NO340870B1 - Tumorassosierte peptid som har evne til å binde til humant leukocyttantigen (HLA) klasse II-molekyler, en nukleinsyre som utelukkende koder for peptidet, en ekspresjonsvektor som kan uttrykke nukleinsyren, en vertscelle som omfatter nukleinsyren, en fremgangsmåte for fremstilling av det tumorassosierte peptidet, en farmasøytisk sammensetning som omfatter peptidet, og anvendelse derav for fremstilling av et medikament. - Google Patents

Description

Den foreliggende oppfinnelsen er relatert til immunterapeutiske metoder, og molekyler og celler for bruk innen immunterapeutiske metoder. Oppfinnelsen er spesielt relatert til immunterapi av kreft, spesielt nyre- og tykktarmkreft. Videre er den foreliggende oppfinnelsen relatert til tumor-assosierte T-hjelpercelle-peptid-epitoper, alene eller i kombinasjon med andre tumor-assosierte peptider, som fungerer som aktive farmasøytiske ingredienser til vaksine-sammensetninger som stimulerer anti-tumor immunresponser. Oppfinnelsen er spesielt relatert til 49 nye peptidsekvenser avledet fra HLA klasse II-molekyler fra humane tumorcellelinjer som kan anvendes i vaksinesammensetninger for å frembringe anti-tumor immunrespons.

Bakgrunnen for oppfinnelsen

Stimulering av en immunrespons avhenger av tilstedeværelse av antigener som oppfattes som fremmede av vertens immunsystem. Oppdagelsen av eksistensen av tumorassosierte antigener har nå medført muligheten for å bruke en verts immunsystem til å virke inn på tumorvekst. Forskjellige mekanismer for å utnytte både de humorale og cellulære grenene til immunsystemet blir for øyeblikket utforsket i forbindelse med kreftimmunterapi.

Spesifikke elementer av den cellulære immunresponsen er i stand til spesifikt å gjenkjenne og ødelegge tumorceller. Isoleringen av cytotoksiske T-celler (CTL) fra tumorinfiltrerende cellepopulasjoner eller fra perifert blod tyder på at slike celler har en viktig rolle i det naturlige immunforsvaret mot kreft (Cheever et al., Annals N.Y. Acad. Sei. 1993 690:101-112). Spesielt CD8-positive T-celler (TCD8<+>), som gjenkjenner klasse I-molekyler til de viktigste vevsforlikelighetsgenkompleks (MHC)-bærende peptider med vanligvis 8 til 10 rester avledet fra proteiner lokalisert i cytosolene, spiller en viktig rolle i denne responsen. MHC-molekyler til mennesker er også betegnet som humane leukocytt-antigener (HLA).

Det finnes to klasser av MHC-molekyler: MHC-I-molekyler, som kan finnes på de fleste celler som har en kjerne som presenterer peptider som resulterer fra proteolytisk spalting av endogene proteiner og større peptider. MHC-II-molekyler kan bare finnes på profesjonelle antigenpresenterende celler (APC) og presenterer peptider fra eksogene proteiner som tas opp av APC-ene i løpet av endocytosen og som deretter prosesseres. Komplekser av peptid og MHC-I gjenkjennes av CD8-positive cytotoksiske T-lymfocytter, og komplekser av peptid og MHC-II gjenkjennes av CD4-positive T-hjelperceller.

CD4-positive T-hjelperceller spiller en viktig rolle i orkestreringen av effektor-funksjonene til anti-tumor T-celleresponser, og av den grunn kan identifiseringen av CD4-positive T-celle-epitoper som avledes fra tumorassosierte antigener (TAA), være av stor betydning for utviklingen av farmasøytiske produkter som utløser anti-tumor immunrespons (Kobayashi, H., R. Omiya, M. Ruiz, E. Huarte, P. Sarobe, J. J. Lasarte, M. Herraiz, B. Sangro, J. Prieto, F. Borras-Cuesta, og E. Celis. 2002. Identification of an antigenic epitope for helper T lymphocytes from carcinoembryonic antigen. Clin. Cancer Res. 8:3219-3225., Gnjatic, S., D. Atanackovic, E. Jager, M. Matsuo, A. Selvakumar, N.K. Altorki, R.G. Maki, B. Dupont, G. Ritter, Y.T. Chen, A. Knuth, and L.J. Old. 2003. Survey of naturally occurring CD4+ T-cell responses against NY-ESO-1 in cancer patients: Correlation with antibody responses. Proe. Nati. Acad. Sci. U. S. A . 100(15):8862-7).

Det har blitt vist i pattedyr dyremodeller, f.eks. mus, at selv ved fravær av cytotoksiske T-lymfocytt (CTL)-effektorceller (dvs. CD8-positive T-lymfocytter), er CD4-positive T-celler tilstrekkelig for inhibering av visualisering av tumorer via inhibering av angiogenese ved sekresjon av interferon-gamma (IFNy) (Qin, Z. and T. Blankenstein. 2000. CD4+ T-cell-mediated tumour rejection involves inhibition of angiogenesis that is dependent on IFN gamma receptor expression by nonhematopoietic cells. Immunity. 12:677-686). I tillegg ble det viste at CD-4-positive T-celler som gjenkjenner peptider fra tumorassosierte antigener presentert av HLA klasse II-molekyler, kan motvirke progresjon av tumoren via induksjon av antistoff-responser (Ab) (Kennedy, R.C., M.H. Shearer, A.M. Watts, and R.K. Bright. 2003. CD4+ T lymphocytes play a critical role in antibody production and tumour immunity against simian virus 40 large tumour antigen. Cancer Res. 63:1040-1045). I motsetning til tumor-assosierte peptider som binder til HLA klasse II-molekyler, er det bare et lite antall klasse II-ligander av TAA som er beskrevet hittil (www.cancerimmunity.org, www.syfpeithi.de). I og med at den konstitutive ekspresjonen av HLA klasse II-molekyler vanligvis begrenses til celler i immunsystemet (Mach, B., V. Steimle, E. Martinez-Soria, and W. Reith. 1996. Regulation of MHC dass II genes: lessons from a disease. Annu. Rev. Immunol. 14:301-331), ble det ikke ansett som mulig å isolere klasse II-peptider direkte fra primærtumorer. Det er derfor blitt beskrevet uttalige strategier for å målrette antigener inn i klasse II-prosesseringsbanen til antigenpresenterende celler (APC), for eksempel inkubasjonen av APC-er med det aktuelle antigenet for at det skal kunne bli tatt opp, prosessert og presentert (Chaux, P., V. Vantomme, V. Stroobant, K. Thielemans, J. Corthals, R. Luiten, A.M. Eggermont, T. Boon, and B.P. van der Bruggen. 1999. Identification of MAGE-3 epitopes presented by HLA-DR molecules to CD4(+) T lymphocytes. J. Exp. Med. 189:767-778), eller transfeksjonen av celler med gener eller minigener som koder for det aktuelle antigenet og fusjonert med invariantkjeden, som medierer translokasjonen av antigener til det lysosomale MHC klasse II-prosesserings- og sammenstillingsrommet (MIIC).

For at et peptid skal utløse (frembringe) en cellulær immunrespons, må det binde til et MHC-molekyl. Denne prosessen er avhengig av allelen til MHC-molekylet og spesifikke poly-morfismer til aminosyresekvensen til peptidet. MHC klasse I-bindende peptider er vanligvis 8-10 rester i lengde og inneholder to konserverte rester ("anker") i sin sekvens, som interagerer med den korresponderende bindingsgropen på MHC-molekylet.

Ved fravær av inflammasjon begrenses ekspresjonen av MHC klasse II-molekyler hoved-sakelig til celler i immunsystemet, spesielt profesjonelle antigenpresenterende celler (APC), f. eks. monocytter, monocyttavledete celler, makrofager, dendrittiske celler.

Antigenene som gjenkjennes av de tumorspesifikke cytotoksiske T- lymfocyttene, det vil si deres epitoper, kan være molekyler som er avledet fra alle proteinklasser, slik som enzymer, reseptorer, transkripsjonsfaktorer osv. Videre kan for eksempel også tumor-assosierte antigener være tilstede bare i tumorcellene, for eksempel som produkter av muterte gener eller fra alternative åpne leserammer (ORFer), eller fra proteinspleising (Vigneron N, Stroobant V, Chapiro J, Ooms A, Degiovanni G, Morel S, van der Bruggen P, Boon T, Van den Eynde BJ. Et antigent peptid produsert ved peptidspleising i proteasomet. Science. 2004 Apr 23;304 (5670):587-90.). En annen viktig klasse av tumorassosierte antigener er vevs-spesifikke strukturer, slik som CT ("cancer testis")-antigener som uttrykkes i forskjellige typer av tumorer og i friskt vev i testiklene.

Forskjellige tumorassosierte antigener er blitt identifisert. Videre anvendes store forsknings-ressurser på å identifisere ytterligere tumorassosierte antigener. Noen grupper av tumor-assosierte antigener, også omtalt innen faget som tumorspesifikke antigener, er vevs-spesifikke. Eksempler omfatter tyrosinase for melanom, PSA og PSMA for prostatakreft og kromosomale «cross-overs» slik som bcr/abl i lymfomer. Imidlertid forekommer mange tumor-assosierte antigener som er identifisert i en flerhet av tumortyper, og noen, slik som onkogene proteiner og/eller tumorsuppressor gener (tumorsuppressor gener er for eksempel gjennomgått for nyrekreft i Linehan WM, Walther MM, Zbar B. The genetic basis of cancer of the kidney. J Uroi. 2003 Dec;170(6 Pt l):2163-72) som faktisk forårsaker transformerings-hendelsen, forkommer i nesten alle tumortyper. For eksempel kan normale cellulære proteiner som kontrollerer cellevekst og differensiering, slik som p53 (som er et eksempel på et tumorsuppressor gen), ras, c-met, mye, pRB, VHL og HER-2/neu, akkumulere mutasjoner som resulterer i oppregulering av ekspresjon av disse genproduktene, og som dermed gjør dem onkogene (McCartey et al. Cancer Research 1998 15:58 2601-5; Disis et al. Ciba Found. Symp. 1994 187:198-211). Disse mutante proteinene kan være målet foren tumorspesifikk immunrespons ved mange typer kreft.

For at proteinene skal bli gjenkjent av de cytotoksiske T-lymfocyttene som tumor-spesifikt antigen, og for å kunne anvendes i en terapi, må spesielle forutsetninger være oppfylt. Antigenet skal i hovedsak uttrykkes av tumorceller og ikke av normalt, friskt vev eller i ganske små mengder. Videre er det ønskelig at det respektive antigenet ikke bare er tilstede i én type tumor, men også i høye konsentrasjoner (f. eks. kopiantall per celle). Nærværet av epitoper i aminosyresekvensen til antigenet er essensielt, i og med at slike peptider ("immunogent peptid") som er avledet fra et tumorassosiert antigen, skal føre til en in vitro eller in vivo T-cellerespons.

Frem til nå er det blitt beskrevet mange strategier for å målrette antigener inn i klasse II prosesseringsbanen. Det er mulig å inkubere antigenpresenterende celler (APC-er) med det aktuelle antigenet for å bli tatt opp og prosessert (Chaux, P., Vantomme, V., Stroobant, V., Thielemans, K., Corthals, J., Luiten, R., Eggermont, A. M., Boon, T. & van der, B. P. (1999) J. Exp. Med. 189, 767-778). Andre strategier bruker fusjonsproteiner som inneholder lysosomale målsekvenser. Uttrykt i APC-er, retter slike fusjonsproteiner antigenene inn i klasse II-prosesseringsrommet (Marks, M. S., Roche, P. A., van Donselaar, E., Woodruff, L, Peters, P. J. & Bonifacino, J. S. (1995) J. Celf Biol. 131, 351-369, Rodriguez, F., Harkins, S., Redwine, J. M., de Pereda, J. M. & Whitton, J. L. (2001) J. Virol. 75, 10421-10430).

WO 03/068940 beskriver komplekser av minst to polypeptider, og fremgangsmåter for anvendelse av samme, for eksempel for screening av stoffer som forstyrrer polypeptid-kompleksene, fremgangsmåter for bestemmelse av endret ekspresjon av et polypeptid i et individ, og fremgangsmåter for behandling/forebygging av forstyrrelser som involverer endret nivå av komplekse eller polypeptid. Den overordnede strategien i WO 03/068940 er å identifisere kritiske HPV-vertsprotein interaksjoner, i og med at HPV er det forårsakende agens for cervix karsinom. WO 03/068940 beskriver ikke SEO ID nr 55 som et tumorassosiert antigen.

T-hjelperceller spiller en viktig rolle i orkestreringen av effektorfunksjonen til CTL-er i anti-tumorimmunitet. T-hjelpercelle epitoper som utløser en T-hjelpercelle respons av type TH1, støtter effektorfunksjoner til CD8 T-dreperceller, som inkluderer cytotoksiske funksjoner rettet mot tumorceller som viser tumorassosierte peptid/MHC-komplekser på sine celle-overflater. På denne måten kan tumorassosierte T-hjelpercelle-peptidepitoper, alene eller i kombinasjon med andre tumorassosierte peptider, tjene som aktive farmasøytiske ingredienser i vaksinesammensetninger som stimulerer anti-tumor immunresponser.

Hovedoppgaven ved utvikling av en tumorvaksine er derfor identifisering og karakterisering av nye tumorassosierte antigener og immunogene T-hjelperepitoper avledet fra disse, som kan gjenkjennes av CD4-positive CTL-er. Det er derfor et formål med den foreliggende oppfinnelsen å tilveiebringe nye aminosyresekvenser for slike peptider, som har evnen til å binde til et molekyl av det viktigste humane vevsforlikelighetsgenkompleks (MHC) klasse II.

I henhold til den foreliggende oppfinnelsen er den oppgaven løst ved å tilveiebringe et tumorassosiert peptid på mellom 9 og 30 aminosyrer som omfatter én sekvens i henhold til SEKV. ID. Nr. 43 i den vedlagte sekvenslisten, der peptidet har evnen til å binde seg til et molekyl av det viktigste humane vevsforlikelighetsgenkomplekset (MHC) klasse-II, forutsatt at peptidet ikke er det intakte humane tumorassosierte polypeptidet.

I oppfinnelsen viser oppfinnerne at det er mulig å isolere og karakterisere peptider som binder til HLA klasse I- eller II-molekyler direkte fra tumorer hos pattedyr, fortrinnsvis humane tumorer, fortrinnsvis faste tumorer, f. eks. fra nyrecellekarsinom og tykktarm-karsinom. Infiltrerende monocytter uttrykker MHC klasse II-molekyler så vel som tumorceller, og i tillegg viste tumorceller oppregulering av flere cytokin- eller kjemokin-induserte genprodukter, f. eks. interferon gamma-induserte genprodukter.

Den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringer et peptid som stammer fra antigener assosiert med tumordannelse og evnen til å binde tilstrekkelig til HLA klasse II-molekyler for å utløse en immunrespons av humane leukocytter, spesielt lymfocytter, spesielt T-lymfocytter, spesielt CD4-positive T-lymfocytter, spesielt CD4-positive T-lymfocytter som medierer THi-type immunrespons. Peptidet stammer fra et tumorassosiert antigen, spesielt et tumorassosiert antigen med en funksjon i f. eks. proteolyse, angiogenese, cellevekst, cellesyklusregulering, celledeling, regulering av transkripsjon, regulering av translasjon, vevsinvasjon. Ytterligere beskrevet er tumorassosierte peptider fra matriks metalloproteinase 7 (MMP7; SEKV. ID. Nr. 1) og insulinlignende vekstfaktor som binder protein 3 (IGFBP3; SEKV. ID. Nr. 25).

I den foreliggende oppfinnelsen fremlegger oppfinnerne også avgjørende bevis for at tumorassosierte peptider bindes tilstrekkelig promiskuøst til HLA klasse II-molekyler, spesielt er de HLA klasse II-allelene som er genetisk kodet av HLA DR loci i det humane genomet, i stand til å frembringe immunresponser medieret av humane CD4-positive T-celler. CD4-positive T-celler ble isolert fra humant perifert blod, og dette viste at de omtalte peptidene er egnet til å utløse T-cellerespons i det humane immunsystemet mot utvalgte peptider i tumorcellepeptidomet. Ettersom peptider kan syntetiseres kjemisk og kan anvendes som aktive farmasøytiske ingredienser i farmasøytiske preparater, kan peptidene som tilveiebringes av oppfinnernes oppfinnelse, bli anvendt i immunterapi, fortrinnsvis kreftimmunterapi.

For å identifisere HLA klasse II-ligander fra TAA i utviklingen av peptidbasert immunterapi, forsøkte oppfinnerne å isolere HLA-DR-presenterte peptider direkte fra dissekerte faste tumorer, spesielt fra nyrecellekarsinom (RCC), som det har blitt rapportert å kunne uttrykke klasse II-molekyler (Gastl, G., T. Ebert, CL. Finstad, J. Sheinfeld, A. Gomahr, W. Aulitzky, and N.H. Bander. 1996. Major histocompatibility complex class I and class II expression in renal cell carcinoma and modulation by interferon gamma. J. Uroi. 155:361-367). Selv om flertallet av tumorcellene var klasse II-negative, bør toppmoderne masse-spektrometre levere den sensitiviteten som trengs for å identifisere klasse II-peptider fra minimale antall av tumorceller, eller fra infiltrerende leukocytter som kan kryss-presentere TAA, eller fra stromaceller i utkanten av den voksende tumoren.

Årsakene til fokuset på RCC for å vise teknisk bevis på konseptet, var følgende: Rundt 150 000 personer på verdensbasis blir nydiagnostisert med RCC hvert år, sykdommen er forbundet med høy dødelighet, noe som resultere i rundt 78 000 dødsfall hvert år (Pavlovich, CP. and L.S. Schmidt. 2004. Searching for the hereditary causes of renal-cell carcinoma. Nat. Rev. Cancer 4:381-393). Hvis metastaser diagnostiseres, synker ettårs overlevelsesraten til rundt 60 % (Jemal, A., R.C Tiwari, T. Murray, A. Ghafoor, A. Samuels, E. Ward, E.J. Feuer, and M.J. Thun. 2004. Cancer statistics, 2004. CA Cancer J. Clin. 54:8-29), hvilket understreker det store udekkete medisinske behovet ved denne indikasjonen. Fordi RCC synes å være en immunogen tumor (Oliver RTD, Mehta A, Barnett MJ. A phase 2 study of surveillance in patients with metastatic renal cell carcinoma and assessment of response of such patients to therapy on progression. Mol Biother. 1988;1:14-20. Gleave M, El h i la I i M, Frodet Y, et al. Interferon gamma-lb compared with placebo in metastatic renal cell carcinoma. N Engl J Med. 1998;338:1265), som indikert av eksistensen av tumor-reagerende og tumorinfiltrerende CTL (Finke, J.H., P. Rayman, J. Alexander, M. Edinger, R.R. Tubbs, R. Connelly, E. Pontes, and R. Bukowski. 1990. Characterization of the cytolytic activity of CD4-positive and CD8-positive tumor-infiltrating lymphocytes in human renal cell carcinoma. Cancer Res. 50:2363-2370), er det igangsatt kliniske studier for å utvikle peptid-baserte antitumor-vaksineringer (Wierecky J, Mueller M, Brossart P. Dendritic cell-based cancer immunotherapy targeting MUC-1. Cancer Immunol Immunother. 2005 Apr 28). Men på grunn av mangel på T-hjelpercelle epitoper fra TAA omfatter vanligvis molekylært definerte vaksiner peptider som fungerer bare som klasse I-ligander.

I løpet av forskningsarbeidet som resulterte i den foreliggende oppfinnelsen, var oppfinnerne i stand til å isolere klasse II-ligander fra ti RCC-prøver, tre kolorektale karsinomer (CCA) og ett overgangsepitelkarsinom (TCC, urotelialt karsinom). Bare noen av ligandene fra TAA som ble identifisert ved denne tilnærmingen, har den samlende kapasiteten til å 1. stamme fra antigener med kjent tumorassosiasjon;

2. binde til den vanligste HLS klasse II DR-allelen, HLA DRB1<*>0101; og

3. ha egenskaper som skiller dem fra majoriteten av HLA klasse II-ligander, på den måten at de oppfyller kriterier i henhold til deres primære aminosyresekvens som lar dem bindes promiskuøst til HLA-DR-molekyler fra minst to forskjellige alleler.

Som eksemplifisert nedenfor med et peptid fra MMP7 (SEKV. ID. Nr. 1) så ble disse promiskuøst HLA-DR-bindende, tumorassisterte peptidene funnet å bli gjenkjent av CD4-positive T-celler.

Et første aspekt av oppfinnelsen tilveiebringer et peptid, som omfatter en aminosyre-sekvens på mellom 9 og 30 aminosyrer i henhold til SEKV. ID. Nr. 43.

Som beskrevet nedenfor, har peptidet som danner basis for den foreliggende oppfinnelsen blitt identifisert som presentert av MHC klasse II-bærende celler (RCC). Derfor vil disse bestemte peptidene så vel som andre peptider som inneholder sekvensen (dvs. avledete peptider), alle sannsynligvis frembringe en spesifikk T-cellerespons, selv om i hvilken grad en slik respons vil bli indusert, kan variere individuelt fra peptid til peptid. Forskjeller kan for eksempel, bli forårsaket av mutasjoner i de nevnte peptidene (se under). Personer med kunnskaper innen dette fagområdet er godt kjent med metoder som kan anvendes for å bestemme i hvilken grad en respons induseres av et individuelt peptid, spesielt med referanse til eksemplene her og den respektive litteraturen.

Fortrinnsvis består et peptid i henhold til den foreliggende oppfinnelsen av en aminosyresekvens i henhold til SEKV. ID. Nr. 43.

"Består i hovedsak av" skal bety at et peptid i henhold til den foreliggende oppfinnelsen, i tillegg til sekvensen i henhold til SEKV. ID. Nr. 43, inneholder ytterligere N-og/eller C-terminalt lokaliserte strekk av aminosyrer som ikke nødvendigvis danner en del av peptidet som fungerer som kjernesekvens av peptidet, som omfatter bindingsmotivet og som en immunogen T-hjelper epitop.

Uansett kan disse strekkene være viktig for å tilveiebringe en effektiv introduksjon av peptidet i henhold til den foreliggende oppfinnelsen, inn i cellene. I én utførelsesform av den foreliggende oppfinnelsen består peptidet ifølge den foreliggende oppfinnelsen av 80 N-terminale aminosyrer av den HLA-DR antigen-assosierte invariante kjeden (s. 33 i den følgende li") som avledet fra NCBI, GenBank tilvekstnummeret X00497 (Strubin, M., Mach, B. and Long, E.O. The complete sequence of the mRNA for the HLA-DR-associated invariant chain reveals a polypeptide with an unusual transmembrane polarity EM BO J. 3 (4), 869-872

(1984)).

Med en "variant" av den gitte aminosyresekvensen mener oppfinnerne at sidekjedene til, for eksempel én eller to av aminosyrerestene er endret (for eksempel ved å erstatte dem med sidekjeder av andre naturlig forekommende aminosyrerester eller noen andre side kjeder) slik at peptidet fremdeles er i stand til å binde til et HLA-molekyl på hovedsakelig samme måte som et peptid bestående av den gitte aminosyresekvensen. For eksempel kan et peptid modifiseres slik at det i det minste opprettholder, eller forbedrer, evnen til å interagere med og binde et egnet MHC-molekyl, slik som HLA-A, og slik at det i det minste opprettholder, eller forbedrer, evnen til å generere aktivert CTL som kan gjenkjenne og drepe celler som uttrykker et polypeptid som inneholder en aminosyresekvens som definert i aspekter av oppfinnelsen. Som man kan utlede fra databasen som beskrevet i det følgende, er visse posisjoner til HLA-A-bind ende peptider typiske ankerrester som danner en kjernesekvens som passer til bindingsmotivet til HLA-bindingsgropen.

De aminosyrerestene, som ikke er essensielle for interageringen med T-cellereseptoren, kan modifiseres ved erstatning med en annen aminosyre, hvis inkorporering i det vesentlige ikke påvirker T-cellereaktiviteten, og som ikke eliminerer binding til den relevante MHCen. Med unntak av det gitte forbeholdet, kan peptidet ifølge oppfinnelsen således være ethvert peptid (med dette begrepet inkluderer oppfinnerne oligopeptid eller polypeptid) som inkluderer aminosyresekvensene eller en del eller variant derav som angitt.

Det er videre kjent for MHC klasse II-presenterte peptider at disse peptidene er satt sammen av en "kjernesekvens" som har et visst HLA-spesifikt aminosyremotiv og, eventuelt, N- og/eller C-terminale forlengelser som ikke virker inn på funksjonen til kjernesekvensen (dvs. at de regnes som irrelevante for den gjensidige innvirkningen mellom peptidet og T-cellen). N- og/eller C-terminalforlengelser kan være mellom henholdsvis 1 til 10 aminosyrer i lengde. Derfor oppviser et foretrukket peptid til den foreliggende oppfinnelsen en total lengde på mellom 16 og 30 aminosyrer. Dette peptidet kan anvendes enten direkte for å lade MHC klasse II-molekyler eller sekvensen kan klones inn i vektorene i henhold til beskrivelsen her, nedenfor. Da disse peptidene danner sluttproduktet av prosesseringen av større peptider inne i cellen, kan også lengre peptider anvendes.

Hvis et peptid som er større enn omtrent 12 aminosyrerester, anvendes direkte til å binde til et MHC-molekyl, foretrekkes det at restene som flankerer den kjerne-HLA-bindende regionen, er slike som ikke vesentlig påvirker peptidets evne til å binde spesifikt til bindingsgropen på MHC-molekylet eller til å presentere peptidet til CTL. Likevel, som allerede angitt ovenfor, vil det bli forstått at større peptider kan bli brukt, spesielt når de kodes for av et polynukleotid, da disse større peptidene kan fragmenteres av egnete antigen-presenterende celler.

Eksempler på peptider med MHC-ligander, motiver, varianter samt visse eksempler på N- og/eller C-terminalforlengelser kan være for eksempel avledet fra databasen SYFPEITHI (Rammensee H, Bachmann J, Emmerich NP, Bachor OA, Stevanovic S. SYFPEITHI: database for MHC ligands and peptide motifs. Immunogenetics. 1999 Nov;

50(3-4):213-9.) på http://syfpeithi.brni-heidelberg.com/ og referansene som er sitert der.

Som eksempler er visse peptider for HLA-DR i databasen K H K V YACEVTHQG L S S-avledet fra lg kappakjede 188-203 (Kovats et al. Eur J Immunol. 1997 Apr;27(4): 1014-21); K V Q WKVDNALOS G N S-avledet fra lg kappakjede 145-159 (Kovats et al. Eur J Immunol. 1997 Apr;27(4):1014-21), L P R L I AFTSEHSH F-avledet fra GAD65 270-283 (Endl et al. J Clin Invest. 1997 May 15;99(10):2405-15) eller F FRMVISN PAA T H Q D I D F L I-avledet fra GAD65 556-575 (Endl et al. J Clin Invest. 1997 May 15;99(10): 2405-15). I tillegg kan peptider også avledes fra muterte sekvenser av antigener, som i tilfellet der ATGFKOSSKA L Q R P V A S-avledet fra bcr-abl 210 kD fusjonsprotein (ten Bosch et al. Blood. 1996 Nov l;88(9):3522-7), G YKVLVLN PSVAA T-avledet fra HCV-1 NS3 28-41 (Diepolder et al. J Virol. 1997 Aug;71(8):6011-9), eller FRKONPDIV IQYM DDLYV G-avledet fra HIV-1 (HXB2) RT 326-345 (van der Burg et al. J Immunol. 1999 Jan l;162(l):152-60). Alle "anker"aminosyrer (se Friede et al., Biochim Biophys Acta. 1996 Jun 7;1316(2):85-101; Sette et al. J Immunol. 1993 Sep 15;151(6): 3163-70.; Hammer et al. Cell. 1993 Jul 16;74(l):197-203., og Hammer et al. J Exp Med. 1995 May l;181(5):1847-55. Som eksempler på HLA-DR4) er market med uthevet skrift, de antatte kjernesekvensene er understreket.

Alle de ovenfor beskrevne peptidene omfattes at termen "varianter" av den gitt aminosyresekvensen.

Med "peptid" inkluderer oppfinnerne ikke bare molekyler hvor aminosyrerester er satt sammen av peptidbindinger (-CO-NH-), men også molekyler hvor peptidbindingen er reversert. Slike retro-inverse peptidetterligninger kan lages ved anvendelse av metoder kjent i faget, for eksempel slike som de beskrevet i Meziere et al (1997) J. Immunol. 159,3230-3237. Denne tilnærmingen involverer fremstilling av pseudopeptider inneholdende endringer som involverer ryggraden, og ikke orienteringen av sidekjedene. Meziere et al

(1997) viser at, i det minste for MHC klasse II og T-hjelpercelleresponser, er disse pseudopeptidene nyttige. Retro-inverse peptider, som inneholder NH-CO-bindinger i stedet for CO-NH-peptidbindinger, er mye mer resistent for proteolyse.

Typisk er peptidet ifølge oppfinnelsen ett som, hvis uttrykket i en antigen-presenterende celle, kan prosesseres slik at det produseres et fragment som er i stand til å binde til et passende MHC-molekyl og kan bli presentert av en egnet celle og frembringe en passende T-cellerespons. Det vil forstås at et fragment fremstilt fra peptidet også kan være et peptid ifølge oppfinnelsen. Hensiktsmessig inneholder peptidet ifølge oppfinnelsen en del som inkluderer den gitte aminosyresekvensen eller en del eller variant av denne, og en ytterligere del som overfører noen ønskede egenskaper. For eksempel kan den ytterligere delen inkludere en ytterligere T-celle epitop (enten avledet fra samme polypeptid som den første T-celle epitop-inneholdende delen, eller ikke) eller den kan inkludere et bærerprotein eller -peptid. Derfor er peptidet i én utførelsesform av oppfinnelsen et trunkert humant protein eller et fusjonsprotein av et proteinfragment og en annen polypeptid del, forutsatt at den humane delen inkluderer én eller flere oppfinneriske aminosyresekvenser.

I en spesielt foretrukket utførelsesform, inkluderer peptidet ifølge oppfinnelsen aminosyresekvensen ifølge oppfinnelsen og minst én ytterligere T-celle epitop hvor den ytterligere T-celle epitopen er i stand til å legge til rette for produksjonen av en T-celle-respons rettet mot den typen tumor som avvikende uttrykker et tumorassosiert antigen. Derfor inkluderer peptidene ifølge oppfinnelsen såkalte "perler på en tråd"-polypeptider som også kan anvendes som vaksiner.

Det vil forstås fra det følgende at i noen anvendelser kan peptidene ifølge oppfinnelsen anvendes direkte (dvs. de blir ikke produsert ved ekspresjon av et polynukleotid i en pasients celle eller i en celle gitt til en pasient); i slike anvendelser er det foretrukket at peptidet har mindre enn 100 eller 50 rester. Et foretrukket peptid ifølge den foreliggende oppfinnelsen har en total lengde på mellom 9 og 30 aminosyrer.

Det foretrekkes at peptidene ifølge oppfinnelsen er i stand til å bindes til HLA-DR. Det er spesielt foretrukket at peptidene bindes selektivt til HLA-DRB1<*>0101.

I et annet aspekt som beskrevet, som er lignende situasjonen som beskrives ovenfor for MHC klasse II-molekyler, kan peptidene som beskrevet anvendes til å utløse en MHC klasse I spesifikk T-celle-respons. Et foretrukket MHC klasse I-spesifikt peptid som beskrevet oppviser en total lengde på mellom 9 og 16 aminosyrer, fortrinnsvis mellom 9 og 12 aminosyrer. Det skal forstås at disse peptidene kan anvendes (for eksempel i vaksiner) som lengre peptider, på samme måte som MHC klasse II-peptider. Metoder for å identifisere MHC klasse I-spesifikke "kjernesekvenser" med et visst HLA-spesifikt aminosyremotiv for HLA klasse I-molekyler er kjent for fagpersoner og kan forutsies, for eksempel med data-programmene PAProC ( http:// www. uni- tuebinqen. de/ uni/ kxi/) og SYFPEITHI ( http:// www. svfpeithi. de).

Peptidet ifølge oppfinnelsen er spesielt nyttig i immunterapeutiske metoder for å målrette og drepe celler som avvikende uttrykker polypeptider som utgjør basis for de foreliggende peptidene ifølge oppfinnelsen. Siden disse spesifikke peptidene som består av at de gitte aminosyresekvensene binder til HLA-DR, er det ønskelig at peptidene ifølge oppfinnelsen er de som binder til HLA-DR, og når de er bundet, er HLA-DR-peptid-komplekset, når tilstede på overflaten til en egnet antigenpresenterende celle, i stand til å fremkalle produksjonen av et CTL som gjenkjenner en celle som avvikende uttrykker et polypeptid som omfatter den gitte aminosyresekvensen.

I én utførelsesform av den foreliggende oppfinnelsen omfatter peptidet ifølge den foreliggende oppfinnelsen de 80 N-terminal aminosyrene til den HLA-DR antigen-assosierte invariantkjeden (s. 33, i følgende "li") som avledet fra NCBI, GenBank aksesjonsnummer X00497 (se også nedenfor).

Med "avvikende uttrykt" inkluderer vi betydningen at polypeptidet er over-uttrykt sammenlignet med normalt nivå for ekspresjon, eller at genet er stille i det vevet som tumoren er avledet fra, men er uttrykt i tumoren. Med "over-uttrykt" mener vi at polypeptidet er tilstede på et nivå på minst 1,2 x det som er tilstede i normalt vev; fortrinnsvis minst 2 x og mer fortrinnsvis minst 5 x eller 10 x nivået som er tilstede i normalt vev.

Peptider (i det minste de som inneholder peptidbindinger mellom aminosyrerester) kan syntetiseres av Fmoc-polyamid modusen til fastfase peptidsyntese som vist av Lu et al

(1981) J. Org. Chem. 46,3433 og referanser i denne. Temporær N-aminogruppe beskyttelse gis av 9-fluorenylmetyloksykarbonyl (Fmoc)-gruppen. Repetitiv spalting av denne svært base-labile beskyttelsesgruppen oppnås ved anvendelse av 20 % piperidin i N, N-dimetylformamid. Sidekjedefunksjonaliteter kan beskyttes da deres butyletere (i tilfellet av serin treonin og tyrosin), butylestere (i tilfellet av glutaminsyre og asparaginsyre), butyloksykarbonyl-derivat (i tilfellet av lysin og histidin), tritylderivat (i tilfellet av cystein) og 4-metoksy-2,3,6-tri-metylbenzensulfonylderivat (i tilfellet av arginin). Der glutamin eller asparagin er C-terminale rester, anvendes 4,4'-dimetoksybenzhydrylgruppen for beskyttelse av sidekjedens amidofunksjonaliteter. Fastfase-bæreren er basert på en polydimetylakrylamidpolymer dannet fra de tre monomerene dimetylakrylamid (ryggrad-monomer), bisakryloyletylen-diamin (kryssbinder) og akryloylsarkosinmetylester (funksjonaliseringsmiddel). Det peptid-til-resin-spaltbare bunnede midlet som anvendes, er det syrelabile 4-hydroksymetyl-fenoksy-eddiksyrederivatet. Alle aminosyrederivatene legges til som sine pre-formede, symmetriske anhydridderivater med unntak av asparagin og glutamin, som legges til ved anvendelse av en reversert N, N-disykloheksyl-karbodiimid/- lhydroksybenzotriasol-mediert koblingsprosedyre. Alle koblings- og avbeskyttelses-reaksjoner overvåkes ved anvendelse av ninhydrin, trinitrobenzen sulfonsyre eller isotin testprosedyrer. Når syntesen er ferdig, spaltes peptidene fra resinbæreren med samtidig fjerning av sidekjedebeskyttelsesgrupper ved behandling med 95 % trifluoreddiksyre inneholdende en 50 % spyleblanding. Spylemidler som vanligvis anvendes, er etanditiol, fenol, anisol og vann, det eksakte valget avhenger av aminosyrene som utgjør peptidet som syntetiseres. Også en kombinasjon av fastfase- og løsningsfasemetoder for syntesen av peptider er mulig (se, for eksempel, Bruckdorfer T, Marder O, Albericio F. From production of peptides in milligram amounts for research to multi-tons quantities for drugs of the future. Curr Pharm Biotechnol. 2004 Feb;5(l):29-43 og referansene som er sitert i denne).

Trifluoreddiksyre fjernes ved avdamping i vakuum, med påfølgende triturering med dietyleter for å gi det uforedlete peptidet. Eventuelle spylemidler som er til stede, fjernes med en enkel ekstraksjonsprosedyre som ved lyofilisering av den vannholdige fasen gir det uforedlete peptidet fritt for spylemidler. Reagenser for peptidsyntese er vanligvis tilgjengelige fra Calbiochem-Novabiochem (UK) Ltd, Nottingham NG7 2QJ, Storbritannia.

Rensing kan utføres med en hvilken som helst, eller en kombinasjon av flere teknikker, som størrelseseksklusjons-kromatografi, ionebytterkromatografi, hydrofob interaksjonskromatografi og (vanligvis) revers-fase væskekromatografi med høy ytelse ved anvendelse av acetonitril/vann-gradient separasjon.

Analyse av peptider kan utføres ved anvendelse av tynnsjikts kromatografi, revers-fase væskekromatografi med høy ytelse, aminosyreanalyse etter syrehydrolyse, og med massespektrometrisk analyse med hurtig atombombardement (FAB), og med MALDI og ESI-Q-TOF massespektrometrisk analyse.

Et ytterligere aspekt av oppfinnelsen tilveiebringer en nukleinsyre (f.eks. polynukleotid) som koder for et peptid ifølge oppfinnelsen. Polynukleotidet kan være DNA, cDNA, PNA, CNA, RNA eller kombinasjoner av disse, og det kan inneholde introner eller ikke, så lenge det koder for peptidet. Selvsagt er det bare peptider som inneholder naturlig forekommende aminosyrerester bundet av naturlig forekommende peptidbindinger som kan kodes for av et polynukleotid. Enda et ytterligere aspekt av oppfinnelsen tilveiebringer en ekspresjonsvektor som er i stand til å uttrykke et polypeptid i henhold til oppfinnelsen.

En rekke metoder er blitt utviklet til operabelt å binde polynukleotider, spesielt DNA, til vektorer for eksempel via komplementære kohesive termini. For eksempel kan komplementære homopolymerområder tilsettes til DNA-segmentet som skal settes inn i vektor-DNAet. Vektoren og DNA-segmentet settes så sammen ved hjelp av hydrogenbinding mellom de komplementære homopolymeriske halene for å danne rekombinante DNA-molekyler.

Syntetiske linkere som inneholder ett eller flere restriksjonsseter, tilveiebringer en alternativ metode for skjøting av DNA-segmentet til vektorer. DNA-segmentet, generert ved endonuklease-restriksjonskutting som tidligere beskrevet, behandles med bakteriofag T4 DNA-polymerase eller E. coli DNA-polymerase I, enzymer som fjerner utstående, 3'-enkelt-trådede termini med deres 3'-5'-eksonukleolytiske aktiviteter, og fyller inn innsenkede 3'-ender med deres polymeriserende aktiviteter.

Kombinasjonen av disse aktivitetene genererer dermed butt-endede DNA-segmenter. De butt-endede segmentene blir så inkubert med et stort molart overskudd av linker-molekyler i nærvær av et enzym som er i stand til å katalysere ligeringen av butt-endede DNA-molekyler, som bakteriofag T4 DNA-ligase. Produktene av reaksjonen er dermed DNA- segmenter som bærer polymere linkersekvenser i sine ender. Disse DNA-segmentene blir så kuttet med det aktuelle restriksjonsenzymet og ligert til en ekspresjonsvektor som er blitt kuttet med et enzym som produserer termini som er kompatible med de til DNA-segmentet.

Syntetiske linkere som inneholder flere restriksjons-endonukleaseseter, er kommersielt tilgjengelige fra flere kilder, blant annet International Biotechnologies Inc, New Haven, CN, USA.

En ønskelig metode for å modifisere DNA-et som koder for polypeptidet ifølge oppfinnelsen, er å anvende polymerase-kjedereaksjonen som beskrevet av Saiki et al

(1988) Science 239,487-491. Denne metoden kan anvendes for å introdusere DNA-et inn i en egnet vektor, for eksempel ved å frembringe egnete restriksjonsseter, eller det kan anvendes til å modifisere DNA-et på andre nyttige måter som er kjent innen faget. I denne metoden flankeres DNA-et som skal amplifiseres enzymatisk, av to spesifikke primere som selv blir inkorporert i det amplifiserte DNA-et. De omtalte spesifikke primerne kan inneholde restriksjons-endonuklease-gjenkjenningsseter som kan anvendes ved kloning inn i ekspresjonsvektorer ved anvendelse av metoder kjent i faget.

DNA-et (eller i tilfellet av retrovirus vektorer, RNA-et) blir så uttrykket i en egnet vert for å produsere et polypeptid som inneholder forbindelsen ifølge oppfinnelsen. Derfor kan DNA-et som koder polypeptidet som utgjør forbindelsen ifølge oppfinnelsen, anvendes i samsvar med kjente teknikker, passende modifisert sett i lys av beskrivelsen her, til å konstruere en ekspresjonsvektor, som så anvendes til å transformere en egnet vertscelle for ekspresjon og produksjon av polypeptidet ifølge oppfinnelsen. Slike teknikker inkluderer de som vises i US Patent-nr. 4,440,859 utstedt 3. april 1984 til Rutter et al, 4,530,901 utstedt 23. juli 1985 til Weissman, 4,582,800 utstedt 15. april 1986 til Crowl, 4,677,063 utstedt 30. juni 1987 til Mark et al, 4,678,751 utstedt 7. juli 1987 til Goeddel, 4,704,362 utstedt 3. november 1987 til Itakura et al, 4,710,463 utstedt 1. desember 1987 til Murray, 4,757,006 utstedt 12. juli 1988 til Toole, Jr. et al, 4,766,075 utstedt 23. august 1988 til Goeddel et al og 4,810,648 utstedt 7. mars 1989 til Stalker.

DNA-et (eller i tilfellet av retrovirus vektorer, RNA-et) som koder for polypeptidet som utgjør forbindelsen ifølge oppfinnelsen, kan kobles til en rekke andre DNA-sekvenser for introduksjon inn i en egnet vert. Det ledsagende DNA-et vil avhenge av vertens natur, introduksjonsmåten for DNA-et inn i verten og om episomalt vedlikehold eller integrering er ønsket.

Vanligvis settes DNA-et inn i en ekspresjonsvektor, slik som et plasmid, i korrekt orientering og korrekt leseramme for ekspresjon. Om nødvendig kan DNA-et være linket til de passende transkripsjons og translasjons reguleringskontroll nukleotidsekvensene som gjenkjennes av den ønskede verten, selv om slike kontroller vanligvis er tilgjengelige i ekspresjonsvektoren. Vektoren blir så introdusert inn i verten ved hjelp av standard teknikker. Vanligvis vil ikke alle vertene bli transformert av vektoren. Derfor vil det være nødvendig å selektere transformerte vertsceller. Én seleksjonsteknikk involverer inkorporering av en DNA-sekvens i ekspresjonsvektoren, med hvilke som helst nødvendige kontrollelementer, som koder for et selekterbart trekk ved den transformerte cellen, slik som antibiotikaresistens.

Alternativt kan genet for et slikt selekterbart trekk være på en annen vektor, som anvendes til ko-transformering av den ønskede vertscellen.

Vertsceller som er blitt transformert med det rekombinante DNA-et ifølge oppfinnelsen, blir så dyrket i tilstrekkelig tid og under passende betingelser, kjent forde med kunnskap i faget, i lyset av den kunnskapen som beskrives her, for å tillate ekspresjon av polypeptidet, som så kan gjenvinnes.

Mange ekspresjonssystemer er kjente, inkludert bakterier (for eksempel E. coli og Bacillus subtilis), gjær (for eksempel Saccharomyces cerevisiae), filamentøse sopp (for eksempel Aspergiflus), planteceller, dyreceller og insektceller. Fortrinnsvis kan systemet være RCC- eller Awells-celler.

En promotor er et ekspresjons-kontrollelement dannet av en DNA-sekvens som tillater binding av RNA-polymerase og at transkripsjon oppstår. Promotor-sekvenser som er kompatible med eksempelvise bakterieverter tilveiebringes typisk i plasmidvektorer som inneholder passende restriksjonsseter for innsetting av et DNA-segment ifølge den foreliggende oppfinnelsen. Typiske prokaryote vektorplasmider er pUC18, pUC19, pBR322 og pBR329 tilgjengelig fra Biorad Laboratories, (Richmond, CA, USA) og pTrc99A og pKK223-3 tilgjengelig fra Pharmacia, Piscataway, NJ, USA.

Et typisk pattedyrcelle-vektorplasmid er pSVL tilgjengelig fra Pharmacia, Piscataway, NJ, USA. Denne vektoren bruker SV40 sen-promotoren til å drive ekspresjon av klonede gener, det høyeste ekspresjonsnivået finner man i T-antigen-produserende celler, slik som COS-l-celler. Et eksempel på en induserbar pattedyr-ekspresjonsvektor er pMSG, også tilgjengelig fra Pharmacia. Denne vektoren anvender den glukokortikoid-induserbare promotoren til mus-brysttumorvirus lang-enderepetisjon til å drive ekspresjon av det klonete genet. Nyttige gjær-plasmidvektorer er pRS403-406 og pRS413-416, og de er vanligvis tilgjengelige fra Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA 92037, USA. Plasmidene pRS403, pRS404, pRS405 og pRS406 er gjærintegrerende plasmider (YIps) og inkorporerer gjær-valgbare markører HIS3, TRP1, LEU2 og URA3. Plasmidene pRS413-416 er gjær-sentromere plasmider (Ycps). Andre vektorer og ekspresjonssystemer er godt kjent innen faget for bruk med mange vertsceller.

Den foreliggende oppfinnelsen er også relatert til en vertscelle transformert med en polynukleotid-vektorkonstruksjon ifølge den foreliggende oppfinnelsen. Vertscellen kan være enten prokaryote eller eukaryote. Bakterieceller kan være foretrukne prokaryote vertsceller under noen omstendigheter og er typisk en stamme av E. coli slik som for eksempel, E. coli-stammene DH5 tilgjengelig fra Bethesda Research Laboratories Inc., Bethesda, MD, USA, og RR1 tilgjengelig fra American Type Culture Collection (ATCC) of Rockville, MD, USA (No ATCC 31343). Foretrukne eukaryote vertsceller inkluderer gjær-, insekt- og pattedyrceller, fortrinnsvis celler fra virveldyr som mus, rotte, ape eller humane fibroblast- og nyrecelle-linjer. Gjær-vertsceller inkluderer YPH499, YPH500 og YPH501 som er vanligvis tilgjengelige fra Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA 92037, USA. Foretrukne pattedyr-vertsceller inkluderer Kinesisk hamster ovarieceller (CHO) tilgjengelig fra ATCC som CCL61, NIH sveitsiske museembryoceller NIH/3T3 tilgjengelig fra ATCC som CRL 1658, COS-l-celler avledet fra apenyrer tilgjengelig fra ATCC som CRL 1650 og 293-celler som er humane embryonale nyreceller. Foretrukne insektceller er Sf9-celler som kan transfekteres med baculovirus ekspresjonsvektorer.

Transformering av passende celleverter med en DNA-konstruksjon ifølge den foreliggende oppfinnelsen, oppnås ved velkjente metoder som typisk avhenger av typen vektor som anvendes. Med hensyn til transformering av prokaryote vertsceller, se for eksempel, Cohen et al (1972) Proe. Nati. Acad. Sei. USA 69,2110 og Sambrook et al (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY. Transformering av gjærceller er beskrevet i Sherman et al (1986) Methods In Yeast Genetics, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY. Metoden til Beggs (1978) Nature 275,104-109 er også nyttig. Med hensyn til virveldyrceller leveres reagens som er nyttige ved transfeksjonen av slike celler, for eksempel kalsiumfosfat og DEAE-dextran eller liposom-formuleringer, fra Stratagene Cloning Systems, eller Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD 20877, USA. Elektroporering er også nyttig for transformering og/eller transfeksjon av celler og er velkjent innenfor faget for transformering av gjærceller, bakterieceller, insektceller og virveldyrceller.

Vellykkede transformerte celler, dvs. celler som inneholder en DNA-konstruksjon ifølge den foreliggende oppfinnelsen, kan identifiseres med velkjente teknikker. For eksempel kan celler som er et resultat av introdusering av en ekspresjonskonstruksjon til den foreliggende oppfinnelsen, dyrkes for å produsere polypeptidet ifølge oppfinnelsen. Celler kan høstes og lyseres, og cellenes DNA-innhold kan undersøkes for nærvær av DNA-et med en metode som den som er beskrevet av Southern (1975) J. Mol. Biol. 98,503 eller Berent et al (1985) Biotech. 3,208. Alternativt kan man detektere nærvær av proteinet i supernatanten ved anvendelse av antistoffer som beskrevet nedenunder.

I tillegg til direkte analyse for nærvær av rekombinant DNA, kan vellykket transformasjon bekreftes med velkjente immunologiske metoder når det rekombinante DNA-et er i stand til å styre ekspresjonen av proteinet. For eksempel produserer celler som er vellykket transformert med en ekspresjonsvektor, proteiner som oppviser korrekt antigenisitet. Prøver med celler som man tror er transformert, høstes og analysert for proteinet ved anvendelse av egnete antistoffer. Derfor består den foreliggende oppfinnelsen, i tillegg til de transformerte vertscellene, også av en kultur av disse cellene, fortrinnsvis en monoklonal (klonalt homogen) kultur, eller en kultur avledet fra en monoklonal kultur, i et næringsmedium.

Det vil verdsettes at enkelte vertsceller ifølge oppfinnelsen er nyttig i fremstillingen av peptidene ifølge oppfinnelsen, foreksempel bakterie-, gjær- og insektsceller. Imidlertid kan andre vertsceller være nyttige i visse terapeutiske metoder. For eksempel kan antigenpresenterende celler, som dendrittiske celler, med fordel anvendes til å uttrykke peptidene ifølge oppfinnelsen slik at de kan lastes opp i egnede MHC-molekyler.

Et ytterligere aspekt av oppfinnelsen tilveiebringer en metode for å produsere et peptid for intravenøs (i.v.) injeksjon, subkutan (s.c.) injeksjon, intradermal (i.d.) injeksjon, intraperitonal (i.p.) injeksjon, intramuskulær (i.m.) injeksjon. Foretrukne måter å injisere peptidet på er s.c, i.d., i.p., i.m. og i.v. Foretrukne måter å injisere DNA på er i.d., i.m., s.c, i.p. og i.v. Det kan gis doser mellom 1 og 500 mg peptid eller DNA.

Et ytterligere aspekt av oppfinnelsen er relatert til bruken av et tumorassosiert peptid i henhold til oppfinnelsen, en nukleinsyre i henhold til oppfinnelsen eller en ekspresjonsvektor i henhold til oppfinnelsen i medisin.

Et ytterligere aspekt av oppfinnelsen beskriver en metode for å drepe målceller i en pasient hvor målcellene uttrykker et polypeptid bestående av en aminosyresekvens ifølge oppfinnelsen, metoden omfatter å administrere til pasienten en effektiv mengde av et peptid i henhold til oppfinnelsen, eller en effektiv mengde av et polynukleotid eller en ekspresjonsvektor som koder et slikt peptid, slik at mengden av dette peptidet eller mengden av dette polynukleotidet eller ekspresjonsvektoren er effektiv for å fremkalle en anti-målcelle immunrespons i nevnte pasient. Målcellen er vanligvis en tumor- eller kreftcelle.

Peptidet eller den peptidkodende nukleinsyren utgjør en tumor- eller kreftvaksine. Den kan administreres direkte inn i pasienten, inn i det påvirkede organet eller systemisk, eller kan påføres ex vivo på celler avledet fra pasienten eller en human cellelinje som deretter administreres til pasienten, eller anvendes in vitro for å velge ut en subpopulasjon fra immunceller avledet fra pasienten, som så re-administreres til pasienten. Hvis nukleinsyren administreres til cellene in vitro, kan det være nyttig for cellene å bli transfektert slik at de ko-uttrykker immunstimulerende cytokiner, slik som interleukin-2. Peptidet kan være vesentlig rent, eller kombinert med en immunstimulerende adjuvans slik som Detox, eller anvendes i kombinasjon med immunstimulerende cytokiner, eller administreres sammen med et egnet avleveringssystem, foreksempel liposomer. Peptidet kan også konjugeres til en egnet bærer som keyhole limpet hemocyanin (KLH) eller mannan (se WO 95/18145 og Longenecker et al (1993) Ann. NY Acad. Sei. 690,276-291). Peptidet kan også bli merket, eller være et fusjonsprotein eller et hybridmolekyl. Peptidene med sekvenser gitt i den foreliggende oppfinnelsen, forventes å stimulere CD4 CTL. Imidlertid er stimulering mer effektivt i nærvær av hjelpen tilveiebragt av CD4-positive T-celler. Derfor tilveiebringer fusjonspartneren eller seksjoner av et hybridmolekyl på en passende måte epitoper som stimulerer CD4-positive T-celler. CD4-positive stimulerende epitoper er velkjente i faget og inkluderer de som er identifisert i tetanustoksoid. Polynukleotidet kan være vesentlig rent, eller inneholdt i en egnet vektor eller leveringssystem.

Egnede vektorer og leveringssystemer inkluderer virus, slik som systemer basert på adenovirus, vacciniavirus, retroviruser, herpesvirus, adeno-assosierte virus eller hybrider som inneholder elementer av mer enn ett virus. Ikke-virus leveringssystemer inkluderer kationiske lipider og kationiske polymerer som er velkjente i faget for DNA-avlevering. Fysisk avlevering, som via en "gene-pistol", kan også anvendes. Peptidet eller peptid kodet for av nukleinsyren, kan være et fusjonsprotein, for eksempel med en epitop som stimulerer CD4-positive T-celler.

Peptidet for bruk i en kreftvaksine kan være ethvert egnet peptid. Spesielt kan det være et egnet 9-mer peptid eller et egnet 7-mer eller 8-mer eller 10-mer eller 11-mer peptid eller 12-mer. Lengre peptider kan også være egnet, men 9-mer eller 10-mer peptider som beskrevet i vedlagte tabell 1, foretrekkes.

Det er passende at enhver nukleinsyre som administreres til pasienten, er steril og pyrogenfri. Nakent DNA kan gis intramuskulært eller intradermalt eller subkutant. Peptidene kan gis intramuskulært, intradermalt, intraperitonealt, intravenøst eller subkutant (se også ovenfor vedrørende metoden for produksjon av et peptid). Fortrinnsvis gis peptidene som aktive farmasøytiske komponenter i kombinasjon med en adjuvans, som for eksempel IL-2, IL-12, GM-CSF, inkomplett Freunds adjuvans, komplett Freunds adjuvans eller liposomale formuleringer. De mest foretrukne adjuvansene kan man finne, for eksempel, i Brinkman JA, Fausch SC, Weber JS, Kast WM. Peptide-based vaccines for cancer immunotherapy. Expert Opin Biol Ther. 2004 Feb;4(2):181-98.

Vaksinasjon resulterer i CTL-responser stimulert av profesjonelle antigen-presenterende celler; så snart CTL først er primet, kan det være en fordel å forsterke MHC-ekspresjon i tumorceller.

Det kan også være nyttig å målrette vaksinen til spesifikke cellepopulasjoner, for eksempel antigenpresenterende celler, enten ved injeksjonsstedet, anvendelse av målrettingsvektorer og leveringssystemer, eller selektiv rensing av en slik cellepopulasjon fra pasienten og ex vivo-administrering av peptidet eller nukleinsyren (for eksempel kan dendrittiske celler bli sortert som beskrevet i Zhou et al (1995) Blood 86,3295-3301; Roth et al (1996) Scand. J. Immunology 43,646-651). For eksempel, kan målrettingsvektorer bestå av en vevs- eller tumorspesifikk promotor som retter ekspresjonen av antigenet til et egnet sted.

Et ytterligere aspekt av oppfinnelsen tilveiebringer derfor en vaksine som er effektiv mot kreft, eller kreft- eller tumorceller, bestående av en effektiv mengde av et peptid i henhold til oppfinnelsen, eller bestående av en nukleinsyre som koder for et slikt peptid. Det foretrekkes også at vaksinen er en nukleinsyrevaksine. Det er kjent at inokulering med en nukleinsyrevaksine, som en DNA-vaksine, som koder for et polypeptid, fører til en T-celle-respons. Mest foretrukket er en vaksine bestående av et (syntetisk) peptid eller peptider (dvs. enten alene eller i kombinasjoner på 1, 2, 3, 4, 5, 6 eller 11 eller enda flere peptider, se også videre nedenfor).

Hensiktsmessig kan nukleinsyrevaksinen omfatte hvilke som helst egnede nukleinsyre-leveringsmidler. Nukleinsyren, fortrinnsvis DNA, kan være nakent (dvs. med i hovedsak ingen andre komponenter som skal administreres) eller det kan avleveres i et liposom eller som en del av et virusvektor-avleveringssystem.

Man tror at opptak av nukleinsyren og ekspresjon av det kodete polypeptidet av dendrittiske celler kan være mekanismen som primer immunresponsen; imidlertid kan det være at dendrittiske celler ikke blir transfektert, men likevel er viktige da de kan ta opp uttrykt peptid fra transfekterte celler i vevet.

Det er foretrukket hvis vaksinen, slik som en DNA-vaksine, administreres inn i muskelen. Det er også foretrukket hvis vaksinen administreres inn i huden. Nukleinsyrevaksinen kan administreres uten adjuvans. Nukleinsyrevaksinen kan også administreres med en adjuvans som BCG eller alun. Andre egnete adjuvanser inkluderer Aquilas QS21 stimulon (Aquila Biotech, Worcester, MA, USA) som er avledet fra saponin, mykobakterie-ekstrakter og syntetiske bakteriecellevegg etterligninger, og kommersielle adjuvanser som Ribi's Detox. Quil A, en annen saponin-avledet adjuvans, kan også anvendes (Superfos, Danmark). Det foretrekkes hvis nukleinsyrevaksinen administreres uten adjuvans. Andre adjuvanser, som Freund's, kan også være nyttige. Det kan også være nyttig å gi peptidet konjugert til keyhole limpet hemocyanin, fortrinnsvis også med en adjuvans.

Polynukleotid-mediert immuniseringsterapi av kreft er beskrevet i Conry et al (1996) Seminars in Oncology 23,135-147; Condon et al (1996) Nature Medicine 2,1122-1127; Gong et al (1997) Nature Medicine 3,558-561; Zhai et al (1996) J. Immunol. 156,700-710; Graham et al (1996) Int J. Cancer 65,664-670; og Burchell et al (1996) pp 309-313 In: Breast Cancer, Advances in biology and therapeutics, Calvo et al (eds), John Libbey Eurotext.

Et enda ytterligere aspekt av den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringer anvendelsen av et peptid i henhold til oppfinnelsen, eller av et polynukleotid eller en ekspresjonsvektor som koder for et slikt peptid, i fremstillingen av et medikament for å drepe målceller i en pasient med målceller som avvikende uttrykker et polypeptid bestående av en aminosyresekvens ifølge oppfinnelsen.

Et enda ytterligere aspekt av den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringer anvendelsen av et peptid i henhold til oppfinnelsen, eller av et polynukleotid eller en ekspresjonsvektor som koder for et slikt peptid, i fremstilling av et medikament for å indusere en immunrespons, spesielt en cellulær immunrespons, mer spesifikt en T-cellemediert immunrespons mot celler i faste tumorer der celler uttrykker et humant klasse II MHC-molekyl på deres overflate og presenterer et polypeptid som omfatter en aminosyre-sekvens ifølge oppfinnelsen. Det er overraskende funnet i konteksten ifølge den foreliggende oppfinnelsen at tumorceller i faste tumorer, i motsetning til friske celler i samme vev, uttrykker humane HLA klasse II-molekyler på deres overflate.

Et ytterligere aspekt av oppfinnelsen tilveiebringer på det vis en metode for å produsere aktiverte cytotoksiske T-lymfocytter (CTL) in vivo eller in vitro, metoden omfatter å kontakte CTL in vitro med antigen-ladete humane klasse II MHC-molekyler uttrykket på overflaten av en egnet antigenpresenterende celle i en tidsperiode tilstrekkelig til å aktivere, på en antigenspesifikk måte, omtalte CTL hvor antigenet er et peptid i henhold til oppfinnelsen.

Det er passende at CTL-ene er CD4-positive hjelperceller, fortrinnsvis av typen TH1. MHC klasse II-molekylene kan bli uttrykket på overflaten av alle egnete celler, og det foretrekkes hvis cellen er en som ikke naturlig uttrykker MHC klasse II-molekyler (i dette tilfellet er cellen transfektert til å uttrykke et slikt molekyl) eller, hvis den gjør det, er defekt i banene for antigenprosessering eller antigenpresentering. På denne måten er det mulig for cellen som uttrykker MHC klasse II-molekylet å bli primet i det vesentlige fullstendig med et valgt peptidantigen før aktivering av CTL-ene.

Den antigenpresenterende cellen (eller stimulatorcellen) har typisk et MHC klasse II-molekyl på sin overflate og er fortrinnsvis i det vesentlige ute av stand til av seg selv å lade omtalte MHC klasse II-molekyl med det valgte antigenet. Som mer detaljert beskrevet nedenfor, kan MHC klasse II-molekylet lett lades med det valgte antigenet in vitro.

Fortrinnsvis mangler pattedyrcellen, eller har et redusert nivå eller har redusert funksjon til TAP peptidtransporteren. Egnede celler som mangler TAP peptidtransporter, inkluderer T2, RMA-S og Drosophila-celler. TAP er Transporter Assosiert med antigenProsessering.

Den humane cellelinjen T2 med manglende peptidlasting er tilgjengelig fra American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, USA under katalognr. CRL 1992. Drosophila-cellelinjen Schneider linje 2 er tilgjengelig fra ATCC under katalognr. CRL 19863. RMA-S-cellelinjen hos mus er beskrevet i Karre and Ljunggren (1985) J. Exp. Med. 162,1745.

Det er hensiktsmessig at nevnte vertscelle uttrykker så godt som ingen MHC klasse I-molekyler før transfeksjonen. Det er også å foretrekke hvis stimulatorcellen uttrykker et molekyl som er viktig for T-celle ko-stimulering som en hvilket som helst av B7.1, B7.2, ICAM-1 og LFA 3.

Nukleinsyresekvensene til mange MHC klasse II-molekyler, og for ko-stimulator-molekylene, er offentlig tilgjengelige fra databasene GenBank og EMBL.

I en ytterligere utførelsesform kan det også anvendes kombinasjoner av HLA-molekyler, slik som for eksempel MHC klasse II-molekyler som beskrevet i tabellene A og B her. Bruken av rekombinante polyepitopvaksiner for avlevering av mange CD8<+>CTL-epitoper er beskrevet i Thomson et al (1996) J. Immunol. 157, 822-826 and WO 96/03144. I relasjon til den foreliggende oppfinnelsen kan det være ønskelig å inkludere i en enkelt vaksine, et peptid (eller en nukleinsyre som koder et peptid) hvor peptidet inkluderer, i enhver rekkefølge, en aminosyresekvens ifølge den foreliggende oppfinnelsen og en annen CD8<+>T-cellestimulerende epitop. Slik en vaksine vil være spesielt nyttig for behandling av kreft. Slike "perler på en tråd"-vaksiner er ofte DNA-vaksiner. Den simultane utløsningen av en MHC klasse II-avhengig immunrespons sammen med en MHC klasse I-avhengig immunrespons har den fordelen at dette fører til en lokal THi-liknende T-cellereaksjon av CD4-positive T-celler, hvorved MHC klasse I-avhengige CD8-positive T-celler understøttes.

Et antall andre metoder kan anvendes for å generere CTL in vitro. For eksempel metodene beskrevet i Peoples et al (1995) Proe. Nati. Acad. Sei. USA 92,432-436 og Kawakami et al (1992) J. Immunol. 148,638643 anvender autologe tumor-infiltrerende lymfocytter til generering av CTL. Plebanski et al (1995) Eur. J. Immunol. 25,1783-1787 anvender autologe perifere blod lymfocytter (PLB-er) ved fremstilling av CTL. Jochmus et al

(1997) J. Gen. Virol. 78,1689-1695 beskriver produksjon av autologe CTL ved å pulsere dendrittiske celler med peptid eller polypeptid, eller via infeksjon med rekombinant virus. Hill et al (1995) J. Exp. Med. 181,2221-2228 og Jerome et al (1993) J. Immunol. 151,1654-1662 anvender B-celler i produksjon av autologe CTL. I tillegg kan makrofager pulsert med peptid eller polypeptid, eller infisert med rekombinant virus anvendes til fremstilling av autologe CTL. S. Walter et al. (Walter S, Herrgen L, Schoor O, Jung G, Wernet D, Buhring HJ, Rammensee HG, Stevanovic S. Cutting edge: predetermined avidity of human CD8 T cells expanded on calibrated MHC/anti-CD28-coated microspheres. J Immunol. 2003 Nov 15;171(10):4974-8) beskriver in vitro priming av T-celler ved anvendelse av kunstige antigenpresenterende celler, som også er en egnet måte for generering av T-celler mot det valgte peptidet.

Allogene celler kan også anvendes ved fremstilling av CTL og denne metoden er beskrevet i detalj i WO 97/26328. For eksempel kan andre celler, i tillegg til Drosophila-celler og T2-celler, anvendes til å presentere antigener slik som CHO-celler, baculovirus-infiserte insektceller, bakterier, gjær, vaccinia-infiserte målceller. I tillegg kan det anvendes planteviruser (se for eksempel Porta et al (1994) Virology 202, 449-955 som beskriver utviklingen av cowpea mosaic virus som et høytytende system for presentering av fremmede peptider).

De aktivert CTL-ene, som er rettet mot peptidene ifølge oppfinnelsen, er nyttig i terapi. Derfor tilveiebringer et ytterligere aspekt av oppfinnelsen aktiverte CTL som kan oppnås ved de foregående fremgangsmåtene ifølge oppfinnelsen.

Enda et ytterligere aspekt av oppfinnelsen tilveiebringer aktiverte CTL som selektivt gjenkjenner en celle som avvikende uttrykker et polypeptid bestående av en aminosyre-sekvens ifølge oppfinnelsen. Fortrinnsvis gjenkjenner CTL den omtalte cellen ved å interagere med HLA/peptid-komplekset (for eksempel, binding). CTL-ene er nyttige i en metode for å drepe målceller i en pasient med målceller som avvikende uttrykker et polypeptid bestående av en aminosyresekvens ifølge oppfinnelsen, hvor pasienten administreres et effektivt antall av de aktiverte CTL-ene. CTL som administreres til pasienten, kan være avledet fra pasienten og aktiveres som beskrevet over (dvs. de er autologe CTL). Alternativt er ikke CTL-ene fra pasienten, men fra et annet individ. Det er selvsagt foretrukket om dette individet er et friskt individ. Med "friskt individ" mener oppfinnerne at individet vanligvis er ved god helse, fortrinnsvis har et kompetent immunsystem og, enda mer fortrinnsvis, ikke lider av noen sykdommer som det kan testes for og som kan detekteres.

De aktiverte CTL-ene uttrykker en T-cellereseptor (TCR) som er involvert i gjen-kjenning av celler som uttrykker det avvikende polypeptidet. Det er nyttig hvis cDNA-et som koder forTCR-en er klonet fra den aktiverte CTL og overføres til en ytterligere CTL for ekspresjon.

In vivo kan målcellene for de CD4-positiv CTL-ene i henhold til den foreliggende oppfinnelsen være tumorceller (som noen ganger uttrykker MHC klasse II) og/eller stromale celler som omgir tumoren (tumorceller) (som noen ganger også uttrykker MHC klasse II).

TCR-ene til CTL-kloner ifølge oppfinnelsen som er spesifikke for peptidene ifølge oppfinnelsen, er klonet. TCR-anvendelsen i CTL-klonene bestemmes ved anvendelse av (i) TCR-variable region-spesifikke monoklonale antistoffer og (ii) RT PCR med primere spesifikke for Va- og Vp-gen familier. Et cDNA-bibliotek er fremstillet fra poly-A mRNA ekstrahert fra CTL-klonene. Primere spesifikke for C-terminalen av TCR a- og P-kjeder og for N-terminaldelen til de identifiserte Va- og P-segmentene anvendes. Det komplette cDNA for TCR a og kjeden amplifiseres med en høy-nøyaktig DNA-polymerase, og de amplifiserte produktene klones inn i en egnet kloningsvektor. De klonede a- og P-kjede-genene kan settes sammen til en enkeltkjede TCR med metoden som er beskrevet av Chung et al (1994) Proe. Nati. Acad. Sei. USA 91, 12654-12658. I denne enkle kjedekonstruksjonen følges VaJ-segmentet av V DJ-segmentet, fulgt av Cp-segmentet fulgt av det transmembrane- og cytoplasma-segmentet til CD3-kjeden. Enkeltkjedet TCR settes så inn i en retrovirus ekspresjonsvektor (et panel med vektorer kan anvendes basert på deres evne til å infisere modne humane CD8-positive T-lymfocytter og til å mediere gen ekspresjon: retrovirus vektorsystemet Kat er en foretrukket mulighet (se Finer et al (1994) Blood 83,43). Høy titrede amfotropiske retrovirus anvendes til å infisere rensede CD8-positive eller CD4-positive T-lymfocytter isolert fra perifert blod fra tumorpasienter (i henhold til en protokoll publisert av Roberts et al (1994) Blood 84,2878, 2878-2889). Anti-CD3 antistoffer anvendes til å utløse proliferering av rensede CD8<+>T-celler, noe som fremmer retrovirus integrering og stabil ekspresjon av enkeltkjede TCR-er. Effektiviteten til retrovirus transduksjon bestemmes ved farging av infiserte CD8<+>T-celler med antistoffer spesifikke for den aktuelle enkeltkjede TCR. In vitro-analyse av transduserte CD8-positive T-celler fastslår at de viser den samme tumorspesifikke drepingen som ses ved den allo-begrensede CTL-klonen som TCR-kjedene opprinnelig ble klonet fra. Populasjoner med transduserte CD8-positive T-celler med den forventede spesifisiteten kan anvendes for adoptiv immunterapi hos tumorpasientene. Pasienter kan behandles med mellom IO<8>og IO<11>autologe, transduserte CTL. Analogt til CD8-positive kan transduserte CD4-positive T-hjelperceller med relaterte konstruksjoner genereres.

Andre egnete systemer for introduksjon av gener i CTL er beskrevet i Moritz et al

(1994) Proe. Nati. Acad. Sei. USA 91, 4318-4322. Eshhar et al (1993) Proe. Nati. Acad. Sei. USA 90,720-724 og Hwu et al (1993) J. Exp. Med. 178, 361-366 beskriver også transfeksjonen av CTL. Derfor tilveiebringer et ytterligere aspekt av oppfinnelsen en TCR som gjenkjenner en celle som avvikende uttrykker et polypeptid bestående av en aminosyre-sekvens ifølge oppfinnelsen, denne TCR er oppnåelig fra aktivert CTL.

I tillegg til TCR er funksjonelt ekvivalente molekyler til TCR inkludert i oppfinnelsen. Disse inkluderer ethvert molekyl som er funksjonelt ekvivalente med en TCR som kan utføre samme funksjon som en TCR. Spesielt inkluderer slike molekyler genetisk tilpassede tre-domene enkeltkjede TCR-er som fremstilt ved metoden beskrevet av Chung et al (1994) Proe. Nati. Acad. Sei. USA 91, 12654-12658, og referert til ovenfor. Oppfinnelsen inkluderer også et polynukleotid som koder TCR eller funksjonelt ekvivalente molekyler, og en ekspresjonsvektor som koder TCR-en eller funksjonelt ekvivalente molekyler til denne. Ekspresjonsvektorer som er egnet for ekspresjon av TCR-en ifølge oppfinnelsen, inkluderer de som er beskrevet ovenfor med hensyn til ekspresjon av peptidene ifølge oppfinnelsen.

Det er imidlertid foretrukket at ekspresjonsvektorene er slike som er i stand til å uttrykke TCR-en i en CTL etter transfeksjonen.

Enda et ytterligere aspekt av oppfinnelsen beskriver en metode for å drepe målceller i en pasient hvis målceller avvikende uttrykker et polypeptid bestående av en aminosyre-sekvens ifølge oppfinnelsen, metoden består av (1) å innhente CTL fra pasienten; (2) å introdusere inn i nevnte celler et polynukleotid som koder for en TCR, eller et funksjonelt ekvivalent molekyl, som definert over; og (3) å introdusere cellene produsert i trinn (2), inn i pasienten.

Enda et ytterligere aspekt av oppfinnelsen beskriver en metode for å drepe målceller i en pasient hvis målceller avvikende uttrykker et polypeptid bestående av en aminosyre-sekvens som definert i første eller andre eller tredje aspekt av oppfinnelsen, metoden består av (1) å innhente antigenpresenterende celler, som dendrittiske celler, fra den aktuelle pasienten; (2) å sette slike antigenpresenterende celler i kontakt med et peptid som definert i første eller andre eller tredje aspekt av oppfinnelsen, eller med et polynukleotid som koder et slikt peptid, ex vivo; og (3) å re-introdusere den antigenpresenterende cellen som er behandlet på denne måten til pasienten.

De antigenpresenterende cellene er fortrinnsvis dendrittiske celler. Det er passende at de dendrittiske cellene er autologe dendrittiske celler som er pulset med et antigent peptid. Det antigene peptidet kan være ethvert egnet antigent peptid som fremkaller en passende T-cellerespons. T-celleterapi ved anvendelse av autologe dendrittiske celler pulset med peptider fra et tumorassosiert antigen er vist i Murphy et al (1996) The Prostate 29,371-380 og Tjua et al (1997) The Prostate 32, 272-278.

I en ytterligere utførelsesform blir de antigenpresenterende cellene, som dendrittiske celler, satt i kontakt med et polynukleotid som koder et peptid ifølge oppfinnelsen. Polynukleotidet kan være ethvert egnet polynukleotid og det foretrekkes at det er i stand til å transdusere de dendrittiske cellene, noe som dermed resulterer i presentering av et peptid og indusering av immunitet.

Det er hensiktsmessig at polynukleotidet kan være omfattet i et virus polynukleotid eller et virus. For eksempel, adenovirus-transduserte dendrittiske celler viser seg å indusere antigenspesifikk antitumor-immunitet i relasjon til MUC1 (se Gong et al (1997) Gene Ther. 4,1023-1028). Pa samme måte kan det anvendes adenovirus-baserte systemer (se for eksempel, Wan et al (1997) Hum. Gene Ther. 8- 1355-1363); retrovirus-systemer kan anvendes (Specht et al (1997) J. Exp. Med. 186, 1213-1221 og Szabolcs et al (1997)); blod partikkel-mediert overføring til dendrittiske celler kan også anvendes (Tuting et al (1997) Eur. J. Immunol. 27, 2702-2707); og RNA kan også anvendes (Ashley et al (1997) J. Exp. Med. 186, 1177-1182).

Det skal påpekes med hensyn til metodene for å drepe målceller i en pasient, så er det spesielt foretrukket at målcellene er kreftceller, enda mer foretrukket nyre- eller tykk-tarmkreftceller.

Det er særlig å foretrekke hvis pasienten som skal behandles med metodene ifølge oppfinnelsen, har HLA-DR haplotypen. I en foretrukket utførelsesform, bestemmes derfor HLA-haplotypen til pasienten før behandlingen. HLA-haplotyping kan utføres ved anvendelse av alle passende metoder som er godt kjente innen faget.

Oppfinnelsen inkluderer spesielt anvendelsen av peptider ifølge oppfinnelsen (eller polynukleotider som koder disse) for aktiv in vivo-vaksinering; for manipulering av autologe dendrittiske celler in vitro etterfulgt av introduksjon av slike manipulerte dendrittiske celler in vivo for å aktivere CTL-responser; for å aktivere autologe CTL in vitro etterfulgt av adoptiv terapi (dvs. slik manipulert CTL blir introdusert i pasienten); og til å aktivere CTL fra friske donorer (MHC-matchet eller u-matchet) in vitro etterfulgt av adoptiv terapi.

I en foretrukket utførelsesform administreres vaksinene ifølge den foreliggende oppfinnelsen til en vert enten alene eller i kombinasjon med en annen kreftterapi for å hemme eller undertrykke dannelse av tumorer.

Peptidvaksinen kan administreres uten adjuvans. Peptidvaksinen kan også administreres med en adjuvans som BCG eller alun. Andre egnete adjuvanser inkluderer Aquilas QS21 stimulon (Aquila Biotech, Worcester, MA, USA) som er avledet fra saponin, mykobakterie-ekstrakter og syntetiske bakterie-celleveggetterligninger, og kommersielle adjuvanser som Ribi's Detox. Quil A, en annen saponin-avledet adjuvans, kan også anvendes (Superfos, Danmark). Andre adjuvanser som CpG-oligonukleotider, stabilisert RNA, Imiquimod (kommersielt tilgjengelige under handelsnavnet Aldara™ fra 3M Pharma, U.S.A.), ukomplett Freund's adjuvans (kommersielt tilgjengelig som Montanide ISA-51 fra Seppic S.A., Paris, Frankrike), liposomale formuleringer eller GM-CSF kan også være nyttige. Det kan også være nyttig å gi peptidet konjugert til keyhole limpet hemocyanin, fortrinnsvis også med en adjuvans.

Peptidene i henhold til oppfinnelsen kan også anvendes som diagnostiske reagenser. Ved anvendelse av peptidene kan man analysere om det i en CTL-populasjon er CTL-er tilstede som er spesifikt rettet mot et peptid eller er indusert med en terapi. Videre kan man teste økningen av forløper T-celler med de peptidene som har reaktivitet mot det definerte peptidet. Videre kan peptidet anvendes som en markør for å overvåke progresjonen av sykdommen til en tumor som uttrykker nevnte antigen som peptidet er avledet fra.

I vedlagt tabell 1 er peptidene som er identifisert opplistet. I tillegg, i tabellen er

proteinene betegnet, fra hvor peptidet er avledet, og den respektive posisjonen til peptidet i det respektive proteinet. Videre gis de respektive aksesjonsnummerne som relaterer til gen-banken til "National Centre for Biotechnology Information" til National Institute of Health (se http:www.ncbi.nlm.nih.gov).

I en annen foretrukket utførelsesform anvendes peptidene for farging av leukocytter, spesielt av T-lymfocytter. Denne anvendelsen er spesielt nyttig hvis det skal påvises om det i en CTL-populasjon finnes spesifikke CTL-er som er rettet mot et peptid. Videre kan peptidet anvendes som markør for å bestemme progresjonen av en terapi ved tumor sykdom eller lidelse.

I en annen foretrukket utførelsesform anvendes peptidene til produksjon av et antistoff. Polyklonale antistoffer kan fremskaffes på standard måte ved immunisering av dyr via injeksjon av peptidet og påfølgende rensing av immunglobulinet. Monoklonale antistoffer kan produseres i henhold til standardprotokoller som beskrevet, for eksempel, i Methods Enzymol. (1986), 121, Hybridoma technology and monoclonal antibodies.

Oppfinnelsen i et ytterligere aspekt relaterer til en farmasøytisk sammensetning, som inneholder en eller flere av omtalte peptider i henhold til oppfinnelsen. Denne sammensetningen anvendes for parenteral administrering, som subkutan, intradermal, intramuskulær eller oral administrering. Til dette blir peptidene løst eller oppslemmet i en farmasøytisk akseptabel, fortrinnsvis vannholdig bærer. I tillegg kan sammensetningen inneholde tilsetninger, som buffere, bindemidler, sprengmidler, fortynnere, smaksstoffer, smøremidler osv. Peptidene kan også bli administrert sammen med immunstimulerende stoffer, som cytokiner. En omfattende opplisting av tilsetninger som kan anvendes i en slik sammensetning, kan, for eksempel, hentes fra A. Kibbe, Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3. Ed., 2000, American Pharmaceutical Association and pharmaceutical press. Sammensetningen kan anvendes i forebygging, profylakse og/eller terapi av tumor-sykdommer.

Det farmasøytiske preparatet, som inneholder minst ett av peptidene ifølge den foreliggende oppfinnelsen på mellom 9 og 30 aminosyrer, som omfatter SEKV. ID. Nr. 43, administreres til en pasient som lider av en tumorsykdom som er assosiert med det respektive peptidet eller antigenet. På denne måten kan en CTL-spesifikk immunrespons bli utløst.

I et annet aspekt av den foreliggende oppfinnelsen kan en kombinasjon av to eller flere peptider i henhold til den foreliggende oppfinnelsen anvendes som vaksine, enten i direkte kombinasjon eller innenfor det samme behandlingsregimet. Dessuten kan man bruke kombinasjoner med andre peptider, foreksempel MHC klasse II-spesifikke peptider. En person med erfaring vil være i stand til å velge foretrukne kombinasjoner av immunogene peptider ved testing, for eksempel, generering av T-celler in vitro, og til å finne deres effektivitet og generelle nærvær, deres forøkning, affinitet og ekspansjon av visse T-celler for visse peptider, og funksjonaliteten til T-cellene, f.eks. ved å analysere produksjonen av IFN-y (se også eksempler nedenfor), IL-12 eller Perforin. Vanligvis blir de mest effektive peptidene deretter kombinert som en vaksine for det formålet som er beskrevet ovenfor.

En egnet vaksine vil inneholde 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 eller 15 forskjellige peptider, fortrinnsvis 4, 5, 6 eller 7 forskjellige peptider, og aller helst 6 forskjellige peptider.

Endelig kan vaksinen være avhengig av den spesifikke typen kreft som pasienten som behandles lider av, og av statusen til lidelsen, tidligere behandlingsregimer, pasientens immunstatus, og, selvsagt, pasientens HLA-haplotype.

Det er vist at de 80 N-terminal-aminosyrene for li er tilstrekkelig til å lede proteiner inn i klasse II- prosesseringsbanen (Sanderson, S., Frauwirth, K. & Shastri, N. (1995) Proe. Nati. Acad. Sei. U. S. A 92, 7217-7221, Wang, R. F., Wang, X., Atwood, A. C, Topalian, S.

L. & Rosenberg, S. A. (1999) Science 284, 1351-1354).

Identifisering av T-hjelpercelle epitoper til tumorassosierte antigener forblir en viktig oppgave ved anti-tumor immunterapi. Her rapporterer oppfinnerne om en vanligvis brukbar metode og peptider som kommer fra differensiell peptidanalyse med MS for å identifisere naturlig prosesserte og presentert MHC klasse II-ligander av tumorassosierte antigener. Denne fremgangsmåten kombinerer for første gang et transfeksjonenstrinn av APC med en vektor som koder for et fusjonsprotein mellom Ii-kjeden og det aktuelle Ag, eluering av de HLA-bundne peptidene og MS-identifisering av de Ag-avledede peptidene som presenteres av transfektantene ved å sammenligne med de ikke-transfekterte cellene. Oppfinnerne kunne i tillegg validere metoden ved å vise at T-cellene som induseres mot de identifiserte peptidene, spesifikt gjenkjenner transfektanter som overuttrykker det beslektede Ag. Selv om de identifiserte peptidene fortsatt må testes for immunogenisitet in vivo, fører vår fremgangsmåte til de eksakte egenskapene for naturlig prosesserte MHC klasse II-ligander. På den måten unngår oppfinnerne å teste enten syntetisk overlappende peptider av tumorassosierte antigener, eller et bredt spekter at peptider valgt ved epitope forutsigelser, som er mindre nøyaktig enn klasse I-epitop forutsigelse. I motsetning til krevende T-celleanalyser, som kan føre til identifiseringen av kryptiske T-celle epitoper som ikke kan indusere T-celleaktivering in vivo (Anderton, S. M., Viner, N. J., Matharu, P., Lowrey, P. A. & Wraith, D. C. (2002) Nat. Immunol. 3, 175-181), kan arbeidet fokusere på de få peptidene som presenteres. Hvis denne metoden anvendes, er det i tillegg ikke nødvendig å produsere rekombinant Ag eller å besitte Ag-avgivende tumorcellelinjer for å bevise at peptidene prosesseres naturlig.

Oppfinnerne brukte N-terminus for li til å lede tumorassosierte antigener inn i klasse II-prosesseringsavdelingen for EBV-transformerte B-celler. For å oppnå dette har oppfinnerne konstruert en allsidig vektor som vi kan bruke til å uttrykke alle typer antigen som et fusjonsprotein med li, og som hjelper oss med å fastslå ekspresjonsnivået for proteinet i transfekterte celler ved hjelp av Western Blot analyse. Det er allerede bevist at N-terminus for li er tilstrekkelig til å målrette proteiner inn i prosesseringsavdeling i klasse II. Men frem til nå har dette kun blitt beskrevet i en modell som bruker ovalbumin (Sanderson, S., Frauwirth, K. & Shastri, N. (1995) Proe. Nati. Acad. Sei. U. S. A 92, 7217-7221), for å identifisere ukjent Ag ved hjelp av fusjonproteinkodede cDNA-bibliotek (Wang, R. F., Wang, X., Atwood, A. C, Topalian, S. L. &. Rosenberg, S. A. (1999) Science 284,

1351-1354) eller for å bekrefte spesifisiteten til kjente T-cellekloner (Chaux, P., Vantomme, V., Stroobant, V., Thielemans, K., Corthals, J., Luiten, R., Eggermont, A. M., Boon, T. & van der, B. P. (1999) J. Exp. Med. 189, 767-778). Etter det oppfinnerne vet har denne metoden aldri tidligere blitt brukt til å identifisere naturlig presenterte MHC klasse II-bundne peptider fra kjente tumorassosierte antigener. Differensialanalysen av klasse II-ligander av transfekterte og ikke-transfekterte celler med MALDI-MS og videre karakterisering av de differensielt avgitte peptidene med ESI-MS, resulterer i en enkel metode for identifisering av klasse II-ligander av interessant antigener. Transfeksjonen av celler med keratin 18-fusjonsproteiner demonstrerte at oppfinnernes metode generelt kan anvendes for interessante antigener, og igjen kunne oppfinnerne beskrive et HLA-DR-presentert peptid fra et modell-transgen, keratin 18.

Identifisering av T-hjelpercelle epitoper til TAA forblir en viktig oppgave ved anti-tumor immunterapi. Inntil nå har ulike strategier for å identifisere peptider av klasse II fra TAA blitt utført, blant annet inkubasjon av APC-er med det aktuelle antigenet for at det skal kunne bli tatt opp og prosessert (Chaux, P., V. Vantomme, V. Stroobant, K. Thielemans, J. Corthals, R. Luiten, A.M. Eggermont, T. Boon, and B.P. van der Bruggen. 1999. Identification of MAGE-3 epitopes presented by HLA-DR molecules to CD4(+) T lymphocytes. J. Exp. Med. 189:767-778), til ulike transfeksjonensstrategier med fusjonsproteiner (Dengjel,J., P.Decker, O. Schoor, F. Altenberend, T. Weinschenk, H.G. Rammensee, and S. Stevanovic. 2004. Identification of a naturally processed cyclin Dl T-helper epitope by a novel combination of HLA class II targeting and differential mass spectrometry. Eur. J. Immunol. 34:3644-3651). Alle disse metodene er meget tidkrevende, og det er ofte uklart om de identifiserte HLA-ligandene faktisk presenteres in vivo av humant vev. Oppfinnerne kunne for første gang vise at det er mulig å isolere HLA klasse II-ligander direkte fra dissekerte faste tumorer, og på den måten identifisere peptidene som presenteres av tumorer og omkringliggende vev in vivo, som dermed kan gjenkjennes av T-celler som bærer den aktuelle T-cellereseptoren og som samtidig uttrykker ko-stimulerende ligand CD4 på celleoverflaten. Blant proteinene som fungerer som en kilde for endogent prosessert HLA klasse II-ligander, ble flere husholdnings og immunrelevante proteiner identifisert. Peptidene fra TAA kunne imidlertid også detekteres, og dette resulterte i en enkel måte for identifisering av in wVo-relevante klasse II-ligander fra TAA.

Oppfinnerne identifiserte tre ligander som utgjør én kjernesekvens fra IGFBP3 og én ligand fra MMP7. Oppfinnerne fant at disse proteinene har overekspresjon i nyrecellekarsinomer, og de er også beskrevet som tumorassosierte (Miyamoto, S., K. Yano, S. Sugimoto, G. Ishii, T. Hasebe, Y. Endoh, K. Kodama, M. Goya, T. Chiba, and A. Ochiai. 2004. Matrix metalloproteinase-7 facilitates insulin-like growth factor bioavailability through its proteinase activity on insulin-like growth factor binding protein 3. Cancer Res. 64:665-671; Sumi, T., T. Nakatani, H. Yoshida, Y. Hyun, T. Yasui, Y. Matsumoto, E. Nakagawa, K. Sugimura, H. Kawashima, and O. Ishiko. 2003. Expression of matrix metalloproteinases 7 and 2 in human renal cell carcinoma. Oncol. Rep. 10:567-570; Cheung, C.W., D.A. Vesey, D.L. Nicol, and D.W. Johnson. 2004. The roles of IGF-I and IGFBP-3 in the regulation of proximal tubule, and renal cell carcinoma cell proliferation. Kidney Int. 65:1272-1279). Peptidet viste god bindeevne til HLA klasse II-molekyler og kunne aktivere CD4-positive T-celler fra ulike friske donorer. Oppfinnernes tilnærming vil således være nyttig i identifisering av nye klasse II-peptidkandidater fra TAA til bruk i kliniske vaksineprotokoller.

Oppfinnelsen i et ytterligere aspekt beskriver en metode for å drepe målceller i en pasient hvor målcellene uttrykker et polypeptid bestående av en aminosyresekvens som gitt her. Metoden består i å administrere en effektiv mengde av et peptid i henhold til den foreliggende oppfinnelsen, eller en nukleinsyre i henhold til den foreliggende oppfinnelsen eller en ekspresjonsvektor i henhold til oppfinnelsen, til pasienten, slik at mengden av dette peptidet eller mengden av denne nukleinsyren eller mengden av denne ekspresjonsvektoren er effektiv for å provosere en anti-målcelle immunrespons i denne pasienten.

Oppfinnelsen er i et ytterligere aspekt beskriver en metode for å drepe målceller i en pasient hvor målcellene uttrykker et polypeptid bestående av en aminosyresekvens som gitt i henhold til den foreliggende oppfinnelsen. Metoden består i å administrere en effektiv mengde av cytotoksiske T-lymfocytter (CTL) som definert i henhold til den foreliggende oppfinnelsen, til pasienten.

Oppfinnelsen er i enda et ytterligere aspekt beskriver en metode for å drepe målceller i en pasient med målceller som uttrykker et polypeptid bestående av en aminosyre-sekvens gitt i henhold til den foreliggende oppfinnelsen. Metoden består av (1) å innhente cytotoksiske T-lymfocytter (CTL) fra pasienten; (2) å introdusere inn i nevnte celler en nukleinsyre som koder en T-cellereseptor (TCR), eller et funksjonelt ekvivalent molekyl, som definert i henhold til den foreliggende oppfinnelsen; og (3) å introdusere cellene som er produsert i trinn (2), inn i pasienten.

Fortrinnsvis er målcellene kreftceller. Nevnte kreft er enda mer fortrinnsvis leukemi eller lymfomer som uttrykker polypeptidet som består av en aminosyresekvens som gitt i henhold til den foreliggende oppfinnelsen.

Det er overraskende funnet i konteksten til oppfinnelsen at tumorceller i faste tumorer, i motsetning til friske celler i samme vev, uttrykker humant HLA klasse II-molekyler på overflaten. Dette er beskrevet kun én gang i Brasanac et al (Brasanac D, Markovic-Lipkovski J, Hadzi-Djokic J, Muller GA, Muller CA. Immunohistochemical analysis of HLA class II antigens and tumor infiltrating mononuclear cells in renal cell carcinoma: correlation with clinical and histopathological data. Neoplasma. 1999;46(3):173-8.), der kryostatsnitt av 37 nyrecellekarsinomer (RCC) - 25 klare celletyper, 10 kornede og 2 kromofobe - ble studert med indirekte immunperoksidasemetode der det ble anvendt monoklonale antistoffer (MoAb) til HLA-DR-, -DP- og -DQ-antigen i analyse av HLA klasse II-antigener, og anti-CD14, -CD3, -CD4 og -CD8 MoAb for tumorinfiltrerende mononukleære celler (TIM). Antallet positive celler ble estimert semi-kvantitativt, og resultatene av en immunhistologisk undersøkelse ble korrelert med kliniske (pasientens alder og kjønn, tumor-størrelse og TNM-stadium) og histopatologiske (cytologi, histologi, grad) karakteristikker av RCC. Alle RCC-er avga HLA-DR, 92 % -DQ- og 73 % -DP-antigener med ekspresjonsnivåer i hierarki DR>-DQ>-DP, men ingen statistisk viktig korrelasjon ble stadfestet med noen av de histopatologiske eller kliniske parameterne som ble analysert. Det var flere monocytter enn T-lymfocytter og CD4+ enn CD8+ T-celler, mens tumorer med overvekt av T-lymfocytt og om lag likt antall CD4+- og CD8+-celler hadde størst gjennomsnittlige diameter. Mangelfull aktivering av T-lymfocytter av tumorceller (på tross av evnen til antigenpresentasjon) kan være årsaken til assosieringen med parametere som indikerer mer aggressiv tumoratferd med avvikende HLA klasse II-antigenekspresjon på RCC.

Oppfinnelsen vil nå bli beskrevet i mer detaljer ved referanse til de følgende figurene, sekvensopplistingen og eksemplene.

SEKV. ID. Nr. 1 til SEKV. ID. Nr. 49 viser peptidsekvenser til T-celle epitoper som inneholder peptider som presenteres av MHC klasse II i henhold til den foreliggende oppfinnelsen.

SEKV. ID. Nr. 50 til SEKV. ID. Nr. 79 viser peptidsekvensene for tabell 3.

Figur 1 viser ekspresjonen av HLA klasse II-molekyler i RCC for tre pasienter. I tumoren til pasient RCC132 ble de HLA-positive cellene derimot fortrinnsvis lokalisert i utkanten (A,B), mens HLA klasse II-ekspresjonsmønstrene for tumorene fra pasient RCC190 og RCC211 som avslørte en mer papillær struktur, var jevnere fordelt (C,E,G). Visualiseringen av CD68-positive makrofager (B,D,F) i serielle vevsnitt illustrerer et nært romlig forhold av tumorinfiltrerende mononukleære immunceller og HLA II-ekspressive tumorceller. Inkubasjon med muse-IgG i stedet for spesifikke antistoffer avslørte negative fargingsresultater (H). Stor T markerer tumoren. Figur 2 viser en FACS-analyse av CD4-positive T-celler som er spesifikke for IGFBP3i69-i8i, MMP7247-262og CCNDli98-2i2- Det vises representative punkter for intracellulær IFNy-farging mot CD4-FITC. Figur 3 viser en skjematisk illustrasjon av antigenspesifikk IFNy som produserer CD4-positive T-celler som ble registrert i hver donor og for hvert peptid. Prosentandelen av IFNy-produserende CD4-positive T-celler for hver donor og peptidet som anvendes til stimulering, vises. Cellene ble inkubert i 96-brønnsplater - 7 brønner per donor og per peptid. Verdier som anses som positive, er innrammet: prosentandel av IFNy-produserende CD4-positive T-celler var mer enn to ganger høyere sammenlignet med negativ kontroll uten peptid. Prosentandeler av IFNy-produserende CD4-positive T-celler som ble detektert etter stimulering med irrelevante peptider, var forbundet med verdier etter stimulering uten peptid, med unntak av donor 1 etter tredje stimulering med IGFBP3169.18i. Denne effekten ble imidlertid ikke observert etter den fjerde stimuleringen. Figur 4 viser ekspresjonen av HLA klasse II-molekyler i CCA165 (moderat differensiert adenokarsinom i tykktarmen). I lamina propria for områder med normal kolonslimhinne (panel c og venstre side av panel a, merket med stjerne) ble typisk noen HLA klasse II-positive makrofager observert, men epitelceller var konsekvent negative for HLA klasse II-ekspresjon. I epitelceller fra forskjellige områder av tumoren ble imidlertid observert en tydelig ekspresjon av HLA II som vist på høyre side av panel a og i panel b og d. Figurene 5a og 5a viser identifiseringen av peptidsekvenser med peptider som ble eluert fra HLA klasse II-molekyler som var isolert fra primært humant tumorvev ved hjelp av massespektroskopi. Figur 5a: fragmenter fra fragmentering av naturlig prosesserte og presenterte HLA klasse II-ligander fra MMP7 korresponderer med peptidsekvensen med SEKV. ID. Nr. 1 (SQDDIKGIQKLYGKRS). Annoterte fragmenter vises i tabell 5. Figur 5b: fragmenter fra fragmentering av syntetiske peptider som har peptidsekvens av SEKV. ID. Nr. 1. Fragmentering av både syntetisk og naturlig prosesserte peptider gir like frag- menteringsmønstre og tillater deduksjon og bekreftelse av de primære aminosyresekvensene for peptidsekvensen som tidligere ikke var beskrevet (SEKV. ID. Nr. 1), i denne HLA klasse II-liganden fra humant MMP7.

EKSEMPLER

Materialer og metoder

MHC klasse II-immunohistologi: Tumorer ble fiksert i 4 % fosfatbufret formaldehyd, innstøpt i parafin, farget med hematoksilin-eosin og undersøkt med lysmikroskopi. Diagnostisering av RCC ble utført i henhold til rutinemessige histopatologiske og immunhistologiske undersøkelser (Fleming, S. and M. 0'Donnell. 2000. Surgical pathology of renal epithelial neoplasms: recent advances and current status. Histopathology 36:195-202).

For immunhistologisk deteksjon av henholdsvis MHC klasse II-molekyler eller CD68-molekyler ble 5 um parafin-innstøpte vevssnitt forhåndsbehandlet med 10 mM citratbuffer, pH 6, etterfulgt av inkubasjon med enten et musanti-HLA-DR alfakjede mAb (klon TAL.1B5, 1:50) eller CD68 Ab (klon PGM1, 1:50) (DAKO, Hamburg, Tyskland) eller mus-IgGl (2 ug/ml, BD Biosciences Pharmingen, San Diego, USA) og visualisert ved hjelp av deteksjonssettet Ventana iView DAB (Nexes System, Ventana Medical Systems, Illkirch, Frankrike). Vevssnitt ble motfarget med hematoksylin og til slutt innstøpt i Entellan.

Elusjon og molekylanalyse av HLA-DR-bundne peptider: Fryste tumorprøver ble prosessert som tidligere beskrevet (Weinschenk, T., C. Gouttefangeas, M. Schirle, F. Obermayr, S. Walter, O. Schoor, R. Kurek, W. Loeser, K.H. Bichler, D. Wernet, S. Stevanovic, and H.G. Rammensee. 2002. Integrated functional genomics approach for the design of patient-individual antitumor vaccines. Cancer Res. 62:5818-5827), og peptidene ble isolert i henhold til standardprotokollen (Dengjel, J., H.G. Rammensee, and S. Stevanovic. 2005. Glycan side chains on naturally presented MHC class II ligands. J. Mass Spectrom. 40:100-104) ved hjelp av det HLA-DR-spesifikke mAb L243 (Lampson, L.A. and R. Levy. 1980. Two populations of Ia-like molecules on a human B cell line. J. Immunol. 125:293-299).

Naturlige peptidblandinger ble analyser ved hjelp av et revers-fase Ultimate HPLC system (Dionex, Amsterdam, Nederland), koblet til et Q-TOF I-massespektrometer (Waters, Eschborn, Germany), eller ved hjelp av et revers-fase CapLC HPLC-system, koblet til en Q-TOF Ultima API (Waters) som beskrevet tidligere (Lemmel, C, S. Weik, U. Eberle, J. Dengjel, T. Kratt, H.D. Becker, H.G. Rammensee, and S. Stevanovic. 2004. Differential quantitative analysis of MHC ligands by mass spectrometry using stable isotope labeling. Nat. Biotechnol. 22:450-454). Fragmentspektre ble analysert manuelt og automatisk.

Genekspresjonsanalyse ved høy-tetthet oligonukleotide mikromatriser: RNA-isolering fra tumor og autologe normale nyreprøver samt genekspresjonsanalyse ved hjelp av Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 oligonukleotide mikromatriser (Affymetrix, Santa Clara, CA, USA) ble utført som beskrevet tidligere (Kruger, T., O. Schoor, C. Lemmel, B. Kraemer, C. Reichle, J. Dengjel, T. Weinschenk, M. Muller, J. Hennenlotter, A. Stenzl, H.G. Rammensee, and S. Stevanovic. 2004. Lessons to be learned from primary renal cell carcinomas: novel tumor antigens and HLA ligands for immunotherapy. Cancer Immunol. Immunother). Data ble analysert med GCOS-programvaren (Affymetrix). Parvise sammenligninger mellom tumor og autolog normal nyre ble beregnet ved hjelp av den respektive normale tabellen som grunnlinje. For RCC149 og RCC211 var ikke tabelldata for autolog normal nyre tilgjengelig. Derfor ble samlet friskt humant nyre-RNA fremskaffet kommersielt (Clontech, Heidelberg, Tyskland) og brukt som grunnlinje for disse tumorene.

Modning av DC-er: DC-er ble fremstillet ved anvendelse av blod fra friske donorer. Kort fortalt ble PBMC-er isolert ved hjelp av standard gradientsentrifugering (Lymphocyte Separation Medium, PAA Laboratories GmbH, Pasching, Østerrike) og platet ved en tett-het på 7 x IO<6>celler/ml i X-Vivo 15 medium. Etter to timer ved 37 °C ble ikke-adherente celler fjernet og adherente monocytter dyrket i 6 dager i X-Vivo medium med 100 ng/ml GM-CSF og 40 ng/ml IL-4 (AL-ImmunoTools, Friesoythe, Tyskland). Pa dag syv ble umodne DC-er aktivert med 10 ng/ml TNF-a (R&D Systems, Wiesbaden, Tyskland) og 20 ug/ml poly(IC) (Sigma Aldrich, Steinheim, Tyskland) i tre dager.

Produksjon av antigenspesifikke CD4-positive T-celler: IO<6>PBMC-er per brønn ble stimulert med 2 x IO<5>peptidpulserte (5 ug/ml) autologe DC-er. Cellene ble inkubert i 96-brønnsplater (7 brønner per donor og per peptid) med T-celle medium: supplert RPMI 1640 i nærvær av 10 ng/ml IL-12 (Promocell, Heidelberg, Tyskland). Etter tre til fire dager med ko-inkubering ved 37 °C ble ferskt medium med 80 U/ml IL-2 (Proleukin, Chiron Corporation, Emeryville, CA, USA) og 5 ng/ml IL-7 (Promocell) tilført. Restimuleringer ble utført med autologe PBMC-er pluss peptider hver 6. til 8. dag.

Intracellulær IFNy-farging: Etter tre og fire runder med stimulering, ble PBMC-ene tint, vasket to ganger i X-Vivo 15 medium, resuspendert ved IO<7>celler/ml i T-celle medium og dyrket over natten. Dagen etter ble PBMC-ene, pulset med 5 ug/ml peptid, inkubert med effektorceller i forholdet 1:1 i 6 timer. Golgi-Stop (Becton Dickinson, Heidelberg, Tyskland) ble tilført for de siste 4 timene av inkubasjonen.

Cellene ble analysert ved hjelp av et Cytofix/Cytoperm Plus-sett (Becton Dickinson) og CD4-FITC- (Immunotools), IFNy-PE- og CD8-PerCP klon SKl-antistoffer (Becton Dickinson). For negative kontroller ble celler med syv brønner samlet og inkubert med henholdsvis enten irrelevant peptid eller uten peptid. Stimulering med PMA/Ionomycin ble brukt for positive kontroller. Celler ble analysert på en trefarget FACSCalibur (Becton Dickinson).

Eksempler

HLA klasse II- ekspresjon med RCC

Under normale, ikke-inflammatoriske forhold skal HLA klasse II-molekyler bare uttrykkes av celler i det hematopoietiske systemet og av thymusepiteliumet (Mach, B., V. Steimle, E. Martinez-Soria, and W. Reith. 1996. Regulation of MHC class II genes: lessons from a disease. Annu. Rev. Immunol. 14:301-331). Situasjonen endres ved inflammasjon. HLA klasse II-ekspresjon kan induseres i de fleste celletyper og vev av IFNy (Leib und Gut-Landmann, S., J. M. Waldburger, M. Krawczyk, L. A. Otten, T. Suter, A. Fontana, H. Acha-Orbea, and W. Reith. 2004. Mini-review: Specificity and expression of CIITA, the master regulator of MHC class II genes. Eur. J. Immunol. 34:1513-1525). Siden RCC-insidens ofte henger sammen med betennelse (Blay, J. Y., J. F. Rossi, J. Wijdenes, C. Menetrier-Caux, S. Schemann, S. Negrier, T. Philip, and M. Favrot. 1997. Role of interleukin-6 in the paraneoplastic inflammatory syndrome associated with renal-cell carcinoma. Int. J. Cancer 72:424-430; Elsåsser-Beile, U., M. Rindsfuser, T. Grussenmeyer, W. Schultze-Seemann, and U. Wetterauer. 2000. Enhanced expression of IFN-gamma mRNA in CD4(+)or CD8(+)tumour-infiltrating lymphocytes compared to peripheral lymphocytes in patients with renal cell cancer. Br. J. Cancer 83:637-641), uttrykkes klasse II-molekyler i nærheten av tumoren, som tidligere har blitt rapportert.

Immunhistokjemisk farging av HLA klasse II- molekyler

Oppfinnerne analyserte HLA klasse II-ekspresjon av ti RCC-prøver som sammen utgjør histologiske klare celler og papillært nyrekarsinom ved hjelp av immunhistokjemisk farging, og de observerte at alle undersøkte prøver avslørte klasse II-positive tumorceller. Som vist i figur IA ble en tydelig HLA klasse II-ekspresjon ofte registrert i utkanten av tumoren. I disse områdene observerte oppfinnerne en tett romlig sammenheng mellom HLA-positive tumorceller og tumorinfiltrerende immunceller som illustrert i visualiseringen av CD68-positive makrofager i et serielt vevssnitt(figur IB). I RCC som avslørte en mer papillær struktur, var ekspresjonen av HLA klasse II-molekyler mer jevnt fordelt i tumoren (figur 1 C, E, G). Sammenligningen av HLA klasse II og CD68 immunhistokjemiske fargingsmønstre i serielle vevssnitt demonstrerer at i tillegg til makrofager, uttrykker også tumorceller HLA klasse II (figur 1C, D og E,F). Det er vist at IFNy-produserende CD4-positive THi-celler samt naturlige dreperceller (NK) infiltrerer RCC (Cozar, J.M., J. Canton, M. Tallada, A. Concha, T. Cabrera, F. Garrido, and O.F. Ruiz-Cabello. 2005. Analysis of NK cells and chemokine receptors in tumor infiltrating CD4 T lymphocytes in human renal carcinomas. Cancer Immunol. Immunother). Siden klasse II-positive tumorceller ble funnet hovedsakelig i de ytre delene av dissekerte tumorer, kan man spekulere i at leukocytter som tiltrekkes av tumoren, produserer IFNy som virker på nærliggende maligne celler. Den unormale ekspresjonen av HLA klasse II-molekyler i neoplastisk vev er ikke begrenset til RCC, den kan også observeres i TCC og CCA. Figur 4 viser immunhistokjemisk farging av prøvevev fra humant adenokarsinom i kolon.

Analyse av ekspresjon av IFNy og gentranskripter indusert av IFNy

I tillegg undersøkte oppfinnerne HLA klasse II-ekspresjon med komparativ genekspresjonsanalyse ved hjelp av oligonukleotide mikromatriser. Med denne teknikken kunne oppfinnerne vurdere den generelle HLA klasse II-ekspresjonen i den dissekerte tumoren uavhengig av ekspresjonscelletypene. Oppfinnerne analyserte differensial-ekspresjonen i fire tumorer, RCC149, RCC180, RCC190 og RCC211, sammenlignet med normale referansenyrer. I alle fire tumorene var genkodingen av HLA klasse II-molekylene overekspresjonert (tabell 2). En mulig årsak til dette kan være en indusert ekspresjon av IFNy, og av denne grunn så oppfinnerne etter andre gener som er kjent for å bli oppregulert av interferoner (Kolchanov, N.A., E.V. Ignatieva, E.A. Ananko, O.A. Podkolodnaya, LL. Stepanenko, T.I. Merkulova, M.A. Pozdnyakov, N.L. Podkolodny, A.N. Naumochkin, and A.G. Romashchenko. 2002. Transcription Regulatory Regions Database (TRRD): its status in 2002. Nucleic Acids Res. 30:312-317). Det er interessant at et stort antall slike gener ble observert å være overekspresjonert i en eller flere tumorprøver. Tabell 2 viser interferoninduserbare gener, som ble oppregulert reproduserbare i alle fire prøvene, i henhold til oppfinnernes tidligere funn (Weinschenk, T., C. Gouttefangeas, M. Schirle, F. Obermayr, S. Walter, O. Schoor, R. Kurek, W. Loeser, K.H. Bichler, D. Wernet, S. Stevanovic, and H.G. Rammensee. 2002. Integrated functional genomics approach for the design of patient-individual antitumor vaccines. Cancer Res. 62:5818-5827). Blant disse er LMP2, LMP7 og MECL1 - proteiner som byttes mot konstitutive subenheter på det store proteolytiske holoenzym som finnes i cytosolen, proteasomen, for å danne immun-proteasomen. Bytte av de normalt uttrykte proteolytiske subenhetene i proteasomen mot IFNy-induserende subenheter er en kontrollprosess i et miljø med mye interferon. I tillegg ble IFNy direkte analysert av kvantitative sanntids-PCR (TaqMan). Tumorene som vises i tabell 2, viste en overekspresjon av IFNy mRNA 5 til 60 ganger større enn sammenlignet med de autologe RNA-prøvene fra samme donor (data ikke vist). På den måten indikerer oppfinnernes resultater at IFNy kan spille en viktig rolle i RCC og være årsaken til rikelig klasse II-ekspresjonering.

HLA- DR- ligander isolert fra kreftvev

I henhold til offentlig tilgjengelige data har peptider som bindes ved hjelp av HLA klasse II-molekyler som uttrykkes i solid tumorvev, så langt ikke blitt isolert eller identifisert av andre. Oppfinnerne analyserte ti forskjellige RCC-er, tre CCA-er og én TCC og kunne isolere HLA-DR-ligander fra alle prøver, totalt 453 peptider til sammen (data ikke vist). Peptidsekvenser ble fastslått ved å koble samme kromotografisk separasjon og tandem-massespektrometrisk analyse (LC-MS/MS), som tidligere beskrevet (Weinschenk, T., C. Gouttefangeas, M. Schirle, F. Obermayr, S. Walter, O. Schoor, R. Kurek, W. Loeser, K.H. Bichler, D. Wernet, S. Stevanovic, and H.G. Rammensee. 2002. Integrated functional genomics approach for the design of patient-individual antitumor vaccines. Cancer Res. 62:5818-582; Schirle M, Keilholz W, Weber B, Gouttefangeas C, Dumrese T, Becker HD, Stevanovic S, Rammensee HG. Identification of tumor-associated MHC class I ligands by a novel T-cell-independent approach. EurJ Immunol. 2000; 30(8):2216-25). Et eksempel på reassumpsjonssekvensiering av peptider ved hjelp av peptider med LC-MS/MS blir gitt i fig. 5a og 5b. De deduserte primære aminosyresekvensene av kollisjonsfragmenter som er annotert i fig. 5a og 5b, er inkludert i tabell 5. Tumorprøvene var forskjellige i deres HLA-genotyper, i vekt og i totalt antall identifiserte HLA-ligander. Tabell 3 viser en representativ liste over peptider og korresponderende kildeproteiner som ble identifisert fra én eksempel tumorprøve, RCC190. Peptidene ble isolert fra HLA klasse II-molekylene som tidligere beskrevet (Dengjel, J., P. Decker, O. Schoor, F. Altenberend, T. Weinschenk, H.G. Rammensee, and S. Stevanovic. 2004. Identification of a naturally processed cyclin Dl T-helper epitope by a novel combination of HLA class II targeting and differential mass spectrometry. Eur. J. Immunol. 34:3644-3651).

Det finnes ingen korrelasjon mellom tumorvekt og antall identifiserte HLA-ligander. Peptidkildeprotein kan deles inn i to grupper. Pa den ene siden ble det funnet ligander som skal presenteres av leukocytter, foreksempel peptider fra komplementkomponenter, for eksempel C3, C4A, C4 bindingsprotein alfa og andre proteiner som kobles til spesifikke funksjoner for celler i immunsystemet, for eksempel CD14, og Fc-fragment for IgG-bindingsprotein. Pa den andre siden kunne oppfinnerne avsløre naturen og egenskapene for tidligere ukjente peptider presentert ved tumorceller fra overekspresjonert TAA, for eksempel fra vimentin, matriksmetalloproteinase 7, eukaryotisk transkripsjonsfaktor 1 alfa 1 og nicotinamid N-metyltransferase. Denne observasjonen er i henhold til immunhistokjemiske data (figur 1 og 4) og demonstrerer at HLA klasse II-positive tumorceller og infiltrerende leukocytter var tilstede i analyserte prøver, og at peptidene som ble eluert, stammer fra antigenene som ble funnet å være overekspresjonert i disse distinkte celletypene.

For å identifisere peptidene fra TAA, sammenlignet oppfinnerne kildeproteinene for de individuelle ligandene med overekspresjonerte gener som ble detektert av mikro-matrise analyse av tumorer (Weinschenk, T., C. Gouttefangeas, M. Schirle, F. Obermayr, S. Walter, O. Schoor, R. Kurek, W. Loeser, K.H. Bichler, D. Wernet, S. Stevanovic, and H.G. Rammensee. 2002. Integrated functional genomics approach for the design of patient-individual antitumor vaccines. Cancer Res. 62:5818-5827; Kruger, T., O. Schoor, C. Lemmel, B. Kraemer, C. Reichle, J. Dengjel, T. Weinschenk, M. Muller, J. Hennenlotter, A. Stenzl, H.G. Rammensee, and S. Stevanovic. 2004. Lessons to be learned from primary renal cell carcinomas: novel tumor antigens and HLA ligands for immunotherapy. Cancer Immunol. Immunother). Oppfinnerne identifiserte et peptid fra insulinlignende bindingsprotein 3 med vekstfaktor, IGFBP3 166-181, ori RCC190. I tillegg ble to varianter av dette peptidet, IGFBP3i69-i8iog IGFBP3i69.i84, som inneholder det samme sekvens-kjernemotivet som er både nødvendig og tilstrekkelig til å tillate binding til HLA-DRB1<*>0101 (se tabell 1 for referanse), funnet på TCC108. Fra samme tumor kunne et peptid fra matriksmetalloproteinase 7, MMP7247-262, isoleres (tabell 1). Pa mRNA-nivå ble MMP7 overekspresjonert i 13 og IGFBP3 i 22 av 23 analyserte RCC (data ikke vist). Totalt er, blant de 453 peptidsekvensene som i utgangspunktet ble identifisert (ikke vist), de underliggende antigenene for 49 peptider (SEKV. ID. Nr. 1-49) identifisert til å være tumorassosierte, enten fra oppfinnernes eksperimenter (data inkludert i dette dokumentet), eller av andre (Miyamoto, S., K. Yano, S. Sugimoto, G. Ishii, T. Hasebe, Y. Endoh, K. Kodama, M. Goya, T. Chiba, and A. Ochiai. 2004. Matrix metalloproteinase-7 facilitates insulin-like growth factor bioavailability through its proteinase activity on insulin-like growth factor binding protein 3. Cancer Res. 64:665-671; Sumi, T., T. Nakatani, H. Yoshida, Y. Hyun, T. Yasui, Y. Matsumoto, E. Nakagawa, K. Sugimura, H. Kawashima, and O. Ishiko. 2003. Expression of matrix metalloproteinases 7 and 2 in human renal cell carcinoma. Oncol. Rep. 10:567-570; Cheung, C.W., D.A. Vesey, D.L. Nicol, and D.W. Johnson. 2004. The roles of IGF-I and IGFBP-3 in the regulation of proximal tubule, and renal cell carcinoma cell proliferation. Kidney Int. 65:1272-1279; Hao, X., B. Sun, L. Hu, H. Lahdesmaki, V. Dunmire, Y. Feng, S.W. Zhang, H. Wang, C. Wu, H. Wang, G.N. Fuller, W.F. Symmans, I. Shmulevich, and W. Zhang. 2004. Differential gene and protein expression in primary breast malignancies and their lymph node metastases as revealed by combined cDNA microarray and tissue microarray analysis. Cancer 100:1110-1122; Helmke, B.M., M. Polychronidis, A. Benner, M. Thorne, J. Arribas, and M. Deichmann. 2004. Melanoma metastasis is associated with enhanced expression of the syntenin gene. Oncol. Rep. 12:221-228; Hofmann, H.S., G. Hansen, G. Richter, C. Taege, A. Simm, R.E. Silber, and S. Burdach. 2005. Matrix metalloproteinase-12 expression correlates with local recurrence and metastatic disease in non-small cell lung cancer patients. Clin. Cancer Res. 11:1086-1092; Kamai, T., T. Yamanishi, H. Shirataki, K. Takagi, H. Asami, Y. Ito, and K. Yoshida. 2004. Overexpression of RhoA, Racl, and Cdc42 GTPases is associated with progression in testicular cancer. Clin. Cancer Res. 10:4799-4805; Koninger, J., N.A. Giese, F.F. di Mola, P. Berberat, T. Giese, I. Esposito, M.G. Bachem, M.W. Buchler, and H. Friess. 2004. Overexpressed decorin in pancreatic cancer: potential tumor growth inhibition and attenuation of chemotherapeutic action. Clin. Cancer Res. 10:4776-4783; Mori, M., H. Shimada, Y. Gunji, H. Matsubara, H. Hayashi, Y.Nimura, M.Kato, M. Takiguchi, T. Ochiai, and N. Seki. 2004. S100A11 gene identified by in-house cDNA microarray as an accurate predictor of lymph node metastases of gastric cancer. Oncol. Rep. 11:1287-1293; Nagler, D.K., S. Kruger, A. Kellner, E. Ziomek, R. Menard, P. Buhtz, M. Krams, A. Roessner, and U. Kellner. 2004. Up-regulation of cathepsin X in prostate cancer and prostatic intraepithelial neoplasia. Prostate 60:109-119; Nanda, A., P. Buckhaults, S. Seaman, N. Agrawal, P. Boutin, S. Shankara, M. Nacht, B. Teicher, J. Stampfl, S. Singh, B. Vogelstein, K.W. Kinzler, and C.B. St. 2004. Identification of a binding partner for the endothelial cell surface proteins TEM7 and TEM7R. Cancer Res. 64:8507-8511; Patel, I.S., P. Madan, S. Getsios, M.A. Bertrand, and CD. MacCalman. 2003. Cadherin switching in ovarian cancer progression. Int. J. Cancer 106:172-177; Santelli, G., D. Califano, G. Chiappetta, M.T. Vento, P.C Bartoli, F. Zullo, F. Trapasso, G. Viglietto, and A. Fusco. 1999. Thymosin beta-10 gene overexpression is a general event in human carcinogenesis. Am. J. Pathol. 155:799-804; Schneider, D., J. Kleeff, P.O. Berberat, Z. Zhu, M. Kore, H. Friess, and M.W. Buchler. 2002. Induction and expression of betaig-h3 in pancreatic cancer cells. Biochim. Biophys. Acta 1588:1-6; Welsh, J.B., LM. Sapinoso, S.G. Kern, D.A.Brown, T. Liu, A.R. Bauskin, R.L. Ward, N.J. Hawkins, D.I. Quinn, P.J. Russell, R.L. Sutherland, S.N. Breit, CA. Moskaluk, H.F. Frierson, Jr., and G.M. Hampton. 2003. Large-scale delineation of secreted protein biomarkers overexpressed in cancer tissue and serum. Proe. Nati. Acad. Sei. U. S. A 100:3410-3415; Xie, D., J.S. Sham, W.F. Zeng, LH. Che, M. Zhang, H.X. Wu, H.L Lin, J.M. Wen, S.H. Lau, L.Hu, and X.Y. Guan. 2005. Oncogenic role ofduste rin overexpression in multistage colorectal tumorigenesis and progression. World J. Gastroenterol. 11:3285-3289). Eksempelanalyser av immunstimulerende potensial for peptider som bindes til vanlige HLA-DR-alleler, viser eksistensen av antigen-spesifikke CD4-positive T-celler mot IGFBP3169.181and MMP7247-262: Promiskiøs binding av eksempel SEKV. ID. Nr. 1 til flere HLA-DR-alleler kan avsløres av flere uavhengige metoder: Ligander for bestemte MHC/HLA-molekyler bærer kjemisk relaterte aminosyrer i bestemte posisjoner for deres primærsekvens, noe som tillater definering av et peptidmotiv for hver MHC/HLA-allele (Falk K, Rotzschke O, Stevanovic S, Jung G, Rammensee HG. Allele-specific motifs revealed by sequencing of self-peptides eluted from MHC molecules. Nature. 1991; 351(6324):290-6). SYFPEITHI bruker motivmatriser utledet fra raffinerte motiv utelukkende basert på naturlig ligandanalyse ved Edman-degradering og tandemmassespektrometri. Disse matrisene tillater forutsigelse av peptidene fra en gitt proteinsekvens presentert på MHC klasse I-eller klasse II-molekyler (Rotzschke O, Falk K, Stevanovic S, Jung G, Walden P, Rammensee HG. Exact prediction of a natural T-cell epitope. Eur J Immunol. 1991; 21(ll):2891-4).

Ved anvendelse av prinsippene for forutsigelsene gitt av SYFPEITHI algoritme-databasen (Rammensee, H.G., J. Bachmann, and S. Stevanovic. 1997. MHC Ligands and Peptide Motifs. Springer-Verlag, Heidelberg, Tyskland; Rammensee H, Bachmann J, Emmerich NP, Bachor OA, Stevanovic S. SYFPEITHI: database for MHC ligands and peptide motifs. Immunogenetics. 1999; 50(3-4):213-9) til tidligere nevnt eksempel peptidsekvens (SEKV. ID. Nr. 1), var bindingen av SEKV. ID. Nr. 1 til flere vanlige HLA-DR-alleler (se tabell 7) rangert. Algoritmen er brukt til å forutsi klasse I- og klasse II-epitoper fra forskjellige antigener, for eksempel fra det humane TAA TRP2 (forutseelse av en HLA klasse I-ligand) (34) og SSX2 (prediksjon av en HLA klasse II-ligand) (Neumann F, Wagner C, Stevanovic S, Kubuschok B, Schormann C, Mischo A, Ertan K, Schmidt W, Pfreundschuh M. Identification of an HLA-DR-restricted peptide epitope with a promiscuous binding pattern derived from the cancer testis antigen HOM-MEL-40/SSX2. Int J Cancer. 2004; 112(4):661-8). Terskelen for en sum på 18 eller høyere for signifikant binding ble definert basert på analysen av bindingssummer for tidligere publiserte HLA-DR-peptidligander med god bindeevne. God bindeevne defineres som binding av et peptid med god bindingsstyrke som indikert med en sum på 18 i SYFPEITHI-testen eller høyere til to eller flere forskjellige felles HLA-DR-alleler. De vanligste HLA DR-allelene vises i tabell 7. Loci for HLA-A og HLA-DR er i link HLA-A2-kombinasjoner som fører til ustabilitet, og spesifikke HLA-DR-er som foretrekkes fremfor andre. HLA-DR-genotypene for kildetumorene ble analysert og bekreftet å være HLA-DRB1<*>11 og DRB1<*>15 i begge tilfellene. Restene fra den fortrukne ankeraminosyren for den vanligste HLA klasse II-allelen (DRB1<*>0101, DRB1<*>0301, DRB1<*>0401, DRB1<*>0701, DRB1<*>1101 og DRB1<*>1501) vises i tabell 4. For eksempel binder HLA klasse II-allelen DRB1<*>0301 fortrinnsvis peptider i bindingsgropen med spesifikke aminosyrerester i posisjonene 1, 4, 6 og 9 fra N- til C-terminalenden for kjernesekvensen for alle typer peptider. DRB1<*>0301 viser spesielt god binding, hvis kjernesekvensen for et peptid har en glutamat-rest (D) i posisjon 4, samt enten L, I, F, M eller V i posisjon 1, samt K, R, E, Q eller N i posisjon 6, samt enten Y, L eller F i posisjon 9.

Resultater fra in s/7/co-analyse basert på datamaskinens algoritmer for forutsigelse av interagering mellom HLA-molekyler og peptidsekvenser gjennom www.syfpeithi.de, indikerer at peptidet MMP7247-262 SEKV. ID. Nr. 1 binder promiskuøst til flere HLA-DR-alleler. I henhold til resultatene fra den prediktive analysen mottar peptidet med SEKV. ID. Nr. 1 et høy bindingsresultat for interagering med DRB1<*>1101, DRB1<*>1501, DRB1<*>0401, DRB1<*>0301 og DRB1<*>0101 (tabell 7). HLA-DR-allelene som ble analysert i denne prøven for interagering med peptidaminosyresekvens/bindingsstyrke, dekker minst 69,6 % av den HLA-A2-positive kaukasier populasjonen (Mori M, Beatty PG, Graves M, Boucher KM, Milford EL. HLA gene and haplotype frequencies in the North American population: the National Marrow Donor Program Donor Registry. Transplantation. 1997; 64(7): 1017-27). Siden det ikke eksisterer hyppighetsdata for HLA-DR15, ble allelen ikke tatt med i beregningen ved kalkuleringen av den resulterende dekningen av den HLA-A2-positive kaukasier populasjonen. Derfor er det svært sannsynlig at med SEKV. ID. Nr. 1 er dekningen i befolkningen høyere enn 69,6 %, som indikerer at peptidet har et svært godt utgangspunkt for å kunne fungere som en kandidat for utviklingen av farmasøytiske preparater for flertallet av kreftpasienter.

Bruk av prediksjonsalgoritmer leder imidlertid kun til endelige resultater hvis resultatene fra in silico-analysene kombineres med eksperimentell bekreftelse for promiskuøs binding, slik det har blitt vist av andre som tidligere har mislyktes i å demonstrere immunrespons utløst av en peptidsekvens som ble forventet å være en god binder (Bohm CM, Hanski ML, Stefanovic S, Rammensee HG, Stein H, Taylor-Papadimitriou J, Riecken EO, Hanski C. Identification of HLA-A2-restricted epitopes of the tumor-associated antigen MUC2 recognized by human cytotoxic T-cells. Int J Cancer. 1998; 75(5):688-93). Prediksjonen av artefakter som i det tidligere nevnte tilfellet, kan primært sett ikke utelukkes, siden algoritmene som anvendes for prediksjon, ikke tar med i beregningen at en peptidsekvens ikke nødvendigvis genereres i en in vivo-situasjon (i levende celler). Eksperimentell bekreftelse kan tilegnes ved å samle in vitro-data fra biologiske tester, for eksempel ved å demonstrere tilstedeværelses eller fraværet av immunogenisiteten for et peptid. Derfor ble eksperimentell bekreftelse av promiskuøs binding av SEKV. ID. Nr. 1 oppnådd ved å samle disse in vitro-dataene. For å teste peptidenes immunstimulerende kapasitet ved in vitro T-celle priming-eksperimenter, ble de korteste variantene ("kjernesekvens") av IGFBP3-peptidene, IGFBP3i69-i8i, og av MMP7-peptidet, MMP7247_262, brukt.

For å generere antigenspesifikke CD4-positive T-celler og teste peptidenes promiskuøse bindeevne, ble PBMC-er fra 4 friske donorer med forskjellige HLA-DR-alleler (figur 2), en av dem med DRB1<*>1101, stimulert ved hjelp av peptidpulserte autologe DC-er. I tillegg ble peptidet CCNDli98-2i2, et kjent T-celle epitop (Dengjel, J., P. Decker, O. Schoor, F. Altenberend, T. Weinschenk, H.G. Rammensee, and S. Stevanovic. 2004. Identification of a naturally processed cyclin Dl T-helper epitope by a novel combination of HLA class II targeting and differential mass spectrometry. Eur. J. Immunol. 34:3644-3651), brukt som positiv kontroll. Som et avlesningssystem for generering av antigen-spesifikke CD4-positive T-celler, ble IFNy-nivåene analysert ved hjelp av flowcytometri. T-cellene ble analysert etter den tredje og fjerde ukentlige stimuleringen ved hjelp av intracellulær IFNy-farging pluss CD4-FITC- og CD8-PerCP-farging for å fastslå prosentandelen av IFNy-produserende celler i spesifikke T-cellesubpopulasjoner. I alle eksperi-mentene ble stimuleringer med irrelevant peptider og uten peptider utført som negative kontroller. IFNy-responsen ble vurdert som positiv hvis prosentandelen av IFNy-produserende CD4-positive T-celler var mer enn to ganger høyere sammenlignet med negative kontroller (Horton, H., N. Russell, E. Moore, I. Frank, R. Baydo, C. Havenar-Daughton, D. Lee, M. Deers, M. Hudgens, K. Weinhold, and M.J. Mc Elrath. 2004. Correlation between interferon- gamma secretion and cytotoxicity, in virus-specific memory T-cells. J. Infect. Dis. 190:1692-1696).

I tre av fire donorer kunne oppfinnerne generere spesifikke CD4-positive T-celler for begge peptidene (figur 2). Det ble ikke observert T-cellerespons i donor 4 etter stimulering. Hos donor 1 ble 0,05 % til 0,1 % (figur 3) IFNy-produserende CD4-positive T-celler detektert i alle syv stimuleringsforsøkene etter den tredje stimuleringen med peptid-IGFBP3169.181. Disse T-cellene kunne i de fleste tilfellene utvides av en ekstra runde med stimulering til 0,09 % til 0,13 %. IFNy-produserende CD4-positive T-celler spesifikke for peptid-IGFBP3i69_i8ible også observert i donor 2 og donor 3, med maksimale frekvenser på 0,05 % og 0,07 % IFNy-produserende CD4<+>T-celler.

Donorene 1, 2 og 3 viste også CD4<+>T-celler som var reaktive mot peptid MMP7247-262. Den høyeste frekvensen av IFNy-produserende CD4<+>T-celler spesifikke for MMP7-peptidet ble funnet i henholdsvis donorene 1 og 2. I tillegg ble peptidet CCNDli98.2i2, et kjent T-celle epitop (Dengjel, J., P. Decker, O. Schoor, F. Altenberend, T. Weinschenk, H.G. Rammensee, and S. Stevanovic. 2004. Identification of a naturally processed cyclin Dl T-helper epitope by a novel combination of HLA class II targeting and differential mass spectrometry. Eur. J. Immunol. 34:3644-3651), brukt som positiv kontroll.

Dermed er peptider fra IGFBP3, MMP7 og CCND1 promiskuøse HLA klasse II-bindere som kan frembringe CD4-positiv T-cellerespons hos tre av fire friske donorer som bærer forskjellige HLA DR-alleler. Hvis HLA-allelene for de to tumorpasientene som IGFBP3- og MMP7-peptidene ble tatt fra, sammenlignes med allelene fra de fire friske donorene, blir det tydelig at peptidene presenteres av HLA-DRB1<*>01, HLA-DRB1<*>04 og HLA-DRB1<*>11. Alle tre tidligere nevnte HLA DR-allotypene har henholdsvis en glysin-aminosyrerest ved posisjon 86 og en asparaginsyrerest ved posisjon 57 på p-kjedene (see www.anthonynolan.com/HIG). Derfor har de svært like bindingsegenskaper for bindingslommene Pl og P9 (Rammensee, H.G., J. Bachmann, and S. Stevanovic. 1997. MHC Ligands and Peptide Motifs. Springer-Verlag, Heidelberg, Germany). For peptidet CCND1 198-212, et T-celle epitop som presenteres ved hjelp av HLA-DRB1<*>0401 og HLA-DRB1<*>0408 (Dengjel, J., P. Decker, O. Schoor, F. Altenberend, T. Weinschenk, H.G. Rammensee, and S. Stevanovic. 2004. Identification of a naturally processed cyclin Dl T-helper epitope by a novel combination of HLA class II targeting and differential mass spectrometry. Eur. J. Immunol. 34:3644-3651), er situasjonen den samme. Donor 4 har HLA-DRB1<*>0318 og HLA-DRB1<*>1401, alleler med peptidmotiver som er annerledes i de primære aminosyresekvensene i betakjedene enn de som blir beskrevet ovenfor. Dette kan forklare hvorfor det ikke er mulig å frembringe T-cellerespons mot de to peptidene som bruker celler fra denne donoren.

Det er interessant at IFNy-produserende CD8-positive T-dreperceller ble detektert hos to donerer etter stimuleringer med de tre peptidene, spesielt hos donor 3, men også i mindre grad hos donor 1 (data ikke vist).

Tabell 6: Haplotypefrekvenser for nordamerikansk kaukasisk populasjon. De serologiske haplotypene vises, i/t betyr ikke tildelt

Claims (27)

1. Et tumorassosiert peptid på mellom 9 og 30 aminosyrer som omfatter en sekvens ifølge SEKV. ID. Nr. 43.

2. Det tumorassosierte peptidet ifølge krav 1, hvor peptidet består av aminosyresekvensen ifølge SEKV. ID. Nr. 43.

3. Det tumorassosierte peptidet ifølge kravene 1 eller 2, som har evne til å binde til et molekyl av humant vevstypekompleks (MHC) klasse-II, spesielt til HLA-DRB1<*>0101.;

4. Det tumorassosierte peptidet ifølge krav 3, som har evne til å binde til minst ett ekstra molekyl i det humane vevstypekompleks (MHC) klasse II.;

5. Det tumorassosierte peptidet ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 4, hvor peptidet inkluderer ikke-peptidbindinger.;

6. Det tumorassosierte peptidet ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 5, hvor peptidet er et fusjonsprotein som særlig omfatter N-terminale-aminosyrer i den HLA-DR-antigenassosierte invariantkjeden (li).;

7. En nukleinsyre som utelukkende koder for et peptid ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 6.;

8. Nukleinsyren ifølge krav 7 som er DNA, cDNA, PNA, CNA, RNA eller kombinasjoner av disse.;

9. En ekspresjonsvektor som er i stand til å uttrykke en nukleinsyre ifølge krav 7 eller 8.;

10. En vertscelle som omfatter en nukleinsyre ifølge krav 7 eller 8, eller en ekspresjonsvektor ifølge krav 9.;

11. Vertscellen ifølge krav 10 som er en rekombinant RCC- eller Awells-celle.;

12. En fremgangsmåte for fremstilling av et tumorassosiert peptid ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 6, hvor fremgangsmåten omfatter å dyrke vertscellen ifølge krav 10 eller 11 og å isolere peptidet fra nevnte vertscelle eller dens dyrkningsmedium.;

13. En farmasøytisk sammensetning som omfatter et tumorassosiert peptid ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 6, en nukleinsyre ifølge krav 7 eller 8, eller en ekspresjonsvektor ifølge krav 9 og en farmasøytisk akseptabel bærer.;

14. Den farmasøytiske sammensetningen ifølge krav 13 hvor den videre omfatter minst ett ytterligere tumorassosiert peptid på mellom 9 og 30 aminosyrer som omfatter minst én av sekvensene ifølge SEQ ID Nr. 1 til SEQ ID Nr. 42 og SEQ ID Nr. 44 til SEQ ID Nr. 49.;

15. Den farmasøytiske sammensetningen ifølge krav 13 eller 14 i form av en kreftvaksine, eventuelt omfattende minst én egnet adjuvans.;

16. Et tumorassosiert peptid ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 6, en nukleinsyre ifølge krav 8 eller 9, eller en ekspresjonsvektor ifølge krav 9 for anvendelse i medisin.;

17. Anvendelse av et tumorassosiert peptid ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 6, en nukleinsyre ifølge krav 7 eller 8, eller en ekspresjonsvektor ifølge krav 9 til fremstilling av et medikament for å drepe målceller i en pasient med målceller som avvikende uttrykker et polypeptid som omfatter en aminosyre-sekvens som gitt i et hvilket som helst av kravene 1 til 4.;

18. Anvendelse av et tumorassosiert peptid ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 6, eller en nukleinsyre ifølge krav 7 eller 8, eller en ekspresjonsvektor ifølge krav 9 til fremstilling av et medikament for å indusere immunrespons, spesielt en cellulær immunrespons, mer spesielt en T-cellemediert immunrespons mot celler i faste tumorer der celler uttrykker et humant klasse II MHC-molekyl på overflaten og presenterer et polypeptid som omfatter en aminosyresekvens ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 4.;

19. En in vitro fremgangsmåte for fremstilling av aktiverte cytotoksiske T-lymfocytter (CTL), der fremgangsmåten omfatter å sette CTL i kontakt med antigen-ladede humane klasse II MHC-molekyler uttrykt på overflaten av en egnet antigen-presenterende celle in vitro, i en tidsperiode tilstrekkelig for å aktivere nevnte CTL på en antigenspesifikk måte, der nevnte antigen er et peptid ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 4.;

20. Fremgangsmåten ifølge krav 19, hvor antigenet er ladet på MHC-klasse II molekyler uttrykt på overflaten av en egnet antigenpresenterende celle ved å bringe en tilstrekkelig mengde av antigenet i kontakt med en antigenpresenterende celle.;

21. Fremgangsmåten ifølge krav 19, hvor den antigenpresenterende cellen omfatter en ekspresjonsvektor ifølge krav 9.;

22. Fremgangsmåten ifølge et hvilket som helst av kravene 19 til 21, hvor MHC-klasse II molekylet er HLA-DRB1<*>0101.

23. Aktiverte cytotoksiske T-lymfocytter (CTL), fremstilt ved fremgangsmåten ifølge et hvilket som helst av kravene 19 til 22, som selektivt gjenkjenner en celle som uttrykker et polypeptid som omfatter en aminosyresekvens angitt i et hvilket som helst av kravene 1 til 4.

24. En T-cellereseptor (TCR) som gjenkjenner en celle som uttrykker et polypeptid som omfatter en aminosyresekvens angitt i et hvilket som helst av kravene 1 til 4, der TCR-en kan fremskaffes fra den cytotoksiske T-lymfocytten (CTL) ifølge krav 23, eller et funksjonelt ekvivalent molekyl for TCR-en.

25. En nukleinsyre som koder for en T-cellereseptor (TCR) ifølge krav 24.

26. En ekspresjonsvektor som er i stand til å uttrykke en T-cellereseptor (TCR) ifølge krav 24.

27. Anvendelse av cytotoksiske T-lymfocytter som definert i krav 23 til fremstilling av et medikament for å drepe målceller i en pasient med målceller som avvikende uttrykker et polypeptid som omfatter en aminosyresekvens angitt i et hvilket som helst av kravene 1 til 4.