WO2012072946A1 - Methode de retention conditionnelle d'une proteine d'interet dans le reticulum endoplasmique - Google Patents

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WO2012072946A1
WO2012072946A1 PCT/FR2011/052812 FR2011052812W WO2012072946A1 WO 2012072946 A1 WO2012072946 A1 WO 2012072946A1 FR 2011052812 W FR2011052812 W FR 2011052812W WO 2012072946 A1 WO2012072946 A1 WO 2012072946A1
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nucleic acid
interest
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frb
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PCT/FR2011/052812
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Carsten BROCK
Jean-Philippe Pin
Laetitia Comps-Agrar
Original Assignee
Cis Bio International
Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs)
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    • C07K2319/43—Fusion polypeptide containing a tag for immunodetection, or an epitope for immunisation containing a FLAG-tag

Definitions

  • the invention relates to a method of conditional retention in the endoplasmic reticulum of proteins of interest.
  • the authors of Stanford University International Patent Application WO94 / 18317 have proposed an approach for regulating certain biological events based on the use of chimeric molecular constructs comprising on the one hand an effector domain and on the other hand an effector domain. share at least one domain allowing their dimerization in the presence of a given ligand.
  • the addition to the extracellular medium of the appropriate ligand leads to the formation of chimeric protein dimers, and the approximation of the effector domains that will be able to activate certain biological processes, such as, for example, the transcription of a target nucleic sequence.
  • the ligands are in fact composed of at least two covalently bonded ligands, each capable of binding to one of the chimeric proteins.
  • rapamycin to the extracellular environment causes the formation of a FRB-rapamycin-FKBP complex, which will have the effect of bringing the effector domains closer together and thereby triggering or regulating a given biological process, in particular the transcription of a gene of interest or the aggregation of proteins to induce activation.
  • Rapamycin analogs having a lower immunosuppressive effect than rapamycin have been described in International Patent Application WO99 / 36553. Epirapamycin analogues have been published in International Patent Application WO01 / 14387. These rapamycin derivatives can potentially be used in the general method described in WO96 / 41865.
  • CRD conditional retention domains
  • the method is illustrated in detail with the F36M mutant of the hFKBP12 protein. Proteins with this mutation have the ability to form dimers, and this dimerization is reversible in the presence of rapamycin derivatives that bind to hFKBP12.
  • This mutant when expressed as a fusion protein with a normally secreted protein of interest, results in the aggregation of these proteins in the endoplasmic reticulum, thus preventing their secretion.
  • the dimers disintegrate and the protein of interest is secreted on the surface of the cell.
  • the authors also tried to use this technique with a membrane protein (the LNGFR receptor) to regulate the migration of the Golgi compartment to the cell membrane.
  • Ariad Gene Therapeutics uses this technology through a product sold under the trade name "RPF TM Regulated Secretion / Aggregation Kit". It would be particularly useful to have a technique that makes it possible to control the retention of a protein of interest in the endoplasmic reticulum without using the aggregation of these proteins as a retention mechanism, in particular to be able to study the natural oligomerization of the receptors. membrane.
  • the present invention provides a method and products for solving this problem.
  • the Applicant has demonstrated that it is possible to conditionally retain a protein of interest in the endoplasmic reticulum of an animal cell by fusing this protein of interest with a FRB domain followed by an endoplasmic retention signal. said protein of interest can then be rapidly released from the interior of the endoplasmic reticulum to migrate especially to the surface of the cell in the presence of rapamycin.
  • the present invention relates to a fusion protein whose release of the endoplasmic reticulum is conditioned by the presence in the environment of the rapamycin cell, or a derivative thereof.
  • the invention also relates to a nucleic acid encoding a fusion protein according to the invention, as well as expression vectors and cells containing them.
  • the invention also relates to a method for the conditional retention of a protein of interest in the endoplasmic reticulum, thus making it possible to control the translocation of a protein towards the plasma membrane, the cytosol, or its secretion in the extracellular medium.
  • This approach is particularly useful for studying the oligomerization phenomena of membrane proteins, but also and much more generally, in all cases where it is desired to increase the expression of a given protein of interest while limiting the Potential adverse effects related to increased activity of this protein, which through the invention can be stored in the endoplasmic reticulum.
  • the invention also relates to kits or kit of reagents comprising such vectors or cells transformed with these vectors for the implementation of these retention or screening methods.
  • the invention relates to a nucleic acid encoding a fusion protein in the same reading cade, said fusion protein comprising a protein of interest, this fusion protein having the particularity of being released by the endoplasmic reticulum only when rapamycin or one of these analogs (known as "rapalogues") is introduced into the cell environment, for example in the extracellular medium.
  • rapalogues rapalogues
  • rapamycin or rapalogue an endogenous rapamycin (or rapalogue) -FKBP complex is formed and will bind to the FRB domain of the fusion protein of the invention.
  • FRB-rapamycin complex (or rapalogue) -FKBP has the effect of masking the retention pattern in the endoplasmic reticulum and the fusion protein is then released from this compartment, to gain for example the plasma membrane if it is is a membrane protein, or even in the case of a soluble protein gain the cytosol or be excreted by the cell.
  • the invention relates to vectors, in particular expression plasmids containing the nucleic acids according to the invention.
  • the invention relates to a method for controlling the retention of a protein of interest in the endoplasmic reticulum.
  • the present invention relates to a nucleic acid, preferably isolated, encoding, in a single reading frame, for a fusion protein, said fusion protein comprising:
  • conditional retention domain consisting of a protein comprising a FRB domain whose C-terminal end is itself constituted by a retention pattern in the endoplasmic reticulum.
  • FRB domains are known to those skilled in the art and have been described in particular in International Patent Applications WO99 / 36553, WO99 / 010510 and European Patent EP833894.
  • the FRB domains are polypeptide domains, generally at least about 89-100 amino acids, which are capable of forming a tripartite complex with an FKBP protein and rapamycin (or one of its analogues, also called “rapalogue”).
  • FRB domains are present in a number of naturally occurring proteins, including human FRAP proteins (also known as RAPT1 or RAFT) or other species, Torl and Tor2 yeast proteins, and a FRAP analog of which is found in yeasts of the Candida type.
  • human FRAP proteins also known as RAPT1 or RAFT
  • Torl and Tor2 yeast proteins a FRAP analog of which is found in yeasts of the Candida type.
  • the nucleic sequences coding for these proteins are known and allow the synthesis or cloning of their FRB domains: human FRAP (cDNA of sequence SEQ ID No. 23 and protein of sequence SEQ ID No.
  • Tor 2 yeast, S. cerevisiae (cDNA of sequence SEQ ID No. 27 and Protein of SEQ ID NO: 28, Kunz et al., 1993, Cell 73, 585-596: EMBL Accession # X71416, NCBI Sea ID 298027 FRAP Candida homolog (see International Patent Application WO95 / 33052).
  • Figure 2 of Chiu et al, supra shows an alignment of 160 amino acids corresponding to the FRB domains of human FRAP, murine FRAP, Torl and Tor2 S. cerevisiae proteins.
  • the FRB domain used in the present invention will comprise the 89 amino acids between the Glu- 39 and Lys / Arg-127 residues of the sequences of this figure.
  • this FRB domain of 89 amino acids is between the residues numbered Glu-2025 to Lys-2113 in the human FRAP case, Glu- 1965 to Lys-2053 in the case of Tor2, and Glu- 1962 to Arg-2050 in the case of Torl.
  • the FRB domain used in the products and methods according to the invention is therefore chosen for its ability to bind to an FKBP complex with rapamycin or a rapalog, and includes one of the natural peptide sequences consisting of the 89 amino acids mentioned above. , or the corresponding domains in similar proteins.
  • this FRB domain may contain up to ten, preferably from 1 to 5, amino acid substitutions, insertions or deletions within this region relative to the natural sequence; it may be encoded by a DNA sequence capable of specifically and selectively hybridizing to a DNA molecule encoding the FRB domain of a natural protein, subject to degeneracy of the genetic code.
  • Specific hybridization means that the hybridization is carried out under conditions of high stringency, particularly under conditions of temperature and ionic strength such that they allow the maintenance of hybridization between two globally complementary DNA fragments.
  • conditions of high stringency of the hybridization step for the purpose of defining the nucleotide sequences described above are advantageously as follows.
  • the hybridization is carried out at a preferred temperature of 65 ° C., in the presence of 6 ⁇ SSC buffer, 5 ⁇ Denhardt's solution, 0.5% SDS and 100 ⁇ g / ml salmon sperm DNA.
  • 1 x SSC corresponds to 0.15 M NaCl and 0.05 M sodium citrate and a solution of 1 x Denhardt corresponds to 0.02% Ficoll, 0.02% polyvinylpyrrolidone and 0.02% bovine serum albumin.
  • the washing steps may, for example, be carried out for 5 to 30 minutes. at 65 ° C, in 2 x SSC buffer or 1 x SSC and 0.1% SDS.
  • the hybridization conditions will be said to be specific since only sequences having at least 90% identity with the sequence complementary to the targeted sequence will be able to hybridize, preferably those having at least 92.5%, 95%, 97.5%, 98%, 99%, 99.5% with this sequence complementary to the target sequence.
  • the FRB domain comprises an amino acid sequence of 89 amino acids corresponding to amino acids 2025-2113 of the human FRAP protein of sequence SEQ ID NO. 24.
  • the FRB domain comprises a sequence of 93 amino acids corresponding to amino acids 2021-2113 of the human FRAP protein of sequence SEQ ID NO. 24. These domains bind to the FKBP protein complexed with rapamycin.
  • Mutants from these domains can also be used; these mutants have the advantage of binding to FKBP complexes with rapalogues, preferentially with respect to endogenous FRB domains.
  • Rapamycin corresponding to rapamycin whose carbon 7 has been substituted by other than an -OMe group may preferentially recognize the FRB domains of which one or more of the following amino acids have been substituted: Tyr2038, Phe2039, Thr2098, Gln2099, Trp21 01 and Asp2102.
  • the FRB domains of hFRAP carrying the following mutations: Y2038H, Y2038L, Y2038V, Y2038A, F2039H, F2039L, F2039A, F2039V, D2102A, T2098A, T2098N, T2098L and T2098S.
  • the FRB domain consisting of amino acids 2021-2113 of hFRAP is a preferred FRB domain.
  • the same domain but carrying the mutation T2098L (called "FRB *" of sequence SEQ ID NO; 2) is also preferred, in particular when the rapalog AP21967 (see FIG. 1) is used.
  • mutations E2032A and E2032S may preferentially recognize the FRB domains of which amino acid Glu2032 has been substituted by another amino acid.
  • the FRB domain is chosen from the following fields:
  • the FRB domain is chosen from the following fields:
  • the FRB domain is chosen from fragments of the human FRAP protein of sequence SEQ ID NO. Between amino acids 2021 and 2113 and further comprising one of the following mutations: Y2038H, Y2038L, Y2038V, Y2038A, F2039H, F2039L, F2039A, F2039V, D2102A, T2098A, T2098N, T2098L, T2098S, E2032A and E21032S.
  • the FRB domain chooses the sequence domain SEQ ID NO. 2.
  • percent identity between two nucleic acid sequences or two amino acid sequences within the meaning of the present invention, it is meant to designate a percentage of nucleotides or identical amino acids between the two sequences to be compared, obtained after the best alignment (optimal alignment), this percentage being purely statistical and the differences between the two sequences being randomly distributed over their entire length. Sequence comparisons between two nucleic acid sequences are traditionally performed by comparing these sequences after optimally aligning them, said comparison being made over the entire length of the reference sequence.
  • the optimal alignment of the sequences for the comparison can be realized, besides manually, by means of the algorithm of local similarity but especially by means of computer software using these algorithms (GAP, BESTFIT, FASTA and TFASTA or by the software of comparison BLAST N or BLAST P (available online at the NCBI website)).
  • the percentage identity between two nucleic acid or amino acid sequences is determined by comparing these two optimally aligned sequences and is calculated by determining the number of positions for which the nucleotide or amino acid is identical between two sequences, dividing this number of identical positions by the total number of positions and multiplying the result obtained by 100 to obtain the percentage identity between these two sequences.
  • the BLAST program "BLAST 2 sequences” (Tatusova et al., "Blast 2 sequences - a new tool for comparing protein and nucleotide sequences", FEMS Microbiol Lett., 174: 247-250) available on the site can be used.
  • the fusion proteins encoded by the nucleic acids according to the invention also comprise a retention motif in the endoplasmic reticulum constituting the C-terminal end of these proteins.
  • KKXX, KXKXX, XKXX and KDEL motifs which must be at the C-terminus of the conditional retention domain, are preferred for purposes of the invention.
  • the KDEL retention pattern is preferred, whereas when it is a membrane protein, the preferred retention motifs are: KKXX, KXKXX, XKXX.
  • the E3 / 19k protein of the adenovirus comprises the KKMP motif, the units KKLL (SEQ ID NO: 16), KK T (SEQ ID NO: 17), KKRD (SEQ ID NO: 18), KKFQ (SEQ ID NO: 19), K SP (SEQ ID NO: 20), and K GY (SEQ ID NO: 21), described by Vincent et al (J Biol Chel 1998).
  • the retention motif is situated immediately after the FRB domain, that is to say that it is located immediately after the C-terminal amino acid of this domain.
  • the nucleic acid according to the invention is characterized in that said fusion protein comprises between the FRB domain and the retention motif, a peptide fragment whose number of amino acid residues is between 1 and 20 amino acids, preferably between 1 and 10 amino acids.
  • the fusion proteins encoded by the nucleic acids according to the invention firstly comprise a recombinant protein of interest.
  • This protein is a known wild-type protein or one of its mutants which the skilled person wishes to control retention in the endoplasmic reticulum, or a wild-type protein whose C-terminal end has been truncated. In the latter case, those skilled in the art will ensure that truncation does not result in the deletion of a domain or amino acid essential to the function or mechanism of interest.
  • the recombinant protein of interest can be chosen indifferently from: a membrane receptor, an ion channel, an immunoglobulin, a soluble protein or other proteins, such as therapeutic or diagnostic proteins.
  • the products and methods according to the invention are nevertheless particularly suitable for the study of membrane proteins, in particular transmembrane receptors such as G-protein coupled receptors.
  • the invention is advantageously used with class C GPCRs. or class A GPCRs.
  • said recombinant protein of interest is chosen from an intracellular protein, a membrane or transmembrane protein, or a soluble protein, the membrane or transmembrane proteins being the most preferred.
  • the recombinant protein of interest is chosen from class C or class A G-protein coupled receptors, channel receptors or receptors with intrinsic or associated enzymatic activity.
  • tyrosine kinase receptors may also be mentioned, those of the immunoglobulin superfamily, cytokine receptors, chemokine receptors, TNF receptors or cell adhesion receptors.
  • RAMPs GTPases, Phospholipases (PLC), Cyclases (adenylate cyclase), phosphatases, Kinases (MAPkinases, AKT / PKB, Cyclin-CDK, PKA, PKC, c-Src, GR),
  • the nucleic acid according to the present invention encodes a fusion protein which further comprises a domain of a suicide enzyme located upstream of the recombinant protein of interest.
  • said suicide enzyme is selected from ⁇ 06-alkylguanine DNA alkyltransferase or a mutant thereof, such as SNAP-tag or CLIP-tag enzymes; a dehalogenase or a mutant thereof, such as the enzyme Halotag; the ACP protein or one of its mutants, such as the ACP-tag protein. It may be particularly useful to integrate into the fusion protein a sequence corresponding to a suicide enzyme capable of forming a covalent bond with its substrate.
  • the substrate in question comprises a marker, such as a fluorescent molecule, this approach makes it possible to label the fusion protein with said fluorescent molecule.
  • suicidal enzymes proteins that have activity enzymatic modified by specific mutations that give them the ability to rapidly and covalently bind a substrate. These enzymes are called “suicides" because each one can bind only one fluorescent molecule, the activity of the enzyme being blocked by the attachment of the substrate. These enzymes are therefore a tool of choice for specifically labeling proteins of interest with a ratio of a fluorescent molecule to a protein.
  • a suicide enzyme is fused, by conventional molecular biology techniques, with the protein of interest - preferably in its N-terminal part if this protein is a G-protein coupled receptor or a tyrosine-receptor.
  • kinase- and the enzyme substrate covalently bound to a label, such as a fluorescent compound, which is introduced into the extracellular medium.
  • a label such as a fluorescent compound
  • mutants of ⁇ -alkylguanine DNA alkyltransferase AGT
  • the SNAP-tag enzymes Juillerat et al., Chemistry & Biology, Vol.10, 313-317 April 2003
  • CLIP-tag Gatier et al., Chemistry and Biology, 15, 128-136, February 2008
  • BG 6- benzylguanine
  • BC ⁇ 0 2 -benzylcytosine
  • the N-AGT enzyme (Gronemeyer et al (Protein engineering, design & selection, vol 19, no 7, pp 309-3016, 2006) is another mutant of this enzyme whose reactivity with 6- benzylguanine is better than that of the enzyme SNAP-tag.
  • mutants of a dehalogenase such as the HaloTag enzyme marketed by Promega
  • a suicide type enzymatic reaction see WO2004 / 072232
  • some of the substrates of which are compounds of the chloroalkane family, in particular the chloroalkanes having the unit -NH-CH 2 CH 2 -O-CH 2 CH 2 -O- (CH 2 ) 6-Cl.
  • the donor / acceptor will be conjugated to this type of reason.
  • the acyl carrier protein, ACP (Acyl Carrier Protein) protein, on which is transferred, in the presence of phosphopanthein transferase, the 4'-phosphopanthein residue of coenzyme A to a serine of ACP (N.George et al. al, Journal of the American Chemical Society 126 (2004) 8896-8897).
  • ACP Acyl Carrier Protein
  • the company NEB markets a fragment of ⁇ ACP under the trade name "ACP-Tag" for the labeling of proteins.
  • the nucleic acid according to the present invention encodes a fusion protein which furthermore further comprises at its N-terminal end a membrane addressing motif, such as that of the T8 signal peptide or mGluR5 receptor signal peptide.
  • a membrane addressing motif such as that of the T8 signal peptide or mGluR5 receptor signal peptide.
  • the coding sequence for the protein of interest does not include a native membrane targeting sequence that could be post-translational cleaved from the binding between the protein. of interest and the suicide enzyme: if it is, it is preferable not to introduce this domain into the expression plasmid.
  • the protein of interest is a membrane protein
  • the Suicide enzyme is exposed to the extracellular medium: when the N-terminal part of the protein of natural interest is exposed to the extracellular medium, which is the case for GPCRs and RTKs, the fusion protein will be constructed in such a way that the suicide enzyme is expressed in the N-terminal portion of the fusion protein, but always downstream of the membrane addressing peptide if present.
  • the nucleic sequence coding for the fusion protein according to the invention may finally comprise upstream of the DNA encoding these proteins, the DNA coding for a label such as for example the FLAG epitope, the myc epitope, or that of influenza hemagglutinin (HA). These labels are not essential but facilitate the manipulation of the fusion protein for control or purification purposes.
  • the fusion proteins encoded by the nucleic acids according to the invention comprising a suicide enzyme are very advantageous when the protein of interest is a membrane protein, in particular a receptor such as a G protein-coupled receptor (GPCR), a receptor tyrosine kinase activity or immunoglobulin.
  • GPCR G protein-coupled receptor
  • the proteins according to the invention make it possible not only to control the targeting of the protein of interest towards the plasma membrane, but also to label it with a fluorescent compound and thus allow all kinds of studies, in particular relative to oligomerization of proteins of interest on the surface of the plasma membrane.
  • the techniques of the prior art were based on the controlled retention of proteins of interest by a phenomenon of aggregation of these proteins in the endoplasmic reticulum, which could interfere with the natural oligomerization phenomena that the person skilled in the art can to study with the present invention.
  • nucleic acids according to the invention based on known sequences, reveals the general knowledge of the person skilled in the art: the sequence of the nucleic acid coding for the protein of interest is available in the various databases, and those FRB domains and retention patterns are also known and easily accessible (see also description, see below).
  • the techniques used for the construction of a nucleic acid according to the invention are based on the PCR technique for amplifying the various DNA fragments constituting the nucleic acid according to the invention, and on the use of DNA ligases. and restriction enzymes for cutting and binding these different nucleic acid fragments.
  • the reagents necessary for this construction are commercially available and those skilled in the art are familiar with their use. It will ensure in particular that the sequences coding for the different parts of the fusion protein according to the invention are all in the same reading frame.
  • the present invention relates to the fusion proteins, preferably isolated, encoded by the nucleic acids according to the invention.
  • the nucleic acids encoding the fusion proteins according to the invention are also included in the invention, as well as their complementary nucleic acid.
  • the invention also relates to vectors, in particular expression plasmids containing the nucleic acids according to the invention.
  • expression plasmids are commercially available, accompanied by instructions for the introduction of a DNA fragment, such as that according to the invention.
  • These expression plasmids can be used for the development of cell cultures expressing the fusion proteins according to the invention.
  • the various techniques for introducing a heterologous DNA into a living cell are well known to those skilled in the art. They include methods based on the use of transfection agents (such as cationic lipids, liposomes, polyamines, dendrimers), mechanical techniques (electroporation, micro injection or thermal shock), or even viruses (especially retro viruses adeno viruses or lenti viruses).
  • the cells in which the expression vectors according to the invention are transfected are eukaryotic cells, preferably animal cells, and preferably mammalian cells.
  • the invention also relates to expression vectors not comprising proteins of interest but simply comprising a nucleic sequence coding for a conditional retention domain consisting of a FRB domain whose C-terminus terminal is itself a retention pattern in the endoplasmic reticulum.
  • FRB domains and these retention motifs in the endoplasmic reticulum being those as defined above with their preference.
  • This type of vector can be used by those skilled in the art to manufacture expression plasmids according to the invention with the protein of interest of their choice and is a particularly interesting product, both technically and commercially.
  • the present invention relates to a vector for the expression of a recombinant protein of interest in a host cell or a nucleic construct comprising a nucleic acid according to the invention.
  • the present invention also relates to a eukaryotic cell, preferably an animal cell, more preferably a mammalian cell, transformed with a vector or a nucleic construct according to the invention.
  • Human and murine cells are particularly preferred.
  • the present invention provides an in vitro method for the conditional retention of a recombinant protein of interest in the endoplasmic reticulum of a eukaryotic cell suspended in a medium, which method comprises the following steps:
  • step c) causes the release of the recombinant protein of interest from the endoplasmic reticulum of the cell by masking the retention pattern by the rapamycin (or rapalogue) -FKBP complex.
  • the cells are also transfected with a plasmid comprising a nucleic sequence encoding the FKBP protein, and this to increase the amount of this protein in the cell.
  • a plasmid comprising a nucleic sequence encoding the FKBP protein
  • the inventors have nevertheless demonstrated that the presence of this additional vector is not essential to the implementation of the method according to the invention.
  • Vectors encoding the FKBP protein are available from Ariad Pharmaceuticals ("Silver" kit). The characteristics of the expression vectors, and of the cells have been described previously, cf. supra.
  • the rapalogue may be one of those described in International Patent Applications WO99 / 36553 or WO01 / 14387. As mentioned above, the choice of rapalogue can depend on the FRB domain used. The person skilled in the art may use commercially distributed rapalogues, which are generally sold with plasmids comprising the appropriate FPvB domain sequence.
  • the method according to the invention is implemented with an expression vector comprising a nucleic sequence coding for the fragment of the human FRAP protein comprised between amino acids 2021 and 21 13 of this protein and of which threonine 2098 has been replaced by a leucine (FRB domain of sequence SEQ ID NO.2), and the rapalogue is the AP21967 compound of formula (I) below:
  • the present invention relates to a reagent kit characterized in that it comprises:
  • the reagent kit according to the invention is characterized in that it comprises:
  • a vector or a nucleic construct according to the invention coding for a fusion protein comprising a suicide enzyme, preferably a 6-alkylguanine DNA alkyltransferase or a mutant thereof, such as the SNAP-tag or CLIP-tag enzymes,
  • one or more markers preferably selected from fluorophores or cryptates of Europium
  • kits or kits of reagents comprising such vectors or nucleic acids simply having a nucleic sequence coding for a conditional retention domain consisting of a FRB domain whose C-terminal end itself consists of a retention pattern in the endoplasmic reticulum (without the recombinant protein of interest) are also part of the present invention.
  • the FRB domains and the endoplasmic retention signals being those defined above with the same preferences.
  • Figure 1 Formula of AP21967.
  • Figure 2 Topological organization of the construction called GB2 WT and the four constructs called GB2-FRB * -KKXX (# 1 to # 4) in which the different protein domains and the fusion sites FRB * -KKXX in the C-terminal part are indicated.
  • Figure 3 Schematic construction FLAG-ST-betal AR (at positions 433 and 462, plasmids # 1- # 2 respectively).
  • FIG. 4 ELIS A assay of the FLAG epitope carried out on cell cultures expressing FLAG-GB1 or FLAG-GB2 or one of the 4 cell cultures expressing the FLAG-GB2-FRB * -KKXX proteins # 1-4), with or without prior permeabilization.
  • FIG. 5 ELISA assay of the FLAG epitope carried out on each of the 4 cell cultures expressing the FLAG-GB2-FRB * -KKXX # 1 to 4 proteins, in the presence or in the absence of the AP21967 rapalog
  • Figure 6 ELISA assay, performed with an anti-HA monoclonal antibody in the presence and absence of the AP21967 rapalogue on a cell culture expressing the FLAG-GB2-FRB * -KKXX # 2 protein.
  • FIG. 7 ELISA assay of the HA epitope carried out on culture of cells presenting two populations of GABA B receptors: a first consisting of HA-ST-GB1 / Myc-GB2 (popl) dimers, and a second consisting of dimers HA-ST-GB1 / FLAG-GB2-FRB * -KKXX (pop2), in the presence or absence of the AP21967 rapalog.
  • Figure 8 Diagram showing the possible TR-FRET signal resulting from the approximation of two populations.
  • FIG. 9 FRET signal evaluated by labeling with a mixture of BG-LUMI4 TM and BG-D2 on cells, carried out after incubation with the rapalogue and translocation of the dimers HA-ST-GB 1 / FLAG-GB2-FRB * -KKXX at the cell surface.
  • Figure 10 Diagram showing the possible TR-FRET signal for verifying whether the approximation of the GB1 subunits observed results from the formation of new tetramers or the exchange between the GB1 subunits of two populations 1 and 2.
  • FIG. 11 Measurement of the expression of the HA epitope by ELISA assay, in the presence or absence of AP21967 rapalogue carried out on culture of cells presenting two populations of GABA B receptors.
  • FIG. 12 FRET signal (Lumi4 TM -D2 energy transfer) measured in a population 1 resulting from the formation of GABA B receptor tetramers, after membrane addressing of a population 2.
  • Figure 13 Observed FRET signal corresponding to the reconciliation of GB1 subunits of the two populations.
  • Figure 14 ELISA assay of the FLAG epitope carried out on cell cultures expressing FLAG-GB2-FRB * -KKXX (control) or one of the 2 cell cultures expressing the FLAG-ST-betalAR-FRB * -KKXX # 1 proteins to 2), in the presence or absence of AP21967 rapalog.
  • the following examples relate to the study of the formation and dissociation of G-protein-coupled membrane receptor oligomers. These examples use the products and methods according to the invention for inducing membrane addressing of receptors. and their labeling by different fluorescent donor or acceptor partners partners of FRET (Fôrster resonance energy transfer).
  • a first population of (popl) receptors was labeled with compatible TR-FRET fluorophores (donor and red acceptor) and the evolution of the TR-FRET signal of this population was recorded before and after onset of membrane addressing.
  • a second population (pop2) of receptors marked by a green acceptor compatible with the donor used to mark the first population.
  • the potential TR-FRET signal resulting from the reconciliation of the two populations was also recorded.
  • RE endoplasmic reticulum
  • SNAP-tag enzyme forms a covalent bond with its substrate Benzylguanine (BG).
  • GB1 GB1 subunit of the GABA B receiver
  • GB2 GB2 sub-unit of the GABA B receiver
  • betal AR beta 1 adrenergic receptor
  • Tris-KREBS buffer 20 mM Tris pH 7.4, 118 mM NaCl, 5.6 mM glucose, 1.2 mM KH 2 PO 4 , 1.2 mM MgSO 4 , 4.7 mM KCl, 1, 8 mM CaCl 2
  • BG-Lumi4 TM substrate of the SNAP-tag enzyme conjugate with a terbium cryptate - marketed by Cisbio Bioassays under the brand name Tag-Lite ® SNAP-Lumi4Tb
  • BG-d2 substrate of the SNAP-tag enzyme conjugate with a cyanine d2 - marketed by Cisbio Bioassays under the brand name Tag-Lite ® SNAP-red BG-fluorescein substrate of the SNAP-tag enzyme, conjugated to a fluorescein derivative - marketed by Cisbio Bioassays under the brand name Tag-Lite ® SNAP-green
  • VFT Venus Flytrap, extracellular domain GABA B
  • CC super coiled propeller (CC for coiled-coil)
  • the plasmids encoding the following fusion proteins were prepared:
  • Plasmid 1 # 1 FLAG-GB2-FRB * -KKXX (SEQ ID NO: 3).
  • Plasmid 1 # 2 FLAG-GB2-FRB * -KKXX (SEQ ID NO: 4).
  • Plasmid 1 # 3 FLAG-GB2-FRB * -KKXX (SEQ ID NO: 5).
  • Plasmid 2 FLAG-CT-GB2-FRB * -KKXX (SEQ ID NO: 7).
  • Plasmid 3 # 1 FLAG-ST-betalAR-FRB * -KKXX (SEQ ID NO: 8).
  • Plasmid 3 # 2 FLAG-ST-betal AR-FRB * -KKXX (SEQ ID NO: 9).
  • the plasmids encoding the fusion proteins described above comprise the signal peptide of the metabotropic glutamate mGlu5 receptor.
  • Plasmids encoding GABA B i a and GABA B2 subunits labeled HA, FLAG or c-Myc at their N-terminus have been previously described (Rniazeff et al, 2004, Nat Str, Mol Biol. 11, 706-713). Subcloning of the Snap-tag sequence (obtained from the plasmid of pSST26m, Covalys, Geneva, Switzerland) into these plasmids at a unique MluI restriction site located in the linker downstream of the HA tags or FLAG has also been previously described (Maurel et al., 2008, Nat Methods 5 (6), 561-567). A MluI restriction site was added using the strategy
  • a NotI site was then inserted at the C-terminus of the FLAG-GB2 coding sequence, FLAG-CT-GB2 (at positions 834, 878, 905 and 940, plasmids # 1-4 respectively, see FIG. 2) and FLAG-ST-betalAR (to positions 433 and 462, plasmids # 1 - # 2 respectively see Figure 3) using the QuikChange strategy (Stratagene).
  • the sequence coding for FRB * -KKXX (ARGENT TM Regulated Heterodimerization Kit), followed by a stop codon was then subcloned between NotI and HindIII (see Figures 2 and 3).
  • HEK-293 cells were cultured in modified Dulbecco Eagle medium (DMEM, GIBCO / BRL / Life Technologies) supplemented with 10% fetal calf serum FBS) and transiently lipofected with the plasmids of Example 1 with of Lipofectamine 2000 according to the manufacturer's instructions (Invitrogen) (for example: 50 ng of HA-ST-GBla with 50 ng of Flag-GB2-FRB * -KKXX per dot (of a 96-well plate) or 50 ng of Flag-ST-betal AR-FRB * -KKXX per point (from a 96-well plate)).
  • DMEM modified Dulbecco Eagle medium
  • BRL BRL / Life Technologies
  • This method was used to prepare cultures each containing one of the plasmids of Example 1.
  • Example 2 An ELISA assay of the FLAG epitope was carried out on cell cultures of Example 2 (cell cultures expressing FLAG-GB1 or FLAG-GB2 or one of the four cell cultures expressing FLAG-GB2-FRB * -KKXX proteins. # 1-4), with or without prior permeabilization.
  • ELISA assays on intact cells were performed as previously described (Maurel et al, 2008, Nat Methods 5 (6), 561-567). Cells were fixed with 4% paraformaldehyde and then blocked by addition of phosphate buffered saline + 1% fetal calf serum for 30 min. An anti-Flag-M2 monoclonal antibody (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), conjugated to horseradish peroxidase, was then applied for 30 min at 0.5 mg / l and the cells were washed. Bound antibodies were detected by chemiluminescence in using SuperSignal substrates (Pierce, Rockford, IL, USA) and a Victor2 Wallac counter (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA).
  • an ELISA assay of the HA epitope was also carried out on cell cultures obtained by cotransfection of plasmids comprising the sequences coding for the fusion proteins HA-GB1 and FLAG-GB2-FRB * -KKXX.
  • the GB1 monomer is naturally retained in the endoplasmic reticulum and is translocated to the cell membrane only when associated with the GB2 monomer to form the GB1-GB2 heterodimer (GABA B receptor).
  • This ELISA assay performed under the same conditions as that of the FLAG epitope, but this time with an anti-HA monoclonal antibody (clone 3F 10, Roche Bioscience, Basel, Switzerland), in the presence and in the absence of the AP21967 rapalogue. (precinubatiojn 3h00, ⁇ ) shows ( Figure 6) that the heterodimer GB1-GB2 is retained in the ER, and that in the presence of rapalogue it is translocated to the plasma membrane.
  • KKXX, HA-ST-GB1 and Myc-GB2 were prepared according to the technique described in Example 2, by transfecting plasmids of Example 1 (50 ng HA-ST-GB1 + 50 ng Flag-GB2- FRB * -KKXX + 4.5 ng Myc-GB2 per point of a 96-well plate).
  • These cells therefore comprise two populations of GABA B receptors: a first consisting of HA-ST-GB1 / Myc-GB2 (popl) dimers, and a second consisting of HA-ST-GB1 / FLAG-GB2-FRB * -KKXX dimers ( pop2)
  • An ELISA assay of the HA epitope was carried out on these cells according to the protocol of Example 4, in the presence or in the absence of the AP21967 rapalog (preincubation 3:00, ⁇ ). The results of this assay (FIG.
  • a first (popl) receptor population was labeled with a donor fluorophore (BG-Lumi4 TM); after triggering the membrane addressing of a second population (pop2) of receptors, this second population was marked by a red acceptor (BG-d2) compatible with the donor used to mark the first population.
  • BG-d2 red acceptor
  • Example 5 The cells of Example 5 were washed in DMEM and then incubated with a fluorescent donor conjugate BG-LUMI4 TM diluted in DMEM (final concentration per well: 0.3 ⁇ l) for 1 h at 37 ° C. in a 5% CO 2 atmosphere to label HA-ST-GB1 / Myc-GB2 (popl) dimers (Maurel et al., 2008, Nat Methods 5 (6), 561-567).
  • the FRET signal was recorded at 665 nm (acceptor emission wavelength d2) on a RubyStar plate reader (BMG Labtechnologies), to determine the signal of NON-specific FRET.
  • the cells were then incubated with 50 ⁇ l of 2X-AP21967 at 2 ⁇ in solution in DMEM (or with DMEM for the negative control). for 2 hours to cause the membrane addressing HA-ST-GB 1 / FLAG-GB2-FRB * -KKXX (pop2) dimers.
  • FRETmax The FRETmax signal corresponding to all possible interactions on the total population of receptors (popl and pop2) was evaluated in parallel by a single labeling step with a mixture of BG-LUMI4 TM and BG-D2 (final concentrations 0, 1 ⁇ and 0.6 ⁇ respectively) on the same cells, carried out after incubation with the rapalogue and translocation of the HA-ST-GB1 / FLAG-GB2-FRB * -KKXX dimers to the cell surface. Experimental conditions ensure equivalent amounts of dimers of populations 1 and 2 (measurement of the expression of the HA epitope by ELISA assay, in the presence or absence of AP21967 rapalog, FIG. 7).
  • the population 1 has been marked by a pair of FRET partners (donor BG-LUMI4 TM and acceptor BG-D2, binding to GB1 subunits) to obtain a signal corresponding to the tetramers of population 1 (HA-ST-GB1 / Myc-GB2), measured at length emission waveform of D2 (665 nm).
  • a BG-fluorescein conjugate was added to the medium and the FRET signals were measured at the fluorescein and D2 wavelengths in FRET ( Figure 10).
  • Population Marking 2 The GB1 subunits of population 2 were labeled according to the protocol of Example 6, but this time using the BG-fluorescein conjugate (final concentration: 0.12 ⁇ ). After incubation and washing, FRET signals at 665 nm (acceptor fluorophore D2 emission wavelength) and 520 nm (fluorescein emission wavelength) were recorded on a RubyStar plate reader (BMG Labtechnologies). ) and an Infinity 500 reader (Tecan), respectively.
  • FRETmax this signal was obtained in the same manner as in Example 6, but this time with the conjugates BG-fluorescein (final concentration: 0.06 ⁇ ) and BG-Lumi4 TM (final concentration: 0.1 ⁇ ) .
  • the experimental conditions provide equivalent amounts of dimers of populations 1 and 2 (measurement of the expression of the HA epitope by ELISA assay, in the presence or absence of AP21967 rapalog, FIG. 11).
  • FIGS. 12 and 13 The results of this experiment are shown in FIGS. 12 and 13: the FRET signal within population 1 (Lumi4 TM -D2 energy transfer), resulting from the formation of GABA B receptor tetramers, is not known. affected by the membrane addressing of the dimers of the population 2, which confirms that once formed, the GABA B tetramers are stable.
  • FIG. 13 shows that a FRET signal corresponding to the approximation of GB1 subunits of the two populations is observed (Lumi4 TM -fluorescein energy transfer), confirming the data obtained in example 5.
  • EXAMPLE 7 Conditional retention of the receiver beta 1 adrenergic using the FRB * domain and the KKXX motif
  • Example 3 was reproduced with the following plasmids:
  • Example 2 An ELISA assay of the FLAG epitope was carried out on cell cultures of Example 2 (cell cultures expressing FLAG-GB2-FRB * -KKXX (control) or one of the two cell cultures expressing the FLAG-ST-proteins. betalAR-FRB * -KKXX # 1 to 2), in the presence or absence of the AP21967 rapalog (preincubation 3:00, 1 ⁇ ), as in Example 2.
  • Figure 14 show that both fusion proteins with the conditional retention domain are correctly addressed to the cell surface in the presence of the AP21967 rapalog.

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Abstract

L'invention concerne un acide nucléique codant pour une protéine de fusion comprenant un domaine de rétention conditionnelle constitué d'un domaine FRB suivi d'un motif de rétention dans le réticulum endoplasmique. Les vecteurs d'expression et cellules transformées par de tels vecteurs font également partie de la présente invention. Sous un autre aspect, l'invention comprend également des méthodes de rétention conditionnelle dans le réticulum endoplasmique de protéine d'intérêt mettant en œuvre ces vecteurs ainsi que des kits ou trousse de réactifs comprenant de tels acides nucléiques ou vecteurs.

Description

L'invention est relative à une méthode de rétention conditionnelle dans le réticulum endoplasmique de protéines d'intérêt.
Les techniques permettant de réguler les processus biologiques mis en œuvre par les cellules sont très précieuses pour l'étude et la compréhension des mécanismes de fonctionnement de la cellule. Par exemple, les méthodes de régulation de l'expression des protéines permettent d'en apprécier le rôle dans le contexte d'une cellule vivante. Ces méthodes sont largement basées sur l'introduction dans les cellules de vecteurs d'expression comprenant la séquence d'une protéine d'intérêt, ou bien celle d'une protéine dont la présence dans la cellule va réguler, de manière directe ou indirecte, l'expression d'une autre protéine d'intérêt.
Les auteurs de la demande internationale de brevet W094/18317 de l'Université de Stanford ont par exemple proposé une approche permettant de réguler certains événements biologiques basée sur l'utilisation de constructions moléculaires chimériques comprenant d'une part un domaine effecteur et d'autre part au moins un domaine permettant leur dimérisation en présence d'un ligand donné. Selon cette méthode, l'ajout au milieu extracellulaire du ligand approprié entraine la formation de dimères de protéines chimériques, et le rapprochement des domaines effecteurs qui vont pouvoir activer certains processus biologiques, comme par exemple la transcription d'une séquence nucléique cible. Dans cette demande de brevet, les ligands sont en fait constitués d'au moins deux ligands liés par liaison covalente, chacun étant capable de se lier à l'une des protéines chimériques.
La demande internationale de brevet W096/41865 d'Ariad Gene Therapeutics décrit une méthode similaire basée sur l'interaction entre les protéines FKBP et FPvB en présence de rapamycine ou d'un de ses dérivés. Cette méthode consiste à introduire dans une cellule deux constructions moléculaires codant chacune pour une protéine de fusion comprenant d'une part, la protéine FKBP liée à un premier domaine effecteur et d'autre part la protéine FRB liée à un deuxième domaine effecteur. L'ajout de rapamycine au milieu extracellulaire provoque la formation d'un complexe FRB-rapamycine-FKBP, ce qui va avoir pour effet de rapprocher les domaines effecteurs et par la même de déclencher ou réguler un processus biologique donné, notamment la transcription d'un gène d'intérêt ou l'agrégation de protéines pour en provoquer l'activation.
Cette technique est commercialisée par la société Ariad sous le nom commercial Argent™.
Des analogues de rapamycine présentant un effet immunosuppresseur moins important que celui de la rapamycine ont été décrits dans la demande internationale de brevet W099/36553. Des analogues de l'épirapamycine ont été publiés dans la demande internationale de brevet WO01/14387. Ces dérivés de la rapamycine peuvent potentiellement être utilisés dans la méthode générale décrite dans la demande W096/41865.
Alors que les techniques de régulation de l'expression protéique au niveau transcriptionnel sont largement connues et ont donné lieu à la commercialisation de nombreux réactifs, il en va différemment des méthodes permettant de contrôler la migration des protéines du réticulum endoplasmique vers le compartiment où elles sont normalement adressées, pour lesquelles très peu de procédés existent. Ce type d'approche a l'avantage, par rapport aux systèmes de contrôle de la transcription, d'offrir un bien meilleur contrôle temporel de la sécrétion d'une protéine d'intérêt ou de sa migration du compartiment golgien vers la membrane plasmique.
La demande internationale de brevet WO00/23602 décrit une méthode permettant de contrôler la sécrétion de protéines d'intérêt, ainsi que des produits utiles à la mise en œuvre de cette méthode, basés sur l'utilisation de domaines de rétention conditionnelle (« CRD »). Ces domaines sont exprimés sous forme de protéine de fusion avec une protéine d'intérêt et ont la propriété de retenir ladite protéine d'intérêt dans le réticulum endoplasmique, à moins qu'un ligand particulier ne soit ajouté au milieu cellulaire. Quelques exemples de domaines CRD sont présentés dans la demande, comme la protéine de liaison du rétinol (RBP, pour « Retinol Binding Protein » en langue anglaise), le mutant Z de l'antitrypsine alpha 1, et un mutant de Γ alpha-gai actosidase A.
La méthode est illustrée en détail avec le mutant F36M de la protéine hFKBP12. Les protéines comportant cette mutation ont la capacité de former des dimères, et cette dimérisation est réversible en présence de dérivés de la rapamycine qui se lient à hFKBP12. Ce mutant, lorsqu'il est exprimé sous forme de protéine de fusion avec une protéine d'intérêt normalement sécrétée, entraine l'agrégation de ces protéines dans le réticulum endoplasmique, empêchant ainsi leur sécrétion. En présence d'un dérivé de la rapamycine, les dimères se désagrègent et la protéine d'intérêt est sécrétée à la surface de la cellule. Les auteurs ont également essayé d'utiliser cette technique avec une protéine membranaire (le récepteur LNGFR, «Low-affinity nerve growth factor receptor» en langue anglaise) pour en réguler la migration du compartiment golgien vers la membrane cellulaire. Cependant, cette technique a fonctionné avec un succès mitigé dans ce contexte puisque une quantité importante de protéine n'est pas retenue dans le réticulum endoplasmique [p.71 1.25], sans doute en raison de contraintes physiques qui limitent l'agrégation des protéines d'intérêt quand celles-ci sont des protéines membranaires. Par ailleurs, cette méthode est très mal adaptée à l'étude de l'oligomérisation des récepteurs membranaires puisque elle peut perturber les mécanismes naturels de formation d'oligomères. De plus, les auteurs préconisent d'inclure dans la protéine de fusion un site de clivage par des enzymes du compartiment golgien (telle que la furine), ce qui rajoute un paramètre de variabilité à l'utilisation de cette méthode.
La société Ariad Gene Therapeutics exploite cette technologie à travers un produit vendu sous le nom commercial de «RPF ™ Regulated Sécrétion / Aggregation Kit». II serait particulièrement utile de disposer d'une technique permettant de contrôler la rétention d'une protéine d'intérêt dans le réticulum endoplasmique, sans utiliser l'agrégation de ces protéines comme mécanisme de rétention, notamment pour pouvoir étudier l'oligomérisation naturelle des récepteurs membranaires. La présente invention fournit une méthode et des produits permettant de résoudre ce problème.
La demanderesse a mis en évidence qu'il était possible de retenir de manière conditionnelle une protéine d'intérêt dans le réticulum endoplasmique d'une cellule animal en fusionnant cette protéine d'intérêt avec une domaine FRB suivi d'un signal de rétention endoplasmique, ladite protéine d'intérêt pouvant être ensuite rapidement libérée de l'intérieur du réticulum endoplasmique pour migrer notamment vers la surface de la cellule en présence de rapamycine.
De plus, la demanderesse a mis en évidence qu'il n'était pas nécessaire de co- exprimer cette protéine de fusion avec la protéine FKBP interagissant avec FRB, la concentration endogène intracellulaire de FKBP dans ces cellules étant suffisante pour obtenir le masquage réversible du signal de rétention endoplasmique. La présente invention a pour objet une protéine de fusion dont la libération du réticulum endoplasmique est conditionnée par la présence dans l'environnement de la cellule de rapamycine, ou d'un de ses dérivés. L'invention est également relative à un acide nucléique codant pour une protéine de fusion selon l'invention, ainsi qu'à des vecteurs d'expression et des cellules les contenant. L'invention concerne aussi une méthode de rétention conditionnelle d'une protéine d'intérêt dans le réticulum endoplasmique, permettant ainsi de contrôler la translocation d'une protéine vers la membrane plasmique, le cytosol, ou bien sa sécrétion dans le milieu extracellulaire. Cette approche est particulièrement utile pour étudier les phénomènes d'oligomérisation des protéines membranaires, mais également et de manière beaucoup plus générale, dans tous les cas où l'on souhaite augmenter l'expression d'une protéine d'intérêt donnée tout en limitant les effets nocifs potentiels liés à l'augmentation de l'activité de cette protéine, qui grâce à l'invention peut être stockée dans le réticulum endoplasmique. Ce type d'outil est particulièrement intéressant dans le cadre du criblage de médicament sur cellules vivantes, puisqu'il permet d'induire la translocation de la protéine étudiée juste avant le test, et cela de manière relativement rapide par rapport aux techniques de l'art antérieur basées sur l'induction de la transcription de gènes d'intérêt. L'invention porte enfin sur des kits ou trousse de réactifs comprenant de tels vecteurs ou cellules transformées avec ces vecteurs pour la mise en œuvre de ces méthodes de rétention ou de criblage.
Dans un premier aspect, l'invention concerne un acide nucléique codant pour une protéine de fusion dans un même cade de lecture, ladite protéine de fusion comprenant une protéine d'intérêt, cette protéine de fusion ayant la particularité de n'être libérée par le réticulum endoplasmique que lorsque de la rapamycine ou un de ces analogues (connus sous le terme de « rapalogues ») est introduite dans l'environnement de la cellule, par exemple dans le milieu extracellulaire. Les protéines de fusion qui forment le deuxième aspect de la présente invention comprennent :
(i) une protéine d'intérêt que l'on souhaite étudier et, à son extrémité C- terminale,
(ii) un domaine de rétention conditionnelle comprenant
- un domaine FRB dont l'extrémité C-terminale est elle-même constituée par - un motif de rétention dans le réticulum endoplasmique.
Les inventeurs ont découvert que lorsque de telles protéines de fusion sont exprimées dans la cellule, elles sont retenues dans le réticulum endoplasmique, à moins que de la rapamycine ou un rapalogue ne soit ajouté au milieu extracellulaire. Dans ce cas, un complexe de rapamycine (ou rapalogue)-FKBP endogène se forme et va se lier au domaine FRB de la protéine de fusion de l'invention. La formation du complexe FRB-rapamycine(ou rapalogue)-FKBP a pour effet de masquer le motif de rétention dans le réticulum endoplasmique et la protéine de fusion est alors libérée de ce compartiment, pour gagner par exemple la membrane plasmique s'il s'agit d'une protéine membranaire, ou bien encore dans le cas d'une protéine soluble gagner le cytosol ou être excrétée par la cellule. De manière surprenante, il n'est pas nécessaire d'augmenter la quantité de FKBP intracellulaire pour que la protéine de fusion soit retenue dans le réticulum endoplasmique : A l'inverse de ce qui a été décrit dans l'art antérieur lorsque les systèmes FRB-FKBP ont été utilisés (notamment dans les produits de la société Ariad), il n'est pas nécessaire de transfecter dans la cellule un plasmide d'expression de FKBP, puisque les inventeurs ont découvert que la FKBP endogène est suffisante à la mise en œuvre de l'invention.
Dans un troisième aspect, l'invention est relative à des vecteurs, en particulier des plasmides d'expression contenant les acides nucléiques selon l'invention. Dans un dernier aspect, l'invention concerne une méthode de contrôle de la rétention d'une protéine d'intérêt dans le réticulum endoplasmique
Les caractéristiques essentielles communes aux différents aspects de l'invention sont décrites ci-après.
Ainsi, sous un premier aspect, la présente invention a pour objet un acide nucléique, de préférence isolé, codant, dans un seul cadre de lecture, pour une protéine de fusion, ladite protéine de fusion comprenant:
a) une protéine recombinante d'intérêt, et
b) à l'extrémité C-terminale de ladite protéine recombinante d'intérêt, un domaine de rétention conditionnelle constitué d'une protéine comprenant un domaine FRB dont l'extrémité C-terminale est elle-même constituée d'un motif de rétention dans le réticulum endoplasmique.
Une autre caractéristique essentielle des protéines de fusion codées par les acides nucléiques selon l'invention est la présence d'un domaine FRB. Les domaines FRB sont connus de l'homme du métier et ont été décrit notamment dans les demandes internationales de brevet W099/36553, WO99/010510 et le brevet Européen EP833894.
Les domaines FRB sont des domaines polypeptidiques, généralement d'au moins environ 89 à 100 acides aminés, qui sont capables de former un complexe tripartite avec une protéine FKBP et la rapamycine (ou un de ses analogues, également appelé « rapalogue »). Les domaines FRB sont présents dans un certain nombre de protéines naturelles, notamment les protéines FRAP (également connues sous les noms RAPT1 ou RAFT) humaines ou d'autres espèces, les protéines de levure Torl et Tor2, et un analogue de FRAP de que l'on trouve chez les levures de type Candida. Les séquences nucléiques codant pour ces protéines sont connues et permettent la synthèse ou le clonage de leurs domaines FRB : - FRAP humaine (ADNc de séquence SEQ ID NO. 23 et protéine de séquence SEQ ID NO. 24, (Brown et al, 1994, Nature 369, 756-758; GenBank numéro Accession #L34075, Seq ID 508481; Chiu et al, 1994, PNAS USA 91, 12574-12578; Chen et al. 1995. PNAS USA 92. 4947-4951) - RAPT1 murine Chiu et al. supra (Protéine de séquence SEQ ID NO. 29, GenBank numéro d'accession NP 064393)
- Torl levure, S. cerevisiae (ADNc de séquence SEQ ID NO. 25 et Protéine de séquence SEQ ID NO. 26, Helliwell et al, 1994, Mol Cell Biol 5. 105-118; EMBL Accession #X74857. NCBI Seq Id #468738
- Tor 2 levure, S. cerevisiae (ADNc de séquence SEQ ID NO. 27 et Protéine de séquence SEQ ID NO. 28, Kunz et al. 1993, Cell 73, 585-596: EMBL Accession #X71416, NCBI Sea ID 298027 - Homologue FRAP Candida (voir la demande internationale de brevet WO95/33052).
La figure 2 de Chiu et al, supra, montre un alignement de 160 acides aminés correspondant aux domaines FRB des protéines FRAP humaine, FRAP murine, Torl et Tor2 de S. cerevisiae. De préférence, le domaine FRB utilisé dans la présente invention comprendra les 89 acides aminés compris entre les résidus Glu- 39 et Lys/Arg-127 des séquences de cette figure. Pour référence, en utilisant la numérotation de Chen et al ou Sabitini et al, ce domaine FRB de 89 acides aminés est compris entre les résidus numéroté Glu-2025 à Lys-2113 dans le cas FRAP humaine, Glu- 1965 à Lys-2053 dans le cas de Tor2, et Glu- 1962 à Arg-2050 dans le cas de la Torl .
Le domaine FRB utilisé dans les produits et méthodes selon l'invention est donc choisi pour sa capacité à se lier à un complexe de FKBP avec la rapamycine ou un rapalogue, et comprends une des séquences peptidiques naturelles constituée des 89 acides aminés mentionnés ci-dessus, ou encore les domaines correspondant dans des protéines analogues. Selon un mode également préférée, ce domaine FRB peut contenir jusqu'à une dizaine, de préférence de 1 à 5, substitutions d'acides aminés, des insertions ou des suppressions au sein de cette région par rapport à la séquence naturelle; il peut être codé par une séquence d'ADN capable de s'hybrider spécifiquement et de manière sélective à une molécule d'ADN codant pour le domaine FRB d'une protéine naturelle, sous réserve de la dégénérescence du code génétique.
Une hybridation spécifique signifie que l'hybridation est réalisée dans des conditions de forte stringence, en particulier dans des conditions de température et de force ionique telles qu'elles permettent le maintien de l'hybridation entre deux fragments d'ADN globalement complémentaires.
A titre illustratif, des conditions de forte stringence de l'étape d'hybridation aux fins de définir les séquences nucléotidiques décrites ci-dessus, sont avantageusement les suivantes.
L'hybridation est réalisée à une température préférentielle de 65°C, en présence de tampon 6 x SSC, 5 x de solution de Denhardt, 0,5 % SDS et 100 μg/ml d'ADN de sperme de saumon. 1 x SSC correspond à 0,15 M NaCl et 0,05 M de citrate de sodium et une solution de 1 x Denhardt correspond à 0,02 % Ficoll, 0,02 % de polyvinylpyrrolidone et 0,02 % de sérum albumine bovine.
Les étapes de lavage peuvent, par exemple, être effectuées pendant 5 à 30 min. à 65°C, dans un tampon 2 x SSC ou 1 x SSC et à 0,1 % SDS.
Les conditions d'hybridation de forte stringence décrites ci- avant pour un polynucléotide de taille définie, seront adaptées par l'homme du métier pour des oligo-nucléotides de taille plus grande ou plus petite, selon l'enseignement de Sambrook et al, 1989.
De préférence, les conditions d'hybridation seront dites spécifiques dès lors que seules les séquences présentant au moins 90 % d'identité avec la séquence complémentaire de la séquence ciblée pourront hybrider, de préférence celles présentant au moins 92,5 %, 95 %, 97,5 %, 98 %, 99 %, 99,5 % avec cette séquence complémentaire de la séquence cible.
De préférence, le domaine FRB comprend une séquence d'acide de 89 acides-aminés correspondant aux acides aminés 2025-2113 de la protéine FRAP humaine de séquence SEQ ID NO. 24.
Dans une autre mise en œuvre préférée, le domaine FRB comprends une séquence de 93 acides aminés correspondant aux acides aminés 2021-2113 de la protéine FRAP humaine de séquence SEQ ID NO. 24. Ces domaines se lient à la protéine FKBP complexée avec la rapamycine.
Des mutants de ces domaines peuvent également être utilisés ; ces mutants présentent l'avantage de se lier à des complexes de FKBP avec des rapalogues, de manière préférentielle par rapport aux domaines FRB endogènes.
Les rapalogues correspondant à la rapamycine dont le carbone 7 a été substitué par autre chose qu'un groupe -OMe peuvent reconnaître préférentiellement les domaines FRB dont un ou plusieurs des acides aminés suivant ont fait l'objet de substitution : Tyr2038, Phe2039, Thr2098, Gln2099, Trp21 01 et Asp2102. On peut citer à titre d'exemple les domaines FRB de hFRAP portant les mutations suivantes : Y2038H, Y2038L, Y2038V, Y2038A, F2039H, F2039L, F2039A, F2039V, D2102A, T2098A, T2098N, T2098L et T2098S. Le domaine FRB constitué des acides aminés 2021-2113 de hFRAP est un domaine FRB préféré. Le même domaine mais portant la mutation T2098L (dénommé « FRB* » de séquence SEQ ID NO ; 2) est également préféré, en particulier lorsque le rapalogue AP21967 (voir Figure 1) est utilisé.
Les rapalogues correspondant à la rapamycine dont le carbone 28 a été substitué par autre chose qu'un groupe -OH, ou bien dont le carbone 30 a été substitué par autre chose qu'un groupe =0 peuvent reconnaître préférentiellement les domaines FRB dont l'acide aminé Glu2032 a été substitué par un autre acide aminé. On peut citer à titre d'exemple les mutations E2032A et E2032S.
Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, le domaine FRB est choisi parmi les domaines suivants :
a) - le domaine FRB de la protéine FRAP humaine de séquence SEQ ID NO. 24, ou l'un de se fragments capable de fixer la rapamycine ;
- le domaine FRB de la protéine RAPT1 murine de séquence SEQ ID NO. 29,
- le domaine FRB de la protéine Torl de levure de séquence SEQ ID NO. 26 ; ou
- le domaine FRB de la protéine Tor 2 de levure de séquence SEQ ID NO. 28, b) un domaine FRB dont la séquence présente au moins 80 % d'identité avec l'une des séquence de domaine FRB tel que défini en a) et capable de se fixer à la protéine
FKBP, ou encore
c) un fragment de domaine tel que défini en a) ou b), ledit fragment étant capable de se fixer à la protéine FKBP. Selon un mode de réalisation également préféré de l'invention le domaine FRB est choisi parmi les domaines suivants :
a) - le fragment de la protéine FRAP humaine compris entre les acides aminés 2025 et 2113 » de la séquence SEQ ID NO. 24 ;
- le fragment de la protéine FRAP humaine compris entre les acides aminés 2021 et 2113 de la séquence SEQ ID NO. 24 ;
- le fragment de la protéine Torl de levure compris entre les acides aminés 1962 et 2050 de séquence SEQ ID NO. 26 ; ou
- le fragment de la protéine Tor2 de levure compris entre les acides aminés 1965 et 2053 de séquence SEQ ID NO. 28, b) un domaine FRB dont la séquence présente au moins 80 % d'identité avec l'une des séquence de domaine FRB tel que défini en a) et capable de se fixer à la protéine FKBP, ou encore
c) un fragment de domaine tel que défini en a) ou b), ledit fragment étant capable de se fixer à la protéine FKBP.
De manière encore plus préférée, le domaine FRB est choisi parmi les fragments de la protéine FRAP humaine de séquence SEQ ID NO. 24 compris entre les acides aminés 2021 et 2113 et comportant en outre une des mutations suivantes : Y2038H, Y2038L, Y2038V, Y2038A, F2039H, F2039L, F2039A, F2039V, D2102A, T2098A, T2098N, T2098L, T2098S, E2032A et E21032S.
De manière encore plus préférée, le domaine FRB choisi le domaine de séquence SEQ ID NO. 2.
Par «pourcentage d'identité» entre deux séquences d'acide nucléique ou deux séquences d'acide aminé au sens de la présente invention, on entend désigner un pourcentage de nucléotides ou d'acides aminés identiques entre les deux séquences à comparer, obtenu après le meilleur alignement (alignement optimal), ce pourcentage étant purement statistique et les différences entre les deux séquences étant réparties au hasard et sur toute leur longueur. Les comparaisons de séquences entre deux séquences d'acide nucléique sont traditionnellement réalisées en comparant ces séquences après les avoir alignées de manière optimale, ladite comparaison étant réalisée sur toute la longueur de la séquence de référence. L'alignement optimal des séquences pour la comparaison peut être réalisé, outre manuellement, au moyen de l'algorithme de similarité locale mais surtout au moyen de logiciels informatiques utilisant ces algorithmes (GAP, BESTFIT, FASTA et TFASTA ou encore par les logiciels de comparaison BLAST N ou BLAST P (disponibles en ligne sur le site de NCBI)).
Le pourcentage d'identité entre deux séquences d'acide nucléique ou d'acide aminés est déterminé en comparant ces deux séquences alignées de manière optimale et est calculé en déterminant le nombre de positions pour lesquelles le nucléotide ou l'acide aminé est identique entre les deux séquences, en divisant ce nombre de positions identiques par le nombre total de positions et en multipliant le résultat obtenu par 100 pour obtenir le pourcentage d'identité entre ces deux séquences. Par exemple, on pourra utiliser le programme BLAST, «BLAST 2 séquences» (Tatusova et al, "Blast 2 séquences - a new tool for comparing protein and nucleotide séquences", FEMS Microbiol Lett. 174:247- 250) disponible sur le site http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorflbl2.html, les paramètres utilisés pouvant être ceux donnés par défaut (en particulier pour les paramètres «open gap penaltie»: 5, et «extension gap penaltie»: 2; la matrice choisie étant par exemple la matrice «BLOSUM 62» proposée par le programme), le pourcentage d'identité entre les deux séquences à comparer étant calculé directement par le programme. Les protéines de fusion codées par les acides nucléiques selon l'invention comportent également un motif de rétention dans le réticulum endoplasmique, constituant l'extrémité C-terminale de ces protéines.
Plusieurs motifs de rétention des protéines dans le réticulum endoplasmique ont été décrits. Dong et al (Biochim Biophys Acta. 2007 April ; 1768(4): 853-870) rappellent l'existence de 3 types de motifs de rétention identifiés dans les domaines intracellulaires de plusieurs protéines : les motifs KDEL (SEQ ID NO. 10), RXR (SEQ ID NO. 11) et KKXX (SEQ ID NO. 12), auxquels il faut rajouter le motif KXKXX (SEQ ID NO. 13) ou XKXX (SEQ ID NO. 14) décrit notamment pas par Jackson et al (EMBO Journal vol 9 no 10 pp3153-3162, 1990). Dans ces motifs, X représente un acide aminé quelconque.
Les motifs KKXX, KXKXX, XKXX et KDEL, qui doivent se trouver à l'extrémité C-terminale du domaine de rétention conditionnelle, sont préférés aux fins de l'invention.
Lorsque la protéine d'intérêt est une protéine soluble, le motif de rétention KDEL est préféré, alors que lorsqu'elle est une protéine membranaire, les motifs de rétention préférés sont: KKXX, KXKXX, XKXX.
Des exemples particuliers du motif de rétention sont les suivants :
- le motif KKTN (SEQ ID NO. 15),
- le motif RSR qui contrôle le trafic intracellulaire de la sous-unité GB1 du récepteur GABAB
- la protéine E3/19k de l'adénovirus comporte le motif KKMP, - les motifs KKLL (SEQ ID NO. 16), KK T (SEQ ID NO. 17), KKRD (SEQ ID NO. 18), KKFQ (SEQ ID NO. 19), K SP (SEQ ID NO. 20), et K GY (SEQ ID NO. 21), décrits par Vincent et al (J Biol Chel 1998). Selon l'invention, le motif de rétention est situé immédiatement après le domaine FRB, c'est-à-dire qu'il est localisé immédiatement après l'acide aminé C- terminal de ce domaine.
Dans une mise en œuvre alternative également préférée, l'acide nucléique selon l'invention est caractérisé en ce que la dite protéine de fusion comprend entre le domaine FRB et le motif de rétention, un fragment peptidique dont le nombre de résidus d'acide aminé est compris ente 1 et 20 acides aminés, de préférence entre 1 et 10 acides aminés. Les protéines de fusion codées par les acides nucléiques selon l'invention comprennent tout d'abord une protéine recombinante d'intérêt. Cette protéine est une protéine sauvage connue ou l'un de ses mutants dont l'homme du métier souhaite contrôler la rétention dans le réticulum endoplasmique, ou bien une protéine sauvage dont l'extrémité C-terminale a été tronquée. Dans ce dernier cas, l'homme du métier veillera à ce que la troncature n'entraine pas la suppression d'un domaine ou un acide aminé essentiel à la fonction ou au mécanisme auquel il s'intéresse.
Selon la présente invention, la protéine recombinante d'intérêt peut être choisie indifféremment parmi : un récepteur membranaire, un canal ionique, une immunoglobuline, une protéine soluble ou d'autres protéines, comme les protéines thérapeutiques ou diagnostiques. Les produits et méthodes selon l'invention sont néanmoins particulièrement adaptés à l'étude des protéines membranaires, en particulier des récepteurs transmembranaires tels que les récepteurs couplés aux protéines G. Parmi ces derniers, l'invention est avantageusement utilisée avec les RCPG de classe C ou les RCPG de classe A.
Ainsi, selon l'invention ladite protéine recombinante d'intérêt est choisie parmi une protéine intracellulaire, une protéine membranaire ou transmembranaire, ou une protéine soluble, les protéines membranaires ou transmembranaires étant les plus préférées. Selon un mode particulièrement préféré, la protéine recombinante d'intérêt est choisie parmi les récepteurs couplés aux protéines G de classe C ou de classe A, les récepteurs canaux ou les récepteurs à activité enzymatique intrinsèque ou associée.
Parmi les récepteurs à activité enzymatique intrinsèque ou associée, on peut encore citer les récepteurs tyrosine kinase, ceux de la superfamille des immunoglobulines, les récepteurs des cytokines, les récepteurs des chimiokines, les récepteurs du TNF ou encore les récepteurs d'adhésion cellulaire.
Parmi ces protéines d'intérêt, on peut citer aussi de façon particulière :
- les protéines Gcc et βγ
- les β-arrestines
- les protéines intracellulaires contenant un domaine PDZ
- les RAMPs, les GTPases, les Phospholipases (PLC), les Cyclases (adénylate cyclase), les phosphatases, les Kinases (MAPkinases, AKT/PKB, Cycline-CDK, PKA, PKC, c-Src, GR ),
- les facteurs de transcription (p53/mdm2, NF-κΒ, Fos/Jun)
- les Immunoglobulines,
Selon un autre mode de réalisation préféré, l'acide nucléique selon la présente invention code pour une protéine de fusion qui comporte en outre un domaine d'une enzyme suicide situé en amont de la protéine recombinante d'intérêt. De préférence, ladite enzyme suicide est choisie parmi Γ06- alkylguanine DNA alkyltransférase ou un de ses mutants, telles que les enzymes SNAP-tag ou CLIP-tag; une déhalogénase ou un de ses mutants, telle que l'enzyme Halotag ; la protéine ACP ou l'un de ses mutants, telle que la protéine ACP-tag. II peut être particulièrement utile d'intégrer à la protéine de fusion une séquence correspondant à une enzyme suicide capable de former une liaison covalente avec son substrat. Lorsque le substrat en question comprend un marqueur, tel qu'une molécule fluorescente, cette approche permet en effet de marquer la protéine de fusion avec ladite molécule fluorescente.
Par enzymes suicides on entend des protéines qui ont une activité enzymatique modifiée par des mutations spécifiques qui leur confèrent la capacité de lier rapidement et de façon covalente un substrat. Ces enzymes sont dites «suicides» car chacune ne peut lier qu'une seule molécule fluorescente, l'activité de l'enzyme étant bloquée par la fixation du substrat. Ces enzymes constituent par conséquent un outil de choix pour marquer spécifiquement des protéines d'intérêt avec un rapport d'une molécule fluorescente pour une protéine. Dans cette approche, une enzyme suicide est fusionnée, par les techniques classiques de biologie moléculaire, avec la protéine d'intérêt -de préférence dans sa partie N- terminale si cette protéine est un récepteur couplé aux protéines G ou un récepteur à activité tyrosine-kinase- et le substrat de l'enzyme lié de manière covalente à un marqueur, tel qu'un composé fluorescent, qui est introduit dans le milieu extracellulaire. La réaction enzymatique a pour conséquence la liaison covalente du substrat marqué à l'enzyme, et donc le marquage de la protéine d'intérêt par le composé fluorescent.
On peut citer à titre d'exemple non limitatif les enzymes suivantes : - les mutants de l'06-alkylguanine DNA alkyltransférase (AGT). Les enzymes SNAP-tag (Juillerat et al, Chemistry & biology, Vol.10, 313-317 Avril 2003) et CLIP-tag (Gautier et al, Chemistry et Biology, 15, 128-136, février 2008) commercialisées par la société NEB sont des mutants de l'AGT humaine dont les substrats sont respectivement, l'06-benzylguanine (ci-après abrégée BG) et Γ02- benzylcytosine (ci-après abrégée BC). L'enzyme N-AGT (Gronemeyer et al (Protein engineering, design & sélection, vol. 19, no 7, pp 309-3016, 2006) est un autre mutant de cette enzyme dont la réactivité avec l'06-benzylguanine est meilleure que celle de l'enzyme SNAP-tag.
- les mutants d'une déhalogénase (telle que l'enzyme HaloTag commercialisée par Promega) qui génère également une réaction enzymatique du type suicide (voir WO2004/072232), dont certains des substrats sont des composés de la famille des chloroalcanes, en particulier les chloroalcanes comportant le motif -NH-CH2CH2-0-CH2CH2-0-(CH2)6-Cl. Dans ce cas, le donneur/accepteur sera conjugué à ce type de motif.
- La protéine ACP (« Acyl Carrier Protein »), protéine transporteur d'acyles, sur laquelle est transféré, en présence de phosphopantéthéine transférase, le résidu 4 '-phosphopantéthéine du coenzyme A sur une sérine de l'ACP (N.George et al, Journal of the American Chemical society 126 (2004) p 8896-8897). Lorsque cette approche est utilisée pour marquer le récepteur membranaire par le donneur ou l'accepteur, il est nécessaire de rajouter au milieu réactionnel de la phosphopantéthéine transférase. La société NEB commercialise un fragment de Γ ACP sous le nom commercial « ACP-Tag » pour le marquage de protéines. Selon un autre mode de réalisation également préféré, l'acide nucléique selon la présente invention code pour une protéine de fusion qui comporte en outre en outre à son extrémité N-terminale un motif d'adressage membranaire, tel que celui du peptide signal T8 ou du peptide signal du récepteur mGluR5. En effet, lorsque la protéine d'intérêt est une protéine membranaire, il peut être utile d'inclure dans le plasmide d'expression, en amont de la séquence codant pour la protéine d'intérêt et de celle codant pour l'enzyme suicide -le cas échéant-, une séquence codant pour un peptide d'adressage membranaire, tels que le peptide signal T8 ou le peptide signal du récepteur mGluR5, dont l'utilisation à cet effet est connue de l'homme du métier. Enfin, il peut également être souhaitable de s'assurer que la séquence codant pour la protéine d'intérêt ne comporte pas de séquence d'adressage membranaire native qui pourrait faire l'objet d'un clivage post-traductionnel de la liaison entre la protéine d'intérêt et l'enzyme suicide : si c'est le cas, il est préférable de ne pas introduire ce domaine dans le plasmide d'expression.
Dans le cas ou l'on travaille sur des cellules intactes, que la protéine d'intérêt est une protéine membranaire, et pour que la réaction enzymatique ait lieu avec le substrat de l'enzyme présent dans le milieu extracellulaire, il est nécessaire que l'enzyme suicide soit exposée au milieu extracellulaire : lorsque la partie N- terminale de la protéine d'intérêt naturelle est exposée au milieu extracellulaire, ce qui est le cas pour les GPCR et les RTK, la protéine de fusion sera construite de telle sorte que l'enzyme suicide soit exprimée dans la partie N-terminale de la protéine de fusion, mais toujours en aval du peptide d'adressage membranaire s'il est présent.
La séquence nucléique codant pour la protéine de fusion selon l'invention peut enfin comprendre en amont de l'ADN codant pour ces protéines, l'ADN codant pour une étiquette telle que par exemple l'épitope FLAG, l'épitope myc, ou encore celui de l'hémagglutinine de l'influenza (HA). Ces étiquettes ne sont pas essentielles mais facilitent la manipulation de la protéine de fusion à des fins de contrôle ou de purification. Les protéines de fusion codées par les acides nucléiques selon l'invention comportant une enzyme suicide sont très avantageuses lorsque la protéine d'intérêt est une protéine membranaire, en particulier un récepteur tel qu'un récepteur couplé aux protéines G (RCPG), un récepteur a activité tyrosine kinase ou encore une immunoglobuline. Dans ce cas précis, les protéines selon l'invention permettent non seulement de contrôler l'adressage de la protéine d'intérêt vers la membrane plasmique, mais également de la marquer par un composé fluorescent et permettre ainsi toute sorte d'études, notamment relatives à l'oligomérisation des protéines d'intérêt à la surface de la membrane plasmique. Les techniques de l'art antérieur étaient basées sur la rétention contrôlée de protéines d'intérêt par un phénomène d'agrégation de ces protéines dans le réticulum endoplasmique, ce qui pouvait interférer avec les phénomènes d'oligomérisation naturels que l'homme du métier peut étudier avec la présente invention.
La construction de tels acides nucléiques selon l'invention, à partir de séquences connues relève des connaissances générales de l'homme du métier : la séquence de l'acide nucléique codant pour la protéine d'intérêt est disponible dans les diverses base de données, et celles des domaines FRB et motifs de rétention sont également connues et facilement accessibles (voir également description, cf. infra). Les techniques mises en œuvre pour la construction d'un acide nucléique selon l'invention reposent sur la technique de PCR pour amplifier les différents fragments d'ADN constitutifs de l'acide nucléique selon l'invention, et sur l'utilisation de DNA ligases et d'enzymes de restrictions pour découper et lier ces différents fragments d'acides nucléiques. Les réactifs nécessaires à cette construction sont disponibles dans le commerce et l'homme du métier est familiarisé avec leur utilisation. Il veillera en particulier à ce que les séquences codant pour les différentes parties de la protéine de fusion selon l'invention soient toutes dans le même cadre de lecture.
Sous un autre aspect, la présente invention a pour objet les protéines de fusion, de préférence isolées, codées par les acides nucléiques selon l'invention.
Compte tenu de la dégénérescence du code génétique, les acides nucléiques codant pour les protéines de fusion selon l'invention sont également compris dans l'invention, ainsi que leur acide nucléique complémentaire. L'invention est aussi relative à des vecteurs, en particulier des plasmides d'expression contenant les acides nucléiques selon l'invention. Là encore, la préparation de ces vecteurs relève des connaissances générales de l'homme du métier. Des plasmides d'expression sont disponibles dans le commerce, accompagnés d'instruction pour l'introduction d 'un fragment d'ADN, tel que celui selon l'invention.
Ces plasmides d'expression peuvent être utilisés pour le développement de cultures cellulaires exprimant les protéines de fusion selon l'invention. Les différentes techniques d'introduction d'un ADN hétérologue dans une cellule vivante sont bien connues de l'homme du métier. Elles comprennent des méthodes basées sur l'utilisation d'agents de transfection (tels que les lipides cationiques, les liposomes, les polyamines, les dendrimères), de techniques mécaniques (électroporation, micro injection ou choc thermique), ou encore de virus (notamment des rétro virus des adéno virus ou des lenti virus).
Les cellules dans lesquelles sont transfectés les vecteurs d'expression selon l'invention sont des cellules eucaryotes, de préférence des cellules animales, et de manière préférée des cellules de mammifères.
Il faut enfin noter que l'invention est aussi relative à des vecteurs d'expression ne comportant pas de protéines d'intérêt mais comportant simplement une séquence nucléique codant pour un domaine de rétention conditionnelle constitué d'un domaine FRB dont l'extrémité C-terminale est elle même constituée d'un motif de rétention dans le réticulum endoplasmique. Ces domaines FRB et ces motifs de rétention dans le réticulum endoplasmique étant ceux tels que définis ci- avant avec leur préférence.
Ce type de vecteurs peut être utilisé par l'homme du métier pour fabriquer des plasmides d'expression selon l'invention avec la protéine d'intérêt de son choix et constitue un produit particulièrement intéressant, tant au niveau technique que commercial.
Ainsi, sous un autre aspect, la présente invention a pour objet un vecteur pour l'expression d'une protéine recombinante d'intérêt dans une cellule hôte ou une construction nucléique comprenant un acide nucléique selon l'invention. La présente invention a aussi pour objet une cellule eucaryote, de préférence une cellule animale, de préférence encore une cellule de mammifère, transformée par un vecteur ou une construction nucléique selon l'invention.
Les cellules humaines et murines sont particulièrement préférées.
Sous un autre aspect, la présente invention a pour objet une méthode in vitro de rétention conditionnelle d'une protéine recombinant d'intérêt dans le réticulum endoplasmique d'une cellule eucaryote en suspension dans un milieu, cette méthode comprenant les étapes suivantes :
a) la transfection dans ladite cellule d'un vecteur d'expression selon la l'invention,
b) l'ajout dans ledit milieu de rapamycine ou d'un rapalogue, c) l'incubation de la cellule, de préférence pendant une période de 1 heure à 4 heures, une période de 3 heures ± 30 min étant préférée.
Cette incubation à l'étape c) provoque la libération de la protéine recombinante d'intérêt du réticulum endoplasmique de la cellule par masquage du motif de rétention par le complexe rapamycine (ou rapalogue) - FKBP.
Dans une mise en œuvre particulière, les cellules sont également transfectées avec un plasmide comprenant une séquence nucléique codant pour la protéine FKBP, et cela pour augmenter la quantité de cette protéine dans la cellule. Comme mentionné plus haut et illustré dans les exemples expérimentaux, les inventeurs ont néanmoins démontré que la présence de ce vecteur additionnel n'est pas indispensable à la mise en œuvre de la méthode selon l'invention. Des vecteurs codant pour la protéine FKBP sont disponibles auprès de la société Ariad Pharmaceuticals (trousse «Argent»). Les caractéristiques des vecteurs d'expression, et des cellules ont été décrites précédemment, cf. supra.
Le rapalogue peut être l'un de ceux décrit dans les demandes internationales de brevets W099/36553 ou WO01/14387. Comme indiqué précédemment, le choix du rapalogue peut dépendre du domaine FRB utilisé. L'homme du métier pourra utiliser des rapalogues distribués dans le commerce, qui sont généralement vendus avec des plasmides comprenant la séquence du domaine FPvB approprié.
De manière préférée, la méthode selon l'invention est mise en œuvre avec un vecteur d'expression comportant une séquence nucléique codant pour le fragment de la protéine FRAP humaine compris entre les acides aminés 2021 et 21 13 de cette protéine et dont la thréonine 2098 a été remplacée par une leucine (domaine FRB de séquence SEQ ID NO.2), et le rapalogue est le composé AP21967 de formule (I) suivante :
Figure imgf000021_0001
AP21S6? (I)
Sous un autre aspect, la présente invention a pour objet une trousse de réactifs caractérisée en ce qu'elle comprend :
a) un vecteur, une construction nucléique ou une cellule transformée selon l'invention,
b) le cas échéant, un vecteurs codant pour la protéine FKBP ; et
c) le cas échéant, de la rapamycine ou un rapalogue.
De préférence, la trousse de réactifs selon l'invention est caractérisée en ce qu'elle comprend :
a) un vecteur ou une construction nucléique selon l'invention codant pour une protéine de fusion comprenant une enzyme suicide, de préférence une 06- alkylguanine DNA alkyltransférase ou un de ses mutants, telles que les enzymes SNAP-tag ou CLIP-tag,
b) un ou plusieurs marqueurs, de préférence choisi parmi les fluorophores ou les cryptâtes d'Europium,
c) le cas échéant, un vecteurs codant pour la protéine FKBP, et
d) le cas échéant, de la rapamycine ou un rapalogue. Selon un autre aspect particulier, les kits ou trousses de réactifs comprenant de tels vecteurs ou acides nucléiques comportant simplement une séquence nucléique codant pour un domaine de rétention conditionnelle constitué d'un domaine FRB dont l'extrémité C-terminale est elle même constituée d'un motif de rétention dans le réticulum endoplasmique (sans la protéine recombinante d'intérêt) font également partie de la présente invention. Les domaines FRB et les signaux de rétention endoplasmiques étant ceux définis ci-avant avec les mêmes préférences.
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaissent dans la suite de la description avec figures et les exemples décrits ci-après.
Légendes des figures
Figure 1 : Formule du composé AP21967.
Figure 2 : Organisation topologique de la construction dénommée GB2 WT et des quatre constructions dénommées GB2-FRB*-KKXX (#1 à #4) dans lesquelles les différents domaines protéiques et les sites de fusion FRB*-KKXX dans la partie C- terminale sont indiqués.
Figure 3 : Schéma construction plasmides FLAG-ST-betal AR (aux positions 433 et 462, plasmides #l-#2 respectivement).
Figure 4 : Dosage ELIS A de l'épitope FLAG effectué sur des cultures cellulaires exprimant FLAG-GB1 ou FLAG-GB2 ou l'une des 4 cultures cellulaires exprimant les protéines FLAG-GB2-FRB*-KKXX #1 à 4), avec ou sans perméabilisation préalable.
Figure 5 : Dosage ELISA de l'épitope FLAG effectué sur chacune des 4 cultures cellulaires exprimant les protéines FLAG-GB2-FRB*-KKXX #1 à 4, en présence ou en l'absence du rapalogue AP21967
Figure 6 : Dosage ELISA, effectué avec un anticorps monoclonal anti-HA en présence et en l'absence le rapalogue AP21967 su une culture cellulaire exprimant la protéine FLAG-GB2-FRB * -KKXX #2.
Figure 7 : Dosage ELISA de l'épitope HA effectué sur culture de cellules présentant deux populations de récepteurs GABAB : une première constituée de dimères HA-ST-GB1 / Myc-GB2 (popl), et une seconde constituée de dimères HA-ST-GBl / FLAG-GB2-FRB*-KKXX (pop2), en présence ou en l'absence du rapalogue AP21967.
Figure 8 : Schéma montrant le signal de TR-FRET éventuel résultant du rapprochement de deux populations.
Figure 9 : Signal de FRET évalué par marquage avec un mélange de BG- LUMI4™et BG-D2 sur cellules, effectué après incubation avec le rapalogue et translocation des dimères HA-ST-GB 1 /FLAG-GB2-FRB * -KKXX à la surface cellulaire.
Figure 10 : Schéma montrant le signal de TR-FRET éventuel permettant de vérifier si le rapprochement des sous-unités GB1 observé découle de la formation de nouveaux tétramères ou de l'échange entre les sous-unités GB1 de deux populations 1 et 2.
Figure 11 : Mesure de l'expression de l'épitope HA par dosage ELISA, en présence ou pas de rapalogue AP21967 effectuée sur culture de cellules présentant deux populations de récepteurs GABAB.
Figure 12 : Signal de FRET (transfert d'énergie Lumi4™ - D2) mesuré au sein de d'une populationl résultant de la formation de tétramères de récepteurs GABAB, après adressage membranaire des d'une population 2.
Figure 13 : Signal de FRET observé correspondant au rapprochement de sous unités GB1 des deux populations.
Figure 14 : Dosage ELISA de l'épitope FLAG effectué sur des cultures cellulaires exprimant FLAG-GB2-FRB*-KKXX (contrôle) ou l'une des 2 cultures cellulaires exprimant les protéines FLAG-ST-betalAR-FRB*-KKXX #1 à 2), en présence ou en l'absence du rapalogue AP21967.
EXAMPLES : Etude de Poligomérisation de récepteurs membranaires
Les exemples suivants sont relatifs à l'étude de la formation et de la dissociation d'oligomères de récepteurs membranaires couplés aux protéines G. Ces exemples mettent en œuvre les produits et méthodes selon l'invention, pour induire l'adressage membranaire de récepteurs, et leur marquage par différents composés fluorescents donneurs ou accepteurs partenaires de FRET (transfert d'énergie par résonance Fôrster). Une première population de récepteurs (popl) a été marquée avec des fluorophores TR-FRET compatibles (donneur et accepteur rouge) et l'évolution du signal de TR-FRET de cette population a été enregistrée avant et après le déclenchement de l'adressage membranaire d'une deuxième population (pop2) de récepteurs, marquée par un accepteur vert compatible avec le donneur ayant servi à marquer la première population. Le signal de TR-FRET éventuel résultant du rapprochement des deux populations a également été enregistré.
Cette méthode a été utilisée pour étudier la dynamique et la stœchiométrie des complexes GABAB, qui sont des hétérodimères obligatoires formés des sous-unités GB1 et GB2. Les résultats obtenus suggèrent que le récepteur GABAB forme des tétramères stables, mais que des hétérodimères GB1- GB2 existe également à la surface de la cellule dans une moindre proportion. Ces résultats permettent également d'exclure la formation d'oligomères constitués de plus de 4 sous-unités. Le récepteur béta adrénergique betal AR, que certains auteurs ont décrit comme formant des oligomères transitoires, a été étudié avec la même approche.
Les abréviations suivantes sont utilisées :
FLAG : épitope Flag
HA : épitope HA
RE : réticulum endoplasmique
ST : enzyme SNAP-tag, forme une liaison covalente avec son substrat Benzylguanine (BG).
GB1 : sous unité GB1 du récepteur GABAB
GB2 : sous unité GB2 du récepteur GABAB
betal AR : récepteur beta 1 adrénergique
tampon Tris-KREBS : 20 mM Tris pH 7,4, 118 mM NaCl, 5,6 mM de glucose, 1,2 mM KH2P04, 1,2 mM de MgS04, 4,7 mM de KC1, 1,8 mM CaCl2
BG-Lumi4™ : substrat de l'enzyme SNAP-tag, conjugué avec un cryptate de Terbium - commercialisé par Cisbio Bioassays sous la dénomination commerciale Tag-Lite® SNAP-Lumi4Tb
BG-d2 : substrat de l'enzyme SNAP-tag, conjugué avec un dérivé de cyanine d2 - commercialisé par Cisbio Bioassays sous la dénomination commerciale Tag-Lite® SNAP-rouge BG-fluorescéine : substrat de l'enzyme SNAP-tag, conjugué avec un dérivé de la fluorescéine - commercialisé par Cisbio Bioassays sous la dénomination commerciale Tag-Lite® SNAP-green
VFT : Venus Flytrap, domaine extracellulaire GABAB
HD : domaine heptahélicoïdal
CC : hélice superenroulée (CC pour « coiled-coil »)
Exemple 1 : Préparation des plasmides
Les plasmides codant pour les protéines de fusion suivantes ont été préparés :
Plasmide 1 #1 : FLAG-GB2-FRB*-KKXX (SEQ ID NO. 3).
Plasmide 1 #2: FLAG-GB2-FRB * -KKXX (SEQ ID NO. 4).
Plasmide 1 #3: FLAG-GB2-FRB * -KKXX (SEQ ID NO. 5).
Plasmide 1 #4 FLAG-GB2-FRB * -KKXX (SEQ ID NO. 6).
Plasmide 2: FLAG-CT-GB2-FRB*-KKXX (SEQ ID NO. 7).
Plasmide 3 #1 : FLAG-ST-betalAR-FRB*-KKXX (SEQ ID NO. 8).
Plasmide 3 #2 : FLAG-ST-betal AR-FRB*-KKXX (SEQ ID NO. 9).
Les plasmides codant pour les protéines de fusion décrites ci-dessus comportent le peptide signal du récepteur métabotropique du glutamate mGlu5.
Les plasmides codant pour les sous-unités GABABia et GABAB2 portant une étiquette HA, FLAG ou c-Myc à leur extrémité N-terminale ont été décrits précédemment (Rniazeff et al, 2004, Nat. Str. Mol. Biol. 11, 706-713). Le sous- clonage de la séquence Snap-tag (obtenu à partir du plasmide de pSST26m, Covalys, Genève, Suisse) dans ces plasmides au niveau d'un site de restriction MluI unique situé dans le bras de liaison en aval des étiquettes HA ou FLAG a également été décrit précédemment (Maurel et al, 2008, Nat. Methods. 5(6), 561-567). Un site de restriction MluI a été ajouté en utilisant la stratégie
QuikChange® (Stratagene) en amont de l'ADNc codant pour la betalAR et le fragment MluI-HindIII a été sous-cloné dans un plasmide pRK5 comportant la séquence codant pour l'étiquette FLAG et l'enzyme SNAP-tag.
Un site Notl a ensuite été inséré à l'extrémité C-terminale de la séquence codant pour FLAG-GB2, le FLAG-CT-GB2 (aux positions 834, 878, 905 et 940, plasmides #l-#4 respectivement, voir Figure 2) et le FLAG-ST-betalAR (aux positions 433 et 462, plasmides #l-#2 respectivement voir Figure 3) en utilisant la stratégie QuikChange (Stratagene). La séquence codant pour FRB*-KKXX (kit ARGENT™ Regulated Heterodimerization Kit), suivie d'un codon stop a ensuite été sous clonée entre Notl et HindIII (voir Figures 2 et 3).
EXEMPLE 2 : Cultures cellulaires
Des cellules HEK-293 ont été cultivées en milieu Dulbecco Eagle modifié (DMEM, GIBCO/BRL/Life Technologies) supplémenté avec 10% de FBS sérum de veau fétal) et transfectées par lipofection de manière transitoire avec les plasmides de l'exemple 1 avec de la Lipofectamine 2000 selon les instructions du fabricant (Invitrogen) (par exemple : 50 ng de HA-ST-GBla avec 50 ng de Flag- GB2-FRB * -KKXX par point (d'une plaque 96 puits) ou 50 ng de Flag-ST-betal AR- FRB*-KKXX par point (d'une plaque 96 puits)). Ces cellules ont ensuite été ensemencées dans une plaque 96 puits (plaque noire avec fond noir, Greiner, CellStar) à 100.000 cellules par puits. Le milieu de culture, le FCS, et autres produits utilisés pour la culture cellulaire (Les acides aminés non essentiels et les antibiotiques pénicilline/streptomycine) ont été achetées chez Gibco / BRL / Life Technologies (Cergy Pontoise, France).
Cette méthode a été utilisée pour préparer des cultures contenant chacune un des plasmides de l'exemple 1.
EXEMPLE 3 : Rétention conditionnelle de GB2 à l'aide du domaine FRB* et du motif KKXX
Un dosage ELISA de l'épitope FLAG a été effectué sur des cultures cellulaires de l'exemple 2 (cultures cellulaires exprimant FLAG-GB1 ou FLAG- GB2 ou l'une des 4 cultures cellulaires exprimant les protéines FLAG-GB2-FRB*- KKXX #1 à 4), avec ou sans perméabilisation préalable.
Les dosages ELISA sur cellules intactes ont été réalisés comme décrit précédemment (Maurel et al, 2008, Nat. Methods. 5(6), 561-567). Les cellules ont été fixées avec du paraformaldéhyde 4% puis bloquées par ajout de tampon phosphate salin + 1% de sérum de veau fœtal pendant 30 min. Un anticorps monoclonal anti-Flag-M2 (Sigma-Aldrich, Saint-Louis, MO, USA), conjugué à la peroxydase de raifort, a ensuite été appliqué pendant 30 min à 0,5 mg / 1 et les cellules ont été lavées. Les anticorps liés ont été détectés par chimio luminescence en utilisant des substrats SuperSignal (Pierce, Rockford, IL, USA) et un compteur Victor2 Wallac (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA).
Les résultats de ce dosage sont présentés sur la Figure 4, qui montre un signal très faible sur cellules non-perméabilisées, et un signal important sur cellules perméabilisées. Cela confirme que les protéines de fusion comportant le motif de rétention conditionnelle sont bien retenues dans la cellule.
Un autre dosage ELISA de l'épitope FLAG a été effectué sur ces cultures cellulaires, en présence ou en l'absence du rapalogue AP21967 (préincubation 3H00, 1 μΜ). Les résultats de ce dosage (Figure 5) montrent que les quatre protéines de fusion comportant le domaine de rétention conditionnelle sont correctement adressées à la surface des cellules en présence du rapalogue AP21967.
Enfin, un dosage ELISA de l'épitope HA a également été effectué sur des cultures cellulaires obtenues par cotransfection de plasmides comportant les séquences codant pour les protéines de fusion HA-GB1 et FLAG-GB2-FRB*- KKXX. Le monomère GB1 est naturellement retenu dans le réticulum endoplasmique et n'est transloqué vers la membrane cellulaire que lorsqu'il est associé au monomère GB2, pour former l'hétérodimère GB1-GB2 (récepteur GABAB). Ce dosage ELISA, effectué dans les mêmes conditions que celui de l'épitope FLAG, mais cette fois avec un anticorps monoclonal anti-HA (clone 3F 10, Roche Bioscience, Bâle, Suisse), en présence et en l'absence le rapalogue AP21967 (précinubatiojn 3h00, ΙμΜ) montre (Figure 6) que l'hétérodimère GB1-GB2 est retenu dans le RE, et qu'en présence de rapalogue il est transloqué vers la membrane plasmique.
EXEMPLE 4 : Etude des récepteurs GABAR et de leur association dans la membrane plasmique sous forme de tétramères - Rétention dans le RE et libération en présence de rapalogue
Des cellules comportant les 3 protéines d'expression FLAG-GB2-FRB*-
KKXX, HA-ST-GBl et Myc-GB2 ont été préparées selon la technique décrite dans l'exemple 2, en transfectant des plasmides de l'exemple 1 (50 ng de HA-ST-GBl + 50 ng de Flag-GB2-FRB*-KKXX + 4,5 ng de Myc-GB2 par point d'une plaque 96 puits). Ces cellules comprennent donc deux populations de récepteurs GABAB : une première constituée de dimères HA-ST-GBl / Myc-GB2 (popl), et une seconde constituée de dimères HA-ST-GBl / FLAG-GB2-FRB*-KKXX (pop2) Un dosage ELISA de l'épitope HA a été effectué sur ces cellules selon le protocole de l'exemple 4, en présence ou en l'absence du rapalogue AP21967 (préincubation 3h00, ΙμΜ). Les résultats de ce dosage (Figure 7) montrent que les dimères HA-ST-GB1/Myc-GB2 ne sont pas retenus dans les cellules et sont exprimés à leurs surfaces (cf Signal obtenu en l'absence de AP21967), alors que l'adressage membranaire des dimères HA-ST-GB1/FLAG-GB2-FRB*-KKXX est conditionné par l'étape de préincubation avec le rapalogue AP21967 (Figure 7). Les conditions de transfection permettent d'obtenir environ 50% de dimères HA-ST- GB1/Myc-GB2 et 50% de dimères HA-ST-GB1/FLAG-GB2-FRB*-KKXX après traitement avec le rapalogue.
EXEMPLE 5 : Etude des récepteurs GABAR et de leur association dans la membrane plasmique sous forme de tétramères - Etude de FRET
Dans cet exemple, une première population de récepteurs (popl) a été marquée avec un fluorophore donneur (BG-Lumi4™) ; après le déclenchement de l'adressage membranaire d'une deuxième population (pop2) de récepteurs, cette deuxième population a été marquée par un accepteur rouge (BG-d2) compatible avec le donneur ayant servi à marquer la première population. Le signal de TR- FRET éventuel résultant du rapprochement des deux populations a été enregistré. (Figure 8)
Marquage de la population 1 : Les cellules de l'exemple 5 ont été lavées dans du DMEM puis incubées avec un conjugué fluorescent donneur BG-LUMI4™ dilué dans du DMEM (concentration finale par puits : 0.3 μΜ) pendant 1 h à 37 ° C, dans une atmosphère à 5% de C02, afin de marquer les dimères HA-ST-GBl/Myc- GB2 (popl) (Maurel et al, 2008, Nat. Methods. 5(6), 561-567).
Après 4 lavages avec le tampon Tris-KREBS, le signal de FRET a été enregistré à 665 nm (longueur d'onde d'émission de l'accepteur d2) sur un lecteur de plaque RubyStar (BMG Labtechnologies), pour déterminer le signal de FRET non-spécifique.
Les cellules ont ensuite été incubées avec 50 μΐ de 2X-AP21967 à 2 μΜ en solution dans du DMEM (ou bien avec du DMEM pour le contrôle négatif) pendant 2 h pour provoquer l'adressage membranaire des dimères HA-ST- GB 1 /FLAG-GB2-FRB * -KKXX (pop2).
Marquage de la population 2 : Ensuite, 50μ1 de conjugué fluorescent accepteur 2X BG-d2 (concentration finale par puits : 1,2 μΜ) ont été ajoutés pour marquer ces demies dimères, et les cellules incubées pendant lhOO. Après 4 lavages avec le tampon Tris-Krebs, le signal de FRET à 665 nm a été enregistrés sur un lecteur de plaque RubyStar (BMG Labtechnologies) après excitation à 320 nm. Calcul du signal de FRET : Le signal de FRET a été calculé comme la différence entre le FRET mesuré et le FRET non- spécifique, dus à des collisions aléatoires et la contamination faibles du donneur à la longueur d'onde démission de l'accepteur. En fait, l'intensité de FRET = (signal à 665 nm mesuré sur les cellules co-marqués avec le donneur et l'accepteur) - (signal enregistré sur les mêmes cellules marquées avec le donneur, en l'absence de l'accepteur).
Par ailleurs, pour tenir compte de internalisation du récepteur, du recyclage et de la néo-synthèse lors de l'incubation de trois heures, des cellules ont été traitées en parallèle et de la même façon avec un milieu de culture (DMEM) au lieu du rapalogue, et le signal mesuré a été soustrait à celui mesuré sur les cellules traitées avec AP21967.
FRETmax : Le signal FRETmax correspondant à toutes les interactions possibles sur la population totale des récepteurs (popl et pop2) a été évalué en parallèle par une étape unique de marquage avec un mélange de BG-LUMI4™et BG-D2 (concentrations finales 0,1 μΜ et 0,6 μΜ respectivement) sur les mêmes cellules, effectué après incubation avec le rapalogue et translocation des dimères HA-ST-GB1/FLAG-GB2-FRB*-KKXX à la surface cellulaire Les conditions expérimentales assurent des quantités équivalentes de dimères des populations 1 et 2 (mesure de l'expression de l'épitope HA par dosage ELISA, en présence ou pas de rapalogue AP21967, Figure 7).
Les résultats de cette expérience sont présentés sur la Figure 9 : un signal de FRET faible mais significatif entre les deux populations de dimères est observé (environ 15% du FRETmax), ce qui indique qu'une partie des sous-unités GBl de la population 1 s'est assemblée, d'une manière ou d'une autre, avec les sous-unités GBl de la population 2, nouvellement adressée à la surface cellulaire. Ce signal de FRET entre les sous-unités GBl peut correspondre soit au rapprochement de dimères de la population 1 avec des dimères de la population 2 (par exemple formation de tétramères), soit résulter de l'échange de sous-unités GBl au sein des populations de dimères 1 et 2.
EXEMPLE 6 : Etude des récepteurs GABAR et de leur association dans la membrane plasmique sous forme de tétramères - Etude de FRET
Pour vérifier si le rapprochement des sous-unités GBl observé dans l'exemple 5 découle de la formation de nouveaux tétramères ou de l'échange entre les sous-unités GBl des populations 1 et 2, la population 1 a été marquée par un couple de partenaires de FRET (donneur BG-LUMI4™et accepteur BG-D2, se liant aux sous-unités GBl) pour obtenir un signal correspondant aux tétramères de la population 1 (HA-ST-GB1/Myc-GB2), mesuré à la longueur d'onde d'émission de D2 (665 nm). Après adressage de la population 2 à la membrane, un conjugué BG- fluorescéine a été ajouté au milieu et les signaux de FRET ont été mesurés aux longueurs d'onde de la fluorescéine et du D2 en FRET (Figure 10). Marquage de la population 1 : Les sous-unités GBl ont été marquées selon le protocole de l'exemple 6, en utilisant les conjugués BG-LUMI4™ (concentration finale : 0,1 μΜ) et BG-D2 (concentration finale : 0,6 μΜ), puis les cellules incubées en présence d'AP21967 pour induire l'adressage des dimères de la population 2.
Marquage de la population 2 : Les sous-unités GBl de la population 2 ont été marquées selon le protocole de l'exemple 6, mais cette fois en utilisant le conjugué BG-fluorescéine (concentration finale : 0,12 μΜ). Après incubation et lavage, les signaux de FRET à 665 nm (longueur d'onde démission du fluorophore accepteur D2) et 520 nm (longueur d'onde d'émission de la fluorescéine) ont été enregistrés sur un lecteur de plaque RubyStar (BMG Labtechnologies) et un lecteur Infinité 500 (Tecan), respectivement.
FRETmax : ce signal é été obtenu de la même manière que dans l'exemple 6, mais cette fois avec les conjugués BG-fluorescéine (concentration finale : 0,06 μΜ) et BG-Lumi4™ (concentration finale : 0,1 μΜ). Les conditions expérimentales assurent des quantités équivalentes de dimères des populations 1 et 2 (mesure de l'expression de l'épitope HA par dosage ELISA, en présence ou pas de rapalogue AP21967, Figure 11).
Les résultats de cette expérience sont présentés sur les Figures 12 et 13 : le signal de FRET au sein de la population 1 (transfert d'énergie Lumi4™ - D2), résultant de la formation de tétramères de récepteurs GABAB, n'est pas affecté par l'adressage membranaire des dimères de la population 2, ce qui confirme qu'une fois formés, les tétramères GABAB sont stables. La Figure 13 montre qu'un signal de FRET correspondant au rapprochement de sous unités GB1 des deux populations est observé (transfert d'énergie Lumi4™-fluorescéine), confirmant les données obtenues dans l'exemple 5. EXEMPLE 7 : Rétention conditionnelle du récepteur béta 1 adrénergique à l'aide du domaine FRB* et du motif KKXX
L'exemple 3 a été reproduit avec les plasmides suivants :
- FLAG-GB2-FRB * -KKXX (contrôle)
- FLAG-ST-betalAR-FRB*-KKXX (2 plasmides différents ont été préparés, 50 ng pour chaque plasmide testé, voir Figure 3).
Un dosage ELISA de l'épitope FLAG a été effectué sur des cultures cellulaires de l'exemple 2 (cultures cellulaires exprimant FLAG-GB2-FRB*-KKXX (contrôle) ou l'une des 2 cultures cellulaires exprimant les protéines FLAG-ST- betalAR-FRB*-KKXX #1 à 2), en présence ou en l'absence du rapalogue AP21967 (préincubation 3h00, 1 μΜ), comme dans l'exemple 2. Les résultats de ce dosage (Figure 14) montrent que les deux protéines de fusion comportant le domaine de rétention conditionnelle sont correctement adressées à la surface des cellules en présence du rapalogue AP21967.

Claims

REVENDICATIONS
1. Acide nucléique codant pour une protéine de fusion comprenant :
a) une protéine recombinante d'intérêt, et
b) à l'extrémité C-terminale de ladite protéine recombinante d'intérêt, un domaine de rétention conditionnelle constitué d'une protéine comprenant un domaine FRB dont l'extrémité C-terminale est elle-même constituée d'un motif de rétention dans le réticulum endoplasmique.
2. Acide nucléique selon la revendication 1, caractérisé en ce que le domaine FRB est choisi parmi les domaines suivants :
a) - le domaine FRB de la protéine FRAP humaine de séquence SEQ ID NO. 24, ou l'un de se fragments capable de se fixer à la protéine FKBP;
- le domaine FRB de la protéine RAPT1 murine de séquence SEQ ID NO. 29,
- le domaine FRB de la protéine Torl de levure de séquence SEQ ID NO. 26 ; ou
- le domaine FRB de la protéine Tor 2 de levure de séquence SEQ ID NO. 28, b) un domaine FRB dont la séquence présente au moins 80 % d'identité avec l'une des séquence de domaine FRB tel que défini en a) et capable de se fixer à la protéine FKBP, ou encore
c) un fragment de domaine tel que défini en a) ou b), ledit fragment étant capable de se fixer à la protéine FKBP.
3. Acide nucléique selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que le domaine FRB est choisi parmi les domaines suivants :
a) - le fragment de la protéine FRAP humaine compris entre les acides aminés 2025 et 2113 de la séquence SEQ ID NO. 24 ;
- le fragment de la protéine FRAP humaine compris entre les acides aminés 2021 et 2113 de la séquence SEQ ID NO. 24 ;
- le fragment de la protéine Torl de levure compris entre les acides aminés 1962 et 2050 de séquence SEQ ID NO. 26 ; ou
- le fragment de la protéine Tor2 de levure compris entre les acides aminés 1965 et 2053 de séquence SEQ ID NO. 28,
b) un domaine FRB dont la séquence présente au moins 80 % d'identité avec l'une des séquence de domaine FRB tel que défini en a) et capable de se fixer à la protéine FKBP, ou encore c) un fragment de domaine tel que défini en a) ou b), ledit fragment étant capable de se fixer à la protéine FKBP.
4. Acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le domaine FRB est choisi parmi les fragments de la protéine FRAP humaine de séquence SEQ ID NO. 24 compris entre les acides aminés 2021 et 2113 et comportant en outre une des mutations suivantes : Y2038H, Y2038L, Y2038V, Y2038A, F2039H, F2039L, F2039A, F2039V, D2102A, T2098A, T2098N, T2098L, T2098S, E2032A et E21032S.
5. Acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que le domaine FRB est le domaine de séquence SEQ ID 2.
6. Acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que le motif de rétention dans le réticulum endoplasmique est choisi parmi les motifs de séquence SEQ ID NOs. 10 à 14.
7. Acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que le motif de rétention dans le réticulum endoplasmique est choisi parmi les motifs de séquence SEQ ID NOs. 15 à 22.
8. Acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que la dite protéine de fusion comprend entre le domaine FRB et le motif de rétention, un fragment peptidique dont le nombre de résidus d'acide aminé est compris entre 1 et 20 acides aminés, de préférence entre 1 et 10 acides aminés.
9. Acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que ladite protéine recombinante d'intérêt est choisie parmi une protéine intracellulaire, une protéine membranaire ou transmembranaire, ou une protéine so lubie.
10. Acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que le ladite protéine recombinante d'intérêt est une protéine membranaire ou transmembranaire .
11. Acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que ladite protéine recombinante d'intérêt est choisie parmi les récepteurs couplés aux protéines G de classe C ou de classe A, les récepteurs canaux ou les récepteurs à activité enzymatique intrinsèque ou associée.
12. Acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 11, caractérisé en ce que ladite protéine de fusion comporte en outre un domaine d'une enzyme suicide situé en amont de la protéine recombinante d'intérêt.
13. Acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 12, caractérisé en ce ladite enzyme suicide est choisie parmi : l'06-alkylguanine DNA alkyltransférase ou un de ses mutants, telles que les enzymes SNAP-tag ou CLIP-tag; une déhalogénase ou un de ses mutants, telle que l'enzyme Halotag ; la protéine ACP ou l'un de ses mutants, telle que la protéine ACP-tag.
14. Acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 13, caractérisé en ce que ladite protéine de fusion comporte en outre à son extrémité N-terminale un motif d'adressage membranaire, tel que celui du peptide signal T8 ou du peptide signal du récepteur mGluR5.
15. Protéine de fusion codée par un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 14.
16. Acide nucléique codant pour une protéine de fusion selon la revendication 15, ou son acide nucléique complémentaire.
17. Vecteur pour l'expression d'une protéine recombinante d'intérêt dans une cellule hôte ou construction nucléique comprenant un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 14 et 16.
18. Cellule eucaryote, de préférence cellule animale, de préférence encore de mammifère, transformée par un vecteur ou une construction nucléique selon la revendication 17.
19. Méthode in vitro de rétention conditionnelle d'une protéine recombinant d'intérêt dans le réticulum endoplasmique d'une cellule eucaryote en suspension dans un milieu, cette méthode comprenant les étapes suivantes : a) la transfection dans ladite cellule d'un vecteur d'expression selon la revendication
17,
b) l'ajout dans ledit milieu de rapamycine ou d'un rapalogue,
c) l'incubation de la cellule, cette incubation provoquant la libération de la protéine recombinante d'intérêt du réticulum endoplasmique de la cellule.
20. Méthode selon la revendication 18, caractérisée en ce que le domaine FRB codé par ledit vecteur d'expression comprend ou est constitué du domaine FRB de séquence SEQ ID NO.2 et en ce que le rapalogue est le composé AP21967 de formule (I) suivante :
Figure imgf000035_0001
ÂP2ÎM?
(I)
21. Trousse de réactifs caractérisée en ce qu'elle comprend :
a) un vecteur ou une construction nucléique selon la revendication 16 ou une cellule transformée selon la revendication 17,
b) le cas échéant, un vecteurs codant pour la protéine FKBP ; et
c) le cas échéant, de la rapamycine ou un rapalogue.
22. Trousse de réactifs selon la revendication 21, caractérisée en ce qu'elle comprend :
a) un vecteur ou une construction nucléique selon la revendication 16 codant pour une protéine de fusion comprenant une enzyme suicide, de préférence une 06- alkylguanine DNA alkyltransférase ou un de ses mutants, telles que les enzymes SNAP-tag ou CLIP-tag,
b) un ou plusieurs marqueurs, de préférence choisi parmi les fluorophores ou les cryptâtes d'Europium,
c) le cas échéant, un vecteurs codant pour la protéine FKBP, et
d) le cas échéant, de la rapamycine ou un rapalogue.
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