進に関しては、Ａ：Ｕは、Ｇ：Ｃよりも好ましく；Ｇ：ＵはＧ：Ｃよりも好ましく；Ｉ：ＣはＧ：Ｃよりも好ましい（Ｉ＝イノシンである）。ミスマッチ、例えば、非正準な対合又は正準以外の対合（本明細書の他の部分に記載）は、正準な対合（Ａ：Ｔ、Ａ：Ｕ、Ｇ：Ｃ）よりも好ましく；ユニバーサル塩基を含む塩基対は、正準な対合よりも好ましい。
一実施形態では、キラル修飾ｄｓＲＮＡ剤は、Ａ：Ｕ、Ｇ：Ｕ、Ｉ：Ｃの群から独立して選択することができるアンチセンス鎖の５’末端からの二重鎖領域内の最初の１つ、２つ、３つ、４つ、又は５つの塩基対の少なくとも１つ、及び二重鎖の５’末端におけるアンチセンス鎖の解離を促進するためのミスマッチ対合、例えば、非正準な対合若しくは正準以外の対合、又はユニバーサル塩基を含む対合を含む。
一実施形態では、アンチセンス鎖の５’末端からの二重鎖領域内の１位にあるヌクレオチドは、Ａ、ｄＡ、ｄＵ、Ｕ、及びｄＴからなる群から選択される。或いは、ンチセンス鎖の５’末端からの二重鎖領域内の最初の１つ、２つ、又は３つの塩基対の少なくとも１つは、ＡＵ塩基対である。例えば、アンチセンス鎖の５’末端からの二重鎖領域内の最初の塩基対は、ＡＵ塩基対である。
本発明者らは、一本鎖又は二本鎖オリゴヌクレオチドの任意の位置におけるジヌクレオチドのホスホジエステル（ＰＯ）、ホスホロチオエート（ＰＳ）、及び／又はホスホロジチオエート（ＰＳ２）結合の３’末端への４’修飾及び／又は５’修飾ヌクレオチドの導入が、ヌクレオチド間結合に立体的影響を与えることができ、従ってヌクレオチド間結合をヌクレアーゼから保護する又は安定させることを見出した。
一実施形態では、５’修飾ヌクレオシドが、一本鎖又は二本鎖ｓｉＲＮＡの任意の位置におけるジヌクレオチドの３’末端に導入される。例えば、５’アルキル化ヌクレオシドを、一本鎖又は二本鎖ｓｉＲＮＡの任意の位置におけるジヌクレオチドの３’末端に導入することができる。リボース糖の５’位置のアルキル基は、ラセミ体又はキラル的に純粋なＲ若しくはＳ異性体であり得る。例示的な５’アルキル化ヌクレオシドは、５’メチルヌクレオシドである。５’メチルは、ラセミ体又はキラル的に純粋なＲ若しくはＳ異性体であり得る。
一実施形態では、４’修飾ヌクレオシドが、一本鎖又は二本鎖ｓｉＲＮＡの任意の位置におけるジヌクレオチドの３’末端に導入される。例えば、４’アルキル化ヌクレオシドを、一本鎖又は二本鎖ｓｉＲＮＡの任意の位置におけるジヌクレオチドの３’末端に導入することができる。リボース糖の４’位置のアルキル基は、ラセミ体又はキラル的に純粋なＲ若しくはＳ異性体であり得る。例示的な４’アルキル化ヌクレオシドは、４’メチルヌクレオシドである。４’メチルは、ラセミ体又はキラル的に純粋なＲ若しくはＳ異性体であり得る。或いは、４’－Ｏ－アルキル化ヌクレオシドは、一本鎖又は二本鎖ｓｉＲＮＡの任意の位置におけるジヌクレオチドの３’末端に導入することができる。リボース糖の４’－Ｏ－アルキルは、ラセミ体又はキラル的に純粋なＲ若しくはＳ異性体であり得る。例示的な４’－Ｏ－アルキル化ヌクレオシドは、４’－Ｏ－メチルヌクレオシドである。４’－Ｏ－メチルは、ラセミ体又はキラル的に純粋なＲ若しくはＳ異性体であり得る。
一実施形態では、５’アルキル化ヌクレオシドが、キラル修飾ｄｓＲＮＡのセンス鎖又はアンチセンス鎖の任意の位置に導入され、このような修飾は、キラル修飾ｄｓＲＮＡの効力を維持又は改善する。５’アルキルは、ラセミ体又はキラル的に純粋なＲ若しくはＳ異性体であり得る。例示的な５’アルキル化ヌクレオシドは、５’－メチルヌクレオシドである。５’－メチルは、ラセミ体又はキラル的に純粋なＲ若しくはＳ異性体であり得る。
一実施形態では、４’アルキル化ヌクレオシドが、キラル修飾ｄｓＲＮＡのセンス鎖又はアンチセンス鎖の任意の位置に導入され、このような修飾は、キラル修飾ｄｓＲＮＡの効力を維持又は改善する。４’アルキルは、ラセミ体又はキラル的に純粋なＲ若しくはＳ異性体であり得る。例示的な４’アルキル化ヌクレオシドは、４’－メチルヌクレオシドである。４’－メチルは、ラセミ体又はキラル的に純粋なＲ若しくはＳ異性体であり得る。
一実施形態では、４’－Ｏ－アルキル化ヌクレオシドが、キラル修飾ｄｓＲＮＡのセンス鎖又はアンチセンス鎖の任意の位置に導入され、このような修飾は、キラル修飾ｄｓＲＮＡの効力を維持又は改善する。５’アルキルは、ラセミ体又はキラル的に純粋なＲ若しくはＳ異性体であり得る。例示的な４’－Ｏ－アルキル化ヌクレオシドは、４’－Ｏ－メチルヌクレオシドである。４’－Ｏ－メチルは、ラセミ体又はキラル的に純粋なＲ若しくはＳ異性体であり得る。
一実施形態では、キラル修飾ｄｓＲＮＡ剤は、２’－５’結合（２’－Ｈ、２’－ＯＨ、及び２’－ＯＭｅを含み、Ｐ＝Ｏ又はＰ＝Ｓである）を含み得る。例えば、２’－５’結合修飾を使用して、ヌクレアーゼ耐性を促進する、若しくはセンス鎖とアンチセンス鎖の結合を阻害することができる、又はセンス鎖の５’末端で使用して、ＲＩＳＣによるセンス鎖の活性化を回避することができる。
別の実施形態では、キラル修飾ｄｓＲＮＡ剤は、Ｌ糖（例えば、２’－Ｈ、２’－ＯＨ、及び２’－ＯＭｅを含むＬリボース、Ｌ－アラビノース）を含み得る。例えば、これらのＬ糖修飾を使用して、ヌクレアーゼ耐性を促進する、若しくはセンス鎖とアンチセンス鎖の結合を阻害することができる、又はセンス鎖の５’末端で使用して、ＲＩＳＣによるセンス鎖の活性化を回避することができる。
１つ以上の糖質部分のキラル修飾ｄｓＲＮＡ剤に対するコンジュゲーションを含むキラル修飾ｄｓＲＮＡ剤は、このｄｓＲＮＡ剤の１つ以上の特性を最適化し得る。多くの場合、糖質部分は、キラル修飾ｄｓＲＮＡ剤の修飾サブユニットに付着する。例えば、キラル修飾ｄｓＲＮＡ剤の１つ以上のリボヌクレオチドサブユニットのリボース糖を、別の部分、例えば、糖質リガンドが付着する非糖質担体（好ましくは環状）で置換することができる。サブユニットのリボース糖がこのように置換されたリボヌクレオチドサブユニットは、本明細書では、リボース置換修飾サブユニット（ＲＲＭＳ）と呼ばれる。環状担体は、炭素環系、即ち全ての環原子が炭素原子である環系であっても良いし、又は複素環系、即ち１つ以上の環原子が、ヘテロ原子、例えば、窒素、酸素、硫黄であり得る環系であっても良い。環状担体は、単環系であっても良いし、又は２つ以上の環、例えば、融合環を含んでも良い。環状担体は、完全に飽和した環系であっても良いし、又は１つ以上の二重結合を含んでも良い。
リガンドは、担体によってポリヌクレオチドに付着することができる。担体は、（ｉ）少なくとも１つの「骨格付着点（ｂａｃｋｂｏｎｅ ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ ｐｏｉｎｔ）」、好ましくは２つの「骨格付着点」、及び（ｉｉ）少なくとも１つの「テザー付着点（ｔｅｔｈｅｒｉｎｇ ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ ｐｏｉｎｔ）」を含む。本明細書で使用される「骨格付着点」は、官能基、例えば、ヒドロキシル基、又は一般に、リボ核酸の骨格、例えば、リン酸塩の骨格、若しくは、例えば、硫黄を含有する修飾リン酸塩の骨格への担体の組み込みに利用可能であり、且つ適した結合を指す。「テザー付着点」（ＴＡＰ）は、一部の実施形態では、選択された部分を接続する環状担体の構成環原子、例えば、炭素原子又はヘテロ原子（骨格付着点を提供する原子とは異なる）を指す。この選択された部分は、例えば、糖質、例えば、単糖、二糖、三糖、四糖、オリゴ糖、及び多糖であり得る。任意選択で、選択された部分は、介在テザー（ｉｎｔｅｒｖｅｎｉｎｇ ｔｅｔｈｅｒ）によって環状担体に接続される。従って、環状担体は、しばしば、官能基、例えば、アミノ基を含む、又は、一般に、別の化学物質、例えば、リガンドの構成環への組み込み又は連結（ｔｅｔｈｅｒｉｎｇ）に適した結合を可能にする。
一実施形態では、キラル修飾ｄｓＲＮＡ剤は、担体を介してリガンドにコンジュゲートし、この担体は、環状基又は非環状基であり得；好ましくは、環状基は、ピロリジニル、ピラゾリニル、ピラゾリジニル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、［１，３］ジオキソラン、オキサゾリジニル、イソキサゾリジニル、モルホリニル、チアゾリジニル、イソチアゾリジニル、キノキサリニル、ピリダジノニル、テトラヒドロフリル、及びデカリンから選択され；好ましくは、非環状基は、セリノール骨格又はジエタノールアミン骨格から選択される。
キラル修飾ｄｓＲＮＡは、任意選択で、１つ以上のリガンドとコンジュゲートしても良い。リガンドは、３’末端、５’末端、又は両末端でセンス鎖、アンチセンス鎖、又は両鎖に付着することができる。例えば、リガンドは、センス鎖、特にセンス鎖の３’末端にコンジュゲートすることができる。
一実施形態では、キラル修飾ｄｓＲＮＡ剤は、５’リン酸化されるか、又は５’末端にホスホリル類似体を含む。５’リン酸修飾は、ＲＩＳＣ媒介遺伝子サイレンシングに適合する修飾を含む。適切な修飾としては：５’－一リン酸（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ－Ｏ－５’）；５’－二リン酸（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ－Ｏ－Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）－Ｏ－５’）；５’－三リン酸（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ－Ｏ－（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ－Ｏ－Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）－Ｏ－５’）；５’－グアノシンキャップ（７－メチル化又は非メチル化）（７ｍ－Ｇ－Ｏ－５’－（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ－Ｏ－（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ－Ｏ－Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）－Ｏ－５’）；５’－アデノシンキャップ（Ａｐｐｐ）、及び任意の修飾又は非修飾ヌクレオチドキャップ構造（Ｎ－Ｏ－５’－（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ－Ｏ－（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ－Ｏ－Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）－Ｏ－５’）；５’－モノチオホスフェート（ホスホロチオエート；（ＨＯ）２（Ｓ）Ｐ－Ｏ－５’）；５’－モノジチオホスフェート（ホスホロジチオエート；（ＨＯ）（ＨＳ）（Ｓ）Ｐ－Ｏ－５’）、５’－ホスホロチオレート（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ－Ｓ－５’）；酸素／硫黄置換一リン酸、二リン酸、及び三リン酸（例えば、５’－α－チオ三リン酸、５’－γ－チオ三リン酸など）、５’－ホスホラミデート（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ－ＮＨ－５’、（ＨＯ）（ＮＨ２）（Ｏ）Ｐ－Ｏ－５’）、５’－アルキルホスホネート（Ｒ＝アルキル＝メチル、エチル、イソプロピル、プロピルなど、例えば、ＲＰ（ＯＨ）（Ｏ）－Ｏ－５’－、５’－アルケニルホスホネート（即ち、ビニル、置換ビニル）、（ＯＨ）２（Ｏ）Ｐ－５’－ＣＨ２－）、５’－アルキルエーテルホスホネート（Ｒ＝アルキルエーテル＝メトキシメチル（ＭｅＯＣＨ２－）、エトキシメチルなど、例えば、ＲＰ（ＯＨ）（Ｏ）－Ｏ－５’－）の任意のさらなる組み合わせが挙げられる。一例では、修飾は、キラル修飾ｄｓＲＮＡ剤のアンチセンス鎖に配置することができる。
リガンド
多種多様な物質が、本発明のオリゴヌクレオチドに結合することができる。好ましい部分は、直接的に又は介在テザーを介して間接的に、好ましくは共有結合で結合されるリガンドである。
好ましい実施形態では、リガンドは、このリガンドが取り込まれる分子の分布、標的化、又は寿命を変更する。好ましい実施形態では、リガンドは、例えば、このようなリガンドが存在しない種と比較して、選択される標的、例えば、分子、細胞若しくは細胞型、区画、受容体、例えば、細胞若しくは器官の区画、組織、器官、又は体の領域に対する親和性を高める。選択される標的に対する親和性を高めるリガンドは、標的化リガンドとも呼ばれる。
一部のリガンドは、エンドソーム溶解特性を有し得る。エンドソーム溶解リガンドは、エンドソームの溶解、及び／又は本発明の組成物若しくはその成分のエンドソームから細胞の細胞質への輸送を促進する。エンドソーム溶解リガンドは、ｐＨ依存性の膜活性及び融合性を示すポリアニオン性ペプチド又はペプチド模倣体であっても良い。一実施形態では、エンドソーム溶解リガンドは、エンドソームのｐＨでその活性型立体構造をとると推定される。「活性型」立体構造とは、エンドソーム溶解リガンドが、エンドソームの溶解、及び／又は本発明の組成物若しくはその成分のエンドソームから細胞の細胞質への輸送を促進する立体構造のことである。例示的なエンドソーム溶解リガンドとしては、ＧＡＬＡペプチド（参照によりその全内容が本明細書に組み入れられる、Ｓｕｂｂａｒａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９８７，２６：２９６４－２９７２）、ＥＡＬＡペプチド（参照によりその全内容が本明細書に組み入れられる、Ｖｏｇｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９９６，１１８：１５８１－１５８６）、及びこれらの誘導体（参照によりその全内容が本明細書に組み入れられる、Ｔｕｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，２００２，１５５９：５６－６８）が挙げられる。一実施形態では、エンドソーム溶解成分は、ｐＨの変化に応じて電荷又はプロトン化の変化を起こす化学基（例えば、アミノ酸）を含み得る。エンドソーム溶解成分は、直鎖であっても、分岐鎖であっても良い。
リガンドは、輸送、ハイブリダイゼーション、及び特異性の特性を向上させることができ、結果として得られる天然オリゴリボヌクレオチド若しくは修飾オリゴリボヌクレオチド、又は本明細書に記載されるモノマー及び／若しくは天然リボヌクレオチド若しくは修飾リボヌクレオチドの任意の組み合わせを含むポリマー分子のヌクレアーゼ耐性も向上させることができる。
リガンドは、一般に、例えば、取り込みを増強するための治療用修飾因子；例えば、分布を監視するための診断化合物又はレポーター基；架橋剤；及びヌクレアーゼ耐性を付与する部分を含み得る。一般的な例として、脂質、ステロイド、ビタミン、糖、タンパク質、ペプチド、ポリアミン、及びペプチド模倣体が挙げられる。
リガンドとしては、天然に存在する物質、例えば、タンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）、若しくはグロブリン）；糖質（例えば、デキストラン、プルラン、キチン、キトサン、イヌリン、シクロデキストリン、若しくはヒアルロン酸）；又は脂質を挙げることができる。リガンドは、組換え分子又は合成分子、例えば、合成ポリマー、例えば、合成ポリアミノ酸、オリゴヌクレオチド（例えば、アプタマー）であっても良い。ポリアミノ酸を含むポリアミノ酸としては、ポリリジン（ＰＬＬ）、ポリＬ－アスパラギン酸、ポリＬ－グルタミン酸、スチレン－無水マレイン酸コポリマー、ポリ（Ｌ－ラクチド－コ－グリコリド）コポリマー、ジビニルエーテル無水マレイン酸コポリマー、Ｎ－（２－ヒドロキシプロピル）メタクリルアミドコポリマー（ＨＭＰＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリウレタン、ポリ（２－エチルアクリル酸）、Ｎ－イソプロピルアクリルアミドポリマー、又はポリホスファジンが挙げられる。ポリアミンの例として、ポリエチレンイミン、ポリリジン（ＰＬＬ）、スペルミン、スペルミジン、ポリアミン、擬似ペプチド－ポリアミン、ペプチド模倣ポリアミン、デンドリマーポリアミン、アルギニン、アミジン、プロタミン、カチオン性脂質、カチオン性ポルフィリン、ポリアミンの第四級塩、又はアルファへリックスペプチドが挙げられる。
リガンドとして、標的化基、例えば、細胞標的化剤又は組織標的化剤、例えば、腎臓細胞などの特定の細胞型に結合するレクチン、糖タンパク質、脂質、若しくはタンパク質、例えば、抗体も挙げることができる。標的化基は、チロトロピン、メラノトロピン、レクチン、糖タンパク質、界面活性剤タンパク質Ａ、ムチン糖質、多価ラクトース、多価ガラクトース、Ｎ－アセチル－ガラクトサミン、Ｎ－アセチル－グルコサミン、多価マンノース、多価フコース、グリコシル化ポリアミノ酸、多価ガラクトース、トランスフェリン、ビスホスホネート、ポリグルタミン酸塩、ポリアスパラギン酸塩、脂質、コレステロール、ステロイド、胆汁酸、葉酸塩、ビタミンＢ１２、ビオチン、ＲＧＤペプチド、ＲＧＤペプチド模倣体、又はアプタマーであっても良い。
リガンドの他の例として、色素、挿入剤（例えば、アクリジン）、架橋剤（例えば、プソラレン、マイトマイシンＣ）、ポルフィリン（ＴＰＰＣ４、テキサフィリン、サフィリン）、多環式芳香族炭化水素（例えば、フェナジン、ジヒドロフェナジン）、人工エンドヌクレアーゼ又はキレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）、親油性分子、例えば、コレステロール、コール酸、アダマンタン酢酸、１－ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、１，３－ビス－Ｏ（ヘキサデシル）グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、１，３－プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、Ｏ３－（オレオイル）リトコール酸、Ｏ３－（オレオイル）コレン酸、ジメトキシトリチル、若しくはフェノキサジン）及びペプチドコンジュゲート（例えば、アンテナペディアペプチド、Ｔａｔペプチド）、アルキル化剤、リン酸塩、アミノ、メルカプト、ＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ－４０Ｋ）、ＭＰＥＧ、［ＭＰＥＧ］２、ポリアミノ、アルキル、置換アルキル、放射性標識マーカー、酵素、ハプテン（例えば、ビオチン）、輸送／吸収促進剤（例えば、アスピリン、ビタミンＥ、葉酸）、合成リボヌクレアーゼ（例えば、イミダゾール、ビスイミダゾール、ヒスタミン、イミダゾールクラスター、アクリジン－イミダゾールコンジュゲート、テトラアザマクロ環のＥｕ３＋複合体）、ジニトロフェニル、ＨＲＰ、又はＡＰが挙げられる。
リガンドは、タンパク質、例えば、糖タンパク質、又はペプチド、例えば、共リガンドに対して特異的な親和性を有する分子、又は抗体、例えば、癌細胞、内皮細胞、若しくは骨細胞などの特定の細胞型に結合する抗体であっても良い。リガンドとして、ホルモン及びホルモン受容体も挙げることができる。リガンドとして、非ペプチド種、例えば、脂質、レクチン、糖質、ビタミン、コファクター、多価ラクトース、多価ガラクトース、Ｎ－アセチル－ガラクトサミン、Ｎ－アセチル－グルコサミン、多価マンノース、多価フコース、又はアプタマーも挙げることができる。リガンドは、例えば、リポ多糖、ｐ３８ ＭＡＰキナーゼの活性化因子、又はＮＦ－κＢの活性化因子であっても良い。
リガンドは、例えば、細胞の細胞骨格を破壊することによって、例えば、細胞の微小管、マイクロフィラメント、及び／又は中間径フィラメントを破壊することによって、ｉＲＮＡ剤の細胞内への取り込みを増大させることができる物質、例えば、薬物であっても良い。薬物は、例えば、タクソン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、サイトカラシン、ノコダゾール、ジャプラキノリド（ｊａｐｌａｋｉｎｏｌｉｄｅ）、ラトランクリンＡ、ファロイジン、スウィンホリドＡ、インダノシン、又はミオセルビン（ｍｙｏｓｅｒｖｉｎ）であっても良い。
リガンドは、例えば、炎症反応を活性化することによって、オリゴヌクレオチドの細胞への取り込みを増加させることができる。このような効果を有し得る例示的なリガンドとしては、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ－α）、インターロイキン－１β、又はγインターフェロンが挙げられる。
一態様では、リガンドは、脂質又は脂質ベースの分子である。このような脂質又は脂質ベースの分子は、好ましくは血清タンパク質、例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に結合する。ＨＳＡ結合リガンドは、コンジュゲートが、標的組織、例えば、体の非腎臓標的組織に分布するのを可能にする。例えば、標的組織は、肝臓の実質細胞を含む肝臓であっても良い。ＨＳＡに結合し得る他の分子もリガンドとして使用することができる。例えば、ナプロキセン又はアスピリンを使用することができる。脂質又は脂質ベースのリガンドは、（ａ）コンジュゲートの分解に対する耐性を増大させ、（ｂ）標的細胞又は細胞膜への標的化又は輸送を増大させることができ、且つ／又は（ｃ）血清タンパク質、例えば、ＨＳＡに対する結合を調節するために使用することができる。
脂質ベースのリガンドは、標的組織に対するコンジュゲートの結合を調節、例えば、制御するために使用することができる。例えば、ＨＳＡにより強く結合する脂質又は脂質ベースのリガンドは、腎臓を標的とする可能性が低く、従って、体内から除去される可能性が低い。ＨＳＡにそれほど強く結合しない脂質又は脂質ベースのリガンドは、コンジュゲートが腎臓を標的にするように使用することができる。
好ましい実施形態では、脂質ベースのリガンドはＨＳＡに結合する。好ましくは、脂質ベースのリガンドは、コンジュゲートが、好ましくは非腎臓組織に分布するように、十分な親和性でＨＳＡに結合する。しかしながら、好ましくは、この親和性は、ＨＳＡ－リガンド結合が逆行できないほど強力ではない。
別の好ましい実施形態では、脂質ベースのリガンドは、ＨＳＡに対して弱く結合するか又は全く結合しないため、コンジュゲートが、好ましくは腎臓に分布する。腎細胞を標的とする他の部分も、脂質ベースのリガンドの代わりに、又はこれに加えて使用することができる。
別の態様では、リガンドは、標的細胞、例えば、増殖細胞によって取り込まれる部分、例えば、ビタミンである。これらは、例えば、悪性型又は非悪性型、例えば、癌細胞の望ましくない細胞増殖を特徴とする障害を治療するのに特に有用である。例示的なビタミンとしては、ビタミンＡ、Ｅ、及びＫが挙げられる。他の例示的なビタミンとしては、ビタミンＢ、例えば、葉酸、Ｂ１２、リボフラビン、ビオチン、ピリドキサール、又は癌細胞によって取り込まれる他のビタミン若しくは栄養素が挙げられる。また、ＨＡＳ、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、及び高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）もが挙げられる。
別の態様では、リガンドは、細胞透過剤、好ましくはヘリックス型の細胞透過剤である。好ましくは、作用剤は両親媒性である。例示的な作用剤は、ペプチド、例えば、ｔａｔ又はアンテナペディアである。作用剤がペプチドである場合、ペプチジル模倣体、反転異性体、非ペプチド結合又は偽ペプチド結合、及びＤ－アミノ酸の使用を含む修飾を施すことができる。好ましくは、このヘリックス型の細胞透過剤は、好ましくは親油性相及び疎油性相を有するアルファヘリックス型の作用剤である。
リガンドは、ペプチド又はペプチド模倣体であっても良い。ペプチド模倣体（本明細書ではオリゴペプチド模倣体とも呼ばれる）は、天然ペプチドと同様の定められた３次元構造に折り畳むことができる分子である。ペプチド部分又はペプチド模倣体部分は、約５～５０のアミノ酸長さ、例えば、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、又は５０のアミノ酸長さであっても良い。ペプチド又はペプチド模倣体は、例えば、細胞透過ペプチド、カチオン性ペプチド、両親媒性ペプチド、又は疎水性ペプチド（例えば、主にＴｙｒ、Ｔｒｐ、若しくはＰｈｅから構成される）であっても良い。ペプチド部分は、デンドリマーペプチド、拘束ペプチド、又は架橋ペプチドであっても良い。別の代替では、ペプチド部分は、疎水性の膜輸送配列（ＭＴＳ）を含み得る。例示的な疎水性ＭＴＳ含有ペプチドは、アミノ酸配列ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡＰを有するＲＦＧＦである。疎水性ＭＴＳを含有するＲＦＧＦ類似体（例えば、アミノ酸配列ＡＡＬＬＰＶＬＬＡＡＰ）も標的化部分であっても良い。ペプチド部分は、「送達」ペプチドであっても良く、この送達ペプチドは、ペプチド、オリゴヌクレオチド、及びタンパク質を含む大きな極性分子を、細胞膜を通過して運搬することができる。例えば、ＨＩＶ Ｔａｔタンパク質由来の配列（ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱ）及びショウジョウバエアンテナペディアタンパク質由来の配列（ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ）は、送達ペプチドとして機能できることが分かっている。ペプチド又はペプチド模倣体、例えば、ファージディスプレイライブラリー、又は１ビーズ１化合物（ＯＢＯＣ）コンビナトリアルライブラリーから特定されたペプチドは、ＤＮＡのランダム配列によってコードされても良い（参照によりその全内容が本明細書に組み入れられる、Ｌａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５４：８２－８４，１９９１）。好ましくは、組み込まれたモノマー単位を介してｉＲＮＡ剤に連結されたペプチド又はペプチド模倣体は、細胞標的化ペプチド、例えば、アルギニン－グリシン－アスパラギン酸（ＲＧＤ）－ペプチド又はＲＧＤ模倣体である。ペプチド部分は、約５つのアミノ酸長さ～約４０のアミノ酸長さの範囲とすることができる。ペプチド部分は、例えば、安定性又は直接的な立体構造特性を高めるための、構造変化を有し得る。下記の構造変化のいずれも利用することができる。ＲＧＤペプチド部分は、内皮腫瘍細胞又は乳癌腫瘍細胞などの腫瘍細胞を標的とするために使用することができる（参照によりその全内容が本明細書に組み入れられる、Ｚｉｔｚｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，６２：５１３９－４３，２００２）。ＲＧＤペプチドは、肺、腎臓、脾臓、又は肝臓を含む種々の他の組織の腫瘍に対するｉＲＮＡ剤の標的化を促進することができる（参照によりその全内容が本明細書に組み入れられる、Ａｏｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ８：７８３－７８７，２００１）。好ましくは、ＲＧＤペプチドは、腎臓に対するｉＲＮＡ剤の標的化を促進する。ＲＧＤペプチドは、直鎖又は環状であっても良く、特定の組織に対する標的化を促進するために修飾する、例えば、グリコシル化又はメチル化することができる。例えば、グリコシル化ＲＧＤペプチドは、αｖβ３を発現する腫瘍細胞にｉＲＮＡ剤を送達することができる（参照によりその全内容が本明細書に組み入れられる、Ｈａｕｂｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．，４２：３２６－３３６，２００１）。増殖細胞に豊富なマーカーを標的とするペプチドを使用することができる。例えば、ＲＧＤ含有ペプチド及びＲＧＤ含有ペプチド模倣体は、癌細胞、特に、インテグリンを提示する細胞を標的とすることができる。従って、ＲＧＤペプチド、ＲＧＤを含有する環状ペプチド、Ｄ－アミノ酸を含むＲＧＤペプチド、及び合成ＲＧＤ模倣体を使用することができる。ＲＧＤに加えて、インテグリンリガンドを標的とする他の部分を使用することもできる。一般に、このようなリガンドは、増殖細胞及び血管新生を制御するために使用することができる。この種のリガンドの好ましいコンジュゲートは、ＰＥＣＡＭ－１、ＶＥＧＦ、又は他の癌遺伝子、例えば、本明細書に記載される癌遺伝子を標的とする。
「細胞透過ペプチド」は、細胞、例えば、微生物細胞、例えば、細菌細胞若しくは真菌細胞、又は哺乳動物細胞、例えば、ヒト細胞を透過することができる。微生物細胞を透過するペプチドは、例えば、α－ヘリックス直鎖ペプチド（例えば、ＬＬ－３７若しくはセロピンＰ１）、ジスルフィド結合含有ペプチド（例えば、α－ディフェンシン、β－ディフェンシン、若しくはバクテネシン）、又は１種若しくは２種の優勢なアミノ酸のみを含有するペプチド（例えば、ＰＲ－３９若しくはインドリシジン）であっても良い。細胞透過ペプチドは、核局在化シグナル（ＮＬＳ）も含み得る。例えば、細胞透過ペプチドは、ＨＩＶ－１ ｇｐ４１の融合ペプチドドメイン及びＳＶ４０ラージＴ抗原のＮＬＳに由来する二部両親媒性ペプチド、例えば、ＭＰＧであっても良い（参照によりその全内容が本明細書に組み入れられる、Ｓｉｍｅｏｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１：２７１７－２７２４，２００３）。
一実施形態では、標的化ペプチドは、両親媒性α－ヘリックスペプチドであっても良い。例示的な両親媒性α－ヘリックスペプチドとしては、限定されるものではないが、セクロピン、リコトキシン（ｌｙｃｏｔｏｘｉｎ）、パラダキシン（ｐａｒａｄａｘｉｎ）、ブフォリン、ＣＰＦ、ボンビニン－様ペプチド（ＢＬＰ）、カテリシジン、セラトトキシン（ｃｅｒａｔｏｔｏｘｉｎ）、エボヤ（Ｓ．ｃｌａｖａ）ペプチド、メクラウナギ腸抗菌ペプチド（ＨＦＩＡＰ）、マガイニン、ブレビニン－２、デルマセプチン、メリチン、プレウロシジン、Ｈ２Ａペプチド、アフリカツメガエルペプチド、エスクレンチニス－１（ｅｓｃｕｌｅｎｔｉｎｉｓ－１）、及びカエリンが挙げられる。好ましくは、多数の因子が、ヘリックス安定性の完全性を維持すると見なされる。例えば、最大数のヘリックス安定化残基（例えばｌｅｕ、ａｌａ、又はｌｙｓ）を利用し、最小数のヘリックス不安定化残基（例えばプロリン、又は環状モノマー単位を利用する。キャッピング残基も考慮される（例えば、Ｇｌｙは、例示的なＮ－キャッピング残基であり、且つ／又はＣ末端アミド化は、追加的な水素結合を実現してヘリックスを安定させるために使用することができる。ｉ±３位、又はｉ±４位離間した、反対の電荷を有する残基間の塩架橋の形成によって安定させることができる。カチオン性残基、例えば、リジン、アルギニン、ホモ－アルギニン、オルニチン、又はヒスチジンは、アニオン性残基であるグルタミン酸又はアスパラギン酸と塩架橋を形成し得る。
ペプチドリガンド及びペプチド模倣体リガンドとしては、天然ペプチド又は修飾ペプチド、例えば、Ｄペプチド若しくはＬペプチド；αペプチド、βペプチド、若しくはγペプチド；Ｎ－メチルペプチド；アザペプチド；１つ以上の尿素結合、チオ尿素結合、カルバミン酸結合、若しくはスルホニル尿素結合で置換された１つ以上のアミド結合、即ち、ペプチ結合を有するペプチド；又は環状ペプチドを有するリガンドが挙げられる。
標的化リガンドは、特定の受容体を標的とすることができるあらゆるリガンドであっても良い。例として、葉酸塩、ＧａｌＮＡｃ、ガラクトース、マンノース、マンノース－６Ｐ、糖クラスター、例えば、ＧａｌＮＡｃクラスター、マンノースクラスター、ガラクトースクラスター、又はアプタマーが挙げられる。クラスターは、２つ以上の糖単位の組み合わせである。標的化リガンドは、インテグリン受容体リガンド、ケモカイン受容体リガンド、トランスフェリン、ビオチン、セロトニン受容体リガンド、ＰＳＭＡ、エンドセリン、ＧＣＰＩＩ、ソマトスタチン、ＬＤＬリガンド、及びＨＤＬリガンドも含む。リガンドは、核酸、例えば、アプタマーをベースにしても良い。アプタマーは、未修飾でも良いし、又は本明細書に開示される修飾の任意の組み合わせを有しても良い。
エンドソーム放出剤としては、イミダゾール、ポリ又はオリゴイミダゾール、ＰＥＩ、ペプチド、融合性ペプチド、ポリカーボキシレート、ポリカチオン、マスクオリゴ又はポリカチオン又はアニオン、アセタール、ポリアセタール、ケタール／ポリケチアル（ｐｏｌｙｋｅｔｙａｌ）、オルトエステル、マスク又は非マスクカチオン又はアニオン電荷を有するポリマー、マスク又は非マスクカチオン又はアニオン電荷を有するデンドリマーが挙げられる。
ＰＫモジュレーターとは、薬物動態学的モジュレーターのことである。ＰＫモジュレーターとしては、脂肪親和物、胆汁酸、ステロイド、リン脂質類似体、ペプチド、タンパク質結合剤、ＰＥＧ、ビタミンなどが挙げられる。例示的なＰＫモジュレーターとしては、限定されるものではないが、コレステロール、脂肪酸、コール酸、リトコール酸、ジアルキルグリセリド、ジアシルグリセリド、リン脂質、スフィンゴ脂質、ナプロキセン、イブプロフェン、ビタミンＥ、ビオチンなどが挙げられる。多数のホスホロチオエート連結を含むオリゴヌクレオチドも、血清タンパク質に結合することが知られており、したがって、骨格に多数のホスホロチオエート連結を含む短鎖オリゴヌクレオチド、例えば、約５塩基、１０塩基、１５塩基、又は２０塩基のオリゴヌクレオチドも、リガンドとして（例えば、ＰＫ調節リガンドとして）本発明に適用可能である。
加えて、血清成分（例えば、血清タンパク質）に結合するアプタマーも、ＰＫ調節リガンドとして本発明に適用可能である。
本発明に適用可能な他のリガンドコンジュゲートは、参照によりそれらの全開示内容が本明細書に組み入れられる、２００４年８月１０日出願の米国特許出願第１０／９１６，１８５号明細書；２００４年９月２１日出願の同第１０／９４６，８７３号明細書；２００７年８月３日出願の同第１０／８３３，９３４号明細書；２００５年４月２７日出願の同第１１／１１５，９８９号明細書、及び２００７年１１月２１日出願の同第１１／９４４，２２７号明細書に記載されている。
２つ以上のリガンドが存在する場合、リガンドは、全て同じ特性を有しても良いし、全てが異なる特性を有しても良く、又は一部のリガンドが、同じ特性を有する一方、他のリガンドが異なる特性を有しても良い。例えば、リガンドは、標的化特性を有しても良いし、エンドソーム的活性を有して良いし、又はＰＫ調節特性を有しても良い。好ましい実施形態では、全てのリガンドが異なる特性を有する。
リガンドは、様々な位置、例えば３’末端、５’末端、及び／又は内部位置で、オリゴヌクレオチドに結合することができる。好ましい実施形態では、リガンドは、介在テザー、例えば、本明細書に記載される担体を介してオリゴヌクレオチドに結合している。前記モノマーが成長している鎖に組み込まれる場合、リガンド又はテザーリガンドは、このモノマーに存在しても良い。一部の実施形態では、リガンドは、「前駆体」モノマーが、成長している鎖に組み込まれた後で、前記「前駆体」モノマーへの結合によって組み込むことができる。例えば、末端がアミノであるテザー（即ち、リガンドが結合されていない）、例えば、ＴＡＰ－（ＣＨ２）ｎＮＨ２を有するモノマーを、成長しているオリゴヌクレオチド鎖に組み込むことができる。これに続く作業、即ち、前駆体モノマーが鎖に組み込まれた後で、リガンドの求電子基と前駆体モノマーのテザーの末端求核基との結合によって、求電子基、例えば、ペンタフルオロフェニルエステル又はアルデヒド基を有するリガンドを、その後、前駆体モノマーに結合させることができる。
別の例では、クリック化学反応に参加するのに適した化学基を有するモノマーを、例えば、末端がアジド又はアルキンのテザー／リンカーに組み込むことができる。これに続く作業、即ち、前駆体モノマーが鎖に組み込まれた後で、相補的な化学基、例えば、アルキン又はアジドを有するリガンドを、アルキン及びアジドを共に結合することによって前駆体モノマーに結合することができる。
二本鎖オリゴヌクレオチドの場合、リガンドは、一方又は両方の鎖に結合することができる。一部の実施形態では、二本鎖ｉＲＮＡ剤は、センス鎖にコンジュゲートされたリガンドを含有する。他の実施形態では、二本鎖ｉＲＮＡ剤は、アンチセンス鎖にコンジュゲートされたリガンドを含有する。
一部の実施形態では、リガンドは、核酸分子の核酸塩基、糖部分、又はヌクレオシド間結合にコンジュゲートすることができる。プリン核酸塩基又はその誘導体に対するコンジュゲーションは、環内原子及び環外原子を含む任意の位置に生じ得る。一部の実施形態では、プリン核酸塩基の２位、６位、７位、又は８位が、コンジュゲート部分に結合している。また、ピリミジン核酸塩基又はその誘導体に対するコンジュゲーションは、どの位置で生じても良い。一部の実施形態では、ピリミジン核酸塩基の２位、５位、及び６位を、コンジュゲート部分と置換することができる。ヌクレオシドの糖部分に対するコンジュゲーションは、どの炭素原子で生じても良い。コンジュゲート部分に結合することができる糖部分の炭素原子の例には、２’、３’、及び５’炭素原子が挙げられる。１’位も、コンジュゲート部分、例えば、脱塩基残基に結合することができる。ヌクレオシド間結合も、コンジュゲート部分を保持することができる。リン含有結合（例えば、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｄｉｔｈｉｏｔａｔｅ）、及びホスホロアミデートなど）の場合、コンジュゲート部分は、リン原子に直接結合する、又はリン原子に結合しているＯ、Ｎ、又はＳ原子に結合することができる。アミン又はアミドを含有するヌクレオシド間結合（例えば、ＰＮＡ）の場合、コンジュゲート部分は、アミン又はアミドの窒素原子に、又は隣接する炭素原子に結合することができる。
ＲＮＡ干渉の分野におけるあらゆる適切なリガンドを使用することができるが、このようなリガンドは、典型的には、糖質、例えば、単糖（例えば、ＧａｌＮＡｃ）、二糖、三糖、四糖、多糖である。
リガンドを核酸にコンジュゲートさせるリンカーは、上述のリンカーを含む。例えば、リガンドは、一価、二価又は三価の分岐リンカーによって付着された１つ以上のＧａｌＮＡｃ（Ｎ－アセチルグルコサミン）誘導体であっても良い。
一実施形態では、キラル修飾ｄｓＲＮＡは、次の式（ＩＶ）～（ＶＩＩ）の何れかに示されている構造を含む二価及び三価の分岐リンカーにコンジュゲートする：
Figure 0007348185000010
 式中、
ｑ２Ａ、ｑ２Ｂ、ｑ３Ａ、ｑ３Ｂ、ｑ４Ａ、ｑ４Ｂ、ｑ５Ａ、ｑ５Ｂ、及びｑ５Ｃは存在ごとに独立して、０～２０を表し、反復単位は、同じであっても良いし、又は異なっていても良く；
Ｐ２Ａ、Ｐ２Ｂ、Ｐ３Ａ、Ｐ３Ｂ、Ｐ４Ａ、Ｐ４Ｂ、Ｐ５Ａ、Ｐ５Ｂ、Ｐ５Ｃ、Ｔ２Ａ、Ｔ２Ｂ、Ｔ３Ａ、Ｔ３Ｂ、Ｔ４Ａ、Ｔ４Ｂ、Ｔ５Ａ、Ｔ５Ｂ、Ｔ５Ｃはそれぞれ存在ごとに独立して、存在しないか、ＣＯ、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＯＣ（Ｏ）、ＮＨＣ（Ｏ）、ＣＨ２、ＣＨ２ＮＨ、又はＣＨ２Ｏを表し；
Ｑ２Ａ、Ｑ２Ｂ、Ｑ３Ａ、Ｑ３Ｂ、Ｑ４Ａ、Ｑ４Ｂ、Ｑ５Ａ、Ｑ５Ｂ、Ｑ５Ｃは存在ごとに独立して、存在しないか、アルキレン、置換アルキレンを表し、１つ以上のメチレンは、Ｏ、Ｓ、Ｓ（Ｏ）、ＳＯ２、Ｎ（ＲＮ）、Ｃ（Ｒ’）＝Ｃ（Ｒ’’）、Ｃ≡Ｃ、又はＣ（Ｏ）の１つ以上によって中断又は終了させることができ；
Ｒ２Ａ、Ｒ２Ｂ、Ｒ３Ａ、Ｒ３Ｂ、Ｒ４Ａ、Ｒ４Ｂ、Ｒ５Ａ、Ｒ５Ｂ、Ｒ５Ｃはそれぞれ存在ごとに独立して、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＣＨ２、Ｃ（Ｏ）Ｏ、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、ＮＨＣＨ（Ｒａ）Ｃ（Ｏ）、－Ｃ（Ｏ）－ＣＨ（Ｒａ）－ＮＨ－、ＣＯ、ＣＨ＝Ｎ－Ｏ、
Figure 0007348185000011
 、又はヘテロシクリルを表し；
Ｌ２Ａ、Ｌ２Ｂ、Ｌ３Ａ、Ｌ３Ｂ、Ｌ４Ａ、Ｌ４Ｂ、Ｌ５Ａ、Ｌ５Ｂ、及びＬ５Ｃは、リガンドを表す；即ち、それぞれ存在ごとに独立して、単糖（例えば、ＧａｌＮＡｃ）、二糖、三糖、四糖、オリゴ糖、又は多糖を表し；且つ
Ｒａは、Ｈ又はアミノ酸側鎖である。
三価コンジュゲートＧａｌＮＡｃ誘導体、例えば、式（ＶＩＩ）のような誘導体は、標的遺伝子の発現を阻害するためのＲＮＡｉ剤と共に使用すると特に有用である：
Figure 0007348185000012
 式中、Ｌ５Ａ、Ｌ５Ｂ、及びＬ５Ｃは、単糖、例えば、ＧａｌＮＡｃ誘導体を表す。
適切な二価及び三価分岐リンカー基コンジュゲートＧａｌＮＡｃ誘導体は、限定されるものではないが、以下の化合物を含む：
Figure 0007348185000013
定義
本明細書で使用される「ｄｓＲＮＡ剤」、「ｓｉＲＮＡ」、及び「ｉＲＮＡ剤」は、標的ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ、例えば、タンパク質をコードする遺伝子の転写物のサイレンシングを媒介することができる作用剤と互換的に使用される。便宜上、このようなｍＲＮＡは、本明細書ではサイレンシングされるｍＲＮＡとも呼ばれる。このような遺伝子は、標的遺伝子とも呼ばれる。一般に、サイレンシングされるＲＮＡは、内在性遺伝子又は病原遺伝子である。加えて、ｍＲＮＡ以外のＲＮＡ、例えば、ｔＲＮＡ、及びウイルスＲＮＡも標的とすることができる。
本明細書で使用される「ＲＮＡｉを媒介する」という句は、標的ＲＮＡを配列特異的にサイレンシングする能力を指す。理論に拘束されることを望むものではないが、サイレンシングは、ＲＮＡｉ機構又はプロセス及びガイドＲＮＡ、例えば、２１～２３のヌクレオチドのｓｉＲＮＡ剤を使用すると考えられる。
本明細書で使用される「特異的にハイブリダイズ可能な」及び「相補的な」は、本発明の化合物と標的ＲＮＡ分子との間に安定した特異的な結合が生じるような十分な相補性を示すために使用される語である。特異的な結合は、特異的な結合が望ましい条件下、即ち、アッセイ若しくは治療の場合の生理的条件下、又はｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイの場合、アッセイが行われる条件下、オリゴマー化合物の非標的配列への特異的な結合を回避するために十分な相補性を必要とする。非標的配列は、典型的には、少なくとも５つのヌクレオチドが異なる。
一実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ剤は、このｄｓＲＮＡ剤が、標的ｍＲＮＡによってコードされるタンパク質の産生をサイレンシングするように、標的ＲＮＡ、例えば、標的ｍＲＮＡに「十分に相補的」である。別の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ剤は、標的ＲＮＡに「厳密に相補的」である、例えば、標的ＲＮＡとｄｓＲＮＡ二重鎖剤とがアニーリングして、例えば、厳密に相補的な領域におけるワトソン－クリック型塩基対のみからなるハイブリッドを形成する。「十分に相補的な」標的ＲＮＡは、標的ＲＮＡに厳密に相補的な内部領域（例えば、少なくとも１０のヌクレオチド）を含み得る。さらに、一部の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ剤は、１つのヌクレオチドの違いを特異的に識別する。この場合、ｄｓＲＮＡ剤は、厳密な相補性が、１つのヌクレオチドの違いがある領域（例えば、７つのヌクレオチド以内）で見られる場合にのみＲＮＡｉを媒介する。
本明細書で使用される「オリゴヌクレオチド」という語は、例えば、１００未満、２００未満、３００未満、又は４００未満のヌクレオチドの核酸分子（ＲＮＡ又はＤＮＡ）を指す。
本明細書で使用される「立体化学的異性体形態」という語句は、同じ一連の結合によって結合された同じ原子から構成されるが、置き換えできない異なる三次元構造を有する異なる化合物を指す。本発明のいくつかの実施形態では、提供される化学組成物は、化合物の個々の立体化学的異性体形態の純粋な調製物であるか、又はそれを含み得；いくつかの実施形態では、提供される化学組成物は、化合物の２つ以上の立体化学的異性体形態の混合物であるか、又はそれを含み得る。特定の実施形態では、そのような混合物は、等量の異なる立体化学的異性体形態を含み；特定の実施形態では、そのような混合物は、異なる量の少なくとも２つの異なる立体化学的異性体形態を含む。いくつかの実施形態では、化学組成物は、化合物のすべてのジアステレオマー及び／又はエナンチオマーを含み得る。いくつかの実施形態では、化学組成物は、化合物のすべてより少ないジアステレオマー及び／又はエナンチオマーを含み得る。いくつかの実施形態では、本発明の化合物の特定のエナンチオマーが望ましい場合、この特定のエナンチオマーは、例えば、不斉合成によって、又は得られるジアステレオマー混合物が分離され、補助基が切断されて純粋な所望のエナンチオマーが提供されるキラル補助基を用いた誘導によって調製することができる。或いは、分子がアミノなどの塩基性官能基を含む場合、ジアステレオマー塩は、適切な光学活性酸で形成され、例えば、分別結晶によって分割される。
「結合リン」という語句は、天然に存在するＤＮＡ及びＲＮＡに存在するヌクレオチド間結合のホスホジエステルのリン原子に対応する、ヌクレオチド間結合に存在するリン原子を示すために使用される。いくつかの実施形態では、結合リン原子は、修飾ヌクレオチド間結合（例えば、修飾リン酸結合）中にあり、ホスホジエステル結合の各酸素原子は、任意選択により、且つ独立に、有機部分又は無機部分によって置き換えられる。いくつかの実施形態では、１つ又は複数のキラル修飾ヌクレオチド間結合の結合リン原子はキラルであり、式ＡのＰ＊原子で示されている。いくつかの実施形態では、１つ又は複数のヌクレオチド間結合の結合リン原子はアキラル又はラセミである。
「Ｐ修飾」という用語は、立体化学的修飾以外の結合リンにおける任意の修飾を指す。いくつかの実施形態では、Ｐ修飾は、結合リンに共有結合したペンダント部分の付加、置換、又は除去を含む。いくつかの実施形態では、「Ｐ修飾」は、－Ｘ－Ｌ－Ｒ１であり、式中、Ｘ、Ｌ、及びＲ１はそれぞれ独立に、本明細書で定義され、記載されている通りである。
「ＢＮＡ」という語は、架橋化核酸（ｂｒｉｄｇｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）を指し、制限された又は隔離されたＲＮＡと呼ばれる場合が多い。ＢＮＡは、「固定された」Ｃ３’－エンド糖パッカリング（Ｃ３’－ｅｎｄｏ ｓｕｇａｒ ｐｕｃｋｅｒｉｎｇ）を有する５、６員、さらには７員の架橋構造を含み得る。この架橋は、典型的には、リボースの２’位置、４’位置に含めて、２’，４’－ＢＮＡヌクレオチド（例えば、ＬＮＡ又はＥＮＡ）を得た。ＢＮＡヌクレオチドの例としては、以下のヌクレオシドが挙げられる：
Figure 0007348185000014
「ＬＮＡ」という語は、ロック核酸を指し、制限された又は隔離されたＲＮＡと呼ばれる場合が多い。ＬＮＡは、修飾ＲＮＡヌクレオチドである。ＬＮＡヌクレオチドのリボース部分は、同じリボース糖の２’ヒドロキシルを４’炭素に結合する追加の架橋（例えば、メチレン架橋又はエチレン架橋）で修飾れている。例えば、この架橋は、リボースを以下の３’－エンド（Ｎｏｒｔｈ）高次構造に「ロック」することができる：
Figure 0007348185000015
「ＥＮＡ」という語は、エチレン架橋核酸を指し、制限された又は隔離されたＲＮＡと呼ばれる場合が多い。
本明細書の「切断部位」は、ｉＲＮＡ剤を利用することによってＲＩＳＣ機構によって切断させる標的遺伝子又はセンス鎖における骨格結合を意味する。そして、標的切断部位領域は、切断部位の両側に少なくとも１つ又は少なくとも２つのヌクレオチドを含む。センス鎖の場合、切断部位は、センス鎖自体が、ＲＮＡｉ機構によって切断されるべき標的であとすると、切断されるセンス鎖の骨格結合である。切断部位は、当分野で公知の方法、例えば、参照によりその全内容が本明細書に組み入れられる、Ｓｏｕｔｓｃｈｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ （２００４） ４３２，１７３－１７８に詳述されている５’－ＲＡＣＥアッセイを用いて決定することができる。当分野で十分に理解されているように、２１ヌクレオチド長の２つの鎖（これらの鎖は、３’末端に２ヌクレオチドの一本鎖オーバーハングを有する１９の連続した塩基対の二本鎖領域を形成する）を含む円錐状二本鎖ＲＮＡｉ剤（ｃｏｎｉｃａｌ ｄｏｕｂｌｅ ｓｔｒａｎｄｅｄ ＲＮＡｉ ａｇｅｎｔ）の切断部位領域は、センス鎖の５’末端の９位～１２位に一致する。
「ハロ」という語は、フッ素、塩素、臭素、又はヨウ素のあらゆるラジカルを指す。「アルキル」という語は、任意選択でＮ、Ｏ、又はＳを挿入しても良い、指示数の炭素原子を含む、直鎖又は分岐鎖であり得る飽和及び不飽和非芳香族炭化水素鎖（これらには、限定されるものではないが、プロピル、アリル、又はプロパルギルが含まれる）を指す。例えば、Ｃ１～Ｃ１０は、基が、その中に１～１０（全てを含む）の炭素原子を有し得ることを示す。「アルコキシ」という語は、－Ｏ－アルキルラジカルを指す。「アルキレン」という語は、二価アルキル（即ち、－Ｒ－）を指す。「アルキレンジオキソ」という語は、構造－Ｏ－Ｒ－Ｏ－の二価種を指し、Ｒは、アルキレンを表す。「アミノアルキル」という語は、アミノで置換されたアルキルを指す。「メルカプト」という語は、－ＳＨラジカルを指す。「チオアルコキシ」という語は、Ｓ－アルキルラジカルを指す。
本明細書で使用される「脂肪族」又は「脂肪族基」という用語は、完全に飽和しているか、若しくは１つ若しくは複数の不飽和単位を含む直鎖（すなわち、非分岐）若しくは分岐状の置換若しくは非置換炭化水素鎖、又は完全に飽和しているか、若しくは１つ若しくは複数の不飽和単位を含むが、芳香族ではない（本明細書では「炭素環」、「脂環式」、若しくは「シクロアルキル」とも呼ばれる）、分子の残りに対して単一の結合点を有する、単環式炭化水素若しくは二環式若しくは多環式炭化水素を意味する。いくつかの実施形態では、脂肪族基は、１～５０個の脂肪族炭素原子、例えば、１～１０個の脂肪族炭素原子、１～６個の脂肪族炭素原子、１～５個の脂肪族炭素原子、１～４個の脂肪族炭素原子、１～３個の脂肪族炭素原子、又は１～２個の脂肪族炭素原子を含む。いくつかの実施形態では、「脂環式」（又は「炭素環」又は「シクロアルキル」）は、完全に飽和しているか、又は１つ又は複数の不飽和単位を含むが、芳香族ではない、分子の残りの部分に単一の結合点を有する、単環式又は二環式Ｃ３－Ｃ１０炭化水素（例えば、単環式Ｃ３－Ｃ６炭化水素）を指す。適切な脂肪族基には、限定されるものではないが、直鎖又は分岐状の置換又は非置換アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、及び（シクロアルキル）アルキル、（シクロアルケニル）アルキル、又は（シクロアルキル）アルケニルなどのそれらのハイブリッドが含まれる。
「アルキレン」という用語は、２価のアルキル基を指す。「アルキレン鎖」は、ポリメチレン基、すなわち－（ＣＨ２）ｎ－であり、式中、ｎは正の整数、好ましくは１～６、１～４、１～３、１～２、又は２～３である。置換アルキレン鎖は、１つ又は複数のメチレン水素原子が置換基で置き換えられたポリメチレン基である。適切な置換基には、以下に記載される置換基が含まれる。
「アルケニレン」という用語は、２価のアルケニル基を指す。置換アルケニレン鎖は、１つ又は複数の水素原子が置換基で置き換えられた、少なくとも１つの二重結合を含むポリメチレン基である。適切な置換基には、以下に記載される置換基が含まれる。
「アリール」という用語は、各環の０個、１個、２個、３個、又は４個の原子が置換基で置換されていてもよい６炭素単環式又は１０炭素二環式芳香環系を指す。「アリール」という用語は、「アリール環」という用語と互換的に使用することができる。アリール基の例としては、フェニル、ビフェニル、ナフチル、及びアントラシルなどが挙げられ、これらは、１つ又は複数の置換基を有し得る。本明細書で使用される「アリール」という用語の範囲内には、芳香環が１つ又は複数の非芳香環に縮合された基、例えば、インダニル、フタルイミジル、ナフチミジル、フェナントリジニル、又はテトラヒドロナフチルなども含まれる。「アリールアルキル」という用語又は「アラルキル」という用語は、アリールで置換されたアルキルを指す。用語「アリールアルコキシ」は、アリールで置換されたアルコキシを指す。
本明細書で用いられる「シクロアルキル」という用語は、３～１２個の炭素、例えば３～８個の炭素、及び、例えば３～６個の炭素を有する飽和及び部分不飽和環状炭化水素基を含み、シクロアルキル基は、さらに任意選択により置換されてもよい。シクロアルキル基には、限定されるものではないが、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロペンテニル、シクロヘキシル、シクロヘキセニル、シクロヘプチル、及びシクロオクチルが含まれる。
「ヘテロアリール」又は「ヘテロアル（ｈｅｔｅｒｏａｒ）－」という用語は、単環式の場合は１～３個のヘテロ原子、二環式の場合は１～６個のヘテロ原子、三環式の場合は１～９個のヘテロ原子を有する芳香族５～８員単環系、８～１２員二環系、又は１１～１４員三環系を指し、前記ヘテロ原子は、Ｏ、Ｎ、又はＳから選択され（例えば、炭素原子、及び単環式、二環式、又は三環式の場合はそれぞれ、Ｎ、Ｏ、又はＳの１～３個、１～６個、又は１～９個のヘテロ原子）、各環の０個、１個、２個、３個、又は４個の原子は、置換基で置換されてもよい。この用語は、ヘテロ芳香環が１つ又は複数のアリール環、脂環式環、又はヘテロシクリル環に縮合している基も含み、ラジカル又は結合点はヘテロ芳香環上にある。ヘテロアリール基の例としては、ピロリル、ピリジル、ピリダジニル、ピラゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、オキサゾリル、イソキサゾリル、オキサジアゾリル、フリル又はフラニル、イミダゾリル、ベンズイミダゾリル、ピリミジニル、ピラジニル、インドリジニル、チオフェニル又はチエニル、キノリニル、インドリル、チアゾリル、イソチアゾリル、チアジアゾリル、プリニル、ナフチリジニル、プテリジニル、イソインドリル、ベンゾチエニル、ベンゾフラニル、ジベンゾフラニル、インダゾリル、ベンズチアゾリル、キノリル、イソキノリル、シンノリニル、フタラジニル、キナゾリニル、キノキサリニル、４Ｈ－キノリジニル、カルバゾリル、アクリジニル、フェナジニル、フェノチアジニル、フェノキサジニル、テトラヒドロキノリニル、テトラヒドロイソキノリニル、及びピリド［２，３－ｂ］－１，４－オキサジン－３（４Ｈ）－オンなどが挙げられる。「ヘテロアリールアルキル」という用語又は「ヘテロアラルキル」という用語は、ヘテロアリールで置換されたアルキルを指す。「ヘテロアリールアルコキシ」という用語は、ヘテロアリールで置換されたアルコキシを指す。
「ヘテロシクリル」、「複素環（ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｅ）」、「複素環式ラジカル」、又は「複素環（ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ ｒｉｎｇ）」という用語は、単環式の場合に１～３個のヘテロ原子、二環式の場合は１～６個のヘテロ原子、又は三環式の場合は１～９個のヘテロ原子を有する非芳香族５～８員単環系、８～１２員二環系、又は１１～１４員三環系を指し、前記ヘテロ原子は、Ｏ、Ｎ、又はＳから選択され（例えば、炭素原子、及び単環式、二環式、又は三環式の場合はそれぞれ、Ｎ、Ｏ、又はＳの１～３個、１～６個、又は１～９個のヘテロ原子）、各環の０個、１個、２個、又は３個の原子は、置換基で置換されてもよい。複素環の環原子に関して使用される場合、「窒素」という用語は、置換窒素を含む。一例として、酸素、硫黄、又は窒素から選択される０～３個のヘテロ原子を有する飽和又は部分不飽和環では、窒素は、Ｎ（３，４－ジヒドロ－２Ｈ－ピロリルと同様）、ＮＨ（ピロリジニルと同様）、又は＋ＮＲ（Ｎ置換ピロリジニルと同様）であり得る。ヘテロシクリル基の例としては、トリゾリル、テトラゾリル、ピペラジニル、ピロリジニル、ジオキサニル、ジオキソラニル、ジアゼピニル、オキサゼピニル、チアゼピニル、モルホリニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロチオフェニルピロリジニル、ピペリジニル、ピロリニル、テトラヒドロキノリニル、テトラヒドロイソキノリニル、デカヒドロキノリニル、オキサゾリジニル、及びキヌクリジニルなどが挙げられる。「ヘテロシクリルアルキル」という用語は、ヘテロシクリルによって置換されたアルキル基を指し、アルキル部分及びヘテロシクリル部分は、独立に任意選択により置換される。
「オキソ」という語は、炭素に結合したときにカルボニルを形成し、窒素に結合したときにＮ－オキシドを形成し、硫黄に結合したときにスルホキシド又はスルホンを形成する酸素原子を指す。
「アシル」という語は、アルキルカルボニル置換基、シクロアルキルカルボニル置換基、アリールカルボニル置換基、ヘテロシクリルカルボニル置換基、又はヘテロアリールカルボニル置換基を指し、これらの何れも、置換基でさらに置換されても良い。
「置換された」という語は、所与の構造における１つ以上の水素ラジカルの特定の置換基のラジカルでの置換を指し、この特定の置換基としては、限定されるものではないが、ハロ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロシクリル、チオール、アルキルチオ、アリールチオ、アルキルチオアルキル、アリールチオアルキル、アルキルスルホニル、アルキルスルホニルアルキル、アリールスルホニルアルキル、アルコキシ、アリールオキシ、アラルコキシ、アミノカルボニル、アルキルアミノカルボニル、アリールアミノカルボニル、アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、ハロアルキル、アミノ、トリフルオロメチル、シアノ、ニトロ、アルキルアミノ、アリールアミノ、アルキルアミノアルキル、アリールアミノアルキル、アミノアルキルアミノ、ヒドロキシ、アルコキシアルキル、カルボキシアルキル、アルコキシカルボニルアルキル、アミノカルボニルアルキル、アシル、アラルコキシカルボニル、カルボン酸、スルホン酸、スルホニル、ホスホン酸、アリール、ヘテロアリール、複素環式、及び脂肪族が挙げられる。置換基は、さらに置換され得ることを理解されたい。
「任意選択により置換された」基の飽和炭素原子の適切な２価の置換基には以下が含まれる：＝Ｏ、＝Ｓ、＝ＮＮＲ＊ ２、＝ＮＮＨＣ（Ｏ）Ｒ＊、＝ＮＮＨＣ（Ｏ）ＯＲ＊、＝ＮＮＨＳ（Ｏ）２Ｒ＊、＝ＮＲ＊、＝ＮＯＲ＊、－Ｏ（Ｃ（Ｒ＊ ２））２―３Ｏ－、又は－Ｓ（Ｃ（Ｒ＊ ２））２―３Ｓ－、ここで、Ｒ＊のそれぞれの独立した存在は、水素、以下で定義されるように置換されてもよいＣ１－６脂肪族、又は窒素、酸素、若しくは硫黄から独立に選択される０～４個のヘテロ原子を有する非置換５～６員飽和、部分不飽和、若しくはアリール環から選択される。「任意選択的に置換された」基の隣接置換可能炭素に結合された適切な２価の置換基には：－Ｏ（ＣＲ＊ ２）２－３Ｏ－が含まれ、ここで、Ｒ＊のそれぞれの独立した存在は、水素、以下で定義されるように置換されていてもよいＣ１－６脂肪族、又は窒素、酸素、若しくは硫黄から独立に選択される０～４個のヘテロ原子を有する非置換５～６員飽和、部分不飽和、若しくはアリール環から選択される。
「ヌクレオシド」及び「ヌクレオチド」という用語は、ヌクレオシド及びヌクレオチドを指すために互換的に使用され；センス鎖若しくはアンチセンス鎖、若しくはその両方に存在する修飾若しくは非修飾ヌクレオチド、又は遊離／非組み込み修飾若しくは非修飾ヌクレオシド／ヌクレオチドを表す。
「部位特異的」という用語は、ｄｓＲＮＡのセンス鎖又はアンチセンス鎖のいずれかの５’末端又は３’末端に対応するセンス鎖又はアンチセンス鎖又は両鎖内の特定の場所又は位置を指す。例えば、部位特異的キラル修飾ヌクレオチド間結合は、所与の鎖の５’末端又は３’末端からｎ番目の位置、例えば、アンチセンス鎖又はセンス鎖の５’末端からｎ番目のヌクレオチド間結合位置におけるキラル修飾ヌクレオチド間結合の配置を示唆する。部位特異的位置は、センス鎖又はアンチセンス鎖の５’末端又は３’末端からの２つ以上の定義された位置を指す。
ヌクレオチド間結合に対する部位特異的キラル修飾は、鎖の５’末端、３’末端、又は５’末端と３’の両末端に存在し得る。これは、本明細書では「末端」キラル修飾と呼ばれる。末端修飾は、末端領域の３’又は５’末端位置、例えば、鎖の末端ヌクレオチド上の位置又は最後の２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、又は１０個のヌクレオチド内に存在し得る。
一実施形態では、「ｎ番目の位置」という用語は：（ｉ）アンチセンス鎖の５’末端から１番目のヌクレオチドと８番目のヌクレオチドとの間のどこかの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、又は８つの部位特異的ヌクレオチド間位置、及びそれらの組み合わせ；（ｉｉ）アンチセンス鎖の３’末端から１番目のヌクレオチドと８番目のヌクレオチドとの間のどこかの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、又は８つの部位特異的ヌクレオチド間位置、及びそれらの組み合わせ；（ｉｉｉ）アンチセンス鎖の５’末端及び３’末端の両方から１番目のヌクレオチドと８番目のヌクレオチドとの間のどこかの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、又は８つの部位特異的ヌクレオチド間位置、及びそれらの組み合わせ；（ｉｖ）センス鎖の５’末端から１番目のヌクレオチドと８番目のヌクレオチドとの間のどこかの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、又は８つの部位特異的ヌクレオチド間位置、及びそれらの組み合わせ；（ｖ）アンチセンス鎖の３’末端及び／又は５末端及びセンス鎖の５’末端から１番目のヌクレオチドと８番目のヌクレオチドとの間のどこかの組み合わせられた１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、又は８つの部位特異的ヌクレオチド間位置、及びそれらの組み合わせを指す。
或いは、ヌクレオチド間結合に対する部位特異的キラル修飾は、鎖の末端領域以外の内部位置に存在し得る。例えば、ヌクレオチド間結合に対する部位特異的キラル修飾は、センス鎖及び／又はアンチセンス鎖のダイサー切断部位の近傍に存在し得る。「ダイサー切断部位」という用語は、本明細書に記載されている。一実施形態では、キラル修飾ｄｓＲＮＡ剤は、ｉｎ ｖｉｖｏでダイサーによって切断可能であるダイサー基質であり、切断されると１７～２３ヌクレオチド長のｓｉＲＮＡ二重鎖になり、このｓｉＲＮＡ二重鎖は、鎖の３’末端及び／又は５’末端に末端のキラル修飾ヌクレオチド間結合（１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、又は８つ以上の末端のキラル修飾ヌクレオチド間結合）を含む。
理論に拘束されるものではないが、本発明者らは、立体的に純粋なＰＳ結合のｉｎ ｖｉｖｏ安定性の利点は、有力な内部切断部位を含まないｄｓＲＮＡ二重鎖でより強化されると考えている。従って、一実施形態では、キラル修飾ｄｓＲＮＡ二重鎖は、ｄｓＲＮＡ二重鎖の５％未満、１０％未満、１５％未満、２０％未満、２５％未満、３０％未満、３５％未満、４０％未満、４５％未満、又は５０％未満の内部ヌクレオチド切断を含む。
切断可能連結基
切断可能連結基は、細胞外で十分安定しているが、標的細胞に入ると切断されてリンカーが一緒に保持する２つの部分を放出する、連結基である。好ましい実施形態では、切断可能連結基は、対象の血液中又は第２の基準条件下（例えば、血液又は血清に存在する条件を模倣又は実現するように選択することができる）よりも、標的細胞内又は第１の基準条件下（例えば、細胞内の条件を模倣又は実現するように選択することができる）において、少なくとも１０倍以上、好ましくは、少なくとも１００倍速く切断する。
切断可能連結基は、切断剤、例えば、ｐＨ、酸化還元電位、又は分解性分子の存在の影響を受けやすい。一般に、切断剤は、血清又は血液中よりも細胞内において、より行き渡る、又はより高いレベル若しくは活性で存在する。このような分解剤の例としては、還元によって酸化還元性切断可能連結基を分解することができる、例えば、細胞内に存在する、酸化酵素若しくは還元酵素又は還元剤、例えば、メルカプタンを含む、特定の基質に対して選択されるか、若しくは基質特異性を有しない酸化還元剤；エステラーゼ；酸性環境を生じさせる、例えば、５以下のｐＨにすることができるエンドソーム又は作用剤；一般酸、ペプチダーゼ（基質特異的であっても良い）、及びホスファターゼとしての機能を果たすことによって酸性切断可能連結基を加水分解又は分解することができる酵素が挙げられる。
切断可能連結基、例えば、ジスルフィド結合は、ｐＨの影響を受けやすい。ヒト血清のｐＨは、７．４であるが、平均細胞内ｐＨは、わずかに低く、約７．１～７．３の範囲である。エンドソームは、５．５～６．０の範囲のより酸性のｐＨを有し、リソソームは、約５．０のさらに酸性のｐＨを有する。いくつかのリンカーは、好ましいｐＨで切断され、これにより、リガンドから細胞内へ、又は細胞の所望の区画内にカチオン性脂質を放出する切断可能連結基を有する。
リンカーは、特定の酵素によって切断可能である、切断可能連結基を含み得る。リンカーに組み込まれる切断可能連結基の種類は、標的とされる細胞によって異なり得る。例えば、肝臓を標的とするリガンドは、エステル基を含むリンカーを介してカチオン性脂質に連結することができる。肝細胞は、エステラーゼが豊富であり、したがって、リンカーは、エステラーゼが豊富でない細胞型よりも肝細胞でより効率的に切断する。エステラーゼが豊富な他の細胞型としては、肺、腎皮質、及び睾丸の細胞が挙げられる。
ペプチダーゼが豊富な細胞型、例えば、肝細胞及び滑膜細胞を標的とする場合は、ペプチド結合を含むリンカーを使用することができる。
一般に、候補の切断可能連結基の適合性は、候補連結基を切断する分解剤（又は条件）の能力を試験することによって評価することができる。また、血中での、又は他の非標的組織と接触しているときの切断に抵抗する能力について候補の切断可能連結基を試験することも望ましい。したがって、第１の条件と第２の条件との間の相対的な切断のしやすさを決定することができ、この第１の条件は、標的細胞内の切断を示すために選択され、この第２の条件は、他の組織又は体液、例えば、血液若しくは血清中での切断を示すために選択される。無細胞系、細胞、細胞培養物、器官若しくは組織培養物、又は動物全体で評価を行うことができる。無細胞又は培養条件で最初の評価を行い、動物全体でのさらなる評価によって確認することが有用であり得る。好ましい実施形態では、有用な候補化合物は、血液若しくは血清（又は細胞外の条件を模倣するように選択されるｉｎ ｖｉｔｒｏでの条件下）と比較して細胞内（又は細胞内の条件を模倣するように選択されるｉｎ ｖｉｔｒｏでの条件下）で少なくとも２倍、４倍、１０倍、又は１００倍速く切断する。
酸化還元性切断可能連結基
切断可能連結基の１つのクラスは、キラル修飾ｄｓＲＮＡ剤に使用することができ、還元又は酸化時に切断される酸化還元性切断可能連結基である。還元的に切断可能な連結基の一例として、ジスルフィド連結基（－Ｓ－Ｓ－）が挙げられる。候補の切断可能連結基が適切な「還元的に切断可能な連結基」であるか否か、又は、例えば、特定のｉＲＮＡ部分及び特定の標的作用剤と共に使用するのに適しているか否かを決定するために、本明細書に記載される方法を確認することができる。例えば、候補は、細胞、例えば、標的細胞で観察され得る切断速度を模倣する当分野で公知の試薬を使用してジチオスレイトール（ＤＴＴ）又はた他の還元剤と共にインキュベートすることによって評価することができる。候補はまた、血液又は血清条件を模倣するために選択される条件下でも評価することができる。好ましい一実施形態では、候補化合物は、血中では最大で１０％切断する。好ましい実施形態では、有用な候補化合物は、血液（又は細胞外の条件を模倣するように選択されるｉｎ ｖｉｔｒｏでの条件下）と比較して、細胞内（又は細胞内の条件を模倣するように選択されるｉｎ ｖｉｔｒｏでの条件下）では少なくとも２倍、４倍、１０倍、又は１００倍速く分解される。候補化合物の切断速度は、細胞内培地を模倣するように選択される条件下で標準的な酵素反応速度アッセイを使用して決定して、細胞外培地を模倣するように選択される条件と比較することができる。
リン酸系切断可能連結基
リン酸系切断可能連結基は、キラル修飾ｄｓＲＮＡ剤に使用することができ、リン酸基を分解又は加水分解する作用剤によって切断される。細胞内のリン酸基を切断する作用剤の一例として、細胞内の酵素、例えば、ホスファターゼが挙げられる。リン酸塩系の連結基の例としては、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＯＲｋ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＳＲｋ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）－Ｓ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）－Ｓ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＯＲｋ）－Ｓ－、－Ｓ－Ｐ（Ｓ）（ＯＲｋ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（Ｒｋ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（Ｒｋ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（Ｒｋ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｓ）（Ｒｋ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（Ｒｋ）－Ｓ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（Ｒｋ）－Ｓ－が挙げられる。好ましい実施形態は、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＳＨ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｓ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｓ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）－Ｓ－、－Ｓ－Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（Ｈ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（Ｈ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（Ｈ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｓ）（Ｈ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（Ｈ）－Ｓ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（Ｈ）－Ｓ－である。好ましい実施形態は、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ－である。これらの候補は、上記の方法と類似した方法を使用して評価することができる。
酸性切断可能連結基
酸性切断可能連結基は、キラル修飾ｄｓＲＮＡ剤に使用することができ、酸性条件下で切断される連結基である。好ましい実施形態では、酸性切断可能連結基は、約６．５以下（例えば、約６．０、５．５、５．０、又はそれ以下）のｐＨの酸性環境において、又は一般酸として機能し得る作用剤、例えば、酵素剤によって切断する。細胞において、特定のｐＨの低い細胞小器官、例えば、エンドソーム及びリソソームは、酸性切断可能連結基に切断環境を提供することができる。酸性切断可能連結基の例としては、限定されるものではないが、ヒドラゾン、エステル、及びアミノ酸エステルが挙げられる。酸性切断可能な基は、一般式：－Ｃ＝ＮＮ－、Ｃ（Ｏ）Ｏ、又は－ＯＣ（Ｏ）を有し得る。好ましい一実施形態は、エステル（アルコキシ基）の酵素に結合した炭素が、アリール基、置換アルキル基、又は第３級アルキル基、例えば、ジメチルペンチル若しくはｔ－ブチルである場合である。これらの候補は、上記の方法と類似した方法を使用して評価することができる。
エステル系連結基
エステル系切断可能連結基は、キラル修飾ｄｓＲＮＡ剤に使用することができ、細胞内の酵素、例えば、エステラーゼ及びアミダーゼによって切断される。エステル系切断可能連結基の例としては、限定されるものではないが、アルキレン基、アルケニレン基、及びアルキニレン基のエステルが挙げられる。エステル系切断可能連結基は、一般式：－Ｃ（Ｏ）Ｏ－又は－ＯＣ（Ｏ）－を有する。これらの候補は、上記の方法と類似した方法を用いて評価することができる。
ペプチド系切断連結基
ペプチド系切断可能連結基は、キラル修飾ｄｓＲＮＡ剤に使用することができ、細胞内の酵素、例えば、ペプチダーゼ及びプロテアーゼによって切断される。ペプチド系切断可能連結基は、オリゴペプチド（例えば、ジペプチド、トリペプチドなど）及びポリペプチドが生じる、アミノ酸間に形成されるペプチド結合である。ペプチド系切断可能連結基は、アミド基（－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－）を含まない。アミド基は、任意のアルキレン、アルケニレン、又はアルキニレン間で形成され得る。ペプチド結合は、ペプチド及びタンパク質が生成するアミノ酸間に形成されるアミド結合の特別な種類である。ペプチド系切断基は、一般に、ペプチド及びタンパク質が生じる、アミノ酸間に形成されるペプチド結合（即ち、アミド結合）に限定され、アミド官能基全体を含むものではない。ペプチド系切断可能連結基は、一般式：－ＮＨＣＨＲＡＣ（Ｏ）ＮＨＣＨＲＢＣ（Ｏ）－を有し、ＲＡ及びＲＢは、２つの隣接するアミノ酸のＲ基である。これらの候補は、上記の方法と類似した方法を使用して評価することができる。本明細書で使用される「糖質」は、それぞれの炭素原子に酸素原子、窒素原子、若しくは硫黄原子が結合した少なくとも６つの炭素原子（直鎖、分岐鎖、若しくは環状でも良い）を有する１つ以上の単糖単位から形成される糖質自体；又は、それぞれの炭素原子に酸素原子、窒素原子、若しくは硫黄原子が結合した少なくとも６つの炭素原子（直鎖、分岐鎖、若しくは環状でも良い）をそれぞれ有する１つ以上の単糖単位から形成される糖質部分をその一部として有する化合物を指す。
代表的な糖質としては、糖（単糖、二糖、三糖、及び約４～９の単糖単位を含むオリゴ糖）、並びに多糖、例えば、スターチ、グリコーゲン、セルロース、及び多糖ガムが挙げられる。特定の単糖としては、Ｃ５及び上記の（好ましくはＣ５～Ｃ８）糖が挙げられ；二糖及び三糖としては、２つ又は３つの単糖単位（好ましくはＣ５～Ｃ８）を有する糖が挙げられる。
本発明はさらに、標的遺伝子の発現を阻害するための、本明細書で定義されるキラル修飾ｄｓＲＮＡ剤の使用に関する。一実施形態では、本明細書で定義されるキラル修飾ｄｓＲＮＡ剤は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの標的遺伝子の発現を阻害するために使用される。本発明はさらに、ｉｎ ｖｉｖｏでの対象における標的遺伝子の発現の阻害に使用するための、本明細書で定義されるキラル修飾ｄｓＲＮＡ剤に関する。この対象は、任意の動物、例えば、マウス、ラット、ヒツジ、ウシ、イヌ、ネコ、又はヒトなどの哺乳動物であり得る。
一実施形態では、キラル修飾ｄｓＲＮＡ剤は、緩衝液に溶解して投与される。
一実施形態では、キラル修飾ｄｓＲＮＡ剤（例えば、ｓｉＲＮＡ）は、対象に投与するために製剤することができる。製剤されるｓｉＲＮＡ組成物は、様々な状態をとることができる。一部の例では、この組成物は、少なくとも部分的に結晶、均一に結晶、及び／又は無水（例えば、８０％未満、５０％未満、３０％未満、２０％未満、又は１０％未満の水）である。別の例では、ｓｉＲＮＡは、水相、例えば、水を含む溶液に溶解される。
水相及び結晶性組成物は、例えば、送達ビヒクル、例えば、リポソーム（特に水相の場合）又は粒子（例えば、結晶性組成物に適切であり得る微粒子）に含めることができる。一般に、ｓｉＲＮＡ組成物は、本明細書に記載される意図する投与法に適合するように製剤される。例えば、特定の実施形態では、この組成物は、少なくとも１つの次の方法によって調製される：噴霧乾燥、凍結乾燥、真空乾燥、蒸発、流動床乾燥、若しくはこれらの技術の組み合わせ；又は脂質を用いた超音波処理、フリーズドライ、凝縮、及び他の自己集合。
ｓｉＲＮＡ調製物は、別の作用剤、例えば、別の治療剤、又はｓｉＲＮＡを安定させる作用剤、例えば、ｓｉＲＮＡと複合体を形成してｉＲＮＰを形成するタンパク質と組み合わせて製剤することができる。なお他の作用剤としては、キレート剤、例えば、ＥＤＴＡ（例えば、二価のカチオン、例えば、Ｍｇ２＋を除去するための）、塩、及びＲＮＡ分解酵素阻害剤（例えば、特異性の広いＲＮＡ分解酵素阻害剤、例えば、ＲＮＡｓｉｎ）などが挙げられる。
一実施形態では、ｓｉＲＮＡ調製物は、別のｓｉＲＮＡ化合物、例えば、第２の遺伝子又は同じ遺伝子に対してＲＮＡｉを媒介することができる第２のｓｉＲＮＡを含む。なお他の調製物は、少なくとも３、５、１０、２０、５０、又は１００以上の異なるｓｉＲＮＡ種を含み得る。このようなｓｉＲＮＡは、同様の数の異なる遺伝子に対してＲＮＡｉを媒介することができる。
一実施形態では、ｓｉＲＮＡ調製物は、少なくとも第２の治療剤（例えば、ＲＮＡ又はＤＮＡ以外の作用剤）を含む。例えば、ウイルス疾患、例えば、ＨＩＶの治療用のｓｉＲＮＡ組成物は、公知の抗ウイルス剤（例えば、プロテアーゼ阻害剤又は逆転写酵素阻害剤）を含む。別の例では、癌治療用のｓｉＲＮＡ組成物は、化学療法剤をさらに含み得る。
キラル修飾ｄｓＲＮＡ剤の投与に使用することができる例示的な製剤が以下に記載される。
リポソーム。説明を容易にするために、このセクションにおける製剤、組成物、及び方法は、主に無修飾ｓｉＲＮＡ／ｄｓＲＮＡ化合物に関して説明する。しかしながら、これらの製剤、組成物、及び方法は、他のｓｉＲＮＡ化合物、例えば、修飾ｓｉＲＮＡを用いて実施することができ、このような実施が、本発明の範囲内であることを理解できよう。ｓｉＲＮＡ化合物、例えば、二本鎖ｓｉＲＮＡ化合物、又はｓｓｉＲＮＡ化合物、（例えば、前駆体、例えば、ｓｓｉＲＮＡ化合物にプロセシングすることができるより大きなｓｉＲＮＡ化合物、又はｓｉＲＮＡ化合物、例えば、二本鎖ｓｉＲＮＡ化合物をコードするＤＮＡ、又はｓｓｉＲＮＡ化合物、又はそれらの前駆体）調製物は、送達するために膜分子集合体、例えば、リポソーム又はミセルに製剤することができる。本明細書で使用される「リポソーム」という語は、少なくとも１つの二重層、例えば、１つの二重層又は複数の二重層で構成された両親媒性脂質からなる小胞を指す。リポソームは、親油性材料及び水性内部から形成される膜を有する単層小胞及び多層小胞を含む。水性部分は、ｓｉＲＮＡ組成物を含む。親油性材料は、水性内部を水性外部から隔離し、この水性外部は、典型的にはｓｉＲＮＡ組成物を含まないが、一部の例では含むこともある。リポソームは、有効成分の作用部位への移送及び送達に有用である。リポソーム膜は、生体膜に構造的に類似しているため、リポソームが組織に接触すると、リポソーム二重層が、細胞膜の二重層と融合する。リポソームと細胞との一体化が進むと、ｓｉＲＮＡを含む内部水性成分が、細胞内に送達され、そこで、ｓｉＲＮＡは、標的ＲＮＡに特異的に結合して、ＲＮＡｉを媒介することができる。場合によって、リポソームは、特異的に標的化され、例えば、ｓｉＲＮＡを特定の細胞型に誘導する。
ｓｉＲＮＡを含むリポソームは、様々な方法で調製することができる。一例では、リポソームの脂質成分は、洗剤に溶解され、これにより、ミセルが脂質成分で形成される。例えば、脂質成分は、両親媒性カチオン脂質又は脂質コンジュゲートとすることができる。洗剤は、高い臨界ミセル濃度を有することができ、非イオン性であり得る。例示的な洗剤としては、コール酸塩、ＣＨＡＰＳ、オクチルグルコシド、デオキシコール酸塩、及びラウロイルサルコシンが挙げられる。次いで、ｓｉＲＮＡ調製物が、脂質成分を含むミセルに添加される。脂質上のカチオン基が、ｓｉＲＮＡと相互作用して、ｓｉＲＮＡの周りに凝縮してリポソームを形成する。凝縮後、洗剤が、例えば、透析によって除去され、ｓｉＲＮＡのリポソーム調製物が得られる。
必要に応じて、凝縮を補助する担体化合物を、例えば、制御された添加によって、凝縮反応中に添加することができる。例えば、担体化合物は、核酸以外のポリマー（例えば、スペルミン又はスペルミジン）とすることができる。ｐＨを、凝縮に適するように調整することもできる。
送達ビヒクルの構造成分としてポリヌクレオチド／カチオン脂質複合体を包含する安定なポリヌクレオチド送達ビヒクルを形成するための方法のさらなる詳細が、国際公開第９６／３７１９４号パンフレットに記載されている。リポソームの形成は、参照によりそれらの全内容が本明細書に組み入れられる、Ｆｅｌｇｎｅｒ，Ｐ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ ８：７４１３－７４１７，１９８７； 米国特許第４，８９７，３５５号明細書；同第５，１７１，６７８号明細書；Ｂａｎｇｈａｍ，ｅｔ ａｌ．Ｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３：２３８，１９６５；Ｏｌｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ５５７：９，１９７９；Ｓｚｏｋａ，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７５：４１９４，１９７８；Ｍａｙｈｅｗ，ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ７７５：１６９，１９８４；Ｋｉｍ，ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ７２８：３３９，１９８３；及びＦｕｋｕｎａｇａ，ｅｔ ａｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１１５：７５７，１９８４に記載されている例示的な方法の１つ以上の態様も含み得る。送達ビヒクルとして使用するのに適切なサイズの脂質凝集体を調製するために一般的に使用される技術は、超音波処理及び凍結融解と押し出しを含む（例えば、参照によりその全内容が本明細書に組み入れられる、Ｍａｙｅｒ，ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ８５８：１６１，１９８６を参照されたい）。一貫して小さく（５０～２００ｎｍ）比較的均一な凝集体が望ましい場合は、微小流動化を使用することができる（参照によりその全内容が本明細書に組み入れられる、Ｍａｙｈｅｗ，ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ７７５：１６９，１９８４）。このような方法は、ｓｉＲＮＡ剤調製物をリポソームの中にパッケージングするために容易に適合される。
ｐＨ感受性又は負に帯電したリポソームは、核酸分子と複合体を形成するのではなく、核酸分子を取り込む。核酸分子及び脂質の両方が同様に帯電しているため、複合体が形成されるのではなく反発が起きる。とは言え、一部の核酸分子は、これらのリポソームの水性内部内に取り込まれる。ｐＨ感受性リポソームは、チミジンキナーゼ遺伝子をコードするＤＮＡを培養中の細胞単層に送達するために使用される。外来遺伝子の発現が標的細胞で検出された（参照によりその全内容が本明細書に組み入れられる、Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，１９，（１９９２） ２６９－２７４）。
１つの重要な種類のリポソーム組成物は、天然由来のホスファチジルコリン以外のリン脂質を含む。中性リポソーム組成物は、例えば、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）又はジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）から形成することができる。アニオン性リポソーム組成物は、一般に、ジミリストイルホスファチジルグリセロールから形成され、アニオン性融合性リポソームは、主として、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）から形成される。別の種類のリポソーム組成物は、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、例えば、大豆ＰＣ及び卵ＰＣなどから形成される。別の種類は、リン脂質及び／又はホスファチジルコリン及び／又はコレステロールの混合物から形成される。
リポソームをｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞に導入する他の方法の例として、米国特許第５，２８３，１８５号明細書；同第５，１７１，６７８号明細書；国際公開第９４／００５６９号パンフレット；同第９３／２４６４０号パンフレット；同第９１／１６０２４号パンフレット；Ｆｅｌｇｎｅｒ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：２５５０，１９９４；Ｎａｂｅｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９０：１１３０７，１９９３；Ｎａｂｅｌ，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．３：６４９，１９９２；Ｇｅｒｓｈｏｎ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．３２：７１４３，１９９３；及びＳｔｒａｕｓｓ ＥＭＢＯ Ｊ．１１：４１７，１９９２が挙げられる。
一実施形態では、カチオン性リポソームが使用される。カチオン性リポソームは、細胞膜に融合できるという利点を有する。非カチオン性リポソームは、効率的には原形質膜と効率的に融合することができないが、ｉｎ ｖｉｖｏでマクロファージによって取り込まれるため、ｓｉＲＮＡをマクロファージに送達するために使用することができる。
リポソームのさらなる利点としては：天然リン脂質から得られるリポソームが、生体適合性且つ生体分解性であること；リポソームが、種々の水溶性及び脂溶性薬物を取り込むことができること；リポソームが、内部区画内に取り込まれたｓｉＲＮＡを代謝及び分解から保護できること（Ｒｏｓｏｆｆ，ｉｎ”Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，”Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ及びＢａｎｋｅｒ （Ｅｄｓ．），１９８８，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．２４５）が挙げられる。リポソーム製剤の調製における重要な考慮すべき事項は、脂質表面の電荷、小胞サイズ、及びリポソームの水中体積である。
正に帯電した合成カチオン性脂質、Ｎ－［１－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル］－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロライド（ＤＯＴＭＡ）を使用して、核酸と自然に相互作用して脂質－核酸複合体を形成する小型リポソームを形成することができ、この脂質－核酸複合体は、組織培養細胞の細胞膜の負に帯電した脂質と融合し、結果としてｓｉＲＮＡを送達することができる（例えば、参照によりそれらの全内容が本明細書に組み入れられる、Ｆｅｌｇｎｅｒ，Ｐ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ ８：７４１３－７４１７，１９８７、並びにＤＯＴＭＡ及びそのＤＮＡとの使用が記載されている米国特許第４，８９７，３５５号明細書を参照されたい）。
ＤＯＴＭＡ類似体、１，２－ビス（オレオイルオキシ）－３－（トリメチルアンモニア）プロパン（ＤＯＴＡＰ）をリン脂質と組み合わせて使用して、ＤＮＡと複合体を形成する小胞を形成することができる。Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標）Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍｄ．）は、高度にアニオン性の核酸を生きた組織培養細胞に送達するための有効な作用剤であり、この組織培養細胞は、負に帯電したポリヌクレオチドと自然に相互作用して複合体を形成する正に帯電したＤＯＴＭＡリポソームを含む。十分に正に帯電したリポソームが使用されると、得られる複合体の正味荷電も正である。このように調製される正に帯電した複合体は、負に帯電した細胞表面に自然に付着し、原形質膜に融合し、そして機能性核酸を、例えば、組織培養細胞に有効に送達する。別の市販のカチオン性脂質、１，２－ビス（オレオイルオキシ）－３，３－（トリメチルアンモニア）プロパン（「ＤＯＴＡＰ」）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，Ｉｎｄｉａｎａ）は、オレオイル部分が、エーテル結合ではなくエステルによって結合されているという点でＤＯＴＭＡとは異なる。
他の報告されているカチオン性脂質化合物は、例えば、２種類のうちの１種類の脂質にコンジュゲートして、化合物、例えば、５－カルボキシスペルミルグリシンジオクタオレオイルアミド（「ＤＯＧＳ」）（Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（商標）、Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）及びジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン５－カルボキシスペルミル－アミド（「ＤＰＰＥＳ」）を含むカルボキシスペルミンを含め、様々な部分にコンジュゲートしたものを含む（例えば、米国特許第５，１７１，６７８号明細書を参照されたい）。
別のカチオン性脂質コンジュゲートは、ＤＯＰＥと組み合わせてリポソーム内に含められて製剤されたコレステロール（「ＤＣ－Ｃｈｏｌ」）による脂質の誘導体を含む（Ｇａｏ， Ｘ．ａｎｄ Ｈｕａｎｇ，Ｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１７９：２８０，１９９１を参照されたい）。ポリリシンをＤＯＰＥにコンジュゲートさせることによって形成されたリポポリリジンは、血清の存在下でのトランスフェクションに有効であることが報告されている（参照によりその全内容が本明細書に組み入れられる、Ｚｈｏｕ，Ｘ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １０６５：８，１９９１）。特定の細胞株では、コンジュゲートカチオン性脂質を含むこのようなリポソームは、ＤＯＴＭＡ含有組成物よりも低い毒性を示し、且つより効率的なトランスフェクションを実現すると言われている。他の市販のカチオン性脂質製品としては、ＤＭＲＩＥ及びＤＭＲＩＥ－ＨＰ（Ｖｉｃａｌ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）及びＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（ＤＯＳＰＡ）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）が挙げられる。オリゴヌクレオチドの送達に適した他のカチオン性脂質は、国際公開第９８／３９３５９号明細書及び同第９６／３７１９４号明細書に記載されている。
リポソーム製剤は、局所投与に特に適しており、リポソームには、他の製剤よりもいくつかの利点が存在する。このような利点は、投与された薬物の高い全身吸収に関連した副作用の低下、所望の標的における投与された薬物の蓄積の増加、及びｓｉＲＮＡを皮膚に投与する能力が挙げられる。一部の実施では、リポソームは、ｓｉＲＮＡを上皮細胞に送達するために、そしてｓｉＲＮＡの皮膚組織、例えば、皮膚への浸透を促進するためにも使用される。例えば、リポソームは、局所的に適用することができる。リポソームとして製剤された薬物の皮膚への局所送達は実証されている（例えば、参照によりそれらの全内容が本明細書に組み入れられる、Ｗｅｉｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，１９９２，ｖｏｌ．２，４０５－４１０ ａｎｄ ｄｕ Ｐｌｅｓｓｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１８，１９９２，２５９－２６５；Ｍａｎｎｉｎｏ，Ｒ．Ｊ．ａｎｄ Ｆｏｕｌｄ－Ｆｏｇｅｒｉｔｅ，Ｓ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：６８２－６９０，１９８８；Ｉｔａｎｉ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅ ５６：２６７－２７６．１９８７；Ｎｉｃｏｌａｕ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．１４９：１５７－１７６，１９８７；Ｓｔｒａｕｂｉｎｇｅｒ，Ｒ．Ｍ．ａｎｄ Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ，Ｄ．Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．１０１：５１２－５２７，１９８３；Ｗａｎｇ，Ｃ．Ｙ．ａｎｄ Ｈｕａｎｇ，Ｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：７８５１－７８５５，１９８７を参照されたい）。
非イオン性リポソーム系もまた、特に、非イオン性界面活性剤及びコレステロールを含む系において、薬物の皮膚への送達における実用性を決定するために試験された。Ｎｏｖａｓｏｍｅ Ｉ（ジラウリル酸グリセリル／コレステロール／ポリオキシエチレン－１０－ステアリルエーテル）及びＮｏｖａｓｏｍｅ ＩＩ（ジステアリン酸グリセリル／コレステロール／ポリオキシエチレン－１０－ステアリルエーテル）を含む非イオン性リポソーム製剤が、マウスの皮膚の真皮に薬物を送達するために使用された。ｓｉＲＮＡを含むこのような製剤は、皮膚障害を治療するのに有用である。
ｓｉＲＮＡを含むリポソームは、高度に変形可能に形成することができる。このような変形性は、リポソームの平均半径よりも小さい孔にリポソームが進入するのを可能にし得る。例えば、トランスファーソームは、変形可能なリポソームの１種である。トランスファーソームは、表面縁活性化因子、通常は界面活性剤を標準的なリポソーム組成物に添加することによって作製することができる。ｓｉＲＮＡを含むトランスファーソームは、ｓｉＲＮＡを皮膚内のケラチノサイトに送達するために、例えば、皮下注射によって送達することができる。無傷の哺乳動物の皮膚を通過するためには、脂質小胞は、適当な経皮勾配の影響下で、直径がそれぞれ５０ｎｍ未満の一連の微孔を通って通過しなければならない。加えて、脂質の特性により、このようなトランスファーソームは、自己最適化性（例えば、皮膚の孔の形状に適応すること）、自己修復性であり得ると共に、多くの場合、断片化されずに標的に到達することができ、しばしば自己負荷性（ｓｅｌｆ－ｌｏａｄｉｎｇ）であり得る。
本発明に適用可能な他の製剤は、２００８年１月２日出願の米国仮特許出願第６１／０１８，６１６号明細書；２００８年１月２日出願の同第６１／０１８，６１１号明細書；２００８年３月２６日出願の同第６１／０３９，７４８号明細書；２００８年４月２２日出願の同第６１／０４７，０８７号明細書；及び２００８年５月８日出願の同第６１／０５１，５２８号明細書に記載されている。２００７年１０月３日出願の国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０８０３３１号パンフレットにも、本発明に適用可能な製剤が記載されている。
界面活性剤。説明を容易にするために、このセクションにおける製剤、組成物、及び方法は、主に無修飾ｓｉＲＮＡ化合物に関して説明する。しかしながら、これらの製剤、組成物、及び方法は、他のｓｉＲＮＡ化合物、例えば、修飾ｓｉＲＮＡ化合物を用いて実施することができ、このような実施が、本発明の範囲内であることを理解できよう。界面活性剤は、製剤、例えば、エマルション（マイクロエマルションを含む）及びリポソーム（上記）において幅広い用途が見出されている。ｓｉＲＮＡ（又は前駆体、例えば、プロセシングしてｓｉＲＮＡにすることができるより大きなｄｓｉＲＮＡ、又はｓｉＲＮＡ若しくは前駆体をコードするＤＮＡ）組成物は、界面活性剤を含み得る。一実施形態では、ｓｉＲＮＡは、界面活性剤を含むエマルションとして製剤される。多数の異なる種類の天然及び合成の両方の界面活性剤の特性を分類及びランク付けする最も一般的な方法は、親水性／親油性バランス（ＨＬＢ）の使用によるものである。親水性基の性質は、製剤に使用される異なる界面活性剤を分類するための最も有用な手段となる（Ｒｉｅｇｅｒ， ｉｎ “Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，”Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，１９８８，ｐ．２８５）。
界面活性剤分子がイオン化されない場合、この界面活性剤分子は、非イオン性界面活性剤として分類される。非イオン性界面活性剤は、薬学的製品において幅広い用途が見出されており、広範囲のｐＨ値に対して使用可能である。一般に、これらのＨＬＢ値は、その構造によって２～約１８の範囲である。非イオン性界面活性剤としては、非イオン性エステル、例えば、エチレングリコールエステル、プロピレングリコールエステル、グリセリルエステル、ポリグリセリルエステル、ソルビタンエステル、スクロースエステル、及びエトキシル化エステルが挙げられる。非イオン性アルカノールアミド及びエーテル、例えば、脂肪アルコールエトキシレート、プロポキシル化アルコール、及びエトキシル化／プロポキシル化ブロックポリマーもこのクラスに含まれる。ポリオキシエチレン界面活性剤は、非イオン性界面活性剤クラスのうち最も一般的なメンバーである。
界面活性剤分子が、水に溶解又は分散されたときに負の電荷を有する場合、この界面活性剤分子は、アニオン性として分類される。アニオン性界面活性剤としては、カルボン酸塩、例えば、石鹸、アシル乳酸塩、アミノ酸のアシルアミド、硫酸のエステル、例えば、硫酸アルキル及び硫酸エトキシル化アルキル、スルホン酸塩、例えば、アルキルベンゼンスルホン酸塩、アシルイセチオン酸塩、アシルタウレート、及びスルホコハク酸塩、並びにリン酸塩が挙げられる。アニオン性界面活性剤クラスのうち最も重要なメンバーは、硫酸アルキル及び石鹸である。
界面活性剤分子が、水に溶解又は分散されたときに正の電荷を有する場合、この界面活性剤分子は、カチオン性として分類される。カチオン性界面活性剤としては、四級アンモニウム塩及びエトキシル化アミンが挙げられる。四級アンモニウム塩は、このクラスのうちで最も使用されるメンバーである。
界面活性剤分子が、正又は負のいずれの電荷も有する能力がある場合、この界面活性剤分子は、両性として分類される。両性界面活性剤としては、アクリル酸誘導体、置換アルキルアミド、Ｎ－アルキルベタイン、及びホスファチドが挙げられる。
薬物製品、製剤、及びエマルションにおける界面活性剤の使用が概説されている（Ｒｉｅｇｅｒ，ｉｎ “Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ”，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９８８，ｐ．２８５）。
ミセル及び他の膜状製剤。説明を容易にするために、このセクションにおけるミセル及び他の製剤、組成物、及び方法は、主に無修飾ｓｉＲＮＡ化合物に関して説明する。しかしながら、これらのミセル及び他の製剤、組成物、及び方法は、他のｓｉＲＮＡ化合物、例えば、修飾ｓｉＲＮＡ化合物を用いて実施することができ、このような実施が、本発明の範囲内であることを理解できよう。ｓｉＲＮＡ化合物、例えば、二本鎖ｓｉＲＮＡ化合物、又はｓｓｉＲＮＡ化合物、（例えば、前駆体、例えば、ｓｓｉＲＮＡ化合物にプロセシングすることができるより大きなｓｉＲＮＡ化合物、又はｓｉＲＮＡ化合物、例えば、二本鎖ｓｉＲＮＡ化合物をコードするＤＮＡ、又はｓｓｉＲＮＡ化合物、又はそれらの前駆体）組成物は、ミセル製剤として提供することができる。「ミセル」は、本明細書では、特定の種類の分子集合体として定義され、この分子集合体では、両親媒性分子の全ての疎水性部分が内側を向き、親水性部分が周囲の水相に接触するように両親媒性分子が球体構造に構成されている。環境が疎水性である場合は、反対の構成で存在する。
経皮膜を通る送達に適した混合ミセル製剤は、ｓｉＲＮＡ組成物の水溶液とアルカリ金属Ｃ８～Ｃ２２アルキル硫酸塩とミセル形成化合物との混合によって調製することができる。例示的なミセル形成化合物としては、レシチン、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸の薬学的に許容され得る塩、グリコール酸、乳酸、カモミール抽出物、キュウリ抽出物、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、モノオレイン、モノオレエート、モノラウレート、ルリヂサ油、月見草油、メントール、トリヒドロキシオキソコラニルグリシン及びその薬学的に許容され得る塩、グリセリン、ポリグリセリン、リジン、ポリリジン、トリオレイン、ポリオキシエチレンエーテル及びその類似体、ポリドカノールアルキルエーテル及びその類似体、ケノデオキシコール酸塩、デオキシコール酸塩、及びこれらの混合物が挙げられる。ミセル形成化合物は、アルカリ金属アルキル硫酸塩と同時又は添加後に、添加することができる。混合ミセルは、実質的にあらゆる種類の成分の混合で形成されるが、より小さいサイズのミセルを提供するためには激しい混合が行われる。
一方法では、ｓｉＲＮＡ組成物及び少なくともアルカリ金属アルキル硫酸塩を含有する第１のミセル組成物が調製される。次いで、第１のミセル組成物が、少なくとも３種類のミセル形成化合物と混合されて混合ミセル組成物が形成される。別の方法では、ミセル組成物は、ｓｉＲＮＡ組成物とアルカリ金属アルキル硫酸塩と少なくとも１種類のミセル形成化合物と混合され、次いで、残りのミセル形成化合物を添加して激しく混合することによって調製される。
フェノール及び／又はｍ－クレゾールを混合ミセル組成物に添加して、製剤を安定させて、細菌の増殖から保護することができる。或いは、フェノール及び／又はｍ－クレゾールは、ミセル形成成分と共に添加しても良い。等張剤、例えば、グリセリンを、混合ミセル組成物の形成後に添加しても良い。
ミセル製剤を噴霧として送達するために、製剤をエアロゾルディスペンサーに入れることができ、このディスペンサーに噴霧剤を充填する。加圧下の噴霧剤は、ディスペンサー内で液体の形態である。水相と噴霧剤相とが１つになる、即ち、１つの相のみが存在するように、成分比が調整される。２つの相が存在する場合、内容物の一部を、例えば、計量弁によってディスペンスする前にディスペンサーを振盪する必要がある。医薬品のディスペンス量が、計量弁から微細な霧状で噴霧される。
噴霧剤としては、水素含有クロロフルオロカーボン、水素含有フルオロカーボン、ジメチルエーテル、及びジエチルエーテルを挙げることができる。特定の実施形態では、ＨＦＡ １３４ａ（１，１，１，２テトラフルオロエタン）を使用しても良い。
必須成分の特定濃度を、比較的簡単な実験によって決定することができる。口腔からの吸収では、多くの場合、注射による投与又は胃腸管を介した投与の投与量を、例えば、少なくとも２倍又は３倍に増量するのが望ましい。
粒子。説明を容易にするために、このセクションにおける粒子、製剤、組成物、及び方法は、主に修飾ｓｉＲＮＡ化合物に関して説明する。しかしながら、これらの粒子、製剤、組成物、及び方法は、他のｓｉＲＮＡ化合物、例えば、無修飾ｓｉＲＮＡ化合物を用いて実施することができ、このような実施が、本発明の範囲内であることを理解できよう。別の実施形態では、ｓｉＲＮＡ化合物、例えば、二本鎖ｓｉＲＮＡ化合物、又はｓｓｉＲＮＡ化合物、（例えば、前駆体、例えば、ｓｓｉＲＮＡ化合物にプロセシングすることができるより大きなｓｉＲＮＡ化合物、又はｓｉＲＮＡ化合物、例えば、二本鎖ｓｉＲＮＡ化合物をコードするＤＮＡ、又はｓｓｉＲＮＡ化合物、又はそれらの前駆体）調製物は、粒子、例えば、微粒子の中に含めることができる。微粒子は、噴霧乾燥によって製造することができるが、凍結乾燥、蒸発、流動床乾燥、真空乾燥、又はこれらの技術の組み合わせを含む他の方法によって製造することもできる。
医薬組成物
キラル修飾ｄｓＲＮＡ剤は、医薬用途のために製剤することができる。本発明はさらに、本明細書で定義されるキラル修飾ｄｓＲＮＡ剤を含む医薬組成物に関する。薬学的に許容され得る組成物は、単独で、或いは１種以上の薬学的に許容され得る担体（添加剤）、賦形剤、及び／又は希釈剤と共に製剤される、前述の実施形態の何れかの１種以上のキラル修飾ｄｓＲＮＡ剤を治療有効量、含む。
医薬組成物は、以下のように適合された投与を含め、固体又は液体の形態で投与されるように特別に製剤することができる：（１）例えば、水薬（水性若しくは非水性溶液、又は懸濁液）、錠剤、例えば、頬側、舌下、及び体内吸収用の錠剤、ボーラス、粉末、顆粒、舌に適用するためのペーストの経口投与；（２）例えば、滅菌液若しくは懸濁液、又は徐放製剤として、例えば、皮下注射、筋肉注射、静脈注射、若しくは硬膜外注射による非経口投与；（３）例えば、皮膚に適用されるクリーム、軟膏、又は放出制御パッチ若しくはスプレーとしての局所適用；（４）例えば、ペッサリー、クリーム、フォームとして膣内又は直腸内投与；（５）舌下投与；（６）眼内投与；（７）経皮的投与；或いは（８）鼻内投与。皮下又は点滴法を用いる送達は、特に有利であり得る。
本明細書で使用される「治療有効量」という句は、あらゆる治療に適用可能な妥当な効果／リスク比で、動物の細胞の少なくとも亜集団においてある程度の望ましい治療効果を得るのに有効な、本発明の化合物を含む化合物、材料、又は組成物の量のことである。
「薬学的に許容され得る」という句は、本明細書では、妥当な効果／リスク比に見合った、過度な毒性、刺激、アレルギー反応、又は他の問題や合併症が発生することなく、ヒト及び動物の組織に接触させるのに適した、正当な医学的判断の範囲内である化合物、材料、組成物、及び／又は剤形を指すために利用される。
本明細書で使用される「薬学的に許容され得る担体」という句は、目的の化合物をある器官又は体の一部から別の器官又は体の一部への運搬又は輸送に関与する薬学的に許容され得る材料、組成物、又はビヒクル、例えば、液体若しくは固体の充填剤、希釈剤、賦形剤、製造補助剤（例えば、潤滑剤、タルク、マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸亜鉛、若しくはステアリン酸（ｓｔｅｒｉｃ ａｃｉｄ））、若しくは材料を被包する溶媒を意味する。各担体は、製剤の他成分と適合性であって、患者に有害でないという点で「許容可能」ではなければならない。薬学的に許容され得る担体として役立ち得る材料の一部の例として：（１）糖、例えば、ラクトース、グルコース、及びスクロース；（２）デンプン、例えば、トウモロコシデンプン及びジャガイモデンプン；（３）セルロース及びその誘導体、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、及び酢酸セルロース；（４）粉末トラガカント；（５）麦芽；（６）ゼラチン；（７）平滑剤、例えば、マグネシウムステート（ｍａｇｎｅｓｉｕｍ ｓｔａｔｅ）、ラウリル硫酸ナトリウム、及びタルク；（８）賦形剤、例えば、ココアバター及び座薬ワックス；（９）油、例えば、ピーナッツ油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油、及び大豆油；（１０）グリコール、例えば、ポリエチレングリコール；（１１）ポリオール、例えば、グリセリン、ソルビトール、マンニトール、及びポリエチレングリコール；（１２）エステル、例えば、オレイン酸エチル及びラウリン酸エチル；（１３）寒天：（１４）緩衝剤、例えば、水酸化マグネシウム及び水酸化アルミニウム；（１５）アルギン酸；（１６）パイロジェンフリー水；（１７）等張食塩水；（１８）リンガー液；（１９）エチルアルコール；（２０）ｐＨ緩衝液；（２１）ポリエステル、ポリカーボネート、及び／又はポリ無水物；（２２）充填剤、例えば、ポリペプチド及びアミノ酸；（２３）血清成分、例えば、血清アルブミン、ＨＤＬ、及びＬＤＬ；（２２）医薬製剤に利用される他の無毒適合物質が挙げられる。
この製剤は、単位剤形で便利に提供することができ、薬学の分野で周知の任意の方法で調製することができる。単一剤形を製造するために担体材料と組み合わせることができる有効成分の量は、治療を受ける者及び投与の特定の方式によって異なる。単一剤形を製造するために担体材料と組み合わせることができる有効成分の量は、一般に、治療効果が得られる化合物の量である。一般に、１００％のうち、この量は、有効成分の約０．１％～約９９％、好ましくは約５％～約７０％、最も好ましくは約１０％～約３０％の範囲である。
特定の実施形態では、本発明の製剤としては、シクロデキストリン、セルロース、リポソーム、ミセル形成剤、例えば、胆汁酸、及びポリマー担体、例えば、ポリエステル及びポリ無水物；及び本発明の化合物からなる群から選択される賦形剤が挙げられる。特定の実施形態では、上述の製剤は、本発明の化合物を経口投与可能にする。
ｉＲＮＡ剤調製物は、別の作用剤、例えば、別の治療剤、又はｉＲＮＡを安定させる作用剤、例えば、ｉＲＮＡと複合体を形成してｉＲＮＰを形成するタンパク質と組み合わせて製剤することができる。なお他の作用剤としては、キレート剤、例えば、ＥＤＴＡ（例えば、二価のカチオン、例えば、Ｍｇ２＋を除去するための）、塩、及びＲＮＡ分解酵素阻害剤（例えば、特異性の広いＲＮＡ分解酵素阻害剤、例えば、ＲＮＡｓｉｎ）などが挙げられる。
これらの製剤又は組成物を調製する方法は、本発明の化合物を担体、及び任意選択で１種以上の補助成分と結合させるステップを含む。一般に、この組成物は、本発明の化合物を液体担体、細かく分割された固体担体、又は両方を均一に密着させて結合させ、次いで、必要に応じて製品を成形することによって調製する。
場合によっては、薬物の効果を持続させるために、皮下注射又は筋肉注射による薬物の吸収を遅延させることが望ましい。これは、水に溶けにくい結晶又は非晶質材料の液体懸濁液の使用によって達成することができる。次に、薬物の吸収速度は、結晶のサイズ及び結晶の形態に依存し得る溶解速度によって決まる。或いは、非経口投与される剤形（ｄｒｕｇ ｆｏｒｍ）の遅延吸収は、油性ビヒクル中に薬剤を溶解又は懸濁することによって達成される。
本発明による化合物は、他の医薬品との類似性によって、ヒト又は動物用の薬物に使用される任意の便利な方法で投与するために製剤することができる。
「治療」という語は、予防、療法、及び治癒も包含するものとする。この治療を受ける患者は、霊長類、特にヒト、及び他の哺乳動物、例えば、ウマ、ウシ、ブタ、及びヒツジ；並びに一般的な家禽及びペットを含む、治療を必要とするあらゆる動物である。
二本鎖ＲＮＡｉ剤は、例えば、細胞に送達される外来性ＤＮＡ鋳型により、ｉｎ ｖｉｖｏの細胞で産生される。例えば、ＤＮＡ鋳型は、ベクターに挿入して、遺伝子治療ベクターとして使用することができる。遺伝子治療ベクターは、例えば、静脈注射、局所投与（参照によりその全内容が本明細書に組み入れられる、米国特許第５，３２８，４７０号）、又は定位注入（例えば、参照によりその全内容が本明細書に組み入れられる、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：３０５４－３０５７を参照されたい）によって対象に送達することができる。遺伝子治療ベクターの医薬調製物は、許容され得る希釈剤中の遺伝子治療ベクターを含み得る、又は遺伝子送達ビヒクルが埋め込まれた徐放マトリックスを含み得る。例えば、ＤＮＡ鋳型は、２つの転写単位を含み得、１つの転写単位は、ｄｓＲＮＡ剤の上鎖を含む転写物を産生し、もう１つの転写単位は、ｄｓＲＮＡ剤の下鎖を含む転写物を産生する。鋳型が転写されると、ｄｓＲＮＡ剤が産生され、遺伝子サイレンシングを媒介するｓｉＲＮＡ剤の断片にプロセシングされる。
送達経路
本明細書で定義されるキラル修飾ｄｓＲＮＡ剤又は本明細書で定義されるキラル修飾ｄｓＲＮＡ剤を含む医薬組成物は、異なる送達経路を使用して対象に投与することができる。ｉＲＮＡを含む組成物は、様々な経路によって対象に送達することができる。例示的な経路には、静脈内、筋肉内、くも膜下腔内、腹腔内、脳室内、皮下、局所、直腸、肛門、膣、鼻腔、肺、眼、及び経皮；並びに静脈内注射、筋肉内注射、髄腔内注射、皮下注射、及び眼注射が含まれる。本発明のｉＲＮＡ分子及び／又はキラル修飾ｄｓＲＮＡ剤は、投与に適した医薬組成物に含めることができる。そのような組成物は、典型的には、１種又は複数種のｉＲＮＡ及び薬学的に許容される担体を含む。本明細書で使用される「薬学的に許容される担体」という語は、医薬投与に適合する、ありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤、及び吸収遅延剤などを含むものとする。薬学的に活性な物質のためのそのような媒体及び薬剤の使用は、当技術分野で周知である。従来の媒体又は薬剤が活性化合物と適合しない場合を除いて、組成物でのそれらの使用が企図される。補助的な活性化合物もまた、組成物に含めることができる。
本発明の組成物は、局所治療又は全身治療が望ましいか否か、及び治療される領域に基づいて様々な方式で投与することができる。投与は、局所（眼、膣、直腸、鼻、経皮を含む）、経口、又は非経口とすることができる。非経口投与としては、点滴、皮下、腹腔内若しくは筋肉内注射、又は気管支内若しくは脳室内投与が挙げられる。
投与の経路及び部位は、標的化を強めるために選択することができる。例えば、筋細胞を標的とするためには、目的の筋肉内への筋肉注射は、論理的な選択であろう。肺細胞は、ｉＲＮＡを噴霧形態で投与することによって標的とすることができる。血管内皮細胞は、バルーンカテーテルをｉＲＮＡでコーティングして、ＤＮＡを機械的に導入することによって標的とすることができる。
用量
一態様では、本発明は、本明細書で定義されるキラル修飾ｄｓＲＮＡ剤、例えば、ｓｉＲＮＡ剤を対象（例えば、ヒト対象）に投与する方法を取り上げる。別の態様では、本発明は、対象における標的遺伝子の発現の阻害に使用される、本明細書で定義されるキラル修飾ｄｓＲＮＡ剤に関する。この方法又は医療での使用は、（ａ）二本鎖部分が、１４～４０ヌクレオチド長、例えば、２１～２３ヌクレオチド長である、（ｂ）標的ＲＮＡ（例えば、外来性又は病原体標的ＲＮＡ）に対して相補的である、且つ、任意選択により、（ｃ）少なくとも１つの１～５ヌクレオチド長の３’オーバーハングを含む、キラル修飾ｄｓＲＮＡ剤、例えば、ｓｉＲＮＡ剤、例えば、二本鎖ｓｉＲＮＡ剤の単位用量を投与するステップを含む。一実施形態では、単位用量は、体重１ｋｇ当たり１０ｍｇ未満、又は体重１ｋｇ当たり１０ｍｇ未満、５ｍｇ未満、２ｍｇ未満、１ｍｇ未満、０．５ｍｇ未満、０．１ｍｇ未満、０．０５ｍｇ未満、０．０１ｍｇ未満、０．００５ｍｇ未満、０．００１ｍｇ未満、０．０００５ｍｇ未満、０．０００１ｍｇ未満、０．００００５ｍｇ未満、又は０．００００１ｍｇ未満であり、且つ体重１ｋｇ当たり２００ｎｍｏｌ未満のＲＮＡ剤（例えば、約４．４×１０１６のコピー）、又は体重１ｋｇ当たり１５００ｎｍｏｌ未満、７５０ｎｍｏｌ未満、３００ｎｍｏｌ未満、１５０ｎｍｏｌ未満、７５ｎｍｏｌ未満、１５ｎｍｏｌ未満、７．５ｎｍｏｌ未満、１．５ｎｍｏｌ未満、０．７５ｎｍｏｌ未満、０．１５ｎｍｏｌ未満、０．０７５ｎｍｏｌ未満、０．０１５ｎｍｏｌ未満、０．００７５ｎｍｏｌ未満、０．００１５ｎｍｏｌ未満、０．０００７５ｎｍｏｌ未満、０．０００１５ｎｍｏｌ未満のＲＮＡ剤である。
規定量は、疾患又は障害、例えば、標的ＲＮＡに関連した疾患又は傷害を治療又は予防するのに有効な量とすることができる。単位用量は、例えば、注射（例えば、静脈内、皮下、若しくは筋肉内）、吸入投与、又は局所適用によって投与することができる。一部の実施形態では、用量は、体重１ｋｇ当たり１０ｍｇ未満、５ｍｇ未満、２ｍｇ未満、１ｍｇ未満、又は０．１ｍｇ未満とすることができる。
一部の実施形態では、単位用量は、１日に１回未満の頻度、例えば、２日に１回未満、４日に１回未満、８日に１回未満、又は３０日に１回未満投与される。別の実施形態では、単位用量は、一定の頻度では投与されない（例えば、定期的な頻度ではない）。例えば、単位用量は、１回で投与することができる。
一実施形態では、有効量は、他の従来の治療様式で投与される。一実施形態では、対象は、ウイルス感染している患者であり、治療様式は、ｄｓＲＮＡ剤以外、例えば、ｓｉＲＮＡ剤以外の抗ウイルス剤である。別の実施形態では、対象は、アテローム性動脈硬化症であり、有効量のｄｓＲＮＡ剤、例えば、ｓｉＲＮＡ剤が、例えば、外科介入後、例えば、血管形成術と組み合わせて投与される。
一実施形態では、対象に、初回量及び１回以上の維持量のキラル修飾ｄｓＲＮＡ剤、例えば、ｓｉＲＮＡ剤、（例えば、前駆体、例えば、ｓｉＲＮＡ剤にプロセシングすることができるより大きなｄｓＲＮＡ剤、又はキラル修飾ｄｓＲＮＡ剤、例えば、ｓｉＲＮＡ剤をコードするＤＮＡ、又はその前駆体）が投与される。１又は複数の維持量は、初回量と同じ、又は初回量よりも少なくする、例えば、初回量の半分とすることができる。維持療法は、１日に付き体重１ｋｇ当たり０．０１μｇ～１５ｍｇの範囲、例えば、１日に付き体重１ｋｇ当たり１０ｍｇ、１ｍｇ、０．１ｍｇ、０．０１ｍｇ、０．００１ｍｇ、又は０．００００１ｍｇの１又は複数の用量を用いて対象を治療するステップを含み得る。維持量は、例えば、２日に１回以下、５日に１回以下、１０日に１回以下、又は３０日に１回以下投与される。さらに、治療法は、一定期間継続することができ、この期間は、特定の疾患の性質、その重症度、及び患者の全体的な状態によって異なり得る。特定の実施形態では、用量を、１日に１回以下、例えば、２４時間、３６時間、４８時間、又はそれ以上に１回、例えば、５日若しくは８日に１回投与することができる。治療後、患者の状態の変化及び病態の症状の緩和について、患者を監視することができる。化合物の用量は、患者が現在の用量レベルに有意に応答しない場合は増量しても良いし、或いは、疾患の状態の症状の緩和が観察された場合、疾患の状態が軽減された場合、又は不所望の副作用が観察された場合は減量しても良い。
有効量は、必要に応じて、又は特定の状況下で適切と見なされる場合、単回又は２回以上の投与で投与することができる。反復又は頻繁な注入を容易にしたい場合は、送達装置、例えば、ポンプ、半永久ステント（例えば、静脈内、腹腔内、嚢内、又は関節内）、又はレザバーの植え込みを提案することができる。
一実施形態では、組成物は、複数のキラル修飾ｄｓＲＮＡ剤種を含む。別の実施形態では、キラル修飾ｄｓＲＮＡ剤種は、天然の標的配列に関しては、別の種とオーバーラップも隣接もしていない配列を有する。別の実施形態では、複数のキラル修飾ｄｓＲＮＡ剤種は、異なる天然の標的遺伝子に特異的である。別の実施形態では、キラル修飾ｄｓＲＮＡ剤は、対立遺伝子特異的である。
本明細書に記載されるキラル修飾ｄｓＲＮＡ剤は、哺乳動物、特に大きい動物、例えば、非ヒト霊長類又はヒトに様々な方法で投与することができる。
一実施形態では、キラル修飾ｄｓＲＮＡ剤、例えば、ｓｉＲＮＡ剤、組成物の投与は、非経口、例えば、静脈内（例えば、ボーラスとして、又は拡散注入として）、皮内、腹腔内、筋肉内、くも膜下、脳室内、頭蓋内、皮下、経粘膜、頬側、舌下、内視鏡、直腸、経口、膣、局所、肺、鼻、尿道、又は眼内である。投与は、対象によって、又は別の人間、例えば、医療提供者によって行うことができる。薬物治療は、測定した用量で、又は測定した用量を送達するディスペンサーで行うことができる。選択される送達方式は、以下に詳細に説明される。
本発明は、本明細書に記載されるキラル修飾ｄｓＲＮＡ剤の直腸投与又は送達のための方法、組成物、及びキットを提供する。
特定の実施形態では、本発明は、上記の方法に使用されるキラル修飾ｄｓＲＮＡ剤に関する。
標的遺伝子の発現を阻害する方法
本発明の実施形態は、標的遺伝子の発現を阻害する方法にも関する。この方法は、標的遺伝子の発現を阻害するのに十分な量の、前述の任意の実施形態におけるキラル修飾ｄｓＲＮＡ剤を投与するステップを含む。本発明はさらに、標的細胞における標的遺伝子の発現を阻害するための、本明細書で定義されるキラル修飾ｄｓＲＮＡ剤の使用に関する。好ましい一実施形態では、本発明はさらに、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの標的細胞における標的遺伝子の発現を阻害するためのキラル修飾ｄｓＲＮＡ剤の使用に関する。
別の態様では、本発明は、本発明のキラル修飾ｄｓＲＮＡ剤を細胞に供給するステップを含む、前記細胞における標的遺伝子の発現を調節する方法に関する。一実施形態では、標的遺伝子は、第ＶＩＩ因子、Ｅｇ５、ＰＣＳＫ９、ＴＰＸ２、ａｐｏＢ、ＳＡＡ、ＴＴＲ、ＲＳＶ、ＰＤＧＦβ遺伝子、Ｅｒｂ－Ｂ遺伝子、Ｓｒｃ遺伝子、ＣＲＫ遺伝子、ＧＲＢ２遺伝子、ＲＡＳ遺伝子、ＭＥＫＫ遺伝子、ＪＮＫ遺伝子、ＲＡＦ遺伝子、Ｅｒｋ１／２遺伝子、ＰＣＮＡ（ｐ２１）遺伝子、ＭＹＢ遺伝子、ＪＵＮ遺伝子、ＦＯＳ遺伝子、ＢＣＬ－２遺伝子、ヘプシジン、活性化プロテインＣ、サイクリンＤ遺伝子、ＶＥＧＦ遺伝子、ＥＧＦＲ遺伝子、サイクリンＡ遺伝子、サイクリンＥ遺伝子、ＷＮＴ－１遺伝子、β－カテニン遺伝子、ｃ－ＭＥＴ遺伝子、ＰＫＣ遺伝子、ＮＦＫＢ遺伝子、ＳＴＡＴ３遺伝子、サバイビン遺伝子、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ遺伝子、トポイソメラーゼＩ遺伝子、トポイソメラーゼＩＩα遺伝子、ｐ７３遺伝子の突然変異、ｐ２１（ＷＡＦ１／ＣＩＰ１）遺伝子の突然変異、ｐ２７（ＫＩＰ１）遺伝子の突然変異、ＰＰＭ１Ｄ遺伝子の突然変異、ＲＡＳ遺伝子の突然変異、カベオリンＩ遺伝子の突然変異、ＭＩＢ Ｉ遺伝子の突然変異、ＭＴＡＩ遺伝子の突然変異、Ｍ６８遺伝子の突然変異、腫瘍抑制遺伝子の突然変異、及びｐ５３腫瘍抑制遺伝子の突然変異からなる群から選択される。
特定の実施形態では、本発明は、上記の方法に使用される本発明のキラル修飾ｄｓＲＮＡ剤に関する。
本発明が、以下の実施例によってさらに例示されるが、これらの実施例は、さらなる限定と解釈されるべきものではない。本出願で言及される全ての参照文献、出願中の特許出願、及び公開特許の開示内容は、参照により本明細書に明確に組み入れられるものとする。
実施例１．ヌクレアーゼ安定性、ＲＩＳＣローディング、及びｓｉＲＮＡのｉｎ ｖｉｖｏ活性全体に対するキラル的に純粋なＰＳ結合の位置依存効果
ヌクレアーゼ活性からｓｉＲＮＡを保護する効果的な方法は、それらのホスホジエステル結合を、リン（Ｒｐ／Ｓｐ中心）においてキラルであるホスホロチオエート（ＰＳ）と交換することである。この実施例は、キラル的に純粋なヌクレオチド間ホスホロチオエート結合をｓｉＲＮＡ剤に導入する効率的な方法を実証し、結果として得られるキラル的に純粋な末端ＰＳ修飾ｓｉＲＮＡが、ｉｎ ｖｉｖｏでの薬理学的特性を維持又は改善すると共に、ＰＳ結合の数を減少させた。
キラル的に純粋な３ＰＳ、４ＰＳ、５ＰＳ、及び６ＰＳ ｓｉＲＮＡを合成するためのアプローチ
様々なプロトコルを使用して、キラル的に純粋なＰＳ結合をオリゴヌクレオチドに生じさせることができる：例えば、Ｈ－ホスホネート法、オリゴヌクレオチドレベルでのＰＳジアステレオ異性体の分離、ホスホラミダイト法のキラル純粋ジヌクレオチドビルディングブロック、又はオキサザホスホリジンアプローチ。
この実施例は、３つのアプローチを実証する：アプローチ１、オリゴヌクレオチドレベルでのＰＳジアステレオマーの分離、アプローチ２、キラル的に純粋なジヌクレオチドビルディングブロックを使用、及びアプローチ３、オキサザホスホリジン（ＯＡＰ）単量体を使用。この実施例では、２’－ＯＭｅ修飾及び／又は２’－Ｆ修飾を含むホスホチオエート結合（ＰＳ）によって結合されたすべての可能なジヌクレオチドを合成し、分析した（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｊａｈｎｓ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｔｅｒｅｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｂｉａｓ ｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄ ｄｕｒｉｎｇ ＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｍｏｄｕｌａｔｅｓ ｔｈｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ ｓｉＲＮＡｓ，”Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ６：６３１７（２０１５）を参照）。
アプローチ１：オリゴヌクレオチドレベルでのＰＳジアステレオマーの分離。完全長オリゴヌクレオチドを、標準の２’－ＯＭｅ－、２’－Ｆ－ホスホラミダイト条件及びアクチベーターとしての５－エチルチオ－１Ｈ－テトラゾール（ＥＴＴ）を使用してＡＢＩで合成した。ＰＳジアステレオ異性体の分離を容易にするために、最後のＤＭＴ基を維持した。Ｃ５標的配列の２１ｍｅｒ ５’－１ＰＳセンス鎖（ＳＳ１及びＳＳ２；ｓｉＲＮＡの配列及びキラリティーが表１に示されている）及び２３ｍｅｒ ３’、５’－２ＰＳアンチセンス鎖（ＡＳ１、ＡＳ２、ＡＳ３、ＡＳ４；ｓｉＲＮＡの配列及びキラリティーが表１に示されている）のジアステレオマー混合物をそれぞれ合成した。ジアステレオマーをイオン交換精製（ＩＥＸ）によって分離した。図１は、ＤＭＴ保護基（ＤＭＴ－オン）を有する５’－１ＰＳセンス鎖のＲｐ／Ｓｐ ＰＳジアステレオマー、及びＤＭＴ－オンの３’，５’－２ＰＳアンチセンス鎖の４つすべてのＰＳジアステレオマーの分析ＩＥＸクロマトグラフィーでの分離の結果を示す。５’末端にＳｐ立体化学を有するＤＭＴ－オンのオリゴヌクレオチドは、典型的には、Ｒｐジアステレオマーの前に逆相ＨＰＬＣで溶出し（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｗａｎ ｅｔ ａｌ．， “Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｓｅｃｏｎｄ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｃｈｉｒａｌ ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ ｌｉｎｋａｇｅｓ，” Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４２（２２）： １３４５６－１３４６８ （２０１４）を参照）、ＩＥＸによって分離されたジアステレオマーについて同じ傾向が観察された。ＤＭＴ基が除去されると、５’末端ＲｐジアステレオマーはＳｐジアステレオマーよりも速く移動した。オリゴヌクレオチドの一部のジアステレオマーは、５’末端にＤＭＴ基が存在しないと分解しなかった。すべてのジアステレオ異性体を、約８０％の純度の化合物ＡＳ２及びＡＳ４を除いて、９０％超の純度で分離した（図１）。
一本鎖の３ＰＳ修飾Ｃ５配列のＰＳジアステレオマーを分離した後、５’－１ＰＳセンス鎖（ＳＳ１、ＳＳ２）及び３’，５’－２ＰＳアンチセンス鎖（ＡＳ１－ＡＳ４）のジアステレオマーを、３ＰＳ修飾ｓｉＲＮＡの８つのキラル的に純粋なジアステレオマーに構築した（表３のｓｉ４、ｓｉ６、ｓｉ８、ｓｉ１０、ｓｉ１２、ｓｉ１４、ｓｉ１６及びｓｉ１８を参照）。
Figure 0007348185000016
アプローチ２：キラル的に純粋なジヌクレオチドビルディングブロックを使用。カップリング／硫化、３’ＴＢＤＭＳ－脱保護、及び３’－ホスフィチル化（図２ａ）を含む４段階の反応での、Ｃ５及びｍｒＴＴＲ配列のキラル的に純粋なジヌクレオチドビルディングブロック（表３に示されている）の合成。ＰＳジヌクレオチドジアステレオ異性体の混合物を、硫化後、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）によって移動速度の速いジアステレオ異性体（上部スポット）と移動速度の遅いジアステレオ異性体（下部スポット）に効果的に分離した（図２ｂ）。分離により、すべての化合物で９９％を超える純度と良好な全収率が得られた。
ＰＳジアステレオマーの３１Ｐ－ＮＭＲシグナルの化学シフトを使用して、Ｒｐ／Ｓｐ立体化学とジアステレオ異性体生成物の比率を決めた。低磁場シフト（３１Ｐ－ＮＭＲスペクトルによる）ジアステレオマーはＲｐジアステレオ異性体として割り当てたが、高磁場シフト（３１Ｐ－ＮＭＲスペクトルによる）ジアステレオマーは、Ｓｐジアステレオマーとして割り当てた（表２）（どちらも参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、Ｂａｒｔｌｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｔｅｒｅｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｏｕｒｓｅ ｏｆ ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｃａｔａｌｙｚｅｄ ｂｙ ａｖｉａｎ ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ．”Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２５７（１５）： ８８７９－８８８４（１９８２）；Ｃｏｎｎｏｌｌｙ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ｏｃｔａｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｔｈｅ ＥｃｏＲＩ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｗｉｔｈ ａ ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ ｇｒｏｕｐ ａｔ ｔｈｅ ｃｌｅａｖａｇｅ ｓｉｔｅ，”Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２３（１５）：３４４３－３４５３（１９８４）を参照）。
ジアステレオマーのジヌクレオチド生成物の比率は、２’糖修飾と核酸塩基による影響を受けたが、各ジヌクレオチドのバッチ間でのジアステレオマー生成物の比率は一定であった。ＥＴＴをアクチベーターとして使用すると、特定のジアステレオマー形態への偏りが生じた。一部のジヌクレオチドにおけるＲｐ／Ｓｐのジアステレオマー比により、エピマー混合物（例えば、ｃｓＵｆ）、Ｒｐジアステレオ異性体への偏り（例えば、ｕｓｃにおいてＲｐ／Ｓｐ＝７０／３０）、又はＳｐジアステレオ異性体への偏り（例えば、ＧｆｓｇにおいてＲｐ／Ｓｐ＝２８／７２）が生じた（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｊａｈｎｓ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｔｅｒｅｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｂｉａｓ ｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄ ｄｕｒｉｎｇ ＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｍｏｄｕｌａｔｅｓ ｔｈｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ ｓｉＲＮＡｓ，”Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ６：６３１７（２０１５）を参照）。
完全に脱保護された立体化学的に純粋なＰＳジヌクレオチドの立体化学を割り当てるために、化合物をヘビ毒ホスホジエステラーゼ（ＳＶＰＤＥ）及びホスホジエステラーゼＩＩ（ＰＤＩＩ）と共にインキュベートした。上部スポットのジアステレオマーは、３１Ｐ－ＮＭＲ化学シフトと、ＳＶＰＤＥがＲｐ ＰＳジアステレオマーを選択的に分解するという事実とに基づいてＲｐジアステレオマーとして割り当てた（参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、Ｐｏｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ａ ｄｉｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｉｓｏｔｏｐｉｃａｌｌｙ ｃｈｉｒａｌ ａｔ ｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓ． Ｓｔｅｒｅｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｏｕｒｓｅ ｏｆ Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｉｔｒｉｎｕｍ ｎｕｃｌｅａｓｅ Ｐ１ ｒｅａｃｔｉｏｎ，”Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２２（６）：１３６９－１３７７（１９８３）を参照）。ＰＤＩＩは、６つの全ジヌクレオチドにおいてＳｐ ＰＳジアステレオマーの分解に対する選択性を示した。（ｇｓａ）ジヌクレオチドは例外であり、３１Ｐ－ＮＭＲ及びヌクレアーゼ分解の規則に基づいて、上部スポットをＳｐジアステレオマーとして割り当てた（表２を参照）。立体化学的に純粋なＰＳジヌクレオチドの立体化学割り当ての結果を表２に示す。
Figure 0007348185000017
次いで、キラル的に純粋な３ＰＳ Ｃ５配列及び３ＰＳ ｍｒＴＴＲ配列のオリゴヌクレオチドを、ジヌクレオチドアプローチ２を使用して合成して、表３に示されている、各標的ｓｉＲＮＡ、ｓｉ３－ｓｉ１８を調製するための８つのジアステレオマーオリゴヌクレオチドを得た。これらのｓｉＲＮＡのセンス鎖については、３’ＧａｌＮＡｃを運ぶ前駆体１９－ｍｅｒを自動化オリゴヌクレオチド合成装置で合成した。センス鎖の５’末端にキラル的に純粋なＰＳ結合を導入するために、対応するジヌクレオチドビルディングブロックを手動でカップリングし、酸化させて前駆体にした。アンチセンス鎖については、２つのキラル的に純粋なＰＳ結合を３’及び５’の両末端に組み込んだ。３’末端ＰＳキラリティーをもたらすキラル的に純粋なジヌクレオチドビルディングブロックは、制御された細孔ガラス（ＣＰＧ）に手動でカップリングし、続いてオリゴヌクレオチド合成装置でホスホジエステルヌクレオチド間結合を含む次の１９ヌクレオチドをカップリングした。アンチセンス鎖の５’末端におけるキラル的に純粋な結合を手動カップリング工程によって組み込み、所望のキラル的に純粋な２ＰＳアンチセンス鎖を得た（アプローチ２、図２ａ）。すべてのオリゴヌクレオチドをＤＭＴ－オンで合成して、オリゴヌクレオチドの立体化学的純度を確認した（図１に示されている）。
２つの異なるアプローチ（アプローチ１及びアプローチ２）によって作製されたＣ５化合物の立体化学を、逆相ＨＰＬＣ及び３１Ｐ－ＮＭＲのＤＭＴ－オン及びオフのフリップで確認した（表２）。オリゴヌクレオチドレベルでのジアステレオマーの分離（アプローチ１）及びキラル的に純粋なジヌクレオチドビルディングブロックの使用（アプローチ２）の両方により、立体化学的に純粋なオリゴヌクレオチドを得た。しかしながら、後者のアプローチは、大規模でより高い純度をもたらした。
２つ以上の連続したキラル的に純粋なＰＳ結合（２ＰＳ、３ＰＳ、４ＰＳ）を含む他のすべてのオリゴヌクレオチドは、ＯＡＰ単量体ビルディングブロックのカップリングを使用して合成した（アプローチ３）。
エピマー混合物のハイブリダイゼーション能力を、融解温度（ＴｍＳ）を測定することによってキラル的に純粋な３ＰＳ化合物と比較した（表３）。３’及び５’末端結合におけるＰＳキラリティーは、ｍｒＴＴＲ ｓｉＲＮＡのハイブリダイゼーションに対してはわずかな影響（±１℃）しか与えなかった。
Figure 0007348185000018
３’－ＡＳ鎖におけるＳｐジアステレオ異性体はより高いｉｎ ｖｉｔｒｏ活性をもたらす
ｓｉＲＮＡの末端位置（すなわち、センス鎖の５’－１ＰＳ、アンチセンス鎖の５’－１ＰＳ及び３’－１ＰＳ）における異なるジアステレオ異性体の生物学的影響を評価するために、８つのキラル的に純粋なｓｉＲＮＡ異性体及びそれらのエピマー混合物（表３に示されているｓｉ１～ｓｉ１８）を、初代マウス肝細胞でのｉｎ ｖｉｔｒｏ自由取り込み実験で試験した。すべてのｓｉＲＮＡを、標的ｍＲＮＡ発現の阻害について段階的濃度で試験し、それらのＩＣ５０値を図３に示す。エピマー３ＰＳ混合物（ｍｒＴＴＲのｓｉ１及びＣ５のｓｉ２）はそれぞれ、０．３８ｎＭ及び０．８２ｎＭのＩＣ５０値で強いノックダウンを示した。両方の標的において、２つのキラル的に純粋な３ＰＳ化合物、Ｒ／Ｒ－Ｓ（ｓｉ５／ｓｉ６）、及びＳ／Ｒ－Ｓ（ｓｉ１３／ｓｉ１４）は、エピマー３ＰＳ混合物と比較して有意に高い活性をもたらした。１つのキラルＰＳ中心が変更された８つのキラル的に純粋なｓｉＲＮＡ異性体の直接比較（例えば、Ｒ／Ｒ－Ｒ対Ｒ／Ｓ－Ｒ）では、５’－１ＰＳアンチセンス鎖にＲｐジアステレオマーを有するｓｉＲＮＡが、すべてのケースでより高いｉｎ ｖｉｔｒｏ活性をもたらした（ｍｒＴＴＲの場合は、ｓｉ３、ｓｉ５、ｓｉ１１、ｓｉ１３＞ｓｉ７、ｓｉ９、ｓｉ１５、ｓｉ１７；Ｃ５の場合は、ｓｉ４、ｓｉ６、ｓｉ１２、ｓｉ１４＞ｓｉ８、ｓｉ１０、ｓｉ１６、ｓｉ１８）。他方、３’－１ＰＳアンチセンス鎖のＳｐジアステレオマーは活性を改善した（ｍｒＴＴＲの場合は、ｓｉ３、ｓｉ７、ｓｉ１１、ｓｉ１５＜ｓｉ５、ｓｉ９、ｓｉ１３、ｓｉ１７；Ｃ５場合は、ｓｉ４＜ｓｉ６、ｓｉ８＜ｓｉ１０、ｓｉ１２＜ｓｉ１４、ｓｉ１６＜ｓｉ１８）。５’－１ＰＳセンス鎖のＲｐジアステレオマーは、Ｒ／Ｓ－ＳからＳ／Ｓ－Ｓ（ｓｉ９、ｓｉ１０＞ｓｉ１７、ｓｉ１８）化合物を除いて、活性を改善した。
ｓｉＲＮＡの２つの重要な薬理学的特性は、ヌクレアーゼに対するその安定性及びその固有のＲＮＡｉサイレンシング効力である。ＰＳ含有オリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ安定性の評価は、典型的には、Ｒｐジアステレオ異性体を分解する傾向がある３’エキソヌクレアーゼＳＶＰＤＥを使用して測定する。この実施例では、キラル的に純粋なジヌクレオチドと５’エキソヌクレアーゼであるホスホジエステラーゼＩＩ（ＰＤＩＩ）のインキュベーションにより、Ｓｐジアステレオマーと比較してＲｐジアステレオ異性体が高い安定性を示した。ホスホロチオエート結合は、一般にホスホジエステルよりも安定であるが、ＲｐとＳｐの安定性の違いは、化合物が一緒にインキュベートされるヌクレアーゼに依存し得る。ジヌクレオチドのヌクレアーゼ安定性及びｉｎ ｖｉｔｒｏ実験は、５’－１ＰＳ Ｒｐジアステレオマー及び３’－１ＰＳ ＳｐジアステレオマーがｓｉＲＮＡヌクレアーゼの安定性及び活性に有益であったことを示している。
ｓｉＲＮＡの効力に影響を与える要因には、二重鎖安定性（どちらも参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、Ｋｈｖｏｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．，“Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｓｉＲＮＡｓ ａｎｄ ｍｉＲＮＡｓ Ｅｘｈｉｂｉｔ Ｓｔｒａｎｄ Ｂｉａｓ，”Ｃｅｌｌ １１５（２）：２０９－１６（２００３）；Ａｄｄｅｐａｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，“Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅｒｍａｌ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｃａｎ ｅｎｈａｎｃｅ ｔｈｅ ｐｏｔｅｎｃｙ ｏｆ ｓｉＲＮＡ．”Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３８（２０）：７３２０－３１ （２０１０）を参照）、鎖の選択（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｓｃｈｗａｒｚ ｅｔ ａｌ．，“Ａｓｙｍｍｅｔｒｙ ｉｎ ｔｈｅ Ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ ｔｈｅ ＲＮＡｉ Ｅｎｚｙｍｅ Ｃｏｍｐｌｅｘ，”Ｃｅｌｌ １１５（２）：１９９－２０８（２００３）を参照）、特定のヌクレオチドモチーフの存在（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｈｕｅｓｋｅｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ａ ｇｅｎｏｍｅ－ｗｉｄｅ ｓｉＲＮＡ ｌｉｂｒａｒｙ ｕｓｉｎｇ ａｎ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｎｅｕｒａｌ ｎｅｔｗｏｒｋ．”Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ ２３（８）：９９５－１００１ （２００５）を参照）、並びにガイド鎖及び／又はパッセンジャー鎖の化学修飾（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｂｒａｍｓｅｎ， ｅｔ ａｌ．，“Ａ ｓｃｒｅｅｎ ｏｆ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ ｐｏｓｉｔｉｏｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｂｙ ＵＮＡ ｔｏ ｍｏｓｔ ｐｏｔｅｎｔｌｙ ｒｅｄｕｃｅ ｓｉＲＮＡ ｏｆｆ－ｔａｒｇｅｔ ｅｆｆｅｃｔｓ，”Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３８（１７）：５７６１－７３（２０１０）を参照）が含まれ得る。薬力学的観点から、治療用ｓｉＲＮＡの最も重要な目的地は、標的細胞の細胞アルゴノート（Ａｇｏ）２である。哺乳動物では、Ａｇｏタンパク質のＡｇｏサブファミリーに属するＡｇｏ２（例えば、Ｃａｒｍｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，“Ｔｈｅ Ａｒｇｏｎａｕｔｅ ｆａｍｉｌｙ：ｔｅｎｔａｃｌｅｓ ｔｈａｔ ｒｅａｃｈ ｉｎｔｏ ＲＮＡｉ，ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ，ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ，ａｎｄ ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓ，”Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １６（２１）：２７３３－４２（２００２）を参照）は、ガイド鎖に結合し、標的ｍＲＮＡの切断を触媒するＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）内のタンパク質である（どちらも参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，“Ａｒｇｏｎａｕｔｅ２ Ｉｓ ｔｈｅ Ｃａｔａｌｙｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅ ｏｆ Ｍａｍｍａｌｉａｎ ＲＮＡｉ，”Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０５（５６８９）：１４３７－４１ （２００４）；Ｍｅｉｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，“Ｈｕｍａｎ Ａｒｇｏｎａｕｔｅ２ Ｍｅｄｉａｔｅｓ ＲＮＡ Ｃｌｅａｖａｇｅ Ｔａｒｇｅｔｅｄ ｂｙ ｍｉＲＮＡｓ ａｎｄ ｓｉＲＮＡｓ，”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ １５（２）：１８５－９７（２００４）を参照）。ＲＮＡガイドと複合体を形成したヒトＡｇｏ２の結晶構造は、Ａｇｏ２残基とアンチセンス鎖の３’末端及び５’末端でのＰＯ結合の非架橋酸素との間の広範な水素結合接触を示す（どちらも参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、Ｅｌｋａｙａｍ ｅｔ ａｌ．，“Ｔｈｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ａｒｇｏｎａｕｔｅ－２ ｉｎ Ｃｏｍｐｌｅｘ ｗｉｔｈ ｍｉＲ－２０ａ，“Ｃｅｌｌ １５０（１）：１００－１１０（２０１２）；Ｓｃｈｉｒｌｅ ｅｔ ａｌ．，“Ｔｈｅ Ｃｒｙｓｔａｌ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ａｒｇｏｎａｕｔｅ２，”Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３６（６０８４）：１０３７－１０４０（２０１２）を参照）。
キラル的に純粋な３ＰＳ ｓｉＲＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏでの様々な活性もたらす、ＰＳ立体化学のＡｇｏローディングに対する影響を評価するために、ｓｉＲＮＡを、まずキラル的に純粋な１ＰＳ化合物として評価した。表４に示されているように、アンチセンス鎖の５’末端（ｓｉ２０／ｓｉ２１）及びアンチセンス鎖の３’末端（ｓｉ２２／ｓｉ２３）における単一の立体化学的に純粋なＰＳ（Ｒｐ／Ｓｐ）結合を有するｓｉＲＮＡを合成し、非ＰＳ ｓｉＲＮＡ（ｓｉ１９）及び６ＰＳステレオ混合物ｓｉＲＮＡ（ｓｉ２４及びｓｉ２５）と比較した。キラル的に純粋な１ＰＳ化合物（ｓｉ２０～２３）を使用して、Ａｇｏローディングに対するアンチセンス鎖の末端でのＲｐ／Ｓｐ立体化学の排除効果を調べた。Ａｇｏ２関連ｓｉＲＮＡを、ＦＬＡＧ－ＨＡタグ付きヒトＡｇｏ２を過剰発現するＨＥＫ２９３細胞溶解物を使用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＳＬ－ＲＴ ＱＰＣＲによって定量した（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｐｅｉ ｅｔ ａｌ．， “Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｉＲＮＡ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｉｎ ｖｉｖｏ，” ＲＮＡ １６（１２）： ２５５３－２５６３ （２０１０））。ヌクレアーゼ阻害剤であるＳｕｐｅｒａｓｅ－Ｉｎを使用して、ｓｉＲＮＡの不所望の分解を排除した。非ＰＳ ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖であるｓｉ１９は、１０ｆｇ／μｌのローディングで予測される優先傾向を示した。ｓｉ２０（５’－Ｒｐ配置を有する）及びｓｉ２１（５’－Ｓｐ配置を有する）のアンチセンス鎖はわずかな違いを示し、５’－Ｒｐ配置ではわずかにＡｇｏローディングが優先された。驚いたことに、アンチセンス鎖の３’末端における立体化学は顕著な違いを示した。ｓｉ２３（３’－Ｓｐ配置を有する）のアンチセンス鎖は、ｓｉ２２（同じ位置に３’－Ｒｐ配置を有する）のアンチセンス鎖と比較して、５倍高いＡｇｏローディングをもたらした。この結果を図４に示す。これは、ＰＳ結合のＳｐ立体化学がＡｇｏローディングを大幅に改善したという初めての驚くべき実証である。
Figure 0007348185000019
１ＰＳ修飾ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖の３’末端におけるＳｐ立体化学の改善されたＡｇｏローディング活性の効果がキラル的に純粋な３ＰＳ ｓｉＲＮＡに変換されるかどうかを評価するために、８つすべてのキラル的に純粋な３ＰＳ ｍｒＴＴＲジアステレオマーのｉｎ ｖｉｔｒｏ Ａｇｏローディング能力を試験した。図５に示されているように、すべての化合物が、３ＰＳエピマー混合物と比較して良好なローディングを示した。一度に１つのキラルＰＳ中心が変化する８つの化合物の直接比較（例えば、Ｒ／Ｒ－Ｒ対Ｒ／Ｒ－Ｓ）では、３’末端アンチセンス鎖にＳｐジアステレオマーを有するｓｉＲＮＡは、すべてのケースでｉｎ ｖｉｔｒｏでより高いＡｇｏローディング活性をもたらした（表３：ｓｉ５、ｓｉ９、ｓｉ１３、ｓｉ１７＞ｓｉ３、ｓｉ７、ｓｉ１１、ｓｉ１５）。５’末端アンチセンス鎖のキラリティーは、比較的小さな役割を果たしているように見えた（Ｒ／Ｒ－Ｒ対Ｒ／Ｓ－Ｒ）。Ｒ／Ｒ－Ｓ（ｓｉ５）及びＳ／Ｒ－Ｓ（ｓｉ１３）のキラリティーパターンを有する２つの化合物は、３ＰＳエピマー混合物と比較して５倍高いＡｇｏローディング活性を示した。５’末端センス鎖のキラリティーは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＡｇｏローディング活性に影響を及ぼさなかった。
ＰＡＺドメインは、疎水性環境を表す、Ａｇｏに見られる高度に保存されたＲＮＡ結合モジュールである（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｍａ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ｏｖｅｒｈａｎｇ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｂｙ ｔｈｅ ＰＡＺ ｄｏｍａｉｎ，”Ｎａｔｕｒｅ ４２９（６９８９）：３１８－３２２（２００４）を参照）。３’末端アンチセンス鎖のキラリティーをさらに分析するために、９－ｍｅｒのＲＮＡ配列５’－ＣＧＵ ＧＡ５Ｃ６ Ｕ７Ｃ８Ｕ９－３’を有するｈＡｇｏｌ ＰＡＺの結晶構造を分析して、リン酸基とＰＡＺ残基との間の接触を評価した。図６に示されているように、ＰＡＺ残基と、Ｕ９とＣ８（Ｐ９）とＣ８とＵ７（Ｐ８）との間のリン酸塩との相互作用を分析した。Ｐ９におけるＳｐ「硫黄」とＲｐ「硫黄」の環境は著しく異なる。従って、Ｓｐ異性体の環境は、Ｔｙｒ－３０９及びＴｙｒ－３１４への２つのＨ結合を有する（酸素に有益である）Ｒｐ異性体と比較して、Ｈｉｓ－２６９との直接接触及びＦ３１０の近傍にもかかわらず、より疎水性である（硫黄にとって有益である）。Ａｇｏと９－ｍｅｒの共結晶構造は、アンチセンス鎖の３’末端におけるＰＳ結合のＳｐジアステレオマーがＡｇｏローディング活性を改善したという実験的発見を支持する。結晶構造はさらに、Ｐ８ヌクレオチド間結合では、ＰＳ結合のＳｐジアステレオマーがＡｇｏのアンチセンス鎖に適応するために有益であり得ることを示した。
Ｉｎ ｖｉｖｏ分析により、各ＰＳ立体異性体の配置についての位置ベースの優先傾向が明らかになる
観察されたｉｎ ｖｉｔｒｏ活性及びＡｇｏローディング活性がｉｎ ｖｉｖｏ活性に変換されることになるかどうかを理解するために、各化合物をＷＴマウスでスクリーニングして、キラル的に純粋な３ＰＳ修飾３’－ＧａｌＮＡｃコンジュゲートｓｉＲＮＡの有効性／持続時間に対する影響を決定し、そして６ＰＳエピマー混合物ｓｉＲＮＡと比較した。動物に各ｓｉＴＴＲ化合物を、６ＰＳ親ＥＤ８０、２ｍｇ／ｋｇで単回皮下投与した。循環マウスＴＴＲタンパク質レベルを、投与の４日後、７日後、１４日後、２１日後、及び２８日後に測定し、各サンプルを、その特定の動物の個々の投与前に対して正規化した。図７に示すように、６ＰＳ修飾エピマー混合物対照は、約８５％のノックダウンを達成し、３ＰＳ修飾エピマー混合物は、４日目、７日目、及び１４日目にノックダウンの減少（約７０～６０％）と合わせて、２１／２８日目にＴＴＲレベルの迅速な回復を示し、動物がベースラインに戻った。３ＰＳ修飾エピマー混合物のｉｎ ｖｉｖｏ活性の低下は、安定性に影響を与えるＰＳ含量の減少に寄与し得る（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｚｌａｔｅｖ ｅｔ ａｌ．，“５’－Ｃ－Ｍａｌｏｎｙｌ ＲＮＡ：Ｓｍａｌｌ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｗｉｔｈ ５’－Ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｉｏｉｓｏｓｔｅｒｅ Ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅ Ｇｅｎｅ Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ Ａｃｔｉｖｉｔｙ，”ＡＣＳ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ １１（４）：９５３－９６０（２０１６）を参照）。５’末端アンチセンスＳｐ立体異性体、ｓｉ７／ｓｉ９／ｓｉ１５／ｓｉ１７（表２）を有する化合物は、活性の大幅な低下を示し、これは５’エキソヌクレアーゼのＳｐ ＰＳジアステレオマー感受性に関連していた（ＰＤＩＩによる分解を伴うジヌクレオチドモデルに示されている）。ｉｎ ｖｉｔｒｏデータと一致して、ジアステレオマーｓｉ５（Ｒ／Ｒ－Ｓ）及びｓｉ１３（Ｓ／Ｒ－Ｓ）は、他のジアステレオマーと比較して優れたｉｎ ｖｉｖｏ活性を示し、それぞれは、エピマー６ＰＳ修飾混合物に匹敵する有効性を示したが、３ＰＳ修飾エピマー混合物よりも有効性が大幅に向上していた。
上記分析されたＧａｌＮＡｃ－ｓｉＲＮＡ－ＴＴＲで作成されたデータが第２の配列に変換されることを確認するために、キラル的に純粋な３ＰＳ ＧａｌＮＡｃ－ｓｉＲＮＡ－Ｃ５配列を使用して同様の実験を行った。ここでもまた、各化合物をＷＴマウスでクリーニングした。各動物に、２．５ｍｇ／ｋｇの単回皮下用量を投与し、循環Ｃ５レベルを定量することによって有効性及び持続時間の両方を測定した。図８に示されているように、６ＰＳ修飾エピマー混合物対照は、約９３％のノックダウンを達成し、３ＰＳ修飾されたエピマー混合物は、約８２％の活性の低下を示した。３ＰＳ修飾エピマー混合物を投与した動物のＣ５レベルは、６ＰＳ修飾エピマー混合物と比較してより速い速度で回復し、２８日目のＣ５活性は、ＰＢＳ対照と比較して８０％のレベルを示した。アンチセンス鎖の５’末端にＲｐ配置を有する化合物、ｓｉ４／ｓｉ６／ｓｉ１２／ｓｉ１４は、少なくとも３ＰＳ修飾エピマー混合物に匹敵する活性を示した。ここでもまた、ｉｎ ｖｉｔｒｏデータと一致して、ジアステレオマーｓｉ６（Ｒ／Ｒ－Ｓ）及びｓｉ１４（Ｓ／Ｒ－Ｓ）は、他のジアステレオマーと比較して優れたｉｎ ｖｉｖｏ活性を示し、それぞれは、エピマー６ＰＳ修飾混合物に匹敵する有効性を示したが、３ＰＳ修飾エピマー混合物よりも有効性が大幅に向上していた。
センス／アンチセンス鎖の５’－Ｒｐキラリティー及びアンチセンス鎖の３’－Ｓｐキラリティーがｉｎ ｖｉｖｏでのヌクレアーゼ安定性に有益であることを示すｉｎ ｖｉｔｒｏデータを確認するために、Ｃ５標的の場合は４日目に、ｍｒＴＴＲ標的では７日目に、全肝臓レベルを調べた。図９ａの結果は、Ｒ／Ｒ－Ｓ（ｓｉ５及びｓｉ６）化合物が、３ＰＳ修飾エピマー混合物と比較して高い全肝臓レベルを有する一方、アンチセンス鎖に反対のキラリティーを有するＲ／Ｓ－Ｒ化合物（ｓｉ７及びｓｉ８）は、より低い全肝臓レベルをもたらしたことを例示する。
２つの高活性化合物Ｒ／Ｒ－Ｓ（ｓｉ５及びｓｉ６）及びＳ／Ｒ－Ｓ（ｓｉ１３及びｓｉ１４）のＡｇｏ２ローディング活性を調べた。図９ｂの結果は、ｓｉ５及びｓｉ６ジアステレオマーが、３ＰＳ修飾エピマー混合物と比較して、最大３倍に増加したＡｇｏ２ローディング活性を示したことを例示する。ｓｉ１３及びｓｉ１４ジアステレオマーのＡｇｏローディング活性は、３ＰＳ修飾エピマー混合物と比較して、最大２倍に増加したＡｇｏ２ローディング活性を示した。
これらの結果は、アンチセンス鎖の５’末端におけるＲｐ ＰＳ立体化学及び３’末端におけるＳｐ ＰＳ立体化学がヌクレアーゼの安定性を改善し、３ＰＳエピマー混合物と比較してより強力なｓｉＲＮＡをもたらしたことを示唆している。さらに、キラル的に純粋な１ＰＳ修飾化合物及びキラル的に純粋な３ＰＳ修飾化合物のｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏ ＲＩＳＣローディング実験の評価と、ｈＡｇｏ２の共結晶構造解析とを組み合わせることにより、ＲＩＳＣローディングに有益であり得る、アンチセンス鎖の３’末端でのＳｐ立体化学の優先傾向が示された。
実施例２：複数のキラル修飾ホスホロチオエート結合を有するキラル的に純粋なｄｓＲＮＡ剤の合成、特徴付け、及び活性
３つのキラル修飾ホスホロチオエート結合（３ＰＳ）を有するキラル的に純粋なｄｓＲＮＡ剤は、合成アプローチ１（キラルＰＳオリゴヌクレオチドアプローチのＤＭＴ－オン精製）及び／又はアプローチ２及び／又はアプローチ３を使用して合成した。
３つ、４つ、５つ、又は６つのキラル修飾ホスホロチオエート結合（例えば、３ＰＳ、４ＰＳ、５ＰＳ、又は６ＰＳ）を有するキラル的に純粋なｄｓＲＮＡ剤は、合成アプローチ２（キラルＰＳジヌクレオチドアプローチ）及び／又は合成アプローチ３（キラルＯＡＰホスホラミダイトビルディングブロック）を使用して合成した。
２つ以上の連続したキラル的に純粋なＰＳ結合（例えば、２ＰＳ、３ＰＳ、又は４ＰＳ）を含むすべてのオリゴヌクレオチドを、ＯＡＰ単量体ビルディングブロック（アプローチ３）のカップリングによって合成した。
アプローチ２及びアプローチ３によるビルディングブロックの例示的な合成を以下に説明する。
Ａ－１．キラル的に純粋な２’－ＯＭｅウリジン－２’－ＯＭｅウリジンホスホロチオエートジヌクレオチド（ＵＯＭｅｓＵＯＭｅ）の合成
Figure 0007348185000020
化合物３：化合物１（１１．１８ｇ、１４．７ｍｍｏｌ）及び化合物２（５．７３ｇ、１５．４ｍｍｏｌ、１．０５当量）を高真空下で乾燥させ、１５０ｍｌのジクロロメタン（乾燥）に溶解した。この溶液に、１１７ｍｌのＥＴＴ（３．８３ｇ、２９．４ｍｍｏｌ、２当量）を加え、そしてこの反応混合物を２．５時間攪拌した。ＰＡＤＳ（６．３５ｇ、２２．０５ｍｍｏｌ、１．５当量）及び２．５２ｍｌの２．６－ルチジン（２．３６ｇ、２２．０５ｍｍｏｌ、１．５当量）を加え、そしてこの反応混合物を４時間撹拌した。反応混合物を８００ｍｌのジクロロメタンで希釈し、Ｈ２Ｏ（３００ｍｌ）で２回洗浄した。有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濃縮した。ジアステレオマーを、ＣｏｍｂｉＦｌａｓｈ（登録商標）（３３０ｇカラム、ＥｔＯＡｃ：ｎ－ヘキサン（４：１）、３ａ Ｒｆ（上部スポット）＝０．４５、３ｂ ＲＦ（下部スポット）＝０．２４）で分離して、３ａ（９．１２ｇ、５６％）及び３ｂ（６．７ｇ、４３％）を得た。
３ａ １Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，アセトニトリル－ｄ３）δ ９．１７（ｓ，２Ｈ），７．６５（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ），７．５９（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ），７．４６（ｄ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，２Ｈ），７．４０－７．２７（ｍ，８Ｈ），６．９２（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，４Ｈ），５．９４（ｄ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，１Ｈ），５．８５（ｄ，Ｊ＝３．４Ｈｚ，１Ｈ），５．６６（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），５．３５（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），５．２５－５．１６（ｍ，１Ｈ），４．５１－４．４０（ｍ，１Ｈ），４．３６－４．１０（ｍ，７Ｈ），３．８０（ｓ，６Ｈ），３．４８（ｓ，３Ｈ），３．４６（ｓ，３Ｈ），３．４５－３．４３（ｍ，２Ｈ），２．７５－２．７０（ｍ，２Ｈ），０．９３（ｓ，９Ｈ），０．１４（ｓ，６Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，ＣＤ３ＣＮ）δ １６３．９５，１６３．７５，１５９．９１，１５１．３７，１５１．３４，１４５．５２，１４１．０３，１４０．８８，１３６．３８，１３６．２４，１３１．２２，１３１．２１，１３０．４６，１２９．４６，１２９．１８，１２９．０７，１２８．１８，１２１．０８，１１４．２９，１１４．２８，１０３．２３，１０２．９９，８９．１１，８８．０３，８７．８３，８３．６３，８２．９５，８２．８７，８２．７１，８２．６５，８２．３１，８２．２８，７６．０６，７６．０３，７０．８８，６８．１０，６８．０５，６４．３２，６４．２９，６２．９９，５９．２３，５８．８７，５６．０４，２６．１５，２０．１６，２０．０９，１８．７５，１５．３９，－４．３６，－４．６２．３１Ｐ ＮＭＲ（１６２ＭＨｚ，ＣＤ３ＣＮ）δ ６８．７７． Ｃ５０Ｈ６２Ｎ５Ｏ１５ＰＳＳｉ（Ｍ＋Ｎａ）の分子量：計算値１０８６．３３６８、実測値１０８６．３３９２。
３ｂ １Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，アセトニトリル－ｄ３）δ ９．０９（ｓ，２Ｈ），７．６７（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ），７．４９（ｄｄ，Ｊ＝２１．３，７．８Ｈｚ，３Ｈ），７．３４（ｄ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，８Ｈ），７．０６（ｄ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，１Ｈ），６．９１（ｄ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，４Ｈ），５．９３（ｄ，Ｊ＝４．７Ｈｚ，１Ｈ），５．８１（ｄ，Ｊ＝３．２Ｈｚ，１Ｈ），５．６４（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），５．３３（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），５．２６－５．１７（ｍ，１Ｈ），４．３３－４．２０（ｍ，６Ｈ），４．１３－４．０９（ｍ，１Ｈ），４．０７－４．０３（ｍ，１Ｈ），３．８０（ｓ，６Ｈ），３．５２（ｓ，３Ｈ），３．４５（ｓ，３Ｈ），３．４３（ｄ，Ｊ＝３．０Ｈｚ，２Ｈ），２．８４（ｔ，Ｊ＝５．８Ｈｚ，２Ｈ），０．９２（ｓ，９Ｈ），０．１２（ｓ，６Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，ＣＤ３ＣＮ）δ １６３．８９，１６３．７３，１５９．９０，１５９．８９，１５１．３７，１５１．２８，１４５．５９，１４１．００，１４０．９２，１３８．３１，１３６．３３，１３６．２０，１３１．２５，１３１．２３，１２９．１５，１２９．０５，１２８．１４，１２１．３４，１１４．２６，１１４．２６，１０３．１７，１０２．９８，８９．２０，８８．０１，８７．９５，８３．５９，８２．７８，８２．７１，８２．６７，８２．６２，８２．４３，８２．４０，７５．９７，７５．９３，７０．６６，６７．７７，６７．７２，６４．５７，６４．５４，６２．８７，５９．２８，５８．８３，５６．０２，２６．１６，２０．２２，２０．１５，１８．７４，１５．３９，－４．３４，－４．６１．３１Ｐ ＮＭＲ（１６２ＭＨｚ，ＣＤ３ＣＮ）δ ６９．２７．Ｃ５０Ｈ６２Ｎ５Ｏ１５ＰＳＳｉ（Ｍ＋Ｎａ）の分子量：計算値１０８６．３３６８、実測値１０８６．３３９２。
化合物４：化合物３（３ａ上部スポット：９．１２ｇ、８．６ｍｍｏｌ；３ｂ下部スポット：７．１４ｇ、６．７ｍｍｏｌ）を乾燥ＴＨＦ（３ａ：１２５ｍｌ；３ｂ：１００ｍｌ）に溶解し、Ｅｔ３Ｎ ３ＨＦ（３ａ：１６．８ｍｌ、１０３．２ｍｍｏｌ、１２当量；３ｂ：１３．１ｍｌ、８０．５ｍｍｏｌ、１２当量）を加えた。反応混合物を１４時間攪拌した。反応混合物を濃縮し、ＣｏｍｂｉＦｌａｓｈ（登録商標）カラム（ＤＣＭ：５％ＭｅＯＨ、Ｒｆ（上部スポット）＝０．２３、Ｒｆ（下部スポット）＝０．２４）によって精製し、４（４ａ（上部スポット：６．５８ｇ、８０．２％）、４ｂ（下部スポット：５．２４ｇ、８２．４％））を得た。
４ａ １Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ １１．４５（ｄ，Ｊ＝１．９Ｈｚ，１Ｈ），１１．３８（ｄ，Ｊ＝１．９Ｈｚ，１Ｈ），７．６６（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），７．５９（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），７．３７（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ），７．３２（ｔ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，２Ｈ），７．２５（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，５Ｈ），６．９０（ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，４Ｈ），５．８５（ｄ，Ｊ＝５．４Ｈｚ，１Ｈ），５．８２（ｄ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，１Ｈ），５．６２（ｄｄ，Ｊ＝８．１，２．１Ｈｚ，１Ｈ），５．４３－５．３７（ｍ，２Ｈ），５．１４－５．０８（ｍ，１Ｈ），４．３１（ｄｄｄ，Ｊ＝１０．３，６．８，３．１Ｈｚ，１Ｈ），４．２７－４．２２（ｍ，１Ｈ），４．２２－４．１７（ｍ，２Ｈ），４．１７－４．０１（ｍ，４Ｈ），３．７３（ｓ，６Ｈ），３．３８（ｓ，３Ｈ），３．３５（ｓ，３Ｈ），３．３３－３．２８（ｍ，３Ｈ），２．８８－２．８１（ｍ，２Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ １６２．８８，１６２．７７，１５８．１７，１５０．３２，１５０．２９，１４４．２５，１４０．１７，１４０．１３，１３５．０５，１３４．８５，１２９．７５，１２７．９１，１２７．７２，１２６．８７，１２０．００，１１７．９５，１１３．２６，１０２．１５，１０２．１４，１０２．１２，１０２．０９，８６．８２，８６．７９，８６．４１，８６．２４，８１．８２，８１．７５，８１．５９，８１．１６，８１．１３，７９．９０，７４．９９，７４．９７，７４．９５，６８．３９，６７．７４，６７．６９，６３．０４，６３．００，６２．２１，５８．０２，５７．６３，５５．０４，５５．０３，１８．７９，１８．７２．３１Ｐ ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ ６７．７４．Ｃ４４Ｈ４８Ｎ５Ｏ１５ＰＳ（Ｍ＋Ｎａ）の分子量：計算値９７２．２５０３、実測値９７２．２５００。
４ｂ １Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，アセトニトリル－ｄ３）δ ９．０９（ｓ，２Ｈ），７．６３（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），７．４９－７．４１（ｍ，３Ｈ），７．３７－７．２１（ｍ，７Ｈ），６．９２－６．８３（ｍ，４Ｈ），５．９０（ｄ，Ｊ＝４．７Ｈｚ，１Ｈ），５．７８（ｄ，Ｊ＝３．３Ｈｚ，１Ｈ），５．６０（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），５．３２（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），５．２３－５．１３（ｍ，１Ｈ），４．３２－４．１８（ｍ，５Ｈ），４．１５－４．０５（ｍ，２Ｈ），４．０３－３．９４（ｍ，１Ｈ），３．７７（ｓ，７Ｈ），３．４９（ｓ，３Ｈ），３．４６（ｓ，３Ｈ），３．４０（ｄ，Ｊ＝３．２Ｈｚ，２Ｈ），３．３２（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，１Ｈ），２．８５－２．７７（ｍ，２Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＣＤ３ＣＮ）δ １６３．８９，１６３．７８，１５９．９０，１５１．４０，１５１．３０，１４５．６３，１４１．０６，１４０．９７，１３６．３５，１３６．２６，１３１．２６，１３１．２３，１２９．１６，１２９．０７，１２８．１５，１１８．６８，１１４．２８，１０３．１９，１０３．０４，８８．９５，８７．９９，８３．６０，８２．８３，８２．７４，８２．６８，８２．６１，８２．４２，８２．３８，７５．９２，７５．８８，６９．７０，６８．３２，６８．２７，６４．５５，６４．５１，６２．９０，５９．２８，５９．０９，５６．０３，２０．２１，２０．１２．３１Ｐ ＮＭＲ（１６２ＭＨｚ，ＣＤ３ＣＮ）δ ６９．２０．Ｃ４４Ｈ４８Ｎ５Ｏ１５ＰＳ（Ｍ＋Ｎａ）の分子量：計算値９７２．２５０３、実測値９７２．２５００。
化合物５：化合物４（４ａ上部スポット：２ｇ、２．１ｍｍｏｌ；４ｂ下部スポット：０．６ｇ、０．６３ｍｍｏｌ）を高真空下で一晩乾燥させ、乾燥酢酸エチル（４ａ：２５ｍｌ；４ｂ：５ｍｌ）に溶解した。Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルアミン（４ａ：９１５μｌ、６７９ｍｇ、５．２５ｍｍｏｌ、２．５当量、４ｂ：２７４μｌ、２０４ｍｇ、４．５８ｍｍｏｌ、２．２５当量）を激しく攪拌しながら滴下した。続いて、２－シアノエチルＮ，Ｎ－ジイソプロピルクロロホスホラミダイト（４ａ：９３７μｌ、９９４ｍｇ、４．２ｍｍｏｌ、２当量、４ｂ：２８１μｌ、２９８ｍｇ、１．２６ｍｍｏｌ、２．５当量）を（１分かけて）滴下し、そしてこの反応混合物を室温で１．５時間撹拌した。反応混合物を、２００ｍｌのＥＡで希釈し、１００ｍｌのＮａＨＣＯ３及び１００ｍｌのブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、乾燥するまで濃縮した。粗生成物（白色の泡）を５ｍｌのＤＣＭに溶解し、１Ｌの冷ｎ－ヘキサン／ジエチルエーテル（１：１）で沈殿させて、５ａ（上部スポット：１．８ｇ、７４．５％）、５ｂ（下部スポット：５９４．２ｍｇ、８２％）を得た。
５ａ １Ｈ ＮＭＲ ５８（５００ＭＨｚ，アセトニトリル－ｄ３）δ ９．３０（ｓ，１Ｈ），７．６７－７．６２（ｍ，１Ｈ），７．５７（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ），７．４７－７．４２（ｍ，２Ｈ），７．３７－７．３０（ｍ，６Ｈ），７．２９－７．２４（ｍ，１Ｈ），６．９０（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，４Ｈ），５．９２（ｄ，Ｊ＝４．７Ｈｚ，１Ｈ），５．８８（ｄｄ，Ｊ＝７．４，４．３Ｈｚ，１Ｈ），５．６７－５．６２（ｍ，１Ｈ），５．３７－５．３０（ｍ，１Ｈ），５．２２－５．１４（ｍ，１Ｈ），４．４９－４．３６（ｍ，１Ｈ），４．３５－４．２３（ｍ，４Ｈ），４．２２－４．１４（ｍ，１Ｈ），４．１２－４．０７（ｍ，２Ｈ），３．９５－３．９１（ｍ，１Ｈ），３．９１－３．８３（ｍ，１Ｈ），３．８１－３．７５（ｍ，７Ｈ），３．７０－３．６１（ｍ，２Ｈ），３．４９－３．４６（ｍ，５Ｈ），３．４５－３．４１（ｍ，３Ｈ），２．７４－２．６４（ｍ，４Ｈ），１．２２－１．１５（ｍ，１２Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，ＣＤ３ＣＮ）δ １６４．６４，１６４．５９，１６４．５０，１６０．４６，１５２．０３，１５１．９７，１４６．０７，１４６．０６，１４１．６０，１４１．５７，１４１．４８，１３６．９４，１３６．９２，１３６．７８，１３１．７７，１２９．７４，１２９．６２，１２８．７４，１２０．３０，１２０．２４，１１４．８５，１０３．７９，１０３．６９，８９．８２，８９．７９，８９．２４，８９．２１，８８．５９，８８．４１，８８．３８，８３．７３，８３．２９，８３．２５，８３．２１，８３．２０，８３．１６，８３．１４，８２．８７，８２．６９，８２．６２，８２．５８，７６．５５，７６．５２，７６．４９，７２．３９，７２．２８，７１．８０，７１．６６，６９．０７，６９．０１，６８．６５，６４．８８，６４．８５，６３．４５，６０．４７，６０．３２，５９．９１，５９．８１，５９．６７，５９．６６，５９．６５，５９．４１，５６．６３，５６．６１，５６．６０，５６．５８，４４．８７，４４．８２，４４．８１，４４．７７，４４．７６，４４．７２，４４．７１，２５．７２，２５．６６，２５．５７，２５．５１，２５．４６，２１．７１，２１．６５，２１．６３，２１．５７，２０．７１，２０．６４．３１Ｐ ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ，ＣＤ３ＣＮ）δ １５１．９７，１５１．５６，６８．５２．Ｃ５３Ｈ６５Ｎ７Ｏ１６Ｐ２Ｓ（Ｍ＋Ｈ）の分子量：計算値１１５０．３７６２、実測値１１５０．３７８２。
５ｂ １Ｈ ＮＭＲ ６１（５００ＭＨｚ，アセトニトリル－ｄ３）δ ９．０９（ｓ，２Ｈ），７．６５（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ），７．５１－７．４３（ｍ，３Ｈ），７．３７－７．３０（ｍ，６Ｈ），７．２９－７．２４（ｍ，１Ｈ），６．８９（ｄ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，４Ｈ），５．９２（ｔ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，１Ｈ），５．８３（ｄｄ，Ｊ＝７．７，４．０Ｈｚ，１Ｈ），５．６４－５．６０（ｍ，１Ｈ），５．３４－５．３０（ｍ，１Ｈ），５．２４－５．１７（ｍ，１Ｈ），４．４２－４．１５（ｍ，８Ｈ），３．９４－３．８１（ｍ，２Ｈ），３．７８（ｓ，６Ｈ），３．７２－３．６１（ｍ，２Ｈ），３．５０（ｄ，Ｊ＝３．０Ｈｚ，３Ｈ），３．４７（ｓ，２Ｈ），３．４５－３．４０（ｍ，４Ｈ），２．８６－２．７９（ｍ，２Ｈ），２．７１－２．６３（ｍ，２Ｈ），１．２１－１．１５（ｍ，１２Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，ＣＤ３ＣＮ）δ １６３．８７，１６３．８２，１６３．７６，１５９．９１，１５１．４０，１５１．３７，１５１．３２，１４５．６０，１４５．５９，１４０．９６，１４０．９２，１３６．３４，１３６．２０，１３１．２５，１３１．２３，１２９．１５，１２９．０６，１２８．１５，１１４．２８，１０３．２５，１０３．１９，１０３．１３，８９．４１，８８．８０，８８．０４，８８．０３，８７．９１，８７．８９，８３．２０，８３．１８，８２．７０，８２．４１，８１．９５，８１．８８，８１．８３，７６．０３，７５．９９，７１．５４，７１．４２，７１．０６，７０．９２，６８．１５，６８．１１，６７．７９，６７．７５，６４．５８，６４．５４，６２．９４，６２．９１，５９．８８，５９．７３，５９．３６，５９．３０，５９．２１，５９．１３，５９．１１，５８．８６，５８．８４，５６．０３，４４．２８，４４．２５，４４．１８，４４．１５，２５．１７，２５．１１，２５．０９，２５．０３，２４．９９，２４．９６，２４．９３，２４．９１，２１．１５，２１．０８，２１．０３，２０．２２，２０．１５．３１Ｐ ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ，ＣＤ３ＣＮ）δ １５１．６８，１５１．４４，６８．８０，６８．７７．Ｃ５３Ｈ６５Ｎ７Ｏ１６Ｐ２Ｓ（Ｍ＋Ｈ）の分子量：計算値１１５０．３７６２、実測値１１５０．３７６５。
Ａ－２．完全に脱保護されたキラル的に純粋なＵＯＭｅｓＵＯＭｅ（ｕｓｕ）の合成
Figure 0007348185000021
化合物６：化合物４（４ａ上部スポット：５００ｍｇ、０．５３ｍｍｏｌ；４ｂ下部スポット：５００ｍｇ、０．５３ｍｍｏｌ）を１．５ｍｌのジクロロメタンに溶解し、８ｍｌのトリクロロ酢酸（ＤＣＭ中、３％）を加えた。反応混合物を室温で１時間攪拌した。反応混合物を濃縮し、ＣｏｍｂｉＦｌａｓｈ（登録商標）カラム（４０ｇ Ｇｏｌｄカラム、流量５０ｍｌ／分、ＤＣＭ中、５％ＭｅＯＨで４分間、ＤＣＭ中、１０％ＭｅＯＨで５分間、ＤＣＭ中、１０％ＭｅＯＨで１０分間）によって精製し、６ａ（Ｒｆ＝０．２７、３４０ｍｇ、９９％）及び６ｂ（Ｒｆ＝０．２４、５６１ｍｇ、９０％）を得た。
６ａ １Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ ７．８７（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ），７．６１（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），５．９１（ｄ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，１Ｈ），５．８４（ｄ，Ｊ＝５．０Ｈｚ，１Ｈ），５．７３－５．６９（ｍ，１Ｈ），５．６５（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），５．０６（ｄｄｄ，Ｊ＝１０．４，４．７，１．８Ｈｚ，１Ｈ），４．３４－４．２８（ｍ，１Ｈ），４．２７－４．００（ｍ，８Ｈ），３．８２（ｔ，Ｊ＝５．１Ｈｚ，１Ｈ），３．６４－３．５７（ｍ，２Ｈ），３．３４（ｓ，３Ｈ），３．３３（ｓ，３Ｈ），２．９４（ｔ，Ｊ＝５．８Ｈｚ，２Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ １６３．０２，１６２．９４，１５０．６５，１５０．４３，１４０．３５，１４０．２３，１１８．３４，１０２．７５，１０２．３０，８６．８８，８５．２５，８３．８１，８３．７８，８２．０２，８１．９５，８１．６７，８０．５４，８０．５０，７６．３８，７６．３４，６８．３９，６７．８２，６７．７７，６３．３２，６３．２９，６０．５９，５８．１５，５７．７７，５７．５５，５４．９６，１８．９７，１８．９０．３１Ｐ ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ ６６．７６．Ｃ２３Ｈ３０Ｎ５Ｏ１３ＰＳ（Ｍ＋Ｈ）の分子量：計算値６４８．１３７７、実測値６４８．１３７５。
６ｂ １Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ １１．４２（ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，１Ｈ），１１．３８（ｄ，Ｊ＝１．８Ｈｚ，１Ｈ），７．８７（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ），７．６１（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），５．９１（ｄ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，１Ｈ），５．８３（ｄ，Ｊ＝４．７Ｈｚ，１Ｈ），５．７１（ｄｄ，Ｊ＝８．１，２．１Ｈｚ，１Ｈ），５．６４（ｄｄ，Ｊ＝８．１，２．２Ｈｚ，１Ｈ），５．４２－５．３６（ｍ，２Ｈ），５．０６（ｄｄｄ，Ｊ＝１０．６，４．８，２．１Ｈｚ，１Ｈ），４．３２－４．０８（ｍ，７Ｈ），４．０５－４．００（ｍ，１Ｈ），３．８２（ｔ，Ｊ＝５．０Ｈｚ，１Ｈ），３．６０（ｓ，２Ｈ），３．３６（ｓ，６Ｈ），２．９６（ｔ，Ｊ＝５．８Ｈｚ，２Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ １６２．９２，１６２．８５，１５０．５７，１５０．３５，１４０．２５，１４０．０７，１１８．１６，１０２．５８，１０２．１３，８６．９０，８５．２４，８３．６９，８３．６５，８１．７９，８１．７２，８１．５７，８０．４２，８０．３８，７６．０９，７６．０６，６８．３０，６７．５６，６７．５１，６３．３１，６３．２７，６０．５１，５８．００，５７．６８，５４．８８，１８．８０，１８．７３．３１Ｐ ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ ６６．８７．Ｃ２３Ｈ３０Ｎ５Ｏ１３ＰＳ（Ｍ＋Ｎａ）の分子量：計算値６７０．１１９６、実測値６７０．１２１６。
化合物７：化合物６（６ａ上部スポット：３４０ｍｇ、０．３８ｍｍｏｌ；６ｂ下部スポット：３１２ｍｇ、０．３５ｍｍｏｌ）を１２ｍｌのメチルアミン（３３ｗｔ％無水エタノール溶液）に溶解し、室温で５分間攪拌した。反応混合物を濃縮し、ＣｏｍｂｉＦｌａｓｈ（登録商標）カラム（２４ｇ Ｇｏｌｄカラム、流量３５ｍｌ／分、酢酸エチル／ＭｅＯＨ（７０：３０）で８分間、酢酸エチル／ＭｅＯＨ（６０：４０）で５分間）によって精製し、７ａ（２２８ｍｇ、７８％）及び７ｂ（４２８ｍｇ、８６％）を得た。酢酸エチル／ＭｅＯＨ（２：１）では、７ａ Ｒｆ＝０．０８及び７ｂ Ｒｆ＝０．０８。
７ａ １Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，重水）δ ８．１２（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，６Ｈ），８．０２（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），６．０４（ｓ，１Ｈ），５．９７（ｓ，１Ｈ），５．９０（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），５．８５（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），４．９１－４．８３（ｍ，１Ｈ），４．４７（ｔ，Ｊ＝４．９Ｈｚ，１Ｈ），４．３５－４．２４（ｍ，３Ｈ），４．２４－４．１２（ｍ，２Ｈ），４．１０－３．９５（ｍ，２Ｈ），３．９５－３．８４（ｍ，１Ｈ），３．６０（ｓ，３Ｈ），３．５６（ｓ，３Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，ｄ２ｏ）δ １６５．８４，１６５．７６，１５１．２２，１５１．１８，１４１．３２，１４１．１８，１０２．３０，１０１．８７，８７．４４，８７．１２，８２．９３，８２．８９，８２．８５，８２．５１，８２．４３，８１．３５，８１．３２，７１．４６，７１．４２，６７．８３，６３．７２，６３．６６，５９．４５，５８．０９，５７．７６．３１Ｐ ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）δ ５６．７４．Ｃ２０Ｈ２７Ｎ４Ｏ１３ＰＳ（Ｍ＋Ｎａ）の分子量：計算値６１７．０９３１、実測値６１７．０９０８。
７ｂ １Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，重水）δ ８．０４（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），７．９７（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），６．０４（ｄ，Ｊ＝３．３Ｈｚ，１Ｈ），５．９９（ｄ，Ｊ＝３．５Ｈｚ，１Ｈ），５．９２－５．８８（ｍ，２Ｈ），４．８８－４．８３（ｍ，１Ｈ），４．４７（ｔ，Ｊ＝５．４Ｈｚ，１Ｈ），４．３８－４．３３（ｍ，１Ｈ），４．３１－４．１９（ｍ，４Ｈ），４．０６（ｔ，Ｊ＝４．０Ｈｚ，１Ｈ），４．００－３．８５（ｍ，２Ｈ），３．５７（ｓ，３Ｈ），３．５５（ｓ，３Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）δ １６６．１１，１６６．０２，１５１．４２，１４１．３４，１０２．３２，１０２．１４，８７．２７，８７．１５，８３．２３，８３．１９，８２．７３，８２．７０，８２．６３，８１．３１，８１．２８，７１．４２，７１．３８，６７．９６，６４．４６，６４．４１，５９．９０，５８．０９，５７．９０．３１Ｐ ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）δ ５５．５５．Ｃ２０Ｈ２７Ｎ４Ｏ１３ＰＳ（Ｍ＋Ｎａ）の分子量：計算値６１７．０９３１、実測値６１７．０９１７。
Ｂ－１．キラル的に純粋な２’－ＯＭｅウリジン－２’Ｆ－ウリジンホスホロチオエートジヌクレオチド（ＵＯＭｅｓＵＦ）（ｕｓＵｆ）の合成
Figure 0007348185000022
化合物１０：化合物８（１１．１８ｇ、１４．７ｍｍｏｌ）及び化合物９（５．５５ｇ、１５．４ｍｍｏｌ、１．０５当量）を高真空下で乾燥させ、３５０ｍｌのジクロロメタン（乾燥）に溶解した。この溶液に、１１７ｍｌのＥＴＴ（３．８３ｇ、２９．４ｍｍｏｌ、２当量）を加え、そして反応混合物を２．５時間撹拌した。ＰＡＤＳ（６．３５ｇ、２２．０５ｍｍｏｌ、１．５当量）及び２．５２ｍｌの２．６－ルチジン（２．３６ｇ、２２．０５ｍｍｏｌ、１．５当量）を加え、そしてこの反応混合物を４時間撹拌した。反応混合物を８００ｍｌのジクロロメタンで希釈し、Ｈ２Ｏ（３００ｍｌ）で２回洗浄した。有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濃縮した。ジアステレオマーをＣｏｍｂｉＦｌａｓｈ（登録商標）カラム（３３０ｇ カラム、ＥｔＯＡｃ：ｎ－ヘキサン（４：１））で分離して、１０ａ（上部スポット：３．３７ｇ、２２％）及び１０ｂ（下部スポット：６．３ｇ、４１％）を得た。ＥｔＯＡｃでは：ｎ－ヘキサン（４：１）、１０ａ（Ｒｆ＝０．５）及び１０ｂ（Ｒｆ＝０．２３）。
１０ａ １Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，アセトニトリル－ｄ３）δ ７．９０（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ １Ｈ），７．６１（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），７．４３－７．３８（ｍ，２Ｈ），７．３５－７．２２（ｍ，７Ｈ），６．９１－６．８４（ｍ，４Ｈ），５．９６（ｄ，Ｊ＝３．９Ｈｚ，１Ｈ），５．８５（ｄｄ，Ｊ＝１９．３，２．１Ｈｚ，１Ｈ），５．６５（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），５．２７－５．１９（ｍ，２Ｈ），５．１０（ｄｄｄ，Ｊ＝５３．１，４．８，２．１Ｈｚ，１Ｈ），４．５３－４．４０（ｍ，２Ｈ），４．３４－４．２２（ｍ，２Ｈ），４．１８－４．１０（ｍ，３Ｈ），４．０６－３．９８（ｍ，１Ｈ），３．７８（ｓ，６Ｈ），３．５８（ｄｄ，Ｊ＝１１．２，３．０Ｈｚ，１Ｈ），３．５１（ｓ，３Ｈ），３．４８（ｄｄ，Ｊ＝１１．１，２．９Ｈｚ，１Ｈ），２．７１（ｑ，Ｊ＝６．１Ｈｚ，２Ｈ），０．９１（ｓ，９Ｈ），０．１４（ｄ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，６Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）δ １６６．０７，１６５．９１，１６０．０１，１５２．２７，１５１．８８，１４６．４０，１４３．１０，１４３．０８，１４２．１１，１３７．３４，１３１．２１，１２９．２９，１２８．６７，１２７．６７，１２４．２０，１１８．６１，１１３．９８，１１３．８５，１０３．３０，１０３．１８，９４．１４，９４．０９，９２．６２，９２．５８，９１．６２，９１．５９，９１．３４，９１．３１，８７．８３，８７．７９，８７．７０，８５．３４，８５．３０，８２．９７，８２．８７，８２．７９，７７．４７，７７．４３，７７．３９，７０．９０，７０．７７，６７．４７，６７．４２，６４．５７，６４．５３，６１．９５，５９．２８，５９．２６，５５．７１，５５．６７，２６．１６，１９．９９，１９．９２，１８．９２，－４．６１，－４．７９．３１Ｐ ＮＭＲ（１６２ＭＨｚ，ＣＤ３ＣＮ）δ ６７．１２．１９Ｆ ＮＭＲ（３７６ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）δ －２０９．６５，－２０９．７０，－２０９．７５，－２０９．８０，－２０９．８４，－２０９．８９，－２１０．１４，－２１０．１８，－２１０．２３，－２１０．２８，－２１０．３２，－２１０．３７．Ｃ４９Ｈ５９ＦＮ５Ｏ１４ＰＳＳｉ（Ｍ＋Ｎａ）の分子量：計算値１０７４．３１６８、実測値１０７４．３１４６。
１０ｂ １Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，アセトニトリル－ｄ３）δ ７．９３（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），７．４９（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），７．４１（ｄ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，２Ｈ），７．３２－７．２２（ｍ，７Ｈ），６．８７（ｄｄ，Ｊ＝９．０，２．４Ｈｚ，４Ｈ），５．９４（ｄ，Ｊ＝３．７Ｈｚ，１Ｈ），５．７３（ｄｄ，Ｊ＝２０．３，１．４Ｈｚ，１Ｈ），５．６１（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），５．３０－５．１７（ｍ，２Ｈ），５．１６－４．９８（ｍ，１Ｈ），４．５２－４．４０（ｍ，１Ｈ），４．３５－４．２３（ｍ，３Ｈ），４．１９－４．０８（ｍ，４Ｈ），４．０１－３．９４（ｍ，１Ｈ），３．７７（ｓ，６Ｈ），３．５４（ｓ，４Ｈ），２．８８（ｔ，Ｊ＝５．８Ｈｚ，２Ｈ），０．９１（ｓ，９Ｈ），０．１３（ｄ，Ｊ＝３．６Ｈｚ，６Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）δ １６５．９８，１６５．８７，１６０．４１，１６０．３７，１５１．９５，１５１．７１，１４５．６８，１４３．２４，１４１．７８，１３６．２６，１３１．６７，１３１．６０，１３１．２３，１２９．５７，１２９．３１，１２９．０１，１２８．６７，１２８．２５，１１８．６２，１１４．３０，１１４．２９，１１３．９９，１０３．１０，１０２．９０，９４．２２，９２．７２，９２．２８，９１．９９，８８．６１，８８．５９，８３．１６，８３．１４，８２．７８，８２．７２，８２．３６，８２．２９，７５．７６，７５．７３，７０．５６，７０．４３，６７．１２，６７．０８，６４．６８，６４．６４，６２．４０，５９．２１，５５．７７，２６．１９，２０．８５，２０．０２，１９．９６，１８．９２，－４．５７，－４．７６．３１Ｐ ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ，ＣＤ３ＣＮ）δ ６７．９０．１９Ｆ ＮＭＲ（３７６ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）δ －２０８．３７，－２０８．４３，－２０８．４８，－２０８．５２，－２０８．５７，－２０８．６２，－２０８．７７，－２０８．８２，－２０８．８７，－２０８．９１，－２０８．９６，－２０９．０１．Ｃ４９Ｈ５９ＦＮ５Ｏ１４ＰＳＳｉ（Ｍ＋Ｎａ）の分子量：計算値１０７４．３１６８、実測値１０７４．３１５７。
化合物１１：化合物１０（１０ａ上部スポット：３．３ｇ、３．１ｍｍｏｌ；１０ｂ下部スポット：６．２５ｇ、６．６ｍｍｏｌ）を乾燥ＴＨＦ（１０ａ：４５ｍｌ；１０ｂ：９０ｍｌ）に溶解し、Ｅｔ３Ｎ ３ＨＦ（１０ａ：６．２ｍｌ、３７．７ｍｍｏｌ、１２当量；１０ｂ：１２．９ｍｌ、７８．９ｍｍｏｌ、１２当量）を加えた。反応混合物を１４時間攪拌した。反応混合物を濃縮し、ＴＨＦで３回共蒸発させ、ＣｏｍｂｉＦｌａｓｈ（登録商標）カラム（ＤＣＭ中、５％ＭｅＯＨ）によって精製して、１１ａ（上部スポット：２．１２ｇ、７３％）及び１１ｂ（下部スポット：１．５２ｇ、２４．５％）を得た。
１１ａ １Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ １１．４５（ｓ，１Ｈ），１１．４１（ｓ，１Ｈ），７．６７（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），７．５８（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），７．３７（ｄ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，２Ｈ），７．３２（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ），７．２５（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，５Ｈ），６．９０（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，４Ｈ），５．９０－５．７９（ｍ，３Ｈ），５．７４（ｓ，１Ｈ），５．５９（ｄｄ，Ｊ＝８．０，１．７Ｈｚ，１Ｈ），５．３９（ｄｄ，Ｊ＝８．０，１．７Ｈｚ，１Ｈ），５．２０－５．０４（ｍ，２Ｈ），４．４４－４．３６（ｍ，１Ｈ），４．２８－４．００（ｍ，８Ｈ），３．７３（ｓ，６Ｈ），３．３８（ｓ，３Ｈ），２．８４（ｑ，Ｊ＝５．５Ｈｚ，２Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ １６３．０２，１６２．７７，１５８．１６，１５０．２７，１５０．０８，１４４．２４，１４０．８７，１４０．２０，１３５．０４，１３４．８４，１２９．７４，１２７．８９，１２７．７２，１２６．８６，１１７．９１，１１３．２４，１０２．１２，１０２．０９，１０１．８６，１０１．８５，９３．４７，９１．９９，８８．９４，８８．６４，８６．５４，８６．５２，８６．２３，８１．１５，８１．１０，８０．１７，８０．１０，７９．９４，７９．９１，７４．８８，６８．０９，６７．９６，６７．３４，６７．３１，６３．０２，６２．９８，６２．１５，５７．９９，５５．０２，５４．８６，１８．７６，１８．６９．３１Ｐ ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ ６７．９９．１９Ｆ ＮＭＲ（３７６ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ －２０６．８７，－２０６．９２，－２０６．９８，－２０７．０１，－２０７．０６，－２０７．１２．Ｃ４３Ｈ４５ＦＮ５Ｏ１４ＰＳ（Ｍ＋Ｎａ）の分子量：計算値９６０．２３０３、実測値９６０．２３２０。
１１ｂ １Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ １１．４５（ｓ，１Ｈ），１１．４０（ｓ，１Ｈ），７．７０（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），７．５４（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），７．４１－７．３５（ｍ，２Ｈ），７．３１（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ），７．２５（ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，５Ｈ），６．８９（ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，４Ｈ），５．８８－５．７３（ｍ，３Ｈ），５．５７（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），５．３６（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），５．１９－５．０２（ｍ，２Ｈ），４．２７－４．１６（ｍ，７Ｈ），４．０２－３．９６（ｍ，１Ｈ），３．７３（ｓ，６Ｈ），３．４１（ｓ，３Ｈ），２．９４（ｔ，Ｊ＝５．７Ｈｚ，２Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ １６４．５７，１６４．３６，１５９．７０，１５１．７９，１５１．６１，１４５．８３，１４２．３４，１４１．７７，１３６．６０，１３６．４０，１３１．３０，１２９．４３，１２９．２７，１２８．３８，１１９．６５，１１４．７８，１０３．５８，１０３．５７，１０３．３８，９５．１０，９５．０８，９０．５２，９０．５０，９０．２３，８８．２１，８７．７８，８２．５８，８２．５４，８１．６２，８１．５６，７６．１６，６９．４９，６９．３６，６８．４８，６８．４５，６４．９０，６４．８７，６３．４６，５９．５７，５６．５６，２０．３５，２０．２８．３１Ｐ ＮＭＲ（１６２ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ ６８．２７．１９Ｆ ＮＭＲ（３７６ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ －２０６．６１，－２０６．６７，－２０６．７２，－２０６．７５，－２０６．８１，－２０６．８７．Ｃ４３Ｈ４５ＦＮ５Ｏ１４ＰＳ（Ｍ＋Ｎａ）の分子量：計算値９３７．８９、実測値９３６．２。
化合物１２：化合物１１（１１ａ上部スポット：２ｇ、２．１ｍｍｏｌ；１１ｂ下部スポット：０．６ｇ、０．６３ｍｍｏｌ）を高真空下で一晩乾燥させ、乾燥酢酸エチル（１１ａ：２５ｍｌ；１１ｂ：５ｍｌ）に溶解した。Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルアミン（１１ａ：９１５μｌ、６７９ｍｇ、５．２５ｍｍｏｌ、２．５当量、１１ｂ：２７４μｌ、２０４ｍｇ、４．５８ｍｍｏｌ、２．２５当量）を激しく攪拌しながら滴下した。続いて、２－シアノエチルＮ，Ｎ－ジイソプロピルクロロホスホラミダイト（１１ａ：９３７μｌ、９９４ｍｇ、４．２ｍｍｏｌ、２当量；１１ｂ：２８１μｌ、２９８ｍｇ、１．２６ｍｍｏｌ、２．５当量）を（１分かけて）滴下し、そしてこの反応混合物を室温で１．５時間撹拌した。反応混合物を２００ｍｌの酢酸エチルで希釈し、１００ｍｌのＮａＨＣＯ３及び１００ｍｌのブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、乾燥するまで濃縮した。粗生成物（白色の泡）を５ｍｌのＤＣＭに溶解し、１Ｌの冷ｎ－ヘキサン／ジエチルエーテル（１：１）によって沈殿させて、１２ａ（上部スポット：１．８６ｇ、７８％）及び１２ｂ（下部スポット：６０９．６ｍｇ、８５％）を得た。
１２ａ １Ｈ ＮＭＲ ７２（５００ＭＨｚ，アセトニトリル－ｄ３）δ ９．１４（ｓ，２Ｈ），７．６６（ｄｄ，Ｊ＝８．１，４．１Ｈｚ，１Ｈ），７．４８－７．４４（ｍ，２Ｈ），７．３８－７．２８（ｍ，８Ｈ），６．９２（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，４Ｈ），５．９３（ｄ，Ｊ＝４．１Ｈｚ，１Ｈ），５．８９－５．８２（ｍ，１Ｈ），５．６３（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），５．３４（ｄｄ，Ｊ＝８．１，５．２Ｈｚ，１Ｈ），５．２８－５．１２（ｍ，２Ｈ），４．６０－４．４８（ｍ，２Ｈ），４．３７－４．２４（ｍ，４Ｈ），４．１９－４．０７（ｍ，３Ｈ），３．９０－３．８３（ｍ，１Ｈ），３．８０（ｓ，６Ｈ），３．７２－３．６１（ｍ，２Ｈ），３．４９（ｄ，Ｊ＝３．３Ｈｚ，３Ｈ），３．４４（ｄ，Ｊ＝３．０Ｈｚ，２Ｈ），２．７５－２．６５（ｍ，４Ｈ），１．２３－１．１８（ｍ，１２Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，ＣＤ３ＣＮ）δ １６３．８９，１６３．８７，１６３．７１，１５９．９２，１５９．９１，１５１．４１，１５１．３９，１５１．１７，１５１．１３，１４５．５５，１４２．０９，１４１．９２，１４０．９０，１３６．３９，１３６．３９，１３６．２５，１３１．２４，１３１．２２，１２９．１９，１２９．０７，１２８．１８，１１４．２８，１０３．２３，１０３．１８，１０３．１１，１０３．０８，９４．３０，９３．７７，９２．８１，９２．２８，９１．４１，９１．３３，９１．１３，９１．０５，８８．０３，８７．９３，８７．９０，８２．６９，８２．３３，８１．１８，８０．８１，７６．００，７５．９６，７０．８５，７０．７３，７０．５９，６７．８４，６７．５２，６４．３１，６４．２８，６３．００，６２．９５，６０．００，５９．８４，５９．８１，５９．６５，５９．２８，５６．０５，５６．０４，５６．０２，４４．３９，４４．３６，４４．２９，４４．２６，２５．１７，２５．１３，２４．９８，２４．９３，２１．１４，２１．０８，２１．０２，２０．１５，２０．０８．３１Ｐ ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ，ＣＤ３ＣＮ）δ １５２．２４，１５２．２１，１５２．１３，１５２．０８，６８．６３，６８．６０．１９Ｆ ＮＭＲ（３７６ＭＨｚ，ＣＤ３ＣＮ）δ －２０５．０４，－２０５．０７，－２０５．０９，－２０５．１２，－２０５．１５，－２０５．１７，－２０５．２１，－２０５．２３，－２０５．２６，－２０５．２９，－２０５．３１，－２０５．６４，－２０５．６６，－２０５．６９，－２０５．７１，－２０５．７５，－２０５．７６，－２０５．７８，－２０５．８０，－２０５．８３，－２０５．８５，－２０５．８９，－２０５．９０．Ｃ５２Ｈ６２ＦＮ７Ｏ１５Ｐ２Ｓ（Ｍ＋Ｈ）の分子量：計算値１１３８．３５６２、実測値１１３８．３５４９。
１２ｂ １Ｈ ＮＭＲ ７３（５００ＭＨｚ，アセトニトリル－ｄ３）δ ９．１０（ｓ，２Ｈ），７．６６（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ），７．４６（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，２Ｈ），７．３８－７．２８（ｍ，８Ｈ），６．９１（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，４Ｈ），５．９４－５．８９（ｍ，１Ｈ），５．８２－５．７１（ｍ，１Ｈ），５．６０－５．５５（ｍ，１Ｈ），５．３６－５．３０（ｍ，１Ｈ），５．２７－５．１１（ｍ，２Ｈ），４．６０－４．３５（ｍ，２Ｈ），４．３４－４．１４（ｍ，６Ｈ），４．１１（ｑ，Ｊ＝４．６Ｈｚ，１Ｈ），３．８９－３．８２（ｍ，１Ｈ），３．８０（ｓ，６Ｈ），３．７１－３．６２（ｍ，２Ｈ），３．５３－３．４８（ｍ，３Ｈ），３．４４－３．３７（ｍ，２Ｈ），２．８４（ｑ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，２Ｈ），２．６７（ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，２Ｈ），１．２３－１．１５（ｍ，１２Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，ＣＤ３ＣＮ）δ １６３．８５，１６３．８３，１６３．７０，１５９．９１，１５９．９０，１５１．４６，１５１．４５，１５１．０８，１５１．０６，１４５．６０，１４５．５８，１４２．２９，１４２．０９，１４０．８７，１３６．３５，１３６．２１，１３１．２５，１３１．２３，１２９．１６，１２９．０７，１２８．１５，１１４．２９，１０３．２３，１０３．２０，１０３．１４，１０３．１０，１０３．０７，１０３．０４，９２．８８，９２．３７，９１．７９，９１．５０，８８．０３，８７．７９，８２．６７，８２．４２，８０．９８，８０．６４，７６．０２，７０．３６，６７．３１，６７．０２，６４．４９，６２．８９，６０．０１，５９．８５，５９．７４，５９．６０，５９．２７，５６．０４，５６．０３，４７．２２，４４．３４，４４．２４，２５．１２，２４．９７，２１．１３，２１．０７，２１．０２，２０．２１，２０．１４．３１Ｐ ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ，ＣＤ３ＣＮ）δ １５２．０８，１５２．０４，６８．７９，６８．７３．１９Ｆ ＮＭＲ（３７６ＭＨｚ，ＣＤ３ＣＮ）δ －２０４．１９，－２０４．２２，－２０４．２５，－２０４．２５，－２０４．２７，－２０４．３０，－２０４．３３，－２０４．３６，－２０４．３９，－２０４．４１，－２０４．４４，－２０４．４７，－２０４．６２，－２０４．６４，－２０４．６７，－２０４．６９，－２０４．７３，－２０４．７５，－２０４．７６，－２０４．７８，－２０４．８２，－２０４．８３，－２０４．８３，－２０４．８７，－２０４．８９．Ｃ５２Ｈ６２ＦＮ７Ｏ１５Ｐ２Ｓ（Ｍ＋Ｈ）の分子量：計算値１１３８．３５６２、実測値１１３８．３５３３。
Ｂ－２．完全に脱保護されたキラル的に純粋なＵＯＭｅｓＵＦ（ｕｓＵｆ）の合成
Figure 0007348185000023
化合物１３：化合物１１（１１ａ上部スポット：５００ｍｇ、０．５３ｍｍｏｌ；１１ｂ下部スポット：５００ｍｇ、０．５３ｍｍｏｌ）を１．５ｍｌのＤＣＭに溶解し、８ｍｌのトリクロロ酢酸（ＤＣＭ中、３％）を加えた。反応混合物を室温で１時間攪拌した。反応混合物を濃縮し、ＣｏｍｂｉＦｌａｓｈ（登録商標）カラム（４０ｇ Ｇｏｌｄカラム、流量５０ｍｌ／分、ＤＣＭ中、５％ＭｅＯＨで４分間、ＤＣＭ中、１０％ＭｅＯＨで５分間、ＤＣＭ中、１０％ＭｅＯＨで１０分間）によって精製して、１３ａ量及び１３ｂ（３１１ｍｇ、９２％）を得た。１３ａ：Ｒｆ＝０．２１及び１３ｂ：Ｒｆ＝０．２１。
１３ａ １Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ １１．４５（ｄｄ，Ｊ＝５．５，２．０Ｈｚ，２Ｈ），７．８８（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ），７．６１（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），５．９４－５．８１（ｍ，３Ｈ），５．７２（ｄｄ，Ｊ＝８．１，２．１Ｈｚ，１Ｈ），５．６３（ｄｄ，Ｊ＝８．１，２．１Ｈｚ，１Ｈ），５．４２（ｔ，Ｊ＝４．３Ｈｚ，１Ｈ），５．２２－５．０３（ｍ，２Ｈ），４．４７－４．３７（ｍ，１Ｈ），４．２８－４．０２（ｍ，７Ｈ），３．６１（ｓ，２Ｈ），３．３４（ｓ，３Ｈ），２．９５（ｔ，Ｊ＝５．８Ｈｚ，２Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ １６３．０７，１６２．８４，１５０．５９，１５０．１３，１４０．９３，１４０．０７，１１８．１７，１０２．６１，１０１．９３，９３．４８，９２．００，８８．９０，８８．６２，８５．２０，８３．６７，８０．４１，８０．３７，８０．２１，８０．１４，７６．１５，７６．１２，６８．０７，６７．９３，６７．２５，６７．２１，６３．１７，６３．１４，６０．５６，５７．９６，５４．８８，１８．８３，１８．７６．３１Ｐ ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ ６６．７４．１９Ｆ ＮＭＲ（３７６ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ －２０６．８５，－２０６．９１，－２０６．９６，－２０７．００，－２０７．０５，－２０７．１１．Ｃ２２Ｈ２７ＦＮ５Ｏ１２ＰＳ（Ｍ＋Ｈ）の分子量：計算値６３６．１１７７、実測値６３６．１１６８。
１３ｂ １Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ １１．５６－１１．２９（ｍ，２Ｈ），７．８８（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ），７．６１（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），５．９５－５．８０（ｍ，３Ｈ），５．７２（ｄｄ，Ｊ＝８．１，２．１Ｈｚ，１Ｈ），５．６２（ｄｄ，Ｊ＝８．１，２．１Ｈｚ，１Ｈ），５．４１（ｔ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，１Ｈ），５．２３－５．０２（ｍ，２Ｈ），４．４２－４．３２（ｍ，１Ｈ），４．３０－４．０１（ｍ，７Ｈ），３．５９（ｓ，２Ｈ），３．３６（ｓ，３Ｈ），２．９６（ｔ，Ｊ＝５．８Ｈｚ，２Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ １６３．５５，１６３．３３，１５１．０５，１５０．５８，１４１．５０，１４０．５４，１１８．６２，１０３．０７，１０２．３７，９４．０１，９２．５３，８９．５６，８９．２７，８５．６８，８４．１９，８４．１６，８０．９２，８０．８８，８０．６３，８０．５６，７６．５８，７６．５４，６８．５０，６８．３７，６７．６０，６７．５６，６３．７７，６３．７４，６０．９９，５８．４７，５５．３６，１９．２７，１９．２０．３１Ｐ ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ ６６．８５．１９Ｆ ＮＭＲ（３７６ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ －２０６．４０，－２０６．４６，－２０６．５２，－２０６．５５，－２０６．６０，－２０６．６６．Ｃ２２Ｈ２７ＦＮ５Ｏ１２ＰＳ（Ｍ＋Ｎａ）の分子量：計算値６５８．０９９６、実測値６５８．０９９７。
化合物１４：化合物１３（１３ａ上部スポット：３００ｍｇ、０．４７ｍｍｏｌ；１３ｂ下部スポット：２９２ｍｇ、０．４６ｍｍｏｌ）を１２ｍｌのメチルアミン（３３ｗｔ％無水エタノール溶液）に溶解し、室温で５分間撹拌した。反応混合物を濃縮し、ＣｏｍｂｉＦｌａｓｈ（登録商標）カラム（２４ｇ Ｇｏｌｄカラム、流量３５ｍｌ／分、酢酸エチル／ＭｅＯＨ（７０：３０）で８分間、酢酸エチル／ＭｅＯＨ（６０：４０）で５分間）によって精製して、１４ａ（２５４ｍｇ、９２％）及び１４ｂ（２５０ｍｇ、９３％）を得た。酢酸エチル／ＭｅＯＨ（２：１）では、１４ａ：Ｒｆ＝０．１７及び１４ｂ：Ｒｆ＝０．１７。
１４ａ １Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，重水）δ ８．０４－８．００（ｍ，２Ｈ），６．１２（ｄ，Ｊ＝１７．７Ｈｚ，１Ｈ），５．９７（ｍ，１Ｈ），５．８９－５．８５（ｍ，２Ｈ），５．２７－５．０９（ｍ，１Ｈ），４．８７－４．８３（ｍ，１Ｈ），４．５３－４．４６（ｍ，１Ｈ），４．４４－４．２８（ｍ，３Ｈ），４．２７－４．１４（ｍ，２Ｈ），４．０６－３．８６（ｍ，２Ｈ），３．６０（ｓ，３Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，ｄ２ｏ）δ １６５．９５，１５１．２７，１５１．１０，１４１．３８，１４１．１９，１０２．１９，１０１．９０，９４．１３，９２．６５，８８．４０，８８．１２，８７．４１，８２．８８，８２．８３，８１．３４，８０．８４，８０．７７，７１．４８，７１．４４，６７．５１，６７．３８，６３．００，６２．９４，５９．４８，５７．７６．３１Ｐ ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）δ ５６．７８．１９Ｆ ＮＭＲ（３７６ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）δ －２０３．４３，－２０３．４８，－２０３．４９，－２０３．５４，－２０３．５７，－２０３．６２，－２０３．６３，－２０３．６８．Ｃ１９Ｈ２４ＦＮ４Ｏ１２ＰＳ（Ｍ＋Ｎａ）の分子量：計算値６０５．０７３１、実測値６０５．０７１８。
１４ｂ １Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，重水）δ ８．０２－７．８８（ｍ，２Ｈ），６．０９（ｄ，Ｊ＝１８．４Ｈｚ，１Ｈ），５．９９（ｄ，Ｊ＝３．８Ｈｚ，１Ｈ），５．８９（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，２Ｈ），５．２１（ｄｄ，Ｊ＝５２．３，４．１Ｈｚ，１Ｈ），４．８８－４．８４（ｍ，１Ｈ），４．５５－４．４２（ｍ，１Ｈ），４．４０－４．２９（ｍ，３Ｈ），４．２９－４．１６（ｍ，２Ｈ），４．０２－３．８１（ｍ，２Ｈ），３．５７（ｓ，３Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，ｄ２ｏ）δ １６５．９７，１５１．３４，１５１．０９，１４１．７５，１４１．３６，１０２．１６，１０２．１１，９４．０１，９２．５３，８８．８２，８８．５４，８７．２１，８３．２２，８３．１８，８１．３２，８１．２８，８０．９３，８０．８５，７１．５４，７１．４９，６７．６６，６７．５３，６３．７０，６３．６６，５９．９４，５７．８９．３１Ｐ ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）δ ５５．６８．１９Ｆ ＮＭＲ（３７６ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）δ －２０２．９４，－２０２．９８，－２０２．９９，－２０３．０４，－２０３．０７，－２０３．１２，－２０３．１３，－２０３．１８．Ｃ１９Ｈ２４ＦＮ４Ｏ１２ＰＳ（Ｍ＋Ｎａ）の分子量：計算値６０５．０７３１、実測値６０５．０７４２。
Ｃ－１．キラル的に純粋な２’－Ｆウリジン－２’－ＯＭｅウリジンホスホロチオエート（ＵＦｓＵＯＭｅ）ジヌクレオチド（Ｕｆｓｕ）の合成
Figure 0007348185000024
化合物１７：化合物１５（１１．０１ｇ、１４．７ｍｍｏｌ）及び化合物１６（５．７４ｇ、１５．４ｍｍｏｌ、１．０５当量）を高真空下で乾燥させ、１００ｍｌのジクロロメタン（乾燥）に溶解した。この溶液に、１１７ｍｌのＥＴＴ（３．８３ｇ、２９．４ｍｍｏｌ、２当量）を加え、そしてこの反応混合物を２．５時間撹拌した。ＰＡＤＳ（６．３５ｇ、２２．０５ｍｍｏｌ、１．５当量）及び２．５２ｍｌの２．６－ルチジン（２．３６ｇ、２２．０５ｍｍｏｌ、１．５当量）を加え、そしてこの反応混合物を一晩撹拌した。反応混合物を８００ｍｌのジクロロメタンで希釈し、Ｈ２Ｏ（３００ｍｌ）で２回洗浄した。有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濃縮した。ジアステレオマーをＣｏｍｂｉＦｌａｓｈ（登録商標）カラム（３３０ｇカラム、ＥｔＯＡｃ：ｎ－ヘキサン（４：１））で分離して、１７ａ（上部スポット：７．２５ｇ、４７％）及び１７ｂ（下部スポット：７．２９ｇ、４７％））を得た。ＥｔＯＡｃでは：ｎ－ヘキサン（４：１）、１７ａ Ｒｆ＝０．２３及び１７ｂ Ｒｆ＝０．１８。
１７ａ １Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ １１．４３（ｓ，１Ｈ），１１．３３（ｓ，１Ｈ），７．７７（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），７．５７（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），７．４２－７．３６（ｍ，２Ｈ），７．３３－７．２０（ｍ，７Ｈ），６．９１－６．８４（ｍ，４Ｈ），５．９２（ｄ，Ｊ＝２１．４Ｈｚ，１Ｈ），５．８１（ｄ，Ｊ＝４．５Ｈｚ，１Ｈ），５．６３（ｄｄ，Ｊ＝８．１，１．８Ｈｚ，１Ｈ），５．６０－５．４２（ｍ，２Ｈ），５．３６－５．２４（ｍ，１Ｈ），４．３４－４．２１（ｍ，３Ｈ），４．２１－４．０６（ｍ，２Ｈ），４．０３－３．９３（ｍ，２Ｈ），３．８６（ｔ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，１Ｈ），３．７３（ｓ，６Ｈ），３．３８（ｄ，Ｊ＝９．５Ｈｚ，１Ｈ），３．３４（ｓ，３Ｈ），３．２９（ｄｄ，Ｊ＝１１．０，４．８Ｈｚ，１Ｈ），２．８３－２．７３（ｍ，２Ｈ），０．８７（ｓ，９Ｈ），０．０８（ｓ，５Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ １６３．１１，１６２．９２，１５８．１３，１５８．１１，１５０．３１，１５０．０２，１４４．３１，１４２．０７，１４０．１３，１３５．０８，１３５．０３，１２９．７７，１２９．７２，１２７．８１，１２７．７６，１２６．７８，１２０．２６，１１７．７０，１１３．１５，１０２．１２，１０１．７３，９１．６３，９０．０５，９０．０３，８９．７５，８７．１２，８５．９７，８１．６９，８１．６２，８１．２４，７９．６１，７９．５４，７３．１２，７３．０１，６９．６４，６７．０８，６７．０６，６３．２６，６３．２３，６１．５８，５７．６１，５５．００，２５．５４，１８．７７，１８．７０，１７．６８，－４．８８，－５．１４．３１Ｐ ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ ６８．１９．１９Ｆ ＮＭＲ（３７６ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ －２０３．６４，－２０３．７０，－２０３．７５，－２０３．７８，－２０３．８３，－２０３．８９．Ｃ４９Ｈ５９ＦＮ５Ｏ１４ＰＳＳｉ（Ｍ＋Ｎａ）の分子量：計算値１０７４．３６８、実測値１０７４．３１７０。
１７ｂ １Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ １１．５１－１１．４６（ｍ，１Ｈ），１１．４３－１１．３８（ｍ，１Ｈ），７．８０（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），７．５６（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ），７．３８（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ），７．３１－７．２０（ｍ，７Ｈ），６．８５（ｄｄ，Ｊ＝８．９，２．１Ｈｚ，４Ｈ），５．９１（ｄ，Ｊ＝２１．８Ｈｚ，１Ｈ），５．７８（ｄ，Ｊ＝４．０Ｈｚ，１Ｈ），５．６３－５．４６（ｍ，２Ｈ），５．４１（ｄｄ，Ｊ＝８．０，２．０Ｈｚ，１Ｈ），５．３８－５．２５（ｍ，１Ｈ），４．２７－４．１５（ｍ，４Ｈ），４．１５－４．０６（ｍ，２Ｈ），３．９６－３．９０（ｍ，１Ｈ），３．８６－３．８１（ｍ，１Ｈ），３．７２（ｓ，６Ｈ），３．４１－３．３６（ｍ，１Ｈ），３．３５（ｓ，３Ｈ），３．２９－３．２４（ｍ，１Ｈ），２．９２（ｔ，Ｊ＝５．８Ｈｚ，２Ｈ），０．８５（ｓ，９Ｈ），０．０７（ｓ，３Ｈ），０．０６（ｓ，３Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ １６３．１２，１６２．９４，１５８．１１，１５６．６１，１５０．２５，１５０．００，１４４．３４，１４２．０６，１４０．０９，１３７．２８，１３５．０７，１３５．００，１２９．７５，１２９．７３，１２７．７７，１２７．７５，１２６．７２，１２０．３２，１１７．９２，１１３．１１，１０１．９９，１０１．６９，９１．７６，９０．２７，９０．０６，８９．７８，８７．３３，８５．９８，８１．４３，８１．４０，８１．３７，７９．４８，７９．４１，７２．８８，７２．７４，６９．４０，６６．７１，６３．５９，６３．５５，６１．３３，５７．６２，５４．９５，２５．５４，１８．８４，１８．７７，１７．６７，－４．８６，－５．１３．３１Ｐ ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ ６８．３４．１９Ｆ ＮＭＲ（３７６ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ －２０３．３６，－２０３．４２，－２０３．４７，－２０３．５０，－２０３．５６，－２０３．６１．Ｃ４９Ｈ５９ＦＮ５Ｏ１４ＰＳＳｉ（Ｍ＋Ｎａ）の分子量：計算値１０７４．３６８、実測値１０７４．３１９８。
化合物１８：化合物１７（１７ａ上部スポット：６ｇ、５．７ｍｍｏｌ；１７ｂ下部スポット：６ｇ、５．７ｍｍｏｌ）を乾燥ＴＨＦ（１７ａ：８０ｍｌ；１７ｂ：８０ｍｌ）に溶解し、Ｅｔ３Ｎ ３ＨＦ（１７ａ：１１．２ｍｌ、６８．４ｍｍｏｌ、１２当量；１７ｂ：１１．２ｍｌ、６８．４ｍｍｏｌ、１２当量）を加えた。反応混合物を１４時間攪拌した。反応混合物を濃縮し、ＴＨＦで３回共蒸発させ、ＣｏｍｂｉＦｌａｓｈ（登録商標）カラム（ＤＣＭからＤＣＭ中、５％ＭｅＯＨ）によって精製して、１８ａ（上部スポット：４．２２ｇ、７８％）及び１８ｂ（下部スポット：４．０９ｇ、７６％）を得た。
１８ａ １Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ １１．４８（ｄ，Ｊ＝１．９Ｈｚ，１Ｈ），１１．３８（ｄ，Ｊ＝１．９Ｈｚ，１Ｈ），７．８０（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），７．５４（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），７．４２－７．３６（ｍ，２Ｈ），７．３０（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ），７．２８－７．２０（ｍ，５Ｈ），６．８７（ｄｄ，Ｊ＝９．０，２．４Ｈｚ，４Ｈ），５．９１（ｄ，Ｊ＝２１．７Ｈｚ，１Ｈ），５．８４（ｄ，Ｊ＝５．０Ｈｚ，１Ｈ），５．６３（ｄｄ，Ｊ＝８．１，２．１Ｈｚ，１Ｈ），５．５４（ｄｄ，Ｊ＝５３．１，４．６Ｈｚ，１Ｈ），５．４２（ｄｄ，Ｊ＝８．０，２．１Ｈｚ，１Ｈ），５．４０－５．３６（ｍ，１Ｈ），５．３６－５．２５（ｍ，１Ｈ），４．２８－４．２１（ｍ，２Ｈ），４．２１－４．１４（ｍ，１Ｈ），４．１４－４．０６（ｍ，２Ｈ），４．０５－４．００（ｍ，１Ｈ），４．００－３．９３（ｍ，１Ｈ），３．７８（ｔ，Ｊ＝５．１Ｈｚ，１Ｈ），３．７３（ｓ，６Ｈ），３．３４（ｓ，４Ｈ），３．２７（ｄｄ，Ｊ＝１１．１，４．７Ｈｚ，１Ｈ），２．８３－２．７６（ｍ，２Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ １６３．１４，１６２．８９，１５８．１３，１５８．１１，１５０．３４，１５０．０１，１４４．３１，１４２．０７，１３９．９７，１３５．０９，１３５．０２，１２９．７７，１２９．７２，１２７．８２，１２７．７７，１２６．７９，１１７．７７，１１３．１７，１０２．１４，１０１．６９，９１．７５，９０．２６，９０．１０，８９．８１，８６．５９，８５．９８，８１．８４，８１．７７，８１．６１，７９．５２，７９．４５，７２．９９，７２．８７，６８．２８，６７．７８，６７．７５，６３．２１，６３．１８，６１．４７，５７．６１，５５．０１，１８．７５，１８．６８．３１Ｐ ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ ６８．１９．１９Ｆ ＮＭＲ（３７６ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ －２０７．６１，－２０７．６５，－２０７．６６，－２０７．７０，－２０７．７５，－２０７．７９，－２０７．８０，－２０７．８４．Ｃ４３Ｈ４５ＦＮ５Ｏ１４ＰＳ（Ｍ＋Ｎａ）の分子量：計算値９６０．２３０３、実測値９６０．２３１１。
１８ｂ １Ｈ ＮＭＲ ５４（５００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ １１．４８（ｄ，Ｊ＝２．３Ｈｚ，１Ｈ），１１．３９（ｄ，Ｊ＝２．３Ｈｚ，１Ｈ），７．８５－７．７５（ｍ，１Ｈ），７．５３（ｄｄ，Ｊ＝８．１，１．０Ｈｚ，１Ｈ），７．４２－７．３４（ｍ，２Ｈ），７．３１－７．２７（ｍ，２Ｈ），７．２７－７．１８（ｍ，５Ｈ），６．９０－６．８３（ｍ，４Ｈ），５．９１（ｄ，Ｊ＝２１．９Ｈｚ，１Ｈ），５．８１（ｄ，Ｊ＝４．６Ｈｚ，１Ｈ），５．６１－５．５６（ｍ，１Ｈ），５．５１－５．４６（ｍ，１Ｈ），５．４４－５．３５（ｍ，２Ｈ），５．３５－５．２４（ｍ，１Ｈ），４．２４－４．１１（ｍ，４Ｈ），４．１１－４．０３（ｍ，２Ｈ），３．９６－３．９１（ｍ，１Ｈ），３．７７（ｔ，Ｊ＝５．０Ｈｚ，１Ｈ），３．７２（ｓ，６Ｈ），３．３９－３．３３（ｍ，４Ｈ），３．２９－３．２３（ｍ，１Ｈ），２．９１（ｔ，Ｊ＝５．９Ｈｚ，２Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ １６３．１２，１６２．８８，１５８．１１，１５８．０８，１５０．２８，１４９．９９，１４４．３２，１４２．０８，１４０．０１，１３５．０６，１３５．０３，１２９．７６，１２９．７１，１２７．７９，１２７．７５，１２６．７３，１１７．９５，１１３．１４，１０２．０１，１０１．６７，９１．７７，９０．３０，９０．０８，８９．８０，８６．８４，８６．８２，８５．９８，８１．６９，８１．６１，８１．５４，７９．４７，７９．３８，７２．８２，７２．６９，６８．１９，６７．５５，６７．５１，６３．４９，６３．４６，６１．３６，５７．６５，５４．９７，１８．７９，１８．７２．３１Ｐ ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ ６８．２６．１９Ｆ ＮＭＲ（３７６ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ －２０７．３９，－２０７．４３，－２０７．４４，－２０７．４８，－２０７．５３，－２０７．５７，－２０７．５８，－２０７．６２．Ｃ４３Ｈ４５ＦＮ５Ｏ１４ＰＳ（Ｍ＋Ｎａ）の分子量：計算値９６０．２３０３、実測値９６０．２３１３。
化合物１９：化合物１８（１８ａ上部スポット：３００ｍｇ、０．３２ｍｍｏｌ；１８ｂ下部スポット：３００ｍｇ、０．３２ｍｍｏｌ）を高真空下で一晩乾燥させ、１８ａは３ｍｌの乾燥ＤＣＭに、１８ｂは３ｍｌの乾燥酢酸エチルに溶解し、０℃まで冷却した。Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルアミン（１８ａ：８４μｌ、６２ｍｇ、０．４８ｍｍｏｌ、１．５当量；１８ｂ：８４μｌ、６２ｍｇ、０．４８ｍｍｏｌ、１．５当量）を激しく攪拌しながら滴下した。続いて、２－シアノエチルＮ，Ｎ－ジイソプロピルクロロホスホラミダイト（１８ａ １０７μｌ、１１４ｍｇ、０．４８ｍｍｏｌ、１．５当量；１８ｂ １０７μｌ、１１４ｍｇ、０．４８ｍｍｏｌ、１．５当量）を（１分かけて）滴下し、そしてこの反応混合物を０℃で１０分間、室温で６０分間撹拌した。反応混合物を、１８ａは２００ｍｌのＤＣＭ、１８ｂは酢酸エチルで希釈し、１００ｍｌのＮａＨＣＯ３及び１００ｍｌのブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、乾燥するまで濃縮した。粗生成物（白色の泡）を５ｍｌのＤＣＭに溶解し、１Ｌの冷ｎ－ヘキサン／ジエチルエーテル（１：１）によって沈殿させて、１９ａ（上部スポット：３１８ｍｇ、８７％）及び１９ｂ（下部スポット：３０５ｍｇ、８４％）を得た。
１９ａ ３１Ｐ ＮＭＲ ７０（２０２ＭＨｚ，ＣＤ３ＣＮ）δ １５２．０１，１５１．４７，６８．８０，６８．７４．１９Ｆ ＮＭＲ（３７６ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ －２０４．７３，－２０４．７８，－２０４．８２，－２０４．８７，－２０４．９２，－２０４．９６，－２０５．０１，－２０５．８５，－２０５．９０，－２０５．９６，－２０６．００，－２０６．０４，－２０６．１０．Ｃ５２Ｈ６２ＦＮ７Ｏ１５Ｐ２Ｓ（Ｍ＋Ｎａ）の分子量：計算値１１３７．３４８４、実測値１１３８．２。
１９ｂ ３１Ｐ ＮＭＲ ７１（２０２ＭＨｚ，ＣＤ３ＣＮ）δ １５１．７８，１５１．５３，６８．７７．１９Ｆ ＮＭＲ（３７６ＭＨｚ，ＣＤ３ＣＮ）δ －２０５．５３，－２０５．５８，－２０５．６３，－２０５．６６，－２０５．７１，－２０５．７６，－２０５．７７，－２０５．８０，－２０５．８４，－２０５．９０．Ｃ５２Ｈ６２ＦＮ７Ｏ１５Ｐ２Ｓ（Ｍ＋Ｈ）の分子量：計算値１１３８．３５６２、実測値１１３８．３５９５。
Ｃ－２．完全に脱保護されたキラル的に純粋なＵＦｓＵＯＭｅ（Ｕｆｓｕ）の合成
Figure 0007348185000025
化合物２０：化合物１８（１８ａ上部スポット：５００ｍｇ、０．５３ｍｍｏｌ；１８ｂ下部スポット：５００ｍｇ、０．５３ｍｍｏｌ）を１．５ｍｌのＤＣＭに溶解し、８ｍｌのトリクロロ酢酸（ＤＣＭ中、３％）を加えた。反応混合物を室温で１時間攪拌した。反応混合物を濃縮し、ＣｏｍｂｉＦｌａｓｈ（登録商標）カラム（４０ｇ Ｇｏｌｄカラム、流量５０ｍｌ／分、ＤＣＭ中、５％ＭｅＯＨで４分間、ＤＣＭ中、１０％ＭｅＯＨで５分間、ＤＣＭ中、１０％ＭｅＯＨで１０分間）によって精製して、２０ａ（３０６ｍｇ、９０％）及び２０ｂ（３２７ｍｇ、９６％）を得た。ＤＣＭ中、５％ＭｅＯＨでは、２０ａ：Ｒｆ＝０．２４及び２０ｂ Ｒｆ＝０．２８。
２０ａ １Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ １１．４８（ｓ，１Ｈ），１１．４１（ｓ，１Ｈ），７．８４（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），７．５８（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），５．９６（ｄｄ，Ｊ＝１８．８，３．０Ｈｚ，１Ｈ），５．８５（ｄ，Ｊ＝５．０Ｈｚ，１Ｈ），５．６７（ｄｄｄ，Ｊ＝７．８，５．５，２．１Ｈｚ，２Ｈ），５．５３－５．２９（ｍ，３Ｈ），５．１７－５．０３（ｍ，１Ｈ），４．３４－４．０８（ｍ，６Ｈ），４．０６－３．９９（ｍ，１Ｈ），３．８０（ｔ，Ｊ＝５．１Ｈｚ，１Ｈ），３．７６－３．６６（ｍ，１Ｈ），３．６０（ｄｔ，Ｊ＝１２．１，４．０Ｈｚ，１Ｈ），３．３４（ｓ，３Ｈ），２．９６（ｔ，Ｊ＝５．８Ｈｚ，２Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ １６３．０７，１６２．９３，１５０．３８，１５０．２６，１４１．２１，１４０．０８，１１８．１２，１０２．１９，１０２．１２，９１．４５，９１．４４，８９．９４，８９．９３，８８．０５，８７．７８，８６．６２，８１．９４，８１．９１，８１．８８，８１．８４，８１．５８，７３．８０，７３．７７，７３．６９，７３．６６，６８．２９，６７．７４，６７．７０，６３．４２，６３．３９，５９．６０，５７．６３，５４．８９，１８．８５，１８．７８．３１Ｐ ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ ６６．７９．１９Ｆ ＮＭＲ（３７６ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ －２０７．６３，－２０７．６７，－２０７．６８，－２０７．７２，－２０７．７７，－２０７．８１，－２０７．８２，－２０７．８６．Ｃ２２Ｈ２７ＦＮ５Ｏ１２ＰＳ（Ｍ＋Ｎａ）の分子量：計算値６５８．０９９６、実測値６５８．０９８９。
２０ｂ １Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ １１．４８（ｓ，１Ｈ），１１．４１（ｓ，１Ｈ），７．８５（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），７．６１（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），５．９５（ｄｄ，Ｊ＝１８．９，２．９Ｈｚ，１Ｈ），５．８４（ｄ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，１Ｈ），５．６６（ｄｄｄ，Ｊ＝１４．１，８．１，２．１Ｈｚ，２Ｈ），５．５２－５．２９（ｍ，３Ｈ），５．１６－５．０１（ｍ，１Ｈ），４．３４－４．１７（ｍ，４Ｈ），４．１７－４．０８（ｍ，２Ｈ），４．０８－３．９９（ｍ，１Ｈ），３．８２（ｔ，Ｊ＝５．０Ｈｚ，１Ｈ），３．７６－３．６７（ｍ，１Ｈ），３．５８（ｄｔ，Ｊ＝１２．３，４．３Ｈｚ，１Ｈ），３．３６（ｓ，３Ｈ），２．９５（ｔ，Ｊ＝５．８Ｈｚ，２Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ １６３．０７，１６２．９３，１５０．３５，１５０．２５，１４１．２２，１４０．２３，１１８．０６，１０２．１１，１０２．０９，９１．４８，９１．４６，８９．９６，８９．９４，８８．１３，８７．８６，８６．８５，８１．８８，８１．８２，８１．７９，８１．７２，８１．５８，７３．５８，７３．５４，７３．４６，７３．４３，６８．２７，６７．７６，６７．７２，６３．４７，６３．４４，５９．５２，５７．６７，５４．８８，１８．８１，１８．７５．３１Ｐ ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ ６６．８３．１９Ｆ ＮＭＲ（３７６ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ －２０７．４８，－２０７．５２，－２０７．５３，－２０７．５７，－２０７．６２，－２０７．６６，－２０７．６７，－２０７．７１．Ｃ２２Ｈ２７ＦＮ５Ｏ１２ＰＳ（Ｍ＋Ｎａ）の分子量：計算値６５８．０９９６、実測値６５８．０９８４。
化合物２１：化合物２０（２０ａ上部スポット：２８６ｍｇ、０．４５ｍｍｏｌ；２０ｂ下部スポット：３０７ｍｇ、０．４８ｍｍｏｌ）を１２ｍｌのメチルアミン（３３ｗｔ％無水エタノール溶液）に溶解し、室温で５分間撹拌した。反応混合物を濃縮し、ＣｏｍｂｉＦｌａｓｈ（登録商標）カラム（２４ｇ Ｇｏｌｄカラム、流量３５ｍｌ／分、酢酸エチル／ＭｅＯＨ（７０：３０）で８分間、酢酸エチル／ＭｅＯＨ（６０：４０）で５分間）によって精製して、２１ａ（２２９ｍｇ、８７％）及び２１ｂ（２４２ｍｇ、８６％）を得た。酢酸エチル／ＭｅＯＨ（２：１）では、２１ａ：Ｒｆ＝０．１５及び２１ｂ：Ｒｆ＝０．１４。
２１ａ １Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，重水）δ ８．０８（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），７．９３（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），６．０４（ｓ，１Ｈ），５．９８（ｄ，Ｊ＝１８．３Ｈｚ，１Ｈ），５．９２（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），５．８５（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），５．４７－５．２１（ｍ，１Ｈ），５．００－４．８６（ｍ，１Ｈ），４．４７（ｔ，Ｊ＝５．３Ｈｚ，１Ｈ），４．３６－４．２４（ｍ，４Ｈ），４．２３－４．１４（ｍ，１Ｈ），４．１２－３．９９（ｍ，２Ｈ），３．９２－３．８９（ｍ，１Ｈ），３．５５（ｓ，４Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，ｄ２ｏ）δ １６５．９６，１６５．８１，１５１．２４，１５０．９５，１４１．８６，１４１．３１，１０２．３７，１０１．８１，９２．５２，９２．５０，９１．０２，８９．６０，８９．３２，８７．０１，８２．８３，８２．６６，８２．５９，８１．６３，８１．５６，７０．９４，７０．９０，７０．８２，７０．７８，６７．８５，６３．７６，６３．７１，５８．９３，５８．０９．３１Ｐ ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）δ ５６．８２．１９Ｆ ＮＭＲ（３７６ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）δ －２００．１７，－２００．２１，－２００．２２，－２００．２７，－２００．３０，－２００．３５，－２００．３６，－２００．４１．Ｃ１９Ｈ２４ＦＮ４Ｏ１２ＰＳ（Ｍ＋Ｎａ）の分子量：計算値６０５．０７３１、実測値６０５．０７２７。
２１ｂ １Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ １１．２９（ｓ，１Ｈ），１１．２６（ｓ，１Ｈ），８．７６（ｓ，１Ｈ），８．７３（ｓ，１Ｈ），８．６９（ｓ，１Ｈ），８．６５（ｓ，１Ｈ），８．０３（ｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，４Ｈ），７．６９－７．５９（ｍ，２Ｈ），７．５９－７．４８（ｍ，４Ｈ），６．４７（ｄｄ，Ｊ＝１６．７，３．６Ｈｚ，１Ｈ），６．２３－６．１５（ｍ，１Ｈ），５．９３（ｄｔ，Ｊ＝５１．４，４．０Ｈｚ，１Ｈ），５．６５－５．５７（ｍ，１Ｈ），５．５４－５．４２（ｍ，１Ｈ），５．３４（ｔ，Ｊ＝５．５Ｈｚ，１Ｈ），４．５５－４．１８（ｍ，８Ｈ），３．７８－３．５８（ｍ，２Ｈ），３．３６（ｓ，３Ｈ），２．９７（ｔ，Ｊ＝５．８Ｈｚ，２Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，ｄ２ｏ）δ １６６．１１，１６５．９４，１５１．３７，１５１．０４，１４２．２３，１４１．３０，１０２．３７，１０１．９４，９２．４４，９２．４２，９０．９４，９０．９２，８９．７６，８９．４７，８６．９９，８２．８０，８２．７２，８２．７０，８１．７３，８１．６７，７０．４０，７０．３５，７０．２７，７０．２３，６７．９０，６４．５９，６４．５４，５９．２１，５８．０９．３１Ｐ ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）δ ５５．９７．１９Ｆ ＮＭＲ（３７６ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）δ －２００．３０，－２００．３５，－２００．４０，－２００．４３，－２００．４９，－２００．５４．Ｃ１９Ｈ２４ＦＮ４Ｏ１２ＰＳ（Ｍ＋Ｎａ）の分子量：計算値６０５．０７３１、実測値６０５．０７３７。
Ｄ－１．キラル的に純粋な２’－Ｆアデノシン－２’－ＯＭｅアデノシンホスホロチオエートジヌクレオチド（ＡＦｓＡＯＭｅ）（Ａｆｓａ）の合成
Figure 0007348185000026
化合物２４：化合物２２（１２．８７ｇ、１４．７ｍｍｏｌ）及び化合物２３（７．７１ｇ、１５．４ｍｍｏｌ、１．０５当量）を高真空下で乾燥し、１１０ｍｌのジクロロメタン（乾燥）に溶解した。この溶液に１１７ｍｌのＥＴＴ（３．８３ｇ、２９．４ｍｍｏｌ、２当量）を加え、そしてこの反応混合物を１．５時間撹拌した。ＰＡＤＳ（６．３５ｇ、２２．０５ｍｍｏｌ、１．５当量）及び２．５２ｍｌの２．６－ルチジン（２．３６ｇ、２２．０５ｍｍｏｌ、１．５当量）を加え、反応混合物を一晩撹拌した。反応混合物を１０００ｍｌのジクロロメタンで希釈し、Ｈ２Ｏ（４００ｍｌ）で２回洗浄した。有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濃縮した。ジアステレオマーをＣｏｍｂｉＦｌａｓｈ（登録商標）カラム（粗生成物３０ｇ、ＥｔＯＡｃ：ｎ－ヘキサン（１：１＋２．５％ＭｅＯＨ））で分離して、２４ａ（上部スポット：８．４８ｇ、４４％）及び２４ｂ（下部スポット：７．８ｇ、４１％）を得た。ＥｔＯＡｃでは：ｎ－ヘキサン（１：１＋２％ＭｅＯＨ）、２４ａ Ｒｆ＝０．１５及び２４ｂ Ｒｆ＝０．０９。
２４ａ １Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，アセトニトリル－ｄ３）δ ９．４５（ｓ，２Ｈ），８．６０（ｓ，１Ｈ），８．５３（ｓ，１Ｈ），８．３０（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，２Ｈ），８．０９－７．９７（ｍ，４Ｈ），７．６９－７．５９（ｍ，２Ｈ），７．５８－７．４７（ｍ，４Ｈ），７．３９－７．３１（ｍ，２Ｈ），７．２６－７．１５（ｍ，７Ｈ），６．７７（ｄ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，４Ｈ），６．３６－６．２６（ｍ，１Ｈ），６．１２（ｄ，Ｊ＝３．８Ｈｚ，１Ｈ），５．９７－５．８０（ｍ，２Ｈ），４．７２（ｔ，Ｊ＝５．２Ｈｚ，１Ｈ），４．５１－４．４４（ｍ，１Ｈ），４．４４－４．３４（ｍ，３Ｈ），４．３０－４．２３（ｍ，１Ｈ），４．２３－４．１３（ｍ，１Ｈ），４．１１－４．０６（ｍ，１Ｈ），３．７３（ｓ，６Ｈ），３．４９（ｄｄ，Ｊ＝１１．３，２．５Ｈｚ，１Ｈ），３．４４（ｓ，３Ｈ），３．２８（ｄｄ，Ｊ＝１１．３，４．２Ｈｚ，１Ｈ），２．６９（ｑ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，２Ｈ），０．９６（ｓ，９Ｈ），０．１７（ｄ，Ｊ＝１．９Ｈｚ，６Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，ＣＤ３ＣＮ）δ １５９．７０，１５２．９８，１５２．７７，１５２．３７，１５１．１７，１５１．０２，１４５．７９，１４４．２０，１４３．３６，１３６．６６，１３３．６１，１３１．０５，１２９．７１，１２９．６８，１２９．２８，１２９．０６，１２８．８１，１２７．９０，１２５．７６，１１４．０３，９２．９７，９１．４５，８８．３９，８８．１２，８８．０２，８７．２５，８３．６８，８３．６２，８１．４３，７４．５８，７４．５７，７１．５１，６８．８２，６４．３９，６２．３８，５９．０４，５５．９６，２６．２０，２０．１２，２０．０５，１８．７８，－４．３３，－４．５３．３１Ｐ ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ，ＣＤ３ＣＮ）δ ６８．９８．１９Ｆ ＮＭＲ（３７６ＭＨｚ，ＣＤ３ＣＮ）δ －２０７．６５，－２０７．７０，－２０７．７５，－２０７．７９，－２０７．８４，－２０７．８９．Ｃ６５Ｈ６９ＦＮ１１Ｏ１２ＰＳＳｉ（Ｍ＋Ｎａ）の分子量：計算値１３２８．４２３７、実測値１３２８．４２４３。
２４ｂ １Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，アセトニトリル－ｄ３）δ ９．３８（ｓ，１Ｈ），８．６８（ｓ，１Ｈ），８．６２（ｓ，１Ｈ），８．３１（ｓ，１Ｈ），８．２８（ｓ，１Ｈ），８．００（ｄ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，４Ｈ），７．７１－７．６０（ｍ，２Ｈ），７．６０－７．４７（ｍ，４Ｈ），７．３８－７．３１（ｍ，２Ｈ），７．２６－７．１５（ｍ，７Ｈ），６．８３－６．６８（ｍ，４Ｈ），６．３９－６．２６（ｍ，１Ｈ），６．１２（ｄ，Ｊ＝３．６Ｈｚ，１Ｈ），６．０７－５．８７（ｍ，２Ｈ），４．７４（ｔ，Ｊ＝５．３Ｈｚ，１Ｈ），４．５３－４．１６（ｍ，８Ｈ），３．７８－３．６７（ｍ，６Ｈ），３．４７（ｓ，３Ｈ），３．３２－３．２６（ｍ，１Ｈ），２．７７（ｔ，Ｊ＝５．８Ｈｚ，２Ｈ），０．９７（ｓ，９Ｈ），０．１８（ｓ，６Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，ＣＤ３ＣＮ）δ １５９．６６，１５２．８２，１５２．４９，１５１．２０，１５１．０５，１４５．８４，１４４．２５，１４３．３５，１３６．６４，１３６．５４，１３４．９３，１３４．８４，１３３．７０，１３３．６３，１３１．０６，１３１．０４，１２９．７３，１２９．７０，１２９．２３，１２９．０２，１２７．８４，１２５．８１，１２５．７７，１１４．０１，９２．９２，９１．４１，８８．３６，８８．０９，８７．２５，８３．５９，８３．５０，８１．５４，８１．４８，７４．７７，７４．６６，７４．６３，７１．３３，６８．３３，６８．２９，６４．６５，６２．２９，５９．０４，２６．２２，２０．２０，２０．１３，１８．７９，－４．３０，－４．４７．３１Ｐ ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ，ＣＤ３ＣＮ）δ ６８．８４．１９Ｆ ＮＭＲ（３７６ＭＨｚ，ＣＤ３ＣＮ）δ －２０８．５２，－２０８．５７，－２０８．６２，－２０８．６６，－２０８．７１，－２０８．７６．Ｃ６５Ｈ６９ＦＮ１１Ｏ１２ＰＳＳｉ（Ｍ＋Ｎａ）の分子量：計算値１３２８．４２３８、実測値１３２８．４２３６。
化合物２５：化合物２４（２４ａ上部スポット：５．６７ｇ、４．３ｍｍｏｌ；２４ｂ下部スポット：４．９ｇ、３．８ｍｍｏｌ）を乾燥ＴＨＦ（２４ａ：８０ｍｌ；２４ｂ：７０ｍｌ）に溶解し、Ｅｔ３Ｎ ３ＨＦ（２４ａ：８．５ｍｌ、５２ｍｍｏｌ、１２当量；２４ｂ：７．４ｍｌ、４５ｍｍｏｌ、１２当量）を加えた。反応混合物を１４時間攪拌した。反応混合物を濃縮し、ＴＨＦで３回共蒸発させ、ＣｏｍｂｉＦｌａｓｈ（登録商標）カラム（ＤＣＭからＤＣＭ中、５％ＭｅＯＨ）によって精製して、２５ａ（上部スポット：４．６８ｇ、９０％）及び２５ｂ（下部スポット：３．２７ｇ、７３％）を得た。
２５ａ １Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ １１．２４（ｓ，１Ｈ），１１．２０（ｓ，１Ｈ），８．７２（ｓ，１Ｈ），８．６４（ｓ，１Ｈ），８．６３（ｓ，１Ｈ），８．６０（ｓ，１Ｈ），８．０４－８．０１（ｍ，４Ｈ），７．６３（ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，２Ｈ），７．５３（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，４Ｈ），７．２９（ｄ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，２Ｈ），７．２０－７．１４（ｍ，７Ｈ），６．７６（ｄｄ，Ｊ＝８．９，２．０Ｈｚ，４Ｈ），６．５５－６．４５（ｍ，１Ｈ），６．１６（ｄ，Ｊ＝４．２Ｈｚ，１Ｈ），６．１４－５．９９（ｍ，１Ｈ），５．９４－５．８３（ｍ，１Ｈ），５．６０－５．５２（ｍ，１Ｈ），４．４８－４．４５（ｍ，２Ｈ），４．４４－４．３５（ｍ，２Ｈ），４．３４－４．２６（ｍ，１Ｈ），４．２３－４．１０（ｍ，２Ｈ），４．０８－４．００（ｍ，１Ｈ），３．６８（ｓ，６Ｈ），３．３９（ｄ，Ｊ＝１０．４Ｈｚ，１Ｈ），３．３５（ｓ，３Ｈ），３．２３（ｄｄ，Ｊ＝１１．１，４．５Ｈｚ，１Ｈ），２．８４－２．８０（ｍ，２Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ １６５．６０，１６５．５５，１５８．００，１５１．９２，１５１．７７，１５１．６５，１５１．４２，１５０．６１，１５０．４７，１４４．４５，１４３．８２，１４２．７８，１３５．２０，１３３．２５，１３３．２２，１３２．４６，１３２．４４，１２９．６３，１２９．５９，１２８．４７，１２８．４２，１２７．６５，１２７．６３，１２６．６１，１２５．７８，１２５．７３，１１７．８２，１１３．０２，９１．４２，８９．９１，８６．４９，８６．２２，８５．７８，８５．６１，８２．６９，８２．６２，８１．７３，７９．８５，７９．７８，７３．４７，７３．４４，７３．３６，７３．３３，６８．７０，６８．０４，６８．００，６３．２４，６３．２０，６１．３９，５７．７２，５４．９５，１８．７６，１８．６９．３１Ｐ ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ ６６．９３．１９Ｆ ＮＭＲ（３７６ＭＨｚ，ｃｄ３ｃｎ）δ －２０８．２５，－２０８．３０，－２０８．３５，－２０８．３９，－２０８．４４，－２０８．４９．Ｃ５９Ｈ５５ＦＮ１１Ｏ１２ＰＳ（Ｍ＋Ｎａ）の分子量：計算値１２１４．３３７２、実測値１２１４．３３７８。
２５ｂ １Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ １１．２５（ｓ，１Ｈ），１１．２１（ｓ，１Ｈ），８．７４（ｓ，１Ｈ），８．６８（ｓ，１Ｈ），８．６２（ｓ，１Ｈ），８．６０（ｓ，１Ｈ），８．０６－８．００（ｍ，４Ｈ），７．６３（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，２Ｈ），７．５３（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，４Ｈ），７．２８（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，２Ｈ），７．１９－７．１１（ｍ，７Ｈ），６．７４（ｄｄ，Ｊ＝９．０，２．５Ｈｚ，４Ｈ），６．４９（ｄｄ，Ｊ＝２０．０，２．３Ｈｚ，１Ｈ），６．１７（ｄ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，１Ｈ），６．１５－６．００（ｍ，１Ｈ），５．９５－５．８４（ｍ，１Ｈ），５．５６（ｄ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，１Ｈ），４．４９－４．４２（ｍ，２Ｈ），４．３５－４．２５（ｍ，３Ｈ），４．２２－４．１３（ｍ，３Ｈ），３．６７（ｓ，６Ｈ），３．３８（ｓ，４Ｈ），３．２２（ｄｄ，Ｊ＝１１．３，４．６Ｈｚ，１Ｈ），２．８７（ｔ，Ｊ＝５．９Ｈｚ，２Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ ８（１２６ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ １６５．５９，１６５．５６，１５７．９６，１５１．９２，１５１．７９，１５１．６９，１５１．４２，１５０．６３，１５０．４８，１４４．４７，１４３．８３，１４２．８０，１３５．２１，１３３．２６，１３３．２２，１３２．４６，１３２．４３，１２９．６２，１２９．５８，１２８．４７，１２８．４２，１２７．６２，１２７．６２，１２６．５６，１２５．７９，１２５．７５，１１７．９３，１１２．９９，９１．４５，８９．９３，８６．５０，８６．２２，８５．８７，８５．５９，８２．６６，８２．５９，８１．７６，７９．８０，７９．７２，７３．１５，７３．１２，６８．６２，６７．９９，６７．９５，６３．４９，６３．４５，６１．２１，５７．７５，５４．９２，１８．７７，１８．７０，－１．２１．３１Ｐ ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ ６６．９８．１９Ｆ ＮＭＲ（３７６ＭＨｚ，ｃｄ３ｃｎ）δ －２０８．１５，－２０８．２０，－２０８．２５，－２０８．２９，－２０８．３４，－２０８．３９．Ｃ５９Ｈ５５ＦＮ１１Ｏ１２ＰＳ（Ｍ＋Ｎａ）の分子量：計算値１２１４．３３７２、実測値１２１４．３３６３。
化合物２６：化合物２５（２５ａ上部スポット：１ｇ、０．８４ｍｍｏｌ；２５ｂ下部スポット：１ｇ、０．８４ｍｍｏｌ）を高真空下で一晩乾燥させ、乾燥酢酸エチル（２５ａ：１３ｍｌ、２５ｂ：１７ｍｌ）に溶解した。Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルアミン（２５ａ：３６６μｌ、２７１ｍｇ、２．１ｍｍｏｌ、２．５当量；２５ｂ：３６６μｌ、２７１ｍｇ、２．１ｍｍｏｌ、２．５当量）を激しく攪拌しながら滴下した。続いて、２－シアノエチルＮ，Ｎ－ジイソプロピルクロロホスホラミダイト（２５ａ：３７９μｌ、４０２ｍｇ、１．７ｍｍｏｌ、２当量；２５ｂ：３７９μｌ、４０２ｍｇ、１．７ｍｍｏｌ、２当量）を（１分かけて）滴下し、そしてこの反応混合物を室温で１．５時間撹拌した。反応混合物を２００ｍｌのＥＡで希釈し、１００ｍｌのＮａＨＣＯ３及び１００ｍｌのブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、乾燥するまで濃縮した。粗生成物（白色の泡）を５ｍｌのＤＣＭに溶解し、１Ｌの冷ｎ－ヘキサン／ジエチルエーテル（１：１）によって沈殿させて、２６ａ（上部スポット：１ｇ、８６％）及び２６ｂ（下部スポット：１．１ｇ、９０％）を得た。
２６ａ １Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，アセトニトリル－ｄ３）δ ８．５７（ｓ，１Ｈ），８．５２（ｄ，Ｊ＝２．７Ｈｚ，１Ｈ），８．３１－８．２３（ｍ，２Ｈ），８．０５－７．９６（ｍ，４Ｈ），７．６７－７．５６（ｍ，２Ｈ），７．５６－７．４３（ｍ，４Ｈ），７．３５－７．２８（ｍ，２Ｈ），７．２３－７．１１（ｍ，７Ｈ），６．８０－６．７０（ｍ，４Ｈ），６．３２－６．２４（ｍ，１Ｈ），６．１０（ｄｄ，Ｊ＝９．１，４．３Ｈｚ，１Ｈ），５．９７－５．７４（ｍ，２Ｈ），４．８５－４．６９（ｍ，１Ｈ），４．５８－４．３２（ｍ，４Ｈ），４．２２－４．１１（ｍ，１Ｈ），４．１１－３．９７（ｍ，１Ｈ），３．９１－３．８０（ｍ，１Ｈ），３．７１（ｓ，８Ｈ），３．４７（ｓ，３Ｈ），３．４１（ｓ，３Ｈ），３．３３－３．１９（ｍ，１Ｈ），２．７３－２．６１（ｍ，３Ｈ），１．２４－１．１６（ｍ，１２Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，ＣＤ３ＣＮ）δ １５９．７０，１５２．９２，１５２．８６，１５２．３４，１５１．１９，１５１．０７，１４５．７９，１４４．２１，１４４．１６，１４３．４０，１４３．３０，１３６．６５，１３６．５８，１３４．９４，１３４．８３，１３３．７０，１３３．６２，１３１．０６，１２９．７１，１２９．６９，１２９．２８，１２９．０６，１２８．８０，１２７．８９，１２５．７８，１１４．０２，９３．０５，９３．０４，９１．６１，９１．５４，８８．４３，８８．４１，８８．１３，８８．０２，８７．２３，８３．２９，８３．１３，８２．９８，８２．８６，８２．７６，８１．４２，８１．３４，７４．６４，７４．５２，７２．２９，７２．１７，７１．７１，７１．５７，６９．１３，６８．７６，６４．４１，６４．３８，６２．３３，６２．２９，６０．０１，５９．８７，５９．４９，５９．３３，５９．２３，５９．０２，５５．９５，４６．０９，４６．０４，４４．３２，４４．２６，４４．２２，４４．１６，２５．１４，２５．０８，２５．０４，２４．９８，２３．４３，２３．２５，２３．１８，２１．２０，２１．１２，２１．０７，２０．１１，２０．０５．３１Ｐ ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ，ＣＤ３ＣＮ）δ １５１．９５，１５１．２２，６９．０１．１９Ｆ ＮＭＲ（３７６ＭＨｚ，ＣＤ３ＣＮ）δ －２０７．１９，－２０７．２４，－２０７．３０，－２０７．３５，－２０７．３８，－２０７．４４，－２０７．４９，－２０７．５４．Ｃ６８Ｈ７２ＦＮ１３Ｏ１３Ｐ２Ｓ（Ｍ＋Ｈ）の分子量：計算値１３９２．４６３１、実測値１３９２．４６８１。
２６ｂ １Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，アセトニトリル－ｄ３）δ ９．３３（ｓ，１Ｈ），８．６４（ｓ，１Ｈ），８．６０（ｄ，Ｊ＝２．２Ｈｚ，１Ｈ），８．２８（ｄ，Ｊ＝１．７Ｈｚ，１Ｈ），８．２４（ｄ，Ｊ＝５．４Ｈｚ，１Ｈ），８．０２－７．９４（ｍ，４Ｈ），７．６６－７．５８（ｍ，２Ｈ），７．５６－７．４８（ｍ，４Ｈ），７．３４－７．２７（ｍ，２Ｈ），７．２４－７．０９（ｍ，７Ｈ），６．７６－６．６９（ｍ，４Ｈ），６．３４－６．２６（ｍ，１Ｈ），６．１２－６．０７（ｍ，１Ｈ），６．０４－５．８０（ｍ，２Ｈ），４．８６－４．７３（ｍ，１Ｈ），４．５５（ｄｔ，Ｊ＝２５．９，４．６Ｈｚ，１Ｈ），４．４５－４．１６（ｍ，６Ｈ），３．９６－３．７３（ｍ，２Ｈ），３．７０（ｓ，７Ｈ），３．５０（ｓ，２Ｈ），３．４７－３．３８（ｍ，３Ｈ），３．２８－３．１９（ｍ，１Ｈ），２．７５（ｑ，Ｊ＝５．９，５．２Ｈｚ，２Ｈ），２．７２－２．６３（ｍ，２Ｈ），１．２５－１．１８（ｍ，１２Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，ＣＤ３ＣＮ）δ １５９．６６，１５２．９３，１５２．５１，１５１．２２，１５１．０８，１４５．８６，１４５．８４，１４４．２３，１４４．２２，１４３．４２，１４３．２７，１３６．６３，１３６．５４，１３４．９５，１３４．８７，１３３．７０，１３３．６２，１３１．０６，１３１．０４，１２９．７３，１２９．７０，１２９．２４，１２９．０２，１２８．７９，１２７．８４，１２５．８５，１２５．８０，１２５．７２，１１４．０１，９２．９１，９１．４２，８８．４９，８８．３２，８８．０６，８７．９８，８７．２５，８３．２３，８３．０８，８２．９２，８２．６４，８１．５６，８１．５１，７４．７５，７２．１０，７１．９７，７１．５９，７１．４５，６８．６３，６８．２９，６４．６５，６４．６１，６２．２９，６０．０２，５９．８７，５９．５０，５９．３４，５９．２７，５９．０２，５５．９５，４６．０９，４６．０４，４４．３４，４４．２８，４４．２４，４４．１８，２５．２０，２５．１６，２５．１０，２５．００，２３．２５，２３．１８，２１．２１，２１．１５，２１．０９，２０．１９，２０．１３．３１Ｐ ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ，ＣＤ３ＣＮ）δ １５１．８９，１５１．３０，６８．７３．１９Ｆ ＮＭＲ（３７６ＭＨｚ，ＣＤ３ＣＮ）δ －２０８．５３，－２０８．５８，－２０８．６３，－２０８．６７，－２０８．７２，－２０８．７６，－２０８．８１，－２０８．８５，－２０８．９０，－２０８．９５．Ｃ６８Ｈ７２ＦＮ１３Ｏ１３Ｐ２Ｓ（Ｍ＋Ｈ）の分子量：計算値１３９２．４６３１、実測値１３９２．４６６９。
Ｄ－２．完全に脱保護されたキラル的に純粋なＡＦｓＡＯＭｅの合成
Figure 0007348185000027
化合物２７：化合物２５（２５ａ上部スポット：５００ｍｇ、０．４２ｍｍｏｌ；２５ｂ下部スポット：５００ｍｇ、０．４２ｍｍｏｌ）を１．５ｍｌのＤＣＭに溶解し、８ｍｌのトリクロロ酢酸（ＤＣＭ中、３％）を加えた。反応混合物を室温で１時間攪拌した。反応混合物を濃縮し、ＣｏｍｂｉＦｌａｓｈ（登録商標）カラム（４０ｇ Ｇｏｌｄカラム、流量５０ｍｌ／分、ＤＣＭからＤＣＭ中、５％ＭｅＯＨで８分間、ＤＣＭ中、５％ＭｅＯＨで１５分間）によって精製して、２７ａ（３５５ｍｇ、９５％）及び２７ｂ（３２７ｍｇ、８８％）を得た。ＤＣＭ中、５％ＭｅＯＨでは、２７ａ：Ｒｆ＝０．１６及び２７ｂ：Ｒｆ＝０．１６。
２７ａ １Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ １１．２９（ｓ，１Ｈ），１１．２６（ｓ，１Ｈ），８．７６（ｓ，１Ｈ），８．７３（ｓ，１Ｈ），８．６９（ｓ，１Ｈ），８．６５（ｓ，１Ｈ），８．０３（ｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，４Ｈ），７．６９－７．５９（ｍ，２Ｈ），７．５９－７．４８（ｍ，４Ｈ），６．４７（ｄｄ，Ｊ＝１６．７，３．６Ｈｚ，１Ｈ），６．２３－６．１５（ｍ，１Ｈ），５．９３（ｄｔ，Ｊ＝５１．４，４．０Ｈｚ，１Ｈ），５．６５－５．５７（ｍ，１Ｈ），５．５４－５．４２（ｍ，１Ｈ），５．３４（ｔ，Ｊ＝５．５Ｈｚ，１Ｈ），４．５５－４．１８（ｍ，８Ｈ），３．７８－３．５８（ｍ，２Ｈ），３．３６（ｓ，３Ｈ），２．９７（ｔ，Ｊ＝５．８Ｈｚ，２Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ １６５．６２，１６５．５９，１５１．９７，１５１．８２，１５１．８０，１５１．７２，１５０．５８，１５０．４９，１４２．９８，１４２．８７，１３３．２５，１３３．２０，１３２．４９，１３２．４５，１２８．４８，１２８．４５，１２８．４４，１２５．７６，１２５．７４，１１８．１０，９１．５１，９１．４９，８９．９６，８５．８２，８５．７２，８５．４６，８２．８０，８２．７３，８２．６７，８１．７３，７４．３６，７４．３３，７４．２５，７４．２２，６８．６７，６８．０３，６７．９９，６３．４２，６３．３９，５９．８９，５７．７３，５４．８８，１８．８４，１８．７７．３１Ｐ ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ ６６．７８．１９Ｆ ＮＭＲ（３７６ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ －２１０．６４，－２１０．６７，－２１０．６８，－２１０．７２，－２１０．７８，－２１０．８１，－２１０．８２，－２１０．８５．Ｃ３８Ｈ３７ＦＮ１１Ｏ１０ＰＳ（Ｍ＋Ｎａ）の分子量：計算値９１２．２０６５、実測値９１２．２０７９。
２７ｂ １Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ １１．２７（ｄ，Ｊ＝１３．１Ｈｚ，２Ｈ），８．７７（ｄ，Ｊ＝５．５Ｈｚ，１Ｈ），８．６８（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，２Ｈ），８．０３（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，４Ｈ），７．６８－７．４９（ｍ，６Ｈ），６．４７（ｄｄ，Ｊ＝１６．９，３．５Ｈｚ，１Ｈ），６．２１（ｄ，Ｊ＝４．４Ｈｚ，１Ｈ），５．９３（ｄｔ，Ｊ＝５１．５，３．９Ｈｚ，１Ｈ），５．６２（ｄ，Ｊ＝５．３Ｈｚ，１Ｈ），５．５４－５．４３（ｍ，１Ｈ），５．３２（ｔ，Ｊ＝５．５Ｈｚ，１Ｈ），４．５５－４．４８（ｍ，２Ｈ），４．４８－４．３３（ｍ，２Ｈ），４．３１－４．１８（ｍ，４Ｈ），３．７８－３．５６（ｍ，２Ｈ），３．３９（ｓ，３Ｈ），２．９３（ｔ，Ｊ＝５．８Ｈｚ，２Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ １６５．６１，１６５．５９，１５１．９６，１５１．８３，１５１．８２，１５１．７１，１５０．５９，１５０．５１，１４３．００，１４２．９７，１３３．２５，１３３．２０，１３２．４９，１３２．４５，１２８．４８，１２８．４５，１２５．７９，１２５．７６，１１８．０３，９１．５３，９１．５１，９０．００，８９．９８，８５．９２，８５．７８，８５．５１，８２．７６，８２．７０，８２．６５，８２．６０，８１．７１，７４．１６，７４．１３，６８．６８，６８．１３，６８．０９，６３．４６，６３．４２，５９．８１，５７．７７，５４．８９，１８．７９，１８．７２．３１Ｐ ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ ６６．８８．１９Ｆ ＮＭＲ（３７６ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ －２１０．４５，－２１０．４８，－２１０．４９，－２１０．５３，－２１０．５８，－２１０．６２，－２１０．６３，－２１０．６６．Ｃ３８Ｈ３７ＦＮ１１Ｏ１０ＰＳ（Ｍ＋Ｎａ）の分子量：計算値９１２．２０６５、実測値９１２．２０５３。
化合物２８：化合物２７（２７ａ上部スポット：３４０ｍｇ、０．３８ｍｍｏｌ；２７ｂ下部スポット：３１２ｍｇ、０．３５ｍｍｏｌ）を１２ｍｌのメチルアミン（３３ｗｔ％無水エタノール溶液）に溶解し、室温で２時間攪拌した。反応混合物を濃縮し、ＣｏｍｂｉＦｌａｓｈ（登録商標）カラム（２４ｇ Ｇｏｌｄカラム、流量３５ｍｌ／分、酢酸エチル／ＭｅＯＨ（７０：３０）で８分間、酢酸エチル／ＭｅＯＨ（６０：４０）で５分間）によって精製して、２８ａ（２０５ｍｇ、８５％）及び２８ｂ（１８６ｍｇ、８５％）を得た。酢酸エチル／ＭｅＯＨ（２：１）では、２８ａ：Ｒｆ＝０．１６及び２８ｂ：Ｒｆ＝０．１３。
２８ａ １Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，重水）δ ８．３９（ｓ，１Ｈ），８．２３（ｓ，１Ｈ），８．１４（ｓ，１Ｈ），７．８３（ｓ，１Ｈ），６．１５（ｄ，Ｊ＝１６．１Ｈｚ，１Ｈ），６．００（ｄ，Ｊ＝３．６Ｈｚ，１Ｈ），５．４１（ｄｄ，１Ｈ），５．１４－５．０１（ｍ，１Ｈ），４．６１（ｔ，Ｊ＝５．１Ｈｚ，１Ｈ），４．４６－４．４０（ｍ，１Ｈ），４．４０－４．３２（ｍ，２Ｈ），４．２４－４．１９（ｍ，１Ｈ），４．１４（ｄ，Ｊ＝１３．１Ｈｚ，１Ｈ），４．１１－４．０５（ｍ，１Ｈ），３．９６（ｄｄ，Ｊ＝１３．２，３．６Ｈｚ，１Ｈ），３．４８（ｓ，３Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，ｄ２ｏ）δ １５４．９０，１５４．５０，１５２．６７，１５１．８１，１４７．５６，１４６．８３，１３８．８６，１３８．６９，１１８．３１，１１７．８６，９２．３６，９０．８６，８７．７０，８７．４４，８５．８９，８３．９７，８２．９０，８２．８２，８１．６３，８１．５６，７１．３１，７１．２７，７１．１９，７１．１５，６８．２３，６３．３４，６３．２９，５９．０１，５８．３３．３１Ｐ ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）δ ５７．２１．１９Ｆ ＮＭＲ（３７６ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）δ －２００．８３，－２００．８７，－２００．８９，－２００．９３，－２００．９６，－２０１．０１，－２０１．０３，－２０１．０７．Ｃ２１Ｈ２６ＦＮ１０Ｏ８ＰＳ（Ｍ＋Ｈ）の分子量：計算値６２９．１４５６、実測値６２９．１４４９。
２８ｂ １Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，重水）δ ８．２８（ｓ，２Ｈ），８．２２（ｓ，１Ｈ），８．１３（ｓ，１３Ｈ），７．８６（ｓ，１Ｈ），６．１４（ｄ，Ｊ＝１５．９Ｈｚ，１Ｈ），６．０６－５．９８（ｍ，１Ｈ），５．４６（ｄ，Ｊ＝５２．３Ｈｚ，１Ｈ），５．００（ｄｔｄ，Ｊ＝１８．９，９．１，４．１Ｈｚ，１Ｈ），４．６３（ｔ，Ｊ＝４．７Ｈｚ，１Ｈ），４．４１－４．３４（ｍ，２Ｈ），４．２８（ｓ，２Ｈ），４．１８（ｓ，１Ｈ），４．０７－４．０１（ｍ，１Ｈ），３．９４－３．８８（ｍ，１Ｈ），３．４８（ｓ，４Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，ｄ２ｏ）δ １５４．９７，１５４．６７，１５２．６７，１５１．９２，１４７．８２，１４７．１１，１３９．１６，１３８．５６，１１８．３８，１１７．９６，９２．１６，９０．６４，８７．３１，８７．０４，８５．６５，８３．５６，８３．１２，８３．０４，８２．１２，８２．０６，７０．３７，７０．３１，７０．２５，７０．１９，６８．２３，６４．８１，６４．８０，６４．７７，５９．２４，５８．２５．３１Ｐ ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）δ ５５．４０．１９Ｆ ＮＭＲ（３７６ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）δ －２０２．１９，－２０２．２３，－２０２．２４，－２０２．２８，－２０２．３２，－２０２．３７，－２０２．３８，－２０２．４２．Ｃ２１Ｈ２６ＦＮ１０Ｏ８ＰＳ（Ｍ＋Ｈ）の分子量：計算値６２９．１４５６、実測値６２９．１４５２。
Ｅ－１．キラル的に純粋な２’－ＯＭｅアデノシン－２’－Ｆウリジンホスホロチオエートジヌクレオチド（ＡＯＭｅｓＵＦ）（ａｓＵｆ）の合成
Figure 0007348185000028
化合物３１：化合物２９（１３．１ｇ、１４．７ｍｍｏｌ）及び化合物３０（５．６ｇ、１５．４ｍｍｏｌ、１．０５当量）を高真空下で乾燥させ、１１０ｍｌのジクロロメタン（乾燥）に溶解した。この溶液に、１１７ｍｌのＥＴＴ（３．８３ｇ、２９．４ｍｍｏｌ、２当量）を加え、そしてこの反応混合物を２時間撹拌した。ＰＡＤＳ（６．３５ｇ、２２．０５ｍｍｏｌ、１．５当量）及び２．５２ｍｌの２．６－ルチジン（２．３６ｇ、２２．０５ｍｍｏｌ、１．５当量）を加え、反応混合物を一晩攪拌した。反応混合物を１０００ｍｌのジクロロメタンで希釈し、Ｈ２Ｏ（４００ｍｌ）で２回洗浄した。有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濃縮した。ジアステレオマーをＣｏｍｂｉＦｌａｓｈ（登録商標）カラム（粗生成物３０ｇ、ＥｔＯＡｃ：ｎ－ヘキサン（１：１＋２．５％ＭｅＯＨ））で分離して、３１ａ（上部スポット：９．４４ｇ、５５％）及び３１ｂ（下部スポット：６．４１ｇ、３７％）を得た。ＥｔＯＡｃでは：ｎ－ヘキサン（１：１＋２．５％ＭｅＯＨ）、３１ａ Ｒｆ＝０．２３、３１ｂ Ｒｆ＝０．１９。
３１ａ １Ｈ ＮＭＲ ７７ａ（５００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ １１．４３（ｄ，Ｊ＝１．７Ｈｚ，１Ｈ），１１．２５（ｓ，１Ｈ），８．６０（ｄ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，２Ｈ），８．０４（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ），７．６７－７．６０（ｍ，２Ｈ），７．５７－７．５２（ｍ，２Ｈ），７．３９（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ），７．２９－７．２３（ｍ，６Ｈ），７．２３－７．１７（ｍ，１Ｈ），６．８４（ｄｄ，Ｊ＝８．９，２．５Ｈｚ，４Ｈ），６．１８（ｄ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，１Ｈ），５．９０－５．８４（ｍ，１Ｈ），５．６３（ｄｄ，Ｊ＝８．０，２．０Ｈｚ，１Ｈ），５．４１－５．３５（ｍ，１Ｈ），５．２２（ｄｄ，Ｊ＝５２．９，４．０Ｈｚ，１Ｈ），５．０７－５．０１（ｍ，１Ｈ），４．４９－４．４０（ｍ，２Ｈ），４．４０－４．３３（ｍ，１Ｈ），４．２７－４．１４（ｍ，３Ｈ），４．１１－４．０６（ｍ，１Ｈ），３．７２（ｓ，６Ｈ），３．３７（ｄｄ，Ｊ＝１０．７，４．６Ｈｚ，１Ｈ），３．３４（ｓ，４Ｈ），２．９２－２．８７（ｍ，２Ｈ），０．８５（ｓ，９Ｈ），０．１３－０．０７（ｍ，６Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ １６５．５８，１６３．０９，１５８．０９，１５１．９６，１５１．６１，１５０．６５，１５０．１２，１４４．５０，１４３．４７，１４１．２０，１３５．２６，１３５．２０，１３３．２０，１３２．４６，１２９．６８，１２９．６７，１２８．４６，１２８．４２，１２７．７５，１２７．６６，１２６．７２，１２５．９３，１１７．９３，１１３．１４，１０１．８９，９２．６３，９２．６１，９１．１３，９１．１０，８９．３５，８９．０９，８５．８７，８５．２４，８２．１９，８０．３２，８０．２３，７８．９６，７５．８７，６９．１８，６９．０５，６６．６３，６３．１５，６３．１１，６２．７３，５９．７０，５８．０８，５４．９８，２５．４５，１８．８６，１８．７９，１７．６２，－４．９７，－５．２８．３１Ｐ ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ ６８．１５．１９Ｆ ＮＭＲ（１６２ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ －２１４．７７，－２１４．９０，－２１５．０２，－２１５．１０，－２１５．２３，－２１５．３５．Ｃ５７Ｈ６４ＦＮ８Ｏ１３ＰＳＳｉ（Ｍ＋Ｈ）の分子量：計算値１１７９．３８８３、実測値１１７９．３９０４。
３１ｂ １Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ １１．４３（ｄ，Ｊ＝１．８Ｈｚ，２Ｈ），１１．２４（ｓ，１Ｈ），８．６０（ｄ，Ｊ＝１２．５Ｈｚ，２Ｈ），８．０３（ｄ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，２Ｈ），７．６７－７．５９（ｍ，２Ｈ），７．５７－７．５２（ｍ，２Ｈ），７．３８（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ），７．２７－７．２２（ｍ，６Ｈ），７．２２－７．１６（ｍ，１Ｈ），６．８６－６．８０（ｍ，４Ｈ），６．１６（ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，１Ｈ），５．８８（ｄ，Ｊ＝２０．９Ｈｚ，１Ｈ），５．６３（ｄｄ，Ｊ＝８．０，２．１Ｈｚ，１Ｈ），５．４３－５．３７（ｍ，１Ｈ），５．２２（ｄｄ，Ｊ＝５３．３，４．７Ｈｚ，１Ｈ），５．０８－５．０２（ｍ，１Ｈ），４．４６－４．３９（ｍ，１Ｈ），４．３９－４．３５（ｍ，１Ｈ），４．３３－４．２０（ｍ，４Ｈ），４．０８－４．０３（ｍ，１Ｈ），３．７１（ｓ，６Ｈ），３．４２－３．３７（ｍ，１Ｈ），３．３６（ｓ，３Ｈ），３．３１－３．２７（ｍ，１Ｈ），２．９５（ｔ，Ｊ＝５．８Ｈｚ，２Ｈ），０．８７（ｓ，９Ｈ），０．１２（ｓ，３Ｈ），０．１１（ｓ，３Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ １６５．５８，１６３．１０，１５８．０７，１５１．８７，１５１．５６，１５０．６４，１５０．１１，１４４．５２，１４３．７１，１４１．１９，１３５．２５，１３５．１９，１３３．２１，１３２．４５，１２９．６７，１２８．４６，１２８．４２，１２７．７１，１２７．６４，１２６．６７，１２６．００，１１８．０５，１１３．１０，１０１．８８，９２．６９，９１．２２，８９．４６，８９．１５，８５．８１，８５．５２，８２．２０，８０．２０，８０．１３，７８．９０，７５．７６，６８．９８，６８．８６，６６．１３，６３．４１，６２．５７，５８．１１，５４．９６，２５．４９，１８．８８，１８．８１，１７．６３，－４．９４，－５．２１．３１Ｐ ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ ６８．３６．１９Ｆ ＮＭＲ（３７６ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ －２０６．３９，－２０６．４４，－２０６．４９，－２０６．５３，－２０６．５８，－２０６．６４．Ｃ５７Ｈ６４ＦＮ８Ｏ１３ＰＳＳｉ（Ｍ＋Ｈ）の分子量：計算値１１７９．３８８３、実測値１１７９．３９０７。
化合物３２：化合物３１（３１ａ上部スポット：９．４４ｇ、８ｍｍｏｌ；３１ｂ下部スポット：６．４１ｇ、５．４ｍｍｏｌ）を乾燥ＴＨＦ（３１ａ：１６０ｍｌ；３１ｂ：９０ｍｌ）に溶解し、Ｅｔ３Ｎ ３ＨＦ（３１ａ：１５．６ｍｌ、９６ｍｍｏｌ、１２当量；３１ｂ：１０．６ｍｌ、６４．８ｍｍｏｌ、１２当量）を加えた。反応混合物を１４時間攪拌した。反応混合物を濃縮し、ＴＨＦで３回共蒸発させ、ＣｏｍｂｉＦｌａｓｈ（登録商標）カラム（３３０ｇ Ｇｏｌｄカラム、流量１５０ｍｌ／分、ＤＣＭからＤＣＭ中、５％ＭｅＯＨ）によって精製して、３２ａ（上部スポット：４．１３ｇ、４９％）及び３２ｂ（下部スポット：２．２３ｇ、３９％）を得た。ＤＣＭ中、５％ＭｅＯＨでは、３２ａ：Ｒｆ＝０．２６、３２ｂ：Ｒｆ＝１．１。
３２ａ １Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ １１．４７－１１．４０（ｍ，１Ｈ），１１．２７（ｓ，１Ｈ），８．６１（ｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，２Ｈ），８．０４（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ），７．６８－７．５８（ｍ，２Ｈ），７．５８－７．５１（ｍ，２Ｈ），７．４３－７．３６（ｍ，２Ｈ），７．２６（ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，６Ｈ），７．２３－７．１７（ｍ，１Ｈ），６．８５（ｄｄ，Ｊ＝８．８，２．１Ｈｚ，４Ｈ），６．１９（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，１Ｈ），５．９２－５．８０（ｍ，２Ｈ），５．６２（ｄｄ，Ｊ＝８．０，１．９Ｈｚ，１Ｈ），５．４３－５．３４（ｍ，１Ｈ），５．２３－５．００（ｍ，２Ｈ），４．５１－４．４０（ｍ，２Ｈ），４．３２－４．１３（ｍ，４Ｈ），４．１２－４．０４（ｍ，１Ｈ），３．７２（ｓ，６Ｈ），３．４１－３．３６（ｍ，１Ｈ），３．３４（ｓ，３Ｈ），３．３３－３．２８（ｍ，１Ｈ），２．９２（ｑ，Ｊ＝５．４Ｈｚ，２Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ １６５．６０，１６３．０５，１５８．０９，１５１．９１，１５１．６３，１５０．６６，１５０．１０，１４４．５２，１４３．６５，１４０．８７，１３５．２８，１３５．２０，１３３．２１，１３２．４７，１２９．７０，１２８．４８，１２８．４４，１２７．７７，１２７．６７，１２６．７３，１２５．９８，１２０．３５，１１８．０１，１１３．１５，１０１．８９，９３．５０，９２．０３，８８．９７，８８．６８，８５．８６，８５．３９，８２．２０，８２．１７，８０．２３，８０．１５，７８．９６，７８．９２，７５．８０，７５．７６，６８．０９，６７．９６，６７．３２，６７．２８，６３．１１，６３．０７，６２．６８，５８．０８，５４．９９，１８．８４，１８．７７．３１Ｐ ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ ６６．８８．１９Ｆ ＮＭＲ（３７６ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ －２０６．８３，－２０６．８８，－２０６．９４，－２０６．９７，－２０７．０２，－２０７．０８．Ｃ５１Ｈ５０ＦＮ８Ｏ１３ＰＳ（Ｍ＋Ｈ）の分子量：計算値１０６５．３０１８、実測値１０６５．３０２４。
３２ｂ １Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ １１．４５（ｄ，Ｊ＝１．７Ｈｚ，１Ｈ），１１．２７（ｓ，１Ｈ），８．６１（ｄ，Ｊ＝９．３Ｈｚ，２Ｈ），８．０４（ｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，２Ｈ），７．６８－７．５８（ｍ，２Ｈ），７．５８－７．５０（ｍ，２Ｈ），７．３９（ｄ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，２Ｈ），７．３１－７．１５（ｍ，７Ｈ），６．８４（ｄｄ，Ｊ＝８．９，２．９Ｈｚ，４Ｈ），６．１７（ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，１Ｈ），５．９５－５．８３（ｍ，２Ｈ），５．６２（ｄｄ，Ｊ＝８．１，２．１Ｈｚ，１Ｈ），５．４４－５．３６（ｍ，１Ｈ），５．２４－５．００（ｍ，２Ｈ），４．４３－４．３３（ｍ，２Ｈ），４．３１－４．１９（ｍ，４Ｈ），４．１１－３．９８（ｍ，１Ｈ），３．７１（ｓ，６Ｈ），３．４１－３．３７（ｍ，１Ｈ），３．３６（ｓ，３Ｈ），３．３３－３．２８（ｍ，１Ｈ），２．９６（ｔ，Ｊ＝５．８Ｈｚ，２Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ １６５．６１，１６３．０７，１５８．０８，１５２．０５，１５１．８９，１５１．７２，１５１．６１，１５０．６６，１５０．４４，１５０．１１，１４４．５４，１４３．７５，１４２．９２，１４０．８６，１３５．３０，１３５．２３，１３３．２７，１３３．２２，１３２．４８，１３２．４４，１２９．６９，１２８．４８，１２８．４４，１２７．７６，１２７．６７，１２６．７１，１２６．０２，１１８．１４，１１３．１４，１０１．９２，９３．５９，９２．０９，８９．０３，８８．７４，８６．２６，８５．８５，８５．５２，８２．５８，８２．２４，８２．２１，８０．１６，８０．０９，７８．９１，７８．８８，７５．７１，７５．６７，６８．６２，６７．９９，６７．８５，６６．９６，６６．９２，６３．３８，６３．３４，６２．６２，６１．１２，５８．１０，５７．５３，５４．９８，１８．８６，１８．７９．３１Ｐ ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ ６７．００．１９Ｆ ＮＭＲ（３７６ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ －２０６．４４，－２０６．５０，－２０６．５５，－２０６．５８，－２０６．６４，－２０６．６９．Ｃ５１Ｈ５０ＦＮ８Ｏ１３ＰＳ（Ｍ＋Ｈ）の分子量：計算値１０６５．３０１８、実測値１０６５．３０１４。
化合物３３：化合物３２（３２ａ上部スポット：１ｇ、０．９４ｍｍｏｌ；３２ｂ下部スポット：１ｇ、０．９４ｍｍｏｌ）を高真空下で一晩乾燥させ、乾燥酢酸エチル（３２ａ：１３ｍｌ；３２ｂ：１２ｍｌ）に溶解した。Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルアミン（３２ａ：４０９μｌ、３０４ｍｇ、２．３５ｍｍｏｌ、２．５当量；３２ｂ：４０９μｌ、３０４ｍｇ、２．３５ｍｍｏｌ、２．５当量）を激しく攪拌しながら滴下した。続いて、２－シアノエチルＮ，Ｎ－ジイソプロピルクロロホスホラミダイト（４ａ：４２４μｌ、４５０ｍｇ、１．９ｍｍｏｌ、２当量；３２ｂ：４２４μｌ、４５０ｍｇ、１．９ｍｍｏｌ、２当量）を（１分かけて）滴下し、そしてこの反応混合物を室温で１．５時間撹拌した。反応混合物を、２００ｍｌのＥＡで希釈し１００ｍｌのＮａＨＣＯ３及び１００ｍｌのブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、乾燥するまで濃縮した。粗生成物（白色の泡）を５ｍｌのＤＣＭに溶解し、１Ｌの冷ｎ－ヘキサン／ジエチルエーテル（１：１）によって沈殿させて、３３ａ（上部スポット：１．１３ｇ、９５％）及び３３ｂ（下部スポット：１．０８ｇ、９１％）を得た。
３３ａ １Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，アセトニトリル－ｄ３）δ ９．３５（ｓ，２Ｈ），８．５７（ｓ，１Ｈ），８．２６（ｓ，１Ｈ），８．０２（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ），７．６５（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，１Ｈ），７．５５（ｔ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，２Ｈ），７．５２－７．４６（ｍ，１Ｈ），７．４４（ｄ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，２Ｈ），７．３５－７．２６（ｍ，６Ｈ），７．２５－７．２０（ｍ，１Ｈ），６．８４（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，４Ｈ），６．１７－６．１２（ｍ，１Ｈ），５．８５（ｄｄ，Ｊ＝１９．６，４．９Ｈｚ，１Ｈ），５．６０（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），５．４９－５．４１（ｍ，１Ｈ），５．２６－５．１０（ｍ，１Ｈ），４．９５－４．８９（ｍ，１Ｈ），４．６２－４．５１（ｍ，１Ｈ），４．４９－４．１５（ｍ，６Ｈ），３．８９－３．７７（ｍ，２Ｈ），３．７６（ｓ，６Ｈ），３．７０－３．６１（ｍ，２Ｈ），３．５０－３．４５（ｍ，１Ｈ），３．４３（ｄ，Ｊ＝３．１Ｈｚ，３Ｈ），３．４２－３．３６（ｍ，１Ｈ），２．７９－２．７２（ｍ，２Ｈ），２．７０－２．６３（ｍ，２Ｈ），１．２１－１．１５（ｍ，１２Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，ｃｄ３ｃｎ）δ １６３．９４，１５９．８０，１５２．９８，１５１．２０，１５１．１６，１５１．１２，１４５．８２，１４５．８２，１４３．７８，１４３．７７，１４２．０２，１４１．８７，１３６．６７，１３４．９２，１３３．６８，１３１．１５，１３１．１２，１２９．７３，１２９．２５，１２９．１４，１２８．９３，１２８．０２，１２５．８９，１１９．６３，１１４．１６，１０３．１５，１０３．０７，９４．３４，９３．８０，９２．８４，９２．２７，９１．３８，９１．２８，９１．１０，９０．９９，８７．５５，８７．３６，８７．３３，８３．６２，８３．５９，８３．５５，８１．３２，８１．２９，８０．９６，８０．９１，８０．８９，８０．８４，７６．９８，７６．９５，７０．８７，７０．７７，７０．７５，７０．６２，６７．９５，６７．９１，６７．６５，６７．６０，６４．３３，６４．２９，６３．６４，５９．９６，５９．８１，５９．７７，５９．６２，５９．４２，５６．００，４４．３６，４４．３４，４４．２６，４４．２４，２５．１８，２５．１２，２５．０２，２４．９９，２４．９７，２４．９６，２４．９３，２４．９２，２１．１４，２１．０８，２１．０７，２１．０１，２０．２０，２０．１３．３１Ｐ ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ，ｃｄ３ｃｎ）δ １５２．０６，１５２．０３，６８．６６，６８．６４．１９Ｆ ＮＭＲ（３７６ＭＨｚ，ｃｄ３ｃｎ）δ －１９８．９０，－１９８．９３，－１９８．９５，－１９８．９８，－１９９．０１，－１９９．０３，－１９９．０４，－１９９．０７，－１９９．０９，－１９９．１２，－１９９．１５，－１９９．１７，－１９９．５５，－１９９．５７，－１９９．６０，－１９９．６２，－１９９．６５，－１９９．６７，－１９９．６９，－１９９．７１，－１９９．７４，－１９９．７６，－１９９．７９，－１９９．８１．Ｃ６０Ｈ６７ＦＮ１０Ｏ１４Ｐ２Ｓ（Ｍ＋Ｈ）の分子量：計算値１２６５．４０９６、実測値１２６５．４１０６。
３３ｂ １Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，アセトニトリル－ｄ３）δ ９．３６（ｓ，２Ｈ），８．５７（ｓ，１Ｈ），８．２５（ｓ，１Ｈ），８．０１（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ），７．６５（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，１Ｈ），７．５５（ｔ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，２Ｈ），７．４６－７．４０（ｍ，３Ｈ），７．３５－７．２５（ｍ，６Ｈ），７．２４－７．１９（ｍ，１Ｈ），６．８６－６．８０（ｍ，４Ｈ），６．１３－６．０９（ｍ，１Ｈ），５．８６－５．７７（ｍ，１Ｈ），５．６１－５．５８（ｍ，１Ｈ），５．４７－５．４２（ｍ，１Ｈ），５．２８－５．１３（ｍ，１Ｈ），４．９７－４．９２（ｍ，１Ｈ），４．６４－４．４８（ｍ，１Ｈ），４．４７－４．３９（ｍ，２Ｈ），４．３７－４．１７（ｍ，４Ｈ），３．９１－３．７７（ｍ，２Ｈ），３．７５（ｓ，６Ｈ），３．７２－３．６１（ｍ，２Ｈ），３．４９－３．４４（ｍ，１Ｈ），３．４３（ｓ，３Ｈ），３．４０－３．３５（ｍ，１Ｈ），２．８６－２．８０（ｍ，２Ｈ），２．７０－２．６４（ｍ，２Ｈ），１．２２－１．１７（ｍ，１２Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，ｃｄ３ｃｎ）δ １６３．９４，１５９．７８，１５９．７７，１５２．９９，１５１．２０，１５１．１６，１５１．１３，１４５．８６，１４３．８９，１４２．３４，１４２．１４，１３６．６６，１３４．９３，１３３．６７，１３１．１６，１３１．１２，１２９．７３，１２９．２５，１２９．１１，１２８．９３，１２７．９９，１１９．６１，１１８．６８，１１４．１６，１０３．１９，１０３．１２，９４．４２，９３．８６，９３．８４，９２．９３，９２．３６，９２．３４，９１．７７，９１．４９，８７．５３，８７．５２，８７．４３，８７．４１，８３．７３，８３．６９，８３．６５，８１．２６，８１．２３，８１．１２，８１．０９，８１．０５，８１．０２，８０．７５，８０．７０，８０．６７，８０．６３，７７．１５，７７．１２，７０．６３，７０．５８，７０．５０，７０．４５，７０．３８，７０．３２，６７．３４，６７．３１，６７．０６，６７．０３，６４．５２，６４．４８，６３．６６，６１．０４，６０．００，５９．８５，５９．７７，５９．６１，５９．３６，５５．９９，４４．３７，４４．３４，４４．２７，４４．２４，２５．２１，２５．１５，２５．０４，２５．０１，２４．９８，２４．９５，２４．９３，２１．２２，２１．１６，２１．１０，２１．０３，２０．２５，２０．１８．３１Ｐ ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ，ｃｄ３ｃｎ）δ １５１．９７，１５１．９４，６８．７５，６８．７１．１９Ｆ ＮＭＲ（３７６ＭＨｚ，ｃｄ３ｃｎ）δ －１９７．８９，－１９７．９４，－１９７．９７，－１９８．００，－１９８．０２，－１９８．０５，－１９８．０８，－１９８．１１，－１９８．１６，－１９８．３２，－１９８．３４，－１９８．３８，－１９８．４０，－１９８．４３，－１９８．４５，－１９８．４６，－１９８．４８，－１９８．５２，－１９８．５４，－１９８．５７，－１９８．５９．Ｃ６０Ｈ６７ＦＮ１０Ｏ１４Ｐ２Ｓ（Ｍ＋Ｈ）の分子量：計算値１２６５．４０９６、実測値１２６５．４０６５。
Ｅ－２．完全に脱保護されたキラル的に純粋なＡＯＭｅｓＵＦの合成
Figure 0007348185000029
化合物３４：化合物３４（３４ａ上部スポット：Ｒｆ＝０．１４、８００ｍｇ、１．０５ｍｍｏｌ；３４ｂ下部スポット：Ｒｆ＝０．０６、４００ｍｇ、０．５３ｍｍｏｌ）を、ＴＢＤＭＳ脱保護反応中に得た。ＥｔＯＡｃでは：ｎ－ヘキサン（１：１＋２．５％ＭｅＯＨ）。
化合物３５：化合物３４（３４ａ上部スポット：８００ｍｇ、１．０５ｍｍｏｌ；３４ｂ下部スポット：４００ｍｇ、０．５３ｍｍｏｌ）を１２ｍｌのメチルアミン（３３ｗｔ％無水エタノール溶液）に溶解し、室温で２時間撹拌した。反応混合物を濃縮し、ＣｏｍｂｉＦｌａｓｈ（登録商標）カラム（２４ｇ Ｇｏｌｄカラム、流量３５ｍｌ／分、酢酸エチル／ＭｅＯＨ（７０：３０）で８分間、酢酸エチル／ＭｅＯＨ（６０：４０）で５分間、及び酢酸エチル／ＭｅＯＨ（６０：４０）で１０分間）によって精製し、３５ａ（５０２ｍｇ、７９％）及び３５ｂ（２８２ｍｇ、８８％）を得た。酢酸エチル／ＭｅＯＨ（２：１）では、３５ａ Ｒｆ＝０．２５及び３５ｂ Ｒｆ＝０．１６。
３５ａ １Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，重水）δ ８．２２（ｓ，１Ｈ），８．０２（ｓ，１Ｈ），７．６８（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），６．０３（ｄ，Ｊ＝３．５Ｈｚ，１Ｈ），５．７６（ｄ，Ｊ＝１７．３Ｈｚ，１Ｈ），５．５０（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），５．０２－４．８５（ｍ，２Ｈ），４．４２（ｔ，Ｊ＝３．９Ｈｚ，１Ｈ），４．３６－４．３２（ｍ，１Ｈ），４．３１－４．１５（ｍ，３Ｈ），４．１０－４．０４（ｍ，１Ｈ），３．９２－３．７７（ｍ，２Ｈ），３．４７（ｓ，３Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，ｄ２ｏ）δ １６５．８８，１５５．５４，１５２．６５，１５０．９８，１４８．１８，１４１．０２，１４０．０８，１１９．１８，１０１．９５，９４．３１，９２．８３，８８．５９，８８．３１，８６．８５，８４．０３，８３．９９，８１．６２，８１．５９，８０．９８，８０．９０，７２．６２，７２．５８，６７．６１，６７．４８，６３．１７，６３．１２，６０．４２，５８．１６．３１Ｐ ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）δ ５７．８３．１９Ｆ ＮＭＲ（３７６ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）δ －２０３．４９，－２０３．５４，－２０３．５５，－２０３．６０，－２０３．６３，－２０３．６８，－２０３．６９，－２０３．７４．Ｃ２０Ｈ２５ＦＮ７Ｏ１０ＰＳ（Ｍ＋Ｈ）の分子量：計算値６０６．１１８４、実測値６０６．１１７１。
３５ｂ １Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，重水）δ ８．１９（ｓ，１Ｈ），８．０４（ｓ，１Ｈ），７．６７（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），５．９９（ｄ，Ｊ＝５．３Ｈｚ，１Ｈ），５．８３（ｄ，Ｊ＝１８．３Ｈｚ，１Ｈ），５．５７（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），５．０２（ｄｄ，Ｊ＝５２．４，４．２Ｈｚ，１Ｈ），４．９３－４．８７（ｍ，１Ｈ），４．４５（ｔ，Ｊ＝５．０Ｈｚ，１Ｈ），４．４１－４．３７（ｍ，１Ｈ），４．３６－４．２７（ｍ，１Ｈ），４．２５－４．０８（ｍ，３Ｈ），３．８４－３．７２（ｍ，２Ｈ），３．４０（ｓ，３Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，ｄ２ｏ）δ １６５．９０，１５５．６１，１５２．５９，１５１．０７，１４８．３５，１４１．６４，１４０．４４，１１９．２５，１０２．０５，９４．１９，９２．７２，８９．０６，８８．７８，８６．８４，８４．６６，８４．６３，８１．５５，８１．５１，８１．０８，８１．０１，７２．８３，７２．７８，６７．８３，６７．７０，６３．９１，６３．８７，６０．９５，５８．２１．３１Ｐ ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）δ ５６．６３．１９Ｆ ＮＭＲ（３７６ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）δ －２０２．８３，－２０２．８８，－２０２．９４，－２０２．９７，－２０３．０２，－２０３．０８．Ｃ２０Ｈ２５ＦＮ７Ｏ１０ＰＳ（Ｍ＋Ｈ）の分子量：計算値６０６．１１８４、実測値６０６．１１８３。
Ｆ－１．キラル的に純粋な２’－ＯＭｅアデノシン－２’－ＯＭｅアデノシンホスホロチオエートジヌクレオチド（ＡＯＭｅｓＡＯＭｅ）（ａｓａ）の合成
Figure 0007348185000030
化合物３８：化合物３６（ｌ３．０５ｇ、１４．７ｍｍｏｌ）及び化合物３７（７．７ｇ、１５．４ｍｍｏｌ、１．０５当量）を高真空下で乾燥させ、１１０ｍｌのジクロロメタン（乾燥）に溶解した。この溶液に、１１７ｍｌのＥＴＴ（３．８３ｇ、２９．４ｍｍｏｌ、２当量）を加え、そしてこの反応混合物を１．５時間撹拌した。ＰＡＤＳ（６．３５ｇ、２２．０５ｍｍｏｌ、１．５当量）及び２．５２ｍｌの２．６－ルチジン（２．３６ｇ、２２．０５ｍｍｏｌ、１．５当量）を加え、反応混合物を一晩撹拌した。反応混合物を１０００ｍｌのジクロロメタンで希釈し、４００ｍｌのＨ２Ｏで２回洗浄した。有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濃縮した。ジアステレオマーをＣｏｍｂｉＦｌａｓｈ（登録商標）カラム（粗生成物３０ｇ、ＥｔＯＡｃ：ｎ－ヘキサン（１：１＋２．５％ＭｅＯＨ））で分離して、３８ａ（上部スポット：１１．５５ｇ、６０％）及び３８ｂ（下部スポット：６．８１ｇ、３５％）を得た。ＥｔＯＡｃでは：ｎ－ヘキサン（１：１＋２．５％ＭｅＯＨ）、３８ａ Ｒｆ＝０．１６、３８ｂ Ｒｆ＝０．１１。
３８ａ １Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ １１．２４（ｓ，１Ｈ），１１．２３（ｓ，１Ｈ），８．７５（ｓ，１Ｈ），８．６９（ｓ，１Ｈ），８．６２（ｓ，１Ｈ），８．５７（ｓ，１Ｈ），８．０３（ｓ，４Ｈ），７．７０－７．５８（ｍ，２Ｈ），７．５９－７．４７（ｍ，４Ｈ），７．４４－７．３３（ｍ，２Ｈ），７．２９－７．２０（ｍ，７Ｈ），６．８８－６．８０（ｍ，４Ｈ），６．１９（ｓ，２Ｈ），５．４４－５．３０（ｍ，１Ｈ），５．０４（ｓ，１Ｈ），４．７２（ｓ，１Ｈ），４．６２（ｓ，１Ｈ），４．５４－４．４６（ｍ，１Ｈ），４．４３（ｓ，１Ｈ），４．３７－４．２８（ｍ，１Ｈ），４．２７－４．１０（ｍ，３Ｈ），３．７０（ｓ，６Ｈ），３．３４（ｓ，４Ｈ），３．３１（ｓ，４Ｈ），２．８９（ｓ，２Ｈ），０．９１（ｓ，９Ｈ），０．１５（ｓ，６Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ １６５．５９，１５８．０９，１５１．９３，１５１．８８，１５１．７３，１５１．５７，１５０．６４，１５０．５４，１４４．５１，１４３．６０，１４３．２１，１３５．２７，１３５．１９，１３３．２４，１３３．２１，１３２．４５，１３２．４１，１２９．６８，１２８．４７，１２８．４１，１２７．７５，１２７．６６，１２６．７１，１２５．９７，１２５．８９，１１７．９０，１１３．１３，８５．９９，８５．８７，８５．３６，８２．８５，８２．７８，８２．２０，８１．２２，７８．９３，７８．８９，７５．８５，７５．８１，７０．２２，６７．３９，６７．３５，６３．１２，６３．０９，６２．７２，５８．０７，５７．７５，５４．９７，２５．５８，１８．８３，１８．７６，１７．７４，－４．８４，－４．９７．３１Ｐ ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ ６８．１９．Ｃ６６Ｈ７２Ｎ１１Ｏ１３ＰＳＳｉ（Ｍ＋Ｎａ）の分子量：計算値１３４０．４４３６、実測値１３４０．４４５１。
３８ｂ １Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ １１．２４（ｓ，１Ｈ），１１．２２（ｓ，１Ｈ），８．７６（ｓ，１Ｈ），８．６９（ｓ，１Ｈ），８．６２（ｓ，１Ｈ），８．５８（ｓ，１Ｈ），８．０４（ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，４Ｈ），７．６７－７．６０（ｍ，２Ｈ），７．５７－７．５１（ｍ，４Ｈ），７．３８（ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，２Ｈ），７．２４（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，７Ｈ），６．８６－６．７７（ｍ，４Ｈ），６．２３－６．１８（ｍ，１Ｈ），６．１８－６．１４（ｍ，１Ｈ），５．４４－５．３３（ｍ，１Ｈ），５．０５（ｓ，１Ｈ），４．７７－４．７０（ｍ，１Ｈ），４．６２（ｓ，１Ｈ），４．４３－４．２８（ｍ，３Ｈ），４．２８－４．１６（ｍ，３Ｈ），３．６９（ｓ，６Ｈ），３．３５（ｓ，７Ｈ），３．３２（ｓ，１Ｈ），２．９４－２．８８（ｍ，２Ｈ），０．９１（ｓ，９Ｈ），０．１５（ｓ，６Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ １６５．５８，１５８．０６，１５１．８７，１５１．７４，１５１．５５，１５０．６５，１５０．５４，１４４．５２，１４３．７４，１４３．１７，１３５．２６，１３５．１９，１３３．２６，１３３．２２，１３２．４４，１３２．４０，１２９．６７，１２８．４６，１２８．４１，１２８．４０，１２７．７０，１２７．６４，１２６．６５，１２６．０２，１２５．８６，１１８．００，１１３．０９，８５．９６，８５．８２，８５．５４，８２．８０，８２．７３，８２．２４，８１．２１，７８．８９，７５．７５，７０．０８，６７．０４，６３．３６，６３．３２，６２．６０，５８．０９，５７．７６，５４．９４，２５．５９，１８．８２，１８．７５，１７．７４，－４．８４，－４．９５．３１Ｐ ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ ６８．３２．Ｃ６６Ｈ７２Ｎ１１Ｏ１３ＰＳＳｉ（Ｍ＋Ｎａ）の分子量：計算値１３４０．４４３６、実測値１３４０．４４２９。
化合物３９：化合物３８（３８ａ上部スポット：１０．５５ｇ、８ｍｍｏｌ；３８ｂ下部スポット：５．８１ｇ、４．４ｍｍｏｌ）を乾燥ＴＨＦ（３８ａ：１６０ｍｌ；３８ｂ：８０ｍｌ）に溶解し、Ｅｔ３Ｎ ３ＨＦ（３８ａ：１５．６ｍｌ、９６ｍｍｏｌ、１２当量；３８ｂ：８．６ｍｌ、５３ｍｍｏｌ、１２当量）を加えた。反応混合物を１４時間撹拌した。反応混合物を濃縮し、ＴＨＦで３回共蒸発させ、ＣｏｍｂｉＦｌａｓｈ（登録商標）カラム（３３０ｇ Ｇｏｌｄカラム、流量１５０ｍｌ／分、ＤＣＭからＤＣＭ中、５％ＭｅＯＨ）によって精製して、３９ａ（上部スポット：７．１８ｇ、７４．８％）及び３９ｂ（下部スポット：２．７４ｇ、５２％）を得た。ＤＣＭ中、５％ＭｅＯＨでは、３９ａ：Ｒｆ＝０．１７、３９ｂ：Ｒｆ＝０．１６。
３９ａ １Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ １１．２４（ｓ，１Ｈ），１１．２３（ｓ，１Ｈ），８．７５（ｓ，１Ｈ），８．６６（ｓ，１Ｈ），８．６３（ｓ，１Ｈ），８．５６（ｓ，１Ｈ），８．０８－８．００（ｍ，４Ｈ），７．６８－７．５９（ｍ，２Ｈ），７．５８－７．４９（ｍ，４Ｈ），７．４２－７．３６（ｍ，２Ｈ），７．２６（ｄｄ，Ｊ＝８．１，５．２Ｈｚ，６Ｈ），７．２２－７．１５（ｍ，１Ｈ），６．８４（ｄｄ，Ｊ＝８．９，２．９Ｈｚ，４Ｈ），６．２５－６．１６（ｍ，２Ｈ），５．６１－５．５６（ｍ，１Ｈ），５．４２－５．３５（ｍ，１Ｈ），５．１０－５．０１（ｍ，１Ｈ），４．５５－４．４０（ｍ，４Ｈ），４．３９－４．２９（ｍ，１Ｈ），４．２７－４．１１（ｍ，３Ｈ），３．７１（ｓ，６Ｈ），３．３７（ｓ，４Ｈ），３．３３（ｓ，１Ｈ），３．３１（ｓ，３Ｈ），２．９４－２．８７（ｍ，２Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ １６５．６１，１６５．５９，１５８．０９，１５１．９６，１５１．８８，１５１．８１，１５１．５７，１５０．６４，１５０．５０，１４４．５３，１４３．８２，１４２．８７，１３５．２９，１３５．２１，１３３．２４，１３３．２１，１３２．４６，１３２．４１，１２９．７０，１２８．４７，１２８．４３，１２８．４１，１２７．７６，１２７．６７，１２６．７１，１２６．０４，１２５．７５，１１７．９９，１１３．１４，８５．８６，８５．５１，８２．７３，８２．６６，８２．２２，８１．７９，７８．８４，７５．８２，６８．７６，６７．８３，６３．０８，６３．０５，６２．６７，５８．０７，５７．７３，５４．９８，１８．８１，１８．７４．３１Ｐ ＮＭＲ（１６２ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ ６８．１８．Ｃ６０Ｈ５８Ｎ１１Ｏ１３ＰＳ（Ｍ＋Ｎａ）の分子量：計算値１２２６．３５７２、実測値１２２６．３５７２。
３９ｂ １Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ １１．２５（ｓ，１Ｈ），１１．２２（ｓ，１Ｈ），８．７６（ｓ，１Ｈ），８．６６（ｓ，１Ｈ），８．６２（ｓ，１Ｈ），８．５８（ｓ，１Ｈ），８．０７－８．００（ｍ，４Ｈ），７．６８－７．５９（ｍ，２Ｈ），７．５９－７．４９（ｍ，４Ｈ），７．４２－７．３５（ｍ，２Ｈ），７．３０－７．２１（ｍ，６Ｈ），７．２１－７．１４（ｍ，１Ｈ），６．８３（ｄｄ，Ｊ＝８．９，２．９Ｈｚ，４Ｈ），６．２１（ｄ，Ｊ＝４．６Ｈｚ，１Ｈ），６．１７（ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，１Ｈ），５．６０（ｄ，Ｊ＝５．３Ｈｚ，１Ｈ），５．４６－５．３２（ｍ，１Ｈ），５．１３－４．９８（ｍ，１Ｈ），４．６０－４．４６（ｍ，２Ｈ），４．４６－４．３９（ｍ，１Ｈ），４．３９－４．３１（ｍ，２Ｈ），４．３１－４．１４（ｍ，３Ｈ），３．７０（ｓ，６Ｈ），３．３９（ｓ，３Ｈ），３．３６（ｓ，３Ｈ），３．３４－３．２７（ｍ，２Ｈ），２．９２（ｔ，Ｊ＝５．８Ｈｚ，２Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ １６５．６０，１５８．０６，１５１．９５，１５１．８６，１５１．８１，１５１．５７，１５０．６５，１５０．５１，１４４．５４，１４３．８２，１４２．９１，１３５．２９，１３５．２２，１３３．２６，１３３．２２，１３２．４６，１３２．４１，１２９．６９，１２８．４７，１２８．４３，１２８．４０，１２７．７４，１２７．６６，１２６．６７，１２６．０５，１２５．７７，１１８．０７，１１３．１２，８５．９４，８５．９３，８５．８４，８５．６０，８５．５９，８２．７５，８２．６９，８２．２０，８１．７３，７８．８３，７５．６２，６８．６９，６７．７４，６３．３０，６３．２６，６２．５７，５８．０８，５７．７５，５４．９６，１８．７９，１８．７２．３１Ｐ ＮＭＲ（１６２ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ ６８．２７．Ｃ６０Ｈ５８Ｎ１１Ｏ１３ＰＳ（Ｍ＋Ｎａ）の分子量：計算値１２２６．３５７２、実測値１２２６．３５６２。
化合物４０：化合物３９（３９ａ上部スポット：５００ｍｇ、０．４２ｍｍｏｌ；３９ｂ下部スポット：５００ｇ、０．４２ｍｍｏｌ）を高真空下で一晩乾燥させ、乾燥ＤＣＭ（３９ａ：５ｍｌ、３９ｂ：５ｍｌ）に溶解した。Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルアミン（３９ａ：１．１ｍｌ、８１４ｍｇ、６．５ｍｍｏｌ、２．５当量；３９ｂ：１．５ｍｌ、１．１ｇ、８．４ｍｍｏｌ、２０当量）を激しく攪拌しながら滴下した。続いて、２－シアノエチルＮ，Ｎ－ジイソプロピルクロロホスホラミダイト（３９ａ：１．１ｍｌ、１．２ｇ、５．２ｍｍｏｌ、１２．５当量；３９ｂ：１．５ｍｌ、１．６ｇ、６．８ｍｍｏｌ、１６当量）を（１分かけて）滴下し、そしてこの反応混合物を室温で１．５時間撹拌した。反応混合物を２００ｍｌのＤＣＭで希釈し、１００ｍｌのＮａＨＣＯ３及び１００ｍｌのブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、乾燥するまで濃縮した。粗生成物（白い泡）を５ｍｌのＤＣＭに溶解し、ＣｏｍｂｉＦｌａｓｈ（登録商標）カラム（ＤＣＭからＤＣＭ中、５％ＭｅＯＨ）によって精製して、４０ａ（上部スポット：３７１ｍｇ、６３％）及び４０ｂ（下部スポット：３２４ｍｇ、５５％）を得た。
４０ａ １Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，アセトニトリル－ｄ３）δ ９．３５（ｓ，２Ｈ），８．６３（ｓ，１Ｈ），８．４７（ｓ，１Ｈ），８．３９－８．３３（ｍ，１Ｈ），８．２６（ｓ，１Ｈ），８．００－７．９７（ｍ，４Ｈ），７．６６－７．６１（ｍ，１Ｈ），７．６１－７．５５（ｍ，１Ｈ），７．５５－７．５１（ｍ，２Ｈ），７．５０－７．４６（ｍ，２Ｈ），７．４４－７．４０（ｍ，２Ｈ），７．３１－７．２８（ｍ，４Ｈ），７．２８－７．２４（ｍ，２Ｈ），７．２１－７．１７（ｍ，１Ｈ），６．８３－６．８０（ｍ，４Ｈ），６．１８－６．１４（ｍ，１Ｈ），６．１２－６．０９（ｍ，１Ｈ），５．４４－５．３８（ｍ，１Ｈ），４．８７－４．８２（ｍ，１Ｈ），４．８２－４．７５（ｍ，１Ｈ），４．６２－４．５４（ｍ，１Ｈ），４．５３－４．４３（ｍ，２Ｈ），４．４１－４．３７（ｍ，２Ｈ），４．２０－４．１１（ｍ，２Ｈ），３．９４－３．８０（ｍ，２Ｈ），３．７３（ｓ，６Ｈ），３．７１－３．６４（ｍ，２Ｈ），３．４７（ｓ，２Ｈ），３．４３－３．４０（ｍ，２Ｈ），３．３６（ｓ，４Ｈ），２．７５－２．６７（ｍ，４Ｈ），１．２４－１．１９（ｍ，１２Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，ＣＤ３ＣＮ）δ １５９．７８，１５２．８９，１５１．１３，１５１．１０，１４５．８７，１４４．０８，１４３．５２，１４３．４０，１３６．６８，１３４．９４，１３３．６６，１３３．５９，１３１．１５，１３１．１２，１２９．７２，１２９．６８，１２９．２６，１２９．２３，１２９．１２，１２８．９１，１２７．９８，１２５．９９，１２５．８６，１１４．１５，８８．４６，８８．０４，８７．５０，８７．４４，８３．５４，８３．１８，８３．０１，８１．１６，７６．９６，７２．３８，７１．７７，７１．７６，６８．８１，６８．５６，６４．２６，６３．６１，６０．０４，５９．８９，５９．３９，５９．２２，５８．９７，５６．００，４４．３６，４４．２９，４４．１９，２５．１９，２５．１４，２５．００，２１．１３，２１．０８，２０．１５，２０．０８．３１Ｐ ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ，ＣＤ３ＣＮ）δ １５２．０７，１５１．３５，６８．７９，６８．７５．Ｃ６９Ｈ７５Ｎ１３Ｏ１４Ｐ２Ｓ（Ｍ＋Ｈ）の分子量：計算値１４０４．４８３１、実測値１４０４．４８２８。
４０ｂ １Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，アセトニトリル－ｄ３）δ ９．２９（ｓ，１Ｈ），８．６５（ｄ，Ｊ＝１．７Ｈｚ，１Ｈ），８．４９（ｓ，１Ｈ），８．３２－８．２７（ｍ，１Ｈ），８．２７－８．２３（ｍ，１Ｈ），７．９８（ｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，２Ｈ），７．９３（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ），７．６４（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，１Ｈ），７．６０－７．５１（ｍ，３Ｈ），７．４６（ｔ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，２Ｈ），７．４３－７．３８（ｍ，２Ｈ），７．３２－７．２７（ｍ，４Ｈ），７．２４（ｔ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，２Ｈ），７．１８（ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，１Ｈ），６．８０（ｄｄ，Ｊ＝８．９，２．４Ｈｚ，４Ｈ），６．１７－６．１２（ｍ，１Ｈ），６．０５－６．００（ｍ，１Ｈ），５．４０－５．３４（ｍ，１Ｈ），４．９５－４．８２（ｍ，２Ｈ），４．６０（ｄｔ，Ｊ＝２５．６，４．５Ｈｚ，１Ｈ），４．４６－４．３７（ｍ，２Ｈ），４．３７－４．３０（ｍ，２Ｈ），４．３０－４．２１（ｍ，３Ｈ），３．９４－３．７９（ｍ，２Ｈ），３．７２（ｓ，７Ｈ），３．５０（ｓ，２Ｈ），３．４５（ｓ，１Ｈ），３．３９－３．３６（ｍ，３Ｈ），３．３６－３．３２（ｍ，１Ｈ），３．３０－３．２４（ｍ，１Ｈ），２．７９（ｑ，Ｊ＝６．１Ｈｚ，２Ｈ），２．７３－２．６６（ｍ，２Ｈ），１．２６－１．１９（ｍ，１２Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，ＣＤ３ＣＮ）δ １５９．７４，１５２．８９，１５１．１２，１４５．９０，１４４．２２，１４４．１７，１４３．５４，１４３．４０，１３６．６８，１３４．９５，１３３．６７，１３３．５６，１３１．１５，１３１．１０，１２９．７４，１２９．６５，１２９．２０，１２９．０９，１２８．９０，１２７．９４，１２６．０３，１２６．０１，１２５．８１，１２５．７４，１１９．７０，１１４．１３，８８．６０，８８．５８，８８．１３，８７．４８，８３．６２，８３．１１，８２．８０，８２．６９，８１．００，７７．１１，７２．１９，７２．０６，７１．７０，７１．５６，６８．１２，６８．１０，６４．４２，６４．３９，６３．６１，６０．０５，５９．９０，５９．５３，５９．３０，５９．０６，５５．９８，４４．３５，４４．３０，４４．２５，４４．２０，２５．２１，２５．１５，２５．１２，２５．０７，２５．０１，２１．２３，２１．１６，２１．１０，２０．１９，２０．１２．３１Ｐ ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ，ＣＤ３ＣＮ）δ １５１．８５，１５１．２９，６８．８４，６８．７５．Ｃ６９Ｈ７５Ｎ１３Ｏ１４Ｐ２Ｓ（Ｍ＋Ｈ）の分子量：計算値１４０４．４８３１、実測値１４０４．４８１３。
Ｆ－２．完全に脱保護されたキラル的に純粋なＡＯＭｅｓＡＯＭｅ（ａｓａ）の合成
Figure 0007348185000031
化合物４１：化合物４１（４１ａ上部スポット：１．９４ｇ、２．２ｍｍｏｌ；４１ｂ下部スポット：８４０ｍｇ、０．９３ｍｍｏｌ）を、ＴＢＤＭＳ脱保護反応中に得た。ＤＣＭ中、５％ＭｅＯＨでは、４１ａ Ｒｆ＝０．１２及び４１ｂ Ｒｆ＝０．１１。
４１ａ １Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ １１．２５（ｓ，１Ｈ），１１．２３（ｓ，１Ｈ），８．７８（ｓ，１Ｈ），８．７６（ｓ，１Ｈ），８．７３（ｓ，１Ｈ），８．６８（ｓ，１Ｈ），８．０４（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，４Ｈ），７．７１－７．５９（ｍ，２Ｈ），７．５９－７．４７（ｍ，４Ｈ），６．２５－６．１８（ｍ，２Ｈ），５．６０（ｄ，Ｊ＝４．９Ｈｚ，１Ｈ），５．４２（ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，１Ｈ），５．２９（ｄｄ，Ｊ＝１０．９，４．８Ｈｚ，１Ｈ），４．８８－４．８０（ｍ，１Ｈ），４．５７－４．４５（ｍ，３Ｈ），４．４２－４．３１（ｍ，２Ｈ），４．３０－４．２０（ｍ，３Ｈ），３．７１－３．６１（ｍ，２Ｈ），３．３８（ｓ，３Ｈ），３．３３（ｓ，３Ｈ），２．９８（ｔ，Ｊ＝５．９Ｈｚ，２Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ １６５．６２，１５２．１１，１５１．９９，１５１．８３，１５０．６３，１５０．５１，１４２．９４，１３３．２５，１３３．２２，１３２．４７，１３２．４３，１２８．４８，１２８．４４，１２８．４２，１２５．８０，１２５．７５，１１８．１７，８５．８８，８５．０６，８４．７１，８２．８４，８２．７７，８１．７５，８０．５２，８０．４９，７６．４２，７６．３９，６８．７３，６７．９１，６７．８６，６３．１８，６３．１５，６０．８６，５８．０３，５７．７３，５４．８８，１８．８４，１８．７７．３１Ｐ ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ ６７．９４．Ｃ３９Ｈ４０Ｎ１１Ｏ１１ＰＳ（Ｍ＋Ｎａ）の分子量：計算値９２４．２２６６、実測値９０１．４。
４１ｂ １Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ １１．２５（ｓ，１Ｈ），１１．２２（ｓ，１Ｈ），８．７８（ｓ，１Ｈ），８．７６（ｓ，１Ｈ），８．７５（ｓ，１Ｈ），８．６８（ｓ，１Ｈ），８．０４（ｄｄ，Ｊ＝５．８，３．９Ｈｚ，４Ｈ），７．６９－７．５９（ｍ，２Ｈ），７．５９－７．４９（ｍ，４Ｈ），６．２２（ｄ，Ｊ＝４．０Ｈｚ，１Ｈ），６．１８（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，１Ｈ），５．６１（ｄ，Ｊ＝４．９Ｈｚ，１Ｈ），５．４２（ｔ，Ｊ＝５．７Ｈｚ，１Ｈ），５．２９（ｄｄｄ，Ｊ＝１０．９，４．８，１．９Ｈｚ，１Ｈ），４．９１－４．７６（ｍ，１Ｈ），４．５９－４．４８（ｍ，２Ｈ），４．４７－４．３４（ｍ，２Ｈ），４．３４－４．２９（ｍ，１Ｈ），４．２９－４．２１（ｍ，３Ｈ），３．７７－３．５６（ｍ，２Ｈ），３．４１（ｓ，３Ｈ），３．３７（ｓ，３Ｈ），２．９６（ｔ，Ｊ＝５．９Ｈｚ，２Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ １６５．６１，１５２．１１，１５１．９６，１５１．８３，１５０．６３，１５０．５１，１４２．９９，１４２．９３，１３３．２６，１３３．２２，１３２．４７，１３２．４２，１２８．４７，１２８．４４，１２８．４１，１２５．８０，１２５．７６，１１８．１３，８５．９５，８５．０９，８４．６８，８２．７６，８２．６９，８１．７０，８０．４９，７６．３２，６８．７０，６７．８５，６７．８２，６３．２８，６３．２５，６０．８１，５８．０６，５７．７８，１８．８０，１８．７３．３１Ｐ ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ ６８．０５．Ｃ３９Ｈ４０Ｎ１１Ｏ１１ＰＳ（Ｍ＋Ｎａ）の分子量：計算値９２４．２２６６、実測値９２４．２２６８。
化合物４２：化合物４１（４１ａ上部スポット：１．９ｍｇ、２ｍｍｏｌ；４１ｂ下部スポット：８４０ｍｇ、０．９ｍｍｏｌ）を１２ｍｌのメチルアミン（３３ｗｔ％無水エタノール溶液）に溶解し、室温で４時間撹拌した。反応混合物を濃縮し、ＣｏｍｂｉＦｌａｓｈ（登録商標）カラム（２４ｇ Ｇｏｌｄカラム、流量３５ｍｌ／分、酢酸エチル／ＭｅＯＨ（７０：３０）で８分間、酢酸エチル／ＭｅＯＨ（６０：４０）で５分間）によって精製して、４２ａ（１．２ｇ、９９％）及び４２ｂ（２１０ｍｇ、３７％）を得た。酢酸エチル／ＭｅＯＨ（２：１）では、４２ａ：Ｒｆ＝０．１３及び４２ｂ：Ｒｆ＝０．１。
４２ａ １Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，重水）δ ８．４１（ｓ，１Ｈ），８．２２（ｓ，１Ｈ），８．１１（ｓ，１Ｈ），７．９２（ｓ，１Ｈ），６．０４（ｄ，Ｊ＝４．４Ｈｚ，１Ｈ），５．９９（ｄ，Ｊ＝３．９Ｈｚ，１Ｈ），５．０５－４．９９（ｍ，１Ｈ），４．６３（ｔ，Ｊ＝５．０Ｈｚ，１Ｈ），４．４２－４．３５（ｍ，３Ｈ），４．３１－４．１９（ｍ，３Ｈ），３．９８－３．８５（ｍ，２Ｈ），３．５２（ｓ，３Ｈ），３．４９（ｓ，３Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）δ １５７．７５，１５７．５０，１５５．３１，１５４．７６，１５０．７８，１５０．３４，１４２．４４，１４１．８９，１２１．２９，１２０．８５，８９．３１，８８．４２，８６．３９，８６．２０，８６．０１，８４．０２，７５．２３，７１．３７，６７．００，６３．０１，６０．９８，６０．４７．３１Ｐ ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）δ ５７．５１．Ｃ２２Ｈ２９Ｎ１０Ｏ９ＰＳ（Ｍ＋Ｈ）の分子量：計算値６４１．１６５６、実測値６４１．１６６８。
４２ｂ １Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，重水）δ ８．３８（ｓ，１Ｈ），８．２０（ｓ，１Ｈ），８．１０（ｓ，１Ｈ），７．９７（ｓ，１Ｈ），６．０８（ｄ，Ｊ＝４．６Ｈｚ，１Ｈ），５．９１（ｄ，Ｊ＝５．４Ｈｚ，１Ｈ），５．０４－４．９８（ｍ，１Ｈ），４．６７（ｔ，Ｊ＝４．７Ｈｚ，１Ｈ），４．４３（ｔ，Ｊ＝５．０Ｈｚ，１Ｈ），４．４１－４．３７（ｍ，２Ｈ），４．３７－４．３３（ｍ，１Ｈ），４．２６－４．２０（ｍ，２Ｈ），３．８３－３．７４（ｍ，２Ｈ），３．５０（ｓ，３Ｈ），３．４６（ｓ，３Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）δ １５７．７４，１５５．２２，１５４．７４，１５１．１１，１５０．５５，１４２．８５，１４１．９６，１２１．４８，１２０．９７，８９．２４，８８．１９，８６．９９，８６．２６，８６．１８，８５．７４，８３．９２，７５．４２，７１．５０，６７．８７，６３．５１，６０．９１，６０．５４．３１Ｐ ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）δ ５６．２７．Ｃ２２Ｈ２９Ｎ１０Ｏ９ＰＳ（Ｍ＋Ｈ）の分子量：計算値６４１．１６５６、実測値６４１．１６５５。
Ｇ－１．キラル的に純粋な２’－ＯＭｅグアノシン－２’－ＯＭｅアデノシンホスホロチオエートジヌクレオチド（ＧＯＭｅｓＡＯＭｅ）（ｇｓａ）の合成
Figure 0007348185000032
化合物４５：化合物４３（１３．１ｇ、１４．７ｍｍｏｌ）及び化合物４４（５．６ｇ、１５．４ｍｍｏｌ、１．０５当量）を高真空下で乾燥させ、１１０ｍｌのジクロロメタン（乾燥）に溶解した。この溶液に、１１７ｍｌのＥＴＴ（３．８３ｇ、２９．４ｍｍｏｌ、２当量）を加え、そしてこの反応混合物を２時間撹拌した。ＰＡＤＳ（６．３５ｇ、２２．０５ｍｍｏｌ、１．５当量）及び２．５２ｍｌの２．６－ルチジン（２．３６ｇ、２２．０５ｍｍｏｌ、１．５当量）を加え、そしてこの反応混合物を一晩撹拌した。反応混合物を１０００ｍｌのジクロロメタンで希釈し、４００ｍｌのＨ２Ｏで２回洗浄した。有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濃縮した。粗生成物をＣｏｍｂｉＦｌａｓｈ（登録商標）カラム（粗生成物３０ｇ、ＥｔＯＡｃ：ｎ－ヘキサン（１：１＋２．５％ＭｅＯＨ）によって精製して４５（１６．５ｇ、８６％）を得た。ＥｔＯＡｃでは：ｎ－ヘキサン（１：１＋２．５％ＭｅＯＨ）、４５ Ｒｆ＝０．１３。
４５ １Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ １２．０５（ｓ，１Ｈ），１１．５５（ｓ，１Ｈ），１１．２１（ｄ，Ｊ＝１０．６Ｈｚ，１Ｈ），８．７４（ｄ，Ｊ＝１３．１Ｈｚ，１Ｈ），８．６７（ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，１Ｈ），８．１２（ｄ，Ｊ＝３．０Ｈｚ，１Ｈ），８．０３（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ），７．６４（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，１Ｈ），７．５４（ｔ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，２Ｈ），７．３４（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ），７．２８－７．１７（ｍ，７Ｈ），６．８６－６．７９（ｍ，４Ｈ），６．１８（ｔ，Ｊ＝５．５Ｈｚ，１Ｈ），５．８９（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ），５．２２－５．１２（ｍ，１Ｈ），４．７８－４．６６（ｍ，２Ｈ），４．６２－４．５４（ｍ，１Ｈ），４．４９－４．２４（ｍ，３Ｈ），４．１７（ｄｑ，Ｊ＝１３．４，８．０，７．１Ｈｚ，３Ｈ），３．７２－３．６９（ｍ，６Ｈ），３．３６－３．３４（ｍ，４Ｈ），３．３１（ｓ，３Ｈ），３．２６－３．１８（ｍ，１Ｈ），２．９３－２．８３（ｍ，２Ｈ），２．７５－２．６４（ｍ，１Ｈ），１．１３－１．０５（ｍ，６Ｈ），０．９３－０．８３（ｍ，９Ｈ），０．１２（ｓ，６Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ １７９．９６，１６５．５５，１５８．１０，１５４．６５，１５１．８２，１５１．７７，１５１．６９，１５０．５３，１４８．９８，１４８．９４，１４８．３６，１４４．３７，１４３．２１，１３７．００，１３６．８９，１３５．０９，１３３．２１，１３２．４４，１２９．６９，１２９．６３，１２８．４４，１２８．４０，１２７．７７，１２７．６５，１２６．７６，１２６．７２，１２５．８７，１２０．２９，１２０．２７，１１８．０１，１１７．９８，１１３．１２，８６．１２，８６．０２，８５．９３，８３．７３，８３．４９，８２．７５，８２．４６，８２．４５，８１．２０，７９．５２，７６．１３，７０．２１，７０．０１，６７．８０，６７．２０，６３．３４，６３．１９，６３．０３，５９．６９，５８．１６，５８．１０，５７．７５，５４．９６，５４．９４，３４．７６，２５．５６，２５．５４，１８．７５，１８．７０，１７．７０，－４．８４，－４．９７，－５．０３．３１Ｐ ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ ６８．６０，６８．３３．Ｃ６３Ｈ７４Ｎ１１Ｏ１４ＰＳＳｉ（Ｍ＋Ｈ）の分子量：計算値１３００．４７２３、実測値１３００．４７１２。
化合物４６：化合物４５（１６ｇ、１２．３ｍｍｏｌ）を乾燥ＴＨＦ（１４０ｍｌ）に溶解し、Ｅｔ３Ｎ ３ＨＦ（１５．１ｍｌ、９２．４ｍｍｏｌ、７．５当量）を加えた。反応混合物を１４時間攪拌した。反応混合物を濃縮し、ＴＨＦで３回共蒸発させ、ＣｏｍｂｉＦｌａｓｈ（登録商標）カラム（ＤＣＭからＤＣＭ中、５％ＭｅＯＨ）によって精製して４６（１３．１ｇ、９０％）を得た。ジアステレオマーは分離されなかった。ジアステレオマーをＧｉｌｓｏｎ ＲＰ－カラム（緩衝液Ａ：５０ｍＭ ＴＥＡＡ、緩衝液Ｂ：２０％Ａ、８０％ＡＣＮ；３０分かけて勾配６０から９０％Ｂ；５０ｍｌ／分）で分離した。
４６ａ １Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ １２．０６（ｓ，１Ｈ），１１．５８（ｓ，１Ｈ），１１．２０（ｓ，１Ｈ），８．７４（ｓ，１Ｈ），８．６４（ｓ，１Ｈ），８．１１（ｓ，１Ｈ），８．０２（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ），７．６３（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，１Ｈ），７．５３（ｔ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，２Ｈ），７．３４（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ），７．２８－７．１６（ｍ，８Ｈ），６．８６－６．８０（ｍ，４Ｈ），６．１９（ｄ，Ｊ＝４．６Ｈｚ，１Ｈ），５．８９（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ），５．５８（ｄ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，１Ｈ），５．１８（ｄｄ，Ｊ＝１０．０，４．４Ｈｚ，１Ｈ），４．７６－４．６９（ｍ，１Ｈ），４．５２－４．４３（ｍ，２Ｈ），４．３５－４．２６（ｍ，３Ｈ），４．２２－４．１４（ｍ，３Ｈ），３．７０（ｓ，６Ｈ），３．３８（ｓ，３Ｈ），３．３５（ｓ，３Ｈ），３．３４－３．３２（ｍ，１Ｈ），３．２４（ｄｄ，Ｊ＝１０．５，４．１Ｈｚ，１Ｈ），２．８８（ｔ，Ｊ＝５．８Ｈｚ，２Ｈ），２．７４－２．６６（ｍ，１Ｈ），１．１０（ｓ，３Ｈ），１．０９（ｓ，３Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ １８０．０１，１６５．５８，１５８．１２，１５８．１０，１５４．６８，１５１．９１，１５１．８１，１５０．５３，１４９．００，１４８．４１，１４４．４２，１４２．９４，１３６．９３，１３５．１４，１３５．１３，１３３．２４，１３２．４５，１２９．７２，１２９．６７，１２８．４７，１２８．４１，１２７．８０，１２７．６８，１２６．７６，１２５．７８，１２０．２７，１１８．０９，１１３．１５，８５．９９，８５．９７，８３．６４，８２．６９，８２．６２，８２．５５，８１．７２，７９．６７，７９．６３，７５．９７，７５．９４，６８．７０，６７．９０，６７．８７，６３．３２，６３．２８，６３．１４，５８．１４，５７．７８，５４．９８，５４．９６，３４．７８，１８．７７，１８．７１．３１Ｐ ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ ６７．２７．Ｃ５７Ｈ６０Ｎ１１Ｏ１４ＰＳ（Ｍ＋Ｈ）の分子量：計算値１１８６．３８５８、実測値１１８６．３８９３。
４６ｂ １Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ １２．０４（ｓ，１Ｈ），１１．５４（ｓ，１Ｈ），１１．１９（ｓ，１Ｈ），８．７２（ｓ，１Ｈ），８．６２（ｓ，１Ｈ），８．１０（ｓ，１Ｈ），８．０３（ｄ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，２Ｈ），７．６３（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，１Ｈ），７．５３（ｔ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，２Ｈ），７．３４（ｄ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，２Ｈ），７．２６（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ），７．２３－７．１７（ｍ，５Ｈ），６．８６－６．７９（ｍ，４Ｈ），６．１８（ｄ，Ｊ＝４．１Ｈｚ，１Ｈ），５．９１（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ），５．５６（ｄ，Ｊ＝５．３Ｈｚ，１Ｈ），５．１７（ｄｄ，Ｊ＝１０．１，４．４Ｈｚ，１Ｈ），４．７６－４．６９（ｍ，１Ｈ），４．４９－４．３８（ｍ，３Ｈ），４．３５－４．２６（ｍ，２Ｈ），４．２３－４．０９（ｍ，３Ｈ），３．７１（ｓ，６Ｈ），３．３８（ｓ，３Ｈ），３．３６－３．３２（ｍ，１Ｈ），３．２９（ｓ，３Ｈ），３．２２（ｄｄ，Ｊ＝１０．５，４．１Ｈｚ，１Ｈ），２．９１－２．８６（ｍ，２Ｈ），２．７４－２．６６（ｍ，１Ｈ），１．０９（ｓ，３Ｈ），１．０８（ｓ，３Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ １７９．９８，１６５．５７，１５８．１２，１５８．１０，１５４．６７，１５１．８５，１５１．７７，１５０．５０，１４８．９６，１４８．３８，１４４．３９，１４２．８６，１３６．９３，１３５．１３，１３５．０９，１３３．２２，１３２．４５，１２９．７１，１２９．６６，１２８．４６，１２８．４１，１２７．７９，１２７．６７，１２６．７７，１２５．７４，１２０．２８，１１８．０６，１１３．１４，８５．９７，８３．６３，８２．６０，８２．５４，８１．８０，７９．６８，７９．６４，７６．１２，７６．０８，６８．７９，６８．２０，６８．１５，６３．２０，６３．０６，６３．０２，５８．０８，５７．７９，５４．９８，５４．９７，３４．７８，１８．８１，１８．７７，１８．７５．３１Ｐ ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ ６７．１６．Ｃ５７Ｈ６０Ｎ１１Ｏ１４ＰＳ（Ｍ＋Ｈ）の分子量：計算値１１８６．３８５８、実測値１１８６．３８８５。
化合物４７：化合物４６（４６ａ上部スポット：６３０ｍｇ、０．５３ｍｍｏｌ；４６ｂ下部スポット：９２０ｇ、０．７８ｍｍｏｌ）を高真空下で一晩乾燥させ、乾燥酢酸エチル（４６ａ：８ｍｌ、４６ｂ：９ｍｌ）に溶解した。Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルアミン（４６ａ：２３２μｌ、１７２ｍｇ、１．３３ｍｍｏｌ、２．５当量；４６ｂ：３４０μｌ、２５２ｍｇ、２ｍｍｏｌ、２．５当量）を激しく攪拌しながら滴下した。続いて、２－シアノエチルＮ，Ｎ－ジイソプロピルクロロホスホラミダイト（４６ａ：２４６μｌ、２６０ｍｇ、１．１ｍｍｏｌ、２当量；４６ｂ：３５７μｌ、３７９ｍｇ、１．６ｍｍｏｌ、２当量）を（１分かけて）滴下し、そしてこの反応混合物を室温で１．５時間撹拌した。反応混合物を２００ｍｌの酢酸エチルで希釈し、１００ｍｌのＮａＨＣＯ３及び１００ｍｌのブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、乾燥するまで濃縮した。粗生成物（白い泡）を５ｍｌのＤＣＭに溶解し、１Ｌの冷ｎ－ヘキサン／ジエチルエーテル（１：１）によって沈殿させて、４７ａ（上部スポット：６８９ｍｇ、９４％）及び４７ｂ（下部スポット：１．０７ｇ、９８％）を得た。
４７ａ １Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，アセトニトリル－ｄ３）δ ８．７０（ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，１Ｈ），８．３３（ｄ，１Ｈ），７．９１（ｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，２Ｈ），７．８２（ｄ，Ｊ＝３．０Ｈｚ，１Ｈ），７．６０（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，１Ｈ），７．４７（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ），７．４１（ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，２Ｈ），７．３０－７．２４（ｍ，６Ｈ），７．２３－７．１８（ｍ，１Ｈ），６．８３－６．７７（ｍ，４Ｈ），６．１７－６．１０（ｍ，１Ｈ），５．８０－５．７３（ｍ，１Ｈ），５．２８－５．２１（ｍ，１Ｈ），４．９３－４．８５（ｍ，１Ｈ），４．７３－４．６３（ｍ，２Ｈ），４．４３－４．１９（ｍ，７Ｈ），３．９７－３．７５（ｍ，２Ｈ），３．７４（ｓ，６Ｈ），３．７３－３．６５（ｍ，３Ｈ），３．５２（ｓ，１Ｈ），３．４７（ｓ，２Ｈ），３．４１（ｄ，Ｊ＝５．１Ｈｚ，３Ｈ），３．３６－３．２９（ｍ，１Ｈ），３．２９－３．２２（ｍ，１Ｈ），２．８３－２．７６（ｍ，２Ｈ），２．７３－２．６７（ｍ，２Ｈ），２．５６－２．４７（ｍ，１Ｈ），１．２６－１．２０（ｍ，１２Ｈ），１．１４－１．０３（ｍ，７Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，ｃｄ３ｃｎ）δ １８０．８３，１５９．７９，１５９．７７，１５６．２５，１５２．９２，１５２．８５，１５２．７４，１５１．０１，１４９．７７，１４９．１９，１４９．１８，１４５．８２，１４５．８１，１４３．９９，１４３．８６，１３８．５３，１３８．５０，１３６．６２，１３６．５３，１３６．５２，１３４．６１，１３３．６８，１３１．１８，１３１．１１，１３１．０４，１２９．７７，１２９．６６，１２９．１８，１２９．１１，１２９．０６，１２８．９３，１２８．７８，１２８．０２，１２５．８６，１２５．７９，１２２．４１，１２２．３９，１１９．７４，１１９．７１，１１４．１４，１１４．０１，８８．８５，８８．４０，８７．４９，８６．２２，８３．９６，８３．９３，８３．２０，８３．１１，８２．９１，８２．８９，８２．７３，８２．６９，８２．６７，８２．６２，８１．５８，８１．５５，７７．０１，７６．９７，７６．９３，７２．０５，７１．９２，７１．５９，７１．４７，６８．２４，６８．２１，６７．９４，６７．９０，６４．４４，６４．４０，６４．１６，６４．１３，６０．０２，５９．８８，５９．５０，５９．３４，５９．３０，５９．２８，５９．０６，５９．０５，５５．９７，５５．９１，４８．１９，４４．３２，４４．２６，４４．２２，４４．１６，３６．７８，２５．１９，２５．１７，２５．１４，２５．１１，２５．０５，２５．００，２４．９９，２４．９５，２１．２１，２１．１５，２１．１０，２０．１９，２０．１３，１９．８４，１９．２７，１９．２６，１９．１９．３１Ｐ ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ，ＣＤ３ＣＮ）δ １５１．６８，１５１．１７，６８．８１，６８．７０．Ｃ６６Ｈ７７Ｎ１３Ｏ１５Ｐ２Ｓ（Ｍ＋Ｈ）の分子量：計算値１３８６．４９３６、実測値１３８６．４９３５。
４７ｂ １Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，アセトニトリル－ｄ３）δ ８．７５－８．７０（ｍ，１Ｈ），８．４０－８．３４（ｍ，１Ｈ），８．００（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ），７．８４（ｓ，１Ｈ），７．６３（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，１Ｈ），７．５２（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ），７．４１（ｄ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，２Ｈ），７．３１－７．２６（ｍ，６Ｈ），７．２３－７．１８（ｍ，１Ｈ），６．８５－６．８０（ｍ，４Ｈ），６．１８－６．１４（ｍ，１Ｈ），５．８９－５．８５（ｍ，１Ｈ），５．３６－５．２７（ｍ，１Ｈ），４．８４－４．７６（ｍ，１Ｈ），４．６７（ｄｔ，Ｊ＝２０．５，４．７Ｈｚ，１Ｈ），４．６３－４．５８（ｍ，１Ｈ），４．５４－４．３７（ｍ，３Ｈ），４．３６－４．３０（ｍ，１Ｈ），４．１８－４．０１（ｍ，２Ｈ），３．９４－３．７６（ｍ，２Ｈ），３．７４（ｓ，６Ｈ），３．７３－３．６５（ｍ，３Ｈ），３．４９（ｓ，１Ｈ），３．４４（ｓ，２Ｈ），３．３６（ｓ，４Ｈ），３．３５－３．２９（ｍ，２Ｈ），２．７３－２．６４（ｍ，４Ｈ），２．５８－２．５１（ｍ，１Ｈ），１．２５－１．２０（ｍ，１２Ｈ），１．０９－１．０４（ｍ，７Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，ｃｄ３ｃｎ）δ １８０．９７，１８０．９５，１５９．８１，１５９．７８，１５６．３０，１５２．９０，１５２．７９，１５１．００，１４９．５５，１４９．５４，１４９．１９，１４９．１６，１４５．７３，１４３．９２，１４３．７９，１３８．５９，１３８．５４，１３６．６０，１３６．５４，１３６．５３，１３４．６７，１３３．７３，１３１．１３，１３１．０５，１２９．７２，１２９．３６，１２９．２２，１２９．１２，１２８．９３，１２８．０５，１２５．９１，１２５．８４，１２２．４４，１２２．４３，１１９．７４，１１４．１４，１１３．９９，８８．８０，８８．４０，８７．５０，８７．４９，８６．６７，８６．６５，８３．７１，８３．６４，８３．４８，８３．４３，８３．２５，８３．２１，８３．１７，８３．１３，８２．９０，８２．８８，８２．７０，８２．６６，８１．９５，８１．９２，７６．６５，７２．４５，７２．３３，７１．８１，７１．６８，６８．９２，６８．８８，６８．６９，６８．６４，６４．２１，６４．１８，６３．８７，６３．８４，６０．０３，５９．８８，５９．２８，５９．２５，５８．９９，５８．９７，５５．９８，５５．９７，４８．１８，４４．３３，４４．２６，４４．２４，４４．１６，３６．７７，２５．１５，２５．１４，２５．１０，２５．０８，２５．０４，２４．９８，２４．９２，２１．２０，２１．１５，２１．１３，２１．０７，２０．１１，２０．０４，１９．７６，１９．４５，１９．４４，１９．１０，１９．０９．３１Ｐ ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ，ｃｄ３ｃｎ）δ １５２．００，１５１．２６，６８．８１，６８．７２．Ｃ６６Ｈ７７Ｎ１３Ｏ１５Ｐ２Ｓ（Ｍ＋Ｈ）の分子量：計算値１３８６．４９３６、実測値１３８６．４９２７。
Ｇ－２．完全に脱保護されたキラル的に純粋なＧＯＭｅｓＡＯＭｅの合成
Figure 0007348185000033
化合物４８：化合物４６（４６ａ上部スポット：５３１ｍｇ、０．４５ｍｍｏｌ；４６ｂ下部スポット：５１７ｍｇ、０．４３ｍｍｏｌ）を１．５ｍｌのＤＣＭに溶解し、１７ｍｌのトリクロロ酢酸（ＤＣＭ中３％）を加えた。反応混合物を室温で１．５時間撹拌した。反応混合物を濃縮し、ＣｏｍｂｉＦｌａｓｈ（登録商標）カラム（４０ｇ Ｇｏｌｄカラム、流量５０ｍｌ／分、ＤＣＭからＤＣＭ中、５％ＭｅＯＨで８分間、ＤＣＭ中、５％ＭｅＯＨで１５分間）によって精製して、４８ａ（３７３ｍｇ、９４％）及び４８ｂ（３６５ｍｇ、９２％）を得た。ＤＣＭ中、１０％ＭｅＯＨでは、４８ａ Ｒｆ＝０．３９及び４８ｂ Ｒｆ＝０．３９。
４８ａ １Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ １２．０７（ｓ，１Ｈ），１１．６７（ｓ，１Ｈ），１１．２２（ｓ，１Ｈ），８．７７（ｓ，１Ｈ），８．６７（ｓ，１Ｈ），８．３０（ｓ，１Ｈ），８．０３（ｄ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，２Ｈ），７．６４（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，１Ｈ），７．５４（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ），６．２０（ｄ，Ｊ＝４．１Ｈｚ，１Ｈ），５．９１－５．８５（ｍ，１Ｈ），５．６１（ｄ，Ｊ＝５．５Ｈｚ，１Ｈ），５．３７（ｔ，Ｊ＝５．３Ｈｚ，１Ｈ），５．１９（ｄｄ，Ｊ＝１０．５，４．６Ｈｚ，１Ｈ），４．６１（ｄｔ，Ｊ＝７．７，３．４Ｈｚ，１Ｈ），４．５４－４．４６（ｍ，２Ｈ），４．３７（ｄｄｔ，Ｊ＝１８．７，１１．１，５．９Ｈｚ，２Ｈ），４．２７－４．１５（ｍ，４Ｈ），３．５９（ｄ，Ｊ＝４．５Ｈｚ，２Ｈ），３．４０（ｓ，３Ｈ），３．３２（ｓ，３Ｈ），２．９３（ｔ，Ｊ＝５．８Ｈｚ，２Ｈ），２．７７－２．６７（ｍ，１Ｈ），１．１０（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，６Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ １８０．０６，１６５．６１，１６４．３８，１５４．７１，１５１．９２，１５１．８４，１５０．５２，１４９．０１，１４８．４５，１４３．００，１３７．１０，１３３．２２，１３２．４６，１２８．４６，１２８．４３，１２５．８０，１１９．９７，１１８．１７，８６．００，８４．６５，８４．６４，８３．６６，８２．７１，８２．６４，８１．７０，８０．８３，８０．７９，７６．７０，７６．６６，７１．０６，６８．７０，６７．９５，６７．９１，６３．２７，６３．２４，６０．７２，５８．０１，５７．８１，３４．７６，１８．８１，１８．７７，１８．７３．３１Ｐ ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ ６８．３０．Ｃ３６Ｈ４２Ｎ１１Ｏ１２ＰＳ（Ｍ＋Ｈ）の分子量：計算値８８４．２５５１、実測値８８４．２５５６。
４８ｂ １Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ １２．０６（ｓ，１Ｈ），１１．６３（ｓ，１Ｈ），１１．２０（ｓ，１Ｈ），８．７５（ｓ，１Ｈ），８．６６（ｓ，１Ｈ），８．２９（ｓ，１Ｈ），８．０２（ｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，２Ｈ），７．６４（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，１Ｈ），７．５４（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ），６．２０（ｄ，Ｊ＝４．１Ｈｚ，１Ｈ），５．８８（ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，１Ｈ），５．６２－５．５５（ｍ，１Ｈ），５．３４（ｔ，Ｊ＝５．２Ｈｚ，１Ｈ），５．１７（ｄｄ，Ｊ＝１０．５，４．６Ｈｚ，１Ｈ），４．６３－４．５５（ｍ，１Ｈ），４．５３－４．４１（ｍ，３Ｈ），４．３７－４．２９（ｍ，１Ｈ），４．２７－４．１６（ｍ，４Ｈ），３．６２－３．５０（ｍ，２Ｈ），３．３９（ｓ，３Ｈ），３．２７（ｓ，３Ｈ），２．９６（ｔ，Ｊ＝５．８Ｈｚ，２Ｈ），２．７６－２．６６（ｍ，１Ｈ），１．０９（ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，６Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ １８０．０５，１６５．５９，１５４．７０，１５１．８９，１５１．８１，１５０．５１，１４８．９９，１４８．４３，１４３．００，１３７．０８，１３３．２１，１３２．４７，１２８．４７，１２８．４３，１２５．７８，１１９．９６，１１８．２３，８６．０１，８４．６３，８３．６５，８２．６９，８２．６２，８１．７３，８０．８８，８０．８４，７６．７２，７６．６８，６８．７８，６８．２０，６８．１６，６３．１５，６３．１２，６０．７２，５７．９４，５７．８０，３４．７６，１８．８４，１８．８０，１８．７６．３１Ｐ ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ ６８．１９．Ｃ３６Ｈ４２Ｎ１１Ｏ１２ＰＳ（Ｍ＋Ｈ）の分子量：計算値８８４．２５５１、実測値８８４．２５５２。
化合物４９：化合物４８（４８ａ上部スポット：３５８ｍｇ、０．４１ｍｍｏｌ；４８ｂ下部スポット：３５０ｍｇ、０．４ｍｍｏｌ）を１７ｍｌのメチルアミン（３３ｗｔ％無水エタノール溶液）に溶解し、室温で３時間攪拌した。反応混合物を濃縮し、ＣｏｍｂｉＦｌａｓｈ（登録商標）カラム（２４ｇ Ｇｏｌｄカラム、流量４０ｍｌ／分、酢酸エチル／ＭｅＯＨ（７０：３０）で８分間、酢酸エチル／ＭｅＯＨ（６０：４０）で５分間）によって精製して、４９ａ（２２２ｍｇ、８３％）及び４９ｂ（２４０ｍｇ、９１％）を得た。
４９ａ １Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，重水）δ ８．４１（ｓ，１Ｈ），８．１７（ｓ，１Ｈ），７．９２（ｓ，１Ｈ），６．１４（ｄ，Ｊ＝４．９Ｈｚ，１Ｈ），５．７５（ｄ，Ｊ＝５．１Ｈｚ，１Ｈ），５．０４－４．９５（ｍ，１Ｈ），４．６８（ｔ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，１Ｈ），４．４５－４．３４（ｍ，３Ｈ），４．３４－４．２７（ｍ，１Ｈ），４．２７－４．１９（ｍ，２Ｈ），３．７９（ｄ，Ｊ＝３．１Ｈｚ，２Ｈ），３．４９（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，６Ｈ），３．３６（ｓ，１Ｈ），２．６１（ｓ，２Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，ｄ２ｏ）δ １５８．７４，１５５．５６，１５３．５９，１５３．０１，１５１．１６，１４８．８８，１３９．６６，１３７．７１，１１８．６９，１１６．６９，８６．１７，８５．８１，８４．１５，８４．１２，８３．９４，８３．８６，８３．３８，８１．３７，８１．３３，７２．７６，７２．７１，６９．１１，６５．６１，６５．５６，６１．０７，５８．５５，５８．１０．３１Ｐ ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ，ｄ２ｏ）δ ５６．０７．Ｃ２２Ｈ２９Ｎ１０Ｏ１０ＰＳ（Ｍ＋Ｈ）の分子量：計算値６５７．１６０５、実測値６５７．１５８０。
４９ｂ １Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，重水）δ ８．４６（ｓ，１Ｈ），８．１７（ｓ，１Ｈ），７．９０（ｓ，１Ｈ），６．１３（ｄ，Ｊ＝４．４Ｈｚ，１Ｈ），５．８０（ｄ，Ｊ＝３．２Ｈｚ，１Ｈ），５．０４（ｄｔ，Ｊ＝１１．４，５．６Ｈｚ，１Ｈ），４．６５（ｔ，Ｊ＝４．９Ｈｚ，１Ｈ），４．４３－４．３７（ｍ，１Ｈ），４．３５－４．２５（ｍ，４Ｈ），４．２５－４．１６（ｍ，１Ｈ），３．９８－３．８０（ｍ，２Ｈ），３．５１（ｄ，Ｊ＝９．７Ｈｚ，６Ｈ），２．６１（ｓ，２Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，ｄ２ｏ）δ １５８．５１，１５５．５１，１５３．４２，１５３．００，１５０．８２，１４８．５９，１３９．６４，１３７．３６，１１８．６０，１１６．５９，８６．６８，８６．０８，８３．８３，８３．７１，８３．６３，８３．５７，８３．５３，８１．４３，８１．４１，７２．７９，７２．７５，６９．０８，６４．６７，６４．６１，６０．６８，５８．６３，５８．００．３１Ｐ ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ，ｄ２ｏ）δ ５７．５３．Ｃ２２Ｈ２９Ｎ１０Ｏ１０ＰＳ（Ｍ＋Ｈ）の分子量：計算値６５７．１６０５、実測値６５７．１５８３。
Ｈ．キラル的に純粋な２’－Ｏ－２－メトキシプロパンチミジン－２’－Ｆウリジンホスホロチオエートジヌクレオチド（ＴＯＭｅＰｒｏｐｓＵＦ）の合成
Figure 0007348185000034
化合物１．２：１．１（５．０ｇ、２０．３ｍｍｏｌ、Ｒ．Ｉ．Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）のピリジン（５０ｍｌ）溶液に、ＤＭＴｒＣｌ（７．５７ｇ、２２．３ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を３時間攪拌した。イミダゾール（３．４６ｇ、５０．８ｍｍｏｌ）及びＴＢＤＭＳＣｌ（３．６７ｇ、２４．４ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を一晩攪拌した。溶媒の除去後、残留物をＣＨ２Ｃｌ２及び飽和ＮａＨＣＯ３（水溶液）で抽出し、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：ＥｔＯＡｃ、２：１、Ｒｆ＝０．１８）によって精製して１．２（１２．７ｇ、１９．２ｍｍｏｌ、９４％）を得た。
１．２：Ｒｆ＝０．１８（ヘキサン：ＥｔＯＡｃ、２：１）１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ－ｄ６，４００ＭＨｚ）δ １１．４６（ｓ，１Ｈ），７．８７（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），７．２２－７．３８（ｍ，９Ｈ），６．８７－６．９０（ｍ，４Ｈ），５．８９（ｄ，Ｊ＝２０．４Ｈｚ，１Ｈ），５．３２－５．３４（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），５．１２－５．２７（ｍ，１Ｈ），４．５１（ｄｄｄ，Ｊ＝２２．８Ｈｚ，８．８Ｈｚ，４．４Ｈｚ，１Ｈ），３．９６－３．９８（ｍ，１Ｈ），３．７３（ｓ，６Ｈ），３．４３（ｄ，Ｊ＝９．６Ｈｚ，１Ｈ），３．１５（ｄｄ，Ｊ＝１１．０Ｈｚ，３．９Ｈｚ，１Ｈ），０．７４（ｓ，９Ｈ），０．０３４（ｓ，３Ｈ），－０．０５９（ｓ，３Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ－ｄ６，１００ＭＨｚ）δ １６３．３，１５８．２，１５０．１，１４４．４，１４１．１，１３５．０，１２９．８，１２７．７，１２６．９，１１３．２，１０１．４，９３．５，８９．３，８８．９，８５．９，８１．０，６８．９，６８．７，６１．２，５５．１，２５．４，１７．６，－４．９，－５．５．１９Ｆ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ－ｄ６，３７６ＭＨｚ）δ －２０２．３９，－２０２．４４，－２０２．５０，－２０２．５３，－２０２．５９，－２０２．６５．Ｃ３６Ｈ４３ＦＮ２ＮａＯ７Ｓｉ（Ｍ＋Ｎａ）の分子量：計算値６８５．２７、実測値６８５．３。
化合物１．３：１．２（１２．５ｇ、１８．９ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２（１２６ｍｌ）及びＭｅＯＨ（５４ｍｌ）溶液に、ＣＨ２Ｃｌ２（６３ｍｌ）及びＭｅＯＨ（２７ｍｌ）中、ベンゼンスルホン酸（８．９５ｇ、５６．６ｍｍｏｌ）を－２０℃で滴下した。混合物を同じ温度で１時間撹拌し、２００ｍｌの飽和ＮａＨＣＯ３水溶液でクエンチした。有機層を分離し、水層をＣＨ２Ｃｌ２で抽出した。組み合わせ有機層をＮａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、濃縮した。粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：ＥｔＯＡｃ、１：１、Ｒｆ＝０．２０）によって精製して、１．３（６．２０ｇ、１７．２ｍｍｏｌ、９１％）を得た。
１．３：Ｒｆ＝０．２０（ヘキサン：ＥｔＯＡｃ）。１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ－ｄ６，４００ＭＨｚ）δ １１．４１（ｓ，１Ｈ），７．８９（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），５．８９（ｄｄ，Ｊ＝１７．９Ｈｚ，１．９Ｈｚ，１Ｈ），５．６４（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），５．０３－５．２３（ｍ，２Ｈ），４．３３（ｄｄｄ，Ｊ＝１８．９Ｈｚ，７．１Ｈｚ，４．５Ｈｚ，１Ｈ），３．８６－３．８８（ｍ，１Ｈ），３．７６（ｄ，Ｊ＝１２．０Ｈｚ，１Ｈ），３．５４（ｄ，Ｊ＝１２．０Ｈｚ，１Ｈ），０．８７（ｓ，９Ｈ），０．１０（ｓ，３Ｈ），０．１０（ｓ，３Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ－ｄ６，１００ＭＨｚ）δ １６３．２，１５０．３，１４０．６，１０１．７，９３．５，９１．６，８７．６，８７．３，８３．４，６８．８，６８．６，５９．１，２５．６，１７．８，－４．９，－５．２．１９Ｆ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ－ｄ６，３７６ＭＨｚ）δ －２０５．３４，－２０５．３８，－２０５．４３，－２０５．４８，－２０５．５３，－２０５．５７．Ｃ１５Ｈ２６ＦＮ２Ｏ５Ｓｉ（Ｍ＋Ｈ）の分子量：計算値３６１．１６、実測値３６１．２。
化合物１．６：１．３（２２７ｍｇ、０．６３０ｍｍｏｌ）及び１．４（５００ｍｇ、０．６００ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２（１５ｍｌ）溶液に、ＣＨ３ＣＮ（４．８ｍｌ、１．２ｍｍｏｌ、Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）中、０．２５Ｍエチルチオ－１Ｈ－テトラゾールを滴下した。混合物を室温で２時間攪拌した。次いで、フェニルアセチルジスルフィド（２７０ｍｇ、０．８９３ｍｍｏｌ）及び２，６－ルチジン（０．１０５ｍｌ、０．９０２ｍｍｏｌ）を加え、この混合物を一晩攪拌した。水性後処理及びシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって、１．６ａ（３４０ｍｇ、０．３０２ｍｍｏｌ、５０％）及び１．６ｂ（２６４ｍｇ、０．２３５ｍｍｏｌ、３９％）を得た。
１．６ａ：Ｓｐ異性体、Ｒｆ＝０．４７（ヘキサン：ＥｔＯＡｃ、１：４）。１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤ３ＣＮ，４００ＭＨｚ）δ ９．２９－９．３１（ｍ，２Ｈ），７．２７－７．７９（ｍ，９Ｈ），６．９１－６．９３（ｍ，４Ｈ），６．０１（ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，１Ｈ），５．８７（ｄ，Ｊ＝１．６Ｈｚ，０．５Ｈ），５．８２（ｄ，Ｊ＝１．６Ｈｚ，０．５Ｈ），５．６５（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），５．２２（ｄｄｄ，Ｊ＝１０．７Ｈｚ，５．１Ｈｚ，３．２Ｈｚ，１Ｈ），５．１３（ｄｄ，Ｊ＝４．７，１．６Ｈｚ，０．５Ｈ），５．００（ｄｄ，Ｊ＝４．７，１．６Ｈｚ，０．５Ｈ），４．４７－４．５３（ｍ，２Ｈ），４．１３－４．３８（ｍ，６Ｈ），３．８０（ｓ，６Ｈ），３．６７（ｄｄ，Ｊ＝１１．０Ｈｚ，３．５Ｈｚ，１Ｈ），３．３８－３．５８（ｍ，４Ｈ），３．２４（ｓ，３Ｈ），２．７１－２．７５（ｍ，２Ｈ），１．４７（ｄ，Ｊ＝１．２Ｈｚ，３Ｈ），１．０７（ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，３Ｈ），０．９４（ｓ，９Ｈ），０．１７（ｓ，３Ｈ），０．１５（ｓ，３Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（ＣＤ３ＣＮ，１００ＭＨｚ）δ １６４．８，１６４．３，１６０．２，１５２．０，１５１．５，１５１．１，１４５．９，１４２．３，１３７．３，１３６．６，１３１．５，１２９．４，１２８．５，１２５．２，１１４．６，１１２．２，１０３．４，９４．７，９２．８，９１．４，９１．０，８８．４，８７．４，８３．５，８２．３，８２．２，８１．６，７７．７，７７．３，７７．２，７５．７，７０．８，７０．７，６８．１，６４．６，６４．２，５７．３，５６．３，２８．２，２６．４，２０．５，２０．４，１９．０，１６．４，１５．７，１２．６，－４．２，－４．４．３１Ｐ ＮＭＲ（ＣＤ３ＣＮ，１６２ＭＨｚ）δ ６７．１７．１９Ｆ ＮＭＲ（ＣＤ３ＣＮ，３７６ＭＨｚ）δ －２０３．３４，－２０３．４０，－２０３．４５，－２０３．４９，－２０３．５４，－２０３．５９．Ｃ５３Ｈ６７ＦＮ５ＮａＯ１５ＰＳＳｉ（Ｍ＋Ｎａ）の分子量：計算値１１４６．３７、実測値１１４６．３。
１．６ｂ：Ｒｐ異性体、Ｒｆ＝０．２７（ヘキサン：ＥｔＯＡｃ、１：４）。１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤ３ＣＮ，４００ＭＨｚ）δ ９．３３（ｂｒｓ，２Ｈ），７．２７－７．５０（ｍ，９Ｈ），６．８９－６．９３（ｍ，４Ｈ），６．００（ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，１Ｈ），５．７５（ｄｄ，Ｊ＝２０．６，１．３Ｈｚ，１Ｈ），５．６０（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），５．２６（ｄｄｄ，Ｊ＝１０．７Ｈｚ，５．１Ｈｚ，２．９Ｈｚ，１Ｈ），５．０７（ｄｄｄ，Ｊ＝５３．３Ｈｚ，４．８Ｈｚ，１．３Ｈｚ，１Ｈ），４．１７－４．４７（ｍ，６Ｈ），４．０４－４．０６（ｍ，１Ｈ），３．７９（ｓ，６Ｈ），３．７０（ｄｄ，Ｊ＝１０．８Ｈｚ，３．２Ｈｚ，１Ｈ），３．４９－３．５８（ｍ，２Ｈ），３．２６－３．３６（ｍ，３Ｈ），３．２５（ｓ，３Ｈ），２．８４（ｔ，Ｊ＝５．９Ｈｚ，２Ｈ），１．４３（ｓ，３Ｈ），１．１０（ｄ，Ｊ＝６．２Ｈｚ，３Ｈ），０．９２（ｓ，９Ｈ），０．１５（ｓ，３Ｈ），０．１４（ｓ，３Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（ＣＤ３ＣＮ，１００ＭＨｚ）δ １６４．８，１６４．４，１６０．２，１５５．９，１５２．１，１５１．５，１４５．９，１４２．５，１３７．５，１３６．６，１３６．５，１３１．５，１３１．５，１２９．４，１２９．４，１２８．５，１２５．２，１１４．６，１１２．３，１０３．４，９４．７，９２．９，９１．９，９１．５，８８．４，８７．２，８３．６，８２．０，８１．９，８１．８，７７．６，７７．５，７５．７，７０．５，７０．３，６７．５，６４．８，６４．７，６４．１，５７．２，５６．３，２８．２，２６．４，２０．５，１９．０，１６．４，１５．７，１２．６，－４．２，－４．４．３１Ｐ ＮＭＲ（ＣＤ３ＣＮ，１６２ＭＨｚ）δ ６７．５５．１９Ｆ ＮＭＲ（ＣＤ３ＣＮ，３７６ＭＨｚ）δ －２０２．４１，－２０２．４７，－２０２．５２，－２０２．５６，－２０２．６１，－２０２．６７．
化合物１．７：１．３（４６２ｍｇ、１．２８ｍｍｏｌ）及び１．５（１．０ｇ、１．２２ｍｍｏｌ、Ｒ．Ｉ．Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）のＣＨ２Ｃｌ２（３０ｍｌ）溶液に、ＣＨ３ＣＮ（９．７６ｍｌ、２．４４ｍｍｏｌ、Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）中、０．２５Ｍエチルチオ－１Ｈ－テトラゾールを滴下した。混合物を室温で２時間撹拌した。次いで、フェニルアセチルジスルフィド（５３３ｍｇ、１．８３ｍｍｏｌ）及び２，６－ルチジン（０．２１３ｍｌ、１．８３ｍｍｏｌ）を加え、この混合物を一晩攪拌した。水性後処理及びシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって、１．７ａ（７２５ｍｇ、０．６５３ｍｍｏｌ、５４％）及び１．７ｂ（５５１ｍｇ、０．４９６ｍｍｏｌ、４１％）を得た。
１．７ａ：Ｓｐ異性体、Ｒｆ＝０．２８（ヘキサン：ＥｔＯＡｃ、１：４）。１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ－ｄ６，４００ＭＨｚ）δ １１．５５－１１．３５（ｍ，２Ｈ），７．６９－７．５４（ｍ，１Ｈ），７．４６（ｓ，１Ｈ），７．１９－７．４３（ｍ，１０Ｈ），，６．８９－６．９１（ｍ，４Ｈ），５．９１（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，１Ｈ），５．８５（ｄ，Ｊ＝２１．０Ｈｚ，１Ｈ），５．６２（ｄｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，２．１Ｈｚ，１Ｈ），５．１４－５．２９（ｍ，２Ｈ），４．０６－４．４９（ｍ，８Ｈ），３．７４（ｓ，６Ｈ），３．７１－３．７２（ｍ，２Ｈ），３．３１－３．４６（ｍ，３Ｈ），３．１７（ｓ，３Ｈ），２．８６（ｔ，Ｊ＝５．８Ｈｚ，２Ｈ），１．３８（ｓ，３Ｈ），０．８８（ｓ，９Ｈ），０．１２（ｓ，３Ｈ），０．１１（ｓ，３Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ－ｄ６，１００ＭＨｚ）δ １６３．５，１６３．２，１５８．３，１５４．０，１５０．６，１５０．２，１４４．３，１４１．４，１３５．３，１３５．２，１３４．８，１２９．８，１２９．７，１２８．０，１２７．７，１２７．０，１２０．７，１１８．０，１１３．３，１１０．２，１０１．９，９２．８，９１．０，８９．５，８９．２，８６．４，８５．６，８１．６，８０．３，７９．０，７６．２，７１．７，６９．８，６９．２，６９．１，６６．７，６３．１，６３．０，５８．３，５５．１，２６．５，２５．５，１８．９，１８．８，１７．７，１４．９，１１．６，－４．９，－５．２．３１Ｐ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ－ｄ６，１６２ＭＨｚ）δ ７１．９６．１９Ｆ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ－ｄ６，３７６ＭＨｚ）δ －２０２．５１，－２０２．５７，－２０２．６２，－２０２．６５，－２０２．７１，－２０２．７６．Ｃ５２Ｈ６５ＦＮ５ＮａＯ１５ＰＳＳｉ（Ｍ＋Ｎａ）の分子量：計算値１１３２．３６、実測値１１３２．２。
１．７ｂ：Ｒｐ異性体、Ｒｆ＝０．１０（ヘキサン：ＥｔＯＡｃ、１：４）。１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ－ｄ６，４００ＭＨｚ）δ １１．５３－１１．３３（ｍ，２Ｈ），７．５７（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），７．４８（ｓ，１Ｈ），７．２３－７．４０（ｍ，１０Ｈ），６．８８－６．９０（ｍ，４Ｈ），５．８９（ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，１Ｈ），５．８３（ｄ，Ｊ＝１９．９Ｈｚ，１Ｈ），５．６０（ｄｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，２．１Ｈｚ，１Ｈ），５．１１－５．２６（ｍ，２Ｈ），３．９７－４．４５（ｍ，８Ｈ），３．７３（ｓ，６Ｈ），３．７０－３．７７（ｍ，２Ｈ），３．２１－３．４９（ｍ，３Ｈ），３．２０（ｓ，３Ｈ），２．９５（ｔ，Ｊ＝５．８Ｈｚ，２Ｈ），１．３８（ｓ，３Ｈ），０．８５（ｓ，９Ｈ），０．１０（ｓ，３Ｈ），０．０９０（ｓ，３Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ－ｄ６，１００ＭＨｚ）δ １６３．６，１６３．２，１５８．３，１５０．５，１５０．１，１４４．３，１４１．２，１３５．４，１３５．１，１３４．８，１２９．８，１２８．０，１２７．７，１２７．０，１１８．２，１１３．３，１１０．１，１０１．９，９２．９，９１．１，８９．４，８９．１，８６．４，８５．９，８１．６，８０．２，８０．１，７９．１，７５．８，７１．６，６９．８，６９．０，６８．８，６６．１，６３．４，６３．３，６２．７，５８．３，５５．１，３０．２，２６．５，２５．５，２０．８，１８．９，１８．８，１８．６，１７．７，１５．０，１３．６，１１．６，－４．９，－５．２．３１Ｐ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ－ｄ６，１６２ＭＨｚ）δ ７２．２４．１９Ｆ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ－ｄ６，３７６ＭＨｚ）δ －２０２．５０，－２０２．５６，－２０２．６１，－２０２．６５，－２０２．７０，－２０２．７６．Ｃ５２Ｈ６５ＦＮ５ＮａＯ１５ＰＳＳｉ（Ｍ＋Ｎａ）の分子量：計算値１１３２．３６、実測値１１３２．２。
化合物１．８ａ：化合物１．６ａ（３４０ｍｇ、０．３０２ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（７ｍｌ）溶液に、トリエチルアミン三フッ化水素酸塩（０．１７６ｍｌ、３．２６ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を一晩撹拌してから濃縮した。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２中、５％ＭｅＯＨ、Ｒｆ＝０．２２）によって精製して１．８ａ（３０２ｍｇ、０．２９９ｍｍｏｌ、９９％）を得た。
１．８ａ：Ｓｐ異性体、Ｒｆ＝０．２２ ５％（ＤＣＭ中、ＭｅＯＨ）。１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤ３ＣＮ，４００ＭＨｚ）δ ９．１０（ｓ，２Ｈ），７．２４－７．４９（ｍ，１１Ｈ），６．８８－６．９０（ｍ，４Ｈ），５．９７（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，１Ｈ），５．７４－５．８８（ｍ，１Ｈ），５．６０（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），５．１７（ｄｄｄ，Ｊ＝１０．５Ｈｚ，４．９Ｈｚ，２．６Ｈｚ，１Ｈ），５．０４（ｄｄ，Ｊ＝５２．５Ｈｚ，４．０Ｈｚ，１Ｈ），４．１１－４．５１（ｍ，５Ｈ），３．８７（ｄ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，１Ｈ），３．７７（ｓ，６Ｈ），３．６８－３．７１（ｍ，１Ｈ），３．３２－３．５１（ｍ，４Ｈ），３．２１（ｓ，３Ｈ），２．７２（ｔｄ，Ｊ＝５．５Ｈｚ，３．１Ｈｚ，２Ｈ），１．４２（ｓ，３Ｈ），１．０４（ｄ，Ｊ＝６．１Ｈｚ，３Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（ＣＤ３ＣＮ，１００ＭＨｚ）δ １６４．８，１６４．３，１６０．３，１５２．１，１５１．５，１４５．９，１４２．０，１３７．３，１３６．７，１３６．６，１３１．５，１２９．５，１２８．６，１１４．７，１１２．４，１０３．３，９５．６，９３．７，９１．０，９０．７，８８．５，８７．１，８３．７，８２．０，８１．９，７７．６，７５．８，６９．９，６９．７，６８．４，６４．６，６４．５，６４．３，５７．２，５６．４，２０．５，２０．４，１６．４，１２．６．３１Ｐ ＮＭＲ（ＣＤ３ＣＮ，１６２ＭＨｚ）δ ７２．６６．１９Ｆ ＮＭＲ（３７６ＭＨｚ，ＣＤ３ＣＮ）δ －２０４．０２，－２０４．０８，－２０４．１３，－２０４．１６，－２０４．２２，－２０４．２７．
化合物１．８ｂ：化合物１．６ｂ（２７３ｍｇ、０．２４３ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（６ｍｌ）溶液に、トリエチルアミン三フッ化水素酸塩（０．１４２ｍｌ、２．６２ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を一晩撹拌してから濃縮した。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２中、５％ＭｅＯＨ、Ｒｆ＝０．２１）による精製によって１．８ｂ（２０９ｍｇ、０．２０７ｍｍｏｌ、８５％）を得た。
１．８ｂ：Ｒｐ異性体、Ｒｆ＝０．２１（ＣＨ２Ｃｌ２中、５％ＭｅＯＨ）。１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤ３ＣＮ，４００ＭＨｚ）δ ９．１２（ｓ，２Ｈ），７．２４－７．４６（ｍ，１１Ｈ），６．８７－６．９０（ｍ，４Ｈ），５．９７（ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，１Ｈ），５．７４（ｄ，Ｊ＝１９．３Ｈｚ，１Ｈ），５．５７（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），５．２２（ｄｄｄ，Ｊ＝１０．７Ｈｚ，５．１Ｈｚ，２．９Ｈｚ，１Ｈ），５．０３（ｄｄ，Ｊ＝５３．１Ｈｚ，４．７Ｈｚ，１Ｈ），４．４３（ｔ，Ｊ＝５．３Ｈｚ，１Ｈ），４．１９－４．３６（ｍ，３Ｈ），４．０４（ｓ，１Ｈ），３．７７（ｓ，６Ｈ），３．６６－３．７０（ｍ，２Ｈ），３．４１－３．５６（ｍ，２Ｈ），３．２７－３．３９（ｍ，２Ｈ），３．２３（ｓ，３Ｈ），２．８２（ｔ，Ｊ＝５．９Ｈｚ，２Ｈ），１．４１（ｓ，３Ｈ），１．０７（ｄ，Ｊ＝６．１Ｈｚ，３Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（ＣＤ３ＣＮ，１００ＭＨｚ）δ １６４．８，１６４．３，１６０．３，１５２．１，１５１．５，１４６．０，１４２．３，１３７．３，１３６．７，１３６．６，１３１．５，１２９．５，１２８．５，１１４．７，１１２．４，１０３．４，９５．５，９３．６，９１．５，９１．２，８８．４，８７．３，８３．６，８１．８，８１．７，７７．６，７７．５，７７．４，７５．８，６９．８，６９．７，６８．１，６８．０，６４．８，６４．７，６４．２，５７．２，５６．４，２０．５，１６．４，１２．６．３１Ｐ ＮＭＲ（ＣＤ３ＣＮ，１６２ＭＨｚ）δ ７２．８６．１９Ｆ ＮＭＲ（３７６ＭＨｚ，ＣＤ３ＣＮ）δ －２０３．１８，－２０３．２４，－２０３．２９，－２０３．３２，－２０３．３８，－２０３．４３．
化合物１．９ａ：化合物１．７ａ（７０５ｍｇ、０．６３５ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（１４ｍｌ）溶液に、トリエチルアミン三フッ化水素酸塩（０．４１２ｍｌ、７．６２ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を一晩撹拌してから濃縮した。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２中、５％ＭｅＯＨ、Ｒｆ＝０．２６）による精製によって１．９ａ（５２１ｍｇ、０．５２３ｍｍｏｌ、８２％）を得た。
１．９ａ：Ｓｐ異性体、Ｒｆ＝０．２６（ＣＨ２Ｃｌ２中、５％ＭｅＯＨ）。１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤ３ＣＮ，４００ＭＨｚ）δ ９．３２（ｓ，２Ｈ），７．２４－７．５３（ｍ，１１Ｈ），６．８８－６．９０（ｍ，４Ｈ），５．９７（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，１Ｈ），５．８４（ｄ，Ｊ＝１９．２Ｈｚ，１Ｈ），５．６３（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），５．２２（ｄｄｄ，Ｊ＝１０．４Ｈｚ，４．９Ｈｚ，２．５Ｈｚ，１Ｈ），５．０４（ｄｄ，Ｊ＝５３．０Ｈｚ，４．５Ｈｚ，１Ｈ），４．０８－４．５５（ｍ，８Ｈ），３．９４（ｓ，１Ｈ），３．７７（ｓ，６Ｈ），３．７２－３．８３（ｍ，２Ｈ），３．４８－３．５１（ｍ，２Ｈ），３．４０（ｄｄ，Ｊ＝１１．０Ｈｚ，２．８Ｈｚ，１Ｈ），３．３３（ｄｄ，Ｊ＝１１．０Ｈｚ，２．７Ｈｚ，１Ｈ），３．２４（ｓ，３Ｈ），２．７２（ｔｄ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，２．５Ｈｚ，２Ｈ），１．４０（ｓ，３Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（ＣＤ３ＣＮ，１００ＭＨｚ）δ １７４．４，１６４．８，１６４．３，１６０．２，１５２．１，１５１．５，１４５．９，１４１．８，１３７．３，１３６．６，１３６．５，１３１．５，１２９．４，１２５．１，１１４．６，１１２．４，１０３．２，９５．６，９３．７，９０．８，９０．５，８８．４，８７．１，８３．６，８３．５，８１．９，８１．８，８１．５，８１．４，７７．９，７３．４，７１．８，６９．７，６９．５，６８．１，６４．５，６４．４，６４．２，５９．６，５６．３，２０．５，２０．４，１２．６．１９Ｆ ＮＭＲ（３７６ＭＨｚ，ＣＤ３ＣＮ）δ －２０４．２４，－２０４．３０，－２０４．３５，－２０４．３９，－２０４．４４，－２０４．５０．Ｃ４３Ｈ４７ＦＮ４Ｏ１５ＰＳ（Ｍ－ＣＨ２ＣＨ２ＣＮ）の分子量：計算値９４１．２５、実測値９４１．２。
化合物１．９ｂ：化合物１．７ｂ（５３０ｍｇ、０．４７７ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（１０ｍｌ）溶液に、トリエチルアミン三フッ化水素酸塩（０．３０９ｍｌ、５．７２ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を一晩攪拌してから濃縮した。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２中、５％ＭｅＯＨ、Ｒｆ＝０．２１）による精製によって１．９ｂ（４０３ｍｇ、０．４０５ｍｍｏｌ、８５％）を得た。
１．９ｂ：Ｒｐ異性体、Ｒｆ＝０．２１（ＣＨ２Ｃｌ２中、５％ＭｅＯＨ）。１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤ３ＣＮ，４００ＭＨｚ）δ ９．３０（ｓ，２Ｈ），７．２２－７．４８（ｍ，１１Ｈ），６．８８－６．９０（ｍ，４Ｈ），５．９６（ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，１Ｈ），５．７０－５．８０（ｍ，１Ｈ），５．５８（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），５．２６（ｄｄｄ，Ｊ＝１０．７Ｈｚ，５．１Ｈｚ，３．０Ｈｚ，１Ｈ），５．０４（ｄｄ，Ｊ＝５２．８Ｈｚ，４．２Ｈｚ，１Ｈ），４．４０（ｔ，Ｊ＝５．４Ｈｚ，１Ｈ），４．２３－４．３４（ｍ，６Ｈ），４．００－４．０８（ｍ，１Ｈ），３．７８－３．８０（ｍ，３Ｈ），３．７７（ｓ，６Ｈ），３．４５－３．５７（ｍ，２Ｈ），３．３６（ｄｄ，Ｊ＝１１．０Ｈｚ，２．９Ｈｚ，１Ｈ），３．３０（ｄｄ，Ｊ＝１１．０Ｈｚ，２．６Ｈｚ，１Ｈ），３．２６（ｓ，３Ｈ），２．８２（ｔ，Ｊ＝５．９Ｈｚ，２Ｈ），１．４０（ｓ，３Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（ＣＤ３ＣＮ，１００ＭＨｚ）δ １６４．８，１６４．３，１６０．２，１５２．１，１５１．４，１４５．９，１４２．２，１３７．３，１３６．６，１３６．５，１３１．５，１２９．４，１２５．１，１１４．６，１１２．３，１０３．３，９５．５，９３．６，９１．４，９１．１，８８．３，８７．３，８３．５，８１．７，８１．４，７７．６，７７．５，７３．４，７１．７，６９．７，６９．５，６８．０，６７．９，６４．７，６４．１，５９．６，５６．３，２０．５，２０．４，１２．５．３１Ｐ ＮＭＲ（ＣＤ３ＣＮ，１６２ＭＨｚ）δ ７２．７６．１９Ｆ ＮＭＲ（３７６ＭＨｚ，ＣＤ３ＣＮ）δ －２０３．２１，－２０３．２７，－２０３．３２，－２０３．３６，－２０３．４１，－２０３．４７．Ｃ４３Ｈ４７ＦＮ４Ｏ１５ＰＳ（Ｍ－ＣＨ２ＣＨ２ＣＮ）の分子量：計算値９４１．２５、実測値９４１．２。
Figure 0007348185000035
化合物１．１０：１．２（７．９１ｇ、１１．９ｍｍｏｌ）のピリジン（４０ｍｌ）及びＤＩＰＥＡ（１０．４ｍｌ、５９．５ｍｍｏｌ）溶液に、ＢｚＣｌ（２．２１ｍｌ、１９．０ｍｍｏｌ）を０℃で加えた。反応混合物を室温で１４時間攪拌した。溶媒の除去後、残留物をＣＨ２Ｃｌ２及び飽和ＮａＨＣＯ３（水溶液）で抽出し、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：ＥｔＯＡｃ、２：１、Ｒｆ＝０．３９）によって精製して１．１０（７．６８ｇ、１０．０ｍｍｏｌ、８４％）を得た。
１．１０：Ｒｆ＝０．３９（ヘキサン：ＥｔＯＡｃ、２：１）。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ ８．０９（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ），８．００－８．０６（ｍ，２Ｈ），７．７６（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，１Ｈ），７．５５（ｔ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，２Ｈ），７．１５－７．４４（ｍ，９Ｈ），６．８８－６．９１（ｍ，４Ｈ），５．９４（ｄ，Ｊ＝２０．０Ｈｚ，１Ｈ），５．５６（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），５．２３（ｄｄ，Ｊ＝５３．４Ｈｚ，４．４Ｈｚ，１Ｈ），４．５２（ｄｄｄ，Ｊ＝２３．３Ｈｚ，９．１Ｈｚ，４．４Ｈｚ，１Ｈ），３．９２－４．０９（ｍ，１Ｈ），３．７４（ｓ，６Ｈ），３．４７（ｄ，Ｊ＝１０．３Ｈｚ，１Ｈ），３．２０（ｄｄ，Ｊ＝１１．１Ｈｚ，３．６Ｈｚ，１Ｈ），０．７４（ｓ，９Ｈ），０．０４６（ｓ，３Ｈ），－０．０５２（ｓ，３Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ １６９．３，１６１．９，１５８．２，１４９．６，１４８．７，１４４．３，１４１．８，１３５．６，１３５．１，１３４．９，１３１．０，１３０．５，１２９．８，１２９．４，１２７．９，１２７．７，１２６．９，１２３．９，１１３．２，１００．９，９３．４，９１．６，８９．５，８９．２，８５．９，８１．２，６８．６，６８．４，６１．０，５５．１，２５．４，１７．５，－４．８，－５．４．１９Ｆ ＮＭＲ（３７６ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ －２０２．９２（ｂｒｓ）．Ｃ４３Ｈ４７ＦＮ２ＮａＯ８Ｓｉ（Ｍ＋Ｎａ）の分子量：計算値７８９．３０、実測値７８９．２。
化合物１．１１：１．１０（２．５０ｇ、３．２６ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２（２１ｍｌ）及びＭｅＯＨ（９ｍｌ）溶液に、ＣＨ２Ｃｌ２（１２ｍｌ）及びＭｅＯＨ（５ｍｌ）中、ベンゼンスルホン酸（１．５５ｇ、９．７８ｍｍｏｌ）を－２０℃で滴下した。混合物を同じ温度で１時間撹拌し、５０ｍｌの飽和ＮａＨＣＯ３（水溶液）でクエンチした。有機層を分離し、水層をＣＨ２Ｃｌ２で抽出した。組み合わせ有機層をＮａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、濃縮した。粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：ＥｔＯＡｃ、１：１、Ｒｆ＝０．２１）によって精製して１．１１（１．４０ｇ、３．０１ｍｍｏｌ、９２％）を得た。
１．１１：Ｒｆ＝０．２１（ヘキサン：ＥｔＯＡｃ、１：１）。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ ８．１４（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ），８．０３（ｄ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，２Ｈ），７．８０（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，１Ｈ），７．６１（ｔ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，２Ｈ），５．９０－５．９６（ｍ，２Ｈ），５．３４（ｔ，Ｊ＝４．７Ｈｚ，１Ｈ），５．０９－５．２３（ｍ，１Ｈ），４．３８（ｄｄｄ，Ｊ＝２０．３Ｈｚ，７．６Ｈｚ，４．４Ｈｚ，１Ｈ），３．９２（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），３．８１－３．９５（ｍ，１Ｈ），３．５８（ｄｄｄ，Ｊ＝１２．４Ｈｚ，４．８Ｈｚ，３．０Ｈｚ，１Ｈ），０．８８（ｓ，９Ｈ），０．１２２（ｓ，３Ｈ），０．１１５（ｓ，３Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ １６９．４０，１６１．９，１４８．９，１４１．３，１３５．６，１３１．１，１３０．５，１２９．５，１０１．２，９３．６，９１．８，８８．１，８７．８，８３．６，６８．５，６８．３，５８．７，２５．５，１７．７，－４．９，－５．１．１９Ｆ ＮＭＲ（３７６ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ －２０４．９９，－２０５．０４，－２０５．１０，－２０５．１４，－２０５．１９，－２０５．２３．
化合物１．１２：１．１１（５９５ｍｇ、１．２８ｍｍｏｌ）及び１．５（１．００ｇ、１．２２ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２（３０ｍｌ）溶液に、ＣＨ３ＣＮ（９．７６ｍｌ、２．４４ｍｍｏｌ、Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）中、０．２５Ｍエチルチオ－１Ｈ－テトラゾールを滴下した。混合物を室温で１時間攪拌した。次いで、フェニルアセチルジスルフィド（５３３ｍｇ、１．８３ｍｍｏｌ）及び２，６－ルチジン（０．２１３ｍｌ、１．８３ｍｍｏｌ）を加え、混合物を一晩攪拌した。水性後処理及びシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって、１．１２ａ（８９３ｍｇ、０．７３５ｍｍｏｌ、６０％）及び１．１２ｂ（５６１ｍｇ、０．４６２ｍｍｏｌ、３８％）を得た。
１．１２ａ：Ｓｐ異性体、Ｒｆ＝０．７１（ヘキサン：ＥｔＯＡｃ、１：４）。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ３ＣＮ）δ ９．１０（ｓ，１Ｈ），７．９８－８．００（ｍ，２Ｈ），７．２４ －７．７２（ｍ，１４Ｈ），６．８８－６．９０（ｍ，４Ｈ），５．９９（ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，１Ｈ），５．９０（ｄｄ，Ｊ＝１８．５Ｈｚ，１．１Ｈｚ，１Ｈ），５．８４（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ），５．２７（ｄｄｄ，Ｊ＝１０．８Ｈｚ，５．１Ｈｚ，２．９Ｈｚ，１Ｈ），４．９９ －５．１３（ｍ，１Ｈ），４．５６（ｄｄｄ，Ｊ＝１１．６Ｈｚ，６．６Ｈｚ，１．８Ｈｚ，１Ｈ），４．４７（ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，１Ｈ），４．２７－４．３５（ｍ，３Ｈ），４．１２－４．１８（ｍ，３Ｈ），３．７８－３．８０（ｍ，２Ｈ），３．７７（ｓ，６Ｈ），３．４８－３．５２（ｍ，２Ｈ），３．４０（ｄｄ，Ｊ＝１０．９Ｈｚ，３．０Ｈｚ，１Ｈ），３．３３（ｄｄ，Ｊ＝１１．０Ｈｚ，２．７Ｈｚ，１Ｈ），３．２４（ｓ，３Ｈ），２．７０（ｄｄ，Ｊ＝９．３Ｈｚ，５．６Ｈｚ，２Ｈ），１．４１（ｓ，３Ｈ），０．９１（ｓ，９Ｈ），０．１４（ｓ，３Ｈ），０．１３（ｓ，３Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤ３ＣＮ）δ ２２５．９，１７０．７，１６４．８，１６３．５，１６０．３，１５２．０，１５０．６，１４５．９，１４２．３，１３６．７，１３６．６，１３２．７，１３１．７，１３１．５，１３０．８，１２９．４，１２５．２，１１８．７，１１４．６，１１２．３，１０３．２，９４．７，９２．９，９１．２，９０．８，８８．４，８７．５，８３．６，８２．５，８２．４，８１．４，８１．３，７７．９，７３．５，７１．７，７０．６，７０．４，６７．７，６４．６，６４．３，５９．７，５６．３４，２８．２，２６．４，２０．５，２０．４，１９．０，１５．７，１２．６，－４．２，－４．４．３１Ｐ ＮＭＲ（ＣＤ３ＣＮ，１６２ＭＨｚ）δ ７２．５７．１９Ｆ ＮＭＲ（ＣＤ３ＣＮ，３７６ＭＨｚ）δ －２０４．２３，－２０４．２８，－２０４．３３，－２０４．３７，－２０４．４２，－２０４．４８．Ｃ５９Ｈ６９ＦＮ５ＮａＯ１６ＰＳＳｉ（Ｍ＋Ｎａ）の分子量：計算値１２３６．３８、実測値１２３６．３。
１．１２ｂ：Ｒｐ異性体、Ｒｆ＝０．４０（ヘキサン：ＥｔＯＡｃ、１：４）。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ３ＣＮ）δ ９．１１（ｓ，１Ｈ），７．９７－７．９９（ｍ，２Ｈ），７．２４－７．６５（ｍ，１４Ｈ），６．８８－６．９０（ｍ，４Ｈ），６．００（ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，１Ｈ），５．８２－５．８９（ｍ，２Ｈ），５．３１（ｄｄｄ，Ｊ＝１０．９Ｈｚ，５．０Ｈｚ，３．１Ｈｚ，１Ｈ），５．０２（ｄｄ，Ｊ＝５２．７Ｈｚ，４．５Ｈｚ，１Ｈ），４．４３（ｔ，Ｊ＝５．７Ｈｚ，１Ｈ），４．２２－４．３４（ｍ，６Ｈ），４．０７－４．０９（ｍ，１Ｈ），３．８０（ｔ，Ｊ＝４．２Ｈｚ，２Ｈ），３．７６（ｓ，６Ｈ），３．４６－３．５７（ｍ，２Ｈ），３．４０（ｄｄ，Ｊ＝１１．０Ｈｚ，２．８Ｈｚ，１Ｈ），３．３４（ｄｄ，Ｊ＝１０．９Ｈｚ，２．６Ｈｚ，１Ｈ），３．２６（ｓ，３Ｈ），２．８２（ｔ，Ｊ＝５．９Ｈｚ，２Ｈ），１．３９（ｓ，３Ｈ），０．８９（ｓ，９Ｈ），０．１３（ｓ，３Ｈ），０．１１（ｓ，３Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤ３ＣＮ）δ １７０．７，１６４．８，１６３．５ １６０．３，１５１．９，１５０．６，１４５．９，１４２．０，１３７．４，１３６．８，１３６．５，１３２．７，１３１．７，１３１．６，１３１．５，１３０．８，１２９．４，１２５．２，１１９．０，１１８．７，１１４．６，１１２．３，１１１．１，１０３．２，９４．８，９２．９，９１．１，９０．７，８８．４，８７．５，８３．６，８２．３，８２．２，８１．５，８１．４，７７．８，７３．４，７１．８，７０．３，７０．１，６７．２，６４．９，６４．８，６４．１，５９．６，５６．３，２６．４，２０．６，２０．５，１９．０，１２．６，－４．２，－４．４．３１Ｐ ＮＭＲ（ＣＤ３ＣＮ，１６２ＭＨｚ）δ ７３．０５．１９Ｆ ＮＭＲ（ＣＤ３ＣＮ，３７６ＭＨｚ）δ －２０３．９４，－２０３．９９，－２０４．０５，－２０４．０８，－２０４．１３，－２０４．１９．Ｃ５９Ｈ６９ＦＮ５ＮａＯ１６ＰＳＳｉ（Ｍ＋Ｎａ）の分子量：計算値１２３６．３８、実測値１２３６．３。
化合物１．１３ａ：化合物１．１２ａ（８７５ｍｇ、０．７２１ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（１５ｍｌ）溶液に、トリエチルアミン三フッ化水素酸塩（０．４６８ｍｌ、８．６５ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を一晩撹拌してから濃縮した。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２中、５％ＭｅＯＨ、Ｒｆ＝０．４６）による精製によって１．１３ａ（６９８ｍｇ、０．６３５ｍｍｏｌ、８８％）を得た。
１．１３ａ：Ｓｐ異性体、Ｒｆ＝０．４６（ＣＨ２Ｃｌ２中、５％ＭｅＯＨ）。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ３ＣＮ）δ ９．２２（ｓ，１Ｈ），７．９８ －８．００（ｍ，２Ｈ），７．８１（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，１Ｈ），７．２５－７．５７（ｍ，１３Ｈ），６．８９－６．９１（ｍ，４Ｈ），６．００（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，１Ｈ），５．８９（ｄ，Ｊ＝１７．８Ｈｚ，１Ｈ），５．８３（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，１Ｈ），５．２１（ｄｄｄ，Ｊ＝９．６Ｈｚ，４．７Ｈｚ，２．０Ｈｚ，１Ｈ），５．１０（ｄｄ，Ｊ＝５２．７Ｈｚ，４．２Ｈｚ，１Ｈ），４．５３（ｄｄｄ，Ｊ＝１１．７Ｈｚ，６．１Ｈｚ，１．８Ｈｚ，１Ｈ），４．３３－４．４４（ｍ，４Ｈ），４．１２－４．２２（ｍ，３Ｈ），３．８２－３．８６（ｍ，２Ｈ），３．７７（ｓ，６Ｈ），３．４９（ｔ，Ｊ＝４．３Ｈｚ，２Ｈ），３．４３（ｄｄ，Ｊ＝１１．０Ｈｚ，２．９Ｈｚ，１Ｈ），３．３５（ｄｄ，Ｊ＝１１．０Ｈｚ，２．９Ｈｚ，１Ｈ），３．２３（ｓ，３Ｈ），２．７３（ｄｔ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，４．７Ｈｚ，２Ｈ），１．４１（ｓ，３Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤ３ＣＮ）δ ２２５．４，１７０．５，１６４．４，１６３．３，１５９．９，１５１．８，１５０．２，１４５．６，１４１．６，１３６．５，１３６．２，１３６．１，１３２．５，１３１．４，１３１．２，１３０．５，１２９．１，１２４．８，１１４．３，１１２．２，１０２．５，９５．４，９３．６，９０．５，９０．２，８８．２，８６．４，８３．４，８３．３，８１．７，８１．６，８１．２，７８．１，７２．９，７１．６，６８．９，６８．８，６７．３，６４．１，５９．３，５６．０，２０．２，２０．１，１２．２．３１Ｐ ＮＭＲ（ＣＤ３ＣＮ，１６２ＭＨｚ）δ ７２．４２．１９Ｆ ＮＭＲ（３７６ＭＨｚ，ＣＤ３ＣＮ）δ －２０５．０８，－２０５．１３，－２０５．１８，－２０５．２１，－２０５．２７，－２０５．３２．
化合物１．１３ｂ：化合物１．１２ｂ（５４１ｍｇ、０．４４６ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（１０ｍｌ）溶液に、トリエチルアミン三フッ化水素酸塩（０．２８９ｍｌ、５．３５ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を一晩撹拌してから濃縮した。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２中、５％ＭｅＯＨ、Ｒｆ＝０．３８）による精製によって１．１３ｂ（４５６ｍｇ、０．４１５ｍｍｏｌ、９３％）を得た。
１．１３ｂ：Ｒｐ異性体、Ｒｆ＝０．３８（ＣＨ２Ｃｌ２中、５％ＭｅＯＨ）。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ３ＣＮ）δ ９．１７（ｓ，１Ｈ），７．９８（ｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，２Ｈ），７．６５（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，１Ｈ），７．２４－７．６６（ｍ，１３Ｈ），６．８８－６．９０（ｍ，４Ｈ），５．９９（ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，１Ｈ），５．８１－５．８８（ｍ，２Ｈ），５．２９（ｄｄｄ，Ｊ＝１０．８Ｈｚ，５．０Ｈｚ，３．０Ｈｚ，１Ｈ），５．０５（ｄｄ，Ｊ＝５２．５Ｈｚ，４．３Ｈｚ，１Ｈ），４．４３（ｔ，Ｊ＝５．４Ｈｚ，１Ｈ），４．０９－４．３５（ｍ，７Ｈ），３．７９－３．８２（ｍ，２Ｈ），３．７６（ｓ，６Ｈ），３．４８－３．５９（ｍ，２Ｈ），３．４０（ｄｄ，Ｊ＝１１．０Ｈｚ，２．９Ｈｚ，１Ｈ），３．３４（ｄｄ，Ｊ＝１１．０Ｈｚ，２．７Ｈｚ，１Ｈ），３．２６（ｓ，３Ｈ），２．８３（ｔ，Ｊ＝５．９Ｈｚ，２Ｈ），１．４０（ｓ，３Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤ３ＣＮ）δ １７０．３，１６４．４，１６３．１，１５９．９，１５１．６，１５０．２，１４５．６，１４１．６，１３６．６，１３６．５，１３６．２，１３２．４，１３１．４，１３１．２，１３０．５，１２９．１，１２４．８，１１４．３，１１２．０，１０２．８，９５．２，９３．４，９０．６，９０．２，８８．１，８７．１，８３．３，８３．２，８１．６，８１．５，８１．１，７７．４，７７．３，７３．１，７１．４，６９．２，６９．０，６７．４，６７．３，６４．５，６３．８，５９．３，５６．０，２０．２，２０．１，１２．２．３１Ｐ ＮＭＲ（ＣＤ３ＣＮ，１６２ＭＨｚ）δ ７２．８９．１９Ｆ ＮＭＲ（３７６ＭＨｚ，ＣＤ３ＣＮ）δ －２０４．５２，－２０４．５７，－２０４．５８，－２０４．６３，－２０４．６６，－２０４．７１，－２０４．７７．
Figure 0007348185000036
化合物１．１４ａ（Ｓｐ異性体）：化合物１．１３ａ（５００ｍｇ、０．４５５ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２（５ｍｌ）溶液に、２，４，６－コリジン（０．２４１ｍｌ、１．８２ｍｍｏｌ）、及び２－シアノエチルＮ，Ｎ－ジイソプロピルクロロホスホラミダイト（０．１５２ｍｌ、０．６８３ｍｍｏｌ）を０℃で加えた。反応混合物を０℃で３０分間撹拌した。反応混合物をＣＨ２Ｃｌ２（５０ｍｌ）で希釈し、２％ＮａＨＣＯ３（水溶液２０ｍｌ）で洗浄した。有機層を分離し、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させた。濾液を濃縮し、得られた粗製物質をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２：ＥｔＯＡｃ、１：１；Ｒｆ＝０．４３）によって精製して、１．１４ａ（２０８ｍｇ、０．１６０ｍｍｏｌ、３５％）を得た。
１．１４ａ：Ｓｐ異性体、Ｒｆ＝０．４３（ＣＨ２Ｃｌ２：ＥｔＯＡｃ、１：１）。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ３ＣＮ）δ ９．０８（ｓ，１Ｈ），７．２４－７．７７（ｍ，１６Ｈ），６．８８－６．９０（ｍ，４Ｈ），５．８２－５．９９（ｍ，３Ｈ），５．１３－５．３１（ｍ，２Ｈ），４．０９－４．６７（ｍ，８Ｈ），３．３１－３．８７（ｍ，１６Ｈ），３．２４（ｓ，３Ｈ），２．６４－２．８６（ｍ，４Ｈ），１．４１（ｓ，３Ｈ），１．１５－１．２８（ｍ，１２Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤ３ＣＮ）δ ２２５．３，２２５．２，１７０．６，１６４．７，１６３．５，１６０．２，１５２．０，１５１．１，１５０．６，１４５．９，１４２．５，１４２．３，１３６．９，１３６．６，１３２．７，１３１．７，１３１．５，１３０．８，１２９．４，１２８．５，１２５．１，１２０．１，１１８．７，１１４．６，１１２．３，１０３．３，１０３．２，９４．９，９２．４，９１．６，９１．２，８８．４，８７．５，８３．６，８１．７，８１．４，７７．８，７３．６，７３．５，７１．７，７１．０，７０．９，７０．７，６７．８，６７．５，６５．２，６４．６，６４．５，６４．３，６０．３，６０．１，６０．０，５９．８，５９．７，５６．３，４８．７，４４．７，４４．５，２５．５，２５．４，２５．３，２５．２，２５．１９，２５．２，２３．１，２１．７，２１．５，２１．４，２０．５，２０．４，１４．４，１２．６，２．３，２．１，１．９，１．７，１．５，１．３，１．１．３１Ｐ ＮＭＲ（ＣＤ３ＣＮ，１６２ＭＨｚ）δ １５６．４０，１５６．３６，１５６．２８，７２．６７．１９Ｆ ＮＭＲ（３７６ＭＨｚ，ＣＤ３ＣＮ）δ －２０１．７５，－２０１．８７，－２０２．３７，－２０２．５２．
化合物１．１４ｂ（Ｒｐ異性体）：化合物１．１３ｂ（４００ｍｇ、０．４１８ｍｍｏｌ）のＣＨ３ＣＮ（５ｍｌ）溶液に、ジイソプロピルエチルアンモニウムテトラゾリド（１４２ｍｇ、０．８３６ｍｍｏｌ、ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ Ｃｏｒｐ．）、及び２－シアノエチルＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトライソプロピルホスホロジアミダイト（０．２００ｍｌ、０．６２８ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温で２時間攪拌した。反応混合物を５０ｍｌのＥｔＯＡｃで希釈し、２％ＮａＨＣＯ３（水溶液２０ｍｌ）で洗浄した。有機層を分離し、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させた。濾液を濃縮し、得られた粗製物質をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２：ＥｔＯＡｃ、１：１；Ｒｆ＝０．２３）によって精製して１．１４ｂ（２００ｍｇ、０．１５４ｍｍｏｌ、３７％）を得た。
１．１４ｂ：Ｒｐ異性体、Ｒｆ＝０．２３（ＣＨ２Ｃｌ２：ＥｔＯＡｃ、１：１）。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ３ＣＮ）δ ８．９９（ｓ，１Ｈ），７．２４－７．９９（ｍ，１６Ｈ），６．８８－６．９０（ｍ，４Ｈ），５．９９（ｄｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，３．０Ｈｚ，１Ｈ），５．８７（ｄｄ，Ｊ＝１８．９Ｈｚ，８．５Ｈｚ，１Ｈ），５．８１（ｄｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１．５Ｈｚ，１Ｈ），５．１０－５．３４（ｍ，２Ｈ），４．００－４．４５（ｍ，８Ｈ），３．３２－３．８４（ｍ，１６Ｈ），３．２６（ｓ，３Ｈ），２．６２－２．８４（ｍ，４Ｈ），１．３８（ｓ，３Ｈ），１．１３－１．２４（ｍ，１２Ｈ）．３１Ｐ ＮＭＲ（ＣＤ３ＣＮ，１６２ＭＨｚ）δ １５６．３７，１５６．３２，１５６．１３，１５６．０８，７２．９１，７２．８４．
Ｉ．キラルＯＡＰ単量体の合成
Ｉ－１．キラル的に純粋な５’－Ｏ－（ＤＭＴｒ）－２’－Ｆ－アデノシン（Ｎ６－Ｂｚ）－（Ｓｐ）ホスホラミダイトの合成
Figure 0007348185000037
化合物４ａ：加熱オーブンで乾燥させた１００ｍＬのＲＢＦに、化合物１（（Ｓ）－フェニル（（Ｒ）－ピロリジン－２－イル）メタノール、２ｇ、ｌｌ．２８ｍｍｏｌ、１．０当量）の無水トルエン（１５ｍＬ）溶液を加えた。Ｎ－メチルモルホリン（２．４８ｍＬ、２２．５７ｍｍｏｌ、２当量）をこの溶液に加え、得られた溶液を、－７８℃のアルゴン下で、カニューレを介して、ＰＣｌ３（０．９３５ｍＬ、１０．７２ｍｍｏｌ、０．９５当量）の無水トルエン（１０ｍＬ）撹拌溶液に滴下した。次いで、混合物を室温まで温め、４０分間撹拌した。得られた溶液を、－７８℃のアルゴン下で、カニューレを介して、化合物３ａ（２．６８ｇ、３．９４８ｍｍｏｌ、０．３５当量）の、トリメチルアミン（７．８６ｍＬ、５６．４ｍｍｏｌ、５当量）を含む無水ＴＨＦ（４０ｍＬ）撹拌溶液に滴下した。次いで、反応混合物を室温で３時間撹拌した。ＴＬＣプレートを、ヘキサン溶液中、１％ＴＥＡで中和した。ＴＬＣを、９２％：５％：３％（ＥｔＯＡｃ：ＡＣＮ：ＴＥＡ）で溶出した。反応混合物を、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液でクエンチし、酢酸エチルで抽出した。組み合わせ有機溶液を無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、濃縮して淡黄色の泡を得た。９２％：５％：３％（ＥｔＯＡｃ：ＡＣＮ：ＴＥＡ）の１００％で溶出される１２５濾過シリカゲルカラムを使用するＩＳＣＯカラムクロマトグラフィーによって精製を行って、白色の泡生成物（１．２１ｇ、３５％）を得た。
１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，クロロホルム－ｄ）δ ９．０７（ｓ，１Ｈ），８．８０（ｓ，１Ｈ），８．３１（ｓ，１Ｈ），８．０６－８．００（ｍ，２Ｈ），７．６５－７．５８（ｍ，１Ｈ），７．５３（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，３Ｈ），７．４２－７．３６（ｍ，３Ｈ），７．３６－７．１６（ｍ，１６Ｈ），６．８３－６．７４（ｍ，５Ｈ），６．３１（ｄｄ，Ｊ＝１７．２，１．７Ｈｚ，１Ｈ），５．８８（ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，１Ｈ），５．３２－５．２０（ｍ，２Ｈ），４．３９（ｄｄ，Ｊ＝７．１，３．７Ｈｚ，１Ｈ），３．９４（ｄｑ，Ｊ＝９．０，６．３Ｈｚ，１Ｈ），３．７７（ｄ，Ｊ＝１．４Ｈｚ，８Ｈ），３．６７－３．５３（ｍ，３Ｈ），３．４０（ｄｄ，Ｊ＝１１．１，３．４Ｈｚ，１Ｈ），３．２１（ｔｔ，Ｊ＝１０．６，６．６Ｈｚ，１Ｈ），１．２０（ｄｑ，Ｊ＝１１．７，５．７Ｈｚ，２Ｈ），０．９６（ｄｑ，Ｊ＝１２．６，８．９Ｈｚ，１Ｈ）．３１Ｐ ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ，クロロホルム－ｄ）δ １５５．９１，１５５．８８．
Ｉ－２．キラル的に純粋な５’－Ｏ－（ＤＭＴｒ）－２’－Ｆ－アデノシン（Ｎ６－Ｂｚ）－（Ｒｐ）ホスホラミダイトの合成
Figure 0007348185000038
化合物７：５’－Ｏ－（ＤＭＴｒ）－２’－Ｆ－アデノシン（Ｎ－Ｂｚ）－（Ｒ）ホスホラミダイトを、セクションＩ－１に上記例示したように化合物４ａの合成と同様の方法で、（Ｒ）－フェニル（（Ｓ）－ピロリジン－２－イル）（化合物５）から中間化合物５’－Ｏ－（ＤＭＴｒ）－２’－Ｆ－アデノシン（Ｎ－Ｂｚ）を介して合成を開始することによって得た。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，クロロホルム－ｄ）δ ９．０６（ｓ，１Ｈ），８．７９（ｓ，１Ｈ），８．２２（ｓ，１Ｈ），８．０６－７．９９（ｍ，２Ｈ），７．６６－７．４８（ｍ，３Ｈ），７．４２－７．１１（ｍ，１４Ｈ），６．８３－６．６８（ｍ，４Ｈ），６．３１（ｄｄ，Ｊ＝１６．９，２．２Ｈｚ，１Ｈ），５．８５（ｔ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，１Ｈ），４．３７（ｄｔ，Ｊ＝７．０，３．４Ｈｚ，１Ｈ），３．９８（ｄｑ，Ｊ＝８．６，６．２Ｈｚ，１Ｈ），３．７４（ｄ，Ｊ＝１．７Ｈｚ，６Ｈ），３．６３－３．５１（ｍ，２Ｈ），３．４０（ｄｄ，Ｊ＝１１．０，４．１Ｈｚ，１Ｈ），３．１８－３．０５（ｍ，１Ｈ），２．０４（ｓ，２Ｈ），１．６３（ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，２Ｈ），１．２６－１．１４（ｍ，１Ｈ），０．９６（ｄｑ，Ｊ＝１２．６，８．７Ｈｚ，１Ｈ）．３１Ｐ ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ，クロロホルム－ｄ）δ １５５．８０，１５５．７６．
Ｉ－３．キラル的に純粋な５’－Ｏ－（ＤＭＴｒ）－２’－ＯＭｅ－シチジン（Ｎ４－アセチル）－（Ｓｐ）ホスホラミダイトの合成
Figure 0007348185000039
 化合物８を、Ｉ－１で上記例示したように化合物４ａの合成と同様の方法で、（Ｓ）－フェニル（（Ｒ）－ピロリジン－２－イル）メタノール（化合物１）から中間化合物５’－Ｏ－（ＤＭＴｒ）－２’－ＯＭｅ－シチジン（Ｎ－アセチル）を介して合成を開始することによって得た。
１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，クロロホルム－ｄ）δ ８．９７（ｓ，１Ｈ），８．６６（ｄ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，１Ｈ），７．４５－７．３９（ｍ，２Ｈ），７．３４（ｑ，Ｊ＝２．９Ｈｚ，５Ｈ），７．３２－７．２３（ｍ，９Ｈ），７．０３（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），６．９０－６．８２（ｍ，４Ｈ），５．９４（ｓ，１Ｈ），５．８９（ｄ，Ｊ＝６．２Ｈｚ，１Ｈ），４．７３（ｄｄｄ，Ｊ＝９．５，７．４，４．８Ｈｚ，１Ｈ），４．３１（ｄｔ，Ｊ＝９．７，２．２Ｈｚ，１Ｈ），３．８７（ｄｑ，Ｊ＝９．２，６．４Ｈｚ，２Ｈ），３．８１（ｄ，Ｊ＝３．０Ｈｚ，８Ｈ），３．６６－３．４９（ｍ，７Ｈ），２．２１（ｓ，３Ｈ），１．６７（ｓ，４Ｈ），１．１６（ｄｔｄ，Ｊ＝１２．５，６．２，３．７Ｈｚ，２Ｈ），０．９６（ｄｑ，Ｊ＝１２．５，９．２Ｈｚ，１Ｈ）．３１Ｐ ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ，クロロホルム－ｄ）δ １５８．１７，１５４．１８．
Ｉ－４．キラル的に純粋な５’－Ｏ－（ＤＭＴｒ）－２’－ＯＭｅ－シチジン（Ｎ４－アセチル）－（Ｒｐ）ホスホラミダイトの合成
Figure 0007348185000040
 化合物９を、Ｉ－１で上記例示したように化合物４ａの合成と同様の方法で、（Ｒ）－フェニル（（Ｓ）－ピロリジン－２－イル）メタノール（化合物５）から中間化合物５’－Ｏ－（ＤＭＴｒ）－２’－ＯＭｅ－シチジン（Ｎ－アセチル）を介して合成を開始することによって得た。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，クロロホルム－ｄ）δ ９．２８（ｓ，１Ｈ），８．５５（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），７．４２－７．１６（ｍ，１６Ｈ），６．９６（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），６．９１－６．７３（ｍ，４Ｈ），６．０１（ｓ，１Ｈ），５．７６（ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，１Ｈ），４．７３（ｄｄｄ，Ｊ＝９．２，７．７，４．７Ｈｚ，１Ｈ），４．３１（ｄｔ，Ｊ＝９．３，２．３Ｈｚ，１Ｈ），３．９９－３．８６（ｍ，２Ｈ），３．８６－３．６８（ｍ，９Ｈ），３．６７－３．５０（ｍ，４Ｈ），３．１７（ｔｄｄ，Ｊ＝１０．５，７．７，５．８Ｈｚ，１Ｈ），２．２３（ｓ，３Ｈ），２．０４（ｓ，２Ｈ），１．６６－１．５６（ｍ，２Ｈ），１．２３－１．１４（ｍ，１Ｈ）．３１Ｐ ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ，クロロホルム－ｄ）δ １５７．６３．
Ｉ－５．キラル的に純粋な５’－Ｏ－（ＤＭＴｒ）－２’－Ｆ－アデノシン（Ｎ６－ＤＭＦ）－（Ｓｐ）ホスホラミダイトの合成
Figure 0007348185000041
化合物１１：加熱オーブンで乾燥させた２００ｍＬのＲＢＦに、化合物１（（Ｓ）－フェニル（（Ｒ）－ピロリジン－２－イル）メタノール、３ｇ、１６．９３ｍｍｏｌ、１．０当量）の無水トルエン溶液（２５ｍＬ）を加えた。Ｎ－メチルモルホリン（３．７２ｍＬ、３３．８５ｍｍｏｌ、２当量）をこの溶液に加え、得られた溶液を、－７８℃のアルゴン下で、カニューレを介して、ＰＣｌ３（１．４０３ｍＬ、１６．０８ｍｍｏｌ、０．９５当量）の無水トルエン（１５ｍＬ）撹拌溶液に滴下した。次いで、混合物を室温まで温め、４０分間撹拌した。得られた溶液を、７８℃のアルゴン下で、カニューレを介して、５’－Ｏ－（ＤＭＴｒ）－２’－Ｆ－アデノシン（Ｎ－ＤＭＦ）化合物１０（３．７１ｇ、５．９３ｍｍｏｌ、０．３５当量）の、トリメチルアミン（１１．８ｍＬ、８４．６５ｍｍｏｌ、５当量）を含む無水ＴＨＦ（６０ｍＬ）撹拌溶液に滴下した。次いで、反応混合物を室温で３時間撹拌した。ＴＬＣプレートを、ヘキサン溶液中、１％ＴＥＡで中和した。ＴＬＣを、９２％：５％：３％（ＥｔＯＡｃ：ＡＣＮ：ＴＥＡ）で溶出した。反応混合物を、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液でクエンチし、酢酸エチルで抽出した。組み合わせ有機溶液を、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、濃縮して、淡黄色の泡を得た。９２％：５％：３％（ＥｔＯＡｃ：ＡＣＮ：ＴＥＡ）の１００％で溶出される１２５濾過シリカゲルカラムを使用するＩＳＣＯカラムクロマトグラフィーによって精製を行って、白色の泡生成物（３．４３ｇ、６９．３％）を得た。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，クロロホルム－ｄ）δ ８．９６（ｓ，１Ｈ），８．５３（ｓ，１Ｈ），８．１５（ｓ，１Ｈ），７．４３－７．１２（ｍ，１５Ｈ），６．８０－６．７０（ｍ，４Ｈ），６．２６（ｄｄ，Ｊ＝１８．３，１．７Ｈｚ，１Ｈ），５．８９（ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，１Ｈ），５．３０（ｄｔｄ，Ｊ＝１６．３，８．２，４．５Ｈｚ，１Ｈ），４．３４（ｄｄ，Ｊ＝７．７，３．３Ｈｚ，１Ｈ），３．９５（ｄｑ，Ｊ＝８．９，６．３Ｈｚ，１Ｈ），３．７６（ｄ，Ｊ＝１．３Ｈｚ，６Ｈ），３．６５－３．５１（ｍ，２Ｈ），３．３５（ｄｄ，Ｊ＝１１．０，３．５Ｈｚ，１Ｈ），３．２６（ｓ，３Ｈ），３．２１（ｓ，４Ｈ），２．０４（ｓ，１Ｈ），１．１８（ｄｔ，Ｊ＝１１．６，５．９Ｈｚ，１Ｈ），０．９５（ｄｑ，Ｊ＝１２．５，８．９Ｈｚ，１Ｈ）．３１Ｐ ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ，クロロホルム－ｄ）δ １５４．９７，１５４．９４．
Ｉ－６．キラル的に純粋な５’－Ｏ－（ＤＭＴｒ）－２’－Ｆ－アデノシン（Ｎ６－ＤＭＦ）－（Ｒｐ）ホスホラミダイトの合成
Figure 0007348185000042
 化合物１２を、Ｉ－５に上記例示したように化合物１１の合成と同様の方法で、（Ｒ）－フェニル（（Ｓ）－ピロリジン－２－イル）メタノール（化合物５）から中間化合物５’－Ｏ－（ＤＭＴｒ）－２’－Ｆ－アデノシン（Ｎ－ＤＭＦ）を介して合成を開始することによって得た。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，クロロホルム－ｄ）δ ８．９４（ｓ，１Ｈ），８．０８（ｓ，１Ｈ），７．４０－７．３３（ｍ，３Ｈ），７．３３－７．１９（ｍ，１０Ｈ），７．１９－７．０９（ｍ，３Ｈ），６．７６－６．６７（ｍ，４Ｈ），６．２６（ｄｄ，Ｊ＝１８．１，２．１Ｈｚ，１Ｈ），５．８３（ｄｄ，Ｊ＝２０．８，５．５Ｈｚ，２Ｈ），５．３７－５．２２（ｍ，１Ｈ），４．３３（ｄｔ，Ｊ＝７．２，３．５Ｈｚ，１Ｈ），３．９９（ｄｑ，Ｊ＝８．７，６．２Ｈｚ，１Ｈ），３．７３（ｓ，６Ｈ），３．６１－３．４８（ｍ，２Ｈ），３．３６（ｄｄ，Ｊ＝１０．９，４．２Ｈｚ，１Ｈ），３．２６（ｓ，３Ｈ），３．２１（ｓ，３Ｈ），３．１４－３．０１（ｍ，１Ｈ），２．０４（ｓ，１Ｈ），１．５９（ｑ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，２Ｈ），１．１８（ｄｔ，Ｊ＝１２．０，６．１Ｈｚ，１Ｈ）．３１Ｐ ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ，クロロホルム－ｄ）δ １５４．６９，１５４．６４．
Ｉ－７．キラル的に純粋な５’－Ｏ－（ＤＭＴｒ）－２’－ＯＭｅ－グアノシン（Ｎ２－ＤＭＦ）－（Ｓｐ）ホスホラミダイトの合成：
Figure 0007348185000043
 化合物１３を、Ｉ－５に上記例示したように化合物１１の合成と同様の方法で、（Ｓ）－フェニル（（Ｒ）－ピロリジン－２－イル）メタノール（化合物１）から中間化合物５’－Ｏ－（ＤＭＴｒ）－２’－ＯＭｅ－グアノシン（Ｎ－ＤＭＦ）を介して合成を開始することによって得た。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，クロロホルム－ｄ）δ ８．６１（ｓ，１Ｈ），７．８０（ｓ，１Ｈ），７．４７－７．３９（ｍ，２Ｈ），７．３８－７．１７（ｍ，１１Ｈ），６．８６－６．７７（ｍ，３Ｈ），６．０８（ｄ，Ｊ＝５．２Ｈｚ，１Ｈ），５．７９（ｄ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，１Ｈ），４．９３（ｄｔ，Ｊ＝９．９，４．９Ｈｚ，１Ｈ），４．３６－４．２３（ｍ，２Ｈ），３．８８（ｄｑ，Ｊ＝８．６，６．２Ｈｚ，１Ｈ），３．７８（ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，５Ｈ），３．６４－３．４５（ｍ，２Ｈ），３．４２－３．３１（ｍ，３Ｈ），３．２３－３．０４（ｍ，６Ｈ），２．０４（ｓ，１Ｈ），１．３０－１．１６（ｍ，２Ｈ），０．９７（ｄｑ，Ｊ＝１２．５，８．７Ｈｚ，１Ｈ）．３１Ｐ ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ，クロロホルム－ｄ）δ １５５．５２．
Ｉ－８．キラル的に純粋な５’－Ｏ－（ＤＭＴｒ）－２’－ＯＭｅ－グアノシン（Ｎ２－ＤＭＦ）－（Ｒｐ）ホスホラミダイトの合成：
Figure 0007348185000044
 化合物１４を、Ｉ－５に上記例示したように化合物１１の合成と同様の方法で、（Ｒ）－フェニル（（Ｓ）－ピロリジン－２－イル）メタノール（化合物５）から中間化合物５’－Ｏ－（ＤＭＴｒ）－２’－ＯＭｅ－グアノシン（Ｎ－ＤＭＦ）を介して合成を開始することによって得た。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，クロロホルム－ｄ）δ ８．６２（ｓ，１Ｈ），７．７５（ｓ，１Ｈ），７．４４－７．１４（ｍ，１５Ｈ），６．８１－６．７０（ｍ，４Ｈ），６．１１（ｄ，Ｊ＝５．９Ｈｚ，１Ｈ），５．７４（ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，１Ｈ），４．８３（ｄｄｄ，Ｊ＝９．６，５．２，３．９Ｈｚ，１Ｈ），４．３５－４．２５（ｍ，２Ｈ），３．９７－３．７２（ｍ，７Ｈ），３．５８（ｄｄｔ，Ｊ＝１４．０，１０．４，７．２Ｈｚ，１Ｈ），３．４８（ｓ，３Ｈ），３．４５－３．３０（ｍ，２Ｈ），３．２３－３．０５（ｍ，７Ｈ），２．０４（ｓ，１Ｈ），１．２１－１．１０（ｍ，１Ｈ），０．９４（ｄｑ，Ｊ＝１２．６，８．８Ｈｚ，１Ｈ）．３１Ｐ ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ，クロロホルム－ｄ）δ １５７．３２．
Ｉ－９．キラル的に純粋な５’－Ｏ－（ＤＭＴｒ）－２’－ＯＭｅ－シチジン（Ｎ４－ＤＭＦ）－（Ｒｐ）ホスホラミダイトの合成：
Figure 0007348185000045
 化合物１５を、Ｉ－５に上記例示したように化合物１１の合成と同様の方法で、（Ｒ）－フェニル（（Ｓ）－ピロリジン－２－イル）メタノール（化合物５）から中間化合物５’－Ｏ－（ＤＭＴｒ）－２’－ＯＭｅ－シチジン（Ｎ－ＤＭＦ）を介して合成を開始することによって得た。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，クロロホルム－ｄ）δ ８．８１（ｓ，１Ｈ），８．２１（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，１Ｈ），７．４３－７．１３（ｍ，１６Ｈ），６．８１－６．６９（ｍ，４Ｈ），５．７２（ｄｄ，Ｊ＝２４．６，６．８Ｈｚ，２Ｈ），４．７４（ｔｄ，Ｊ＝８．５，４．９Ｈｚ，１Ｈ），４．２８（ｄｔ，Ｊ＝９．０，２．４Ｈｚ，１Ｈ），３．９９－３．８５（ｍ，２Ｈ），３．７２（ｄ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，６Ｈ），３．７０－３．５２（ｍ，６Ｈ），３．１３（ｄ，Ｊ＝１３．７Ｈｚ，７Ｈ），１．１７（ｄｔ，Ｊ＝１２．４，６．３Ｈｚ，１Ｈ），０．９５（ｄｑ，Ｊ＝１２．５，８．７Ｈｚ，１Ｈ）．３１Ｐ ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ，クロロホルム－ｄ）δ １５７．４０．
Ｉ－１０．キラル的に純粋な５’－Ｏ－（ＤＭＴｒ）－２’－ＯＭｅ－シチジン（Ｎ４－ＤＭＦ）－（Ｓｐ）ホスホラミダイトの合成：
Figure 0007348185000046
 化合物１６を、Ｉ－５に上記例示したように化合物１１の合成と同様の方法で、（Ｓ）－フェニル（（Ｒ）－ピロリジン－２－イル）メタノール（化合物１）から中間化合物５’－Ｏ－（ＤＭＴｒ）－２’－ＯＭｅ－シチジン（Ｎ－ＤＭＦ）を介して合成を開始することによって得た。
１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，アセトニトリル－ｄ３）δ ８．６６（ｓ，１Ｈ），８．０８（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，１Ｈ），７．４９－７．４２（ｍ，２Ｈ），７．３８－７．２７（ｍ，９Ｈ），７．２７－７．２１（ｍ，２Ｈ），６．８９－６．８１（ｍ，４Ｈ），５．８６（ｄ，Ｊ＝１．８Ｈｚ，１Ｈ），５．７８（ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，１Ｈ），５．６３（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，１Ｈ），４．７８（ｔｄ，Ｊ＝８．５，５．０Ｈｚ，１Ｈ），４．１３（ｄｔ，Ｊ＝８．３，２．７Ｈｚ，１Ｈ），３．９１－３．８３（ｍ，２Ｈ），３．７５（ｓ，６Ｈ），３．６１－３．４４（ｍ，５Ｈ），３．３８（ｄｄ，Ｊ＝１１．２，３．１Ｈｚ，１Ｈ），３．１４（ｓ，３Ｈ），３．１３－３．０２（ｍ，４Ｈ），１．９７（ｓ，１Ｈ），１．６５－１．５４（ｍ，２Ｈ）．３１Ｐ ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ，アセトニトリル－ｄ３）δ １５３．９０．
Ｉ－１１．キラル的に純粋な５’－Ｏ－（ＤＭＴｒ）－２’－ＯＭｅ－アデノシン（Ｎ６－ＤＭＦ）－（Ｓｐ）ホスホラミダイトの合成：
Figure 0007348185000047
 化合物１７を、Ｉ－５に上記例示したように化合物１１の合成と同様の方法で、（Ｓ）－フェニル（（Ｒ）－ピロリジン－２－イル）メタノール（化合物１）から中間化合物５’－Ｏ－（ＤＭＴｒ）－２’－ＯＭｅ－アデノシン（Ｎ－ＤＭＦ）を介して合成を開始することによって得た。
１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，アセトニトリル－ｄ３）δ ８．９０（ｓ，１Ｈ），７．４０－７．１４（ｍ，１７Ｈ），６．７９－６．７２（ｍ，５Ｈ），６．０５（ｄ，Ｊ＝４．０Ｈｚ，１Ｈ），５．７９（ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，１Ｈ），５．１８（ｄｔ，Ｊ＝９．７，５．４Ｈｚ，１Ｈ），４．７４（ｄｄ，Ｊ＝５．０，４．０Ｈｚ，１Ｈ），４．１９（ｄｔ，Ｊ＝５．８，３．７Ｈｚ，１Ｈ），４．０２－３．９１（ｍ，１Ｈ），３．７３（ｄ，Ｊ＝２．１Ｈｚ，７Ｈ），３．５６（ｄｄｄｄ，Ｊ＝１３．５，１０．４，８．０，６．０Ｈｚ，１Ｈ），３．４２（ｓ，４Ｈ），３．２３－３．０２（ｍ，９Ｈ）．３１Ｐ ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ，アセトニトリル－ｄ３）δ １５０．８０．
Ｉ－１２．キラル的に純粋な５’－Ｏ－（ＤＭＴｒ）－２’－ＯＭｅ－アデノシン（Ｎ６－ＤＭＦ）－（Ｒｐ）ホスホラミダイトの合成：
Figure 0007348185000048
 化合物１８を、Ｉ－５に上記例示したように化合物１１と同様の方法で、（Ｒ）－フェニル（（Ｓ）－ピロリジン－２－イル）メタノール（化合物５）から中間化合物５’－Ｏ－（ＤＭＴｒ）－２’－ＯＭｅ－アデノシン（Ｎ－ＤＭＦ）を介して合成を開始することによって得た。
１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，アセトニトリル－ｄ３）δ ８．８９（ｓ，１Ｈ），８．４０（ｓ，１Ｈ），８．１２（ｓ，１Ｈ），７．４４－７．３２（ｍ，５Ｈ），７．３２－７．１３（ｍ，１１Ｈ），６．８０－６．７２（ｍ，４Ｈ），６．０５（ｄ，Ｊ＝４．５Ｈｚ，１Ｈ），５．８９（ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，１Ｈ），５．１５（ｄｔ，Ｊ＝１０．０，５．１Ｈｚ，１Ｈ），４．７０（ｔ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，１Ｈ），４．２５－４．１６（ｍ，１Ｈ），３．９３（ｄｑ，Ｊ＝８．１，６．２Ｈｚ，１Ｈ），３．７１（ｄ，Ｊ＝１．１Ｈｚ，６Ｈ），３．５５－３．３９（ｍ，６Ｈ），３．２９（ｄｄ，Ｊ＝１０．７，４．８Ｈｚ，１Ｈ），３．１５（ｄ，Ｊ＝３．１Ｈｚ，６Ｈ），２．９４（ｔｄｄ，Ｊ＝１０．４，８．０，５．７Ｈｚ，１Ｈ）．３１Ｐ ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ，アセトニトリル－ｄ３）δ １５３．２１．
Ｉ－１３．キラル的に純粋な５’－Ｏ－（ＤＭＴｒ）－２’Ｆ－シチジン（Ｎ４－ＤＭＦ）－（Ｓｐ）ホスホラミダイトの合成：
Figure 0007348185000049
 化合物１９を、Ｉ－５に上記例示したように化合物１１の合成と同様の方法で、（Ｓ）－フェニル（（Ｒ）－ピロリジン－２－イル）メタノール（化合物１）から中間化合物５’－Ｏ－（ＤＭＴｒ）－２’－Ｆ－シチジン（Ｎ－ＤＭＦ）を介して合成を開始することによって得た。
１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，アセトニトリル－ｄ３）δ ８．６８（ｓ，１Ｈ），７．９８（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，１Ｈ），７．４９－７．４１（ｍ，２Ｈ），７．３８－７．２８（ｍ，８Ｈ），７．２８－７．１９（ｍ，５Ｈ），６．８７－６．８０（ｍ，４Ｈ），５．８７（ｄ，Ｊ＝１９．５Ｈｚ，１Ｈ），５．８１（ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，１Ｈ），５．６８（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，１Ｈ），５．１９（ｄ，Ｊ＝４．４Ｈｚ，１Ｈ），４．９４（ｄｔｄ，Ｊ＝２３．６，８．９，４．３Ｈｚ，１Ｈ），４．１７（ｄｔ，Ｊ＝９．２，２．７Ｈｚ，１Ｈ），３．８９（ｄｑ，Ｊ＝８．６，６．２Ｈｚ，１Ｈ），３．７５（ｓ，６Ｈ），３．６０－３．４８（ｍ，２Ｈ），３．３７（ｄｄ，Ｊ＝１１．２，３．３Ｈｚ，１Ｈ），３．１４（ｓ，３Ｈ），３．１２－３．０２（ｍ，４Ｈ），２．１０（ｓ，１Ｈ），１．６９－１．５３（ｍ，２Ｈ）．３１Ｐ ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ，アセトニトリル－ｄ３）δ １５３．７４，１５３．７２
Ｉ－１４．キラル的に純粋な５’－Ｏ－（ＤＭＴｒ）－２’Ｆ－シチジン（Ｎ４－ＤＭＦ）－（Ｒｐ）ホスホラミダイトの合成：
Figure 0007348185000050
 化合物２０を、Ｉ－５に上記例示したように化合物１１の合成と同様の方法で、（Ｒ）－フェニル（（Ｓ）－ピロリジン－２－イル）メタノール（化合物５）から中間化合物５’－Ｏ－（ＤＭＴｒ）－２’－Ｆ－シチジン（Ｎ－ＤＭＦ）を介して合成を開始することによって得ることができる。
Ｉ－１５．キラル的に純粋な５’－Ｏ－（ＤＭＴｒ）－２’Ｆ－グアノシン（Ｎ２－ＤＭＦ）－（Ｒｐ）ホスホラミダイトの合成：
Figure 0007348185000051
 化合物２１を、Ｉ－５に上記例示したように化合物１１の合成と同様の方法で、（Ｒ）－フェニル（（Ｓ）－ピロリジン－２－イル）メタノール（化合物５）から中間化合物５’－Ｏ－（ＤＭＴｒ）－２’－Ｆ－グアノシン（Ｎ－ＤＭＦ）を介して合成を開始することによって得ることができる。
Ｉ－１６．キラル的に純粋な５’－Ｏ－（ＤＭＴｒ）－２’Ｆ－グアノシン（Ｎ２－ＤＭＦ）－（Ｓｐ）ホスホラミダイトの合成：
Figure 0007348185000052
 化合物２２を、Ｉ－５に上記例示したように化合物１１の合成と同様の方法で、（Ｓ）－フェニル（（Ｒ）－ピロリジン－２－イル）メタノール（化合物１）から中間化合物５’－Ｏ－（ＤＭＴｒ）－２’－Ｆ－グアノシン（Ｎ２－ＤＭＦ）を介して合成を開始することによって得ることができる。
Ｉ－１７．キラル的に純粋な５’－Ｏ－（ＤＭＴｒ）－２’Ｆ－ウリジン－（Ｒｐ）ホスホラミダイトの合成：
Figure 0007348185000053
 化合物２３を、Ｉ－５に上記例示したように化合物１１の合成と同様の方法で、（Ｒ）－フェニル（（Ｓ）－ピロリジン－２－イル）メタノール（化合物５）から中間化合物５’－Ｏ－（ＤＭＴｒ）－２’－Ｆ－ウリジンを介して合成を開始することによって得た。
Ｉ－１８．キラル的に純粋な５’－Ｏ－（ＤＭＴｒ）－２’Ｆ－ウリジン－（Ｓｐ）ホスホラミダイトの合成：
Figure 0007348185000054
 化合物２３を、Ｉ－５に上記例示したように化合物１１の合成と同様の方法で、（Ｓ）－フェニル（（Ｒ）－ピロリジン－２－イル）メタノール（化合物１）から中間化合物５’－Ｏ－（ＤＭＴｒ）－２’－Ｆ－ウリジンを介して合成を開始することによって得た。
Ｉ－１９．キラル的に純粋な５’－Ｏ－（ＤＭＴｒ）－２’ＯＭｅ－ウリジン－（Ｒｐ）ホスホラミダイトの合成：
Figure 0007348185000055
 化合物２５を、Ｉ－５に上記例示したように化合物１１の合成と同様の方法で、（Ｒ）－フェニル（（Ｓ）－ピロリジン－２－イル）メタノール（化合物５）から中間化合物５’－Ｏ－（ＤＭＴｒ）－２’－ＯＭｅ－ウリジンを介して合成を開始することによって得た。
Ｉ－２０．キラル的に純粋な５’－Ｏ－（ＤＭＴｒ）－２’ＯＭｅ－ウリジン－（Ｓｐ）ホスホラミダイトの合成：
Figure 0007348185000056
 化合物２６を、Ｉ－５に上記例示したように化合物１１の合成と同様の方法で、（Ｓ）－フェニル（（Ｒ）－ピロリジン－２－イル）メタノール（化合物１）から中間化合物５’－Ｏ－（ＤＭＴｒ）－２’－ＯＭｅ－ウリジン（Ｎ－ＤＭＦ）を介して合成を開始することによって得た。
Ｊ．ジヌクレオチドにおけるホスホロチオエート（ＰＳ）立体化学の割り当て
ヘビ毒ホスホジエステラーゼ（ＳＶＰＤＥ）アッセイ：
キラル的に純粋な完全に脱保護された各ホスホロチオエートジヌクレオチドの１ｍｇ／ｍＬ Ｈ２Ｏ（ヌクレアーゼフリー）溶液を調製し、ヘビ毒ホスホジエステラーゼ（ＳＶＰＤＥ）と共に３７℃で４８時間インキュベートし、逆相ＨＰＬＣで分析した。各サンプルについて、個別の対照を調製した（酵素をＨ２Ｏで置き換えた）。ＳＶＰＤＥと対照実験の実験条件を表５に示す。
Figure 0007348185000057
逆相ＨＰＬＣ条件：ｘＢｒｉｄｇｅ Ｃ１８、３．５μｍ、４．６×１５０ｍｍカラム、緩衝液Ｂ＝アセトニトリル、Ａ＝ｄｄＨ２Ｏ、勾配３％から３０％Ｂ（６分間）、流量１．２ｍＬ／分、又は勾配３％から１５％Ｂ（６分間）。
ＴＬＣ上部スポットのジアステレオマーの結果を用いたヘビ毒ホスホジエステラーゼアッセイを図１０～図１６に示す。
ＴＬＣ下部スポットジアステレオマーの結果を用いたヘビ毒ホスホジエステラーゼアッセイを図１７～図２３に示す。
ホスホジエステラーゼＩＩ（ＰＤＩＩ）アッセイ：
キラル的に純粋な各ホスホロチオエートジヌクレオチドの１ｍｇ／ｍＬ Ｈ２Ｏ（ヌクレアーゼフリー）溶液を調製し、ホスホジエステラーゼＩＩ（ＰＤＩＩ）と共に３７℃で４８時間（及び５日間）インキュベートし、逆相ＨＰＬＣで分析した。各サンプルについて、個別の対照を調製した（酵素をＨ２Ｏで置き換えた）。ＳＶＰＤＥ及び対照実験の実験条件を表６に示す。
Figure 0007348185000058
逆相ＨＰＬＣ条件：ｘＢｒｉｄｇｅ Ｃ１８、３．５μｍ、４．６×１５０ｍｍカラム、緩衝液Ｂ＝アセトニトリル、Ａ＝ｄｄＨ２Ｏ、勾配３％から３０％Ｂ（６分間）、流量１．２ｍＬ／分、又は勾配３％から１５％Ｂ（６分間）。
ＴＬＣ上部スポットのジアステレオマーの結果を用いたホスホジエステラーゼＩＩアッセイを図２４～図３３に示す。
ＴＬＣ下部スポットのジアステレオマーの結果を用いたホスホジエステラーゼＩＩアッセイを図３４～図４３に示す。
Ｋ．キラル的に純粋なＰＳジヌクレオチドを使用したキラル的に純粋なＰＳオリゴヌクレオチドにおけるＰＳ立体化学の割り当て
合成異性体の立体化学配置の割り当て方法
キラル的に純粋なＰＳジヌクレオチドホスホラミダイトビルディングブロックを使用して合成された立体的に純粋なオリゴヌクレオチドの立体化学を予測するために、「精製された異性体の立体化学配置の割り当て方法」（以下のセクションＬ．を参照）で説明される方法と同じ方法を利用した。これらの化合物は異性体混合物として合成されなかったため、オリゴヌクレオチドは、１つ（センス鎖）又は２つ（アンチセンス鎖）のキラル的に純粋な立体中心を含んでいた。３１Ｐ－ＮＭＲを使用して、Ｒｐ異性体又はＳｐ異性体のみが最終精製化合物に存在するかどうか、又はＲｐ異性体とＳｐ異性体の混合物が存在するかどうかを分析的に決定した。イオン交換分析を用いて、Ｒｐ異性体とＳｐ異性体との間の保持時間差を確認した。これを行うために、１つの位置に異なる配置（しかしながら、アンチセンスの場合は反対側の末端に同じ配置）を含む化合物を一定の比率（例えば、７５：２５）で混合して、どの異性体がより速く溶出するかを決定した。これは、５’－ＤＭＴ－オン（ＤＭＴ：ジメトキシトリチル保護基）及び５’末端異性体のＤＭＴ－オフを用いて行って、上記の「精製異性体の立体化学配置の割り当て方法」のセクションで説明されている「フリップ」を視覚化した。
アンチセンス鎖とＲｐ異性体を優先的に分解する３’エキソヌクレアーゼヘビ毒ホスホジエステラーゼ（ＳＶＰＤ）とのインキュベーションを使用して、３’末端のＲｐ割り当て又はＳｐ割り当てのさらなる証拠を提供した。５’エキソヌクレアーゼホスホジエステラーゼＩＩは、ホスホチオエート結合（ＰＳ）を２’－Ｆ修飾ヌクレオチドと組み合わせて使用した。表７は、この方法で同定されたすべての化合物を示す。
Figure 0007348185000059
「上部スポット」及び「下部スポット」の説明は、ホスホラミダイト二量体の合成及びキラル対応物への分離について説明するセクションＡ１～Ｈで確認することができる。表７のすべてのケースで、「（ｇｓａ）」二量体の分離のケースを除いて、上部スポットはＲｐ異性体に対応し、下部スポットはＳｐ異性体に対応することが分かった。「（ｇｓａ）」二量体は逆相によって分離し、その他のすべては順相によって分離した。
キラル的に純粋な二量体を使用して合成したｍｒＴＴＲ異性体の同定
表８は、この実施例で使用されるｍｒＴＴＲ異性体の配置を予測するために使用される方法の要約である。
Figure 0007348185000060
これらの分析では、すべての粗オリゴヌクレオチド濃度は、２６０ｎｍのＵＶ吸光度に基づいて決定し、示された比率で混合し、水で約３ＯＤ／ｍＬに希釈した。注入量は３０μＬとし、サンプルを、４５℃のカラム温度で、Ｄｉｏｎｅｘ ＤＮＡＰａｃ ＰＡ２００イオン交換分析カラム、４ｍｍ×２５０ｍｍ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｃａｔ＃０６３０００）で分離した。緩衝液Ａは、２０ｍＭリン酸ナトリウム、１５％アセトニトリル、ｐＨ１１とし；緩衝液Ｂには１Ｍ臭化ナトリウムも含めた。流量１ｍＬ／分で１６分間に３１％から５７％の勾配を使用して、すべてのサンプルを分析した。
すべてのセンス鎖の５’末端異性体は、５’－ＤＭＴ－オン及び５’－ＤＭＴ－オフで良好な分離を示した。イオン交換分析（ＩＥＸ）中の溶出時間における「フリップ」は、粗化合物が図４４及び図４５に示す比率で混合されている場合、すべてのセンス鎖の異性体（図４５）で観察することができる。
すべてのアンチセンス鎖の５’末端異性体は、５’－ＤＭＴ－オンのみで良好な分離を示した。ＰＳがＳｐ配置にあるオリゴヌクレオチドは、５’－ＤＭＴ－オンのＲｐ配置（遅い）よりも早く（速く）溶出することが分かった（図４６及び図４７）。
４つのアンチセンス鎖異性体をＳＶＰＤと共にインキュベートして、３’末端ジアステレオマーの安定性を評価し、アッセイプロトコル、「３’エキソヌクレアーゼＳＶＰＤ安定性アッセイ」（以下のセクションＯ．を参照）に記載されているように１時間ごとに自動的にサンプリングして分析した。ＳＶＰＤ分解の結果を図４８に示す。図４８は、Ａ－１５２４７８及びＡ－１５２４７９が、Ａ－１５２４８１及びＡ－１５２４８０よりも不安定であることが認められたことを例示する。従って、Ａ－１５２４７８及びＡ－１５２４７９は、３’末端にＲｐ配置を有することが分かった。
キラル的に純粋なジヌクレオチドを使用して合成されたＣ５ ｓｉＲＮＡに使用される異性体の同定
表９は、キラル的に純粋なジヌクレオチドホスホラミダイトを使用して合成されたＣ５異性体の配置を決定するために使用された方法の要約である。
Figure 0007348185000061
Ａ－１５６８２０及びＡ－１５６８２１は、（ｇｓａ）二量体を用いて合成したセンス鎖である。これは、Ｒｆ値（上部スポット）がより高い化合物がＲｐ配置に対応しなかったことが認められた唯一の例である。
キラル的に純粋なジヌクレオチドで作製されたＣ５ ｍＲＮＡを標的とするように設計されたオリゴヌクレオチドは、イオン交換精製のためにＤＭＴ－オフで合成した。ＤＭＴ－オフのイオン交換分析を行って、５’末端センス鎖ジアステレオマー及び３’末端アンチセンスジアステレオマーを確認した。アンチセンス鎖の５’末端ジアステレオマーは、５’－ＤＭＴの存在なしでは、イオン交換分析によって分離されなかった。図４９に示されているように、センス鎖の決定された５’末端のＲｐ異性体は、Ｓｐ異性体と比較して、ＤＭＴ－オフでより早く溶出したが、その差はわずかであった。
アンチセンス鎖の３’末端の異性体（図５０に示されているＡ－１５６８２２及びＡ－１５６８２３、Ａ－１５６８２４及びＡ－１５６８２５）は、イオン交換分離中に分離された。３’末端における異性体は、配列の５’末端におけるＤＭＴの存在による影響を受けなかった。３’末端のＲｐ異性体は、ＤＭＴが５’末端に存在するかどうかに関係なく、常にイオン交換分析中に最初に溶出した。３’末端配置のみが異なるＤＭＴ－オフのオリゴヌクレオチドを、７５：２５の比率を使用するイオン交換分析によって分析した。これらのクロマトグラムでは、勾配は、１２分間に３０％から５０％の緩衝液Ｂとし；サンプルの調製及び分析の他のすべてのパラメーターは上記の通りとした。
各配列の異性体を精製、脱塩、及び凍結乾燥した後、各異性体を、凍結乾燥した化合物を重水１０ｍｇ／ｍＬに溶解することによって３１Ｐ－ＮＭＲ分析に供した。得られた３１Ｐ－ＮＭＲスペクトルを図５１及び図５２に示す。図５１及び図５２は、Ｒｐ配置の２’－ＯＭｅセンス鎖がＳｐ配置（５５．０５ｐｐｍ）と比較して低磁場シフト（５７．２８ｐｐｍ）したことを示す。
図５３は、Ｒｐ異性体のみに対応する、５７．１３ｐｐｍに共鳴ピークを有するアンチセンス鎖Ａ－１５６８２２の３１Ｐ－ＮＭＲスペクトルを示す。図５４は、Ｒｐ異性体及びＳｐ異性体それぞれに対応する、５７．１５ｐｐｍ及び５５．２９ｐｐｍに共鳴ピークを有するアンチセンス鎖Ａ－１５６８２３の３１Ｐ－ＮＭＲスペクトルを示す。
図５５は、Ｒｐ異性体及びＳｐ異性体それぞれに対応する、５７．１６ｐｐｍ及び５５．２７ｐｐｍに共鳴ピークを有するアンチセンス鎖Ａ－１５６８２４の３１Ｐ－ＮＭＲスペクトルを示す。図５６は、Ｓｐ異性体のみに対応する、５５．２７ｐｐｍに単一の共鳴ピークを有するアンチセンス鎖Ａ－１５６８２５の３１Ｐ－ＮＭＲスペクトルを示す。
Ｌ．オリゴヌクレオチドの合成
一般的なオリゴヌクレオチドの合成及び分析
オリゴヌクレオチドは、市販のＲＮＡアミダイト、ウリジンの５’－Ｏ－（４，４’－ジメトキシトリチル）－２’－デオキシ－２’－フルオロ－、及び５’－Ｏ－（４，４’－ジメトキシトリチル）－２’－Ｏ－メチル－３’－Ｏ－（２－シアノエチル－Ｎ、Ｎ－ジイソプロピル）ホスホラミダイト単量体、４－Ｎ－アセチルシチジン、６－Ｎ－ベンゾイルアデノシン、及び２－Ｎ－イソブチリルグアノシンを使用してＢｉｏａｕｔｏｍａｔｉｏｎ Ｍｅｒｍａｄｅ １２合成装置で合成した。標準的な固相オリゴヌクレオチド合成プロトコルを使用した。ＧａｌＮＡｃリガンドを、記載の通りピロリジン足場間のホスホジエステル結合によってｓｉＲＮＡのセンス（Ｓ）鎖の３’末端に共有結合させた（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｎａｉｒ ｅｔ ａｌ．，“Ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ Ｎ－ａｃｅｔｙｌｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｓｉＲＮＡ ｌｏｃａｌｉｚｅｓ ｉｎ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ ａｎｄ ｅｌｉｃｉｔｓ ｒｏｂｕｓｔ ＲＮＡｉ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ，”Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１３６：１６９５８－６１（２０１４）；Ｐａｒｍａｒ ｅｔ ａｌ．，“５’－（Ｅ）－Ｖｉｎｙｌｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ：ａ ｓｔａｂｌｅ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｍｉｍｉｃ ｃａｎ ｉｍｐｒｏｖｅ ｔｈｅ ＲＮＡｉ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｓｉＲＮＡ－ＧａｌＮＡｃ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ，”ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ．１７：９８５－８９（２０１６）を参照）。ホスホロチオエート結合を、ピリジン中、０．１Ｍ ３－（（Ｎ，Ｎ－ジメチル－アミノメチリデン）アミノ）－３Ｈ－１，２，４－ジチアゾール－５－チオン（ＤＤＴＴ）を使用して亜リン酸塩の酸化によって導入した。ホスホロチオエート異性体が合成後に分離された場合は、最終的なジメトキシトリチル保護基は合成の完了後に除去されなかった。
利用した脱保護手順は、２’－Ｆ及び２’－ＯＭｅ修飾オリゴヌクレオチドに適していた。合成後、支持体を、カラム上でアセトニトリル（ＡＣＮ）中、０．５Ｍピペリジンで１５分間処理した。カラムをＡＣＮで洗浄し、ＡＣＮ中、０．５Ｍピペラジンでさらに１５分間処理してから、再度ＡＣＮで洗浄した。支持体を、真空下、カラム上で乾燥させ、次いで、密閉可能な容器に入れ、水酸化アンモニウム水溶液（２８～３０％）で、６０℃で２～３時間加熱した。脱保護手順は、３０℃で一晩振盪することで完了した。次いで、オリゴヌクレオチドを濾過して、５倍量の水で支持体を除去し、ＬＣ－ＭＳ及びイオン交換分析によって分析して、上記のＮａｉｒら及びＰａｒｍａｒらに記載されているように粗生成物の質を決定した。
イオン交換ＨＰＬＣ精製のカラムサイズは、スケール（総ＯＤ負荷）に依存した。Ｔｏｓｏｈ ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎのＴＳＫｇｅｌ Ｓｕｐｅｒ Ｑ－５ＰＷ（２０）陰イオン交換樹脂を精製に使用した。精製緩衝液Ａは、２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ８．５）、１５％ＡＣＮからなり、緩衝液Ｂは、２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ８．５）、１５％ＡＣＮ、１Ｍ臭化ナトリウムとした。合成後に異性体の分離を行わないのであれば、約２０カラム容量で１５％から４５％の勾配で十分であった。勾配開始時間は、粗生成物のイオン交換分析における全長生成物の保持時間に応じて調整した。Ｄｉｏｎｅｘ ＤＮＡＰａｃ ＰＡ２００イオン交換分析カラム、４ｍｍ×２５０ｍｍ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｃａｔ＃０６３０００）を室温で使用するイオン交換分析によって画分を分析した。緩衝液Ａは、２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ１２）、１５％アセトニトリル、緩衝液Ｂは、２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ１２）、１５％アセトニトリル、１Ｍ臭化ナトリウムとした。流量１ｍｌ／分で１２分間に３０％から５０％の勾配を画分の分析に使用した。
８５％を超える純度の画分をプールし、乾燥させ、水に溶解し、サイズ排除カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で、流量１０ｍｌ／分で脱塩した。脱塩した最終生成物を乾燥させ、水に再懸濁し、０．２μｍのポリエーテルスルホンフィルターで濾過し、２６０ｎｍでの吸光度の定量分析を行った。約１ＯＤ／ｍｌのサンプルを、ＬＣ－ＭＳ及びイオン交換分析によって評価した。次いで、オリゴヌクレオチドを凍結及び凍結乾燥させてから、等モル量の相補鎖をアニーリングして、９０℃まで加熱して徐冷することによって所望のｓｉＲＮＡ二重鎖を作製した。上記のＮａｉｒら及びＰａｒｍａｒらに記載されているように、ｓｉＲＮＡサンプルを、エンドトキシン及び浸透圧について質量分析及びキャピラリーゲル電気泳動によって分析した。
ジヌクレオチドビルディングブロックを使用した一般的なオリゴヌクレオチドの合成
ジヌクレオチドホスホラミダイトビルディングブロックを手動で結合して、オリゴヌクレオチドを支持した、又は伸長させた。ジヌクレオチドホスホラミダイトは、乾燥アセトニトリル中、０．１５Ｍ溶液として調製した。アクチベーター５－（エチルチオ）－１Ｈ－テトラゾール（乾燥アセトニトリル中、０．２５Ｍ溶液）を使用した。１回の１５分のカップリング時間を使用した。
Ｍ．オリゴヌクレオチドにおけるＰＳジアステレオマーの立体化学の分離／割り当て（アプローチ１）
アンチセンス鎖Ａ－１２２６２５の４つのジアステレオマーへの精製
５’末端に１つと３’末端に１つの２つのホスホロチオエート結合を含むオリゴヌクレオチドＡ－１２２６２５（５’ＤＭＴ－ａｓＵｆｕＡｆｕＡｆｇＵｆｇＡｆｇｕｕＡｆｕＵｆｕＵｆｇＵｆｃａｓａ－３’）を、４つのジアステレオマーに分離した。サンプルを水で約０．０３ｍｇ／ｍｌに希釈し、３０μｌを、Ｄｉｏｎｅｘ ＤＮＡＰａｃ ＰＡ２００イオン交換分析カラム、４ｍｍ×２５０ｍｍ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）に３０℃のカラム温度で注入した。緩衝液Ａは、２０ｍＭリン酸ナトリウム、１５％アセトニトリル、ｐＨ１１とし、緩衝液Ｂは、１Ｍ臭化ナトリウムを追加した以外は同一とした。流量１ｍＬ／分で１６分間に４０％から６８％の勾配を使用してＤＭＴ－オンのサンプルを分析した。１６分間に３１％から５７％の勾配を使用して、ＤＭＴ－オフのサンプルを分析した（図５７を参照）。カラム温度は３０℃に維持した。ＤＭＴ－オンのＡ－１２２６２５の４つすべてのジアステレオマーのベースライン分離を、イオン交換ＨＰＬＣによって達成した。ＤＭＴ除去後、３’末端異性体のみを分離した。
この上記の分析方法を、分取スケールでの異性体の分離を達成するためにスケールアップした。陰イオン交換Ｄｉｏｎｅｘ ＤＮＡＰａｋ ＰＡ２００（２２ｍｍ×２５０ｍｍ）分取カラム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用し、緩衝液Ａ及びＢは、上記の分析緩衝液と同一とした。勾配は、５．７カラム容量に対応する、流量１２ｍｌ／分で４５分間に４２％から５７％の緩衝液Ｂとし、カラム温度は４０℃に維持した。良好な分離を達成するために、少量の粗製物質（約３．２ｍｇ）を試験ごとに負荷した。８５％以上の異性体純度を得るために、画分を組み合わせて「濃縮」異性体プールを作製し、再精製した。４つの各異性体の最も純粋な領域を、すべての試験でプールし；このようにして、合計５０回の試験を行った。方法が再現可能であったため、これらの領域を、すべての試験からの画分の分析なしでプールした。２つ～４つの５．５ｍＬの画分を、試験ごとに各異性体についてプールし、保持時間は、異性体１の場合は３５～３６．５分、異性体２の場合は３７～３８分、異性体３の場合は３９～４０．５分、及び異性体４の場合は４３．５～４５．５分であった。４つの異性体の精製プロフィールを、各異性体のプール領域を示す図５８に示す。
４つの異性体プールを乾燥させ、サイズ排除カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で、流量１０ｍｌ／分で脱塩し、再び乾燥させ、５ｍｌの２０％酢酸を室温で１０分かけて加えることによって脱トリチル化した。ＰＳからＰＯへの変換を回避するために、インキュベーション時間を最小限にした。次いで、各プールを、１８ｍＬの飽和重炭酸水素ナトリウム溶液を添加して中和した。サンプルを乾燥させ、水に溶解し、サイズ排除によって再び脱塩した。各異性体プールを再精製して、残りの不純物を除去した。キラル純度を決定するために、Ｄｉｏｎｅｘ ＤＮＡＰａｃ ＰＡ２００カラム（４ｍｍ×２５０ｍｍ）を使用して、流量１ｍＬ／分でイオン交換分析を行った。ＤＭＴ－オンのサンプルの分析勾配は、１６分間に４０％から６８％の緩衝液Ｂとした。ＤＭＴ－オフのサンプルでは、勾配は、１６分間に３１％から５７％の緩衝液Ｂとした。２６０ｎｍでのピーク面積の積分値を使用して、キラル純度を決定した。逆相ＬＣ－ＭＳ分析を使用して、質量不純物を検出した。使用したカラムは、Ｗａｔｅｒｓ ＸＢｒｉｄｇｅ（Ｃ８ ２．５μｍ、２．１ｍｍ×５０ｍｍ；ＰＮ １８６００３１０１）とした。緩衝液Ａは、水中、２００ｍＭのヘキサフルオロイソプロパノール及び１６ｍＭのトリエチルアミンとした。緩衝液Ｂは１００％メタノールとした。すべての試薬はＬＣ－ＭＳグレードであった。勾配は、流量０．７ｍＬ／分で９．６分間に０％から４０％メタノールとした。濃縮された異性体プールのイオン交換クロマトグラムを図５９に示し、異性体１、２、３、及び４の最終純度を図６０に示す。
標準的な合成比率で異性体混合物を含む化合物も必要であった。この化合物は、ＤＭＴ－オフで合成され、２０ｍＭリン酸ナトリウム、１５％アセトニトリル、ｐＨ８．５の緩衝液Ａ及び１Ｍ臭化ナトリウムをさらに含む緩衝液Ｂを使用するイオン交換クロマトグラフィーによって精製した。精製は、Ｔｏｓｏｈ ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎのＴＳＫｇｅｌ Ｓｕｐｅｒ Ｑ－５ＰＷ（２０）陰イオン交換樹脂を充填したＷａｔｅｒｓ ２－ＡＰカラムで行った。流量１０ｍｌ／分で１５０分間に１７％から４２％の緩衝液Ｂの勾配を利用した。画分をｐＨ１１ ＩＥＸによって分析し、純度８５％超の画分をプールした。このプールを乾燥させ、水に再懸濁し、上記のようにサイズ排除クロマトグラフィーによって脱塩した。
Ａ－１４１３８１及びＡ－１４１３８２の２つのジアステレオマーへの精製
それぞれ５’末端に１つのＰＳを有する、２つのＧａｌＮＡｃコンジュゲートセンス鎖Ａ－１４１３８１及びＡ－１４１３８２を合成した。表１０に示すように、Ａ－１４１３８１は５’末端に２’Ｆ－Ｇを含み、Ａ－１４１３８２は５’末端に２’ＯＭｅ－Ｇを含んでいた。５’末端のホスホロチオエート異性体の効率的な分離を可能にするＤＭＴ－オンで精製を行った。
Figure 0007348185000062
サンプルを水で約０．０３ｍｇ／ｍＬに希釈し、３０μｌの各サンプルをＤｉｏｎｅｘ ＤＮＡＰａｃ ＰＡ２００イオン交換分析カラム（４ｍｍ×２５０ｍｍ；ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）に注入した。緩衝液Ａは、２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ１１）、１５％アセトニトリルとし、緩衝液Ｂは、２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ１１）、１５％アセトニトリル、１Ｍ臭化ナトリウムとした。流量１ｍｌ／分で１６分間に３１％から５７％の緩衝液Ｂの勾配を使用して、これらのサンプルを分析した。カラム温度は４５℃に維持した。異性体の分離は、図６１に示すようにベースライン（又はベースライン近傍）であった。
異なる陰イオン交換樹脂を使用して、これらの化合物をそれぞれの異性体に精製した（Ｓｏｕｒｃｅ ３０Ｑ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）。この樹脂を、直径２ｃｍのガラスカラム（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ＡＰ－２ Ｇｌａｓｓ Ｃｏｌｕｍｎ、２０ｍｍ×３００ｍｍ）に手動で充填した。緩衝液Ａは、２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ１１）、１５％アセトニトリルとし、緩衝液Ｂは、２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ１１）、１５％アセトニトリル、１Ｍ臭化ナトリウムとした。使用した勾配は、流量１０ｍＬ／分で１５０分間に１５％から５５％の緩衝液Ｂとした。この勾配は、約２１カラム容量に等しい。カラムの温度は６５℃とした。各化合物について３～５回の試験を行い、約８００ ＯＤ／試験を行った。この手順により、８５％超の純度で適切な量の各異性体が得られた。異性体の精製プロフィールを図６２に示す。画分をｐＨ１１ ＩＥＸによって分析し、各異性体の純度８５％超の画分を組み合わせた。
結果として得られた４つの異性体のＤＭＴ－オンのプールを乾燥させ、水に再懸濁し、サイズ排除カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で、流量１０ｍＬ／分で脱塩し、再度乾燥させ、室温で１０分間かけて５ｍＬの２０％酢酸を加えて脱トリチル化した。次いで、各プールを、１８ｍＬの飽和重炭酸水素ナトリウム溶液を添加して中和した。これらの溶液を乾燥させ、オリゴヌクレオチドを再びサイズ排除によって脱塩した。図６３及び図６４のｐＨ １１ ＩＥＸクロマトグラムは、センス鎖異性体の純度を示す。カラム温度の差が、Ａ－１４１３８１（図６３、４５℃）とＡ－１４１３８２（図６４、３０℃）の保持時間の差を説明し得る。
精製異性体の立体化学配置の割り当て方法
立体化学を予測するために、いくつかの方法を利用した。使用した１つのツールは、カップリングされるアミダイトの２’－修飾のサイズと性質に依存する、Ｒｐ異性体とＳｐ異性体の合成比率とした。これらのカップリング反応は、オリゴヌクレオチド合成における所与のカップリング工程中に生成されるジアステレオ異性体比率を表すために、ＰＳジヌクレオチドの合成によって模倣することができる。合成中、これらの比率は、リン酸の保護基（シアノエチル）及びアクチベーター型（０．５Ｍ ＥＴＴ）が一定である限り、合成の規模又はオリゴヌクレオチド配列内の位置により大きな影響を受けない。
Ｒｐ異性体とＳｐ異性体の合成比率を、アクチベーターとして０．５Ｍ ＥＴＴを使用して、可能なすべての２’－Ｆ及び２’－ＯＭｅ（シアノエチル－保護）ジヌクレオチドについて決定した。２’－Ｆ及び２’－ＯＭｅジヌクレオチドのジアステレオマー比率を表１１に示す。この比率は、３１Ｐ－ＮＭＲスペクトルに基づいており、低磁場ジアステレオマー（Ｄｏｗｎｆｉｅｌｄ Ｄｉａｓｔｅｒｅｏｍｅｒ）（Ｒｐ）／高磁場ジアステレオマー（Ｕｐｆｉｅｌｄ Ｄｉａｓｔｅｒｏｍｅｒ）（Ｓｐ）として表わされる。
Figure 0007348185000063
表１１に一覧で示されているジヌクレオチドは、ＡＢＩ合成装置のユニバーサル支持体で４０μＭスケールで合成した。アンモニアを、固体支持体からの切断及び脱保護に使用し、脱保護後に蒸発（真空下での遠心分離）によって除去し、得られた物質を凍結及び凍結乾燥した。サンプルを、５００μＬの重水に５ｍｇの凍結乾燥生成物を溶解することによって、３１Ｐ－ＮＭＲ分析用に調製した。３１Ｐ－ＮＭＲ分析は、２つの理由から使用した。第１に、異性体を５５～６０ｐｐｍの範囲で分離し；イオン交換分析又は逆相ＨＰＬＣ分析では、すべてのジヌクレオチドのすべての異性体が分離するわけではないことが観察された。第２に、完全に脱保護されたジヌクレオチドの場合、Ｒｐ異性体は、高磁場シフトした（較正基準に対して０ｐｐｍから離れている、δ３１Ｐ）Ｓｐ異性体と比較して低磁場シフトしていた（較正基準に対して０ｐｐｍから離れている、δ３１Ｐ）。
３１Ｐ－ＮＭＲ分析はまた、最終的な精製されたオリゴヌクレオチド中にＲＰ異性体又はＳＰ異性体のみか又はＲＰ異性体とＳｐ異性体の混合物が存在するかを決定するための分析方法としても使用した。
異性体を同定するために使用した別の方法は、Ｒｐ異性体がＳｐ異性体よりも早く溶出することが見出されたＨＰＬＣイオン交換分析であった。Ｒｐ異性体は、以下の場合を除いて最初に溶出した：ホスホロチオエート結合が５’末端にあり、ＤＭＴ保護基が残っている場合は、Ｒｐ異性体の前にＳｐ異性体が溶出した。この観察は、合成アプローチ２を使用した異性体の同定で説明されているように、５’末端における異性体配置の確認に役立った。
特に３’末端における精製異性体を同定するために使用した補完的な方法は、エキソヌクレアーゼによる分解の分析によるものであった。Ｓｐ異性体は、３’エキソヌクレアーゼであるヘビ毒ホスホジエステラーゼ（ＳＶＰＤ）に対してＲｐ異性体よりも安定であった。さらに、Ｒｐ異性体は、５’エキソヌクレアーゼ（ＰＤＩＩ）であるホスホジエステラーゼＩＩに対してＳｐ異性体よりもより安定であった。しかしながら、ＰＳ結合が２’－ＯＭｅ修飾と組み合わせられている場合には、ＳＶＰＤ及び／又はホスホジエステラーゼＩＩでのＲｐ異性体及びＳｐ異性体の分解速度にほとんど又はまったく差がなかった。
Ａ－１２２６２５ジアステレオマーの同定
Ａ－１２２６２５は、配列の３’末端の１つと５’末端の１つの２つのＰＳ結合を含み、４つの異なる立体異性体をもたらす。５’－ＤＭＴ保護基の除去後、陰イオン交換ＨＰＬＣ分析によって３’末端異性体のみ分離された。これは、５’末端に１つのＰＳ結合を有するＡ－１２２６２８の合成及び分析によって確認された。表１２に示すように、Ａ－１２２６２８は、３’末端にＰＳ結合がないことを除いて、Ａ－１２２６２５と同じ配列を有する。Ａ－１２２６２８のイオン交換ＨＰＬＣ分析では１つのピークのみが観察され、観察された分離が３’末端異性体に由来することを立証した。
Figure 0007348185000064
表１１に示されているデータに基づくと、Ａ－１２２６２５の３’末端（ａｓａ）二量体の３１Ｐ－ＮＭＲ分析によるジアステレオマー比率は６６：３４（Ｒｐ：Ｓｐ）である。
化合物が合成された後、Ａ－１２２６２５の比率は、イオン交換ＨＰＬＣ分析によると６２：３８であった（図６５）。５’末端の配置に関係なく、３’末端におけるＰＳ結合に対応する異性体を分離した。
５’－ＤＭＴオンのＡ－１２２６２５を分析すると、５’末端ＰＳ異性体と３’末端ＰＳ異性体がイオン交換ＨＰＬＣで分離された（図６６）。図６６で観察されたＡ－１２２６２５についての５９：４１及び５７：４３（Ｒｐ：Ｓｐ）のジアステレオマー比率は、６０：４０（Ｒｐ：Ｓｐ；表１１のａｓＵｆ）の比率と同様であった。さらに、４つの主ピークが合計１００％のＵＶ領域に統合される場合、異性体１及び３（３’－Ｒｐ異性体）は合計の６２％を占めた。異性体２及び４（３’－Ｓｐ異性体）は３８％を占めた。これは、ＤＭＴ－オフのＡ－１２２６２５で観察されたＲｐ：Ｓｐ比率（６２：３８）に対応する（図６５）。
Ａ－１２２６２５の４つの異性体が妥当な純度及び適切な量で得られたら、化合物を３１Ｐ－ＮＭＲ分析によって分析して、異性体の同定の割り当てを確認した。化合物は、凍結乾燥オリゴヌクレオチドを１０ｍｇ／ｍＬの濃度の５５０μＬの重水に溶解することによって調製した。異性体４（５’Ｒ－３’Ｓ）を４．４ｍｇ／ｍＬの濃度で分析した。異性体２、３、及び４、並びに異性体混合物の３１Ｐ－ＮＭＲ分析を図６７～図７０に示す。図６７に示されているように、異性体２（５’Ｓ－３’Ｓ）の５８．０１ｐｐｍの主ピークは、少量の異性体１（５’Ｓ－３’Ｒ）及び／又は異性体３（５’Ｒ－３’Ｒ）の存在が原因であり得る５９．８０ｐｐｍのピークと比較して高磁場シフトした。異性体３（５’Ｒ－３’Ｒ）の３１Ｐ－ＮＭＲスペクトルにおけるＲｐ異性体のピークは６０．３０及び５９．８１ｐｐｍで観察され；Ｓｐ異性体のピークは、５８．０３ｐｐｍで検出されなかった（図６８）。Ｒｐ（５９．７１ｐｐｍ）及びＳｐ（５８．００ｐｐｍ）の両方のピーク特性は、異性体４（５’Ｒ－３’Ｓ）の３１Ｐ－ＮＭＲスペクトルに現れた（図６９）。
４つすべての異性体を含む混合物についての３１Ｐ－ＮＭＲスペクトルの５８．１８ｐｐｍ及び５６．３７ｐｐｍのピークはそれぞれ、Ｒｐ異性体及びＳｐ異性体によるものであった（図７０）。ピーク下の面積を統合すると、Ｒｐ：Ｓｐ比率は約１．４：１．０であり、合成比率と一致した。
ＳＶＰＤアッセイでインキュベートしたサンプルを使用して、３’末端の配置をさらに分析した。Ａ－１２２６２５異性体及び混合物の分析を図７１に示す。各異性体及び混合物の半減期を表１３に一覧で示す。
Figure 0007348185000065
図７１及び表１３の結果は、２’－ＯＭｅと組み合わせたホスホロチオエートを含むサンプル（この場合、３’末端はＰＳ結合と組み合わせた２’－ＯＭｅ－Ａである）が、ＳＶＰＤと共にインキュベートした場合のＲｐ異性体とＳｐ異性体との間の安定性の違いを示したことを例示する。
Ａ－１４１３８１及びＡ－１４１３８２ジアステレオマーの同定
上記の方法を利用して、センス鎖Ａ－１４１３８１及びＡ－１４１３８２の両方で分離された２つの各異性体を同定した（配列は表１０に示されている）。両方の配列は、５’末端に１つのＰＳ結合を含む。Ａ－１４１３８１は、５’末端に２’－Ｆ－Ｇ（Ｇｆ）を有し、Ａ－１４１３８２は、５’末端に２’－ＯＭｅ－Ｇ（ｇ）を有する。
５’末端に（Ｇｆｓａ）を有するＡ－１４１３８１では、合成比率は３０：７０（Ｒｐ：Ｓｐ、表１１）であり、粗化合物のイオン交換クロマトグラムのピーク積分によって得られた比率は、図７２に示すように３４：６６（Ｒｐ：Ｓｐ）であった。５’末端に（ｇｓａ）を有するＡ－１４１３８２では、合成比率は５３：４７（Ｒｐ：Ｓｐ、表１１）であり、実験的に見出された比率は、図７２に示すように５３：４７（Ｒｐ：Ｓｐ）であった。
図７２に示されている各クロマトグラムの２つのピークのより速い移動はＳｐであると決定され、第２のピークはＲｐ（５’－ＤＭＴ－オン）であると決定され、これは表１１のジヌクレオチドの合成比率と一致した。５’－ＤＭＴ基が最終生成物から除去されると、Ｓｐ異性体はより長い保持時間で溶出した（異性体をゆっくりと溶出）。図７７に示されているように、ＤＭＴの存在は、ＤＭＴ－オンの生成物の溶出と比較して、５’末端のＲｐ異性体とＳｐ異性体の溶出に「フリップ」を引き起こす。
各配列の異性体が精製され、ＤＭＴが除去されたら、各異性体を、１０ｍｇ／ｍＬの重水溶液として３１Ｐ－ＮＭＲ分析に供した。得られた３１Ｐ－ＮＭＲスペクトルを図７３～図７６に示す。Ａ－１４１３８１では、異性体１（Ｓｐ）の３１Ｐ－ＮＭＲのスペクトルは、５５．４０ｐｐｍの主共鳴ピークを示し、５７．３６ｐｐｍの不純物Ｒｐ異性体に対して高磁場シフトしている（図７３）。異性体２（Ｒｐ）の３１Ｐ－ＮＭＲスペクトルは、５７．４８ｐｐｍの主共鳴ピークを示し、５５．５７ｐｐｍの不純物Ｓｐ異性体と比較して低磁場シフトしている（図７４）。Ａ－１４１３８２では、異性体１（Ｓｐ）は、５５．０５ｐｐｍに主共鳴ピークを有し、５７．３０ｐｐｍの不純物（Ｒｐ異性体）に対して高磁場シフトしている（図７５）。異性体２（Ｒｐ）は、５７．３７ｐｐｍに主共鳴ピークを有し、５５．３４ｐｐｍの不純物（Ｓｐ異性体）に対して低磁場シフトしている（図７６）。
オキサザホスホリジン（ＯＡＰ）単量体を使用したオリゴヌクレオチドの合成（アプローチ３）
二環式オキサザホスホリジン（ＯＡＰ）単量体を使用した第３のアプローチを、連続したキラル結合を含むすべての化合物に利用した。参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｗａｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｓｅｃｏｎｄ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｃｈｉｒａｌ ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ ｌｉｎｋａｇｅｓ，”Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４２（２２）：１３４５６－６８（２０１４）に記載されているパラメーターに従って、改良合成サイクルを最適化して使用した。２つの個別のサイクルが必要であり、１つは変更サイクルを使用したオリゴヌクレオチドの５’末端又は３’末端のいずれかにおけるキラルＰＳカップリング用であり、もう１つは標準的な固相オリゴヌクレオチド合成プロトコルを使用したＰＯヌクレオチドカップリングの内部ストレッチ用であった。
合成及び特性評価の後、ＯＡＰ単量体を、アセトニトリル：トルエン １：１（ｖ：ｖ）中、０．２Ｍに調製して、ＡＢＩ ３９４自動合成装置ですぐに使用した。ＯＡＰ単量体を使用したキラルＰＳサイクルでは、アセトニトリル中、１Ｍ ４，５－ジシアノイミダゾール及び０．１Ｍ Ｎ－メチルイミダゾールをアクチベーターとして使用した。カップリング効率を高めるために、「二重カップリング」（ＯＡＰ及びアクチベーターの２つの適用；それぞれ７．５分の接触時間）を使用した。カップリング後、無水酢酸／ピリジン／ＴＨＦを含むキャップＡ試薬（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）への２分間の曝露をまず行った（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｉｗａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，“Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ Ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ Ｓｔｅｒｅｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ Ｉｎｃｒｅａｓｅｓ ｔｈｅ Ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，”Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３５（９）：８４５－８５１（２０１７）を参照）。この後、ＴＨＦ（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）中、１０％Ｎ－メチルイミダゾールを含むキャップＡ及びキャップＢを一緒にカラムに流した。カップリング後のキラル亜リン酸トリエステルを硫化するために、ピリジン中、０．１Ｍ ３－（（Ｎ，Ｎ－ジメチル－アミノメチリデン）アミノ）－３Ｈ－１，２，４－ジチアゾール－５－チオン（ＤＤＴＴ）の硫化剤を使用した。十分な硫化を確実にするために、ＤＤＴＴの４つの経路を利用し、各経路で７．５分の接触時間とした。脱トリチル化のために標準的なデブロッキング試薬（ジクロロメタン中、３％ジクロロ酢酸）を使用した。合成の完了後、最後のＤＭＴ保護基を除去し、固体支持オリゴヌクレオチドを含むカラムを、乾燥アセトニトリル中、１Ｍピペリジンに各１０分間、３回曝露した（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｏ’Ｓｈｅａ ｅｔ ａｌ．，“Ａｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｄｅｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ５’－［Ｏ，Ｏ－ｂｉｓ（ｐｉｖａｌｏｙｌｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）］－∈－ｖｉｎｙｌｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，”Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ７４（４２）：６１８２－６１８６（２０１８）を参照）。固体支持体をＡＣＮで洗浄し、乾燥させ、アンモニア水（２８～３０重量％）に懸濁し、６０℃に８～１０時間加熱した。
５’［Ｏ，Ｏ－ビス（ピバロイルオキシメチル））］－（Ｅ）－ビニルホスホネートを含むオリゴヌクレオチドの場合、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｏ’Ｓｈｅａ ｅｔ ａｌ．“Ａｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｄｅｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ５’－［Ｏ，Ｏ－ｂｉｓ（ｐｉｖａｌｏｙｌｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）］－（Ｅ）－ｖｉｎｙｌｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，”Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ７４（４２）：６１８２－６１８６（２０１８）に従って、アンモニア中、５％（ｖ／ｖ）ジエチルアミンを使用して脱保護を行った。
Ｎ． ｉｎ ｖｉｔｒｏ実験
トランスフェクション
初代マウス肝細胞（ＰＭＨ）をｓｉＲＮＡでトランスフェクトしてサイレンシング効率を試験し、示された濃度のｓｉＲＮＡ（５μｌ）を、３８４ウェルプレートの１ウェル当たり４．９μｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭ及び０．１μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉＭａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡ．ｃａｔ＃１３７７８－１５０）と混合し、室温でインキュベートした。１５分後、約５×１０３個の細胞を含む４０μｌのウィリアムズＥ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈ）又はＥＭＥＭ培地（ＡＴＣＣ）をウェルに加えた。ＲＮＡ精製の前に、細胞を２４時間インキュベートした。
自由取り込み
自由取り込み実験をＰＭＨで行った。ｓｉＲＮＡ（示された濃度で５μｌ）を、３８４ウェルプレートの１ウェル当たり５μｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭと混合した。１５分後、約５×１０３個の細胞を含む４０μｌのウィリアムズＥ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈ）又はＥＭＥＭ培地（ＡＴＣＣ）をｓｉＲＮＡ混合物に加えた。ＲＮＡ精製の前に、細胞を２４時間インキュベートした。
ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ ｍＲＮＡ分離キットを使用した全ＲＮＡ単離：
ＤＹＮＡＢＥＡＤｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ｃａｔ＃６１０１２）を使用するＢｉｏＴｅｋ－ＥＬ４０６プラットフォームで自動化プロトコルを使用してＲＮＡを単離した。簡単に述べると、５０μｌの溶解／結合緩衝液及び３μｌの磁気ビーズを含む２５μｌの溶解緩衝液を各ウェルに加えた。プレートを電磁シェーカーで、室温で１０分間インキュベートしてから、磁気ビーズを捕捉し、上清を除去した。次いで、ビーズに結合したＲＮＡを、１５０μｌ／ウェルの緩衝液Ａで２回、１５０μｌ／ウェルの緩衝液Ｂで１回洗浄した。次いで、ビーズを、１５０μｌの溶出緩衝液で洗浄し、再捕捉し、上清を収集した。
ＡＢＩ高性能ｃＤＮＡ逆転写キットを使用したｃＤＮＡ合成
ｃＤＮＡ合成は、ＡＢＩキットＣａｔ＃４３６８８１３を使用して行った。ＤＹＮＡＢＥＡＤＳを使用して単離したＲＮＡを含む３８４ウェルプレートのウェルに、１μｌの１０×緩衝液、０．４μｌの２５×ｄＮＴＰ、１μｌの１０×ランダムプライマー、０．５μｌの逆転写酵素、０．５μｌのＲＮａｓｅ阻害剤、及び６．６μｌのＨ２Ｏを含む１０μｌのマスターミックスを加えた。プレートを密封し、混合し、そして室温で１０分間、電磁シェーカー上でインキュベートし、続いて３７℃で２時間インキュベートした。
リアルタイムＰＣＲ
ｃＤＮＡ（２μｌ）を含む３８４ウェルプレート（Ｒｏｃｈｅ Ｃａｔ＃０４８８７３０１００１）の各ウェルに、０．５μｌのマウスＧＡＰＤＨ ＴａｑＭａｎプローブ（４３５２３３９Ｅ）、０．５μｌのＣ５マウスプローブ（Ｍｍ００４３９２７５＿ｍｌ）、又は適切な標的プローブ、及び５μｌのＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ ４８０プローブマスターミックスを含むマスターミックスを加えた。ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０リアルタイムＰＣＲシステム（Ｒｏｃｈｅ）でリアルタイムＰＣＲを行った。各ｓｉＲＮＡ濃度を２連で分析した。相対的な倍数変化を計算するために、リアルタイムデータを、ΔΔＣｔ法を使用して分析し、非標的対照ｓｉＲＮＡをトランスフェクトした細胞で行われるアッセイに対して正規化した。
Ｏ． ＲＩＳＣローディング実験
全肝臓及びＡｇｏ２関連ｓｉＲＮＡレベルの定量
投与後７日目にマウスを屠殺し、肝臓を液体窒素で急速冷凍し、さらなる分析のために粉砕して粉末にした。全ｓｉＲＮＡ肝臓レベルを、０．２５％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ１００を含むＰＢＳ中、１０ｍｇ／ｍｌで肝臓粉末を再構成することによって測定した。組織懸濁液を、４℃の組織ホモジナイザー（Ｑｉａｇｅｎ ＴｉｓｓｕｅＬｙｓｅｒ ＬＴ）で５０サイクル／秒で５分間、５ｍｍスチール製粉砕ボールでさらに粉砕した。次いで、ホモジナイズしたサンプルを９５℃で５分間加熱し、短時間ボルテックスし、氷上で５分間静置した。次いで、サンプルを、４℃で５分間、２１，０００×ｇで遠心分離した。上清を含むｓｉＲＮＡを新しい管に移した。ｓｉＲＮＡセンス鎖及びガイド鎖のレベルを、以前に公開された方法（どちらも参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、Ｃｈｅｎ，“Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ ｂｙ ｓｔｅｍ－ｌｏｏｐ ＲＴ－ＰＣＲ，”Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３３：ｅ１７９（２００５）；Ｐｅｉ ｅｔ ａｌ．，“Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｉＲＮＡ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｉｎ ｖｉｖｏ，”ＲＮＡ １６：２５５３－６３（２０１０）を参照）に基づいてＴａｑｍａｎ ＰＣＲ（ＳＬ－ＲＴ ＱＰＣＲ）に従ったステムループ逆転写によって定量した。
マウス肝臓からのＡｇｏ２結合ｓｉＲＮＡを、１：１００希釈のプロテアーゼ阻害剤（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｐ８３４０）及び１ｍＭ ＰＭＳＦ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）が新たに加えられて補充された溶解緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ １００）で１００ｍｇ／ｍｌの肝臓粉末溶解物を調製することによって定量した。全肝臓溶解物（１０ｍｇ）を、各Ａｇｏ２免疫沈降（ＩＰ）及び対照ＩＰに使用した。抗Ａｇｏ２抗体は、Ｗａｋｏ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｃｌｏｎｅ Ｎｏ．：２Ｄ４）から購入した。対照マウスＩｇＧは、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ｓｃ－２０２５）から購入した。Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して抗体を沈殿させた。Ａｇｏ２関連ｓｉＲＮＡを、加熱（５０μＬ ＰＢＳ、０．２５％Ｔｒｉｔｏｎ；９５℃、５分）によって溶出し、上記のＣｈｅｎ及びＰｅｉらによって説明されているように、ＳＬ－ＲＴ ＱＰＣＲによって定量した。
ヒトＡｇｏ２関連ｓｉＲＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ定量
Ａｇｏ２結合ｓｉＲＮＡを、ＦＬＡＧ－ＨＡタグ付きヒトＡｇｏ２を過剰発現するＨＥＫ２９３細胞溶解物で定量した（上記のＰｅｉらを参照）。細胞を溶解緩衝液（１００ｍＭ ＫＣｌ、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、０．５ｍＭ ＴＣＥＰ、０．０５％ＮＰ－４０）中で穏やかに揺らしながら室温で３０分間インキュベートすることによってＨＥＫ２９３溶解物を調製した。溶解物を遠心分離（２５，０００×ｇ、２０分、４℃）によって清澄化し、上清アリコートをドライアイスで凍結してから、－８０℃で保存した。各７０μｌのｉｎ ｖｉｔｒｏローディング反応は、３０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＤＴＴ、０．０３ｍｇ／ｍｌクレアチンキナーゼ、２５ｍＭ クレアチンリン酸、１Ｕ／μｌ Ｓｕｐｅｒａｓｅ－Ｉｎヌクレアーゼ阻害剤、１ｍＭ ＡＴＰ、０．２ｍＭ ＧＴＰ、３５μＬのＨＥＫ２９３細胞溶解物、及び７μＬの２００ｎＭ ｓｉＲＮＡ二重鎖（合計１．４ｐｍｏｌ）を含んでいた。ローディング反応物を３７℃で４時間インキュベートした。インキュベーション後、反応物を、４３０μＬの２０ｍｇ／ｍｌ ＱＡＥ ５０陰イオン交換樹脂（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、４℃で１５分間回転させて浄化した。サンプルを酢酸セルロースフィルターカラムに通してＱＡＥ樹脂を除去してから、６０μＬのＰｒｏｔｅｉｎ Ｇ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、３μｌの抗ＨＡ抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，３７２４Ｓ）、並びに１：１００希釈のプロテアーゼ阻害剤（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｐ８３４０）及び１ｍＭ ＰＭＳＦ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）が新たに加えられて補充された６００μｌの溶解緩衝液を添加した。４℃での一晩のインキュベーション（免疫沈降）後、Ａｇｏ２関連のｓｉＲＮＡを加熱（５０μＬ ＰＢＳ、０．２５％Ｔｒｉｔｏｎ；９５℃、５分）により溶出し、上記のＣｈｅｎ及びＰｅｉらによって説明されているＳＬ－ＲＴ ＱＰＣＲによって定量した。
Ｐ． ３’／５’エキソヌクレアーゼアッセイ
３’エキソヌクレアーゼＳＶＰＤ安定性アッセイ
修飾オリゴヌクレオチドを、０．１ｍｇ／ｍｌで５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．２）（Ｌｏｎｚａ Ｃａｔ Ｎｏ．５１２３６）及び１０ｍＭ ＭｇＣｌ２（Ａｍｂｉｏｎ Ｐ／Ｎ ＡＭ９５３０Ｇ）の溶液に加えた。ヘビ毒ホスホジエステラーゼ（ＳＶＰＤ）（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｃａｔ＃ＬＳ００３９２６）を７５０ｍＵ／ｍｌで混合物に加えた。酵素の添加直後に、サンプルをＤｉｏｎｅｘ ＤＮＡＰａｃ ＰＡ２００カラム（４ｍｍ×２５０ｍｍ）に３０℃で注入し、７．５分間かけて４０％から５５％の緩衝液Ｂの勾配で、流量１ｍｌ／分で流した。緩衝液Ａは、２０ｍＭリン酸ナトリウム、１５％アセトニトリル、ｐＨ１１とし；緩衝液Ｂには、１Ｍ臭化ナトリウム（ｐＨ１１）も含めた。アリコートを２４時間にわたって１時間ごとに分析した。完全長オリゴヌクレオチドに対応するピーク下の面積を、０時間の時点（最初の注射）の面積に対して正規化した。半減期の計算では、一次崩壊速度論を前提とした。対照配列、ｄＴ１９ｓｄＴ（ｄＴはデオキシチミジンである）を毎日分析し、半減期を、対照配列の半減期と比較して報告した。酵素を、１ｍｌ管に等分した１０００ｍＵ／ｍｌのストックとして調製し、－２０℃で保存した。新しいアリコートを毎週使用した。
５’エキソヌクレアーゼ、ホスホジエステラーゼＩＩ安定性アッセイ
修飾オリゴヌクレオチドを０．１ｍｇ／ｍｌで、５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ６．５）（Ｓｉｇｍａ Ｃａｔ．Ｓ８７５０－１ｋｇ）及び１０ｍＭ ＭｇＣＬ２（Ａｍｂｉｏｎ Ｐ／Ｎ ＡＭ９５３０Ｇ）の溶液に加えた。ウシ脾臓由来ホスホジエステラーゼＩＩ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｃａｔ＃ＬＳ００３６０２）を５００ｍＵ／ｍｌで混合物に加えた。酵素の添加直後に、サンプルをＤｉｏｎｅｘ ＤＮＡＰａｃ ＰＡ２００カラム（４ｍｍ×２５０ｍｍ）に注入し、７．５分間かけて３７％から５２％の緩衝液Ｂの勾配で流量１ｍｌ／分で流した。緩衝液Ａは、２０ｍＭリン酸ナトリウム、１５％アセトニトリル、ｐＨ１１とし；緩衝液Ｂには、１Ｍ臭化ナトリウムも含めた。アリコートを２４時間にわたって１時間ごとに分析した。完全長オリゴヌクレオチドに対応するピーク下の面積を、０時間の時点（最初の注射）の面積に正規化した。半減期の計算では、一次崩壊速度論を前提とした。対照配列、ｄＴｓｄＴ１９を毎日分析し、半減期を、対照配列の半減期と比較して報告した。酵素を、１ｍｌ管に等分した２０００ｍＵ／ｍｌのストックとして調製し、－２０℃で保存した。新しいアリコートを毎週使用した。
Ｑ． ｉｎ ｖｉｖｏ実験
動物：
マウスを使用するすべての手順は、地方、州、及び連邦の規制に準拠したプロトコルを使用して、認定された検査施設職員が行った。実験プロトコルは、施設内動物管理使用委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）、国際実験動物管理公認協会（Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ａｎｄ Ａｃｃｒｅｄｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）（認定番号：００１３４５）、及び実験動物福祉局（ｏｆｆｉｃｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｗｅｌｆａｒｅ）（認定番号：＃Ａ４５１７－０１）によって承認された。動物実験のサンプル数を決定する場合、ＩＡＣＵＣガイドラインに従って必要とされる、最小数の動物を使用して得られるデータセットを信頼できるようにする数にするために必要な最終数を決定した。すべての動物を、試験開始までの４８時間、社内で順化させた。約８週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手し、各群にランダムに割り当てた。すべての動物を、ＩＡＣＵＣプロトコルに従って処置した。動物に、ｓｉＲＮＡ二重鎖又はＰＢＳ生理食塩水対照を１０μｌ／ｋｇで皮下投与した。ｓｉＲＮＡをリン酸緩衝生理食塩水（Ｇｉｂｃｏ）で希釈した。すべての投与溶液は、注入時まで４℃で保存した。投与後５日又は７日で動物を屠殺した。肝臓を採取し、分析のために急速冷凍した。
サル：
雄カニクイザル（未投与）を試験に使用した。各動物の投与時の体重は２～５ｋｇ以上であり、投与時の年代は若い成体／成体であった。
投与。すべての群の動物は、投与前の一晩（約１２～１８時間）と投与後約４時間絶食させた。被験物質を、１日目に皮下注射によってすべての動物に投与した。皮下用量は、肩甲骨中央部に注射器と針で投与した。各動物に投与するべき被験物質の量は、投与日に得た体重に基づいて計算した。すべての群の用量処方は、ｓｉＲＮＡ被験物質のストック溶液を１×リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で混合することによって用量レベルの要件を満たす適切な濃度で調製した。
薬物動態学（ＰＫ）用の血漿。血液（約１ｍＬ）を、投与の約０．２５時間後、１時間後、４時間後、８時間後、及び２４時間後に各動物から採取した。血液を、大腿静脈の静脈穿刺によって（又は必要に応じて伏在静脈から）Ｋ２ＥＤＴＡ抗凝固剤を含む管に採取し、処理して血漿にした。血液サンプルを穏やかに混合し、遠心分離するまでウェットアイス（破砕）上に置くか又は冷蔵クライオラック（ｃｈｉｌｌｅｄ ｃｒｙｏｒａｃｋ）に入れた。サンプルを、冷蔵遠心分離機（約４℃）において約２７００ｒｐｍで約１０分間遠心分離した。各ＰＫ時点の被験物質のレベルを、ＲＴ－ｑＰＣＲを使用して評価した。
薬力学（ＰＤ）用の血漿。血液（約１ｍＬ）を、各動物から、投与の６日前、３日前、前日、４日後、８日後、１５日後、２２日後、２９日後、３６日後、４３日後、５７日後、７１日後、８５日後、９９日後、１１３日後、１２７日後、１４１日後、１５５日後、及び１６９日後のそれぞれで採取した。血液を、大腿静脈の静脈穿刺によって（又は必要に応じて伏在静脈から）Ｋ２ＥＤＴＡ抗凝固剤を含む管に採取し、処理して血漿にした。血液サンプルを穏やかに混合し、遠心分離するまでウェットアイス（破砕）又は冷蔵クライオラックに入れた。サンプルを、冷蔵遠心分離機（約４℃）において約２７００ｒｐｍで約１０分間遠心分離した。ＰＤ用の循環タンパク質レベルは、適切なＥＬＩＳＡキットを使用して分析した。
肝生検（腹腔鏡）。肝臓生検サンプルを、２匹の動物／群について合計１つの非末端生検（ｎｏｎ－ｔｅｒｍｉｎａｌ ｂｉｏｐｓｙ）／動物に対して、投与の約２４時間後及び１６８時間後（それぞれ２日目及び８日目）に１匹の動物／群／時点から収集した。
遺伝子発現解析（ＲＴ－ｑＰＣＲ）：
ＱＩＡｚｏｌ試薬（Ｑｉａｇｅｎ）を使用したＲＮＡの単離は、ＰＢＳ（１×）洗浄直後の成長している細胞、又はＰＢＳ洗浄後に収集した細胞ペレットに試薬を添加することによって行い、急速冷凍して－８０℃で保存した。或いは、製造者の指示に従って、Ｑｉａｇｅｎ ＲＮＡｅａｓｙキットを使用してサンプルからＲＮＡを単離した。ＲＮＡ濃度を、Ｎａｎｏｄｒｏｐ分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して決定した。ＲＮＡ濃度を、２５ｎｇ／μｌに調整した。ｃＤＮＡを、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓの逆転写キット（カタログ番号４３６８８１４）を使用して、２５０ｎｇのＲＮＡから作製した。ＲＮＡの定量のためのすべてのプローブは、遺伝子発現の分析を可能にする二重標識プローブを有するそれらのＴａｑｍａｎ遺伝子発現系を利用してＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから取得した。標的遺伝子の発現を、二重標識系を利用して各ウェルのＧＡＰＤＨユビキタス対照に対して正規化した。Ｃｐ値を、Ｌｉｇｈｔ Ｃｙｃｌｅｒ ４８０（Ｒｏｃｈｅ）を使用して測定した。以下の式を使用して、相対的遺伝子発現：２－（Ｃ ｔ Ｔａｒｇｅｔ）／２－（Ｃ ｔ Ｃｏｎｔｒｏｌ）を決定した。Ｔａｑｍａｎプローブのカタログ番号：マウスＣ５（Ｍｍ００４３９２７５＿ｍ１）、マウスＧＡＰＤＨ ４３５２３３９Ｅ、マウスＴＴＲ（Ｍｍ００４４３２６７＿ｍｌ）。
血清の収集：
ＩＡＣＵＣ承認プロトコルに従って、最終投与の２４時間後に眼窩後眼出血手順を利用して採血した。サンプルを、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（ＢＤ）血清分離管（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃａｔ＃ＢＤ３６５９６７）に収集した。血清サンプルを、室温で１時間保持した後、微量遠心機において２２×ｇ、室温で１０分間遠心した。－８０℃で保存するために、血清を１．５ｍｌマイクロ遠心管に移した。循環Ｃ５の分析のために収集した血清を、室温で１５分間保持し、その後即座に４℃に下げてから、マイクロ遠心機において２２×ｇ、室温で１０分間遠心分離した。
循環血清トランスチレチンレベル
血清サンプルを１：４０００に希釈し、マウスプレアルブミンの検出専用のＡＬＰＣＯが市販するキット（カタログ番号４１－ＰＡＬＭＳ－Ｅ０１）を使用してアッセイした。タンパク質濃度（μｇ／ｍｌ）を、社内で調製された精製ＴＴＲ標準との比較により決定し、製造者の指示に従った。
循環Ｃ５レベル
循環マウスＣ５レベルを特異的に検出するためにＥＬＩＳＡアッセイを開発した。一次抗体はヤギ抗ヒトＣ５（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ＃Ａ２２０）とし、二次抗体はウシ抗ヤギＩｇＧ－ＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ ８０５－０３５－１８０）とし、これらは、他の種との交差反応性は最小限であった。抗体は０．８ｍｇ／ｍｌで使用した。アッセイはＴＭＢ基質キットを使用して開発し、測定前に硫酸を使用して反応を停止させた。血清サンプルを、分析のために１から５，０００に希釈した。
循環Ａｎｇｐｔｌ３レベル
ＥＬＩＳＡヒトアンジオポエチン様３ Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｃａｔ＃ＤＡＮＬ３０）を製造者のプロトコルに従って使用した。
循環因子１２レベル
ＥＬＩＳＡヒト凝固因子ＸＩＩ全抗原ＥＬＩＳＡキット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ Ｃａｔ＃ＨＦＸＩＩＫＴ－ＴＯＴ）を製造者のプロトコルに従って使用した。
循環アンジオテンシノーゲンレベル
ＥＬＩＳＡヒト全アンジオテンシノーゲンアッセイキット（ＩＢＬ Ｃａｔ＃２７４１２）を製造者のプロトコルに従って使用した。
ＲＮＡとアルゴノート（ＮＨＰ肝臓由来）との共沈
アルゴノートタンパク質を、Ａｇｏ－ＡＰＰ（ペプチドによるアルゴノートタンパク質親和性精製）（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｈａｕｐｔｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｐｅｐｔｉｄｅ－Ｂａｓｅｄ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｒｇｏｎａｕｔｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ Ｕｓｉｎｇ Ａｇｏ－ＡＰＰ”ｉｎ Ｔａｍａｓ Ｄａｌｍａｙ，“ＭｉｃｒｏＲＮＡ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔａｒｇｅｔ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，”ｖｏｌ．１５８０（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ ２０１７）の改良型）を使用して非ヒト霊長類肝臓溶解物から単離した。Ａｇｏ－ＡＰＰは、ヒトタンパク質ＴＮＲＣ６Ｂに由来するペプチドに依存し、このヒトタンパク質ＴＮＲＣ６Ｂは、種を越えてアルゴノートタンパク質のＰＩＷＩドメインの２つのトリプトファン結合ポケットに結合することが知られているいくつかのＧＷ（グリシン、トリプトファン）リピートを含む。ペプチドを、細菌からの精製を可能にするＧＳＴタグ、及び抗ＦＬＡＧ抗体でコーティングされた磁気ビーズによるアルゴノートのプルダウン（ｐｕｌｌｄｏｗｎ）を可能にするＦＬＡＧタグを含むようにさらに修飾した。サンプル溶解物のＡＰＰペプチド及び磁気ビーズとのインキュベーション後、磁石を使用してビーズを固定し、残りの溶解物を除去して廃棄した。ビーズを数回洗浄して、非特異的なバックグラウンド相互作用を取り除いた。アルゴノートがローディングされたｓｉＲＮＡを、サンプルを煮沸することによって溶出し、ＲＴ－ｑＰＣＲによるｓｉＲＮＡの定量のために溶出液を収集した。
実施例３．マウス、ラット、及びＮＨＰにおけるキラル的に純粋なＰＳ異性体の代謝安定性の決定
キラル的に純粋なＰＳ結合を含むオリゴヌクレオチドを、実施例１～２のプロトコル（アプローチ１、２、及び３）を使用して調製した。キラル修飾ヌクレオチド間結合を含むｓｉＲＮＡ二重鎖の代謝安定性を評価した。
ＰＳキラル修飾ｓｉＲＮＡ剤のｍｒＴＴＲ配列及び構成モチーフを表１４～表１９に示す。
Figure 0007348185000066
例示的なｍ／ｒＴＴＲ ｓｉＲＮＡ及びそのキラルＰＳ ｓｉＲＮＡ型を、雌ラット（ｎ＝３）に１０ｍｇ／ｋｇの単回用量で皮下投与した。投与の１日後及び７日後に動物を屠殺した。肝臓を採取し、ホモジナイズし、核酸を抽出してＬＣ－ＭＳによって分析した。１日目及び７日目の雌ラットにおけるｍ／ｒＴＴＲ ｓｉＲＮＡ－ＧａｌＮＡｃコンジュゲートのセンス鎖及びアンチセンス鎖の相対的ｉｎ ｖｉｖｏ代謝安定性プロフィールの結果を図９５～図９７に示す。これらの結果は、立体化学的に純粋なＰＳ結合が、修飾ｓｉＲＮＡのエキソヌクレアーゼ分解に対して強い影響を与えたことを示す。
Figure 0007348185000067
７日目のｓｉＲＮＡ二重鎖の全肝臓レベルを図８５に示す。ｓｉＲＮＡの全Ａｇｏ２レベルを図８６に示し、全肝臓レベルの全Ａｇｏ２パーセンテージを図８７に示す。７日目のノックダウン（ｒＴＴＲタンパク質レベル）を図８８に示す。さらに、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、及び０．７５ｍｇ／ｋｇの漸増用量でＡＤ－１５７６９７（Ｒ／Ｒ－ＲＳ）及びＡＤ－１５７６９８（Ｒ／Ｒ－ＳＳ）をＡＤ－６４２２８（６ＰＳ混合物）と比較する、用量反応ｉｎ ｖｉｖｏ持続時間試験をマウスで行った。結果を図８９に示す。
Figure 0007348185000068
図９０は、ラットにおけるすべてのｍ／ｒＴＴＲ ｓｉＲＮＡの２１日目までの経過観察ｉｎ ｖｉｖｏ活性持続時間試験を示す。図９１～図９３は、ラットにおけるすべてのｍ／ｒＴＴＲ ｓｉＲＮＡの４６日目までの経過観察ｉｎ ｖｉｖｏ活性持続時間試験を示し、各図は、ｓｉＲＮＡ二重鎖の異なるセットを６ＰＳ混合物（ＡＤ－６４２２８）と比較している。
Figure 0007348185000069
これらのｓｉＲＮＡ二重鎖のｈＡｇｏ２ローディングレベルを図９４に示す。
Figure 0007348185000070
Figure 0007348185000071
図７９～図８４は、ラットにおけるこれらの化合物の様々な分類のｉｎ ｖｉｖｏ活性の結果を示す。３つの最も強力な化合物の５８日目までの活性データを示す図８３を除いて、すべての図は２８日目までの活性を示す。
Ｒｐ異性体及びＳｐ異性体は、部位特異的キラル修飾ヌクレオチド間を含むｓｉＲＮＡのｉｎ ｖｉｖｏ安定性に影響を与えた。アンチセンス鎖の３’末端におけるＳｐ異性体は、ｍ／ｒＴＴＲ二重鎖に安定性をもたらしたが、アンチセンス鎖の３’末端におけるＲｐ異性体は、ｍ／ｒＴＴＲ二重鎖に不利益をもたらした。センス鎖の５’末端における固定異性体（ｆｉｘｅｄ ｉｓｏｍｅｒ）は、親よりも安定性を改善しなかった；センス鎖のＳ－異性体の代謝のわずかな増加が観察された（図９６を参照）。
例示的なＦ１２ ｓｉＲＮＡ及びそのキラルＰＳ ｓｉＲＮＡ型を、１０ｍｇ／ｋｇの単回用量で雌ラット（ｎ＝３）に皮下投与した。投与の１日後及び４日後に動物を屠殺した。肝臓を採取し、ホモジナイズし、核酸を抽出してＬＣ－ＭＳによって分析した。１日目及び４日目の雌ラットにおけるＦ１２ ｓｉＲＮＡ及びそのキラルＰＳ ｓｉＲＮＡ型のセンス鎖及びアンチセンス鎖の相対的ｉｎ ｖｉｖｏ代謝安定性プロフィールの結果を図９８Ａ～図９８Ｃに示す。これらの結果は、立体化学的に純粋なＰＳ結合が、修飾ｓｉＲＮＡのエキソヌクレアーゼ分解に対して強い影響を与えたことを示す。
例示的なＦ１２及びＡｎｇｔｐｌ３（ＡＮＧ）ｓｉＲＮＡ及びそれらのキラルＰＳ ｓｉＲＮＡ型を、１０ｍｇ／ｋｇの単回用量でマウス（ｎ＝１）に皮下投与した。投与後１日目又は７日目に動物を屠殺した。肝臓を採取し、ホモジナイズし、核酸を抽出してＬＣ－ＭＳによって分析した。１日目及び７日目のマウスにおけるＦ１２ ｓｉＲＮＡ及びそのキラルＰＳ ｓｉＲＮＡ型のセンス鎖及びアンチセンス鎖の相対的ｉｎ ｖｉｖｏ代謝安定性プロフィールの結果を図９９Ａ及び図９９Ｂに示す。これらの結果は、立体化学的に純粋なＰＳ結合が、修飾ｓｉＲＮＡのエキソヌクレアーゼ分解に対して影響を与えたことを示す。
例示的なＦ１２ ｓｉＲＮＡ及びそのキラルＰＳ ｓｉＲＮＡ型を、１ｍｇ／ｋｇの単回用量でＮＨＰ（ｎ＝１）に皮下投与した。投与後１日目又は７日目に肝生検を行った。肝生検組織を処理し、ホモジナイズし、核酸を抽出してＬＣ－ＭＳによって分析した。１日目及び７日目のＮＨＰにおけるＦ１２ ｓｉＲＮＡ及びそのキラルＰＳ ｓｉＲＮＡ型のセンス鎖及びアンチセンス鎖の相対的ｉｎ ｖｉｖｏ代謝安定性プロフィールの結果を図１００に示す。これらの結果は、立体化学的に純粋なＰＳ結合が修飾ｓｉＲＮＡのエキソヌクレアーゼ分解に対して影響を与えたことを示す。
例示的なＡｎｇｐｔｌ３（ＡＮＧ）ｓｉＲＮＡ及びそのキラルＰＳ ｓｉＲＮＡ型を、３ｍｇ／ｋｇの単回用量でＮＨＰ（ｎ＝１）に皮下投与した。投与後１日目又は７日目に肝生検を行った。肝生検組織を処理し、ホモジナイズし、核酸を抽出してＬＣ－ＭＳによって分析した。１日目及び７日目のＮＨＰにおけるＡＮＧ ｓｉＲＮＡ及びそのキラルＰＳ ｓｉＲＮＡ型のセンス鎖及びアンチセンス鎖の相対的ｉｎ ｖｉｖｏ代謝安定性プロフィールの結果を図１０１Ａ及び図１０１Ｂに示す。これらの結果は、立体化学的に純粋なＰＳ結合が修飾ｓｉＲＮＡのエキソヌクレアーゼ分解に対して影響を与えなかったことを示す。
例示的なＦ１２配列２ ｓｉＲＮＡ及びそのキラルＰＳ ｓｉＲＮＡ型を、１ｍｇ／ｋｇの単回用量でＮＨＰ（ｎ＝１）に皮下投与した。投与後１日目又は７日目に肝生検を行った。肝生検組織を処理し、ホモジナイズし、核酸を抽出してＬＣ－ＭＳによって分析した。１日目及び７日目のＮＨＰにおけるＦ１２配列２ ｓｉＲＮＡ及びそのキラルＰＳ ｓｉＲＮＡ型のセンス鎖及びアンチセンス鎖の相対的ｉｎ ｖｉｖｏ代謝安定性プロフィールの結果を図１０３Ａ及び図１０３Ｂに示す。これらの結果は、立体化学的に純粋なＰＳ結合が、修飾ｓｉＲＮＡのエキソヌクレアーゼ分解に対して影響を与えたことを示す。
例示的なＦ１２配列１ ｓｉＲＮＡ及びそのキラルＰＳ ｓｉＲＮＡ型を、１．５ｍｇ／ｋｇ又は０．５ｍｇ／ｋｇの単回用量でＮＨＰ（ｎ＝１）に皮下投与した。投与後１日目又は７日目に肝生検を行った。肝生検組織を処理し、ホモジナイズし、核酸を抽出してＬＣ－ＭＳによって分析した。１日目及び７日目のＮＨＰにおけるＦ１２配列１及びそのキラルＰＳ ｓｉＲＮＡ型のセンス鎖及びアンチセンス鎖の相対的ｉｎ ｖｉｖｏ代謝安定性プロフィールの結果を図１０２Ａ～図１０２Ｃに示す。これらの結果は、立体化学的に純粋なＰＳ結合が、修飾ｓｉＲＮＡのエキソヌクレアーゼ分解に対して影響を与えたことを示す。
実施例４． ｉｎ ｖｉｔｒｏ並びにマウス、ラット、及びＮＨＰにおけるキラル的に純粋なＰＳ異性体の効力の評価
ラットにおける例示的なＦ１２ ｓｉＲＮＡ及びそのキラルＰＳ ｓｉＲＮＡ型の持続時間試験
例示的なＦ１２ ＥＬＦ ｓｉＲＮＡ及びそのキラルＰＳ ｓｉＲＮＡ型を、ラットでの持続時間試験のために調べ、結果を図１０４Ａ～図１０４Ｃに示す。図１０４Ａは、使用したキラル修飾ｓｉＲＮＡの構成モチーフ、使用した動物と用量、及び試験の期間を含む、持続時間試験の試験デザインを示す。図１０４Ｂは、ラットでの持続時間試験に使用したＦ１２ ＥＬＦ異性体の一覧を示す。図１０４Ｃは、５０日目までのＦ１２ ＥＬＦの持続時間試験の結果を示す。
ラットにおける例示的なＦ１２ ＥＬＦ ｓｉＲＮＡ及びそのセンス鎖キラルＰＳ異性体の持続時間試験
例示的なＦ１２ ＥＬＦ ｓｉＲＮＡ及びそのセンス鎖キラルＰＳ異性体を、２８日目までのラットにおけるｉｎ ｖｉｖｏ相対的タンパク質発現レベルについて調べ、結果を図１０５Ａ～図１０５Ｃに示す。図１０５Ａは、使用したキラル修飾ｓｉＲＮＡの構成モチーフ、使用した動物と用量、及び試験の期間を含む、持続時間試験の試験デザインを示す。図１０５Ｂは、ラットでの持続時間試験に使用したＦ１２ ＥＬＦセンス鎖異性体の一覧を示す。図１０５Ｃは、２８日目までのＦ１２ ＥＬＦセンス鎖異性体の持続時間試験の結果を示す。
例示的なＦ１２ ＥＬＦ ｓｉＲＮＡ及びそのキラルＰＳ ｓｉＲＮＡ型のｉｎ ｖｉｖｏマウス試験
例示的なＦ１２ ＥＬＦ ｓｉＲＮＡ及びそのキラルＰＳ ｓｉＲＮＡ型を、３５日目までのマウスにおけるｉｎ ｖｉｖｏ相対的血漿発現レベルについて調べ、結果を図１０６Ａ～図１０６Ｃに示す。図１０６Ａは、使用したキラル修飾ｓｉＲＮＡの配列変数と構成モチーフ、使用した用量、及び試験の期間を含む試験デザインを示す。図１０６Ｂは、使用したＦ１２ ＥＬＦ異性体の一覧を示す。図１０６Ｃは、３５日目までのＦ１２ ＥＬＦ相対的血漿発現レベルの結果を示す。
Ｆ１２ ＥＬＦ ｓｉＲＮＡ及びそのキラルＰＳ ｓｉＲＮＡ型のｉｎ ｖｉｔｒｏ自由取り込み及びトランスフェクションＩＣ５０の結果
例示的なＦ１２ ＥＬＦ ｓｉＲＮＡ及びそのキラルＰＳ ｓｉＲＮＡ型を、初代マウス肝細胞及び初代カニクイザル肝細胞におけるｉｎ ｖｉｔｒｏ自由取り込みＩＣ５０及びｉｎ ｖｉｔｒｏトランスフェクションＩＣ５０について調べ、結果を図１０７Ａ～図１０７Ｃに示す。図１０７Ａは、使用したキラル修飾ｓｉＲＮＡの配列及び構成モチーフの一覧を示す。図１０７Ｂは、初代マウス及びカニクイザル肝細胞におけるｉｎ ｖｉｔｒｏ自由取り込みＩＣ５０の結果を示す。図１０７Ｃは、初代マウス及びカニクイザル肝細胞におけるｉｎ ｖｉｔｒｏトランスフェクションＩＣ５０の結果を示す。
ＮＨＰにおけるＦ１２ ＥＬＦ ｓｉＲＮＡ及びそのキラルＰＳ ｓｉＲＮＡ型の評価
例示的なＦ１２ ＥＬＦ ｓｉＲＮＡ及びそのキラルＰＳ ｓｉＲＮＡ型を、血漿ＰＤ、血漿ＰＫ、ＮＨＰにおける肝臓レベル、並びに肝臓におけるペプチドによるａｇｏ親和性精製、及びＲＩＳＣにローディングされた全アンチセンスのパーセントについて調べた。結果を図１０８Ａ～図１０８Ｅに示す。図１０８Ａは、使用したキラル修飾ｓｉＲＮＡの用量、配列、及び構成モチーフの一覧を示す。図１０８Ｂは、ＮＨＰにおける血漿薬力学（ＰＤ）の結果（Ｆ１２ ＥＬＦ ｓｉＲＮＡ及びそのキラルＰＳ ｓｉＲＮＡ型の相対的血漿レベル）を示す。図１０８Ｃは、ＮＨＰにおける血漿薬物動態学（ＰＫ）の結果を示す。図１０８Ｄは、ＮＨＰにおけるＦ１２ ＥＬＦ ｓｉＲＮＡ及びそのキラルＰＳ ｓｉＲＮＡ型の肝臓レベルを示す。図１０８Ｅは、ＮＨＰにおけるペプチドによるアルゴノートタンパク質親和性精製（Ａｇｏ－ＡＰＰ）及び肝臓におけるＲＩＳＣにローディングされたアンチセンスの結果を示す。
Ｃ５、Ｆ１２、及びｈＡＧＴ ｓｉＲＮＡ並びにそれらのキラルＰＳ ｓｉＲＮＡ型のｉｎ ｖｉｔｒｏ自由取り込みＩＣ５０の結果
例示的なＣ５、Ｆ１２、ｈＡＧＴ ｓｉＲＮＡ及びそれらのキラルＰＳ ｓｉＲＮＡ型を、初代マウス肝細胞及び初代カニクイザル肝細胞におけるｉｎ ｖｉｔｒｏ自由取り込みＩＣ５０について調べ、結果を図１０９Ａ及び図１０９Ｂに示す。図１０９Ａは、使用したキラル修飾ｓｉＲＮＡの配列及び構成モチーフの一覧を示す。図１０９Ｂは、初代マウス及びカニクイザル肝細胞におけるｉｎ ｖｉｔｒｏ自由取り込みＩＣ５０の結果を示す。
例示的なＣ５、Ｆ１２、及びｈＡＧＴ ｓｉＲＮＡ並びにそれらのキラルＰＳ ｓｉＲＮＡ型のｉｎ ｖｉｖｏマウス試験
例示的なＣ５、Ｆ１２、及びｈＡＧＴ ｓｉＲＮＡ並びにそれらのキラルＰＳ ｓｉＲＮＡ型を、２８日目又は４８日目までのマウスにおけるｉｎ ｖｉｖｏ相対的発現レベルについて調べ、結果を図１１０Ａ～図１１０Ｃに示す。図１１０Ａは、使用したキラル修飾ｓｉＲＮＡの構成モチーフ、使用した用量、及び試験の期間を含む試験デザインを示す。図１１０Ｂは、使用したすべての配列の一覧を示す。図１１０Ｃは、２８日目又は４８日目までの相対的発現レベルの結果を示す。
ＮＨＰにおけるＦ１２ ＥＬＦ ｓｉＲＮＡ及びそのキラルＰＳ ｓｉＲＮＡ型の評価
例示的なＦ１２及びＡｎｇｐｔｌ３（ＡＮＧ）ｓｉＲＮＡ及びそれらのキラルＰＳ ｓｉＲＮＡ型を、ＮＨＰにおける血漿ＰＤについて調べ、結果を図１１１Ａ～図１１１Ｄに示す。図１１１Ａは、使用したキラル修飾ｓｉＲＮＡの構成モチーフ並びに使用した動物及び用量の一覧を示す。図１１１Ｂは、使用したすべての配列の一覧を示す。図１１１Ｃは、ＮＨＰにおけるＦ１２配列１ ｓｉＲＮＡ及びそのキラルＰＳ ｓｉＲＮＡ型の血漿薬力学（ＰＤ）の結果（相対的血漿レベル）を示す。図１１１Ｄは、ＮＨＰにおけるＦ１２配列２及びＡｎｇｐｔｌ３（ＡＮＧ）ｓｉＲＮＡ並びにそれらのキラルＰＳ ｓｉＲＮＡ型の血漿薬力学（ＰＤ）の結果（相対的血漿レベル）を示す。
本明細書で言及したすべての米国特許、米国特許出願公開、外国特許、外国特許出願、及び非特許公報は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。さらに別の実施形態を提供するために様々な特許、出願、及び刊行物の概念を利用する必要がある場合、実施形態の態様を変更することができる。
上記の詳細な説明に照らして、これら及び他の変更を実施形態に加えることができる。一般に、以下の特許請求の範囲では、使用される用語は、本明細書及び特許請求の範囲に開示される特定の実施形態に請求項を限定するように解釈されるべきではなく、可能なすべての実施形態及びそのような請求項が権利を与えられる等価物の全範囲を含むように解釈されるべきである。従って、請求項は本開示によって限定されない。
最後に、本発明の好ましい実施態様を項分け記載する。
［実施態様１］
標的遺伝子の発現を阻害することができるキラル修飾二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）剤であって、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、各鎖は１４～４０ヌクレオチドを有し、
前記センス鎖が、５’末端に１つ又は複数の末端のキラル修飾ヌクレオチド間結合を含み、
前記アンチセンス鎖が、５’末端に１つ又は複数の末端のキラル修飾ヌクレオチド間結合、及び３’末端に１つ又は複数の末端のキラル修飾ヌクレオチド間結合を含む、キラル修飾二本鎖ＲＮＡ剤。
［実施態様２］
各末端のキラル修飾ヌクレオチド間結合のキラル結合リン原子に関するキラル純度が少なくとも５０％である、実施態様１に記載のキラル修飾ｄｓＲＮＡ剤。
［実施態様３］
各末端のキラル修飾ヌクレオチド間結合がホスホロチオエート結合である、実施態様１に記載のキラル修飾ｄｓＲＮＡ剤。
［実施態様４］
前記末端のキラル修飾が、前記アンチセンス鎖の３’末端の１番目のヌクレオチド間結合に存在し、前記結合リン原子がＳｐ配置にある、実施態様３に記載のキラル修飾ｄｓＲＮＡ剤。
［実施態様５］
末端のキラル修飾が、前記アンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチド間結合に存在し、前記結合リン原子がＲｐ配置にある、実施態様３に記載のキラル修飾ｄｓＲＮＡ剤。
［実施態様６］
末端のキラル修飾が、前記センス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチド間結合に存在し、前記結合リン原子が、Ｒｐ配置又はＳｐ配置のいずれかにある、実施態様３に記載のキラル修飾ｄｓＲＮＡ剤。
［実施態様７］
前記結合リン原子がＳｐ配置にある、前記アンチセンス鎖の３’末端の１番目のヌクレオチド間結合に存在する末端のキラル修飾、
前記結合リン原子がＲｐ配置にある、前記アンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチド間結合に存在する末端のキラル修飾、及び
前記結合リン原子がＲｐ配置又はＳｐ配置のいずれかにある、前記センス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチド間結合に存在する末端のキラル修飾鎖を含む、実施態様３に記載のキラル修飾ｄｓＲＮＡ剤。
［実施態様８］
４つ以上の末端のキラル修飾ヌクレオチド間結合を含む、実施態様１に記載のキラル修飾ｄｓＲＮＡ剤。
［実施態様９］
前記結合リン原子がＳｐ配置にある、前記アンチセンス鎖の３’末端の１番目及び２番目のヌクレオチド間結合に存在する末端のキラル修飾、
前記結合リン原子がＲｐ配置にある、前記アンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチド間結合に存在する末端のキラル修飾、及び
前記結合リン原子がＲｐ配置又はＳｐ配置のいずれかにある、前記センス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチド間結合に存在する末端のキラル修飾を含む、実施態様８に記載のキラル修飾ｄｓＲＮＡ剤。
［実施態様１０］
５つ以上の末端のキラル修飾ヌクレオチド間結合を含む、実施態様１に記載のキラル修飾ｄｓＲＮＡ剤。
［実施態様１１］
前記結合リン原子がＳｐ配置にある、前記アンチセンス鎖の３’末端の１番目、２番目、及び３番目のヌクレオチド間結合に存在する末端のキラル修飾、
前記結合リン原子がＲｐ配置にある、前記アンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチド間結合に存在する末端のキラル修飾、及び
前記結合リン原子がＲｐ配置又はＳｐ配置のいずれかにある、前記センス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチド間結合に存在する末端のキラル修飾を含む、実施態様１０に記載のキラル修飾ｄｓＲＮＡ剤。
［実施態様１２］
前記結合リン原子がＳｐ配置にある、前記アンチセンス鎖の３’末端の１番目及び２番目のヌクレオチド間結合に存在する末端のキラル修飾、
前記結合リン原子がＲｐ配置にある、前記アンチセンス鎖の３’末端の３番目のヌクレオチド間結合に存在する末端のキラル修飾、
前記結合リン原子がＲｐ配置にある、前記アンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチド間結合に存在する末端のキラル修飾、及び
前記結合リン原子がＲｐ配置又はＳｐ配置のいずれかにある、前記センス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチド間結合に存在する末端のキラル修飾を含む、実施態様１０に記載のキラル修飾ｄｓＲＮＡ剤。
［実施態様１３］
前記結合リン原子がＳｐ配置にある、前記アンチセンス鎖の３’末端の１番目及び２番目のヌクレオチド間結合に存在する末端のキラル修飾、
前記結合リン原子がＲｐ配置にある、前記アンチセンス鎖の５’末端の１番目及び２番目のヌクレオチド間結合に存在する末端のキラル修飾、及び
前記結合リン原子がＲｐ配置又はＳｐ配置のいずれかにある、前記センス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチド間結合に存在する末端のキラル修飾を含む、実施態様１０に記載のキラル修飾ｄｓＲＮＡ剤。
［実施態様１４］
６つ以上の末端のキラル修飾ヌクレオチド間結合を含む、実施態様１に記載のキラル修飾ｄｓＲＮＡ剤。
［実施態様１５］
８つ以上の末端のキラル修飾ヌクレオチド間結合を含む、実施態様１に記載のキラル修飾ｄｓＲＮＡ剤。
［実施態様１６］
前記末端のキラル修飾ヌクレオチド間連結によって結合されたジヌクレオチドの各ヌクレオチドが独立に、非環状ヌクレオチド、ＬＮＡ、ＨＮＡ、ＣｅＮＡ、２’－Ｏ－メトキシアルキル、２’－Ｏ－メチル、２’－Ｏ－アリル、２’－Ｃ－アリル、２’－デオキシ、２’－フルオロ、２’－Ｏ－Ｎ－メチルアセトアミド（２’－Ｏ－ＮＭＡ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノエトキシエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＥＯＥ）、２’－Ｏ－アミノプロピル（２’－Ｏ－ＡＰ）、及び２’－ａｒａ－Ｆからなる群から選択される修飾で修飾される、実施態様１に記載のキラル修飾ｄｓＲＮＡ剤。
［実施態様１７］
前記センス鎖及び前記アンチセンス鎖のそれぞれが独立に、非環状ヌクレオチド、ＬＮＡ、ＨＮＡ、ＣｅＮＡ、２’－Ｏ－メトキシアルキル、２’－Ｏ－メチル、２’－Ｏ－アリル、２’－Ｃ－アリル、２’－デオキシ、２’－フルオロ、２’－Ｏ－Ｎ－メチルアセトアミド（２’－Ｏ－ＮＭＡ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノエトキシエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＥＯＥ）、２’－Ｏ－アミノプロピル（２’－Ｏ－ＡＰ）、及び２’－ａｒａ－Ｆからなる群から選択される修飾で修飾される、実施態様１に記載のキラル修飾ｄｓＲＮＡ剤。
［実施態様１８］
前記センス鎖及び前記アンチセンス鎖のそれぞれが１５～３０ヌクレオチドを有する、実施態様１に記載のキラル修飾ｄｓＲＮＡ剤。
［実施態様１９］
前記センス鎖が１９～２２ヌクレオチドを有し、前記アンチセンス鎖が１９～２５ヌクレオチドを有する、実施態様１３に記載のキラル修飾ｄｓＲＮＡ剤。
［実施態様２０］
少なくとも１つのＡＳＧＰＲリガンドをさらに含む、実施態様１に記載のキラル修飾ｄｓＲＮＡ剤。
［実施態様２１］
前記ＡＳＧＰＲリガンドが、前記センス鎖又は前記アンチセンス鎖の３’末端に付着している、実施態様２０に記載のキラル修飾ｄｓＲＮＡ剤。
［実施態様２２］
前記ＡＳＧＰＲリガンドが、１つ又は複数の切断可能なリンカーを介して付着している、実施態様２０に記載のキラル修飾ｄｓＲＮＡ剤。
［実施態様２３］
前記ＡＳＧＰＲリガンドが、２価又は３価の分岐リンカーを介して付着した１つ又は複数のＧａｌＮＡｃ誘導体である、実施態様２０に記載のキラル修飾ｄｓＲＮＡ剤。
［実施態様２４］
前記ＡＳＧＰＲリガンドが、
Figure 0007348185000072
 である、実施態様２３に記載のキラル修飾ｄｓＲＮＡ剤。
［実施態様２５］
実施態様１～２４のいずれかに記載のキラル修飾ｄｓＲＮＡ剤及び薬学的に許容される担体又は賦形剤を含む医薬組成物。
［実施態様２６］
実施態様１～２５のいずれかに記載のキラル修飾ｄｓＲＮＡ剤を標的遺伝子の発現を阻害するのに十分な量で投与する工程を含む、標的遺伝子の発現を阻害するための方法。
［実施態様２７］
前記キラル修飾ｄｓＲＮＡ剤が、皮下投与又は静脈内投与によって投与される、実施態様３０に記載の方法。

Claims (19)

  1. 標的遺伝子の発現を阻害することができるキラル修飾二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）剤であって、１９～２９ヌクレオチドを有するセンス鎖及び１９～３０ヌクレオチドを有するアンチセンス鎖を含み、
    前記センス鎖は、５’末端の１番目、２番目、３番目、または４番目のヌクレオチド間結合に存在する１つ又は複数の末端キラル修飾ヌクレオチド間結合を含み、
    前記アンチセンス鎖は、５’末端の１番目、２番目、３番目、または４番目のヌクレオチド間結合に存在する１つ又は複数の末端キラル修飾ヌクレオチド間結合、及び３’末端の１番目、２番目、３番目、または４番目のヌクレオチド間結合に存在する１つ又は複数の末端キラル修飾ヌクレオチド間結合を含み、
    各末端キラル修飾ヌクレオチド間結合はホスホロチオエート結合であり、
    末端キラル修飾が、前記アンチセンス鎖の３’末端の１番目のヌクレオチド間結合に存在し、その結合リン原子がＳｐ配置にあり、かつ
    末端キラル修飾が、前記アンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチド間結合に存在し、その結合リン原子がＲｐ配置にある、キラル修飾二本鎖ＲＮＡ剤。
  2. 各末端キラル修飾ヌクレオチド間結合のキラル結合リン原子に関するキラル純度が少なくとも５０％である、請求項１に記載のキラル修飾ｄｓＲＮＡ剤。
  3. 前記センス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチド間結合に末端キラル修飾が存在し、その結合リン原子がＲｐ配置又はＳｐ配置のいずれかにある、請求項１に記載のキラル修飾ｄｓＲＮＡ剤。
  4. ４つ以上の末端キラル修飾ヌクレオチド間結合を含み、
    結合リン原子がＳｐ配置にある、アンチセンス鎖の３’末端の１番目及び２番目のヌクレオチド間結合に存在する末端キラル修飾、
    結合リン原子がＲｐ配置にある、アンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチド間結合に存在する末端キラル修飾、及び
    結合リン原子がＲｐ配置又はＳｐ配置のいずれかにある、センス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチド間結合に存在する末端キラル修飾
    を含む、請求項１に記載のキラル修飾ｄｓＲＮＡ剤。
  5. ５つ以上の末端キラル修飾ヌクレオチド間結合を含み、
    （ｉ）
    結合リン原子がＳｐ配置にある、アンチセンス鎖の３’末端の１番目、２番目、及び３番目のヌクレオチド間結合に存在する末端キラル修飾、
    結合リン原子がＲｐ配置にある、アンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチド間結合に存在する末端キラル修飾、及び
    結合リン原子がＲｐ配置又はＳｐ配置のいずれかにある、センス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチド間結合に存在する末端キラル修飾
    を含む、あるいは
    （ｉｉ）
    結合リン原子がＳｐ配置にある、アンチセンス鎖の３’末端の１番目及び２番目のヌクレオチド間結合に存在する末端キラル修飾、
    結合リン原子がＲｐ配置にある、アンチセンス鎖の３’末端の３番目のヌクレオチド間結合に存在する末端キラル修飾、
    結合リン原子がＲｐ配置にある、アンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチド間結合に存在する末端キラル修飾、及び
    結合リン原子がＲｐ配置又はＳｐ配置のいずれかにある、センス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチド間結合に存在する末端キラル修飾
    を含む、あるいは
    （ｉｉｉ）
    結合リン原子がＳｐ配置にある、アンチセンス鎖の３’末端の１番目及び２番目のヌクレオチド間結合に存在する末端キラル修飾、
    結合リン原子がＲｐ配置にある、アンチセンス鎖の５’末端の１番目及び２番目のヌクレオチド間結合に存在する末端キラル修飾、及び
    結合リン原子がＲｐ配置又はＳｐ配置のいずれかにある、センス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチド間結合に存在する末端キラル修飾
    を含む、
    請求項１に記載のキラル修飾ｄｓＲＮＡ剤。
  6. ６つ以上の末端キラル修飾ヌクレオチド間結合を含む、請求項１に記載のキラル修飾ｄｓＲＮＡ剤。
  7. ８つ以上の末端キラル修飾ヌクレオチド間結合を含む、請求項１に記載のキラル修飾ｄｓＲＮＡ剤。
  8. 前記末端キラル修飾ヌクレオチド間連結によって結合されたジヌクレオチドの各ヌクレオチドが、独立に、非環状ヌクレオチド、ＬＮＡ、ＨＮＡ、ＣｅＮＡ、２’－Ｏ－メトキシアルキル、２’－Ｏ－メチル、２’－Ｏ－アリル、２’－Ｃ－アリル、２’－デオキシ、２’－フルオロ、２’－Ｏ－Ｎ－メチルアセトアミド（２’－Ｏ－ＮＭＡ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノエトキシエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＥＯＥ）、２’－Ｏ－アミノプロピル（２’－Ｏ－ＡＰ）、及び２’－ａｒａ－Ｆからなる群から選択される修飾で修飾されている、請求項１～７のいずれか一項に記載のキラル修飾ｄｓＲＮＡ剤。
  9. 前記センス鎖及び前記アンチセンス鎖のそれぞれが独立に、非環状ヌクレオチド、ＬＮＡ、ＨＮＡ、ＣｅＮＡ、２’－Ｏ－メトキシアルキル、２’－Ｏ－メチル、２’－Ｏ－アリル、２’－Ｃ－アリル、２’－デオキシ、２’－フルオロ、２’－Ｏ－Ｎ－メチルアセトアミド（２’－Ｏ－ＮＭＡ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノエトキシエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＥＯＥ）、２’－Ｏ－アミノプロピル（２’－Ｏ－ＡＰ）、及び２’－ａｒａ－Ｆからなる群から選択される修飾で修飾されている、請求項１～７のいずれか一項に記載のキラル修飾ｄｓＲＮＡ剤。
  10. 前記センス鎖及び前記アンチセンス鎖のそれぞれが１９～２５ヌクレオチドを有する、請求項１～９のいずれか一項に記載のキラル修飾ｄｓＲＮＡ剤。
  11. 前記センス鎖が１９～２２ヌクレオチドを有し、前記アンチセンス鎖が１９～２５ヌクレオチドを有する、請求項１～９のいずれか一項に記載のキラル修飾ｄｓＲＮＡ剤。
  12. 少なくとも１つのアシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰＲ）リガンドをさらに含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載のキラル修飾ｄｓＲＮＡ剤。
  13. 前記ＡＳＧＰＲリガンドが、前記センス鎖又は前記アンチセンス鎖の３’末端に付着している、請求項１２に記載のキラル修飾ｄｓＲＮＡ剤。
  14. 前記ＡＳＧＰＲリガンドが、１つ又は複数の切断可能なリンカーを介して付着している、請求項１２または１３に記載のキラル修飾ｄｓＲＮＡ剤。
  15. 前記ＡＳＧＰＲリガンドが、２価又は３価の分岐リンカーを介して付着した１つ又は複数のＧａｌＮＡｃ誘導体である、請求項１２～１４のいずれか一項に記載のキラル修飾ｄｓＲＮＡ剤。
  16. 前記ＡＳＧＰＲリガンドが、
    Figure 0007348185000073
     である、請求項１５に記載のキラル修飾ｄｓＲＮＡ剤。
  17. 請求項１～１６のいずれか一項に記載のキラル修飾ｄｓＲＮＡ剤及び薬学的に許容される担体又は賦形剤を含む医薬組成物。
  18. 請求項１～１６のいずれか一項に記載のキラル修飾ｄｓＲＮＡ剤を含む、標的遺伝子の発現を阻害するための組成物。
  19. 皮下投与又は静脈内投与によって投与される、請求項１８に記載の組成物。
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