MX2007000770A - Induccion de apoptosis en celulas tumorales que expresan el receptor tipo toll. - Google Patents

Abstract

Algunos tipos de celulas cancerosas expresan uno o mas receptores tipo Toil (TLR5); estos TLRs son blancos terapeuticos; la invencion se refiere a metodos para el tratamiento de canceres y celulas tumorales que expresan el receptor tipo TolI mediante la seleccion de una celula tumoral que expresa TLR y poner en contacto a la celula con una cantidad terapeuticamente efectiva de un ligando de TLR; la invencion se refiere particularmente a metodos para el tratamiento de canceres y celulas tumorales que expresan TLR3 utilizando agonistas de TLR3.

Description

INDUCCIÓN DE APOPTOSIS EN CÉLULAS TUMORALES QUE EXPRESAN EL RECEPTOR TIPO TOLL REFERENCIA RECIPROCA A LAS SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud reclama prioridad a la Solicitud de E.U.A número de serie 60/589,616.

CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se refiere a métodos para el tratamiento de cánceres y células tumorales que expresan el receptor tipo Toll (TLR) mediante la selección de una célula tumoral que expresa TLR y poniendo en contacto a la célula con una cantidad terapéuticamente efectiva de un ligando de TLR. La invención se refiere particularmente a métodos para el tratamiento de cánceres y células tumorales que expresan TLR3 utilizando agonistas de TLR3.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El cáncer es una de las causas principales de muerte en el mundo. Por lo tanto, es esencial que desarrollemos nuevos métodos para tratamiento de esta enfermedad mortal. Muchas terapias de cáncer actuales afectan rápidamente a las células en división. Estas terapias tienen efectos laterales devastadores debido a que afectan a todas las células que se dividen rápidamente, tales como a las células del tracto gastrointestinal y folículos pilosos, y no solamente a las células cancerosas. Por lo tanto, son necesarios nuevos métodos de tratamiento que no tengan dichos efectos laterales devastadores. La presente solicitud identifica al receptor 3 tipo Toll como un blanco terapéutico en el tratamiento del cáncer. Las proteínas toll de Drosophila controlan el patrón dorsal-ventral en embriones de Drosophila y también se piensa que representa un antiguo mecanismo de defensa del hospedero. También se han identificado los homólogos humanos de toll de Drosophila, denominados receptores tipo Toll (TLRs). El alineamiento de las secuencias de las proteínas Toll de humano y de Drosophila muestra que existe homología en toda la longitud de las cadenas de la proteína. Por consiguiente, se cree que TLRs es un componente importante de la inmunidad innata en humanos. La familia de los receptores tipo Toll de humano está comprendida de diez proteínas receptores altamente conservados, TLR1 -TLR10. A semejanza de toll de Drosophila, los TLRs de humano son proteínas transmembranales tipo I con un dominio extracelular que consiste de un dominio repetido rico en leucina (LRR) que reconoce los patrones moleculares asociados con el patógeno (PAMPs), y un dominio citoplasmático que es homólogos al dominio citoplasmático del receptor de la interleucina-1 (IL-1 ) de humano. De manera similar a las rutas de señalización para ambos toll de Drosophila y el receptor IL-1 , los receptores tipo Toll de humano señalizan a través de la ruta NF- B. Aunque los TLRs de mamífero comparten muchas características y mecanismos de transducción de la señal, sus funciones biológicas son muy diferentes. Esto es debido en parte al hecho de que cuatro diferentes moléculas adaptadores (MyD88, TIRAP, TRIF y TRAF) están asociadas en diversas combinaciones con los TLRs y median diferentes rutas de señalización. Además, diferentes ligados para un TLR pueden activar preferiblemente diferentes rutas de transducción de la señal. Además, los TLRs se expresan de manera diferencial en diversas células hematopoiéticas y no hematopoiéticas. Por consiguiente, la respuesta a un ligando de TLR no solamente depende de la ruta de señal activada por el TLR, sino también de la naturaleza de las células en las cuales se expresa el TLR individual. Aunque los ligados para algunos TLRs aún tienen que ser identificados, ya se han reportado numerosos ligados específicos de TLR. Por ejemplo, Poli IC y Poli AU son ambos agonistas de TLR3. El ácido poliinosínico-policitidílico (Poli IC) es un ARN sintético de cadena doble de alto peso molecular que es heterogéneo en tamaño. Poli IC es un agonista de TLR3, pero también es un activador potente del PKR, de una enzima ubicua implicada en las respuestas anti-virales y en la regulación post-transcripcional del gen.

El ácido poliadenílico-poliuridílico (Poli AU) es un complejo de doble cadena de polirribonucleótidos sintéticos. Poli AU es un agonista de TLR3. Poli AU es un modulador tanto de las respuestas inmunes humorales como celulares, y también es un inductor del interferón. Aunque tanto Poli IC como Poli AU se utilizaron en varios ensayos clínicos como terapia adyuvante en diferentes tipos de cáncer, tales como cáncer de mama, de vejiga, de riñon y de estómago, estos agentes no han sido utilizados previamente en los métodos novedosos descritos en la presente invención. Como se estableció previamente, la presente solicitud identifica al receptor 3 tipo Toll como un agente terapéutico en el tratamiento del cáncer. Los siguientes estudios publicados se refieren a la relación entre los TLRs y la apoptosis. Aliprantis et al. reporta sobre experimentos que examinan el efecto de las lipoproteínas bacterianas (BLPs) sobre la inducción de la apoptosis en una línea celular monocítica que expresa el receptor 2 tipo Toll de humano (hTLR2). Véase Aliprantis et al., "Cell Activation and Apoptosis by Bacterial Lipoproteins Through Toll-like Receptor-2", Science, vol. 285, pp. 736-739 (Julio 30, 1999). Otra referencia por Aliprantis et al. se refiere al papel de TLR2 en el inicio de la activación de la caspasa 8 a través del reclutamiento de FADD. Véase Aliprantis et al., "The apoptotic signaling pathway activated by Toll-like receptor-2", Embo J., vol. 19 (13), pp. 3325-3336 (2000).

Sabroe et al. se refiere al papel de TLR2 en la supervivencia del neutrófilo. Véase Sabroe et al., "Selective Roles for Toll-Like Receptor (TLR)2 and TLR4 in the Regulation of Neutrophil Activation and Life Span", J. Immunology, vol. 170, pp. 5268-5275 (2003). Bannerman y Goldblum se refiere a estudios que indican a TLR4 y a TLR2 como receptores de liposacáridos bacterianos (LPS). Véase Bannerman y Goldblum, "Mechanisms of bacterial lipoPolisaccharide-induced endothelial apoptosis", Am. J. Physiology Lung Cell Molecular Physiology, vol. 284, pp. L899-L914 (2003). Meyer et al. se refiere a estudios sobre la inducción de apoptosis mediante un agonista de TLR7 en líneas celulares epiteliales de humano (HeLa S3), queratinocitos (células HaCaT y A431 ) y fibroblastos de ratón (células McCoy). Véase Meyer et al., "Induction of apoptosis by Toll-like Receptor-7 agonist in tissue cultures", British J. Dermatology, vol. 149 (suplemento 66), pp. 9-13 (2003). Wen et al. sugiere que la diabetes es inducida, en parte, por la combinación del reconocimiento directo del estímulo semejante al del virus por las isletas pancreáticas a través de la expresión del receptor inmune innato, TLR3. Wen et al. también especula que la inducción de la apoptosis by Poli IC es posiblemente mediada por TLR3. Véase Wen et al., "The Effect of Innate Immunity on Autoimmune Diabetes and the Expression of Toll-Like Receptors on Pancreatic Islets", J. Immunology, vol. 172, pp. 3173-3180 (2004).

Finalmente, Han et al. se refiere a la inducción de la apoptosis en células 293 que sobre-expresan TRIF. Han et al. también se refiere a un modelo propuesto para las rutas de señalización intracelular inducidas por TRIF (ISRE/IFNß, NF-?B y apoptosis) que es activado por TLR3. Véase Han et al., "Mechanisms of the TRIF-induced Interferon-stimulated Response Element and NF-/cB Activation and Apoptosis Pathways", J. Biological Chemistry, vol. 279, no. 15, pp. 15652-15661 (2004).

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Una modalidad de la invención provee un método para el tratamiento del cáncer que comprende: a) seleccionar un paciente que tiene un cáncer que expresa TLR, y b) administrar al paciente una cantidad terapéuticamente efectiva de un ligando de TLR. Preferiblemente, el ligando es un agonista o un antagonista. Una modalidad alteARNtiva de la invención provee un método para la inducción de apoptosis de una célula tumoral que comprende: a) seleccionar una célula tumoral que expresa TLR, y b) poner en contacto la célula con un ligando de TLR en una cantidad efectiva para inducir apoptosis en la célula. Preferiblemente, el ligando es un agonista o un antagonista. Otra modalidad de la invención provee un método para el tratamiento del cáncer que comprende: a) seleccionar un paciente que tiene un cáncer que expresa TLR3; y b) administrar al paciente una cantidad terapéuticamente efectiva de un ligando de TLR3. Preferiblemente, el ligando es un agonista o un antagonista. Más preferiblemente, el agonista es Poli AU. Más preferiblemente, el agonista es Poli IC. AíteARNtivamente, el antagonista es un anticuerpo o fragmento del mismo. Preferiblemente, el cáncer que expresa TLR3 es cáncer de colon. Más preferiblemente, el cáncer que expresa TLR3 es cáncer de mama. El método puede comprender adicionalmente administrar al paciente un agente quimioterapéutico o un tratamiento para el cáncer. El método también puede comprender adicionalmente administrar al paciente una dosis baja del IFN tipo I antes de la administración del ligando de TLR3. Una modalidad alteARNtiva de la invención provee un método para la inducción de apoptosis de una célula tumoral que comprende: a) seleccionar una célula tumoral que expresa TLR3, y b) poner en contacto la célula con un ligando de TLR3 en una cantidad efectiva para inducir apoptosis en la célula. Preferiblemente, el ligando es un agonista o un antagonista. Más preferiblemente, el agonista es Poli AU. Más preferiblemente, el agonista es Poli IC. AlteARNtivamente, el antagonista es un anticuerpo o fragmento del mismo. Preferiblemente, la célula tumoral que expresa TLR3 es una célula de cáncer de colon. Más preferiblemente, la célula tumoral que expresa TLR3 es una célula de cáncer de mama. El método puede comprender adicionalmente poner en contacto a la célula con un agente quimioterapéutico o un tratamiento para el cáncer. El método también puede comprender adicionalmente poner en contacto a la célula con una dosis baja del IFN tipo I antes de la administración del ligando de TLR3.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Lo anterior y otras características de la presente invención serán más fácilmente evidentes a partir de la siguiente descripción detallada de la invención y de la breve descripción del dibujo en la cual: Las figuras 1A-1 D son una serie de gráficas que muestran el efecto del silenciamiento por ARNsi de TLR3 sobre la apoptosis de las células Cama-1 después de la incubación por 48 horas con Poli IC. El TLR3 se requiere para la muerte de la célula Cama-1 inducida por Poli IC, como se muestra por el silenciamiento por ARNsi de su expresión. Las células Cama-1 se transfectaron con ARNsi ya sea de una secuencia irrelevante (ARN de Ser) o de una secuencia que corresponde a hTLR3. Las células se cultivaron entonces con o sin Poli IC, como se describe en el ejemplo 4. Después de 48 horas de cultivo, el ciclo celular se analizó mediante FACS, después de la tinción con yoduro de propidio.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Todas las publicaciones citadas en la presente invención se incorporan como referencia en su totalidad.

Definiciones El término "apoptosis" significa muerte celular programada. El término "agonista" significa un ligando que es capaz de unirse a y activar un receptor. El término "antagonista" significa un ligando que es capaz de unirse a y bloquear o inactivar un receptor. AlteARNtivamente, un "antagonista" puede unir a y bloquear o inactivar un agonista de manera que previene su unión a un receptor. El término "anticuerpo" significa una inmunoglobulina completa, por ejemplo, que contiene dos fragmentos Fab conectados a un fragmento Fc. El término "anticuerpo" incluye anticuerpos policlonales, monoclonales, quiméricos, primatizados, humanizados y de humano. El término "anticuerpo" incluye cualquiera de las cinco clases principales de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y también subclases (isotipos) de inmunoglobulinas, por ejemplo, IgGI, lgG2, lgG3, lgG4, IgA e lgA2. El término "fragmento de anticuerpo" significa cualquier fragmento o combinación de fragmentos de una inmunoglobulina completa, tales como, los fragmentos Fab, Fc, F(ab)2 y Fv. El término "cáncer" describe la condición fisiológica que se caracteriza típicamente por un crecimiento celular no regulado. Los ejemplos de cáncer incluyen, pero no se limitan a, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma y leucemia. Los ejemplos más específicos incluyen cáncer de célula escamosa, cáncer pulmonar de célula pequeña, cáncer pulmonar no de célula pequeña, cáncer gastrointestinal, cáncer pancreático, glioblastoma, cáncer cervical, cáncer ovárico, cáncer hepático, cáncer de vejiga, hepatoma, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer colorectal, carcinoma endometrial, carcinoma de glándulas salival, cáncer renal, cáncer de próstata, cáncer vulval, cáncer tiroideo, carcinoma hepático y diversos tipos de cánceres de cabeza y cuello. El término "agente quimioterapéutico" significa un compuesto químico útil en el tratamiento del cáncer. El término "tratamiento" significa medidas terapéuticas, profilácticas o supresoras para una enfermedad o trastorno que lleva a cualquier efecto clínicamente deseable o benéfico, incluyendo, pero no limitado a, alivio de uno o más síntomas, regresión, disminución de la velocidad o cese de la progresión de la enfermedad o trastorno. El término "ARNsi" significa un ARN corto de interferencia. El término "TLR" significa un receptor tipo Toll. El TLR puede ser de cualquier especie de receptor tipo Toll. Preferiblemente, el término se refiere a un receptor tipo Toll de humano (hTLR), tal como uno de TLRs 1 -10. El término "cáncer que expresa TLR" significa un tumor que contiene células que expresan un receptor tipo Toll. El término "célula tumoral que expresa TLR" significa una célula tumoral que expresa un receptor tipo Toll. Los términos "expresan ", "expresa", "expresión" y "que expresa" significan la transcripción y traducción de un ácido nucleico para producir un polipéptido. En una célula, esto significa que el polipéptido será ya sea secretado, permanecerá en el citoplasma, o residirá al menos parcialmente en la membrana celular. El término "ligando" significa cualquier molécula que es capaz de unir específicamente a otra molécula, tal como un receptor. El término "ligando" incluye tanto agonistas como antagonistas. Un "ligando" puede ser, por ejemplo, una molécula pequeña (una molécula orgánica), un anticuerpo o fragmento de anticuerpo, ARNsi, un ácido nucleico antisentido, un polipéptido, ADN y ARN. El término "ligando de TLR" significa cualquier molecular capaz de unir específicamente a un receptor tipo Toll, particularmente TLRs 1-10 de humano. El término "ligando de TLR" incluye tanto agonistas como antagonistas de TLRs. Un "ligando de TLR" puede ser, por ejemplo, una molécula pequeña (una molécula orgánica), un anticuerpo o fragmento de anticuerpo, ARNsi, un ácido nucleico antisentido, un polipéptido, ADN y ARN. El término "ligando de TLR correspondiente" significa un ligando que se une a un TLR particular. Por ejemplo, un ligando de TLR1 es el ligando de correspondiente de TLR para TLR1. De manera similar, un ligando de TLR2 es el ligando de TLR correspondiente para TLR2. Este mismo principio se aplica para TLRs 3-10. El término "paciente" significa tanto humano como animales no humanos. El término "Poli IC" significa ácido poliinosínico-policitidílico.

El término "Poli AU" significa ácido poliadenílico-poliuridílico. El término "cantidad terapéuticamente efectiva" significa una cantidad de una composición, tal como un ligando de TLR, que mejorará uno o más de los parámetros que caracterizan las condiciones médicas ocasionadas o mediadas por los TLRs, tales como el cáncer. Los términos "cantidad efectiva" y " efectiva cantidad " significan una cantidad de una composición farmacéutica, tal como un ligando de TLR, que ocasionará un cierto efecto, tal como la inducción de la apoptosis en una célula. El término "dosis baja" significa una cantidad de una sustancia que es menor que la que se considera normal para lograr un cierto efecto, tal como un efecto terapéutico.

Caracterización del receptor tipo Toll (TLR) La familia de los receptores tipo Toll de humano (hTLRs) está comprendida de diez miembros, hTLRs 1-10. La secuencia nucleotídica del marco de lectura abierto completo y la secuencia de aminoácidos correspondiente de cada uno de hTLRs 1-10 se conocen en la técnica. Por ejemplo, las secuencias para hTLRs 1-10 se describen en la Publicación PCT No. WO 01/90151 , aunque las secuencias se numeran de manera diferente que en la nomenclatura pública. Las secuencias nucleotídicas y de aminoácidos para cada uno de los hTLRs 1-10 también se puede encontrar en la base de datos de GenBank®, como se muestra en el cuadro 1 a continuación.

CUADRO 1 Una persona experta en la técnica será capaz, dada la secuencia de ácidos nucleicos y de aminoácidos de cualquier TLR1 de producir cualquier proteína TLR o fragmento de la misma, anticuerpo a la proteína o fragmento, ácido nucleico o fragmento del mismo, sonda de ácido nucleico, antisentido, ARNsi, etc. utilizando técnicas estándares de biología molecular. Estas moléculas se pueden utilizar entonces para seleccionar un cáncer o célula tumoral que expresa TLR.

Se han identificado algunos ligandos de TLR, como se muestra a continuación en el cuadro 2. Una persona experta en la técnica será capaz de aislar o generar cualquiera de los ligandos a continuación. AlteARNtivamente, los ligandos se pueden obtener a partir de fuentes comerciales. CUADRO 2 Los TLRs funcionan como mediadores de la respuesta inmune. Por lo tanto, existen aplicaciones terapéuticas para los TLRs en las áreas de oncología, enfermedad infecciosa, autoinmunidad, alergia, asma, COPD y cardiología. La presente invención se basa, en parte, en el descubrimiento de que ciertos tipos de células tumorales expresan los receptores tipo Toll y que el ligando que se une a estos TLRs ayuda en el establecimiento y mejora la efectividad de las respuestas inmunes dirigidas al tumor.

Selección de un cáncer o célula tumoral que expresa TLR Un paso del método de la invención incluye seleccionar un paciente que tiene un cáncer que expresa TLR o seleccionar una célula tumoral que expresa TLR. El término "seleccionar" significa identificar algo de interés. En el contexto de la presente solicitud, la frase "seleccionar un paciente" significa identificar un paciente que tiene una característica particular, tal como un cáncer que expresa TLR. La frase "seleccionar una célula tumoral que expresa TLR" significa identificar una célula tumoral que expresa un receptor tipo Toll. Como se sabe en la técnica, existen muchas maneras de seleccionar un paciente que tiene un cáncer que expresa TLR o seleccionar una célula tumoral que expresa TLR. Por ejemplo, un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo se puede utilizar para unir a e identificar una célula tumoral que expresa TLR. Preferiblemente, un anticuerpo de TLR3 se utiliza para unir a e identificar una célula tumoral que expresa TLR3. El anticuerpo o fragmento del mismo se puede proporcionar in vivo en una composición farmacéutica o in vitro. Preferiblemente, se lleva a cabo una biopsia en un paciente y las células tumorales se seleccionan in vitro. También es posible incrementar la expresión del TLR antes de la biopsia como un medio potencial para reclutar a los pacientes que podrían de otra manera no haber sido incluidos en el protocolo para tratamiento del ligando de TLR. En el caso de TLR3, una dosis baja del IFN tipo I o del ligando de TLR3 mismo se podría administrar por unos pocos días antes de la biopsia o antes de cualquier otro procedimiento de diagnóstico (aspiración con aguja o imagen médica). AlteARNtivamente, cualquiera de los ligandos de TLR identificados en el cuadro 2 de esta solicitud, u otras moléculas pequeñas se pueden utilizar para unir a e identificar una célula tumoral que expresa TLR. Preferiblemente, un ligando de TLR3 se utiliza para unir a e identificar una célula que expresa TLR3. De nuevo, el paso de selección se lleva a cabo preferiblemente in vitro. Además, las células tumorales se pueden lisar para determinar si las células exhiben niveles incrementados de una proteína TLR particular (mediante Western blot) o un ARN particular de TLR (mediante Northern blot). El proceso de selección puede incluir el uso de marcas detectables. Por ejemplo, los anticuerpos anteriormente mencionados, fragmentos de anticuerpo, moléculas pequeñas, ADN, ARN, y otros ligados pueden necesitar ser marcados con el objeto de ser detectados. La detección se puede lograr visualmente, o mediante el uso de un dispositivo. Las marcas detectables comúnmente utilizadas en la técnica incluyen, por ejemplo, radiomarcas, marcas fluorescentes, y marcas enzimáticas, aunque se puede utilizar cualquier marca detectable. Además de identificar una célula tumoral que expresa un TLR, el paso de selección probablemente identificará cuál receptor tipo Toll (TLRs 1-10) expresa una célula tumoral particular. Esto se debe al hecho de que muchos anticuerpos, fragmentos de anticuerpo, ADNs, ARNs, moléculas pequeñas, u otros ligados utilizados para seleccionar una célula tumoral que expresa TLR se unen específicamente a un TLR individual de TLRs 1-10. El paso de seleccionar un paciente que tiene un cáncer que expresa TLR o de seleccionar una célula tumoral que expresa TLR también se puede llevar a cabo de manera indirecta. Por ejemplo, la expresión de un TLR particular por un cáncer puede estar asociada a un subtipo específico de cáncer con una etiología específica. Cualquier marcador de esta etiología específica, tal como un virus, puede ser indicativo de la expresión de un TLR dado y puede ser un marcador útil para la guía de uso del ligando de TLR correspondiente.

Administración de los liqandos de TLRs a los pacientes Otro paso del método de la invención incluye la administración a un paciente de una cantidad terapéuticamente efectiva de un ligando de TLR. Este paso incluye la administración del ligando de TLR en una composición farmacéutica. Por ejemplo, la composición farmacéutica puede estar en la forma de una tableta, de tal manera que el ligando se absorbe en el torrente sanguíneo. El sistema circulatorio puede entonces suministrar el ligando de TLR a un cáncer que expresa TLR de tal manera que el ligando y el cáncer se pueden poner en contacto entre sí. Este paso de contacto permitirá que el ligando se una al receptores) tipo Toll del cáncer e induzca inhibición del crecimiento y apoptosis en el cáncer. AlteARNtivamente, la composición farmacéutica se puede administrar localmente o tópicamente, tal como para el tratamiento de melanoma. Como se estableció anteriormente, el paso de selección probablemente identificará al TLR particular que expresa el cáncer. Preferiblemente, el paso de administración incluye la administración de un ligando correspondiente a un paciente que tiene un cáncer que expresa un receptor tipo Toll. Por ejemplo, si un cáncer expresa TLR1 , preferiblemente al paciente se le administra con una cantidad efectiva de un ligando de TLR1. De manera similar, si un cáncer expresa TLR2, preferiblemente al paciente se le administra con una cantidad efectiva de un ligando de TLR2. El mismo principio permanece cierto para TLRs 3-10. Preferiblemente, el método de la invención incluye la administración a un paciente que tiene un cáncer que expresa TLR3 de una cantidad efectiva de un ligando de TLR3. Preferiblemente, que ligando de TLR3 es un agonista. Más preferiblemente, que ligando de TLR3 es Poli AU. Más preferiblemente, en ligando de TLR3 es Poli IC. Preferiblemente, el cáncer es célula de cáncer de colon o de cáncer de mama. Preferiblemente, el método de la invención comprende adicionalmente administrar a un paciente un agente quimioterapéutico o un tratamiento para el cáncer. Preferiblemente, el método de la invención comprende adicionalmente administrar al paciente una dosis baja del IFN tipo I o ligando de TLR3. Por ejemplo, una dosis baja del IFN tipo I se encuentra en el intervalo de 1-3 MU, y preferiblemente 2 MU. Más preferiblemente, la dosis baja del IFN tipo t es menor de 1 MU.

Contacto de las células tumorales que expresan TLR con liqandos de TLR AlteARNtivamente, un paso del método de la invención incluye poner en contacto una célula tumoral que expresa TLR con una cantidad efectiva de un ligando de TLR. In vivo, el paso de contacto incluye administrar un ligando de TLR en una composición farmacéutica a un paciente. In vitro, el paso de contacto incluye poner una célula tumoral que expresa TLR y un ligando de TLR en proximidad física cercana de tal manera que el ligando y la célula se pueden poner en contacto entre sí. Este paso de contacto permitirá que ligando se una al receptor tipo Toll de la célula e induce inhibición del crecimiento y apoptosis en la célula tumoral. Como se estableció anteriormente, el paso de selección probablemente identificará el TLR particular que expresa la célula tumoral. Preferiblemente, el paso de contacto incluye poner en contacto una célula que expresa un receptor tipo Toll a su ligando correspondiente. Por ejemplo, si una célula tumoral expresa TLR1 , preferiblemente la célula se pone en contacto con una cantidad efectiva de un ligando de TLR1. De manera similar, si una célula tumoral expresa TLR2, preferiblemente la célula se pone en contacto con una cantidad efectiva de un ligando de TLR2. El mismo principio se mantiene cierto para TLRs 3-10.

Preferiblemente, el método de la invención incluye poner en contacto una célula tumoral que expresa TLR3 con una cantidad efectiva de un ligando de TLR3. Preferiblemente, el ligando de TLR3 es un agonista. Más preferiblemente, el ligando de TLR3 es Poli AU. Más preferiblemente, el ligando de TLR3 es Poli IC. Preferiblemente, la célula es una célula de cáncer de colon o una célula de cáncer de mama. Preferiblemente, el método de la invención comprende adicionalmente poner en contacto a la célula con un agente quimioterapéutico o un tratamiento para el cáncer. Preferiblemente, el método de la invención comprende adicionalmente poner en contacto a la célula con una dosis baja del IFN tipo I o del ligando TLR3. Por ejemplo, una dosis baja del IFN tipo I se encuentra en el intervalo de 1-3 MU, y preferiblemente 2 MU. Más preferiblemente, la dosis baja del IFN tipo I es menor de 1 MU.

Polipéptidos Los polipéptidos, tal como un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo o un lipopéptido, se pueden utilizar en el paso de selección, para seleccionar un cáncer o célula que expresa TLR, en el paso de administración, para suministrar un ligando de TLR a un paciente, o en el paso de contacto, para inducir la inhibición del crecimiento y la apoptosis en una célula que expresa TLR, en el método de la presente invención. Además, los polipéptidos de TLR o fragmentos de los mismos se pueden producir con el objeto de identificar o generar ligandos, tales como un anticuerpo, que se unirá al TLR. Como se utiliza en la presente invención, el término "polipéptido" o "péptido" significa un fragmento o segmento, por ejemplo, de un polipéptido que contiene al menos 8, preferiblemente al menos 12, más preferiblemente al menos 20, y más preferiblemente al menos 30 o más residuos de aminoácidos contiguos, hasta e incluyendo el número total de residuos en la proteína completa. El término "polipéptido" también comprende deleciones, adiciones, modificaciones, sustituciones, análogos, variantes, y polipéptidos glicosilados o no glicosilados. Las sustituciones incluyen tanto sustituciones conservativas como no conservativas. Las modificaciones de residuos de aminoácidos pueden incluir, pero no se limitan a, esteres alifáticos o amidas del extremo carboxilo o de residuos que contienen cadenas laterales de carboxilo, derivados de O-acilo de residuos que contienen el grupo hidroxilo, y derivados de N-acilo del aminoácido amino-terminal o residuos que contienen un grupo amino, por ejemplo, lisina o arginina. Los análogos son polipéptidos que contienen modificaciones, tales como la incorporación de residuos de aminoácidos no naturales, o residuos de aminoácidos fosforilados, tales como residuos de fosfotirosina, fosfoserina o fosfotreonina. Otras modificaciones potenciales incluyen sulfonación, biotinilación, o la adición de otras porciones, particularmente aquellas que tienen formas moleculares similares a los grupos fosfato. Se describen las técnicas para la síntesis de polipéptidos, por ejemplo, en Merrifield, J. Amer. Chem. Soc. 85: 2149 (1963); Merrifield, Science 232: 341 (1986); y Atherton et al., Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach, 1989, IRL Press, Oxford. Se pueden preparar los análogos de polipéptidos mediante síntesis química o mediante el uso de mutagénesis sitio dirigida [Gillman et al., Gene 8:81 (1979); Roberts et al., Nature, 328:731 (1987) o Innis (Ed.), 1990, PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press, New York, NY] o el método de reacción en cadena de la polimerasa [PCR; Saiki et al., Science 239: 487 (1988)], como se ejemplifica por Daugherty et al. [Nucleic Acids Res. 79:2471 (1991 )] para modificar los ácidos nucleicos que codifican los receptores completos. Se considera la adición de marcas de epítopes para la purificación o detección de productos recombinantes. Ácidos nucleicos Los ácidos nucleicos se pueden utilizar para seleccionar un paciente que tiene un cáncer que expresa TLR o para seleccionar una célula tumoral que expresa TLR. Con el objeto de seleccionar a un paciente, preferiblemente se llevó a cabo una biopsia del tumor del paciente. Posteriormente, las células tumorales se pueden analizar in vitro para la expresión de ácidos nucleicos de TLR.

Como se muestra en el cuadro 1 de esta solicitud, las secuencias de ácidos nucleicos y de aminoácidos de cada uno de hTLRs 1-10 se conocen en la técnica. Un experto en la técnica es capaz de utilizar las secuencias conocidas o fragmentos de las mismas con el objeto de generar un ensayo de hibridación para determinar si una célula tumoral particular está expresando los ácidos nucleicos de TLR. Por ejemplo, utilizando la secuencia conocida para un TLR particular, una persona experta en la técnica podría llevar a cabo un análisis de Northern blot para determinar si una célula tumoral está expresando ese TLR particular. Además, los ácidos nucleicos que codifican TLRs específicos o fragmentos de los mismos se pueden utilizar para generar polipéptidos de TLR. Los polipéptidos de TLR se pueden utilizar entonces para generar anticuerpos a un TLR específico. Un "fragmento" de ácido nucleico se define en la presente invención como una secuencia nucleotídica que comprende al menos 17, generalmente al menos 25, preferiblemente al menos 35, más preferiblemente al menos 45, y más preferiblemente al menos 55 o más nucleótidos contiguos. Las técnicas generales para la manipulación y expresión de ácido nucleico se describen generalmente, por ejemplo, en Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a ed.), 1989, Vols. 1 -3, Cold Spring Harbor Laboratory.

Producción del anticuerpo Los anticuerpos y fragmentos de los mismos que son específicos para TLRs se pueden utilizar ya sea en el paso de selección, para la selección de una célula que expresa TLR, en el paso de administración, para suministrar un ligando de TLR a un paciente, o en el paso de contacto, para inducir inhibición del crecimiento y apoptosis en una célula que expresa TLR, del método de la presente invención. Se pueden producir los fragmentos antigénicos (por ejemplo, inmunogénicos) de un TLR individual. Sin importar si se unen al ligando de TLRs, dichos fragmentos, como los receptores completos, son útiles como antígenos para la preparación de anticuerpos que se pueden unir a los receptores completos. Fragmentos más cortos pueden estar concatenados o unidos a un vehículo. Debido a que se sabe bien en la técnica que los epítopes generalmente contienen al menos aproximadamente cinco, preferiblemente al menos 8, residuos de aminoácidos [Ohno et al., Proc. Nati.

Acad. Sci. USA 82: 2945 (1985)], los argumentos utilizados para la producción de anticuerpos generalmente serán de al menos ese tamaño. Preferiblemente, éstos contendrán incluso más residuos, como se describió anteriormente. Si un fragmento dado es inmunogénico, ésto se puede determinar fácilmente mediante experimentación de rutina. Aunque generalmente no es necesario cuando se utilizan TLRs completos como antígenos para inducir la producción del anticuerpo en un hospedero inmunológicamente competente, preferiblemente los fragmentos antigénicos más pequeños se vuelven inicialmente más inmunogénicos mediante entrecruzamiento o concatenación, o mediante el acoplamiento a una molécula vehículo inmunogénica (por ejemplo, una macromolécula que tiene la propiedad de inducir independientemente una respuesta inmunológica en un animal hospedero). El entrecruzamiento o conjugación a una molécula vehículo se puede requerir debido a que los fragmentos polipeptídicos pequeños algunas veces actúan como haptenos (moléculas que son capaces de unirse específicamente a un anticuerpo pero son incapaces de inducir la producción del anticuerpo, por ejemplo, no son inmunogénicas). La conjugación de dichos fragmentos a una molécula vehículo inmunogénica las vuelve más inmunogénicas a través de lo que se conoce como el "efecto vehículo". Dichas moléculas vehículo incluyen, por ejemplo, proteínas y compuestos poliméricos naturales o sintéticos, tales como polipéptidos, polisacáridos, lipopolisacáridos, etc. las moléculas vehículo de proteína se prefieren especialmente, incluyendo, pero no limitadas a, hemocianina de lapa cerradura y proteínas de suero de mamífero, tales como gamaglobulina de humano o de bovino, albúmina de suero de humano, de bovino o de conejo, o derivados metílados u otros derivados de dichas proteínas. Serán evidentes otros vehículos de proteína a aquéllos expertos en la técnica. Preferiblemente, pero no necesariamente, el vehículo de proteína será externo al animal hospedero en el cual se desea inducir anticuerpos en contra de los fragmentos.

El acoplamiento covalente a la molécula vehículo se puede lograr utilizando métodos bien conocidos en la técnica, la elección exacta de los cuales será dirigida por la naturaleza de la molécula vehículo utilizada. Cuando la molécula vehículo inmunogénico es una proteína, los fragmentos de la invención se pueden acoplar, por ejemplo, utilizando carbodiimidas solubles en agua, tales como diciclohexilcarbodiimida o glutaraldehído. Los agentes de acoplamiento tales como éstos también se pueden utilizar para entrecruzar los fragmentos a sí mismos sin el uso de una molécula vehículo separada. Dicho entrecruzamiento hacia agregados también puede incrementar la inmunogenicidad. La inmunogenicidad también se puede incrementar mediante el uso de adyuvantes conocidos, solos o en combinación con el acoplamiento o la agregación. Los adyuvantes adecuados para la vacunación de animales incluyen, pero no se limitan a, Adjuvante 65 (que contiene aceite de cacahuate, monooleato de mannida y monoestearato de aluminio); adyuvante completo o incompleto de Freund; geles minerales, tales como hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio y alumbre; agentes tensioactivos, tales como hexadecilamina, octadecilamina, lisolecitina, bromuro de dimetildioctadecilamonio, N,N-dioctadecil-N',N'-bis(2-hidroximetil) propandiamina, metoxihexadecilglicerol y polioles plurónicos; polianiones, tales como pirano, dextrán sulfato, Poli IC, ácido poliacrílico y carbopol; péptidos, tales como muramil dipéptido, dimetilglicina y tuftsina; y emulsiones oleosas. Los polipéptidos también se podrían administrar después de la incorporación dentro de liposomas u otros microvehículos. La información que se refiere a adyuvantes y diversos aspectos de inmunoensayos se describe, por ejemplo, en la serie por P. Tijssen, Practice and Theory of Enzyme Immunoassays, 3a Edición, 1987, Elsevier, New York. Otras referencias útiles con referencia los métodos para la preparación de antisuero policlonal incluyen Microbiology, 1969, Hoeber Medical División, Harper y Row; Landsteiner, Specificity of Serological Reactions, 1962, Dover Publications, New York, y Williams, et al., Methods in Immunology and Immunochemistry, Vol. 1 , 1967, Academic Press, New York. El suero producido a partir de animales inmunizados utilizando métodos estándares se puede utilizar directamente, o la fracción de IgG se puede separar a partir del suero utilizando métodos estándares, tales como plasmaféresis o cromatografía de adsorción con adsorbentes específicos a IgG, tal como la proteína A inmovilizada. AlteARNtivamente, se pueden preparar los anticuerpos monoclonales. Los hibridomas que producen anticuerpos monoclonales en contra de los TLRs o de fragmentos antigénicos de los mismos se producen mediante técnicas bien conocidas. Usualmente, el proceso incluye la fusión de una línea celular inmortalizada con un linfocito B que produce el anticuerpo deseado. AlteARNtivamente, se pueden utilizar las técnicas no de fusión para la generación de líneas celulares inmortales que producen anticuerpo, por ejemplo, transformación inducida viralmente [Casali et al., Science 234: 476 (1986)]. Las líneas celulares inmortalizadas usualmente son células transformadas de mamífero, particularmente células de mieloma de origen de roedor, bovino, y humano. Más frecuentemente, se emplean las líneas celulares de mieloma de rata o de ratón como un asunto de conveniencia y disponibilidad. Se conocen bien las técnicas para la obtención de linfocitos productores de anticuerpo a partir de mamíferos inyectados con antígenos. Generalmente, los linfocitos de sangre periférica (PBLs) se utilizan si se emplean células de origen humano, o las células de bazo o células del nodulo linfático se utilizan a partir de fuentes de mamíferos no humanos. Un animal hospedero se inyecta con dosis repetidas del antígeno purificado (las células de humano son sensibilizadas in vitro), y al animal se le permite generar las células productoras de anticuerpo deseadas antes de que sean cosechadas para fusión con la línea celular inmortalizada. Las técnicas para fusión también se conocen bien en la técnica, y en general incluyen la mezcla de células con un agente para fusión, tal como polietilenglicol. Los hibridomas se seleccionan mediante procedimientos estándares, tales como selección por HAT (hipoxantina-aminopterina-timidina). Aquellos que secretan el anticuerpo deseado se seleccionan utilizando inmunoensayos estándares, tales como Western blot, ELISA (ensayo inmunosorbente asociado a enzima), RÍA (radioinmunoensayo), o los similares. Los anticuerpos se recuperaron a partir del medio utilizando técnicas estándares de purificación de proteína [Tijssen, Practice and Theory of Enzyme Immunoassays (Elsevier, Amsterdam, 1985)]. Muchas referencias están disponibles para proveer una guía en la aplicación de las técnicas anteriormente mencionadas [Kohler et al., Hybridoma Techniques (Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1980); Tijssen, Practice and Theory of Enzyme Immunoassays (Elsevier, Amsterdam, 1985); Campbell, Monoclonal Antibody Technology (Elsevier, Amsterdam, 1984); Hurrell, Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications (CRC Press, Boca Ratón, FL, 1982)]. Los anticuerpos monoclonales también se pueden producir utilizando sistemas bien conocidos de librería de fago. Véase, por ejemplo, Huse, et al., Science 246: 1275 (1989); Ward, et al., Nature, 347: 544 (1989). Los anticuerpos así producidos, sean policlonales o monoclonales, se pueden utilizar, por ejemplo, en una forma inmovilizada unida a un soporte sólido mediante métodos bien conocidos, para purificar los receptores mediante cromatografía por inmunoafinidad. También se pueden utilizar anticuerpos en contra de los fragmentos antigénicos, no marcados o marcados mediante métodos estándares, como la base para inmunoensayos de los TLRs. La marca particular utilizada dependerá del tipo de inmunoensayo. Los ejemplos de marcas que se pueden utilizar incluyen, pero no se limitan a, radiomarcas, tales como 32P, 125l, 3H y 14C; marcas fluorescentes, tales como fluoresceína y sus derivados, rodamina y sus derivados, dansilo y umbeliferona; quimioluminiscentes, tales como luciferina y 2,3-dihidroftalazindionas; y enzimas, tales como peroxidasa de rábano, fosfatasa alcalina, lisozima y glucosa-6-fosfato deshidrogenasa. Los anticuerpos se pueden marcar con dichas marcas mediante métodos conocidos. Por ejemplo, se pueden utilizar agentes de acoplamiento, tales como aldehidos, carbodiimidas, dimaleimida, imidatos, succinimidas, benzadina bisdiazotizada y los similares para marcar los anticuerpos con marcas fluorescentes, quimioluminiscentes o enzimáticas. Los métodos generales implicados se conocen bien en la técnica y se describen, por ejemplo, en Immunoassay: A Practical Guide, 1987, Chan (Ed.), Academic Press, Inc., Orlando, FL. Dichos inmunoensayos se podrían llevar a cabo, por ejemplo, sobre fracciones obtenidas durante la purificación de los receptores. Los anticuerpos de la presente invención también se pueden utilizar para identificar clonas particulares de ADNc que expresan los TLRs en sistemas de expresión de clonación. También se pueden utilizar los anticuerpos neutralizantes específicos para el sitio de unión al ligando de un receptor como antagonistas (inhibidores) para bloquear la unión al ligando. Dichos anticuerpos neutralizantes se pueden identificar fácilmente a través de experimentación de rutina, por ejemplo, mediante el uso de un ensayo de unión al radioligando descrito a continuación. El antagonismo de la actividad del TLR se puede alcanzar utilizando moléculas completas de anticuerpo, o fragmentos bien conocidos de unión al antígeno tales como los fragmentos Fab, Fc, F(ab)2, y Fv. Las definiciones de dichos fragmentos se pueden encontrar, por ejemplo, en Klein, Immunology (John Wiley, New York, 1982); Parham, capítulo 14, en Weir, ed. Immunochemistry, 4a Ed. (Blackwell Scientific Publishers, Oxford, 1986). El uso y generación de fragmentos de anticuerpo también se han descrito, por ejemplo: Fab fragments [Tijssen, Practice and Theory of Enzyme Immunoassays (Elsevier, Amsterdam, 1985)], fragmentos Fv [Hochman et al., Biochemistry 72: 1130 (1973); Sharon et al., Biochemistry 75: 1591 (1976); Ehriich et al., Patente de E.U.A. No. 4,355,023] y moléculas de la mitad del anticuerpo (Auditore-Hargreaves, Patente de E.U.A. No. 4,470,925). Se han descrito completamente los métodos para la elaboración de fragmentos recombinantes de Fv que se basan en secuencias conocidas de la región variable de la cadena pesada y ligera del anticuerpo, por ejemplo, por Moore et al. (Patente de E.U.A. No. 4,642,334) y por Plückthun [Bio/Technology 9: 545 (1991 )]. AlteARNtivamente, éstos se pueden sintetizar químicamente mediante métodos estándares. Los anticuerpos anti-idiotípicos, tanto policlonales como monoclonales, también se pueden producir utilizando los anticuerpos inducidos en contra de los receptores como antígenos. Dichos anticuerpos pueden ser útiles ya que pueden imitar a los receptores.

Composiciones farmacéuticas Los agonistas y antagonistas de TLR se pueden utilizar terapéuticamente para estimular o bloquear la actividad de un TLR, y por lo tanto para tratar cualquier condición médica ocasionada o mediada por el TLR. El régimen de dosis implicado en una aplicación terapéutica será determinado por el médico tratante, considerando diversos factores los cuales pueden modificar la acción de la sustancia terapéutica, por ejemplo, la condición, peso corporal, sexo y dieta del paciente, tiempo de administración, y otros factores clínicos. Los protocolos típicos para la administración terapéutica de dichas sustancias se conocen bien en la técnica. La administración de las composiciones farmacéuticas típicamente es mediante inyección parenteral, intraperitoneal, intravenosa, subcutánea, o intramuscular, o mediante infusión o mediante cualquier otro método sistémico aceptable. Frecuentemente, las dosis para tratamiento se titulan hacia arriba a partir de un nivel bajo para optimizar la seguridad y eficiencia. Generalmente, las dosis diarias caen dentro de un intervalo de aproximadamente 0.01 a 20 mg de proteína por kg de peso corporal. Típicamente, el intervalo de dosis será de aproximadamente 0.1 a 5 mg por kg de peso corporal. Las dosis se ajustarán para considerar para los tamaños moleculares más pequeños y posiblemente vidas medias disminuidas (tiempos de eliminación) después de la administración. No obstante, se apreciará por aquellos expertos en la técnica, que los antagonistas de TLR abarcan anticuerpos neutralizantes o fragmentos de unión de los mismos además de otros tipos de inhibidores, incluyendo moléculas orgánicas pequeñas y análogos inhibidores del ligando, los cuales se pueden identificar utilizando los métodos de la invención. Aunque las composiciones farmacéuticas se podrían administrar en solución simple, éstas se utilizan más típicamente en combinación con otros materiales tales como vehículos, preferiblemente vehículos farmacéuticos. Los vehículos farmacéuticos útiles pueden ser cualesquiera sustancias compatibles, no tóxicas adecuadas para administración de las composiciones farmacéuticas a un paciente. Se pueden incluir en un vehículo agua estéril, alcohol, grasas, ceras, y sólidos inertes. Los adyuvantes farmacéuticamente aceptables (agentes reguladores de pH, agentes para dispersión) también se pueden incorporar dentro de la composición farmacéuticas. Generalmente, se conocen bien las composiciones utilizadas para la administración parenteral de dichos fármacos, por ejemplo Remington's Pharmaceutical Science, 17a Ed. (Mack Publishing Company, Easton, PA, 1990). AlteARNtivamente, las composiciones farmacéuticas se pueden introducir dentro del cuerpo de un paciente mediante sistemas implantables de administración de fármaco [Urquhart et al., Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 24: 199 (1984)]. Las formulaciones terapéuticas se pueden administrar en muchas formulaciones de dosis convencionales. Las formulaciones típicamente comprenden al menos un ingrediente activo, junto con uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables. Las formulaciones pueden incluir aquellas adecuadas para administración oral, rectal, nasal o parenteral (incluyendo subcutánea, intramuscular, intravenosa e intradermal). Las formulaciones se pueden presentar de manera conveniente en formas de dosis unitarias y se pueden preparar mediante cualesquiera métodos bien conocidos en la técnica de farmacia. Véase, por ejemplo, Gilman et al. (eds.) (1990), The Pharmacological Bases of Therapeutics, 8a Ed., Pergamon Press; y Remington's Pharmaceutical Sciences, anteriormente mencionado, Easton, Penn.; Avis et al. (eds.) (1993) Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications Dekker, New York; Lieberman et al. (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets Dekker, New York; y Lieberman et al. (eds.) (1990), Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems Dekker, New York.

Terapias de combinación La efectividad de un ligando de TLR en la prevención o tratamiento del cáncer se puede mejorar mediante la administración del ligando en combinación con otro agente o tratamiento que es efectivo para el mismo propósito. Por ejemplo, se puede administrar un ligando de TLR en combinación con un agente quimioterapéutico o un tratamiento para el cáncer. Preferiblemente, el ligando de TLR es un agonista de TLR3. Un "agente quimioterapéutico" es un compuesto químico útil en el tratamiento del cáncer. Los ejemplos de agentes quimioterapéuticos incluyen agentes alquilantes, tales como tiotepa y ciclosfosfamida (CYTOXAN™); sulfonatos de alquilo, tales como busulfán, improsulfán y piposulfán; aziridinas, tales como benzodopa, carbocuona, meturedopa y uredopa; etileniminas y metilamelaminas, incluyendo altretamina, trietilenmelamina, trietilenfosforamida, trietilentiofosforamida y trimetilolomelamina; acetogeninas (especialmente bulatacina y bulatacinona); una camptotecina (incluyendo el análogo sintético topotecano); briostatina; calistatina; CC-1065 (incluyendo sus análogos sintéticos adozelesina, carzelesina y bizelesina); criptoficinas (particularmente criptoficina 1 y criptoficina 8); dolastatina; duocarmicina (incluyendo los análogos sintéticos, KW-2189 y CBI-TMI); eleuterobina; pancratistatina; una sarcodictiina; espongistatina; nitrógeno mostazas, tales como clorambucil, cloARNfazina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, clorhidrato de óxido de mecloretamina, melfalan, novembicina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida y uracilo mostaza; nitrosureas, tales como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina, ranimustina; antibióticos, tales como los antibióticos enediina (por ejemplo caliqueamicina, especialmente caliqueamicina gammal l y caliqueamicina phill , véase, por ejemplo, Agnew, Chem Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994); dinemicina, incluyendo dinemicina A; bisfosfonatos, tal como clodronato; una esperamicina; así como cromóforo neocarzinostatina y cromóforos antibióticos relacionados con la cromoproteína enediina, aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorubicina, detorubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorubicina (Adriamicina™) (incluyendo morfolino-doxorubicina, cianomorfolino-doxorubicina, 2-pirrolino-doxorubicina y deoxidoxorubicina), epirubicina, esorubicina, idarubicina, marcelomicina, mitomicinas, tales como mitomicina C, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina y zorubicina; anti-metabolitos, tales como metotrexato y 5-fluorouracilo (5-FU); análogos del ácido fólico tales como denopterina, metotrexato, pteropterina y trimetrexato; análogos de purina, tales como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina y tioguanina; análogos de pirimidina, tales como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, dideoxiuridina, doxifluridina, enocitabina y floxuridina; andrógenos, tales como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano y testolactona; anti-adrenales, tales como aminoglutetimida, mitotano y trilostano; reabastecedor del ácido fólico, tales como ácido frolínico; aceglatona; aldofosfamida glicósido; ácido aminolevulínico; eniluracilo; amsacrina; bestrabucil; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diaziquona; elfomitina; acetato de eliptinio; una epotilona; etoglúcido; nitrato de galio; hidroxiurea; lentinano; lonidamina; maitansinoides, tales como maitansina y ansamitocinas; mitoguazona; mitoxantrona; mopidamol; nitracrina; pentostatina; fenamet; pirarubicina; losoxantrona; ácido podofilínico; 2-etilhidrazida; procarbazina; PSK®; razoxano; rizoxina; sizofirano; espirogermanio; ácido tenuazónico; triaziquona; 2,2',2"-triclorotrietilamina; tricotecenos (especialmente toxina T-2, verracurina A, roridina A y anguidina); uretano; vindesina; dacarbazina; mannomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobromano; gacitosina; arabinosida ("Ara-C"); ciclofosfamida; tiotepa; taxoides, por ejemplo paclitaxel (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.) y doxetaxel (TAXOTERE®, Rhone-Poulenc Rorer, Antony, Francia); clorambucilo; gemcitabina (Gemzar™); 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; análogos de platino, tales como cisplatina y carboplatina; vinblastina; platino; etopósideo (VP-16); ifosfamida mitoxantrona; vincristina; vinorelbina (NavelbineT™); novantrona; tenipósido edatrexato; daunomicina; aminopterina; xeloda; ibandronato; CPT-11 inhibidor de la topoisomerasa RFS 2000; difluorometilomitina (DMFO) retinoides, tales como ácido retinóico; capecitabina; y sales farmacéuticamente aceptables, ácidos o derivados de cualesquiera de los anteriormente mencionados. También se incluyen en esta definición agentes anti-hormonales que actúan para regular o inhibir la acción hormonal sobre tumores, tales como anti- estrógenos y moduladores selectivos del receptor de estrógeno (SERMs), incluyendo, por ejemplo, tamoxifen (incluyendo Nolvadex™), raloxifen, droloxifen, 4-hidroxitamoxifen, trioxifen, keoxifen, LY117018, onapristona, y toremifen (Fareston™); inhibidores de la aromatasa que inhiben a la enzima aromatasa, la cual regula la producción de estrógeno en las glándulas adrenales, tales como, por ejemplo, 4(5)-imidazoles, aminoglutetimida, acetato de megestrol (Megace™), exemestano, formestano, fadrozol, vorozol (Rivisor™), letrozol (Femara™), y anastrozol (Arimidex™); y anti-andrógenos, tales como flutamida, nilutamida, bicalutamida, leuprolida y goserelina; y sales farmacéuticamente aceptables, ácidos o derivados de cualesquiera de los anteriormente mencionados. Un "tratamiento" para el cáncer incluye cirugía, para remover un cáncer, y tratamiento con radiación, para reducir o eliminar un cáncer o tumor. La efectividad de un ligando de TLR en la prevención o tratamiento del cáncer también se puede mejorar mediante la administración del ligando en combinación con una dosis baja del IFN tipo I. Por ejemplo, una dosis baja del IFN tipo I se encuentra en el intervalo de 1-3 MU, y preferiblemente 2 MU. Más preferiblemente, la dosis baja del IFN tipo I es menor de 1 MU. Preferiblemente, el ligando de TLR es un agonista de TLR3. Como se estableció anteriormente, el régimen de dosis implicado en una terapia de combinación será determinado por el médico tratante.

EJEMPLOS La presente invención se puede entender mejor mediante referencia a los siguientes ejemplos no limitantes, los cuales proveen un ejemplo de la invención. Los siguientes ejemplos se presentan con el objeto de ilustrar adicionalmente la invención, y no deben considerarse como limitantes del alcance de la invención. A menos que se indique de otra manera, los porcentajes dados para sólidos en mezclas sólidas, líquidos en soluciones líquidas, y sólidos en soluciones líquidas están en base p/p, vol/vol y p/vol, respectivamente. Las condiciones estériles generalmente se mantuvieron durante el cultivo celular.

Materiales y métodos generales Los métodos estándares se utilizaron, como se describió, por ejemplo, en Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1982, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press; Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (2a ed.), Vols 1-3, 1989, Cold Spring Harbor Press, NY; Ausubel et al., Biology, Greene Publishing Associates, Brooklyn, NY; o Ausubel, et al. (1987 y suplementos), Current Protocols in Molecular Biology, Greene/Wiley, New York; Innis et al. (eds.) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, 1990, Academic Press, N.Y.

Líneas celulares y reactivos Las líneas celulares de tumor de mama de humano, Cama-1 , SW527, BT-483 y MCF-7, se obtuvieron a partir del ATCC (Rockville, MD) y se cultivaron en DMEM F12 que contenía 4.5 g/mL de glucosa (Invitrogen, San Diego, CA) complementado con L-glutamina 2 mM (Life Technologies, Paisley Park, GB), 10% de suero de ternera fetal (Life Technologies), 160 µg/mL de gentalina (Schering Plough, Kenilworth, NJ), 2.5 mg/mL de bicarbonato de sodio (Life Technologies), aminoácidos (Invitrogen) y piruvato de sodio 1 mM (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO) (referido como medio completo). Se obtuvo el ácido poliinosínico-policitidílico, Poli IC, a partir de Invivogen (San Diego, CA). Se obtuvieron peptidoglicano (PGN) y lipopolisacárido (LPS) a partir del Sigma-Aldrich. El mAb que bloquea el receptor del IFN tipo I se obtuvo a partir de PBL Biochemical Laboratories (Piscataway, NJ) y el mAb que neutraliza el TNF-a se obtuvo a partir de Genzyme (Cambridge, MA). Los anticuerpos a Stati, Stati fosforilado (tirosina 701 ) y PKR se obtuvieron a partir de Cell Signaling (Beverly, MA). Los anticuerpos al IFN-ß de humano se obtuvieron a partir de R&D Systems (Minneapolis, MIN). Los anticuerpos a la subunidad p65 de NF-?B, TRAF6 y ß-tubulina se obtuvieron a partir de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). El inhibidor general de la caspasa z-VAD-fmk se obtuvo a partir de R&D Systems. La cicloheximida (CHX) se obtuvo a partir de Sigma-Aldrich. La muestra de tumor primario de mama de humano se obtuvo a partir del Centre León Berard (Lyon, Francia) de conformidad con los protocolos bioéticos del Hospital. Se obtuvo una suspensión de células particulares después de la digestión con colagenasa A (Sigma- Aldrich) y de los lavados y del enriquecimiento en células positivas al antígeno epitelial de humano (HEA) utilizando microglóbulos de HEA (Mylteni Biotech, Bergisch Gladbach, Alemania) de conformidad con las instrucciones del fabricante. La suspensión final de células particulares contenía más del 80% de células positivas a HEA y menos de 2% de contaminantes hematopoiéticos de CD4+.

Análisis de apoptosis La recuperación de células después de tratamiento con los ligandos de TLR se midió mediante tinción con cristal violeta (Sigma-Aldrich). Las células se sembraron a 104 células/pozo en placas de 96 pozos. Después de 72 horas de cultivo ya sea con o sin ligando de TLR, las células se lavaron con PBS, se fijaron en 6% de formaldehído (Sigma-Aldrich) por 20 minutos, se lavaron dos veces, y luego se tiñeron con 0.1 % de cristal violeta por 10 minutos. Después de los lavados y de la incubación en 1 % de SDS por 1 hora, se leyó la absorbancia a 605 nm en un lector de placas Vmax (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). La tinción con anexina V se llevó a cabo con un equipo para detección de apoptosis por anexina-FITC (BD Pharmingen, San Diego, CA) de conformidad con las instrucciones del fabricante. Las células sub-diploides se detectaron mediante tinción con 3 µg/mL de yoduro de propidio (Pl) (Molecular probes, Eugene, OR), después de una permeabilización durante toda la noche en 70% de etanol. La fluorescencia se analizó mediante citometría de flujo en un FACScalibur (Becton Dickinson, Mountain View, CA) equipado con un módulo de discriminación de dobletes y utilizando el software Cellquest Pro (Becton Dickinson).

Bioquímica Las células Cama-1 se usaron en regulador de pH que contenía 1 % de Nonidet-P40. Se cargaron 20 µg de proteína total por línea en geles de SDS-Poliacrilamida (Invitrogen). Se llevaron a cabo los Western Blot (WB) con técnicas estándares utilizando los anticuerpos anteriormente descritos. Los anticuerpos monoclonales anti IRAK-4 se generaron en el laboratorio de conformidad con el protocolo descrito en Fossiez et al., "T cell interleukin-17 induces stromal cells to produce proinflammatory and hematopoietic cytokines", J. Exp. Med., vol. 183 (6), pp. 2593-2603 (1996).

Secreción de citocina La secreción de IL-6 se midió en los sobrenadantes de cultivo mediante el ensayo estándar asociado a enzima (ELISA) utilizando un equipo DuoSet ELISA de conformidad con las instrucciones del fabricante (R&D Systems).

Experimentos con ARNsi Las células Cama-1 se sembraron en placas de 6 pozos a 3x105 células por pozo. Después de adherencia durante toda la noche, se llevaron a cabo las transfecciones de ARNsi por 5 horas en medio OptiMEM (Life technologies) que contenía 3 µ?g/mL de lipofectamine 2000 (Invivogen) y ARNsi 100 nM. Luego las células se lavaron y se cultivaron por 72 horas en medio completo antes del tratamiento con Poli IC y del análisis de la apoptosis. Los dúplex de ARNsi específicos para TLR3, PKR, IRAK-4, TRAF6 y p65 se obtuvieron a partir de Dharmacon (Lafayette, CO) como agrupamientos SMART. Los ARNsi de TRIF se obtuvieron a partir del mismo abastecedor que los oligodúplex particulares (5'- GCUCUUGUAUCUGAAGCAC-3') (SEQ ID NO: 23). Se ensayo la expresión de TLR3 y TRIF mediante PCR (35 ciclos: 1 minuto 94°C, 1 minuto 55°C, 2 minutos 72°C) con Taq PCR ReadyMix (Sigma-Aldrich) utilizando los siguientes iniciadores: 5'-AACGATTCCTTTGCTTGGCTTC-S' (hacia adelante) (SEQ ID NO: 24)/5'-GCTTAGATCCAGAATGGTCAAG-3'(reverso) (SEQ ID NO: 25) para TLR3 y 5'-ACTTCCTAGCGCCTTCGACA-S' (hacia adelante) (SEQ ID NO: 26)/5,-ATCTTCTACAGAAAGTTGGA-S' (reverso) (SEQ ID NO: 27) para TRIF. Se evaluó la expresión de PKR, IRAK-4, TRAF6 y p65 mediante WB como se describió anteriormente.

EJEMPLO 1 En esta serie de experimentos, se detectó la expresión de TLR para cada uno de los TLRs 1-10 con RT-PCR en seis líneas celulares de adenocarcinoma colorectal de humano. Las seis líneas celulares analizadas fueron Caco 2, LoVo, Coló 320 DM, SNU-C1 , T84 y Coló 205. Se extrajeron iguales cantidades de ARNm a partir de cada línea celular. El ARNm se amplificó subsecuentemente mediante PCR por 35 ciclos (30 segundos a 94°C, 45 segundos a 60°C, 90 segundos a 72°C) utilizando iniciadores específicos para hTLR. Se utilizaron los siguientes iniciadores: TLR1 F: caggatcaaggtacttgatcttc (SEQ ID NO: 1 ); TLR1 R: tttctctcatgaaggcaaatctg (SEQ ID NO: 2); TLR2F: ctcaggagcagcaagcactg (SEQ ID NO: 3); TLR2R: atcttccgcagcttgcagaag (SEQ ID NO: 4); TLR3F: aacgattcctttgcttggcttc (SEQ ID NO: 5); TLR3R: gcttagatccagaatggtcaag (SEQ ID NO: 6); TLR4F: ctcagaatgactttgcttgtac (SEQ ID NO: 7); TLR4R: gcaggacaatgaagatgatacc (SEQ ID NO: 8); TLR5F: cgaacctcatccacttatcag (SEQ ID NO: 9); TLR5R: gtgaactttagggactttaagac (SEQ ID NO: 10); TLR6F: ccaatgtacctgtgagctaag (SEQ ID NO: 11 ); TLR6R: ccactcactctggacaaagttg (SEQ ID NO: 12); TLR7F: ggatctgtctttcaattttgaac (SEQ ID NO: 13); TLR7R: ccaaggtctgcccatacttg (SEQ ID NO: 14); TLR8F: gctatccttgtgatgagaaaaag (SEQ ID NO: 15); TLR8R: gcattgaagcacctcggacag (SEQ ID NO: 16); TLR9F: actgtttcgccctctcgctg (SEQ ID NO: 17); TLR9R: gccagcacaaacagcgtcttg (SEQ ID NO: 18); TLR10F: ttgttcagagctgccaggaag (SEQ ID NO: 19); y TLR10R: gcaaagtagaattcataatggcac (SEQ ID NO: 20). Los productos de PCR se analizaron entonces en un gel de agarosa que se tiñó con bromuro de etidio. Los resultados de estos experimentos muestran que la línea celular Caco 2 expresó los TLRs 2, 5, 7 y 9. La línea celular LoVo expresó los TLRs 2, 3, 4, 5 y 6. La línea celular Coló 320 DM expresó los TLRs 5 y 6. La línea celular SNU-C1 expresó TLR 4. La línea celular T84 expresó los TLRs 4, 5 y 6. La línea celular Coló 205 expresó los TLRs 4, 5 y 6. Se llevó a cabo un análisis similar en ocho líneas celulares de pulmón de humano (NCl- H526, SHP-77, NCI-N417, A549, NCI-H358, A427, NCI-H292, NCI-M 87) y cuatro líneas celulares de cáncer de mama de humano (SW527, Cama-1 , BT483, MCF-7). Los resultados de estos experimentos muestran que la línea celular NCI-H526 (carcinoma pulmonar de célula pequeña) expresó los TLRs 2, 3, 5 y 9. La línea celular SHP-77 (variante de SCLC de célula grande) expresó los TLRs 4, 5, 6, 7, 9 y 10. La línea celular NCI-N417 (carcinoma pulmonar de célula pequeña) expresó TLR 5. La línea celular A549 (carcinoma pulmonar) expresó los TLRs 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7 y 10. La línea celular NCI-H358 (carcinoma bronquioloalveolar) expresó los TLRs 2, 4, 5, 6, 7 y 10. La línea celular A427 (carcinoma pulmonar) expresó los TLRs 2, 3, 5 y 6. La línea celular NCI-H292 (carcinoma pulmonar epidermoide) expresó los TLRs 1 , 2, 3, 4, 5, 6 y 10. La línea celular NCI-H 187 (carcinoma pulmonar de célula pequeña) expresó los TLRs 5, 6 y 10. La línea celular SW527 (adenocarcinoma de mama) expresó los TLRs 2, 4, 6 y 10. La línea celular Cama-1 (adenocarcinoma de mama) expresó los TLRs 2, 5, 6 y 10. La línea celular BT483 (adenocarcinoma de mama) expresó los TLRs 2, 4, 5, 6, 7, 9 y 10. La línea celular MCF-7 (adenocarcinoma de mama) expresó los TLRs 2, 5, 6 y 9. Es evidente que todas las líneas tumorales de humano evaluadas a partir de colon, mama y pulmón expresan numerosos transcritos de TLR. Sin embargo, existe una heterogeneidad sustancial debido a la cual los TLRs se expresan en cada línea celular y a su nivel de expresión.

EJEMPLO 2 Se analizaron cuatro líneas celulares de tumor de mama de humano, Cama-1 , SW527, BT483 y MCF-7, para muerte celular en respuesta a Poli IC. Las células se cultivaron por 72 horas con 5 µg/ml de PGN, 50 µg/ml de Poli IC o 10 µg/ml de LPS. Las células control se cultivaron con PBS. La citotoxicidad se evaluó mediante tinción con cristal violeta y se expresó como un porcentaje del control. En promedio, las células control exhibieron 100% de recuperación celular. Las células PGN exhibieron un promedio de 95% de recuperación celular. Las células tratadas con LPS exhibieron 95% de recuperación, en promedio. En promedio, las células tratadas con Poli IC exhibieron 67.5% de recuperación celular. Específicamente, las líneas celulares Cama-1 , SW527, BT483 y MCF-7 exhibieron recuperaciones celulares de 33%, 75%, 67% y 100%, respectivamente. Los datos muestran que Poli IC activa una disminución en la recuperación celular en tres de las líneas celulares evaluadas, Cama-1 , BT483 y SW527. Como se puede observar a partir de los datos, la línea celular Cama-1 exhibió de manera consistente la reducción más dramática.

Sin embargo, Poli IC no ocasionó una disminución en la recuperación celular en la línea celular MCF-7. Además, se evaluaron los ligandos adicionales de TLRs para determinar cualesquiera efectos posibles sobre la toxicidad celular. Los ligandos evaluados fueron PGN, LPS, Flagelina, R848 y CpG. Las células se cultivaron por 72 horas con 5 µg/ml de PGN, 10 µg/ml de LPS, 50 ng/ml de flagelina, 6 µg/ml de R848, 10 µg/ml de ADNs CpG, o con PBS como control. La recuperación celular se evaluó mediante tinción con cristal violeta y se expresó como un porcentaje del control. Ninguno de esos ligandos redujo significativamente la recuperación celular de cualesquiera de las cuatro líneas celulares de cáncer de mama (Cama-1 , BT483, SW527 y MCF-7). Aunque PGN no tuvo efecto sobre la recuperación celular, éste induce la secreción de IL-8 en ciertas líneas celulares, por lo tanto estableciendo que la ausencia de citotoxicidad no se debe a la ausencia de la activación por TLR.

EJEMPLO 3 Las células Cama-1 se analizaron para expresión del ARNm de TLR3 en respuesta a Poli IC. Las células Cama-1 se cultivaron en medio completo (DMEM F12 que contenía 4.5 g/mL de glucosa y estaba complementado con L-glutamina 2 mM, 10% de suero de ternera fetal, 160 µg/mL de gentalina, 2.5 mg/mL de bicarbonato de sodio) por 48 horas ya sea solo o con LPS (5 µg/ml) y/o con Poli IC (5 µg/ml). Se extrajo el ARNm a partir de cada grupo de células. Posteriormente el ARNm se retro-transcribió y se amplificó mediante PCR por 35 ciclos (como se mencionó anteriormente en el ejemplo 1 ) con iniciadores específicos para hTLR3: TLR3F: aacgattcctttgcttggcttc (SEQ ID NO: 5) y TLR3R: gcttagatccagaatggtcaag (SEQ ID NO: 6). El ARNm de TLR3 no se pudo amplificar a partir de las células Cama-1 en reposo. El ADN amplificado a partir de la RT-PCR utilizando los iniciadores específicos para hTLR3 se procesó en un gel. El gel mostró la expresión del TLR3 en el control positivo (plásmido TLR3), en células tratadas con Poli IC, y en células tratadas con tanto con Poli IC como con LPS. El gel no mostró la expresión del TLR3 en células tratadas ya sea con LPS o con nada (el control negativo). Los datos muestran que la expresión del ARNm de TLR3 se indujo por Poli IC en las células Cama-1 de carcinoma de mama de humano. Por lo tanto, el tratamiento con Poli IC sobre-regula la expresión de su receptor reconocido, TLR3, en ciertas líneas celulares tumorales. Por otra parte, el tratamiento con LPS no afecta la expresión del ARNm de TLR3 en células Cama-1.

EJEMPLO 4 Se analizaron dos líneas celulares, la línea celular de cáncer de colon LS174T y la línea celular de cáncer de mama Cama-1 , para muerte y cambios en el ciclo celular. Las células se cultivaron por 48 horas ya sea en la presencia o en la ausencia de Poli IC (5 µg/ml). Después de un pulso de 30 minutos con 1 µg/ml de bromodeoxiuridina (BrdU), las células se fijaron durante toda la noche a 4°C en 70% de etanol antes de teñir con anticuerpo monoclonal anti-BrdU acoplado a FITC y 3 µg/ml de yoduro de propidio. La muerte celular y el ciclo celular se analizaron mediante citometría de flujo (FACS). La incorporación de BrdU es una medida de la proliferación, mientras que la tinción con yoduro de propidio permite la cuantificación del contenido de ADN, en particular la población de células subdiploides que llevan a cabo apoptosis. Los datos muestran que el porcentaje de células LS174T que incorporaron BrdU fue de 27% antes del tratamiento a 9% después de un cultivo de 48 horas en la presencia de Poli IC. Contrariamente, el porcentaje de las células LS174T que tenían un contenido subdiploide de ADN fue de 3% antes del tratamiento a 23% después de un cultivo de 48 horas en la presencia de Poli IC, indicativo de una fuerte citotoxicidad del Poli IC. Los datos también muestran que el porcentaje de células Cama-1 que incorporaron BrdU fue de 15% antes del tratamiento a 2% después de un cultivo de 48 horas en la presencia de Poly IC. Contrariamente, el porcentaje de células Cama-1 que tenía un contenido subdiploide de ADN fue de 4% antes del tratamiento a 17% después de un cultivo de 48 horas en la presencia de Poli IC, indicativo de la apoptosis activada por Poli IC.

Estos datos indican que después del tratamiento por 48 horas con Poli IC, tanto las líneas celulares LS174T como Cama-1 detienen su división y llevan a cabo apoptosis.

EJEMPLO 5 Para investigar adicionalmente el efecto del tratamiento de Poli IC sobre las líneas celulares de cáncer de mama, se analizó la muerte celular en las células Cama-1 mediante la tinción con annexina V. Las células se cultivaron por 24 horas ya sea con o sin 5 µg/ml de Poli IC. La apoptosis se midió mediante la tinción con annexina V y citometría de flujo. Los datos muestran que más del 70% de las células Cama-1 se tiñeron con Annexina V, demostrando adicionalmente la apoptosis inducida por Poli IC. Los inventores también trataron de determinar las cinéticas de la apoptosis inducida por Poli IC. Las células Cama-1 se cultivaron ya sea con o sin 5 µg/ml o 50 ng/ml de Poli IC. El porcentaje de células apoptóticas (positivas a annexina) en el cultivo se midieron durante las siguientes 30 horas. Los datos muestran que las células no tratadas exhibieron 15% de apoptosis espontánea después de 30 horas. Sin embargo, 80% de las células tratadas con Poli IC exhibieron muerte celular. Específicamente, la apoptosis activada por Poli IC en células Cama-1 empezó 9 horas después de la adición de Poli IC y llegó hasta 80% de células apoptóticas después de 30 horas de tratamiento.

Cuando los inventores trataron de determinar el efecto que tiene Poli IC sobre las células de tumor primario de mama de humano. Se incubaron suspensiones recientemente recuperadas de células particulares tumorales ya sea con PBS o con Poli IC (50 µg/ml) por 48 horas. La apoptosis se midió mediante la tinción con Pl. El porcentaje representa la proporción de células con bajo contenido de ADN (células subG0/G1 ), por ejemplo, células apoptóticas. Los datos muestran que 19.5% de las células tratadas con PBS tuvieron un bajo contenido de ADN mientras que 38.6% de de las células tratadas con Poli IC tuvieron un bajo contenido de ADN. Por lo tanto, se observó un efecto citotóxico similar de Poli IC sobre las células de tumor primario de mama de humano.

EJEMPLO 6 TLR3 se analizó para su papel en la apoptosis inducida por Poli IC. Las células Cama-1 se transfectaron con ARNsi que correspondía ya sea a: una secuencia irrelevante (ARN de Ser; secuencia: ACUAGUUCACGAGUCACCUtt) (SEQ ID NO: 21 ), o hTLR3 (secuencia: CAGUGUUGAACCUUACCCAtt) (SEQ ID NO: 22). Se llevaron a cabo las transfecciones de ARNsi por 5 horas en 1 ml de medio OptiMEM™ que contenían 3 µg/ml de lipofectamine 2000 y ARNsi 100 nM. Luego las células se lavaron en solución salina con pH regulado con fosfato (PBS) y se cultivaron por 72 horas en medio completo antes del tratamiento subsecuente por 48 horas con 5 µg/mL de Poli IC. Luego se analizó el ciclo celular mediante FACS después de la tinción con bromuro de etidio, como se describe en el ejemplo 3. Los resultados de estos experimentos se muestran en las figuras 1A-1 D. Los datos muestran que una incubación 48 horas de células Cama-1 transfectadas con ARN irrelevante, mezclado en la presencia de Poli IC incrementa el porcentaje de células subdiploides de 2% a 45%. Sin embargo, una incubación de 48 horas de células Cama-1 transfectadas con ARNsi de hTLR3 en la presencia de Poli IC no incrementa el porcentaje de células subdiploides, el cual permaneció sin cambio a 3%. Estos datos demuestran que la señal apoptótica suministrada a las células Cama-1 por Poli IC requiere la expresión de TLR3.

EJEMPLO 7 Poli AU se analizó para sus efectos sobre la apoptosis. Las células Cama-1 se cultivaron por 48 horas ya sea con PBS o con concentraciones en incrementa de Poli AU que tenía un intervalo de 5 ng/ml a 50 µg/ml. la apoptosis se analizó mediante la medición del porcentaje de células positivas a annexina V. Los datos muestran que, de manera similar a Poli IC, Poly AU activa la apoptosis.

EJEMPLO 8 Los inventores analizaron el efecto de IFN sobre la apoptosis inducida por Poli IC in vivo. Los ratones con marca TRP expresan el antígeno SV40 T en el epitelio pigmentado retinal y típicamente desarrollan tumores oculares con penetración completa dentro de las primeras semanas de nacimiento. En estos experimentos, se trataron de catorce a dieciséis ratones TRP-Tag/IFNaß?R-/- por experimento (estos son ratones con marca TPR que han sido cruzados con ratones simultáneamente deficientes en el receptor para los interferones tipo I (IFNaßR) y el receptor para el interferón tipo II (IFN?R)) a los días 21 , 23, 25, 27 y 29 mediante inyecciones intravenosas ya sea de Poli IC (100 µg/dosis) o PBS. Las cinéticas del desarrollo tumoral visible del ojo se monitorearon 2-3 veces por semana. La aparición de los tumores oculares se retrasó por hasta 21 días en los ratones tratados con Poli IC en comparación con los ratones tratados con PBS. Puesto que los ratones utilizados en estos experimentos no tuvieron sistema de respuesta funcional al interferón, los datos muestran que la inhibición de crecimiento tumoral inducida por Poli IC es independiente del interferón tipo I y tipo II in vivo.

EJEMPLO 9 Con el objeto de determinar la ruta de toxicidad de la célula Cama-1 inducida por Poli IC, se utilizó el ARN de interferencia para subregular de manera eficiente la expresión de TRIF y PKR. Las células Cama-1 se sembraron en placas de 6 pozos a 3x105 células por pozo. Después de la adherencia durante toda la noche, las transfecciones con ARNsi se llevaron a cabo por 5 horas en medio OptiMEM (Life technologies) que contenía 3 µg/mL de lipofectamine 2000 (Invivogen) y ARNsi 100 nM. Las células se transfectaron ya sea SIN TRATAMIENTO (agua), ARNsi dúplex control mezclado (ser), ARNsi de TRIF o ARNsi de PKR. Los dúplex de ARNsi específicos para PKR se obtuvieron a partir de Dharmacon (Lafayette, CO) como agrupamientos SMART. El ARNsi de TRIF se obtuvo a partir del mismo abastecedor que los oligoduplex particulares 5'-GCUCUUGUAUCUGAAGCAC-S' (SEQ ID NO: 23). Se evaluó la expresión de TLR3 y TRIF mediante PCR (35 ciclos: 1 minuto 94°C, 1 minuto 55°C, 2 minutos 72°C) con Taq PCR ReadyMix (Sigma-Aldrich) utilizando los siguientes iniciadores: 5'-AACGATTCCTTTGCTTGGCTTC-S' (SEQ ID NO: 24) (hacia adelante)/5'-GCTTAGATCCAGAATGGTCAAG-S' (SEQ ID NO: 25) (reverso) para TLR3 y 5'-ACTTCCTAGCGCCTTCGACA-S' (SEQ ID NO: 26) (hacia adelante)/5'-ATCTTCTACAGAAAGTTGGA-S' (SEQ ID NO: 27) (reverso) para TRIF. La expresión de PKR se evaluó mediante Western Blot. Para el ARNm de TRIF, se llevó a cabo la PCR después de otras 24 horas de cultivo ya sea con o sin 5 µg/ml de Poli IC. Los datos muestran que el ARN de interferencia se utilizó para subregular de manera eficiente la expresión de TRIF y PKR. 72 horas después de la transfección con ARNsi, las células Cama-1 se cultivaron por otras 24 horas ya sea con o sin 5 µg/ml de Poli IC.

La apoptosis se midió mediante la tinción con annexina V y se expresó como un porcentaje de las células apoptóticas en cultivo. En promedio, 10% de las células control (SIN TRATAMIENTO y ser) que no se trataron llevaron a cabo apoptosis. En contraste, aproximadamente 75% de las células control (SIN TRATAMIENTO y ser) que se trataron con Poli IC llevaron a cabo apoptosis.

En los grupos con ARNsi de TRIF, las células no tratadas exhibieron 10% de células apoptóticas, mientras que las células tratadas con ARNsi de TRIF exhibieron 20% de células apoptóticas. Finalmente, en el grupo con ARNsi de PKR, las células no tratadas exhibieron 10% de células apoptóticas, mientras que las células tratadas con ARNsi de PKR exhibieron 80% de células apoptóticas. Por lo tanto, el tratamiento con ARNsi a TRIF virtualmente anuló la apoptosis inducida por Poli IC, mientras que la muerte celular se presentó normalmente en la ausencia de expresión de PKR. Estos datos claramente demuestran que la apoptosis inducida por Poli IC en las células Cama-1 es tanto mediana por ambos TLR3 y TRIF, como independiente de PKR.

EJEMPLO 10 Para investigar adicionalmente la citotoxicidad mediada por TLR3, se evaluó la participación de las moléculas de señalización IRAK-4 y TRAF6, ambos mediadores cascada abajo de la señalización de TLR. Las células Cama-1 se sembraron en placas de 6 pozos a 3x105 células por pozo. Después de adherencia durante toda la noche, se llevaron a cabo las transfecciones de ARNsi por 5 horas en medio OptiMEM (Life technologies) que contenía 3 µg/mL lipofectamine 2000 (Invivogen) y ARNsi 100 nM. Las células se transfectaron ya sea con ARNsi dúplex mezclado (ser) control, ARNsi de IRAK-4 o ARNsi de TRAF-6. Luego las células se lavaron y cultivaron por 72 horas en medio completo antes del tratamiento con Poli IC y del análisis de la apoptosis. Los dúplex de ARNsi específicos para IRAK-4 y TRAF6 se obtuvieron a partir del Dharmacon (Lafayette, CO) como agrupaciones SMART. Se analizó la expresión de IRAK-4 y TRAF6 mediante Western Blot. El Western Blot muestra que los ARNsi de IRAK-4 y TRAF6 suprimen la expresión de las proteínas correspondientes. 72 horas después de la transfección con ARNsi, las células Cama-1 se cultivaron por otras 24 horas ya sea con o sin 5 µg/ml de Poli IC. La apoptosis se midió mediante la tinción con annexina V y se expresó como un porcentaje de las células apoptóticas en cultivo. En promedio, 10% de las células control (ser) que no fueron tratadas llevaron a cabo apoptosis. En contraste, aproximadamente 75% de las células control (ser) que se trataron con Poli IC llevaron a cabo apoptosis. En los grupos con ARNsi de IRAK-4, los cultivos exhibieron solamente 20% de células apoptóticas, mientras que en los grupos con ARNsi de TRAF6, 75% de las células fueron apoptóticas al final del cultivo. En los grupos tratados con ARNsi de TRAF6, las células no tratadas exhibieron 15% de células apoptóticas, mientras que las células tratadas con ARNsi de TRAF6 exhibieron 75% de células apoptóticas. Los datos muestran que la inhibición de la expresión de IRAK-4 resultó en inhibición de la toxicidad celular mediada por TLR3. Sin embargo, la inhibición de la expresión de TRAF6 no resultó en inhibición de la toxicidad celular mediada por TLR3. Este hallazgo fue inesperado debido a que se piensa que TRAF6 se localiza cascada abajo de IRAK-4 en la ruta de señalización de TLR. Por lo tanto, esto sugiere que TLR3 podría señalizar vía IRAK-4 para activar una ruta apoptótica independiente de TRAF6. En paralelo, la concentración de IL-6 en los sobrenadantes de células Cama-1 transfectadas con ARNsi por 24 horas ya sea con o sin 5 µg/ml de Poli IC se determinó mediante ELISA. Los datos muestran que para el grupo ser, las células no tratadas y tratadas tuvieron concentraciones de IL-6 (pg/ml/106 células) de 10 y 110, respectivamente. En el grupo con ARNsi de IRAK-4, las células no tratadas y tratadas tuvieron concentraciones de IL-6 (pg/ml/106 células) de 10 y 40, respectivamente. En el grupo con ARNsi de TRAF6, las células no tratadas y tratadas tuvieron concentraciones de IL-6 (pg/ml/106 células) de 10 y 20, respectivamente. Estos datos muestran que ambos 1 RAK-4 y TRAF6 fueron requeridos para la producción de citocina.

EJEMPLO 11 Se evaluó la participación del interferón tipo 1 en la apoptosis mediada por TLR3. Las células Cama-1 se incubaron con 5 µg/ml de Poli IC ya sea por 0 horas, 1 hora, 6 horas, 18 horas o 24 horas. La presencia de IFN-ß, Stati fosforilada (tirosina 701 ) (P-Stat-1 ) y Stat-1 total en los lisados celulares se analizaron mediante Western Blot. Los datos muestran que la producción de IFN-ß Se indujo fuertemente después del tratamiento con Poli IC. También, se observó la fosforilación de Stati. Estas observaciones de muestran que la señalización del IFN tipo I se activó mediante Poli IC en las células Cama-1. De manera interesante, la fosforilación de Stati se presentó a un máximo después de 6 horas de tratamiento con Poli IC, cuando la producción de IFN-ß aún era difícilmente detectable. En otro experimento, las células Cama-1 se preincubaron por 1 hora con 20 µg/ml de cualquier mAb del receptor de IFN tipo I neutralizante (anti-IFN R1 ) o isotipo control (IgGI de ratón). Luego las células se cultivaron por 24 horas ya sea con o sin 5 µg/ml de Poli IC o con una mezcla de 1000 U/ml de cada uno de IFN-a o IFN-ß. La apoptosis se midió mediante la tinción con annexina V y se expresó como un porcentaje de células apoptóticas en el cultivo. En la ausencia de anticuerpo, las células no tratadas, tratadas con Poli IC y tratadas con IFNa/ß exhibieron 10%, 70% y 20% de células apoptóticas, respectivamente. En el grupo con mlgG1 , las células no tratadas, tratadas con Poli IC y tratadas con IFNa/ß exhibieron 10%, 70% y 20% de células apoptóticas, respectivamente. En el grupo con anti-IFN R1 , las células no tratadas, tratadas con Poli IC y tratadas con IFNa/ß exhibieron 10%, 30% y 15% de células apoptóticas, respectivamente. Los datos muestran que la neutralización de los receptores del IFN tipo I con un anticuerpo monoclonal específico redujo significativamente la apoptosis inducida por Poli IC. Esto demuestra que los IFNs tipo I son necesarios para la apoptosis mediada por TLR3. El tratamiento de las células Cama-1 con una mezcla de IFNa y IFNß no fue capaz de inducir una apoptosis significativa. Esto muestra que la señalización del IFN tipo I fue necesaria para la citotoxicidad activada por TLR3, pero no es una adecuada para inducir sola la muerte celular.

EJEMPLO 12 Los inventores trataron de determinar si TNF-a desempeña un papel en la apoptosis mediada por TLR3. Las células Cama-1 se preincubaron ya sea con o sin 20 µg/ml de mAb anti TNF-a neutralizante o 10 µg/ml de CHX. Luego las células se cultivaron ya sea con o sin 5 µg/ml de Poli IC o 25 ng/ml de TNF-a. La apoptosis se midió mediante la tinción con annexina V y se expresó como un porcentaje de las células apoptóticas en cultivo. En la ausencia de anticuerpo, las células no tratadas, tratadas con Poli IC y tratadas con TNF-a exhibieron 10%, 70% y 40% de células apoptóticas, respectivamente. En el grupo con mAb anti-TNF-a, las células no tratadas, tratadas con Poli IC y tratadas con TNF-a exhibieron 10%, 65% y 10% de células apoptóticas, respectivamente. En el grupo con CHX, las células no tratadas, tratadas con Poli IC y tratadas con TNF-a exhibieron 15%, 40% y 70% de células apoptóticas, respectivamente. Los datos muestran que un anticuerpo anti-TNF-a neutralizante, el cual protegió a las células Cama-1 de la apoptosis inducida por TNF-a, no tuvo efecto sobre la muerte celular activada por Poli IC. Por lo tanto, TNF-a no desempeña un papel en la apoptosis mediada por TLR3. Como se estableció anteriormente, las células Cama-1 se pretrataron con el inhibidor transcripcional general CHX, el cual se sabe que sensibiliza a las células a la apoptosis inducida por TNF-a mediante el bloqueo del programa de supervivencia controlado por NFKB. Los datos muestran que CHX significativamente sensibilizó a las células Cama-1 para la apoptosis inducida por TNF-a. En contraste, CHX protegió parcialmente a las células en contra de la apoptosis inducida por Poli IC. Esto confirma que diferentes mecanismos fueron activados por estos dos estímulos pro-apoptóticos. El ARN de interferencia se utilizó entonces para evaluar la participación de NFKB en la apoptosis mediada por TLR3. Las células Cama-1 transfectadas 72 horas antes con ARNsi a p65 o con el dúplex mezclado control (ser) se cultivaron por 24 horas ya sea con o sin 50 ng/ml o 5 µg/ml de Poli IC. La extinción de la expresión de la proteína p65 antes de tratamiento con Poli IC se evaluó mediante Western Blot. La apoptosis se midió mediante la tinción con annexina V. Los resultados se expresaron como un porcentaje de las células apoptóticas en cultivo. En el grupo con ser, las células no tratadas, tratadas con Poli IC (50 ng/ml) y tratadas con Poli IC (5 µg/ml) exhibieron 10%, 20% y 70% de células apoptóticas, respectivamente. En el grupo con ARNsi de p65, las células no tratadas, tratadas con Poli IC (50 ng/ml) y tratadas con Poli IC (5 µg/ml) exhibieron 10%, 10% y 20% de células apoptóticas, respectivamente. Los datos muestran que la inhibición de la expresión de NFKB p65 por ARNsi llevó a una protección significativa en contra de la toxicidad celular inducida por Poli IC. Esto confirma el papel pro-apoptótico de NF/cB en la apoptosis activada por Poli IC. Colectivamente, estos resultados demuestran que la secreción de TNF-a no es responsable de la apoptosis inducida por Poli IC. Además, estos resultados demuestran un papel pro- apoptótico de NFKB en la apoptosis mediada por TLR3, lo cual contrasta con su efecto anti-apoptótico después del tratamiento con TNF.

EJEMPLO 13 A continuación los inventores se enfocaron en el papel de las caspasas en la apoptosis. Las células Cama-1 se preincubaron con 25 µM del inhibidor general de caspasa z-VAD-fmk o DMSO por 1 hora antes del cultivo por 24 horas con o sin 5 µg/ml de Poli IC o 25 ng/ml de TNF-a (utilizado como un control positivo). La apoptosis se midió mediante la tinción con annexina V y se expresó como un porcentaje de célula apoptótica en el cultivo. En el grupo con DMSO, las células no tratadas, tratadas con Poli IC y tratadas con TNF-a exhibieron 10%, 70% y 40% de células apoptóticas, respectivamente. En el grupo con z-VAD-fmk, las células no tratadas, tratadas con Poli IC y tratadas con TNF-a exhibieron 10%, 30% y 10% de células apoptóticas, respectivamente. Los datos muestran que la inhibición de la actividad de caspasa mediante el inhibidor amplio de caspasa z-VAD-fmk redujo en gran medida la apoptosis inducida por Poli IC. Esto sugiere un papel principal para las caspasas en la citotoxicidad activada por TLR3. En otro experimento, se analizaron los utilizados a partir de células anteriormente obtenidas mediante Western Blot para la escisión de PARP, caspasa 3 y caspasa 8.

Los datos muestran que la escisión de PARP, una característica clave de la apoptosis dependiente de caspasa, se presentó en las células Cama-1 después del tratamiento con Poli IC. Esto confirma la participación de las caspasas en la apoptosís mediada por TLR3. De hecho, la caspasa 3 se activó después del tratamiento con Poli IC, como se evidenció por análisis de Western Blot.

EJEMPLO 14 Los inventores intentaron investigar si existía cualquier sinergia entre los ligandos TLR3 e IFN tipo I. Las células de carcinoma primario de mama SKBr3 se sembraron en placas de 6 pozos a 3x105 células por pozo. Después de adherencia durante toda la noche, las transfecciones con ARNsi se llevaron a cabo por 5 horas en medio OptiMEM (Life technologies) que contenía 3 µg/ml de lipofectamine 2000 (Invivogen) y ARNsi 100 nM. Las células se transfectaron ya sea SIN TRATAMIENTO (agua), ARNsi de TLR3 o ARNsi de PKR. Luego las células se lavaron y cultivaron por 72 horas en medio completo antes de las 24 horas de tratamiento con 50 µg/ml de Poli IC y del análisis de la apoptosis. En el grupo SIN TRATAMIENTO, las células no tratadas y tratadas con Poli IC (50 µg/ml) exhibieron 10% y 22% de células apoptóticas, respectivamente. En el grupo con ARNsi de TLR3, las células no tratadas y tratadas con Poli IC (50 µg/ml) exhibieron 8% y 13% de células apoptóticas, respectivamente. En el grupo con ARNsi de PKR, las células no tratadas y tratadas con Poli IC (50 µg/ml) exhibieron 12% y 22% de células apoptóticas, respectivamente. Los datos muestran que la línea celular de adenocarcinoma de mama SKBr3 llevó a cabo apoptosis parcial cuando se trató con Poli IC.

Además, los datos muestran que el pretratamiento de las células con ARNsi de TLR3 suprimió la apoptosis, mientras que ARNsi de PKR no tuvo un efecto protector. En otro experimento, los inventores trataron de determinar si IFN y Poli IC actúan de manera sinergística para inducir la apoptosis. Las células SKBr3 no se trataron o se pretrataron ya sea con 10 U/ml o 100 U/ml de una mezcla a dosis baja de IFN-a o IFN-ß. Poli IC se administró en las siguientes dosis: 0, 0.5, 5 y 50 µg/ml por 48 horas. Los datos muestran que en el grupo no tratado con Poli IC group, las células no tratadas, tratadas con IFN-a/ß (10 U/ml) y tratadas con IFN-a/ß (100 U/ml) exhibieron 10%, 14% y 22% de células apoptóticas, respectivamente. En el grupo con 0.5 µg/ml de Poli IC, las células no tratadas, tratadas con IFN-a/ß (10 U/ml) y tratadas con IFN-a/ß (100 U/ml) exhibieron 15%, 45% y 55% de células apoptóticas, respectivamente. En el grupo con 5 µg/ml de Poli IC, las células no tratadas, tratadas con IFN-a/ß (10 U/ml) y tratadas con IFN-a/ß (100 U/ml) exhibieron 20%, 55% y 60% de células apoptóticas, respectivamente. En el grupo con 50 µg/ml de Poli IC, las células no tratadas, tratadas con IFN-a/ß (10 U/ml) y tratadas con IFN-a/ß (100 U/ml) exhibieron 20%, 55% y 60% de células apoptóticas, respectivamente. Por lo tanto, IFN fue capaz de actuar de manera sinergística con Poli IC para inducir la apoptosis. Esta sinergia tuvo dos manifestaciones: 1 ) cuando las células pretratadas SKBr3 se volvieron sensibles a la apoptosis inducida por Poli IC a concentraciones que fueron un ciento de veces menores que las células no pretratadas; y 2) el porcentaje de células SKBr3 que fueron inducidas a apoptosis por Poli IC se incrementó de 22% a 66% después del pretratamiento con IFN tipo I. En conclusión, el pretratamiento con IFN tipo I sensibiliza a las células de adenocarcinoma de mama SKBr3 a la apoptosis inducida por Poli IC mediada por TLR3. Por lo tanto, el pretratamiento de pacientes con cáncer de mama, bajas dosis de IFN tipo I no solamente incrementa la eficiencia del tratamiento con Poli IC, sino que también permite el reclutamiento de pacientes que de otra manera no tendrían el beneficio de Poli IC. Los pacientes también se podrían tratar antes de la cirugía con dosis bajas del IFN tipo I para incrementar el porcentaje de tumores que serán evaluados como positivos mediante immuno-histología sobre las biopsias, y que responderían a los ligandos TLR3. Además, la combinación de una dosis baja del IFN tipo I y una dosis baja del Poli IC puede ser más efectiva que una dosis mayor de Poli IC solo. Esta combinación también puede reducir el riesgo de efectos laterales.

Claims (31)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- El uso de un ligando de TLR, en la elaboración de un medicamento útil para el tratamiento del cáncer en un paciente que tiene un cáncer que expresa TLR.

2.- El uso que se reclama en la reivindicación 1 , en donde dicho ligando es un agonista o un antagonista.

3.- Un método in vitro para la inducción de apoptosis de una célula tumoral que expresa TLR que comprende: poner en contacto a dicha célula tumoral con un ligando de TLR en una cantidad efectiva para inducir apoptosis en dicha célula.

4.- El método in vitro de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado además porque dicho ligando es un agonista o un antagonista.

5.- El uso de un ligando de TLR, en la elaboración de un medicamento útil para el tratamiento del cáncer en un paciente que tiene un cáncer que expresa TLR3.

6.- El uso que se reclama en la reivindicación 5, en donde dicho ligando es un agonista o un antagonista.

7.- El uso que se reclama en la reivindicación 6, en donde dicho agonista es Poli IC.

8.- El uso que se reclama en la reivindicación 6, en donde dicho agonista es Poli AU.

9.- El uso que se reclama en la reivindicación 6, en donde dicho antagonista es un anticuerpo o fragmento del mismo.

10.- El uso que se reclama en la reivindicación 5, en donde dicho cáncer que expresa TLR3 es cáncer de mama.

11.- El uso que se reclama en la reivindicación 5, en donde dicho cáncer que expresa TLR3 es cáncer de colon.

12.- El uso que se reclama en la reivindicación 5, en donde el medicamento se adapta para ser administrable adicionalmente con un agente quimioterapéutico o un tratamiento para el cáncer.

13.- El uso que se reclama en la reivindicación 5, en donde el medicamento se adapta para ser administrable adicionalmente en una dosis baja del IFN tipo I.

14.- Un método in vitro para la inducción de apoptosis de una célula tumoral que expresa TLR3 que comprende: poner en contacto a dicha célula con un ligando de TLR3 en una cantidad efectiva para inducir apoptosis en dicha célula.

15.- El método in vitro de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado además porque dicho ligando es un agonista o un antagonista.

16.- El método in vitro de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado además porque dicho agonista es Poli IC.

17.- El método in vitro de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado además porque dicho agonista es Poli AU.

18.- El método in vitro de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado además porque dicho antagonista es un anticuerpo o fragmento del mismo.

19.- El método in vitro de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado además porque dicha célula tumoral que expresa TLR3 es una célula de cáncer de mama.

20.- El método in vitro de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado además porque dicha célula tumoral que expresa TLR3 es una célula de cáncer de colon.

21.- El uso de un ligando TLR, en la elaboración de un medicamento útil para inducir apoptosis de una célula tumoral que expresa TLR.

22.- El uso que se reclama en la reivindicación 21 , en donde dicho ligando es un agonista o un antagonista.

23.- El uso de un ligando TLR3, en la elaboración de un medicamento útil para inducir apoptosis de una célula tumoral que expresa TLR3.

24.- El uso que se reclama en la reivindicación 23, en donde dicho ligando es un agonista o un antagonista.

25.- El uso que se reclama en la reivindicación 24, en donde dicho agonista es Poli IC.

26.- El uso que se reclama en la reivindicación 24, en donde dicho agonista es Poli AU.

27.- El uso que se reclama en la reivindicación 24, en donde dicho antagonista es un anticuerpo o fragmento del mismo.

28.- El uso que se reclama en la reivindicación 23, en donde dicha célula tumoral que expresa TLR3 es una célula cancerígena de mama.

29.- El uso que se reclama en la reivindicación 23, en donde dicha célula tumoral que expresa TLR3 es una célula cancerígena de colon.

30.- El uso que se reclama en la reivindicación 23, en donde el medicamento se adapta para ser administrable adicionalmente con un agente quimioterapéutico o un tratamiento para el cáncer.

31.- El uso que se reclama en la reivindicación 23, en donde el medicamento se adapta para ser administrable adicionalmente en una dosis baja del IFN tipo I.