CN103889453A - 肿瘤选择性趋化因子调节 - Google Patents

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Abstract

本申请公开了有效治疗和预防癌症以及其他疾病的疗法。这些方法包括给予治疗有效量的试剂，所述试剂增加肿瘤病灶中效应细胞吸引趋化因子的局部生成，同时伴随抑制吸引调节T(reg)细胞的不需要的趋化因子的局部生成。这些方法包括给予主体治疗有效量的Toll样受体(TLR)激动剂或其他NF-κB通路的激活剂与前列腺素合成阻断剂或前列腺素信号阻断剂的组合、与I-型干扰素的组合，或者同时与前列腺素合成或信号阻断剂和I-型干扰素的组合，从而治疗或预防癌症或传染性疾病。或者，所述方法来自相同的范例，但是旨在用于治疗或预防自身免疫性疾病、慢性炎性疾病、移植排斥或GvH，所述方法包括Toll样受体(TLR)激动剂与前列腺素或其他cAMP激活剂的组合。

Description

肿瘤选择性趋化因子调节
优先权声明
本申请要求2011年7月22日提交的美国临时申请号61/510，855的优先权，其通过引用并入本申请。
政府支持的声明
本发明是在由美国国立卫生研究院提供的基金1PO1CA132714的美国政府支持下完成的，美国政府对本发明享有一定的权利。
技术领域
本申请涉及肿瘤治疗领域，包括治疗癌症、预防癌症发生或预防癌症复发的方法。此外，所述方法可以用于治疗感染性疾病、自身免疫性疾病、过敏和炎症，以及治疗或预防移植排异和移植相关病症。
背景技术
仅在美国每年就有无数人出现癌前病变，这是一种新生瘤，如下文所讨论的。这种病变显示出较强的发展成恶性肿瘤或癌症的趋势。这种病变包括乳腺病变(能够发展成乳腺癌)、皮肤病变(能够发展成恶性黑色素瘤或基底细胞癌)、结肠腺瘤性息肉(能够发展成结肠癌)、宫颈上皮癌前病变(能够发展成宫颈癌)和其他类似的肿瘤生成。能够阻止癌前病变或诱导现有的癌前病变、癌病变、或癌缓解，或者在通过手术、化疗、放疗和生物治疗后能够阻止或延迟其复发的化合物可大大减少癌症导致的疾病和死亡。
举例来说，每年约有60，000人死于结肠癌，并且有超过150，000个结肠癌新增病例被检查出。将美国人群作为一个整体，个体具有6％的生成结肠癌的终生风险，这使其成为在该国第二流行的癌症。结肠癌还盛行于西欧。据信饮食中脂肪消耗的增加使得在日本的结肠癌的风险增加。
到目前为止，从过去的几十年中，五年生存率未发生改变或仅有较小改变来看，在预防和治疗晚期癌症包括结直肠癌、卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌、肺癌、头颈癌、子宫癌、脑癌、胰腺癌、肾癌、血液系统恶性肿瘤和黑色素瘤方面没有取得什么进展。对于这种癌症唯一的治愈方法是在极早期阶段进行手术。不幸的是，这些癌症中的大部分均发现的太晚以至于无法通过手术治愈。在很多病例中，患者在发展成恶性阶段之前并不会表现出症状。
CD8+T细胞浸润癌症病灶的能力对于抗肿瘤免疫是必不可少的，正如在多种类型的癌症(包括截直肠癌(CRC)，卵巢癌和黑色素瘤)中的研究证明凸显了效应T细胞(Teff)的预后价值。而相反的是，调节T细胞(Treg)对不同类型癌症的浸润预后效果不良。趋化因子及其各自的受体是T细胞迁移和归巢的关键。
几组数据表明不同群体的趋化因子(CK)或优先吸引促炎免疫细胞：效应T(eff)细胞(CTL，Th1细胞)和NK细胞，其在癌症和慢性感染中是有益的；或优先吸引调节T(reg)细胞，据信其在癌症和慢性感染中是有害的。促炎免疫细胞表达高水平的CXCR3和CCR5(分别针对CXCR9、CXCR10、CXCR11，和CCL3、CCL4及CCL5的趋化因子受体，及CCL5)，而Treg表达高水平的CCR4和CXCR4。Treg优选表达CCR4(CCL17和CCL22的受体)、CXCR4(CXCL12的受体)和CCR6(CCL20的受体)。
肿瘤组织中CCL5/RANTES(CCR5配体)和CXCL9/MIG和CXCL10/IP10(CXCR3的配体)的水平升高与CD8+T细胞在CRC、黑色素瘤和胃癌中的浸润增强相关。而与CCL5和CXCL9-11在肿瘤内表达的益处相反的是，在卵巢癌患者中，CCR4配体优先吸引Treg，这可能与存活率降低相关。在CXCL12和CCL22依赖性机制中，癌症的进展被认为与功能性CTL的缺乏以及骨髓来源的抑制细胞(MDSC)和调节T细胞(Treg)的累积相关。这些因素表明有效的癌症免疫疗法可能需要涉及体外诱导的CTL的接种或过继转移以修复局部的免疫监视。我们此前己经证明了在OvCa中MDSC是PGE2和其他抑制因子的主要来源，并且EP2和EP4介导的PGE2增强COX2表达的能力导致PGE2与PGE2合成主要的调节因子COX2之间形成正反馈，这是在OvCa环境中维持MDSC的抑制功能所需的。而且，我们最近报道了PGE2诱导的SDF1/CXCL12的生成和CXCR4的表达可能有助于MDSC在OvCa腹水中的局部累积和贮留。类似地，较高数量的Treg细胞，另一种类型的抑制性免疫细胞，和较低的CTL/Treg比率也被证明是癌症患者的不良预后因素。CCL22在向OvCa吸引表达CCR4的Treg中的关键作用，CCL22的不良预后值以及我们得到的PGE2是主要的CCL22诱导因子的观察结果均暗示了在癌症环境中限制PGE2的生成可能通过减少Treg的内流而具有治疗价值。通过EP2和EP4受体发挥作用的PGE2，还能够促进Treg的产生。此外，我们和其他人己经发现PGE2能够削弱DC与天然的、记忆和效应细胞之间的相互作用，同时促进其与Treg之间的相互作用。PGE2还参与调节Treg的抑制性活性。
人黑色素瘤的T细胞浸润水平被认为是黑色素瘤存活率的一个独立预后因素，表现出与CXCR3配体；CXCL9和(较少量生成的)CXCL10的表达水平的最强相关性。由肿瘤浸润性巨噬细胞产生的CXCL9在原发性黑色素瘤病变而非转移组织中特别有效，这增加了原发性和转移性肿瘤会差异性调节浸润APC细胞中CK生成的可能性。与证明T细胞表达的CXCR3与长期存活率相关的数据相一致的是，这些数据表明CXCR3配体构成了能够使T细胞进入黑色素瘤的重要CK，同时使得在疫苗诱导的T细胞表面被诱导生成的CXCR3和在非浸润性肿瘤灶中诱导生成的CXCR3配体成为癌症免疫治疗中有趣的靶点。
与临床研究类似，在小鼠中进行的研究也显示大部分的抗肿瘤活性与L-选择素低-表达的T细胞相关，并且一些研究团体最近己证实肿瘤相关趋化因子在肿瘤排斥中具有重要作用。己在小鼠腺癌、P815肥大细胞瘤、不同的小鼠乳腺癌模型和淋巴瘤模型中利用腺病毒转染或直接注射趋化因子的方法证实了CCL3(MIP1α，CCR1和CCR5的配体)、CCL7(MCP3；CCL1、CCL2、CCL3的配体)、CCL16(LEC；CCR1的配体)、CCL19(MIP3β；CCR7的配体)和CXCL11(ITAC：CXCR3配体)的抗肿瘤活性。己发现转导了XCL1(淋巴细胞趋化因子；XCR1的配体)的DC对B16黑色素瘤显示出更好的治疗效果。在SP2/0骨髓瘤模型中，也显示了直接使用CXCL1(淋巴细胞趋化因子；CXCR1的配体)转染骨髓瘤细胞可诱导由CXCR1阳性的CD4+和CD8+T细胞介导的肿瘤排斥。Keshaw和他的同事发现黑色素瘤频繁表达CXCL1(Gro-α)，并尝试通过将该趋化因子的受体(CXCR2)转染至T细胞以增强癌症免疫疗法的疗效。
尽管不同肿瘤类型对不同亚类的T细胞的吸引己知是由多种趋化因子组成的复杂网络调节的，但是我们目前的功能数据(参见详述和附图部分)显示旨在在所有肿瘤病变中一致地增强肿瘤相关的CXCR3配体和CCR5配体的疗法能够促进效应CD8+T细胞的内流(自发产生TIL和由癌症疫苗诱导；包括被认为可增加CCR5和CXCR3在肿瘤特异性CTL上的表达的αDC1疫苗)。CXCR3和CCR5在吸引Th1细胞和NK细胞上的己知作用表明这种疗法还能够促进这些其他类型的所需细胞进入肿瘤。
由于不仅仅是自发产生的肿瘤特异性效应细胞，而且不同的癌症疫苗(包括α-DC1或其他类型的1型极化DC(如由LPS和IFNγ联合诱导生成的或者由TNFα和IFNγ或TNFα和IL-1β和IFNγ联合诱导生成的))诱导的肿瘤特异性效应细胞，也在肿瘤特异性T细胞上表达高水平的CCR5或CXCR3，因而通过结合这些疫苗的使用也许可以特别有效地诱导在肿瘤组织中生成CCR5配体和/或CXCR3配体。
尽管在过去的15年中己经发现不同的T细胞亚类具有不同的归巢性质，但是一系列最新研究显示DC在这方面具有关键作用。从派伊尔氏淋巴集结(Peyers’Patches)分离或经类维生素A处理的DC显示出能够在天然的T细胞中诱导肠归巢性质的能力。类似地，最近发现迁移的APC负责使T细胞具有归巢中枢神经系统的能力。在人黑色素瘤特异性T细胞的迁移能力可能受到DC相关因素的影响(“信号4”的传递)这一观点的支持下，己经发现全身性使用IL-12对患者进行治疗能够诱导功能性CLA(皮肤归巢受体；皮肤内皮表达的ELAM的配体)的表达增加和效应CTL向皮肤中转移性黑色素瘤病变部位的迁移增加。事实上，Ogg和他的同事发现白癜风患者的CTL上的CLA表达水平较高，这使得这些细胞能够有效的进入皮肤并启动对黑色素细胞的杀伤。Berger和他的同事最近报道了接种单核细胞衍生的DC能够诱导生成可归巢至皮肤和内脏的黑色素瘤特异性T细胞。
然而，涉及T细胞的过继性转移的通过调节趋化因子模式以促进效应T细胞进入肿瘤从而增强肿瘤免疫治疗疗效的可能性尚未被探讨。同样的，到目前为止，尚没有研究报道通过调节肿瘤部位趋化因子的模式促进在患者中由疫苗诱导的或自发产生的效应类型T细胞进入肿瘤进而达到增强癌症免疫治疗疗效的可能性。
NF-κB的过度活化是多种类型癌症组织的一个共同特征。通常由多种Toll样受体(TLR；其中包括双链RNA受体TLR3)的配体，以及多种其他促炎性刺激因子包括TNFα或IL1β激活的NF-κB信号传导是诱导Treg和Teff吸引类型的趋化因子所需的重要条件。然而，到目前为止尚不知晓如何利用NF-κB信号传导的模式并且对其进行调节以使其选择性或至少优选在肿瘤组织而非边缘组织中增强Teff吸引的趋化因子的产生以便选择性地将Teff细胞直接导向肿瘤。
此前若干研究己证实IFN和TLR具有促进Teff招募的趋化因子(包括CCR5-和CXCR3的配体)生成的能力。另一方面，此前己发现CRC和其他肿瘤过度生成的并与不良预后相关的因子PGE2抑制这种Teff吸引的CK并且促进Th2/Treg募集CK。然而，这些不同群组的炎性因子在原发性和转移性癌症组织中是否影响Teff吸引CK与Tref吸引CK生成比例的平衡，在这些因子中是否有某些因子展现出任意的协同活性，以及是否可能应用CK调节因子的某些组合以选择性增强Teff吸引CK的生成(但不增强Treg吸引CK的生成)以及如何确保将这种作用选择性作用于肿瘤组织(而非健康组织)以便将所需类型的免疫细胞聚焦在疾病部位。
我们目前的数据提供了这种可能性，即证实现肿瘤微环境不仅仅自发地过度活化NF-κB，而且还会通过进一步增强NF-κB的活性来对预定的治疗方法进行应答。由于在肿瘤存活和生长中起关键作用的NF-κB的活化，代表了多种肿瘤类型的固有特征，因此现有数据提示目前所描述的NF-κB对肿瘤微环境的靶向调节可以适用于多种类型的癌症。
在癌症背景下效应免疫细胞优选的活化据信是有益，与此相反的是，在慢性炎症、自身免疫性疾病、移植排斥或骨髓移植后的移植物抗宿主病背景下，据信效应器免疫细胞是引起病变的原因，而抑制性细胞如Tref和MDSC则是有益的。在这种情况下，选择性抑制吸引效应器细胞的趋化因子并且增加吸引Treg和MDSC的趋化因子可能产生对治疗有益的结果。
发明概述
本申请公开了有效治疗和预防癌症和其他疾病的疗法。这些方法包括给予治疗有效量的至少两种不同药剂，其协同地差异性调节肿瘤组织(或其他受疾病影响的组织)中IP-10(CXCL10)和RANTES(CCL5)的生成，而非(相反的作用或无改变)CCL22的生成，己知该趋化因子吸引不需要的调节T细胞。
我们新的和预料之外的数据证实可以通过靶向IFN和前列腺素合成差异性调节NF-κB-驱动的吸引Treg相对于Teff的趋化因子类型的生成。己知前列腺素和IFN均调节趋化因子的生成，但是其与TLR配体以及NF-κB通路的其他激活因子在负向调节吸引Treg相对于Teff的趋化因子类型中的相互作用尚未用于治疗目的。若干研究显示多种类型的肿瘤均具有过表达COX2和过度产生COX2的产物PGE2的倾向。这可能是在肿瘤组织而非边缘组织中选择性增加吸引Teff-的趋化因子的生成拟采用的策略，以便选择性地将Teff细胞引入肿瘤并且其适用于多种类型的肿瘤和其他与NF-κB失衡相关的疾病，如感染、慢性炎症、癌前病变状态、自身免疫现象或者移植排斥包括移植的器官、组织和分离的细胞的排斥，包括移植排斥和移植物抗宿主(GvH)病。
在预防或治疗癌症、一些癌前病变状态和多种感染中，我们的数据显示将TLR配体或NF-κB通路的其他激活剂与前列腺素的抑制剂(可能是前列腺素受体的抑制剂和/或其他使cAMP生成增加的试剂的抑制剂或cAMP信号的抑制剂)联合使用，并且在之前、同时或之后给予IFNα和/或其他I型和II型干扰素是有益的，以选择性增强吸引Teff的趋化因子的生成，同时抑制吸引Treg的趋化因子的生成。
另一方面，在预防或治疗与不需要的免疫系统过度活化相关的状态(慢性炎症、一些癌前病变状态、自身免疫现象或移植排斥，包括移植的器官、组织和分离的细胞的排斥，包括移植排斥和移植物抗宿主(GvH)病)中，我们的数据显示将TLR配体或NF-κB通路的其他激活因子与前列腺素或其他cAMP升高剂(和使用IFN产生或IFN应答的潜在抑制剂)联合使用对选择性增强吸引Teff的趋化因子的产生，同时抑制吸引Treg的趋化因子的产生是有益的。
在一些实施方式中，本申请提供了在主体中治疗或预防结直肠癌、黑色素瘤、非黑色素瘤的皮肤癌、神经胶质瘤、卵巢癌、乳腺癌、肺癌、子宫内膜癌、宫颈癌、胃癌、食道癌、胰腺癌、胆囊癌、肾癌、膀胱癌、外阴癌、神经内分泌癌、前列腺癌、头颈癌、软组织肉瘤、骨癌、间皮瘤、内皮来源的癌症、血液系统恶性肿瘤包括但不限于多发性骨髓瘤、淋巴瘤和白血病、己知与发展成癌症的风险增加相关的癌前病变或者其他形式的癌症发生或复发的方法。这些方法包括给予主体治疗有效量的至少两种不同的药剂例如但不限于干扰素、前列腺素合成的抑制剂和Toll样受体(TLR)激动剂。
在一些实施方式中，本申请提供了在主体中治疗癌症或者预防癌症发生或复发的方法，包括给予主体治疗有效量的增加IP-10/CXCL10的产生并抑制MDC/CCL22的产生的前列腺素抑制剂(如前列腺素合成或前列腺素应答的抑制剂)或其他cAMP抑制剂，以及治疗有效量的Toll样受体(TLR)激动剂。
在其他实施方式中，本申请提供了在主体中治疗癌症或者预防癌症发生或复发的方法，通过给予主体治疗有效量的干扰素或使IP-10活性增加的药剂以及治疗有效量的前列腺素合成抑制剂，以便在主体中治疗或预防结直肠癌。
由于不仅仅是自发产生的肿瘤特异性效应细胞，不同的癌症疫苗诱导的肿瘤特异性效应器细胞，包括αDC1或其他类型的1型极化DC(如由LPS和IFNγ联合诱导或者由TNFα和IFNγ联合诱导)也在肿瘤特异性T细胞上表达高水平的CCR5或CXCR3，因而在肿瘤组织中肿瘤选择性诱导CCR5配体和/或CXCR3配体与这种疫苗联合使用可能特别有效。
通过下文中对若干实施实施方式的详细描述并结合附图前述的和其他特征和优点将更加显而易见。
附图简述
图1是1型极化树突状细胞(αDC)在诱导功能性CTL表达CXCR3和CCR5中的优越的活性的示意图。其中，A-C：αDC1是CD8+T细胞针对多种肿瘤相关表位应答的优越的诱导剂。(A)在αDC1或sDC上负载存在黑色素瘤相关CTL表位的HLA-A2(MART-1，gp100&酪氨酸酶)并且用于在体外敏化(IVS)系统中敏化来自HLA-A2+黑色素瘤患者(IV期)的自体CD8+T细胞。在经过使用PBMC的一轮附加刺激后(用于检测稳定性的差异)，通过ELISPOT检测CD8+T细胞对个肽的应答。(B)CTL致敏的αDC1杀伤HLA-A2匹配的黑色素瘤细胞。使用铬释放检测在第20天时对差异性敏化的CD8+T细胞对HLA-A2+黑色素瘤细胞系的杀伤能力进行检测。(C)αDC1是CD8+T细胞针对CEA(CAP-1表位)应答的优越的诱导剂。使用结直肠癌患者的血液进行IVS。(D)在IVS系统中αDC1是黑色素瘤特异性CD8+T细胞上的CXCR3和CCR5的优越的诱导剂(如图A所示)。通过流式细胞术对MART-1-四聚体+CD8+T细胞上的趋化因子受体的表达情况进行分析。(D)在使用自体CLL细胞负载的αDC1或sDC的IVS系统中，αDC1具有较高的CTL诱导活性。使用了两轮DC刺激，未进行PBMC刺激。(E)在使用SEB-驱动模型的T细胞活化IVS系统中，αDC1和标准(s)DC-致敏的CD8+T细胞之间的差异性CCR5表达和CCL5应答。
图2是吸引Teff或Treg的趋化因子在不同肿瘤中的异质性表达的示意图。其中，将来自结肠癌或黑色素瘤患者的肿瘤活检组织裂解，提取RNA并进行Taqman分析。(A)吸引Treg和Teff的趋化因子在皮肤、淋巴结和黑色素瘤皮肤病变中的异质性表达。(B)CXCL10/IP10和CCL22在不同结直肠癌病变中的异质性表达。
图3是在肿瘤中Teff和Treg标记物的存在与相应吸引Teff或Treg的趋化因子在肿瘤内表达的相关性的示意图。其中，将来自结肠癌患者的肿瘤活检组织裂解，提取RNA并对不同标记物进行Taqman分析。(A)在肿瘤病灶中Teff标记物(CD8和颗粒酶B；GZMB)与吸引Teff的趋化因子(CCL5和CXCL10)之间的相关性。(B)在肿瘤病灶中Treg标记物(FOXP3和GITR)与趋化因子CCL22之间的相关性。
图4是在肿瘤中存在的Treg和Teff标记物与吸引Teff和Treg的趋化因子在肿瘤内表达的相关性的示意图。其中，(A)可选的CXCR3配体CXCL9的表达与CXCL10的局部表达和与Teff标记物、CD8和GZMB之间的相关性。(B)CCL22和COX-2之间的相关性。(C)例证：CCL22和CXCL13之间缺乏相关性。
图5是COX抑制剂吲哚美辛、IFNα和聚I：C(poly-I：C)在离体细胞培养物中诱导所需类型的趋化因子表达中的相互作用的示意图。其中，(A)在体外产生的巨噬细胞(见M&M)和在成纤维细胞中(来自Cascade Biological)，IFNα和聚I：C在吸引Teff和Treg的趋化因子生成中的剂量依赖性的影响。所附数据为三次典型实验中的一次数据。(B)通过ELISA分析的，吲哚美辛对巨噬细胞中(N＝3)生成的吸引Teff和Treg的趋化因子的影响。通过ELISA分析48小时培养物中趋化因子的浓度。注意吲哚美辛CCL22生成的抑制作用。
图6是不同的肿瘤组织对各趋化因子调节物的异质性应答模式及其对IFNα、聚I：C的吲哚美辛组合的一致性应答的示意图。其中，(A)不使用或使用单独的IFNα和聚I：C或使用其组合对来自11名转移性结直肠癌患者的新鲜肿瘤样本处理48小时。通过ELISA分析释放进入培养基的CCL5和CXCL10。数字表示各趋化因子的表达模式(以A、B或C表示)在肿瘤中的普遍性。(B)在未经或经过IFNα+聚I：C处理以及加入或未加入吲哚美辛的肿瘤样本中，CCL5、CCL22和CXCL10的ELISA分析结果。(C)来自同一患者的不同肿瘤病灶对趋化因子调节混合物中各组分的异质性应答(CCL5和CXCL10的产生)。(D)吲哚美辛和塞来昔布增强结直肠癌病灶中IFNα/聚I：C诱导的吸引Teff的趋化因子的表达，但抑制吸引Treg的趋化因子的表达。所有培养物均培养48小时。数据为来自3个不同患者的肿瘤的组合数据(n＝3)。
图7是IFNα、聚I：C和吲哚美辛的组合在肿瘤组织中持续上调吸引Teff的趋化因子并且持续抑制吸引Treg的趋化因子的示意图。其中，(A)未经过或经过吲哚美辛、IFNα和聚I：C(IAP)的组合处理的肿瘤组织活检样品中各种趋化因子mRNA(黑点)的分别进行原位杂交的结果。(B)对来自10个不同患者的肿瘤组织(未经处理或经过处理)经过48小时培养的上清液中的趋化因子含量进行的ELISA分析。
图8是在暴露于IFNα、聚I：C和吲哚美辛的组合后不同肿瘤组织中CXCL10的生成均出现NF-κB依赖性选择性增强的示意图。其中，(A)通过ELISA测定的匹配的正常肝脏和来自10名不同患者的未经(左图)或经过(右图)处理的肝脏转移组织中CXCL10的表达情况。(B)显示在正常肝脏或未经或经过处理(右图)的肝脏转移组织中NF-κB核迁移的各视野计数的平均细胞数(共聚焦显微镜；共计10个视野)。各条件下的典型图像如左图所示。(C)在不存在或存在20μM CAY10470(NF-κB抑制剂)的条件下，通过ELISA测定匹配的正常肝脏和未经或经过(IFNα、聚I：C和吲哚美辛)处理的肝脏转移结直肠癌组织中CXCL10的生成情况。D)在黑色素瘤病灶中(对比健康皮肤)趋化因子调节的选择性。使用IFNα+聚I：C处理不同的黑色素瘤病灶或边缘的健康皮肤并且通过ELISA测定CXCL10/IP10的分泌水平。
图9是与正常肝脏组织相比，CXCL10和CCL5在肝脏转移中的选择性诱导：NF-κB的作用的示意图。其中，将边缘肝脏组织的匹配样品和肝脏转移结直肠癌组织(3份活检以1ml的量接种于24孔板)不经或经IFNα+聚I：C+吲哚美辛处理培养24小时并且(A)通过Taqman分析CCL5和CXCL10的表达。(B)在不存在或存在20μM CAY10470(NF-κB抑制剂)的条件下，组织未经或经过IFNα+聚I：C+吲哚美辛的处理。通过ELISA分析上清液中CCL5的产生情况(参见图4中匹配的CXCL10数据)。(C)在匹配的边缘肝脏组织和肝脏转移结直肠癌中CAY10470(20μM)对肝脏糖原磷酸化酶mRNA表达的作用。
图10是经IFNα、聚I：C和吲哚美辛处理的肿瘤显示出增强的吸引Teff的能力，但显著降低的吸引Treg的能力的示意图。其中，(A)在Transwell小室趋药性检测中，体外生成的Teff(左图)或分离的CD8+肿瘤浸润淋巴细胞(右图)(参见材料和方法部分)均能够迁移至来自3名不同患者未经或经过处理的肿瘤上清液。(B)负性分离的总CD4+T细胞能够迁移至经过或未经处理的肿瘤上清液中。将迁移细胞裂解并通过Taqman分析FOXP3的表达。U.D.：无法检测
图11是IFN对TLR传感器的调节的示意图。其中，分析整个肿瘤组织样本，血液中分离的NK细胞或单核细胞衍生的DC中自发的和IFNα(或PGE2)诱导的TLR3和MyD88mRNA的表达情况(Taqman)。
图12是不同TLR配体和替代的NF-κB激活剂与I型和II型干扰素在诱导IP10/CXCL10中的协同作用的示意图。其中，单独使用IFNα或IFNγ或者使用其与聚I：C(TLR3配体)、LPS(TLR4配体)或促炎性细胞因子TNFα联合处理分离的细胞。(B)通过Taqman测定IP10/CXCL10的诱导情况。
图13是塞来昔布(COX2抑制剂)、IFNα和聚I：C的组合在经过化疗剂美法仑处理的黑色素瘤组织中消除吸引Treg和吸引Teff的趋化因子之间比率(CCL22/CXCL10的比率)不利的升高的示意图。其中，在缺乏或存在塞来昔布、IFNα和聚I：C三重组合(CAP)的条件下，在渐增浓度的美法仑中对肿瘤组织活检样本进行体外培养。通过ELISA测定CC22和CXCL10的分泌水平。
具体实施方式
本申请公开了有效的治疗和预防癌症和其他疾病的治疗方法。这些方法包括给予治疗有效量的药剂，所述药剂增加肿瘤病灶内吸引效应细胞的趋化因子的局部产生，同时抑制吸引调节T(reg)细胞的不利的趋化因子的局部产生。这些方法包括给予主体治疗有效量的Toll样受体(TLR)激动剂联合前列腺素合成阻断剂或者联合1型干扰素，或者联合前列腺素合成阻断剂和1型干扰素，以便在所述主体中治疗或预防癌症或感染性疾病或者预防其复发。或者，所述方法来自于相同的范例，但是用于治疗或预防自身免疫性疾病、慢性炎性疾病或移植排斥，包括将Toll样受体(TLR)激动剂的组合与前列腺素包括但不限于前列腺素E2(PGE2)或其他的腺苷酸环化酶/cAMP/CREB信号通路的激动剂联合使用。
I.一般术语
除非另有说明，否则技术术语按照常规用法使用。分子生物学中常规术语的定义可以参见：Benjamin Lewin，Genes V，Oxford University Press，1994(ISBN0-19-854287-9)；Kendrew et al.(eds.)，The Encyclopedia of Molecular Biology，Blackwell Science Ltd.，1994(ISBN0-632-02182-9)；和Robert A.Meyers(ed.)，Molecular Biology and Biotechnology：a Comprehensive Desk Reference.VCHPublishers，Inc.，1995(ISBN1-56081-569-8)。
为了便于对本申请的不同实施方式的审阅，为特定术语提供了下述解释：
“趋化因子”：诱导免疫细胞向其来源(对抗梯度)迁移的免疫化学引诱剂。IP10/CXCL10、RANTES/CCL5和MDC/CCL22是趋化因子的例子。IP10(连同两个相关的趋化因子MIG/CXCL9和I-TAC/CXCL11)均与相同的趋化因子受体结合：CXCR3，主要在效应类型的免疫细胞上表达如Th1细胞、BK细胞和CTL细胞，其均己知促进肿瘤排斥。RANTES/CCL5与CCR5、CCR3和CCR1结合。与CXCR3配体类似，己知其也主要吸引免疫效应细胞并促进肿瘤排斥。MDC/CCL22与CCL4结合，其主要在调节T(reg)细胞上表达，己知这种类型的细胞参与保护肿瘤使其免于受到免疫破坏并促进肿瘤进展。与“所需的趋化因子IP10、MIG、ITAC和RANTES”相反，“不利的”趋化因子包括介导不利的Treg细胞的吸引的MDC/CCL22和介导不利的Treg细胞和MDSC的吸引的SDF1/CXCL12。
“化疗剂”：在治疗具有异常细胞生长特征的疾病中具有治疗作用的任意化学剂。这种疾病包括肿瘤、赘生物和癌症。在一个实施方式中，化疗剂是用于治疗结直肠癌、黑色素瘤或其他肿瘤的药剂。在一个实施方式中，化疗剂是放射性化合物。本领域技术人员能够容易地确定使用的化疗剂(例如参见：Slapak and Kufe，Principles of Cαncer Therαpy，Chapter86in Harrison's Principlesof Internal Medicine，14th edition；Perry et al.，Chemotherαpy，Ch.17in Abeloff，Clinical Oncology2nd ed.，
Figure BDA0000478253300000121
2000Churchill Livingstone，Inc.；Baltzer，L，Berkery，R.(eds.)：Oncology Pocket Guideto Chemotherαpy，2nd ed.St.Louis，Mosby-YearBook，1995；以及Fischer，D.S.，Knobf，M.F.，Durivage，H.J.(eds)：The CαncerChemotherαpy Hαndbook，4th ed.St.Louis，Mosby-Year Book，1993)。
联合化疗指给予一种以上的药剂以治疗癌症。一个例子是将抗体或其片段与放射活性或化学化合物联用。
“环氧合酶抑制剂”：选择性抑制环氧合酶-2酶和/或环氧合酶-1酶，减少前列腺素产生的化合物。
“环氧合酶-2(COX-2)选择性抑制剂”：选择性抑制环氧合酶-2酶而非环氧合酶-1酶的化合物。在一个实施方式中，在人全血COX-2检测中，所述化合物具有的环氧合酶-2的IC50低于约2μM和具有的环氧合酶-1的IC50高于约5μM(参见：Brideau等，Inflamm Res.，45：68-74(1996))并且其还具有环氧合酶-2抑制与环氧合酶-1抑制的比值至少约10的选择性比率，如至少约40。在另一个实施方式中，所述化合物具有的环氧合酶-1的IC50高于约1μM，优选地高于20μM。所述化合物还能够抑制脂氧合酶。这种选择性可以指示降低常见的NSAID导致的副作用的能力。
“干扰素诱导的蛋白-10(IP-10)”：一种细胞因子也称为免疫蛋白-10；10kDa干扰素诱导蛋白，也称为γ-IP-10、INP-10或C7。这种蛋白的大鼠同源物称为mob-1。名称CXCL10也指这种因子。基因符号是SCYB10。基于其保守的三维结构域的存在和直接的抗菌活性，因此将IP-10分类为kinocidin(杀菌性趋化因子)。
在人体内，天然的该蛋白的长度为98个氨基酸。其与PF4(血小板因子-4)具有同源性并且属于称为趋化因子的趋化性细胞因子家族。IP-10也与被称为CRG-2的基因相关(参见：CRG，细胞因子应答基因)。鼠源性CRG-2被认为和人IP-10具有同源性。人IP-10基因具有4个外显子并且定位于染色体4q12-21中其他编码趋化因子的基因附近。
IP-10的受体是CXCR3。IP-10还显示出与病毒编码的病毒编码受体M3的结合。IP-10由多种细胞表达包括单核细胞、内皮细胞、角化细胞和成纤维细胞，其由IFN-γ和TNF-α诱导。人中性粒细胞产生的IP-10对IFN-γ与TNFα或细菌脂多糖的组合产生应答。
“赘生物、恶性肿瘤、癌症或肿瘤”：异常的或失控的细胞生长的结果。赘生物、恶性肿瘤、癌症和肿瘤通常可以互换使用。在个体中肿瘤的量是“肿瘤负荷”，其可以通过肿瘤的数量、体积或重量测定。将不发生转移的肿瘤称为“良性的”。将侵袭周围组织和/或能够转移的肿瘤称为“恶性的”。血液系统肿瘤的例子包括白血病，包括急性白血病(如11q23-阳性急性白血病、急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病以及成髓细胞、早幼粒细胞、髓单核细胞、单核细胞和红白血病)、慢性白血病(如慢性髓细胞(粒细胞)白血病、慢性髓单核细胞白血病和慢性淋巴细胞白血病)、真性红细胞增多症、淋巴瘤、霍奇金氏病、非霍奇金氏淋巴瘤(惰性和高分级形式)、多发性骨髓瘤、华氏巨球蛋白血症、重链病、骨髓增生异常综合征、毛细胞白血病和骨髓异常增生。
实体瘤的例子，如肉瘤和癌，包括纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、成骨肉瘤和其他肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因氏瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、淋巴恶性肿瘤、胰腺癌、乳腺癌(包括基底乳腺癌、导管癌和小叶乳腺癌)、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、肝细胞癌、鳞状细胞癌、黑色素瘤、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、甲状腺髓样癌、甲状腺乳头样癌、嗜铬细胞瘤、皮脂腺癌乳头状癌、乳头状腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、绒毛膜癌、维尔姆斯瘤、宫颈癌、睾丸癌、精原细胞瘤、膀胱癌和CNS肿瘤(如胶质瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤、黑色素瘤、成神经细胞瘤和视网膜母细胞瘤)。
“预防、治疗或改善疾病”：“预防”疾病指完全抑制疾病发展或推迟疾病发展。“治疗”指在其开始发展后缓解疾病或病理条件的指征或症状的治疗干涉。“改善”指降低疾病如癌症的指征或症状的数量或严重程度。
“PGE2的生成”：PGE2合成的过程涉及磷脂酶A2(PLA2)家族成员，其动员细胞膜上的花生四烯酸，环氧合酶(具有组成型活性的COX1和诱导型COX2)将花生四烯酸转化成前列腺素H2(PGH2)，以及最终形式的PGE2所需的前列腺素E合酶(PGES)。尽管PGE2合成的速率以及由此产生的炎症过程会受到其他因素的影响，如局部存在的AA，但是在大多数生理条件下，PGE2合成的速率受COX2的局部表达和活性的控制。
“PGE2的降解”：PGE2降解的速率受15-羟基前列腺素脱氢酶(15-PGDH)的控制，这表明除了PGE2合成的速率以外PGE2降解的速率也构成了免疫调节的靶点。
“PGE2的应答”：四种不同的PGE2受体分别是EP1、EP2、EP3和EP4。通过两个Gs-偶联受体EP2和EP4由腺苷酸环化酶触发的cAMP/PKA/CREB通路所介导的信号转导主要介导抗炎和抑制PGE2活性的两个方面。而EP2据信主要是cAMP-依赖形式的信号，EP4也激活PI3K-依赖的ERK1/2通路。然而，EP2和EP4均己显示出激活GSK3/β-连环蛋白通路。
根据在原发性肺纤维化患者中观察到的结果，EP2的表达以及其所产生的对PGE2的应答能够通过超甲基化被抑制。这些观察结果增大了一种可能性，即除了调节PGE2的生成及其降解以外，在各PGE2受体表达水平上对PGE2应答的调节也能够用于对人类疾病的发病机制及其治疗方法的探索中。使用合成抑制剂优选影响EP2、EP3或EP4信号的抑制剂，能够差异性的抑制PGE2活性的不同方面这一发现也支持上述可能性(审核中)。
“前列腺素(PG)合成抑制剂”：指抑制PG的一般合成或特定类型PG合成的因素。PG合成抑制剂包括COX-1和COX-2的非选择性抑制剂，这是PG合成通路中的两种关键的酶，和COX-2的选择性抑制剂，据信其具有更高的针对COX-2的特异性和更低的毒性。非选择性PG抑制剂的例子包括阿司匹林、吲哚美辛或布洛芬(Advil，Motrin)。COX-2选择性抑制剂的例子包括塞来昔布(西乐葆)和罗非昔布(万络)。COX-1特异性抑制剂的例子是舒林酸(奇诺力)。抑制前列腺素合成的其他药物包括甾体激素(例如：氢化可的松、可的松、泼尼松或地塞米松)和对乙酰氨基酚(泰诺，必理通)，常用作抗炎、解热和镇痛药。最常用的选择性COX2抑制剂的例子包括塞来昔布、阿来昔布、伐地昔布和罗非昔布。
最常用的非选择性COX1和COX2抑制剂的例子包括：乙酰水杨酸(阿司匹林)和其他水杨酸盐、对乙酰氨基酚(泰诺)、布洛芬(雅维、Motrin、Nuprin、Rufen)、萘普生(Naprosyn、Aleve)、萘丁美酮(瑞力芬)或瑞力芬(凯扶兰)。
“前列腺素(PG)信号转导抑制剂”：前列腺素通过多种受体进行信号传导，其中发挥的关键的免疫抑制作用由腺苷酸环化酶的活化所介导，结果使得细胞内的环(c)AMP、PKA以及下游PKA/CREB通路的活性升高。
干扰PG应答的另一个层面包括干扰其与PG受体结合。在PGE2的情况下，两种关键的cAMP活化受体是EP2和EP4，针对其存在多种特异性抑制剂。
由前列腺素或其他因素诱导的cAMP水平升高能够被磷酸二酯酶(PDE；目前己知有6种类型，PDE1-PDE5和PDE10，其使细胞内cAMP的水平降低)所阻止。PDE能够被磷酸二酯酶抑制剂调控，其包括例如物质如黄嘌呤(咖啡因、氨茶碱、IBMX、己酮可可碱、可可碱、茶碱或副黄嘌呤)，其均使得细胞内cAMP的水平升高，以及更多选择性合成的和天然的因子，包括长春西汀、西洛他唑、氨力农、西洛他唑、松叶菊碱、咯利普兰、异丁司特、屈他维林、吡拉米司特、西地那非、他达拉非、伐地那非或罂粟碱。
而且，可以通过抑制cAMP的下游信号如PKA或CREB干扰PGE2信号(或干扰其他cAMP升高因子的信号如组胺，β肾上腺素受体激动剂)。
“治疗有效量”：指单独使用或与一种或多种其他治疗剂合用的诱导所需的应答如降低发展成癌症的风险或减轻癌症的指征或症状的治疗剂(如IP-10或者使IP-10/CXCL10和/或RANTES/CCL5的产生增加、使CCL22的产生减少、或增加表达CXCR3和/或CCR5的免疫细胞的数量或质量并使其能够向CXCL10或CCL5迁移的药剂)的用量。在一个例子中，其是在主体中预防或推迟肿瘤如黑色素瘤或结直肠癌发展所需的药剂的用量。在另一个例子中，其是在主体如患有黑色素瘤或结直肠癌的主体中预防或推迟肿瘤转移，导致现有的肿瘤消退，或治疗与肿瘤相关的一种或多种指征或症状所需的药剂的用量。在理想情况下，治疗有效量在主体中提供了治疗效果同时基本上不会导致不良反应。本申请所公开的制剂以治疗有效量给予。
在一个例子中，所需的应答是预防肿瘤发展。在另一个例子中，所需的应答是使肿瘤的发展、进展或转移推迟例如至少约3个月、至少约6个月、至少约1年、至少约2年、至少约5年或至少约10年。在进一步的例子中，所需的应答是减少癌症的发生，如结直肠癌或黑色素瘤。在另一个例子中，所需的应答是减轻癌症的指征和症状，如肿瘤的尺寸、体积或数量或者转移。例如，在一些例子中，与缺乏治疗组合物时的应答相比，所述组合物能够使肿瘤(如结直肠肿瘤)的尺寸、体积或数量减小期望值，例如至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少50％、至少75％或甚至至少90％。
在一般情况下，给予人类主体的组合物的有效量将随着与该主体相关的多种因素的改变而改变，例如主体的总体健康状况、待治疗的状况或病情的严重程度。可以通过改变产品的剂量或测定所得到的治疗应答如癌症如结直肠癌或黑色素瘤的发生的减少，或者肿瘤的尺寸、体积或数量减小确定组合物的有效量。根据获得期望应答所需，任意药剂可以被给予单剂量或若干剂量。然而，有效量可能取决于应用来源、待治疗的主体、待治疗的病情的严重程度和类型和给药方式包括给药途径、速率和频率、以及各活性化合物或其组合的配方、以及各组分涉及彼此和总体患者护理(手术、放疗、化疗、生物疗法或症状管理的任意方法)的其他因素的相对给药周期。
“Toll样受体(TLR)”：在病原识别和先天免疫活化中起最基本作用的受体家族。TLR从果蝇到人类高度保守并且具有结构和功能的相似性。其识别在感染性物质上表达的病原相关分子模式(PAMP)并且介导产生有效的免疫所必须的细胞因子的产生。共计有13种哺乳动物TLR，其中的9种(TLR1-9)己被广泛的研究并且己知其活化NF-κB通路。
“Toll样受体3(TLR3)”：Toll样受体(TLR)家族成员。其氨基酸序列参见NCBI登录号NP003256，2009年1月2日，其公开的内容通过引用并入本申请。TLR3是Toll样受体(TLR)成员。这种受体在胎盘和胰腺的表达最丰富，并且仅限于白细胞的树突状细胞亚群。其识别与病毒感染相关的dsRNA，并且诱导NF-κB的活化和1型干扰素的生成。TLR3mRNA序列参见NCBI登录号NM＿003265，2009年1月2日，其也通过引用并入本申请。TLR3参见WO98/50547，其公开的内容也通过引用并入本申请。术语“TLR3基因”指Toll样受体3基因及其变体、类似物和其片段，包括其等位基因(例如，胚系突变)。这种变体包括例如由于个体之间的等位基因改变导致的天然存在的变体(例如，多态性)，选择性剪切形式等。在若干实施方式中，变体基本上与NCBI登录号NM003265序列具有同源性，如具有的核苷酸序列与对照序列的一致性至少约65％、至少约75％、至少约85％或者至少约95％。TLR3基因的变体和类似物也包括核酸序列，所述核酸序列能够与上文所定义的序列(或其互补链)在高度严谨的杂交条件下杂交。人TLR3DNA序列的遗传多态性是己知的，例如在TLR3基因的胞质区和在TLR3基因最接近5′端的序列的等位基因改变(参见：Piriel等，(2005)Tissue Antigens66(2)：125，其公开的内容通过引用并入本申请)，例如在TLR3基因中在位点2593的C/T多态性、在位点2642的C/A多态性和在位点2690的AJG多态性。
II.增加CXCR3配体和CCR5配体生成的药剂，如I型干扰素(IFN-α和IFN-β)和II型干扰素(IFN-γ)
本申请所使用的术语“干扰素-α”指与抑制病毒复制和细胞增殖和调节免疫应答相关的多肽家族。术语“IFN-α”、“IFN-alpha”或“IFN-a”包括天然存在的IFN-a多肽；非天然存在的IFN-a多肽；以及保留了母体天然存在的或非天然存在的IFN-a的抗病毒活性的天然存在的或非天然存在的IFN-a的类似物。
适宜的α干扰素包括但不限于天然存在的IFN-a(包括但不限于天然存在的IFN-a2a，IFN-a2b)；重组的干扰素α-2b如内含子A，来自新泽西州凯尼尔沃斯的先灵公司的干扰素；重组干扰素α-2a如R(g)，来自新泽西州纳特利的霍夫迈罗氏公司的干扰素；重组干扰素α-2C如Beroforα2，来自康涅狄格州里奇菲尔德的勃林格殷格翰药物公司的干扰素；干扰素α-nl，纯化的天然α干扰素的混合物，例如来自日本的住友公司的Sumiferon，或来自英国伦敦的葛兰素公司的Wellferon干扰素α-nl(INS)；以及干扰素α-n3，天然α干扰素的混合物，其分别由Interferon Sciences公司制备和来自康涅狄格州诺沃克的Purdue Frederick Co.公司。
IFN-α还包括共有IFN-a。“共有IFN-a”指非天然存在的多肽，其包括在所有天然存在的人白细胞IFN-a亚型序列中相同的那些氨基酸残基，并且在所有亚型无相同氨基酸的的一个或多个位点中其包括在该位点出现频率较高的氨基酸，如果在任意这种位点中所有亚型无相同氨基酸，所述多肽不包括在至少一个天然存在的亚型中都不存在的任意氨基酸残基。所有天然存在的人白细胞IFN-a亚型序列相同的氨基酸残基(“相同氨基酸残基”)和在非相同残基出现频率较高的氨基酸残基(“共有氨基酸残基”)均是本领域公知的。共有IFN-a(也称为“CIFN”和“IFN-con”和“共有干扰素”)包括但不限于被称为IFN-conl、IFN-con2和IFN-con3的氨基酸序列，其己在美国专利号4，695，623和4，897，471中公开；和通过确定天然存在的干扰素α的共有序列定义的共有干扰素(例如，加利福尼亚州布利斯班的InterMune，Inc.公司的Infergen(g))。IFN-conl是在Infergen(Dalfacon-1产品)中的共有干扰素药剂。Infergen共有干扰素产品在本申请中以其商标名(Infergen(Z))或以其通用名(干扰素alfacon-1)表示。可以按照前述专利中的描述或其他标准方法合成编码IFN-con的DNA序列。特别关注的是CIFN的用途。
包括IFN-a和不同多肽的融合多肽也适用于本申请所公开的方法。适宜的IFN-a溶液多肽包括但不限于Albuferon-α(人白蛋白和IFN-a的融合产品；人基因组科学；参见例如：Osbom等，(2002)J Pharmaco1.Exp.Therap.303：540-548)。基因重组形式的IFN-a也适用于本发明的用途。参见例如：Masci等，(2003)Curr.Onco1.Rep.5：108-113。
IFN-a多肽可以采用任意公知的方法生产。编码IFN-con的DNA序列可以按照上文所述的专利或其他标准方法合成。在多个实施方式中，IFN-a多肽是将DNA序列转化或转染至细菌宿主如大肠杆菌或真核宿主细胞(例如，酵母；哺乳动物细胞如CHO细胞等)所产生的表达产物。在这些实施方式中，IFN-a是重组体。当宿主细胞是细菌宿主细胞时，IFN-a被修饰以使其包含N-末端甲硫氨酸。在大肠杆菌中生产的IFN-a通常采用本领域技术人员公知的程序纯化，通常参见：Klein等(1988)J Chromatog.454：205-215)针对IFN-conl的描述。
细菌生成的IFN-a可能包含具有不同N-末端氨基酸残基的亚型的混合物。例如，纯化的IFN-con可能包含具有不同N-末端甲硫氨酸状态的异构体的混合物。例如，在一些实施方式中，IFN-con包含N-末端甲硫氨酰基IFN-con、具有未封闭的N-末端的des-甲硫氨酰基IFN-con和具有封闭的N-末端的des-甲硫氨酰基IFN-con的混合物。根据一个非限制性例子，纯化的IFN-conl包含甲硫氨酰基IFN-conl、des-甲硫氨酰基IFN-conl和具有封闭的N-末端的des-甲硫氨酰基IFN-conl的混合物。Klein等，((1990)Arch.Biochemistry&amp；Biophys.276：531-537)。或者，IFN-con可能包含特定的、孤立的异构体。通过如本领域技术人员所公知的等电聚焦的技术可将IFN-con的异构体彼此分离。本申请中描述的IFN-a可以包含一种或多种修饰过的氨基酸残基，例如糖基化、化学修饰等诸如此类。
术语“IFN-a”还包含IFN-a的衍生物，其被衍生化(例如，化学修饰)以改变某些性质如血清半衰期。这样，术语“IFN-a”包含糖基化的IFN-a；经过聚乙二醇(“PEG化的IFN-a”)衍生化的IFN-a等等。PEG化的IFN-a以及制备这种分子的方法参见美国专利号5，382，657；5，981，709和5，951，974。PEG化的IFN-a包括PEG的偶联物以及任意上文所述的IFN-a分子，包括但不限于PEG偶联的干扰素α-2a(Roferon，新泽西州纳特利的霍夫迈罗氏公司)、干扰素α2b(Intron，新泽西州麦迪逊的先灵葆雅公司)、干扰素α-2c(Berofor Alpha，德国殷格翰的勃林格殷格翰公司)；以及通过确定天然存在的干扰素α的共有序列定义的共有干扰素(Infergen&commat，加利福尼亚州布利斯班的InterMune，Inc.公司)。
任意上文所述的IFN-a多肽均可以被一个或多个聚乙二醇部分修饰，例如PEG化。PEG化IFN-a多肽的PEG分子与IFN-a多肽的一个或多个氨基酸侧链偶联。在一些实施方式中，PEG化的IFN-a仅在一个氨基酸上含有PEG部分。在其他实施方式中，PEG化的IFN-a在两个或多个氨基酸上含有PEG部分，例如IFN-a含有与两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个不同的氨基酸残基连接的PEG部分。
IFN-a可以通过氨基、巯基、羟基或羧基直接与PEG偶联(如无连接基团)。在一些实施方式中，PEG化的IFN-a在或接近IFN-a多肽的氨基末端(N-末端)PEG化，例如PEG部分与IFN-a多肽在氨基酸1至氨基酸4或者氨基酸5至10中的一个或多个氨基酸残基偶联。在其他实施方式中，PEG化的INF-a在约10至约28的一个或多个氨基酸残基PEG化。在部分实施方式中，PEG化的IFN-a在或接近IFN-a多肽的羧基末端(C-末端)PEG化，例如在氨基酸156-166或氨基酸150-155的一个或多个残基。在部分实施方式中，PEG化的IFN-a在氨基酸100-114的一个或多个残基PEG化。聚乙二醇在IFN-a上连接位点的选择根据在受体-结合和/或蛋白活性位点结构域中各位点的作用确定，这是本领域技术人员所公知的。在通常情况下，PEG化的氨基酸应避免包括氨基酸30或氨基酸40中的氨基酸残基；以及氨基酸113至氨基酸149中的氨基酸残基。在一些实施方式中，PEG通过连接基团与IFN-a连接。所述连接基团是指任意生物相容性的连接基团，其中“生物相容性”指无毒性和可以在体外或体内使用且不会导致损伤、疾病、病症或死亡的化合物或基团。PEG能够与连接基团键合，例如通过醚键、酯键、硫醇键或酰胺键。适宜的生物相容性连接基团包括但不限于酯基、酰胺基、亚胺基、氨甲酰基、羧基、羟基、糖、琥珀酰亚胺基(包括例如琥珀酰亚胺琥珀酸酯(SS)、琥珀酰亚胺丙酸酯(SPA)、琥珀酰亚胺甲基羧酸酯(SCM)、琥珀酰亚胺琥珀酰胺(SSA)或N-羟基琥珀酰亚胺(NHS))、环氧化物基团、氧代羰基咪唑基(包括例如，羰基二咪唑(CDI))、硝基苯基(包括例如硝基苯基碳酸酯(NPC)或三氯苯基碳酸酯(TPC))、甲苯磺酸基、醛基、异氰酸基、乙烯砜基、酪氨酸基、半胱氨酸基、组氨酸基或伯胺。制备琥珀酰亚胺丙酸酯(SPA)和琥珀酰亚胺丁酸甲酯(SBA)活化的PEG的方法参见美国专利号5，672，662(Harris等)和WO97/03106。将PEG与IFN-a多肽连接的方法是本领域公知的并且可以使用任意己知的方法。参见例如：Park等，Anticancer Res，1：373-376(1981)；Zaplipsky和Lee，Polyethylene Glycol Chemistry：Biotechnical andBiomedical Applications，J.M.Harris，ed.，Plenum Press，NY，第21章(1992)；和美国专利号5，985，265。PEG化的IFN-a也在美国专利号5，382，657；5，981，709；5，985，265和5，951，974中公开。PEG化的IFN-a包括PEG与任意上文所述的IFN-a分子的偶联物，包括但不限于PEG偶联的干扰素α-2a(Roferon，新泽西州纳特利的霍夫迈罗氏公司)，其中将PEG化的Roferon称为PEGASYSX(霍夫迈罗氏公司)；干扰素α2b(Intron，新泽西州麦迪逊的先灵葆雅公司)，其中将PEG化的Intron称为PEG-INTRONO(先灵葆雅公司)；干扰素α-2c(Berofor Alpha，德国殷格翰的勃林格殷格翰公司)。
“干扰素-β(IFNβ或IFN-β)”：通过相同的受体(干扰素I型受体)传递信号的1型IFN家族成员并且据信与IFN-a具有相似的生物学功能。干扰素-β以Avonex(Biogen Idec公司)、Rebif(默克雪兰诺公司)或CinnoVex(CinnaGen是生物仿制药)的名称销售。
“干扰素-γ(IFNγ或IFN-γ)”：也称为II型IFN，己知通过单独的受体传递信号，但是激活与I型干扰素部分重叠的信号通路并且分享其促进吸引效应器细胞的趋化因子生成的能力。
III.TLR3激动剂
TLR3激动剂能够选自在体内激活TLR3和/或与TLR3的活化相关的后续一连串的生化事件的任意适宜药剂。检测TLR3激动剂活性的检测方法是本领域公知的，其包括例如对NF-κB报告质粒中荧光素酶(1uc)产生情况的检测，或者对内源性IL-8诱导情况的检测(K.Kariko等，J.Immuno1.2004，172：6545-49，其公开的内容通过引用并入本申请)。检测待测化合物对TLR3激动作用的检测方法也在例如PCT公开号WO03/31573、WO04/053057、WO04/053452和WO04/09467l中进行了描述，其公开的内容均通过引用并入本申请。
无论是否引入特定的检测方法，如果使用该化合物进行检测得到的结果是己知由TLR3介导的一些生物活性的增加至少达到临界值，则可以将化合物鉴定为TLR3的激动剂。相反的，如果当使用旨在检测由TLR3介导的生物活性的检测方法进行检测时，该化合物无法使生物活性的增加达到临界值，则可以将化合物鉴定为不具有TLR3激动剂的作用。除非另有明示，否则生物活性的增加指与在适宜的对照中所观察到的相同生物活性的增加。检测可以与或者不与适宜的对照同时进行。随着经验的增长，本领域技术人员可能对某一特定的检测方法足够熟悉(例如，在特定检测条件下，在适宜的对照中所观察到的值的范围)，因此在用于确定化合物TLR3激动作用的特定检测方法中可能并不总是必须使用对照。用于确定在给定的检测中特定化合物是否是TLR3激动剂的TLR3介导的生物活性的精确增加临界值可以随着本领域公知的因素而改变，包括但不限于在检测终点观察到的生物活性、用于测定或检测检测终点的方法、检测方法的信噪比、检测方法的精密度以及是否使用相同的检测方法确定化合物对多种TLR的激动作用。本领域技术人员在考虑这些因素后能够容易地确定适宜的阈值。然而，无论是否引入特定的检测方法，如果使用该化合物进行检测得到的结果是TLR3介导的一些生物活性增加至少达到临界值，则可以将化合物鉴定为TLR3的激动剂。
当以例如约1μM至约10μM的浓度提供化合物用于鉴定化合物是转染至细胞的TLR3的激动剂时，使用转染了可表达的TLR3结构基因的HEK293细胞的检测可以使用的临界值为，例如在TLR3-介导的生物活性中(如NF-κB活化)至少3倍增加的临界值。然而，在某些情况下，不同的临界值和/或不同的浓度范围可能是适用的。
TLR3激动剂可以是激动性抗体、这种抗体的激动性片段、这种抗体或片段的嵌合形式或者其他活性抗体衍生物。在本发明中使用的TLR3激动剂抗体可以采用本领域公知的任意不同技术制备。典型地，通过使用包含TLR3蛋白或TLR3肽的免疫原免疫接种非人动物如小鼠生产。免疫原可以包括完整的表达TLR3的肿瘤细胞，表达TLR3的细胞的细胞膜，TLR3蛋白的全长序列(重组生产或从天然来源分离)，或其片段或衍生物，典型地为免疫原性片段，例如包含表达TLR3的细胞表面暴露的表位的多肽的部分。
在一些实施方式中，免疫原包括在脂质膜上的野生型人TLR3多肽或其免疫原片段，典型地来自表达TLR-3的细胞的膜片段。在特定实施方式中，免疫原包括全部表达TLR3的肿瘤细胞，完整的或可选地被化学或物理裂解的。
单克隆或多克隆抗体的制备是本领域公知的，并且可以使用大量可用技术中的任意一种(参见例如：Kohler&Milstein，Nature256：495-497(1975)；Kozbor等，Immunology Today4：72(1983)；Cole等，Monoclonal Antibodies and CancerTherapy(1985)的第77-96页)。可以采用本领域公知的任意方法完成使用免疫原免疫非人哺乳动物的步骤(参见例如：E.Harlow和D.Lane，Antibodies：ALaboratory Manual.Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY(1988))。在通常情况下，将免疫原混悬或溶解在缓冲液中，可选地加入佐剂如完全弗氏佐剂。检测免疫原的量、缓冲液的类型和佐剂的量的方法是本领域技术人员公知的并且不以任何方式限制本发明。类似地，足以刺激抗体产生的免疫接种的部位和频率也是本领域公知的。在典型的免疫接种方案中，在第1天给非人动物腹腔注射抗原并在约1周后再次注射。此后在约第20天再次注射抗原，可选地加入佐剂如不完全弗氏佐剂。静脉重复注射并且可以连续数天重复。此后在第40天加强注射，通过静脉或腹腔，一般不加入佐剂。采用该方案在约40天后产生抗原特异性的生成抗体的B细胞。还可以使用其他方案只要其结果为生成表达针对免疫接种使用的抗原的抗体的B细胞即可。在另一个实施方式中，从未经免疫的非人哺乳动物中分离淋巴细胞，在体外培养，然后将其与细胞培养基中的免疫原接触。然后收集淋巴细胞并进行下文所述的融合步骤。
对于单克隆抗体而言，其优选用于生产在本发明的方法中使用的激动性抗体，下一个步骤是从免疫的非人哺乳动物中分离细胞例如淋巴细胞、脾细胞或B细胞，并在随后将脾细胞或B细胞或淋巴细胞与永生化的细胞融合以形成生成抗体的杂交瘤。分离脾细胞如从非人哺乳动物中分离是本领域所公知的并且通常涉及从己麻醉的非人哺乳动物中摘取脾，切成小块并从脾膜上挤下脾细胞并通过尼龙筛细胞过滤器将其滤入适当的缓冲液中以制备单细胞悬液。洗涤细胞，离心并将其重悬于能够使所有红细胞裂解的缓冲液中。将溶液再次离心并将剩余的淋巴细胞团最终重悬于新鲜的缓冲液中。一旦分离并存在于单细胞悬液中，产生抗体的细胞与永生化的细胞系融合。其通常是小鼠骨髓瘤细胞系，尽管本领域公知也可以使用多种其他的永生化细胞系制备杂交瘤。优选的鼠源性骨髓瘤细胞系包括但不限于来自美国加利福尼亚州的圣地亚哥的SaIk Institute Cell DistributionCenter的MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤，来自美国模式培养物保藏中心(美国马里兰州洛克威尔)的X63Ag8653和SP-2细胞。使用聚乙二醇或其类似物实现融合。然后，将所得到的杂交瘤在含有一种或多种抑制未融合的、亲代骨髓瘤细胞生长或存活的物质的选择性培养基中培养。例如，如果亲代骨髓瘤细胞缺乏酶次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT或HPRT)，则杂交瘤典型的培养基将包括次黄嘌呤、氨基喋呤和胸腺嘧啶(HAT培养基)，这些物质将阻止HGPRT缺陷细胞的生长。
杂交瘤可以在巨噬细胞饲养层上生长。所述巨噬细胞优选来自分离脾细胞使用的非人哺乳动物的同胞仔并且通常在使用杂交瘤铺板前几天预先给予不完全弗氏佐剂或类似物。融合方法参见例如(Goding，“Monoclonal Antibodies：Principles and Practice，”第59-103页(Academic Press，1986))，其所公开的全部内容通过引用并入本申请。将细胞在选择性培养基中培养足够长的时间以形成集落和生成抗体。通常是7至14天。然后检测杂交瘤集落的上清液生成特异性活化TLR3蛋白的抗体的情况。对生成所需抗体的阳性孔进行检查以确定是否存在一个或多个明显的集落。如果存在一个以上的集落，则可以将细胞重新克隆和培养以确保仅由单一细胞形成了产生所需抗体的集落。通常将具有明显单一集落的阳性孔再克隆和再检测以确保仅检测到和生成了单克隆抗体。
然后将己确证生成TLR3激动性单克隆抗体的杂交瘤在适当的培养基如DMEM或RPMI-1640中扩大培养。或者，杂交瘤细胞可以在动物体内以腹水瘤的形式生长。在经过足够的生长以产生所需的单克隆抗体后，将含有单克隆抗体的生长培养基(或腹水)与细胞分离并将其中存在的单克隆抗体纯化。纯化通常使用凝胶电泳、透析、采用A蛋白或G蛋白层析柱或者与固体支持物如琼脂糖或Sepharose小珠连接的抗小鼠Ig进行(均参见例如，Antibody PurificationHandbook，Amersham Biosciences，发行号18-1037-46，AC版，其所公开的内容均通过引用并入本申请)。通常使用低pH缓冲液(pH3.0或更低的甘氨酸或醋酸盐缓冲液)将结合的抗体从A蛋白/G蛋白层析柱上洗脱并立即中和含有抗体的组分。根据需要将这些组分集中、透析并浓缩。在特定实施方式中，将编码激动TLR3的抗体的DNA从杂交瘤中分离，并且置于适当的表达载体中以转染进入适当的宿主。然后使用宿主重组生产抗体、及其变体、及其活性片段或人源化的或者包含抗体的抗原识别部分的嵌合抗体。使用常规的方法能够容易地将编码本发明单克隆抗体的DNA分离并测序(例如，使用能够与编码鼠源性抗体重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)。一旦分离，可以将DNA置于表达载体中，然后将其转染至宿主细胞如大肠杆菌细胞、猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或者不会产生免疫球蛋白的骨髓瘤细胞以便在重组宿主细胞中合成单克隆抗体。编码抗体的DNA在细菌中重组表达是本领域所公知的(参见例如：Skerra等，(1993)Curr.Op.Immunol.5：256；和Pluckthun(1992)Immunol.Revs.130：151)。
还可以通过免疫球蛋白组合文库的筛选生产抗体，例如：Ward等，(1989)Nature341：544中所公开的。TLR3激动性抗体可以是全长抗体或抗体片段或衍生物。抗体片段的例子包括Fab、Fab′、Fab′-SH、F(ab′)2和Fv片段；双体；单链Fv(scFv)分子；仅含有一个轻链可变结构域的单链多肽，或者含有轻链可变结构域的三个CDR的其片段，无相关的重链部分；仅含有一个重链可变区的单链多肽，或者含有重链可变区的三个CDR的其片段，无相关的轻链部分；和由抗体片段形成的多特异性抗体。这种片段和衍生物以及制备其的方法是本领域公知的。例如，可以使用胃蛋白酶消化抗体铰链区的二硫键以生成F(ab)′2，其为Fab的二聚体，其本身即为与VH-CH1通过二硫键连接的轻链。可以在温和条件下将F(ab)′2降解，破坏铰链区的二硫键，以便将F(ab)′2二聚体转化为Fab'单体。Fab'单体基本上是具有部分铰链区的Fab(参见：Fundamental Immunology(Pauled.，第3版1993))。尽管不同抗体片段是通过完整抗体的消化情况定义的，但是本领域技术人员将认识到这种片段可以通过化学方法或使用重组DNA方法重新合成。
小分子TLR3激动剂可以是小于约1500道尔顿的有机分子。可以通过使用TLR3己知的晶体结构(Choe等，Science.309，第581-85页(2005)，其公开的内容通过引用并入本申请)设计和选择(例如，从组合文库中)或合成小分子TLR3激动剂。这种设计或选择可以从选择不同的填入己知双链RNA激动剂结合的假定的结合口袋的部分开始。有多种选择填入各结合口袋的部分的方法。这些包括通过进入不同结合口袋的选定部分的晶体结构和手动对接模型阐述的对活性位点的物理模型或计算机模型的目测检测结果。可以使用本领域公知的和可获得的建模软件。这些包括QUANTA[Molecular Simulations，Inc.，Burlington，Mass.，1992]和SYBYL[Molecular Modeling Software，Tripos Associates，Inc.，St.Louis，Mo.，1992]。该建模步骤可能在使用标准分子力学力场如CHARMM和AMBER将能量最小化之后。(Weiner等，J.Am.Chem.Soc，1984，106，765；Brooks等，J.Comp.Chem.1983，4，187)。此外，有多种更加专业的计算机程序以辅助优化将完整分子或分子片段放入TLR3激动剂结合位点的过程。这些包括：GRID(Goodford.P.J.A Computational Procedure for Determining EnergeticallyFavorable Binding Sites on Biologically Important Macromolecules.J.Med.Chem.1985，28，849-857)。GRID来自英国牛津的牛津大学；MCSS(Mariner，A.；Karplus，M.Functionality Maps of Binding Sites：A Multiple Copy Simultaneous SearchMethod.Proteins：Structure，Function and Genetics1991，11，29-34)。MCSS来自马萨诸塞州伯灵顿的Molecular Simulations公司；和DOCK(Kuntz，I.D.；Blaney，J.M.；Oatley，S.J.；Langridge，R.；Ferrin，T.E.A Geometric Approach toMacromolecule-Ligand Interactions.J.Mol.Biol.1982，161，269-288)。DOCK来自加利福尼亚州旧金山的加利福尼亚大学。
一旦选定了适宜的结合方向，则可以选择完整的分子进行生物学评估。在分子片段的情况下，可以将其组装成单一的激动剂。可以通过将不同部分与中心支架连接完成该组装。可以通过例如通过目测检查随后人工建立模型，再使用软件如Quanta或Sybyl完成组装过程。也可以使用多种其他程序辅助选择连接不同部分的方法(Bartlett等，CAVEAT：A Program to Facilitate the Structure-DerivedDesign of Biologically Active Molecules.In“Molecular Recognition in Chemical andBiological Problems，”Special Pub.，Royal Chem.Soc.1989，78，182-196)。除了上述激动剂化合物的计算机辅助建模以外，可以使用TLR3的空激动剂结合位点或者可选地包括己知激动剂的一些部分构建TLR3激动剂。这种方法是本领域公知的。
可以使用常用于将药物建模的多种技术(参见综述：Cohen等，“MolecularModeling Software and Methods for Medicinal Chemistry，”J.Med.Chem.，1990，33，883)。在化学技术文献中同样有多个例子可以用于特定的药物设计项目中。参见综述：Navia，M.A.和Murcko，M.A.，Current Opinions in Structural Biology.1992，2，202。这些特定应用的一些例子包括：Baldwin，J.J.等，J.Med.Chem..1989，32，2510；Appelt，K.等，J.Med.Chem..1991，34，1925和Ealick，S.E.等，Proc.Nat.Acad.Sci.USA.1991，88，11540。或者通过筛选现有的TLR3激动剂的小分子化学文库设计或模拟小分子TLR3激动剂。可以通过本领域公知的任意TLR3激动剂检测筛选这种文库，包括本申请所公开的那些。可以使用更高通量的检测初始筛选化合物文库，如使用己知的标记TLR3激动剂的竞争性检测，如双链RNA分子polyLpolyC或polyA：polyU。然后对在竞争性检测中呈阳性的化合物进行进一步检测以评估其活化TLR3以及导致随后一系列的生化事件的能力。
基于TLR3激动剂的核酸包括双链核糖核酸区域。术语“双链”指激动剂的一部分，其中核糖核苷酸与互补的核糖核苷酸通过氢键键合(碱基对)以形成双链结构。优选地，整个基于核酸的TLR3激动剂由核糖核苷酸和化学修饰的核糖核苷酸组成(“dsRNA TLR3激动剂”)。更优选地，在体内条件下至少50％的dsRNA TLR3激动剂处于双链构象。甚至更优选地，在体内条件下至少60％、70％、80％、90％、95％或97％的dsRNA TLR3激动剂处于双链构象。通过使用碱基对中的核苷酸数除以分子中的核苷酸总数确定处于双链构象的dsRNA TLR3激动剂的百分率。这样，在3′和5′端均含有2个核苷酸悬突的21个碱基对的分子具有作为碱基对的42个核苷酸和不是碱基对的4个核苷酸，这使得其具有42/46或91.3％的双链。类似地，包含两条21个核苷酸的链且除了在各条链中部的两个核苷酸以外所有的核苷酸均彼此互不的分子将具有作为碱基对的38(19+19)个核苷酸和不是碱基对的4(2+2)个核苷酸。该分子具有38/42或90.5％的双链。
dsRNA TLR3激动剂的双链区可以通过单链RNA分子的自身互补(例如，茎环结构，如发夹RNA和shRNA)，通过彼此的全部或部分杂交的两个RNA分子(如在双链RNA中)，或这两者的混合物(例如，RNA分子部分自身互补并且另一个RNA与前者在形成发夹后仍保持单链的区域杂交)形成。dsRNATLR3激动剂还可以包括单链区域如在激动剂末端的3′和/或5′悬突，和/或在激动剂内的“错配”和“环出”结构。在shRNA的情况下，dsRNA TLR3激动剂由存在于表达载体上的DNA序列编码。表达载体是给予主体的分子。表达载体通常包括由RNA聚合酶II或E1活化的启动子和终止子序列，其均可操作地与shRNA编码序列连接以确保其适当地转录。由RNA聚合酶π活化的启动子包括但不限于U6、tRNAval、H1及其经修饰的版本。由RNA聚合酶III活化的启动子包括但不限于CMV和EF1α。在一个实施方式中，启动子是诱导性启动子或肿瘤细胞特异性启动子。在本申请的范围内，术语“dsRNA TLR3激动剂”指包含双链区的任意具有治疗或预防作用的RNA化合物。这种化合物通常本身具有活性；其不编码多肽或不需要通过翻译被激活。dsRNA TLR3激动剂可以是任意长度。优选地，dsRNA TLR3激动剂的长度为至少约10个碱基对(bp)、20bp、30bp、50bp、80bp、100bp、200bp、400bp、600bp、800bp或1000bp。在一个方面，dsRNATLR3激动剂是链长小于30bp、50bp、80bp、100bp或200bp的短dsRNA。在另一个实施方式中，dsRNA TLR3激动剂是更长的dsRNA，但是其链长小于400bp、600bp、800bp或1000bp。在另一个实施方式中，dsRNA TLR3激动剂是链长大于1000bp的长dsRNA。在一个方面，dsRNA TLR3激动剂是包含dsRNA分子异质混合物的组合物，其中多个分子具有不同的长度。优选地，在这种组合物中dsRNA分子的平均长度至少约10bp、20bp、30bp、50bp、80bp、100bp、200bp、400bp、600bp、800bp或100bp。在另一个实施方式中，dsRNA TLR3激动剂组合物包含多个dsRNA分子，其中至少20％、50％、80％、90％或98％的dsRNA分子的长度为每条链至少约10bp、20bp、30bp、50bp、80bp、100bp、200bp、400bp、600bp、800bp或1000bp。在一个例子中，dsRNA是10至30之间的短dsRNA，更优选地每条链为20至30bp。在另一个例子中，dsRNA TLR3激动剂组合物是dsRNA分子基本上均质的混合物，其中各条链上的所有分子的链长之间的差异均不超过30bp、50bp、80bp、100bp或200bp。通过例如凝胶渗透层析能够容易地确定组合物中dsRNA TLR3激动剂的平均链长。在这种组合物中的一个或多个dsRNA分子可选地是癌抗原靶向的siRNA分子。dsRNA TLR3激动剂中的核糖核苷酸可以是天然的或合成的，并且可以是天然核苷酸的化学修饰衍生物或类似物。修饰包括稳定化修饰，并且其可以在磷酸二酯键中和/或糖基上，和/或碱基上包括至少一个修饰。例如，dsRNA的一条或两条链可以独立地包括一个或多个硫代磷酸酯键、二硫代磷酸酯键和/或甲基磷酸酯键；在糖基2′-位的修饰，如2'-O-甲基修饰、2'-O-甲氧基乙基修饰、2′-氨基修饰、2′-脱氧修饰、2′-卤代修饰如2′-氟代；上述的组合如2′-脱氧-2′-氟代修饰；无环核苷酸类似物，并且还可以包括至少一个磷酸二酯键。
在dsRNA TLR3激动剂中使用的寡核苷酸还可以包括碱基修饰或取代。修饰的碱基包括其他合成的或天然存在的碱基如5-甲基胞嘧啶(5-Me-C)、5-羟基甲基胞嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和肌苷的6-甲基和其他烷基衍生物、腺嘌呤和肌苷的2-丙基和其他烷基衍生物、2-硫尿嘧啶和2-巯基胞嘧啶、5-卤代尿嘧啶和胞嘧啶、5-丙炔(-C＝C-CH3)尿嘧啶和胞嘧啶以及嘧啶碱基的其他炔基衍生物、6-偶氮尿嘧啶和胞嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫尿嘧啶、8-卤代、8-氨基、8-硫代、S-硫代烷基、8-羟基和其他8-取代腺嘌呤和肌苷、5-卤代特别是5-溴、5-三氟甲基和其他5-取代尿嘧啶和胞嘧啶、7-甲基肌苷和7-甲基腺嘌呤、2-F-腺嘌呤、2-氨基-腺嘌呤、8-氮杂肌苷和8-氮杂腺嘌呤、7-脱氮杂肌苷和7-脱氮杂腺嘌呤以及3-脱氮杂肌苷和3-脱氮杂腺嘌呤。
其他修饰包括3′-和/或5′-末端加帽、末端Y-5'键连以及5′-末端磷酸基团或修饰的磷酸基团。末端加帽部分的例子包括但不限于反转的脱氧碱基部分、反转的脱氧核苷酸或甘油基部分。此外，一条或两条链(在双链dsRNA TLR3激动剂中)可以是或包括由通过接头连接的两个或多个寡核苷酸序列组成的连环体。所有的这些修饰均是本领域公知的。(参见例如：Kandimalla等，“2003)Nucl.Acid.Res.31(9)：2393-2400)。此前评估双链RNA(dsRNA)作为有效的干扰素诱导剂能力的研究表明dsRNA剂必须具有双链螺旋的二级结构。适于作为TLR3激动剂的其他dsRNA被证明包括双链聚核苷酸，其不是互补的或不完全是互补的；其具有己知称为“错配”或“环出”的结构并存在于天然存在的RNA如转移tRNA、核糖体RNA和病毒RNA二级结构中。一个常提及的dsRNA化合物Ampligen，包括一个结构其中在poly Lpoly C结构中的部分胞嘧啶被尿嘧啶(即，错配的RNA)取代；己报道该化合物具有与母体poly Ipoly C具有类似的生理活性。然而，人们将意识到在本申请的方法中可以使用任意类型和构象的TLR3激动剂。在通常情况下，聚核苷酸需要对核酸酶具有抗性以使其在足够长的时间内保持大分子形式；当其是双螺旋复合体时聚核苷酸对核酸酶的攻击具有较低的敏感性。然而，某些类似物如AmpligenTM似乎保持了其TLR3激动剂的活性。在特定实施方式中，这些dsRNA的各链可以具有约5至50个碱基的长度，更优选地为5至40、35、30、25或20个碱基。各链优选完全与另一条链互补。这种dsRNA优选的例子是均聚RNA如dsRNA，其中各链均基本上包含相同碱基的重复；或包含均聚RNA区域。
在这种均聚RNA链中的碱基可以是任意天然存在的碱基(例如，polyA、polyU、polyC、polyG)或非天然存在的(例如，化学合成的或修饰的)碱基(例如，polyl)。聚核苷酸典型的例子是聚肌苷酸聚胞苷酸即poly(I)：poly(C)或poly LC和聚腺苷酸-尿苷酸即poly(A)：poly(U)或poly A：U，其均为本领域公知的化合物并且己知通过免疫细胞诱导干扰素生成。因此，在一些实施方式中，本发明使用的TLR3激动剂是选自下组的双链RNA：聚肌苷酸和聚胞苷酸、聚腺苷酸和聚尿苷酸、聚肌苷酸类似物和聚胞苷酸、聚肌苷酸和聚胞苷酸类似物、聚肌苷酸类似物和聚胞苷酸类似物、聚腺苷酸类似物和聚尿苷酸、聚腺苷酸和聚尿苷酸类似物以及聚腺苷酸类似物和聚尿苷酸类似物。本申请所使用的术语“类似物”指上文所述的任意核苷酸修饰。人们将意识到dsRNA TLR3激动剂可以包含碱基的任意组合并且可以使用任意适宜的方法设计。优选地，对双链区域的基本要求是考虑对核酸酶攻击的稳定性和抗性以及对链长度的参数选择。可以通过例如参照rAn：rUn或rIn：rCn复合物检测和评估任意dsRNA TLR3激动剂的这些性质以及相对的TLR3激动活性。可以采取措施以增加其对核酸酶的稳定性和抗性或者增加或可选地降低其干扰素诱导的作用。
dsRNA的其他例子包括美国专利号5，298，614和6，780，429中描述的核酸。美国专利号5，298，614中公布了当双链核酸衍生物的链长限定在某一范围时，所得到的物质显示出所需的生理活性且具有非常低的毒性，其具有以碱基对数计算长度为约50至10，000的聚核苷酸。还公开了一个衍生物，其中在核酸聚合物中的嘌呤或嘧啶环被至少一个SH基团取代，或者所述的衍生物含有二硫键，或者具有这两者(在polyC中存在的硫原子与胞苷酸的数量的比例优选1：6至39)。美国专利号6，780，429中描述了一种特定类型的dsRNA化合物，其是“链缩短的”，具有以碱基对数计算长度为约100至1，000，或者优选地为200至800，和更优选地为300至600。己报道后面的化合物通过某种方法设计含有较低数量的2′-5′磷酸二酯键以避免磷酸基通过称为假旋转的机制由3′位向2′位的分子内重排，其可能在聚核苷酸水解过程中同时发生，使得在链缩短的聚核苷酸分子中部分3′-5′磷酸二酯键被2′-5′麟酸二酯键替代。
能够适于作为TLR3激动剂使用的其他核酸激动剂参见：Field等：Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.58，1004，(1967)；Field等：Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.58，2102，(1967)；Field等：Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.61，340，(1968)；Tytell等：Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.58，1719，(1967)；Field等：J.Gen.Physio1.56，905(1970)；以及De Clercq等：Methods in Enzymology，78，291(1981)。己描述了多种合成的核酸衍生物，包括均聚物-均聚物复合物(双链核酸聚合物如poly I：C或poly A：U作为母体结构的那些)，其中这些均聚物-均聚物复合物含有：(1)碱基修饰，例如聚肌苷酸-聚(5-溴代胞苷酸)、聚肌苷酸-聚(2-硫代胞苷酸)、聚(7-脱氮杂肌苷酸)-聚胞苷酸、聚(7-脱氮杂肌苷酸)-聚(5-溴代胞苷酸)和聚肌苷酸-聚(5-硫代尿苷酸)；(2)糖修饰，例如聚(2′-叠氮基肌苷酸)-聚胞苷酸；和(3)磷酸修饰，例如聚肌苷酸-聚(胞苷基-5′-硫代磷酸)。己描述的其他合成的核酸衍生物包括互换共聚物，例如聚(腺苷酸-尿苷酸)；均聚物-共聚物复合物，例如聚肌苷酸-聚(胞苷酸-尿苷酸)和聚肌苷酸-聚(胞苷酸-4-硫代尿苷酸)。己描述的其他合成的核酸衍生物包括合成的核酸与聚阳离子的复合物，例如聚肌苷酸-聚胞苷酸-聚-L-赖氨酸羧基-甲基纤维素复合物(称为“Poly ICLC”)。合成核酸衍生物的又一个例子是聚肌苷酸-聚(1-乙烯基胞嘧啶)。
TLR3激动剂的一个例子是AMPLIGENTM(美国马里兰州罗克维尔的Hemispherx，Inc.公司)，其是由聚核糖肌苷/聚核糖胞苷/尿苷酸复合形成的dsRNA，如rIn：r(Cx、U或G)n，其中x的值是4至29，例如rIn：r(Ci2U)n-。己研究了多种性质与AMPLIGENTM相似的错配dsRNA聚合物；将基于poly LC的错配dsRNA包括在聚肌苷和聚胞苷的复合物中，其含有某一尿嘧啶碱基或胍碱基的比例，例如1：5至1：30的这种碱基。如在美国专利号3，666，646中的描述，己报道与其他形式的天然和/或合成的dsRNA相比错配dsRNA的关键治疗益处是化合物的毒性降低。根据本发明的双链RNA的特定例子进一步包括Polyadenur(Ipsen公司)和Ampligen(Hemispherx公司)。Polyadenur是polyA/U RNA分子，即含有polyA链和polyU链。Polyadenur己开发用于乙型肝炎病毒(HBV)感染的潜在治疗。AMPLIGENTM是polyl/polyC的混合物(或其变体，含有polyI/polyCl2U RNA分子)。AMPLIGENTM己在例如EP281380或EP113162中公开。AMPLIGENTM己拟用于治疗癌症、病毒感染和免疫病症。主要开发其用于肌痛性脑脊髓盐(ME，或慢性疲劳综合征/慢性疲劳免疫功能障碍综合征，CFS/CFIDS)的潜在治疗。
供使用的dsRNA的特定例子是包括polyA/polyU区的dsRNA，其中所述dsRNA的各链均含有少于25个碱基。供使用的dsRNA的另一个例子是包括polyI/polyC(U)区的dsRNA，其中所述dsRNA的各链均含有少于25个碱基。己在文献中公开了或者可以开发更多的dsRNA，可以将其用于本发明的方法中。更通常的，如本申请所公开的，可以使用任意合成的双链均聚RNA，以及任意其他的dsRNA。在一个实施方式中，dsRNA完全是双链(例如，平末端；无悬突)polyA：polyU分子，其由19至30个碱基对(例如，19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个碱基对)组成并且含有1至30个稳定化修饰和/或3′和/或5′帽。稳定化修饰和帽如上文所述并且其为本领域所公知的。稳定化修饰和/或存在的帽使dsRNA对血清降解具有更高的抗性。稳定化修饰包括硫代磷酸酯核苷酸间键、2′-脱氧核糖核苷酸、2′-O-甲基核糖核苷酸、2′-脱氧-2′-氟代核糖核苷酸、“通用碱基”核苷酸、“无环”核苷酸、5-C-甲基核苷酸和末端掺入甘油基和/或反向脱氧碱基残基并入。这些化学修饰己知会显著增加dsRNA化合物的血清稳定性。稳定的dsRNA的一个例子是STEALTHTM RNAi(可以从美国加利福尼亚州的卡尔斯班的Invitrogen公司购买获得)。稳定的dsRNA的另一个例子是poly-ICLC(Hiltonol，由Oncovir生产)。
在另一个实施方式中，dsRNA TLR3激动剂是siRNA分子或shRNA分子，其被设计特异性的与编码肿瘤细胞的抗原或参与肿瘤增殖的另一个蛋白的mRNA杂交。在这个实施方式中，dsRNA分子在癌症治疗中具有双重作用。其是TLR3激动剂和特定肿瘤抗原表达的抑制剂。己证实靶向细胞蛋白的siRNA分子和shRNA分子均显示出序列依赖性基因抑制和不依赖于序列的由TLR3介导的作用(K.Kariko等，J.Immunol..2004，172：6545-6549)。因此，预计肿瘤抗原或或肿瘤增殖特异性siRNA和shRNA分子在癌细胞中也将是TLR3的激动剂。
其他Toll样受体3(TLR1-9)的配体己知也活化NF-kB通路：己鉴定在哺乳动物中共有13种TLR，包括己广泛研究的9种(TLR1-9)并且己知其活化NF-κB通路。
活化的TLR募集细胞胞质中的接头分子以启动信号转导。己知至少有四个接头分子MyD88、TIRAP(Mal)、TRIF和TRAM参与信号。
TLR信号被划分成两个不同的信号通路MyD88依赖性和TRIF依赖性通路。MyD88依赖性应答发生在TLR受体的二聚化上，并且其被除TLR3以外的每个TLR所利用。MyD88活化的主要作用是激活NF-κB。MyD88(TIR家族成员)募集IRAM激酶IRAK1、IRAK2和IRAK4。IRAK激酶磷酸化并活化信号蛋白TRAF6，其反过来将蛋白TAK1以及其自身聚泛素化以便与IKKβ结合。结合后，TAK1将IKKβ磷酸化，其然后将IκB磷酸化，这导致其降解并且使得NF-κB进入细胞核并激活转录。
TRL3和TRL4均利用TRIF依赖性通路，其分别由dsRNA和LPS触发。对于TRL3而言，dsRNA导致受体活化，募集接头TRIF。TRIF活化激酶TBK1和RIP1。TRIF/TBK1信号复合物将IRF3磷酸化，促进其进入核并生成I型IFN。RIP1的活化导致聚泛素化和TAK1的活化(与MyD88信号和NF-κB转录的接头通路，其与其他TLR信号的MyD88依赖性通路相似)。
IV.前列腺素合成抑制剂
前列腺素特别是前列腺素E2(PGE2)参与了多种不同的生理和病理生理功能。这些类花生酸类物质由前列腺素内过氧化物合成酶作用于花生四烯酸生成。前列腺素内过氧化物合酶的活性来自于两个不同的和独立的调节同工酶，将其称为前列腺素内过氧化物合成酶-1和前列腺素内过氧化物合成酶-2并且由两个不同的基因编码。
前列腺素内过氧化物合成酶-1是持续性表达的并且认为其特别是在血小板聚集、胃内细胞保护和正常肾功能的调节中具有生理作用。前列腺素内过氧化物合成酶-2(PGE2)是诱导性同工酶并且前列腺素内过氧化物合成酶-2的表达被多种试剂包括内毒素、细胞因子和分裂素诱导。重要的是，在促炎性刺激下体内前列腺素内过氧化物合成酶-2被诱导至显著水平。
前列腺素内过氧化物合成酶-2选择性抑制剂的两种一般结构类型常见于文献的报道。除了在体外选择性抑制前列腺素内过氧化物合成酶-2以外，多种这些化合物在大鼠佐剂诱导的关节炎模型中均具有抗炎活性并且与现有的抗炎剂相比起其具有预料不到的安全性性质。这些结构类型包括三环非酸性芳基甲基砜(例如DuP697和SC8092)和酸性磺酰胺(例如Flosulide和NS-398)(图2)。在三环非酸性化合物如SC8092中的芳基甲基磺酰基部分在前列腺素内过氧化物合成酶-2的选择性抑制中起重要作用，与前列腺素内过氧化物合成酶-1的选择性抑制剂SC8076的硫化物官能团相比，这些化合物如SC8092中的砜基团减少。
PGE2抑制剂包括Cox-2抑制剂。用于本发明的适宜的COX-2抑制剂包括下述化合物或其衍生物或其药学上可接受的盐，或其任意的水合物：罗非昔布、依托昔布、塞来昔布、伐地昔布、帕瑞昔布。用于本发明的其他类型的Cox-2抑制剂化合物是甲烷磺酰苯胺类抑制剂，NS-398、氟舒胺和尼美舒利均是其示例性成员。还有-类COX-2抑制剂是三环类抑制剂，还可以进一步将其分为具有中央碳环的(例子包括SC-57666，1和2)；那些具有中央单环杂环的(例子包括DuP697、SC-58125、SC-58635、SC236以及3、4和5)和那些具有中央双环杂环的(例子包括6、7、8、9和10)三环类抑制剂小类。化合物3、4和5参见美国专利号5，474，995。COX-2抑制剂的又一个类型可以是结构修饰的NSAIDS。除了结构分类、亚类、特异性COX-2抑制剂化合物的例子以外，选择性抑制环氧合成酶-2的化合物的例子还可参见下述专利申请，其全部内容通过引用并入本申请：美国专利号5，344，991；5，380，738；5，393，790；5，409，944；5，434，178；5，436，265；5，466，823；5，474，995；5，510，368；5，536，752；5，550，142；5，552，422；5，604，253；5，604，260；5，639，780；和国际专利说明书号94/13635、94/15932、94/20480、94/26731、94/27980、95/00501、95/15316、96/03387、96/03388、96/06840：和国际公开号WO94/20480、WO96/21667、WO96/31509、WO96/36623、WO97/14691、WO97/16435。一些上述化合物也可以以下述化学名表示：3：3-苯基(4-(甲基磺酰基)苯基)-2-(5H)-呋喃酮；4：3-(3，4-二氟苯基)-4-(4-(甲基磺酰基)苯基)-2-(5H)-呋喃酮；5：5，5-二甲基-4-(4-(甲基磺酰基)苯基)-3-(3-氟苯基)-H-呋喃-2-酮；12：5，5-二甲基-4-(4(甲基磺酰基)苯基)-3-(2-丙氧基)-5H-呋喃-2-酮；13：5-氯-3-(4-(甲基磺酰基)苯基)-2-(2-甲基-5-吡啶基)吡啶；14：2-(3，5-二氟苯基)-3-(4-(甲基磺酰基)苯基)-2-环戊烯-1-酮；15：5(S)-5-乙基-5-甲基-4-(4-甲基磺酰基)苯基)-3-(2-丙氧基)-5H-呋喃-2-酮；16：5-乙基-5-甲基-4-(4-(甲基磺酰基)苯基)-3-(3，4-二氟苯基)-5H-呋喃-2-酮；17：3-((2-噻唑基)甲氧基)-4-(4-甲基磺酰基)苯基)-5，5-二甲基-5H-呋喃-2-酮；18：3-丙氧基-4-(4-甲基磺酰基)苯基)-5，5-二甲基-5H-呋喃-2-酮；19：3-(1-环丙基乙氧基)-5，5-二甲基-4-(4-甲基磺酰基)苯基)-5H-呋喃-2-酮；20：2-(4-氯苯基)-3-(4-甲基磺酰基)苯基)-4-氧-2-戊烯酸甲酯钠；21：3-(环丙基甲氧基)-5，5-二甲基-4(4-甲基磺酰基)苯基)-5H-呋喃-2-酮；22：3-(环丙基甲氧基)-5，5-二甲基-4-(4-甲基磺酰基)苯基)--2，5-二氢呋喃-2-醇；23：33-异丙氧基-5，5-二甲基-4-(4-甲基磺酰基)苯基)-2，5-二氢呋喃-2-醇；24：5，5-二甲基-3-(3-氟苯基)-2-羟基-4-(4-甲基磺酰基)苯基)-2，5-二氢呋喃；25：5-氯-3-(4-甲基磺酰基)苯基)-2-(3-吡啶基)吡啶。亦参见美国专利号7，345，088，其通过引用并入本申请。
最常用的选择性COX-2抑制剂的例子包括塞来昔布、alecoxib、伐地昔布和罗非昔布。
最常用的非选择性COX1和COX2抑制剂的例子包括：乙酰水杨酸(阿司匹林)和其他水杨酸盐、对乙酰氨基酚(泰诺)、布洛芬(雅维、Motrin、Nuprin、Rufen)、萘普生(Naprosyn，Aleve)、萘丁美酮(瑞力芬)或双氯芬酸(凯扶兰)。
V.前列腺素应答抑制剂
前列腺素的主要抑制性和肿瘤促进作用由腺苷酸环化酶的激活所介导，其使得细胞内环(c)AMP、PKA升高以及下游PKA/CREB通路活化。
干扰PG应答的另一个层面包括干扰其与PG受体结合。在PGE2的情况下，两种关键的cAMP活化受体是EP2和EP4，针对其存在多种特异性抑制剂。
由前列腺素或其他因素诱导的cAMP水平升高能够被磷酸二酯酶(PDE；目前己知有6种类型，PDE1-PDE5和PDE10，其使细胞内cAMP的水平降低)所阻止。PDE能够被磷酸二酯酶抑制剂控制，其包括例如物质如黄嘌呤(咖啡因、氨茶碱、IBMX、己酮可可碱、可可碱、茶碱或副黄嘌呤)其均使得细胞内cAMP的水平升高，以及更多选择性合成的和天然的因子，包括长春西汀、西洛他唑、氨力农、西洛他唑、松叶菊碱、咯利普兰、异丁司特、屈他维林、吡拉米司特、西地那非、他达拉非、伐地那非或罂粟碱。
而且，可以通过抑制cAMP的下游信号如PKA或CREB干扰PGE2信号(或干扰其他cAMP升高因子的信号如组胺，β肾上腺素受体激动剂)。
VI.组合物和治疗方法
本申请公开的方法用于预防或治疗癌症和其他疾病，包括炎症、自身免疫性疾病、器官排斥和移植物抗宿主病(GvH)。能够应用本申请公开的方法的癌症类型的例子包括下述，但不限于：结直肠癌、肺癌、喉癌、黑色素瘤、非黑色素瘤的皮肤癌、神经胶质瘤、卵巢癌、乳腺癌、子宫内膜癌、宫颈癌、胃癌、食道癌、胰腺癌、胆囊癌、肾癌、膀胱癌、外阴癌、神经内分泌癌、前列腺癌、头颈癌、软组织肉瘤、骨癌、间皮瘤、内分泌来源的癌症、血液系统恶性肿瘤包括但不限于多发性骨髓瘤、淋巴瘤和白血病、己知与发展成癌症的风险增加相关的癌前病变。该方法包括给予治疗有效量的药剂，所述药剂增加IP10/CXCL10、MIG/CXCL9、RANTES/CCL5和其他促炎性趋化因子的产生。这种方法包括给予治疗有效量的Toll样受体激动剂或者其他的NF-κB通路激活剂，与给予治疗有效量的前列腺素合成或cAMP依赖性前列腺素信号的抑制剂，与给予治疗有效量的干扰素，或者这两者联用，以产生二元佐剂或三元佐剂。
如果与一种或多种其他治疗剂联用后诱导所需的应答如发展成癌症的风险降低或癌症的指征和症状减轻，则认为治疗剂的量有效。在一个例子中，为需要在主体中预防或推迟肿瘤进展的药剂的量。在另一个例子中，为需要在主体如患有黑色素瘤或结直肠癌的主体中预防或推迟肿瘤转移、导致现有的肿瘤消退、或者治疗与肿瘤相关的一个或多个指征或症状的药剂的量。在理想情况下，治疗有效量在主体中提供了治疗效果同时基本上不会导致不良反应。本申请所公开的制剂以治疗有效量给予。
在一个例子中，所需的应答是预防肿瘤发展。在另一个例子中，所需的应答是使肿瘤的发展、进展或转移推迟例如至少约3个月、至少约6个月、至少约1年、至少约2年、至少约5年或至少约10年。在进一步的例子中，所需的应答是减少癌症的发生，如结直肠癌或黑色素瘤。在另一个例子中，所需的应答是减轻癌症的指征和症状，如肿瘤的尺寸、体积或数量或者转移。例如，在一些例子中，与缺乏治疗组合物时的应答相比，所述组合物能够使肿瘤(如结直肠肿瘤)的尺寸、体积或数量减小所需的量，例如至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少50％、至少75％或甚至至少90％。
包括一种或多种本申请公开的药剂的组合物在所述载体中提供。可以将组合物制成用于给予个体的单位剂型。给药量和给药周期由主治医师确定以达到所需的目的。可以将药剂制成供系统或局部(如瘤内)给药的制剂。在一个例子中，将药剂供胃肠外给药的制剂如静脉给药。
供给药的组合物可以包括用于将药剂溶解在药学上可接受载体中的溶液，如水性载体或脂质体的生物相容性制剂或其他生物相容性囊泡或其他缓释基质和载体。可以使用多种水性载体例如缓冲盐水等。这些溶液是无菌的并且通常不含不需要的物质。可以采用常规的、公知的灭菌技术对这些组合物灭菌。所述组合物可以根据需要含有药学上可接受的辅助物质以达到所需的生理条件如pH调节和缓冲剂、毒性调节剂等，例如乙酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、乳酸钠等。在这些制剂中的抗体浓度可以广泛改变，并且将根据所选择的特定给药方式和主体的需求主要基于液体体积、粘度和体重等对其进行选择。
用于静脉给药的典型药物组合物包括约0.1至10mg抗体每个主体每天。可以使用0.1至高达约100mg每个主体每天的剂量，特别是将药剂给予隐蔽位点并且不进入循环或淋巴系统如进入体腔或进入器官管腔。制备可给药的组合物的实际方法是本领域技术人员公知的和显而易见的，详情参见这样的出版物如Remington′s Pharmaceutical Science，第19扳Mack Publishing Company，Easton，PA(1995)。
药剂如蛋白可以以冻干形式提供并且在给药前使用无菌水将其再水化，但是其也可以以己知浓度的无菌溶液形式提供。然后将蛋白溶液加入含有0.9％氯化钠USP的输液袋中，并且典型地以0.5至15mg/kg体重的剂量给予。自1997年在美国
Figure BDA0000478253300000371
获批准上市，本领域在给予抗体药物方面具有相当多的经验。药剂可以以缓慢输注形式给药，而非静脉推注或快速注射。在一个例子中，给予较高的负荷剂量，随后给予较低水平的维持剂量。例如，在约90分钟内可以输注给予4mg/kg的初始负荷剂量，如果此前的剂量耐受良好，则连续4-8周每周一次在30分钟内输注给予2mg/kg的维持剂量。
可以给予所述药剂以减缓或抑制细胞生长，如癌细胞。在这些应用中，将治疗有效量的抗体给予主体，其量足以抑制癌细胞的生长、复制或转移，或者抑制癌症如黑色素瘤或结直肠癌的指征或症状。在一些实施方式中，给予主体所述药剂以抑制或预防转移的发展，或减少微转移数，如向局部淋巴结的微转移(Goto等，Clin.Cαncer Res.14(11)：3401-3407，2008)。
所使用的药剂的治疗有效量将依赖于疾病的严重程度和患者的一般健康状况。当对患有结直肠癌或黑色素瘤的主体给药时，药剂的治疗有效量是使症状主观缓解或者经医师或其他有资质的观察人员鉴定客观改善的剂量。这些组合物可以与其他化疗剂同时或顺序的联合给予。
多种化疗剂目前是本领域公知的。其可以采用己公开的方法给予。在一个实施方式中，化疗剂选自下组：有丝分裂抑制剂、烷化剂、抗代谢剂、嵌入抗生素、生长因子抑制剂、细胞周期抑制剂、酶、拓扑异构酶抑制剂、抗存活剂、生物反应调节剂、抗激素例如抗雄激素和抗血管生成剂。
组合物的单次或多次给予取决于所需的给药剂量和频率以及患者的耐受性。所述剂量可以一次性给予，但也可以周期性的应用，直至达到治疗结果或直至出现副作用需要停止治疗。在一个例子中，隔日输注30分钟给予一个剂量的该药剂。在这个例子中，隔日可以给予约1个至约10个剂量，如可以给予3个或6个剂量。在进一步的例子中，连续输注给药约5至约10天。可以以规则的间隔对主体进行治疗如每月一次，直至达到所需的治疗结果。在通常情况下，所述剂量足以治疗或改善疾病的症状或指征，同时不会产生令患者无法接受的毒性。
药物的最佳活性往往要求其长期给药，并且在不同药物联合给药的情况下，可能要求其以特定顺序给药。可以通过使用控制递送系统完成这些要求，以相同或不同的动力学，在相同的时间点开始或顺序释放治疗药物中的一种、三种或更多种组分。
可以将控制释放胃肠外制剂制成植入剂、油性注射剂或颗粒系统。对于蛋白递送系统的全面综述参见Banga，A.J.，Therapeutic Peptides and Proteins：Formulation，Processing，and Delivery Systems，Technomic Publishing Company，Inc.，Lancaster，PA，(1995)，其通过引用并入本申请。颗粒系统包括微球、微粒、微囊、纳米胶囊、纳米球和纳米颗粒。微囊含有治疗性蛋白如细胞毒素或药物作为中心核。在微球中，治疗剂分散于颗粒中。通常分别将小于约1μm的颗粒、微球和微囊称为纳米颗粒、纳米球和纳米胶囊。毛细血管的直径约为5μμm，因此仅有纳米颗粒可以静脉给药。微颗粒的直径通常为约100μμm，皮下或肌内给予。参见例如：Kreuter，J.，Colloidal Drug Delivery Systems，J.Kreuter，ed.，MarcelDekker，Inc.，New York，NY，第219-342页(1994)；和Tice&Tabibi，Treatise onControlled Drug Delivery，A.Kydonieus，ed.，Marcel Dekker，Inc.New York，NY，第315-339页(1992)，其均通过引用并入本申请。
聚合物可以用于本申请公布的化合物的离子控制释放。多种用于控制药物递送的可降解和非可降解聚合物基质是本领域的公知常识(Langer，AccountsChem.Res.26：537-542，1993)。例如，嵌段共聚物泊洛沙姆407在较低温度下是粘性的可流动液体但是在体温下形成半固体凝胶。己显示其是制备和持续递送重组白介素-2和脲酶的有效载体(Johnston等，Phαrm.Res.9：425-434，1992；and Pecetal.，J. Pαrent.Sci.Tech.44(2)：58-65，1990)。或者，羟基磷灰石被使用作为蛋白控制释放的微载体(Ijntema等，Lt.J. Phαrm.112：215-224，1994)。在又一个方面，脂质体被用于控制脂质囊包裹药物的释放和靶向递送(Betageri等，LiposomeDrug Delivery Systems，Technomic Publishing Co.，Inc.，Lancaster，PA(1993))。多种控制治疗性蛋白递送的其他系统也是公知的(参见美国专利号5，055，303；美国专利号5，188，837；美国专利号4，235，871；美国专利号4，501，728；美国专利号4，837，028；美国专利号4，957，735；美国专利号5，019，369；美国专利号5，055，303；美国专利号5，514，670；美国专利号5，413，797；美国专利号5，268，164；美国专利号5，004，697；美国专利号4，902，505；美国专利号5，506，206；美国专利号5，271，961；美国专利号5，254，342和美国专利号5，534，496)。
除非另有说明，否则本申请所使用的所有技术和科学术语均与本领域普通技术人员对其所公开范围的通常理解具有相同的含义。除非上下文另有明示，否则单数形式的术语“一”和“一个”以及“所述”均包括其复数形式。类似地，除非上下文另有明示，否则单词“或”也包括“和”。将进一步理解所有核酸或多肽的碱基尺寸或氨基酸尺寸，以及所有的分子重量或分子量值均是近似的并且是供说明用的。尽管与本申请公开的那些近似的或等效的方法和材料可以用于实施或检测本公开，但是适宜的方法和材料如下文所述。术语“包含”指“包括”。本申请提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献均通过引用整体并入本申请。当存在矛盾时，以本说明书包括对术语的解释为准。此外，材料、方法和例子仅用于解释而非旨在限制。
VII.非限制性例子
通过下述的非限制性例子对本公开的发明进行说明。
实施例1
“表达高水平CCR5和CXCR3的效应型免疫细胞”
我们己经观察到在同时存在IFNα和IFNγ条件下的DC成熟，使得稳定的1型极化DC(DC1)的产生显著增加，而非在随后的刺激中产生IL-12p70的能力“耗竭”。在我们的原始方案中DC1的诱导依赖于牛血清存在。
在我们DC1生成的基本方案(IL-1β/TNFα/IFNγ)中加入IFNα和聚I：C(具有IFNα诱导活性的dsRNA合成类似物)，以便在临床可接受的无血清培养基中开发DC1(即αDC1)。使用黑色素瘤和结直肠癌患者的血液，我们观察到使用DC1诱导极大地增加了黑色素瘤-或CRC-特异性的IFNγ-生成的CTL，其能够识别特定CRC或黑色素瘤特异性表位和相关的肿瘤细胞(图1A-C)。我们的数据表明DC1-诱导的CTL的功能还涉及其能够杀死HLA-A2+癌细胞(图1B)，并且显示出肿瘤归巢相关趋化因子受体：CXCR3和CCR5的表达的显著升高(计算值的10倍)(图1D)。而且，我们己获得的功能性数据(在多克隆模型中)显示αDC1和sDC致敏的CTL之间CKR表达的差异导致差异性的CK应答(图1E)。
实施例2
“在结直肠肿瘤样品中募集效应T细胞(Teff)的趋化因子的表达与效应CD8+T细胞标记物相关，而COX2水平与吸引Treg的CK的过表达和吸引Teff的CK的抑制以及Treg标记物密切相关。”
新鲜获得的未经处理的肿瘤包括黑色素瘤和结直肠癌病灶显示出“所需的”趋化因子(CCR5配体和CXCR3配体)和“不利的”CCL22较高的异质性表达(图2)。重要的是，即使在相同组织类型(黑色素瘤或CRC)和相似部位的肿瘤的组中，不同肿瘤样品各CK的表达显示出显著的异质性。尽管可供使用的样本的数量相对较小(无法在原发和转移病变之间进行正式的统计比较)，肝脏转移CRC显示出在Teff-低/Treg-高的CK类型之间可能存在偏倚(数据未显示)。
这些数据表明一些肿瘤可能可以通过凭借特定趋化因子生成模式排除Teff(在己切除的CRC患者中Teff浸润己被证实可预计长期无复发存活)和优选吸引Treg细胞以避免受到免疫攻击。而且，其暗示在所有肿瘤病变中吸引Teff的趋化因子标准化的过表达可以改善自发开始的抗肿瘤应答的后果和可以通过选择性将Teff细胞指向肿瘤病灶促进癌症的免疫治疗。其暗示有效诱导所需的效应类型免疫细胞(己知主要表达CXCR3和CCR5)的癌症疫苗可能仅能够诱导部分肿瘤消退(表达CXCR3和CCR5配体的)，但是可能需要与肿瘤特异性CK调节方案联用以诱导不能自发吸引Teff细胞以取代吸引Treg的CK过表达的其他肿瘤消退。
使用从72名患有晚期结直肠癌的患者(68名患者转移)中切除的肿瘤材料，我们观察到与两种吸引Teff-的趋化因子CCL5和CXCL10相比，两种Teff细胞标记物(CD8和颗粒酶B；GZMB)的局部表达较强(图3A)。而相反的是，T删标记物FOXP3和GITR与己知的Treg吸引剂CCL22(图3B)相关。在CXCL9(备选的CXCR3配体)与Teff标记物之间和CCL22与CCL22诱导因子(22)COX2之间也观察到了相关性(图4)。
从这些结肠癌患者中获得的CD8+肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)表型分析的结果显示大多数的CD8+实际上是CCR5+CXCR3+和颗粒酶B+的(未显示)，这进一步表明肿瘤内表达的CCR5-和CXCR3-配体负责将效应T细胞募集进入肿瘤。
实施例3
“聚I：C、IFNα和COX抑制剂的组合在肿瘤组织中选择性增强募集Teff的趋化因子的产生并抑制募集Treg的趋化因子。”
为了检测在肿瘤中将趋化因子环境调整成较低的吸引Teff与Treg的趋化因子的比值的可能性，我们在试验性研究中检测了使用IFNα、吲哚美辛(COX1/2抑制剂)和po1y-I：C的不同组合在各肿瘤相关细胞(己知浸润肿瘤)群体如巨噬细胞或成纤维细胞中调节其生成的可行性。我们观察到在巨噬细胞和成纤维细胞中在诱导CCL5和CXCL10的过程中IFNα和poly-I：C之间具有较强的协同作用，IFNα对CCL22的生成具有较强的抑制作用(图5A)。在存在吲哚美辛时这些所需的作用被进一步增强(图5B)。
为了检测使用这些因子操控整个肿瘤组织复杂的微环境包括所有上述的细胞类型及其相互作用，我们使用了此前己开发用于研究DC迁移的离体肿瘤/组织移植培养系统。该系统使我们避免了在肿瘤解离过程中出现趋化因子生成细胞的非特异性活化。
如图6所示，在仅使用IFNα或poly-I：C处理不同的肿瘤组织后显示出多变的趋化因子表达，共分为三种不同类型：最少的CCL5和CXCL10诱导；最小的CCL5诱导但是CXCL10被显著诱导；或者CCL5和CXCL10均被显著诱导(图6A)。在来自不同患者的肿瘤中，甚至在单一患者的不同病灶中均观察到了这种异质性(图6A和6C)。然而，在所有己检测的肿瘤中，将IFNα和poly-I：C组合均使CCL5和CXCL10产生了均一的高表达(图6A和6C)。
再暴露于吲哚美辛(其阻断COX1和COX2)会在整个肿瘤组织中进一步增加由IFNα和poly-I：C的组合诱导的CCL5和CXCL10的生成水平并降低CCL22的水平，这与使用选择性COX2阻断剂得到的结果类似(图6B和6D)。
基于这些数据，我们选择使用IFNα、poly-I：C和吲哚美辛三者的组合作为对所有后续实验的优选处理方式。该组合在所有肿瘤样品中均持续增加CXCL10和CCL5的生成并抑制CCL22的生成(图7)。在CXCL9中也得到的类似的观察结果(数据未列出)。
对HLA-DR(免疫组化)和趋化因子mRNA(ISH)的双染显示HLA-DR+APC主要表达CCL22，而CXCL10和CCL5由HLA-DR+和HLA-DR-细胞表达(未列出)，这表明在肿瘤微环境中的多种肿瘤相关细胞类型为募集Teff的细胞因子的产生做出了贡献。
实施例4
“通过趋化因子调节方案增加肿瘤相关NF-κB的活性使得在肿瘤而非边缘健康组织中选择性的或至少优选的诱导CXCL10：肿瘤选择性趋化因子调节的可能性。”
使用来自患有转移性结肠癌的10名患者的匹配组织样品，我们比较了肝脏转移肿瘤组织和边缘组织对趋化因子调节方案的应答情况。如图8和图9所示，尽管未经处理的肝脏转移肿瘤和边缘肝脏组织之间趋化因子产生的基线差异未达到显著性(P＝0.12)，但是使用IFNα、poly-I：C和吲哚美辛的组合处理肿瘤后，与边缘组织相比，肿瘤组织诱导的CXCL10的分泌更加显著(P＜0.01)。在蛋白和趋化因子基因表达水平，在CCL5中也得到了类似的观察结果。根据糖原磷酸化酶的表达水平未受到干扰的检测结果可知，肿瘤与边缘组织相比应答的增加并不是由于边缘组织的存活降低所致(图9C)。
在黑色素瘤病变与邻近的健康皮肤中也观察到了这种预料之外的趋化因子调节的选择性，这表明我们的发现具有普遍的适用性(图8D)。
在此前报道的NF-κB在CXCL10和其他趋化因子的诱导中具有关键作用以及在癌症病灶中NF-κB信号的普遍增强是肿瘤的存活和生长所急需的驱动下，我们检测了是否是NF-κB活化的潜在差异负责肿瘤与边缘组织对趋化因子调节方案应答能力的差异。
根据这种可能性，我们观察到结直肠癌组织不仅显示出NF-κB活化的基线水平升高(由其核转位率测定)(图8B)，而且在经过IFNα/poly-I：C/吲哚美辛处理后进一步活化NF-κB的能力甚至更加显著(图8B，右图)。通过使用NF-κB抑制剂CAY10470验证了NF-κB在肿瘤组织CXCL10的产生中的关键作用，CAY10470完全消除CXCL10的诱导(图8C)。
CCL5的调节显示出了相似的模式(在肿瘤而非边缘组织中处理诱导上调)并且其也被CAY10470所阻断(补充图S5B)，这显示出在通过趋化因子调节方案产生的吸引Teff的趋化因子的选择性诱导中肿瘤相关NF-κB下调的普遍作用。如在未经和经过处理的组织中糖原磷酸化酶mRNA的表达相似所示(图9C)，在这些实验中所用的CAY10470(20pM)无毒性。
有趣的是，我们的共聚焦显微镜分析表明显示出NF-κB核转位和生成CCL5和CXCL10的大部分细胞均为CD45+浸润的炎性细胞和肿瘤相关成纤维细胞，较少涉及CD326/EpCAM+癌细胞，其生成CCL5(未显示)。
实施例5
“IFNα/poly-I：C/吲哚美辛处理的结直肠肿瘤优选吸引效应CD8+T细胞：使用本趋化因子调节方法的自发产生的或疫苗诱导的CTL趋向肿瘤病变的肿瘤选择性吸引的可能性。”
为了证明由IFNα、poly-I：C和吲哚美辛的组合产生的趋化因子的调节事实上足以影响肿瘤吸引不同亚型T细胞的能力，我们使用了离体药物趋化性检测，该检测中涉及的上清液来自经过不同处理的肿瘤以及扩大肿瘤浸润的CD8+T细胞(TIL)或由负载了αDC1的超级抗原诱导的多克隆离体诱导的效应CD8+T细胞。如图10A-B所示，对所有IFNα/poly-I：C/吲哚美辛处理的肿瘤这两种类型的效应CD8+T细胞均显示出一致的显著增加的迁移应答。而相反的是，根据迁移的血液分离的CD4+T细胞的Taqman分析(图10C)或流式细胞术(未列出)测定，CD4+FOXP3+T细胞优选迁移至未经处理的肿瘤。
实施例6
“靶向NF-κB、PGE2/cAMP和IFN-信号通路附加因素的可行性。”
如图11所示，前列腺素、TLR和干扰素系统之间在不同类型趋化因子的肿瘤选择性调节中的协同机制可能涉及COX2活性和PGE受体表达(EP1-4)的局部差异，TLR3表达细胞浸润的差异，以及TLR表达和应答的调节。我们在图12中列出的数据直接支持了使用多种TLR激动剂和附加的NF-κB激活剂(包括TNFα)的可能性。
实施例7
“在化疗中靶向NF-κB、PGE2/cAMP和IFN-信号通路的理论依据”
图13中的数据显示了使用化疗剂美法仑处理黑色素瘤组织后吸引Treg和吸引Teff的趋化因子比率(CCL22/CXCL10之比)出现了不利的升高，并且塞来昔布(COX2抑制剂)、IFNα和poly-I：C的组合逆转这种化疗不利的作用。这些结果为将本发明的方法引入用于癌症患者的化疗方案以及将所提出的因素引入化疗药制剂(组合的递送系统；组合的物理连锁制剂)中提供了直接的理论支持。
VIII.对实施例中数据的解释和进一步讨论
我们的数据表明了使用临床应用的药理学和生物因素的组合以矫正肿瘤浸润Teff和Treg细胞之间的平衡，肿瘤选择性调节趋化因子环境的可行性，Teff和Treg细胞是己知对癌症的临床过程具有不同影响的免疫细胞类型。重要的是针对这一策略的临床应用，我们观察到尽管各肿瘤病灶(甚至在同一患者中)对各趋化因子调节剂的应答具有较大的差异性(与这种因子单独应用时有限的临床作用一致)，在所检测的肿瘤病灶中，IFNα、poly-I：C和环氧合酶抑制剂合用使得吸引Teff的趋化因子(CCL5和CXCL9-10)高度一致的和选择性的增加，同时伴有局部吸引Treg的趋化因子CCL22一致的抑制。
IFNα/poly-I：C/吲哚美辛诱导的吸引Teff的趋化因子的生成具有较高的肿瘤选择性，这表明即使全身给药这些趋化因子调节因子也能够优选地使效应细胞作用于肿瘤。尽管将不同亚型的T细胞吸引至不同的肿瘤类型己知是由未包括在我们目前分析中的其他趋化因子组成的复杂网络所调控并且可以在趋化因子受体表达水平调节的，例如利用CCR5的多态性，但是我们目前的功能性数据表明拟采用的方案能够均一的促进效应CD8+T细胞(自发产生的TIL和αDC1疫苗诱导的CTL)的内流。CXCR3和CCR5在吸引Th1细胞和NK细胞中的己知作用表明拟采用的方案还能够促进这些其他类型的所需细胞进入肿瘤。
我们观察到拟采用方案的肿瘤选择性取决于肿瘤相关成纤维细胞和浸润炎性细胞(较少涉及肿瘤细胞本身)自发高度活化NF-κB，同时对进一步提高NF-κB活化水平的治疗产生应答。由于NF-κB活化在肿瘤的存活和生长中具有重要作用，其为多种肿瘤类型的固有特征，因此目前的数据表明目前描述的对肿瘤微环境的NF-κB靶向调节可以应用于多种类型的癌症中。
到目前为止我们的分析未揭示出肿瘤和边缘组织之间的IFNα受体、TLR3、IRF1或IRF3的表达之间存在任何差异(数据未列出)，但是我们目前的工作集中于在整个肿瘤组织和不同类型的肿瘤相关细胞中对各通路的差异性调节(对poly-I：C、IFNα和PGE2的应答)。类似地，我们还评估了肿瘤相关细胞对活化的NF-κB的敏感性增加以及不同肿瘤对poly-I：C活化需求的相对异质性的机制，这有助于我们鉴定出趋化因子调节和NF-κB靶向肿瘤治疗的新策略。
对优选实施方式的描述
下文中描述了调节肿瘤微环境(或治疗所关注的其他组织)，靶向TLR(或者其他己知的NF-κB激活剂的受体)、前列腺素/cAMP系统和干扰素以及干扰素信号的方法的一些优选的实施方式：
一个优选的实施方式是给予癌症、癌前病变或此前己治疗癌症的患者治疗有效量的至少两种不同的药剂，所述药剂对于在肿瘤组织中(或其他疾病影响组织)吸引效应细胞的趋化因子如IP-10(CXCL10)和RANTES(CCL5)的生成具有协同的选择性诱导作用，同时抑制或对CCL22的生成没有影响，该趋化因子己知吸引不利的调节性T细胞。
在预防或治疗癌症、一些癌前状态和多种感染的情况下，本发明的一种优选的实施方式是将TLR配体或NF-κB通路的另一种激活剂与前列腺素的抑制剂(或者前列腺素受体的抑制剂和/或其他cAMP升高剂的抑制剂或cAMP信号的抑制剂)联合使用并在之前、同时或之后给予IFNα和/或其他I型或II性干扰素，以选择性增强吸引Teff-的趋化因子的生成，同时抑制吸引Treg-的趋化因子的生成。
在预防或治疗与免疫系统不利的过度活化相关的疾病状态(慢性炎症、一些癌前状态、自身免疫性现象或者移植排斥，包括对所移植器官、组织和分离的细胞的排斥，包括移植排斥和移植物抗宿主(GvH)病)的情况下，本发明的一种优选的实施方式是将TLR配体或NF-κB通路的其他激活剂与前列腺素或其他cAMP升高剂(和潜在附加使用IFN生成或IFN应答的抑制剂)联合使用，以选择性增强吸引Treg的趋化因子的生成，同时抑制吸引Teff的趋化因子的生成。
在一些实施方式中，所提供的在主体中治疗癌症或预防癌症的发生或复发的方法包括给予主体治疗有效量的前列腺素抑制剂或其他cAMP抑制剂以增加IP-10/CXCL10的产生和抑制MDC/CCL22的产生以及治疗有效量的Toll样受体(TLR)激动剂。
在其他实施方式中，所提供的在主体中治疗癌症或预防癌症的发生或复发的方法通过给予主体治疗有效量的干扰素或增加IP-10活性的药剂以及治疗有效量的前列腺素合成抑制剂，以便在主体中治疗或预防结直肠癌。
本发明的一个实施方式是给予主体治疗有效量的(1)Toll样受体(TLR)激动剂，联合(2)前列腺素合成阻断剂、PGE2受体阻断剂或者cAMP信号的阻断剂和/或(3)治疗有效量的干扰素，使用常规的给药系统同时或顺序加入或者使用给药系统的组合以使得各因子以不同的动力学释放。
本发明的另一个实施方式是给予主体治疗有效量的复合分子，包括(1)Toll样受体(TLR)激动剂，(2)前列腺素合成阻断剂、PGE2受体阻断剂或者cAMP信号的阻断剂和/或(3)干扰素或I型或II型干扰素受体的激动剂(抗体或小分子)。一个相关的实施方式是在常规基质(乳剂、脂质体、纳米囊泡、缓释基质、多孔材料)中使用两个或三个上述因子。
本发明的另一个实施方式是给予主体治疗有效量的复合分子，包括(1)Toll样受体(TLR)激动剂，(2)前列腺素合成阻断剂、PGE2受体阻断剂或者cAMP信号的阻断剂和/或(3)干扰素或I型或II型干扰素受体的激动剂(抗体或小分子)，通过同一导管顺序或同时给予。
本发明的另一个实施方式是给予主体治疗有效量的复合分子，包括(1)Toll样受体(TLR)激动剂，(2)前列腺素合成阻断剂、PGE2受体阻断剂或者cAMP信号的阻断剂和/或(3)干扰素或I型或II型干扰素受体的激动剂(抗体或小分子)，使用可植入泵或者两个或多个泵顺序或同时给予。
由于不仅仅是自发生成的肿瘤特异性效应细胞(或针对感染物的效应器细胞)，不同的癌症疫苗诱导的肿瘤特异性效应细胞，包括αDC1或其他类型的1型极化DC(如由LPS和IFNγ联合诱导或者由TNFα和IFNγ联合诱导)也在肿瘤特异性T细胞上表达高水平的CCR5或CXCR3，结合这些疫苗的使用也许对于在肿瘤组织中的肿瘤选择性的CCR5配体和/或CXCR3配体的诱导特别有效。
在预防或治疗与免疫系统不利的过度活化相关的疾病状态(慢性炎症、一些癌前状态、自身免疫性现象或者移植排斥，包括对所移植器官、组织和分离的细胞的排斥，包括移植排斥和移植物抗宿主(GvH)病)的情况下，本发明的一种优选的实施方式是将TLR配体或NF-κB通路的其他激活剂与前列腺素或其他cAMP升高剂(和使用IFN产生或IFN应答的潜在抑制剂)联合使用(同时或顺序)，使用常规基质(乳剂、脂质体、纳米囊泡、缓释基质、多孔材料)、同一导管、可植入泵或若干个泵，或者物理上连接的形式。
而且，本发明的实施方式还包括：
·将肿瘤选择性(优选肿瘤组织而非健康组织)趋化因子调节作为单独的治疗以加强对癌症或感染的自发的免疫。
·将肿瘤选择性趋化因子调节作为加强疫苗诱导的T细胞(或者过继转移的T细胞)针对癌症或感染物以进入肿瘤组织和调节癌症消退或使其稳定的能力的方法。
·将病原特异性(与病原受累组织匹配)和肿瘤选择性(优选受累组织而非健康组织)趋化因子调节作为单独治疗以加强对感染的自发的免疫
·旨在加强Treg浸润和抑制吸引Teff的CK的互逆(reciprocal)方法可以用于移植、自身免疫性疾病或一些慢性炎症过程。
显而易见的是在不脱离本发明描述的主旨的前提下对所描述的方法和组合物的精确细节可以进行改变或修饰。我们请求保护落入下述权利要求的范围和主旨内的所有的这种修饰和改变。

Claims (51)

1.一种在主体中治疗癌症或预防癌症发生或复发的方法，所述方法包括给予主体治疗有效量的(1)NF-κB激活剂、(2)前列腺素合成阻断剂或前列腺素应答阻断剂、和(3)干扰素。
2.一种在主体中治疗癌症或预防癌症发生或复发的方法，所述方法包括给予主体治疗有效量的(1)Toll样受体(TLR)激动剂、(2)前列腺素合成阻断剂或前列腺素应答阻断剂、和(3)干扰素。
3.一种在主体中治疗癌症或预防癌症发生或复发的方法，所述方法包括给予主体治疗有效量的(1)NF-κB激活剂和(2)前列腺素合成阻断剂或前列腺素应答阻断剂。
4.一种在主体中治疗癌症或预防癌症发生或复发的方法，所述方法包括给予主体治疗有效量的(1)Toll样受体(TLR)激动剂和(2)前列腺素合成阻断剂或前列腺素应答阻断剂。
5.一种在主体中治疗癌症或预防癌症发生或复发的方法，所述方法包括给予主体治疗有效量的(1)NF-κB激活剂和(2)干扰素。
6.一种在主体中治疗癌症或预防癌症发生或复发的方法，所述方法包括给予主体治疗有效量的(1)Toll样受体(TLR)激动剂和(2)干扰素。
7.一种治疗或预防自身免疫性疾病、慢性炎性疾病、抑制排斥或GvH的起始或复发的方法，所述方法包括给予主体治疗有效量的(1)NF-κB激活剂和(2)前列腺素或其他cAMP信号通路的激活剂。
8.一种治疗或预防自身免疫性疾病、慢性炎性疾病、抑制排斥或GvH的起始或复发的方法，所述方法包括给予主体治疗有效量的(1)TLR配体和(2)前列腺素或其他cAMP信号通路的激活剂。
9.一种在主体中治疗癌症或预防癌症发生或复发的方法，所述方法包括给予主体治疗有效量的(1)NF-κB激活剂、(2)前列腺素合成阻断剂或前列腺素应答阻断剂、(3)干扰素和(4)化疗剂。
10.一种在主体中治疗癌症或预防癌症发生或复发的方法，所述方法包括给予主体治疗有效量的(1)Toll样受体(TLR)激动剂、(2)前列腺素合成阻断剂或前列腺素应答阻断剂、(3)干扰素和(4)化疗剂。
11.一种在主体中治疗癌症或预防癌症发生或复发的方法，所述方法包括给予主体治疗有效量的(1)NF-κB激活剂、(2)前列腺素合成阻断剂或前列腺素应答阻断剂、和(3)化疗剂。
12.一种在主体中治疗癌症或预防癌症发生或复发的方法，所述方法包括给予主体治疗有效量的(1)Toll样受体(TLR)激动剂、(2)前列腺素合成阻断剂或前列腺素应答阻断剂、和(3)化疗剂。
13.一种在主体中治疗癌症或预防癌症发生或复发的方法，所述方法包括给予主体治疗有效量的(1)NF-κB激活剂、(2)干扰素和(3)化疗剂。
14.一种在主体中治疗癌症或预防癌症发生或复发的方法，所述方法包括给予主体治疗有效量的(1)Toll样受体(TLR)激动剂、(2)干扰素、和(3)化疗剂。
15.一种在主体中治疗癌症或预防癌症发生或复发的方法，所述方法包括给予主体治疗有效量的(1)NF-κB激活剂、(2)前列腺素合成阻断剂或前列腺素应答阻断剂、(3)干扰素和(4)增强肿瘤特异性T细胞上的CCR5或CXCR3表达水平的疫苗或其他疗法。
16.一种在主体中治疗癌症或预防癌症发生或复发的方法，所述方法包括给予主体治疗有效量的(1)Toll样受体(TLR)激动剂、(2)前列腺素合成阻断剂或前列腺素应答阻断剂、(3)干扰素和(4)增强肿瘤特异性T细胞上的CCR5或CXCR3表达水平的疫苗或其他疗法。
17.一种在主体中治疗癌症或预防癌症发生或复发的方法，所述方法包括给予主体治疗有效量的(1)NF-κB激活剂(2)前列腺素合成阻断剂或前列腺素应答阻断剂、和(3)增强肿瘤特异性T细胞上的CCR5或CXCR3表达水平的疫苗或其他疗法。
18.一种在主体中治疗癌症或预防癌症发生或复发的方法，所述方法包括给予主体治疗有效量的(1)Toll样受体(TLR)激动剂(2)前列腺素合成阻断剂或前列腺素应答阻断剂、和(3)增强肿瘤特异性T细胞上的CCR5或CXCR3表达水平的疫苗或其他疗法。
19.一种在主体中治疗癌症或预防癌症发生或复发的方法，所述方法包括给予主体治疗有效量的(1)NF-κB激活剂、(2)干扰素和(3)增强肿瘤特异性T细胞上的CCR5或CXCR3表达水平的疫苗或其他疗法。
20.一种在主体中治疗癌症或预防癌症发生或复发的方法，所述方法包括给予主体治疗有效量的(1)Toll样受体(TLR)激动剂、(2)干扰素、和(3)增强肿瘤特异性T细胞上的CCR5或CXCR3表达水平的疫苗或其他疗法。
21.根据权利要求2、4、6、8、10、12、14、16、18或20所述的方法，其中所述TLR激动剂是TLR-3配体。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述TLR-3配体是聚I：C。
23.根据权利要求21所述的方法，其中所述TLR-3配体是能够与TLR3结合的聚I：C的衍生物。
24.根据权利要求21所述的方法，其中所述TLR-3配体是能够与TLR3结合的双链RNA。
25.根据权利要求21所述的方法，其中所述TLR-3配体是小分子。
26.根据权利要求21所述的方法，其中所述TLR-3配体是抗体。
27.根据权利要求2、4、6、8、10、12、14、16、18或20所述的方法，其中所述TLR激动剂是TLR-4配体。
28.根据权利要求2、4、6、8、10、12、14、16、18或20所述的方法，其中所述TLR激动剂是TLR-7配体。
29.根据权利要求2、4、6、8、10、12、14、16、18或20所述的方法，其中所述TLR激动剂是TLR-8配体。
30.根据权利要求2、4、6、8、10、12、14、16、18或20所述的方法，其中所述TLR激动剂是TLR-9配体。
31.根据权利要求2、4、6、8、10、12、14、16、18或20所述的方法，其中所述TLR激动剂是TLR-5配体。
32.根据权利要求2、4、6、8、10、12、14、16、18或20所述的方法，其中所述TLR激动剂是TLR-2配体。
33.根据权利要求2、4、6、8、10、12、14、16、18或20所述的方法，其中所述TLR激动剂是TLR-1配体。
34.根据权利要求1、3、5、7、9、11、13、15、17或19所述的方法，其中所述NF-κB激活剂是TNFα、IL-1β或其他促炎性细胞因子或者是NF-κB活化的模式识别受体的内源性或外源性配体。
35.根据权利要求1、2、3、4、9、10、11、12、15、16、17或18所述的方法，其中所述前列腺素合成的阻断剂是环氧合酶(COX)抑制剂。
36.根据权利要求1、2、3、4、9、10、11、12、15、16、17或18所述的方法，其中所述前列腺素合成的阻断剂是环氧合酶(COX)-1和环氧合酶(COX)-2两者的抑制剂。
37.根据权利要求1、2、3、4、9、10、11、12、15、16、17或18所述的方法，其中所述前列腺素合成的阻断剂是环氧合酶2(COX-2)的选择性抑制剂。
38.根据权利要求1、2、3、4、9、10、11、12、15、16、17或18所述的方法，其中所述前列腺素合成的阻断剂是塞来昔布。
39.根据权利要求1、2、3、4、9、10、11、12、15、16、17或18所述的方法，其中所述前列腺素合成的阻断剂是罗非昔布。
40.根据权利要求1、2、3、4、9、10、11、12、15、16、17或18所述的方法，其中所述前列腺素合成的阻断剂是吲哚美辛。
41.根据权利要求1、2、3、4、9、10、11、12、15、16、17或18所述的方法，其中所述前列腺素应答的阻断剂是前列腺素E2受体EP2或EP4的抑制剂。
42.根据权利要求1、2、5、6、9、10、13、14、15、16、19或20所述的方法，其中所述干扰素是I型干扰素。
43.根据权利要求1、2、5、6、9、10、13、14、15、16、19或20所述的方法，其中所述干扰素是干扰素α或干扰素β。
44.根据权利要求1、2、5、6、9、10、13、14、15、16、19或20所述的方法，其中所述干扰素是干扰素γ。
45.根据权利要求15、16、17、18、19或20所述的方法，其中所述疫苗包含α-DC1。
46.根据权利要求15、16、17、18、19或20所述的方法，其中所述疫苗包含任意类型的1型-极化的DC，如由LPS和IFNγ的组合或者由TNFα和IFNγ的组合诱导产生的那些。
47.根据权利要求7或8所述的方法，其中所述前列腺素是前列腺素E2(PGE2)。
48.根据权利要求7或8所述的方法，其中所述cAMP升高剂是PGE2的EP2或EP4受体激动剂。
49.根据权利要求7或8所述的方法，其中所述cAMP升高剂是组胺、肾上腺素、去甲肾上腺素，或者组胺、肾上腺素或去甲肾上腺素的cAMP升高受体的激动剂。
50.根据权利要求7或8所述的方法，其中所述cAMP信号通路的激活剂是腺苷酸环化酶、CREB或者CREB信号通路下游元件的激活剂。
51.根据权利要求1、2、3或4所述的方法，其中所述前列腺素应答的阻断剂是cAMP合成的抑制剂，cAMP降解的诱导剂、磷酸二酯酶活性或其他促进剂，或者CREB或CREB信号通路的下游元件的抑制剂。
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