CN101712950B - 可以高效率地检索5-羟色胺6受体配体的可稳定表达ha-5-ht6r的细胞系 - Google Patents

可以高效率地检索5-羟色胺6受体配体的可稳定表达ha-5-ht6r的细胞系 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种5-羟色胺6受体配体的高效率检索方法，尤其是一种利用可稳定表达HA-5-HT6R的细胞系的5-羟色胺6受体配体高效率检索方法。本发明的细胞系可稳定地表达HA-5-HT6R，因此有效地提高了针对选择性地作用于5-HT6R的配体的检索效率，可以对结合5-HT6R的蛋白质的研究做出贡献。本发明可以有效地预防及诊断出5-HT6R相关抑郁症、阿尔茨海默之类的脑疾病及精神疾病，进而开发出其治疗剂。

Description

可以高效率地检索5-羟色胺6受体配体的可稳定表达HA-5-HT6R的细胞系
【技术领域】
本发明涉及一种5-羟色胺6受体(5-HT6R)配体高效率检索方法。 
【背景技术】
5-羟色胺受体(5-HTR)包括5-HT1R到5-HT7R的各种亚型，目前为止被发现的种类共有15种，被认为与抑郁症、精神分裂症、焦虑症(anxiety)及睡眠障碍等精神疾病及阿尔茨海默病等有关。 
其中，5-HT6R是最近探索出盐基序列的5-HTR，虽然还没有研究出其机制，但被认为涉及到退化性脑疾病与精神疾病之类的疾病。根据最近的研究报告显示，5-HT6R的刺激在生物化学及行动学方面可以呈现出类似于抗抑郁剂的效果，而且各种报告均指出脑发育(brain development)、记忆和学习(learning and memory)及老年痴呆症(Alzheimer disease)等很多重大脑部疾病都与其有密切关系(Grimaldi B et al.，NaunynSchmiedebergs Arch Pharmacol.357(4)：393-400，1999；Garcia-AllozaM et al.，Neuropsychopharmacology 29(2)：410-416，2004；Lorke D etal，，BMC Neurosci.27；7-36，2006；Greengard et al.，J Neurosci.27(15)：4201-4209，2007)。以5-HTR作为作用点的药物包括非选择性地结合于一切5-HTR的氯氮平(clozapine)，选择性地结合于5-HT6R的药物为SB258585，但还无法作为疾病的治疗剂使用。在研究抑郁症或阿尔茨海默病等疾病时，由于人们对于5-HT6R在脑细胞的具体功能及5-HT6R参与的信号传达机制几乎没有任何认识，为了研究其功能与机制并选择性地开发配体，需要具备可以选择性地研究5-HT6R的系统。 
本发明人们制作出可以表达出HA(Hemagglutinin)被连接到N端(N-terminal)的5-HT6R的细胞系，上述HA-5-HT6R暴露于细胞表面外部，可以稳定表达上述HA-5-HT6R并维持上述5-HT6R的活性，确认了上述细胞系可以在5-HT6R的选择性配体的开发过程中进行高效率检索。
【发明内容】
【发明需要解决的技术问题】 
本发明的目的是提供一种可以稳定表达5-HT6R的细胞系。 
本发明的另一个目的是提供一种基于上述细胞系的5-HT6R配体高效率检索方法。 
本发明的再一个目的是提供一种包含上述细胞系的5-HT6R配体高效率检索用组成物。 
【解决问题的技术方案】 
为了实现上述目的，本发明提供一种含有N端连接HA(Hemagglutinin)的5-HT6R基因构建体的载体(vector)被转导到宿主细胞而稳定表达HA-5-HT6R的细胞系。 
本发明提供的5-HT6R配体高效率检索方法包括下列步骤：步骤1，利用受检化合物处理本发明稳定表达HA-5-HT6R的细胞系； 
步骤2，检查上述经过处理的细胞系的5-HT6R活性；及 
步骤3，和未经过处理的细胞系进行比较，筛选出可以在上述细胞系中增加或减少5-HT6R活性的受检化合物。 
本发明提供的5-HT6R配体高效率检索方法包括下列步骤：步骤1，利用受检化合物处理本发明稳定表达HA-5-HT6R的细胞系； 
步骤2，精制上述经过处理的细胞系的蛋白质； 
步骤3，测定上述经过精制的蛋白质的5-HT6R活性；及 
步骤4，和未经过处理的细胞系进行比较，筛选出可以在上述细胞系中增加或减少5-HT6R活性的受检化合物。 
本发明还提供包含本发明稳定表达HA-5-HT6R的细胞系的5-HT6R配体高效率检索用组成物。 
下面说明本发明所使用的术语。 
术语“5-HT6R配体”表示结合在5-HT6R而调节活性的物质。 
下面详细说明本发明。 
本发明提供一种通过含N端连接HA(Hemagglutinin)的5-HT6R基因构建体的载体被转导到宿主细胞而稳定表达HA-5-HT6R的细胞系。
在本发明的较佳实施例中，把含有HA基因与取自人类绒毛膜癌细胞系的5-HT6R基因连接而成的HA-5-HT6R构建体的载体(参照图1)转导到人胚肾细胞系(human embryonic kidney cell line；HEK293细胞系)。利用PCR方法对特异表达HA-5-HT6R基因的细胞系进行筛选后(参照图2a)，把上述选定转基因细胞系从第一代培养到第六代。然后利用PCR方法验证各代的HA-5-HT6R基因是否出现特异表达(参照图2b)。检查结果发现本发明的细胞系可稳定表达HA-5-HT6R，2008年09月12日把上述经过验证的细胞系寄托到韩国细胞系研究基金会(Korean Cell Line ResearchFoundation)(寄托编号：KCLRF-BP-00187)。 
在本发明的较佳实施例中，按照时间顺序对本发明稳定表达HA-5-HT6R的细胞系进行了5-羟色胺(5-HT)处理，确认了ERK(Extracellular signal-regulated kinases)的磷酸化增加(参照图3a)，可知上述细胞系所表达的HA-5-HT6R在细胞内部正常地发挥功能。上述细胞系受到5-HT与EMD386088的刺激后增加了ERK的磷酸化现象，SB258585则减少其效果(参照图3b)。把可以表达嵌合体G α 15蛋白质的载体与脂质体基因感染到本发明稳定表达HA-5-HT6R的细胞系后利用5-HT给与刺激，然后再与表达5-HT6R的细胞系的细胞内部钙流入情形进行比较，确定HA-连接没有改变5-HT6R的功能(参照图5a及图5b)，还确定了上述活性具有5-HT浓度依赖性(参照图5c)。 
在本发明的较佳实施例中，分别在HA及大韩民国公开专利第2008-0004994号确认为5-HT6R的结合蛋白质的Fyn使用特异抗体，可以观察到本发明稳定表达HA-5-HT6R的细胞系细胞膜内部的5-HT6R的N端所连接的HA位于细胞表面的外部(参照图4a)，可以在细胞膜观察到HA-5-HT6R(参照图4b及图4c)。 
在本发明的较佳实施例中，对于本发明稳定表达HA-5-HT6R的细胞系与临时表达HA-5-HT6R的细胞系的细胞内部钙流入情形进行比较后发现，由于本发明稳定表达HA-5-HT6R的细胞系可以稳定表达HA-5-HT6R，因此其实验重现性优于临时表达的细胞系(参照图6)。 
本发明的细胞系是寄托编号为KCLRF-BP-00187的可稳定表达HA-5-HT6R的细胞系。
上述HA在细胞系以连接5-HT6R的形态表达并位于细胞表面的外部，可以利用上述HA选择性地检查表达在细胞表面的5-HT6R。 
上述转导可以在下列方法中选择一个方法后进行：在脂质体(Lipofectamine)、Dojindo公司的Hilymax、Fugene、jetPEI、Effectene及DreamFect所组成的群中选择某一商业化的转导用试药 的 方法；利用磷酸钙(calcium-phosphate)、正电荷型高分子、微脂粒、纳米粒子、核转染(nucleofection)、电穿孔法(electroporation)、热冲击(heatshock)、磁珠转染(magnetofection)的方法；以及利用反转病毒的方法。 
本发明提供的5-HT6R配体高效率检索方法包括：步骤1，利用受检化合物处理本发明稳定表达HA-5-HT6R的细胞系； 
步骤2，测定上述经过处理的细胞系的5-HT6R活性；及 
步骤3，和未经过处理的细胞系进行比较，筛选出可以在上述细胞系中增加或减少5-HT6R活性的受检化合物。 
在本发明的较佳实施例中，本发明稳定表达HA-5-HT6R的细胞系中细胞膜内部的5-HT6R的N端所连接的HA位于细胞表面的外部(参照图4a)，可以在细胞膜观察到HA-5-HT6R(参照图4b及图4c)。 
在本发明的较佳实施例中，把稳定表达HA-5-HT6R的细胞系的细胞内部钙流入情形与表达5-HT6R的细胞系进行比较，确定HA-连接没有改变5-HT6R的功能(参照图5a及图5b)，还确定了上述活性具有5-HT浓度依赖性(参照图5c)。 
在本发明的较佳实施例中，对于可稳定表达HA-5-HT6R的细胞系与临时表达HA-5-HT6R的细胞系的细胞内部钙流入情形进行比较后发现，由于本发明稳定表达HA-5-HT6R的细胞系可以稳定表达HA-5-HT6R，因此其实验重现性优于临时表达的细胞系(参照图6)。 
本发明稳定表达HA-5-HT6R的细胞系利用位于细胞表面外部的HA选择性地检查表达在细胞表面上的5-HT6R，因此可以有效地运用到5-HT6R配体的高效率检索作业。 
步骤1的受检化合物以天然化合物、合成化合物、RNA、DNA、多肽、酶、蛋白质、配体、抗体、抗原、细菌或真菌的代谢产物及生物活性分子较佳，但不限于此。
步骤2在测定5-HT6R活性时可以采取通过5-HT6R测定细胞内部钙浓度流入情形的方法，但不限于此。此时测定细胞内部钙浓度流入情形的目标细胞系可以在进行受检化合物的处理之前先利用表达嵌合体Gα 15蛋白质的载体与脂质体进行基因感染。 
本发明5-HT6R配体高效率检索方法包括下列步骤：步骤1，利用受检化合物处理本发明稳定表达HA-5-HT6R的细胞系； 
步骤2，上述经过处理的细胞系的蛋白质精制步骤； 
步骤3，测定上述经过精制的蛋白质的5-HT6R活性；及 
步骤4，和未经过处理的细胞系进行比较，筛选出可以在上述细胞系中增加或减少5-HT6R活性的受检化合物。 
在本发明的较佳实施例中，利用5-HT，EMD386088及SB258585刺激本发明稳定表达HA-5-HT6R的细胞系后，确定了上述转基因细胞系所表达的HA-5-HT6R在细胞内部发挥正常功能(参照图3a及图3b)。 
在本发明的较佳实施例中，本发明稳定表达HA-5-HT6R的细胞系中细胞膜内部的5-HT6R的N端所连接的HA位于细胞表面的外部(参照图4a)，可以在细胞膜观察到HA-5-HT6R(参照图4b及图4c)。 
本发明稳定表达HA-5-HT6R的细胞系利用位于细胞表面外部的HA(HA)选择性地检查表达在细胞表面上的5-HT6R，因此可以有效地运用到5-HT6R配体的高效率检索作业。 
步骤1的受检化合物以天然化合物，合成化合物，RNA，DNA，多肽，酶、蛋白质、配体、抗体、抗原、细菌或真菌的代谢产物及生物活性分子较佳，但不限于此。 
步骤2的5-HT6R活性测定不限于此，但可以利用测定上述5-HT6R所磷酸化的ERK的方法进行测定。 
本发明还可以提供包含本发明稳定表达HA-5-HT6R的细胞系的5-HT6R配体高效率检索用组成物。 
在本发明的较佳实施例中，本发明稳定表达HA-5-HT6R的细胞系中细胞膜内部的5-HT6R的N端所连接的HA位于细胞表面的外部(参照图4a)，可以在细胞膜观察到HA-5-HT6R(参照图4b及图4c)。
在本发明的较佳实施例中，确定HA-连接没有改变5-HT6R的功能(参照图5a及图5b)，还确定了上述活性具有5-HT浓度依赖性(参照图5c)。在本发明的较佳实施例中，由于本发明细胞系可以稳定表达HA-5-HT6R，因此其实验重现性优于临时表达的细胞系(参照图6)。 
本发明稳定表达HA-5-HT6R的细胞系利用位于细胞表面外部的HA(HA)选择性地检查表达在细胞表面上的5-HT6R，因此可以作为5-HT6R配体高效率检索用组成物使用。 
本发明的细胞系是寄托编号为KCRF-BP-00187的可稳定表达HA-5-HT6R的细胞系。 
上述组成物可以另外添加Gα15基因、脂质体、荧光钙标记物及洗涤缓冲液，上述荧光型钙标记物可以使用对钙浓度敏感的Fluoro-4/AM与普朗尼克(Pluronic)F-127等。 
【发明效果】 
本发明的细胞系可以稳定地表达HA-5-HT6R，进而提高选择性地作用在5-HT6R的配体的检索效率，对于和5-HT6R结合的蛋白质研究做出贡献。本发明可以有效地预防及诊断出5-HT6R相关抑郁症、阿尔茨海默之类的脑疾病及精神疾病，进而开发出其治疗剂。 
图1是包括N端连接HA的人类5-HT6R基因在内的质体的序列图。 
图2是利用逆转录PCR方法检查HA-5-HT6R转导的细胞系的结果： 
a：HA-5-HT6R转导的细胞系的筛选；及 
b：从P1到P6对稳定表达HA-5-HT6R的鉴定。 
图3是本发明的HA-5-HT6R被转导的HEK293细胞系的HA-5-HT6R的功能检查结果图： 
a：5-羟色胺(5-HT)的刺激所造成的ERK磷酸化；及 
b：5-HT6R的活性剂5-HT及EMD386088及对抗药SB258585的效果确认。 
图4是本发明的HA-5-HT6R被转导的HEK293细胞系的细胞表面的HA-5-HT6R表达形态分析结果(整体：在细胞内部及表面检查表达形态)： 
a：5-HT6R的N端所连接的、位于细胞表面外部的HA的模式图； 
b：Fyn过表达之前的Fyn及HA-5-HT6R的分布；及 
c：Fyn过表达时的Fyn及HA-5-HT6R的分布. 
图5是本发明的细胞系表达的HA-5-HT6R的功能没有被HA-连接影响的鉴定结果： 
a：细胞内部钙量的变化；b：细胞内部钙量的平均；及 
c：HA-5-HT6R的浓度-依存活性。 
图6是临时或稳定表达HA-5-HT6R的细胞系的重现性差异图。 
【发明的具体实施方式】 
下面详细描述本发明的较佳实施例。 
但下列实施例仅为本发明的举例，本发明的内容不受下列实施例的限定。 
<实施例1>转基因细胞系的制备 
<1-1>野生型细胞系的培养 
在含有10％胎牛血清及1％青霉素/链霉素(v/v)的DMEM(Dulbecco’smodified-Eagle’s medium)培养池上以37℃，5％CO2的加湿条件培养HEK293细胞系(ATCC CRL 1573)。上述培养液3-4日交换一次，细胞则每星期进行一次传代培养(sub-culture)。把上述HEK293细胞系涂敷在10cm培养皿上5.0×106左右后培养12小时。 
<1-2>HA-5-HT6R细胞系的制备 
利用BglII限制酶处理HA-5-HT6R-pcDNA3.1(+)质体(图1；MissouriS&T cDNA Resource Center，USA)而使其线性化后，以1:3的比率(线性化的HA-5-HT6R-pcDNA3.1(+)12μg，Lipofectamine 36μl)和Lipofectamine  2000(Invitrogen，USA)一起投入Opti-MEM(Invitrogen，USA)培养池并混合5分钟，30分钟后把上述混合液投入培养皿使细胞系发生基因感染。6小时后利用DMEM培养池更换培养池，再培养细胞24小时后添加800μg/ml的G418(Invitrogen，USA)筛选出转基因细胞。选择性地培养14天后，分别在24孔板针对已形成了集落的细胞群进行传代培养(subculture)使其成长，筛选出成长速度最快的细胞群，得到了可稳定表达HA-5-HT6R的细胞系。得到了稳定的细胞系后，逐渐降低G418浓度后在添加了400μg/
Figure G2008101825453D0007144007QIETU
的培养池里进行培养。 
<1-3>5-HT6R细胞系的制备 
利用5-HT6R-pcDNA3.1(+)质体(Missouri S&T cDNA ResourceCenter，USA)按照实施例1-2的方法得到转基因的细胞系。 
<实施例2>转基因细胞系的确认 
<2-1>转基因细胞系的筛选 
把实施例1-2中得到的转基因细胞系按照各集落区分后在DMEM培养池以37℃、5％CO2细胞培养池培养，然后使用三环唑试药分离RNA。利用AMV逆转录酶制备cDNA，使用序列号为1的正向引物(forwardprimer)(5’-CCACTCTTCATGCGGGACTTC-3)及序列号为2的逆向引物(5’-TCAGTTCGTGGGGATGCCAAG-3’)放大HA-5-HT6R基因。对照组则使用序列号为3的正向引物(5’-GTCACCAACTGGGACGACATG-3’)及序列号为4的逆向引物(5’-GCCGTCAGGCAGCTCGTAGC-3’)放大β-actin基因。PCR条件为，在95℃进行预变异4分钟后，以95℃下1分钟、60℃下30秒钟、72℃下30秒钟的顺序反复进行30次，最后在72℃的温度下反应10分钟，然后在4℃下冷却。 
其结果为，如图2a所示得到了可以特异放大HA-5-HT6R基因(363bp)的细胞系(lane 1)。 
<2-2>可稳定表达HA-5-HT6R的转基因细胞系的鉴定
每3-4日就为按照实施例2-1的方法培养出来的细胞系更换一次培养液，每星期进行一次传代培养而在42天内得到1(P1)到6(P6)代，在使用之前一直在-70℃的温度下妥善保管。对照组则使用了野生型细胞系的1到6代。 
利用上述方法到的细胞系按照实施例2-1的方法得到RNA，形成cDNA，放大HA-5-HT6R基因。对照组则放大β-actin基因。 
其结果如图2b所示，可以在P1到P6特异放大HA-5-HT6R基因。2008年09月12日把上述经过验证的细胞系寄托到韩国细胞系研究基金会(KoreanCell Line Research Foundation)(寄托编号：KCLRF-BP-00187)。 
<2-3>可以临时表达HA-5-HT6R的转基因细胞系的制备 
以1:3的比率把HA-5-HT6R-pcDNA3.1(+)质体与Lipofectamine2000一起投入Opti-MEM培养池并混合5分钟，30分钟后把上述混合液投入培养皿使细胞系发生基因感染。6小时后利用DMEM培养池更换培养池，再培养细胞24小时后制成可以临时表达HA-5-HT6R的转基因细胞系。 
<实施例3>HA-5-HT6R的细胞信号传达过程分析 
<3-1>对于5-HT6R的活性剂5-羟色胺(5-HT)的反应性检查 
<3-1-1>5-HT处理 
在含有无血清DMEM培养池的6-孔培养皿里把按照实施例2的方法筛选的、可稳定表达HA-5-HT6R的转基因细胞系以1×106细胞/孔分注后进行培养。3小时后，按照预设为0~60分钟的间隔(0，1，5，15，30及60分钟)处理20μM 5-HT(Sigma，USA)。 
<3-1-2>Western免疫印迹(Western blot) 
针对各5-HT的处理时间而收集试料，把上述细胞保管在-20℃的温度下，然后和包含蛋白质酶抑制剂(protease inhibitor，CompleteMini，Roche Diagnostics GmbH，Germany)的冰凉RIPA溶解缓冲液(upstate biotechnology，USA)一起投入均质化器加以粉碎后进行均质化。均质化的试料以13,000rpm的转速进行离心分离10分钟，使上层清液与不溶型凝集物分离。分离后的上层清液的蛋白质浓度通过伯乐蛋白定量试剂盒(Bio-Rad protein assay kit，Bio-Rad，USA)进行测定。以1:4的比率混合上层清液与5×SDS(0.156M Tris-HCl，pH6.8，2.5％SDS，37.5％ 甘油，37.5mM DTT)后在100℃的温度下煮10分钟。把煮过的试料加载到10％SDS-PAGE凝胶的孔(well)里，在125V的电压下电泳(electrophoresis)2小时并根据分子量进行分离，在20V、400A以下的条件下把上述蛋白质电泳1小时后移到PVDF膜。然后利用5％的脱脂牛奶把接受了蛋白质的膜遮蔽12小时，再使用第一阶段抗体(抗-ERK/p-ERK抗体；Cell signaling，USA)处理4小时后用TBST(Tris Buffered Saline+0.1％tween)清洗3次，每次清洗10分钟，用第二阶段抗体(抗兔-IgG-HRP；Amersham Bioscience，UK)处理1小时。再用TBST清洗4次，每次清洗10分钟，然后利用ECL检测试剂盒(Amersham Biosciences，UK)引起发光反应，再暴露于Hyperfilm-MP(Amersham Biosciences，UK)并观察其结合反应。 
其结果如图3a所示，受到5-羟色胺(5-HT)的刺激而增加了ERK的磷酸化程度，其影响在5分钟时达到最高值。 
<3-2>对于5-HT6R的活性剂EMD386088与对抗药SB258585的反应性检查 
在含有无血清DMEM培养池的6-孔培养皿里把按照实施例2的方法筛选的、可稳定表达HA-5-HT6R的转基因细胞系以1×106细胞/孔分注后进行培养。3小时后，利用20μM 5-HT，1μM EMD386088(Tocris，USA)及10μMSB258585(Tocris，USA)分别按照预设的间隔处理5分钟。对于EMD386088/SB258585，首先对SB258585进行30分钟的预处理后再处理EMD386088。按照实施例3-1-2的Western免疫印迹方法检查了上述化学物质处理对ERK磷酸化的影响。 
其结果如图3b所示，受到5-HT与EMD386088的刺激后增加了ERK的磷酸化程度，SB258585则降低其效果。 
<实施例4>HA-5-HT6R的细胞表面表达分析 
<4-1>Fyn过表达之前的分析 
为了在本发明稳定表达HA-5-HT6R的细胞系中观察细胞膜外部的5-HT6R的N端所连接的HA是否位于细胞表面的外部(图4a)，使用了在大韩民国公开专利第2008-0004994号中确认为5-HT6R的结合蛋白质的Fyn。
具体地说，整体细胞或表面蛋白质分析时使用免疫荧光细胞化学法(immunofluorescence)。利用把涂层盖玻片(cover glass)中生育的实施例2所筛选的、可稳定表达HA-5-HT6R的转基因细胞系清洗3次，利用溶于PBS的4％多聚甲醛在4℃的温度下把细胞固定30分钟，再使用冰凉的PBS清洗3次。之后，把抗体投入细胞内部后，为了观察整体细胞而利用PBST(PBS+0.2％Triton X-100)处理20分钟，或者省略上述PBST处理步骤而注入抗体并阻止抗体流入细胞内部，然后分析细胞表面。之后利用5％的BSA遮蔽1小时，再利用第一阶段抗体，anti-HA(1:500；Cell Signaling，USA)与anti-Fyn(1:500；Cell Signaling，USA)反应6小时后，利用PBS清洗3次，每次10分钟，第二阶段抗体则处理1小时。利用PBS清洗3次后，利用CRYSTAL/MOUNT(Biomeda Corp.，USA)把盖玻片固定在Slide上。为了观察抗体标记的两种特定蛋白质的细胞内部位置，使用confocal LSM 510 laserscanning microscope(Zeiss，Gottingen，Germany)对影像进行分析。 
其结果如图4b所示，可以在本发明的转基因细胞系中稳定表达的HA-5-HT6R的宿主细胞HEK293细胞系中观察到独自表达Fyn蛋白质的分布。而且，如果阻止HA抗体渗透细胞表面膜，可以在细胞膜观察到HA-5-HT6R。 
<4-2>Fyn过表达之后的分析 
在含有无血清DMEM培养池的100mm板上把按照实施例2的方法筛选的、可稳定表达HA-5-HT6R的转基因细胞系以1×106细胞/孔分注后进行培养，然后以1:3的比率把Fyn-pcDNA3.1(+)与Lipofectamine 2000投入Opti-MEM培养池并混合5分钟，30分钟后把上述混合液投入培养皿使细胞系发生基因感染。6小时后利用DMEM培养池更换培养池，再培养细胞24小时后使Fyn过表达。 
之后，为了按照实施例4-1的方法观察整体细胞而添加PBST(PBS+0.2％Triton X-100)20分钟并观察整体细胞，或者省略该步骤后观察细胞表面。 
其结果如图4c所示，如果阻止HA抗体渗透细胞表面膜，即使Fyn过表达时也没有在细胞膜观察到Fyn而只观察到了HA-5-HT6R。 
<实施例5>HA-5-HT6R的活性测定
<5-1>细胞处理条件 
在含有无血清DMEM培养池的100mm板上把按照实施例2的方法筛选的、可稳定表达HA-5-HT6R的细胞系与临时表达HA-5-HT6R的细胞系、野生型HEK293细胞系及表达5-HT6R的细胞系以5×106细胞/孔把单一96-孔板分成3个区块后分别分注并进行培养。24小时后以1:3的重量比把表达Gα 15蛋白质的载体(Evi Kostenis，Institute for Pharmaceutical Biology，Germany)与Lipofectamine 2000加以混合后使上述细胞系发生基因感染，然后在含有1％FBS的DMEM培养16小时以上。在进行活性检索的前一天，以每孔5×104的密度把上述基因感染的细胞分注到经过多聚赖氨酸(0.05mg/ml)处理的96-孔板上。为了抑制受体内化(internalization)而使用了血清饥饿(serum starvation)条件。上述受体内化内化到细胞质内部时，将被分解或非活化而进行受体下调。 
<5-2>利用FDSS6000测定荧光钙 
使用高通量细胞筛选器FDSS6000(Hamamatsu Photonics，JP)测定荧光钙。荧光钙标记物使用了对钙浓度敏感的Fluoro-4/AM与0.001％普朗尼克F-127(Sigma，USA)。让细胞选择性地暴露于480nm，利用CCD摄像机拍摄通过515nm的放射荧光后得到相关数据。 
具体地说，实验当天使用HEPES缓冲溶液把附在96-孔板上的细胞清洗3次，使用溶于HEPES缓冲溶液的4μM Fluoro-4/AM与0.001％普朗尼克F-127在培养池反应1小时后，利用HEPES缓冲溶液重新清洗2次后，让细胞选择性地暴露于480nm，利用CCD摄像机拍摄通过515nm的放射荧光后得到相关数据。 
<5-3>调查HA-连接的影响 
把实施例5-1中利用表达Gα 15蛋白质的载体进行了基因感染的、可稳定表达HA-5-HT6R的细胞系与表达5-HT6R的细胞系分别利用10μM 5-HT加以处理后，按照实施例4-2的方法测定活性。阴性对照组则是使用仅具备HA标签的空载体进行了转基因的细胞系。F表示480nm的荧光强度，F0表示初始值。 
其结果如图5a所示，位于N端的HA-连接没有改变5-HT6R的功能。而且，上述荧光强度变化(F/F0)的平均值如图5b所示，可稳定表达HA-5-HT6R 的细胞系为0.111±0.003，表达5-HT6R的细胞系为0.105±0.003，使用仅具备HA标签的空载体进行了转基因的细胞系则是0.014±0.007(n＝4)。 
<5-4>5-HT浓度-依存活性 
针对实施例5-1中利用表达Gα 15蛋白质的载体进行了基因感染的、可稳定表达HA-5-HT6R的细胞系，除了96-孔板以外，还另外准备了一个可以使5-HT6受体活化的、含有不同浓度(10-11~10-5M)的5-HT6受体活性剂的96-孔药物板。大部分的高通量细胞筛选器虽然具备了注入药物时所需要的液体应用系统(Liquid Application system)，但不具备液体吸入系统，把需要检索的5-HT及其它活性剂药物以5倍的高浓度在分别HEPES缓冲溶液制备20μl，在最终体积100μl(粘附状态的培养细胞80+5X 5-HT及其它活性剂药物)稀释1/5后进行测定。最后，以25秒为基准进行测定，在90秒钟的药物处理条件下把5-HT6受体活性剂5-HT在10-10~10-5M浓度范围内利用荧光标记染料Fluoro-4以％形式求得5-HT6受体活性的Ca2+信号(signal)。把480nm的最大比率值的面积作为100％求得5-HT的活性效果后，得到细胞的浓度-依存性曲线并导出EC50值(图5c)。此时，对于5-HT的EC50值使用y/ymax＝1/(1+(K1/2/[5-HT]nH)计算(ymax是最大反应，K1/2是EC50值，Nh是Hill常数)。 
<5-5>检查稳定表达HA-5-HT6R的细胞系 
把实施例5-1中利用表达Gα 15蛋白质的载体进行了基因感染的、可稳定表达HA-5-HT6R的细胞系与表达HA-5-HT6R的细胞系(S1~S3)与临时表达HA-5-HT6R的细胞系(T1~T3)分别利用10μM 5-HT加以处理后，按照实施例4-2的方法测定活性，利用Integration Ratio Max(HamamatsuPhotonics program，JAPAN)计算了细胞内部钙流入值(Integrate ratiomax values)。 
其结果如图6所示，由于本发明稳定表达HA-5-HT6R的细胞系可以稳定地表达HA-5-HT6R，因此其实验重现性优于临时表达的细胞系。
IA088981 序列表 
<110>韩国科学技术研究院 
<120>可以高效率地检索5-羟色胺6受体配体的可稳定表达HA-5-HT6R的细胞系 
<130>IA088981 
<150>KR10-2008-0095258 
<151>2008-09-29 
<160>4 
<170>KopatentIn 1.71 
<210>1 
<211>21 
<212>DNA 
<213>人工序列 
<220> 
<223>HA-5-HT6R 正向引物 
<400>1 
Figure G2008101825453D00131
<210>2 
<211>21 
<212>DNA 
<213>人工序列 
<220> 
<223>HA-5-HT6R反向引物 
<400>2 
<210>3 
<211>21 
<212>DNA 
<213>人工序列 
<220> 
<223>β肌动蛋白正向引物 
<400>3 
Figure G2008101825453D00133
<210>4 
<211>20 
<212>DNA 
<213>人工序列 
<220> 
<223>β肌动蛋白反向引物 
<400>4 

Claims (17)

1.一种细胞系，含有N端连接HA的5-HT6R基因构建体的载体被转导到宿主细胞而稳定表达HA-5-HT6R的细胞系，所述细胞系以寄托编号KCLRF-BP-00187寄托。
2.根据权利要求1所述的细胞系，其特征在于：上述转导在下列方法中选择一个方法后进行：在脂质体、Dojindo公司的Hilymax，Fugene，jetPEI、Effectene及DreamFect所组成的群中选择某一商业化的转导用试药；利用磷酸钙、正电荷型高分子、微脂粒、纳米粒子、核转染、电穿孔法、热冲击、磁珠转染的方法；以及利用反转病毒的方法。
3.一种5-HT6R配体高效率检索方法，包括下列步骤：
步骤1，利用受检化合物处理权利要求1的细胞系；
步骤2，测定上述经过处理的细胞系的5-HT6R活性；及
步骤3，和未经过处理的细胞系进行比较，筛选出可以在上述细胞系中增加或减少5-HT6R活性的受检化合物。
4.根据权利要求3所述的高效率检索方法，其特征在于：权利要求3中步骤1的受检化合物在天然化合物和合成化合物所组成的群中选择一个。
5.根据权利要求3所述的高效率检索方法，其特征在于：权利要求3中步骤1的受检化合物在RNA、DNA、多肽、酶、配体、细菌或真菌的代谢产物及生物活性分子所组成的群中选择一个。
6.根据权利要求3所述的高效率检索方法，其特征在于：权利要求3中步骤1的受检化合物为蛋白质。
7.根据权利要求3所述的高效率检索方法，其特征在于：权利要求3中步骤1的受检化合物在抗体和抗原所组成的群中选择一个。
8.根据权利要求3所述的高效率检索方法，其特征在于：测定5-HT6R的活性时，通过上述5-HT6R测定细胞内部钙浓度流入情形。
9.根据权利要求8所述的高效率检索方法，其特征在于：测定细胞内部钙浓度流入情形的目标细胞系在进行受检化合物处理之前，先利用可以表达Gα15蛋白质的载体与脂质体进行基因感染。
10.一种5-HT6R配体高效率检索方法，包括下列步骤：
步骤1，利用受检化合物处理权利要求1的细胞系；
步骤2，上述经过处理的细胞系的蛋白质精制步骤；
步骤3，测定上述经过精制的蛋白质的5-HT6R活性；及
步骤4，和未经过处理的细胞系进行比较，筛选出可以在上述细胞系中增加或减少5-HT6R活性的受检化合物。
11.根据权利要求10所述的高效率检索方法，其特征在于：权利要求10中步骤1的受检化合物在天然化合物和合成化合物所组成的群中选择一个。
12.根据权利要求10所述的高效率检索方法，其特征在于：权利要求10中步骤1的受检化合物在RNA、DNA、多肽、酶、配体、细菌或真菌的代谢产物及生物活性分子所组成的群中选择一个。
13.根据权利要求10所述的高效率检索方法，其特征在于：权利要求10中步骤1的受检化合物为蛋白质。
14.根据权利要求10所述的高效率检索方法，其特征在于：权利要求10中步骤1的受检化合物在抗体和抗原所组成的群中选择一个。
15.根据权利要求10所述的高效率检索方法，其特征在于：测定5-HT6R的活性时，测定上述5-HT6R所磷酸化的ERK。
16.一种5-HT6R配体高效率检索用组成物，其特征在于：包含权利要求1的细胞系。
17.根据权利要求16所述的高效率检索用组成物，其特征在于：上述组成物另外包括可以表达Gα15蛋白质的载体、脂质体、荧光钙标记物及洗涤缓冲溶液。
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