MX2014000872A - Modulacion de quimiocina selectiva de tumor. - Google Patents

Abstract

Se describen terapias eficaces para el tratamiento y prevención de cáncer y otras enfermedades. Estos métodos incluyen la administración de cantidades terapéuticamente eficaces de agentes que incrementan la producción local de quimiocinas que atraen células efectoras dentro de las lesiones de tumor, con supresión concomitante de producción local de quimiocinas indeseables que atraen linfocitos T reguladores (Treg). Estos métodos incluyen administrar al sujeto cantidades terapéuticamente eficaces de un agonista de receptor similar a peaje (TLR) u otro activador de la vía NF-KB en combinación con un bloqueador de síntesis de prostaglandina o un bloqueador de señalización de prostaglandina, en combinación con un interferón tipo-l, o en combinación tanto con un bloqueador de síntesis de prostaglandina como señalización y con un interferón tipo-1. De manera alternativa, se describen métodos derivados de los mismos paradigmas pero que tienen como objetivo tratar o evitar enfermedad autoinmune, enfermedad inflamatoria crónica, rechazo de transplantes o GvR, que incluyen la combinación de un agonista de receptor similar a peaje (TLR) en combinación con una prostaglandina u otro activador de AMPc.

Description

MODULACION DE QUIMIOCINA SELECTIVA DE TUMOR CAMPO DE LA INVENCION Esta invención se relaciona con el campo de terapias contra tumores que incluye los métodos para el tratamiento de cáncer, prevención de presentación de cáncer o prevención de recurrencia de cáncer. Además, los métodos descritos se pueden utilizar en el tratamiento de enfermedades infecciosas, enfermedades autoinmunes, alergias e inflamación así como para tratar o evitar rechazos de transplantes y trastornos asociados con transplantes.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION Cada año, únicamente en los Estados Unidos, números incontables de personas desarrollan lesiones precancerosas , una forma de neoplasia, como se describe más adelante. Estas lesiones presentan una tendencia notable a desarrollarse en tumores malignos, o cáncer. Estas lesiones incluyen lesiones en las mamas (que pueden desarrollarse en cáncer de mama) , lesiones de la piel (que se pueden desarrollar en melanoma maligno o carcinoma de células básales) , pólipos adenomatosos en el colon (que se pueden desarrollar en cáncer de colon) , lesiones premalignas del epitelio cervical (que se pueden desarrollar en cáncer cervical) y otros de estos neoplasmas. Los compuestos que evitan o inducen la remisión de las lesiones precancerosas o cancerosas o los carcinomas Ref. 246286 existentes o para evitar o retrasar su presentación después del tratamiento por cirugía, quimioterapia, radioterapia y tratamientos biológicos reduciría en gran medida la enfermedad y muerte por cáncer.

Por ejemplo, aproximadamente 60,000 personas mueren de cáncer de colon y más de 150,000 casos nuevos de cáncer de colon se diagnostican cada año. Para la población norteamericana en su totalidad, los individuos presentan seis por ciento de riesgo durante el tiempo de vida de desarrollar cáncer de colon, lo que la vuelve la segunda forma más prevalente de cáncer en los Estados Unidos. El cáncer de colon también es prevalente en europa occidental. Se considera que el consumo aumentado de grasa en la dieta es lo que incrementa el riesgo de cáncer de colon en Japón.

Hasta ahora se han realizado pocos avances en la prevención y tratamiento de cáncer avanzado, que incluyen cáncer colorrectal, cáncer ovárico, cáncer de próstata, cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer de vías respiratorias y digestivas altas, cáncer cervical, cáncer de cerebro, cáncer pancreático, cáncer renal, cánceres malignos hematológicos y melanoma, como se refleja por la carencia de un cambio o un cambio solo moderado en la tasa de supervivencia a cinco años durante las últimas décadas. La única cura para este cáncer es la cirugía en una etapa extremadamente temprana. Desafortunadamente, la mayor parte de estos cánceres se descubre demasiado tarde para su cura quirúrgica. En muchos casos el paciente no experimenta síntomas hasta que el cáncer ha progresado a una etapa maligna .

La capacidad de los linfocitos T CD8+ para infiltrarse en lesiones cancerosas es esencial para inmunidad antitumoral, como se vuelve evidente por las investigaciones que resaltan el valor pronóstico de los linfocitos T efectores (Teff) en múltiples tipos de cáncer, que incluyen cáncer colorrectal (CRC, por sus siglas en inglés) , cáncer de ovario y melanoma. En contraste, la infiltración de diferentes tipos de cánceres con linfocitos T reguladores (Tregs) predice resultados pobres. Las quimiocinas y sus respectivos receptores son críticos para el desplazamiento y ecotaxia de linfocitos T.

Los datos de varios grupos han demostrado que diferentes grupos de quimiocinas (CK) atraen de manera preferencial ya sea células inmunitarias proinflamatorias : linfocitos T efectores (eff) (células CTL, Thl) y células NK, deseables en cáncer e infecciones crónicas o linfocitos T reguladores (reg) que se consideran pe judiciales en cáncer e infecciones crónicas. Las células inmunes proinflamatorias que expresan niveles altos de CXCR3 y CCR5 (receptores de quimiocina para, respectivamente, CXCR9, CXCR10, CXCR11 y para CCL3 , CCL4 y CCL5 y CCL5 ) , mientras que los Tregs expresan altos niveles de CCR4 y CXCR4. Los T reguladores expresan de manera preferencial CCR4 (receptor para CCL17 y CCL22) , CXCR4 (receptor para CXCL12) y CCR6 (receptor para CCL20) .

Los niveles altos de CCL5/RATES (ligando CCR5) y CXCL9/MIG y CXCL10/IP10 (ligandos para CXCR3) en tejidos de tumor se asocian con infiltración aumentada de linfocitos T CD8+ en CRC, melanoma y cáncer gástrico, en contraste con los beneficios de la expresión intratumoral de CCL5 y CXCL9 a 11, niveles altos de CCL22/MDC, el ligando de CCR4 que atrae de manera preferencial Treg, se puede asociar con una supervivencia reducida, como se muestra en pacientes con cáncer de ovario. El progreso de cáncer se sabe que se asocia con la escasez de CTL funcionales y acumulación de células supresoras derivadas de mieloide (MDSC) y linfocitos T reguladores (Treg) en un mecanismo que depende de CXCL12 y CCL22. Estas consideraciones sugieren que las inmunoterapias eficaces contra el cáncer necesitan involucrar la vacunación o transferencia adoptiva de CTL inducidos in vivo para restaurar vigilancia inmunitaria local. Previamente se ha demostrado que las MDSC son la fuente clave de PGE2 y otros factores supresores en OvCa y que la capacidad mediada por EP2 y EP4 de PGE2 para incrementar la expresión de COX2 genera retroalimentación positiva entre PGE2 y COX2 , el regulador clave de la síntesis de PGE2, esto es lo que se requiere para el mantenimiento de funciones supresoras de las MDSC en el ambiente OvCa. Además, recientemente hemos reportado que la producción de SDF1/CXCL12 inducida por PGE2 y la expresión de CXCR4 puede contribuir a la acumulación y retención local de las MDSC en ascitis de OvCa. De igual manera, números altos de linfocitos Treg, otro tipo de células inmunitarias supresoras y relaciones bajas de CTL/Treg también se ha demostrado que son factores de pronóstico negativo para pacientes con cáncer. El papel clave de CCL22 para atraer Treg que expresan CCR4 a OvCa, el valor pronóstico negativo de CCL22 y nuestras observaciones de que PGE2 constituye un factor inductor clave de CCL22 sugieren que la limitación de la producción de PGE2 en un ambiente de cáncer puede tener valor terapéutico para reducir la entrada de Treg. PGE2 que actúa vía receptores EP2 y EP4 también puede promover el desarrollo de 1os Treg. Ademas, nosotros y otros investigadores hemos demostrado que PGE2 puede deteriorar la interacción de los DC con células previamente no expuestas, de memoria y efectoras mientras que promueve su interacción con los Treg. PGE2 también está involucrado en mediar la actividad supresora de los Treg.

El nivel de infiltración de linfocitos T de melanomas humanos, se sabe que es un factor de pronóstico independientemente de supervivencia a melanoma, que muestra la correlación más fuerte con la expresión de los ligandos de CXCR3; CXCL9 y (producido en menores cantidades) CXCL10. La producción de CXCL9 en macrófagos que se infiltran en tumores es particularmente eficaz en lesiones de melanoma primarias, en vez de en tejidos metastásicos, lo que incrementa la posibilidad de que los tumores primarios y metastásicos puedan modular de manera diferenciada la producción de CK en los APC que se infiltran. En concordancia con los datos que muestran que CXCR3 que se expresa en linfocitos T se correlaciona con supervivencia a largo plazo, estos datos sugieren que los ligandos de CXCR3 constituyen CK importantes que permiten la entrada de linfocitos T en los melanomas, lo que vuelve la inducción de CXCR3 sobre linfocitos T inducidos por vacunación, la inducción de ligandos CXCR3 sobre lesiones de tumores no infiltrados objetivos interesantes de inmunoterapia contra el cáncer.

De manera similar a las investigaciones clínicas los estudios en ratón también han demostrado que la mayor parte de la actividad antitumoral se asocia con linfocitos T que expresan L-selectinaba:|0 y varios grupos recientemente han demostrado el importante papel de las quimiocinas asociadas a tumor en el rechazo de tumores. Las actividades antitumorales de transfección adenoviral o la inyección directa con quimiocinas se ha demostrado en el caso de CCL3 (????a, ligando para CCR1 y CCR5) , CCL7 (MCP3; ligando para CCL1, CCL2 , CCL3 ) , CCL16 (LEC; ligando para CCR1), CCL19 (???3ß), ligando para CCR7) y CXCL11 (ITAC; ligando para CXCR3) en modelos de ratón para adenocarcinoma, mastocitoma P815, modelos en ratón distintos de cáncer de mama y linfoma. Se ha demostrado que los DC transducidos por XCLI (linfotactina; ligando para XCR1) muestran eficacia terapéutica superior contra melanoma B16. En el modelo de mieloma SP2/0, también se ha demostrado que la transfección directa de células de mieloma con CXCL1 (linfotactina; ligando para CXCR1) induce rechazo de tumor mediado por linfocitos T CD4+ y CD8+ positivos a CXCR1. Keshaw y colaboradores demostraron expresión frecuente de CXCL1 (Gro-a) por melanomas e intentaron mejorar la eficacia de inmunoterapia contra el cáncer por transfección de receptor para esta quimiocina (CXCR2) en linfocitos T.

Aunque la atracción de diferentes subconjuntos de linfocitos T a diferentes tipos de tumores se sabe que está regulado por una compleja red de quimiocinas múltiples, nuestros datos funcionales actuales (véase la Descripción Detallada de la Invención y las Figuras) indican que los regímenes que tienen como objetivo el mejoramiento de los ligandos CXCR3 asociados a tumor y los ligandos CCR5 de manera uniforme en todas las lesiones de tumor pueden promover la entrada de linfocitos T CD8+ efectores (tanto las TIL que surgen espontáneamente como inducidas por vacunas de cáncer; que incluyen la vacuna aDCl que se conoce que incrementa la expresión de CCR5 y CXCR3 sobre los CTL específicos de tumor, CTL) . El papel conocido de CXCR3 y CCR5 en la atracción de células Thl y células NK sugiere que estos regímenes también pueden ser capaces de promover la entrada de estos tipos adicionales de células deseables en los tumores .

Puesto que no solo las células efectoras específicas de tumor que surgen espontáneamente sino también las células efectoras específicas de tumor inducidas por diferentes vacunas contra el cáncer, que incluyen a-DCls u otro tipo de DC polarizadas tipo 1 (tales como las inducidas por la combinación de LPS e IFNy o por la combinación de TNFa e IFNy o TNFa e IL-?ß e INFy) expresan niveles altos de CCR5 o CXCR3 sobre linfocitos T específicos de tumor, la inducción de ligandos CCR5 y/o ligandos CXCR3 en te idos de tumor puede ser particularmente eficaz en combinación con la aplicación de estas vacunas .

Aunque las diferencias en las propiedades de ecotaxia de los diferentes subconjuntos de linfocitos T se han conocido por más de 15 años, una serie de investigaciones recientes demuestran el papel clave de la DC a este respecto. DC aislada de placas de Peyer o tratadas con retinoides muestran la capacidad para inducir propiedades de ecotaxia al intestino en linfocitos T previamente no expuestos. De modo similar, se ha demostrado recientemente que las APC migratorias son responsables de imprimir la capacidad de los linfocitos T para ecotaxia al sistema nervioso central. Fundamentando la noción de que la capacidad de desplazamiento de linfocitos T específicos de melanoma humanos puede ser afectada por factores relacionados con DC (suministro de la "señal 4"), se ha demostrado que la expresión mejorada de CLA funcional (receptor de ecotaxia cutáneo; ligando para ELAM expresado en endotelio cutáneo) y un desplazamiento mejorado de CTL efectoras a lesiones de melanomas metastásicos en la piel se puede inducir por el tratamiento de pacientes con IL-12 sistémico. En realidad, Ogg y colaboradores demostraron que una expresión alta de CLA en los CTL de pacientes con vitíligo presentan estas células las cuales entran eficientemente en la piel e inician la destrucción de melanocitos. Berger y colaboradores recientemente han reportado que la vacunación con DC derivados de monocito puede inducir a los linfocitos T específicos de melanoma para ecotaxia tanto a piel como a metástasis visceral.

No obstante, aún no se ha explorado la posibilidad de mejorar la eficacia de inmunoterapia contra el cáncer que involucre transferencia adoptiva de linfocitos T al modular el patrón de quimiocinas en los sitios de tumor para facilitar la entrada en tumor de los linfocitos T de tipo efector. De manera similar, hasta ahora, ningún estudio aún ha tomado en consideración la posibilidad de mejorar la eficacia de inmunotera ia contra el cáncer por medio de modulación del patrón de quimiocinas en los sitios de tumor para facilitar la entrada en el tumor de linfocitos T de tipo efector inducida por vacunas o que surjan espontáneamente en pacientes.

La hiperactivación de NF-??, una característica común de muchos tipos de tejidos cancerosos. La señalización por NF-??, activada comúnmente por ligandos de receptores similares a peaje (los TLR; que incluyen TLR3 , un receptor para ARN de hebra doble) ; y múltiples estímulos proinflamatorios adicionales, que incluyen TNFOÍ O IL1 , es un requerimiento importante para la inducción de quimiocinas atrayentes tanto de clases Treg como Teff. No obstante, hasta ahora no se ha sabido como utilizar el patrón de señalización de NF-?? y modularlo con el fin de mejorar de modo selectivo o por lo menos preferencial la producción de quimiocinas atrayentes de Teff en tejidos tumorales, en vez de en tejidos marginales con el fin de dirigir selectivamente las células Teff a los tumores.

Varios estudios previamente han demostrado la capacidad de los IFN y los ligandos de TLR para promover la producción de quimiocinas que reclutan Te , que incluyen ligandos CCR5 y CXCR3. Por otra parte PGE2, un factor sobreproducido por CRC y otros tumores y asociado con un pronóstico negativo, previamente se ha implicado en la supresión de las CK atrayentes de Teff y CK que promueven reclutamiento de Th2/Treg. No obstante, aún no se sabe si estos diferentes grupos de factores inflamatorios afectan el equilibrio de producción de las CK que atraen Teff o Treg en tejido canceroso primario y metastásico, si cualquiera de estos factores muestra alguna actividad sinergística y si es posible aplicar cualquiera de las combinaciones de los factores moduladores de CK para mejorar selectivamente la producción de CK que atraen Teff (sin incrementar la producción de CK que atraen Treg) y la manera de que se asegure la selectividad de estos efectos a tejidos tumorales (en vez de a tejidos sanos), para enfocar los tipos deseables de células inmunitarias sobre los sitios de enfermedad.

Tal posibilidad ha sido proporcionada por nuestros datos actuales que demuestran que los microambientes de tumor no solo hiperactivan espontáneamente NF- ?, sino que también responden a los tratamientos propuestos con niveles aumentados adicionalmente de activación de NF-??. Puesto que la activación de NF-??, involucrada de manera crítica y la supervivencia y crecimiento de tumores representa un rasgo intrínseco de muchos tipos de tumores, los datos actuales sugieren que la modulación dirigida a NF-?? descrita actualmente del microambiente de tumor puede ser aplicable a múltiples tipos de cáncer.

En contraste con el cáncer, en donde se considera que es benéfica una movilización preferencial de las células inmunitarias efectoras, en la inflamación crónica, enfermedades autoinmunes, rechazo de transplantes o enfermedad de rechazo inverso posterior a transplante de médula ósea se considera que las células inmunitarias efectoras son la causa de patología mientras que las células supresoras, tales como Treg y las MDSC son benéficas. En estos casos, la supresión selectiva de quimiocinas que atraen células efectoras y el mejoramiento de quimiocinas que atraen Treg Y MDSC es probable que resulte en el beneficio terapéutico .

SUMARIO DE LA INVENCION Las terapias eficaces para el tratamiento y prevención de cáncer y otras enfermedades se describen en la presente. Estos métodos incluyen la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de por lo menos dos agentes diferentes que actúan de modo sinergístico para modular diferencialmente la producción de IP-10 (CXCL10) y RANTES (CCL5) en tejidos de tumor (u otros tejidos alterados por enfermedad) versus (un efecto opuesto o sin cambio) en la producción de CCL22, la quimiocina que se sabe atrae linfocitos T reguladores indeseables.

Nuestros datos novedosos e inesperados demuestran que los patrones de la producción impulsada por NF-?? de clases de quimiocinas que atraen Treg versus Teff se pueden regular de modo diferencial por direccionamiento de los IFN y síntesis de prostaglandina . Ambos, prostaglandinas e IFN se sabe que regulan la producción de quimiocinas, pero su interrelación con los ligandos de TLR y otros activadores de las vías de NF-?? en la regulación recíproca de las clases que atraen Treg versus eff de quimiocinas no ha sido utilizada para propósitos terapéuticos. Puesto que varios estudios han indicado la susceptibilidad de múltiples tipos de tumores al sobreexpresar C0X2 y sobreproducir un producto de C0X2 , PGE2. Es probable que las estrategias propuestas incrementen selectivamente la producción de quimiocinas que atraen Teff en tejidos de tumor, en vez de en tejidos marginales, con el fin de dirigir selectivamente a las células Teff a tumores y aplicable a tipos múltiples de tumores y otras enfermedades asociadas con el desequilibrio en NF-??, tales como infecciones, inflamaciones crónicas, estados premalignos, fenómenos autoinmunes o rechazo de transplantes, que incluyen en rechazo de órganos transplantados, tejidos y células aisladas, que incluyen rechazos-transplantes y enfermedad de rechazo inverso (GvH, por sus siglas en inglés) .

En el caso de prevención o tratamiento de cáncer, algunos estados premalignos y muchas infecciones, nuestros datos sugieren un beneficio de una aplicación combinada de ligando de TLR u otros activadores de las vías de NF-?? con los inhibidores de prostanoides (y potencialmente con los inhibidores de receptores de prostaglandina y/o los inhibidores de la producción de otros agentes que elevan AMPc o los inhibidores de la señalización de AMPc) y con administración previa, concomitante o subsecuente de IFNa y/u otros interferones tipo I y tipo II) con el fin de mejorar selectivamente la producción de quimiocinas que atraen Teff mientras se suprime la producción de quimiocinas que atraen Por otra parte, en el caso de prevención o tratamiento de los estados asociados con hiperactivación indeseable del sistema inmunitario (inflamaciones crónicas, algunos estados premalignos, fenómenos autoinmunes o rechazo de transplantes que incluyen rechazo de órganos transplantados, tejidos y células aisladas que incluyen rechazo de transplante y enfermedad de rechazo inverso (GvH) ) , nuestros datos sugieren un beneficio de aplicación combinada de ligandos de TLR u otros activadores de las vías de NF-?? con prostanoides u otros agentes que elevan AMPc (y con inhibidores potenciales de la producción de la capacidad de respuesta de IFN) , con el fin de mejorar selectivamente la producción de quimiocinas que atraen Treg mientras se suprime la producción de quimiocinas que atraen Teff - En algunas modalidades, se proporcionan métodos para tratar o prevenir la incidencia o recurrencia de cáncer colorrectal, melanoma, cánceres cutáneos diferentes de melanoma, glioma, cáncer de ovario, cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer endometrial, cáncer cervical, cáncer gástrico, cáncer esofágico, cáncer pancreático, cáncer biliar, cáncer renal, cáncer de ve iga, cáncer vulvar, cáncer neuroendocrino, cáncer de próstata, cáncer de vías respiratorias y digestivas altas, sarcoma de tejido suave, cáncer óseo, mesotieloma, cáncer de origen endotelial, cáncer maligno hemorrágico que incluye pero que no se limita a mieloma múltiple, linfornas y leucemias, una lesión premaligna que se sabe está asociada con un riesgo aumentado de desarrollar cáncer u otras formas de cáncer en un sujeto. Estos métodos incluyen administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de por lo menos dos agentes diferentes tales como, pero sin limitarse a interferones , inhibidores de síntesis de prostanoides y agonistas de receptor similar a peaje (TLR) .

En algunas modalidades se proporcionan métodos para tratar cáncer o evitar la presentación o recurrencia de cáncer en un sujeto que incluye administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un inhibidor de prostaglandina (tal como un inhibidor de síntesis de prostaglandina o capacidad de respuesta de prostaglandina) u otro agente que suprime AMPc que incrementa la producción de IP-10/CXCL10 y que inhibe la producción de DC/CCL22 y una cantidad terapéuticamente eficaz de un agonista receptor similar a peaje (TLR) .

En otras modalidades, se proporcionan métodos para tratar cáncer o evitar presentación o recurrencia de cáncer en un sujeto al administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un interferón o un agente que incrementa la actividad de IP-10 y una cantidad terapéuticamente eficaz de un inhibidor de síntesis de prostaglandina con lo que se trata o evita cáncer colorrectal en el sujeto.

Puesto que no solo las células efectoras específicas de tumor que surgen espontáneamente sino también células efectoras específicas de tumor inducidas por diferentes vacunas contra el cáncer inducen a-dCls u otro tipo de DC polarizado tipo 1 (tal como el inducido por la combinación de LPS e INFNy o por la combinación de TNFa e IFNy) , expresan niveles altos de CCR5 o CXCR3 sobre linfocitos T específicos de tumor, la inducción selectiva de tumor de ligandos CCR5 y/o ligandos CXCR3 en tejidos de tumor puede ser particularmente eficaz en combinación con la aplicación de estas vacunas.

Lo anterior y otros rasgos y ventajas se volverán más evidentes a partir de la siguiente descripción detallada de varias modalidades, las cuales se llevan a cabo con referencia a las figuras anexas.

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS Figuras 1A-1E. Actividad superior de células dendríticas polarizadas tipo 1 (OÍDC) en inducir CTL funcional que expresa CXCR3 y CCR5. A-C: aDCl son inductores superiores de respuestas de linfocitos T CD8+ contra epítopos asociados a tumor múltiple, (fig. 1A) aDCl o sDC se cargan con epítopos de CTL asociados con tnelanoma presentados por HLA-A2 (MART-1, gp 100 y tirosinasa) y se utilizan para sensibilizar linfocitos T CD8+ autólogos a partir de un paciente con melanoma HLA-A2 + (etapa IV) en un sistema de sensibilización in vitro (IVS) . Después de una ronda adicional de estimulación con PBMC (para probar estabilidad de diferencias) , los linfocitos T CD8+ que responden a los péptidos individuales se detectaron por ELISPOT. (Fig. IB), CTL cebados por aDCl destruyen células de melanoma pareadas por HLA-A2. La capacidad de linfocitos T CD8+ sensibilizados de modo diferencial para destruir la línea de células de melanoma HLA-A2+ se prueba en el día 20, utilizando análisis de liberación de cromo (Fig. 1C) aDCl son inductores superiores de respuesta de linfocitos T CD8+ contra CEA (epítopo CAP-1) . IVS con sangre de un paciente de cáncer colorrectal . (Fig. ID) aDCl son inductores superiores de CXCR3 y CCR5 en linfocitos T CD8+ específicos de melanoma en el sistema IVS (descritos en el panel A) . La expresión del receptor de quimiocina sobre linfocitos T CD8+ MART-1 tetrámero+ se analizan por citometría de flujo. (Fig. 1E) Expresión diferencial de CCR5 y capacidad de respuesta de CCL5 sobre aDCl y linfocitos T CD8+ estándar cebados con DC en el sistema IVS utilizando el modelo impulsado por SEB de activación de linfocitos T.

Figuras 2A-2B. Expresión heterogénea de quimiocinas que atraen Teff o Treg en diferentes tumores. Se lisaron biopsias de tumor de cáncer de colon o pacientes con melanoma, se extrajo con ARN y se llevó a cabo análisis Taqman. (Fig. 2A) Expresión heterogénea de quimiocinas que atraen Treg y Teff en lesiones de piel, nodulo linfático y lesiones cutáneas de melanoma. (Fig. 2B) Expresión heterogénea de CXCL10/IP10 y CCL22 en diferentes lesiones de cáncer colorrectal.

Figuras 3A-3B. Presencia de marcadores Teff y Treg en tumores se correlaciona con la expresión intratumoral , respectivamente, de quimiocinas que atraen eff o Treg. Se lisaron biopsias de tumor de pacientes con cáncer de colon, se extrajo el ARN y se realizó el análisis Taqman de diversos marcadores. (Fig. 3A) Correlación entre los marcadores Teff (CD8 y Granzyme B; GZ B) y quimiocinas que atraen Teff (CCL5 y CXCL10) en lesiones de tumor. (Fig. 3B) Correlación entre marcadores Treg (FOXP3 y GITR) y la quimiocina CCL22 en lesiones de tumor.

Figuras 4A-4C. Presencia de marcadores Treg y etf en tumores se correlaciona con la expresión intratumoral de quimiocinas que atraen Teff y Treg. (Fig. 4A) Expresión de un ligando CXCR3 alternativo, CXCL9 que se correlaciona con la expresión local de CXCL10 y con marcadores Teff, CD8 y GZMB . (Fig. 4B) Correlación entre CCL22 y COX-2 (Fig. 4C) Ejemplo: carencia de correlación entre CCL22 y CXCL13.

Figuras 5A-5B. Interrelación entre indometacina inhibidor de COX, IFNOÍ y poli-I:C en la inducción de patrones deseables de expresión de quimiocina en cultivos de células aisladas. (Fig. 5A) Impacto dependiente de la dosis de INFa y poli-I:C en la producción de quimiocinas atrayentes de Teff y Treg por macrófagos generados in vitro (véanse materiales y métodos) y en fibroblastos (obtenidos de Cascade Biological) . Los datos de un experimento representativo de tres. (Fig. 5B) Efectos de indotemacina sobre quimiocinas atrayentes de Teff y Treg producidas por macrófagos (N=3) por análisis de ELISA. Las concentraciones de quimiocinas en cultivos de 48 h se analizaron por ELISA. Nótese la supresión de producción de CCL22 por indometacina.

Figuras 6A-6D. Patrón de respuesta heterogénea de diferentes tejidos de tumor a moduladores de quimiocina individuales y su respuesta uniforme a la combinación de INFa, poli-I:C e indometacina. (Fig. 6A) Muestras de tumor frescas de 11 pacientes con cáncer colorrectal metastásico que no fueron tratadas o fueron tratadas con IFNa y poli-I:C, ya sea individualmente o en combinación durante 48 horas. Se analizó por ELISA la liberación de CCL5 y CXCL10 al medio de cultivo. Los números indican la prevalencia de tumores con cada patrón de quimiocina (patrones respectivos A, B o C) . (Fig. 6B) Análisis por ELISA de CCL5, CCL22 y CXCL10 en tumores no tratados o tratados con INFa + pI:C, con o sin indometacina . (Fig. 6C) Respuesta heterogénea de diferentes lesiones de tumor a partir del mismo paciente (producción de CCL5 y CXCL10) a los componentes individuales de la combinación de modulación de quimiocina. (Fig. 6D) Indometacina y celecoxib incrementan la expresión de quimiocina atrayente de Tef£ inducida por IFNa/poli - I : C, pero suprime la expresión de quimiocina atrayente de Treg en lesiones de cáncer colorrectal . Todos los cultivos son de 48 h. Datos combinados a partir de los tumores de 3 pacientes diferentes (n = 3) .

Figura 7. Combinación de INFa, poli-I;C e indometacina, de manera consistente regula por aumento las quimiocinas que atraen Teff y de manera consistente suprime las quimiocinas que atraen Treg en tejidos de tumor. Las biopsias de tumor fueron dejados sin tratar o que se trataron con la combinación de indometacina. FNa y poli-I:C (IAP) . Análisis por ELISA de los contenidos de quimiocina en los sobrenadantes de tejidos de tumor cultivados durante 48 horas (no tratados o tratados) de 10 pacientes diferentes.

Figuras 8A-8D. Mejoramiento selectivo dependiente de NF-?? de producción de CXCL10 en diferentes tejidos de tumor después de la exposición a la combinación de INFa, poli-I:C e indometacina . (Fig. 8A) ELISA para la expresión de CXCL10 en hígado normal pareado y tejidos metastásicos de hígado de 10 pacientes diferentes ya sea sin tratar (panel izquierdo) o tratados (panel derecho) . (Fig. 8B) Número promedio de células contadas por campo (microscopía confocal; en un total de 10 campos) que muestra translocación nuclear de NF-?? en hígado normal o tejidos metastásicos de hígado ya sea sin tratar o tratados (panel derecho) . Las imágenes representativas de cada condición se muestran en el panel izquierdo. (Fig. 8C) Análisis por ELISA de producción de CXCL10 por hígado normal pareado y tejidos de cáncer colorrectal metastásicos a hígado, ya sea no tratados o tratados (INFa, poli-I:C e indometacina) en ausencia o presencia de CAY10470 20 µ? (inhibidor de NF-??) . (Fig. 8D) Selectividad de modulación de quimiocina en lesiones de melanoma (versus piel sana) . Diferentes lesiones de melanoma de piel sana marginal se tratan con IFNOÍ + poli-I:C, y los niveles de secreción de CXCL10/IP10 se miden por ELISA.

Figuras 9A-9C. Inducción selectiva de CXCL10 y CCL5 en metástasis de hígado en comparación con tejidos de hígado normal: papel de NF-??. Muestras pareadas de tejidos de hígado marginal y tejidos de cáncer colorrectal metastásico a hígado (3 biopsias en 1 mi, en una placa de 24 pozos) se cultivan durante 24 h ya sea sin tratar o tratadas con IFNOÍ + poli-I:C + indometacina y (Fig. 9A) se analizan para expresión de CCL5 y CXCLIO por Taqman. (Fig. 9B) Los tejidos se dejan sin tratar o se tratan con INFOÍ + poli-l:C + indometacina en ausencia o presencia de CAY10470 20 µ? (inhibidor de NF-??) . Los sobrenadantes se analizan para producción de CCL5 por ELISA (véase datos de CXCLIO pareados en las figuras 4A-4C) . (Fig. 9C) efecto de CAY10470 (20 µ?) sobre la expresión de AR m para glucógeno fosforilasa en hígado en tejido de hígado marginal pareado y cáncer colorrectal metastásico a hígado.

Figuras 10A-10B. Los tumores tratados con INFOÍ, poli-I:C e indometacina muestran capacidad mejorada para atraer Teff pero capacidad fuertemente reducida para atraer Treg. (Fig. 10A) Se permite que los Teff generados ex vivo (izquierda) o linfocitos infiltrados de tumor CD8+ aislados (derecha) (véanse materiales y métodos) se desplacen hacia sobrenadantes de tumores ya sea no tratados o tratados de 3 pacientes diferentes en análisis de quimiotaxis transpozo. (Fig. 10B) Los linfocitos T CD4+ totales aislados de manera negativa se permite que se desplacen hacia los sobrenadantes de tumor tratados o no tratados. Las células que se desplazan se lisan y analizan para expresión de F0XP3 por Taqman. U.D. : indetectable .

Figura 11. Modulación de los sensores de TLR por IFN. Las muestras de te ido de tumor completo, células NK aisladas en sangre, DC derivados de monocito se analizaron para expresión espontánea, inducible por INF - (o PGE2) de ARNm para TLR3 y MyD88 (Taqman) .

Figura 12. Diferentes ligandos de TLR y activadores de NF-?? alternativos sinergizan con interferones tipo I y tipo II en la inducción de IP10/CXCL10. Células aisladas se trataron con IFNa o IFNy solo o en combinación con poli-I:C (ligando TLR3) , LPS (ligando TLR4) o una citocina proinflamatoria . TNFOÍ . (B) La inducción del gen para IP10/CXCL10 se mide por Taqman.

Figura 13. Combinación de celecoxib (inhibidor de COX2) IFNa y poli-I:C, contrarresta la elevación indeseble de la relación entre quimiocinas que atraen Treg y que atraen Teff (relación entre CCL22/CXCL10) en tejido de melanoma tratado por un agente quimioterapéutico, melfalano. Las biopsias de tumor se cultivaron ex vivo en presencia de concentraciones en aumento de melfalano, en ausencia o presencia de la combinación triple (CAP) de Celecoxib, IFNa y poli-I:C. Se midieron por ELISA los niveles de secreción de CCL22 y CXCL10.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION Los tratamientos eficaces para el tratamiento y prevención de cáncer y otras enfermedades se describen en la presente. Estos métodos incluyen la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de agentes que incrementan la producción local de quimiocinas que atraen células efectoras dentro de lesiones tumorales, con supresión concomitante de producción local de quimiocinas indeseables que atraen linfocitos T reguladores (reg) . Estos métodos incluyen administrar al sujeto en una cantidad terapéuticamente eficaz de un agonista de receptor similar a peaje (TLR) en combinación con un bloqueador de síntesis de prostaglandina, en combinación con un interferón tipo-1, o en combinación con tanto un bloqueador de síntesis de prostaglandinas como con un interferón tipo-1, por lo que se trata o evita cáncer o una enfermedad infecciosa o se evita la recurrencia de la misma en el sujeto. De manera alternativa, los métodos derivados a partir de los mismos paradigmas pero que tienen como objetivo tratar o evitar enfermedades autoinmunes, enfermedad inflamatoria crónica o rechazo de transplantes incluyen la combinación de un agonista receptor similar a peaje (TLR) en combinación con una prostaglandina que incluye, pero que no se limita a prostaglandina E2 (PGE2) u otro activador de la vía de señalización de adenilato ciclasa/AMPc/CREB.

I. Términos Generales A menos que se indique en otro sentido, se utilizan los términos técnicos de acuerdo con el uso convencional.

Las definiciones de los términos comunes en biología molecular se pueden encontrar en Benjamín Lewin, Genes V, publicado por Oxford University Press, 1004 (ISBN 0-19-854287-9); Kendrew et al. (eds) . The Encyclopedia of Molecular Biology, publicada por Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9); y Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology : a Comprehensive Desk Reference, publicado por VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8) .

Con el fin de facilitar una revisión de las diversas modalidades de esta descripción, se proporcionan las siguientes explicaciones de los términos específicos: Quimiocinas : Quimioatrayentes inmunitarios que inducen el desplazamiento de células inmunitarias hacia su fuente (contra el gradiente) . IP10/CXCL10, RANTES/CCL5 y MDC/CCL22 son ejemplos de quimiocinas. IP10 (junto con dos qumiocinas relacionadas, MIG/CXCL9 y I -TAC/CXCL11 ) se unen todas al mismo receptor de quimiocina: CXCR3 , que se expresa principalmente en células inmunitarias de tipo efector tales como células Thl , células BK y CTL, que son todas conocidas por promover rechazo de tumores. RANTES/CCL5 se une a CCR5, CCR3 y CCR1. Similar a los ligandos CXCR3 también se sabe que atraen principalmente células efectoras inmunitarias y promueven rechazo de tumor. MDC/CCL22 se unen a CCL4 , que se expresa principalmente sobre linfocitos T reguladores (reg) , el tipo de célula que se sabe está involucrado para proteger tumores de la destrucción inmunitaria y promueve progreso del tumor. En contraste con las quimiocinas "deseables" IP10, MIG, ITAC y RANTES, las quimiocinas "indeseables" incluyen MDC/CCL22 que media la atracción de linfocitos Treg indeseables y SDF1/CXCL12 que media la atracción de linfocitos Treg indeseables y MDSC.

Agentes quimioterapéuticos : Cualquier agente químico con utilidad terapéutica en el tratamiento de enfermedades caracterizado por crecimiento normal de células. Estas enfermedades incluyen tumores, neoplasmas y cáncer. En una modalidad un agente quimioterapéutico es un agente de uso en el tratamiento de cáncer colorrectal, melanoma u otro tumor. En una modalidad, un agente quimioterapéutico es un compuesto radioactivo. Una persona experta en el ámbito podrá identificar con facilidad un agente quimioterapéutico de uso (véase, por ejemplo, Slapak y Kufe, Principies of Cáncer Therapy, Chapter 86 in Harrison's Principies of Internal Medicine, 14th edition; Perry efc al., Che otherapy, Ch . 17 in Abeloff, Clinical Oncology 2nd ed. , © 2000 Churchill Livingstone, Inc.; Baltzer, L. Berkey, R. (eds.) : Oncology Pocket Guide to Chemotherapy, 2nd ed. St . Louis, Mosby-Year Book, 1995; Fischer, D.S., Knonf, M.F., Durivage, H.J. (eds) : The Cáncer Chemotherapy Handbook, 4th ed. St . Louis, Mosby-Year Book, 1993) .

La quimioterapia combinada es la administración de más de un agente para tratar cáncer. Un ejemplo es la administración de un anticuerpo o un fragmento del mismo utilizado en combinación con un compuesto radioactivo o un compuesto químico.

Inhibidor de ciclooxigenasa : Un compuesto que inhibe selectivamente a la enzima ciclooxigenasa-2 y/o a la enzima ciclooxigenasa- 1 , que reduce la producción de prostanoides .

Inhinbidor selectivo de ciclooxigenasa-2 (COX2) : Un compuesto que selectivamente inhibe a la enzima ciclooxigenasa-2 sobre la enzima ciclooxigenasa- 1. En una modalidad, el compuesto tiene una CI50 de ciclooxigenasa-2 de menos de aproximadamente 2 µ? y una CI50 de ciclooxigenasa- 1 de más de aproximadamente 5 µ?, en el análisis de COX-2 de sangre completa humana (como se describe en Brideau et al., Inflamm Res., 45: 68-74 (1996)) y también tiene una relación de selectividad de inhibición de ciclooxigenasa-2 respecto a inhibición de ciclooxigenasa- 1 de por lo menos aproximadamente 10, tal como por lo menos aproximadamente 40. En otra modalidad, el compuesto tiene una CI50 de ciclooxigenasa- 1 de más de aproximadamente 1 µ? y preferiblemente de más de 20 µ?. El compuesto también inhibe a la enzima lipooxigenasa . Esta selectividad puede indicar la capacidad para reducir la incidencia de efectos secundarios inducidos por MAINE comunes.

Proteína-10 inducible por interferón (IP-10) : Una citocina también conocida como proteína-10 inmune; proteína inducible por interferón de 10 kDa] también: gamma-IP-10, INP-10 o C7. El homólogo de rata de esta proteína se denomina mob-1. Se ha propuesto el nombre CXCLIO para este factor. El símbolo de gen es SCYB10. En base en la presencia de un motivo tridimensional conservado y actividad microbicida directa, se ha clasificado a IP-10 como una quinocidina (quimiocina microbicida) .

En humanos, la proteína nativa tiene una longitud de 98 aminoácidos. Tiene homología con PF4 (factor plaquetario 4) y pertenece a la familia de citocinas quimiotácticas conocidas como quimiocinas. IP-10 también se relaciona con un gen denominado CRG-2 (véase: CRF, genes que responden a citocinas) . CRG2 murino e IP-10 humano se consideran homólogos. Los genes de IP10 humanos contienen cuatro exones y mapas para el cromosoma 4ql2-21 en la vecindad de otros genes que codifican para quimiocinas.

El receptor para IP-10 es CXCR3. Se ha demostrado que IP-10 se une a viroceptor M3 codificado por virus. La expresión de IP-10 a partir de una diversidad de células, que incluyen monocitos, células endoteliales , queratinocitos y fibroblastos, es inducida por IF-gamma y TFN-alfa. Los neutrófilos humanos producen IP-10 en respuesta a IFN-gamma en combinación con ya sea TNF-alfa o lipopolisacáridos bacterianos.

Neoplasia, malignidad, cáncer o tumor: El resultado de crecimiento de células de modo anormal y sin control. La neoplasia, la malignidad, el cáncer y el tumor con frecuencia se utilizan de modo intercambiable. La cantidad de un tumor en un individuo es la "carga de tumor" la cual se puede medir como el número, volumen o peso del tumor. Un tumor que no produce metástasis se denomina como "benigno". Un tumor que invade el tejido circundante y/o que puede generar metástasis se denomina como "maligno" . Los ejemplos de tumores hematológicos incluyen leucemias que incluyen leucemia aguda (tal como leucemia aguda positiva a llq23, leucemia linfocítica aguda, leucemia mielocítica aguda, leucemia mielógena aguda y mieloblástica , promielocítica , mielomonocítica, monocítica y eritroleucemia) , leucemias crónicas (tal como leucemia mielocítica crónica (granulocítica) , leucemia mielógena crónica y leucemia linfocítica crónica) , policitemia vera, linfoma, enfermedad de Hodgking, linfoma no hodgkiniano (de formas indolente y de alto grado) , mieloma múltiple, macroglobulinemia de Waldenst om, enfermedad de cadena pesada, síndrome mielodisplásico, tricoleucemia y mielodisplasia .

Los ejemplos de tumores sólidos tales como sarcomas y carcinomas incluyen fibrosarcoma, mixosarcoma , liposarcoma, condrosarcoraa, sarcoma osteogénico y otros sacrcomas, sinovioma, mesotelomia, tumor de Ewing, leiomisarcoma, rabdomiosarcoma, carcinoma de colon, malignidad linfoide, cáncer pancreático, cáncer de mama (que incluye carcinoma de mama basal, carcinona ductal y carcinoma de mama lobular), cánceres de pulmón, cáncer de ovario, cáncer de próstata, carcinoma hepatocelular , carcinona de células escamosasa, carcinoma de células básales de melanoma, adenocarcinoma, carcinoma de glándulas sudoriporas, carcinoma de tiroides medular, carcinoma de tiroides papilar, feocromocitomas , carcinoma de glándulas sebáceas, carcinoma papilar, adenocarcinomas papilares, carcinoma medular, carcinoma broncogénico, carcinoma de células renales, hepatoma, carcinoma de ducto biliar, coriocarcinoma, tumor de Wilms, cáncer cervical, tumor testicular, seminoma, carcinoma de vejiga y tumores del SNC (tales como un glioma, astrocitoma, meduloblastoma, craniofariogioma , ependimoma, pinealoma, hemangioblastoma, neuroma acústico, oligodendroglioma, menangioma, melanoma, neuroblastoma y retinoblastoma) .

Prevención, tratamiento o disminución de una enfermedad: "Prevenir" una enfermedad se refiere a inhibir el desarrollo completo de una enfermedad o retrasar el desarrollo de la enfermedad. "Tratar" se refiere a una intervención terapéutica que disminuye un signo o síntoma de una enfermedad o condición patológica después de que ha comenzado a desarrollarse. "Aminorar" se refiere a la reducción en el número o gravedad de signos o síntomas de una enfermedad, tal como cáncer.

Producción de PGE2 : El proceso de síntesis de PGE2 involucra miembros de la familia de fosfolipasa A2 (PLA2) que movilizan ácido araquidónico desde membranas celulares, ciclooxigenasas (C0X1 activa de manera constitutiva y C0X2 inducible) que convierte ácido araquidónico en prostaglandina H2(PGH2) y prostaglandina E sintasa (PGES) necesaria para la formulación final de PGE2. Aunque la velocidad de síntesis de PGE y el proceso inflamatorio resultante pueden ser alterados por factores adicionales, tales como disponibilidad local de AA, en condiciones principalmente fisiológicas la velocidad de síntesis de PGE2 es controlada por la expresión local y actividad de C0X2.

Degradación de PGE2. La velocidad de degradación de PGE2 es controlada por 15 -hidroxiprostaglandina deshidrogenasa (15-PGDH) , lo que sugiere que además de la velocidad de síntesis de PGE2, también la velocidad de extinción de PGE2 constituye un objetivo para inmunomodu1ación .

Capacidad de respuesta a PGE2. Cuatro receptores diferentes para PGE2 son EP1, EP2 , EP3 y EP4. La señalización a través de dos receptores acoplados a Gs, EP2 y EP4, es mediada por la vía AMPc/PKA/CREB activada por adenilato ciclasa, que media los aspectos dominantes de la actividad antiinflamatoria y supresora de PGE2. Aunque EP2 se considera que señaliza de una manera que depende en gran medida de AMPc, EP4 también activa la vía ERK1/2 dependiente de PI3K. No obstante, tanto EP2 como EP4 se ha demostrado que activan la vía GSK3/ -catetina .

La expresión de EP2 y la capacidad de respuesta resultante a PGE2 se puede suprimir por hiper-metilación, como se observa en pacientes con fibrosis pulmonar idiopática. Estas observaciones hacen surgir la posibilidad de que, además de la regulación de la producción de PGE2 y su degradación, la regulación de la capacidad de respuesta de PGE2 a nivel de expresión de receptores de PGE2 individuales también puede contribuir a la patogénesis de enfermedad humana y puede ser aprovechada en el tratamiento. Para fundamentar esta posibilidad, el uso de inhibidores sintéticos, que afectan de modo preferencial la señalización de EP2, EP3 o EP4 permiten supresión diferencial de diferentes aspectos de la actividad de PGE2 (revisado en la presente) .

Inhibidores de síntesis de pros aglandina (PG) : Factor el cual inhibe la síntesis de las PG en general o la síntesis de un tipo específico de las PG. Los inhibidores de síntesis de PG incluyen inhibidores no selectivos de COX-1 y COX-2, las dos enzimas clave en la vía de síntesis de PG y los inhibidores selectivos de COX-2, los cuales se considera que son más específicos para COX-2 y menos tóxicos. Los ejemplos de inhibidores de PG no selectivos incluyen aspirina, indometacina, o ibuprofeno (Advil, Motrin) . Los ejemplos de inhibidores selectivos de COX-2 incluyen celecoxib (Celebrex) y rofecoxib (Vioxx) . El ejemplo de inhibidor específico de COX-1 es sulindac (Clinoril) . Otros fármacos que suprimen la síntesis de prostaglandina incluyen esteroides (ejemplo: hidrocortisona, cortisol, prednisona o dexametasona) y acetaminofeno (Tylenol, Panadol) utilizados habitualmente como medicamentos antiinflamatorios, antipiréticos y analgésicos. Los ejemplos de los inhibidores de COX2 selectivos utilizados más comúnmente incluyen celecoxib, alecoxib, valdecoxib y rofecoxib.

Los ejemplos de los inhibidores de COX 1 y COX2 no selectivos utilizados más comúnmente incluyen: ácido acetilsalicílico (aspirina) y otros salicilatos, acetaminofeno (Tylenol), ibuprofeno (Advil, Motrin, Nuprin, Rufen) , naproxeno (Naprosyn, Aleve) , nabumetona (Relaten) o diclofenaco (Cataflam) .

Inhibidores de señalización de prostaglandina (PG) : La señal de las prostaglandinas a través de numerosos receptores, con los efectos inmunosupresores claves son mediados por la activación de adenilato ciclasa, la elevación resultante de AMP cíclico (c) intracelular, PKA y la activación corriente abajo de la vía PKA/CREB.

Otro nivel de interferencia con la capacidad de respuesta de PG incluye la interferencia con su unión a receptores de PG. En caso de PGE2 , los dos receptores activadores de AMPc claves son EP2 y EP4 , para los cuales existen muchos inhibidores específicos.

El incremento de los niveles de AMPc inducido por prostaglandinas u otros factores se puede evitar por fosfodiesterasas (PDE; actualmente se conocen 6 tipos, PDE1 a PDE5 y PDE10, lo cual reduce los niveles de AMPc intracelular) . Las PDE pueden ser controladas por inhibidores de fosfodiesterasa los cuales incluyen sustancias tales como xantinas (cafeína, aminofilina, IBMX, pentoxifilina, teobromina, teofilina o paraxantina) , todas las cuales incrementan los niveles de AMPc intracelular y los factores sintéticos y naturales más selectivos que incluyen vinpocetina, cilostazol, inamrinona, cilostazol, mesembrina, rolipram, ibudilast, drotaverina, piclamilast, sildafenilo, tadalafilo, verdenafilo o papaverina.

Además, la interferencia con la señalización de PGE2 (o con la señalización de otros factores que elevan AMPc tales como histamina o agonistas beta-adrenérgicos) se puede obtener por la inhibición de señales corriente abajo de AMPc tal como PKA o CREB .

Cantidad terapéuticamente eficaz: Una cantidad de un agente terapéutico (tal como IP-10 o un agente que incrementa la producción de IP-10/CXCL10 y/o RA TES/CCL5, disminuye la producción de CCL22 o incrementa el número o la calidad de las células inmunitarias que expresan CXCR3 y/o CCR5 y que son capaces de desplazarse hacia CXCL10 o CCL5) que, solas o juntas con uno o más agentes terapéuticos adicionales inducen la respuesta deseada tal como una disminución del riesgo de desarrollar cáncer o disminución en los signos y síntomas de cáncer. En un ejemplo, es una cantidad de un agente necesario para evitar o retrasar el desarrollo de un tumor tal como melanona o cáncer colorrectal en un sujeto. En otro ejemplo, es una cantidad del agente necesario para evitar o retrasar la metástasis de un tumor, provocar regresión de un tumor existente o tratar uno o más signos o síntomas asociados con un tumor en un sujeto tal como un sujeto que tiene melanoma o cáncer colorrectal. Idealmente, una cantidad terapéuticamente eficaz proporciona un efecto terapéutico sin provocar efectos adversos sustanciales en el sujeto. Las preparaciones descritas en la presente se administran en cantidades terapéuticamente eficaces .

En un ejemplo, la respuesta deseada es evitar el desarrollo de un tumor. En otro ejemplo, una respuesta deseada es retrasar el desarrollo, progreso o metástasis de un tumor, por ejemplo, en por lo menos aproximadamente 3 meses, por lo menos aproximadamente seis meses, por lo menos aproximadamente un año, por lo menos aproximadamente dos años, por lo menos aproximadamente cinco años o por lo menos aproximadamente diez años. En un ejemplo adicional, una respuesta deseada es disminuir la presentación de cáncer, tal como cáncer colorrectal o melanoma. En otro ejemplo, una respuesta deseada es disminuir los signos y síntomas de cáncer, tal como el tamaño, volumen o número de tumores o metástasis. Por ejemplo, en algunos ejemplos la composición puede disminuir el tamaño, volumen o número de tumores (tales como tumores colorrectales) en una cantidad deseada, por ejemplo en por lo menos 5%, por lo menos 10%, por lo menos 15%, por lo menos 20%, por lo menos 25%, por lo menos 30%, por lo menos 50%, por lo menos 75% o incluso por lo menos 90%, en comparación a una respuesta en ausencia de la composición terapéutica.

En general, una cantidad eficaz de una composición administrada a un sujeto humano variará dependiendo de diversos factores asociados con el sujeto, por ejemplo la salud general del sujeto, la condición que va ser tratada, la gravedad de la condición. Una cantidad eficaz de una composición se puede determinar al variar la dosificación del producto y medir la respuesta terapéutica resultante, tal como la disminución en la presentación de cáncer, tal como cáncer colorrectal o melanoma, o la disminución en el tamaño, volumen o número de tumores . Cualquier agente se puede administrar en una dosis única o en varias dosis, según se requiera, para obtener la respuesta deseada. No obstante, la cantidad eficaz puede depender de la fuente aplicada, el sujeto que es tratado, la gravedad y el tipo de condición que es tratada y la manera de administración que incluye la vía, tasa y frecuencia de administración así como la formulación de cada uno de los compuestos activos o su combinación, así como la sincronización relativa de la administración de cada uno de los componentes unos en relación con otros y con otros elementos del cuidado del paciente en general (cirugía, radioterapia, quimioterapia, terapia biológica o cualquier medio de administración de síntomas) .

Receptor similar a peaje (TLR) : Una familia de receptores los cuales juegan un papel fundamental en el reconocimiento de patógenos y activación de inmunidad innata. Los TLR están altamente conservados desde Drosophila hasta humanos y comparten similitudes estructurales y funcionales. Reconocen patrones moleculares asociados a patógenos (PA P) que se expresan sobre agentes infecciosos y que median la producción de citocinas necesarias para el desarrollo de inmunidad eficaz. Existen un total de 13 TLR de mamífero, que incluyen nueve (TLR1 a 9) que se han estudiado intensamente y que se sabe activan la vía NF-KB.

Receptor similar a peaje 3 (TLR3) : Un miembro de la familia de receptor similar a peaje (TLR) . Su secuencia de aminoácidos se muestra en NCBI, acceso número NP_003256, del 2 de enero del 2009, la descripción del cual se incorpora en la presente como referencia. TLR3 es un miembro del receptor similar a peaje (TLR) . Este receptor se expresa de manera más abundante en placenta y páncreas y está limitado a la subpoblación dendrítica de los leucocitos. Reconoce ARNds asociado con infección viral e induce la activación de NF-KB y la producción de interferones tipo I . La secuencia de ARNm para TLR3 se describe en NCBI, acceso número NM_003265, el cual también se incorpora como referencia del 2 de enero del 2009. TLR3 se describe en WO 98/50547, la descripción de la cual también se incorpora en la presente como referencia) . El término "gen para TLR3" designa al gen para el receptor similar a peaje 3 así como variantes, análogos y fragmentos del mismo que incluye alelos del mismo (por ejemplo mutaciones de línea germinal) . Estas variantes incluyen, por ejemplo, variantes que se encuentran de manera natural debido a variaciones alélicas entre individuos (por ejemplo, polimorfismos), formas de empalme alternativas, etc. En varias modalidades las variantes son sustancialmente homologas a la secuencia NCBI acceso No. NM_003265, de manera que tienen una identidad de secuencia nucleotídica de por lo menos aproximadamente 65%, por lo menos aproximadamente 75%, por lo menos aproximadamente 85% o por lo menos aproximadamente 95% con la secuencia de referencia. Las variantes de análogos de un gen para TLR3 también incluyen secuencias de ácido nucleico las cuales hibridizan con una secuencia como se define en lo anterior (o una cadena complementaria de la misma) bajo condiciones de hibridación altamente rigurosas. Los polimorfismos genéticos de la secuencia de ADN para TLR3 humana se conocen, por ejemplo variaciones alélicas en la región citoplásmica del gen para TLR3 y en la secuencia 5' inmediata del gen para TLR3 (véase Piriel et al (2005) Tissue Antigens 66(2): 125, la descripción de la cual se incorpora en la presente como referencia) , por ejemplo, el polimorfismo C/T en la posición 2593, el polimorfismo C/A en la posición 2642 y el polimorfismo AJG en la posición 2690 en el gen para TLR3.

II. Agentes que incrementan la producción de ligandos de CXCR3 y ligandos de CCR5, tales como interferones tipo I (IFN-OC e IFN-ß) e interferones tipo II (IFN-?) El término "interferón alfa", como se utiliza en la presente, se refiere a una familia de polipéptidos relacionados que inhiben la replicación viral y proliferación celular y que modulan la respuesta inmunitaria. El término "IFN-a", "IFN-alfa" o "IFN-a", incluye polipéptidos de IFN-a que se encuentran de modo natural; polipéptidos de IFN-a que no se encuentran de manera natural y análogos de IFN-a que se encuentran de manera natural o que no se encuentran de manera natural que retienen actividad antiviral de un IFN-a original como se encuentra de manera natural o que no se encuentra de manera natural .

Los interferones alfa adecuados incluyen, pero no se limitan a IFN-a como se encuentra de manera natural (que incluye, pero que no se limita a IFN-a2a como se encuentra de manera natural, IFN-a2b) ; interferón alfa-2b recombinante tal como Intron A, interferón disponible de Schering Corporation, Kenilworth, N. J. ; interferón recombinante alfa-2a tal como Roferon (g) interferón disponible de Hoffmann-La Roche, Nutley, N. J. ; interferón recombinante alfa-2C tal como interferón alfa 2 Berofor disponible de Boehringer Ingelheim Pharmaceutical , Inc., Ridgefield, Conn. ; interferón alfa-nl, una combinación purificada de interferones alfa naturales tales como Sumiferon disponible de Sumitomo, Japón o como interferón alfa-nl Wellferon (INS) disponible de Glaxo-Wellcome Ltd., Londres, Gran Bretaña; e interferón alfa-n3, una mezcla de interferones alfa naturales elaborados por Interferón Sciences y disponible de Purdue Frederick Co . , Norwalk, Conn.

IFN-alfa también abarca IFN-a de consenso. "IFN-a de consenso" se refiere a un polipéptido que no se presenta de modo natural, el cual incluye aquellos residuos aminoácidos que son comunes para todas las secuencias de subtipo IFN-a de leucocito humano que se encuentran de manera natural y las cuales incluyen, en una o más de las posiciones en donde no existe un aminoácido común a todos los subtipos, un aminoácido el cual se presenta de manera predominante en esa posición, con la condición de que cualquiera de estas posiciones en donde no hay un aminoácido común a todos los subtipos, el polipéptido excluye a cualquier residuo aminoácido el cual no está presente en por lo menos un subtipo como se encuentra de manera natural. Los residuos aminoácidos que son comunes a todas las secuencias de subtipo IFN-a de leucocitos humanos como se encuentra de manera natural ("residuos aminoácidos comunes") y residuos aminoácidos que se encuentran de manera predominante en residuos no comunes ("residuos de aminoácidos de consenso") son conocidos en el ámbito. El IFN-a de consenso (también denominado como "CIFN" e "IFN-con" e "interferón de consenso") abarca, pero no se limita a las secuencias de aminoácidos designadas IFN-conl, IFN-con2 e IFN-con3, las cuales se describen en las patentes de E.U.A. Nos. 4,695,623 y 4,897,471; e interferón de consenso como se define por determinación de la secuencia de consenso de interferones alfa como se encuentran de manera natural (por ejemplo Infergen (g) , InterMune, Inc., Brisbane, Calif.). IFN-conl el agente de interferón de consenso en el Infergen (producto D alfacon-1) . El producto de interferón de consenso Infergen se denomina en la presente por su nombre comercial (Infergen (Z) o por su nombre genérico (interferón alfacon-1) ) . Las secuencias de ADN que codifican para IFN-con se pueden sintetizar como se describe en las patentes mencionadas antes u otros métodos estándar. El uso de CIFN es de interés particular .

También es adecuado para uso en los métodos que aquí se describen los polipéptidos de fusión que comprenden un IFN-a y un polipéptido heterólogo. Los polipéptidos de fusión de IFN-a adecuados incluyen, pero no se limitan a Albuferon-alfa (un producto de fusión de albúmina humana e IFN-a; Human Genome Sciences; véase, pro ejemplo, Osborn et al. (2002) J Pharmacol . Exp. Therap. 303: 540-548). También son adecuados para uso en la presente invención las formas barajadas de genes de IFN-a. Véase, por ejemplo, Masci et al. (2003) Curr. Oncol . Re . 5: 108-113.

Los polipéptidos de IFN-a se pueden producir por cualquier método conocido. Las secuencias de ADN que codifican para IFN-con se pueden sintetizar como se describe en las patentes mencionadas en lo anterior u otros métodos estándar. En muchas modalidades, los polipéptidos de IFN-a son los productos de expresión de secuencias de ADN manufacturadas transformadas o transíectadas en hospedadores bacterianos tales como E. coli o en células hospedadoras eucarióticas (por ejemplo, levadura; células de mamífero tales como células CHO; y similares) . En estas modalidades, el IFN-a es recombinante . Cuando la célula hospedadora es una célula hospedadora bacteriana, el IFN-a se modifica para comprender una metionina N-terminal. La IFN-a producida en E. coli generalmente se purifica por procedimientos conocidos por aquellos expertos en el ámbito y descritos generalmente en Klein et al. ((1988) J Chromatog. 454: 205-215) para IFN-conl .

El IFN-a producido bacterialmente puede comprender una mezcla de isoformas con respecto al residuo aminoácido N-terminal. Por ejemplo, el IFN-con purificado puede comprender una mezcla de isoformas con respecto al estado de metionina N-terminal. Por ejemplo, en algunas modalidades, un IFN-con comprende una mezcla de IFN-con metionil N-terminal, IFN-con des-metionil con una parte N-terminal no bloqueada e IFN-con des-metionil con una parte N-terminal bloqueada. Como un ejemplo no limitante, el IFN-conl purificado comprende una mezcla de IFN-conl metionil, IFN-conl des-metionil e IFN-conl des-metionil con la parte N-terminal bloqueada. Klein et al. ((1990) Aren. Biochemistry & Biophys. 276: 531-537). De manera alternativa, el INF-con puede comprender una isoforma aislada específica. Las isoformas de IFN-con están separadas entre sí por técnicas tales como enfoque isoeléctrico el cual es conocido por aquellos expertos en el ámbito. IFN-a, como se describe en la presente, puede comprender uno o más residuos aminoácidos modificados, por ejemplo glucosilaciones , modificaciones químicas y similares.

El término "IFN-a" también abarca derivados de IFN-a que son derivatizados (por ejemplo, son modificados químicamente) para alterar ciertas propiedades tales como vida media en suero. De esta manera, el término "IFN-a" incluye IFN-a glucosilado; IFN-a derivatizado con polietilenglicol ("IFN-a PEGilado"); y similares. El IFN-a PEGilado y métodos para elaboración de esta molécula se describen en las patentes de E.U.A. Nos. 5,382,657; 5,981,709; y 5,951,974. El IFN-a PEGilado abarca conjugados de PEG y cualquiera de las moléculas de IFN-a descritas en lo anterior que incluyen pero que no se limitan a PEG conjugado a interferón alfa-2a (Roferon, Hoffmann La-Roche, Nutley, N. J.), interferón alfa 2b (Intron, Schering-Plough, Madison, N. J.), interferón alfa-2c (Berofor Alpha, Boehringer Ingelheim, Ingelheim, Alemania) ; e interferón de consenso como se define por la determinación de una secuencia de consenso de interferones alfa como se encuentran de modo natural ( Infergen&commat ; , Inter une, Inc., Brisbane, Calif ) .

Cualquiera de los polipéptidos de IFN-a mencionados en lo anterior se puede modificar con una o más porciones de polietilenglicol, por ejemplo, PEGilada. La molécula de PEG de un polipéptido de IFN-a PEGilado se conjuga a una o más cadenas laterales de aminoácidos del polipéptido IFN-a.

En algunas modalidades, el IFN-a PEGilado contiene una porción PEG en únicamente un aminoácido. En otras modalidades, el IFN-a PEGilado contiene una porción PEG en dos o más aminoácidos, por ejemplo el IFN-a contiene una porción PEG unida a dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez residuos aminoácidos diferentes.

El IFN-a se puede acoplar directamente a PEG (por ejemplo, sin un grupo enlazante) a través de un grupo amino, un grupo sulfhidrilo, un grupo hidroxilo o un grupo carboxilo. En algunas modalidades, el IFN-a PEGilado está PEGilado en o cerca de la parte amino terminal (N-terminal) del polipéptido de IFN-a, por ejemplo, la porción PEG está conjugada al polipéptido de IFN-a en uno o más residuos aminoácidos desde el aminoácido 1 al aminoácido 4, o desde al aminoácidos 5 hasta aproximadamente 10. En otras modalidades, el IFN-a PEGilado está PEGilado en uno o más residuos aminoácidos desde aproximadamente 10 a aproximadamente 28. En otras modalidades, el IFN-a PEGilado está PEGilado en o cerca de la parte carboxilo terminal (C-terminal) del polipéptido de IFN-a, tal como en uno o más residuos de los aminoácidos 156 a 166 o de los aminoácidos 150 a 155. En otras modalidades, el IFN-a PEGilado está PEGilado en uno o más residuos aminoácidos en uno o más residuos desde los aminoácidos 100 a 114. La selección del sitio de unión de polietilenglicol en el IFN-a se determina por el papel de cada uno de estos sitios dentro de los dominios de unión a receptor y/o de sitio activo de la proteína, como lo conocen los expertos en el ámbito. En general, los aminoácidos en los cuales la pegilación debe evitarse incluyen residuos aminoácidos desde el aminoácido 30 o el aminoácido 40; y los residuos aminoácidos desde el aminoácidos 113 al aminoácido 149. En algunas modalidades, PEG está unido a IFN-a por medio de un grupo enlazante. El grupo enlazante es cualquier grupo enlazante biocompatible en donde "biocompatible" indica que el compuesto o el grupo es no tóxico y puede ser utilizado in vitro o in vivo sin provocar daño, mareos, enfermedad o muerte. Se puede unir PEG al grupo enlazante, por ejemplo, por medio de una unión éter, una unión éster, una unión tiol o una unión amida. Los grupos enlazantes biocompatibles adecuados incluyen, pero no se limitan a un grupo éster, un grupo amida, un grupo imida, un grupo carbamato, un grupo carboxilo, un grupo hidroxilo, un carbohidrato, un grupo succinimida (que incluye, por ejemplo, succinato de succinimidilo (SS) , propionato de succinimidilo (SPA) , carboximetilato de succinimidilo (SCM) , succinimidil succinamida (SSA) o N-hidroxisuccinimida (NHS) ) , un grupo epóxido, un grupo oxicarbonilimidazol (que incluye, por ejemplo, carbonildimidazol (CDI) ) , un grupo nitrofenilo (que incluye, por ejemplo, carbonato de nitrofenilo (NPC) o carbonato de triclorofenilo (TPC) , un grupo trisilato, un grupo aldehido, un grupo isocianato, un grupo vinilsulfona, un grupo tirosina, un grupo cisteína, un grupo histidina o una amina primaria. Los métodos para elaborar propionato de succinimidilo (SPA) y butanoato de succinimidilo (SBA) de PEG activado por éster se describen en la patente de E.U.A. NO. 5.672,662 (Harris, et al.) y WO 97/03106. Los métodos para unir un PEG a un polipéptido IFN-a se conocen en el ámbito y cualquier método conocido se puede utilizar. Véase, por ejemplo, Park et al, Anticancer Res, 1: 373-376 (1981); Zaplipsky y Lee, Polyethylene Glycol Chemistry: Biotechnical y Biomedical Applications, J. M. Harris, ed. , Plenum Press, NY, capítulo 21 (1992); y patente de E.U.A. No. 5,985,265. El IFN-a pegilado también se describe en las patentes de E.U.A Nos. 5,382,657; 5,981,709; 5,985,265; y 5,951,974. El IFN-a pegilado abarca conjugados de PEG y cualquiera de las moléculas de IFN-a descritas en lo anterior que incluyen, pero que no se limitan a PEG conjugado a interferón alfa-2a (Roferon, Hoffmann LaRoche, Nutley, N. J.), en donde el Roferon PEGilado se conoce como PEGASYSX (Hoffmann La Roche) ; interferón alfa 2b (Intron, Schering-Plough, Madison, N. J.), en donde el intrón PEGilado se conoce como PEG- INTRONO (Schering-Plough) ; interferón alfa-2c (Berofor Alpha, Boehringer Ingelheim, Ingelheim, Alemania) .

Interferón-beta (?? ß o INF-ß) : Un miembro de la familia de IFN tipo 1 que señaliza a través del mismo receptor (receptores tipo I de interferón) se considera que tiene funciones biológicas similares que IFN-a. El interferón-beta se vende bajo los nombres Avonex (Biogen Idee) , Rebif (Merck Serono) o Cinno Vex (CinnaGen es biosimilar) .

Interferón-gamma (IFNy o IFN-?) : También denominado como IFN tipo II se sabe que señaliza por un receptor separado, pero activa una vía de señalización que se superpone parcialmente como interferones tipo I y comparte su capacidad para promover la producción de quimiocinas que atraen células efectoras.

III. Agonistas de TLR3 Un agonista de TLR3 se puede seleccionar de cualquier agente adecuado que active TLR3 y/o la cascada subsecuente de eventos bioquímicos asociados con la activación de TLR3 in vivo. Los análisis para detectar actividad agonista de TLR3 se conocen en el ámbito e incluyen, por ejemplo, la detección de producción de luciferasa (luc) a partir de un plásmido indicador NF-KB, o la inducción de IL-8 endógeno (K. Kariko et al., J. Immunol . 2004, 172: 6545-49, las descripciones de los cuales se incorporan en la presente como referencia) . Los análisis para detectar agonismo de TLR3 de los compuestos de prueba también se describen, por ejemplo, en las publicaciones PCT Nos. O 03/31573, WO 04/053057, WO 04/053452 y WO 04/094671, las descripciones de cada uno de los cuales se incorporan en la presente como referencia.

Sin importar el análisis particular usado, se puede identificar un compuesto como un agonista de TLR3 si se realiza el análisis con ese compuesto y resulta en un incremento por lo menos umbral de alguna actividad biológica conocida como mediada por TLR3. Inversamente, se puede identificar a un compuesto como que no actúa como un agonista de TLR3 sí, cuando se utiliza para realizar un análisis diseñado para detectar actividad biológica mediada por TLR3, el compuesto no induce un incremento umbral en la actividad biológica. A menos que se indique en otro sentido, un incremento en la actividad biológica se refiere a un incremento en la misma actividad biológica con respecto a la observada en un control apropiado. Un análisis puede o no realizarse junto con el control apropiado. Por experiencia, una persona experta en el ámbito puede desarrollar familiaridad suficiente con un análisis particular (por ejemplo, el intervalo de valores observados en un control apropiado bajo condiciones de análisis específicas) que realiza un control puede no siempre ser necesario para determinar el agonismo de TLR3 de un compuesto en un análisis particular. El incremento umbral preciso de actividad biológica mediada por TLR3 para determinar si un compuesto particular es o no un agonista de TLR3 en un análisis dado puede variar de acuerdo con factores conocidos en el ámbito que incluyen pero que no se limitan a la actividad biológica observada como el criterio de valoración del análisis, el método utilizado para medir o detectar el criterio de valoración del análisis, la relación señal a ruido del análisis, la precisión del análisis y si el mismo análisis se utiliza para determinar el agonismo de un compuesto para múltiples TLR. Aquellos habitualmente expertos en el ámbito pueden determinar fácilmente el umbral apropiado con consideración debida de estos factores. No obstante, sin importar el análisis particular utilizado, un compuesto en general se puede identificar como un agonista de TLR3 sí al realizar el análisis con un compuesto resulta en un incremento por lo menos umbral de cierta actividad biológica mediada por TLR3.

Los análisis que utilizan HEK293 transíectadas con un gen estructural de TLR3 expresable pueden utilizar un umbral, por ejemplo, de por lo menos un incremento triple en una actividad biológica mediada por TLR3 (tal como activación de NF-KB) cuando el compuesto se proporciona en una concentración, por ejemplo, desde aproximadamente 1 µ? a aproximadamente 10 µ? para identificar un compuesto como un agonista de TLR3 transfectado en la célula. No obstante, diferentes umbrales y/o diferentes intervalos de concentración pueden ser adecuados en ciertas circunstancias.

Un agonista de TLR3 puede ser un anticuerpo agonista, un fragmento agonista de tal anticuerpo, una versión quimérica de estos anticuerpos o un fragmento, u otro derivado de anticuerpo activo. Los anticuerpos de agonista TLR3 útiles en esta invención se pueden producir por cualquiera de una diversidad de técnicas conocidas en el ámbito. Típicamente, se producen por inmunización de una animal no humano tal como un ratón, con un inmunógeno que comprende una proteína TLR3 o un péptido de TLR3. El inmunógeno puede comprender células tumorales que expresan TLR3 intacto, células de membrana de células que expresan TLR-3, la secuencia de longitud completa de la proteína de TLR3 (producida de manera recombinante o aislada de una fuente natural) o un fragmento o derivado del mismo, típicamente un fragmento inmunogénico, por ejemplo una porción del polipéptido que comprende un epítopo expuesto a la superficie de células que expresan TLR3.

En algunas modalidades, el inmunógeno comprende un polipéptido TLR3 humano natural o un fragmento inmunogénico del mismo en una membrana lipídica, típicamente derivados de una fracción de membrana de una célula que expresa TLR-3. En una modalidad específica, el inmunógeno comprende células tumorales que expresan TLR3 completo, intacto u opcionalmente lisado química o físicamente.

La preparación de anticuerpos monoclonales o policlonales es bien conocida en el ámbito y cualquiera de una gran cantidad de técnicas disponibles se puede utilizar (véase, por ejemplo, Kohler & Milstein, Nature 256:495-497 (1975); Kozbor et al., Immunology Today 4: 72 (1983); Colé et al., pp . 77-96 en Monoclonal Antibodies and Cáncer Therapy (1985) ) . La etapa de inmunizar un mamífero no humano con un inmunógeno se puede llevar a cabo de cualquier manera bien conocida en el ámbito para tal fin (véase, por ejemplo, E. Harlow y D. Lañe, Antibodies: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1988) ) . Generalmente, el inmunógeno se suspende o se disuelve en un amortiguador, opcionalmente con un adyuvante tal como adyuvante completo de Freund. Los métodos para determinar la cantidad de inmunógeno, tipos de amortiguadores y cantidades de adyuvantes son bien conocidos por aquellos expertos en el ámbito y de ninguna manera imitan la presente invención. De modo similar, la ubicación y frecuencia de inmunización suficiente para estimular la producción de anticuerpos también es conocida en el ámbito. En un protocolo de inmunización típico, los animales no humanos se les inyecta intraperitonealmente con antígeno en el día 1 y nuevamente aproximadamente una semana después . Esto es seguido por inyecciones de recuerdo del antígeno aproximadamente el día 20, opcionalmente con adyuvante tal como adyuvante incompleto de Freund. Las inyecciones de recuerdo se realizan intravenosamente y se pueden repetir durante varios días consecutivos. Esto es seguido por una inyección de refuerzo en el día 40, por vía intravenosa o intraperitoneal , típicamente sin adyuvante. Este protocolo resulta en la producción de linfocitos B productores de anticuerpo específicos de antígeno después de aproximadamente 40 días. También se pueden utilizar otros protocolos en la medida en que resultan en la producción de linfocitos B que expresen un anticuerpo dirigido al antígeno utilizado en inmunización. En otra modalidad, los linfocitos de un mamífero no humano inmunizado se aislan, se hacen crecer in vitro y después se exponen al inmunógeno en cultivo celular. Los linfocitos después se cosechan y se lleva a cabo la etapa de fusión descrita más adelante.

Los anticuerpos monoclonales , los cuales se prefieren para producir agonistas para uso en los presentes métodos, la siguiente etapa es el aislamiento de células, por ejemplo, linfocitos, esplenocitos o linfocitos B del mamífero no humano inmunizado y la fusión subsecuente de estos esplenocitos o linfocitos B, o linfocitos con una célula inmortalizada con el fin de formar un hibridoma productor de anticuerpos. En aislamiento de esplenocitos, tal como a partir de un mamífero no humano, es bien conocido en el ámbito y generalmente involucra extirpar el bazo de un mamífero no humano anestesiado, cortarlo en piezas pequeñas y exprimir los esplenocitos de la cápsula esplénica y a través de una malla de nylon de un separador de células en un amortiguador apropiado de manera que se produce una suspensión de células solas. Las células se lavan, se centrifugan y se resuspenden en un amortiguador que lisa cualquier eritrocito. La solución se centrifuga nuevamente y los linfocitos remanentes en el sedimento se resuspenden finamente en amortiguador fresco. Una vez aislados y presentes en suspensión de células solas, las células productoras de anticuerpo se fusionan a una línea de células inmortales. Esta es habitualmente una línea de células de mieloma de ratón, aunque se conocen en el ámbito muchas otras líneas de células inmortales útiles para crear hibridomas. Las líneas de mieloma murino preferidas incluyen, pero no se limitan a aquellas derivadas de tumores de ratón MOPC-21 y MPC-11 disponibles de Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California, Estados Unidos, células X63 Ag8653 y SP-2 disponibles de American Type Culture Collection, Rockville, Maryland Estados Unidos. La fusión se lleva a cabo utilizando polietilenglicol o similares. Los hibridomas resultantes después se hacen crecer en medios selectivos que contienen una o más sustancias que inhiben el crecimiento o supervivencia de células de mieloma originales no fusionadas. Por ejemplo, si las células de mieloma originales carecen de la enzima hipoxantina guanina fosforribosil transferasa (HGPRT o HPRT) , el medio de cultivo para los hibridomas típicamente incluirá hipoxantina, aminopterina y timidina (medio HAT) , sustancias las cuales evitan el crecimiento de células deficientes de HGPRT.

Los hibridomas se pueden hacer crecer sobre una capa alimentadora de macrófagos . Los macrófagos preferiblemente son compañeros de carnada del mamífero no humano utilizado para aislar esplenocitos y típicamente se ceban con adyuvante de Freund incompleto o similar, varios días antes de la siembra en placa de los hibridomas. Los métodos de fusión se describen, por ejemplo en (Goding, "Monoclonal Antibodies: Principies and Practice", pp. 59-103 (Academic Press, 1986)), la descripción de la cual se incorpora en la presente como referencia. Se permite que las células crezcan en el medio de selección durante tiempo suficiente para formación de colonias y producción de anticuerpos. Esto habitualmente requiere 7 y 14 días. Los sobrenadantes de las colonias de hibridoma después se analizan para determinar la producción de anticuerpos que activan específicamente la proteína TLR3. Los pozos positivos para la producción de anticuerpo deseados se examinan para determinar si están presentes una o más colonias distintas. Si está presente más de una colonia, las células se pueden volver a clonar y se pueden hacer crecer para asegurar que únicamente una sola célula haya crecido en la colonia productora del anticuerpo deseado. Las células positivas con una colonia aparente única típicamente se vuelven a clonar y se vuelven a analizar para asegurar que únicamente se está detectando y produciendo un solo anticuerpo monoclonal.

Los hibridomas que se confirma son los productores de un anticuerpo monoclonal agonista de TLR3 después se hacen crecer en cantidades más grandes en un medio apropiado tal como DMEM o RPMI-1640. De manera alternativa, las células de hibridoma se pueden hacer crecer in vivo como tumores ascíticos en un animal. Después de crecimiento suficiente para producir el anticuerpo monoclonal deseado, el medio de crecimiento que contiene el anticuerpo monoclonal (o el fluido ascítico) se separa de las células y el anticuerpo monoclonal presente después se purifica. La purificación habitualmente se lleva a cabo por electroforesis en gel, diálisis, cromatografía utilizando proteína A o proteína G-Sepharose o un anticuerpo anti Ig de ratón unido a un soporte sólido tal como agarosa o esferas de Sepharose (todas descritas, por ejemplo, en el Antibody Purification Handbook, Amersham, Biosciences, publicación No. 18-1037-46, Edición AC, la descripción de la cual se incorpora en la presente como referencia) . El anticuerpo unido típicamente eluye de las columnas de proteína A/proteína G mediante el uso de amortiguadores de pH bajo (amortiguadores de glicina o de acetato de pH 3.0 o menores) con neutralización inmediata de las fracciones que contienen anticuerpo. Estas fracciones se acumulan, se dializan y concentran según se requiera. En algunas modalidades, el ADN que codifica para un anticuerpo que antagoniza para TLR3 se aisla del hibridoma y se coloca en un vector de expresión apropiado para transfección en un hospedador apropiado. El hospedador después se utiliza para producción recombinante del anticuerpo, variantes del mismo, fragmentos activos del mismo o anticuerpos humanizados o quiméricos que comprende la porción del anticuerpo que reconoce el antígeno. El ADN que codifica para los anticuerpos monoclonales de la invención se puede aislar y secuenciar fácilmente utilizando procedimientos convencionales (por ejemplo, mediante la utilización de sondas oligonucleotídicas que son capaces de unirse específicamente a genes que codifican para las cadenas pesada y ligera de los anticuerpos murinos) . Una vez aislado, el ADN se puede colocar en vectores de expresión los cuales después se transfectan en células hospedadoras tales como células de E. coli, células COS de simio, células de ovario de hámster chino (CHO) o células de mieloma que de otra manera no producen proteína inmunoglobulina, para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales en células hospedadoras recombinantes . La expresión recombinante en bacterias de ADN que codifican para el anticuerpo es bien conocido en el ámbito (véase, por ejemplo, Skerra et al. (1993) Curr. Op .

Immunol. 5:256; y Pluckthun (1992) Immunol . Revs . 130:151.

Los anticuerpos también se pueden producir por selección de bibliotecas combinatorias de inmunoglobulinas , como se describe, por ejemplo, en Ward et al. (1989) Nature 341:544. Los anticuerpos agonistas de TLR3 pueden ser anticuerpos de longitud completa o fragmentos o derivados de anticuerpo. Los ejemplos de fragmento de anticuerpo incluyen Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2 y fragmentos Fv; diacuerpos; moléculas Fv de cadena sencilla (scFv) ; polipéptidos de cadena sencilla que contienen únicamente dominio variable de cadena ligera o fragmentos de los mismos que contienen las tres CDR del dominio variable de cadena ligera sin una porción de cadena pesada asociada polipéptidos de cadena sencilla que contienen únicamente una región variable de cadena pesada o un fragmento del mismo que contiene las tres CDR de la región variable de cadena pesada, sin una porción de cadena ligera asociada; y anticuerpos multiespecífieos formados a partir de fragmentos de anticuerpo. Estos fragmentos y derivados y métodos de preparación de los mismos son bien conocidos en el ámbito. Por ejemplo, se puede utilizar pepsina para digerir un anticuerpo debajo de los enlaces disulfuro en la región de bisagra para producir F(ab) 12, un dímero de Fab el cual en sí mismo es una cadena ligera unida a VH-CH1 por un enlace disulfuro. El F(ab) '2 puede reducirse adicionalmente bajo condiciones ligeras para romper el enlace disulfuro en la región de bisagra, con lo que se convierte al dímero F(ab) '2 en un monómero Fab 1. El monómero Fab' es esencialmente Fab con una parte de la región de bisagra (véase Fundamental Immunology (Paul ed. , 3d ed. 1993)) . Aunque diversos fragmentos de anticuerpos se definen en términos de la digestión del anticuerpo intacto, una persona experta en el ámbito apreciará que estos fragmentos se pueden sintetizar de novo ya sea químicamente o mediante la utilización de metodología de ADN recombinante .

Un agonista de TLR3 de molécula pequeña puede ser una molécula orgánica de menos de aproximadamente 1500 Daltons. El diseño y selección (por ejemplo, a partir de una biblioteca combinatoria) o la síntesis de un agonista de TLR3 de molécula pequeña se puede obtener mediante el uso de la estructura de cristal conocida de TLR3 (Choe et al., Science. 309, pp . 581-85 (2005), la descripción de la cual se incorpora en la presente como referencia) . Este diseño o selección puede comenzar con selección de diversas porciones las cuales satisfacen uno o varios de los receptáculos de unión putativos en los cuales se unen los agonistas de ARN de hebra doble conocidos. Existen numerosas maneras para seleccionar porciones para llenar receptáculos de unión individuales. Estos incluyen inspección visual de un modelo físico o modelo de computadora del sitio activo dilucidado a partir de la estructura cristalina y anclaje manual de modelos de porciones seleccionadas en diversos receptáculos de unión. Un programa de generación de modelos que es bien conocido y está disponible en el ámbito se puede utilizar. Estos incluyen QUA TA [Molecular Simulations, Inc., Burlington, Mass., 1992], y SYBYL [Molecular Modeling Software, Tripos Associates, Inc., St . Louis, Mo . , 1992]. Esta etapa de generación de modelo puede ser seguida por minimización de energía con campos de fuerza mecánica molecular convencionales tales como CHARMM y AMBER (Weiner et al, J. Am. Chem. Soc . , 1984, 106, 765; Brooks et al., J. Comp . Chem. 1983, 4, 187). Además, existen numerosos programas de computadora más especializados para ayudar en el proceso de colocación de manera óptima ya sea de moléculas completas o fragmentos moleculares en sitios de unión del agonista de TLR3. Estos incluyen: GRID (Goodford, P. J. A. Computational Procedure for Determining Energetically Favorable Binding Sites on Biologically Important Macromolecules . J. Med. Chem. 1985, 28, 849-857). GRID está disponible de Oxford University, Oxford, Reino Unido; MCSS (Mariner, A.; Karplus, M. Funcionality Maps of Binding Sites: A Múltiple Copy Simultaneous Search Method. Proteins: Structure, Function and Genetics 1991, 11, 29-34) . MCSS está disponible de Molecular Simulations, Burlington, Mass; y DOCK (Kuntz, I. D.; Blaney, J. M. ; Oatley, S. J.; Langridge, R. ; Ferrin, T. E. A Geometric Approach to Macromolecule-Ligand Interactions . J. Mol. Biol . 1982, 161, 269-288). DOCK está disponible de University of California, San Francisco, California .

Una vez que se han seleccionado las orientaciones de unión, se pueden seleccionar moléculas completas para evaluación biológica. En el caso de fragmentos, se pueden ensamblar en un agonista único. Este ensamblado se puede llevar a cabo por conexión de diversas porciones al andamiaje central. El proceso de ensamblaje puede realizarse, por ejemplo, por inspección visual seguido por construcción de modelo manual, nuevamente utilizando un programa tal como Quanta o Sybyl . También se pueden utilizar muchos otros programas para ayudar a seleccionar las maneras de conectar las diversas porciones (Barlett et al., CAVEAT: A Program to Facilítate the Structure-Derived Design of Biologically Active Molecules . En "Molecular Recognition in Chemical and Biological Problems", Special Pub . , Royal Chem. Soc . 1989, 78, 182-196) . Además de la generación de modelos asistida por computadora anterior de los compuestos agonistas, se puede construir un agonista de TLR3 "de novo" utilizando un sitio de unión de agonista vacío de TLE3 u opcionalmente que incluya a unas porciones de un agonista conocido. Estos métodos son bien conocidos en el ámbito.

Muchas de las técnicas utilizadas habitualmente para generación de modelos para fármacos se pueden utilizar (para una revisión véase: Cohén et al., "Molecular Modeling Software and Methods for Medicinal Chemistry" , J. Med. Chem., 1990, 33, 883). De igual manera existen numerosos ejemplos en la literatura química de técnicas que se pueden aplicar a proyectos de diseño de fármacos específicos. Para una revisión véase: Navia, M. A. y Murcko, M. A., Current Opinions en Structural Biology, 1992, 2, 202. Algunos ejemplos de estas aplicaciones específicas incluyen: Baldwin, J. J. et al., J. Med. Chem., 1989, 32, 2510; Appelt, K. et al., J. Med. Chem., 1991, 34, 1925; y Ealick, S. E. et al., Proc. Nat . Acad. Sci. EUA. 1991, 88, 11540. Una alternativa a la generación de diseños o de modelos de agonistas de TLR3 de molécula pequeña es un cribado de las bibliotecas químicas de moléculas pequeñas existentes en búsqueda de agonistas de TLR3. Estas bibliotecas pueden ser analizadas por cualquiera de los análisis de agonistas de TLR3 conocidos en el ámbito que incluyen los que aquí se describen. Las bibliotecas de compuestos inicialmente pueden ser cribadas utilizando un análisis de mayor rendimiento tal como un análisis de competencia con un agonista de TLR3 marcado conocido tal como moléculas de ARN de hebra doble polyLpolyC o polyA:polyU. Los compuestos que son positivos en un análisis de competencia después se analizan adicionalmente para determinar su capacidad para activar TLR3 y provocar la cascada subsecuente de eventos bioquímicos.

Los agonistas de TLR3 basados en ácido nucleico comprenden una región de ácidos ribonucleicos de hebra doble. El término "de hebra doble" significa una porción del agonista en donde los ribonucleótidos están unidos a hidrógeno (pareados en bases) a ribonucleótidos complementarios para formar una estructura de hebra doble. Preferiblemente, la totalidad del agonista de TLR3 basado en ácido nucleico consiste de ribonucleótidos y ribonucleótidos modificados químicamente ("agonista de TLR3 ARNds"). De manera más preferible, por lo menos 50% del agonista de TLR3 ARNds está en una conformación de hebra doble bajo las condiciones in vivo. Incluso de manera preferida si por lo menos 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, ó 97% del agonista de TLR3 ARNds está en una conformación de hebra doble bajo condiciones in vivo. Para determinación del porcentaje del agonista de TLR3 ARNds que está en una conformación de hebra doble se obtiene dividir el número de nucleótidos que están pareados en bases entre el número total de nucleótidos en una molécula. De esta manera, una molécula pareada en bases que contiene dos nucleótidos sobresalientes en ambos extremos, 3' y 5 ' tendrán 42 nucleótidos que estén pareados en 12 bases y 4 nucleótidos que no estén pareados en bases, lo que constituye 42/46 ó 91.3% de hebra doble. De modo similar, una molécula constituida de dos cadenas de 21 nucleótidos que son complementarios entre sí en todos los nucleótidos excepto para los nucleótidos dentro de la parte media de cada cadena tendrán 38 (19 + 19) nucleótidos que están pareados en bases y 4 (2 + 2) que no están pareados en bases. Esta molécula será 38/42 ó 90.5% de hebra doble.

Una región de hebra doble de un agonista TLR3 ARNds se puede formar por región autocomplementaria de una molécula de AR única (por ejemplo, una estructura de tallo y bucle, tal como un ARN de horquilla o ARNsh) por dos moléculas de ARN que hibridizan entre sí en su totalidad o en parte (como en ARN de hebra doble) , o una mezcla de ambas (por ejemplo, una molécula parcialmente autocomplementaria de ARN y una segunda molécula de ARN que hibridiza a regiones en la primera que permanecen en forma de cadena sencilla después de la formación de la horquilla) . El agonista de TLR3 ARNds también puede comprender regiones de cadena sencilla tales como partes sobresalientes 3' y/o 5' en cualquiera de los extremos del agonista y/o estructuras "mal pareadas" o "de bucle saliente" dentro del agonista. En el caso de ARNsh, el agonista TLR3 ARNds es codificado por una secuencia de ADN presente sobre un vector de expresión. El vector de expresión es la molécula que es administrada al sujeto. El vector de expresión típicamente comprende un promotor que es activado por ARN polimerasa II o El y secuencias terminadoras , cada una de las cuales está unida operablemente a la secuencia codificante ARNsh para asegurar su transcripción adecuada.

Los promotores activados por AR polimerasa p incluyen, pero no se limitan a U6 , tAR val, Hl y versiones modificadas de los anteriores. Los promotores activados por ARN polimerasa III incluyen, pero no se limitan a CMV y EF la. En una modalidad, el promotor es un promotor inducible o un promotor específico de célula tumoral . Dentro del contexto utilizado en la presente, el término "agonista de TLR3 ARNds" designa cualquier compuesto de ARN terapéutica o profilácticamente eficaz que comprenda una región de hebra doble. Estos compuestos típicamente son activos por sí mismos; no codifican para un polipéptido y no requieren traducción para ser activos. Un agonista de TLR3 ARNds puede ser de cualquier longitud. Preferiblemente, un agonista de TLR3 ARNds tiene una longitud de por lo menos aproximadamente 10 pares de bases (pb, por sus siglas en inglés) , 20 bp, 30 bp, 50 bp, 80 bp, 100 bp, 200 bp, 400 bp, 600 bp, 800 bp ó 1000 bp . En un aspecto, el agonista de TLR3 ARNds es un ARNds corto que tiene una longitud de cadena de menos de 30 bp, 50 bp, 80 bp, 100 bp ó 200 bp . En otra modalidad, el agonista de TLR3 ARNds es un ARNds más largo, pero que tiene una longitud de cadena de menos de 400 bp, 600 BP, 800 BP ó 1000 BP. En otra modalidad, el agonista de TLR3 ARNds es un ARNds largo que tiene una longitud de cadena de más de 1000 bp . En un aspecto, un agonista de TLR3 ARNds es una composición que comprende una mezcla heterogénea de moléculas de ARNds, en donde la pluralidad de moléculas tienen longitudes diferentes. Preferiblemente, las moléculas de ARNds en esta composición tienen, en promedio, una longitud de aproximadamente 10 bp, 20 bp, 30 bp, 50 bp, 80 bp, 100 bp, 200 bp, 400 bp, 600 bp, 800 bp ó 1000 bp . En otra modalidad, la composición agonista de TLR3 ARNds comprende una pluralidad de moléculas de ARNds en donde por lo menos 20%, 50%, 80%, 90% ó 98% de moléculas de ARNds tienen una longitud de por lo menos 10 bp 20 bp, 30 bp, 50 bp, 80 pb, 100 pb, 200 bp, 400 bp, 600 bp, 800 bp ó 1000 bp por cadena. En un ejemplo, el ARNds es un ARNds corto que tiene entre 10 y 30, de manera más preferible entre 20 y 30 bp de cadena. En otro ejemplo, una composición agonista de TLR3 ARNds tiene una mezcla sustancialmente homogénea de moléculas de ARNds, en donde sustancialmente todas las moléculas en cada cadena no difieren en longitud de cadena en más de 30 bp, 50 bp, 100 bp ó 200 bp . La longitud de cadena promedio de agonistas de TLR3 ARNds en una composición se puede determinar fácilmente, por ejemplo, por cromatografía de permeación en gel. Una o más de las moléculas de ARNds dentro de estas composiciones opcionalmente es una molécula de ARNsi dirigida contra un antígeno de cáncer. Los ribonucleótidos en el agonista de TLR3 ARNds pueden ser naturales o sintéticos y pueden ser derivados o análogos modificados químicamente de nucleótidos naturales. Las modificaciones incluyen modificaciones estabilizantes y por lo tanto pueden incluir por lo menos una modificación en el enlace fosfodiéster y/o el azúcar y/o sobre la base. Por ejemplo, una o ambas cadenas de ARNds pueden incluir independientemente uno o más enlaces fosforotioato, enlaces fosforoditioato y/o enlaces metilfosfonato; modificaciones en la posición 21 del azúcar, tales como modificación 21 -O-metilo, modificaciones 2 ' -O-metoxietilo, modificaciones 2 ' -amino, modificaciones 2'-desoxi, modificaciones 21 -halo tales como 21 -fluoro; combinaciones de los anteriores tales como modificaciones 21 -desoxi-21 -fluoro; análogos de nucleótido acíclico y también se pueden incluir por lo menos un enlace fosfodiéster .

Los oligonucleótidos utilizados en el agonista de TLR3 ARNds también pueden incluir modificaciones o sustituciones en la base. Las bases modificadas incluyen otras bases sintéticas y como se encuentran de modo natural tales como 51 -metilcitosina (5-Me-C) , 5 -hidroximetil citosina, xantina, hipoxantina, 2 -aminoadenina, 6-metilo y otros derivados de alquilo de adenina e inosina, 2 -propilo y otros derivados de alquilo de adenina e inosina, 2-tiouracilo y 2 -tiocitosina, 5-halouracilo y citosina, 5 -propinil ( -C=C-CH3 ) uracilo y citosina y otros derivados de alquinilo de bases de pirimidina, 6-azo uracilo y citosina, 5-uracilo (pseudouracilo) , 4-tiouracilo, 8-halo, 8-amino, 8-tiol, S-tioalquilo, 8-hidroxilo y otras adeninas e inosinas 8-sustituidas, 5-halo, particularmente 5-bromo, 5 -trifluorometilo y otras 5-uracilo y citosinas 5-sustituidos, 5 -metilinosina y 7-metiladenina, 2-F-adenina, 2-amino-adenina, 8-azainosina y 8-azaadenina, 7 -desazainosina y 7 -desazaadenina y 3 -desazainosina y 3 -desazaadenina .

Otras modificaciones incluyen una capa 31 y/o 5 '-terminal, un enlace 3 '-5' terminal y un grupo fosfato 5 '-terminal o un grupo fosfato modificado. Los ejemplos de porciones de capa terminal incluyen, pero no se limitan a una porción abásica desoxi invertida, desoxi nucleótidos invertidos o una porción glicerilo. Además, una o ambas hebras (en un agonista de TLR3 ARNds de doble cadena) pueden ser o pueden incluir un concaténero que consiste de dos o más secuencias oligonucleotídicas unidas por uno o varios enlazantes. Todas estas modificaciones son bien conocidas en el ámbito (véase, por ejemplo, Kandimalla et al. ((2003) Nucí. Acid. Res. 31(9): 2393-2400). Estudios previos de ARN de hebra doble (ARNds) determinando su capacidad para ser inductores eficaces de interferón sugiere que los agentes de ARNds deben poseer la estructura secundaria de una hélice de hebra doble. Otros agentes de ARNds los cuales también se ha demostrado que son adecuados como agonista de TLR3 incluyen polinucleótidos de hebra doble los cuales no son complementarios o no perfectamente complementarios; se les ha conocido o se les ha denominado estructuras "mal pareadas" o "de bucle saliente" y existen en los ARN como se encuentran de modo natural tales como los ARNt de transferencia, ARN ribosómico y las estructuras secundarias de ARN viral. Un compuesto de ARNds mencionado comúnmente, Ampligen, comprende una estructura en donde algunas partes de citidina en la estructura poli LpoliC están sustituidas con uridina (es decir, ARN mal pareado) ; este compuesto se ha reportado que tiene actividad fisiológica similar a la poli lipoliC original. No obstante, se apreciará que los agonistas TLR3 de cualquier tipo y configuración se pueden utilizar de acuerdo con los métodos descritos. Generalmente, los polinucleótidos necesitan ser resistentes a nucleasas con el fin de permanecer como macromoléculas durante un período de tiempo suficiente; los polinucleótidos son menos sensibles a ataque de nucleasa cuando se encuentran en un complejo helicoidal. No obstante, algunos análogos tales como AmpligenMR parecen retener su actividad agonista de TLR3. En una modalidad particular, cada cadena de estos ARNds puede tener una longitud comprendida entre aproximadamente 5 y 50 bases, de manera más preferible entre 5 y 40, 35, 30, 25 ó 20 bases. Cada cadena, de modo preferible, es perfectamente complementaria entre sí. Los ejemplos preferidos de estos ARNds son los ARN de homopoli, tales como los ARNds en los cuales cada cadena comprende esencialmente una secuencia repetida de la misma base; o comprende una región homopoli ARN.

La base de tales cadenas homopoli ARN pueden ser cualquier base como se encuentran de modo natural (por ejemplo, poliA, poliU, poliC, poliG) o bases que no se encuentran de modo natural (por ejemplo, sintetizadas químicamente o modificadas) (por ejemplo, poliL) . Los polinucleótidos tipificados por ácido poliinosínico-policitidílico, es decir, poli(I) :poli(C) o poli LC y ácido poliadenílico-poliuridílico, es decir, poli (A) : poli (U) o poli A:U, son compuestos bien conocidos en el ámbito y se ha sabido que inducen producción de interferón por células inmunitarias . De este modo, en algunas modalidades, el agonista de TLR3 para uso de acuerdo con la invención es un ARN de hebra doble que se selecciona del grupo que consiste de: ácido poliinosínico y ácido policitidílico, ácido poliadenílico y ácido poliuridílico, análogo de ácido poliinosínico y ácido policitidílico, ácido poliinosínico y análogo de ácido policitidílico, análogo de ácido poliinosínico y análogo de ácido policitidílico, análogo de ácido poliadenílico y ácido poliuridílico, ácido poliadenílico y análogo de ácido poliuridílico y análogo de ácido poliadenílico y análogo de ácido poliuridílico. El término "análogo", como se utiliza en la presente significa cualquiera de las modificaciones de nucleótidos descritas en lo anterior. Se apreciará que los agonistas de TLR3 ADMds pueden comprender cualquier combinación de bases y se pueden diseñar utilizando cualquier método adecuado. Preferiblemente, el requerimiento básico de una región de hebra doble, estabilidad y resistencia al ataque de nucleasas y las preferencias para longitud de cadena deben de tomarse en consideración. Estas propiedades así como la actividad agonista TLR3 relativa de cualquiera de los agonistas de TLR3 AR ds se puede probar y determinar con referencia, por ejemplo, al complejo rAn:rUn o rIn:rCn. Se pueden tomar medidas para incrementar la estabilidad y resistencia a nucleasas o para incrementar u opcionalmente disminuir la acción inductora de interferón.

Otros ejemplos de ARNds incluyen ácidos nucleicos descritos en las patentes de E.U.A. Nos. 5,298,614 y 6,780,429. La patente de E.U.A. No. 5,298,614 describe que, cuando la longitud de los derivados de ácido nucleico de hebra doble se limita a ciertos intervalos, las sustancias resultantes presentan actividad fisiológica deseada con toxicidad notablemente menor, lo que proporciona polinucleótidos que tienen una longitud de aproximadamente 50 a 10,000 calculado por los números de pares de bases. También se describe derivados en donde el anillo purina o pirimidina en el polímero de ácido nucleico está sustituido con por lo menos un grupo SH, o el derivado contiene una unión disulfuro, o ambos (la relación preferida de número de átomos de azufre respecto a ácido citidílico presente en poli C es 1:6 a 39). La patente de E.U.A. No. 6,780,429 describe un tipo particular de compuestos ARNds que son "de cadena acortada" que tienen longitudes de aproximadamente 100 a 1,000 calculado por el número de pares de bases, o preferiblemente de 200 a 800 y de manera más preferible de 300 a 600. Estos últimos compuestos se reporta que contienen números bajos de uniones 2 '-5' fosfodiéster por un método diseñado para evitar grupos fosfato que provoquen rearreglo intramolecular desde la posición 3 ' a la posición 21 a través de un mecanismo denominado pseudo-rotación que simultáneamente se puede producir durante la hidrólisis de polinucleótidos, lo que resulta en una porción de uniones 3 '-5' fosfodiéster en la molécula polinucleótidica de cadena acortada que es sustituida por uniones 2' -5' fosfodiéster.

Otros agonistas de ácido nucleico que pueden ser adecuados para uso como agonistas de TLR3 se proporcionan en: Field et al: Proc . Nat . Acad. Sci. E.U. 58,1004, (1967); Field et al: Proc. Nat. Acad. Sci. E.U. 58,2102, (1967); Field et al: Proc. Nat. Acad. Sci. E.U. 61,340, (1968); Tytell et al: Proc. Nat. Acad. Sci. E.U. 58,1719, (1967); Field et al: J. Gen. Physiol. 56, 905 (1970); De Clercq et al: Methods in Enzymology, 78, 291 (1981). Se han descrito numerosos derivados sintéticos de ácido nucleico que incluyen complejos homopolímero-homopolímero (Polímero de ácido nucleico de hebra doble tal como aquellos los cuales poli I:C o poli A:U son las estructuras de origen, en donde estos complejos homopolímero-homopolímero contienen: (1) modificaciones de base, ejemplificadas por ácido poliinosínico-poli (ácido 5-bromocitidílico) , ácido poliinosínico-poli (ácido 2-tiocitidílico) , poli (ácido 7-desazainosínico) -ácido policitidílico, poli (ácido 7-desazainosínico) -poli (ácido 5-bromocitidílico), y ácido poliinosínico-poli (ácido 5 -tiouridílico) ; (2) modificaciones con azúcar, ejemplificados por poli (ácido 2 ' -azidoinosínico) -ácido policitidílico; y (3) modificaciones con ácido fosfórico, ejemplificadas por ácido poliinosínico-poli (ácido citidil-51 -tiofosfórico) . Otros derivados de ácido nucleico sintéticos que se han descrito incluyen copolímeros intercambiados, ejemplificados por poli (ácido adenílico-ácido uridílico) ; y complejos homopolímero-copolímero, ejemplificados por ácido poliinosínico-poli (ácido citidílico-ácido uridílico) y ácido poliinosínico-poli (ácido citidílico-ácido 4 -tiouridílico) . Otros derivados sintéticos de ácido nucleico que se han descrito incluyen complejos de ácido nucleico sintético con policatión, ejemplificados por el complejo de ácido poliinosínico-ácido policitidílico-poli -L-lisinacarboxi-metilcelulosa (denominado "poli ICLC"). Otro ejemplo adicional de derivado de ácido nucleico sintético es ácido poliinosínico-poli (l-vinilcitosina) .

Un ejemplo de un agonista TLR3 es AMPLIGENMR (Hemispherx, Inc., de Rockville, Md. , E.U.A.), un ARNds formado por complejos de ácidos polirriboinosínico y polirribocitidílico/uridílico tales como rIn:r(Cx,U o G)n en donde x tiene un valor de 4 a 29, por ejemplo, rIn:r(Cj2 U) n- . Se han estudiado muchos polímeros de ARNds mal pareados los cuales comparten similitud con AMPLIGENMR; los ARNds mal pareados basados en poli LC han incluido complejos de un poliinosinato y policitidilato que contiene una proporción de bases uracilo o bases guanidina, por ejemplo de 1 a 5 a 1 en 30 de estas bases. La ventaja terapéutica clave de los ARNds mal pareados con respecto a otras formas de ARNds naturales y/o sintéticos es una reducción reportada en toxicidad sobre compuestos tales como los descritos en la patente de E.U.A. 3,66,646. Los ejemplos específicos de ARN de hebra doble de acuerdo con la presente invención incluye nada más Poliadenur (Ipsen) y Ampligen (Hemispherx) . Poliadenur es una cadena de ARN poliA/U, es decir, contiene una cadena poliA y una cadena poliu. Poliadenur se ha desarrollado para el tratamiento potencial de infección por virus de hepatitis B (HBV) . A PLIGENMR es un compuesto polil/poliC (o una variante del mismo que comprende una molécula de ARN polil/poliC12U) . AMPLIGENMR se describe, por ejemplo, en los documentos EP 281 380 o EP 113 162. Se ha propuesto AMPLIGEN para el tratamiento de cáncer, infecciones virales y trastornos inmunitarios .

Fue desarrollado principalmente para el tratamiento potencial de encefalomielitis miálgica (ME, o síndrome de fatiga crónica/síndrome de disfunción inmunitaria y fatiga crónica, CFS/CFIDS) .

Un ejemplo particular de un AR ds para uso es un ARNds que comprende una región poliA/poliU, en donde cada cadena de ARNds contiene menos de 25 bases. Otro ejemplo particular de un ARNds para uso es un ARNds que comprende una región polil/poliC (U) , en donde cada hebra de ARNds contiene menos de 25 bases. Además, se han descrito los ARNds en la literatura o se pueden desarrollar, los cuales pueden ser utilizados dentro de los presentes métodos. De manera más general, se puede utilizar cualquier homopoliARN de hebra doble sintético, así como cualquier otro ARNds como se describe en la presente. En una modalidad, el ARNds es una molécula de poliA:poliU de hebra doble completa (por ejemplo de extremos romos; sin partes sobresalientes) que consisten de entre 19 y 30 pares de bases (por ejemplo, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ó 30 pares de bases) y que comprende entre 1 y 30 modificaciones estabilizantes y/o una capa 3' y/o 5'. La modificación estabilizante y las capas se describen en lo anterior y son bien conocidos en el ámbito. Las modificaciones estabilizantes y/o la presencia de una capa vuelven al ARNds más resistentes a degradación en suero. Las modificaciones estabilizantes incluyen enlaces internucleotídicos fosforotioato, 21 -desoxirribonucleótidos , 2 ' -O-metil ribonucléotidos , 2 ' -desoxi-2 ' -fluoro ribonucléotidos , nucleótidos de "base universal", nucleótidos "acíclicos", 5-C-metil nucleótidos y la incorporación de residuos glicerilo terminales y/o abásicos de desoxi invertidos. Se sabe que estas modificaciones químicas incrementan notablemente la estabilidad en suero de los compuestos ARNds. Un ejemplo de un ARNds estabilizado es el ARNi STEALTHMR (disponible comercialmente de Invitrogen, Carlsbad, CA USA) . Otro ejemplo de ARNds estabilizado es poli-ICLC (Hiltonol, producido por Oncovir) .

En otra modalidad, el agonista de TLR3 ARNds es una molécula de ARNsi o una molécula de ARNsh que está diseñada para hibridizar específicamente con el ARNm que codifica para el antígeno de célula tumoral u otra proteína involucrada en la proliferación de tumores. En esta modalidad, la molécula de ARNds juega un papel doble en el tratamiento de cáncer. Es tanto un agonista de TLR3 como un supresor de la expresión de un antígeno de tumor específico. Se ha demostrado que las moléculas de ARNsi y las moléculas de ARNsh están dirigidas contra proteínas celulares que presentan tanto supresión de gen dependiente de secuencia como efectos independientes de secuencia mediados a través de TLR3 (K. Kariko et al., J.

Immunol., 2004, 172: 6545-6549). Por lo tanto, se espera que las moléculas de ARNsi y ARNsh específicas para proliferación de antígeno o proliferación de tumor también sean agonistas de TLR3 en células cancerosas.

Ligandos de receptores similares a peaje 3 (TLR 1 a 9) alternativos, que también se sabe activan la vía NF-kB: Ha habido un total de 13 TLR3 identificados en mamíferos, que incluyen nueve (TLR1 a 9) que han sido estudiados extensamente y que se conoce que activan la vía NF-KB.

Los TLR activados reclutan moléculas adaptadoras dentro del citoplasma celular para iniciar la transducción de señal. Por lo menos cuatro moléculas adaptadoras MyD88, TIRAP (Mal) , TRIF y TRAM se sabe que están involucradas en la señalización.

La señalización de TLR se divide en dos vías de señalización distintas, la vía dependiente de MyD88 y la dependiente de TRIF. La respuesta dependiente de MyD88 se produce ante la dimerización del receptor TLR y se utiliza por cada TLR excepto TLR3. El efecto primario de la activación de MyD88 es la activación de NF-??. MyD88 (un miembro de la familia TIR) recluta IRAM cinasas IRAK 1, IRAK 2 e IRAK 4. Las cinasas IRAK fosforilan y activan la proteína de señalización TRAF6, la cual a su vez poliubiquitina la proteína TAK1, así como a sí misma con el fin de facilitar la unión de ???ß. Al unirse, TAK1 fosforila a ? ?ß, la cual después fosforila ??? provocando su degradación y permitiendo que NF-?ß entre al núcleo celular y active la transcripción.

Tanto TLR3 como TLR4 utilizan la vía dependiente de TRIF, la cual es activada, respectivamente, por ARNds y LPS. Para TLR3 , ARNds induce la activación del receptor, reclutando el adaptador TRIF. TRIF activa las cinasas TBK1 y RIP1. El complejo de señalización TRIF/TBK1 fosforila IRF3, promoviendo su entrada en el núcleo y la producción de las IFN tipo I. La activación de RIP1 provocan la poliubiquitinación y activación de TAK1 (vía conjunta con señalización MyD88 y transcripción de NF- ? similar a la vía dependiente de MyD88 de otra señalización TLR.

IV. Inhibidores de síntesis de prostaglandina Las prostaglandinas , particularmente las prostaglandina E2 (PGE2) , está involucrada en muchas funciones diversas fisiológicas y fisiopatológicas . Estos eicosanoides son producidos por la acción de la prostaglandina endoperóxido sintasa sobre ácido araquidónico . La actividad de prostaglandina endoperóxido sintasa se origina de dos isozimas distintas y reguladas de manera independiente, denominadas prostaglandina endoperóxido sintasa- 1 y prostaglandina endoperóxido sintasa- 2 y son codificadas por dos genes diferentes.

La prostaglandina endoperóxido sintasa- 1 se expresa de modo constitutivo y se considera que juega un papel fisiológico, particularmente en agregación plaquetaria, citoprotección en el estómago y regulación de la función renal normal. La prostaglandina endoperóxido sintasa-2 (PGE2) es la isozima inducible y la expresión de prostaglandina endoperóxido sintasa-2 es inducida por diversos agentes los cuales incluyen endotoxina, citosinas y mitógenos. De manera importante, la prostaglandina endoperóxido sintasa-2 es inducida in vivo en niveles significativos ante estímulos proinflamatorios .

Comúnmente se reportan en la literatura dos clases estructurales generales de inhibidores selectivos de prostaglandina endoperóxido sintasa-2. Además de la inhibición selectiva de prostaglandina endoperóxido sintasa-2 in vi tro, muchos de estos compuestos poseen potente actividad antiinflamatoria en el modelo de artritis inducido por adyuvante en rata junto con perfiles de seguridad excepcionales en comparación con los agentes antiinflamatorios existentes. Las clases estructurales incluyen las arilmetilsulfonas no ácidas tricíclicas (ejemplificadas por DuP 697 y SC 8092) y las sulfonamidas ácidas (ejemplificadas por Flosulide y NS-398) (figura 2) . La porción arilmetil sulfonilo en los compuestos no ácidos tricíclicos tales como SC 8092 pueden jugar un papel clave en la inhibición selectiva de prostaglandina endoperóxido sintasa-2 por estos compuestos dado que la reducción del grupo sulfona en SC 8092 al sulfuro correspondiente genera funcionalmente SC 8076, un inhibidor selectivo de prostaglandina endoperóxido sintasa-1.

Los inhibidores de PGE2 incluyen inhibidores de Cox-2. Los inhibidores de COX-2 adecuados para uso en la invención pueden incluir los siguientes compuestos o derivados de los mismos o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, o cualquier hidrato del mismo: rofecoxib, etoricoxib, celecoxib, valdecoxib y parecoxib. Una clase alternativa de compuestos inhibidores de Cox-2 para uso en la invención son la clase de inhibidores metano sulfonanilida de los cuales miembros ejemplares son NS-398, flosulida y nimesulida. Una clase adicional de inhibidores de COX-2 es la clase de inhibidores tricíclicos los cuales se pueden dividir adicionalmente en clases secundarias de inhibidores tricíclicos con un anillo carboxíclico central (los ejemplos incluyen SC-57666, 1 y 2; aquellos con un anillo heterocíclico monocíclico central (los ejemplos incluyen DuP 697, SC-58125, SC-58635, SC 236 y 3, 4 y 5); y aquellos con un anillo heterocíclico bicíclico central (los ejemplos incluyen 6, 7, 8, 9 y 10) . Los compuestos 3, 4 y 5 se describen en la patente de E.U.A. No. 5,474,995. Una clase adicional de inhibidores de COX-2 se puede denominar como aquellos los cuales son MAINE modificados estructuralmente .

Además de las clases estructurales, las clases secundarias y ejemplos de compuestos inhibidores de COX-2 específicos, los ejemplos de compuestos los cuales inhiben de modo selectivo ciclooxigenasa-2 también se han descrito en las siguientes publicaciones de patentes, la totalidad de las cuales se incorporan en la presente como referencia: patentes de E.U.A. Nos. 5,344,991; 5,380,738; 5,393,790; 5,409,944; 5,434,178; 5,436,265; 5,466,823; 5,474,995; 5,510,368; 5,536,752; 5,550,142; 5,552,422; 5,6 04,253; 5,604,260; 5,639,780; en las especificaciones de patentes internacionales Nos. 94/13635, 94/15932, 94/20480, 94/26731, 94/27980, 95/00501, 95/15316, 96/03387, 96/03388, 96/06480; y las publicaciones internacionales Nos. O 94/20480, WO 96/21667, WO 96/31509, WO 96/36623, WO 97/14691, WO 97/16435. Algunos de los compuestos anteriores también pueden ser identificados por los siguientes nombres químicos: 3: 3 -fenil (4-metilsulfonil ) fenil) -2- (5H) -furanona; 4: 3- (3,4-difluorofenil) -4- (4- (metilsulfonil) fenil) -2- (5H) -faranona; 5 : 5 , 5-dimetil-4- (4- (metilsulfonil ) fenil) -3- (3-fluorofenil) -H-furan-2-ona; 12: 5 , 5 -dimetil-4 - (4 - (raetilsulfonil ) fenil ) -3- (2 -propoxi) -5H-furan-2-ona; 13: 5-cloro-3- (4- (metilsulfonil) -fenil) -2- (2-metil-5-piridinil) -piridina; 14: 2- (3,5-difluorofenil ) -3- (4- (metilsulfonil ) fenil) -2-ciclopenten-l-ona; 15: 5 (S) -5 -etil -5 -metil -4 - (4 -metilsulfonil ) fenil ) -3 - (2 -propoxi) -5H-furan-2 -ona; 16: 5-etil-5-metil-4- (4- metilsulfonil) fenil) -3- (3 , 4-difluorofenil) -5H-furan-2-ona; 17 : 3 - ( (2-tiazolil) metoxi) -4- (4 -metilsulfonil ) fenil) -5,5-dimetil-5H-furan-2-ona; 18: 3-propiloxi-4- (4-metilsulfonil ) fenil) -5 , 5-dimetil-5H-furan-2-ona; 19: 3-(l-ciclopropiletoxi) -5 , 5 -dimetil-4- (4 -metilsulfonil ) fenil) -5H-furan-2-ona; 20: 2- (4-clorofenil) -3- (4 -metilsulfonil ) fenil) -4-oxo-2-pentenoato de sodio; 21: 3 - (ciclopropilmetoxi) -5 , 5-dimetil-4 (4 -metilsulfonil) fenil) -5H-furan-2-ona; 22: 3-( ciclopropilmetoxi) -5 , 5 -dimetil-4- (4 -metilsulfonil ) fenil -2 , 5-dihidrofuran-2 -ol ; 23: 33-isopropoxi-5, 5-dimetil-4- (4-metilsulfonil) fenil ) -2 , 5-dihidrofuran-2 -ol ; 24: 5,5-dimetil-3 - (3 -fluorofenil ) -2 -hidroxi -4 - (4 -metilsulfonil ) fenil ) -2,5-dihidrofuran; 25: 5 -cloro-3 - (4 -metilsulfonil ) fenil ) -2 -( 3 -piridinil ) piridina . Véase también la patente de E.U.A. No. 7,345,088, incorporada en la presente como referencia.

Los ejemplos de inhibidores de COX2 selectivos utilizados más comúnmente incluyen celecoxib, alecoxib, valdecoxib y rofecoxib.

Los ejemplos de los inhibidores COX1 y C0X2 no selectivos utilizados más comúnmente incluyen: ácido acetilsalicílico (aspirina) y otros salicilatos, acetaminofeno (Tylenol) , ibupropfeno (Advil, Motrin, Nuprin, Rufen) , naproxeno (Naprosyn, Aleve) , nabumetona (Relafen) o diclofenaco (Cataflam) .

V. Inhibidores de la. capacidad de respuesta de prostaglandina Los efectos clave, sorprendentes y promotores de tumor de las prostaglandinas son mediados por la activación de adenilato ciclasa, la elevación resultante de AMP cíclico (c) intracelular , PKA y la activación corriente debajo de la PKA/CREB.

Otro nivel de interferencia con la capacidad de respuesta PG incluye la interferencia con su unión a receptores de PG. En el caso de PGE2 , los dos receptores clave activadores de AMPc son EP2 y EP4, para los cuales existen numerosos inhibidores específicos.

El incremento de los niveles de AMPc inducido por prostaglandinas u otros factores se pueden evitar por fosfodiesterasa (PDE; actualmente se conocen 6 tipos, PDE1 a PDE5 y PDE10, los cuales reducen los niveles de AMPc intracelular) . Las PDE se pueden controlar por inhibidores de fosfodiesterasa los cuales incluyen sustancias tales como xantinas (cafeína, aminofilina, IBMX, pentoxifilina, teobromina, teofilina o paraxantina) , la totalidad de las cuales incrementan los niveles de AMPc intracelular y de manera más selectiva factores sintéticos y naturales que incluyen vinpocetina, cilostazol, inamrinona, cilostazol, mesembrina, rolipram, ibudilast, drotaverina, piclamilast, sildafenil, tadalafil, verdenafil o papaverina.

Adicionalmente , la interferencia con la señalización de PGE2 (o con la señalización de otros factores que elevan AMPc tales como histidina o agonistas beta-adrenérgicos) se puede obtener por la inhibición de señales corriente debajo de AMPc tales como PKA o CREB .

VI. Composiciones y métodos terapéuticos En la presente se describen métodos para prevenir o tratar cáncer y otras enfermedades que incluyen inflamación, autoinmunidad, rechazo de transplante y enfermedad de rechazo inverso o inserto versus hospedador (GvH, por sus siglas en inglés) . Los ejemplos de tipos de cánceres en los que se pueden aplicar los métodos descritos incluyen los siguientes, sin limitación: cáncer colorrectal, cáncer de pulmón, cáncer laríngeo, melanoma, cánceres cutáneos diferentes de melanoma, glioma, cáncer de ovario, cáncer de mama, cáncer endometrial, cáncer cervical, cáncer gástrico, cáncer esofágico, cáncer pancreático, cáncer biliar, cáncer renal, cáncer de vejiga, cáncer vulvar, cáncer neuroendocrino, cáncer de próstata, cáncer de vías respiratorias y digestivas altas, sarcomas de tejido suave, cáncer óseo, mesotelioma, cáncer de origen endotelial, cáncer maligno hematológico que incluye pero que no se limita a mieloma múltiple, linfornas, leucemias o una lesión premaligna que se sabe está asociada con un riesgo aumentado de desarrollar cáncer. Los métodos incluyen administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de agentes que incrementan la producción de IP10/CXCL10, MIG/CXCL9, RANTES/CCL5 y otras quimiocinas proinflamatorias . Estos métodos incluyen la administración de cantidades terapéuticamente eficaces de un agonista de receptor similar a peaje o activadores alternativos de la vía NF-??, combinado con la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de un inhibidor de la síntesis de prostaglandina o una señalización de prostaglandina dependiente de AMPc, con la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de un interferón, o ambos, lo que resulta en adyuvantes binarios o adyuvantes terciarios .

Una cantidad de un agente terapéutico se considera eficaz si, junto con uno o más agentes terapéuticos adicionales, inducen, la respuesta deseada, tal como disminución del riesgo de desarrollar cáncer o disminuir lo signos y síntomas de cáncer. En un ejemplo, es una cantidad de un agente necesario para evitar o retrasar el desarrollo de un tumor en un sujeto. En otro ejemplo, es una cantidad de agente necesario para evitar o retrasar la metástasis de un tumor, provocar regresión de un tumor existente o tratar uno o más signos o síntomas asociados con un tumor en un sujeto, tal como un sujeto que presenta melanoma o cáncer colorrectal . Idealmente, una cantidad terapéuticamente eficaz proporciona un efecto terapéutico sin provocar un efecto citotóxico sustancial en el sujeto. Las preparaciones que aquí se describen se administran en cantidades terapéuticamente eficaces.

En un ejemplo, una respuesta deseada es evitar el desarrollo de un tumor. En otro ejemplo, una respuesta deseada es retrasar el desarrollo, progreso o metástasis de un tumor, por ejemplo en por lo menos aproximadamente 3 meses, por lo menos aproximadamente seis meses, por lo menos aproximadamente un año, por lo menos aproximadamente dos años, por lo menos aproximadamente cinco años o por lo menos aproximadamente diez años. En un ejemplo adicional, una respuesta deseada es disminuir la presentación de cáncer, tal como cáncer colorrectal o melanoma. En otro ejemplo, una respuesta deseada es disminuir los signos y síntomas de cáncer tal como el tamaño, volumen o número de tumores o metastásis. Por ejemplo, en algunos ejemplos la composición puede disminuir el tamaño, volumen o número de tumores (tales como tumores colorrectales) en una cantidad deseada, por ejemplo en por lo menos 5%, por lo menos 10%, por lo menos 15%, por lo menos 20%, por lo menos 25%, por lo menos 30%, por lo menos 50%, por lo menos 75% o incluso por lo menos 90% en comparación con una respuesta en ausencia de la composición terapéutica.

Se proporcionan composiciones que incluyen uno o más de los agentes descritos en la presente que se describen en la presente en un portador. Las composiciones se pueden preparar en formas de dosificación unitaria para administración a un sujeto. La cantidad y sincronización de administración quedan a criterio del médico que suministra el tratamiento para obtener los propósitos deseados. El agente se puede formular para administración sistémica o local (tal como intratumoral ) . En un ejemplo, los agentes se formulan para administración parenteral tal como administración intravenosa.

Las composiciones para administración pueden incluir una solución de los agentes de uso disueltos en un portador farmacéuticamente aceptable tal como un portador acuoso o formulaciones biocompatibles de liposomas u otras vesículas biocompatibles u otras matrices y vehículos de liberación lenta. Se pueden utilizar una diversidad de portadores acuosos, por ejemplo, solución salina amortiguada y similares. Estas soluciones son estériles y generalmente están libres de material indeseable. Estas composiciones se pueden esterilizar por técnicas de esterilización convencionales bien conocidas. Las composiciones pueden contener sustancia auxiliares farmacéuticamente aceptables según se requiera para proporcionar condiciones fisiológicas tales como ajuste de pH y agentes amortiguadores, agentes de ajuste de toxicidad y similares, por ejemplo, acetato de sodio, cloruro de sodio, cloruro de potasio, cloruro de calcio, lactato de sodio y similares. La concentración de anticuerpo en estas formulaciones puede variar ampliamente y se seleccionará principalmente en base en volúmenes de fluido, viscosidades, peso corporal y similares, de acuerdo con el modo y administración particular seleccionado y las necesidades del sujeto.

Una composición farmacéutica típica para administración intravenosa incluye aproximadamente 0.1 a 10 mg de anticuerpo por sujeto al día. Se pueden utilizar dosificaciones de 0.1 hasta aproximadamente 100 mg por sujeto al día, particularmente si el agente se administra en un sitio aislado y no en el sistema circulatorio o linfático, tal como en una cavidad corporal o en el lumen de un órgano. Los métodos actuales para preparar composiciones administrables son conocidos o serán evidentes para aquellos expertos en el ámbito y se describen con mayor detalle en publicaciones tales como Remington's Pharmaceutical Science, 19th ed. , Mack Publishing Company, Easton, PA (1995) .

Los agentes tales como proteínas se pueden proporcionar en forma liofilizada y se rehidratan con agua estéril antes de administración, aunque también se pueden proporcionar en soluciones estériles de concentración conocida. La solución de proteína después se agrega a una bolsa de infusión que contiene cloruro de sodio 0.9%, USP y típicamente se administra en una dosificación de 0.5 a 15 mg/kg de peso corporal. Está disponible experiencia considerable en el ámbito en la administración de fármacos de anticuerpos los cuales han sido comercializados en los Estados Unidos desde la aprobación de RITUXANMR en 1997. Se pueden administrar agentes por infusión lenta, en vez de un bolo intravenoso. En un ejemplo, se administra una dosis de carga superior, con dosis de mantenimiento subsecuentes que se administran a un nivel menor. Por ejemplo, una dosis inicial de cargado de 4 mg/kg se puede suministrar por infusión durante un período de aproximadamente 90 minutos, seguido por dosis de mantenimiento semanales durante 4 a 8 semanas de 2 mg/kg suministrados por infusión durante un período de 30 minutos si la dosis previa ha sido bien tolerada .

Los agentes se pueden administrar para frenar o inhibir el crecimiento de células tales como células cancerosas. En estas aplicaciones, una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo se administra a un sujeto en una cantidad suficiente para inhibir el crecimiento, replicación o metástasis de células cancerosas o para inhibir un signo o un síntoma del cáncer, tal como melanoma o cáncer colorrectal . En algunas modalidades, los agentes se administran a un sujeto para inhibir o evitar el desarrollo de metástasis o para disminuir el número de micrometástasis tales como micrometástasis en nodulos linfáticos regionales (Goto et al., Clin. Cáncer Res. 14 (11) ¡3401-3407, 2008).

Una cantidad terapéuticamente eficaz de los agentes se utilizará dependiendo de la gravedad de la enfermedad y el estado general de la salud del paciente. Una cantidad terapéuticamente eficaz del agente cuando se administra a un sujeto que presenta cáncer colorrectal o melanoma es aquella que proporciona alivio subjetivo de uno o varios síntomas o una mejora identificable ob etivamente, como se observe por el médico u otro observador calificado. Estas composiciones se pueden administrar junto con otro agente quimioterapéutico, de manera simultánea o secuencial.

Actualmente se conocen en el ámbito muchos agentes quimioterapéuticos . Esto se puede administrar junto con los métodos descritos. En una modalidad, el agente quimioterapéutico se selecciona del grupo que consiste de inhibidores de mitosis, agentes alquilantes, antimetabolitos , antibióticos intercaladores , inhibidores de factores de crecimiento, inhibidores del ciclo celular, enzimas, inhibidores de topoisomerasa, agentes contra la supervivencia, modificadores de respuesta biológica, antihormonas, por ejemplo, antiandrógenos o agentes antiangiogénesis .

Las administraciones simples o múltiples de las composiciones se administran dependiendo de la dosificación y frecuencia según se requiera y sea tolerado por el paciente. Las dosificaciones se pueden administrar una vez pero se pueden aplicar periódicamente hasta que cualquiera de los resultados terapéuticos se obtenga o hasta que los efectos secundarios obliguen a suspensión del tratamiento. En un ejemplo, una dosis de los agentes se suministra por infusión durante treinta minutos cada tercer día. En este ejemplo, se pueden administrar aproximadamente 1 a aproximadamente diez dosis, tal como tres o seis dosis se pueden administrar cada tercer día. En un ejemplo adicional, se administra una infusión continua durante aproximadamente cinco a aproximadamente diez días. El sujeto puede ser tratado a intervalos regulares, por ejemplo mensualmente, hasta que se obtenga el resultado terapéutico deseado. Generalmente, la dosis es suficiente para tratar o disminuir los síntomas o signos de enfermedad sin producir toxicidad inaceptable al paciente.

La actividad óptima de fármacos con frecuencia requiere su administración prolongada y en el caso de administración combinada de diferentes fármacos puede requerir su administración en una secuencia específica. Ambos de estos requerimientos se pueden satisfacer por la aplicación de sistemas de suministro controlados, liberando uno, tres o más de los componentes del tratamiento con cinética similar o diferente, comenzando en el mismo punto en el tiempo o de modo secuencial.

Las formulaciones parenterales de liberación controlada se pueden producir como implantes, inyecciones oleosas o como sistemas particulados. Para una revisión amplia de los sistemas de suministro de proteínas véase Banga, A.J., Therapeutic Peptides and Proteins : Formulation, Processing, and Delivery Systems, Technomic Publishing Company, Inc., Lancaster, PA, (1995) incorporada en la presente como referencia. Los sistemas particulados incluyen microesferas , micropartículas , microcápsulas , nanocápsulas , nanoesferas y nanopartículas . Las microcápsulas contienen la proteína terapéutica tal como una citotoxina o un fármaco, como un núcleo central. En las microesferas la sustancia terapéutica se suministra en toda la partícula. Las partículas, microesferas y microcápsulas menores de aproximadamente 1 µp? generalmente se denominan como nanopartículas, nanoesferas y nanocápsulas respectivamente. Capilares con un diámetro de aproximadamente 5 µ?? de manera que únicamente las nanopartículas son administradas intravenosamente. Las micropartículas típicamente son de aproximadamente 100 µp? de diámetro y se administran por vía subcutánea o intramuscular. Véase, por ejemplo Kreuter, J. , Colloidal Drug Delivery Systems, J. Kreuter, ED., Marcel Dekker, Inc., Nueva York, NY, p . 219-342 (1994); y Tice & Tabibi, Treatise on Controlled Drug Delivery, A. Kydonieus, ed., Marcel Dekker, Inc. Nueva York, NY, pp, 315-339, (1992) ambas las cuales se incorporan en la presente como referencia .

Los polímeros se pueden utilizar para liberación controlada por iones de las composiciones descritas en la presente. Se conocen en el ámbito diversas matrices poliméricas degradables y no degradables para uso en el suministro controlado de fármacos (Langer, Accounts Chem. Res. 26:537-542, 1993) . Por ejemplo, el copolímero de bloques poloxámero 407, existe como un líquido viscoso aunque móvil a temperaturas bajas, pero forma un gel semisólido a temperatura corporal. Se ha demostrado que es un vehículo eficaz para la formulación de suministro sostenido de interleucina 2 -recombinante y ureasa (Johnston et al., Phar . Res. 9:425-434, 1992; y Pee et al., J. Parent . Sci. Tech. 44(2):54-65, 1990). De manera alternativa, se ha utilizado hidroxiapatita como un microportador para liberación controlada de proteínas (Ijntema et al., Int. J. Pharm. 112:215-224, 1994) . En otro aspecto adicional, se utiliza liposomas para liberación controlada así como direccionamiento de fármacos del fármaco encapsulado en lípido (Betageri et al., Liposome Drug Delivery Systems, Technomic Publishing Co., Inc., Lancaster, PA (1993)). Se conocen numerosos sistemas adicionales para suministro controlado de proteínas terapéuticas (véanse la patente de E.U.A. No. 5,055,303; la patente de E.U.A. No. 5,188,837; la patente de E.U.A. No. 4,235,871; la patente de E.U.A. No. 4,501,728; la patente de E.U.A. No .4 , 837 , 028 ; la patente de E.U.A. No. 4,957,735; la patente de E.U.A. No. 5,019,369; la patente de E.U.A. No. 5,055,303; la patente de E.U.A. No. 5,514,670; la patente de E.U.A. No. 5,413,797; la patente de E.U.A. No. 5,268,164; la patente de E.U.A. No. 5,004,697; la patente de E.U.A. No. 4,902,505; la patente de E.U.A. No. 5,506,206; la patente de E.U.A. No. 5,271,961; la patente de E.U.A. No. 5,254,342 y la patente de E.U.A. No. 5,534,496).

A menos que se explique en otro sentido, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente tienen el mismo significado al entendido comúnmente por una persona habitualmente experta en el ámbito al cual pertenece la descripción. Los términos singulares "un", "uno" y "el" incluyen referencias a las formas plurales a menos que el contexto claramente lo indique en otro sentido. De modo similar, la conjunción "o" se pretende que incluya al término "y" , a menos que el contexto claramente lo indique en otro sentido. Adicionalmente debe entenderse que todos los tamaños de base o todos los tamaños de aminoácido y todos los pesos moleculares o valores de masas moleculares, dados para ácidos nucleicos o polipéptidos son aproximados y se proporcionan para descripción. Aunque los métodos y materiales similares o equivalentes a los que aquí se describen se pueden utilizar en la práctica o la prueba de esta descripción, los métodos y materiales adecuados se describen a continuación. El término "que comprende" significa "que incluye". Todas las publicaciones, solicitudes de patente, patentes u otras referencias mencionadas en este documento se incorporan como referencia en su totalidad. En caso de conflicto, prevalecerá la presente especificación, incluyendo las explicaciones de los términos. Además, los materiales, métodos y ejemplos son únicamente ilustrativos y no se pretende que sean limitantes. VII. Ejemplos no limitantes La invención descrita se ilustra por los siguientes ejemplos no limitantes.

EJEMPLO 1 Células inmunitarias de tipo efector que expresan niveles altos de CCR5 y CXCR3 Hemos observado que la maduración de DC en presencia combinada de IFNa e IFNy resulta en el desarrollo de DC polarizados tipo 1 (DC1) estables con capacidad fuertemente elevada, en vez de "agotada" para producir IL-12p70 por estimulación subsecuente. La inducción de DC1 en nuestros protocolos originales depende de la presencia de suero bovino.

La adición de IFNa y poli-I:C (un análogo sintético e ARds con actividad inductora de IFNa) a nuestro protocolo básico de generación de DC1 ( IL- lp/TNFa/IFNy) sigue para el desarrollo de DC1 (es decir, aDCl) en un medio libre de suero clínicamente aceptable. Utilizando la sangre de melanoma y pacientes con cáncer colorrectal, observamos que DC1 induce expansión superior de los CTL productores de IFNy específicos para melanoma o para CRC, capaces de reconocer epítopos específicos de CRC o de melanoma definidos y las células tumorales relevantes (figura 1A a figura 1C) . Nuestros datos demuestran que los CTL inducidos por aDCl son funcionales también con respecto a su capacidad de destruir células cancerosas HLA-A2+ (figura IB) y muestran una expresión muy elevada (aproximadamente 10 veces) de los receptores de quimiocina relevantes para ecotaxia de tumor: CXCR3 y CCR5 (figura ID) . Además, hemos obtenido datos funcionales (en modelos policlonales) que muestran que las diferencias en la expresión de CKR entre los CTL cebados con aDCl y on sDC genera una capacidad de respuesta diferencial de CK (figura 1E) .

EJEMPLO 2 La expresión de quimiocinas que reclutan linfocitos T efectores (Teff) en muestras de tumor colorrectal se correlaciona con marcadores de linfocitos T CD8+ efectores mientras que loe niveles de COX2 se correlacionan estrechamente con la sobreexpresión de CK que atraen Treg y supresión de las CK que atraen Teff y marcadores de Treg.

Tumores no tratados recién obtenidos, que incluyen lesiones de melanoma y cáncer colorrectal muestran una expresión altamente heterologa de las quimiocinas "deseables" (ligandos de CCR5 y ligandos de CXCR3) y CCL22 "indeseables" (figuras 2A-2B) . De manera importante, incluso dentro del grupo de tumores del mismo tipo histológico (melanoma o CRC) y ubicación similar, diferentes muestras de tumor muestran heterogeneidad significativa con respecto a la expresión de las CK individuales. Aunque los números de las muestras disponibles es relativamente pequeño (lo que evita una comparación estadística formal entre lesiones primarias y metastásicas) , el CRC metastásico a hígado muestra una posible desviación hacia un patrón de CK bajo en Teff/alto en Treg (datos no mostrados) .

Estos datos sugieren que algunos tumores pueden ser capaces de evitar el ataque inmunitario excluyendo a los Terf (se ha demostrado que la infiltración de Teff predice la supervivencia libre de recaída a largo plazo en pacientes en los que se ha extirpado CRC) y atrae de manera preferencial células Treg en virtud de un patrón de producción de quimiocina particular. Además, implican que la sobreexpresión estandarizada de quimiocinas que atraen Teff en todas las lesiones de tumor pueden mejorar los resultados de respuestas antitumorales que surjan espontáneamente y pueden facilitar la inmunoterapia de cáncer mediante direccionamiento selectivo de células Teff a lesiones tumorales. Esto implica que las vacunas contra el cáncer que sean efectivas para inducir células inmunitarias de tipo efector deseables (que se sabe que expresan principalmente CXCR3 y CCR5) pueden ser capaces de inducir regresión de solo una parte de los tumores (aquellos que expresan ligandos para CXCR3 y CCR5) pero se puede necesitar una combinación con regímenes moduladores de CK, específicos de tumor, con el fin de inducir la regresión de tumores adicionales que no atraigan espontáneamente a células Teff, en vez de sobreexpresar CK que atraigan a Treg.

Utilizando material de tumor extirpado de 72 pacientes con cáncer colorrectal avanzado (metastásico en 68 pacientes) , observamos que la expresión local de dos marcadores de células Teff (CD8 y Granzyme B; GZMB) se correlaciona fuertemente con la expresión de dos quimiocinas que atraen Teff, CCL5 y CXCL10 (figura 3A) . En contraste, los marcadores de Treg FOXP3 y GITR se correlacionan con CCL22 (figura 3B) , un atrayente conocido de Treg. Se observaron correlaciones irregulares entre CXCL9 (ligando de CXCR3 alternativo) y marcadores de Teff y entre CCL22 y factor que induce CCL22 (22) COX2 (figuras 4A-4C) .

El análisis fenotípico de linfocitos que se infiltran en tumor CD8+ (TIL) obtenido a partir de pacientes con cáncer de colon mostró que la mayor parte de los TIL CD8+ son en realidad CCR5+ CXCR3+ y Granzyme B+ (no mostrados) , lo cual indica adicionalmente que la expresión intratumoral de los ligandos para CCR5 y CXCR3 es responsable de reclutar a linfocitos T efectores en el tumor.

EJEMPLO 3 Combinación de poli-I: C, IFNa e inhibidores de COX que incrementan selectivamente la producción de quimiocinas que reclutan Teff en tejidos de tumor y suprimen quimiocinas gue reclutan Treg.

Con el fin de probar la posibilidad de corregir el ambiente de quimiosina en tumores con relaciones bajas de quimiocinas que atraen a Teff respecto a Treg, se llevaron a cabo estudios piloto para determinar la factibilidad de modular su producción utilizando diferentes combinaciones de IFNa, indometacina (inhibidor de COX1/2) y poli-I :C en poblaciones individuales de células relevantes para tumores (que se sabe infiltran tumores) tales como macrófagos, o fibroblastos. Se observó una fuerte sinergia entre IFNa y poli-I:C en la inducción de CCL5 y CXCLIO, y un fuerte efecto supresor de IFNa en la producción de CCL22 en macrófagos y fibroblastos (figura 5A) . Estos secretos deseables se potenciaron adicionalmente en presencia de indometacina (figura 5B) .

Con el fin de probar la factibilidad de utilizar estos factores para manipular el complejo microambiente de los tejidos de tumor completos, que involucran todos los tipos de células anteriores y sus interacciones, se utilizó un sistema de cultivo de tumor ex vivo/ex plante de tejido desarrollado previamente para estudiar el desplazamiento de las DC. Este sistema nos permite evitar activación inespecífica de células productoras de quimiocina durante la disociación del tumor.

Como se muestra en las figuras 6A-6D, diferentes tejidos de tumor tratados con IFNOÍ O poli-I:C, solo, mostraron expresión de quimiocina variable, que se encuentra en tres patrones diferentes: inducción mínima de CCL5 y CXCL10; inducción mínima de CCL5 pero inducción significativa de CXCL10; o inducción significativa tanto de CCL5 como de CXCL10 (figura 6A) . Esta heterogeneidad se observó entre tumores de diferentes pacientes e incluso entre lesiones diferentes dentro de un paciente único (figura 6A y figura 6C) . No obstante, combinar IFNa y poli-I:C resulta en expresión uniformemente alta tanto de CCL5 como de CXCL10 en todos los tumores probados (figura 6A y figura 6C) .

Una exposición adicional a indometacina (lo cual bloquea C0X1 y COX2) incrementa aún más la producción de CCL5 y CXCL10 inducida por la combinación de IFNa y poli-I:C y niveles reducidos de CCL22 en tejido de tumor completo, con resultados similares obtenidos utilizando bloqueador selectivo de C0X2 (figura 6B y figura 6D) .

En base en estos datos, seleccionamos la combinación triple de IFNa, poli-I:C e indometacina como el tratamiento preferido para todos los experimentos subsecentes. Esta combinación incrementó de manera consistente la producción de CXCL10 y CCL5 y suprimió la produción de CCL22 en todas las muestras de tumor (figura 7) . También se realizaron observaciones similares en el caso de CXCL9 (datos no mostrados) .

La tinción doble para HLA-DR (inmunohistoquímica) y AR m para quimiocina (ISH) demostró que CCL22 se expresa de manera predominante en las APC HLA-DR+, mientras que CXCL10 y CCL5 se expresa en células tanto HLA-DR+ como HLA-DR" (no mostrado) , lo que indica la contribución de múltiples de células asociadas a tumor con la producción de quimiocinas que resultan Teff dentro del microambiente del tumor.

EJEMPLO 4 La activación mejorada de NF-?? asociada a tumor por el régimen modulador de quimiocina resulta en inducción selectiva o por lo menos preferencial de CXCL10 en tumores, en vez de en tejidos sanos marginales; factibilidad de modulación de quimiocina selectiva a tumor Utilizando muestras de tejido pareadas de 10 pacientes con cáncer de colon metastásico se comparó la capacidad de respuesta al régimen modulador de quimiocina entre tejidos de tumor metastásicos a hígado y tejidos marginales. Como se muestra en las figuras 8A-8D y en la figuras 9A-9C, aunque las diferencias de valores iniciales en la producción de quimiocina entre tumores metastásicos de hígado no tratados en tejidos hepáticos marginales no alcanzó significancia (P = 0.12), el tratamiento de tumor con la combinación de IFNa, poli-I:C e indometacina indujo una secreción mucho más pronunciada de CXCL10 por tejidos de tumor en comparación con los tejidos marginales (P < 0.01) . Se realizaron observaciones similares a nivel de expresión del gen para proteína y para quimiocina en el caso de CCL5. Esta capacidad de respuesta aumentada de tumores en comparación con tejidos marginales no es debido a supervivencia disminuida de los tejidos marginales, determinado por niveles de expresión no alterados de glucógeno fosforilasa (figura 9C) .

Esta selectividad inesperada de modulación de quimiocina también se observó en casos de lesiones de melanoma y piel sana adyacente, lo que demuestra la aplicabilidad general de nuestros resultados (figura 8D) .

Impulsado por el papel clave reportado previamente de NF-?? en la inducción de CXCL10 y otras quimiocinas y el mejoramiento ubicuo de la señalización de NF-?? en lesiones con cáncer críticamente necesaria para la supervivencia y crecimiento del tumor, se probó si las diferencias potenciales en la activación de NF-?? pueden ser responsables de la capacidad diferencial de los tumores versus tejidos marginales para responder al régimen modulador de quimiocina.

De acuerdo con esta posibilidad, observamos que los tejidos de cáncer colorrectal muestran no solo niveles de valor inicial elevados de activación de NF-?? (medido por la velocidad de su translocación nuclear (figura 8B) , sino incluso una capacidad más pronunciada para activar adicionalmente NF-?? después del tratamiento con iFNa/poli-I : C/indometacina (figura 8B, derecha). El papel clave de NF-?? en la producción de CXCL10 por tejidos de tumor se validó utilizando un inhibidor de NF-??, CAY10470, el cual suprime por completo la inducción de CXCL10 (figura 8C) .

La regulación de CCL5 mostró un patrón similar (regulación por aumento inducida por tratamiento en tumores, en vez de en tejidos marginales) y también estuvo bloqueada por CAY10470 (figura suplementaria S5B) , que muestra el papel general de la desregulación de NF- ? asociada a tumor en la inducción selectiva de quimiocinas que atraen Teff por el régimen modulador de quimiocina. CAY10470, optimizado en estos experimentos (a 20 µ?) no es tóxico, como se muestra por la expresión similar de AR m para glucógeno fosforilasa en tejidos no tratados y tratados (figura 9C) .

De manera interesante, nuestro análisis por microscopía confocal mostró que la mayor parte de las células que muestran translocación local de NF-?? y que produjeron CCL5 y CXCL10 representaron células inflamatorias que infiltran CD45+ y fibroblastos asociados a tumor, con una relación menor de células cancerosas CD326/EpCAM* , las cuales producen CCL5 (no mostrado) .

EJEMPLO 5 Tumores colorrectales tratados con IFNa/poli-I : C/indometacina atraen de manera preferencial linfocitos T CD8+ efectoras : factibilidad de atracción selectiva de tumor de los CTL que se producen de manera espontánea o inducidos por vacunación a lesiones tumorales, utilizando los métodos presentados de modulación de quimiocina.

Con el fin de demostrar que la modulación de quimiocina obtenida por la combinación de IFNa, poli-I:C e indometacina es en realidad suficiente para alterar la capacidad de tumores para atraer subconj untos diferentes de linfocitos T, utilizamos un análisis de quimiotaxia ex vivo que involucra sobrenadantes de tumores tratados de modo diferencial y sus linfocitos T CD8+ de infiltración de tumor expandido (TIL) o linfocitos T CD8+ efectores inducidos ex vivo policlonales , inducidos por aDCls cargado con superantígeno . Como se muestra desde la figura 10A hasta la figura 10B, ambos tipos de linfocitos T CD8+ efectores muestran capacidad de respuesta migratoria mejorada fuertemente de modo uniforme para la totalidad de los tumores tratados con IFNa/poli - I : C/ indometacina . En contraste, los linfocitos T CD4+FOXP3+ se desplazan de modo preferencial a tumores no tratados como se determina por el análisis Taqman de los linfocitos T CD4+ aislados en sangre desplazados (figura 10C) o por citometría de flujo (no mostrado) .

EJEMPLO 6 Factibilidad de elementos adicionales de direccionamiento de las vías de señalización NF-??, PGE2/AMPC e IFN.

Los mecanismos de la sinergia entre los moduladores de la prostaglandina, TLR y los sistemas de interferón en la regulación selectiva por tumor de diferentes clases de quimiocinas es probable que involucren diferencias locales en la actividad de COX2 y en la expresión del receptor PGE (EP1-4), infiltración diferente con células que expresan TLR3 así como la regulación de la expresión de TLR y la capacidad de respuesta, como se ejemplifica en la figura 11. La posibilidad de utilizar múltiples agonistas de TLR y activadores adicionales de NF-?? (que incluyen TNFOÍ) está soportado directamente por nuestros datos presentados en la figura 12.

EJEMPLO 7 Razonamiento para direccionamiento de elementos NF-KB, PGE2/AMPc y vías de señalización de IFN durante quimioterapia Los datos presentados en la figura 13 muestran una elevación indeseable de la relación entre quimiocinas que atraen Treg y que atraen Teff (relación entre CCL22/CXCL10) en tejidos de melanoma tratados por un agente quimioterapéutico melfalano y la inversión de estos efectos indeseables de quimioterapia por la combinación de celecoxib (inhibidor de C0X2), IFNOÍ y poli-I:C. Estos resultados proporcionan el razonamiento directo para la incorporación del presente método en el régimen quimioterapéutico aplicado a pacientes con cáncer y la incorporación de los factores presentados en la formulación de fármacos quimioterapéuticos (sistema de suministro combinado; formulaciones combinadas de enlace físico) .

VIII. Interpretación de los datos presentados en los ejemplos y discusión adicional Nuestros datos demuestran la factibilidad de modulación selectiva por tumor del ambiente de quimiocina, utilizando combinaciones clínicamente aplicables de factores farmacológicos y biológicos para corregir el equilibrio entre células Teff y Terg que se infiltran en tumor, dos tipos de células inmunitarias que se conoce que alteran diferencialmente el curso clínico del cáncer. De manera importante, para la aplicación clínica de esta estrategia, observamos que aunque la respuesta de las lesiones de tumor individuales (incluso en el mismo paciente) respecto a los moduladores de quimiocina individuales son altamente variables (consistente con la eficacia clínica limitada de estos factores aplicados individualmente) , la combinación de IFNOÍ , poli-I:C e inhibidores de ciclooxigenasa permiten un mejoramiento altamente consistente y selectivo de quimiocinas que atraen Teff (CCL5 y CXCL9-10) dentro de lesiones de tumor probadas, con la supresión uniforme concomitante de CCL22 local, la quimiocina que atrae Treg.

La producción inducida por IFNoí/poli-I : C/indometacina de quimiocinas que atraen Teff es altamente selectiva de tumor, lo que sugiere que incluso la administración sistémica de estos factores moduladores de quimiocina pueden dirigir de modo preferencial células efectoras a tumores. Aunque la atracción de diferentes subconj untos de linfocitos T a diferentes tipos de tumor se sabe que es regulado por una compleja red de quimiocinas adicionales no incluidas en nuestro análisis actual y que pueden ser sujeto de regulación a nivel de expresión de receptor de quimiocina, por ejemplo por polimorfismo de CCR5, nuestros datos funcionales actuales indican que el régimen propuesto puede promover de manera uniforme la entrada de linfocitos T CD8+ efectores (tanto los TIL que surgen de manera espontánea como los CTL inducidos por vacuna de OÍDCI) . El papel conocido de CXCR3 y CCR5 en la atracción de células Thl y células NK sugiere que el régimen propuesto también es capaz de promover la entrada de estos tipos adicionales de células deseables en tumores.

Observamos que la selectividad por tumor del régimen propuesto depende de la susceptibilidad de los fibroblastos asociados a tumor y células inflamatorias de infiltración (con menor relación de las células tumorales mismas) a hiperactivar no solo espontáneamente NF-?? sino que también responden al tratamiento con niveles mejorados adicionales de activación de NF-??. Puesto que la activación de NF-??, involucrada de manera critica en supervivencia y crecimiento de tumores representa un rasgo intrínseco de muchos tipos de tumores, los datos actuales sugieren que la modulación dirigida a NF-?? descrita actualmente del microambiente del tumor puede ser aplicable a múltiples tipos de cáncer.

Nuestro análisis realizado hasta ahora no mostró diferencia alguna entre la expresión del receptor IFNa, TLR3, IRF1 o IRF3 entre tumores y tejidos marginales (datos no mostrados) , pero nuestra investigación actual se enfoca sobre la regulación diferencial de cada una de las vías (capacidad de respuesta poli-I:C, IFNa y PGE2) en tejidos de tumor completos y diferentes tipos de células asociadas a tumor. Similarmente , también evaluamos los mecanismos subyacentes a la sensibilidad aumentada de células relacionadas con tumor para activar NF-?? y la heterogeneidad relativa de diferentes tumores con respecto al requerimiento de activación de poli-I:C, la cual puede ayudarnos a identificar estrategias nuevas de regulación de quimiocina y de direccionamiento NF-?? en el tratamiento contra tumores.

DESCRIPCION DE LAS MODALIDADES PREFERIDAS Lo siguiente es una descripción de algunas modalidades preferidas de un método de la modulación del implemento de tumores (u otro tejido de interés terapéutico), direccionamiento de los TLR (o los resultados de otros activadores de NF-?? conocidos) , sistema de prostaglandina/A Pc e interferones y señalización de interferón : Una modalidad preferida es la administración a un paciente con cáncer, una lesión precancerosa o cáncer tratado previamente, una cantidad terapéuticamente eficaz de por lo menos dos agentes diferentes que actúan de manera sinergística para inducir selectivamente la producción de quimiocinas que atraen células efectoras tales como IP-10 (CXCL10) y RANTES (CCL5) en tejidos de tumor (u otros tejidois afectados por la enfermedad) mientras se suprime o no tienen pacto sobre la producción de CCL22, la quimiocina conocida para atraer linfocitos T reguladores indeseables.

En caso de prevención de tratamiento de cáncer, algunos estados premalignos y muchas infecciones, una modalidad preferida de esta invención es una aplicación combinada de un ligando de TLR u otro activador de la vía NF-?? con un inhibidor de prostanoides (o con un inhibidor de receptores de prostaglandina y/o inhibidores de agentes que elevan AMPc alternativos o inhibidores de la señalización de AMPc) y con administración previa, concomitante o subsecuente de IFNa y/u otros interferones de tipo I o tipo II) con el fin de mejorar selectivamente la producción de quimiocinas que atraen Teff mientras se suprime la producción de quimiocinas que atraen Terg- En caso de prevención o tratamiento de los estados de enfermedad asociados con activación excesiva indeseable del sistema inmunitario (inflamaciones crónicas, algunos estados premalignos, fenómenos autoinmunes o rechazo de transplantes, que incluyen el rechazo de órganos, tejidos y células aisladas transplantadas que incluyen rechazo de transplantes y enfermedad de rechazo inverso (GvH) ) , una modalidad preferida de esta invención es una aplicación combinada de un ligando de TLR u otros activadores de las vías de NF-?? con prostanoides u otros agentes que elevan AMPc (y con uso adicional potencial de inhibidores de producción de IFN o capacidad de respuesta a IFN) con el fin de mejorar selectivamente la producción de quimiocinas que atraen Treg mientras se suprime la producción de quimiocinas que atraen Teff .

En algunas modalidades se proporcionan métodos para tratar cáncer o evitar la presentación o recurrencia de cáncer en un sujeto que incluye administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un inhibidor de prostaglandina u otro agente que suprime AMPc que incremente la producción de ??-10/CXCLlO y que inhiba la producción de MDC/CCL22 y una cantidad terapéuticamente eficaz de un agonista receptor similar a peaje (TLR) .

En otras modalidades se proporcionan métodos para tratar cáncer o prevenir la presentación o recurrencia de cáncer en un sujeto al administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un interferón o un agente que incrementa la actividad de IP-10 y una cantidad terapéuticamente eficaz de un inhibidor de síntesis de prostaglandina, por lo que se trata o evita cáncer colorrectal en el sujeto.

Una modalidad de esta invención es administrar al sujeto en cantidades terapéuticamente eficaces de (1) un agonista de receptor similar a peaje (TLR), combinado con (2) un bloqueador de síntesis de prostaglandina, un bloqueador de receptor de PGE2 o un bloqueador de señalización de AMPc y/o (3) cantidades terapéuticamente eficaces de un interferón, aplicado simultáneamente o secuencialmente , utilizando un sistema de suministro común o una combinación de sistemas de suministro lo que permite la liberación de cada uno de los factores con cinéticas diferentes.

Otra modalidad de esta invención es administrar al sujeto en cantidades terapéuticamente eficaces de una molécula compleja que incorpora: (1) un agonista de receptor similar a peaje (TLR) , (2) un bloqueador de la síntesis de prostaglandina, un bloqueador de receptor de PGE2 o un bloqueador de señalización de AMPc y/o (3) un interferón o un agonista del receptor de interferón tipo I o tipo II (un anticuerpo o una molécula pequeña) . Una modalidad relacionada es la aplicación de los dos o tres de los factores anteriores utilizando un medio común (emulsión, liposomas, nanovesículas , matriz de liberación lenta, un material poroso) .

Otra modalidad de esta invención es administrar al sujeto en cantidades terapéuticamente eficaces de una molécula compleja que incorpora: (1) un agonista de receptor similar a peaje (TLR) , (2) un bloqueador de síntesis de prostaglandina, un bloqueador de receptor PGE2 o un bloqueador de señalización de AMPc, y/o (3) un interferón o un agonista del receptor de interferón tipo I o tipo II (un anticuerpo o una molécula pequeña) de manera secuencial o simultánea a través del mismo catéter.

Otra modalidad de esta invención es administrar al sujeto en cantidades terapéuticamente eficaces de una molécula compleja que incorpora: (1) un agonista de receptor similar a peaje (TLR), (2) un bloqueador de síntesis de prostaglandina, un bloqueador de receptor PGE2 o un bloqueador de señalización de AMPc y/o (3) un interferón o un agonista del receptor de interferón tipo I o tipo II (un anticuerpo o una molécula pequeña) , de manera secuencial o simultánea utilizando una bomba implantable o dos más bombas .

Puesto que no solo las células efectoras específicas de tumor que surgen espontáneamente (o células efectoras contra agentes infecciosos) sino también células efectoras específicas de tumor inducidas por diferentes vacunas contra el cáncer que incluyen a-DCls u otro tipo de DCs polarizadas tipo 1 (tales como las inducidas por la combinación de LPS e IFNy o por la combinación de TNF e IFNY) , expresan niveles altos de CCR5 o CXCR3 sobre linfocitos T específicos de tumor, la inducción selectiva de tumor de ligandos CCR5 y/o ligandos CXCR3 en tejidos de tumor puede ser particularmente eficaz en combinación con la aplicación de estas vacunas.

En caso de prevención o tratamiento de las enfermedades asociadas con la hiperactivación indeseable del sistema inmunitario (inflamaciones crónicas, algunos estados premalignos, fenómenos autoinmunes o rechazo de transplantes que incluyen el rechazo de órganos, tejidos y células aisladas transplantadas que incluyen rechazo de transplante y enfermedad de rechazo inverso (GvH) ) , una modalidad preferida de esta invención es la aplicación combinada (concomitante o secuencial) de ligandos de TLR u otros activadores de las vías de NF-?? con prostanoides u otros agentes que elevan AMPc (y con inhibidores potenciales de producción de IFN o con capacidad de respuesta de IFN) utilizando un medio común (emulsión, liposomas, nanovesículas , matriz de liberación lenta, un material poroso) , el mismo catéter, una bomba implantable o varias bombas, o en forma físicamente enlazada.

Además, las modalidades de la invención actual también incluyen: Tratamiento selectivo de tumor (preferencial para el tejido de tumor, en vez de tejidos sanos), modulación de quimiocina como un tratamiento autosustentable para reforzar la inmunidad que se presenta de manera natural contra cáncer o infecciones.

Modulación de quimiocina selectivo para tumor como una manera de reforzar la capacidad de linfocitos T inducidos por vacunación (o linfocitos T transferidos de manera adoptada) contra cáncer o agentes infecciosos para entrar en tejidos tumorales y mediar regresión del cáncer o estabilización .

Modulación de quimiocina específica de patógeno (que coincide con el tejido afectado por patógeno) y selectiva de tumor (referencial por el te ido afectado, en vez de tejidos sanos) como tratamiento autosustentable para reforzar la inmunidad como se produce de manera natural contra infecciones.

Enfoques recíprocos que tienen como objetivo el reforzar la infiltración de Terg y la supresión de las CK que atraen a los Teff se pueden aplicar al transplante, enfermedad autoinmunes o algunos procesos inflamatorios.

Será evidente que los detalles precisos de los métodos o composiciones descritos pueden variar o modificarse sin por esto apartarse del espíritu de la invención descrita. Se reivindica la totalidad de tales modificaciones y variaciones que se encuentran dentro del alcance y espíritu de las reivindicaciones siguientes.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (3)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :

1. Una composición caracterizada porque incluye uno o más agentes que se seleccionan de: (1) un activador de NF- ? O un agonista de TLR, (2) un bloqueador de síntesis de prostaglandina o un bloqueador de capacidad de respuesta de prostaglandina, (3) un interferón, y combinaciones de los mismos en una dosificación unitaria eficaz para tratar o evitar cáncer en un sujeto que recibe tratamiento con el agente como parte de una combinación de (1) , (2) y (3) .

2. Una composición caracterizada porque incluye uno o más agentes que se seleccionan de (1) un activador de NF-?? o un agonista de TLR, (2) un bloqueador de síntesis de prostaglandina o un bloqueador de capacidad de respuesta de prostaglandina y combinaciones de los mismos en una dosificación unitaria eficaz para tratar o evitar cáncer en un sujeto que recibe tratamiento con el agente como parte de una combinación de (1) y (2) .

3. Una composición caracterizada porque incluye uno o más agentes que se seleccionan de (1) un activador de NF-?? O un agonista de TLR, (2) un interferón, y combinaciones de los mismos en una dosificación unitaria eficaz para tratar o evitar cáncer en un sujeto que recibe tratamiento con el agente como parte de una combinación de (1) y (2) .