TWI763994B - 包含lrit2抑制劑作為活性成分之用於預防或治療癌症的藥學組成物 - Google Patents

包含lrit2抑制劑作為活性成分之用於預防或治療癌症的藥學組成物

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Abstract

本發明有關一種用於預防或治療癌症的藥學組成物，其包含LRIT2抑制劑作為活性成分。根據本發明之LRIT2抑制劑可增加免疫細胞的活性，因此可用作免疫增強劑。此外，根據本發明之LRIT2抑制劑可增強個體的免疫力，因此可用於有效地預防或治療癌症。

Description

包含LRIT2抑制劑作為活性成分之用於預防或治療癌症的藥學組成物
發明領域 本發明有關一種用於預防或治療癌症的藥學組成物，其包含LRIT2抑制劑作為活性成分。
發明背景 T細胞在人體的免疫力方面扮演重要角色。T細胞分成殺手T細胞、輔助T細胞、調節T細胞及記憶T細胞。特別是，殺手T細胞會在細胞表面上表達CD8；輔助T細胞會在細胞表面上表達CD4，而調節T細胞會在細胞表面上表達CD4及CD25。
當如細菌之抗原從體外進入時，輔助T細胞會分泌如細胞激素的物質活化殺手T細胞及B細胞。被活化的殺手T細胞會殺死病原感染的細胞，而活化的B細胞會分泌抗體，抑制抗原的活化。近年來，已嘗試藉由活化T細胞此一免疫調節能力來治療如癌症之疾病。
此外，T細胞介導的疾病被認為是代表各種免疫系統疾病之疾病。特別是，T細胞被視為是引起及延續自體免疫疾病之原因。對自身抗原的免疫反應是因連續或周期的活化自體反應性T細胞所引起。此外，自體反應性T細胞因會引起在自體免疫疾病中直接或間接確定之特有的組織損傷及組織破壞而受到關注。
同時，細胞程式死亡配體1 (PD-L1)是一種第1型穿膜蛋白，其是細胞程式死亡-1 (PD-1)之配體。PD-L1在如T淋巴細胞、B淋巴細胞、樹狀細胞或巨噬細胞之造血細胞中表達。PD-1被稱作免疫查核點因子或免疫調節劑，其會調節T細胞之次級信號活化。此外，據報導PD-1具有抑制T細胞功能之作用，如通過與如活化的T細胞或樹狀細胞之細胞表面上表達的PD-L1或相似物結合，抑制T細胞的增生及減少細胞激素的表達(Krzysztof M. Zak, et al., 2015)。
近來，已嘗試使用會調節T細胞之免疫功能的物質如PD-1及PD-L1，開發抗癌劑及免疫調節劑。
技術問題 據此，在研發能夠抑制或增加免疫細胞之活性的物質的過程中，本發明人已鑑定出LRIT2細胞信號系統可調節T細胞之活性，因此完成了本發明。解決問題之方法
在一實施例中，提供一種免疫增強劑，其包含一種會與LRIT2蛋白結合的物質或一種會抑制LRIT2基因表達的物質，作為活性成分。
此外，在一實施例中，提供一種用於預防或治療癌症之藥學組成物，其包含一種會與LRIT2蛋白結合的物質或一種會抑制LRIT2基因表達的物質，作為活性成分。
此外，在一實施例中，提供一種用於治療癌症之方法，其包含對一個體投與該藥學組成物之步驟。本發明之優勢效應
根據本發明之LRIT2抑制劑可增加免疫細胞之活性，因此可用作為免疫增強劑。此外，根據本發明之LRIT2抑制劑可增強個體之免疫力，因此可用於有效地預防或治療癌症。
進行本發明之最佳模式 在一實施例中，提供一種免疫增強劑，其包含一種會與富白胺酸重複、免疫球蛋白樣域及含穿膜域蛋白2 (leucine-rich repeat, immunoglobulin-like domain and transmembrane domain-containing protein 2，LRIT2)蛋白結合的物質或一種會抑制LRIT2基因表達的物質，作為活性成分。
本文所使用之術語"LRIT2"是"富白胺酸重複、免疫球蛋白樣域及含穿膜域蛋白2"之縮寫，可為具有序列辨識編號1之胺基酸序列之蛋白。該具有序列辨識編號1之胺基酸序列之蛋白，可由具有序列辨識編號2之核苷酸序列之多核苷酸編碼。
在本發明中，該會與LRIT2蛋白結合的物質，可為會與LRIT2蛋白專一性結合之化合物、適配體、胜肽或抗體或其片段。該抗體或其片段可為選自由下列所構成之群組中之任一者：單株抗體scFv、Fab、Fab'及F(ab)'。
在本發明中，該會抑制LRIT2基因表達的物質，可為會與LRIT2基因之DNA或mRNA互補結合之反義核酸、siRNA、shRNA、miRNA或核酶(ribozyme)。該LRIT2 siRNA可為序列辨識編號3至14之核苷酸序列中之任一者。
在本發明之一實施例中，目的是鑑定靶向LRIT2及抑制其活性之抗LRIT2抗體或LRIT2 siRNA，是否可增加周邊血液單核細胞(PBMCs)對癌細胞之細胞毒性。結果，用LRIT2抑制劑處理PBMCs與癌細胞株之混合物，在PBMCs對癌細胞株之細胞毒性方面，表現出比對照組高的位準。此外，在本發明之另一實施例中，目的是鑑定會抑制LRIT2活性之LRIT2 siRNA，是否會抑制小鼠中腫瘤之生長。結果，相較於對照組，在通過LRIT2 siRNA處理而使LRIT2敲減(knock down)之小鼠中，表現出腫瘤之生長率顯著地受到抑制。從以上結果可看出，靶向LRIT2且抑制其活性之LRIT2抗體或LRIT2 siRNA，會阻斷或敲減LRIT2且抑制其活性或表達，從而延緩或停止癌症之進展。
此外，在一實施例中，提供一種用於預防或治療癌症之藥學組成物，其包含一種會與LRIT2蛋白結合的物質或一種會抑制LRIT2基因表達的物質，作為活性成分。
該會與LRIT2蛋白結合的物質或該會抑制LRIT2基因表達的物質之說明如上。該藥學組成物可進一步包含一藥學上可接受的添加物。
在本發明中，該癌症可為但不限於選自由下列所構成之群組中之任一者：膀胱癌、骨癌、血癌、乳癌、黑色素瘤、甲狀腺癌、副甲狀腺癌、骨髓癌、直腸癌、咽喉癌(throat cancer)、喉癌(laryngeal cancer)、肺癌、食道癌、胰臟癌、結直腸癌、胃癌、舌癌、皮膚癌、腦腫瘤、子宮癌、頭頸癌、膽囊癌、口腔癌、結腸癌、肛周癌、中樞神經系統腫瘤及肝癌。
該包含一種會與LRIT2蛋白結合的物質或一種會抑制LRIT2基因表達的物質作為活性成分之用於預防或治療癌症之藥學組成物的較佳每日劑量，可在0.01ug/kg至10g/kg及較佳地0.01mg/kg至1g/kg之範圍內，取決於病人的病況、體重、性別、年齡、疾病嚴重度及投藥途徑。投藥可每天一次或數次。
此外，在一實施例中，提供一種用於治療癌症之方法，其包含對一個體投與該包含一種會與LRIT2蛋白結合的物質或一種會抑制LRIT2基因表達的物質作為活性成分之用於預防或治療癌症之藥學組成物。
投藥途徑可為但不限於選自由下列所構成之群組中之任一者：靜脈注射、肌肉注射、皮內注射、皮下注射、腹膜內注射、小動脈注射、心室內注射、病灶內注射、鞘內腔注射、局部注射及其組合。本發明之模式
以下，將藉由下列範例更詳細的說明本發明。然而，下列範例僅用於說明本發明之目的，而本發明之範疇不受其限制。製備範例1 ，緩衝液之製備
在範例中所使用的緩衝液之製備如下： 1XPBS (Thermo Fisher gibco #10010)之製備係通過將155mM氯化鈉、2.96mM磷酸鈉溶液與1.05mM磷酸鉀溶液混合，pH 7.4。
FACS緩衝液之製備係通過將1XPBS (Thermo Fisher gibco #10010)、10ml之2% FBS (Thermo Fisher gibco #16000-044)與1ml之1mM EDTA (Fisher 15575020)混合。
1XRBC溶胞溶液之製備係通過將10XRBC溶液(Biolegend #420301)於三次蒸餾水中以1：10稀釋。
10% FBS RPMI1640之製備係通過將RPMI培養基(Cellgrow #10-040-CVR)、50ml之10% FBS (Thermo Fisher gibco #16000-044)、5ml之1%抗生素(Thermo Fisher gibco #15140-122)與0.5ml之2-巰乙醇(Thermo Fisher gibco #21985-023)混合。
MACS緩衝液之製備是通過將1XPBS (Thermo Fisher gibco #10010)、0.5%之牛血清白蛋白(BSA) (Millipore #82-100-6)與2ml之2mM EDTA (Fisher 15575020)混合。範例1 ，LRIT2 蛋白在T 細胞增生及活性上的抑制作用之鑑定
在本範例中，目的是鑑定LRIT2蛋白是否會抑制T細胞的增生及活性，因而使癌細胞能避開T細胞介導的免疫系統。範例1.1 ，CD4+ T 細胞與CD8+ T 細胞之製備
採集人血，置於塗佈EDTA (或肝素)之10mL試管中。將該人血與PBS以1：1之比例混合。然後，於一50mL試管中置入Ficoll-Paque PLUS，且於其中加入以上之血液樣本。離心後，收集人PBMCs。將收集到的產物通過離心除去上清液。之後，於其中加入RBC溶胞(1x)緩衝液，進行移液，之後將產物保持在冰上3分鐘。之後，於其中加入50ml之10% FBS RPMI1640，且對該混合物進行離心除去上清液。之後，於其中加入FACS緩衝液且進行離心除去上清液。之後，於其中加入50ml之MACS緩衝液(含0.5% BSA及2mM EDTA之PBS)，計數細胞數，並進行離心除去上清液。
使用40μl之MACS緩衝液/1×107 個細胞，重新懸浮CD4+ T細胞及CD8+ T細胞。將各10μl的抗CD4及抗CD8生物素抗體置於試管中，之後將試管保持在冰箱中5分鐘。之後，於所產生的產物中加入30μl之MACS緩衝液/1×107 個細胞。於其中加入20μl的抗生物素微珠，進行混合。隨後，使用LS管柱分離CD4+ T細胞與CD8+ T細胞，並計數各別的細胞之數目。
將各個製得的CD4+ T細胞與CD8+ T細胞與1μl之羧基螢光素琥珀酼亞胺酯(CFSE)/2×106 個細胞混合，且使各個混合物保持在37°C下3分鐘。之後，將FBS加至含有各個CD4+ T細胞及CD8+ T細胞之各試管中，然後將各試管保持在冰上10分鐘。之後，進行離心除去上清液。於所產生的產物中加入30ml之FACS緩衝液，之後進行移液。進行離心除去上清液。之後，於其中加入10%的FBS RPMI1640，然後進行移液。進行離心除去上清液。之後，將所產生的產物與10ml之10% FBS RPMI1640混合，然後計數細胞數。範例1.2 ，LRIT2 蛋白引起的抑制T 細胞活性之鑑定
重組人IgG1蛋白(目錄號110-HG)及重組人PD-L1/B7-H1蛋白(目錄號156-B7)是從R&D Systems購得。此外，重組人LRIT2蛋白(目錄號8388-LR-050)是從Sino Biological Inc購得。
使10μg/ml之各個蛋白分別混合與2μg/ml、3μg/ml、4μg/ml及6μg/ml之抗CD3抗體(BioLegend，目錄號317325)。 在4°C下使用各個混合物塗佈96孔盤，且用PBS洗滌三次。於96孔盤之各孔中，加入200μl，細胞數量為2×106 個之範例1.1中所製備的各CD4+ T細胞及CD8+ T細胞，及進行培育。令使用抗CD3抗體對CD4+ T細胞及CD8+ T細胞之活化進行72個小時。在此，可通過CFSE染色位準，識別CD4+ T細胞及CD8+ T細胞的增生，且通過流動式細胞測量術，使用FACSDiVa軟體(BD Biosciences)分析。結果述於圖1及2中。
圖1及2是分別表示經由流動式細胞測量術測得之CD4+ T細胞及CD8+ T細胞之增生率(%)的長條圖。如圖1及2所示，與用IgG1處理之對照組相比，在用D-L1處理的對照組中，CD4+ T細胞及CD8+ T細胞二者之增生均受到抑制。
此外，與用IgG1處理之對照組相比，在用LRIT2處理之群組中，CD4+ T細胞及CD8+ T細胞之增生明顯地受到抑制，及相對於用PD-L1處理之對照組，CD4+ T細胞及CD8+ T細胞之增生受到抑制的位準相似。從此等結果可看出，由於LRIT2阻斷或敲減中和LRIT2，減少了LRIT2對T細胞增生之抑制能力，因此使能有效的治療癌症。範例2 ，PBMC 細胞毒性之分析
在本範例中，目的是鑑定在使用LRIT2抑制劑中和LRIT2之情況下，PBMCs是否能夠增加對癌細胞之細胞毒性(毒殺能力)。範例2.1 ，PBMCs 之製備
採集人血，且將其置於10mL塗佈EDTA (或肝素)之試管中。將人血與PBS以1：1之比例混合。之後，於一50mL試管中置入Ficoll-Paque PLUS，然後於其中加入以上的血液樣本。離心後，收集人PBMCs。
在4°C下，使用1.0μg/ml之抗CD3抗體(BioLegend，目錄號317325)塗佈96孔盤。在添加PBMCs之前，先用PBS洗滌96孔盤中之各孔3次。將之前獲得的PBMCs混合與10% FBS RPMI1640，然後以100μl，細胞數量為6×105 個之濃度加至96孔盤中之各孔中。令使用抗CD3抗體對PBMCs之活化進行72個小時。範例2.2 ，癌細胞之製備
使肺癌細胞株A549 (ATCC®CCL-185)、結腸癌細胞株HCT-116 (ATCC®CCL-247)、乳癌細胞株MDA-MB-231 (ATCC®HTB-26)、胃癌細胞株MKN-74 (KCLB No. 80104)及白血病細胞株U937 (ATCC®CRL-1593.2)各與5μM之CFSE混合，並保持在37°C下5分鐘。之後，於各個含有各細胞株之試管中加入FBS，然後使各個試管保持在冰上10分鐘。之後，進行離心除去上清液。於所獲得的產物中加入30ml的FACS緩衝液。之後，進行移液，然後進行離心除去上清液。之後，於其中加入10% FBS RPMI1640。之後，進行移液及進行離心除去上清液。使所獲得的產物與10ml之10% FBS RPMI1640混合，然後計數細胞數。
將各類的癌細胞，以3×104 個細胞/100μl加至範例2.1中製得的96孔盤之各個含有PBMC的孔中，且進行培育。範例2.3 ，PBMCs 對癌細胞株之細胞毒性的測量
於該96孔盤之各個孔中加人10μg/mL之抗人LRIT2抗體或50nM之LRIT2 siRNA，並進行培育24個小時。以下表1顯示其中使用四種中和抗體阻斷LRIT2之實驗組及未處理的對照組；而以下表2顯示其中使用三種siRNAs敲減LRIT2之實驗組及未處理的對照組。 [表1]
Figure 108116930-A0304-0001
 [表2]
Figure 108116930-A0304-0002
將PBMCs與各癌細胞株之各個混合物，與該抗體或siRNA一起培育。24個小時後，為了鑑定溶解的細胞，用7-胺基放線菌素D (7-AAD; BD Pharmingen, San Diego, Calif., USA)染細胞。使用FACSDiVa軟體(BD Biosciences)測量對CFSE及7-AAD之染色，鑑定PBMC對各癌細胞株的細胞毒殺能力。結果示於圖3A至7D中。
具體地，用LRIT2中和抗體或siRNA處理肺癌細胞株A549之情況下所獲得的實驗結果示於圖3A至3D中。用LRIT2中和抗體或siRNA處理結腸癌細胞株HCT-116之情況下所獲得的實驗結果示於圖4A至4D中。用LRIT2中和抗體或siRNA處理乳癌細胞株MDA-MB-231之情況下所獲得的實驗結果示於圖5A至5D中。用LRIT2中和抗體或siRNA處理胃癌細胞株MKN-74之情況下所獲得的實驗結果示於圖6A至6D中。用LRIT2中和抗體或siRNA處理白血病癌細胞株U937之情況下所獲得的實驗結果示於圖7A至7D中。
如圖3A至3D所述，相較於未處理的對照組，在用LRIT2中和抗體處理的肺癌細胞株A549與PBMCs之情況下，表現出毒殺肺癌細胞之能力顯著地增加，然而視抗體之種類，在毒殺能力方面具有程度上的不同；甚至在用LRIT2 siRNA處理肺癌細胞株之情況下，亦表現出毒殺肺癌細胞之能力顯著地增加的。
與以上PBMCs表現出對肺癌細胞株毒殺能力增加之結果相似，在使用LRIT2中和抗體或siRNA中和LRIT2之情況下，鑑定出PBMCs亦表現出增加對結腸癌細胞株、乳癌細胞株、胃癌細胞株及白血病細胞株之毒殺能力(圖4A至7D)。範例3 ，使用腫瘤小鼠模型之實驗
在本範例中，目的是鑑定在使用LRIT2抑制劑中和LRIT2之情況下，小鼠活體內之腫瘤是否受到抑制。
將源自C57BL/6結腸腺癌細胞之MC38細胞株以2.0×105 個細胞之濃度重新懸浮於50μl的PBS中，然後將其注射至6周大的雌性C57BL/6小鼠之側翼。以下表3顯示其中使用siRNA敲減LRIT2之實驗組及未處理的對照組。 [表3]
Figure 108116930-A0304-0003
針對全部的實驗組，從注射MC38細胞株後第11天開始，在5天間隔內，於小鼠腫瘤中注射各個靶向小鼠LRIT2之siRNA共3次。具體地，根據製造商之說明書，將10μg之siRNA與7.5μl之Oligofectamine (Invitrogen)於PBS中混合，然後將該混合物以0.5mg/kg之劑量直接注射至在小鼠中誘發的腫瘤組織中。測量未處理之對照組及其中LRIT2敲減之實驗組中小鼠體內的腫瘤大小所獲得的結果，示於圖8A至8D中。
如圖8A至8D所示，發現在未處理的對照組中，腫瘤在小鼠中產生後持續生長。相反的，發現相較於未處理的對照組，在其中LRIT2敲減之小鼠中，腫瘤之生長率明顯地受到抑制。此顯示在LRIT2被阻斷或敲減及其活性或表達被抑制的情況下，癌的進展延緩或停止了且癌的發展受到了抑制。據此，LRIT2抑制劑可用於預防或治療癌症。
圖1說明LRIT2會抑制T細胞成熟成CD4+ T細胞。 圖2說明LRIT2會抑制T細胞成熟成CD8+ T細胞。 圖3A至3D說明用LRIT2抑制劑(抗體或siRNA)處理肺癌細胞株A549及PBMCs之情況下所獲得的每一組之周邊血液單核細胞的細胞毒性(%)。 圖4A至4D說明用LRIT2抑制劑(抗體或siRNA)處理結腸癌細胞株HCT-116及PBMCs之情況下所獲得的每一組之PBMCs的細胞毒性(%)。 圖5A至5D說明用LRIT2抑制劑(抗體或siRNA)處理乳癌細胞株MDA-MB-231及PBMCs之情況下所獲得的每一組之PBMCs的細胞毒性(%)。 圖6A至6D說明用LRIT2抑制劑(抗體或siRNA)處理胃癌細胞株MKN-74及PBMCs之情況下所獲得的每一組之PBMCs的細胞毒性(%)。 圖7A至7D說明用LRIT2抑制劑(抗體或siRNA)處理血癌細胞株U937及PBMCs之情況下所獲得的每一組之PBMCs的細胞毒性(%)。 圖8A至8D說明用LRIT2抑制劑(各用3種siRNAs)處理之每一組小鼠中腫瘤大小的變化。
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Claims (12)

  1. 一種免疫增強劑，其包含下列作為活性成分：一種會與富白胺酸重複、免疫球蛋白樣域及含穿膜域蛋白2(leucine-rich repeat,immunoglobulin-like domain and transmembrane domain-containing protein 2，LRIT2)蛋白結合的物質；或一種會抑制LRIT2基因表達的物質，其中該會與LRIT2蛋白結合的物質是會與該LRIT2蛋白專一性結合之抗體或其片段，且其中該會抑制LRIT2基因表達的物質是會與該LRIT2基因之DNA或mRNA互補結合之反義核酸、siRNA、shRNA、miRNA或核酶(ribozyme)。
  2. 如請求項1之免疫增強劑，其中該LRIT2蛋白具有序列辨識編號1之胺基酸序列。
  3. 如請求項1之免疫增強劑，其中該抗體或其片段是選自由下列所構成之群組中之任一者：單株抗體、scFv、Fab、Fab'及F(ab)'。
  4. 如請求項1之免疫增強劑，其中該LRIT2基因之DNA具有序列辨識編號2之核苷酸序列。
  5. 如請求項1之免疫增強劑，其中該siRNA是序列辨識編號3至14之核苷酸序列中之任一者。
  6. 一種用於預防或治療癌症之藥學組成物，其包含下列作為活性成份： 一種會與LRIT2蛋白結合的物質；或一種會抑制LRIT2基因表達的物質，其中該會與LRIT2蛋白結合的物質是會與該LRIT2蛋白專一性結合之抗體或其片段，且其中該會抑制LRIT2基因表達的物質是會與該LRIT2基因之DNA或mRNA互補結合之反義核酸、siRNA、shRNA、miRNA或核酶。
  7. 如請求項6之藥學組成物，其中該LRIT2蛋白具有序列辨識編號1之胺基酸序列。
  8. 如請求項6之藥學組成物，其中該抗體或其片段是選自由下列所構成之群組中之任一者：單株抗體、scFv、Fab、Fab'及F(ab)'。
  9. 如請求項6之藥學組成物，其中該LRIT2基因之DNA具有序列辨識編號2之核苷酸序列。
  10. 如請求項6之藥學組成物，其中該siRNA是序列辨識編號3至14之核苷酸序列中之任一者。
  11. 如請求項6之藥學組成物，其中該癌症是選自由下列所構成之群組中之任一者：膀胱癌、骨癌、血癌、乳癌、黑色素瘤、甲狀腺癌、副甲狀腺癌、骨髓癌、直腸癌、咽喉癌(throat cancer)、喉癌(laryngeal cancer)、肺癌、食道癌、胰臟癌、結直腸癌、胃癌、舌癌、皮膚癌、腦腫瘤、子宮癌、頭頸癌、膽囊癌、口腔癌、結腸癌、肛周癌、中樞神經系統腫瘤及肝癌。
  12. 一種會與LRIT2蛋白結合的物質或會 抑制LRIT2基因表達的物質於製備藥物的用途，該藥物是用於治療癌症，其中該會與LRIT2蛋白結合的物質是會與該LRIT2蛋白專一性結合之抗體或其片段，且其中該會抑制LRIT2基因表達的物質是會與該LRIT2基因之DNA或mRNA互補結合之反義核酸、siRNA、shRNA、miRNA或核酶。
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