CN105440119A - 混杂地结合于人类白细胞抗原(hla)ii类分子的肿瘤相关肽 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及免疫治疗方法，以及用于免疫治疗方法中的分子与细胞。本发明特别涉及肿瘤的免疫治疗方法。本发明更进一步涉及T辅助细胞肽抗原表位-单独或与其它癌症细胞肽结合而作为疫苗混合物的活性药物成分以刺激抗肿瘤的免疫反应。本发明特别涉及衍生自人类肿瘤细胞株的HLA(人类白细胞抗原)II类分子的49种新型肽序列，所述肽可用于诱发抗癌免疫反应的疫苗组合物中。

Description

混杂地结合于人类白细胞抗原(HLA)II类分子的肿瘤相关肽
本申请是2006年9月5日提交的、申请号为200680038365.7、发明名称为“混杂地结合于人类白细胞抗原(HLA)II类分子的肿瘤相关肽”的中国发明专利申请的分案申请。
描述
本发明涉及免疫治疗方法，及用于免疫治疗方法中的分子与细胞。特别的是，本发明涉及肿瘤的免疫治疗方法。本发明更进一步涉及T辅助细胞肽的抗原表位-其单独或与其它癌症细胞相关肽结合而作为疫苗组合物的活性药物成分，所述活性药物成分刺激抗肿瘤的免疫反应。尤其是，本发明涉及衍生自人类肿瘤细胞系上的人类白细胞抗原(HLA)II类分子的49种新型肽序列，所述肽序列可用于引发抗肿瘤免疫反应的疫苗组合物中。
本文此处所提及所有参考文献均以参考的方式以其全文并入本文。
发明背景
免疫反应的诱发是依赖被宿主免疫系统视为外来物的抗原存在。癌症相关抗原的发现已使得藉宿主免疫系统反应干扰肿瘤生长成为可能。目前利用不同的机制控制包括免疫系统的体液的与细胞的抗癌免疫机制正被研究。
细胞性免疫反应的特异性成份可以特异性识别与摧毁癌症细胞。由癌细胞浸润的细胞群中或由周边血液分离出的细胞毒性T细胞暗示着这些细胞在自然抗癌免疫反应中起重要作用(Cheeveretal.,AnnalsN.Y.Acad.Sci.1993690:101-112)。特别是CD8-阳性T细胞(TCD8+)，它可识别I类主要组织相容性复合体(MHCClassI)-所携带来自细胞质蛋白质的通常为8至10个残基的肽，在前述免疫反应中扮演重要角色。人类的主要组织相容性复合体分子(MHC)又被称为人类白细胞抗原(HLA)。
有两种主要组织相容性复合体分子(MHC)：MHCI类分子(MHCclassI)，可于大多数呈现经由降解内源性蛋白质与较大肽的有核细胞中发现。MHCII类分子(MHCclassII)仅于专职抗原提呈细胞(APC)，提呈被APC经内吞作用所得外来蛋白质的肽，并被后续处理。肽与MHCI类分子的复合物可被CD8阳性的细胞毒性T细胞所识别，肽与MHCII类分子的复合物可被CD4阳性的辅助性T细胞所识别。
CD4阳性的辅助性T细胞在指导抗癌T细胞反应的有效功能上扮演重要角色，因此，肿瘤相关抗原(TAA)衍生的CD4阳性的T细胞抗原表位的鉴别可能对于开发诱发抗癌免疫反应的药学产品有极大的重要性(Kobayashi,H.,R.Omiya,M.Ruiz,E.Huarte,P.Sarobe,J.J.Lasarte,M.Herraiz,B.Sangro,J.Prieto,F.Borras-Cuesta,andE.Celis.2002.IdentificationofanantigenicepitopeforhelperTlymphocytesfromcarcinoembryonicantigen.Clin.CancerRes.8:3219-3225.,Gnjatic,S.,D.Atanackovic,E.M.Matsuo,A.Selvakumar,N.K.Altorki,R.G.Maki,B.Dupont,G.Ritter,Y.T.Chen,A.Knuth,andL.J.Old.2003.SurveyofnaturallyoccurringCD4+T-cellresponsesagainstNY-ESO-1incancerpatients:Correlationwithantibodyresponses.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.100(15):8862-7)。
在如小鼠等哺乳动物模式中显示，即便无细胞毒性T细胞(亦即CD8阳性T细胞)，CD4阳性T细胞仍可藉由分泌INF-γ抑制血管生成而足以抑制肿瘤形成(Qin,Z.andT.Blankenstein.2000.CD4+T-cell-mediatedtumorrejectioninvolvesinhibitionofangiogenesisthatisdependentonIFNgammareceptorexpressionbynonhematopoieticcells.Immunity.12:677-686)。此外，CD4阳性T细胞识别的由人类白细胞抗原II类分子所提呈的肿瘤相关抗原肽能够通过抗体(Ab)反应的诱导来对抗肿瘤的发展(Kennedy,R.C.,M.H.Shearer,A.M.Watts,andR.K.Bright.2003.CD4+Tlymphocytesplayacriticalroleinantibodyproductionandtumorimmunityagainstsimianvirus40largetumorantigen.CancerRes.63:1040-1045)。相对于肿瘤相关肽结合于人类白细胞抗原I分子，至今仅有少数TAA的人类白细胞抗原II类配体(ligand)被描述(www.cancerimmunity.org,www.syfpeithi.de)。因为HLAII的组成性表达多局限于免疫系统的细胞(Mach,B.,V.Steimle,E.Martinez-Soria,andW.Reith.1996.RegulationofMHCclassIIgenes:lessonsfromadisease.Annu.Rev.Immunol.14:301-331)，所以直接由原始肿瘤分离出可与人类白细胞抗原II结合的肽被认为是不可能的。因此，许多将抗原靶向APC的人类白细胞抗原II类处理途径的策略已经被发掘，例如：将感兴趣的抗原与APC一起培育，以致抗原被吸收、处理与提呈(Chaux,P.,V.Vantomme,V.Stroobant,K.Thielemans,J.Corthals,R.Luiten,A.M.Eggermont,T.Boon,andB.P.vanderBruggen.1999.IdentificationofMAGE-3epitopespresentedbyHLA-DRmoleculestoCD4(+)Tlymphocytes.J.Exp.Med.189:767-778)，或将能编码感兴趣的抗原的基因或微基因转染细胞，以及融合入不变链–此不变链可介导抗原转移位置至溶酶体的MHCII类处理及装配的隔室(MIIC)。
肽必须与MHC分子结合才能引发(产生)细胞免疫反应。这个过程是有赖于MHC分子的等位基因与肽氨基酸序列的特异多态性。结合于MHCI类分子的肽通常有8至10个残基长度且具有两个保守性残基(“锚”)可与MHC分子上相对应的结合槽交互作用。
当无炎症反应时，MHCII类分子的表达主要局限于免疫系统的细胞，特别是专职的抗原呈现细胞(APC)，如：单核细胞、单核细胞衍生细胞、巨噬细胞与树突细胞。
可为特异抗肿瘤的细胞毒性T淋巴细胞所识别的抗原，亦即它们的抗原表位，可以是来自所有各类蛋白质的分子，例如酶、受体、转录因子等等。更近一步，举例来说，肿瘤相关抗原如：突变基因、不同的开放阅读框(openreadingframes)，或蛋白质剪接的产物(VigneronN,StroobantV,ChapiroJ,OomsA,DegiovanniG,MorelS,vanderBruggenP,BoonT,VandenEyndeBJ.Anantigenicpeptideproducedbypeptidesplicingintheproteasome.Science.2004Apr23；304(5670):587-90.)可只存在于肿瘤细胞。另一类重要的癌症相关抗原是组织特异的结构，如表达于不同种类的肿瘤细胞或于睾丸正常组织的CT(癌睾丸)抗原。
各样的肿瘤相关抗原已经被发现。更甚者，更多的研究力量致力于发现其它癌症相关基因。某些类的肿瘤相关抗原，在本领域被称为肿瘤特异性抗原，是组织特异的。相关例子包含，但不限于，黑色素细胞瘤的酪胺酸酶，前列腺癌的PSA与PSMA以及淋巴瘤的bcr与abl的染色体互换。然而许多肿瘤相关抗原在多种不同肿瘤所发现，且有些如致癌基因的蛋白质产物以及/或抑癌基因(抑癌基因如此篇评论肾癌LinehanWM,WaltherMM,ZbarB.Thegeneticbasisofcancerofthekidney.JUrol.2003Dec；170(6Pt1):2163-72)是真正导致转型的因素，而这几乎发生在所有种类的肿瘤。例如，控制细胞成长与分化的正常细胞蛋白质，如p53(本身是肿瘤抑制基因的例子)、ras、c-met、myc、pRB、VHL与HER-2/neu等，可因这些基因产物的过度表达累积突变而使他们具致癌性(McCartey等人CancerResearch199815:582601-5；Disis等人CibaFound.Symp.1994187:198-211)。在许多癌症中，这些突变蛋白质可作为肿瘤特异免疫反应的靶标。
为了让细胞毒性T细胞能将这些蛋白质识别为肿瘤特异抗原并用于治疗，必须符合特殊的需求。抗原必须主要表达于肿瘤细胞而非正常健康的组织或是相对少量。更近一步的条件，各自的抗原不只是表达于单一种类肿瘤，且要以高浓度形式表达(如每个细胞的份数)。最基本的是抗原氨基酸序列上需有抗原表位，因为这种来自一肿瘤相关抗原肽(“产生免疫反应的肽”)应该会引发活体中或离体中的T细胞反应。
直到目前，已有许多策略描述将标的抗原送入II类处理通路中。将抗原呈现细胞与感兴趣的抗原一起孵育以使之被带入细胞并处理是可能的(Chaux,P.,Vantomme,V.,Stroobant,V.,Thielemans,K.,Corthals,J.,Luiten,R.,Eggermont,A.M.,Boon,T.&vander,B.P.(1999)J.Exp.Med.189,767-778)。其他方法使用包含分解微粒的标的序列的融合蛋白。这种融合蛋白表现于抗原呈现细胞，可将抗原带至II类处理隔室(Marks,M.S.,Roche,P.A.,vanDonselaar,E.,Woodruff,L.,Peters,P.J.&Bonifacino,J.S.(1995)J.CellBiol.131,351-369,Rodriguez,F.,Harkins,S.,Redwine,J.M.,dePereda,J.M.&Whitton,J.L.(2001)J.Virol.75,10421-10430)。
T辅助细胞在指挥细胞毒性T细胞的抗癌免疫反应中扮演重要角色。启动TH1形式的T辅助细胞反应其T辅助细胞的抗原表位支持著CD8阳性毒杀T细胞的功能，这包含直接针对在细胞表面表现肿瘤相关肽与MHC分子复合体的肿瘤细胞的毒杀功能。以此方式，不管是单独存在或与其他肿瘤相关肽结合的肿瘤相关T辅助细胞的肽抗原表位，可作为疫苗的活性药物成分以刺激抗肿瘤的免疫反应产生。
发展肿瘤疫苗的主要难题是找出新的肿瘤相关抗原，并对由该抗原所得到的可引发免反应且可被CD4阳性的CTL所识别的T辅助细胞的抗原表位定性。因此，本发明的目标就是为此种肽提供新的氨基酸序列，该肽具有与MHCII类分子结合的能力。依据本发明，其目标藉由提供选自至少包含附件所列序列群的SEQIDNo.1至SEQIDNo.49序列的肿瘤相关肽，这些肽具有结合至人类主要组织相容性复合体(MHC)I类分子的能力，只要该肽不是完整的人类肿瘤相关多肽。
于本发明中，本发明人展示直接由哺乳类肿瘤分离并定性可结合于HLAII类II类分子上的肽是可能的，尤其是实体瘤，如肾细胞癌与结肠癌。
本发明提供源自于与肿瘤生成相关抗原的肽，以及与HLAII类分子结合后足以触发人类白细胞(尤其是淋巴细胞，特别是T淋巴细胞中可介导TH1免疫反应的CD4阳性的T淋巴细胞)的免疫反应。该类源自于与肿瘤生成相关抗原的肽，尤其是指具有蛋白质水解、血管生成、细胞生长、细胞周期调控、细胞分裂、转录调控、转译调控，或组织侵入(如来自基质金属蛋白酶-7的肿瘤相关肽(MMP7；SEQIDNo.1)以及胰岛素样生长因子结合蛋白3(IGFBP3；SEQIDNo.25)等功能的肿瘤相关抗原。
本发明人于本发明中亦提供确实的证据，指出肿瘤相关肽充分的与HLAII类分子混杂地结合，特别是那些遗传上由人类基因组HLADR所在所产出的HLAII类分子，可以引发由人类CD4阳性的T淋巴细胞介导的免疫反应。由人类外周血液分离出CD4阳性的T淋巴细胞，显示该类肽是适于触发人类免疫系统的T细胞反应对抗肿瘤细胞肽谱中所选的肽。因为肽可以化学方式合成而作为具制药活性的成分，本发明人的发明所提供的肽可作为免疫疗法，尤其是癌症免疫疗法。
为了由TAA鉴定出HLAII类分子以发展以肽为基础的免疫疗法，本发明人试图直接由实体瘤切片分离出HLA-DR呈现的肽，该实体瘤特别是指肾细胞癌(RCC)-此类癌细胞已经被报导可表达II类分子(Gastl,G.,T.Ebert,C.L.Finstad,J.Sheinfeld,A.Gomahr,W.Aulitzky,andN.H.Bander.1996.MajorhistocompatibilitycomplexclassIandclassIIexpressioninrenalcellcarcinomaandmodulationbyinterferongamma.J.Urol.155:361-367)。即便大多数肿瘤细胞是II类分子阴性，以目前发展中的质谱仪的敏感水平应可提供足以由少数肿瘤细胞中、或是由可能交叉呈现TAA的浸润的白细胞中、或是由成长的肿瘤外围的基质细胞鉴定出II类分子。
聚焦于RCC的原因是要以展示以下的技术证明概念：每年世上约150,000人被诊断罹患RCC，此疾病具相当高的死亡率，造成每年约78,000人死亡(Pavlovich,C.P.andL.S.Schmidt.2004.Searchingforthehereditarycausesofrenal-cellcarcinoma.Nat.Rev.Cancer4:381-393)。若被诊断出有转移现象，则一年的存活率降至约60％(Jemal,A.,R.C.Tiwari,T.Murray,A.Ghafoor,A.Samuels,E.Ward,E.J.Feuer,andM.J.Thun.2004.Cancerstatistics,2004.CACancerJ.Clin.54:8-29)，此指标预告着未达成的医疗需求。因为RCC似乎是一种可引发免疫反应的肿瘤(OliverRTD,MehtaA,BarnettMJ.Aphase2studyofsurveillanceinpatientswithmetastaticrenalcellcarcinomaandassessmentofresponseofsuchpatientstotherapyonprogression.MolBiother.1988；1:14-20.GleaveM,ElhilaliM,FrodetY,etal.Interferongamma-1bcomparedwithplaceboinmetastaticrenalcellcarcinoma.NEnglJMed.1998；338:1265)，这由对肿瘤反应与浸润肿瘤的CTL可显示(Finke,J.H.,P.Rayman,J.Alexander,M.Edinger,R.R.Tubbs,R.Connelly,E.Pontes,andR.Bukowski.1990.CharacterizationofthecytolyticactivityofCD4-positiveandCD8-positivetumor-infiltratinglymphocytesinhumanrenalcellcarcinoma.CancerRes.50:2363-2370)，为发展以肽为基础的抗肿瘤疫苗的临床试验已经开始(WiereckyJ,MuellerM,BrossartP.Dendriticcell-basedcancerimmunotherapytargetingMUC-1.CancerImmunolImmunother.2005Apr28)。然而，由于缺乏来自TAA的辅助T细胞的抗原表位，分子定义疫苗通常包含肽，而其功能仅止于HLAI类分子的配合体。
在引导至本发明的研究工作中，本发明人由10个RCC样本、3个结肠直肠癌(CCA)以及1个移型细胞癌(TCC，尿路移行细胞癌)中可分离出HLAII类分子配合体。只有由此方式所鉴定出的来自TAA所选的配合体有一致的能力：
1.源自已知肿瘤相关抗原
2.可结合至最常见HLAII类DR等位基因-HLADRB1*0101；与
3.有与其它大部分HLAII类配合体区分开来的特性，因为该配合体符合可混杂地结合至来自至少两种不同等位基因的HLADR分子的一级氨基酸序列的条件。
如下述以来自MMP7(SEQIDNo.1)肽的范例所示，这些混杂地与HLADR结合的肿瘤相关肽被发现可被CD4阳性T细胞所识别。
本发明的第一观点为提供肽，该肽包含一根据由SEQIDNo.1至SEQIDNo.49或其中任一的变化的氨基酸序列，只要该衍生的氨基酸序列(亦即，任一在连接ID位置所列的全长序列(登录号参见以下所附表一)非衍生自完整的人类多肽。
如以下所述，以本发明为基础的该肽已经全数被鉴定出可为带有MHCII类分子细胞(RCC)所呈现。因此，这些特殊的肽与其它包含这种序列(亦即，衍生的肽)的肽将即有可能引发一专一性的T细胞免疫反应，虽然这些反应程度可能会因肽的不同而有所差异。这些差异，可能是由于如该肽的突变(参见以下)所造成。本领域技术人员清楚地了解用以鉴定哪一种肽引起何种程度反应的方法，尤其是本文所提及的参考资料及其相关文献。
更好的是，依据本发明基本上包含依据任一由SEQIDNo.1至SEQIDNo.49或其变异的氨基酸序列的肽。
“基本上包含”应指依据本发明的肽，除了含任一SEQIDNo.1至SEQIDNo.49或其变异的序列，包含多余的N端与/或C端延伸的氨基酸，该延伸的氨基酸并不必须是引发免疫反应的核心肽序列(包含结合部位并作为引发免疫反应的T辅助细胞的抗原表位)的部分组成。
然而，这些延伸的氨基酸对于提供一个将依据本发明的肽有效导入至细胞是重要的。于本发明的一个实施例中，本发明的肽包含衍生自NCBI、GenBank登录号X00497(Strubin,M.,Mach,B.andLong,E.O.ThecompletesequenceofthemRNAfortheHLA-DR-associatedinvariantchainrevealsapolypeptidewithanunusualtransmembranepolarityEMBOJ.3(4),869-872(1984))的HLA-DR抗原相关不变链(28页，于其下“Ii”)的N端的80个氨基酸。
藉由一个所给的氨基酸序列“变体”，本发明人是指如一或两个氨基酸基的侧链被改变(如以其他自然介存在的氨基酸基或其他侧链取代)而使这肽基本上仍可像含所给的氨基酸序列的肽一样结合于HLA分子。例如，肽可被修改而如果没改善但至少保留与适当的MHC分子(如HLA-A)交互作用或结合的能力，而使之至少保留产生活化CTL的能力，该活化的CTL可辨别并毒杀表现携带发明者所定义的氨基酸序列的多肽的细胞。某些HLA-A结合肽的位置，如以下描述可于资料库取得，是典型的固定残基，这些残基形成一符合HLA结合槽结合部位的核心序列。
那些非必须与T细胞受体反应的氨基酸残基可以用其它氨基酸取代而修改，引进这些氨基酸基本上不会影响T细胞反应，并且不会去除结合至相关MHC分子的能力。因此除了先前提及本发明的肽外，还可以是任何包含这些鞍基酸序列或序列的一部分或其它所提及该肽的变异(本发明人所指包含寡肽与多肽)。
不仅已知由MHCII类呈现的肽是由一个含HLA特异氨基酸功能域的“核心序列”，而且该肽任意的N端与/或C端延伸并不干扰核心序列的功能(亦即，被认为与肽和T细胞间的反应无关)。N端与/或C端延伸可以分别是介于1至10个氨基酸长度。因此，一个本发明中理想的肽全长介于9至100个氨基酸，优选介于9至30个氨基酸。这些肽可直接装载于MHCII类分子或此序列可依据以下所述方法被克隆至载体。这些肽来自于细胞内处理较大肽的终产物，较长的肽亦可使用。本发明的肽可以是各种长度。按一般来说他们的分子量少于100000，优选是少于50000，更优选是少于10000且一般约是5000。以氨基酸残基数目而言，本发明的肽可以是少于1000残基，优选的是少于500个残基，更好是少于100个残基。
如果一肽有多于12个氨基酸残基直接用在结合于MHC分子，优选的是这些邻近HLA核心结合序列残基实质上不影响此肽特异地结合在MHC分子的结合槽或影响呈现肽予细胞毒性T细胞。然而，就如先前所言，较大的肽会被使用是可理解的，特别是由一多核苷酸所转译，因为这些较大的肽可被适当的抗原呈现细胞所降解。
MHC配合体、功能域、变异的肽范例以及某些N端与/或C端延伸的范例，可以是如衍生自网站http://syfpeithi.bmi-heidelberg.com/的SYFPEITHI数据库以及该网站所引用的参考文献。
至于不限定的范例，如：在该数据库中某些针对HLA-DR的肽为KHKVYACEV THQGLSS，此为衍生自Igκ链的188-203位置(Kovatsetal.EurJImmunol.1997Apr；27(4):1014-21)；KVQWKVDNALQSGNS，此为衍生自Igκ链的145-159位置(Kovatsetal.EurJImmunol.1997Apr；27(4):1014-21)；LPRLIAFTSEHSH F为衍生自GAD65270-283位置(Endletal.JClinInvest.1997May15；99(10):2405-15)，或FFRMVISNPAATHQDIDFLI为衍生自GAD65556-575位置(Endletal.JClinInvest.1997May15；99(10):2405-15)。此外，肽还可以为衍生自抗原的突变序列，如此例：ATGFKQSSKALQRPVAS，此为衍生自bcr-abl210kD融合蛋白(tenBoschetal.Blood.1996Nov1；88(9):3522-7)；GYKVLVLNPSVAAT，此为衍生自HCV-1NS328-41位置(Diepolderetal.JVirol.1997Aug；71(8):6011-9)；或FRKQNPDIVIQYMDDLYVG，此为衍生自HIV-1(HXB2)RT326-345位置(vanderBurgetal.JImmunol.1999Jan1；162(1):152-60)。所有”锚”的氨基酸(参见Friedeetal.,BiochimBiophysActa.1996Jun7；1316(2):85-101；Setteetal.JImmunol.1993Sep15；151(6):3163-70.；Hammeretal.Cell.1993Jul16；74(1):197-203.,andHammeretal.JExpMed.1995May1；181(5):1847-55。针对HLA-DR4的例子)已经以粗体字标示，而预测的核心序列则于其下画线(以底线)标示。
以上全部所叙述的肽囊括于所叙述的氨基酸序列的“变异”。
发明人在此所提及的“肽”，不只包含由肽键(-CO-NH-)所连接的氨基酸残基而成的分子，也包含肽键反转的分子。此种连接顺序颠倒-改变构型的胺肽模拟物可以此领域已知的方法制造，例如在此篇列入本发明参考数据的论文所描述(Meziereetal(1997)J.Immunol.159,3230-3237)。该方法包含制造有变异的伪肽，这些变异包含骨干，且不是侧链的方向。Meziere等人(1997)展示，这些伪肽至少对MHCII类分子与T细胞反应是有效的。此种连接顺序颠倒-改变构型的肽，包含NH-CO键而非CO-NH肽键，较能抵抗蛋白质分解。
一般来说，本发明的肽，如果由抗原呈现细胞所表达，可以被处理产生一可结合至适当的MHC分子的片段，可被适当的细胞呈现而引发适当的T细胞反应。从这肽所产生的片段也可以是本发明的肽。方便地，本发明的肽包含一部分带有所给的氨基酸序列或部分或变异，以及一个多出的部分符合一些值得有的的特性。例如，这多出的部分，包含一多出的T细胞抗原表位(不管是否如第一个T细胞抗原表位一样得自同一多肽)，或者它可能包含一携带蛋白或肽。因此，在一实施例中本发明的肽为一截短的人类蛋白或一蛋白质片段与其它多肽部分的融合蛋白，如果这些人类蛋白质包含一或多个本发明的肽序列。
在一个优选实施例中，本发明的肽包含本发明的氨基酸序列以及至少一延伸的T细胞抗原表位，其中这T细胞抗原表位是足以促使针对此种型态肿瘤的T细胞反应且该肿瘤异常地表达一肿瘤相关抗原。因此，本发明的肽包含一所谓“在线的珠子”(beadsonastring)的多肽可作为疫苗。
由下所述将可了解在某些本发明肽的应用中可被直接使用(亦即，他们并非于病人细胞中或者是在给予病人的细胞由多核苷酸表达所产生)；这些应用中优选的肽是包含少于100或50个氨基酸残基。本发明优选的肽是全长介于9至30个氨基酸残基。
本发明肽的优选例子是可以结合到HLA-DR。特别优选的例子是可特异地结合至HLA-DRB1*0101的肽。
本发明的另一观点，相似于如前述针对MHCII类分子的状况，本发明的肽可用以诱发MHCI类分子特异的T细胞反应。本发明的优选MHCI类分子特异的肽全长介于9至16，最好是9至12个氨基酸。需知道的是，该类肽可以较长的肽使用(例如用于疫苗)，类似于MHCII类肽。方法用于鉴定具有一针对HLAI类分子的某些HLA特异氨基酸功能域的MHCI类特异“核心序列”已为本领域技术人员所知并预测，例如：以计算机软件PAProC(http://www.uni-tuebingen.de/uni/kxi/)与SYFPEITHI(http://www.syfpeithi.de)。
本发明的肽对使用于免疫治疗方法中特别有效，该免疫治疗方法是用标识与毒杀异常地表达本发明肽为基础的多肽的细胞。因为这些特殊的肽包含可结合至HLA-DR之所给予的氨基酸序列，优选的是本发明的肽是结合至HLA-DR并且当此HLA-DR-肽复合体存在于一适当的抗原呈现细胞表面，可以诱使CTL的产生，而该CTL识别细胞异常表达包含所给予的氨基酸序列的多肽。
于本发明的一实施例中，本发明的肽包含衍生自NCBI、GenBank登录号X00497的HLA-DR抗原相关不变链(28页，于其下“Ii”)的N端的80个氨基酸(亦可参见下文)。
此处所提的“异常表达”包含以下解释：这些多肽相较于正常表达量是过度的，或是在肿瘤所取出的组织该基因是不表达，但却在肿瘤表达。此处所言的“过度表达”是指这些多肽表达量至少是正常组织的1.2倍；优选的是正常组织的2倍，更优选是5或10倍。
肽(至少是那些在氨基酸残基间包含肽键)可以Fmoc-聚酰胺形式作固相合成这已由Lu等人(1981)于J.Org.Chem.46,3433与该文参考数据中揭示。暂时的N-端胺基组的防护可由9-芴甲氧羰基(9-fluorenylmethyloxycarbonyl(Fmoc)group)所达成。以20％呱啶溶在二甲基甲酰胺中重复切除此对碱敏感的防护组。侧链的功能可以其丁醚(butylethers)衍生物(在此指丝氨酸、苏氨酸与酪氨酸)、丁酯(butylesters)衍生物(在此指麸氨酸、天门冬氨酸)、叔丁氧羟基(butyloxycarbonyl)衍生物(在此指离氨酸、组氨酸)、三苯基(trityl)衍生物(在此指半胱氨酸)、4-甲氧基-2,3,6三甲基苯硫酚(4-methoxy-2,3,6-trimethylbenzenesulphonyl)衍生物(在此指精氨酸)衍生物保护。在此麸胺酰与天门冬氨酰是C端的残基，是以4,4'-二甲基(4,4'-dimethoxybenzhydryl)组作为保护侧链胺基功能而制造出。此处固相支撑是基于以三单体的二烯-丙烯酰胺(dimethylacrylamide)(骨架单体)、二丙烯酰乙烯(bisacryloylethylenediamine)(横向连接)与丙烯酰基肌氨酸烯酸酯(acryloylsarcosinemethylester)(功能性试剂)所组成的聚二烯-丙烯酰胺(polydimethyl-acrylamide)多聚体。对酸敏感的4-羟甲基-苯氧乙酸(4-hydroxymethyl-phenoxyaceticacid)的衍生物被用于作为切开肽与树酯间连接的试剂。除麸氨酸、天门冬氨酸是以反式N,N`-二环己基碳化二亚胺/1-羟基苯并三唑(N,N-dicyclohexyl-carbodiimide/1hydroxybenzotriazole)介导的耦合方法加入，其它所有氨基酸衍生物是以其本身对称的无水衍生物被加入。所有耦合与去防护反应是以苯并戊三酮(ninhydrin)、三硝基苯磺酸(trinitrobenzenesulphonicacid)或吲哚醌(isotin)测试方法监测。完成合成后，肽是施以95％三氟醋酸(trifluoroaceticacid)与包含50％清除剤混和伴随除去侧练保护组由树酯上被切下。常用清除剤有乙二硫醇(ethandithiol)、酚(phenol)、苯甲醚(anisole)与水,真正的选择是基于要合成的肽的氨基酸组成。一固相与液相合并的合成方法是可能的(例如可参见BruckdorferT,MarderO,AlbericioF.Fromproductionofpeptidesinmilligramamountsforresearchtomulti-tonsquantitiesfordrugsofthefuture.CurrPharmBiotechnol.2004Feb；5(1):29-43与该文的参考数据)。
三氟醋酸以抽气的方式去除，接着以二乙烯乙醚(diethylether)产生粗制的肽粉末。任何存在的清除剂可以简单萃取步骤去除，在这步骤以低压冻干以使液相的天然的肽完全无清除剂。合成肽所需的试剂一般可由Calbiochem-Novabiochem(UK)Ltd,NottinghamNG72QJ,UK购得。
纯化可受任何一个或组合技术所影响，这些技术如分子大小排斥层析、离子交换层析、疏水色谱法以及(通常)使用氰甲烷/水密度分离的逆相高效能液相层析。
肽的分析，可使用薄层层析法、逆相高效能液相层析、酸水解后的氨基酸分析、与快速原子轰击质谱分析，以及MALDI与ESI-Q-TOF质谱分析。
本发明更进一步观点提供一可编码本发明肽的核苷酸(如多核苷酸)。此多核苷酸可为DNA、cDNA、PNA、CNA、RNA或以上的组合，且多核苷酸本身可含或不含内含子-只要其本身可编码这些肽。当然，只有包含天然的肽键的天然氨基酸残基的多肽才可能由多核苷酸编码出。本发明更进一步观点提供一可表达本发明的多肽的表达载体。
许多方法被发展以可操作地连接多核苷酸(特别是DNA)到载体，如藉由互补的且有黏合力的终端。举例来说，一大片互补的共聚物可以加到欲插入载体DNA中的DNA片段上。此载体DNA与此DNA片段随后以互补的共聚物拖曳端的氢键合而形成重组DNA分子。
合成的连接子(linker)包含一或多个限制酶区，这提供另一方法以连接DNA至载体。如先前所提及，这个以内核酸酶限制切除而产生的DNA片段，经噬菌体T4DNA聚合酶或大肠杆菌DNA聚合酶处理，这两种酶以其3’-5’的外切活性去除3’单股终端，并以其聚合酶活性填补嵌壁式的3’端。
这些步骤的组合形成钝端的DNA片段。钝端片段与大量的连接子(linker)一起在催化连接钝端的酶(如噬菌体T4DNA连接酶)存在下反应。如此，此反应的产物是DNA片段在其终端带有连接子序列的多聚体。这些DNA片段随即以一可产生与这些DNA片段兼容的互补终端的酶切开。
合成的连接子包含不同的限制酶切除位置可由许多如InternationalBiotechnologiesInc.(NewHaven,CN,USA.)供货商购得。
一优选方式修饰可编码本发明多肽的DNA是使用由Saiki等人于1988年Science239,487-491所提出的聚合酶链反应。此方法可用于将DNA导入适当载体，如藉由操纵适当的限制酶切除位置、或以此领域已知其它有用方式技术修改DNA。在此法中用酶扩大的DNA其紧接的邻近两个特殊的启动子已被囊括于扩大的DNA中。该特殊引子可包含限制性内切酶识别位置，以此领域已知方法利用该限制性内切酶识别位置可将引子导入表达载体。
此DNA(或在此例中的反转录载体，RNA)于适当宿主中表达以产生包含本发明组合的多肽。因此，由此DNA译码所得的包含本发明组合的多肽可用于已知的技术，以此处所提及的技术观点作适当的修正，以构造一个表达载体，此载体随后用于使一适当宿主细胞转型以表达及产出本发明的多肽。这些技术包含在以下专利所提及：于1984年四月三日授予Rutter等人的美国专利编号4,440,859、于1985年七月二十三日授予Weissman等人的美国专利编号4,530,901、于1986年四月十五日授予Crowl等人的美国专利编号4,582,800、于1987年六月三十日授予Mark等人的美国专利编号4,677,063、于1987年七月七日授予Goeddel等人的美国专利编号4,678,751、于1987年十一月三日授予Itakura等人的美国专利编号4,704,362、于1987年十二月一日授予Murray等人的美国专利编号4,710,463、于1988年七月十二日授予Toole等人的美国专利编号4,757,006、于1988年八月二十三日授予Goeddel等人的美国专利编号4,766,075、于1989年三月七日授予Stalker等人的美国专利编号4,810,648，以上所提各专利均为本文参考数据。
此DNA(或在此例中的反转录载体，RNA)解码所得的包含本发明组合的多肽可接在许多不同DNA序列而导入适当宿主。此伴随DNA是依宿主、或依将DNA导入宿主的方式而定，不论是否需要基因体外的维护或插入。
一般说来，DNA是以适当方向与正确开放读架插入一表达载体中而表达，如质体。如果需要，此DNA可以串接至可被所用宿主所识别的适当转录与翻译调控核酸序列，虽然这些控制是可在一般载体中发现。此载体随后以标准技术被导入宿主。因此，选出被转型的宿主细胞是必要的。一种选择的技术是导入一段DNA序列至表达载体，以适当的控制元素能在转型细胞中表达出可选择的特征如对抗生素的抗药性。
另一种方法，这种可选择的特征可在另一表达载体，可与前述载体一同转型宿主细胞。
以被重组DNA转型的宿主细胞将会以本文所提的技术观点、以此领域所熟知的技术在适当状况下培养足够时间，以使表达肽随后并取得。
许多已知表达载体包含细菌(大肠杆菌与枯草杆菌)、酵母菌(如Saccharomycescerevisiae)、丝状菌(如Aspergillus)、植物细胞、动物细胞、与昆虫细胞。优选的可使用RCC或Awells细胞。
启动子是一由DNA序列所形成的控制基因表达要素，RNA多聚酶可以结合在其上使转录开始进行。兼容于示范细菌宿主的启动子序列通常以质体载体方式提供，此质体载体包含便利的限制酶切除区以插入本发明的DNA序列。典型的原核载体质体包含BioradLaboratories(Richmond,CA,USA)的pUC18、pUC19、pBR322与pBR329，与Pharmacia(Piscataway,NJ,USA)的pTrc99A与pKK223-3。
一典型哺乳动物细胞载体质体pSVL可购自Pharmacia(Piscataway,NJ,USA)。此载体使用SV40晚期启动子驱动克隆基因的表达，在T抗原表达细胞-如COS-1细胞，发现最高程度表达。PMSG是一个可诱发表达的哺乳动物细胞载体，亦可购自Pharmacia。这个载体使用小鼠乳癌病毒长终端重复的启动子，其可由糖皮质激素驱动克隆基因的表达。有用的酵母菌质体载体如pRS403-406与pRS413-416可购自StratageneCloningSystems,LaJolla,CA92037,USA。质体pRS403、pRS404、pRS405与pRS406是酵母菌的插入质体(YeastIntegratingplasmids)，其中包含酵母菌可选择的标志HIS3、TRP1、LEU2与URA3。质体pRS413-416是酵母菌中心体质体(YeastCentromereplasmids)。还由其它此领域熟知的可用于许多不同宿主细胞的载体与表达系统。
本发明也与以带有本发明的多核苷酸的载体转型宿主细胞有关。宿主细胞可以是原核或真核细胞。原核宿主细胞在某些情况下使用细菌细胞是优选的选择，通常会使用大肠杆菌，例如可由BethesdaResearchLaboratoriesInc.,Bethesda,MD,USA购得的DH5菌株，以及可由AmericanTypeCultureCollection(ATCC)ofRockville,MD,USA购得的菌株RR1(编号ATCC31343)。优选的真核宿主细胞包含酵母菌、昆虫与哺乳动物细胞，优选的选择是来自脊椎动物如小鼠、大鼠、猴子或人类纤维或肾脏细胞株。酵母菌宿主细胞包括YPH499、YPH500与YPH501等一般可由StratageneCloningSystems,LaJolla,CA92037,USA所购得。优选的哺乳动物细胞包括中国苍鼠卵巢细胞(CHO)CCL6可自ATCC取得、NIH瑞士小鼠胚胎细胞株NIH/3T3可以CRL1658编号自ATCC取得、猴子肾脏细胞株COS-1可以CRL1650编号自ATCC取得以及人类胚胎肾脏细胞293细胞株。优选的昆虫细胞是Sf9细胞株其可为枯草杆菌表达载体所转染(transfect)。
以本发明的DNA构成以转型适当宿主细胞是藉由所熟知的方法达成，而这些一般是由所用的载体类别来决定。以转型原核细胞宿主为例Cohen等人所著的(1972)Proc.Natl.Acad.Sci.USA69,2110以及Sambrook等人所著的(1989)MolecularCloning,ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NY。针对酵母菌细胞的转型描述于Sherman等人所著的(1986)MethodsInYeastGenetics,ALaboratoryManual,ColdSpringHarbor,NY。Beggs于(1978)Nature275,104-109所提的方法也很有用处。针对脊椎动物细胞，用于此类细胞转型的试剂，如磷酸钙与DEAE-dextran或脂肪微粒配方，可自StratageneCloningSystems,orLifeTechnologiesInc.,Gaithersburg,MD20877,USA取得。电穿孔也是极佳用于转型与/或转染(transfect)细胞，此法也是本领域所熟知用于转型酵母菌细胞、细菌细胞、昆虫细胞与脊椎动物细胞。
成功转型的细胞，即包含本发明的DNA结构的细胞，可以熟知的技术鉴定。例如，导入本发明的架构的细胞，可以成长以产出本发明的多肽。经收集并融解的细胞，其DNA成分可以用Southern于1975年发表(J.Mol.Biol.98,503)或Berent等人于1985年发表(Biotech.3,208)的方法检测DNA的存在。另外，悬浮液中蛋白质的存在可以如以下所述用抗体检测。
除了直接检测重组DNA存在外，当重组DNA可以指挥蛋白质表达时，可以用免疫学的方法鉴定成功转型的细胞。例如，经一可表达适当抗原性的表达载体成功转型的细胞。疑似被转型的细胞样本经收集与以适当抗体测试蛋白质存在。此外，除了转型宿主细胞本身外，本发明亦仔细考虑这些细胞的在培养基中培养，最优选的是单株(均质性培养)，或来自单株培养的细胞。
大家将了解本发明的某些宿主细胞，对制备本发明的肽很有用处，例如细菌细胞，酵母菌细胞与昆虫细胞。然而，其它宿主细胞在某些治疗方法更为有用。例如，抗原呈现细胞，如树突状细胞，适用于表达本发明的肽，因为这些肽会被装载于适当的MHC分子。
本发明的进一步的观点是提供一方法生产肽以作为血管内注射(iv)、皮下注射、皮间注射、腹腔注射、肌肉注射。肽优选的注射方式为皮下注射、皮间注射、腹腔注射、肌肉注射与血管内注射。DNA优选的注射方式为皮间注射、肌肉注射、皮下注射、腹腔注射与血管内注射。DNA或肽注射剂量介于1至500微克。
本发明的进一步的观点是关于使用根据本发明的肿瘤相关抗原、根据本发明的核苷酸或者是根据本发明的表达载体于医学上。
本发明的进一步的观点是提供一个杀伤病人体内异常地表达包含本发明氨基酸序列的多肽的标的细胞，此法包含施予病人一有效剂量的本发明的肽、或一有效剂量的多肽，或一可产出本发明肽的表达载体；其中该肽或该多肽或该表达载体的量是足以引发该病人的抗标的细胞的免疫反应。代表性地该标的细胞可为肿瘤或癌细胞。
此肽或编码肽的核酸组成肿瘤或癌疫苗。疫苗可直接施予病人，直接打入受影响的器官或全身性，或以活体细胞培养方式施予得自病人的或人类细胞株随后再打入并人体内，或用于离体中以筛选出病人免疫细胞的次群体然后再施打予病人。如果此核苷酸是于离体施予细胞，较有用的方式是转染细胞以使细胞一起表达激发免疫反应的细胞激素，如白细胞介素-2。此肽可以是纯化的或与一激发免疫反应的佐剂混合，如DETOX，或与激发免疫反应的细胞激素混合，或与适当的传递系统如脂肪微粒一同施予。此肽可以连接于适当的携带者如钥孔虫戚血蓝蛋白(keyholelimpethaemocyanin，KLH)或甘露聚糖(参见WO95/18145与Longeneckeretal(1993)Ann.NYAcad.Sci.690,276-291)。此肽亦可以被标示或形成融合蛋白或杂合分子。本发明的肽序列是被预期可以刺激CD4阳性的T细胞毒杀反应。然而，此反应在CD4阳性的T细胞存在协助下反应更有效。因此，融合的另一组成分或适当的杂合分子提供抗原表位以刺激CD4阳性的T细胞。CD4阳性刺激抗原表位为此领域所熟知并包含那些在破伤风类毒素中所发现。此多核苷酸可是纯化的或是涵括在适当载体或传递系统。
适当的载体与传递系统包括病毒的如基于腺病毒、痘苗病毒、反转录病毒、疱疹病毒、线病毒相关病毒或包含来自多种病毒成份的杂合病毒。非病毒的传递系统包括脂质体与阳离子聚合物是此领域熟知的传递DNA的技术。物理性传递如亦可使用基因枪。此肽或此核酸编码的肽可以是融合蛋白如与可刺激CD4阳性T细胞的抗原表位形成融合蛋白。
用于癌症疫苗的肽可以是任何适当的肽，特别是，适当的9个氨基酸肽或适当的7个或8个或10个或11个或12个氨基酸肽。较长的肽可能比较适合，但附表1中所描述的9个氨基酸肽或10个氨基酸肽是表较适当。
任何施打于病人的核苷酸是无菌的或无产热原。裸露DNA可以肌肉间或皮间或皮下施打。肽可以肌肉间或皮间或腹腔或血管或皮下施打(亦可参考关于生产肽的方法)。优选地，此肽可作为活性药学成分与佐剂如IL-2、Il-12、GM-CSF、弗氏不完全佐剂、弗氏完全佐剂或脂微粒配方一同施予。最优选的佐剂可参考BrinkmanJA,FauschSC,WeberJS,KastWM.Peptide-basedvaccinesforcancerimmunotherapy.ExpertOpinBiolTher.2004Feb；4(2):181-98。
施打疫苗导致的CTL反应是由专业的抗原呈现细胞刺激而得。一但CTL被激发，增强肿瘤细胞表达MHC分子是会是一个优点。
将疫苗的目标对准特殊的细胞族群也是有用的，例如，抗原呈现细胞，藉由使用注射、标的载体、传递系统、或筛选病人体内的这一群细胞然后经活体培养中加入肽或核苷酸(如树突细胞可以Zhou等人(1995)Blood86,3295-3301与Roth等人(1996)Scand.J.Immunology43,646-651所描述方法分离)。例如，标的载体可包含组织特异或肿瘤特异的启动子可以指挥抗原于适当的地方表达。
本发明进一步的观点是提供一有效抗癌、或癌/肿瘤细胞的疫苗，该疫苗包含根据本发明的有效剂量的肽或者是有效剂量的可编码该肽的核酸。优选的疫苗是核酸疫苗。已知接种核酸疫苗，如DNA疫苗，转译成的蛋白质可以激发T细胞反应。多数优选的疫苗是含一(合成)肽或数种肽(亦即，单一种或合并1、2、3、4、5、6、11或甚至更多肽，详述如下)。
方便地，该核苷酸疫苗可包含任一适当核苷酸携带方式。此核苷酸，优选的是DNA，可以是裸露的(亦即基本上接种时不含其它成份)或其本身可藉由脂微粒携带或是病毒载体系统的一部分。
咸信核苷酸经由树突细胞吸收并表达此转译多肽是促成免疫反应活跃的机制；然而树突细胞可不经转入作用而仍扮演重要角色，因为它们仍可获得组织中转入细胞表达的肽。
如果是DNA疫苗，肌肉接种是较合宜的。经由皮肤接种也是较好的方式。核苷酸疫苗可以不加佐剂接种，或者与佐剂如BCG或alum一起接种。其它适合的佐剂包括Aquila'sQS21stimulon(AquilaBiotech,Worcester,MA,USA)，这是由皂苷(saponin)、结合杆菌萃取物与合成细菌细胞壁模拟物衍生与适当的佐剂如Ribi'sDetox而得。另一种由皂苷(saponin)衍生的佐剂，QuilA(Superfos,Denmark)，也可以使用。核苷酸疫苗如果不与佐剂一同接种是较合宜的。其它佐剂如弗氏佐剂也可使用。将肽连接于钥孔虫戚血蓝蛋白也是有用的，最好与佐剂一同施用。
多核苷酸介导的癌症免疫疗法描述于Conry等人(1996)于SeminarsinOncology23,135-147；Condon等人(1996)于NatureMedicine2,1122-1127；Gong等人(1997)于NatureMedicine3,558-561；Zhai等人(1996)于J.Immunol.156,700-710；Graham等人(1996)于IntJ.Cancer65,664-670；andBurchell等人(1996)于pp309-313In:BreastCancer,Advancesinbiologyandtherapeutics,Calvo等人(eds),JohnLibbeyEurotext，以上文献全文均为本文的参考数据。
本发的进一步观点是提供本发明肽、或者是转译该肽的多核苷酸或表达该肽的载体的使用；以制造可杀伤病人体内异常地表达含本发明的氨基酸序列的多肽的标地细胞。
本发明的更进一步观点是提供一个使用根据本发明的肽、可表达根据本发明肽的核苷酸，或者是可表达根据本发明肽的表现载体于制造一可诱发一种免疫反应-特别是细胞性免疫反应-的药剂；更特别指一T细胞介导的免疫反应，此反应针对于细胞表面表达人类MHCII类分子并呈现包含本发明氨基酸序列的实体瘤细胞。本发明中很惊人的发现实体瘤的肿瘤细胞，相对于同一组织中的正常细胞，于其细胞表面表达人类HLAII类分子。
本发明的进一步观点是提供于活体中或离体中产生活化细胞毒性T细胞的方法，此法是于离体中让CTL与表现于适当抗原呈现细胞表面且装载抗原的人类MHCI类分子一段足够时间后以抗原特异地活化该CTL，该抗原即为本发明的肽。
适当地，此CTL是CD4阳性的辅助细胞，优选的是TH1类型。MHCII类分子可表达于任何适当细胞，优选的是，如果该细胞在自然状况下不表达MHCII类分子(在此状况下该细胞是藉由转染而表达此分子)，或者是该细胞在抗原呈现或是抗原呈现路径有缺陷。以此方式，细胞表达MHCII类分子基本上可以在活化CTL前完全用选择的肽抗原预先装载。
该抗原呈现细胞(或激活细胞)基本上表达MHCII类分子于细胞表面且根本上本身无法将所选的抗原装载该MHCII类分子上。如以下所详述，该MHCII类分子可于离体中装载所选择的抗原。
使用哺乳动物细胞缺乏或有较低或其TAP肽传递功能低下是较适宜的。无TAP肽传递功能的细胞包含T2、RMA-S与果蝇细胞。TAP是“抗原处理相关的转运蛋白”(Transportorassociatedwithantigenprocessing)。
可装载人类肽的缺陷细胞株T2可由美国典型培养物保藏中心(简称ATCC),12301ParklawnDrive,Rockville,Maryland20852,USA以目录编号CRL1992取得；果蝇细胞株Schneiderline2可由ATCC以目录编号CRL19863取得；小鼠细胞株RMA-S描述于KarreandLjunggren(1985)J.Exp.Med.162,1745。
便利上来说，在转入前宿主细胞基本上无MHCI类分子表达。若刺激者细胞表达一个协同刺激T细胞的分子如B7.1、B7.2、ICAM-1与LFA3是较好的。
许多MHCII类分子的核苷酸序列以及协同激活分子可由GenBank与EMBL数据库公开取得。
更进一步的实施例，合并HLA分子也可被使用，如此处表A与表B中MHCII类分子。使用重组多抗原表位疫苗以携带多组CD8阳性CTL抗原表位描述于Thomson等人(1996)J.Immunol.157,822-826与WO96/03144，两者均为本文的参考数据。与本发明相关，可以用一包含本发明氨基酸序列的肽(或一转译该肽的核苷酸)，以任何顺序，与另一激活CD8阳性T细胞抗原表位混合作为单一疫苗。此种疫苗将会对癌症治疗特别有用。这种“在线的珠子”疫苗是典型的DNA疫苗。此种同时启动依赖MHCII类分子免疫反应与依赖MHCI类分子免疫反应，有导致区域的CD4阳性T细胞的似TH1T细胞反应的优势，因而支持依赖MHCI类分子的CD8阳性T细胞。
有一些可在离体中产生CTL的其它方法，如Peoples等人于(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.USA92,432-436与Kawakami等人于(1992)J.Immunol.148,638643所提出使用自体浸润于肿瘤的淋巴细胞于产生CTL。Plebanski等人于(1995)Eur.J.Immunol.25,1783-1787利用自体外周血液的淋巴细胞制备CTL。Jochmus等人于(1997)J.Gen.Virol.78,1689-1695描述使用肽或多肽规律地装载于树突细胞以产生自体的CTL，或Hill等人于(1995)J.Exp.Med.181,2221-2228描述藉由感染重组病毒，与Jerome等人(1993)J.Immunol.151,1654-1662描述使用B细胞产生自体的CTL。此外，使用肽或多肽规律地装载于或经感染重组病毒的巨噬细胞，可用于制备自体的CTL。S.Walter等人(WalterS,HerrgenL,SchoorO,JungG,WernetD,BuhringHJ,RammenseeHG,StevanovicS.Cuttingedge:predeterminedavidityofhumanCD8TcellsexpandedoncalibratedMHC/anti-CD28-coatedmicrospheres.JImmunol.2003Nov15；171(10):4974-8)描述离体中使用人工处理的抗原呈现细胞激活T细胞，此法亦适于产生对抗所选的肽的T细胞。
异种细胞也可使用于制备CTL，此法描述于WO97/26328并涵括于本文的参考数据。例如，除使用果蝇与T2细胞外，其它细胞，如CHO细胞、杆状病毒感染的昆虫细胞、细菌、酵母菌、痘苗病毒感染的标地细胞，亦可被使用于呈现抗原。此外植物病毒亦可被使用(参见Porta等人于(1994)Virology202,449-955描述开发豇豆嵌纹病毒使成为高产量呈现外来肽的系统)。
直接对抗本发明肽的活化CTL也被使用于治疗。因此，本发明进一步的观点是提供由先前方法所获得的活化CTL。
本发明更进一步的观点是提供活化的CTL，该CTL可特异地识别细胞异常地表达含本发明氨基酸序列的多肽。优选的是此CTL藉由与HLA/肽复合物反应(也就是“结合”)识别该细胞。该CTL对使用于杀伤病人标的细胞很有用，该标的细胞异常地表达含本发明的氨基酸序列的多肽，而且该病人被施与有效量活化的CTL。施予病人的CTL可从病人体内取得并以上述方法活化(亦即，这些是自体的CTL)。另外，这些CTL可以是来自病人以外的其它个体。当然，最好是来自健康人的。本发明人所谓”健康个体”是指此个体一般健康状况良好，优选的是有正常的免疫系统，并且最好并无罹患任何可立即检测到的疾病。
该活化的CTL表达T细胞受体(TCR)，此T细胞受体与识别异常地表达本发明多肽的细胞有关。如果转译该TCR的cDNA是由活化的CTL克隆而得并且转移至一CTL中表达是有用的。
在活体中，根据本发明的CD4阳性CTL的标的细胞可以是肿瘤细胞(表达MHCII类分子)以及/或环绕肿瘤或肿瘤细胞的间质细胞(有时也会表达MHCII类分子)。
特异识别本发明的肽的CTL细胞株的T细胞受体已经被克隆。这些CTL细胞株的T细胞受体使用下述方法确定(i)针对T细胞受体变动区的特异单株抗体，以及(ii)使用Va与Vp基因家族特异的引子作反转录多聚酶链反应(RT-PCR)。由这些CTL细胞株所萃取的poly-AmRNA建立一cDNA文库。针对T细胞受体C端部分a与P链与N端部分Va与P片段的引子被使用。T细胞受体a链的完整的cDNA是利用超高忠实性DNA聚合酶扩增，此扩增产物被克隆至适当的克隆载体。a与P链的基因克隆可以组合成单链T细胞受体藉由用下述方法：Chung等人(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA91,12654-12658。在这单链的构成中，其VDJ片段紧跟在VaJ片段之后，其后有Cp片段与CD3链的跨膜与胞质片段。此单链T细胞受体随后插入反转录病毒载体(依据其感染成熟的人类CD8阳性T淋巴细胞以及介导基因表达的能力，有一系列的载体可供使用，其中反转录病毒载体系统Kat是较适宜的-参见Finer等人(1994)Blood83,43)。高效价的假型的双向性(amphotrophic)反转录病毒使用于感染分离自肿瘤患者外周血液纯化的CD8阳性或CD4阳性淋巴细胞(操作步骤出版于1994由Roberts等人所著的Blood84,2878-2889，涵括于本文参考数据)。抗CD3抗体被用于启动纯化的CD8阳性T细胞增生，此举亦促进反转录病毒的插入并稳定表达单链TCRs。反转录病毒的转导功效是以针对此单链TCR的抗体染色于CD8阳性T细胞而测定。离体中分析转导的CD8阳性T细胞发现他们表达相同的肿瘤特异的毒杀作用，如同最初TCR链克隆自异种限制的(allo-restricted)CTL细胞株。转导的CD8阳性T细胞携带所预期的特异性可以用于过继免疫治疗肿瘤患者。病人可以施予108至109自体转导的CTL。相似于CD8阳性，经导入的携有相关构成CD4阳性T辅助细胞亦可被产生。
其它导入基因至CTL的适当系统描述于Moritz等人(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA91,4318-4322,含括于本文参考数据.Eshhar等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90,720-724与Hwu等人(1993)J.Exp.Med.178,361-366也描述CTL的转入。因此，本发明的进一步观点提供一T细胞受体可识别细胞异常地表达包含本发明氨基酸序列的多肽，该T细胞受体可由活化的CTL细胞取得。
除了T细胞受体，功能相同于T细胞受体的分子也涵盖于本发明中。包括任何分子功能相同于T细胞受体可以执行与T细胞受体相同功能。特别是指经基因工程制成的三结构域单链(threedomainsinglechain)T细胞受体，其制法描述于本发明参考数据并于前文中提及：Chung等人(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA91,12654-12658。本发明亦包含一可转译T细胞受体的多核苷酸或功能相同的分子，以及一转译T细胞受体的多核苷酸或功能相同的分子的表达载体。本发明的T细胞受体的适当表达载体包含前文有关于本发明的肽所描述。
然而，较适合的表达载体是可以于转入CTL中表达T细胞受体者。
本发明更进一步的观点是提供一方法杀伤患者体内异常地表达包含本发明氨基酸序列的多肽的标地细胞，此方法包含以下步骤(1)由患者取得CTL；(2)于该细胞转导入一转译T细胞受体的多核苷酸或功能相同的分子，如前文所定义；(3)将(2)所述细胞导入病人体内。
本发明更进一步的观点是提供一方法杀伤患者体内异常地表达包含本发明氨基酸序列的多肽的标的细胞，该氨基酸序列定义于本发明的第一或第二或第三观点，此方法含以下步骤(1)由该患者取得抗原呈现细胞，如树突细胞；(2)于活体培养中，以本发明定义于第一或第二或第三观点的肽、或可转译该多肽的多核苷酸，接触该抗原呈现细胞；(3)将处理后的抗原呈现细胞导入病人体内。
优选的抗原呈现细胞是树突细胞。适当的，该树突细胞是曾规律地装载过抗原性肽的自体树突细胞。该抗原性肽可以是任一适当肽可以激发适当T细胞反应。使用曾规律地装载过肿瘤相关肽的自体树突细胞的T细胞疗法描述于Murphy等人(1996)TheProstate29,371-380与Tjua等人(1997)TheProstate32,272-278。
在一进一步的实施例中，其抗原呈现细胞(如树突细胞)，是与一可转译本发明肽的多核苷酸接触。该多核苷酸可以是任何适当的多核苷酸，而优选可以转导至树突细胞，以致肽被呈现且引发免疫反应。
便利的，此多核苷酸可以是病毒的多核苷酸或病毒的组成。例如，腺病毒转导的树突细胞被显示可以引起抗原特异的抗肿瘤反应关于MUC1(参见Gong等人(1997)GeneTher.4,1023-1028)。相似地，可以使用基于腺病毒的系统(参见如Wan等人(1997)Hum.GeneTher.8,1355-1363)；反转录病毒系统亦可被使用(Specht等人(1997)J.Exp.Med.186,1213-1221与Szabolcs等人(1997)；于血液中藉由颗粒介导转入树突细胞也可被使用(Tuting等人(1997)Eur.J.Immunol.27,2702-2707)；RNA也可被使用(Ashley等人(1997)J.Exp.Med.186,11771182)。
可以了解，关于杀伤病人体内的标的细胞的方法，较好的标的细胞是癌症细胞，最好是肾脏或结肠的癌细胞。
特别适宜的是，若以本发明的方法治疗的病人有HLA-DR。因而，在一优选的实施例中该病人HLA的单元型在治疗前就被确认。HLA的单元型定性可以任何适用的方法进行，这些方法为此领域所熟知。
本发明特别包含本发明肽的使用(或可转译该多肽的多核苷酸)于活化活体疫苗接种；于离体中操纵自体树突细胞随后将该树突细胞导入活体中激活CTL反应；于离体中活化自体CTL随后进行过继治疗(亦即，该活化自体CTL被导入患者体内)；于离体中活化健康捐赠者的CTL(MHC相配的或不相配的)随后进行过继治疗。
在一较合宜的实施例中，本发明的疫苗单独或与其它癌症治疗方法合并施予宿主以防止或抑制肿瘤形成。
本肽疫苗可以无须佐剂而施予病人。本肽疫苗也可与佐剂如BCG或明矾(alum)一并给予病人。其它适当的佐剂包含Aquila'sQS21stimulon(AquilaBiotech,Worcester,MA,USA)是皂苷的衍生物、结合杆菌萃取物与合成细胞壁模拟物、与专利的佐剂如Ribi'sDetox.QuilA(另一种皂苷的衍生物)也可使用(Superfos,Denmark)。其它的佐剂如CpG寡核苷酸、稳定的RNA、Imiquimod(可以商标名AldaraTM购自3MPharma,U.S.A.)、不完全弗氏佐剂(可以商品名MontanideISA-51购自SeppicS.A.,Paris,France)、脂微粒配方或GM-CSF也是有用的。将肽连接于钥孔虫戚血蓝蛋白也是有用的，最好与佐剂一同施用。
依据本发明的肽可以作为诊断试剂。将本肽用于分析在病人CTL族群中是否存在或被治疗所激活可特异对抗该肽的CTL。更进一步，可用此肽测定T细胞前身是否对所使用的肽有反应。进而，可用此肽作为标识以监视表达该含此肽的抗原的肿瘤的进展。
在附件表一中，所发现的肽均被列出。此外，在该表中这些肽的来源蛋白质被标示出，并且在相对的蛋白质中该肽位置被标示出。其相对应的索引号(Acc-Numbers)更被标出，该索引号与NationalInstituteofHealth(参见http://www.ncbi.nlm.nih.gov)的"NationalCentreforBiotechnologyInformation"的Genbank中资料相关连。
在另一较合宜的实施例中，这些肽被用于白细胞染色，特别指T淋巴细胞。这是特别有优点如果他可以证实在CTL族群中是否存在可特异对抗该肽的CTL。进一步，该肽可作为标志测定肿瘤的治疗状况。
在另一较合宜的实施例中，本发明的肽被用于制备抗体。多株抗体可以一标准方式获得，藉由注射该肽免疫动物的后纯化免疫球蛋白。单株抗体可以标准步骤制备如于MethodsEnzymol.(1986),121,Hybridomatechnologyandmonoclonalantibodies所描述。
本发明的更进一步观点与药学成分有关，其中包含一或多个本发明的肽。该组成用于非口服方式施予，如皮下、皮间、肌肉、或口服。为此，这些肽是溶于或悬浮于药学上可接受，优选水状载体。此外，该成分可包含赋形剂如缓冲物、爆破剂、释剂、调味品、润滑剂等等。该肽也可与免疫激活物质如细胞间质素一同施予。可用于此成份的一赋形剂名单由A.Kibbe所著文献中所提出，HandbookofPharmaceuticalExcipients,3.Ed.,2000,由AmericanPharmaceuticalAssociationandpharmaceutical出版。这些组成可用于癌症疾病的预防(prevention)、预防法(prophylaxis)，与/或治疗。
药学的制备包含至少包含本发明的肽，该肽由任一SEQIDNo.1至SEQIDNo.49组成被给予一罹患与相关肽或抗原有关的癌症病人。由此，一CTL特异的免疫反应可被启动。
本发明的另一观点，两种或以上本发明肽的组合可作为疫苗，不论直接混合或用同样的疗法。更进一步，与其它肽混合,如MHCII类特异的肽可被使用。技术人员有能力以测试方式选择优选的肽组合，如离体中产生T细胞以及其有效性与整体存在、增生、亲合力，如藉由分析IFN-γ(参见以下例子)、IL-12或穿孔素(Perforin)。通常最有效的肽会被混合成疫苗，以达成前述的目的。
一适合的疫苗将包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15种不同肽，优选4、5、6或7种不同肽，最优选6种肽。
最后，此疫苗可依据患者所罹患的特殊型态的癌症以及癌症的状态、早期治疗方法、患者的免疫系统状况，以及该病人的HLA单元型。
已经发现Ii的N端的80个氨基酸就足以将蛋白质导引至第二型的处理路径(Sanderson,S.,Frauwirth,K.&Shastri,N.(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A92,7217-7221,Wang,R.F.,Wang,X.,Atwood,A.C.,Topalian,S.L.&Rosenberg,S.A.(1999)Science284,1351-1354)。
肿瘤相关抗原其T辅助细胞抗原表位的确认在抗癌免疫疗法中是一个重要的工作。于此，本发明人报导了一个一般可行的方法，以及一类衍生自由MS所分析的不同肽，该分析是用以鉴定出MHCII类肿瘤相关抗原配合体的天然的处理与呈现。此法综合以表达融合蛋白的载体第一次转染抗原呈现细胞的步骤，该融合蛋白介于Ii链与有兴趣的抗原间；冲提出与HLA结合的肽后，以MS分析转染细胞呈现的抗原衍生肽并与未转染细胞比较。虽然鉴定出的肽其免疫反应产生能力仍需经活体测试，这个方法可对经天然处理的MHCII类配合体做确切的定性研究。
因此，本发明人避开测试或合成肿瘤相关抗原的重迭肽，或是由抗原表位预测出的广泛范围的肽所选出–此法与I类抗原表位预测相较准确度较低。相对于费劲的T细胞分析–可能鉴定出隐密的但于活体中无法诱发T细胞活化的T细胞抗原表位(Anderton,S.M.,Viner,N.J.,Matharu,P.,Lowrey,P.A.&Wraith,D.C.(2002)Nat.Immunol.3,175-181)，本发明可聚焦于少数所发现被呈现的肽。此外，使用此方法就不需制造重组抗原或拥有表达抗原的肿瘤细胞株以证明该抗原是经天然处理所产生。
本发明人使用Ii的N端将肿瘤相关抗原导引至EBV转型细胞的第二型的处理内体区室。为达成这个方法，本发明人建构一个能变通的载体，于该载体我们可以将任一抗原与Ii形成融合蛋白表达，以方便用西方墨点分析法鉴定融合蛋白于转染细胞中的表达量。已经发现Ii的N端就足以将标的蛋白质导引至第二型的处理路径的内体区室；然而直到目前，这仅被描述于使用白蛋白的模式中(Sanderson,S.,Frauwirth,K.&Shastri,N.(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A92,7217-7221)，使用于可转译融合蛋白的cDNAlibrary以鉴定未知抗原(Wang,R.F.,Wang,X.,Atwood,A.C.,Topalian,S.L.&Rosenberg,S.A.(1999)Science284,1351-1354)、或确认以知T细胞株的特异性(Chaux,P.,Vantomme,V.,Stroobant,V.,Thielemans,K.,Corthals,J.,Luiten,R.,Eggermont,A.M.,Boon,T.&vander,B.P.(1999)J.Exp.Med.189,767-778)。依据本发明人所知，此法从未被使用于鉴定可被MHCII类自然呈现的、来自已知肿瘤抗原的肽。以MALDI-MS作转染或未转染细胞其第二型配合体的差示分析，并进一步ESI-MS对不同表达的肽作定性分析，形成一个直接鉴定感兴趣的抗原其第二型配合体的方法。以角质蛋白(keratin)18的融合蛋白转染细胞证明本发明者的方法一般适用于感兴趣的抗原，再一次，本发明人亦可将HLA-DR呈现的肽以此模式转植基因-角质蛋白(keratin)18-描述。
肿瘤相关抗原其T辅助细胞抗原表位的确认在抗癌免疫疗法中是一个重要的工作。直到目前，用于鉴定来自肿瘤相关抗原的第二型肽的不同方法被使用，从将感兴趣的抗原与抗原呈现细胞一起培育以使抗原被细胞携入并处理(Chaux,P.,V.Vantomme,V.Stroobant,K.Thielemans,J.Corthals,R.Luiten,A.M.Eggermont,T.Boon,andB.P.vanderBruggen.1999.IdentificationofMAGE-3epitopespresentedbyHLA-DRmoleculestoCD4(+)Tlymphocytes.J.Exp.Med.189:767-778)，到以融合蛋白转染的不同方法(Dengjel,J.,P.Decker,O.Schoor,F.Altenberend,T.Weinschenk,H.G.Rammensee,andS.Stevanovic.2004.IdentificationofanaturallyprocessedcyclinD1T-helperepitopebyanovelcombinationofHLAclassIItargetinganddifferentialmassspectrometry.Eur.J.Immunol.34:3644-3651)。前述所有方法不仅耗时，而且经常无法确认所鉴定出的HLA配合体是否真正于人体组织中表达。本发明人是第一个展示能从切片的实体瘤中分离出HLAII类配合体，因此，鉴定于活体的肿瘤或其周围组织中所呈现的肽，且该肽可为具有适当T细胞受体且同时于细胞表面表达协同刺激配合体CD4的T细胞所识别。在作为内生性处理的HLAII类配合体来源的蛋白质中，数种看家基因以及免疫相关蛋白被鉴定出。然而，来自肿瘤相关抗原的肽也被发现，形成一个于活体中鉴定来自肿瘤相关抗原的HLAII类配合体直接方法。
本发明人鉴定出三种配合体负责(accountingfor)一核心序列来自IGFBP3与一来自MMP7的配合体。本发明人发现这些蛋白质于肾脏癌中过度表达，此外，这些蛋白质也被发现与肿瘤有关(Miyamoto,S.,K.Yano,S.Sugimoto,G.Ishii,T.Hasebe,Y.Endoh,K.Kodama,M.Goya,T.Chiba,andA.Ochiai.2004.Matrixmetalloproteinase-7facilitatesinsulin-likegrowthfactorbioavailabilitythroughitsproteinaseactivityoninsulin-likegrowthfactorbindingprotein3.CancerRes.64:665-671；Sumi,T.,T.Nakatani,H.Yoshida,Y.Hyun,T.Yasui,Y.Matsumoto,E.Nakagawa,K.Sugimura,H.Kawashima,andO.Ishiko.2003.Expressionofmatrixmetalloproteinases7and2inhumanrenalcellcarcinoma.Oncol.Rep.10:567-570；Cheung,C.W.,D.A.Vesey,D.L.Nicol,andD.W.Johnson.2004.TherolesofIGF-IandIGFBP-3intheregulationofproximaltubule,andrenalcellcarcinomacellproliferation.KidneyInt.65:1272-1279)。这些肽混杂地结合于HLAII类分子并可活化来自不同健康捐赠者的CD4阳性T细胞。因此，本发明人的方法将对鉴定新的来自TAA的第二型的候选肽以使用于临床疫苗方法是有帮助的。
本发明更进一步的观点是关于一个方法可杀伤患者体内表达包含本处所提及氨基酸序列的多肽的标地细胞，此方法含施予病人有效剂量的基于本发明的肽、或基于本发明的核苷酸、或基于本发明的表达载体，在此该肽、该核苷酸、该表达载体用量是足以激发该病人的抗标的细胞免疫反应。
本发明更进一步的观点是关于一个可杀伤患者体内表达包含本处的氨基酸序列的多肽的标地细胞的方法，该方法包含施予病人有效剂量的本发明定义的细胞毒性T细胞。
本发明更进一步的观点是关于一个可杀伤患者体内表达包含本处的氨基酸序列的多肽的标地细胞的方法，此方法包含以下步骤(1)由患者取得细胞毒性T细胞(CTL)；(2)于该细胞转导入一转译T细胞受体的核苷酸或功能相同的分子如本发明所定义；(3)将(2)所述细胞导入病人体内。
优选的是，该标地细胞是癌症细胞。更好的是，该癌症是可表达包含本发明的氨基酸序列的多肽的白血病或淋巴瘤。
本发明的一惊人发现是相对于相同组织的健康细胞，实体瘤的肿瘤细胞于细胞表面表达人类HLAII类分子。这个现象仅于Brasanac等人的文献中被报导过一次(BrasanacD,Markovic-LipkovskiJ,Hadzi-DjokicJ,MullerGA,MullerCA.ImmunohistochemicalanalysisofHLAclassIIantigensandtumorinfiltratingmononuclearcellsinrenalcellcarcinoma:correlationwithclinicalandhistopathologicaldata.Neoplasma.1999；46(3):173-8.)，于该文献中，37个肾细胞癌(RCC)冷冻切片，其中有25个透明细胞癌型(clearcelltype)、10个颗粒细胞癌型(granular)、2个嫌色细胞癌型(chromophobe)，施以针对HLA-DR、-DP、-DQ抗原的单株抗体间接免疫过氧化酶(immunoperoxidase)分析HLAII类抗原，以及以抗CD14、CD3、CD4与CD8单株抗体分析浸润于肿瘤中的单核细胞(TIM)。阳性细胞被半定量(semiquantitatively)，且免疫组织化学调查结果与肾细胞癌的临床资料(患者的年龄、性别、肿瘤大小与TNM期别)与组织病理学特性(细胞学、组织学、等级)相关联。所有肾细胞癌表达HLA-DR，92％表达HLA-DQ，73％表达HLA-DP抗原，其表达多寡为–DR>-DQ>-DP，但该组织病理学或临床上的参数间并无统计学上的重要相关。该文献中报导，单核细胞(monocyte)较T细胞多，且CD4阳性T细胞较CD8阳性T细胞多，其中T细胞较多且CD4阳性T细胞与CD8阳性T细胞数目大致相当的肿瘤有较大的直径。一些相关数据显示HLAII类抗原异常表达的肾细胞癌却较有侵略性，没被肿瘤细胞足够活化的T细胞(不论抗原表达能力)可能是导致这个现象的原因。
需了解此处提及集揭示的本发明特点，其使用不限于所提及的相关组合也包含不悖离本发明所指范围的单一状态。
本发明将会藉由参考以下图、序列表与例子作更详细的叙述。接下来的例子是仅供展示目的而非限制本发明。
SEQIDNo.1至SEQIDNo.49显示T细胞抗原表位的肽序列包含基于本发明的MHCI类呈现的肽。
SEQIDNo.50至SEQIDNo.79为表3中的肽序列。
图1显示三位肾细胞癌患者的HLAII类分子表达。其中在肾细胞癌患者RCC132中，其HLA阳性细胞较集中于边界(A、B)，而肾细胞癌患者RCC190与在肾细胞癌患者RCC211其HLAII类分子表达型态揭示一更均匀分布的管状架构(C、E、G)。连续的组织切片中可见CD68阳性的巨噬细胞揭示浸润肿瘤的单核免疫细胞与表达HLAII类分子的肿瘤细胞在一封闭空间的关系。以小鼠IgG而非其它特异抗原一致地显示阴性结果(H)。大写T标示出肿瘤。
图2显示FACS分析CD4阳性T细胞对IGFBP3169-181、MMP7247-262、CCND1198-212特异。此处所示的点代表细胞内IFNγ与抗CD4-FITC染色。
图3展示概要的显示在每个捐赠者针对每个肽可检测到抗原专一且可生产IFNγ的CD4阳性T细胞。图中显示每个捐赠者其可生产IFNγ的CD4阳性T细胞的百分比，以及所用于刺激的肽。细胞于96洞的培养皿中培育–每一捐赠者与每一肽7个洞。框线内的值是视为阳性：可生产IFNγ的CD4阳性T细胞的百分比是没有加肽的阴性控制组的2倍以上。以不相关的肽刺激后可检测到的可生产IFNγ的CD4阳性T细胞的百分比是与没有加肽的阴性控制组相关的(correlatewith)，除了1号捐赠者于第3次以IGFBP3169-181刺激。然而这个效果在第4次刺激时就看不到。
图4展示于CCA165(中度分化的结肠腺癌)中HLAII类分子的表达。于正常结肠黏膜的固有层(cpanel范围与a范围左边以星号标示)一般可观察到一些HLAII类阳性的巨噬细胞，但上皮细胞是一致地不表达HLAII类。然而，来自肿瘤不同区域的上皮细胞，可注意到HLAII类显着的表达，显示于范围a的右侧，范围b与范围d。
图5A与5B显示以质谱仪分析由初期人类肿瘤组织所分离出HLAII类分子后所冲提出的肽的序列。图5A：来自MMP7经自然处理与呈现的HLAII类配合体片段与SEQIDNo.1(SQDDIKGIQKLYGKRS)肽序列符合。标示的片段展示于表5。图5B：来自包含SEQIDNo.1合成肽片段。合成与天然处理的肽相同的片段模式并可推断与确认的这个来自人类MMP7HLAII类配合体先前未定性的肽序列(SEQIDNo.1)其一级氨基酸序列。
实施例
材料与方法
MHCII类免疫组织学：肿瘤以4％甲醛磷酸盐缓冲溶液固定，包埋于石蜡中，随后以苏木素-伊红染色并以光学显微镜观察。RCC的诊断是根据组织病理学与免疫组织学的常规检查(Fleming,S.andM.O'Donnell.2000.Surgicalpathologyofrenalepithelialneoplasms:recentadvancesandcurrentstatus.Histopathology36:195-202)。
为分别以免疫组织学方法监测MHCII类或CD68分子，5μm包埋于石蜡的组织切片以10mM、酸碱值6的柠檬酸盐缓冲溶液制备，接着与小鼠的抗HLA-DRα链单株抗体(TAL.1B5克隆，1:50稀释)或CD68抗体(PGM1克隆，1:50稀释)(DAKO，Hamburg，Germany)，或小鼠IgG1(2μg/ml，BDBiosciencesPharmingrn，SanDiago，USA)培育，并以VentanaiViewDAB检测试剂组(NexesSystem,VentanaMedicalSystems,Illkirch,France)呈色。组织切片随后以苏木素-伊红作对比染色，最后以荧光切片包埋剂(Entellan)包埋。
HLA-DR结合肽的冲提与分子分析：冷冻的肿瘤样本以前述方法(Weinschenk,T.,C.Gouttefangeas,M.Schirle,F.Obermayr,S.Walter,O.Schoor,R.Kurek,W.Loeser,K.H.Bichler,D.Wernet,S.Stevanovic,andH.G.Rammensee.2002.Integratedfunctionalgenomicsapproachforthedesignofpatient-individualantitumorvaccines.CancerRes.62:5818-5827)处理，肽则以HLA-DR特异单株抗体L243(Lampson,L.A.andR.Levy.1980.TwopopulationsofIa-likemoleculesonahumanBcellline.J.Immunol.125:293-299)根据标准步骤(Dengjel,J.,H.G.Rammensee,andS.Stevanovic.2005.GlycansidechainsonnaturallypresentedMHCclassIIligands.J.MassSpectrom.40:100-104)分离。
天然的肽混合物以反相终极HPLC系统(ReversedphaseUltimateHPLCsystem(Dionex,Amsterdam,Netherlands))偶合至Q-TOFI质谱仪(Waters,Eschborn,Germany)分析，或如前述(Lemmel,C.,S.Weik,U.Eberle,J.Dengjel,T.Kratt,H.D.Becker,H.G.Rammensee,andS.Stevanovic.2004.DifferentialquantitativeanalysisofMHCligandsbymassspectrometryusingstableisotopelabeling.Nat.Biotechnol.22:450-454)以反相CapLCHPLC系统偶合至Q-TOFUltimaAPI(Waters)。片段的质谱以人工或自动方式分析。
以高密度寡核苷酸微数组分析基因表达：以AffymetrixHumanGenomeU133Plus2.0寡核苷酸微阵列(Affymetrix,SantaClara,CA,USA)分析分离自肿瘤与自体的正常肾检体的RNA与基因表达如前面所描述(Krüger,T.,O.Schoor,C.Lemmel,B.Kraemer,C.Reichle,J.Dengjel,T.Weinschenk,M.Müller,J.Hennenlotter,A.Stenzl,H.G.Rammensee,andS.Stevanovic.2004.Lessonstobelearnedfromprimaryrenalcellcarcinomas:noveltumorantigensandHLAligandsforimmunotherapy.CancerImmunol.Immunother)。以GCOS软件(Affymetrix)分析资料。肿瘤与自体的正常肾检体一对对的比对计算，并以相对的正常数组作为基准。RCC149与RCC211无自体的正常肾检体的数组数据。因此，汇集的正常的人类肾检体RNA聚集购自Clontech,Heidelberg,Germany作为这些肿瘤检体的基准。
DCs的成熟：DCs制备是取自健康捐赠人的血液。简单的说，外周血液单核细胞以标准密度梯度离心(LymphocyteSeparationMedium,PAALaboratoriesGmbH,Pasching,Austria)分离并以浓度7×106细胞/ml覆以X-Vivo15培养基。在37℃2小时后，未附着的细胞被移除，而黏着的单核细胞在100ng/mlGM-CSF与40ng/mlIL-4(AL-ImmunoTools,Friesoythe,Germany)的X-Vivo培养基中，培养6天。在第7天，未成熟的DCs以10ng/mlTNF-α(R&DSystems,Wiesbaden,Germany)与20μg/mlpoly(IC)(SigmaAldrich,Steinheim,Germany)活化3天。
抗原特异的CD4阳性T细胞的产生：每洞106的外周血液单核细胞细胞以2x105自体DCs刺激，这些DCs事先经过规律地施予5μg/ml肽。细胞以T细胞培养基被培育于96洞的培养皿(每种肽每个捐赠者7个洞)：包含10ng/mlIL-12(Promocell,Heidelberg,Germany)的RPMI1640补充培养基。于37℃培养3-4天，加入新鲜的培养基、80U/mlIL-2(Proleukin,ChironCorporation,Emeryville,CA,USA)与5ng/mlIL-7(Promocell)。每6-8天重复以自体外周血液单核细胞规律地施予肽刺激一次。
细胞内IFNγ染色：于3-4次的刺激后，外周血液单核球细胞以X-Vivo15培养基清洗两次，再以107细胞/ml浓度重新悬浮于T细胞培养基中隔夜培养。第二天，外周血液单核球细胞规律地施予5μg/ml肽，并与效应细胞(effectorcell)以1：1比例培养6小时。再培养的最后4小时加入Golgi-Stop(BectonDickinson,Heidelberg,Germany)。
细胞以Cytofix/CytopermPlus试剂组(BectonDickinson)与CD4-FITC-(Immunotools),IFNγ-PE-与CD8-PerCP克隆SK1-抗体(BectonDickinson)分析。阴性对照组以收集自7个洞的细胞并分别与不相关的肽或不加肽培养。阳性对照组以PMA/Ionomycin刺激。细胞最后以3色FACSCalibur(BectonDickinson)分析。
实施例
RCC表达HLAII类
于正常、未发炎状况下，HLAII类仅表达于血细胞生成系统的细胞以及胸腺上皮(Mach,B.,V.Steimle,E.Martinez-Soria,andW.Reith.1996.RegulationofMHCclassIIgenes:lessonsfromadisease.Annu.Rev.Immunol.14:301-331)。这个情况在发炎时会改变。HLAII类表达可以IFNγ于多数种类细胞与组织被诱发(LeibundGut-Landmann,S.,J.M.Waldburger,M.Krawczyk,L.A.Otten,T.Suter,A.Fontana,H.Acha-Orbea,andW.Reith.2004.Mini-review:SpecificityandexpressionofCIITA,themasterregulatorofMHCclassIIgenes.Eur.J.Immunol.34:1513-1525)。因为RCC病例常伴随发炎(Blay,J.Y.,J.F.Rossi,J.Wijdenes,C.Menetrier-Caux,S.Schemann,S.Negrier,T.Philip,andM.Favrot.1997.Roleofinterleukin-6intheparaneoplasticinflammatorysyndromeassociatedwithrenal-cellcarcinoma.Int.J.Cancer72:424-430；U.,M.Rindsfuser,T.Grussenmeyer,W.Schultze-Seemann,andU.Wetterauer.2000.EnhancedexpressionofIFN-gammamRNAinCD4(+)orCD8(+)tumour-infiltratinglymphocytescomparedtoperipherallymphocytesinpatientswithrenalcellcancer.Br.J.Cancer83:637-641)，如前面所报导，第二型分子常于肿瘤邻近或肿瘤本身表达。
HLAII类分子免疫组织化学染色
在本发明人所分析的10个肾细胞癌包包含以免疫组织化学染色且在组织学上分类为透明肾细胞癌与乳头状肾细胞癌其HLAII类分子的表达，发现所有调查的样本中显示HLAII类分子阳性的肿瘤细胞。如图1A所示，在肿瘤周围经常可检测到明显的HLAII类分子表达。在这些区域，本发明人观察到一HLA阳性肿瘤细胞与浸润肿瘤的免疫细胞的密切的空间关联，由一连续的组织切片(图1B)中的CD68阳性巨噬细胞所显示。在一RCC揭示一个更为乳头状架构，HLAII类分子的表达更加均匀地分布于肿瘤中(图1C、E、G)。于一连续的组织切片中的HLAII类与CD68免疫组织化学染色型态的比较，清楚的显示除了巨噬细胞，肿瘤细胞也表达HLAII类(图1C、D与E、F)。生产IFNγ的CD4阳性的TH1细胞以及自然杀手细胞(NK细胞)浸润于RCC中(Cozar,J.M.,J.Canton,M.Tallada,A.Concha,T.Cabrera,F.Garrido,andO.F.Ruiz-Cabello.2005.AnalysisofNKcellsandchemokinereceptorsintumorinfiltratingCD4Tlymphocytesinhumanrenalcarcinomas.CancerImmunol.Immunother)。由于HLAII类阳性肿瘤细胞主要分布于切除的肿瘤外围，可以假设被肿瘤吸引的白细胞生产IFNγ作用于邻近的恶性细胞。在恶性组织中异常的表达HLAII类分子并不限于RCC，在TCC与CCA中也可检测到。图4显示人类结肠腺癌的组织样本的免疫组织化学染色。
分析IFN-γ的表达与IFN-γ诱发的基因转录
此外，本发明人使用寡核苷酸微数组比较基因表达以调查HLAII类分子表达。本发明人使用此技术可获得切除的肿瘤全部HLAII类分子的表达，不管表达的细胞是哪一种类。本发明人分析4个肿瘤样本-RCC149,RCC180,RCC190,与C211的不同的表达，与作为参考的正常肾脏比较。所有4个肿瘤样本其HLAII类基因都过度表达(表2)。造成这现象的一个可能的原因是由IFNγ所诱发的，因此本发明人寻找其它已知可被干扰素上调的基因(Kolchanov,N.A.,E.V.Ignatieva,E.A.Ananko,O.A.Podkolodnaya,I.L.Stepanenko,T.I.Merkulova,M.A.Pozdnyakov,N.L.Podkolodny,A.N.Naumochkin,andA.G.Romashchenko.2002.TranscriptionRegulatoryRegionsDatabase(TRRD):itsstatusin2002.NucleicAcidsRes.30:312-317)。有趣的是，在一个或多个肿瘤样本中，有相当数量的该类基因被发现过度表达。表2显示被干扰素上调的基因在所有4个样本中可被重复地诱发，与本发明人的早期发现相吻合(Weinschenk,T.,C.Gouttefangeas,M.Schirle,F.Obermayr,S.Walter,O.Schoor,R.Kurek,W.Loeser,K.H.Bichler,D.Wernet,S.Stevanovic,andH.G.Rammensee.2002.Integratedfunctionalgenomicsapproachforthedesignofpatient-individualantitumorvaccines.CancerRes.62:5818-5827)。其中，LMP2、LMP7、与MECL1–蛋白质针对细胞质中大的蛋白质分解完全酶-蛋白酶体的组成亚单位作交换，而形成免疫蛋白酶体。此正常表达的蛋白酶体的蛋白质分解亚单位与干扰素上调的亚单位作交换，印证了这是一个富含干扰素的环境。此外，IFN-γ直接以实时定量(逆转录)聚合酶链反应(TaqMan)分析。表2中，同一捐赠者中与自体正常RNA样本相较(数据未附)，肿瘤显示5至60倍IFN-γmRNA过度表达。因此，本发明人的结果指出IFN-γ在RCC中扮演重要角色且是造成大量HLAII类分子表达的原因。
表2：干扰素诱发基因的mRNA表达
肿瘤样本中的表达是与自体正常的肾组织(RCC180、RCC190)或是混合的正常肾(RCC149、RCC211)作比较。4个肿瘤样本的所有基因显示以GCOS软件的改变呼叫算法(change-callalgorithm)分析有“增加”的结果，且已被描述是干扰素所诱发。
分离自癌症组织的HLA-DR配合体
根据公开可取得资料，其它人迄今尚未分离或鉴定出可结合至表达于实体瘤组织的HLAII类分子上的肽。本发明人分析10个不同的RCC、3个CCA、1个TCC，从全部样本中可分离出HLA-DR配合体，共计453种肽(资料未附)。以偶合色层分析分离与串联质谱分析(LC-MS/MS)鉴定肽序列，如前述(Weinschenk,T.,C.Gouttefangeas,M.Schirle,F.Obermayr,S.Walter,O.Schoor,R.Kurek,W.Loeser,K.H.Bichler,D.Wernet,S.Stevanovic,andH.G.Rammensee.2002.Integratedfunctionalgenomicsapproachforthedesignofpatient-individualantitumorvaccines.CancerRes.62:5818-582；SchirleM,KeilholzW,WeberB,GouttefangeasC,DumreseT,BeckerHD,StevanovicS,RammenseeHG.Identificationoftumor-associatedMHCclassIligandsbyanovelT-cell-independentapproach.EurJImmunol.2000；30(8):2216-25)。一个重新以LC-MS/MS定序的肽显示于图5A与5B。所推测撞击片段的一级氨基酸序列标示于图5A与5B囊括于表5。这些肿瘤样本的HLA基因型、质量、以及所有鉴定出的HLA配合体数目皆不同。表3显示一来自示范肿瘤样本-RCC190，由该肿瘤样本所鉴定出的个别的肽以及相对应的来源蛋白质名单。如前面所描述(Dengjel,J.,P.Decker,O.Schoor,F.Altenberend,T.Weinschenk,H.G.Rammensee,andS.Stevanovic.2004.IdentificationofanaturallyprocessedcyclinD1T-helperepitopebyanovelcombinationofHLAclassIItargetinganddifferentialmassspectrometry.Eur.J.Immunol.34:3644-3651)分离出细胞的HLAII类分子所结合的肽。
表3：由RCC190分离出HLA-DR配合体实例名单
表中显示由RCC190分离出HLA-DR(HLA-DRB1*11,DRB1*15,DRB3,DRB5)配合体的核心序列。
肿瘤重量与所鉴定出的HLA-DR配合体数目之间并无相关。肽来源蛋白质可区分为两类。另一方面，一些应该为白细胞所呈现的配合体也被发现，例如来自补体组成的肽–如C3,C4A,C4结合蛋白α、以及其它与免疫细胞特殊功能相关的蛋白质-如CD14与IgG结合蛋白的Fc片段。另一方面，本发明人揭开来自过度表达TAA且为肿瘤细胞呈现的肽的本质与特性，如波形蛋白(vimentin)，基质金属蛋白酶-7(matrixmetalloproteinase7)，真核转译延长因子1α1(eukaryotictranslationelongationfactor1alpha1)，与尼克酰胺-N-甲基转移酶(nicotinamideN-methyltransferase)。这个观察与免疫组织化学数据(图1与图4)一致，并且展示HLAII类阳性的肿瘤细胞与浸润其中的白细胞出现于所分析样本中，其中所冲提出的肽其来源抗原被发现过度表达于这些不同的细胞。
为了鉴定来自TAA的肽，本发明人比较于肿瘤中以微数组分析检测到的过度表达基因个别配合体来源蛋白质(Weinschenk,T.,C.Gouttefangeas,M.Schirle,F.Obermayr,S.Walter,O.Schoor,R.Kurek,W.Loeser,K.H.Bichler,D.Wernet,S.Stevanovic,andH.G.Rammensee.2002.Integratedfunctionalgenomicsapproachforthedesignofpatient-individualantitumorvaccines.CancerRes.62:5818-5827；Krüger,T.,O.Schoor,C.Lemmel,B.Kraemer,C.Reichle,J.Dengjel,T.Weinschenk,M.Müller,J.Hennenlotter,A.Stenzl,H.G.Rammensee,andS.Stevanovic.2004.Lessonstobelearnedfromprimaryrenalcellcarcinomas:noveltumorantigensandHLAligandsforimmunotherapy.CancerImmunol.Immunother)。本发明人于RCC190检体中鉴定出一来自似胰岛素生长因子结合蛋白3的肽IGFBP3166-181。此外，两种包含相同且是必须并足以结合于HLA-DRB1*0101(请参考表一)的核心功能域的该肽的变种-IGFBP3169-181与IGFBP3169-184，于TCC108检体中被发现。从同一肿瘤中也分离出一来自基质金属蛋白酶-7,MMP7247-262的肽(表1)。于mRNA层级，总共23个分析的RCC检体中，MMP7于13个检体以及IGFBP3在22个检体过度表达(资料未附)。总结而言，最初所鉴定出的453个肽序列(资料未附)，其下的49个肽(SEQIDNos.1–49)根据本发明人的实验(资料含括于本文件中)或其它文献被发现与肿瘤有关(Miyamoto,S.,K.Yano,S.Sugimoto,G.Ishii,T.Hasebe,Y.Endoh,K.Kodama,M.Goya,T.Chiba,andA.Ochiai.2004.Matrixmetalloproteinase-7facilitatesinsulin-likegrowthfactorbioavailabilitythroughitsproteinaseactivityoninsulin-likegrowthfactorbindingprotein3.CancerRes.64:665-671；Sumi,T.,T.Nakatani,H.Yoshida,Y.Hyun,T.Yasui,Y.Matsumoto,E.Nakagawa,K.Sugimura,H.Kawashima,andO.Ishiko.2003.Expressionofmatrixmetalloproteinases7and2inhumanrenalcellcarcinoma.Oncol.Rep.10:567-570；Cheung,C.W.,D.A.Vesey,D.L.Nicol,andD.W.Johnson.2004.TherolesofIGF-IandIGFBP-3intheregulationofproximaltubule,andrenalcellcarcinomacellproliferation.KidneyInt.65:1272-1279；Hao,X.,B.Sun,L.Hu,H.Lahdesmaki,V.Dunmire,Y.Feng,S.W.Zhang,H.Wang,C.Wu,H.Wang,G.N.Fuller,W.F.Symmans,I.Shmulevich,andW.Zhang.2004.DifferentialgeneandproteinexpressioninprimarybreastmalignanciesandtheirlymphnodemetastasesasrevealedbycombinedcDNAmicroarrayandtissuemicroarrayanalysis.Cancer100:1110-1122；Helmke,B.M.,M.Polychronidis,A.Benner,M.Thome,J.Arribas,andM.Deichmann.2004.Melanomametastasisisassociatedwithenhancedexpressionofthesynteningene.Oncol.Rep.12:221-228；Hofmann,H.S.,G.Hansen,G.Richter,C.Taege,A.Simm,R.E.Silber,andS.Burdach.2005.Matrixmetalloproteinase-12expressioncorrelateswithlocalrecurrenceandmetastaticdiseaseinnon-smallcelllungcancerpatients.Clin.CancerRes.11:1086-1092；Kamai,T.,T.Yamanishi,H.Shirataki,K.Takagi,H.Asami,Y.Ito,andK.Yoshida.2004.OverexpressionofRhoA,Rac1,andCdc42GTPasesisassociatedwithprogressionintesticularcancer.Clin.CancerRes.10:4799-4805；Koninger,J.,N.A.Giese,F.F.diMola,P.Berberat,T.Giese,I.Esposito,M.G.Bachem,M.W.Buchler,andH.Friess.2004.Overexpresseddecorininpancreaticcancer:potentialtumorgrowthinhibitionandattenuationofchemotherapeuticaction.Clin.CancerRes.10:4776-4783；Mori,M.,H.Shimada,Y.Gunji,H.Matsubara,H.Hayashi,Y.Nimura,M.Kato,M.Takiguchi,T.Ochiai,andN.Seki.2004.S100A11geneidentifiedbyin-housecDNAmicroarrayasanaccuratepredictoroflymphnodemetastasesofgastriccancer.Oncol.Rep.11:1287-1293；Nagler,D.K.,S.Kruger,A.Kellner,E.Ziomek,R.Menard,P.Buhtz,M.Krams,A.Roessner,andU.Kellner.2004.Up-regulationofcathepsinXinprostatecancerandprostaticintraepithelialneoplasia.Prostate60:109-119；Nanda,A.,P.Buckhaults,S.Seaman,N.Agrawal,P.Boutin,S.Shankara,M.Nacht,B.Teicher,J.Stampfl,S.Singh,B.Vogelstein,K.W.Kinzler,andC.B.St.2004.IdentificationofabindingpartnerfortheendothelialcellsurfaceproteinsTEM7andTEM7R.CancerRes.64:8507-8511；Patel,I.S.,P.Madan,S.Getsios,M.A.Bertrand,andC.D.MacCalman.2003.Cadherinswitchinginovariancancerprogression.Int.J.Cancer106:172-177；Santelli,G.,D.Califano,G.Chiappetta,M.T.Vento,P.C.Bartoli,F.Zullo,F.Trapasso,G.Viglietto,andA.Fusco.1999.Thymosinbeta-10geneoverexpressionisageneraleventinhumancarcinogenesis.Am.J.Pathol.155:799-804；Schneider,D.,J.Kleeff,P.O.Berberat,Z.Zhu,M.Korc,H.Friess,andM.W.Buchler.2002.Inductionandexpressionofbetaig-h3inpancreaticcancercells.Biochim.Biophys.Acta1588:1-6；Welsh,J.B.,L.M.Sapinoso,S.G.Kern,D.A.Brown,T.Liu,A.R.Bauskin,R.L.Ward,N.J.Hawkins,D.I.Quinn,P.J.Russell,R.L.Sutherland,S.N.Breit,C.A.Moskaluk,H.F.Frierson,Jr.,andG.M.Hampton.2003.Large-scaledelineationofsecretedproteinbiomarkersoverexpressedincancertissueandserum.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A100:3410-3415；Xie,D.,J.S.Sham,W.F.Zeng,L.H.Che,M.Zhang,H.X.Wu,H.L.Lin,J.M.Wen,S.H.Lau,L.Hu,andX.Y.Guan.2005.Oncogenicroleofclusterinoverexpressioninmultistagecolorectaltumorigenesisandprogression.WorldJ.Gastroenterol.11:3285-3289)。以可结合至HLA-DR的肽其刺激免疫系统的能力示范分析中显示有针对IGFBP3169-181与MMP7247-262的CD4阳性T细胞存在：
示范的肽SEQIDNo.1杂乱的结合至数种HLA-DR等位基因可以几种不同方法揭示：特定MHC/HLA配合体分子在一级序列的某些位置带有化学上相关的氨基酸，该序列定义了每个MHC/HLA的肽功能域(FalkK,RotzschkeO,StevanovicS,JungG,RammenseeHG.Allele-specificmotifsrevealedbysequencingofself-peptideselutedfromMHCmolecules.Nature.1991；351(6324):290-6)。SYFPEITHI利用由精密的功能域矩阵，该功能域矩阵是特别基于天然配合体的Edman降解与串联的质谱仪分析推测而得Edman降解与肽的串联式质谱图。这些矩阵使我们可预测由MHCI类或II类分子所呈现的蛋白质序列的肽(RotzschkeO,FalkK,StevanovicS,JungG,WaldenP,RammenseeHG.ExactpredictionofanaturalT-cellepitope.EurJImmunol.1991；21(11):2891-4)。
应用这些由SYFPEITHI算法(Rammensee,H.G.,J.Bachmann,andS.Stevanovic.1997.MHCLigandsandPeptideMotifs.Springer-Verlag,Heidelberg,Germany；RammenseeH,BachmannJ,EmmerichNP,BachorOA,StevanovicS.SYFPEITHI:databaseforMHCligandsandpeptidemotifs.Immunogenetics.1999；50(3-4):213-9)所得的预测原则于前述的示范肽序列(SEQIDNo.1)，针对SEQIDNo.1可结合的数种常见HLA-DR等位基因(见表7)排序。该算法已经被成功地使用于预测不同抗原的HLAI类或II类分子抗原表位，如来自人类TAATRP2(预测为HLAI类配合体)(34)与SSX2(预测为HLAII类配合体)(NeumannF,WagnerC,StevanovicS,KubuschokB,SchormannC,MischoA,ErtanK,SchmidtW,PfreundschuhM.IdentificationofanHLA-DR-restrictedpeptideepitopewithapromiscuousbindingpatternderivedfromthecancertestisantigenHOM-MEL-40/SSX2.IntJCancer.2004；112(4):661-8)。18分或较高分以显示专一的结合，是基于先前发表的混杂地结合HLA-DR的肽配合体的结合分数的分析结果。混杂地结合的定义是：于SYFPEITHI测试中肽有高结合强度如所示18分或较高分数，可结合至2或更多HLA-DR等位基因。最常见的HLA-DR等位基因摘录于表7。HLA-A与HLA-DR的连锁不平衡(linkagedisequilibrium)导致HLA-A2重组且特殊的HLA-DRs较常出现。在这两个例子中，这些肿瘤其HLA-DR的基因型经分析与确认为HLA-DRB1*11与DRB1*15。最常见的HLAII类等位基因(DRB1*0101、DRB1*0301、DRB1*0401、DRB1*0701、DRB1*1101与DRB1*1501)其优选的锚氨基酸残基摘录于表4。例如，HLAII类等位基因DRB1*0301的肽结合槽其任一肽核心序列的由N至C端的1、4、6与9有特别的氨基酸残基。特别的是，在下述状况时DRB1*0301显示良好的结合能力：如果核心序列于位置4有谷氨酸盐残基时，或于位置1有亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、苯丙氨酸(F)、甲硫氨酸(M)或缬氨酸(V)，或于位置6有赖氨酸(K)、精氨酸(R)、谷氨酸(E)、谷氨酰胺(Q)或天冬酰胺(N)，或于位置9有酪氨酸(Y)、亮氨酸(L)或苯丙氨酸(F)。
表4：常见HLA-DR等位基因的肽功能域
摘录于此的是以一英文字母表示的于相关结合口袋(bindingpockets)的锚氨基酸残基。
由www.syfpeithi.de所提供基于预测HLA分子与肽序列的计算器算法所得的计算器仿真分析结果，指出肽MMP7247-262SEQIDNo.1混杂地结合于数种HLA-DR等位基因。根据预测分析的结果，包含SEQIDNo.1的肽在与DRB1*1101、DRB1*1501、DRB1*0401、DRB1*0301与DRB1*0101(表7)之间的反应得到交高分数。在这HLA-DR等位基因与肽氨基酸序列结合强度的分析中已经涵盖约69.6％HLA-A2阳性的高加索人(MoriM,BeattyPG,GravesM,BoucherKM,MilfordEL.HLAgeneandhaplotypefrequenciesintheNorthAmericanpopulation:theNationalMarrowDonorProgramDonorRegistry.Transplantation.1997；64(7):1017-27)。因为目前尚无HLA-DR15发生频率的数据，这个等位基因就不列入本文用以计算结果HLA-A2阳性的高加索人族群涵盖率中。因此，就SEQIDNo.1而言其族群涵盖率很可能高于69.6％，这也指出，对大多数癌症患者来说，该肽是发展药学制剂的一个相当好候选标的。
然而，应用预测的算法只会导致最终的结果，如果该结果经过计算器分析结合实验确认是混杂地结合，如之前其它人的实验发现一肽序列经预测是一个好的结合体，但实验发现该肽无法启动免疫反应(BohmCM,HanskiML,StefanovicS,RammenseeHG,SteinH,Taylor-PapadimitriouJ,RieckenEO,HanskiC.IdentificationofHLA-A2-restrictedepitopesofthetumor-associatedantigenMUC2recognizedbyhumancytotoxicT-cells.IntJCancer.1998；75(5):688-93)。该人造预测就如先前所提及例子大部分无法排除，因为该算法没考虑该肽是否于活体状况(于活细胞中)可产生。实验确认可藉由收集离体中的生化测试资料，如藉由展示该肽是否能启动免疫反应。因此，为了以实验确认SEQIDNo.1的混杂地结合，我们收集此类离体中实验资料。以该肽于离体中对T细胞激发实验测试其免疫刺激能力，我们使用IGFBP3与MMP7肽的最短变异(“核心序列”)–IGFBP3169-181与MMP7247-262。
为了产生抗原特异的CD4阳性T细胞并测试该肽其混杂地结合能力，来自4位具不同HLA-DR等位基因(图2)(其中一人带有DRB1*1101)的健康捐赠人的外周血液单核细胞，以肽规律地刺激自体树突细胞(DCs)。此外，一已知T细胞抗原表位-CCND1198-212肽(Dengjel,J.,P.Decker,O.Schoor,F.Altenberend,T.Weinschenk,H.G.Rammensee,andS.Stevanovic.2004.IdentificationofanaturallyprocessedcyclinD1T-helperepitopebyanovelcombinationofHLAclassIItargetinganddifferentialmassspectrometry.Eur.J.Immunol.34:3644-3651)，作为阳性控制组。以流式细胞计量术测量IFN-γ高低，作为一测量产生抗原特异CD4阳性T细胞的系统。于3至4次的每周刺激后，以细胞内IFN-γ染色加上CD4-FITC与CD8-PerCP染色以决定于特殊T细胞族群中IFN-γ产生的细胞百分比作分析。于所有的实验中，以不相关的肽或不加肽者作为阴性对照组。如果，产生IFN-γ的CD4阳性T细胞百分比是阴性对照组的2倍以上，则该实验被视为是阳性IFN-γ反应(Horton,H.,N.Russell,E.Moore,I.Frank,R.Baydo,C.Havenar-Daughton,D.Lee,M.Deers,M.Hudgens,K.Weinhold,andM.J.McElrath.2004.Correlationbetweeninterferon-gammasecretionandcytotoxicity,invirus-specificmemoryT-cells.J.Infect.Dis.190:1692-1696)。
对该2种肽，本发明人发现4位捐赠人中有3人的细胞均可产生特异的CD4阳性T细胞(图2)。在任何刺激后，没观察到有任何T细胞反应于4号捐赠人检体中。于1号捐赠人的7个检体中经过施以第3次IGFBP3169-181肽后，有0.05％至0.1％(图3)产生IFN-γ的CD4阳性T细胞被检测到。这些T细胞于大多数的例子，藉由多一次的刺激可被扩增为0.09％至0.13％。于2号与3号捐赠人亦可发现IGFBP3169-181肽特异的产生IFN-γ的CD4阳性T细胞，其产生IFN-γ的CD4阳性T细胞最大的频率是0.05％至0.07％。
1号、2号与3号捐赠人亦有对MMP7247-262肽的CD4阳性T细胞反应。其产生IFN-γ且对MMP7247-262肽特异的CD4阳性T细胞最高的频率分别于1号、2号捐赠人中发现。1号、2号与3号捐赠人对CCND1198-212肽有IFN-γ反应，此肽已经被证实是一种MHCII类限制的T细胞抗原表位(Dengjel,J.,P.Decker,O.Schoor,F.Altenberend,T.Weinschenk,H.G.Rammensee,andS.Stevanovic.2004.IdentificationofanaturallyprocessedcyclinD1T-helperepitopebyanovelcombinationofHLAclassIItargetinganddifferentialmassspectrometry.Eur.J.Immunol.34:3644-3651)。
因此，来自IGFBP3、MMP7与CCND1的肽是HLAII类的混杂地结合者，且可于4个带有不同HLA-DR等位基因健康捐赠人的3人中诱发CD4阳性T细胞反应。如果以IGFBP3与MMP7来源的两位肿瘤患者其HLA等位基因与4位健康捐赠人相较，很明显地这些肽是由HLA-DRB1*01、HLA-DRB1*04与HLA-DRB1*11所呈现。前述提及的所有HLA-DR的同种异型分别在位置86处皆有一甘氨酸的氨基酸残基，在β链的位置57有天门冬氨酸(参见www.anthonynolan.com/HIG)。因此，他们有非常相似的结合特性于其结合口袋(bindingpocket)P1与P9(Rammensee,H.G.,J.Bachmann,andS.Stevanovic.1997.MHCLigandsandPeptideMotifs.Springer-Verlag,Heidelberg,Germany)。对CCND1198-212肽而言，已知一T细胞抗原表位可被HLA-DRB1*0401andHLA-DRB1*0408(Dengjel,J.,P.Decker,O.Schoor,F.Altenberend,T.Weinschenk,H.G.Rammensee,andS.Stevanovic.2004.IdentificationofanaturallyprocessedcyclinD1T-helperepitopebyanovelcombinationofHLAclassIItargetinganddifferentialmassspectrometry.Eur.J.Immunol.34:3644-3651)所呈现，一样有效。4号捐赠人带有HLA-DRB1*0318与HLA-DRB1*1401，这两个等位基因的肽功能域与前述的β链一级氨基酸序列不同。这可解释在这个捐赠人中为何无法以该2种肽诱发T细胞反应。
有趣的是，在以这三种肽刺激后于两位捐赠人-特别是3号捐赠人，而在1号捐赠人也发现较少量的产生IFN-γ的CD8阳性细胞毒性T细胞(资料未附)。
表5：
表6：
表6：北美高加索人族群其单元型频率。此处显示为血清学单元型。“n.a.”代表未指定。
表7：SEQNo.1对常见的HLA-DR等位基因的结合分数
此处显示为SEQNo.1与SEQNo.25对高加索人族群最常见HLA-DRB1(等位基因)等位基因其SYFPEITHI结合分数。括号中的数字是相对应的HLA-A2阳性的高加索人血清学频率。这些肽只要是分数等于或大于18就可被认为足以与HLAII类分子产生良好结合。

Claims (32)

1.肿瘤相关肽，所述肽选自包含任意的SEQIDNo.33、SEQIDNo.43、SEQIDNo.31、SEQIDNo.2至SEQIDNo.32、SEQIDNo.34至SEQIDNo.41及SEQIDNo.44至SEQIDNo.49或前述肽的变体中的至少一个序列的肽，条件是所述肽不是完整的人类肿瘤相关多肽。
2.如权利要求1所述的肿瘤相关肽，其中所述肽基本上包含任一的SEQIDNo.2至SEQIDNo.41及SEQIDNo.43至SEQIDNo.49或其变体的氨基酸序列。
3.如权利要求1或2所述的肿瘤相关肽，其中所述肽具有9至100个氨基酸，优选为9至30个氨基酸的总长度。
4.如权利要求1-3中任一权利要求所述的肿瘤相关肽，所述肽包含任一的SEQIDNo.2至SEQIDNo.41及SEQIDNo.43至SEQIDNo.49的氨基酸序列。
5.如权利要求1-4中任一权利要求所述的肿瘤相关肽，所述肽具有结合于人类主要组织相容复合体(MHC)II类分子，特别是HLA-DRB1*0101的能力。
6.如权利要求5所述的肿瘤相关肽，所述肽具有结合于至少一种人类主要组织相容复合体(MHC)II类的其它分子的能力。
7.如权利要求1-6中任一权利要求所述的肿瘤相关肽，其中所述肽包含非肽键。
8.如权利要求1-7中任一权利要求所述的肿瘤相关肽，其中所述肽是融合蛋白，特别是包含HLA-DR抗原相关不变链(Ii)的N端氨基酸。
9.核酸，其编码权利要求1-8中任一权利要求所述的肽。
10.如权利要求9所述的核酸，其是DNA、cDNA、PNA、CNA、RNA或前述的混合。
11.能够表达权利要求9或10所述核酸的表达载体。
12.包含权利要求9或10的核酸或权利要求11的表达载体的宿主细胞。
13.如权利要求12所述的宿主细胞，其是重组的RCC或Awells细胞。
14.生产权利要求1-8中任一权利要求的肿瘤相关肽的方法，所述方法包括培养权利要求13所述的宿主细胞以及从所述宿主细胞或其培养基中分离所述肽。
15.药物组合物，其包含权利要求1-8中任一权利要求的肿瘤相关肽、权利要求9或10的核酸或权利要求11的表达载体，及制药学上可接受的载体。
16.如权利要求15所述的药物组合物，其为癌症疫苗形式，任选包含至少一种适合的佐剂。
17.权利要求1-8中任一权利要求的肿瘤相关肽、权利要求9或10的核酸或权利要求11的表达载体在医学中的用途。
18.杀伤患者的靶细胞的方法，所述患者的靶细胞异常表达包含权利要求1-6中任一权利要求给出的氨基酸序列的多肽，所述方法包括给予所述患者有效量的权利要求1-8中任一权利要求的肽、权利要求9或10的核酸或权利要求11的表达载体，其中所述肽的量或所述核酸的量或所述表达载体的量，对激发所述患者中抗靶细胞的免疫反应是有效的。
19.权利要求1-8中任一权利要求的肿瘤相关肽、权利要求9或10的核酸或权利要求11的表达载体在制造用于杀伤患者的靶细胞的药物中的用途，其中所述患者的靶细胞异常表达包含权利要求1-6中任一权利要求给出的氨基酸序列的多肽。
20.权利要求1-8中任一权利要求的肿瘤相关肽、权利要求9或10的核酸或权利要求11的表达载体在制造用于诱导抗实体肿瘤细胞的免疫反应、特别是细胞性免疫反应、尤其是T细胞介导的免疫反应的药物中的用途，所述实体肿瘤细胞在其表面表达人类MHCII类分子，并呈现权利要求1-6中任一权利要求给出的氨基酸序列的多肽。
21.体外产生活化的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的方法，所述方法包含将体外接触抗原加载的在适合的抗原提呈细胞表面表达的人类MHCII类分子足够的时间，从而以抗原特异的方式活化所述CTL，其中所述抗原为权利要求1-8中任一权利要求所述的肽。
22.如权利要求21所述的方法，其中所述抗原通过将充足量的所述抗原与抗原提呈细胞接触，加载于在适合的抗原提呈细胞表面表达的MHCII类分子上。
23.如权利要求21所述的方法，其中所述抗原提呈细胞包含权利要求11所述的表达载体。
24.如权利要求21-23中任一权利要求所述的方法，其中所述MHCII类分子是HLA-DRB1*0101。
25.权利要求21-24中任一权利要求所述的方法产生的活化的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)，其选择性识别异常表达包含权利要求1-6中任一权利要求给出的氨基酸序列的多肽的细胞。
26.T细胞受体(TCR)，其识别异常表达包含权利要求1-6中任一权利要求给出的氨基酸序列的多肽的细胞，所述TCR获得自权利要求24或25的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)或是所述TCR的功能等价分子。
27.编码权利要求25或26的T细胞受体(TCR)的核酸。
28.能够表达权利要求25或26的T细胞受体(TCR)的表达载体。
29.杀伤患者的靶细胞的方法，所述患者的靶细胞异常表达包含权利要求1-6中任一权利要求给出的氨基酸序列的多肽，所述方法包含给予所述患者有效数量的权利要求25或26定义的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。
30.杀伤患者的靶细胞的方法，所述患者的靶细胞异常表达包含权利要求1-6中任一权利要求给出的氨基酸序列的多肽，所述方法包括以下步骤：
(1)从所述患者获得细胞毒性T淋巴细胞(CTL)；
(2)将编码权利要求25或26定义的T细胞受体(TCR)或功能等价分子的核酸引入所述细胞；
(3)将步骤(2)中产生的细胞引入所述患者。
31.如权利要求18、29或30中任一权利要求所述的杀伤患者的靶细胞的方法，其中所述靶细胞是癌症细胞，特别是实体肿瘤细胞，所述实体肿瘤细胞在其表面表达人类MHCII类分子，并呈现权利要求1-6中任一权利要求给出的氨基酸序列的多肽。
32.权利要求25或26定义的细胞毒性T淋巴细胞在制造用于杀伤患者的靶细胞的药物中的用途，所述患者的靶细胞异常表达包含权利要求1-6中任一权利要求给出的氨基酸序列的多肽。
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