KR20190131448A

KR20190131448A - Lrit2 억제제를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물

Info

Publication number: KR20190131448A
Application number: KR1020190057103A
Authority: KR
Inventors: 윤경완; 허윤경; 전부남; 손진영; 김윤연; 이수노; 정주연; 정아름
Original assignee: 주식회사 지놈앤컴퍼니
Priority date: 2018-05-16
Filing date: 2019-05-15
Publication date: 2019-11-26
Also published as: US20210009710A1; TW202003578A; KR102200428B1; JP7099678B2; JP2021517172A; EP3795585A1; WO2019221516A1; TWI763994B; EP3795585A4; CN111971297A; US11787870B2

Abstract

본 발명은 LRIT2 억제제를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 LRIT2 억제제는 면역세포의 활성을 증가시킬 수 있으므로, 면역증강제로 사용될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 LRIT2 억제제는 개체의 면역력을 증강시켜 암을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있다.

Description

LRIT2 억제제를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물{PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR PREVENTING OR TREATING CANCER COMPRISING LRIT2 INHIBITOR AS ACTIVE INGREDIENT}

본 발명은 LRIT2 억제제를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

T 세포는 인체의 면역에 중요한 역할을 하는 세포이다. T 세포는 살해 T 세포, 도움 T 세포, 조절 T 세포, 기억 T 세포로 구분된다. 특히, 살해 T 세포는 CD8이 세포 표면에 발현되며, 도움 T 세포는 CD4가 세포 표면에 발현되며, 조절 T 세포의 경우 CD4와 CD25가 세포 표면에 발현된다.

외부에서 세균과 같은 항원이 들어왔을 때, 도움 T 세포가 사이토카인과 같은 물질을 분비하여 살해 T 세포와 B 세포를 활성화시킨다. 활성화된 살해 T 세포는 병원체에 감염된 세포들을 죽이게 되며, B 세포는 항체를 분비하여 항원의 활성을 저해한다. 최근, 이와 같은 T 세포의 면역조절 능력을 활성화시켜 암과 같은 질환을 치료하려는 시도가 이루어지고 있다.

또한, T 세포 매개성 질병이 다수 면역계 질환들을 대표하는 질병으로 인식되고 있다. 특히 T 세포는 자가면역질환(autoimmune disease)을 발생시키고 영속시키는 것으로 간주되고 있다. 자기(self)항원에 대한 면역 반응은 자가 반응성 T 세포의 지속적인 활성화 또는 정기적인 활성화에 의해 이루어진다. 또한, 자가 반응성 T 세포는 직, 간접적으로 자가면역질환에서 확인되는 특징적인 조직 상해 및 조직 파괴의 원인으로 주목받고 있다.

한편, PD-L1(programmed cell death ligand 1)은 PD-1(programmed cell death-1)에 대한 리간드인 1형 막관통 단백질이다. PD-L1은 T 림프구, B 림프구, 수지상 세포, 또는 대식 세포와 같은 조혈 세포에서 발현된다. PD-1은 T 세포의 이차 신호 활성을 조절하는 면역 체크포인트(immune check point) 인자 또는 면역 조절자로서 알려져 있다. 또한, PD-1은 활성화된 T 세포나 수지상 세포와 같이 세포 표면에서 발현하는 PD-L1 등과 결합을 통해, T 세포의 증식을 억제하고, 사이토카인 발현을 감소시키는 등 T 세포의 기능을 억제하는 작용을 할 수 있다고 보고된 바 있다(Krzysztof M. Zak, et al., 2015).

최근, PD-1 및 PD-L1과 같이, T 세포의 면역 기능을 조절하는 물질을 이용하여 항암제나 면역 조절제를 개발하려는 시도가 이루어지고 있다.

Krzysztof M. Zak, et al., 2015. Structure of the Complex of Human Programmed Death 1, PD-1, and Its Ligand PD-L1. Structure 23. pp. 2341-2348.

이에, 본 발명자들은 면역세포의 활성을 억제하거나 증가시킬 수 있는 물질을 연구하던 중, LRIT2 세포 신호체계가 T 세포의 활성을 조절할 수 있다는 점을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

실시예는 LRIT2 단백질에 결합하는 물질 또는 LRIT2 유전자의 발현을 억제하는 물질을 유효성분으로 포함하는 면역증강제를 제공한다.

또한, 실시예는 LRIT2 단백질에 결합하는 물질 또는 LRIT2 유전자의 발현을 억제하는 물질을 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 LRIT2 억제제는 면역세포의 활성을 증가시킬 수 있으므로, 면역증강제로 사용될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 LRIT2 억제제는 개체의 면역력을 증강시켜 암을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있다.

도 1은 LRIT2가 T 세포를 CD4+ T 세포로의 성숙을 억제한다는 것을 나타낸 것이다.
도 2는 LRIT2가 T 세포를 CD8+ T 세포로의 성숙을 억제한다는 것을 나타낸 것이다.
도 3a 내지 도 3d는 폐암세포주 A549와 PBMC(peripheral blood mononuclear cell)를 LRIT2 억제제(항체 또는 siRNA)로 처리하였을 때 그룹별 PBMC의 세포독성(%)을 나타낸 것이다.
도 4a 내지 도 4d는 결장암세포주 HCT-116과 PBMC를 LRIT2 억제제(항체 또는 siRNA)로 처리하였을 때 그룹별 PBMC의 세포독성(%)을 나타낸 것이다.
도 5a 내지 도 5d는 유방암세포주 MDA-MB-231과 PBMC를 LRIT2 억제제(항체 또는 siRNA)로 처리하였을 때 그룹별 PBMC의 세포독성(%)을 나타낸 것이다.
도 6a 내지 도 6d는 위암세포주 MKN-74와 PBMC를 LRIT2 억제제(항체 또는 siRNA)로 처리하였을 때 그룹별 PBMC의 세포독성(%)을 나타낸 것이다.
도 7a 내지 도 7d는 혈액암세포주 U937과 PBMC를 LRIT2 억제제(항체 또는 siRNA)로 처리하였을 때 그룹별 PBMC의 세포독성(%)을 나타낸 것이다.
도 8a 내지 도 8d는 LRIT2 억제제(3가지 타입의 siRNA)로 처리한 마우스에서 종양 크기의 변화를 그룹별로 나타낸 것이다.

실시예는 LRIT2(leucine-rich repeat, immunoglobulin-like domain and transmembrane domain-containing protein 2) 단백질에 결합하는 물질 또는 LRIT2 유전자의 발현을 억제하는 물질을 유효성분으로 포함하는 면역증강제를 제공한다.

본 명세서에서 사용된 용어, "LRIT2"는 "leucine-rich repeat, immunoglobulin-like domain and transmembrane domain-containing protein 2"의 약자로서, 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질일 수 있다. 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드는 서열번호 2의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩될 수 있다.

본 발명에서, LRIT2 단백질에 결합하는 물질은 LRIT2 단백질에 특이적으로 결합하는 화합물, 앱타머(aptamer), 펩타이드 또는 항체 또는 이의 단편일 수 있다. 상기 항체 또는 이의 단편은 모노클로날 항체, scFv, Fab, Fab' 및 F(ab)'으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.

본 발명에서, LRIT2 유전자의 발현을 억제하는 물질은 LRIT2 유전자의 DNA 또는 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 핵산, siRNA, shRNA, miRNA 또는 리보자임일 수 있다. 상기 LRIT2 siRNA는 서열번호 3 내지 14의 염기서열 중 어느 하나일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는, LRIT2를 타겟하여 활성을 억제하는 항-LRIT2 항체 또는 LRIT2 siRNA가 PBMC(peripheral blood mononuclear cell)의 암세포에 대한 세포독성을 증가시킬 수 있는지 여부를 확인하였다. 그 결과, LRIT2 억제제를 처리한 PBMC 및 암세포주의 혼합물에서 암세포주에 대한 PBMC의 세포독성이 대조군에 비해 높게 나타났다. 또한, 본 발명의 다른 실시예에서는, LRIT2의 활성을 억제하는 LRIT2 siRNA가 마우스 종양의 성장을 억제시키는지를 확인하였다. 그 결과, LRIT2 siRNA가 처리되어 LRIT2가 넉다운된 마우스의 종양은 대조군에 비해 성장속도가 현저하게 억제되었다. 상기 결과를 통해, LRIT2를 타겟하여 활성을 억제하는 항-LRIT2 항체 또는 LRIT2 siRNA는 LRIT2를 블로킹 또는 넉다운시켜 그 활성 또는 발현을 억제함으로써 암의 발달을 지연 또는 중지시키는 것을 알 수 있다.

상기 LRIT2 단백질에 결합하는 물질 또는 LRIT2 유전자의 발현을 억제하는 물질은 전술한 바와 같다. 상기 약학 조성물은 약학적으로 허용가능한 첨가제를 포함할 수 있다.

본 발명에서, 암은 방광암, 골암, 혈액암, 유방암, 흑색종양, 갑상선암, 부갑상선암, 골수암, 직장암, 인후암, 후두암, 폐암, 식도암, 췌장암, 대장암, 위암, 설암, 피부암, 뇌종양, 자궁암, 두부 또는 경부암, 담낭암, 구강암, 결장암, 항문 부근암, 중추신경계 종양, 간암 및 대장암으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 LRIT2 단백질에 결합하는 물질 또는 LRIT2 유전자의 발현을 억제하는 물질을 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태, 체중, 성별, 연령, 환자의 중증도, 투여 경로에 따라 1일 0.01 ug/kg ~ 10 g/kg 범위, 바람직하게는 0.01 mg/kg ~ 1 g/kg 범위일 수 있다. 투여는 1일 1회 또는 수회로 나누어 이루어질 수 있다.

또한, 실시예는 LRIT2 단백질에 결합하는 물질 또는 LRIT2 유전자의 발현을 억제하는 물질을 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암을 치료하는 방법을 제공한다.

상기 투여 경로는 정맥내, 근육내, 피내, 피하, 복강내, 소동맥내, 심실내, 병변내, 척추강내, 국소 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

이하, 본 발명을 하기 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.

제조예 1. 버퍼 제조

실시예에서 사용되는 버퍼를 다음과 같이 제조하였다:

1X PBS(Thermo Fisher gibco #10010)는 155 mM의 염화나트륨, 2.96 mM의 인산나트륨 용액, 및 1.05 mM의 pH 7.4 인산칼륨 용액을 혼합하여 제조하였다.

FACS 버퍼는 1X PBS(Thermo Fisher gibco #10010), 10 ml의 2% FBS(Thermo fisher gibco #16000-044), 및 1 mM의 1 ml EDTA(Fisher 15575020)를 혼합하여 제조하였다.

1X RBC lysis 버퍼는 10X RBC solution(Biolegend #420301)을 3차 증류수에 1/10으로 희석하여 제조하였다.

10% FBS RPMI1640은 RPMI medium(Cellgrow #10-040-CVR), 50 ml의 10% FBS(Thermo fisher gibco #16000-044), 5 ml의 1% antibiotics(Thermo fisher gibco #15140-122), 및 0.5 ml의 2-mercaptoethanol(Thermo fisher gibco #21985-023)을 혼합하여 제조하였다.

MACS 버퍼는 1X PBS(Thermo Fisher gibco #10010), 0.5% BSA(bovine serum albumin)(Milipore #82-100-6), 2 mM의 2 ml EDTA(Fisher 15575020)를 혼합하여 제조하였다.

실시예 1. LRIT2 단백질의 T세포 증식 및 활성 억제 효과 확인

본 실시예에서는 LRIT2 단백질이 T 세포의 증식 및 활성을 저해하여 암세포로 하여금 T 세포 매개 면역시스템을 회피하도록 하는지 여부를 확인하고자 하였다.

실시예 1.1. CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포 준비

인간 혈액을 채취하여 EDTA(또는 헤파린)로 코팅된 10 mL 튜브에 넣고 1:1의 비율로 PBS와 혼합하였다. 그리고 나서, 50 mL 튜브에 Ficoll-Paque PLUS를 넣고, 상기 혈액 시료를 첨가하였다. 원심분리한 후, 인간 PBMC를 수거하였다. 수거된 결과물을 원심분리하고 상층액을 제거하였다. 이어서, RBC lysis(1x) 버퍼를 첨가하고, 파이펫팅한 후 아이스에서 3분 동안 보관하였다. 이어서, 10% FBS RPMI1640 50 ml를 첨가하고, 혼합물을 원심분리하여 상층액을 제거하였다. 그리고 나서, FACS 버퍼를 첨가하고 상층액을 원심분리에 의해 제거하였다. 그 후, 50 ml의 MACS 버퍼(0.5% BSA 및 2mM EDTA 포함 PBS)를 첨가하고, 세포 수를 카운팅하고 원심분리에 의해 상층액을 제거하였다.

CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포를 1 x 10⁷ 세포 수 기준 40 μl MACS 버퍼를 이용하여 재현탁시키고, 항 CD4 및 항 CD8 바이오틴 항체를 튜브에 각각 10 μl 넣은 후 5분 동안 냉장고에 보관하였다. 그 후, 1 x 10⁷ 세포 수 기준 MACS 버퍼 30 μl를 상기 생성물에 첨가하고, 항-바이오틴 마이크로비드 20 μl를 첨가하여 혼합하였다. 이어서, LS 컬럼을 이용하여 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포를 분리하고 세포 수를 카운팅하였다.

준비된 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포를 2 x 10⁶ 세포 수 기준 CFSE(Carboxyfluorescein succinimidyl ester) 1 μl와 혼합하고, 37℃에서 3분 동안 보관하였다. 그리고 나서, CD4+ T 세포와 CD8+ T 세포를 각각 함유하고 있는 튜브에 FBS를 첨가하고, 10분 동안 아이스에서 보관하였다. 그 후, 원심분리에 의해 상층액을 제거하였다. 생성물에 FACS 버퍼 30 ml를 첨가한 후 파이펫팅하고, 원심분리하여 상층액을 제거하였다. 그리고 나서, 10% FBS RPMI1640을 첨가한 후 파이펫팅하고, 원심분리하여 상층액을 제거하였다. 그 후, 생성물을 10% FBS RPMI1640 10 ml와 혼합한 후, 세포 수를 카운팅하였다.

실시예 1.2. LRIT2 단백질에 의한 T세포의 활성 저해 확인

재조합 인간 IgG1 단백질(Cat. No. 110-HG) 및 재조합 인간 PD-L1/B7-H1 단백질(Cat. No. 156-B7)을 R&D systems에서 구입하였다. 또한, 재조합 인간 LRIT2 단백질(Cat. No.8388-LR-050)을 Sino Biological에서 구입하였다.

상기 각 단백질 10 μg/ml를 anti-CD3 항체(BioLegend, Cat. No. 317325) 2 μg/ml, 3 μg/ml, 4 μg/ml 및 6 μg/ml와 각각 혼합하였다. 생성된 혼합물로 96-웰 플레이트를 4℃에서 코팅하고 PBS로 3회 세척하였다. 상기 실시예 1.1에서 준비한 CD4+ T 세포와 CD8+ T 세포를 96-웰 플레이트의 웰마다 200 μl씩 2 x 10⁶개 첨가하고 인큐베이션하였다. anti-CD3 항체를 이용하여 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포를 72시간 동안 활성화시켰다. 이때, CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포의 증식은 CFSE 염색의 정도로 확인할 수 있었고, 이는 FACSDiVa 소프트웨어(BD Biosciences)를 이용하여 플로우 사이토메트리에 의해 분석하였다. 그 결과를 도 1 및 도 2에 나타내었다.

도 1 및 도 2는 플로우 사이토메트리로 측정한 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포의 증식율(%)을 각각 막대그래프로 표현한 것이다. 도 1 및 도 2에서 나타난 바와 같이, PD-L1로 처리한 대조군은 IgG1로 처리한 대조군에 비해 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포의 증식이 모두 억제되었다.

또한, LRIT2로 처리한 군은 IgG1로 처리한 대조군에 비해 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포의 증식이 현저하게 억제되었으며, PD-L1로 처리한 대조군과 대비하여 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포의 증식 억제 수준이 유사하였다. 이를 통해, LRIT2를 블로킹하거나 넉다운시켜 중화시키면, LRIT2의 T 세포 증식 억제능을 저하시킴으로써 효율적인 암 치료가 가능해짐을 알 수 있다.

실시예 2. PBMC 세포독성 어세이

본 실시예에서는 LRIT2를 LRIT2 억제제를 이용하여 중화시켰을 때, PBMC의 암세포에 대한 세포독성(살상능)을 증가시킬 수 있는지 여부를 확인하고자 하였다.

실시예 2.1. PBMC 준비

인간 혈액을 채취하여 EDTA(또는 헤파린)로 코팅된 10 mL 튜브에 넣고 1:1의 비율로 PBS와 혼합하였다. 그리고 나서, 50 mL 튜브에 Ficoll-Paque PLUS를 넣고, 상기 혈액 시료를 첨가하였다. 원심분리한 후, 인간 PBMC를 수거하였다.

96-웰 플레이트를 4℃에서 anti-CD3 항체(BioLegend, Cat. No. 317325) 1.0 μg/ml로 코팅하였다. 96-웰 플레이트의 웰은 PBMC를 첨가하기 전에 PBS로 3회 세척하였다. 앞서 수득한 PBMC를 10% FBS RPMI1640과 혼합하고, 96-웰 플레이트의 각 웰마다 6 x 10⁵ 개를 100 μl씩 첨가하였다. PBMC는 72시간 동안 anti-CD3 항체에 의해 활성화시켰다.

실시예 2.2. 암세포 준비

폐암세포주 A549(ATCC®CCL-185), 결장암세포주 HCT-116(ATCC®CCL-247), 유방암세포주 MDA-MB-231(ATCC®HTB-26), 위암세포주 MKN-74(KCLB No.80104), 및 백혈병세포주 U937(ATCC®CRL-1593.2)을 각각 5 μM의 CFSE와 혼합하고, 37℃에서 5분 동안 보관하였다. 그 후, 각각의 세포주를 함유한 튜브에 FBS를 첨가하고, 10분 동안 아이스에서 보관하였다. 이어서, 상층액을 원심분리에 의해 제거하였다. 이에 따라 수득된 생성물에 FACS 버퍼 30 ml를 첨가한 후 파이펫팅하고, 원심분리하여 상층액을 제거하였다. 그리고 나서, 10% FBS RPMI1640을 첨가한 후 파이펫팅하고, 원심분리하여 상층액을 제거하였다. 이에 따라 수득된 생성물을 10% FBS RPMI1640 10 ml와 혼합한 후, 세포 수를 카운팅하였다.

상기 암세포를 상기 실시예 2.1에서 준비한 96-웰 플레이트의 PBMC 함유 웰마다 3 x 10⁴개/100 μl 첨가하고 인큐베이션하였다.

실시예 2.3. 암세포주에 대한 PBMC의 세포독성 측정

상기 96-웰 플레이트의 각 웰에 10 μg/mL의 anti-human LRIT2 항체 또는 50 nM의 LRIT2 siRNA를 첨가하고 24시간 동안 인큐베이션하였다. LRIT2를 블로킹하기 위해 4종의 중화 항체를 사용한 실험군과 무처리 대조군은 하기 표 1에 나타내었으며, LRIT2를 넉다운하기 위해 3종의 siRNA를 사용한 실험군과 무처리 대조군은 하기 표 2에 나타내었다.

	인간 LRIT2 중화 항체
Control group	무처리
Group 1	anti-human LRIT2 항체(Biobyt사, orb185006)
Group 2	anti-human LRIT2 항체(Thermo사, PA5-58105)
Group 3	anti-human LRIT2 항체(Atlas사, HPA037788)
Group 4	anti-human LRIT2 항체(Novusbio사, NBP1-90876)

	인간 LRIT2 siRNA
Control group	무처리
Group 5	Sense (5’-GA GCU UAG UGC UUG CAU GA-3’) (서열번호 3) Antisense (5’-UC AUG CAA GCA CUA AGC UC-3’) (서열번호 4)
Group 6	Sense (5’-CU ACA UUG CAU CGG AUG AA-3’) (서열번호 5) Antisense (5’-UU CAU CCG AUG CAA UGU AG-3’) (서열번호 6)
Group 7	Sense (5’-UG UGU UGA CAU CUU CUA CU-3’) (서열번호 7) Antisense (5’-AG UAG AAG AUG UCA ACA CA-3’) (서열번호 8)

PBMC 및 암세포주의 혼합물과 항체 또는 siRNA를 함께 인큐베이션하고, 24시간 후에 용균된 세포를 확인하기 위하여 7-아미노액티노마이신 D(7-AAD; BD Pharmingen, San Diego, CA, USA)로 세포를 염색하였다. FACSDiVa 소프트웨어(BD Biosciences)를 이용하여 CFSE 및 7-AAD에 대한 염색을 측정함으로써 암 세포주에 대한 PBMC의 암세포 용해능을 확인하였다. 그 결과를 도 3a 내지 도 7d에 나타내었다.구체적으로, 폐암세포주 A549에 대해 LRIT2 중화 항체 또는 siRNA로 처리하였을 때의 실험결과를 도 3a 내지 도 3d에 나타내었다. 결장암세포주 HCT-116에 대해 LRIT2 중화 항체 또는 siRNA로 처리하였을 때의 실험결과를 도 4a 내지 도 4d에 나타내었다. 유방암세포주 MDA-MB-231에 대해 LRIT2 중화 항체 또는 siRNA로 처리하였을 때의 실험결과를 도 5a 내지 도 5d에 나타내었다. 위암세포주 MKN-74에 대해 LRIT2 중화 항체 또는 siRNA로 처리하였을 때의 실험결과를 도 6a 내지 도 6d에 나타내었다. 백혈병세포주 U937에 대해 LRIT2 중화 항체 또는 siRNA로 처리하였을 때의 실험결과를 도 7a 내지 도 7d에 나타내었다.

도 3a 내지 도 3d에 나타난 바와 같이, 폐암세포주 A549와 PBMC를 LRIT2 중화 항체로 처리하였을 때, 항체의 종류에 따라 정도의 차이는 있으나 무처리 대조군에 비해 폐암세포 살상능이 유의적으로 증가하였다. 또한, 폐암세포주를 LRIT2 siRNA로 처리한 경우에도 폐암세포 살상능이 유의적으로 증가하였다.

상기 폐암세포주에 대한 PBMC의 살상능이 증가하는 결과와 마찬가지로, LRIT2 중화 항체 또는 siRNA를 이용하여 LRIT2를 중화시켰을 때, 결장암세포주, 유방암세포주, 위암세포주 및 백혈병세포주에서도 PBMC의 살상능이 증가함을 확인하였다(도 4a 내지 도 7d).

실시예 3. 종양 마우스 모델 실험

본 실시예에서는 LRIT2를 LRIT2 억제제를 이용하여 중화시켰을 때 마우스 종양의 성장이 억제되는지 여부를 in vivo 에서 확인하고자 하였다.

C57BL/6 결장 선암종 세포에서 유래된 MC38 세포주를 50 μl PBS 중에 2.0 x 10⁵ 세포수 농도로 재현탁시키고, 6주령 암컷 C57BL/6 마우스의 옆구리에 피하 주사하였다. LRIT2를 넉다운시키기 위해 siRNA를 사용한 실험군과 무처리 대조군을 하기 표 3에 나타내었다.

	마우스 LRIT2 siRNA
대조군	무처리
Group 8	Sense (5’-CU CUU CAG UUC CUA ACC AA-3’) (서열번호 9) Antisense (5’-UU GGU UAG GAA CUG AAG AG-3’) (서열번호 10)
Group 9	Sense (5’-GU CAC UAU CCA GGU AGG AA-3’) (서열번호 11) Antisense (5’-UU CCU ACC UGG AUA GUG AC-3’) (서열번호 12)
Group 10	Sense (5’-CA GAC AAC UUU CCC GAA GA-3’) (서열번호 13) Antisense (5’-UC UUC GGG AAA GUU GUC UG-3’) (서열번호 14)

모든 실험군은 MC38 세포주를 주사한지 11일째 되는 날부터 마우스 LRIT2를 타겟하는 각각의 siRNA를 5일 간격으로 총 3회 마우스의 종양에 주사하였다. 구체적으로, siRNA 10 μg을 PBS 중 올리고펙타민(Invitrogen사) 7.5 μl 와 제조사 지시에 따라 혼합한 후, 마우스에 유도한 종양 조직에 직접 0.5 mg/kg의 투여량으로 주사하였다. 무처리 대조군과 LRIT2가 넉다운된 실험군에서 마우스의 종양 크기를 측정한 결과를 도 8a 내지 도 8d에 나타내었다.도 8a 내지 도 8d에 나타난 바와 같이, 무처리 대조군은 마우스에서 종양이 생성된 이후 지속적으로 성장하는 것을 확인할 수 있었다. 반면, LRIT2가 넉다운된 마우스의 종양은 무처리 대조군에 비해 그 성장속도가 현저하게 억제됨을 알 수 있었다. 이는 LRIT2를 블로킹 또는 넉다운시켜 그 활성 또는 발현을 억제할 경우 암의 발달이 지연 또는 중지되고 암의 발생이 억제됨을 보여 준다. 따라서, LRIT2 억제제는 암의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

<110> genomeandcompany <120> PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR PREVENTING OR TREATING CANCER COMPRISING LRIT2 INHIBITOR AS ACTIVE INGREDIENT <130> FPD/201903-0030 <150> KR 10-2018-0055909 <151> 2018-05-16 <160> 14 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 550 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LRIT2 <400> 1 Met Ala Ser Val Phe His Tyr Phe Leu Leu Val Leu Val Phe Leu Asp 1 5 10 15 Thr His Ala Ala Gln Pro Phe Cys Leu Pro Gly Cys Thr Cys Ser Glu 20 25 30 Glu Ser Phe Gly Arg Thr Leu Gln Cys Thr Ser Val Ser Leu Gly Lys 35 40 45 Ile Pro Gly Asn Leu Ser Glu Glu Phe Lys Gln Val Arg Ile Glu Asn 50 55 60 Ser Pro Leu Phe Glu Met Pro Gln Gly Ser Phe Ile Asn Met Ser Thr 65 70 75 80 Leu Glu Tyr Leu Trp Leu Asn Phe Asn Asn Ile Ser Val Ile His Leu 85 90 95 Gly Ala Leu Glu His Leu Pro Glu Leu Arg Glu Leu Arg Leu Glu Gly 100 105 110 Asn Lys Leu Cys Ser Val Pro Trp Thr Ala Phe Arg Ala Thr Pro Leu 115 120 125 Leu Arg Val Leu Asp Leu Lys Arg Asn Lys Ile Asp Ala Leu Pro Glu 130 135 140 Leu Ala Leu Gln Phe Leu Val Ser Leu Thr Tyr Leu Asp Leu Ser Ser 145 150 155 160 Asn Arg Leu Thr Val Val Ser Lys Ser Val Phe Leu Asn Trp Pro Ala 165 170 175 Tyr Gln Lys Cys Arg Gln Pro Asp Cys Gly Ala Glu Ile Leu Ser Ser 180 185 190 Leu Val Val Ala Leu His Asp Asn Pro Trp Val Cys Asp Cys Arg Leu 195 200 205 Arg Gly Leu Val Gln Phe Val Lys Ser Ile Thr Leu Pro Val Ile Leu 210 215 220 Val Asn Ser Tyr Leu Ile Cys Gln Gly Pro Leu Ser Lys Ala Gly Gln 225 230 235 240 Leu Phe His Glu Thr Glu Leu Ser Ala Cys Met Lys Pro Gln Ile Ser 245 250 255 Thr Pro Ser Ala Asn Ile Thr Ile Arg Ala Gly Gln Asn Val Thr Leu 260 265 270 Arg Cys Leu Ala Gln Ala Ser Pro Ser Pro Ser Ile Ala Trp Thr Tyr 275 280 285 Pro Leu Ser Met Trp Arg Glu Phe Asp Val Leu Thr Ser Ser Thr Gly 290 295 300 Glu Asp Thr Ala Leu Ser Glu Leu Ala Ile Pro Ala Ala His Leu Val 305 310 315 320 Asp Ser Gly Asn Tyr Thr Cys Met Ala Ser Asn Ser Ile Gly Lys Ser 325 330 335 Asn Leu Val Ile Ser Leu His Val Gln Pro Ala Gln Ala Leu His Ala 340 345 350 Pro Asp Ser Leu Ser Ile Pro Ser Glu Gly Asn Ala Tyr Ile Asp Leu 355 360 365 Arg Val Val Lys Gln Thr Val His Gly Ile Leu Leu Glu Trp Leu Ala 370 375 380 Val Ala Asp Thr Ser Lys Glu Glu Trp Phe Thr Leu Tyr Ile Ala Ser 385 390 395 400 Asp Glu Ala Phe Arg Lys Glu Val Val His Ile Gly Pro Gly Ile Asn 405 410 415 Thr Tyr Ala Val Asp Asp Leu Leu Pro Gly Thr Lys Tyr Glu Ala Cys 420 425 430 Leu Ser Leu Glu Gly Gln Pro Pro His Gln Gly Gln Cys Val Ala Phe 435 440 445 Val Thr Gly Arg Asp Ala Gly Gly Leu Glu Ala Arg Glu His Leu Leu 450 455 460 His Val Thr Val Val Leu Cys Val Val Leu Leu Ala Val Pro Val Gly 465 470 475 480 Ala Tyr Ala Trp Ala Ala Gln Gly Pro Cys Ser Cys Ser Lys Trp Val 485 490 495 Leu Arg Gly Cys Leu His Arg Arg Lys Ala Pro Ser Cys Thr Pro Ala 500 505 510 Ala Pro Gln Ser Lys Asp Gly Ser Phe Arg Glu His Pro Ala Val Cys 515 520 525 Asp Asp Gly Glu Gly His Ile Asp Thr Glu Gly Asp Lys Glu Lys Gly 530 535 540 Gly Thr Glu Asp Asn Ser 545 550 <210> 2 <211> 1653 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LRIT2 <400> 2 atggcttcag tttttcatta cttcctgtta gttctggtct ttctggatac acacgcagct 60 cagcctttct gtctgccagg atgcacttgc tcagaggaga gttttggcag gactctgcag 120 tgcacatctg tctccttggg aaagatccct gggaaccttt ctgaagagtt caagcaagtg 180 agaattgaaa attcaccctt atttgagatg ccccaagggt ctttcatcaa catgagcacc 240 ttggaatacc tctggctcaa ttttaacaat atcagtgtga tccacctagg agccctggaa 300 cacctgccag aactgaggga gctgagactg gaggggaaca agctctgctc agtaccatgg 360 acagcgttcc gtgccacccc tctcctgagg gtcttggatc tcaaacgcaa caagattgat 420 gcactccctg agctggctct tcaattcttg gtcagcctga cctaccttga cctatcctcc 480 aataggctta cagttgtatc caagagtgtc ttcctgaact ggccagccta ccagaaatgc 540 cggcagcctg actgtggggc tgagattctc tccagcctgg tggtggccct gcatgacaac 600 ccctgggtat gtgactgtcg cctaaggggg cttgtccagt ttgtcaagtc cattaccctc 660 ccagtcatcc tggtgaattc ctacctgata tgtcagggcc ctctgtccaa ggcagggcag 720 ctttttcatg aaactgagct tagtgcttgc atgaagccac agatctcaac ccccagtgcc 780 aatatcacca tccgggcagg acagaatgtg accctgcgat gcttggcaca ggccagcccc 840 tcaccatcca ttgcatggac ttatcccctg agtatgtgga gagaatttga tgtgttgaca 900 tcttctactg gagaagacac tgctctgtca gagctggcca tacctgctgc ccacctggta 960 gacagtggta attacacctg catggcctcc aactccattg gcaagagcaa ccttgtaatc 1020 tctctccatg tccagcctgc ccaggcccta catgcacctg attctctttc catcccctcg 1080 gagggcaatg cctacattga cctgcgggtt gtcaagcaga cagtgcatgg gattttgctg 1140 gagtggcttg cagtggctga cacctctaag gaggagtggt tcaccctcta cattgcatcg 1200 gatgaagcct tcaggaagga ggtggttcac attggccccg gaatcaatac ttatgctgtg 1260 gatgacctcc ttcctggcac aaaatatgag gcctgcctca gcctagaggg ccagcctcca 1320 caccagggcc agtgtgtagc ttttgtaaca ggcagagatg ctggtgggct agaggcacgt 1380 gagcacctcc tgcatgtcac agtggtcctg tgtgtggtgc tgcttgcagt gcctgtgggc 1440 gcctatgcct gggcagccca gggcccctgc agctgcagca agtgggtcct gcgcggctgt 1500 cttcatcgca ggaaagcccc cagctgcacc cctgcagccc cgcagtccaa ggatggctcc 1560 tttagagaac atccagctgt ctgtgatgac ggtgaagggc acatagacac tgagggggac 1620 aaggagaaag gaggaacgga agacaacagc tga 1653 <210> 3 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> human LRIT2 siRNA-sense(Group 5) <400> 3 gagcuuagug cuugcauga 19 <210> 4 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> human LRIT2 siRNA-antisense(Group 5) <400> 4 ucaugcaagc acuaagcuc 19 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> human LRIT2 siRNA-sense(Group 6) <400> 5 cuacauugca ucggaugaa 19 <210> 6 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> human LRIT2 siRNA-antisense(Group 6) <400> 6 uucauccgau gcaauguag 19 <210> 7 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> human LRIT2 siRNA-sense(Group 7) <400> 7 uguguugaca ucuucuacu 19 <210> 8 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> human LRIT2 siRNA-antisense(Group 7) <400> 8 aguagaagau gucaacaca 19 <210> 9 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse LRIT2 siRNA-sense(Group 8) <400> 9 cucuucaguu ccuaaccaa 19 <210> 10 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse LRIT2 siRNA-antisense(Group 8) <400> 10 uugguuagga acugaagag 19 <210> 11 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse LRIT2 siRNA-sense(Group 9) <400> 11 gucacuaucc agguaggaa 19 <210> 12 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse LRIT2 siRNA-antisense(Group 9) <400> 12 uuccuaccug gauagugac 19 <210> 13 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse LRIT2 siRNA-sense(Group 10) <400> 13 cagacaacuu ucccgaaga 19 <210> 14 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse LRIT2 siRNA-antisense(Group 10) <400> 14 ucuucgggaa aguugucug 19

Claims

LRIT2(leucine-rich repeat, immunoglobulin-like domain and transmembrane domain-containing protein 2) 단백질에 결합하는 물질 또는 LRIT2 유전자의 발현을 억제하는 물질을 유효성분으로 포함하는, 면역증강제.
제1항에 있어서,
상기 LRIT2 단백질에 결합하는 물질은 LRIT2 단백질에 특이적으로 결합하는 화합물, 앱타머(aptamer), 펩타이드 또는 항체 또는 이의 단편인 것인, 면역증강제.
제2항에 있어서,
상기 LRIT2 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 것인, 면역증강제.
제2항에 있어서,
상기 항체 또는 이의 단편이 모노클로날 항체, scFv, Fab, Fab' 및 F(ab)'으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 것인, 면역증강제.
제1항에 있어서,
상기 LRIT2 유전자의 발현을 억제하는 물질은 LRIT2 유전자의 DNA 또는 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 핵산, siRNA, shRNA, miRNA 또는 리보자임인 것인, 면역증강제.
제5항에 있어서,
상기 LRIT2 유전자의 DNA가 서열번호 2의 염기 서열을 갖는 것인, 면역증강제.
제5항에 있어서,
상기 siRNA는 서열번호 3 내지 14의 염기서열 중 어느 하나인 것인, 면역증강제.
LRIT2 단백질에 결합하는 물질 또는 LRIT2 유전자의 발현을 억제하는 물질을 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제8항에 있어서,
상기 LRIT2 단백질에 결합하는 물질은 LRIT2 단백질에 특이적으로 결합하는 화합물, 앱타머(aptamer), 펩타이드 또는 항체 또는 이의 단편인 것인, 암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제9항에 있어서,
상기 LRIT2 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 것인, 암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제9항에 있어서,
상기 항체 또는 이의 단편이 모노클로날 항체, scFv, Fab, Fab' 및 F(ab)'으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 것인, 암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제8항에 있어서,
상기 LRIT2 유전자의 발현을 억제하는 물질은 LRIT2 유전자의 DNA 또는 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 핵산, siRNA, shRNA, miRNA 또는 리보자임인 것인, 암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제12항에 있어서,
상기 LRIT2 유전자의 DNA가 서열번호 2의 염기 서열을 갖는 것인, 암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제12항에 있어서,
상기 siRNA는 서열번호 3 내지 14의 염기서열 중 어느 하나인 것인, 암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제8항에 있어서,
상기 암은 방광암, 골암, 혈액암, 유방암, 흑색종양, 갑상선암, 부갑상선암, 골수암, 직장암, 인후암, 후두암, 폐암, 식도암, 췌장암, 대장암, 위암, 설암, 피부암, 뇌종양, 자궁암, 두부 또는 경부암, 담낭암, 구강암, 결장암, 항문 부근암, 중추신경계 종양, 간암 및 대장암으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것인, 암 예방 또는 치료용 약학 조성물.