KR20130019033A - 인간 백혈구 항원(ｈｌａ) 유형 ｉｉ 분자에 불규칙적으로 결합하는 종양 관련 펩티드 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 면역 요법 및 면역 요법에 사용하기 위한 분자 및 세포에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 암에 대한 면역 요법에 대한 것이다. 더욱이 본 발명은 종양 관련 보조 T 세포 펩티드 항원결정인자와 밀접한데 (다른 종양 관련 펩티드의 결합 유무와 관계없이), 이 결정인자는 항 종양 면역 반응을 자극하는 백신 물질의 활성 약학 조성물으로 작용한다. 특히, 본 발명은 항 종양 면역 반응을 위해서 사용될 수 있는 백신 성분 중 인간종양세포의 HLA 유형 II 분자에서 비롯한 49개의 새로운 펩티드 서열을 제시한다.

Description

인간 백혈구 항원(ＨＬＡ) 유형 ＩＩ 분자에 불규칙적으로 결합하는 종양 관련 펩티드{TUMOR-ASSOCIATED PEPTIDES BINDING PROMISCUOUSLY TO HUMAN LEUKOCYTE ANTIGEN(HLA) CLASS II MOLECULES}
본 발명은 면역 요법 및 면역 요법에 사용하기 위한 분자 및 세포에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 암(그 중에서도 신장암과 결장암)에 대한 면역 요법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 항 종양 면역 반응(anti-tumor immune responses)을 자극하는 백신 조성물의 활성 약물 성분으로서 작용하는, 종양 관련 보조 T 세포 펩티드 항원결정인자(tumor-associated T-helper cell peptide epitopes) 단독 또는 다른 종양 관련 펩티드와 조합된 종양 관련 보조 T 세포 펩티드 항원결정인자에 관한 것이다. 특히, 항 종양 면역 반응을 유발하기 위한 백신 조성물에 사용되는 인간 종양 세포주의 HLA 유형 II 분자에서 유래한 49개의 새로운 펩티드 서열에 관한 것이다.
본원에 인용된 문헌들은 그 전체가 참고로서 인용된다.
면역 반응은 숙주 면역계에 이종(foreign)으로서 인식되는 항원의 존재에 따라 일어난다. 종양 관련 항원의 발견으로 숙주의 면역계를 이용하여 종양의 성장을 막을 수 있는 가능성이 열렸다. 체액성(humoral)과 세포성(cellular) 면역계를 모두 이용하는 다양한 기전들이 현재 암 면역치료를 위해 활발히 연구되고 있다.
세포성 면역 반응의 특정 요소들은 종양 세포를 특이적으로 인식하여 파괴할 수 있다. 종양 침윤성 세포군(Tumor-infiltrating cell populations) 또는 말초 혈액으로부터 세포독성 T 세포(cytotoxic T-cells: CTL)를 단리하는 것은, 이 세포들이 암에 대항하여 자연적인 면역 방어작용에 중요한 역할을 수행함을 의미한다(문헌[Cheever 외, Annals N.Y. Acad. Sci. 1993 690:101-112]). 특히 CD8 양성 T 세포(TCD8+)는 세포질에 위치한 단백질에서 유래된 8 내지 10 개의 잔기를 갖는 주조직 적합성 복합체(major histocompatibility complex: MHC) 함유 펩티드의 유형 I 분자를 인식하며, 이 반응에서 매우 중요한 역할을 담당한다. 인간의 MHC 분자 또한 인간 백혈구 항원(HLA)을 의미한다.
MHC 분자는 두 가지로 나뉘어진다: MHC-I- 분자는 핵을 가진 대부분의 세포에서 발견되며, 이 핵은 큰 펩티드 및 내인성 단백질의 단백질 가수 분해로 인해 발생되는 펩티드가 존재한다. 이와 달리 MHC-II-분자는 전문 항원제시세포(antigen presenting cells: APC)에서만 발견되며, 내포작용(endocytosis)이 이루어지는 동안 항원제시세포에 의해 이입된 후 가공된 외인성 단백질 펩티드가 존재한다. 펩티드 및 MHC-I의 복합체는 CD8 양성 세포독성 T 림프구(CD8-positive cytotoxic T-lymphocytes)에 의해 인식되며, 펩티드 및 MHC-II의 복합체는 CD4 양성 보조 T 세포(CD4-positive-helper-T-cells)에 의해 인식된다.
CD4 양성 보조 T 세포는 항종양 T 세포(anti-tumor T-cell) 반응의 효과기 역할을 조율하는 데 아주 중요한데, 이러한 이유로 종양 관련 항원(tumor associated antigen: TAA)으로부터 유래된 CD4 양성 보조 T 세포 항원결정인자를 식별하는 것이, 항 종양 면역 반응을 일으킬 수 있는 약물 발명에 있어 주요한 과제이다(문헌[Kobayashi,H., R. Omiya, M. Ruiz, E. Huarte, P. Sarobe, J. J. Lasarte, M. Herraiz, B. Sangro, J. Prieto, F. Borras-Cuesta, and E. Celis. 2002, 암배아항원으로부터 보조 T 림프구에 대한 항원결정인자의 구별. Clin. Cancer Res . 8:3219-3225., Gnjatic, S., D. Atanackovic, E. Jㅴger, M. Matsuo, A. Selvakumar, N.K. Altorki, R.G. Maki, B. Dupont, G. Ritter, Y.T. Chen, A. Knuth, and L.J. Old. 2003. 암환자에서의 NY-ESO-1에 대해 자연적으로 발생하는 CD4+ T세포 반응 조사: 항체 반응과의 관련성: Proc . Natl. Acad . Sci .U.S.A. 100(15):8862-7]).
마우스와 같은 포유동물 모델에서 나타나듯이, CTL 효과기 세포(즉, CD8 양성 T 림프구)가 없더라도, CD4 양성 T 세포는 인터페론 감마(IFNγ) 분비로 인한 혈관신생 억제과정을 통해 종양의 가시화를 억제하기에 충분하다(문헌[Qin, Z. and T. Blankenstein. 2000. CD4+ T세포 매개의 종양 거부는 비조혈세포에 의한 인터페론 감마(IFNγ) 수용체 발현에 따른 혈관형성의 억제를 필요로 한다 Immunity. 12:677-686]). 또한, HLA 유형 II 분자에 의해 제시된 종양 관련 항원으로부터의 펩티드를 인식하는 CD4 양성 T 세포가, 항체(Ab) 반응을 유도하여 종양의 진행을 막을 수 있음이 입증되었다(문헌[Kennedy, R.C., M.H. Shearer, A.M. Watts, and R.K. Bright. 2003. CD4+ T 림프구는 원숭이 바이러스 40 큰 종양 항원에 대한 항체형성 및 종양면역에 결정적인 역할을 한다. Cancer Res. 63:1040-1045]). HLA 유형 I 분자에 결합하는 종양 관련 펩티드와 반대로, 종양 관련 항원의 유형 II 리간드 소수만이 알려져 있다(www.cancerimmunity.org, www.syfpeithi.de). HLA 유형 II 분자의 구조적 발현은 일반적으로 면역계의 세포로 제한되므로(문헌[Mach, B., V. Steimle, E. Martinez-Soria, and W. Reith. 1996. MHC II 유전자의 조절: 질병으로부터의 교훈. Annu. Rev. Immunol. 14:301-331]), 유형 II 펩티드를 일차 종양으로부터 직접적으로 단리하는 것은 가능한 것으로 고려되지 않는다. 따라서, 항원제시세포의 유형 II 처리 경로로 항원을 유인하는 수많은 전략이 기술되어 왔다(예를 들면, 항원제시세포가 이입되어 가공되고 제시될 수 있도록 관심 있는 항원과 함께 항원제시세포를 배양하는 것(문헌[Chaux, P., V. Vantomme, V. Stroobant, K. Thielemans, J. Corthals, R. Luiten, A.M. Eggermont, T. Boon, and B.P. van der Bruggen. 1999. CD4(+) T 림프구에 대해 HLA-DR이 발현하는 MAGE-3 항원결정인자의 구별. J. Exp . Med. 189:767-778]), 또는 관심 있는 항원을 암호화하고 불변 쇄에 융합된 유전자 또는 미니 유전자(minigene)에 의해 세포를 형질감염하여 항원의 리소솜 MHC 유형 II 가공 및 조립 구획(MIIC)으로의 전위를 매게하는 것이 있다).
펩티드가 세포성 면역 반응을 유도하기 위해서는, MHC 분자와 결합해야 한다. 이 과정은 MHC-분자의 대립유전자 및 펩티드의 아미노산 서열의 특이적 다형성(polymorphism)에 따라 달라진다. MHC-유형 I 결합 펩티드는 상응하는 MHC-분자의 결합 그루브(binding groove)와 상호작용하는 서열에서 보통 8 내지 10개의 잔기를 가지며, 2개의 보존성 잔기(고정(anchor))를 포함한다.
염증이 없을 시에, MHC 유형 II 분자의 발현은 면역계 세포(특히, 단핵구, 단핵구 유래 세포, 대식세포, 수지상세포 등의 전문 항원제시세포)로 주로 제한된다.
종양 특이적 CTL에 의해 인식되는 항원, 즉 항원결정인자는 효소, 수용체, 전사 인자 등과 같은 모든 종류의 단백질로부터 유래된 분자일 수 있다. 게다가 한 예로 종양 관련 항원은 종양 세포에만 존재하는데, 예를 들면 돌연변이 유전자의 산물로서, 또는 대체 오픈리딩프레임(ORF)으로부터 또는 단백 스플라이싱으로부터의 것일 수 있다(문헌[Vigneron N, Stroobant V, Chapiro J, Ooms A, Degiovanni G, Morel S, van der Bruggen P, Boon T, Van den Eynde BJ. 프로테아좀에서 펩티드 스플라이싱에 의해 생성된 항원성 펩티드. Science. 2004 Apr 23;304 (5670):587-90.]). 종양 관련 항원의 또 다른 중요 부류는 조직 특이적 구조, 예컨대 다양한 종류의 종양 및 고환의 건강한 조직에 발현되는 고환암 항원이다.
다양한 종양 관련 항원이 밝혀졌다. 게다가, 현재 추가적인 종양 관련 항원을 밝히기 위한 연구 노력이 활발하다. 종양 관련 항원의 일부 군들은 또한 종양 특이적 항원으로서 불리는데, 이들은 조직 특이적이다. 이 예로는 흑색종의 티로시아나제(tyrosinase), 전립선암에 대한 PSA와 PSMA, 림프종에 대한 bcr/abl 등의 염색체 교차가 있지만, 이에 제한되지 않는다. 그러나, 식별된 많은 종양 관련 항원은 다양한 종양 유형에서 발생하며, 실제로 형질전환을 유발하는 발암성 단백질 및/또는 종양 억제 유전자 같은 일부 종암 관련 항원은 거의 모든 종양 유형에서 발생한다(종양억제유전자는 한 예로 문헌[Linehan WM, Walther MM, Zbar B. 신장암의 유전적 근거. J Urol. 2003 Dec;170(6 Pt 1):2163-72]에서 신장암에 대한 보고가 있다). 예를 들어, p53(종양 억제 유전자의 예), ras, c-met, myc, pRB, VHL, 및 HER-2/neu와 같은 세포 성장 및 분화를 조절하는 정상 세포성 단백질은 돌연변이를 축적할 수 있는데, 이는 결국 이들 유전자 산물의 발현의 상향조절로 이어져 이들을 발암성 물질로 변화시키게 된다(문헌[McCartey 외. Cancer Research 1998 15:58 2601-5; Disis 외. Ciba Found. Symp. 1994 187:198-211]). 이러한 돌연변이 단백질은 다양한 유형의 암에서 종양 특이적 면역 반응의 표적일 수 있다.
종양 특이적 항원으로서 CTL에 의해 단백질이 인식되고, 이것이 치료에 사용되기 위해서는, 특정 선행조건들이 충족되어야 한다. 항원은 정상적인 건강한 조직이 아닌, 종양 세포에 의해 주로 또는 다소 적은 양으로 발현되어야 한다. 개개의 항원이 한 유형의 종양에 있는 것은 물론이고, 높은 농도로 존재하는 것이 더욱 바람직하다(예: 세포당 복사된 수). 무엇보다 항원의 아미노산 서열에서 항원결정인자의 존재가 필수적인데, 이는 종양 관련 항원으로부터 유래된 펩티드(면역성 펩티드)가 시험관내 또은 생체내에서 T 세포 반응을 유발하기 때문이다.
현재까지, 표적 항원을 유형 II 가공 경로에 도입하기 위한 수많은 전략들이 소개되었다. 관심 있는 항원과 함께 항원제시세포를 배양하면 항원이 도입되고 가동될 수 있다(문헌[Chaux, P., Vantomme, V., Stroobant, V., Thielemans, K., Corthals, J., Luiten, R., Eggermont, A. M., Boon, T. & van der, B. P. (1999) J. Exp. Med. 189, 767-778]). 다른 전략은 융합 단백질을 사용하는데, 이 단백질은 리소솜 표적 서열(lysosomal target sequences)을 함유하고 있다. 항원제시세포에서 발현하는 이러한 융합 단백질은 항원을 직접적으로 유형 II 가공 구획으로 옮긴다(문헌[Marks, M. S., Roche, P. A., van Donselaar, E., Woodruff, L., Peters, P. J. & Bonifacino, J. S. (1995) J. Cell Biol. 131, 351-369, Rodriguez, F., Harkins, S., Redwine, J. M., de Pereda, J. M. & Whitton, J. L. (2001) J. Virol. 75, 10421-10430]).
보조 T 세포는 항 종양 면역에서 CTL의 효과기 기능을 조율하는데 매우 중요한 역할을 한다. TH1 유형의 보조 T 세포 반응을 유도하는 보조 T 세포 항원결정인자는 CD8 양성 살해 T 세포(CD8-positive Killer T-cells)의 효과기 기능을 지원하는데, 이 기능은 세포 표면에 종양 관련 펩티드/MHC 복합체를 나타내는 종양 세포에 대항하는 세포독성 기능을 포함한다. 이러한 방식으로, 종양 관련 보조 T 세포 펩티드 항원결정인자는 다른 종양 관련 펩티드와 함께 또는 단독으로 항 종양 면역 반응을 자극하는 백신 조성물의 활성 약학 성분으로서 작용할 수 있다.
그러므로, 종양 백신 발명의 주된 업무는 CD4 양성 CTL에 의해 인식될 수 있는 새로운 종양 관련 항원 및 이로부터 유래된 면역성 보조 T 세포 항원결정인자를 식별 및 특성화하는 것이다. 따라서, 인간의 MHC 유형 II 분자에 결합할 수 있는 펩티드에 대한 새로운 아미노산 서열을 제공하는 것이 본 발명의 목적이다.
본 발명에 따라, 이러한 목적은 종양 관련 펩티드에 의해 성취될 수 있는데, 여기서 이 펩티드는 첨부된 서열 리스트의 임의의 서열 번호 1 내지 서열 번호 49에 따른 하나 이상의 서열을 포함하는 펩티드의 군으로부터 선택되며, 이때 펩티드가 무손상 인간 종양 관련 폴리펩티드가 아닌 한, 그 펩티드는 인간 MHC 유형-II 분자에 결합할 수 있다.
본 발명에서, 본 발명자들은 포유동물 종양, 우선적으로 인간 종양, 우선적으로 고형 종양, 예컨대 신장 세포 암종 및 결장 암종으로부터 직접적으로 HLA 유형 II 분자에 직접적으로 결합하는 펩티드를 단리하고 특성화하는 것이 가능하다는 것을 증명하였다. 침윤성 단핵구는 종양 세포뿐 아니라 MHC 유형 II 분자를 발현하며, 또한 종양 세포는 몇몇 시토카인 또는 케모카인 유도 유전자 산물, 예컨대 인터페론 감마 유도 유전자 산물의 상향조절을 보였다.
발명의 개요
본 발명은, 종양형성과 관련된 항원으로부터 비롯된 펩티드를 제공하며, 인간 백혈구, 특히 림프구, 특히 T 림프구 및 CD4 양성 T 림프구, 특히 TH1-유형 면역 반응을 매개하는 CD 양성 T 림프구의 면역 반응을 유도하기 위해 HLA 유형 II 분자에 충분히 결합할 수 있는 능력을 갖는 제공한다. 상기 펩티드는 종양 관련 항원, 특히 단백질 가수분해, 혈관 신생, 세포 성장, 세포 주기 조절, 세포 분화, 전사 조절, 번역 조절, 기질-금속단백분해효소(MMP) 7(MMP: 서열 번호 1) 및 인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질 3(IGFBP3; 서열 번호 25)을 비롯한 조직 침투 등의 기능을 가진 종양 관련 항원으로부터 유도된다.
본 발명에서 발명자들은 HLA-유형 II 분자에 불규칙하게 결합하는 종양 관련 펩티드, 특히 인간 게놈의 HLA DR 부위에 의해 유전자적으로 암호화되는 HLA 유형 II 대립유전자가 인간 CD4 양성 T 세포에 의해 매개되는 면역 반응을 꾀할 수 있다는 증거를 제공하였다. CD4 양성 T 세포는 인간 말초 혈액으로부터 단리되는데, 상기한 펩티드들은 종양 세포 펩티돔의 선택된 펩티드에 대하여 인간 면역계의 T 세포 반응을 유도하는데 적합함을 보여준다. 펩티드가 화학적으로 합성될 수 있고 약학 제제의 활성 약학 성분으로서 사용될 수 있기 때문에, 발명자들의 발명에 의해 제공된 펩티드는 면역 요법, 특히 암 면역 요법에 사용될 수 있다.
펩티드를 기반으로 한 면역 요법의 발명을 위해 종양 관련 항원에서 얻은 HLA 유형 II 리간드를 식별하기 위해서, 발명자들은 특히 유형 II 분자를 발현한다고 이미 보고된 신장 세포 암종(renal cell carcinoma: RCC)과 같은 고형 종양을 직접 절개하여 HLA-DR 제시 펩티드의 단리를 시도했다(문헌[Gastl, G., T. Ebert, C.L. Finstad, J. Sheinfeld, A. Gomahr, W. Aulitzky, and N.H. Bander. 1996. MHC I 및 유형 II 신장세포암종에서의 발현 및 인터페론 감마에 의한 조절. J. Urol. 155:361-367]). 종양 세포 대부분이 유형 II 음성이라하더라도, 최신식의 질량 분석기를 이용하여 적은 수의 종양 세포, 종양 관련 항원을 교차 제시하는 침윤성 백혈구, 또는 성장하는 종양 주변의 기질 세포로부터의 유형 II 펩티드 식별을 위해 요구되는 민감성을 제공해야 한다.
이러한 개념의 기술적 증거를 나타내기 위해 신장 세포 암종에 초점을 맞추는 이유는 다음과 같다. 매년 약 15만 명의 인간들이 신장 세포 암종 진단을 받는데, 이 질환의 사망률은 꽤 높은 편이라 매년 7만 8천명이 사망한다(문헌[Pavlovich, C.P. and L.S. Schmidt. 2004. 신장세포 암종의 유전적 원인에 대한 검토. Nat . Rev . Cancer 4:381-393]). 여기에 전이가 진단되면, 일년 생존율은 약 60%로 떨어지며, 이는 의료적 치료가 이루어지기 힘들다는 것을 암시한다(문헌[Jemal, A., R.C. Tiwari, T. Murray, A. Ghafoor, A. Samuels, E. Ward, E.J. Feuer, and M.J. Thun. 2004. 암 통계학, 2004. CA Cancer J. Clin. 54:8-29]). 신장 세포 암종은 면역성 종양으로 간주되기 때문에(문헌[Oliver RTD, Mehta A, Barnett MJ. A전이성 신장세포 암종에서의 (면역) 감시에 대한 제2상 임상시험 및 그와 같은 환자에서의 암진행에 대한 치료반응 평가. Mol Biother. 1988; 1:14-20. Gleave M, Elhilali M, Frodet Y, 외. 전이성 신장세포 암종에서 위약과 비교한 인터페론 감마-1b. N Engl J Med. 1998;338:1265]), 종양-반응성 CTL 및 종양-침윤성 CTL 의 존재에 의해 시사되듯이(문헌[Finke, J.H., P. Rayman, J. Alexander, M. Edinger, R.R. Tubbs, R. Connelly, E. Pontes, and R. Bukowski. 1990. 인간 신장세포 암종에서 CD4-양성 및 CD8-양성 종양-침윤성 림프구의 특성. Cancer Res . 50:2363-2370]), 펩티드에 기초한 항종양 백신 개발이 실제 임상적으로 연구되기 시작했다(문헌[Wierecky J, Mueller M, Brossart P. 수상세포에 근거한 MUC-1 표적 암면역요법. 암면역 면역요법. 2005 Apr 28]). 그러나, 종양 관련 항원의 보조 T 세포 항원결정인자가 부족하기 때문에, 분자학적으로 정의된 백신은 보통 유형 I 리간드의 기능만 하는 펩티드를 포함한다.
본 발명을 이끄는 과학적 노력으로 인해, 발명자들은 열 개의 신장 세포 암종 샘플, 세 개의 직장 암종(colorectal carcinomas: CCA), 및 한 개의 전이 세포 암종(TCC, urothelial carcinoma)에서 유형 II 리간드를 단리할 수 있었다. 이 접근법으로 식별된 종양 관련 항원으로부터의 선택된 리간드는 다음과 같은 기능을 통합할 수 있다.
1. 공지된 종양 관련성을 지닌 항원으로부터 유래.
2. 가장 흔한 HLA 유형 II DR 대립유전자, HLA DRB1*0101에 결합.
3. 대다수의 HLA 유형 II 리간드와 구분짓는 다른 특성을 가짐.
(최소한 두 개의 서로 다른 대립유전자로부터의 HLA-DR 분자와 불규칙적으로 결합할 수 있게 하는 일차 아미노산 서열에 따른 기준을 만족시킴)
아래에 기재한 MMP7(서열 번호 1) 펩티드 예처럼, 이러한 불규칙적 HLA-DR 결합성의 종양 관련 펩티드는 CD4 양성 T 세포에 의해 인식되는 것으로 밝혀졌다.
본 발명의 제 1 양태는 서열 번호 1 내지 서열 번호 49 중 어느 아미노산 서열 또는 이들의 변이체를 포함하는 펩티드를 제공하되, 상기 펩티드는 아미노산 서열이 유래된 무손상 인간 폴리펩티드는 아니다(즉, 유전자자리 연결 ID(수납 번호, 하기 표 1 참고)에 기재된 전장 서열 중 하나).
후술한 바와 같이, 본 발명에서 가장 기반이 되는 펩티드들은 MHC 유형 II를 가지는 세포(신장 세포 암종)에 의해 제시된 바와 같이 모두 식별되었다. 따라서, 이러한 특정 펩티드 및 그 서열(즉 유래된 펩티드)을 포함하는 다른 펩티드는 특이적 T 세포 반응을 모두 일으키기 쉽지만, 이러한 반응이 유도될 정도는 펩티드 마다 개별적으로 상이할 수 있다. 한 예로, 아래 언급한 펩티드들의 돌연변이에 의해 차이가 일어날 수 있다. 본 발명의 기술자들은 특히 본원의 실시예 및 개별 문헌을 참고로 할때 개별 펩티드에 의해 유도된 반응의 정도를 결정하는 방법을 매우 잘 인식한다.
바람직하게는, 본 발명의 펩티드는 서열 번호 1 내지 서열 번호 49 중 어느 하나에 따른 아미노산 서열, 또는 그의 변이체로 본질적으로 이루어진다.
"본질적으로 이루어진다"는 본 발명의 펩티드가 서열 번호 1 내지 서열 번호 49 중 어느 하나 또는 그의 변이체에 따른 서열 외에도, 면역성 보조 T 세포 항원결정인자 및 결합 모티프를 포함하는 펩티드의 중심 서열로서 작용하는 펩티드의 필수 형성 부분이 아닌 아미노산의 추가의 N 말단 및/또는 C 말단 부위의 스트레치를 함유함을 의미한다.
그럼에도 불구하고 이들 스트레치는 본 발명의 펩티드를 세포 내로 효과적으로 도입하기 위해 중요하다. 본 발명의 한 실시양태에서, 본 발명의 펩티드는 NCBI, 유전자 은행 열람 번호에서 유래된 HLA-DR 항원 관련 불변 쇄( 다음에 이어지는 li에서 p33)의 80개 N 말단 아미노산을 포함한다(문헌Strubin, M., Mach, B. and Long, E.O. HLA-DR-연관된 불변 쇄에 대한 mRNA의 전체 서열을 통해 드문 막극성의 폴리펩티드를 발견하였다. EMBO J. 3 (4), 869-872 (1984)]).
아미노산 서열의 "변이체"란 예를 들어 (다른 천연 아미노산 잔기의 측쇄 또는 다른 측쇄로 대체시킴으로써) 아미노산 잔기의 1 또는 2개의 측쇄가 변경된 것으로, 해당 펩티드는 여전히 주어진 아미노산 서열로 구성된 펩티드와 같은 방식으로 HLA 분자에 결합할 수 있음을 의미한다. 한 예로 펩티드가 개질되었다면, 이는 최소한 HLA-A와 같은 적합한 MHC 분자와 상호작용하고 결합할 수 있는 기능을 최소한 유지하며, 본 발명의 양태에서 정의한 아미노산 서열을 함유하는 폴리펩티드를 발현하는 세포를 인식하고 사멸시킬 수 있는 활성 CTL을 생성할 수 있는 기능을 최소한 유지할 수 있어야 한다. 하기 언급한 데이터베이스에 나와있는 바처럼, HLA-A 결합 펩티드의 특정 위치는 HLA 결합 그루브의 결합 모티프에 맞는 중심 서열을 형성하는 전형적인 고정 잔기이다.
T 세포 수용체와 본질적으로 상호작용을 하지 않는 아미노산 잔기들은 다른 아미노산으로 대체하여 개질할 수 있으며, 그의 혼입은 T 세포 반응을 실질적으로 일으키지 않고 적절한 MHC에의 결합을 제거하지 않아야 한다. 따라서, 주어진 조건과 달리 본 발명의 펩티드는 아미노산 서열 또는 그 일부 또는 변이체를 포함하는 임의의 펩티드(여기서 발명자들은 올리고펩티드 또는 폴리펩티드를 포함하는 것으로 규정함)일 수 있다.
MHC 유형 II 제시 펩티드는 HLA 특이적 아미노산 모티프를 갖는 중심 서열, 및 선택적으로 중심 서열의 기능을 방해하지 않는, 즉, T 세포 및 펩티드의 상호작용에 대해 부적절하다고 보이는 N 말단 및/도는 C 말단 연장부로 구성되는 것으로 공지된다. N 말단 및/또는 C 말단 연장부는 1 내지 10개의 아미노산으로 구성되어 있다. 따라서, 본 발명의 바람직한 펩티드는 전체 길이가 9 내지 100개, 특히 9 내지 30개의 아미노산을 나타낸다. 이들 펩티드들은 MHC 유형 II 분자를 도입하기 위해 직접적으로 사용될 수 있거나, 상기 서열은 아래에 설명된 바에 따라 벡터로 클로닝될 수 있다. 이 펩티드들이 세포 내에서 거대 펩티드 가공의 마지막 산물을 형성하기 때문에, 길이가 긴 펩티드 역시 사용될 수 있다. 본 발명의 펩티드는 임의의 크기일 수 있으나, 전형적으로는 분자량이 100,000 미만(특히 50 000 미만, 보다 바람직하게는 10,000 미만, 전형적으로 약 5,000 이하)일 수 있다. 아미노산 잔기의 개수는, 1000개 미만(특히 500개 미만, 보다 바람직하게는 100개 미만)의 잔기를 가질 수 있다.
약 12개 초과의 아미노산 잔기인 펩티드가 MHC 분자에 직접적으로 결합하도록 사용되는 경우, 중심 HLA 결합 영역에 인접한 잔기는 MHC 분자의 결합 그루부에 특이적으로 결합하거나 CTL에 대해 펩티드를 제시하는 펩티드의 능력에 실질적으로 영향을 주지 않는 것이 바람직하다. 그러나, 앞서 언급한 바대로 큰 펩티드가 사용될 수 있는 것으로 이해되는 데(특히 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화될 때), 큰 펩티드들이 적합한 항원제시세포에 의해 단편화될 수 있기 때문이다.
N 말단 및/또는 C 말단 연장부에 대한 특정 예뿐만 아니라, MHC 리간드, 모티프, 변이체의 펩티드에 대한 예는 SYFPEITHI 데이터베이스(문헌[Rammensee H, Bachmann J, Emmerich NP, Bachor OA, Stevanovic S. SYFPEITHI: MHC 리간드 및 펩티드 모티프에 대한 데이터베이스. 면역유전학. 1999 Nov; 50(3-4):213-9.])와 http://syfpeithi.bmi-heidelberg.com/ 및 그 안의 인용 문헌으로부터 유래될 수 있다.
비제한적인 예로서, 이 데이터베이스에서 HLA-DR에 대한 특정 펩티드는 Ig 카파 쇄 188-203(문헌[Kovats 외. Eur J Immunol. 1997 Apr; 27(4): 1014-21])으로부터 유래된 K H K V Y A C E V T H Q G L S S; Ig 카파 쇄 145-159(문헌[Kovats 외. Eur J Immunol. 1997 멕 27(4): 1014-21])에서 유래된 K V Q W K V D N A L Q S G N S; GAD65 270-283(문헌[Endl 외. J Clin Invest. 1997 May 15; 99(10): 2405-15])에서 유래된 L P R L I A F T S E H S H F; GAD65 556-575(문헌[Endl 외. J Clin Invest. 1997 May 15; 99(10): 2405-15])에서 유래된 F F R M V I S N P A A T H Q D I D F L I이다. 또한 항원의 돌연변이 서열에서도 펩티드를 유도할 수 있는데 그 예는 다음과 같다: A T G F K Q S S K A L Q R P V A S는 bcr-abl 210 kD 융합 단백질(문헌[ten Bosch 외. Blood. 1996 Nov 1;88(9):3522-7])에서, G Y K V L V L N P S V A A T는 HCV-1 NS3 28-41(문헌[Diepolder 외. J Virol. 1997 Aug;71(8):6011-9])에서, F R K Q N P D I V I Q Y M D D L Y V G는 HIV-1 (HXB2) RT 326-345(문헌[van der Burg 외. J Immunol. 1999 Jan 1;162(1):152-60])에서 각각 유래되었다. 모든 고정(anchor) 아미노산은(참조 문헌[Friede 외., Biochim Biophys Acta. 1996 Jun 7; 1316(2): 85-101; Sette 외. J Immunol. 1993 Sep 15; 151(6):3163-70.; Hammer 외. Cell. 1993 Jul 16; 74(1): 197-203., and Hammer 외. J Exp Med. 1995 May 1; 181(5):1847-55. HLA-DR4에 대한 예로써]) 볼드체로 기재되었으며, 추정되는 중심 서열에는 밑줄을 그어 표시했다.
상기에 언급된 모든 펩티드는 주어진 아미노산 서열의 변이체라는 용어로 포괄한다.
"펩티드"에는 아미노산 잔기가 펩티드 (-CO-NH-) 연결에 의해 결합되는 분자 및 펩티드 결합이 역전되는 분자가 포함된다. 이러한 레트로-인버소 펩티도미네틱(retro-inverso peptidominetics)은 Meziere 외 학자들이 1997년에 J.Immunol. 159.3230-3237에 밝힌 것과 같은 방법으로 만들어진 것이다. 이러한 접근법은 골격을 포함한 변화를 함유하지만 측쇄의 배향을 포함하지 않는 가성펩티드(pseudopeptide) 제작을 포함한다. Meziere 외(1997)는 적어도 MHC 유형 II 및 보조 T 세포 반응에 대해서, 이러한 가성펩티드들이 유용하다고 보았다. CO-NH 펩티드 결합 대신에 NH-CO 결합을 가지는 리트로-인버소 펩티드는 단백질 가수분해에 비교적 저항력이 세다.
전형적으로, 본 발명의 펩티드는 항원제시세포에 발현될 경우, 가공되어 그 단편이 적절한 MHC 분자에 결합하고 적절한 세포에 의해 제시된 후 최종적으로 적합한 T 세포 반응을 꾀하게 되는 것이다. 본 발명의 펩티드로부터 생성된 단편이 이 본 발명의 펩티드일 수 있는 것으로 이해된다. 편의상, 본 발명의 펩티드는 주어진 아미노산 서열 또는 그 일부나 그 변이체를 포함하는 부분 및 일부 바람직한 특성을 부여하는 추가의 부분을 함유한다. 예를 들어, 추가 부분에는 추가의 T 세포 항원결정인자를 포함할 수 있거나(제 1 T 세포 항원결정인자 함유 부분과 동일한 폴리펩티드로부터 유도되거나 되지 않음), 운반 단백질 또는 펩티드를 포함할 수도 있다. 따라서, 한 실시양태에서, 본 발명의 펩티드는 끝이 짤린 인간 단백질 또는 단백질 단편의 융합 단백질 및 또 다른 폴리펩타이드 부분이되, 단 인간 부분은 하나 이상의 본 발명의 아미노산 서열을 포함한다.
특히 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 펩티드는 본 발명의 아미노산 서열 및 하나 이상의 추가의 T 세포 항원결정인자를 포함하고, 이때 추가의 T 세포 항원결정인자는 비정상적으로 종양 관련 항원(TAA)을 발현하는 종양 유형에 대해 T 세포 반응의 생성을 촉진할 수 있다. 따라서, 본 발명의 펩티드는 백신으로도 사용될 수 있는 "스트링 상의 비드(beads on a string)" 폴리펩티드라 부른다.
몇몇 적용에서, 본 발명의 펩티드는 직접 사용될 수 있는데(즉, 이들은 환자의 세포 또는 환자가 제공한 세포 속의 폴리뉴클레오티드 발현에 의해 생성되는 것은 아니다), 이 경우 펩티드가 100 또는 50개 미만의 잔기를 갖는 것이 바람직하다. 본 발명의 바람직한 펩티드는 전체 길이가 9 내지 30개의 아미노산 길이를 나타낸다.
또한, 본 발명의 펩티드가 HLA-DR에 결합할 수 있는 것이 바람직하다. 펩티드가 HLA-DRB1*0101에 선택적으로 결합할 수 있는 것이 특히 바람직하다.
본 발명의 또 다른 양태에서, MHC 유형 II 분자에 대해 상기한 상황과 유사하게, 본 발명의 펩티드는 MHC 유형 I 특이적 T 세포 반응을 유도하는데 사용될 수 있다. 보다 바람직한 본 발명의 MHC 유형 I 특이적 펩티드는 전체 길이가 9 내지 16개(바람직하게는 9 내지 12개)의 아미노산을 나타낸다. 이러한 펩티드는 MHC 유형 II 펩티드와 유사하게 긴 펩티드로서 사용될 수 있는 것(예컨대, 백신에서)으로 이해된다. HLA 유형 I 분자에 대해 특정 HLA-특이적 아미노산 모티프를 갖는 MHC 유형 I 특이적 "중심 서열" 식별 방법은 당해 분야의 숙련자에게 공지되어 있고, 예를 들면 PAProC (PAProC (http://www.uni-tuebingen.de/uni/kxi/) 및 SYFPEITHI (http://www.syfpeithi.de)등의 컴퓨터 프로그램을 통해 예측할 수 있다.
본 발명의 펩티드는 본 발명의 펩티드에 대한 기초를 형성하는, 비정상적으로 폴리펩티드를 발현하는 세포를 겨낭하고 사멸하는 면역치료 방법의 적용에 유용하다. 주어진 아미노산 서열로 구성된 특정 펩티드는 HLA-DR에 결합하기 때문에, 본 발명의 펩티드는 HLA-DR에 결합하며, 이것이 HLA-DR 펩티드 착체에 결합할 때, 적절한 항원제시세포 표면에 존재하는 경우 주어진 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 비정상적으로 발현하는 세포를 인식하는 CTL의 생산을 유도할 수 있다.
본 발명의 한 양태에서, 본 발명의 펩티드는 NCBI, 유전자은행 열람번호X00497(하기 참조)로부터 유래된 HLA-DR 항원 관련 불변 쇄(하기 Ii에서 p33)의 80개의 N 말단 아미노산을 포함한다.
앞서 언급한 "비정상적으로 발현되는"은 폴리펩타이드가 정상 발현 수준과 비교하여 과발현되거나, 유전자가 종양에서는 발현하나 종양에서 유래한 조직에서는 발현되지 않는 경우를 의미함을 포함한다. "과발현"은 정상 조직보다 최소한 1.2배 수준으로 발현이 많을 때(보다 적절하게는 2배 이상 또는 5배 또는 10배 수준 더 발현량이 많을 때) 사용된다.
펩티드(적어도 아미노산 잔기 사이에 펩티드 연결을 포함하는 펩티드)는 문헌[Lu 외 (1981) J. Org. Chem. 46,3433]에 의해 개시된 고체상 펩티드 합성의 Fmoc-폴리아미드 모드에 의해 합성될 수 있다. 일시적인 N-아미노기 보호는 9-플루오레닐메틸옥시카보닐(Fmoc)기에 의해 이루어진다. N,N-디메틸포름아미드의 20% 피페리딘을 사용하여 이러한 염기에 매우 취약한 보호기의 반복적인 분할이 나타난다. 측쇄 작용기는 그것의 부틸 에테르(세린 트레오닌 및 티로신의 경우), 부틸 에스테르(글루탐산 및 아스파르트산의 경우), 부티록시카르보닐 유도체(리신 및 히스티딘의 경우), 트리틸 유도체(시스테인의 경우) 및 4-메톡시-2,3,6-트리메틸벤젠설포닐 유도체(아르기닌의 경우)로서 보호될 수 있다. 글루타민 또는 아스파라긴은 C-말단 잔기있는 경우, 측쇄 아미도 작용기의 보호를 위해 4,4-디메톡시벤지드릴 기로 만들어진다. 고체상 지지체는 3개의 단량체인 디메틸아크릴아미드(백본-단량체), 비사크릴로일에틸렌 디아민(교차 연결) 및 아크릴로일사르코신 메틸 에스테르(작용화제)로 구성된 폴리디메틸-아크릴아미드 중합체에 근거한다. 사용된 펩티드-대-수지의 분할가능한 연결제는 산에 취약한 4-히드로메틸-페녹시아세트산 유도체이다. 모든 아미노산 유도체는 이미 형성된 대칭적 무수물 유도체로써 첨가되며, 아스파라긴 및 글루타민은 예외적으로 역 N,N-디시클로헥실-카르보디이미드/1히드록시벤조트리아졸 매개의 결합 절차를 이용하여 첨가된다. 모든 결합 및 탈보호 반응은 닌히드린, 트리니트로벤젠 설폰산 또는 이소틴 검사 절차를 사용하여 모니터링된다. 합성 완료시, 50% 소거제를 포함한 95% 트리플루오로아세트산 혼합물로 처리하여 측쇄 보호기를 동시 제거하고 수지 지지체로부터 펩티드가 분할된다. 일반적으로 사용되는 소거제는 에탄디티올, 페놀, 아니솔 및 물이며, 합성되는 펩티드 구성 아미노산에 따라 사용이 결정된다. 또한 펩티드 합성에 대한 고체상 및 액체상 방법론의 병합이 가능하다(예를 들어 문헌[Bruckdorfer T, Marder O, Albericio F. 미래의 약물을 위한 멀티톤의 연구를 위한 밀리그람의 펩티드 생산으로부터. Curr Pharm Biotechnol. 2004 Feb;5(1):29-43] 및 여기에 인용된 참고문헌을 참고하라.)
진공상태에서 트리플루오로아세트산은 증발에 의해 제거된 후, 디에틸 에테르로 분쇄되어 조질 펩티드가 생성된다. 모든 소거제는 액상의 동결 건조가 소거제 없이 조질 펩티드를 제공하는 단순한 추출 절차에 의해 제거된다. 펩티드 합성용 시약은 보통 Calbiochem-Novabiochem (UK) Ltd, Nottingham NG7 2QJ, UK에서 구입 가능하다.
정제는 크기배제 크로마토 그래피(SEC), 이온교환 크로마토그래피(IEC), 소수성 작용 크로마토그래피, 그리고 아세토니트릴/물 경사 분리을 이용하는 역상 고성능액체 크로마토그래피(HPLC) 또는 이것들의 결합에 실시될 수 있다.
펩티드 분석은 MALDI, ESI-Q-TOF 질량분광분석법은 물론, 얇은 막 크로마토그래피(TLC), 역상 고성능액체 크로마토그래피(HPLC),산 가수분해 후 아미노산 분석, 고속원자충돌법(FAB), 질량분광분석법을 통해 이루어진다.
본 발명의 추가의 양태는 본 발명의 펩티드를 암호화하는 핵산(예: 폴리뉴클레오티드)을 제공한다. 폴리뉴클레오티드는 DNA, cDNA, PNA, CNA, RNA 또는 이들의 재조합인데, 이것이 펩티드를 암호화 하는 한 인트론을 가질 수도 그렇지 않을 수도 있다. 물론, 이는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화될 수 있는 천연 펩티드 결합에 의해 결합한 천연 아미노산 잔기를 포함하는 것은 펩티드이다. 본 발명의 추가의 양태는 본 발명의 폴리펩티드를 발현할 수 있는 발현 벡터이다.
폴리뉴클레오티드들은 연결하기 위해 다양한 방법들이 사용되었다. DNA의 예를 들면, 상보 점착 말단을 통한 벡터가 있다. 예를 들어, 상보 동종중합체 관은 DNA 분절에 추가되어 벡터 DNA에 삽입될 수 있다. 이 벡터와 DNA 분절들은 그 뒤 상보 동종중합체 꼬리들 사이를 수소결합에 의해 연결하여 재조합 DNA 분자를 형성한다.
하나 이상의 제한 부위를 포함하는 합성 링커는 DNA 분절을 벡터에 결합하는 다른 방안을 제공한다. 앞서 서술한 대로 엔도뉴클라제 제한효소 분해(endonuclease restriction digestion)로 생성된 DNA 분절은 박테리오파지 T4 DNA 중합효소 또는 대장균 DNA 중합효소 I (3'-5'-핵산말단분해활성 기능으 로3-단쇄 말단을 제거하는 효소)로 처리된 후, 중합 활성을 가지는 돌출 3-말단으로 채워지게 된다.
따라서, 이들 활성의 조합은 블런트 말단 DNA 분절을 생성한다. 그 후, 블런트 말단 분절은 박테리오파지 T4 DNA 연결효소와 같은 블런트-말단 DNA 분자의 결찰을 촉진할 수 있는 효소의 존재 하에서, 과다한 몰 량의 링커 분자와 함께 배양된다. 따라서, 이 반응의 산물은 각 말단의 중합체 링커 서열을 갖는 DNA 분절이다. 이런 DNA 분절들은 그 후 적절한 제한 효소로 분할된 뒤, 발현 벡터에 결찰되고, 이는 DNA 분절의 것과 융화되는 말단을 생성하는 효소로 분할된다.
다양한 제한 엔도뉴클라제 부위를 포함하는 합성 링커는 International Biotechnologies Inc, New Haven, CN, USA에서 구입했다.
본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 DNA를 개질하는 바람직한 방법은 문헌[Saiki 외 (1988, Science 239,487-491)]에 개시된 중합효소 연쇄 반응(PCR)이 있다. 이 방법은 예를 들면 적합한 제한 부위에서 유전공학 처리함으로써 DNA를 적절한 벡터에 유입하는데 사용될 수 있거나, 당해 분야에 공지된 다른 유용한 방법에서 DNA를 개질하는데 사용될 수 있다. 이 방법에서 효소를 통해 증폭된 DNA는 그 자체가 증폭된 DNA에 혼입되는 두 개의 특이적 프라이머 옆에 위치하게 된다. 상기 특이적 프라이머는 당해 분야에 공지된 방법을 사용하여 발현 벡터로 클로닝하기 위해 사용될 수 있는 엔도뉴클라제 인식 부위를 함유할 수 있다.
그 후, DNA(또는 레트로바이러스 벡터인 경우에는 RNA)는 적당한 숙주에서 발현되어 본 발명의 화합물을 포함하는 폴리펩티드가 생성된다. 따라서, 본 발명의 화합물을 구성하는 폴리펩티드를 암호화하는 DNA는, 본원에 함유된 교시에 따라 적절하게 개질된 공지된 기법에 따라 사용되어, 발현 벡터를 구성하고, 이후 이는 본 발명의 폴리펩티드의 발현 및 생산을 위한 적절한 숙주를 형질전환하는데 사용된다. 그러한 기술에는 다음의 미국 특허를 포함한다. 4,440,859 Rutter 외 1984년 4월 3일 발행, 4,530,901 Weissman 1985년 7월 23일 발행, 4,582,800 Crowl 1986년 4월 15일 발행, 4,677,063 Mark 외 1987년 6월 30일 발행, 4,678,751 Goeddel 1987년 7월 7일 발행, 4,704,362 Itakura 외 1987년 11월 3일발행, 4,710,463 Murray 1987년 12월 1일 발행, 4,757,006 Toole, Jr. 외 1988년 7월 12일 발행, 4,766,075 Goeddel 외 1988년 8월 23일 발행, 4,810,648 Stalker 1989년 3월 7일 발행된 문헌들 모두 여기에 참고문헌으로 이용되었다.
본 발명의 화합물을 구성하는 폴리펩티드를 암호화하는 DNA (또는 레트로바이러스 벡터인 경우에는 RNA)는 적절한 숙주에 도입하기 위해 다양한 다른 DNA 서열에 결합될 수 있다. 이 동반 DNA는 숙주 특성, 숙주에게 DNA를 도입하는 방식, 및 에피솜 유지 또는 통합이 바람직한지에 따라 달라진다.
일반적으로, DNA는 발현을 위해 적절한 배향 및 정확한 해독 틀에서 플라스미드 같은 발현 벡터에 삽입된다. 필요한 경우, DNA는 목적하는 숙주에 의해 인식되는 적절한 전사 및 번역 제어 조절 뉴클레오티드 서열에 연결될 수 있으나, 그와 같은 조절은 발현 벡터에서 일반적으로 가능하다. 벡터는 표준 기술을 통해 숙주에게 도입된다. 일반적으로 모든 숙주들이 벡터에 의해 형질전환이 되는 것은 아니다. 따라서, 형질전환된 숙주 세포를 선택하는 것이 필요하다. 하나의 선택 기법은 필요한 임의의 조절 요소와 함께 DNA 서열을 발현 벡터에 삽입하는 것이 있으며, 이러한 DNA 서열은 항생제 내성과 같이 형질전환된 세포의 선택 가능한 특성을 암호화한다.
다르게는, 이러한 선택 특성을 위한 유전자는 또 다른 벡터 상에 있을 수 있으며, 이는 목적하는 숙주 세포를 공동 형질전환시키는데 사용된다.
본 발명의 재조합 DNA에 의해 형질전환된 숙주 세포는 그 후 폴리펩티드의 발현을 허용하는 본원에 개시된 교시에 따라 당해 분야의 숙련자에게 공지된 적절한 조건 및 충분한 시간동안 세포 배양된 후, 회수될 수 있다.
박테리아(예: 에스케리치아 콜라이(E. coli) 및 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)), 효모(예: 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)), 곰팡이(예: 아스퍼질러스(Aspergillus)), 식물 세포, 동물 세포 및 곤충 세포 등의 여러 가지 발현 체계가 잘 알려져 있다. 이러한 발현 체계는 RCC 또는 아웰스 세포(Awells cells)가 선호된다.
프로모터는 RNA 중합효소와의 결합을 허용하여 전사를 일으키는 DNA 서열에 의해 형성된 발현 조절 요소이다. 예시적인 박테리아 숙주와 융화될 수 있는 프로모터 서열은 전형적으로 본 발명의 DNA 분절의 삽입을 위한 편리한 제한 부위를 함유하는 플라스미드 벡터에 존재한다. 전형적인 원핵생물성 벡터 플라스미드는 pUC18, pUC19, pBR322 및 pBR329(Biorad Laboratories, (Richmond, CA, USA)에서 구입가능), pTrc99A 및 pKK223-3(Pharmacia, Piscataway, NJ, USA.에서 구입가능)이 있다.
전형적인 포유동물 세포 벡터 플라스미드는 pSVL(Pharmacia, Piscataway, NJ, USA에서 구입 가능)이다. 이러한 벡터는 클로닝된 유전자의 발현을 유도하기 위해 COS-1 세포와 같은 T 항원 생산 세포에서 고발현되는 SV40 후기 프로모터를 사용한다. 유발성 포유류 발현 벡터의 예로는 pMSG가 있으며 이는 또한 Pharmacia에서 구할 수 있다. 이 벡터는 클로닝된 유전자의 발현을 유도하기 위해 마우스의 유선 종양 바이러스 긴 말단 반복의 글루코코르티코이드-유도 프로모터를 사용한다. 유용한 효모 플라스미드 벡터로는 pRS403-406 및 pRS413-416이 있으며 Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA 92037, USA에서 구입 가능하다. 플라스미드 pRS403, pRS404, pRS405 및 pRS406는 효 모통합 플라스미드(Yip)이며, 효모 선별 마커인 HIS3, TRP1, LEU2 및 URA3를 혼입한다. 플라스미드 pRS413-416는 효모 동원체 플라스미드(Ycp)이다. 다양한 숙주 세포 사용을 위한 그 밖에 다른 벡터 및 발현 체계도 잘 알려져 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 폴리뉴클레오티드 벡터 구조체로 형질전환된 숙주 세포에 관한 것이다. 숙주 세포는 진핵성 또는 원핵성일 수 있다. 박테리아 세포는 특정한 환경에서 원핵 세포가 바람작히가, 전형적으로 E.coli DH5 균주와 같은 E-Coli 균주(Bethesda Research Laboratories Inc, Bethesda, MD, USA에서 구입 가능) 및 RR1(American Type Culture Collection (ATCC) of Rockville, MD, USA(No ATCC 31343)에서 구입가능)이 있다. 선호되는 진핵성 숙주 세포는 효모, 곤충, 포유동물 세포, 특히 마우스, 래트, 원숭이 또는 인간의 섬유아세포 및 신장 세포주와 같은 척추동물 세포를 포함한다. 효모 숙주 세포는 YPH499, YPH500 및 YPH501을 포함하며 이들은 Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA 92037, USA에서 구입 가능하다. 바람직한 포유동물 숙주 세포는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포(ATCC에서 CCL61로서 구입가능), NIH 스위스 마우스 배아세포 NIH/3T3(ATCC에서 CRL 1658로서 구입가능), 원숭이 신장 유도된 COS-1 세포(ATCC에서 인간 배아 신장 세포인CRL1650 및 293 세포로서 구입가능)가 있다. 바람직한 곤충 세포는 바큘로바이러스 발현 벡터로 형질감염될 수 있는 Sf9 세포이다.
적절한 세포 숙주를 본 발명의 DNA 구조체로 형질전환하는 것은 사용된 벡터 유형에 따라 좌우되는 공지된 방법에 의해 달성된다. 원핵성 숙주 세포 형질전환의 경우에서는 문헌[Cohen 외 (1972) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69,2110 와 Sambrook 외 (1989) 분자 클로닝, 실험실 설명서, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY]을 참고할 수 있다. 효모세포의 형질전환은 문헌[Sherman 외 (1986) 효모 유전학 방법, 실험실 설명서, Cold Spring Harbor, NY에 설명되어 있으며, 벡스 방법 (1978) Nature 275,104-109] 또한 유용하다. 척추동물 세포의 경우에는 인산칼슘과 DEAE-덱스트란 또는 리포솜 제형을 이용한 형질감염이 효과적인데 이들은 Stratagene Cloning Systems이나 Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD 20877, USA에서 구입 가능하다. 또한, 전기천공법(Electroporation)은 세포의 형질전환 및/또는 형질감염을 위해 유용하며, 효모 세포, 박테리아 세포, 곤충 세포 및 척추동물를 형질감염시키기 위해 당해 분야에 공지되어 있다.
성공적으로 형질전환된 세포, 즉, 본 발명의 DNA 구조체를 함유하는 세포는 이미 알려진 기술로 충분히 식별할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 발현 구조체의 도입으로 인해 발생한 세포는 본 발명의 폴리펩티드를 생산할 수 있도록 성장될 수 있다. 이 세포들을 모아 용해한 후, 그의 DNA 함량을 문헌[Southern (1975) J. Mol. Biol. 98,503나 Berent 외 (1985) Biotech. 3,208]에 의해 기재된 바와 가은 방법을 사용하여 DNA 존재에 대해 시험한다. 다르게는, 상층액 중 단백질은 하기 항체를 사용하여 검출될 수 있다.
재조합 DNA의 존재를 직접적으로 조사하는 것 이외에도, 재조합 DNA가 직접적으로 단백질 발현을 유도할 수 있는 경우 공지된 면역 방법을 통해 성공적인 형질전환을 확인할 수 있다. 예를 들어, 발현 벡터로 성공적으로 형질전환된 세포는 적절한 항원성을 보이는 단백질을 생산한다. 형질전환이 의심되는 세포의 샘플을 모아서 적합한 항체를 사용하여 단백질에 대해 분석한다. 그러므로, 형질전환된 숙주 세포 자체 외에도, 본 발명은 또한 영양 배지 중 이러한 세포 배양, 특히 단일클론성(동질한 클론) 배양 또는 단일클론성 배양에서 유래한 배양을 고려한다.
본 발명의 특정 숙주 세포(예를 들어 박테리아, 효모 및 곤충 세포)는 본 발명의 펩티드의 제조에 유용한 것으로 인식될 것이다. 그러나, 다른 숙주 세포는 다른 특정 치료 방법에 유용할 수 있다. 예를 들어, 수지상 세포 같은 항원제시세포는 적절한 MHC 분자로 로딩될 수 있도록 본 발명의 펩티드를 발현하는 데 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 정맥 주입, 피하 주입, 피부 내 주입, 복부 내 주입, 근육 내 주입 등의 주입을 위한 펩티드 제조 방법을 제공한다. 보다 선호하는 펩티드 주입법으로는 s.c., i.d., i.p., i.m.과 i.v 이 있으며, DNA 주입시는 i.d., i.m., s.c., i.p.와 i.v 주입법이 선호된다. 이 때 펩티드 또는 DNA를 1내지 500 mg 양으로 주입한다.
또한 본 발명의 양태는 본 발명에 따른 종양 관련 펩티드 및 본 발명에 따른 핵산, 또는 본 발명에 따른 발현 벡터의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 추가의 양태는 본 발명의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 비정상적으로 발현하는 표적 세포를 가진 환자에서 표적 세포를 사멸하는 방법을 제공하며, 이때 상기 방법은 본 발명에 따른 펩티드의 효과적인 양, 또는 상기 펩티드를 암호화하는 발현 벡터 또는 폴리뉴클레오티드의 효과적인 양을 환자에게 투여하는 단계를 포함하며, 이때 상기 펩티드의 양, 또는 상기한폴리뉴클레오티드 또는 발현 벡터의 양은 상기 환자에게서 항표적 세포 면역 반응을 유발하기에 효과적이다. 표적 세포는 전형적으로 종양 또는 암 세포이다.
펩티드 또는 펩티드를 암호화하는 핵산은 종양 또는 암 백신을 구성한다. 이는 직접 환자에게 투여될 수도 있고, 특정 기관(organ) 또는 전신에 투입되거나 생체 외로 환자에게 후속적으로 투여되는 인간 세포주 또는 환자로부터 유래된 세포로 적용되거나, 환자로부터 유래된 면역 세포의 하위 집답을 선택하기 위해 시험관내 사용된 후 환자에게 재투여된다. 만약 핵산을 시험관내로 세포로 투여할 경우, 세포는 형질감염되어 인터루킨-2 같은 면역자극시토카인을 동시에 발현하는 데에 유용할 수 있다. 펩티드는 실질적으로 순수하거나, 또는 데톡스(Detox) 같은 면역 자극 보조제와 조합되거나, 또는 면역 자극 시토카인과 조합하여 사용되거나, 리포솜 같은 적절한 전달 방식으로 투여될 수 있다. 펩티드는 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH) 또는 만난(mannan)(참고: WO 95/18145 and Longenecker 외 (1993) Ann. NY Acad. Sci. 690, 276-291)과 같은 적합한 운반 물질에 합쳐질 수도 있다. 펩티드는 또한 표지되거나, 융합 단백질 또는 하이브리드 분자일 수 있다. 본 발명에서 제시한 서열을 갖는 펩티드는 CD4 CTL을 자극할 것이라고 예상된다. 그러나, 이러한 자극 반응은 CD4 양성 T 세포에 의한 보조반응이 있을 때 더 효과적이다. 따라서, 하이브리드 분자의 일부 또는 융합 파트너는 CD4 양성 T 세포을 자극하는 항원결정인자를 적절하게 제공한다. CD4 양성 자극 항원결정인자는 잘 알려져 있으며, 파상풍 톡소이드에서 입증된 것들을 포함한다. 이 폴리뉴클레오티드는 실질적으로 순수하거나 또는 적절한 벡터 또는 전달 체계에 함유될 수 있다.
적절한 벡터 및 전달 체계는 바이러스, 예컨대 아데노바이러스, 우두바이러스, 레트로바이러스, 헤르페스바이러스, 아데노관련바이러스 또는 하나 이상의 바이러스를 포함한 하이브리드을 기준으로 한 체계를 포함한다. 비 바이러스성 전달 체계는 양이온성 지질 및 양이온성 중합체를 포함하며 DNA 운반 기술에 잘 알려져 있다. 또한, 유전자 총(Gene-gun) 같은 물리적 도입 방법도 있다. 펩티드 또는 핵산에 의해 암호화되는 펩티드는 융합 단백질일 수도 있는데, 예를 들어 CD4 양성 T 세포를 자극하는 항원결정인자를 가진 경우가 이에 해당한다.
암 백신에 사용되는 펩티드는 임의의 적합한 펩티드일 수 있다. 이는 9-mer, 7-mer, 8-mer, 10-mer, 11-mer 펩티드 또는 12-mer일 수 있다. 펩티드는 길수록 좋은데, 첨부한 표 1에서 서술한 바와 같이 9 내지 10-mer 펩티드가 선호된다.
적합하게는, 환자에게 투여되는 임의의 핵산은 무균적인 것으로 발열물질 없는 것이어야 한다. 네이키드 DNA는 근육 내, 피부 내 또는 피하내로 주어질 수 있다. 또한, 펩티드는 근육 내, 피부 내, 복부 내, 정맥 내 또는 피하내로 주어질 수 있다(위에 제시한 펩티드 산출 방법 참조). 바람직하게는, 활성 약학 성분으로서 펩티드는 예를 들어 IL-2, IL-12, GM-CSF, 불완전 프로인드 보조제, 완전 프로인드 보조제 또는 리포솜 제형 등의 보조제와 결합한 형태로 주어진다. 가장 바람직한 보조제는 문헌[Brinkman JA, Fausch SC, Weber JS, Kast WM. 암 면역요법에 대한 펩티드 의거 백신. Expert Opin Biol Ther. 2004 Feb;4(2):181-98]을 참조할 수 있다.
백신반응은 전문 항원제시세포에 의해 자극된 CTL 반응을 일으킨다; 일단 CTL이 프라이밍되면, 종양 세포에서 MHC 발현을 증가시키는 장점이 있을 수 있다.
백신이 주입 부위, 표적 벡터 및 전달 체계의 사용, 또는 환자로부터의 세포 집단의 선택적 정제 및 펩티드 또는 핵산의 생체 외 투여에 의해 항원제시세포 같은 특정한 세포 집단을 표적화하는데 유용할 수 있다(예를 들어 수지상 세포는 문헌[Zhou 외 (1995) Blood 86,3295-3301; Roth 외 (1996) Scand. J. Immunology 43,646-651]에 기술된 바와 같이 분류될 수 있다). 예를 들어, 표적 벡터는 적절한 위치에서 항원 발현을 꾀할 수 있도록 조직 또는 종양 특이적 프로모터를 포함할 수 있다.
본 발명의 추가의 양태는 본 발명의 펩티드 효과량을 포함하거나, 또는 펩티드를 암호화하는 핵산을 포함하는, 암, 또는 암 또는 종양 세포에 효과적인 백신을 제공한다. 백신이 핵산 백신인 것이 바람직하다. 핵산 백신, 예컨대 폴리펩티드를 암호화하는 DNA 백신으로의 접종은 T 세포 반응을 유발하는 것으로 알려져 있다. 따라서 (합성) 펩티드 또는 펩티드를 포함하는 백신이 가장 선호된다 (즉, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6, 11 또는 보다 많은 펩티드 결합과 함께 또는 단독으로, 아랫 부분 참조).
편리하게도, 핵산 백신은 임의의 적절한 핵산 전달 수단을 포함할 수 있다. 핵산, 바람직하게는 DNA는 네이키드 형태(다시 말해, 투여될 다른 요소가 없는 형태)일 수도 있고, 또는 리포솜 또는 바이러스성 벡터 전달 체계의 일부로 전달될 수도 있다.
수지상 세포에 의해 암호화된 폴리펩티드의 발현 및 핵산 유입은 면역 반응을 프라이밍하는 기전이 될 수 있는 것으로 여겨진다. 그러나, 수지상 세포는 형질감염되지 않으나 중요 형태로 남아있는데 그 이유는 조직에서 형질감염된 세포로부터 수지 상세포가 발현 펩티드를 얻게 될 수 있기 때문이다.
DNA 백신 같은 백신이 근육에 투여하는 것이 바람직하다. 또한 백신을 피부로 투여하는 것도 바람직하다. 핵산 백신은 보조제 없이 투여될 수 있다. 또한 핵산 백신은 BCG 또는 명반 같은 보조제와 함께 투여될 수도 있다. 다른 적절한 보조제는 사포닌, 미코박테리아성 추출물 및 합성 박테리아 세포벽 유사물질에서 유래된 아퀼라 QS21 스티뮬론(Aquila Biotech, Worcester, MA, USA), 및 사유 보조제, 예컨대 Ribi's Detox가 있다. 또 다른 사포닌 유래 보조제인 Quil A도 사용될 수 있다(Superfos, Denmark). 또한 핵산 백신을 보조제 없이 투여하는 것이 바람직하다. Freund's 같은 다른 보조제도 유용할 수 있다. 특히 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH)에 결합된 펩티드가 바람직하게는 보조제와 함께 주어지는 것이 유용할 수 있다.
암에 대한 폴리뉴클레오티드 매개 면역화 요법은 문헌[Conry 외 (1996) 종양학 세미나 23,135-147; Condon 외 (1996) Nature Medicine 2,1122-1127; Gong 외 (1997) Nature Medicine 3,558-561; Zhai 외 (1996) J. Immunol. 156,700-710 Graham 외 (1996) Int J. Cancer 65,664-670, Burchell 외 (1996) pp 309-313 In: 유방암, 생물학 및 치료학에서의 진보 Calvo 외 (eds), John Libbey Eurotext]에 기재되어 있으며, 이들 모두는 참고문헌으로 이용되었다.
또한, 본 발명의 다른 양태는 본 발명의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 비정상적으로 발현하는 표적 세포를 가진 환자의 표적 세포를 사멸하는 약제의 제조에서 본 발명에 따른 펩티드, 또는 그러한 펩티드를 암호화하는 발현 벡터 또는 폴리뉴클레오티드의 용도를 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태는 면역 반응, 특히 세포 면역, 보다 구체적으로 본 발명의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 제시하고 표면에 인간 유형 II MHC 분자를 발현하는 고형 종양 세포에 대한 T 세포 매개성 면역 반응을 유도하기 위한 약제의 제조에 있어서 본 발명에 따른 펩티드 또는 그러한 펩티드를 암호화하는 발현 벡터나 폴리뉴클레오티드의 용도를 제공한다. 동일한 조직의 건강한 세포와 비교하여 고형 종양의 종양 세포는 표면에 인간 HLA 유형 II 분자를 발현하고 있다는 것은 매우 놀라운 발견이다.
본 발명의 또 다른 양태는 또한 활성 CTL의 생체내 또는 시험관내 제조 방법을 제공하며, 이 방법은 항원 특이적 방식으로 활성화되기에 충분한 시간 동안 적절한 항원제시세포 표면에 발현하는 항원 도입 인간 유형 II MHC 분자와 시험관내에서 CTL이 접촉함을 포함하며, 이때 항원은 본 발명에 따른 펩티드이다.
적합하게, CTL은 CD4 양성 조세포, 바람직하게는 TH1 유형이다. MHC 유형 II 분자는 임의의 적절한 세포 표면에 발현될 수 있고, 세포가 자연적으로 MHC 유형 II 분자를 발현하지 않거나 (이 경우 세포는 이 분자를 발현하도록 형질감염된다) , 이 분자를 발현할 경우, 항원 가공 또는 항원제시 경로에서는 불완전한 것이 바람직하다. 이러한 방식으로, MHC 유형 II 분자를 발현하는 세포는 CTL 활성 전에 이미 선택한 펩티드 항원으로 완전히 프라이밍될 수 있다.
항원제시세포(또는 자극 세포)는 전형적으로 표면에 MHC 유형 II 분자를 갖고, 선택한 항원에 의해 상기 MHC 유형 II 분자를 직접 로딩할 수는 없다. 밑에 자세히 언급하겠지만, MHC 유형 II 분자는 시험관내에서 선택된 항원으로 용이하게 로딩될 수 있다.
바람직하게는, 포유동물 세포는 TAP 펩티드 트랜스포터가 없거나, 낮은 수준으로 갖고 있거나 또는 감소된 기능으로 갖고 있다. TAP 펩티드 트랜스포터가 결핍된 적합한 세포는 T2, RMA-S 및 초파리 세포가 있다. TAP는 항원 가공과 관련된 트랜스포터(Transporter Associated with antigen Processing)의 약어이다.
결핍 세포주 T2를 로딩하는 인간 펩티드는 American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, USA에서 Catalogue No CRL 1992로 구입 가능하다: 초파리 세포주 슈나이더 주 2는 ATCC under Catalogue No CRL 19863에서 구입 가능하며, 마우스의 RMA-S 세포주는 문헌[Karre and Ljunggren (1985) J. Exp. Med. 162,1745]에 기재되어 있다.
편리하게도, 상기한 숙주 세포는 형질감염 전에 어떠한 MHC 유형 I 분자도 실질적으로 발현하지 않는다. 자극 세포가 B7.1, B7.2, ICAM-1 및 LFA 3 같은 T 세포 공자극에 중요한 분자를 발현하는 것이 바람직하다.
수많은 MHC 유형 II 분자 및 공자극자 분자의 핵산 서열은 GenBank 및 EMBL 데이타베이스에서 얻을 수 있다.
추가의 실시양태에서, 예를 들어 표 A 및 B에 제시한 MHC-유형 II 분자와 같은 HLA 분자의 조합도 사용될 수 있다. 재조합성 다항원결정인자 백신을 다양한 CD8+ CTL 항원결정인자 전달에 사용하는 방법은 (여기에서 참고문헌으로 이용된) 문헌[Thomson 외 (1996) J. Immunol. 157, 822-826] 및 WO 96/03144에 언급되어 있다. 본 발명과 관련하여, 펩티드(또는 펩티드를 암호화하는 핵산)가 단일 백신에 포함되는 것이 바람직하며, 이때 펩티드는 임의의 순서로 본 발명의 아미노산 서열 및 다른 CD8+ T 세포 자극 항원결정인자를 포함한다. 이러한 백신은 암치료에 특히 유용할 것이다. 이러한 실에 꿴 염주알 백신은 보통 DNA 백신이다. MHC 유형 II 의존 면역 반응을 MHC 유형 I 의존 면역 반응과 함께 자극하는 것은 국소적인 CD4 양성 T 세포의 TH1 유사 T 세포 반응을 유발하게 되며, 특히 MHC 유형 I 의존성 CD8 양성 T 세포가 지원된다는 점에서 장점을 갖는다.
시험관내에서 CTL을 생성하기 위해 다양한 다른 방법이 사용될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Peoples 외 (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92,432-436] 및 문헌[Kawakami 외 (1992) J. Immunol. 148,638643]은 CTL 생성에 자가 종양 침윤성 림프구를 사용했다. 문헌[Plebanski 외 (1995) Eur. J. Immunol. 25,1783-1787]은 CTL의 제조에서 자가 말초 혈액 림프구(PLB)를 이용했다. 또한 문헌[Jochmus 외 (1997) J. Gen. Virol. 78,1689-1695]은 재조합 바이러스를 이용한 감염 또는 펩티드 또는 폴리펩티드로 수지상 세포를 적용하여 자가 CTL을 초래했다. 문헌[Hill 외 (1995) J. Exp. Med. 181,2221-2228] 및 문헌[Jerome 외 (1993) J. Immunol. 151,1654-1662]은 자가 CTL을 생성하기 위해 B 세포를 이용했다. 게다가, 펩티드 또는 폴리펩티드로 펄스되었거나 또는 재조합 바이러스로 감염된 대식세포가 자가 CTL 제조를 위해 사용될 수도 있다. 문헌[S. Walter 외 (Walter S, Herrgen L, Schoor O, Jung G, Wernet D, Buhring HJ, Rammensee HG, Stevanovic S. 최첨단: 조정된 MHC/항CD28으로 덮힌 미세구체에 의해 인간CD8 T세포의 미리 결정된 결합력. J Immunol. 2003 Nov 15;171(10):4974-8)]은 인공 항원제시세포를 이용하여 T 세포를 시험관내에서 프라이밍했는데, 이는 펩티드 선택에 대한 T 세포를 발생시키는데 역시 효과적인 방법이다.
CTL 제조 시 동종이형 세포를 사용할 수 있는데, 이는 (여기에 참고문헌으로 이용된) WO 97/26328 에 상세히 기재되어 있다. 예를 들어, 초파리 세포 및 T2 세포뿐만 아니라, CHO 세포, 바큘로바이러스 감염 곤충 세포, 박테리아, 효모, 백시니아 감염 표적 세포 등의 기타 세포도 항원제시에 이용될 수 있다. 또한 식물 바이러스도 사용될 수 있다(참조 문헌[Porta 외 (1994) Virology 202, 449-955에는 외부 펩티드 발현에 대한 고수익 시스템으로써의 카우피 모자이크바이러스의 개발에 대해 설명되어 있다]).
본 발명의 펩티드에 대해 지시된 활성화된 CTL은 치료 방법에 유용하다. 따라서, 본 발명의 추가의 양태는 앞서 말한 방법에 의해 획득가능한 활성화된 CTL을 제공한다.
본 발명의 추가의 양태는 본 발명의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 비정상적으로 발현하는 세포를 선택적으로 인식하는 활성화된 CTL을 제공한다. 바람직하게는, CTL은 HLA/펩티드 복합체(예를 들어 결합)와의 상호작용에 의해 상기 세포를 인식한다. CTL은 표적 세포가 본 발명의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 비정상적으로 발현하는 환자에서 표적 세포를 사멸하는 방법에 유용하며, 이때 환자는 효과적인 수의 활성화된 CTL이 투여된다. 환자에게 투여되는 CTL은 환자로부터 유래되고, 또한 위에 언급한 대로 활성화될 수 있다(즉 자가 CTL). 대안적으로, CTL은 환자 자신이 아닌 타인으로부터 얻은 것을 사용할 수도 있다. 물론, 개체가 건강하면 더 좋을 것이다. 여기서 말하는 건강한 개체는 개체가 일반적으로 양호한 건강인 것, 바람직하게는 적격 면역계를 갖는 것, 보다 바라직하게는 용이하게 시험될 수 있거나 감지될 수 있는 임의의 질병이 없는 것을 의미한다.
활성화된 CTL는 T 세포 수용체(T-cell receptor: TCR)를 발현하는 데 이 수용체는 비정상적인 폴리펩티드를 발현하는 세포에 대한 인식과정에 관여한다. TCR을 암호화하는 cDNA가 활성화된 CTL로부터 클로닝되고 발현을 위해 다른 CTL로 형질감염되는 것이 유용하다.
생체내에서, 본 발명에 따른 CD4 양성 CTL에 대한 표적 세포는 (때때로 MHC 유형 II를 발현하는) 종양 세포일 수도 있고/거나 (때때로 MHC 유형 II를 발현하는) 종양 (종양 세포)를 둘러싸는 기질 세포일 수도 있다.
본 발명의 펩티드에 특이적인 본 발명의 CTL 클론의 TCR은 클로닝된다. CTL 클론에 사용되는 TCR은 1) TCR 가변성 영역-특이적 단일클론성 항체(TCR variable region-specific monoclonal antibodies) 및 2) Va 및 Vp 유전자과에 특이적인 프라이머를 이용한 RT PCR을 사용하여 결정된다. cDNA 라이브러리는 CTL 클론에서 추출한 poly-A mRNA로부터 만들어지게 된다. TCR a 및 P 쇄의 C 말단 부분 및 식별된 Va 및 P 분절의 N 말단 부분에 특이적인 프라이머를 사용한다. TCR a 및 쇄에 대한 완전 cDNA는 고정확도 DNA 중합효소로 증폭되고 증폭 산물은 적절한 클로닝 벡터로 클로닝된다. 클로닝된 a 및 P 쇄 유전자는 문헌[Chung 외 (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 12654-12658]에 기재된 방법에 의해 단일 쇄 TCR로 모을 수 있다. 단일 쇄에서 VaJ 분절은 V DJ 분절 뒤에 오고, 이는 CD3 쇄의 세포막 및 세포질 분절 뒤에 오는 Cp 분절이 그 뒤를 잇는다. 이 단일 쇄 TCR은 그 후 레트로바이러스 발현 벡터에 삽입된다(벡터의 패널은 성숙한 인간의 CD8 양성 T 림프구를 감염시키고 유전자 발현을 매개하는 능력에 따라 사용될 수 있다. 레트로바이러스 벡터 시스템 Kat가 그러한 바람직한 예이다(참조 문헌[Finer 외 (1994) Blood 83,43])). 고역가 양친화성 레트로바이러스는 종양 환자의 말초 혈액에서 단리한 CD8 양성 또는 CD4 양성 T 림프구를 감염시키는 데 사용된다(문헌[Roberts 외 (1994) Blood 84,2878-2889]의 프로토콜 참조). CD3 항체는 정제된 CD8+ T 세포의 증폭 과정을 유발하는데 사용되며, 이는 단일 쇄 TCR의 안정적인 발현양상과 레트로바이러스 통합을 촉진한다. 레트로바이러스 형질도입의 효과는 단일 쇄 TCR에 특이적인 항체로 CD8+ T 세포를 염색하여 결정된다. 형질도입된 CD8 양성 T 세포의 시험관내 분석은, 이들이 TCR 쇄가 원래 클로닝된 자가제한 CTL 클론에 의해 알 수 있는 바와 같이 동일한 종양 특이적 사멸을 나타낸다는 것을 확립하였다. 예상되는 특이성을 갖는 형질도입된 CD8 양성 T 세포의 집단은 종양 환자의 채택된 면역요법에 사용될 수 있다. 환자들은 108 에서 1011개의 자가 형질도입된 CTL에 의해 치료받는. CD8 양성과 유사하게, 관련 구조체를 운반하는 형질도입된 CD4 양성 보조 T 세포도 발생할 수 있다.
유전자를 CTL에 도입하는 적절한 방법은 여기에 참고문헌으로 인용된 문헌[Moritz 외 (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 4318-4322]에 잘 나와있다. 문헌[Eshhar 외 (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 720-724] 및 문헌[Hwu 외 (1993) J. Exp. Med. 178, 361-366]도 CTL의 형질감염을 기재했다. 따라서, 본 발명의 추가의 양태는 본 발명의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 비정상정으로 발현하는 세포를 인식하는 TCR(활성화된 CTL에서 얻을 수 있는 TCR)을 제공한다.
TCR뿐만 아니라, TCR에 기능적으로 동일한 분자들도 본 발명에 포함되어 있다. TCR과 동일한 기능을 수행할 수 있는 TCR과 기능적으로 동등한 임의의 분자가 포함된다. 특히, (여기에 참고문헌으로 인용된 문헌[Chung 외 (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 12654-12658]에 나타한 방식에 의해 만들어진) 유전적으로 설계된 세 부위의 단일 쇄 TCR이 이 분자에 포함된다. 또한 본 발명은 TCR을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 또는 기능적으로 동등한 분자, 및 TCR을 암호화하는 발현 벡터 또는 기능적으로 동등한 분자를 포함한다. 본 발명의 TCR을 발현하는 데 적합한 발현 벡터는 본 발명의 펩티드 발현에 대해 앞서 언급했던 것들을 동일하게 포함한다.
그러나, 형질감염 후에 CTL에 TCR을 발현할 수 있는 발현 벡터가 더 바람직하다.
또한, 본 발명의 투가의 양태는, 본 발명의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 비정상적으로 발현하는 환자의 표적 세포만을 사멸하는 방법을 제공하며, 이때 상기 방법은 1) 환자로부터 CTL을 수득하는 단계; 2) TCR 또는 기능적으로 동등한 분자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 상기 세포에 도입하는 단계: 3) 상기 단계 (2)에서 생성된 세포를 환자에게 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명의 추가의 양태는, 본 발명의 제 1, 제 2 또는 제 3 양태에서 정의된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 비정상적으로 발현하는 표적 세포를 갖는 환자의 표적 세포를 사멸하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 1) 수지상 세포 같은 항원제시세포를 환자에게서 수득하는 단계; 2) 본 발명의 제 1, 제 2 또는 제 3 양태에서 정의된 펩티드 및 항원제시세포를 접촉시키거나 또는 이러한 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드와 항원제시세포를 생체 외로 접촉시키는 단계, 및 3) 이렇게 처리된 항원제시세포를 환자에게 재주입하는 단계를 포함한다.
바람직하게는, 항원제시세포로는 수지상 세포이다. 적합하게는, 수지상 세포는 항원성 펩티드로 펄스될 수 있는 자가조직의 수지상 세포이다. 항원성 펩티드는 적절한 T 세포 반응을 일으키는 임의의 적합한 항원성 펩티드일 수 있다. 종양 관련 항원에서 유래한 펩티드로 펄스한 자가조직의 수지상 세포를 이용한 T 세포 치료는 문헌[Murphy 외 (1996) The Prostate 29,371-380 와 Tjua 외 (1997) The Prostate 32, 272-278]에 발표되었다.
추가의 실시양태에서, 수지상세포 같은 항원제시세포는 본 발명의 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드와 접촉된다. 폴리뉴클레오티드는 임의의 적합한 폴리뉴클레오티드일 수 있고, 수지상 세포를 형질도입하여, 펩티드의 제시 및 면역성의 유도를 유발하는 것이 바람직하다.
편리하게도, 폴리뉴클레오티드는 바이러스성 폴리뉴클레오티드 또는 바이러스에 포함될 수 있다. 예를 들어, 아데노바이러스-도입된 수지상 세포는 MUC1과 관련한 항원 특이적 항종양 면역성을 유발한다고 알려져 왔다(문헌[Gong 외 (1997) Gene Ther. 4,1023-1028]). 유사하게, 아데노바이러스에 의거한 시스템이 사용될 수 있으며(문헌[Wan 외 (1997) Hum. Gene Ther. 8, 1355-1363]), 레트로바이러스 시스템도 사용될 수 있고(문헌[Specht 외 (1997) J. Exp. Med. 186, 1213-1221] 및 문헌[Szabolcs 외 (1997)]), 수지상 세포에 혈액입자를 매개한 방식도 이용될 수 있고(문헌[Tuting et al (1997) Eur. J. Immunol. 27, 2702-2707]), RNA도 사용될 수 있다(문헌[Ashley 외 (1997) J. Exp. Med. 186, 1177-1182]).
환자의 표적 세포를 사멸하는 방법에 대해서, 표적 세포가 암세포, 특히 신장 또는 결장 암 세포인 경우가 특히 더 효과적이다.
본 발명의 방법에 의해 치료된 환자가 HLA-DR 하플로타입을 가진 경우가 특히 더 바람직하다. 따라서, 바람직한 실시양태에서, 환자의 HLA 하플로타입은 치료 전에 결정된다. HLA 하플로타이핑은 임의의 적합한 방법을 사용하여 수행될 수 있고, 이 방법은 당해 분야에 공지되어 있다.
본 발명은 생체내 백신요법의 활성화를 위해; 시험관내에서 자가조직 수지상 세포의 조작 및 이어서 그렇게 조작된 생체내 수지상 세포를 도입시켜 CTL 반응을 활성화시키기 위해; 시험관내 자가조직의 CTL을 활성화시킨 후 채택 요법(즉, 그렇게 조작된 CTL을 환자에게 도입함)을 수행하기 위해; 건강한 공여자(MHC 일치 여부에 관계 없이)로부터 CTR을 활성화시킨 후 채택 요법을 수행하기 위해 본 발명의 펩티드(또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드)를 사용하는 것을 포함한다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명의 백신은 종양의 형성을 억제하거나 또는 억제하기 위해 단독으로 또는 다른 암 치료와 병용하여 숙주에게 투여된다.
펩티드 백신은 보통 보조제 없이 투여될 수 있다. 또한, 펩티드 백신은 BCG 또는 명반 같은 보조제와 함께 투여할 수 있다. 다른 적합한 보조제에는 사포닌, 미코박테리아 추출물 및 합성 세균 세포벽 유사제로부터 유래된 Aquila's QS21 스티뮬론 (Aquila Biotech, Worcester, MA, USA)이 있으며 Ribi's Detox. Quil A같은 사전독점 보조제, 그 밖의 사포닌 유래 보조제 등이 사용될 수 있다(Superfos, Denmark). CpG 올리고뉴클레오티드, 안정화된 RNA, 이미퀴모드 (상품명 Aldara, 3M Pharma, U.S.A.에서 구입가능), 불완전 프로인드 보조제 (Montanide ISA-51, Seppic S.A., Paris, France 에서 구입가능), 리포솜 제형 또는 GM-CSF(과립구-대식구 집락 자극인자)와 같은 기타 보조제도 사용할 수 있다. 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH)과 결합된 펩티드를 제공하는 것도 유용하며, 보조제와 함께 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명의 펩티드는 진단 시약으로서 또한 사용될 수도 있다. 펩티드를 사용함으로써, CTL 집단에서, CTL이 치료에 의해 유도되거나 또는 펩티드에 대항하여 특이적으로 반응하는 지를 분석할 수도 있다. 더욱이, T 세포 전구체의 증가는 정의된 펩티드에 대한 반응을 보이는 펩티드에 의해 시험될 수 있다. 게다가, 펩티드는 펩티드가 유래된 항원을 발현하는 종양의 질병의 진행을 관찰하기 위해, 마커로서 사용할 수 있다.
첨부된 표 1에는 식별된 펩티드가 나열되어 있다. 또한 각 펩티드의 유래 단백질뿐만 아니라, 각각의 단백질에서 각각의 펩티드 위치를 기재했다. 더욱이 각각의 열람번호는 미국 국립보건원(National Institute of Health)의 생명공학 정보 국립센터(National Centre for Biotechnology Information) 유전자 은행을 참조한 것이다(참고 http: www.ncbi.nlm.nih.gov.)
다른 바람직한 실시양태에서, 펩티드는 백혈구, 특히 T 림프구 염색 시에 사용된다. CTL 집단에 펩티드에 대하여 반응하는 특이적 CTL이 존재하는지를 증명하고자 할 때 특히 유용하다. 또한, 펩티드는 종양 질환 치료의 진행을 평가하는데 마커로서 사용될 수 있다.
또 다른 바람직한 실시양태에서, 펩티드는 항체 생산에 사용될 수 있다. 다클론 항체는 펩티드를 특정동물에게 주입후 발생하는 면역화에 의해 표준화된 방식으로 얻을 수 있다. 단일클론성 항체도 이미 표준화된 프로토콜에 의해 만들어진다(예를 들어, Enzymol. (1986), 121, 하이브리도마 기술 및 단클론성 항체).
본 발명은 본 발명의 하나 이상의 펩티드를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다. 이 조성물은 비경구 (예를 들어 피하, 피부 내, 근육 내) 또는 경구 투여 모두 가능하다. 이를 위해서, 펩티드는 약학적으로 허용가능한, 바람직하게는 수성 담체에서 용해되거나 현탁된다. 또한, 이 조성물은 완충제, 결합제, 파열제, 희석물, 향미료, 윤활제 같은 첨가물을 함유할 수도 있다. 또한 시토카인과 같은 면역제극성 물질과 함께 투여될 수도 있다. 이러한 조성물은 A. Kibbe, 제약 부형제 편람, 3판, 2000년, 미국제약협회 및 제약출판에 잘 나와 있다. 이러한 조성물은 종양 질환의 예방책으로 사용될 수 있다.
본 발명의 펩티드(서열 번호 1 내지 서열 번호 49)를 하나 이상 포함하는 약학 제제는 개개의 펩티드 또는 항원과 연관된 종양 질환으로 고생하는 환자에게 투여된다. 이로써, CTL에 특이적인 면역 반응이 일어날 수 있다.
또 다른 본 발명의 양태에서, 본 발명의 둘 이상의 펩티드들의 조합물이 직접 조합물로서 또는 동일한 치료 섭생에서 백신으로서 사용될 수 있다. 게다가, MHC 유형 II 특이적 펩티드 같은 다른 펩티드의 조합물도 사용될 수 있다. 당해 분야의 숙련자는 실험을 통해 어떤 펩티드를 혼합하였을 때 그 면역성이 좋은지 실험해 봐야 한다. 예를 들어, 1) 특정한 펩티드에 대한 특정 T 세포의 증가, 친화, 증폭, 전반적인 관여, 효율성뿐만 아니라 시험관내에서 T 세포의 발생, 그리고 2) T세포의 기능 (예를 들어 IFN- (아래 예시 참조), IL-12 또는 퍼포인(Perfoin) 분비) 등을 검사한다. 보통, 그 뒤에 가장 효율이 좋은 펩티드를 위의 목적으로써 백신으로 혼합하여 사용한다.
적절한 백신은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15 개의 다른 펩티드 (특히 4, 5, 6, 또는 7 개의 펩티드)를 포함하고 6 개의 펩티드가 가장 좋다.
결국, 백신은 환자의 HLA-하플로타입은 물론이고 환자의 면역 상태, 초기 치료 처방, 질환의 상태뿐만 아니라 암의 유형에 따라 결정된다.
Ii의 80개의 N말단 아미노산은 직접 단백질을 유형 II 가공 경로로 이끌기 충분하다고 이미 밝혀졌다(Sanderson, S., Frauwirth, K. & Shastri, N. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 92, 7217-7221, Wang, R. F., Wang, X., Atwood, A. C., Topalian, S. L. & Rosenberg, S. A. (1999) Science 284, 1351-1354).
종양 관련 항원의 보조 T 세포 항원결정인자의 식별은 항 종양 면역요법에서 가장 중요한 일이라 볼 수 있다. 따라서 발명자들은 일반적인 적용 가능한 방법 및 MS에 의한 상이한 펩티드 분석을 통해 결정된 펩티드들을 (자연적으로 가공되고 제시되는 종양 관련 항원의 MHC 유형 II 리간드를 규명하기 위해) 연구 및 보고한다. 최초로 이러한 접근은 Ii 쇄와 특이 항원 간 융합단백질을 암호화하는 벡터로의 APC(항원발현세포) 감염단계, HLA 결합 펩티드의 분리 및 비감염세포와 비교하여 감염세포에 의해 발현된 항원 유래 펩티드의 MS 확인을 종합한다. 또한, 발명자들은 동종 항원을 과발현하는 감염세포를 특이적으로 인식하는 규명된 펩티드에 반하여 유도된 T 세포를 보여주는 방식으로 타당성을 검증한다. 비록, 규명 펩티드가 생체내에서 면역성에 대한 검증 과정을 거쳐야 할지라도, 우리의 접근법으로 자연적으로 가공된 MHC 유형 II 리간드의 특징을 정확하게 부여할 수 있다. 따라서, 발명자들은 겹치는 종양 관련 항원의 합성 펩티드 또는 항원결정인자에 의해 선택된 다양한 펩티드(이는 유형 I 항원결정인자와 비교하여 상대적으로 정확성이 떨어진다)에 대한 검증을 피한다. 실험실에서의 T 세포 실험방법(생체내에서 T 세포 활성을 유도할 수 없는 잠재 T 세포 항원결정인자 규명을 가능케 하는 방법)(문헌[Anderton, S. M., Viner, N. J., Matharu, P., Lowrey, P. A. & Wraith, D. C. (2002) Nat. Immunol. 3, 175-181])과는 대조적으로, 본 과정은 존재하는 것으로 밝혀진 일부 펩티드에게만 그 초점이 맞춰줘 있다. 또한 이 방법을 사용함으로써, 펩티드가 자연적으로 가공되었는지를 증명하기 위해 재조합 Ag를 생산하거나 Ag-발현 종양 세포주를 가질 필요가 없다.
본 발명자들은 종양 관련 항원을 EBV-형질도입된 B 세포의 유형 II 가공 구획으로 인도하기 위해 Ii의 N 말단을 이용했다. 이를 위해, 이들은 Ii를 가진 융합 단백질 같은 임의의 항원을 발현할 수 있고, 웨스턴 블롯 분석(Western blot analysis)을 통해 형질감염된 세포 내에서의 단백질 발현 수준을 우리가 결정하도록 돕는 다양한 벡터를 제작했다. 단백질이 유형 II 가공 구획을 표적화하는데 Ii의 N 말단이 충분하다고 이미 밝혀졌다. 그러나 융합 단백질 암호화 cDNA 라이브러리를 사용하여 미지의 항원을 규명하거나(문헌[Wang, R. F., Wang, X., Atwood, A. C., Topalian, S. L. & Rosenberg, S. A. (1999) Science 284, 1351-1354]), 이미 알려진 T 세포 클론의 특이성을 확증하기 위해(문헌[Sanderson, S., Frauwirth, K. & Shastri, N. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 92, 7217-7221]) 지금까지 난백알부민을 사용한 모델에서만 이것이 나타났다(문헌[Chaux, P., Vantomme, V., Stroobant, V., Thielemans, K., Corthals, J., Luiten, R., Eggermont, A. M., Boon, T. & van der, B. P. (1999) J. Exp. Med. 189, 767-778]). 본 발명의 발명자가 아는 바로는, 본 방법이 알려진 종양 관련 항원의 자연적으로 존재하는 MHC 유형 II 결합 펩티드를 식별하는데에 사용된 적은 지금까지 없었다. 형질감염 및 비형질감염 세포의 유형 II 리간드 분석방법(MALDI-MS에 의한) 및 상이하게 발현하는 펩티드의 특성 규명 방법(ESI-MS에 의한)은 관심 있는 항원의 유형 II 리간드를 식별하는 직접적인 방법이라 할 수 있다. 케라틴 18 융합 단백질로 세포를 형질감염하면, 모델 형질전환유전자, 케라틴 18에서 유래한 HLA-DR 제시 펩티드를 평가할 수 있다.
TAA의 보조 T 세포 항원결정인자의 식별은 항종양 면역치료에서 여전히 중요한 과제로 남아있다. 현재까지, TAA의 유형 II 펩티드를 식별하는 몇몇 전략이 밝혀졌는데, 그 범위는 관심있는 항원과 항원제시세포를 배양하는 것부터(문헌[Chaux, P., V. Vantomme, V. Stroobant, K. Thielemans, J. Corthals, R. Luiten, A.M. Eggermont, T. Boon, and B.P. van der Bruggen. 1999. CD4(+) T 림프구에 대한 HLA-DR 분자에 의해 발현된 MAGE-3 항원결정인자 확인. J. Exp . Med. 189:767-778]), 융합단백질로 다양하게 형질감염하는 것까지(문헌[Dengjel,J., P.Decker, O. Schoor, F. Altenberend, T. Weinschenk, H.G. Rammensee, and S. Stevanovic. 2004. HLA 유형 II 표적 및 감별 질량 분광측정법의 진성조합에 의해 자연적으로 처리된 시클린 D1 보조 T 항원결정인자의 확인. Eur.J.Immunol. 34:3644-3651]) 이른다. 모든 이러한 방법들은 시간 낭비도 많을뿐더러 또한 HLA 리간드가 실제로 인간의 조직 생체내에서 제시되는지도 불분명한 상태이다. 우선 발명자들은 절개한 고형 종양으로부터 직접적으로 HLA 유형 II 리간드를 분리하여, 생체내에서 주위조직과 종양 부위에서 제시되는 펩티드를 식별해야 한다. 이는 적절한 T 세포 수용체를 유도하여 T 세포에 의한 인식이 가능하게 되고, 또한 그 세포 표면에 공자극 리간드인 CD4를 동시에 발현되게 한다. 내인성으로 가공된 HLA 유형 II 리간드에 대한 공급원으로서 기능하는 단백질 중에서, 일련의 관리단백질 및 면역 관련 단백질이 식별되었다. 그러나, 이 외에도 생체내에서 TAA의 적절한 유형 II 리간드를 규명하기 위한 지름길로 종양 관련 항원의 펩티드도 연구할 가치가 충분하다.
본 발명의 발명자들은 MMP7의 하나의 리간드 및 IGFBP3의 중심 서열을 담당하는 세 개의 리간드를 식별했다. 이들은 신장세포 암종에서 이들 단백질이 과발현됨을 발견했고, 더욱이 이 단백질들이 종양에 관련성있다고 보았다(문헌[Miyamoto, S., K. Yano, S. Sugimoto, G. Ishii, T. Hasebe, Y. Endoh, K. Kodama, M. Goya, T. Chiba, and A. Ochiai. 2004. 인슐린 유사 성장인자 결합단백질 3에 대한 기질 금속단백분해효소-7의 단백분해활성을 통해 기질 금속단백분해효소-7은 인슐린 유사 성장인자 생체이용률을 촉진한다. Cancer Res . 64:665-671; Sumi, T., T. Nakatani, H. Yoshida, Y. Hyun, T. Yasui, Y. Matsumoto, E. Nakagawa, K. Sugimura, H. Kawashima, and O. Ishiko. 2003. 인간신장세포암종에서의 기질 금속단백분해효소 7 및 2의 발현. Oncol . Rep . 10:567-570; Cheung, C.W., D.A. Vesey, D.L. Nicol, and D.W. Johnson. 2004. 근위세관 조절에서의 IGF-I 및 IGFBP-3의 역할 및 신장세포암종의 증식. Kidney Int. 65:1272-1279]). 이들 펩티드는 HLA 유형 II 분자에 불규칙적으로 결합하며 다른 건강한 공여자의 CD4 양성 T 세포를 활성시켰다. 따라서, 이러한 접근법은 TAA의 새로운 유형 II 펩티드의 후보 규명과정에 매우 도움을 주어 이는 실제 임상에서 백신 프로토콜에 꽤 효율적인 연구가 될 것이다.
추가의 양태에서 본 발명은 본원에 주어진 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 발현하는 표적 세포를 갖는 환자의 표적 세포를 사멸하는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 본 발명에 따른 효과량의 펩티드 또는 본 발명에 따른 핵산 또는 본 발명에 따른 발현 벡터를 환자에게 투여하는 단계를 포함하고, 상기 펩티드의 양, 상기 핵산의 양, 또는 상기 발현 벡터의 양은 상기 환자의 항표적 세포 면역 반응을 유발하는데 효과적이다.
또한 본 발명은 본 발명에 따라 정의된 효과적인 개수의 세포독성 T 림프구(CTL)를 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 표적 세포가 본 발명에 따라 주어진 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 발현하는 환자의 표적 세포를 사멸하는 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 표적 세포가 본 발명에 따라 주어진 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 발현하는 환자의 표적 세포를 사멸하는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 (1) 환자로부터 CTL을 수득하는 단계, (2) 본 발명에 따라 정의된 T 세포 수용체(TCR)를 암호화하는 핵산 또는 기능적으로 동등한 분자를 상기 세포에 도입하는 단계, 및 (3) 단계 (2)에서 생성된 세포를 환자에게 도입하는 단계를 포함한다.
바람직하게는, 표적 세포는 암세포이다. 보다 바람직하게는, 상기 암은 본 발명에 따라 주어진 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 발현하는 백혈병 또는 림프종이다.
고형 종양의 종양 세포는 동일 조직의 건강한 세포와는 대조적으로 세포 표면에 인간의 HLA 유형 II 분자를 발현한다는 것을 놀랍게도 발견하였다. 이러한 사실은 문헌[Brasanac 외 (Brasanac D, Markovic-Lipkovski J, Hadzi-Djokic J, Muller GA, Muller CA. 신장세포암종에서 HLA 유형 II 항원 및 종양 침윤성 단핵세포의 면역조직화학분석: 임상 및 조직병리 정보와의 관련성. Neoplasma. 1999;46(3):173-8.)에서만 유일하게 한번 기재되었고, 여기에서는 37개의 신장 세포 암종(25가지 투명세포 종류, 10가지 과립성, 2가지 혐색소성)이 HLA 유형 II 항원 및 종양 침윤성 단핵세포(TIM) 분석하기 위한 항-CD14, -CD3, -CD4 및 -CD8 MoAb를 분석하기 위해서 단일클론성 항체 (MoAb)를 HLA-DR, -DP 및 DQ에 적용하는 면역과산화효소법으로 연구되었다. 염색 양성은 준정량적으로 세었고, 실험 결과는 RCC에 대한 1) 임상적인 (환자 나이, 성별, 종양 크기, TNM 단계), 2) 조직학적인 (세포는 세포학, 조직학, 수준) 특성과 연결시켰다. HLA-DR, 92% -DQ 와 73% -DP 항원을 발현하는(발현수준 DR>-DQ>-DP) 모든 RCC는 조직학적 또는 임상적인 모수와는 통계적으로 유의미한 결과가 나오지는 않았다. 단핵세포가 T 림프구보다 많고 CD4+가 CD8+ T 세포보다 더 많은 반면, T 클론이 많고 CD4+ 및 CD8+ T세포의 수가 대략 같은 종양의 평균 직경이 가장 컸다. 종양 세포에 의한 불충분한 T 클론 활성은 모수 상관성에 영향을 미치는데, 이는 RCC의 비정상적인 HLA 유형 II 항원 발현을 보이는, 보다 공격적인 종양 특성을 나타내는 것이다.
본 발명에서 밝혀지고 기재된 특성들은 각각을 적절하게 결합하여 사용할 수도 있고, 본 발명의 의도에서 벗어나지 않은 한도 내에서 단적으로 사용할 수도 있다.
본 발명을 다음의 표, 서열표, 예시를 통해 보다 상세히 기재했다. 예시는 오로지 서술적인 목적으로만 기재한 것이지 본 발명의 제한을 두는 의도는 전혀 아니다.
본원 발명에 따른 종양 관련 펩티드는 면역 요법, 특히, 암(그 중에서도 신장암과 결장암)에 대한 면역 요법에 이용될 수 있다.
또한, 본원 발명에 따른 종양 관련 펩티드는 항 종양 면역 반응(anti-tumor immune responses)을 자극하는 백신 조성물의 활성 약물 성분으로서 작용하는, 종양 관련 보조 T 세포 펩티드 항원결정인자(tumor-associated T-helper cell peptide epitopes) 단독 또는 다른 종양 관련 펩티드와 조합된 종양 관련 보조 T 세포 펩티드 항원결정인자로서 이용될 수 있다.
또한, 본원 발명에 따른 종양 관련 펩티드는 항 종양 면역 반응을 유발하기 위한 백신 조성물에 이용될 수 있다.
도 1은 RCC를 가진 세 환자의 HLA 유형 II 분자 발현양상을 보여준다. RCC 132 환자의 종양에서 HLA 양성세포는 가장자리(A, B)에 바람직하게는 집중되어 있는 반면, RCC 190 및 RCC 211 환자로부터의 종양의 HLA 유형 II 발현 패턴은 골고루 퍼져있음을 확인할 수 있다(C, E, G). 연속 조직 절편에서 CD68 양성 대식세포(B, D, F)들은 종양 침윤성 단핵면역세포 및 HLA II 발현 세포와 매우 밀접함을 확인할 수 있었다. 특정한 항체 대신에 마우스 IgG로 배양했을 때는 음성 염색 결과가 나왔다 (H). 대문자 T는 종양을 나타낸다.
도 2는 IGFBP3169 -181, MMP7247 -262 및 CCND1198 -212에 특이적인 CD4 양성 T세포의 FACS 분석결과이다. CD4-FITC에 대한 세포내 인터페론 감마의 점적 염색을 볼 수 있다.
도 3a 내지 3c는 각 공여자와 각 펩티드에 대해 파악된 CD4 양성세포를 발생하는 항원에 특이적인 IFNγ 개략적 삽화로, 각 공여자와 자극 유발을 위해 사용한 펩티드에 대한 CD4 양성 T 세포를 발생하는 IFNγ 퍼센트를 볼 수 있다. 세포들을 96 웰(공) 플레이트에서 공여자와 펩티드 당 7 웰(공)을 배양시켰다. 상자표식은 양성 값들이다: CD4 양성 T세포를 야기하는 IFNγ 퍼센트는 펩티드 없는 음성 대조군의 그것과 비교했을 때 거의 두 배가 더 높다. 부적당한 펩티드로 자극한 CD4 양성 T세포를 발생하는 IFNγ의 퍼센트는 펩티드 없이 자극한 군의 값들과 밀접한데 이는 IGFBP3169-181로 시행한 3번째 자극 이후 공여자 1에서는 예외다. 그러나, 이 효과는 4번째 자극 이후에는 더 이상 관찰되지 않았다.
도 4는 CC1 165 (약간 상이한 결장 암종)의 HLA 유형 II 분자의 발현양상이다. 정상적 결장 점막(패널c와 좌측의 패널 a: 별표)의 고유판 부위에서, 전형적으로 일부 HLA 유형 II 양성 대식세포가 발견되나 상피세포들은 모두 HLA 유형 II에 대해 음성으로 나왔다. 그러나, 종양의 각기 상이한 부위의 상피세포들 중 패널 a의 우측부위, 패널 b와 d의 세포들은 HLA II 에 뚜렷한 염색반응을 보였다.
도 5는 질량분석법으로 인간 종양 조직에서 분리한 HLA 유형 II 분자에서 용해한 펩티드 서열 규명자료이다. 도 5a는 서열 번호 1 (SQDDIKGIQKLYGKRS) 펩티드 서열에 상응하는 MMP7로부터 자연적으로 가공되고 제시된 HLA 유형 II 리간드가 쪼개져 나온 절편을 보여주는 그림이다. 주석달린 조각들은 표 5에 기재했다. 도 5b는 서열 번호 1 펩티드 서열을 가지는 합성 펩티드를 쪼개서 나온 절편들을 나타낸다. 합성으로, 자연적으로 가공된 두 펩티드 절편들은 동일한 절편 양상을 보여주며, (이전에 규명되지 않았던 서열 번호 1) 인간의 MMP7에서 유래한 HLA 유형 II 리간드의 일차 아미노산 서열을 추론하여 확립할 수 있었다.
서열 번호 1 내지 서열 번호 49는 본 발명에 따른 MHC 유형 II에 의해 제시되는 펩티드를 함유하는 T 세포 항원결정인자의 펩티드 서열이다.
서열 번호 50 내지 서열 번호 79는 표 3에 그 펩티드 서열을 표시했다.
Figure pat00001
Figure pat00002
Figure pat00003
19 이상의 점수를 획득한 펩티드는 DRB1*0101 결합제로 간주.
재료와 방법
MHC 유형 II 면역조직법: 종양을 4% 인산염완충포름알테히드에 고정시켜 파라핀에 안착시킨 후 헤마톡실린-에오신에 염색하고 광현미경으로 관찰했다. 통상적인 조직병리학적, 면역조직학적 검사로 RCC를 진단하였다 (Fleming, S. and M. O'Donnell. 2000 신장상피종양의 수술병리학: 최신 경향 및 상태. Histopathology 36:195-202).
MHC 유형 II 분자 또는 CD 68 분자 각각의 면역조직학적 검사를 위해, 파라핀으로 안착한 조직을 5 μm 두께로 잘랐다. 이 절편을 10 mM 구연산염완충액, pH 6 에 담궈 전처치한 후, 마우스의 항 HLA-DR 알파쇄 mAb (clone TAL.1B5, 1:50) 또는 CD68 Ab (Clone PGM1, 1:50) (DAKO, Hamburg, Germany), 마우스의 IgG1(2 μ g/ml, BD Biosciences Pharmingen, San Diego, USA)로 배양한 뒤, Ventana iView DAB 발견 키트(Nexes System, Ventana Medical Systems, Illkirch, France)로 발색하였다. 발색한 조직을 헤마톡실린으로 대조 염색한 뒤 최종적으로 엔텔란에 안착시켰다.
HLA-DR 결합 펩티드 분자수준의 분석: 얼린 종양 표본들을 위에 상기한 방법대로 처리하였다(문헌[Weinschenk, T., C. Gouttefangeas, M. Schirle, F. Obermayr, S. Walter, O. Schoor, R. Kurek, W. Loeser, K.H. Bichler, D. Wernet, S. Stevanovic, and H.G. Rammensee. 2002 환자개별 항종양 백신 고안을 위한 통합기능적 유전체 접근. Cancer Res. 62:5818-5827]). 또한 표준화된 프로토콜에 따라(문헌[Dengjel, J., H.G. Rammensee, and S. Stevanovic. 2005. 자연적으로 발현된 MHC 유형 II 리간드의 글리칸 곁쇄. J. Mass Spectrom. 40:100-104]) HLA-DR에 특이적인 mAb L243을 이용하여 펩티드를 분리하였다(문헌[Lampson, L.A. and R. Levy. 1980. 인간 B 세포주에서 Ia 유사 분자의 2가지 집단. J. Immunol. 125:293-299]).
천연 펩티드 혼합물은 Q-TOF 질량분석기(Waters, Eschborn, Germany)에 연결한 역상 Ultimate HPLC 시스템(Dionex, Amsterdam, Netherlands) 또는 Q-TOF Ultima AP (Waters)와 연결한 역상 CapLC HPLC 시스템으로 분석하였다(문헌[Lemmel, C., S. Weik, U. Eberle, J. Dengjel, T. Kratt, H.D. Becker, H.G. Rammensee, and S. Stevanovic. 2004. 안정된 동위원소 표지 사용 질량 분광측정법에 의한 MHC 리간드의 감별양적분석. Nat.Biotechnol. 22:450-454]). 분광 분절은 수동 및 자동으로 분석하였다.
고밀도 올리고뉴클레오티드 미세배열법에 의한 유전자 발현 분석: 아피메트릭스 인간 게놈 U133 플러스 2.0 올리코뉴클레오티드 미세배열법(Affymetrix, Santa Clara, CA, USA)으로 시행한 유전자 발현 분석 뿐만 아니라 종양 및 자가조직의 정상 신장에서 분리한 RNA 분리는 상기에 서술한 방식대로 시행하였다(문헌[Kruger, T., O. Schoor, C. Lemmel, B. Kraemer, C. Reichle, J. Dengjel, T. Weinschenk, M. Mㆌller, J. Hennenlotter, A. Stenzl, H.G. Rammensee, and S. Stevanovic. 2004. 원발성 신장세포암종으로부터의 교훈: 면역요법을 위한 진성 종양 항원 및 HLA 리간드. Cancer Immunol. Immunother]). 자료는 GCOS 소프트웨어(Affymetrix)로 분석했다. 종양과 자가조직성 정상 신장 사이의 쌍비교는 각각의 정상 배열을 기준으로 삼아 계산하였다. RCC 149 및 RCC 211에 대해서는 자가조직의 정상 신장 배열 자료를 사용하지 않았다. 따라서, 건강한 사람의 신장 RNA는 상업적으로 입수하였고(Clontech, Heidelberg, Germany) 이들 종양에 대한 기준으로 사용되었다.
DC의 성숙: DC는 건강한 공여자의 혈액을 사용하여 준비하였다. 즉, PBMC는 표준화된 농도 원심분리로 분리하고(림프구 분리 배지, PAA Laboratories GmbH, Pasching, Austria), X-Vivo 15 배지에 ml당 7 X 106의 농도로 평판 배양하였다. 37℃에서 두 시간 경과후, 비유착 세포는 제거되고 유착 단핵구는 100 ng/ml GM-CSF 및 40 ng/ml IL-4로 된 X-Vivo 배지에서 6일 동안 배양된다(AL-ImmunoTools, Friesoythe, Germany). 7일째 되는날, 미성숙 DC들을 10 ng/ml TNF-α(R&D Systems, Wiesbaden, Germany) 및 20 μg/ml poly(IC)(Sigma Aldrich, Steinheim, Germany)와 함께 3일동안 활성화되었다.
항원 특이적인 CD4 양성 T세포 발생: 웰(공)당 106의 PBMCS를 2 X 105 펩티드 펄스형(5 μg/ml) 자가 DC로 자극시켰다. 세포들을 T 세포 배지에 96 웰(공) 플레이트에 배양하고(공여자와 펩티드 당 7 웰), 배지 추가된 RPMI 1640를 10 ng/ml IL-12에 첨가했다(Promocell, Heidelberg, Germany). 37℃에서 3-4일 동안 동시 배양시킨 뒤, 새로운 배지에 80 U/ml IL-2 (Proleukin, Chiron Corporation, Emeryville, CA, USA) 및 5 ng/ml IL-7 (Promocell)를 첨가하였다. 매 6일 내지 8일 사이에 자가조직 PBMC + 펩티드로 재자극시켰다.
세포내 IFNγ 염색: 자극 3, 4 라운드 후에, PBMC를 녹이고 X-Vivo 15 배지에 두 번 세척한 뒤, ml당 107의 농도로 T 세포 배지에 재부유한 후 밤새 배양하였다. 그 다음 날, PBMC 5 μg/ml 펩티드로 펄스를 주고 6시간 동안 1:1의 비율로 효과기 세포와 함께 배양하였다. Golgi-Stop(Becton Dickinson, Heidelberg, Germany)을 배양 마지막 4시간 동안 첨가하였다.
세포들을 Cytofix/Cytoperm Plus kit (Becton Dickinson) 및 CD4-FITC- (Immunotools), IFNγ-PE- 및 클론 SK1-항체 (Becton Dickinson)를 사용해서 분석하였다. 음성 대조군으로, 7 웰(공) 세포들을 모은 뒤, 부적당한 펩티드로 또는 펩티드가 없이 각각 배양시켰다. 양성 대조군으로는, PMA/Ionomycin로 자극했다. 세포들은 three-color FACSCalibur (Becton Dickinson)에서 분석되었다.
실시예
RCC 에 의한 HLA 유형 II 발현
정상적인 비염증 상태에서 HLA 유형 II 분자는 오직 조혈모세포 및 흉선 상피에서 발현된다(문헌[Mach, B., V. Steimle, E. Martinez-Soria, and W. Reith. 1996. MHC 유형 II 유전자의 조절: 질병으로부터의 교훈. Annu.Rev.Immunol. 14:301-331]). 그러나 염증에서는 그 상황이 다르다. HLA 유형 II은 IFNγ에 의해 대부분의 세포 및 조직에서 발현된다(문헌[Leib und Gut-Landmann, S., J. M. Waldburger, M. Krawczyk, L. A. Otten, T. Suter, A. Fontana, H. Acha-Orbea, and W. Reith. 2004. 미니 재검토: MHC 유형 II 유전자의 주조절자인 CIITA의 특이성 및 발현. Eur.J.Immunol. 34:1513-1525]). RCC가 일련의 염증 상황을 종종 수반하기 때문에(문헌[Blay, J. Y., J. F. Rossi, J. Wijdenes, C. Menetrier-Caux, S. Schemann, S. Negrier, T. Philip, and M. Favrot. 1997. 신장세포암종과 관련된 종양부수염증증후군에서의 인터루킨-6 역할. Int. J. Cancer 72:424-430; Elsasser-Beile, U., M. Rindsfuser, T. Grussenmeyer, W. Schultze-Seemann, and U. Wetterauer. 2000. 신장세포암 환자에서 말초 림프구와 비교하여 CD4(+)또는 CD8(+) 종양 침윤성 림프구에서의 인터페론-감마 mRNA 발현 증가. Br. J. Cancer 83:637-641]), 유형 II 분자는 보고된 바와 같이 종양 부근 또는 종양에서 발현된다.
HLA 유형 II 분자 조직면역화학염색법
본 발명의 발명자들은 면역조직화학염색법으로 유두 신장암(papillary renal carcinoma) 및 깨끗한 조직학 세포를 포함하는 10개의 RCC 표본들의 HLA 유형 II 발현을 조사했는데, 모든 관찰 표본에서 유형 II 양성 종양 세포를 발견할 수 있었다. 도 1A에 예시된 것처럼, 종양 가장자리에서 종종 HLA 유형 II 발현이 뚜렷하다. 이들 부위에서, 발명자들은 연속 조직 절편 상 CD68 양성 대식세포에 대한 결과에서처럼 종양 침윤성 면역 세포와 HLA 양성 종양세포가 공간적으로 매우 밀접한 관계가 있음을 확인했다(도 1B). 유두구조가 많은 RCC에서, HLA 유형 II 발현이 종양 전반에 걸쳐 보다 균일하게 분포하였다(도 1 C, E, G). HLA 유형 II 및 CD68 면역 조직 염색 결과를 연속 절편 상 비교 시, 대식세포 외에도, 종양 세포들 또한 HLA 유형 II를 발현함을 알 수 있다(도 1 C, D, E, F). 자연 킬러 세포(natural killer: NK cell)는 물론, IFNγ 생성 CD4 양성 TH1 세포는 RCC를 침윤한다(문헌[Cozar, J.M., J. Canton, M. Tallada, A. Concha, T. Cabrera, F. Garrido, and O.F. Ruiz-Cabello. 2005. 인간신장암종에서의 종양침윤성 CD4 T 림프구에서의 NK 세포 및 시토카인 분석. Cancer Immunol. Immunother]). 유형 II 양성 종양세포가 주로 절개된 종양의 외곽부위에서 발견되는 결과로 인해, 종양에 의해 이끌린 백혈구가 이웃의 악성 세포들에 작용하는 IFNγ을 생산한다는 것을 유추해볼 수 있다. 신생물 조직에서 HLA 유형 II 분자의 비정상적인 발현양상은 RCC에만 국한되지 않으며, TCC 및 CCA에서도 발견될 수 있다. 도 4는 인간 결장 암종으로부터의 조직을 염색한 결과이다.
IFNγ에 의해 유도된 유전자 발현과 IFNγ 자체의 발현 분석
또한, 발명자들은 올리고뉴클레오티드 미세배열법을 이용하여 상대적인 유전자 발현 분석을 시행하여 HLA 유형 II 발현을 살펴보았다. 이 기술로 발명자들은 발현 세포 유형에 관계없이, 절개된 종양에서 전반적인 HLA 유형 II의 발현을 볼 수 있었다. 또한 정상 신장 조직과 비교하여 4 개의 종양 RCC149, RCC180, RCC190 및 RCC211에서 각기 상이한 발현을 살펴 보았다. 모든 4 개의 종양에서 HLA 유형 II 분자를 발현하는 유전자들은 과발현된 것으로 나타났다(표 2). 이는 IFNγ에 의해 유도될 수 있었으므로, 발명자들은 인터페론에 의해 상향 조절되는 것으로 공지된 다른 유전자들도 살펴보았다(문헌[Kolchanov, N.A., E.V. Ignatieva, E.A. Ananko, O.A. Podkolodnaya, I.L. Stepanenko, T.I. Merkulova, M.A. Pozdnyakov, N.L. Podkolodny, A.N. Naumochkin, and A.G. Romashchenko. 2002. 전사조절부위 데이터베이스(TRRD): 2002년 상태. Nucleic Acids Res. 30:312-317]). 흥미롭게도, 그와 같은 유전자의 상당한 수가 1개 이상의 종양 샘플에서 과발현되는 것으로 확인되었다. 표 2는 발명자의 초기 발견과 일치하게, 모든 4개 샘플에서 다시 상향 조절된 인터페론 유발 유전자를 나타낸다(문헌[Weinschenk, T., C. Gouttefangeas, M. Schirle, F. Obermayr, S. Walter, O. Schoor, R. Kurek, W. Loeser, K.H. Bichler, D. Wernet, S. Stevanovic, and H.G. Rammensee. 2002. 환자 개별 종양억제 백신 설계에 대한 통합 기능적 유전자 접근. Cancer Res. 62:5818-5827]). 이들 중에, LMP2, LMP7 및 MECL1 단백질은 면역 프로테아좀을 만들기 위해 세포질에 존재하는 커다란 단백질분해 홀 효소의 필수 하부구조가 변경된 것들이다. 인터페론 감마 유도 아단위에 대한 정상 발현 단백질분해 아단위의 교환은 인터페론이 풍부한 상황에서 중요한 특징이다. 또한, IFNγ은 양적실시간(RT) PCR(TaqMan)에 의해 직접적으로 평가될 수 있다. 표 2에 나타난 종양에서 동일한 공여자의 자가조직 정상 RNA 표본과 비교해서 IFNγ mRNA 발현양이 5배 내지 60배까지 증가했다(자료 제시하지 않음). 따라서, 이러한 결과들은 RCC에서 IFNγ이 중요한 역할을 하며, 이는 유형 II 발현 증가의 이유가 됨을 나타낸다.
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종양 표본에서의 발현을 자가 정상 신장(RCC180, RCC190), 또는 건강한 신장(RCC149, RCC211) 표본의 발현과 비교하였다. 모든 유전자들은 모든 4 종양에 대해 GCOS 소프트웨어의 체인지-콜 알고리즘(the change-call algorithm) 상에서 증가를 보였으며, 인터페론 유도가능이라고 나타났다.
암 조직에서 분리한 HLA - DR 리간드
현재까지 밝혀진 문헌들을 참고해 보면, 고형 종양 조직에 발현된 HLA 유형 II 분자에 결합하는 펩티드들은 지금까지 단리하거나 식별되지 못했다. 본 발명자들은 10개의 상이한 RCC, 3개의 CCA, 한 개의 TCC를 분석하여 모든 표본에서 HLA-DR 리간드를 단리할 수 있었고, 이는 총 453 개의 펩티드에 해당하는 양이다(자료는 제시하지 않음). 이미 앞서 언급한 것처럼 펩티드 서열은 커플링 크로마토그래피 분리 및 직렬 질량 분광측정 분석법(LS-MS/MS)에 의해 결정되었다(문헌[Weinschenk, T., C. Gouttefangeas, M. Schirle, F. Obermayr, S. Walter, O. Schoor, R. Kurek, W. Loeser, K.H. Bichler, D. Wernet, S. Stevanovic, and H.G. Rammensee. 2002. 환자개별 항종양 백신 고안을 위한 통합기능적 유전체 접근. Cancer Res. 62:5818-582; Schirle M, Keilholz W, Weber B, Gouttefangeas C, Dumrese T, Becker HD, Stevanovic S, Rammensee HG. 진성 T세포 비의존성 접근에 의한 종양관련 MHC 유형 I 리간드의 확인. Eur J Immunol. 2000; 30(8):2216-25]). LC-MS/MS에 의해 새로 발견된 펩티드 서열은 도 5a 및 5b에 실었다. 도 5a 및 5b에 나열한 충돌 단편에서 추론한 일차 아미노산 서열은 표 5에 포함된다. 종양 표본은 HLA 유전형, 식별된 HLA 리간드의 무게, 그리고 총 개수 면에서 차이가 났다. 표 3은 대표적인 펩티드 리스트 및 하나의 실험용 종양인 RCC190에서 식별한 해당 단백질 공급원을 보여준다. 앞서 언급한 것처럼 펩티드는 세포의 HLA 유형 II 분자로부터 단리되었다(문헌[Dengjel, J., P. Decker, O. Schoor, F. Altenberend, T. Weinschenk, H.G. Rammensee, and S. Stevanovic. 2004. HLA 유형 II 표적 및 감별 질량 분광측정법의 진성조합에 의해 자연적으로 처리된 시클린 D1 보조 T 항원결정인자의 확인. Eur .J. Immunol. 34:3644-3651]).
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Figure pat00006
RCC190 (HLA-DRB1*11, DRB1*15, DRB3, DRB5)에서 분리한 HLA-DR 리간드의 중심 서열
식별된 HLA 리간드의 종양 무게 및 개수 사이에 연관성은 없었다. 펩티드 공급원 단백질은 두 그룹으로 나눌 수 있었다. 먼저 백혈구에 의해 제시되어야만 하는 리간드(C3, C4A, C4 결합 단백질 알파 등의 보체에서 얻은 펩티드, 및 CD14, IgG 결합 단백질의 Fc 단편과 같은 면역계의 세포의 특이적 기능에 연결된 다른 단백질)가 발견되었다. 한편, 발명자들은 비멘틴, 기질 금속단백분해효소 7, 진핵 번역 연장 인자 1 알파 1, 니코틴아미드 N-메틸기전이효소 등의 과발현 종양 관련 항원으로부터 얻은 종양 세포에 의해 제시되는 미지의 펩티드 특성과 성질을 발견할 수 있었다. 이러한 관찰은 면역조직화학법 자료(도 1 및 4)와 일치하며, HLA 유형 II 양성 종양세포 및 침윤성 백혈구들이 분석 표본에 존재한다는 사실 및 용리된 펩티드가 이러한 뚜렷한 세포 유형에서 과발현하는 항원으로부터 유래함을 알게 되었다.
본 발명의 발명자들은 종양 관련 항원으로부터 펩티드를 규명하기 위해, 각각의 리간드에 대한 단백질 소스와 종양의 미세배열 분석 결과 발견한 과발현 유전자를 비교하여 살펴보았다(Weinschenk, T., C. Gouttefangeas, M. Schirle, F. Obermayr, S. Walter, O. Schoor, R. Kurek, W. Loeser, K.H. Bichler, D. Wernet, S. Stevanovic, and H.G. Rammensee. 2002. 환자개별 항종양 백신 고안을 위한 통합기능적 유전체 접근. Cancer Res. 62:5818-5827; Krㆌger, T., O. Schoor, C. Lemmel, B. Kraemer, C. Reichle, J. Dengjel, T. Weinschenk, M. Mㆌller, J. Hennenlotter, A. Stenzl, H.G. Rammensee, and S. Stevanovic. 2004. 원발성 신장세포암종으로부터의 교훈: 면역요법을 위한 진성 종양 항원 및 HLA 리간드. Cancer Immunol.Immunother). 발명자들은 RCC190 상의 인슐린 유사 성장인자 결합 단백질 3, IGFBP3166-181에서 펩티드를 발견했다. 또한 이 펩티드의 두 변이체인 IGFBP3169-181와 IGFBP3169-184(HLA-DRB1*0101 (참조 표 1)에 결합하기에 충분하며 또한 꼭 필요한 동일한 중심 모티프를 포함하는)이 TCC108에서 발견되었다. 동일한 종양에서 기질 금속단백분해효소 7인 MMP7247-262의 펩티드를 분리할 수 있었다(표1). mRNA 수준에서는, 분석한 23개의 RCC 중 22개의 IGFBP3가 과발현되었으며, 13개의 MMP7가 과발현되었다(자료 제시하지 않음). 전체적으로, 초기에 규명한 453 펩티드 서열에서(자료 제시하지 않음) 49개의 펩티드(서열 번호 149)에 대한 항원을 종양 관련성 있다고 보았는데, 이는 발명자의 실험(자료는 본 문서에 포함) 또는 다른 학자들의 실험(Miyamoto, S., K. Yano, S. Sugimoto, G. Ishii, T. Hasebe, Y. Endoh, K. Kodama, M. Goya, T. Chiba, and A. Ochiai. 2004. 인슐린 유사 성장인자 결합단백질에 대한 기질 금속단백분해효소-7의 단백분해활성을 통해 기질 금속단백분해효소-7은 인슐린 유사 성장인자 생체이용률을 촉진한다. Cancer Res. 64:665-671; Sumi, T., T. Nakatani, H. Yoshida, Y. Hyun, T. Yasui, Y. Matsumoto, E. Nakagawa, K. Sugimura, H. Kawashima, and O. Ishiko. 2003. 인간 신장세포암종에서의 기질 금속단백분해효소 7 및 2의 발현. Oncol. Rep. 10:567-570; Cheung, C.W., D.A. Vesey, D.L. Nicol, and D.W. Johnson. 2004. 근위세관 조절에서의 IGF-I 및 IGFBP-3의 역할 및 신장세포암종의 증식. Kidney Int. 65:1272-1279; Hao, X., B. Sun, L. Hu, H. Lahdesmaki, V. Dunmire, Y. Feng, S.W. Zhang, H. Wang, C. Wu, H. Wang, G.N. Fuller, W.F. Symmans, I. Shmulevich, and W. Zhang. 2004. 통합 cDNA 미세배열법 및 조직 미세배열 분석법에 의해 밝혀진, 원발성 유방 악성종양 및 림프절 전이에서의 특이 유전자 및 단백질 발현. Cancer 100:1110-1122; Helmke, B.M., M. Polychronidis, A. Benner, M. Thome, J. Arribas, and M. Deichmann. 2004. 흑색종 전이는 신테닌 유전자의 발현 증가와 연관된다. Oncol. Rep. 12:221-228; Hofmann, H.S., G. Hansen, G. Richter, C. Taege, A. Simm, R.E. Silber, and S. Burdach. 2005. 비소세포폐암 환자에서 기질 금속단백분해효소-12의 발현은 국소 재발 및 전이성 질환과 관련있다. Clin. Cancer Res. 11:1086-1092; Kamai, T., T. Yamanishi, H. Shirataki, K. Takagi, H. Asami, Y. Ito, and K. Yoshida. 2004. RhoA, Rac1, and Cdc42 GTPases는 고환암 진행과 연관된다. Clin. Cancer Res. 10:4799-4805; Koninger, J., N.A. Giese, F.F. di Mola, P. Berberat, T. Giese, I. Esposito, M.G. Bachem, M.W. Buchler, and H. Friess. 2004. 췌장암에서의 과발현된 데코린: 종양 성장 억제 가능성 및 화학요법 작용의 약화. Clin. Cancer Res. 10:4776-4783; Mori, M., H. Shimada, Y. Gunji, H. Matsubara, H. Hayashi, Y.Nimura, M.Kato, M. Takiguchi, T. Ochiai, and N. Seki. 2004. 위암의 림프절 전이에 대한 정확한 예측인자로써, 사내 cDNA 미세배열법에 의한 S100A11 유전자. Oncol. Rep. 11:1287-1293; Nagler, D.K., S. Kruger, A. Kellner, E. Ziomek, R. Menard, P. Buhtz, M. Krams, A. Roessner, and U. Kellner. 2004. 전립선암 및 전립선 상피내 종양에서의 카셉신 X의 상향조절. Prostate 60:109-119; Nanda, A., P. Buckhaults, S. Seaman, N. Agrawal, P. Boutin, S. Shankara, M. Nacht, B. Teicher, J. Stampfl, S. Singh, B. Vogelstein, K.W. Kinzler, and C.B. St. 2004. 내피세포 표면 단백질 TEM7 및 TEM7R에 대한 결합 파트너의 확인. Cancer Res. 64:8507-8511; Patel, I.S., P. Madan, S. Getsios, M.A. Bertrand, and C.D. MacCalman. 2003. 난소암 진행에 있어서의 카드헤린 전환. Int. J. Cancer 106:172-177; Santelli, G., D. Califano, G. Chiappetta, M.T. Vento, P.C. Bartoli, F. Zullo, F. Trapasso, G. Viglietto, and A. Fusco. 1999. 인간 발암에서 티모신 베타-10 유전자의 과발현은 일반적인 현상이다. Am. J. Pathol. 155:799-804; Schneider, D., J. Kleeff, P.O. Berberat, Z. Zhu, M. Korc, H. Friess, and M.W. Buchler. 2002. 췌장암세포에서의 betaig-h3 의 유도 및 발현. Biochim. Biophys. Acta 1588:1-6; Welsh, J.B., L.M. Sapinoso, S.G. Kern, D.A.Brown, T. Liu, A.R. Bauskin, R.L. Ward, N.J. Hawkins, D.I. Quinn, P.J. Russell, R.L. Sutherland, S.N. Breit, C.A. Moskaluk, H.F. Frierson, Jr., and G.M. Hampton. 2003 암조직 및 혈청에서 과발현된 분비 단백질 생체표지의 대규모 윤곽. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 100:3410-3415; Xie, D., J.S. Sham, W.F. Zeng, L.H. Che, M. Zhang, H.X. Wu, H.L. Lin, J.M. Wen, S.H. Lau, L.Hu, and X.Y. Guan. 2005. 다단계 결장직장 발암 및 진행에서 과발현된 클러스테린의 발암 역할. World J. Gastroenterol. 11:3285-3289)에 따른 것이다. 일반적인 HLA-DR 대립유전자에 결합하는 펩티드의 면역자극성은 IGFBP3169-181과 MMP7247 -262에 대한 항원에 특이적인 CD4 양성 T 세포의 존재 유무에 따라 결정된다.
서열 번호 1같은 서열이 여러 개의 HLA-DR 대립유전자에 불규칙적으로 결합하는 것은 일련의 독립적인 방법으로 그 사실을 확인할 수 있다: 특정한 MHC/HLA 분자의 리간드는 모든 MHC/HLA 대립유전자에 대하여 펩티드 모티프를 명확케 하는 일차 서열 부위 안에서, 화학적으로 연관성 있는 아미노산을 운반한다(Falk K, Rotzschke O, Stevanovic S, Jung G, Rammensee HG. MHC 분자에서 분리된 자가 펩티드 서열에 의해 밝혀진 대립유전자 특이 모티프. Nature. 1991; 351(6324):290-6). SYFPEITHI는 자연적 리간드 분석에 독점적으로 근거한 정제된 모티프에서 유래된 모티프 기질을 사용하며, 이 분석은 에드만 분해 및 직렬 질량 분석법에 근거한다. 이러한 기질을 통해 MHC I 또는 유형 II 분자에 제시된 해당 단백질 서열에서 펩티드를 예측할 수 있다. (Rotzschke O, Falk K, Stevanovic S, Jung G, Walden P, 자연적 T 세포 항원결정인자의 정확한 예측. Eur J Immunol. 1991; 21(11):2891-4).
SYFPEITHI 알고리즘(Rammensee, H.G., J. Bachmann, and S. Stevanovic. 1997. MHC 리간드와 펩티드 모티프. Springer-Verlag, Heidelberg, Germany; Rammensee H, Bachmann J, Emmerich NP, Bachor OA, Stevanovic S. SYFPEITHI: MHC 리간드와 펩티드 모티프 데이터베이스. 면역 유전학 1999; 50(3-4):213-9)에 의해 예견된 규칙들을 앞서 언급한 펩티드 예시 서열(서열 번호 1)에 적용하여, 서열 번호 1가 여러 개의 일반적인 HLA-DR 대립유전자(참고 표 7)에 결합하는 순서가 밝혀졌다. 이 알고리즘은 (예를 들어 인간의 TAA TRP2 (예측 HLA 유형 I 리간드) (34)와 SSX2 (예측 HLA 유형 II 리간드) 등의) 다양한 항원들로부터 유형 I과 유형 II 항원결정인자를 예측하는데 매우 효과적으로 사용되었다(Neumann F, Wagner C, Stevanovic S, Kubuschok B, Schormann C, Mischo A, Ertan K, Schmidt W, Pfreundschuh M 고환암 항원 HOM-MEL-40/SSX2에서 유래된 불규칙 결합 패턴으로 HLA-DR-제한 펩티드의 확인. Int J Cancer. 2004; 112(4):661-8). 유의미한 결합에 대한 18이상의 역치값은 HLA-DR 펩티드 리간드 결합에 대한 이전의 결합수치를 참고하여 나온 값이다. 불규칙적인 결합이란 둘 이상의 상이한 일반적 HLA-DR 대립유전자에 대한 결합능력이 좋은 펩티드의 결합을 말하는데, 이는 SYFPEITHI 실험에서 18 이상의 점수일 때 결합이 좋은 것으로 판단한다. 가장 일반적인 HLA DR 대립유전자를 표 7에 기재했다. HLA-A와 HLA-DR의 유전자 좌는 다른 것에 비해 선행하는 특정한 HLA-DRs과 HLA-A2의 결합을 야기하는 결합불균형에 속해 있다. 종양의 HLA-DR 유전자형을 분석해보니 HLA-DRB1*11 와DRB1*15로 확인되었다. 가장 일반적인 HLA 유형 II 대립유전자들(DRB1*0101, DRB1*0301, DRB1*0401, DRB1*0701, DRB1*1101, DRB1*1501)에 대해 선호되는 고정 아미노산 잔기를 표 4에 기재했다. 예를 들어, HLA 유형 II 대립유전자 DRB1*0301는 결합 그루브에서 펩티드와 결합이 잘 일어나는데, 펩티드의 중심서열의 N말단과 C말단으로부터 1, 4, 6, 9 자리에 있는 특정한 아미노산 잔기가 그 특징이다 할 수 있다. 특히, DRB1*0301은 펩티드 중심서열이 글루탐산 잔기를 위치 4에서 가질 경우 (1) 위치 1의 L, I, F, M이나 V뿐만 아니라, 2) 위치 6의 K, R, E, Q 이나 N뿐만 아니라 3) 위치 9의 Y, L 이나 F 에서 결합이 매우 좋다.
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상응하는 결합 주머니에 한 글자로 고정 아미노산 표기
www.syfpeithi.de를 통해 예측하는 펩티드 서열과 HLA 분자사이의 상호작용에 대한 컴퓨터 알고리즘에 기초한 인실리코 분석 결과, 펩티드 MMP7247-262 서열 번호 1가 여러 개의 HLA-DR 대립유전자에 불규칙적으로 결합한다는 사실을 알게 되었다. 예측 분석의 결과에 따라, 서열 번호 1 펩티드는 DRB1*1101, DRB1*1501, DRB1*0401, DRB1*0301, DRB1*0101 에 대한 결합 수치가 매우 높았다(표 7). 펩티드 아미노산 서열/ 결합 시 상호 작용에 대한 실험에서 분석된 HLA-DR 대립유전자는, 백인종 집단에서 최소한 69.6%가 HLA-A2 양성이었다(Mori M, Beatty PG, Graves M, Boucher KM, Milford EL. 북미 집단에서의 HLA 유전자 및 주조직적합항원복합체염색체 빈도: 국립골수기증자계획 기증자 등록. 이식. 1997; 64(7):1017-27). 현재 HLA-DR15에 대한 빈도 결과는 없지만, 이 대립유전자는 양성 HLA-A2 백인종 집단에 대한 결과 범위를 계산하는 데 적합하지 못하다. 따라서, 서열 번호 1은 인구 범위가 심지어 69.6% 이상이며, 이는 이 펩티드가 대다수의 암환자의 약학적 처방 개선에 중요한 후보물질이 될 수 있다는 전망을 우리에게 시사해 준다.
그러나, 만약 인실리코 분석 결과가 물규칙적 결합에 대한 실험적인 확증으로 이어진다면 예측성 알고리즘은 오로지 결론적인 결과만을 초래한다. 결합력이 좋다고 예측된 펩티드에 의해 야기되는 면역 반응을 입증하는데 실패한 다른 연구자들이 과거에 있었다(Bohm CM, Hanski ML, Stefanovic S, Rammensee HG, Stein H, Taylor-Papadimitriou J, Riecken EO, Hanski C 인간의 CTL에 의해 발견된 종양관련 항원 MUC2의 HLA-A2 제한된 항원결정인자 확인. Int J Cancer. 1998; 75(5):688-93). 앞서 언급한 경우에서와 같은 예측은 원칙적으로는 배제될 수 없다. 왜냐하면 예측을 위해 사용한 알고리즘이 펩티드 서열이 생체내에서 꼭 발생한다 라는 사실을 고려하지 않기 때문이다. 실험적으로 확인하려면 생물학적 실험에서 얻은 시험관내 데이터를 수집하는 것으로 충분하기 때문이다. 실험적 증명은 펩티드의 면역성 존재 또는 결핍 유무를 증명하는 등 생물학적 실험으로부터 생체내 자료를 수집하여 얻을 수 있다. 따라서, 서열 번호 1 의 불규칙적 결합에 대한 실험적인 증명은 시험관내 자료로 충분히 가능하다. 펩티드를 시험관내 초회항원자극(T-cell priming) 실험을 이용하여 이들의 면역 자극 능력을 살펴보기 위해서, IGFBP3 펩티드, IGFBP3169-181, MMP7 펩티드 및 MMP7247-262의 가장 짧은 변이체(중심서열)를 사용한다.
항원에 특이적인 CD4 양성 T세포를 만들고 또한 불규칙적 결합을 위한 펩티드를 검사하기 위해, DRB1*1101을 운반하는 각기 다른 HLA-DR 대립유전자(도 2)를 가진 건강한 4명의 공여자의 PBMCs를 펩티드 펄스된 자가조직성 DCs로 자극했다. 또한, T 세포 항원결정인자로 알려진 CCND1198-212 펩티드 항원결정인자(Dengjel, J., P. Decker, O. Schoor, F. Altenberend, T. Weinschenk, H.G. Rammensee, and S. Stevanovic. 2004. HLA 유형 II 표적 및 감별 질량 분광측정법의 진성조합에 의해 자연적으로 처리된 시클린 D1 보조 T 항원결정인자의 확인. Eur . J. Immunol. 34:3644-3651)를 양성 대조군으로 사용했다. 항원 특이적인 CD4 양성 T세포 유발에 대한 체계로, 유세포 측정법에 의한 IFNγ 수준이 측정되었다. T 세포를 제 3과 4주 자극한 후에 세포 내 IFNγ 염색과 CD4-FITC, CD8-PerCP 염색을 시행하여 특정 T세포 집단에서 IFNγ을 생산하는 세포의 퍼센트를 살펴보았다. 모든 실험에서, 부적당한 펩티드 사용이나 펩티드를 사용하지 않은 자극군을 두어 이를 음성 대조군으로 삼았다. IFNγ을 생산하는 CD4 양성 T 세포의 퍼센트가 음성 대조군의 그것과 비교하여 2배가 높았을 경우 IFNγ 반응을 양성으로 간주하였다(Horton, H., N. Russell, E. Moore, I. Frank, R. Baydo, C. Havenar-Daughton, D. Lee, M. Deers, M. Hudgens, K. Weinhold, and M.J. Mc Elrath. 2004. 바이러스 특정 기억 T 세포에서의 인터페론-감마 분비와 세포독성 간의 관련성. J. Infect . Dis . 190:1692-1696).
4명의 공여자중 3명에서, 두 펩티드에 대한 특정한 CD4 양성 T 세포를 생산할 수 있었다(도 2). T 세포 반응은 어느 자극을 하더라도 4 공여자에서 발견되지는 않았다. 1 공여자에서, CD4 양성 T세포를 유도하는 0.05에서 0.1% IFNγ(도 3a 내지 3c)은 모든 7번의 자극 시도에서 발견되었는데, 이는 펩티드 GFBP3169-181로 제 3 자극한 후이다. 0.09에서 0.13% 자극까지 대부분의 경우에서 이들 T 세포가 커질 수 있다. 펩티드 GFBP3169-181에 대한 CD4 양성 T세포를 유도하는 IFNγ은 또한 최대 빈도 0.05 - 0.07%에서 공여자 2와 3에서 발견되었다
공여자 1, 2와 3은 펩티드 MMP7247-262 에 대한 CD4 양성 T 세포를 보인다. 이들 세포를 야기하는 IFNγ의 가장 높은 빈도는 각각 공여자 1과 2에서 발견되었다. 공여자 1, 2, 3은 펩티드 CCND1198-212 에 IFNγ 반응성을 보였으며, 이는 MHC 유형 II- 제한 T 세포 항원결정인자로 이미 언급했다. (Dengjel, J., P. Decker, O. Schoor, F. Altenberend, T. Weinschenk, H.G. Rammensee, and S. Stevanovic. 2004. HLA 유형 II 표적 및 감별 질량 분광측정법의 진성조합에 의해 자연적으로 처리된 시클린 D1 보조 T 항원결정인자의 확인. Eur . J. Immunol. 34:3644-3651).
따라서, IGFBP3, MMP7, CCND1의 펩티드들은 각기 다른 HLA DR 대립유전자들을 운반하는 4명의 건강한 공여자 중 3명에서 CD4 양성 T 세포 반응을 꾀할 수 있는 HLA 유형 II 결합체들이다. 만약 IGFBP3 와 MMP7 펩티드가 유도된 두 종양 환자의 HLA 대립유전자들을 4명의 건강한 공여자들의 것들과 비교한다면, HLA-DRB1*01, HLA-DRB1*04와 HLA-DRB1*11에 의해 펩티드가 제시된다는 것이 명백해 질 것이다. 상기의 모든 3 HLA DR 동종이형들은 위치 86에 글라이신 아미노산 잔기를, 위치 57의 β 쇄에 아스파르산 잔기를 각각 가지고 있다(참고 www.anthonynolan.com/HIG). 따라서, 이들은 결합 주머니 P1 및 P9에 대한 매우 유사한 결합 특성을 가지고 있다(Rammensee, H.G., J. Bachmann, and S. Stevanovic. 1997. MHC 리간드와 펩티드 모티프. Springer-Verlag, Heidelberg, Germany). 펩티드 CCND1198-212에 대해, HLA-DRB1*0401과 HLA-DRB1*0408에 의해 제시된다고 알려진 T 세포 항원결정인자(Dengjel, J., P. Decker, O. Schoor, F. Altenberend, T. Weinschenk, H.G. Rammensee, and S. Stevanovic. 2004. HLA 유형 II 표적 및 감별 질량 분광측정법의 진성조합에 의해 자연적으로 처리된 시클린 D1 보조 T 항원결정인자의 확인. Eur . J. Immunol . 34:3644-3651) 역시 이와 동일하다. 공여자 4는 (상기에 언급한 β 쇄의 일차 아미노산 서열이 다른 펩티드 부위를 가지는 대립유전자인) HLA-DRB1*0318와 HLA-DRB1*1401를 운반한다. 이는 왜 공여자의 세포를 사용하여 두 개의 펩티드에 대한 T세포 반응을 유도할 수 없는지 설명해준다.
흥미롭게도, CD8 양성 킬러 T 세포를 야기하는 IFNγ은 세 펩티드로 자극한 두 명의 공여자에서 발견되나 공여자 1에서는 정도가 미비하게 나타났다(자료는 제시하지 않음).
Figure pat00009
Figure pat00010
혈청학적 주조직적합항원[복합체]염색체 기재.
n.a.는 할당못함(not assigned)의 약어.
Figure pat00011
백인종 집단에서 가장 일반적인 HLA-DRB1 에 대한 서열 번호 1 와 서열 번호 25 SYFPEITHI 결합 수치.
HLA-A2 양성 백인종의 혈청학적 주조직적합항원[복합체]염색체에 상응하는 빈도를 괄호안에 기재함.
만약 이 점수가 18이상이면, HLA 유형 II 분자에 결합을 잘하는 펩티드로 간주함.
<110> Immatics biotechnologies GmbH <120> TUMOR-ASSOCIATED PEPTIDES BINDING PROMISCUOUSLY TO HUMAN LEUKOCYTE ANTIGEN(HLA) CLASS II MOLECULES <130> fpl08020114 <150> EP 05019254.1 <151> 2005-09-05 <160> 79 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Ser Gln Asp Asp Ile Lys Gly Ile Gln Lys Leu Tyr Gly Lys Arg Ser 1 5 10 15 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Asn Lys Gln Lys Pro Ile Thr Pro Glu Thr Ala Glu Lys Leu Ala Arg 1 5 10 15 Asp <210> 3 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Asp Asp Pro Ser Thr Ile Glu Lys Leu Ala Lys Asn Lys Gln Lys Pro 1 5 10 15 <210> 4 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Asn Pro Leu Lys Ile Phe Pro Ser Lys Arg Ile Leu Arg Arg His 1 5 10 15 <210> 5 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Glu Thr Gly Trp Leu Leu Leu Asn Lys Pro Leu Asp Arg 1 5 10 <210> 6 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Asp Asn Glu Leu Gln Glu Met Ser Asn Gln Gly Ser Lys 1 5 10 <210> 7 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Ala Ala Gly Leu Leu Ser Thr Tyr Arg Ala Phe Leu Ser Ser His 1 5 10 15 <210> 8 <211> 21 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Ala Pro Ser Leu Arg Pro Lys Asp Tyr Glu Val Asp Ala Thr Leu Lys 1 5 10 15 Ser Leu Asn Asn Gln 20 <210> 9 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Gly Pro Val Asp Glu Val Arg Glu Leu Gln Lys Ala Ile Gly Ala Val 1 5 10 15 Pro <210> 10 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Ile Asn His Val Val Ser Val Ala Gly Trp Gly Ile Ser Asp Gly 1 5 10 15 <210> 11 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Val Pro Asp Asp Arg Asp Phe Glu Pro Ser Leu Gly Pro Val Cys Pro 1 5 10 15 Phe Arg <210> 12 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Leu Pro Gln Ser Ile Val Tyr Lys Tyr Met Ser Ile Arg Ser Asp Arg 1 5 10 15 Ser Val Pro Ser 20 <210> 13 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Ile Val His Arg Tyr Met Thr Ile Thr Ser Glu Arg Ser Val Pro Ala 1 5 10 15 <210> 14 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Lys Asn Gly Phe Val Val Leu Lys Gly Arg Pro Cys Lys 1 5 10 <210> 15 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15 Ile Thr Gly Tyr Ile Ile Lys Tyr Glu Lys Pro Gly Ser Pro Pro 1 5 10 15 <210> 16 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 Gly Ala Thr Tyr Asn Ile Ile Val Glu Ala Leu Lys Asp Gln 1 5 10 <210> 17 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17 Leu Thr Gly Tyr Arg Val Arg Val Thr Pro Lys Glu Lys Thr Gly Pro 1 5 10 15 <210> 18 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18 Ile Pro Gly His Leu Asn Ser Tyr Thr Ile Lys Gly Leu Lys Pro Gly 1 5 10 15 <210> 19 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 19 Asn Leu Arg Phe Leu Ala Thr Thr Pro Asn Ser Leu 1 5 10 <210> 20 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 20 Ser Asn Thr Asp Leu Val Pro Ala Pro Ala Val Arg Ile Leu Thr Pro 1 5 10 15 Glu <210> 21 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21 Ala Glu Ile Leu Glu Leu Ala Gly Asn Ala Ala Arg Asp Asn 1 5 10 <210> 22 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22 Val Lys Glu Pro Val Ala Val Leu Lys Ala Asn Arg Val Trp Gly Ala 1 5 10 15 Leu <210> 23 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 23 Thr Ala Glu Ile Leu Glu Leu Ala Gly Asn Ala Ala Arg Asp Asn Lys 1 5 10 15 <210> 24 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 24 His Pro Leu His Ser Lys Ile Ile Ile Ile Lys Lys Gly His Ala Lys 1 5 10 15 <210> 25 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 25 His Ser Lys Ile Ile Ile Ile Lys Lys Gly His Ala Lys Asp Ser Gln 1 5 10 15 <210> 26 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 26 Arg Pro Lys His Thr Arg Ile Ser Glu Leu Lys Ala Glu Ala Val Lys 1 5 10 15 Lys Asp <210> 27 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 27 Gly Pro Glu Asp Asn Val Val Ile Ile Tyr Leu Ser Arg Ala Gly Asn 1 5 10 15 Pro Glu <210> 28 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 28 Ser Arg Pro Val Ile Asn Ile Gln Lys Thr Ile Thr Val Thr Pro Asn 1 5 10 15 <210> 29 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 29 Leu Asp Leu Ser Phe Asn Gln Ile Ala Arg Leu Pro Ser Gly Leu Pro 1 5 10 15 Val <210> 30 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 30 Lys Leu Pro Ser Val Glu Gly Leu His Ala Ile Val Val Ser Asp Arg 1 5 10 15 <210> 31 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 31 Asp Thr Ser Thr Leu Glu Met Met His Ala Pro Arg Cys Gly 1 5 10 <210> 32 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 32 Asp Gln Asn Thr Ile Glu Thr Met Arg Lys Pro Arg Cys Gly Asn Pro 1 5 10 15 Asp <210> 33 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 33 Asn Pro Gly Glu Tyr Arg Val Thr Ala His Ala Glu Gly Tyr Thr Pro 1 5 10 15 Ser <210> 34 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 34 Leu Asp Phe Leu Lys Ala Val Asp Thr Asn Arg Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 <210> 35 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 35 His Gly Asn Gln Ile Ala Thr Asn Gly Val Val His Val Ile Asp Arg 1 5 10 15 <210> 36 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 36 Arg Ala Ile Glu Ala Leu His Gly His Glu Leu Arg Pro Gly 1 5 10 <210> 37 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 37 Asp Pro Gly Val Leu Asp Arg Met Met Lys Lys Leu Asp Thr Asn Ser 1 5 10 15 Asp <210> 38 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 38 Asn Glu Glu Glu Ile Arg Ala Asn Val Ala Val Val Ser Gly Ala Pro 1 5 10 15 <210> 39 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 39 Pro Ala Ile Leu Ser Glu Ala Ser Ala Pro Ile Pro His 1 5 10 <210> 40 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 40 Lys Val Ile Gln Ala Gln Thr Ala Phe Ser Ala Asn Pro Ala 1 5 10 <210> 41 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 41 Asn Gly Ala Tyr Lys Ala Ile Pro Val Ala Gln Asp Leu Asn Ala Pro 1 5 10 15 Ser <210> 42 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 42 Thr Asn Gly Val Val His Val Ile Thr Asn Val Leu Gln Pro Pro Ala 1 5 10 15 <210> 43 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 43 Thr Thr Thr Gln Leu Tyr Thr Asp Arg Thr Glu Lys Leu Arg Pro Glu 1 5 10 15 <210> 44 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 44 Gly Lys Lys Glu Tyr Leu Ile Ala Gly Lys Ala Glu Gly Asp Gly 1 5 10 15 <210> 45 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 45 Met Gly Glu Ile Ala Ser Phe Asp Lys Ala Lys Leu Lys Lys Thr 1 5 10 15 <210> 46 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 46 Met Ala Glu Ile Glu Lys Phe Asp Lys Ser Lys Leu Lys Lys 1 5 10 <210> 47 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 47 Val Val Ser Ser Ile Glu Gln Lys Thr Glu Gly Ala Glu Lys Lys 1 5 10 15 <210> 48 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 48 His Ser Lys Ile Ile Ile Ile Lys Lys Gly His Ala Lys 1 5 10 <210> 49 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 49 Asn Pro Pro Ser Met Val Ala Ala Gly Ser Val Val Ala Ala Val 1 5 10 15 <210> 50 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 50 Trp Ile Ser Lys Gln Glu Tyr Asp Glu Ser Gly Pro Ser Ile Val His 1 5 10 15 Arg Lys Cys Phe 20 <210> 51 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 51 Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro 1 5 10 <210> 52 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 52 Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly 1 5 10 <210> 53 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 53 Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser 1 5 10 15 <210> 54 <211> 21 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 54 Glu Lys Ser Lys Glu Gln Leu Thr Pro Leu Ile Lys Lys Ala Gly Thr 1 5 10 15 Glu Leu Val Asn Phe 20 <210> 55 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 55 Tyr Pro Lys Ser Leu His Met Tyr Ala Asn Arg Leu Leu Asp His Arg 1 5 10 15 <210> 56 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 56 Glu Pro Tyr Tyr Lys Met Gln Thr Arg Ala Gly Ser Arg Glu 1 5 10 <210> 57 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 57 Ala Pro Pro Ser Gly Gly Pro Gly Phe Leu Ser Ile Glu Arg Pro Asp 1 5 10 15 Ser Arg Pro Pro 20 <210> 58 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 58 Phe Gly Pro Ile Tyr Asn Tyr Lys Asp Thr Ile Val Phe Lys 1 5 10 <210> 59 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 59 Ser Pro Asp Pro Ser Ile Tyr Ala Tyr Asp Asn Phe 1 5 10 <210> 60 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 60 Glu Pro Pro Val Ile Gln Asn Pro Glu Tyr Lys Gly Glu Trp Lys Pro 1 5 10 15 Arg Gln Ile Asp Asn Pro Asp 20 <210> 61 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 61 Gly Val Ile Lys Val Phe Asn Asp Met Lys Val Arg Lys 1 5 10 <210> 62 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 62 Ala Pro Gly Tyr Leu Ala Ile Thr Lys Lys Val Ala Val Pro Tyr 1 5 10 15 <210> 63 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 63 Ala Ser Val Asp Leu Lys Asn Thr Gly Arg Glu Glu Phe Leu Thr Ala 1 5 10 15 <210> 64 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 64 Gly Asn His Gln Phe Ala Lys Tyr Lys Ser Phe Lys Val Ala Asp Glu 1 5 10 15 <210> 65 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 65 Val Ser His Phe Phe Arg Glu Leu Ala Glu Glu Lys Arg Glu Gly 1 5 10 15 <210> 66 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 66 Thr Pro Asp Ala Met Lys Ala Ala Met Ala Leu Glu Lys Lys 1 5 10 <210> 67 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 67 Phe Val Met Gly Val Asn His Glu Lys Tyr Asp Asn 1 5 10 <210> 68 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 68 Thr Gly Val Phe Thr Thr Met Glu Lys Ala Gly Ala His 1 5 10 <210> 69 <211> 25 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 69 Ile Ser Trp Tyr Asp Asn Glu Phe Gly Tyr Ser Asn Arg Val Val Asp 1 5 10 15 Leu Met Ala His Met Ala Ser Lys Glu 20 25 <210> 70 <211> 22 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 70 Gly Thr Gly Ala Ser Gly Ser Phe Lys Leu Asn Lys Lys Ala Ala Ser 1 5 10 15 Gly Glu Ala Lys Pro Lys 20 <210> 71 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 71 Asp Val Gly Val Tyr Arg Ala Val Thr Pro Gln Gly Arg Pro Asp 1 5 10 15 <210> 72 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 72 Asp Val Gly Glu Phe Arg Ala Val Thr Glu Leu Gly Arg Pro Asp 1 5 10 15 <210> 73 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 73 His Pro Leu His Ser Lys Ile Ile Ile Ile Lys Lys Gly His Ala Lys 1 5 10 15 <210> 74 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 74 Asp Lys Asp Leu Phe Lys Ala Val Asp Ala Ala Leu Lys Lys 1 5 10 <210> 75 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 75 Lys Asp Lys Thr Tyr Ser Tyr Leu Asn Lys Leu Pro Val Lys 1 5 10 <210> 76 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 76 Val Ile Lys Met Gly Val Ala Ala His Lys Lys Ser His Glu Glu Ser 1 5 10 15 His Lys Glu <210> 77 <211> 21 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 77 Met Ile Glu Gln Asn Thr Lys Ser Pro Leu Phe Met Gly Lys Val Val 1 5 10 15 Asn Pro Thr Gln Lys 20 <210> 78 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 78 Gly Pro His Phe Asn Pro Leu Ser Arg Lys His Gly Gly Pro Lys 1 5 10 15 <210> 79 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 79 Asp Pro Gln Thr Phe Tyr Tyr Ala Val Ala Val Val Lys Lys Asp Ser 1 5 10 15

Claims (33)

  1. 서열 번호 25에 따른 서열을 포함하는 종양 관련 펩티드.
  2. 제 1 항에 있어서,
    서열 번호 25에 따른 아미노산 서열로 이루어진 종양 관련 펩티드.
  3. 제 1 항에 있어서,
    9 내지 100개의 아미노산의 총 길이를 갖는 종양 관련 펩티드.
  4. 제 1 항에 있어서,
    인간 주조직 적합성 복합체(major histocompatibility complex; MHC) 유형 II, 특히 HLA-DRB1* 0101 분자에 결합할 수 있는 종양 관련 펩티드.
  5. 제 4 항에 있어서,
    하나 이상의 추가적인 인간 MHC 유형 II 분자에 결합할 수 있는 종양 관련 펩티드.
  6. 제 1 항에 있어서,
    비펩티드 결합을 포함하는 종양 관련 펩티드.
  7. 제 1 항에 있어서,
    융합 단백질, 특히 HLA-DR 항원 관련 불변 쇄(Ii)의 N-말단 아미노산을 포함하는 융합 단백질인 종양 관련 펩티드.
  8. 제 1 항에 따른 펩티드를 암호화하는 핵산.
  9. 제 8 항에 있어서,
    DNA, cDNA, PNA, CNA, RNA 또는 이들의 조합인 핵산.
  10. 제 8 항에 따른 핵산을 발현할 수 있는 발현 벡터.
  11. 제 8 항 또는 제 9 항에 따른 핵산, 또는 제 10 항에 따른 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  12. 제 11 항에 있어서,
    재조합 RCC 또는 아웰스(Awells) 세포인 숙주 세포.
  13. 제 8 항 또는 제 9 항에 따른 핵산, 또는 제 10 항에 따른 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 배양하고 상기 숙주 세포 또는 그의 배양 배지로부터 펩티드를 단리시킴을 포함하는, 제 1 항 내지 제 7 항중 어느 한 항에 따른 종양 관련 펩티드의 제조방법.
  14. 제 1 항 내지 제 7 항중 어느 한 항에 따른 종양 관련 펩티드, 제 8 항 또는 제 9 항에 따른 핵산, 또는 제 10 항에 따른 발현 벡터, 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 항 종양 면역 반응을 자극하는 약학 조성물.
  15. 제 14 항에 있어서,
    하나 이상의 적합한 보조제(adjuvant)를 포함하거나 포함하지 않는, 암 백신 형태의 약학 조성물.
  16. 약제에서 사용하기 위한, 제 1 항 내지 제 7 항중 어느 한 항에 따른 종양 관련 펩티드, 제 8 항 또는 제 9 항에 따른 핵산, 또는 제 10 항에 따른 발현 벡터.
  17. 인간이 아닌 환자에게 효과량의 제 1 항 내지 제 7 항중 어느 한 항에 따른 펩티드, 제 8 항 또는 제 9 항에 따른 핵산, 또는 제 10 항에 따른 발현 벡터를 투여함을 포함하며, 이때 상기 펩티드, 핵산 또는 발현 벡터의 양이 상기 환자에게서 항-표적 세포 면역 반응을 일으키기에 효과적인, 상기 환자에게서 제 1 항에 따른 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 비정상적으로 발현하는 표적 세포를 사멸시키는 방법.
  18. 환자에게서 제 1 항에 따른 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 비정상적으로 발현하는 표적 세포를 사멸시키기 위한 약제로서, 제 1 항 내지 제 7 항중 어느 한 항에 따른 종양 관련 펩티드, 제 8 항 또는 제 9 항에 따른 핵산, 또는 제 10 항에 따른 발현 벡터를 포함하는 약제.
  19. 표면상에 인간 MHC 유형 II 분자를 발현하고 제 1 항에 따른 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 제시하는 고형 종양 세포에 대한 면역 반응, 특히 세포성 면역 반응, 더욱 특히 T-세포 매개성 면역 반응을 유도하기 위한 약제로서, 제 1 항 내지 제 7 항중 어느 한 항에 따른 종양 관련 펩티드, 제 8 항 또는 제 9 항에 따른 핵산, 또는 제 10 항에 따른 발현 벡터를 포함하는 약제.
  20. 적합한 항원제시세포 표면상에 발현되는 항원 로딩된 인간 MHC 유형 II 분자와 세포독성 T-림프구(cytotoxic T lymphocyte; CTL)를 상기 CTL을 활성화시키기에 충분한 시간동안 시험관내에서 항원 특이적 방식으로 접촉시킴을 포함하며, 이때 상기 항원이 제 1 항에 따른 펩티드인, 활성 CTL의 시험관내 제조방법.
  21. 제 20 항에 있어서,
    충분한 양의 항원을 항원제시세포와 접촉시킴으로써 항원이 적합한 항원제시세포의 표면상에서 발현되는 MHC 유형 II 분자에 로딩되는 제조방법.
  22. 제 20 항에 있어서,
    항원제시세포가 제 10 항에 따른 발현 벡터를 포함하는 제조방법.
  23. 제 20 항에 있어서,
    MHC 유형 II 분자가 HLA-DRB1*0101인 제조방법.
  24. 제 20 항에 따른 제조방법에 의해 제조된 활성 CTL.
  25. 제 1 항에 따른 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 비정상적으로 발현하는 세포를 인식하는 T-세포 수용체(T-cell receptor; TCR) 또는 상기 TCR과 기능적으로 동등한 분자.
  26. 제 25 항에 따른 TCR을 암호화하는 핵산.
  27. 제 25 항에 따른 TCR을 발현할 수 있는 발현 벡터.
  28. 인간이 아닌 환자에게 유효수의 제 24 항에 따른 CTL을 투여함을 포함하는, 상기 환자에게서 제 1 항에 따른 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 비정상적으로 발현하는 표적 세포를 사멸시키는 방법.
  29. 인간이 아닌 환자에게서 제 1 항에 따른 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 비정상적으로 발현하는 표적 세포를 사멸시키는 방법으로서,
    (1) 상기 환자로부터 CTL을 수득하는 단계;
    (2) 제 25 항에 따른 TCR 또는 상기 TCR과 기능적으로 동등한 분자를 암호화하는 핵산을 상기 세포내로 도입시키는 단계; 및
    (3) 상기 단계 (2)에서 수득한 세포를 상기 환자에게 도입시키는 단계
    를 포함하는 방법.
  30. 제 17 항에 있어서,
    표적 세포가 암세포, 특히 표면상에 인간 MHC 유형 II 분자를 발현시키는 고형 종양 세포인 방법.
  31. 환자에게서 제 1 항에 따른 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 비정상적으로 발현하는 표적 세포를 사멸시키기 위한 약제로서, 제 24 항에 따른 CTL을 포함하는 약제.
  32. 제 28 항에 있어서,
    표적 세포가 암세포, 특히 표면상에 인간 MHC 유형 II 분자를 발현시키는 고형 종양 세포인 방법.
  33. 제 29 항에 있어서,
    표적 세포가 암세포, 특히 표면상에 인간 MHC 유형 II 분자를 발현시키는 고형 종양 세포인 방법.
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