KR20070043795A - 톨-유사 수용체 발현 종양 세포에서 세포자멸사의 유도방법 - Google Patents

톨-유사 수용체 발현 종양 세포에서 세포자멸사의 유도방법 Download PDF

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Abstract

일부 유형의 암 세포는 하나 이상의 톨-유사 수용체(TLR)를 발현한다. 이들 TLR은 치료학적 표적이다. 본 발명은 TLR을 발현하는 종양 세포를 선택하고 당해 세포를 치료학적 유효량의 TLR 리간드와 접촉시킴으로써 톨-유사 수용체를 발현하는 암 및 종양 세포를 치료하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 특히 TLR3 효능제를 사용하여 TLR3을 발현하는 암 및 종양 세포를 치료하는 방법에 관한 것이다.
톨-유사 수용체, 톨-유사 수용체 발현 종양 세포, 톨-유사 수용체 리간드

Description

톨-유사 수용체 발현 종양 세포에서 세포자멸사의 유도 방법{Induction of apoptosis in toll-like receptor expressing tumor cells}
관련 출원에 대한 전후 참조
본 출원은 미국 특허원 제60/589,616호에 대한 우선권을 청구한다.
본 발명은 톨-유사 수용체(TLR) 발현 종양 세포를 선택하여 당해 세포를 치료학적 유효량의 TLR 리간드와 접촉시킴으로서 TLR 발현 암 및 종양 세포를 치료하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 특히 TRL3 효능제(agonist)를 사용하여 TRL3 발현 암 및 종양 세포를 치료하는 방법에 관한 것이다.
암은 전세계에서 사망의 주요 원인 중 하나이다. 따라서, 본 발명자는 이러한 치명적인 질병을 치료하기 위한 새로운 방법을 개발하는 것이 필수적이다. 많은 현재의 암 치료요법은 신속하게 분열하는 세포에 영향을 미친다. 이러한 치료요법은 암 세포에만이 아니라, 위장관 및 모포(hair follicle)의 세포와 같이 모든 빠르게 분열하는 세포에 영향을 미치므로 파괴적인 부작용을 지닌다. 따라서, 이러한 파괴적인 부작용을 지니지 않는 새로운 치료 방법이 요구되고 있다. 본 출원 은 암의 치료시 치료학적 표적으로서 톨-유사 수용체 3을 확인 또는 동정(identifying)한다.
드로소필라 톨(Drosophila toll) 단백질은 드로소필라 배아에서 등-배쪽 패턴화(dorsal-ventral patterning)를 조절하며 또한 오래된 숙주 방어 메카니즘(ancient host defense mechanism)을 나타내는 것으로 사료되고 있다.
톨-유사 수용체(TLR 또는 TLRs)라고 불리우는, 드로소필라 톨(Drosophila toll)의 사람 상동기관 또한 확인되었다. 사람 및 드로소필라 톨 단백질의 서열의 정렬은, 단백질 쇄의 전체 길이에 걸쳐 상동성이 있음을 나타낸다. 따라서, TLR은 사람에 있어서 선천적 면역성의 주요 성분인 것으로 여겨지고 있다.
사람 톨-유사 수용체의 과는 10개의 고도로 보존된 수용체 단배질인, TLR1 내지 TLR10을 포함한다. 드로소필라 톨과 유사하게, 사람 TLR은 병원체-관련 분자 패턴(PAMP)을 인지하는 루이신이 풍부한 반복(LRR) 도메인과, 사람 인터류킨-1(IL-1) 수용체의 세포질 도메인과 유사한 세포질 도메인으로 이루어진 세포외 도메인을 지닌 제I형 전이막(transmembrane) 단백질이다. 드로소필라 톨 및 IL-1 수용체 둘 다에 대한 시그날링 경로와 유사하게, 사람 톨-유사 수용체는 NF-κB 경로를 통해 신호를 전달한다.
포유동물 TLR이 많은 특징과 시그날 변환 메카니즘을 공유한다고 해도, 이들의 생물학적 기능은 매우 상이하다. 이는 부분적으로, 4개의 상이한 적응기 분자(MyD88, TIRAP, TRIF 및 TRAF)가 TLR과의 다양한 조합에 있어 관련되어 있으며 상이한 시그날링 경로를 중재한다는 사실에 기인한다. 또한, 하나의 TLR에 대한 상이한 리간드는 상이한 시그날 변환 경로를 우선적으로 활성화시킬 수 있다. 더우기, TLR은 각종의 조혈 세포 및 비-조혈세포에서 상이하게 발현된다. 따라서, TLR 리간드에 대한 반응은 TLR에 의해 활성화된 시그날 경로에만 의존하는 것이 아니라, 개개의 TLR이 발현되는 세포의 특성에도 의존한다.
비록 일부 TLR에 대한 리간드가 동정되어 있지만, 다수의 TLR 특이적인 리간드가 이미 보고되어 있다. 예를 들면, 폴리 IC 및 폴리 AU는 둘 다 TLR3 효능제이다.
폴리이노신산-폴리시티딜산(폴리 IC)은 크기가 불균일하고 분자량의 합성 이본쇄 RNA이다. 폴리 IC는 TLR3 효능제이나, 또한 항-바이러스 반응 및 유전자 전사후 조절에 관련된 편재하는 효소인, PKR의 강력한 활성인자이다.
폴리아데닐산-폴리우리딜산(폴리 AU)은 합성 폴리리보뉴클레오타이드의 이본쇄 착물이다. 폴리 AU는 TLR3 효능제이다. 폴리 AU는 체액성 및 세포성 면역 반응 둘다의 조절인자이며, 또한 인터페론의 유도인자이다.
비록 폴리 IC 및 폴리 AU 둘 다가 유방암, 방광암, 신장암 및 위암과 같은 상이한 유형의 암에서 보조 치료요법으로서 몇가지 임상적 시도에 사용되었다 하더라도, 이들 제제는 본원에 기술된 신규 방법에서 이미 사용되지는 않았다.
앞서 기술한 바와 같이, 본 출원은 암의 치료시 치료 표적으로서 톨-유사 수용체 3를 확인한다. 다음의 공개된 연구는 TLR와 세포자멸사 간의 관계에 관한 것이다.
알리프란티스(Aliprantis) 등은 사람 톨-유사 수용체 2(hTLR2)를 발현하는 단핵세포에서 세포자멸사의 유도시 세균 지단백질(BLPs)의 효과를 시험하는 실험을 보고하고 있다[참조: Aliprantis et al., "Cell Activation and Apoptosis by Bacterial Lipoproteins Through Toll-like Receptor-2", Science, vol. 285, pp. 736-739 (July 30, 1999)].
알리프란티스 등에 의한 다른 문헌은 FADD의 보충을 통한 카스파제 8의 활성화를 트리거링(triggering)하는 데 있어서 TLR2의 역할에 관한 것이다[참조: Aliprantis et al., "The apoptotic signaling pathway activated by Toll-like receptor-2", Embo J., vol. 19(13), pp. 3325-3336 (2000)].
사브로에(Sabroe) 등은 중성구 생존시 TLR2의 역할에 관한 것이다[참조: Sabroe et al., "Selective Roles for Toll-Like Receptor (TLR)2 and TLR4 in the Regulation of Neutrophil Activation and Life Span", J. Immunology, vol. 170, pp. 5268-5275 (2003)].
반너만(Bannerman) 및 골드블룸(Goldblum)은 세균 지질다당류(LPS) 수용체로서의 TLR4 및 TLR2를 지적하는 연구에 관한 것이다[참조: Bannerman 및 Goldblum, "Mechanisms of bacterial lipopolysaccharide-induced endothelial apoptosis", Am. J. Physiology Lung Cell Molecular Physiology, vol. 284, pp. L899-L914 (2003)].
메이어(Meyer) 등은 사람 상피 세포주(HeLa S3), 각질세포(HaCaT 및 A431 세포) 및 마우스 섬유아세포(McCoy 세포)에서 TLR7 효능제에 의한 세포자멸사의 유도시 연구에 관한 것이다[참조: Meyer et al., "Induction of apoptosis by Toll- like Receptor-7 agonist in tissue cultures", British J. Dermatology, vol. 149 (supp. 66), pp. 9-13 (2003)].
웬(Wen) 등은, 당뇨병이 부분적으로 선천 면역 수용체인 TLR3의 발현을 통해 이자 섬에 의한 바이러스-유사 자극의 직접적인 인지의 조합으로 유도됨을 제안한다. 웬(Wen) 등은 또한 폴리 IC에 의한 세포자멸사의 유도가 TLR3에 의해 가능하게 중재 또는 매개(mediating)됨을 고려하고 있다[참조: Wen et al., "The Effect of Innate Immunity on Autoimmune Diabetes and the Expression of Toll-Like Receptors on Pancreatic Islets", J. Immunology, vol. 172, pp. 3173-3180 (2004)].
최종적으로, 한(Han) 등은 TRIF를 과발현하는 293 세포에서 세포자멸사의 유도에 관한 것이다. 한(Han) 등은 또한 TLR3에 의해 활성화되는 TRIF-유도된 세포내 시그날링 경로(ISRE/IFNβ, NF-κB 및 세포자멸사)에 대한 제안된 모델을 언급하고 있다[참조: Han et al., "Mechanisms of the TRIF-induced Interferon-stimulated Response Element and NF-/κB Activation and Apoptosis Pathways", J. Biological Chemistry, vol. 279, no. 15, pp. 15652-15661 (2004)].
발명의 요약
본 발명의 양태는 a) TLR을 발현하는 암을 지닌 환자를 선택하는 단계, 및 b) 치료학적 유효량의 TLR 리간드를 당해 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 암 치료 방법을 제공한다. 바람직하게는, 리간드는 효능제 또는 길항제이다.
본 발명의 다른 양태는 a) TLR을 발현하는 종양 세포를 선택하는 단계, 및 b) 세포에서 세포자멸사를 유도하는데 효과적인 양의 TLR 리간드와 당해 세포를 접촉시키는 단계를 포함하는, 종양 세포의 세포자멸사의 유도 방법을 제공한다. 바람직하게는, 리간드는 효능제 또는 길항제이다.
본 발명의 다른 양태는 a) TLR3를 발현하는 암을 지닌 환자를 선택하는 단계; 및 b) 당해 환자에게 치료학적 유효량의 TLR3 리간드를 투여하는 단계를 포함하는, 암의 치료 방법을 제공한다. 바람직하게는, 리간드는 효능제 또는 길항제이다. 더욱 바람직하게는, 효능제는 폴리 AU이다. 가장 바람직하게, 효능제는 폴리 IC이다. 달리는, 길항제는 항체 또는 이의 단편이다. 바람직하게, TLR3을 발현하는 암은 결장암이다. 가장 바람직하게 TLR3을 발현하는 암은 유방암이다. 당해 방법은 환자에게 화학치료제 또는 암 치료제를 투여하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 당해 방법은 TLR 3 리간드를 투여하기 전에 환자에게 낮은 투여량의 제I형 IFN을 투여하는 것을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 양태는 a) TLR3을 발현하는 종양 세포를 선택하는 단계, 및 b) 당해 세포를 세포내에서 세포자멸사를 유도하기에 효과적인 양의 TLR3 리간드와 접촉시키는 단계를 포함하는, 종양 세포의 세포자멸사의 유도 방법을 제공한다. 바람직하게는, 당해 리간드는 효능제 또는 길항제이다. 더욱 바람직하게는, 효능제는 폴리 AU이다. 가장 바람직하게는, 효능제는 폴리 IC이다. 달리는, 길항제는 항체 또는 이의 단편이다. 바람직하게는, TLR3를 발현하는 종양 세포는 결장암 세포이다. 가장 바람직하게는, TLR3를 발현하는 종양 세포는 유방암 세포이다. 당해 방법은 또한 세포를 화학요법제(chemotherapeutic agent) 또는 암 치료 제(cancer treatment)와 접촉시킴을 추가로 포함할 수 있다. 당해 방법은 또한 TLR3 리간드를 투여하기 전에 세포와 낮은 투여량의 제I형 IFN을 접촉시킴을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 상기한 특징 및 다른 특징은 다음의 본 발명의 상세한 설명 및 도면의 간단한 설명으로부터 더욱 명백해질 것이며, 여기서,
도 1은 폴리 IC와 48시간 동안 항온처리한 후 카마(Cama)-1 세포의 세포자멸사에 있어서 TLR3의 siRNA 사일런싱(silencing)의 효과를 나타내는 그래프 세트이다.
본원에 인용된 모든 공보는 이의 전문이 참조로 인용된다.
정의
용어 "세포자멸사"는 프로그램화된 세포 사멸을 의미한다.
용어 "효능제"는 수용체에 결합하여 이를 활성화시킬 수 있는 리간드를 의미한다.
용어 "길항제"는 수용체에 결합하여 이를 차단하거나 불활성화시킬 수 있는 리간드를 의미한다. 달리는, "길항제"는 효능제에 결합하여 이를 차단시키거나 불활성화시킴으로써 효능제가 수용체에 결합하는 것을 방지하도록 할 수 있다.
용어 "항체"는 전체 면역글로불린, 즉, Fc 단편에 연결된 2개의 Fab 단편을 함유하는 전체 면역글로불린을 의미한다. 용어 "항체"는 폴리클로날, 모노클로날, 키메라성, 영장류화된(primatized), 사람화된 및 사람 항체를 포함한다. 용어 "항체"는 면역글로불린의 5개의 주요 부류: IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM 중 어느 하나, 및 또한 면역글로불린의 아부류(동형), 즉, IgGI , lgG2, lgG3, lgG4, IgA 및 lgA2를 포함한다.
용어 "항체 단편"은 Fab, Fc, F(ab)2 및 Fv 단편과 같은, 전체 면역글로불린의 어떠한 단편 또는 단편들의 조합을 의미한다.
용어 "암"은 통상적으로 조절되지 않은 세포 성장을 특징으로 하는 생리학적 상태를 기술한다. 암의 예는 암종, 림프종, 모세포종, 육종 및 백혈병을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 더욱 구체적인 예는 편평세포암, 소세포 폐암, 비-소세포 폐암, 위장암, 췌장암, 아교모세포종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간세포암, 유방암, 결장암, 결장직장암, 자궁내막암종, 타액선 암종, 신장암, 전립샘암, 음문암, 갑상샘암, 간 암종 및 각종 유형의 두부 및 경부암을 포함한다.
용어 "화학치료요법제"는 암의 치료에 유용한 화학적 화합물을 의미한다.
용어 "치료"는 하나 이상의 증상의 완화, 질병 또는 장애의 진행의 회복, 지연 또는 중지를 포함하나, 이에 한정되지 않는 모든 임상적으로 바람직하거나 또는 유익한 효과를 가져오는 질병 또는 장애의 치료학적, 예방학적 또는 억제 방법을 의미한다.
용어 "siRNA"는 짧은 방해(short interfering) RNA를 의미한다.
용어 "TLR"은 톨-유사 수용체를 의미한다. TLR은 어떠한 종의 톨-유사 수용체일 수 있다. 바람직하게는, 당해 용어는 TLRs 1 내지 10 중의 하나와 같은 사람 톨-유사 수용체(hTLR)를 말한다.
용어 "TLR을 발현하는 암"은 톨-유사 수용체를 발현하는 세포를 함유하는 종양을 의미한다.
용어 "TLR을 발현하는 종양 세포"는 톨-유사 수용체를 발현하는 종양 세포를 의미한다.
용어 "발현하다", "발현" 및 "발현하는"은 모두 폴리펩타이드를 생산하기 위한 핵산의 전사 및 해독을 의미한다. 세포에서, 이는, 폴리펩타이드가 세포질내로 분비되거나, 잔존하거나, 또는 세포 막내에 적어도 부분적으로 잔류할 것임을 의미한다.
용어 "리간드"는 수용체와 같은, 다른 분자에 특이적으로 결합할 수 있는 특정 분자를 의미한다. 용어 "리간드"는 효능제 및 길항제 둘다를 포함한다. "리간드"는 예를 들면, 소 분자(유기 분자), 항체 또는 항체 단편, siRNA, 안티센스 핵산, 폴리펩타이드, DNA 및 RNA일 수 있다.
용어 "TLR 리간드"는 톨-유사 수용체, 특히 사람 TLRs 1 내지 10에 특이적으로 결합할 수 있는 특정 분자를 의미한다. 용어 "TLR 리간드"는 TLRs의 효능제 및 길항제 둘다를 포함한다. "TLR 리간드"는 예를 들면, 소 분자(유기 분자), 항체 또는 항체 단편, siRNA, 안티센스 핵산, 폴리펩타이드, DNA 및 RNA일 수 있다.
용어 "상응하는 TLR 리간드"는 특정 TLR에 결합하는 리간드를 의미한다. 예를 들어, TLR1 리간드는 TLR1에 대한 상응하는 TLR 리간드이다. 유사하게, TLR2 리간드는 TLR2에 대한 상응하는 TLR 리간드이다. 이러한 동일한 원리는 TLRs 3 내지 10에도 적용된다.
용어 "환자"는 사람 및 비-사람 동물 둘다를 의미한다.
용어 "폴리 IC"는 폴리이노신산-폴리시티딜산을 의미한다.
용어 "폴리 AU"는 폴리아데닐산-폴리우리딜산을 의미한다.
용어 "치료학적 유효량"은 암과 같은, TLR에 의해 유발되거나 매개된 의학적 상태를 특징으로 하는 하나 이상의 매개변수를 완화시킬, TLR 리간드와 같은 조성물의 양을 의미한다.
용어 "유효량" 및 "효과적인 양"은 세포에서 세포자멸사을 유도하는 것과 같이, 특정의 효과를 유발할, TLR 리간드와 같은 약제학적 조성물의 양을 의미한다.
용어 "낮은 투여량"은 치료 효과와 같은, 특정의 효과를 달성하기에 정상적인 것으로 고려되는 것보다 낮은 물질의 양을 의미한다.
톨-유사 수용체( TLR ) 특징화
사람 톨-유사 수용체(hTLR)의 족(family)은 10개의 구성원, hTLR 1 내지 10을 포함한다. 완전한 개방 판독 프레임의 뉴클레오타이드 서열 및 각각의 hTLR 1 내지 10의 상응하는 아미노산 서열은 당해 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, hTLR 1 내지 10에 대한 서열은, 비록 당해 서열들이 공개된 명명법과는 상이하게 번호매김되어 있다고 해도, PCT 공보 제WO 01/90151호에 기술되어 있다. hTLR 1 내지 10 각각에 대한 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열은 또한 하기 표 1에 나타낸 바와 같이 GenBank® 데이타베이스에서 찾을 수 있다.
Figure 112007005702645-PCT00001
당해 분야의 숙련가는, 특정의 TLR의 핵산 및 아미노산 서열이 제공되면, 특정의 TLR 단백질 또는 이의 단편, 당해 단백질 또는 단편에 대한 항체, 핵산 또는 이의 단편, 핵산 프로브, 안티센스, siRNA 등을 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 생산할 수 있다. 이후에, 이러한 분자를 사용하여 TLR을 발현하는 암 또는 종양 세포를 선택할 수 있다.
일부 TLR 리간드가 하기 표 2에 나타낸 바와 같이 확인되어 있다. 당해 분야의 숙련가들은 하기 리간드중 어느 것을 분리하거나 또는 생성할 수 있을 것이다. 달리는, 당해 리간드는 시판 공급원으로부터 구입할 수 있다.
TLR 리간드
TLR1 마이코플라즈마 리포펩타이드(디아실화된 지질단백질) [제조원: 시그마-알드리히(Sigma-Aldrich)]
TLR2 마이코플라즈마 리포펩타이드(디아실화된 지질단백질) (제조원: 시그마-알드리히), 세균 지질펩타이드(제조원: 시그마-알드리히)
TLR3 dsRNA[제조원:인비보겐(Invivogen)], 폴리아데닐산-폴리우리딜산(폴리 AU) (wpwhdnjs: 인비보겐), 폴리이노신산-폴리시티딜산(폴리 IC)(제조원: 인비보겐)
TLR4 LPS(제조원: 시그마-알드리히)
TLR5 플라겔린[칼바이오켐(제조원: Calbiochem)]
TLR6 세균 지질펩타이드(제조원: 시그마-알드리히)
TLR7 이미퀴모드(Aldara®)[쓰리엠 파마슈티칼스(3M Pharmaceuticals) 제조원], R848(쓰리엠 파마슈티칼스 제조원)
TLR8 R848(제조원: 쓰리엠 파마슈티칼스)
TLR9 CpG DNA[제조원: 엠더블유지 바이오테크(MWG Biotech)]
TLR10 공지되어 있지 않음
TLR은 면역 반응의 조절인자로서 작용한다. 따라서, TLR에 대한 치료학적 적용은 종양학, 감염병, 자가면역성, 알레르기, 천식, COPD 및 심장학 분야에서 존재한다.
본 발명은 부분적으로는, 특정 유형의 종양 세포가 톨-유사 수용체를 발현하고 이들 TLR에 결합하는 리간드가 확립시 도움을 주며 종양 지시된 면역 반응의 효능을 증진시킨다는 발견에 기초한다.
TLR 을 발현하는 암 또는 종양 세포의 선택
본 발명의 방법의 단계는 TLR을 발현하는 암을 지닌 환자를 선택하거나 또는 TLR을 발현하는 종양 세포를 선택하는 것을 포함한다.
용어 "선택하는"은 흥미있는 것을 확인함을 의미한다. 본원의 문맥에서, 어구 "환자를 선택하는"은 TLR을 발현하는 암과 같은 특정의 특징을 지닌 환자를 확인하는 것을 의미한다. 어구 "TLR을 발현하는 종양 세포를 선택하는"은 톨-유사 수용체를 발현하는 종양 세포를 확인하는 것을 의미한다.
당해 분야에 공지된 바와 같이, TLR을 발현하는 암을 지닌 환자를 선택하거나 또는 TLR을 발현하는 종양 세포를 선택하는 많은 방법이 존재한다. 예를 들면, 항체 또는 항체 단편을 사용하여 TLR을 발현하는 종양 세포에 결합시키고 동정한다. 바람직하게는, TLR3 항체를 사용하여 TLR3을 발현하는 종양 세포에 결합시키거나 또는 확인한다. 항체 또는 이의 단편을 약제학적 조성물로서 생체내에 제공하거나 또는 시험관내에서 제공할 수 있다. 바람직하게는, 환자에 대해 생검(biopsy)을 수행하고 종양 세포를 시험관내에서 선택한다. 또한 TLR 리간드 치료에 대한 프로토콜에 포함되지 않았던 환자를 충원하는 강력한 수단으로서의 생검 이전에 TLR의 발현을 증가시키는 것도 가능하다. TLR3의 경우에, 낮은 투여량의 제I형 IFN 또는 TLR3 리간드 자체를 생검 이전에 또는 어떠한 다른 진단 과정(침 흡인 또는 의학적 영상) 이전에 투여할 수 있다. 달리는, 본원의 표 2에 확인된 TLR 리간드중 어느 하나, 또는 다른 소 분자를 사용하여 TLR을 발현하는 종양 세포에 결합시키고 이를 확인할 수 있다. 바람직하게는, TLR3 리간드를 사용하여 TLR3을 발현하는 세포에 결합시키고 이를 확인한다. 다시, 선택하는 단계는 바람직하게는 시험관내에서 수행한다. 또한, 종양 세포를 분해하여, 세포가 특별한 TLR 단백질[웨스턴 블롯(Western blot)에 의해] 또는 특별한 TLR RNA[노던 블롯(Northern blot)에 의함]의 증가된 수준을 나타내는지를 측정할 수 있다.
선택 과정은 검출가능한 표지의 사용을 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 항체, 항체 단편, 소 분자, DNA, RNA, 및 기타 리간드를, 검출하기 위해 표지할 필요가 있을 수 있다. 검출은 가시적으로, 또는 장치를 사용함으로써 달성할 수 있다. 당해 분야에서 일반적으로 사용되는 검출가능한 표지는, 비록 어떠한 검출가능한 표지도 사용될 수 있다고 해도, 예를 들면, 방사선표지, 형광성 표지 및 효소적 표지를 포함한다.
TLR을 발현하는 종양 세포를 확인하는 것 외에, 선택 단계는 아마도 특정 종양 세포가 어떠한 톨-유사 수용체(TLR 1 내지 10)을 발현하는지를 확인할 것이다. 이는, TLR을 발현하는 종양 세포를 선택하는데 사용된 많은 항체, 항체 단편, DNA, RNA, 소 분자 또는 다른 리간드가 TLR 1 내지 10의 개개의 TLR에 특이적으로 결합한다는 사실에 기인한다.
TLR을 발현하는 암을 지닌 환자를 선택하거나 TLR을 발현하는 종양 세포를 선택하는 단계를 또한 간접적인 방식으로 수행할 수 있다. 예를 들어, 암에 의한 특별한 TLR의 발현은 특이적 병인을 갖는 암의 특정 아-유형에 연결시킬 수 있다. 바이러스와 같은 이러한 특수 병인의 어떠한 마커도 제공된 TLR의 발현의 지표일 수 있으며 상응하는 TLR 리간드의 사용을 안내하는 유용한 마커일 수 있다.
환자에 TLR 리간드의 투여
본 발명의 방법의 다른 단계는 환자에게 치료학적 유효량의 TLR 리간드를 투여함을 포함한다. 당해 단계는 TLR 리간드를 약제학적 조성물로 투여함을 포함한다. 예를 들어, 약제학적 조성물은 정제의 형태일 수 있으므로, 리간드는 혈류내로 흡수된다. 이후에, 순환계는 TLR 리간드를 TLR을 발현하는 암으로 전달함으로써 리간드 및 암이 서로 접촉될 수 있도록 할 수 있다. 당해 접촉 단계는, 리간드가 암의 톨-유사 수용체(들)에 결합하여 암에서 성장 억제 및 세포자멸사를 유도하도록 할 것이다. 달리는, 약제학적 조성물을 흑색종의 치료의 경우와 같이 국부적으로 또는 국소적으로 투여할 수 잇다.
위에서 기술한 바와 같이, 선택하는 단계는 아마도, 암이 발현하는 특별한 TLR을 확인할 것이다. 바람직하게는, 당해 투여 단계는 상응하는 리간드를 톨-유사 수용체를 발현하는 암을 지닌 환자에게 투여함을 포함한다. 예를 들어, 암이 TLR1을 발현하는 경우, 환자에게 바람직하게는 유효량의 TLR1 리간드를 투여한다. 유사하게, 암이 TLR2를 발현하는 경우, 환자에게 바람직하게는 유효량의 TLR2 리간드를 투여한다. 동일한 원리가 TLR 3 내지 10에도 정확하게 유지된다.
바람직하게는, 본 발명의 방법은 TLR을 발현하는 암을 지닌 환자에게 유효량의 TLR3 리간드를 투여함을 포함한다. 바람직하게는, TLR3 리간드는 효능제이다. 더욱 바람직하게는, TLR3 리간드는 폴리 AU이다. 가장 바람직하게, TLR3 리간드는 폴리 IC이다. 바람직하게는, 암은 결장 암 세포 또는 유방암이다.
바람직하게는, 본 발명의 방법은 또한 환자에게 화학요법제 또는 암 치료제를 투여함을 포함한다.
바람직하게는, 본 발명의 방법은 환자에게 낮은 투여량의 제I형 IFN 또는 TLR3 리간드를 투여함을 추가로 포함한다. 예를 들어, 낮은 투여량의 제I형 IFN은 1 내지 3MU, 및 바람직하게는 2MU의 범위이다. 더욱 바람직하게는, 낮은 투여량의 제I형 IFN은 1MU 미만이다.
TLR 을 발현하는 종양 세포와 TLR 리간드의 접촉
달리는, 본 발명의 방법의 단계는 TLR을 발현하는 종양 세포를 유효량의 TLR 리간드와 접촉시키는 것을 포함한다. 생체내에서, 당해 접촉 단계는 약제학적 조성물중 TLR 리간드를 환자에게 투여함을 포함한다. 시험관내에서, 당해 접촉 단계는 TLR을 발현하는 종양 세포와 TLR 리간드를 물리적으로 근접하도록 함으로써 리간드와 세포가 서로 접촉할 수 있도록 함을 포함한다. 이러한 접촉 단계는, 리간드가 세포의 톨-유사 수용체에 결합하도록 하여 종양 세포내에서 성장 억제 및 세포자멸사를 유도하도록 할 것이다.
위에서 기술한 바와 같이, 선택 단계는 종양 세포가 발현하는 특별한 TLR을 확인할 것이다. 바람직하게는, 접촉 단계는 톨-유사 수용체를 발현하는 세포를 이의 상응하는 리간드에 접촉시킴을 포함한다. 예를 들어, 종양 세포가 TLR1을 발현하는 경우, 세포는 바람직하게는 유효량의 TLR1 리간드와 접촉한다. 유사하게, 종양 세포가 TLR2를 발현하는 경우, 세포는 바람직하게는 유효량의 TLR2 리간드와 접촉한다. 동일한 원리가 TLR 3 내지 10에도 정확하게 유지된다.
바람직하게는, 본 발명의 방법은 TLR3을 발현하는 종양 세포를 유효량의 TLR3 리간드와 접촉시킴을 포함한다. 바람직하게는, TLR3 리간드는 효능제이다. 더욱 바람직하게는, TLR3 리간드는 폴리 AU이다. 가장 바람직하게, TLR3 리간드는 폴리 IC이다. 바람직하게는, 세포는 결장암 세포 또는 유방암 세포이다.
바람직하게는, 본 발명의 방법은 세포를 화학요법제 또는 암 치료제와 접촉시킴을 추가로 포함한다.
바람직하게는, 본 발명의 방법은 또한 세포를 낮은 투여량의 제I형 IFN 또는 TLR3 리간드와 접촉시킴을 추가로 포함한다. 예를 들어, 낮은 투여량의 제I형 IFN은 1 내지 3MU의 범위이고, 바람직하게는 2MU이다. 더욱 바람직하게는, 낮은 투여량의 제I형 IFN은 1MU 미만이다.
폴리펩타이드
항체, 항체 단편 또는 지질펩타이드와 같은 폴리펩타이드는, 선택 단계에서는, TLR을 발현하는 암 또는 세포를 선택하기 위해, 투여 단계에서는, TLR 리간드를 환자에게 전달하기 위해, 또는 접촉 단계에서는 TLR을 발현하는 세포내 성장 억제 또는 세포자멸사를 유도하기 위해 본 발명의 방법에서 사용될 수 있다. 또한, TLR 폴리펩타이드 또는 이의 단편은 TLR에 결합하게 되는, 항체와 같은 리간드를 확인하거나 또는 생성하기 위해 생산할 수 있다.
본원에 사용된 것으로서, 용어 "폴리펩타이드" 또는 펩타이드"는 예를 들면, 8개 이상, 바람직하게는 12개 이상, 더욱 바람직하게는 20개 이상, 및 가장 바람직하게는 30개 이상의 연속된 아미노산 잔기에서 완전한 단백질내 잔기의 전체 수 까지 또는 이를 포함하는 잔기를 함유하는 폴리펩타이드의 단편 또는 분절을 의미한다. 용어 "폴리펩타이드"는 또한 결실, 첨가, 변형, 치환, 유사체, 변이체, 및 글리코실화되거나 또는 비-글리코실화된 폴리펩타이드를 포함한다.
치환은 보존된 및 보존되지 않은 치환 둘다를 포함한다.
아미노산 잔기의 변형은 카복실 측쇄를 함유하는 잔기 또는 카복실 말단의 지방족 에스테르 또는 아미드, 하이드록실 그룹을 함유하는 잔기의 O-아실 유도체, 및 아미노-말단 아미노산 또는 아미노- 그룹을 함유하는 잔기의 N-아실 유도체를 포함할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
유사체는 비천연의 아미노산 잔기, 또는 포스포티로신, 포스포세린 또는 포스포트레오닌 잔기와 같은 포스포릴화된 아미노산 잔기의 혼입과 같은 변형을 함유하는 폴리펩타이드이다. 다른 잠재적인 변형은 설폰화, 바이오티닐화, 또는 다른 잔기, 특히 포스페이트 그룹과 유사한 분자 형태를 지니는 것들의 첨가를 포함한다.
폴리펩타이드의 합성 기술은 예를 들면, 문헌[참조: Merrifield, J. Amer. Chem. Soc. 85:2149 (1963); Merrifield, Science 232:341 (1986); 및 Atherton et al., Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach, 1989, IRL Press, Oxford]에 기술되어 있다.
폴리펩타이드의 유사체는 화학 합성에 의해 또는 부위-지시된 돌연변이유발[참조: Gillman et al., Gene 8:81 (1979); Roberts et al., Nature, 328:731 (1987) or Innis (Ed.), 1990, PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press, New York, NY]을 사용함에 의해 또는 도퍼티(Daugherty) 등에 의해 예시된 바와 같이[참조: Nucleic Acids Res. 19:2471 (1991)], 폴리머라제 연쇄 반응 방법[참조: PCR; Saiki et al., Science 239:487 (1988)]을 사용함에 의해 완전한 수용체를 암호하하는 핵산을 변형시키기 위해 제조할 수 있다. 재조합 생성물을 정제하거나 또는 검출하기 위한 추가의 에피토프 태그가 고려된다.
핵산
핵산은 TLR을 발현하는 암을 지닌 환자를 선택하거나 또는 TLR을 발현하는 종양 세포를 선택하기 위해 사용할 수 있다. 환자를 선택하기 위해서는, 환자 종양의 생검이 바람직하게 수행된다. 이후에, 종양 세포를 TLR 핵산의 발현에 대해 시험관내에서 분석할 수 있다.
본원의 표 1에 나타낸 바와 같이, 각각의 hTLR 1 내지 10의 핵산 및 아미노산 서열은 당해 분야에 공지되어 있다. 당해 분야의 숙련가는, 하이브리드화 검정을 생성하기 위해 공지된 서열 또는 이의 단편을 사용함으로써 특수 종양 세포가 TLR 핵산을 발현하는지를 측정할 수 있다. 예를 들어, 특수 TLR에 대한 공지된 서열을 사용하여, 당해 분야의 숙련가는 노던 블롯 분석을 수행함으로써 종양 세포가 특별한 TLR을 발현하는지를 측정할 수 있다.
또한, 특정 TLR 또는 이의 단편을 암호화하는 핵산을 사용하여 TLR 폴리펩타이드를 생성할 수 있다. 이후에, TLR 폴리펩타이드를 사용하여 특정 TLR에 대한 항체를 생성할 수 있다.
핵산 "단편"은 본원에서 17개 이상, 일반적으로 25개 이상, 바람직하게는 35개 이상, 더욱 바람직하게는 45개 이상, 및 가장 바람직하게는 55개 이상의 연속된 뉴클레오타이드를 포함하는 뉴클레오타이드 서열로서 정의된다.
핵산 조작 및 발현을 위한 일반적인 기술은 일반적으로 예를 들면, 문헌[참조: Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed.), 1989, Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory]에 기술되어 있다.
항체 생산
TLRs에 대해 특이적인 항체 및 이의 단편은, 본 발명의 방법의, 선택 단계에서는 TLR을 발현하는 세포를 선택하기 위해, 투여 단계에서는 TLR 리간드를 환자에게 전달하기 위해, 또는 접촉 단계에서는, TLR을 발현하는 세포내 성장 억제 및 세포자멸사를 유도하기 위해 사용될 수 있다.
개개의 TLR의 항원(예를 들면, 면역원성) 단편이 생산될 수 있다. 이들이 TLR 리간드에 결합하는지의 여부에 상관없이, 완전한 수용체와 같이, 이러한 단편은 완전한 수용체에 결합할 수 있는 항체를 제조하기 위한 항원으로서 유용하다. 보다 짧은 단편을 연쇄시키거나 또는 담체에 부착시킬 수 있다. 에피토프가 일반적으로 약 5개 이상, 바람직하게는 8개 이상의 아미노산 잔기를 함유한다는 것은 당해 분야에 잘 공지되어 있으므로[참조: Ohno et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:2945 (1985)], 항체의 생산에 사용된 단편은 일반적으로 최소한 상기 크기일 것이다. 바람직하게는, 이들은 위에서 기술한 바와 같이 심지어 더욱 많은 잔기를 함유할 것이다. 제공된 단편이 면역원성인지는 정규 실험으로 용이하게 측정할 수 있다.
일반적으로, 완전한 TLRs가 면역학적으로 적격인 숙주내에서 항체 생산을 유발하기위해 사용되는 경우 필수적이지 않다고 해도, 더 작은 항원 단편을 교차-결합 또는 연쇄화에 의해, 또는 면역원성 담체 분자(즉, 숙주 동물에서 면역학적 반응을 독립적으로 유발하는 특성을 지닌 거대분자)에 커플링시킴에 의해 우선 바람직하게는 더욱 면역원성이 되도록 한다. 작은 폴리펩타이드 단편이 때때로 합텐(항체에 특이적으로 결합할 수 있으나 항체 생산을 유발할 수 없는 분자, 즉, 이들은 면역원성이 아니다)으로서 작용하므로, 담체 분자에 대한 교차-결합 또는 접합이 요구될 수 있다. 면역원성 담체 분자에 대한 이러한 단편의 접합은, "담체 효과"로 일반적으로 알려진 것을 통해 이들을 더욱 면역원성이 되도록 한다.
적합한 담체 분자는 예를 들면, 단백질 및, 폴리펩타이드, 다당류, 지질폴리사카라이드 등과 같은 천연 또는 합성 중합체성 화합물을 포함한다. 키홀 림페트 헤모시아닌(keyhole limpet hemocyanin) 및, 사람 또는 소 감마글로불린, 사람, 소 또는 토끼 혈청 알부민과 같은 포유동물 혈청 단백질, 또는 이러한 단백질의 메틸화된 유도체 또는 다른 유도체를 포함하나, 이에 한정되지 않는 단백질 담체 분자가 특히 바람직하다. 다른 단백질 담체도 당해 분야의 숙련가에게 명백할 것이다. 필수적이지 않지만, 바람직하게는, 당해 단백질 담체는, 단편에 대한 항체가 유발되는 숙주 동물과 관계가 없을 것이다.
담체 분자에 대한 공유 커플링은 당해 분야에 잘 공지된 방법을 사용하여 달성할 수 있으며, 이의 정확한 선택은 사용한 담체 분자의 특성에 의해 영향받을 것이다. 면역원성 담체 분자가 단백질인 경우, 본 발명의 단편은 예를 들면, 디사이클로헥실카보디이미드 또는 글루타르알데하이드와 같은 수용성 카보디이미드를 사용하여 커플링시킬 수 있다.
이들과 같은 커플링 제제는 또한 별도의 담체 분자의 사용없이도 자체에 단편을 교차-결합시키는데 사용할 수 있다. 응집체(aggregate)에 대한 이러한 교차-결합은 또한 면역원성을 증가시킬 수 있다. 면역원성은 또한 공지된 부형제를 단독으로 사용하거나, 또는 커플링 또는 응집과 함께 사용하여 증가시킬 수 잇다.
동물의 백신화에 적합한 부형제는 부형제 65(땅콩 오일, 만나이드 모노올레이트 및 알루미늄 모노스테아레이트); 프레운드(Freund)의 완전 또는 불완전 부형제; 수산화알루미늄, 인산알루미늄 및 백반과 같은 무기질 겔; 헥사데실아민, 옥타데실아민, 리소레시틴, 디메틸디옥타데실암모늄 브로마이드, N,N-디옥타데실-N',N'-비스(2-하이드록시메틸)프로판디아민, 메톡시헥사데실글리세롤 및 플루로닉 폴리올과 같은 표면활성제; 피란, 덱스트란 설페이트, 폴리 IC, 폴리아크릴산 및 카보폴과 같은 다가음이온; 무라밀 디펩타이드, 디메틸글리신 및 투프트신과 같은 펩타이드; 및 오일 에멀젼을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 폴리펩타이드는 또한 리포좀 또는 기타 미세담체내로 혼입시킨 후 투여할 수 있다.
부형제 및 면역검정의 각종 측면에 관한 정보는 문헌[참조: 예를 들면, P. Tijssen, Practice and Theory of Enzyme Immunoassays, 3rd Edition, 1987, Elsevier, New York]에 기술되어 있다. 폴리클로날 항혈청을 제조하기 위한 방법을 포함하는 다른 유용한 참조문헌은 문헌[참조: Microbiology, 1969, Hoeber Medical Division, Harper and Row; Landsteiner, Specificity of Serological Reactions, 1962, Dover Publications, New York, 및 Williams, et al., Methods in Immunology and Immunochemistry, Vol. 1 , 1967, Academic Press, New York]을 포함한다.
표준 방법을 사용하여 면역화시킨 동물로부터 생산된 혈청은 직접 사용할 수 있거나, 또는 IgG 분획을 면역화된 단백질 A와 같은 IgG-특이적인 흡착제를 사용한 흡착 크로마토그래피 또는 혈장분리반출술과 같은 표준 방법을 사용하여 혈청으로부터 분리할 수 있다. 달리는, 모노클로날 항체를 제조할 수 있다.
TLR 또는 이의 항원 단편에 대한 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마는 익히 공지된 기술로 생산한다. 일반적으로, 당해 공정은 무한증식하는 세포주를 목적한 항체를 생산하는 B-림프종과 융합시킴을 포함한다. 달리는, 무한증식 항체-생산 세포주를 생성하기 위한 비-융합 기술, 예를 들면, 바이러스적으로 유도된 형질전환[참조: Casali et al., Science 234:476 (1986)]을 사용할 수 있다. 무한증식 세포주는 일반적으로 형질전환된 포유동물 세포, 특히 설치류, 소 및 사람 기원의 골수종 세포이다. 가장 흔히, 랫트 또는 마우스 흑색종 세포주를 편의성 및 이용가능성의 문제로 사용한다.
항원이 주입된 포유동물로부터 항체를 생산하는 림프구를 수득하기 위한 기술은 알려져 있다. 일반적으로, 사람 기원의 세포를 사용하는 경우, 말초 혈액 림프구(PBS)가 사용되거나, 또는 비장 또는 림프절 세포가 비-사람 포유동물 공급원으로부터 사용된다. 숙주 동물에게 정제된 항원의 반복된 용량을 주입하고(사람 세포는 시험관내에서 감작화시킨다), 동물이 목적한 항체-생산 세포를 생성하도록 한 후 이들을 무한증식하는 세포주와의 융합을 위해 수거한다. 융합 기술은 또한 당해 분야에 잘 공지되어 있으며, 일반적으로 세포를 폴리에틸렌 글리콜과 같은 융합제와 혼합시킴을 포함한다.
하이브리도마는 HAT(하이폭산틴-아미노프테린-티미딘) 선택과 같은 표준 과정으로 선택한다. 바람직한 항체를 분비하는 것들을 웨스턴 블롯팅, ELISA(효소-결합된 면역흡착성 검정), RIA(방사면역검정) 등과 같은 표준 면역검정을 사용하여 선택한다. 항체는 표준 단백질 정제 기술[참조: Tijssen, Practice and Theory of Enzyme Immunoassays (Elsevier, Amsterdam, 1985)]을 사용하여 배지로부터 회수한다.
많은 참조문헌이 상기 기술을 적용하기 위한 안내를 제공하기 위해 이용가능하다[참조: Kohler et al., Hybridoma Techniques (Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1980); Tijssen, Practice and Theory of Enzyme Immunoassays (Elsevier, Amsterdam, 1985); Campbell, Monoclonal Antibody Technology (Elsevier, Amsterdam, 1984); Hurrell, Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications (CRC Press, Boca Raton, FL, 1982)]. 모노클로날 항체는 또한 잘-공지된 파아지 라이브러리 시스템을 사용하여 생산할 수 있다[참조: Huse, et al., Science 246:1275 (1989); Ward, et al., Nature, 341:544 (1989)].
이렇게 생산된 항체는, 폴리클로날 또는 모노클로날에 상관없이 예를 들면, 면역친화성 크로마토그래피에 의해 수용체를 정제하기 위해 익히 공지된 방법으로 고체 지지체에 결합된 고정형으로 사용될 수 있다.
항원성 단편에 대한 항체를 TLRs의 면역검정을 위한 기준물로서, 사용하거나, 표지시키지 않거나, 또는 표준 방법에 의해 표지시킬 수 있다. 사용된 특정한 표지는 면역검정의 유형에 좌우될 것이다. 사용될 수 있는 표지의 예는 32P, 125I, 3H 및 14C와 같은 방사선표지; 플루오레세인 및 이의 유도체, 로다민 및 이의 유도체, 단실 및 움벨리페론과 같은 형광성 표지; 루시페리아 및 2,3-디하이드로프탈라진디온과 같은 화학발광제(chemiluminescer); 및 서양고추냉이 퍼옥시다제, 알칼리성 포스파타제, 리소자임 및 글루코즈-6-포스페이트 데하이드로게나제와 같은 효소를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
항체는 공지된 방법에 의해 이러한 표지로 태그(tag)시킬 수 있다. 예를 들어, 알데하이드, 카보디이미드, 디말레이미드, 이미데이트, 석신이미드, 비스디아조티즈화된 벤즈아딘 등과 같은 커플링제를 사용하여 항체를 형광성, 화학발광성 또는 효소 표지로 태그시킬 수 있다. 일반적인 방법은 당해 분야에 잘 공지되어 있으며, 예를 들면, 문헌[참조: Immunoassay: A Practical Guide, 1987, Chan (Ed.), Academic Press, Inc., Orlando, FL]에 기술되어 있다. 이러한 면역검정은 예를 들면, 수용체의 정제 동안 수득된 분획상에서 수행할 수 있다.
본 발명의 항체를 또한 사용하여 발현 클로닝 시스템에서 TLR을 발현하는 특별한 cDNA 클론을 확인하는데 사용할 수 있다.
수용체의 리간드-결합 부위에 대해 특이적인 중화 항체를 또한 리간드 결합을 차단하기 위한 길항제(억제제)로서 사용할 수 있다. 이러한 중화 항체는 통상의 실험, 예를 들면, 상기 기술된 방사리간드 결합 검정을 사용함으로써 용이하게 동정할 수 있다. TLR 활성의 길항작용은 완전한 항체 분자, 또는 Fab, Fc, F(ab)2, 및 Fv 단편과 같은 잘-공지된 항원 결합 단편을 사용하여 달성할 수 있다.
이러한 단편의 확인은 예를 들면, 문헌[참조: Klein, Immunology (John Wiley, New York, 1982); Parham, Chapter 14, in Weir, ed. Immunochemistry, 4th Ed. (Blackwell Scientific Publishers, Oxford, 1986)]에서 찾을 수 있다. 항체 단편, 예를 들면, Fab 단편[참조: Tijssen, Practice and Theory of Enzyme Immunoassays (Elsevier, Amsterdam, 1985)], Fv 단편[참조: Hochman et al., Biochemistry 12:1130 (1973); Sharon et al., Biochemistry 15:1591 (1976); Ehrlich et al., 미국 특허 제4,355,023호] 및 항체 반 분자(참조: Auditore-Hargreaves, 미국 특허 제4,470,925호)의 이용 및 생성도 또한 기술되어 있다. 공지된 항체 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 기초로 하는 재조합 Fv 단편을 제조하는 방법은 또한 예를 들면, 문헌[참조: Moore et al. (미국 특허 제4,642,334호)] 및 플뤼크툰(Plueckthun)의 문헌[참조: Bio/Technology 9:545 (1991)]에 기술되어 잇다. 또한, 이들은 표준 방법에 의해 화학적으로 합성할 수 있다.
항-이디오타입 항체(anti-idiotype antibody), 폴리클로날 및 모노클로날 둘다를 또한 항원으로서의 수용체에 대해 유발된 항체를 사용하여 생산할 수 있다. 이러한 항체는, 이들이 수용체를 모사하므로 유용할 수 있다.
약제학적 조성물
TLR 효능제 및 길항제를 치료학적으로 사용하여 TLR의 활성을 자극하거나 또는 차단함으로써, TLR에 의해 유발되거나 또는 중재된 특정의 의학적 상태를 치료할 수 있다. 치료학적 적용에 포함된 용량 섭생은 치료 물질의 작용을 개질시킬 수 있는 각종 인자, 예를 들면, 환자의 상태, 체중, 성별 및 식이, 투여 시간, 및 기타 임상 인자를 고려하여, 주치의에 의해 결정될 것이다.
이러한 물질의 치료학적 투여를 위한 대표적인 프로토콜은 당해 분야에 잘 공지되어 있다. 약제학적 조성물의 투여는 통상적으로 비경구, 복강내, 정맥내, 피하내 또는 근육내 주사이거나, 또는 주입 또는 특정의 다른 허용되는 전신계 방법이다. 종종, 치료 용량은 낮은 수준으로부터 안정성 및 효능을 최적화시킬 때가지 증가시키면서 적정한다. 일반적으로, 1일 용량은 체중 kg당 약 0.01 내지 20mg 의 단백질의 범위내일 것이다. 통상적으로, 용량 범위는 체중 kg당 약 0.1 내지 5mg일 것이다.
용량은 투여후 보다 작은 분자 크기 및 가능하게는 감소된 반감기(청소 시간)를 고려하여 조절될 것이다. 그러나, TLR 길항제가 본 발명의 방법을 사용하여 확인할 수 있는, 작은 유기 분자 및 억제성 리간드 유사체를 포함하는 다른 유형의 억제제 외에 중화 항체 또는 이의 결합 단편을 포함한다는 것은 당해 분야의 숙련가들에 의해 인지될 것이다.
비록 약제학적 조성물을 단순한 용액으로 투여할 수 있다고 해도, 이들은 담체, 바람직하게는 약제학적 담체와 같은 다른 물질과 함께 사용된다. 유용한 약제학적 담체는 약제학적 조성물을 환자에게 전달하기에 적합한 어떠한 혼화성의 비-독성 물질일 수 있다. 멸균수, 알코올, 지방, 왁스 및 불활성 고체가 담체에 포함될 수 있다. 약제학적으로 허용되는 부형제(완충제, 분산제)를 또한 약제학적 조성물내로 혼입시킬 수 있다. 일반적으로, 이러한 약물의 비경구 투여에 유용한 조성물은 문헌[참조: 예를 들면, Remington's Pharmaceutical Science, 17th Ed.(Mack Publishing Company, Easton, PA, 1990)]에 공지되어 있다. 달리는, 약제학적 조성물을 삽입가능한 약물 전달 시스템에 의해 환자의 체내로 도입시킬 수 있다[참조: Urquhart et al., Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 24:199 (1984)].
치료학적 제형은 많은 통상의 용량 제형으로 투여할 수 있다. 제형은 통상적으로 하나 이상의 활성 성분과 함께, 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 제형은 경구, 직장, 비강 또는 비경구(피하, 근육내, 정맥내 및 피내를 포함)에 적합한 것들을 포함할 수 있다.
제형은 편리하게는 단위 용량형으로 제공될 수 있으며 약제학 분야에 익히 공지된 어떠한 방법으로도 제조할 수 있다[참조: 예를 들면, Gilman et al. (eds.) (1990), The Pharmacological Bases of Therapeutics, 8th Ed., Pergamon Press; 및 Remington's Pharmaceutical Sciences, supra, Easton, Penn.; Avis et al. (eds.) (1993) Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications Dekker, New York; Lieberman et al. (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets Dekker, New York; 및 Lieberman et al. (eds.) (1990), Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems Dekker, New York].
조합 치료요법
암을 예방하거나 또는 치료하는데 있어서 TLR 리간드이 효능은 동일한 목적을 위해 효과적인 다른 제제 또는 치료제와 함께 조합하여 리간드를 투여함으로써 증진시킬 수 있다. 예를 들어, TLR 리간드는 화학요법제 또는 암 치료와 함게 투여할 수 있다. 바람직하게는, TLR 리간드는 TLR3 효능제이다.
"화학요법제"는 암의 치료에 유용한 화학적 화합물이다. 화학요법제의 예는 티오테파 및 사이클로포스파미드(CYTOXANTM)과 같은 알킬화제; 부설판, 임프로설판 및 피포설판과 같은 알킬 설포네이트; 벤조도파, 카르보쿠온, 메투레도파 및 우레도파와 같은 아지리딘; 알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포르아미드, 트리에틸렌티오포스포르아미드 및 트리메틸올로멜라민을 포함하는 에틸렌이민 및 메틸라멜라민; 아세토게닌(특히 불라타신 및 불라타시논); 캄프토테신(합성 유사 토포테칸 포함); 브리오스타틴; 칼리스타틴; CC-1065(이의 아도젤레신, 카르젤레신 및 비젤레신 합성 유사체 포함); 크립토신(특히, 피크립토피신 1 및 크립토피신 8); 돌라스타틴; 듀오카르마이신(합성 유사체, KW-2189 및 CBI-TMI 포함); 엘레우테로빈; 판크라티스타틴; 사르코딕티인; 스폰기스타틴; 클로르암부실, 클로르나파진, 콜로포스파미드, 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로레타민, 메틀로레타민 옥사이드 하이드로클로라이드, 멜팔란, 노벰비친, 페네스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파미드 및 우라실 머스타드와 같은 질소 머스타드; 카르무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴, 라니무스틴과 같은 니트로스우레아; 에네디인 항생제{예: 칼리체아미신, 특히 칼리체아미신 감마 1I 및 칼리케아미신 필1[참조: Agnew, Chem Intl. Ed. Engl., 33:183-186 (1994)]과 같은 항생제; 다이네미신 A를 포함하는 다이네미신; 클로드로네이트와 같은 비스포스포네이트; 에스퍼라미신; 및 네오카르지노스타틴 크로모포르 및 관련 크로모단백질 에네디인 항생제 크로모모포어, 아클라시노미신, 악티오마이신, 아우트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 카라비신, 카르미노마이신, 카르지노필린, 클로모마이신, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, 독소루비신(Adriamycin™)(모르폴리노-독소루비신, 시아노모르폴리노-독소루비신, 2-피롤리노-독소루비신 및 데옥시독소루비신 포함), 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신, 예를 들면, 미토마이신 C, 마이코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포트피로마이신, 푸로마이신, 쿠엘라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 투베르시딘, 우베니멕스, 지노스타틴 및 조루비신; 메토트렉세이트 및 5-플루오로우라실(5-FU)와 같은 항-대사물질; 데노프테린, 메토트렉세이트, 프테로프테린 및 트리메트렉세이트와 같은 엽산 유사체; 플루다라빈, 6-머캅토푸린, 티아미프린 및 티오구아닌과 같은 퓨린 유사체; 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카르모푸르, 시타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈 및 플록수리딘과 같은 피리미딘 유사체; 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄 및 테스토락톤과 같은 안드로겐; 아미노글루테쓰이미드, 미토탄 및 트릴로스탄과 같은 항-아드레날; 프롤린산과 같은 엽산 보충물; 아세글라톤; 알도포스파미드 글리코사이드; 아미노레불린산; 에닐루아실; 암사크린; 베스트라부실; 비산트렌; 에다트락세이트; 데포파민; 데메콜신; 디아지퀴온; 엘포르니틴; 엘리프티늄 아세테이트; 에포틸론; 에토글루시드; 갈륨 니트레이트; 하이드록시우레아; 렌티난; 로니다민; 마이탄신 및 안사미토신과 같은 마이탄시노이드; 미토구아존; 미톡산트론; 모피다몰; 니트라크린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 로속산트론; 포도필린산; 2-에틸하이드라지드; 프로카르바진; PSK®; 라족산; 리족신; 시조피란; 스피로게르마늄; 테뉴라존산; 트리아지쿠온; 2,2',2''-트리클로로트리에틸아민; 트리코테센(특히, T-2 독소, 베라쿠린 A, 로리딘 A 및 안구이딘); 우레탄; 빈데신; 다카르바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미토락톨; 피포브로만; 가시토신; 아라비노시드("Ara-C"); 사이클로포스파미드; 티오테파; 탁소이드, 예를 들면, 파클리탁셀[TAXOL®, 미국 뉴저지주 프린스턴 소재의 브리스톨-메이어스 스퀴브 온콜로지(Bristol-Myers Squibb Oncology) 제조원] 및 독세탁솔[TAXOTERE®, 프랑스 안토니 소재의 롱-플랑 로러(Rhone-Poulenc Rorer) 제조원]; 클로람부실; 겜시타빈(Gemzar™); 6-티오구아닌; 머캅토푸린; 메토트렉세이트; 시스플라틴 및 카브로플라틴과 같은 백금 유사체; 빈블라스틴; 백금; 에토포시드(VP-16); 이포스파미드; 미톡산트론; 빈크리스틴; 비노렐빈(NavelbineT™); 노반트론; 테니포시드; 에다트렉세이트; 다우노마이신; 아미노프테린; 크셀로다; 이반드로네이트; CPT-11; 토포이소머라제 억제제 RFS 2000; 디플루오로메틸오르니틴(DMFO); 레티노산과 같은 레티노이드; 카펙시타빈; 및 상기중 어느 것의 약제학적으로 허용되는 염, 산 또는 유도체를 포함한다. 또한 당해 정의에는 예를 들면, 타목시펜(Nolvadex™ 포함), 랄록시펜, 드롤록시펜, 4-하이드록시타목시펜, 트리옥시펜, 테옥시펜, LY117018, 오나프리스톤, 및 토레미펜(Fareston™)을 포함하는 항-에스트로겐 및 선택적인 에스트로겐 수용체 조절인자(SERM); 예를 들면, 4(5)-이미다졸, 아미노글루테쓰이미드, 메게스트롤 아세테이트(Megace™), 엑세메스탄, 포르메스탄, 파드로졸, 보로졸(Rivisor™), 레트로졸(Femara™), 및 아나스트로졸(Arimidex™)과 같은 부신에서 에스트로겐 생산을 조절하며, 효소 아로마타제를 억제하는 아로마타제 억제제; 및 플루타미드, 닐루타미드, 비칼루타미드, 류프롤리드 및 고세렐린과 같은 항-안드로겐; 및 상기 중의 어느 것의 약제학적으로 허용되는 염, 산 또는 유도체를 포함하는, 항-에스트로겐 및 선택적인 에스트로겐 수용체 조절인자(SERM)와 같이, 종양에서 호르몬 작용을 조절하거나 억제하는데 작용하는 항-호르몬제가 포함된다.
암에 대한 "치료"는 암을 제거하기 위한 수술, 및 암 또는 종양을 감소시키거나 사멸시키기 위한 방사선 치료를 포함한다. 암을 예방하거나 또는 치료하는데 있어서 TLR 리간드의 효능은 리간드와 함께 낮은 투여량의 제I형 IFN을 투여함으로써 증진시킬 수 있다. 예를 들어, 낮은 투여량의 제I형 IFN은 1 내지 3MU의 범위, 및 바람직하게는 2MU이다. 더욱 바람직하게는, 낮은 투여량의 제I형 IFN은 1MU 미만이다. 바람직하게는, TLR 리간드는 TLR3 효능제이다.
위에서 기술한 바와 같이, 조합 치료요법에 포함된 용량 섭생은 주치의에 의해 결정될 것이다.
본 발명은 본 발명의 예로서 제공되는 다음의 비-제한적 실시예를 참조로 더욱 잘 이해될 수 있다. 다음 실시예들은 본 발명을 더욱 완전히 설명하기 위해 제공되며, 본 발명의 광범위한 범위를 제한하는 것으로 고려되어서는 안된다. 달리 제시하지 않는 한, 고체 혼합물에서 고체, 액체중 액체, 및 액체중 고체에서 하기 제공된 퍼센트는 각각 wt/wt, vol/vol 및 wt/vol 기준이다. 멸균 조건은 일반적으로 세포 배양동안 유지되었다.
물질 및 일반적인 방법
예를 들면, 문헌[참조: Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1982, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press; Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (2d ed.), VoIs 1-3, 1989, Cold Spring Harbor Press, NY; Ausubel et al., Biology, Greene Publishing Associates, Brooklyn, NY; or Ausubel, et al. (1987 and Supplements), Current Protocols in Molecular Biology, Greene/Wiley, New York; lnnis et al. (eds.) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, 1990, Academic Press, N.Y.]에 기술된 바와 같은 표준 방법이 사용되었다.
세포주 및 시약
사람 유방 종양 세포 주, Cama-1 , SW527, BT-483 및 MCF-7은 ATCC (미국 매릴랜드주 록크빌 소재)로부터 입수하여 2mM L-글루타민[제조원: 영국 페이슬리 파크 소재의 라이프 테크놀로지스(Life Technologies)], 10% 태(fetal) 송아지 혈청(라이프 테크놀로지스 제조원), 160 μg/mL 겐탈린[미국 뉴저지주 케닐워쓰 소재의 쉐링 플라우(Schering Plough) 제조원], 2.5 mg/mL 중탄산나트륨(라이프 테크놀로지스 제조원), 아미노산(인비트로겐 제조원) 및 1 mM 나트륨 피루베이트[미국 미쥬리주 세인트 루이스 소재의 시그마-알드리히(Sigma-Aldrich) 제조원](완전 배지로 언급됨)이 보충된, 4.5 g/mL 글루코즈[미국 캘리포니아주 샌 디에고 소재의 인비트로겐(Invitrogen) 제조원]를 함유하는 DMEM F12속에서 배양하였다. 폴리이노신산-폴리사이티딜산, 폴리 IC는 인비보겐(Invivogen)(미국 캘리포니아주 샌 디에고 소재)로부터 입수하였다. 펩티도글리칸(PGN) 및 지질다당류(LPS)는 시그마-알드리히(Sigma-Aldrich)에서 구입하였다. 제I형 IFN 수용체 차단 mAb는 피비엘 바이오케미칼 래보러토리스(PBL Biochemical Laboratories)(미국 뉴저지주 피스카타웨이 소재) 및 TNF-α 중화 mAb는 겐자임(Genzyme)(미국 매사츄세츠주 캠브릿지 소재)에서 구입하였다. Stat1에 대한 항체, 포스포릴화된 Stat1(타이로신 701) 및 PKR은 셀 시그날링(Cell Signaling)(미국 매사츄세츠주 베버리 소재)로부터 구입하였다. 사람 IFN-β에 대한 항체는 알 앤드 디 시스템스(R&D Systems)(미국 미네소타주미네아폴리스 소재)로부터 구입하였다. NF-κB p65 소단위, TRAF6 및 β-튜불린에 대한 항체는 산타 크루즈 바이오테크놀로지(Santa Cruz Biotechnology)(미국 캘리포니아주 산타 크루즈 소재)로부터 구입하였다. 일반적인 카스파제 억제제 z-VAD-fmk는 알앤드디 시스템에서 구입하였다. 사이클로헥스이미드(CHX)는 시그마-알드리히로부터 구입하였다.
사람 원발 유방 종양 샘플은 병원 생명윤리 프로토콜에 부합하여 기관[프랑스 레온 소재의 센트레 레옹 베라르(Centre Leon Berard)]으로부터 입수하였다. 단일 세포 현탁액은 콜라게나제 A(시그마-알드리히 제조원)으로 분해하고 사람 상피 항원(HEA) 양성 세포속에서 HEA-마이크로비드[독일 베르기슈 글라디바흐 소재의 밀테니 바이오테크(Mylteni Biotech) 제조원]를 사용하여 제조업자의 지시에 따라 세척하고 풍부하게 한 후 수득하였다. 최종 단일 세포 현탁액은 80% 이상의 HEA 양성 세포 및 2% 미만의 CD4+ 조혈 오염물질을 함유하였다.
세포자멸사 분석
TLR 리간드로 치료한 후 세포 회수를 결정 바이올렛 염색(시그마-알드리히 제조원)으로 측정하였다. 세포를 96웰 플레이트에서 104 세포/웰로 플레이팅하였다. TLR 리간드의 존재 또는 부재하에 72시간 배양 한 후, 세포를 PBS로 세척하고, 6% 포름알데하이드(시그마-알드리히 제조원)속에서 20분 동안 고정시키고, 2회 세척한 후, 0.1% 결정 바이올렛으로 10분 동안 염색하였다. 세척하고 1% SDS 속에서 1시간 동안 항온처리한 후, 흡광도를 Vmax 플레이트 판독기[미국 캘리포니아주 서니베일 소재의 몰레큘러 디바이스(Molecular Devices) 제조원] 상에서 605 nm로 판독하였다. 아넥신 V 염색을 아넥신-FITC 세포자멸사 검출 키트[미국 캘리포니아 샌 디에고 소재의 비디 파밍겐(BD Pharmingen) 제조원]로 제조업자의 지시에 따라서 수행하였다. 아-이배체 세포를 70% 에탄올 중에서 밤새 침투시킨 후 3μg/mL 프로피디움 요오다이드(PI)[미국 오레건주 유젠 소재의 몰레큘러 브로브스(Molecular probes) 제조원]로 염색하여 검출하였다. 형광성을 이중-식별 모듈(doublet-discrimination module)이 장착되고 셀퀘스트 프로 소프트웨어(Cellquest Pro software)(벡톤 디킨슨 제조원)을 사용하는 FACScalibur[미국 캘리포니아주 마운틴 뷰 소재의 벡톤 디킨슨(Becton Dickinson) 제조원]상에서 유동 세포측정법으로 분석하였다.
생화학
카마-1 세포를 1% 노니데트(Nonidet)-P40-함유 완충액 속에서 분해하였다. 20μg의 총 단백질을 SDS-폴리아크릴아미드 겔(인비트로겐 제조원)상에서 레인당 로딩하였다. 웨스턴 블롯(WB)을 위에서 기술한 항체를 사용하는 표준 기술로 수행하였다. 항 IRAK-4 모노클로날 항체를 문헌[참조: Fossiez et al., "T cell interleukin-17 induces stromal Cells to produce proinflammatory and hematopoietic cytokines", J. Exp. Med., vol. 183(6), pp. 2593-2603 (1996)]에 기술된 프로토콜에 따라 연구실에서 생성시켰다.
사이토킨 분비
IL-6 분비는 듀오셋 엘리자 키트(DuoSet ELISA kit)를 사용하여 제조업자의 지시(제조원: 알 앤드 시스템즈)에 따라 표준 효소-결합된 검정(ELISA)으로 배양물 상층액 속에서 측정하였다.
siRNA 실험
카마-1 세포를 웰당 3x105 세포에서 6웰 플레이트속에서 플레이팅하였다. 밤새 부착시킨 후, siRNA 형질감염을 3㎍/mL 리포펙타민 2000(인비보겐 제조원) 및 100 nM siRNA를 함유하는 OptiMEM 배지(라이프 테크놀로지스 제조원) 속에서 5시간 동안 수행하였다. 이후에, 세포를 세척하고 완전 배지속에서 72시간 동안 배양한 후 폴리 IC로 치료하고 세포자멸사 분석을 하였다. TLR3, PKR, IRAK-4, TRAF6 및 p65에 대해 특이적인 siRNA 이본쇄(duplex)는 SMART-풀(pool)로서 다르마 콘[Dharmacon(Lafayette, CO)]에서 구입하였다. TRIF siRNA는 동일한 공급업자로부터 단일 올리고이본쇄(5'-GCUCUUGUAUCUGAAGCAC-3')(서열 23)로 구입하였다. TLR3 및 TRIF 발현을 PCR(35 주기; 94℃에서 1분, 55℃에서 1분, 72℃에서 2분)에 의해 태크 PCR 레디믹스(Taq PCR ReadyMix)(시그마-알드리히 제조원)로 다음 프라이머를 사용하여 평가하였다:
TLR3에 대해 5'-AACGATTCCTTTGCTTGGCTTC-3' (정방향)(서열 24)/ 5'-GCTTAGATCCAGAATGGTCAAG-3'(역방향)(서열 25) 및
TRIF에 대해 5'-ACTTCCTAGCGCCTTCGACA-3' (정방향)(서열 26)/ 5'-ATCTTCTACAGAAAGTTGGA-S' (역방향)(서열 27).
PKR, IRAK-4, TRAF6 및 p65의 발현은 위에서 기술한 바와 같이 WB로 평가하였다.
실시예 1
이들 시험 세트에서, 각각의 TLR 1 내지 10에 대한 TLR 발현은 6개의 사람 직장결장 샘암종 세포주에서 RT-PCR로 검출하였다. 분석된 6개의 세포주는 Caco 2, LoVo, Colo 320 DM, SNU-C1 , T84 및 Colo 205이었다. 동량의 mRNA를 각각의 세포주로부터 추출하였다. mRNA를 후속적으로 PCR에 의해 35 주기(94℃에서 30초, 6O℃에서 45초, 72℃에서 90초) 동안 hTLR-특이적인 프라이머를 사용하여 증폭시켰다. 다음 프라이머를 사용하였다:
TLR1F: caggatcaaggtacttgatcttc (서열 1);
TLR1R : tttctctcatgaaggcaaatctg (서열 2);
TLR2F : ctcaggagcagcaagcactg (서열 3);
TLR2R : atcttccgcagcttgcagaag (서열 4);
TLR3F : aacgattcctttgcttggcttc (서열 5);
TLR3R : gcttagatccagaatggtcaag (서열 6);
TLR4F : ctcagaatgactttgcttgtac (서열 7);
TLR4R : gcaggacaatgaagatgatacc (서열 8);
TLR5F : cgaacctcatccacttatcag (서열 9);
TLR5R : gtgaactttagggactttaagac (서열 10);
TLR6F : ccaatgtacctgtgagctaag (서열 11);
TLR6R : ccactcactctggacaaagttg (서열 12);
TLR7F : ggatctgtctttcaattttgaac (서열 13);
TLR7R : ccaaggtctgcccatacttg (서열 14);
TLR8F : gctatccttgtgatgagaaaaag (서열 15);
TLR8R : gcattgaagcacctcggacag (서열 16);
TLR9F : actgtttcgccctctcgctg (서열 17);
TLR9R : gccagcacaaacagcgtcttg (서열 18);
TLR10F : ttgttcagagctgccaggaag (서열 19); 및
TLR10R : gcaaagtagaattcataatggcac (서열 20).
이후에, PCR 생성물을 에티디움 브로마이드로 염색한 아가로즈 겔상에서 분석하였다.
이들 시험의 결과는, 카코 2 세포주가 TLR 2, 5, 7 및 9를 발현하였음을 나 타낸다. LoVo 세포주는 TLR 2, 3, 4, 5 및 6을 발현하였다. Colo 320 DM 세포주는 TLR 5 및 6를 발현하였다. SNU-C1 세포주는 TLR 4를 발현하였다. T84 세포주는 TLR 4, 5 및 6을 발현하였다. Colo 205 세포주는 TLR 4, 5 및 6을 발현하였다.
유사한 분석을 8개의 사람 폐 세포주(NCI- H526, SHP-77, NCI-N417, A549, NCI-H358, A427, NCI-H292, NCI-H187) 및 4개의 사람 유방암 세포주(SW527, Cama-1, BT483, MCF-7)상에서 수행하였다. 이들 시험의 결과는, NCI-H526 세포주(소 세포 폐 암종)이 TLR 2, 3, 5 및 9를 발현하였음을 나타낸다. SHP-77 세포주 (SCLC의 거대 세포 변이체)는 TLR 4, 5, 6, 7, 9 및 10을 발현하였다. NCI-N417 세포주(소 세포 폐 암종)은 TLR 5를 발현하였다. A549 세포주(폐 암종)은 TLR 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 및 10을 발현하였다. NCI-H358 세포주(세기관지폐포암종)은 TLR 2, 4, 5, 6, 7 및 10을 발현하였다. A427 세포주(폐 암종)은 TLR 2, 3, 5 및 6을 발현하였다. NCI-H292 세포주(표피양 폐 암종)은 TLR 1 , 2, 3, 4, 5, 6 및 10을 발현하였다. NCI-H 187 세포주(소 세포 폐 암종)은 TLR 5, 6 및 10을 발현하였다. SW527 세포주(유방 샘암종)은 TLR 2, 4, 6 및 10을 발현하였다. Cama-1 세포주(유방 샘암종)은 TLR 2, 5, 6 및 10을 발현하였다. BT483 세포주(유방 샘암종)은 TLR 2, 4, 5, 6, 7, 9 및 10을 발현하였다. MCF-7 세포주 (유방 샘암종)은 TLR 2, 5, 6 및 9를 발현하였다.
결장, 유방 및 폐로부터의 시험한 사람 종양 세포주 모두는 다수의 TLR 전사체를 발현함이 명백하다. 그러나, 실질적인 이질성은, 각각의 세포주 내에서 발현되는 TLR의 종류 및 이들의 발현 수준에 대해 존재한다.
실시예 2
4개의 사람 유방 종양 세포주, Cama-1 , SW527, BT483 및 MCF-7을 폴리 IC에 대한 반응시 세포 사멸에 대해 분석하였다. 세포를 5㎍/ml PGN, 50㎍/ml 폴리 IC 또는 10㎍/ml LPS와 함께 72시간 동안 배양하였다. 대조군 세포를 PBS와 함께 배양하였다. 세포독성을 크리스탈 바이올렛 염색으로 평가하고 대조군의 퍼센트로서 나타내었다.
평균적으로, 대조군 세포는 100% 세포 회복률을 나타내었다. PGN 세포는 평균 95%의 세포 회복률을 나타내었다. LPS로 치료된 세포는 평균 95%의 회복률을 나타내었다. 평균적으로, 폴리 IC로 치료한 세포는 67.5%의 세포 회복률을 나타내었다. 상세하게는, Cama-1, SW527, BT483 및 MCF-7 세포주는 각각 33%, 75%, 67% 및 100%의 회복률을 나타내었다.
당해 데이타는, 폴리 IC가 Cama-1 , BT483 및 SW527로 시험한 3개의 세포주에서 세포 회복률의 감소를 유발함을 나타낸다. 당해 데이타로부터 알 수 있는 바와 같이, Cama-1 세포주는 일관되게 대부분의 놀라운 감소를 나타내었다. 그러나, 폴리 IC는 MCF-7 세포주에서 세포 회복의 감소를 유발하지 않았다.
또한, 추가의 TLR 리간드를 시험하여 세포독성에 있어서 어떠한 가능한 효과를 측정하였다. 시험한 리간드는 PGN, LPS, 플라겔린, R848 및 CpG이었다. 세포를 5㎍/ml PGN, 10㎍/ml LPS, 50 ng/ml 플라겔린, 6㎍/ml R848, 10㎍/ml CpG ODNs, 또는 대조군으로서 PBS와 함께 72 시간 동안 배양하였다. 세포 회복을 크리스탈 바이올렛 염색으로 평가하고 대조군 퍼센트로서 나타내었다. 이들 리간드중 어느 것도 4개의 유방암 세포주(Cama-1, BT483, SW527 및 MCF-7)중 어느 것의 세포 회복을 현저히 감소시키지 않았다. 비록 PGN이 세포 회복에 있어 효과가 없다고 하더라도, 이는 특정 세포주에서 IL-8의 분비를 유도하였으므로, 세포독성의 결핍이 TLR 트리거링(triggering)의 부재에 기인하지 않음을 입증한다.
실시예 3
Cama-1 세포를 폴리 IC에 대한 반응시 TLR3 mRNA 발현에 대해 분석하였다. Cama-1 세포를 완전 배지(4.5 g/mL 글루코즈를 함유하고 2mM L-글루타민, 10% 태 송아지 혈청, 160 μg/mL 겐탈린, 2.5 mg/mL 중탄산나트륨이 보충된 DMEM F12)속에서 48시간 동안 단독으로, 또는 LPS (5 μg/ml) 및/또는 폴리 IC(5㎍/ml)과 함께 배양하였다. 각각의 그룹의 세포로부터 mRNA를 추출하였다. 이후에, mRNA를 역-전사하고 35 주기(실시예 1에 상기 나타낸 바와 같이)로 hTLR3 특이적인 프라이머: TLR3F: aacgattcctttgcttggcttc (서열 5) 및 TLR3R: gcttagatccagaatggtcaag (서열 6)를 사용하여 PCR 증폭시켰다. TLR3 mRNA는 수득되는 Cama-1 세포로부터 증폭될 수 없다.
hTLR3 특이적인 프라이머를 사용하여 RT-PCR로부터의 증폭된 DNA를 겔상에서 수행하였다. 겔은 양성 대조군(플라스미드 TLR3)에서, 폴리 IC로 치료한 세포에서, 및 폴리 IC와 LPS 둘다로 치료한 세포에서 TLR3 발현을 나타내었다. 겔은, 세포내 TLR3 발현이 LPS로 치료되거나, 또는 전혀로 치료되지 않은(음성 대조군) 세포에서 TLR3 발현을 나타내지 않았다.
당해 데이타는, TLR3 mRNA 발현이 사람 유방 암종 Cama-1 세포에서 폴리 IC 에 의해 유도됨을 나타낸다. 따라서, 폴리 IC 치료는 특정의 종양 세포주에서 이의 인지된 수용체인 TLR3의 발현을 상향조절한다. 한편, LPS를 사용한 치료는 Cama-1 세포에서 TLR3 mRNA 발현에 영향을 미치지 않았다.
실시예 4
2개의 세포주, 결장 암 세포주 LS174T 및 유방암 세포주 Cama-1을 사멸 및 세포 주기 변화에 대해 분석하였다. 세포를 폴리 IC(5 μg/ml)의 존재 또는 부재하에 48시간 동안 배양하였다. 1㎍/ml 브로모데옥시우리딘(BrdU)으로 30분 펄스한 후, 세포를 밤새 4℃로 70% 에탄올 속에서 고정시킨 후 FITC-커플링된 항-BrdU 모노클로날 항체 및 3㎍/ml 프로피듐 요오다이드로 염색하였다. 세포 사멸 및 세포 주기를 유동 세포측정법(FACS)으로 분석하였다. BrdU 혼입은 증식의 척도인 반면, 프로피듐 요오다이드 염색은 DNA 함량 정량, 특히 세포자멸사를 겪는 아이배체 세포 집단의 적량을 허용한다.
당해 데이타는, BrdU가 혼입된 LS174T 세포의 퍼센트가 치료 전 27%에서 폴리 IC의 존재하에 48시간 배양한 후 9%로 됨을 나타낸다. 역으로, 아이배체 DNA 함량을 갖는 LS174T 세포의 퍼센트는 치료 전 3%에서 폴리 IC의 강력한 세포독성의 지표인, 폴리 IC의 존재하에서 48시간 배양한 후 23%로 된다.
또한, 당해 데이타는, BrdU가 혼입된 Cama-1 세포가 치료 전 15%에서 폴리 IC의 존재하에 48시간 배양한 후 2%로 됨을 나타낸다. 역으로, 아이배체 DNA 함량을 갖는 Cama-1 세포의 퍼센트는 치료 전 4%에서 폴리 IC에 의해 트리거된 세포자멸사의 지표인, 폴리 IC의 존재하에서 48시간 배양한 후 17%로 되었다.
이들 데이타는, 폴리 IC로 48시간 동안 치료시, LS174T 및 Cama-1 세포주 둘다가 분열을 정지하고 세포자멸사됨을 나타낸다.
실시예 5
유방 종양 세포주에서 폴리 IC 치료의 효과를 시험하기 위해, 세포 사멸을 아넥신 V 염색에 의해 Cama-1 세포에서 분석하였다. 세포를 24시간 동안 5㎍/ml의 IC의 존재 또는 부재하에 배양하였다. 세포자멸사를 아넥신 V 염색 및 유동 세포측정으로 측정하였다. 당해 데이타는, 70% 이상의 Cama-1 세포가 아넥신 V에 의해 염색됨을 나타내며, 또한 폴리 IC에 의해 유도된 세포자멸사를 입증한다.
본 출원인은 또한 폴리 IC 유도된 세포자멸사의 역학을 측정하려 노력하였다. Cama-1 세포를 5㎍/ml 또는 50 ng/ml의 폴리 IC의 존재 또는 부재하에서 배양하였다. 배양물중 세포자멸사(아넥신 양성) 세포의 퍼센트를 추가의 30시간 동안 측정하였다. 당해 데이타는, 치료되지 않은 세포가 30시간 후 15%의 자발적인 세포자멸사를 나타내었음을 나타낸다. 그러나, 폴리 IC로 치료한 세포의 80%가 세포 사멸을 나타내었다. 상세하게는, 폴리 IC 첨가후 9시간째에 개시하여 치료 30분 후 세포자멸사 세포가 80%에 이르기 까지 폴리 IC는 Cama-1 세포에서 세포자멸사를 트리거링하였다.
이후에, 본 출원인은, 폴리 IC가 사람 원발 유방 종양 세포에서 지니는 효과에 대해 측정하려 노력하였다. 새로이 회수된 종양 단일 세포 현탁액을 PBS 또는 폴리 IC(50 μg/ml)의 존재하에 48시간 동안 배양하였다. 세포자멸사를 PI 염색으로 측정하였다. 퍼센트는 낮은 DNA 함량(subG0/G1 세포), 즉, 세포자멸사 세포를 지닌 세포의 비율을 나타낸다. 당해 데이타는, PBS로 치료된 세포의 19.5%가 낮은 DNA 함량을 지니는 반면, 폴리 IC로 치료한 세포의 38.6%가 낮은 DNA 함량을 지님을 나타낸다. 따라서, 폴리 IC의 유사한 세포독성 효과가 사람 유방 원발 종양 세포에서 관측되었다.
실시예 6
TLR3를 폴리 IC 유도된 세포자멸사에서 이의 역할에 대해 분석하였다. Cama-1 세포를 비가역적 서열(Scr RNA; 서열: ACUAGUUCACGAGUCACCUtt) (서열 21), 또는 hTLR3(서열: CAGUGUUGAACCUUACCCAtt)(서열 22)에 상응하는 siRNA로 형질감염시켰다. siRNA 형질감염을 3 μg/mL 리포펙타민 2000 및 100 nM siRNA를 함유하는 1 mL OptiMEM™ 배지 속에서 5시간 동안 수행하였다. 이후에, 세포를 포스페이트 완충화된 염수 용액(PBS)속에서 세척하고 완전 배지속에서 72시간 동안 배양한 후 연속해서 5㎍/mL 폴리 IC로 48시간 치료하였다. 이후에, 세포 주기를 실시예 3에서 기술한 바와 같이 에티디움 브로마이드로 염색한 후 FACS로 분석하였다.
이들 시험의 결과를 도 1에 나타낸다. 당해 데이타는, 폴리 IC의 존재하에서 비가역적인, 스크램블드(scrambled) RNA로 형질감염시킨 Cama-1 세포의 48시간 배양이 아이배체 세포의 퍼센트를 2%에서 45%로 증가시켰음을 나타낸다. 그러나, 폴리 IC의 존재하에서 hTLR3 siRNA로 형질감염시킨 Cama-1 세포의 48시간 배양은 아이배체 세포의 퍼센트를 증가시키지 않았고, 3%에서 변하지 않았다.
이들 데이타는, 폴리 IC에 의해 Cama-1 세포로 전달된 세포자멸사 시그날이 TLR3의 발현을 필요로 함을 입증한다.
실시예 7
폴리 AU를 세포자멸사에서의 이의 효과에 대해 분석하였다. Cama-1 세포를 PBS와 함께, 또는 5ng/ml 내지 50 μg/ml의 범위로 증가하는 농도의 폴리 AU와 함께 48시간 동안 배양하였다. 세포자멸사를 아넥신 V 양성 세포의 퍼센트를 측정하여 분석하였다. 당해 데이타는, 폴리 IC와 유사하게, 폴리 AU도 세포자멸사를 트리거함을 나타낸다.
실시예 8
본 출원인은 생체내에서 폴리 IC 유도된 세포자멸사에 있어서 IFN의 효과를 분석하였다. TRP-태그 마우스는 망막 색소상피에서 SV40 T 항원을 발현하며 통상적으로 출생후 몇주내에 완전한 투과성을 지닌 눈 종양으로 발전한다.
이들 실험에서는, 실험당 14 내지 16개의 TRP-태그/IFNαβγR-/- 마우스[이들은 제I형 인터페론(IFNαβR)에 대한 수용체 및 제II형 인터페론(IFNγR)에 대한 수용체가 동시에 결손된 마우스에 교배된 TRP-태그 마우스이다]를 폴리 IC(100 μg/투여량) 또는 PBS를 정맥내 주사함으로써 21 , 23, 25, 27 및 29일째에 치료하였다. 가시적인 눈 종양 진행의 역학을 주당 2 및 3회 모니터하였다.
눈 종양의 외관은 PBS로 치료한 마우스와 비교하여 폴리 IC로 치료한 마우스에서 21일째까지 지연되었다. 이들 실험에 사용된 마우스는 작용적 인터페론 반응 시스템을 지니지 않았으므로, 데이타는, 폴리 IC가 생체내에서 제I형 및 제II형 인터페론과는 독립적임을 나타낸다.
실시예 9
폴리 IC 유도된 Cama-1 세포 독성의 경로를 측정하기 위하여, RNA 간섭을 사용하여 TRIF 및 PKR의 발현을 효율적으로 하향조절하였다. Cama-1 세포를 6 웰 플레이트속에서 웰당 3x105 세포로 플레이팅하였다. 밤새 부착시킨 후, siRNA 형질감염을 3㎍/mL 리포펙타민 2000(임비보겐 제조원) 및 100 nM siRNA를 함유하는 OptiMEM 배지[라이프 테크놀로지스(Life technologies) 제조원]속에서 5시간 동안 수행하였다. 세포를 MOCK(물), 대조군 스크램블드 이본쇄(scr) siRNA, TRIF siRNA 또는 PKR siRNA로 형질감염시켰다.
PKR에 대해 특이적인 siRNA 이본쇄는 SMART-풀(Pool)로서 다마콘(콜로라도주 Lafayette 소재)으로부터 시판되었다. TRIF siRNA는 동일한 공급업자로부터 단일 올리고이본쇄 5'-GCUCUUGUAUCUGAAGCAC-3' (서열 23)로서 시판되었다. TLR3 및 TRIF 발현을 태그 PCR 레디믹스(시그마-알드리히 제조원)로 PCR(35 주기: 94℃에서 1분, 55℃에서 1분, 72℃에서 2분)에 의해 다음 프라이머: TLR3에 대해 5'-AACGATTCCTTTGCTTGGCTTC-3' (서열 24) (정방향)/ 5'-GCTTAGATCCAGAATGGTCAAG-3' (서열 25) (역방향) 및 TRIF에 대해 5'-ACTTCCTAGCGCCTTCGACA-3' (서열 26) (정방향)/5'-ATCTTCTACAGAAAGTTGGA-3' (서열 27) (역방향)을 사용하여 평가하였다. PKR의 발현은 웨스턴 블롯으로 평가하였다. TRIF mRNA의 경우, PCR을 5㎍/ml의 폴리 IC의 존재 또는 부재하에서 다른 24시간 배양후 수행하였다.
당해 데이타는, RNA 간섭을 사용하여 TRIF 및 PKR의 발현을 효율적으로 하향조절하였음을 나타낸다.
siRNA 형질감염 후 72시간 째에, Cama-1 세포를 5μg/ml 폴리 IC의 존재 또는 부재하에서 다른 24시간 동안 배양하였다. 세포자멸사를 아넥신 V 염색으로 측정하고 배양물중 세포자멸사 세포의 퍼센트로 나타내었다. 평균적으로, 치료되지 않은 대조군 세포(MOCK 및 scr)의 10%가 세포자멸사를 겪지 않았다. 대조적으로, 폴리 IC로 치료한 대조군 세포(MOCK 및 scr)중 약 75%가 세포자멸사를 겪었다. TRIF siRNA 그룹에서, 치료되지 않은 세포는 10% 세포자멸사 세포를 나타낸 반면, TRIF siRNA로 치료한 세포는 20% 세포자멸사 세포를 나타내었다. 최종적으로, PKR siRNA 그룹에서, 치료되지 않은 세포는 10% 세포자멸사 세포를 나타내었으나, PKR siRNA로 치료한 세포는 80% 세포자멸사 세포를 나타내었다.
따라서, TRIF에 대한 siRNA로의 치료는 폴리 IC 유도된 세포자멸사를 현저히 방해한 반면, 세포 사멸은 PKR 발현의 부재하에서 정상적으로 발생하였다.
이러한 데이타는, Cama-1 세포에서 폴리 IC 유도된 세포자멸사가 TLR3 및 TRIF 둘다에 의해 중재되며, PKR과는 독립적임을 입증한다.
실시예 10
TLR3 중재된 세포독성을 추가로 조사하기 위해, 둘다 TLR 시그날링의 하부 중재인자인, 시그날링 분자 IRAK-4 및 TRAF6을 포함시켜 평가하였다. Cama-1 세포를 6 웰 플레이트 속에서 웰당 3x105 세포로 플레이팅하였다. 밤새 부착시킨 후, siRNA 형질감염을 3㎍/mL 리포펙타민 2000(인비보겐 제조원) 및 100 nM siRNA를 함유하는 OptiMEM 배지(라이프 테크놀로지스 제조원) 속에서 5시간 동안 수행하였다. 세포를 대조군 스크램블드된 이본쇄(scr) siRNA, IRAK-4 siRNA 또는 TRAF-6 siRNA 중의 하나로 형질감염시켰다. 이후에, 세포를 세척하고 완전 배지속에서 72시간 동안 배양한 후 폴리 IC로 치료하고 세포자멸사를 분석하였다. IRAK-4 및 TRAF6에 대해 특이적인 siRNA 이본쇄는 다마콘(콜로라도주 Lafayette 소재)으로부터 SMART-풀로서 시판되는 것을 구입하였다.
IRAK-4 및 TRAF6의 발현을 웨스턴 블롯으로 분석하였다. 웨스턴 블롯은, IRAK-4 및 TRAF6 siRNA가 상응하는 단백질의 발현을 중지시킴을 나타낸다.
siRNA 형질감염 후 72시간째에, Cama-1 세포를 5㎍/ml 폴리 IC의 존재 또는 부재하에 다른 24시간 동안 배양하였다. 세포자멸사를 아넥신 V 염색으로 측정하고 배양물중 세포자멸사 세포의 퍼센트로 나타내었다. 평균적으로, 치료되지 않은 대조군 세포(scr)의 10%는 세포자멸사를 겪었다. 대조적으로, 폴리 IC로 치료된 대조군 세포(scr)중 약 75%는 세포자멸사를 겪었다. IRAK-4 siRNA 그룹에서, 배양물은 단지 20%의 세포자멸사 세포를 나타내었으나, TRAF6 siRNA 그룹에서는, 세포중 75%가 배양 말기에 세포자멸사되었다. TRAF6 siRNA 그룹에서는, 치료되지 않은 세포가 15%의 세포자멸사 세포를 나타내었으나, TRAF6 siRNA로 치료한 세포는 75% 세포자멸사 세포를 나타내었다.
당해 데이타는, IRAK-4 발현이, 억제된 TLR3-중재된 세포 독성을 초래하였음을 나타낸다. 그러나, TRAF6 발현의 억제는, 억제된 TLR3-중재된 세포 독성을 초래하지 않았다. 이러한 발견은, TRAF6이 TLR 시그날링 경로에서 IRAK-4의 하부에 위치하는 것으로 고려되기 때문에 예측불가능한 것이었다. 따라서, 이는, TLR3이 IRAK-4를 통해 시그날을 제공함으로써 TRAF6 독립적인 세포자멸사 경로를 활성화함을 제안한다.
동시에, 5㎍/ml의 폴리 IC의 존재 또는 부재하에 24시간 동안 배양한 siRNA 형질감염된 Cama-1 세포의 상층액중 IL-6 농도를 ELISA로 측정하였다. 당해 데이타는, scr 그룹의 경우, 치료하지 않은 세포 및 치료한 세포가 각각 10 및 110의 IL-6 농도(pg/ml/106 세포)를 지님을 나타낸다. siRNA IRAK-4 그룹에서, 치료되지 않은 세포 및 치료된 세포는 각각 10 및 40의 IL-6 농도(pg/ml/106 세포)를 지녔다. siRNA TRAF6 그룹에서, 치료되지 않은 세포 및 치료된 세포는 각각 10 및 20의 IL-6 농도(pg/ml/106 세포)를 지녔다. 이들 데이타는, IRAK-4 및 TRAF6 둘 다가 사이토킨 생산에 요구되었음을 나타낸다.
실시예 11
TLR3 중재된 세포자멸사에서 제1형 인터페론을 포함시켜 평가하였다. Cama-1 세포를 5 μg/ml 폴리 IC와 함께 0 시간, 1시간, 6시간, 18시간 또는 24시간 동안 배양하였다. 세포 분해물에서 IFN-β, 포스포릴화된 Stat1(타이로신 701)(P-Stat-1) 및 총 Stat-1을 웨스턴 블롯으로 분석하였다.
당해 데이타는, IFN-β 생산이 폴리 IC 치료시 강력하게 유도되었음을 나타낸다. 또한, Stat1 포스포릴화가 관측되었다. 이러한 관측은, 제I형 IFN 시그날링이 Cama-1 세포에서 폴리 IC에 의해 트리거되었음을 입증한다. 흥미롭게도, Stat1 포스포릴화는, IFN-β 생산을 여전히 검출하기 어려운 경우에 폴리 IC 치료 6시간 후에 최대였다.
다른 실험에서, Cama-1 세포를 중화 IFN 제I형 수용체 mAb (항-IFN R1) 또는 동형 대조군(마우스 IgGI) 20㎍/ml와 함께 1시간 동안 예비-배양하였다. 이후에, 세포를 5㎍/ml의 폴리 IC의 존재 또는 부재하에, 또는 1000 U/ml의 각각의 IFN-α 또는 IFN-β의 혼합물과 함께 24시간 동안 배양하였다. 세포자멸사를 아넥신 V 염색으로 측정하고 배양물중 세포자멸사 세포의 퍼센트로 나타내었다.
항체의 부재하에서, 치료되지 않은 폴리 IC 및 IFNα/β로 치료된 세포는 각각 10%, 70% 및 20% 세포자멸사 세포를 나타내었다. mIgG1 그룹에서, 치료되지 않은 세포, 폴리 IC로 치료된 세포 및 IFNα/β로 치료된 세포는 각각 10%, 70% 및 20% 세포자멸사 세포를 나타내었다. 항-IFN R1 그룹에서, 치료되지 않은 세포, 폴리 IC로 치료된 세포 및 IFNα/β로 치료된 세포는 각각 10%, 30% 및 15% 세포자멸사 세포를 나타내었다.
당해 데이타는, 특이적인 모노클로날 항체를 사용한 제I형 IFN 수용체의 중화가 폴리 IC 유도된 세포자멸사를 현저히 감소시켰음을 나타낸다. 이는, 제I형 IFN이 TLR3 중재된 세포자멸사에 필수적임을 입증한다.
IFNα 및 IFNβ의 혼합물을 사용한 Cama-1 세포의 치료는 현저한 세포자멸사를 유도할 수 없었다. 이는, 제I형 IFN 시그날링이 TLR3 트리거된 세포독성에 필요함을 나타내었지만 세포 사멸만을 유도하기에는 충분하지 않음을 나타낸다.
실시예 12
본 출원인은, TNF-α가 TLR3 중재된 세포자멸사에 있어 역할을 담당하는지를 측정하기 위해 노력하였다. Cama-1 세포를 20 μg/ml의 중화 항 TNF-α mAb 또는 10 μg/ml CHX의 존재 또는 부재하에 예비-배양하였다. 이후에, 세포를 5 μg/ml의 폴리 IC 또는 25 ng/ml의 TNF-α의 존재 또는 부재하에 배양하였다. 세포자멸사는 아넥신 V 염색으로 측정하고 배양물중 세포자멸사 세포의 퍼센트로 나타내었다.
항체의 부재하에서, 치료되지 않은 세포, 폴리 IC로 치료된 세포 및 TNF-α로 치료된 세포는 각각 10%, 70% 및 40%의 세포자멸사 세포를 나타내었다. 항-TNF-α mAb 그룹에서, 치료되지 않은 세포, 폴리 IC로 치료된 세포 및 TNF-α로 치료된 세포는 각각 10%, 65% 및 10% 세포자멸사 세포를 나타내었다. CHX 그룹에서, 치료되지 않은 세포, 폴리 IC로 치료된 세포 및 TNF-α로 치료된 세포는 각각 15%, 40% 및 70%의 세포자멸사 세포를 나타내었다.
당해 데이타는, TNF-α 유도된 세포자멸사로부터 Cama-1 세포를 보호한 중화 항-TNF-α 항체가 폴리 IC 트리거된 세포 사멸에 있어 효과를 지니지 않았음을 나타낸다. 따라서, TNF-α는 TLR3 중재된 세포자멸사에 있어 역할을 하지 않는다.
위에서 기술한 바와 같이, Cama-1 세포는 NFκB 조절된 생존 프로그램을 차단함으로써 TNF-α 유도된 세포자멸사에 대해 세포를 감작화시키는 것으로 공지된 일반적인 전사 억제제 CHX로 예비-처리하였다.
당해 데이타는, CHX가 TNF-α 유도된 세포자멸사에 대해 Cama-1 세포를 현저히 감작화시킴을 나타낸다. 대조적으로, CHX는 폴리 IC 유도된 세포자멸사에 대해 세포를 부분적으로 보호하였다. 이는, 상이한 메카니즘이 이들 2개의 후-세포자멸 사 자극에 의해 트리거되었음을 입증한다.
이후에, RNA 간섭(interference)를 사용하여 TLR3 중재된 세포자멸사에서 NFκB의 관련성을 평가하였다. p65에 대해 siRNA 및 스크램블드된 대조군 이본쇄(scr)로 72시간 전에 형질감염시킨 Cama-1 세포를 50 ng/ml 또는 5㎍/ml의 폴리 IC의 존재 또는 부재하에 24시간 동안 배양하였다. 폴리 IC로 치료전에 p65 단백질 발현의 중지를 웨스턴 블롯으로 평가하였다. 세포자멸사는 아넥신 V 염색으로 측정하였다. 결과는 배양물중 세포자멸사 세포의 퍼센트로 나타내었다.
scr 그룹에서, 치료되지 않은 세포, 폴리 IC (50 ng/ml)로 치료된 세포 및 폴리 IC(5㎍/ml)로 치료된 세포는 각각 10%, 20% 및 70% 세포자멸사 세포를 나타내었다. siRNA p65 그룹에서, 치료되지 않은 세포, 폴리 IC (50 ng/ml)로 치료된 세포 및 폴리 IC(5㎍/ml)로 치료된 세포는 각각 10%, 10% 및 20% 세포자멸사 세포를 나타내었다.
당해 데이타는, siRNA에 의한 NFκB p65 발현의 억제가 폴리 IC 유도된 세포 독성에 대해 현저히 보호함을 나타낸다. 이는, 폴리 IC 트리거된 세포자멸사에서 NFκB의 세포사멸사 후 역할을 입증한다.
총괄적으로, 이들 결과는, TNF-α 분비가 폴리 IC 유도된 세포자멸사에 관여하지 않음을 입증한다. 또한, 이들 결과는 TLR로 중재된 세포사멸사에서 NFκB의 세포사멸사 후 역할을 입증하며, 이러한 역할은 TNF 치료시 항-세포자멸사 효과와는 대조적이다.
실시예 13
다음에서 본 출원인은 세포자멸사에서 카스파제(caspase)의 역할에 촛점을 맞추었다. Cama-1 세포를 25μM의 일반적인 카스파제 억제제 z-VAD-fmk 또는 DMSO와 함께 1시간 동안 예비-배양한 후 5μg/ml 폴리 IC 또는 25 ng/ml TNF-α(양성 대조군으로서 사용)의 존재 또는 부재하에 24시간 동안 배양하였다. 세포자멸사를 아넥신 V 염색으로 측정하고 배양물중 세포자멸사 세포의 퍼센트로 나타내었다.
DMSO 그룹에서, 치료되지 않은 그룹, 폴리 IC로 치료된 그룹 및 TNF-α로 치료된 세포는 각각 10%, 70% 및 40% 세포자멸사 세포를 나타내었다. z-VAD-fmk 그룹에서, 치료되지 않은 세포, 폴리 IC로 치료된 세포 및 TNF-α로 치료된 세포는 각각 10%, 30% 및 10% 세포자멸사 세포를 나타내었다.
당해 데이타는, 광범위한 카스파제 억제제 z-VAD-fmk에 의한 카스파제 활성의 억제가 폴리 IC 유도된 세포자멸사를 현저히 감소시킴을 나타낸다. 이는, TLR3 트리거된 세포독성에서 카스파제에 대한 주요 역할을 제안한다.
다른 실험에서, 상기 수득한 세포로부터의 분해물을 PARP, 카스파제 3 및 카스파제 8의 분해에 대해 웨스턴 블롯으로 분석하였다.
당해 데이타는, 카스파제-의존성 세포자멸사의 특징인 PARP가 폴리 IC 치료시 Cama-1 세포에서 발생하였음을 나타낸다. 이는 TLR3 중재된 세포자멸사에서 카스파제의 관련성을 확인한다. 실제로, 카스파제 3는 웨스턴 블롯 분석에 의해 입증되는 바와 같이, 폴리 IC로 치료시 활성화되었다.
실시예 14
본 출원인은 TLR3 리간드 및 제I형 IFN사이에 어떠한 협동작용이 존재하는지 를 추가로 조사하기 위해 노력하였다. 원발성 유방 암종 세포 SKBr3를 6웰 플레이트에서 웰당 3x105 세포로 플레이팅하였다. 밤새 부착시킨 후, siRNA 형질감염을 3 μg/mL 리포펙타민 2000(인비보겐 제조원) 및 100 nM siRNA를 함유하는 OptiMEM 배지(라이프 테크놀로지스 제조원)에서 5시간 동안 수행하였다. 세포를 MOCK(물), TLR3 siRNA 또는 PKR siRNA로 형질감염시켰다. 이후에, 세포를 세척하고 완전 배지속에서 72시간 동안 배양한 후 50 μg/ml 폴리 IC로 치료하고 세포자멸사 분석을 수행하였다.
MOCK 그룹에서, 치료되지 않은 세포 및 폴리 IC (50 μg/ml)로 치료된 세포는 각각 10% 및 22%의 세포자멸사 세포를 나타내었다. TLR3 siRNA 그룹에서, 치료되지 않은 세포 및 폴리 IC (50 μg/ml)로 치료된 세포는 각각 8% 및 13%의 세포자멸사 세포를 나타내었다. PKR siRNA 그룹에서,로 치료되지 않은 세포 및 폴리 IC (50㎍/ml)로 치료된 세포는 각각 12% 및 22%의 세포자멸사 세포를 나타내었다.
당해 데이타는, 유방 샘암종 세포주 SKBr3가 폴리 IC로 치료하는 경우 부분적인 세포자멸사를 겪음을 나타낸다. 또한, 당해 데이타는, 세포를 TLR3 siRNA로 예비-치료하는 것이 세포자멸사를 중지시키지만, PKR siRNA은 보호 효과를 지니지 않았음을 나타낸다.
다른 실험에서, 본 출원인은 IFN 및 폴리 IC가 세포자멸사를 유도하기 위해 상승적으로 작용하는지를 측정하기 위해 노력하였다. SKBr3 세포는 10 U/ml 또는 100 U/ml의 낮은 투여량의 IFN-α 또는 IFN-β의 혼합물로 예비-치료하거나로 치료 하지 않았다. 폴리 IC는 다음 투여량으로 투여하였다:: 48 시간 동안 0, 0.5, 5 및 50 μg/ml.
당해 데이타는, 치료되지 않은 폴리 IC 그룹에서, 치료되지 않은 세포, IFN-α/β(10 U/ml)로 치료된 세포 및 IFN-α/β(100 U/ml)로 치료된 세포가 각각 10%, 14% 및 22%의 세포자멸사 세포를 나타내었음을 나타낸다. 0.5 μg/ml 폴리 IC 그룹에서, 치료되지 않은 그룹, IFN-α/β(10 U/ml)로 치료된 그룹 및 IFN-α/β(100 U/ml)로 치료된 세포는 각각 15%, 45% 및 55%의 세포자멸사 세포를 나타내었다. 5 μg/ml 폴리 IC 그룹에서, 치료되지 않은 세포, IFN-α/β(10 U/ml)로 치료된 세포 및 IFN-α/β(100 U/ml)로 치료된 세포는 각각 20%, 55% 및 60%의 세포자멸사 세포를 나타내었다. 50 μg/ml 폴리 IC 그룹에서, 치료되지 않은 세포, IFN-α/β (10 U/ml)로 치료된 그룹 및 IFN-α/β(100 U/ml)로 치료된 세포는 각각 20%, 55% 및 60%의 세포자멸사 세포를 나타내었다.
따라서, IFN은 폴리 IC와 상승적으로 작용하여 세포자멸사를 유도할 수 잇다. 이러한 상승작용은 2개의 징후를 지녔다: 1) 예비-처리하는 경우, SKBr3 세포는 예비처리되지 않은 세포보다 100배 더 낮은 농도에서 세포자멸사를 유도하는 폴리 IC에 대해 민감성이 되고; 2) 폴리 IC에 의한 세포사멸에 대해 유도된 SKBr3 세포의 비율은 제I형 IFN 예비-처리후 22%에서 66%로 증가하였다.
결론적으로 , 제I형 IFN 예비-치료는 TLR3 중재된 폴리 IC 유도된 세포자멸사에 대해 SKBr3 유방 샘암종 세포를 감작화시킨다. 따라서, 낮은 투여량의 제I형 IFN을 사용한 유방암 환자의 예비-치료는 폴리 IC 치료의 효능을 증가시킬 뿐만 아 니라, 기타의 경우에 폴리 IC로부터의 이점을 갖지 않는 환자의 회복도 허용한다. 환자는 수술 전에 또한 낮은 투여량의 제I형 IFN으로 치료함으로써 생검시 면역-조직학에 의해 양성인 것으로 기록되고, TLR3 리간드에 대해 반응성인 것으로 될 종양의 퍼센트를 증가시킬 수 있다. 또한, 낮은 투여량의 제I형 IFN 및 낮은 투여량의 폴리 IC의 조합은 보다 많은 투여량의 폴리 IC 단독보다 더욱 효과적일 수 있다. 이러한 조합은 또한 부작용 위험을 감소시킬 수 있다.
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Claims (22)

  1. a) TLR을 발현하는 암을 지닌 환자를 선택하는 단계, 및
    b) 당해 환자에게 치료학적 유효량의 TLR 리간드를 투여하는 단계를 포함하는, 암의 치료방법.
  2. 제1항에 있어서, 리간드가 효능제 또는 길항제인 방법.
  3. a) TLR을 발현하는 종양세포를 선택하는 단계, 및
    b) 당해 세포를 당해 세포에서 세포자멸사를 유도하기에 효과적인 양의 TLR 리간드와 접촉시키는 단계를 포함하는, 세포자멸사의 유도방법.
  4. 제3항에 있어서, 리간드가 효능제 또는 길항제인 방법.
  5. a) TLR3를 발현하는 암을 지닌 환자를 선택하는 단계, 및
    b) 당해 환자에게 치료학적 유효량의 TLR3 리간드를 투여하는 단계를 포함하는, 암의 치료방법.
  6. 제5항에 있어서, 리간드가 효능제 또는 길항제인 방법.
  7. 제6항에 있어서, 효능제가 폴리 IC인 방법.
  8. 제6항에 있어서, 효능제가 폴리 AU인 방법.
  9. 제6항에 있어서, 길항제가 항체 또는 이의 단편인 방법.
  10. 제5항에 있어서, TLR3를 발현하는 암이 유방암인 방법.
  11. 제5항에 있어서, TLR3를 발현하는 암이 결장암인 방법.
  12. 제5항에 있어서, 환자에게 화학요법제 또는 암 치료제를 투여함을 추가로 포함하는 방법.
  13. 제5항에 있어서, 환자에게 낮은 투여량의 제I형 IFN을 투여한 후 TLR3 리간드를 투여함을 추가로 포함하는 방법.
  14. a) TLR3를 발현하는 종양 세포를 선택하는 단계, 및
    b) 당해 세포를 당해 세포에서 세포자멸사를 유도하는데 효과적인 양의 TLR3 리간드와 접촉시키는 단계를 포함하는, 세포자멸사의 유도방법.
  15. 제14항에 있어서, 리간드가 효능제 또는 길항제인 방법.
  16. 제15항에 있어서, 효능제가 폴리 IC인 방법.
  17. 제15항에 있어서, 효능제가 폴리 AU인 방법.
  18. 제15항에 있어서, 길항제가 항체 또는 이의 단편인 방법.
  19. 제14항에 있어서, TLR3를 발현하는 종양 세포가 유방암 세포인 방법.
  20. 제14항에 있어서, 상기 TLR3를 발현하는 종양 세포가 결장암 세포인 방법.
  21. 제14항에 있어서, 세포를 화학요법제 또는 암 치료제와 접촉시킴을 추가로 포함하는 방법.
  22. 제14항에 있어서, 세포를 낮은 투여량의 제I형 IFN와 접촉시킨 후 TLR3 리간드를 투여함을 추가로 포함하는 방법.
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