TWI781928B - 新抗原及其使用方法 - Google Patents

Abstract

本發明領域係關於免疫治療肽、肽結合劑及其等用於(例如)癌症免疫療法中之用途。

Description

新抗原及其使用方法

本發明領域係關於免疫治療肽、編碼該等肽之核酸、肽結合劑及其等用於(例如)癌症免疫療法之用途。在一態樣中，本發明提供新抗原肽，其可單獨或與另一腫瘤相關性肽、抗癌劑或免疫調節劑組合使用來治療癌症。

腫瘤疫苗通常係由腫瘤抗原及免疫刺激分子(例如，佐劑、細胞介素或TLR配體)構成，其共同起作用以誘導抗原特異性細胞毒性T細胞(CTL)識別並溶解腫瘤細胞。該等疫苗含有共有之組織限制性腫瘤抗原或呈整體腫瘤細胞製劑形式之共有抗原及患者特異性抗原之混合物。共有之組織限制性腫瘤抗原係在許多個體內選擇性表現於腫瘤中之免疫原性理想的蛋白質，且其通常以合成肽或重組蛋白之形式遞送至患者。相反，整體腫瘤細胞製劑係以自體經輻照細胞、細胞溶解物、細胞融合物、熱休克蛋白製劑或總mRNA之形式遞送至患者。由於整體腫瘤細胞係從自體患者分離的，故該等細胞可包括患者特異性腫瘤抗原以及共有之腫瘤抗原。最後，存在第三類腫瘤抗原(新抗原)，其已用於疫苗中，其係由具有會引起經改變胺基酸序列之腫瘤特異性突變之蛋白質(其可為患者特異性的或共有的)所組成。該等突變蛋白係：(a)為腫瘤細胞獨有的，乃因突變及其相應的蛋白 僅存在於腫瘤中；(b)避免中樞耐受性且因此更可能具有免疫原性；(c)提供免疫識別(包括體液性及細胞免疫性)之優良靶標。然而，使用個人化新抗原需要對每一患者之基因體進行測序及然後產生患者特異性新抗原組合物。因此，業內需要研發其他癌症治療劑。

本文提供包含腫瘤特異性新表位之經分離新抗原肽，其中經分離新抗原肽不為天然多肽，其中新表位包含由A_xB_yC_z表示之胺基酸序列之至少8個鄰接胺基酸，其中每一A及C表示對應於天然多肽之胺基酸，y為至少1且B表示天然多肽之胺基酸取代或插入，x+y+z為至少8，該至少8個鄰接胺基酸包含B_y，且天然多肽係由選自由以下組成之群之基因編碼：(a)ABL1，其中A_xB_yC_z係(i)

(SEQ ID NO：1)、(ii)

(SEQ ID NO：2)、(iii)

(SEQ ID NO：3)、(iv)

(SEQ ID NO：4)或(v)

(SEQ ID NO：5)；(b)ALK，其中A_xB_yC_z係(i)

(SEQ ID NO：6)或(ii)

(SEQ ID NO：7)；(c)BRAF，其中A_xB_yC_z係

(SEQ ID NO：8)；(d)BTK，其中A_xB_yC_z係

(SEQ ID NO：9)；(e)EEF1B2，其中A_xB_yC_z係

(SEQ ID NO：10)；(f)EGFR，其中A_xB_yC_z係(i)

(SEQ ID NO：11)或(ii)

(SEQ ID NO：12)；(g)ERBB3，其中A_xB_yC_z係

(SEQ ID NO：13)；(h)ESR1，其中A_xB_yC_z係(i)

(SEQ ID NO：14)、(ii)

(SEQ ID NO：15)、(iii)

(SEQ ID NO：16)、(iv)

(SEQ ID NO：17)或(v)

(SEQ ID NO：18)；(i)FGFR3，其中A_xB_yC_z係

(SEQ ID NO：19)；(j)FRG1B，其中A_xB_yC_z係

(SEQ ID NO：20)；(k)HER2，其中A_xB_yC_z係

(SEQ ID NO：21)；(l)IDH1，其中A_xB_yC_z係(i)

(SEQ ID NO：22)、(ii)

(SEQ ID NO：23)、(iii)

(SEQ ID NO：24)或(iv)

(SEQ ID NO：25)；(m)KIT，其中A_xB_yC_z係(i)

(SEQ ID NO：26)或(ii)

(SEQ ID NO：26)；(n)MEK，其中A_xB_yC_z係(i)

(SEQ ID NO：27)或(ii)

(SEQ ID NO：28)；(o)MYC，其中A_xB_yC_z係(i)MPLNVSFTNRNYDLDYDSVQPYFYCDEEENFYQQQQQSDLQPPAPSEDIWKKFELLPTPPLSPSRRSGLCSPSYVAVTPFSLRGDNDGG(SEQ ID NO：29)、(ii)

(SEQ ID NO：30)或(iii)

(SEQ ID NO：31)；(p)PDGFRa，其中A_xB_yC_z係

(SEQ ID NO：32)；(q)PIK3CA，其中A_xB_yC_z係(i)

(SEQ ID NO：33)、(ii)

(SEQ ID NO：34)或(iii) LFINLFSMMLGSGMPELQSFDDIAYIRKTLALDKTEQEALEYFMKQMNDARHGGWTTKMDWIFHTIKQHALN(SEQ ID NO：35)；(r)POLE，其中A_xB_yC_z係

(SEQ ID NO：36)；(s)PTEN，其中A_xB_yC_z係

(SEQ ID NO：37)；(t)RAC1，其中A_xB_yC_z係MQAIKCVVVGDGAVGKTCLLISYTTNAFSGEYIPTVFDNYSANVMVDGKPVNLGLWDTAGQEDYDRLRPLSYPQTVGET(SEQ ID NO：38)；及(u)TP53，其中A_xB_yC_z係(i)

(SEQ ID NO：39)、(ii)

(SEQ ID NO：40)、(iii)

(SEQ ID NO：41)、(iv)

(SEQ ID NO：42)或(v)

(SEQ ID NO：43)。

在實施例中，天然多肽係由EGFR、ERBB3或FGFR3基因編碼且至少一個B_y係在細胞外表現。

本文提供包含腫瘤特異性新表位之經分離新抗原肽，其中經分離新抗原肽不為天然多肽，其中新表位包含由A_xB_yC_z表示之胺基酸序列之至少8個鄰接胺基酸，其中每一A係對應於天然多肽之胺基酸；B_y不存在；每一C係由編碼天然多肽之序列之框移編碼之胺基酸；x+y+z為至少8；該至少8個鄰接胺基酸包含至少一個C_z；且天然多肽係由選自由以下組成之群之基因編碼：(a)APC，其中C_z係(i)AKFQQCHSTLEPNPADCRVLVYLQNQPGTKLLNFLQERNLPPKVVLRHPKVHLNTMFRRPHSCLADVLLSVHLIVLRVVRLPAPFRVNHAVEW(SEQ ID NO：44)、(ii)APVIFQIALDKPCHQAEVKHLHHLLKQLKPSEKYLKIKHLLLKRERVDLSKLQ(SEQ ID NO：45)或(iii)MLQFRGSRFFQMLILYYILPRKVLQMDFLVHPA(SEQ ID NO：46)；(b)ARID1A，其中C_z係(i)

(SEQ ID NO：47)、(ii)AHQGFPAAKESRVIQLSLLSLLIPPLTCLASEALPRPLLALPPVLLSLAQDHSRLLQCQATRCHLGHPVASRTASCILP(SEQ ID NO：48)、(iii)

(SEQ ID NO：49)、(iv)

(SEQ ID NO：50)、(v)RTNPTVRMRPHCVPFWTGRILLPSAASVCPIPFEACHLCQAMTLRCPNTQGCCSSWAS(SEQ ID NO：51)或(vi)TNQALPKIEVICRGTPRCPSTVPPSPAQPYLRVSLPEDRYTQAWAPTSRTPWGAMVPRGVSMAHKVATPGSQTIMPCPMPTTPVQAWLEA(SEQ ID NO：52)；(c)β2M，其中C_z係(i)RMERELKKWSIQTCLSARTGLSISCTTLNSPPLKKMSMPAV(SEQ ID NO：53)或(ii)LCSRYSLFLAWRLSSVLQRFRFTHVIQQRMESQIS(SEQ ID NO：54)；(d)CDH1，其中C_z係(i)RSACVTVKGPLASVGRHSLSKQDCKFLPFWGFLEEFLLC(SEQ ID NO：55)、(ii)

(SEQ ID NO：56)、(iii)PTDPFLGLRLGLHLQKVFHQSHAEYSGAPPPPPAPSGLRFWNPSRIAHISQLLSWPQKTEERLGYSSHQLPRK(SEQ ID NO：57)、(iv)FCCSCCFFGGERWSKSPYCPQRMTPGTTFITMMKKEAEKRTRTLT(SEQ ID NO：58)或(v)

(SEQ ID NO：59)；(e)GATA3，其中C_z係(i)

(SEQ ID NO：60)；或(ii) PRPRRCTRHPACPLDHTTPPAWSPPWVRALLDAHRAPSESPCSPFRLAFLQEQYHEA(SEQ ID NO：61)；(f)MLL2，其中C_z係

(SEQ ID NO：62)；(g)PTEN，其中C_z係(i)SWKGTNWCNDMCIFITSGQIFKGTRGPRFLWGSKDQRQKGSNYSQSEALCVLL(SEQ ID NO：63)、(ii)KRTKCFTFG(SEQ ID NO：64)、(iii)PIFIQTLLLWDFLQKDLKAYTGTILMM(SEQ ID NO：65)、(iv)QKMILTKQIKTKPTDTFLQILR(SEQ ID NO：66)、(v)GFWIQSIKTITRYTIFVLKDIMTPPNLIAELHNILLKTITHHS(SEQ ID NO：67)、(vi)NYSNVQWRNLQSSVCGLPAKGEDIFLQFRTHTTGRQVHVL(SEQ ID NO：68)或(vii)YQSRVLPQTEQDAKKGQNVSLLGKYILHTRTRGNLRKSRKWKSM(SEQ ID NO：69)；(h)TP53，其中C_z係(i)SSQNARGCSPRGPCTSSSYTGGPCTSPLLAPVIFCPFPENLPGQLRFPSGLLAFWDSQVCDLHVLPCPQQDVLPTGQDLPCAAVG(SEQ ID NO：70)、(ii)GAAPTMSAAQIAMVWPLLSILSEWKEICVWSIWMTETLFDIVWWCPMSRLRLALTVPPSTTTTCVTVPAWAA(SEQ ID NO：71)、(iii)

(SEQ ID NO：72)、(iv)FHTPARHPRPRHGHLQAVTAHDGGCEALPPP(SEQ ID NO：73)、(v) CCPRTILNNGSLKTQVQMKLPECQRLLPPWPLHQQLLHRRPLHQPPPGPCHLLSLPRKPTRAATVSVWASCILGQPSL(SEQ ID NO：74)、(vi)VRKHFQTYGNYFLKTTFCPPCRPKQWMI(SEQ ID NO：75)或(vii)LARTPLPSTRCFANWPRPALCSCGLIPHPRPAPASAPWPSTSSHST(SEQ ID NO：76)；或(i)VHL，其中C_z係(i)ELQETGHRQVALRRSGRPPKCAERPGAADTGAHCTSTDGRLKISVETYTVSSQLLMVLMSLDLDTGLVPSLVSKCLILRVK(SEQ ID NO：77)、(ii)KSDASRLSGA(SEQ ID NO：78)、(iii)RTAYFCQYHTASVYSERAMPPGCPEPSQA(SEQ ID NO：79)、(iv)TRASPPRSSSAIAVRASCCPYGSTSTASRSPTQRCRLARAAASTATEVTFGSSEMQGHTMGFWLTKLNYLCHLSMLTDSLFLPISHCQCIL(SEQ ID NO：80)、(v)SSLRITGDWTSSGRSTKIWKTTQMCRKTWSG(SEQ ID NO：81)或(vi)

(SEQ ID NO：82)；(j)ACVR2A，其中A_xB_yC_z係(i)GVEPCYGDKDKRRHCFATWKNISGSIEIVKQGCWLDDINCYDRTDCVEKKRQP(SEQ ID NO：83)或(ii)

(SEQ ID NO：84)；(k)C15ORF40，其中A_xB_yC_z係

(SEQ ID NO：85)；(l)CNOT1，其中A_xB_yC_z係(i)LSVIIFFFVYIWHWALPLILNNHHICLMSSIILDCNSVRQSIMSVCFFFFSVIFSTRCLTDSRYPNICWFK(SEQ ID NO：86)或(ii)LSVIIFFFVYIWHWALPLILNNHHICLMSSIILDCNSVRQSIMSVCFFFFCYILNTMFDR(SEQ ID NO：87)；(m)EIF2B3，其中A_xB_yC_z或C_z係

(SEQ ID NO：88)；(n)EPHB2，其中A_xB_yC_z或C_z係

(SEQ ID NO：89)；(o)ESRP1，其中A_xB_yC_z係(i)LDFLGEFATDIRTHGVHMVLNHQGRPSGDAFIQMKSADRAFMAAQKCHKKKHEGQIC(SEQ ID NO：90)或(ii)LDFLGEFATDIRTHGVHMVLNHQGRPSGDAFIQMKSADRAFMAAQKCHKKT(SEQ ID NO：91)；(p)FAM11B，其中A_xB_yC_z係GALCKDGRFRSDIGEFEWKLKEGHKKIYGKQSMVDEVSGKVLEMDISKKKHYNRKISIKKLNRMKVPLMKLITRV(SEQ ID NO：92)；(q)GBP3，其中A_xB_yC_z係RERAQLLEEQEKTLTSKLQEQARVLKERCQGESTQLQNEIQKLQKTLKKKPRDICRIS(SEQ ID NO：93)；(r)JAK1，其中A_xB_yC_z係(i) VNTLKEGKRLPCPPNCPDEVYQLMRKCWEFQPSNRTSFQNLIEGFEALLKTSN(SEQ ID NO：94)或(ii)CRPVTPSCKELADLMTRCMNYDPNQRPFFRAIMRDINKLEEQNPDIVSEKNQQLKWTPHILKSAS(SEQ ID NO：95)；(s)LMAN1，其中A_xB_yC_z係(i)DDHDVLSFLTFQLTEPGKEPPTPDKEISEKEKEKYQEEFEHFQQELDKKKRGIPEGPPRPPRAACGGNI(SEQ ID NO：96)或(ii)DDHDVLSFLTFQLTEPGKEPPTPDKEISEKEKEKYQEEFEHFQQELDKKKRNSRRATPTSKGSLRRKYLRV(SEQ ID NO：97)；(t)MSH3，其中A_xB_yC_z係(i)TKSTLIGEDVNPLIKLDDAVNVDEIMTDTSTSYLLCISENKENVRDKKKGQHFYWHCGSAACHRRGCV(SEQ ID NO：98)或(ii)LYTKSTLIGEDVNPLIKLDDAVNVDEIMTDTSTSYLLCISENKENVRDKKRATFLLALWECSLPQARLCLIVSRTLLLVQS(SEQ ID NO：99)；(u)NDUFC2，其中A_xB_yC_z係(i)LPPPKLTDPRLLYIGFLGYCSGLIDNLIRRRPIATAGLHRQLLYITAFFFCWILSCKT(SEQ ID NO：100)或(ii)SLPPPKLTDPRLLYIGFLGYCSGLIDNLIRRRPIATAGLHRQLLYITAFFLLDIIL(SEQ ID NO：101)；(v)RBM27，其中A_xB_yC_z係

(SEQ ID NO：102)；(w)RPL22，其中A_xB_yC_z係(i)MAPVKKLVVKGGKKKEASSEVHS(SEQ ID NO：103)或 (ii)MAPVKKLVVKGGKKRSKF(SEQ ID NO：104)；(x)SEC31A，其中A_xB_yC_z係(i)MPSHQGAEQQQQQHHVFISQVVTEKEFLSRSDQLQQAVQSQGFINYCQKKN(SEQ ID NO：105)或(ii)MPSHQGAEQQQQQHHVFISQVVTEKEFLSRSDQLQQAVQSQGFINYCQKKLMLLRLNLRKMCGPF(SEQ ID NO：106)；(y)SEC63，其中A_xB_yC_z係(i)AEVFEKEQSICAAEEQPAEDGQGETNKNRTKGGWQQKSKGPKKTAKSKKKETFKKKTYTCAITTVKATETKAGKWSRWE(SEQ ID NO：107)或(ii)MAEVFEKEQSICAAEEQPAEDGQGETNKNRTKGGWQQKSKGPKKTAKSKKRNL(SEQ ID NO：108)；(z)SLC35F5，其中A_xB_yC_z係NIMEIRQLPSSHALEAKLSRMSYPVKEQESILKTVGKLTATQVAKISFFFALCGFWQICHIKKHFQTHKLL(SEQ ID NO：109)；(aa)SMAP1，其中A_xB_yC_z係(i)YEKKKYYDKNAIAITNISSSDAPLQPLVSSPSLQAAVDKNKLEKEKEKKKGREKERKGARKAGKTTYS(SEQ ID NO：110)或(ii)

(SEQ ID NO：111)；(bb)TFAM，其中A_xB_yC_z係(i)IYQDAYRAEWQVYKEEISRFKEQLTPSQIMSLEKEIMDKHLKRKAMTKKKRVNTAWKTKKTSFSL(SEQ ID NO：112)或(ii)IYQDAYRAEWQVYKEEISRFKEQLTPSQIMSLEKEIMDKHLKRKAMT KKKS(SEQ ID NO：113)；(cc)TGFBR2，其中A_xB_yC_z係(i)KPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKAW(SEQ ID NO：114)或(ii)EKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKSLVRLSSCVPVALMSAMTTSSSQKNITPAILTCC(SEQ ID NO：115)；(dd)THAP5，其中A_xB_yC_z係VPSKYQFLCSDHFTPDSLDIRWGIRYLKQTAVPTIFSLPEDNQGKDPSKKNPRRKTWKMRKKYAQKPSQKNHLY(SEQ ID NO：116)；(ee)TTK，其中A_xB_yC_z係GTTEEMKYVLGQLVGLNSPNSILKAAKTLYEHYSGGESHNSSSSKTFEKKGEKNDLQLFVMSDTTYKIYWTVILLNPCGNLHLKTTSL(SEQ ID NO：117)；及(ff)XPOT，其中A_xB_yC_z係QQLIRETLISWLQAQMLNPQPEKTFIRNKAAQVFALLFVTEYLTKWPKFFLTFSQ(SEQ ID NO：118)。

本文提供包含腫瘤特異性新表位之經分離新抗原肽，其中經分離新抗原肽不為天然多肽，其中新表位包含由A_xB_yC_z表示之胺基酸序列之至少8個鄰接胺基酸，其中每一A係對應於第一天然多肽之胺基酸；每一C係對應於第二天然多肽或第一天然多肽之隱藏外顯子或剪接變體之外顯子之胺基酸，每一B係並非對應於第一天然多肽、第二天然多肽或第一天然多肽之隱藏外顯子之胺基酸之胺基酸，且x+y+z為至少8，其中y不存在且至少8個鄰接胺基酸包含至少一個A_x及至少一個C_z或y為至少1且至少8個鄰接胺基酸包含至少一個B_y，其中：(a)第一天然多肽係由BCR基因編碼，第二天然多肽係由ABL基因編碼，且(i)y係0，且A_xB_yC_z係

(SEQ ID NO：119)或(ii)y係1，且A_xB_yC_z係

(SEQ ID NO：120)；(b)第一天然多肽係由C11orf95基因編碼，第二天然多肽係由RELA基因編碼，y為1，且A_xB_yC_z係

(SEQ ID NO：121)；(c)第一天然多肽係由CBFB基因編碼及第二天然多肽係由MYH11基因編碼，y為0，且A_xB_yC_z係

(SEQ ID NO：122)；(d)第一天然多肽係由CD74基因編碼及第二天然多肽係由ROS1基因編碼，y為0，且A_xB_yC_z係

(SEQ ID NO：123)；(e)第一天然多肽係由EGFR基因編碼且第二天然多肽係由(i)SEPT14基因編碼，y為0，且A_xB_yC_z係

(SEQ ID NO：124)；或(ii)EGFR基因，y為1，且A_xB_yC_z係MRPSGTAGAALLALLAALCPASRALEEKKGNYVVTDHGSCVRACGA DSYEMEEDGVRKCKKCEGPCRKVCNGIGIGEFKD(SEQ ID NO：125)；(f)第一天然多肽係由EML4基因編碼，第二天然多肽係由ALK基因編碼，y為1，且A_xB_yC_z係

(SEQ ID NO：126)(g)第一天然多肽係由FGFR3基因編碼，第二天然多肽係由TACC3基因編碼，y為0，且A_xB_yC_z係

(SEQ ID NO：127),(h)第一天然多肽係由NAB基因編碼，第二天然多肽係由STAT6基因編碼，y為至少1，且A_xB_yC_z係

(SEQ ID NO：128)；(i)第二天然多肽係由ERG編碼，y為0，及(i)第一天然多肽係由NDRG1基因編碼，且A_xB_yC_z係MSREMQDVDLAEVKPLVEKGETITGLLQEFDVQEALSVVSEDQSLFECAYGTPHLAKTEMTASSSSDYGQTSKMSPRVPQQDW(SEQ ID NO：129)或(ii)第一天然多肽係由TMPRSS2基因編碼，且A_xB_yC_z係MALNSEALSVVSEDQSLFECAYGTPHLAKTEMTASSSSDYGQTSKMSPRVPQQDW(SEQ ID NO：130)；(j)第一天然多肽係由PML基因編碼，第二天然多肽係由RARA基因編碼，y為1，且A_xB_yC_z係(i)

(SEQ ID NO：131)或(ii)

(SEQ ID NO：132)；(k)第一天然多肽係由RUNX1基因編碼，第二天然多肽係由CBFA2T1(RUNX1T1)基因編碼，y為1，且A_xB_yC_z係

(SEQ ID NO：133)；(l)第一天然多肽係由AR-v7基因編碼，隱藏外顯子或剪接變體之外顯子係由AR-v7基因編碼，y為0，且A_xB_yC_z係SCKVFFKRAAEGKQKYLCASRNDCTIDKFRRKNCPSCRLRKCYEAGMTLGEKFRVGNCKHLKMTRP(SEQ ID NO：134)。

本文提供包含腫瘤特異性新表位之經分離新抗原肽，其中經分離新抗原肽不為天然多肽，其中新表位包含由A_xB_yC_z表示之胺基酸序列之至少8個鄰接胺基酸，其中每一A係對應於第一天然多肽之胺基酸；每一B係並非對應於第一天然多肽或第二天然多肽之胺基酸之胺基酸，每一C係由編碼第二天然多肽之序列之框移編碼之胺基酸；x+y+z為至少8，其中y不存在且至少8個鄰接胺基酸包含至少一個C_z，或y為至少1且至少8個鄰接胺基酸包含至少一個B_y及/或至少一個C_z；及(a)第一天然多肽係由AC011997.1基因編碼，第二天然多肽係由LRRC69基因編碼，y為1，且A_xB_yC_z係MAGAPPPASLPPCSLISDCCASNQRDSVGVGPSEPGNNIKICNESASRK(SEQ ID NO：135)(b)第一天然多肽係由EEF1DP3基因編碼，第二天然多肽係由FRY基因編碼，y為1，且A_xB_yC_z係 HGWRPFLPVRARSRWNRRLDVTVANGRSWKYGWSLLRVPQVNGIQVLNVSLKSSSNVISY(SEQ ID NO：136),(c)第一天然多肽係由MAD1L1基因編碼，第二天然多肽係由MAFK基因編碼，y為0，且A_xB_yC_z係RLKEVFQTKIQEFRKACYTLTGYQIDITTENQYRLTSLYAEHPGDCLIFKLRVPGSSVLVTVPGL(SEQ ID NO：137)或(d)第一天然多肽係由PPP1R1B基因編碼，第二天然多肽係由STARD3基因編碼，y為1，且A_xB_yC_z係

(SEQ ID NO：138)。

在實施例中，經分離新抗原肽包含根據表1之序列。在實施例中，x+y+z為至多500、至多250、至多150、至多125或至多100。在實施例中，x+y+z為至少8、至少50、至少100、至少200或至少300。在實施例中，z為至多500、至多250、至多150、至多125或至多100。在實施例中，z為至少8、至少50、至少100、至少200或至少300。在實施例中，經分離新抗原肽之長度為約8至約500個胺基酸。在實施例中，經分離新抗原肽之長度為約8至約100個胺基酸。在實施例中，經分離新抗原肽之長度為約8至約50個胺基酸。在實施例中，經分離新抗原肽之長度為約15至約35個胺基酸。在實施例中，經分離新抗原肽之長度為約8至約15個胺基酸。在實施例中，經分離新抗原肽之長度為約8至約11個胺基酸。在實施例中，經分離新抗原肽之長度為9或10個胺基酸。在實施例中，經分離新抗原肽結合I類主要組織相容性複合體(MHC)。在實施例中，經分離新抗原肽結合I類MHC，且結合親和力為約500nM或更小。在實施例中，經分 離新抗原肽結合I類MHC，且結合親和力為約250nM或更小。在實施例中，經分離新抗原肽結合I類MHC，且結合親和力為約50nM或更小。在實施例中，經分離新抗原肽之長度為約8至約30個胺基酸。在實施例中，經分離新抗原肽之長度為約8至約25個胺基酸。在實施例中，經分離新抗原肽之長度為約15至約24胺基酸。在實施例中，經分離新抗原肽之長度為約9至約15個胺基酸。在實施例中，經分離新抗原肽結合II類MHC。在實施例中，經分離新抗原肽結合II類MHC，且結合親和力為1000nM或更小。在實施例中，經分離新抗原肽結合I類MHC，且結合親和力為約500nM或更小。在實施例中，經分離新抗原肽進一步包含側翼胺基酸。在實施例中，側翼胺基酸不為天然側翼胺基酸。在實施例中，經分離新抗原肽之總長度為至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少27、至少28、至少29、至少30、至少40、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少150、至少200、至少250、至少300、至少350、至少400、至少450或至少500個胺基酸。在實施例中，經分離新抗原肽之總長度為至多8、至多9、至多10、至多11、至多12、至多13、至多14、至多15、至多16、至多17、至多18、至多19、至多20、至多21、至多22、至多23、至多24、至多25、至多26、至多27、至多28、至多29、至多30、至多40、至多50、至多60、至多70、至多80、至多90、至多100、至多150、至多200、至多250、至多300、至多350、至多400、至多450或至多500個胺基酸。在實施例中，經分離新抗原肽係連接至至少第二新抗原肽之第一新抗原肽。在實施例中，經分離新抗原肽係藉由聚-甘胺酸或聚-絲胺酸 連接體連接至至少第二新抗原肽。在實施例中，第二新抗原肽結合I類或II類MHC，且結合親和力小於約1000nM。在實施例中，第二新抗原肽結合I類或II類MHC，且結合親和力小於約500nM。在實施例中，經分離新抗原肽且第二新抗原肽結合至人類白血球抗原(HLA)-A、-B、-C、-DP、-DQ或-DR。在實施例中，經分離新抗原肽結合I類HLA且第二新抗原肽結合II類HLA。在實施例中，經分離新抗原肽結合II類HLA且第二新抗原肽結合I類HLA。在實施例中，經分離新抗原肽進一步包含增加活體內半衰期、細胞靶向、抗原攝取、抗原處理、MHC親和力、MHC穩定性、抗原呈遞或其組合之修飾。在實施例中，修飾係偶聯至載體蛋白、偶聯至配體、偶聯至抗體、聚乙二醇化、聚唾液酸化羥乙基澱粉化、重組體PEG模擬物、Fc融合、白蛋白融合、奈米粒子附接、奈米微粒囊封、膽固醇融合、鐵融合、醯化、醯胺化、醣基化、側鏈氧化、磷酸化、生物素化、添加表面活性材料、添加胺基酸模擬物或添加非天然胺基酸。在實施例中，經分離新抗原肽進一步包含增加對抗原呈遞細胞之細胞靶向之修飾。在實施例中，抗原呈遞細胞係樹突細胞。在實施例中，樹突細胞係使用以下來靶向：DEC205、XCR1、CD197、CD80、CD86、CD123、CD209、CD273、CD283、CD289、CD184、CD85h、CD85j、CD85k、CD85d、CD85g、CD85a、CD141、CD11c、CD83、TSLP受體、Clec9a或CD1a標記物。在實施例中，樹突細胞係使用以下來靶向：CD141、DEC205、Clec9a或XCR1標記物。在實施例中，樹突細胞係自體細胞。在實施例中，樹突細胞中之一或多者係結合至T細胞。在實施例中，T細胞係自體T細胞。在實施例中，經分離新抗原肽不為表2中列示之經分離新抗原肽。在實施例中，經分離新抗原肽係連接至表1或2中列示之至少一 種其他新抗原肽。

本文提供包含本文所闡述之經分離新抗原肽之活體內遞送系統。在實施例中，遞送系統包括細胞穿透肽、奈米微粒囊封、類病毒顆粒、脂質體或其任一組合。在實施例中，細胞穿透肽係TAT肽、單純皰疹病毒VP22、轉運素、Antp或其任一組合。

本文提供包含本文所闡述之經分離新抗原肽之細胞。在實施例中，該細胞係抗原呈遞細胞。在實施例中，該細胞係樹突細胞。在實施例中，該細胞係自體細胞。在實施例中，該細胞係結合至T細胞。在實施例中，T細胞係自體T細胞。

本文提供包含本文所闡述之經分離新抗原肽之組合物。

在實施例中，組合物包含至少2種、至少3種、至少4種、至少5種、至少6種、至少7種、至少8種、至少9種、至少10種、至少11種、至少12種、至少13種、至少14種、至少15種、至少16種、至少17種、至少18種、至少19種、至少20種、至少21種、至少22種、至少23種、至少24種、至少25種、至少26種、至少27種、至少28種、至少29種、至少30種、至少40種、至少50種、至少60種、至少70種、至少80種、至少90種或至少100種根據表1或2之包含腫瘤特異性新表位之經分離新抗原肽。在實施例中，組合物包含約2至約20種新抗原肽或約2至約30種新抗原肽。在實施例中，新抗原對個別個體之腫瘤具有特異性。在實施例中，組合物進一步包含至少1種、至少2種、至少3種、至少4種、至少5種、至少6種、至少7種、至少8種、至少9種、至少10種、至少11種、至少12種、至少13種、至少14種、至少15種、至少16種、至少17種、至少18種、至少19種、至少20種、至少21種、至少22種、至少23種、至少24或至少25 種、至少26種、至少27種、至少28種、至少29種、至少30種、至少40種、至少50種、至少60種、至少70種、至少80種、至少90種或至少100種其他新抗原肽。在實施例中，組合物包含約4至約20種其他新抗原肽、約4至約30種其他新抗原肽。在實施例中，其他新抗原肽中之至少一者對個別個體之腫瘤具有特異性。在實施例中，個體特異性新抗原肽係藉由鑑別在個體之腫瘤試樣之基因體、外顯子體及/或轉錄體與非腫瘤試樣之基因體、外顯子體及/或轉錄體之間之序列差異來選擇。在實施例中，試樣係新鮮的或福馬林固定的石蠟包埋之腫瘤組織、剛分離之細胞或循環腫瘤細胞。在實施例中，序列差異係藉由次世代定序來測定。

本文提供編碼本文所闡述之經分離新抗原肽之經分離多核苷酸。在實施例中，多核苷酸係DNA。在實施例中，多核苷酸係RNA。在實施例中，RNA係自擴增RNA。在實施例中，RNA經修飾以增加穩定性、增加細胞靶向、增加轉譯效率、佐劑性、胞質液可及性及/或降低細胞毒性。在實施例中，修飾係偶聯至載體蛋白、偶聯至配體、偶聯至抗體、密碼子最佳化、增加GC-含量、納入經修飾核苷、納入5'-端帽或端帽類似物及/或納入未遮蔽聚-A序列。

本文提供包含本文所闡述之多核苷酸之細胞。

本文提供包含本文所闡述之多核苷酸之載體。在實施例中，多核苷酸可操作連接至啟動子。在實施例中，載體係自擴增RNA複製子、質體、噬菌體、轉位子、黏粒、病毒或病毒粒子。在實施例中，載體源於腺相關病毒、皰疹病毒、慢病毒屬或其假型。

本文提供包含本文所闡述之經分離多核苷酸之活體內遞送系統。在實施例中，遞送系統包括球形核酸、病毒、類病毒顆粒、質體、細菌質體 或奈米粒子。

本文提供包含本文所闡述之載體或遞送系統之細胞。在實施例中，該細胞係抗原呈遞細胞。在實施例中，該細胞係樹突細胞。在實施例中，該細胞係不成熟樹突細胞。

本文提供包含至少一種本文所闡述之多核苷酸之組合物。在實施例中，組合物包含至少2種、至少3種、至少4種、至少5種、至少6種、至少7種、至少8種、至少9種、至少10種、至少11種、至少12種、至少13種、至少14種、至少15種、至少16種、至少17種、至少18種、至少19種、至少20種、至少21種、至少22種、至少23種、至少24種、至少25種、至少26種、至少27種、至少28種、至少29種、至少30種、至少40種、至少50種、至少60種、至少70種、至少80種、至少90種或至少100種經分離多核苷酸。在實施例中，組合物包含約2種至約20種經分離多核苷酸或約2種至約30種經分離多核苷酸。在實施例中，新抗原肽係由包含經分離多核苷酸中之一或多者之載體編碼。在實施例中，組合物進一步包含至少1種、至少2種、至少3種、至少4種、至少5種、至少6種、至少7種、至少8種、至少9種、至少10種、至少11種、至少12種、至少13種、至少14種、至少15種、至少16種、至少17種、至少18種、至少19種、至少20種、至少21種、至少22種、至少23種、至少24種、至少25種、至少26種、至少27種、至少28種、至少29種、至少30種、至少40種、至少50種、至少60種、至少70種、至少80種、至少90種或至少100種編碼其他新抗原肽之其他新抗原多核苷酸。在實施例中，其他新抗原肽中之一或多者係由包含其他新抗原多核苷酸中之一或多者之載體編碼。在實施例中，組合物包含約4至約20種其他新抗原多核苷酸或約4至約30種其他新抗原多核苷酸。在 實施例中，經分離多核苷酸及其他新抗原多核苷酸係連接的。在實施例中，多核苷酸係使用編碼聚-甘胺酸或聚-絲胺酸連接體之核酸連接。在實施例中，其他新抗原肽中之至少一者對個別個體之腫瘤具有特異性。在實施例中，個體特異性新抗原肽係藉由鑑別在個體之腫瘤試樣之基因體、外顯子體及/或轉錄體與非腫瘤試樣之基因體、外顯子體及/或轉錄體之間之序列差異來選擇。在實施例中，試樣係新鮮的或福馬林固定的石蠟包埋之腫瘤組織、剛分離之細胞或循環腫瘤細胞。在實施例中，序列差異係藉由次世代定序來測定。

本文提供能結合至少一種本文所述新抗原肽或包含至少一種本文所述新抗原肽之MHC-肽複合體之T細胞受體(TCR)。在實施例中，MHC-肽之MHC係I類或II類MHC。在實施例中，TCR係進一步包含包括能結合抗原之抗體或抗體片段之結構域之雙特異性TCR。在實施例中，抗原係T細胞特異性抗原。在實施例中，抗原係CD3。在實施例中，抗體或抗體片段係抗CD3 scFv。

本文提供包含以下之嵌合抗原受體：(i)T細胞活化分子；(ii)跨膜區；及(iii)抗原識別部分，其能結合至少一種本文所述新抗原肽或包含至少一種本文所述新抗原肽之MHC-肽複合體。在實施例中，CD3-ζ係T細胞活化分子。在實施例中，嵌合抗原受體進一步包含至少一個共刺激信號傳導結構域。在實施例中，信號傳導結構域係CD28、4-1BB、ICOS、OX40、ITAM或Fc ε RI-γ。在實施例中，在I類或II類MHC之情形下抗原識別部分能結合經分離新抗原肽。在實施例中，CD3-ζ、CD28、CTLA-4、ICOS、BTLA、KIR、LAG3、CD137、OX40、CD27、CD40L、Tim-3、A2aR或PD-1跨膜區。在實施例中，新抗原肽位於腫瘤相關多肽 之細胞外結構域中。在實施例中，MHC-肽之MHC係I類或II類MHC。

本文提供包含本文所闡述之T細胞受體或嵌合抗原受體之T細胞，視情況其中T細胞係輔助T細胞或細胞毒性T細胞。在實施例中，T細胞係個體之T細胞。

本文提供包含能結合至少一種本文所述新抗原肽或包含至少一種本文所述新抗原肽之MHC-肽複合體之T細胞受體(TCR)的T細胞，其中T細胞係自個體之T細胞群分離之T細胞，該T細胞群已與抗原呈遞細胞及至少一種本文所述新抗原肽中之一或多者一起培育足以活化T細胞之時間。在實施例中，T細胞係CD8+ T細胞、輔助T細胞或細胞毒性T細胞。在實施例中，來自個體之T細胞群係來自該個體之CD8+ T細胞群。在實施例中，至少一種本文所述新抗原肽中之一或多者係個體特異性新抗原肽。在實施例中，個體特異性新抗原肽具有不同的腫瘤新表位，該腫瘤新表位係對個體之腫瘤具有特異性之表位。在實施例中，個體特異性新抗原肽係個體之非腫瘤試樣中不存在之腫瘤特異性非沉默突變之表現產物。在實施例中，個體特異性新抗原肽結合至個體之HLA蛋白。在實施例中，個體特異性新抗原肽以小於500nM之IC₅₀結合至個體之HLA蛋白。在實施例中，經活化CD8+ T細胞與抗原呈遞細胞係分開的。在實施例中，抗原呈遞細胞係樹突細胞或CD40L-擴增之B細胞。在實施例中，抗原呈遞細胞係未轉變之細胞。在實施例中，抗原呈遞細胞係未經感染之細胞。在實施例中，抗原呈遞細胞係自體細胞。在實施例中，抗原呈遞細胞已經處理以自其表面剝離內源性MHC相關肽。在實施例中，剝離內源性MHC相關肽之處理包含在約26℃下培養細胞。在實施例中，剝離內源性MHC相關肽之處理包含用弱酸溶液處理細胞。在實施例中，抗原呈遞細胞已經至少一種 本文所述新抗原肽脈衝。在實施例中，脈衝包含在至少約2μg/ml之至少一種本文所述新抗原肽中之每一者存在下培育抗原呈遞細胞。在實施例中，經分離T細胞對抗原呈遞細胞之比率在約30：1與300：1之間。在實施例中，經分離T細胞群之培育係在IL-2及IL-7存在下進行。在實施例中，MHC-肽之MHC係I類或II類MHC。

本文提供活化腫瘤特異性T細胞之方法，其包含：自個體分離T細胞群；及將經分離T細胞群與抗原呈遞細胞及至少一種本文所述新抗原肽一起培育足以活化T細胞之時間。在實施例中，T細胞係CD8+ T細胞、輔助T細胞或細胞毒性T細胞。在實施例中，來自個體之T細胞群係來自該個體之CD8+ T細胞群。在實施例中，至少一種本文所述新抗原肽中之一或多者係個體特異性新抗原肽。在實施例中，個體特異性新抗原肽具有不同的腫瘤新表位，該腫瘤新表位係對個體之腫瘤具有特異性之表位。在實施例中，個體特異性新抗原肽係個體之非腫瘤試樣中不存在之腫瘤特異性非沉默突變之表現產物。在實施例中，個體特異性新抗原肽結合至個體之HLA蛋白。在實施例中，個體特異性新抗原肽以小於500nM之IC₅₀結合至個體之HLA蛋白。在實施例中，該方法進一步包含將經活化T細胞與抗原呈遞細胞分離。在實施例中，該方法進一步包含測試經活化T細胞以證實針對本文所述新抗原肽中之至少一者之反應性。在實施例中，抗原呈遞細胞係樹突細胞或CD40L-擴增之B細胞。在實施例中，抗原呈遞細胞係未轉變之細胞。在實施例中，抗原呈遞細胞係未經感染之細胞。在實施例中，抗原呈遞細胞係自體細胞。在實施例中，抗原呈遞細胞已經處理以自其表面剝離內源性MHC相關肽。在實施例中，剝離內源性MHC相關肽之處理包含在約26℃下培養細胞。在實施例中，剝離內源性MHC相關肽之處理 包含用若酸溶液處理細胞。在實施例中，抗原呈遞細胞已經至少一種本文所述新抗原肽脈衝。在實施例中，脈衝包含在至少約2μg/ml之至少一種本文所述新抗原肽中之每一者存在下培育抗原呈遞細胞。在實施例中，經分離T細胞對抗原呈遞細胞之比率在約30：1與300：1之間。在實施例中，經分離T細胞群之培育係在IL-2及IL-7存在下進行。在實施例中，MHC-肽之MHC係I類或II類MHC。

本文提供之組合物包含藉由本文所述方法產生之經活化腫瘤特異性T細胞。

本文提供治療個體之癌症之方法，其包含向個體投與治療有效量之本文所闡述或藉由本文所述方法產生之經活化腫瘤特異性T細胞。在實施例中，投與包含投與約10⁶至10¹²、約10⁸至10¹¹或約10⁹至10¹⁰個經活化腫瘤特異性T細胞。

本文提供包含可操作連接至編碼本文所述T細胞受體之多核苷酸之啟動子之核酸。在實施例中，在I類或II類主要組織相容性複合體(MHC)之情形下TCR能結合至少一種新抗原肽。

本文提供包含可操作連接至編碼本文所述嵌合抗原受體之多核苷酸之啟動子之核酸。在實施例中，在I類或II類主要組織相容性複合體(MHC)之情形下抗原識別部分能結合至少一種新抗原肽。在實施例中，新抗原肽位於腫瘤相關多肽之細胞外結構域中。在實施例中，核酸包含CD3-ζ、CD28、CTLA-4、ICOS、BTLA、KIR、LAG3、CD137、OX40、CD27、CD40L、Tim-3、A2aR或PD-1跨膜區。

本文提供能結合至少一種本文所述新抗原肽或包含至少一種本文所述新抗原肽之MHC-肽複合體之抗體或抗體片段，視情況其中該抗體片段 係雙特異性T細胞銜接器(BiTE)。在實施例中，抗體或抗體片段結合至至少一種新抗原肽之細胞外部分。在實施例中，天然多肽係由選自由以下組成之群之基因編碼：β2M，其中C_z係RMERELKKWSIQTCLSARTGLSISCTTLNSPPLKKMSMPAV(SEQ ID NO：53)或LCSRYSLFLAWRLSSVLQRFRFTHVIQQRMESQIS；EGFR(SEQ ID NO：54)，其中A_xB_yC_z係

(SEQ ID NO：12)；BTK，其中A_xB_yC_z係

(SEQ ID NO：9)；或ESR1，其中A_xB_yC_z係

(SEQ ID NO：14)、

(SEQ ID NO：15)、

(SEQ ID NO：16)、

(SEQ ID NO：17)或

(SEQ ID NO：18)；或HER2，其中A_xB_yC_z係

(SEQ ID NO：139)。在實施例中，抗體或抗體片段係雙特異性抗體或抗體片段。在實施例中，雙特異性抗體或抗體片段之一個抗原結合結構域係抗CD3結合結構域。

本文提供經本文所述核酸轉染或轉導之經修飾細胞。在實施例中，經修飾細胞係T細胞、腫瘤浸潤淋巴球、NK-T細胞、TCR表現細胞、CD4+ T細胞、CD8+ T細胞或NK細胞。

本文提供包含本文所闡述之T細胞受體或嵌合抗原受體之組合物。

本文提供包含含有本文所闡述之T細胞受體或嵌合抗原受體之自體個體T細胞之組合物。在實施例中，組合物進一步包含免疫檢查點抑制劑。在實施例中，組合物進一步包含至少兩種免疫檢查點抑制劑。在實施例中，免疫檢查點抑制劑中之每一者抑制選自由以下組成之群之檢查點蛋白：CTLA-4、PDL1、PDL2、PD1、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、TIM3、GAL9、LAG3、VISTA、KIR、2B4、CD160、CGEN-15049、CHK 1、CHK2、A2aR及B-7家族配體或其組合。在實施例中，免疫檢查點抑制劑中之每一者與選自由以下組成之群之檢查點蛋白之配體相互作用：CTLA-4、PDL1、PDL2、PD1、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、TIM3、GAL9、LAG3、VISTA、KIR、2B4、CD160、CGEN-15049、 CHK 1、CHK2、A2aR及B-7家族配體或其組合。在實施例中，T細胞係PD-1及/或CTLA4剔除T細胞，視情況其中PD-1及/或CTLA4剔除T細胞係使用CRISPR系統產生的。在實施例中，組合物進一步包含免疫調節劑或佐劑。在實施例中，免疫調節劑係共刺激配體、TNF配體、Ig超家族配體、CD28、CD80、CD86、ICOS、CD40L、OX40、CD27、GITR、CD30、DR3、CD69或4-1BB。在實施例中，免疫調節劑係至少一種癌細胞或癌細胞提取物。在實施例中，癌細胞對需要組合物之個體係自體細胞。在實施例中，癌細胞已進行溶解或已暴露於UV輻射。在實施例中，該組合物進一步包含佐劑。在實施例中，佐劑係選自由以下組成之群：聚(I：C)、聚-ICLC、STING激動劑、1018 ISS、鋁鹽、阿普利瓦(Amplivax)、AS15、BCG、CP-870,893、CpG7909、CyaA、dSLIM、GM-CSF、IC30、IC31、咪喹莫特(Imiquimod)、ImuFact IMP321、IS Patch、ISS、ISCOMATRIX、JuvImmune、LipoVac、MF59、單磷醯脂質A、Montanide IMS 1312 VG、Montanide ISA 206 VG、Montanide ISA 50 V2、Montanide ISA 51 VG、OK-432、OM-174、OM-197-MP-EC、ISA-TLR2激動劑、ONTAK、PepTel®載體系統、PLG微粒、雷西莫特(resiquimod)、SRL172、病毒體及其他類病毒顆粒、YF-17D、VEGF阱、R848、β-葡聚糖、Pam3Cys、Pam3CSK4、丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物、馬來酸酐之共聚物及QS21刺激子。在實施例中，該組合物在投與個體時誘導體液性反應。在實施例中，該組合物在投與個體時誘導1型T輔助細胞。

本文提供抑制表現腫瘤特異性新表位之腫瘤細胞之生長之方法，其包含使腫瘤細胞與本文所闡述之肽、多核苷酸、遞送系統、載體、組合 物、抗體或細胞接觸。

本文提供預防個體之方法，其包含使個體之細胞與本文所闡述之肽、多核苷酸、遞送系統、載體、組合物、抗體或細胞接觸。在實施例中，天然多肽係由選自由以下組成之群之基因編碼：β2M，其中C_z係RMERELKKWSIQTCLSARTGLSISCTTLNSPPLKKMSMPAV(SEQ ID NO：53)或LCSRYSLFLAWRLSSVLQRFRFTHVIQQRMESQIS(SEQ ID NO：54)；EGFR，其中A_xB_yC_z係

(SEQ ID NO：12)；BTK，其中A_xB_yC_z係

(SEQ ID NO：9)；或ESR1，其中A_xB_yC_z係

(SEQ ID NO：14)、

(SEQ ID NO：15)、

(SEQ ID NO：16)、

(SEQ ID NO：17)或

(SEQ ID NO：18)；及HER2，其中A_xB_yC_z係

(SEQ ID NO：139)。

本文提供在有需要之個體中治療癌症或發動、增強或延長抗腫瘤反應之方法，其包含向個體投與本文所闡述之肽、多核苷酸、載體、組合物、抗體或細胞。在實施例中，個體係人類。在實施例中，個體患有癌症。在實施例中，癌症係選自由以下組成之群：泌尿生殖癌症、婦科癌症、肺、胃腸、頭頸癌、惡性神經膠母細胞瘤、惡性間皮瘤、非轉移或轉移乳癌、惡性黑色素瘤、默克爾細胞癌(Merkel Cell Carcinoma)或骨與軟組織肉瘤、血液性贅瘤形成、多發性骨髓瘤、急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、骨髓發育不良症候群及急性淋巴母細胞性白血病、非小細胞肺癌(NSCLC)、乳癌、轉移結腸直腸癌、激素敏感性或激素抵抗性前列腺癌、結腸直腸癌、卵巢癌、肝細胞癌、腎細胞癌、胰臟癌、胃癌、食道癌、肝細胞癌、膽管細胞癌、頭頸鱗狀細胞癌軟組織肉瘤及小細胞肺癌。在實施例中，本文所闡述之肽、多核苷酸、載體、組合物、抗體或細胞用於治療根據表1或表2之相應癌症。在實施例中，本文所闡述之肽、多核苷酸、載體、組合物、抗體或細胞用於治療具有HLA類型之個體，該HLA類型係根據表1或表2之相應HLA類型。在實施例中，個體已進行腫瘤之 手術移除。在實施例中，肽、多核苷酸、載體、組合物或細胞係經由靜脈內、腹膜內、腫瘤內、真皮內或皮下投與來投與。在實施例中，肽、多核苷酸、載體、組合物或細胞係投與會匯流至淋巴結池中之解剖位置處。在實施例中，投與多個淋巴結池中。在實施例中，投與係藉由皮下或真皮內途徑進行。在實施例中，投與肽。在實施例中，投與係腫瘤內投與。在實施例中，投與多核苷酸、視情況RNA。在實施例中，多核苷酸係以靜脈內方式投與。在實施例中，細胞係T細胞或樹突細胞。在實施例中，肽或多核苷酸包含抗原呈遞細胞靶向部分。在實施例中，該細胞係自體細胞。在實施例中，方法進一步包含向個體投與至少一種免疫檢查點抑制劑。在實施例中，檢查點抑制劑係生物治療劑或小分子。在實施例中，檢查點抑制劑係選自由以下組成之群：單株抗體、人類化抗體、全人類抗體及融合蛋白或其組合。在實施例中，檢查點抑制劑係PD-1抗體或PD-L1抗體。在實施例中，檢查點抑制劑係選自由以下組成之群：伊匹單抗(ipilimumab)、曲美目單抗(tremelimumab)、尼沃魯單抗(nivolumab)、阿維魯單抗(avelumab)、德瓦魯單抗(durvalumab)、阿替珠單抗(atezolizumab)、派姆單抗(pembrolizumab)及其任何組合。在實施例中，檢查點抑制劑抑制選自由以下組成之群之檢查點蛋白：CTLA-4、PDL1、PDL2、PD1、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、TIM3、GAL9、LAG3、VISTA、KIR、2B4、CD160、CGEN-15049、CHK 1、CHK2、A2aR及B-7家族配體及其任何組合。在實施例中，檢查點抑制劑與選自由以下組成之群之檢查點蛋白之配體相互作用：CTLA-4、PDL1、PDL2、PD1、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、TIM3、GAL9、LAG3、VISTA、KIR、2B4、CD160、CGEN-15049、CHK 1、CHK2、A2aR及 B-7家族配體或其組合。在實施例中，投與兩種或更多種檢查點抑制劑。在實施例中，該兩種或更多種檢查點抑制劑中之至少一者係PD-1抗體或PD-L1抗體。在實施例中，該兩種或更多種檢查點抑制劑中之至少一者係選自由以下組成之群：伊匹單抗、曲美目單抗、尼沃魯單抗、阿維魯單抗、德瓦魯單抗、阿替珠單抗及派姆單抗。在實施例中，檢查點抑制劑及組合物係同時或以任一順序依序投與。在實施例中，肽、多核苷酸、載體、組合物或細胞係在檢查點抑制劑之前投與。在實施例中，肽、多核苷酸、載體、組合物或細胞係在檢查點抑制劑之後投與。在實施例中，檢查點抑制劑之投與在新抗原肽、多核苷酸、載體、組合物或細胞療法中始終持續。在實施例中，新抗原肽、多核苷酸、載體、組合物或細胞療法係投與對檢查點抑制劑療法僅部分反應或不反應之個體。在實施例中，該組合係以靜脈內或皮下方式投與。在實施例中，檢查點抑制劑係以靜脈內或皮下方式投與。在實施例中，檢查點抑制劑係在組合物投與位置處約2cm內以皮下方式投與。在實施例中，組合物係投與與檢查點抑制劑相同之匯流淋巴結。在實施例中，該方法進一步包含在用肽、多核苷酸、載體、組合物或細胞治療之前、同時或之後向個體投與另一治療劑。在實施例中，另一藥劑係化學治療劑、免疫調節藥物、免疫代謝改良藥物、靶向療法、輻射抗血管生成劑或降低免疫抑制之藥劑。在實施例中，化學治療劑係烷基化劑、拓樸異構酶抑制劑、抗代謝物或抗有絲分裂劑。在實施例中，另一藥劑係抗糖皮質激素誘導之腫瘤壞死因子家族受體(GITR)激動性抗體或抗體片段、依魯替尼(ibrutinib)、多西他賽(docetaxeol)、順鉑(cisplatin)、CD40激動性抗體或抗體片段、IDO抑制劑或環磷醯胺。在實施例中，該方法引發CD4+ T細胞免疫反應或CD8+ T細胞免疫反應。在實 施例中，該方法引發CD4+ T細胞免疫反應及CD8+ T細胞免疫反應。

本文提供刺激個體之免疫反應之方法，其包含投與有效量之本文所闡述之經修飾細胞或組合物。在實施例中，免疫反應具有細胞毒性及/或體液性免疫反應。在實施例中，該方法刺激個體之T細胞調介之免疫反應。在實施例中，T細胞調介之免疫反應係對抗靶細胞。在實施例中，靶細胞係腫瘤細胞。在實施例中，經修飾細胞係在活體內經轉染或轉導。在實施例中，經修飾細胞係離體經轉染或轉導。在實施例中，經修飾細胞係自體個體T細胞。在實施例中，自體個體T細胞係自接受新抗原肽或核酸疫苗個體之獲得。在實施例中，新抗原肽或核酸疫苗包含至少一種個人化新抗原。在實施例中，新抗原肽或核酸疫苗包含於表1或2中列示之至少一種其他新抗原肽。在實施例中，個體在接受新抗原肽或核酸疫苗之前及/或期間接受化學治療劑、免疫調節藥物、免疫代謝改良藥物、靶向療法或輻射。在實施例中，個體接受至少一種檢查點抑制劑之治療。在實施例中，自體T細胞係自已接受至少一輪含有新抗原之T細胞療法之個體獲得。在實施例中，該方法進一步包含過繼性T細胞療法。在實施例中，過繼性T細胞療法包含自體T細胞。在實施例中，自體T細胞係靶向腫瘤抗原。在實施例中，過繼性T細胞療法進一步包含同種異體T細胞。在實施例中，同種異體T細胞係靶向腫瘤抗原。在實施例中，過繼性T細胞療法係在檢查點抑制劑之前、在其之後或與其同時投與。

本文提供評估本文所述細胞中之任一者之效能之方法，其包含：(i)在投與經修飾細胞之前量測自個體獲得之第一試樣中靶細胞之數量或濃度、(ii)在投與經修飾細胞之後量測自個體獲得之第二試樣中靶細胞之數量或濃度，及(iii)確定與第一試樣中之靶細胞之數量或濃度相比，第二試 樣中靶細胞之數量或濃度之增加或降低。在實施例中，治療效能係藉由監測以下各項來測定：臨床結果；T細胞對抗腫瘤活性之增加、增強或延長；與治療前之數量相比，抗腫瘤T細胞或經活化T細胞之數量增加；B細胞活性；CD4+ T細胞活性；或其組合。在實施例中，治療效能係藉由監測生物標記來測定。在實施例中，生物標記係選自由以下組成之群：CEA、Her-2/neu、膀胱腫瘤抗原、甲狀腺球蛋白、α-胎兒蛋白、PSA、CA 125、CA19.9、CA 15.3、瘦素、泌乳素、骨橋蛋白、IGF-II、CD98、肌成束蛋白、sPIgR、14-3-3 η、肌鈣蛋白I、循環腫瘤細胞RNA或DNA及b型利鈉肽。在實施例中，臨床結果係選自由以下組成之群：腫瘤消退；腫瘤縮小；腫瘤壞死；由免疫系統引起之抗腫瘤反應；腫瘤擴增、復發或擴散；或其組合。在實施例中，治療效應係藉由T細胞之存在或藉由指示T細胞發炎之基因印記之存在或其組合來預測。

本文提供在有需要之個體中治療癌症或發動、增強或延長抗腫瘤反應之方法，其包含向個體投與：本文所闡述之肽、多核苷酸、載體、組合物、抗體或細胞；及至少一種檢查點抑制劑。在實施例中，該方法進一步包含投與免疫調節劑或佐劑。在實施例中，免疫調節劑或佐劑係選自由以下組成之群：聚(I：C)、聚-ICLC、STING激動劑、1018 ISS、鋁鹽、阿普利瓦、AS15、BCG、CP-870,893、CpG7909、CyaA、dSLIM、GM-CSF、IC30、IC31、咪喹莫特、ImuFact IMP321、IS Patch、ISS、ISCOMATRIX、JuvImmune、LipoVac、MF59、單磷醯脂質A、Montanide IMS 1312 VG、Montanide ISA 206 VG、Montanide ISA 50 V2、Montanide ISA 51 VG、OK-432、OM-174、OM-197-MP-EC、ISA-TLR2激動劑、ONTAK、PepTel®載體系統、PLG微粒、雷西莫特、 SRL172、病毒體及其他類病毒顆粒、YF-17D、VEGF阱、R848、β-葡聚糖、Pam3Cys、Pam3CSK4、丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物、馬來酸酐之共聚物及QS21刺激子共刺激配體、TNF配體、Ig超家族配體、CD28、CD80、CD86、ICOS、CD40L、OX40、CD27、GITR、CD30、DR3、CD69或4-1BB。在實施例中，免疫調節劑或佐劑係聚-ICLC。在實施例中，檢查點抑制劑係抗PD1抗體或抗體片段。在實施例中，抗PD1抗體或抗體片段係尼沃魯單抗或派姆單抗。在實施例中，檢查點抑制劑係抗PD-L1抗體或抗體片段。在實施例中，抗PD-L1抗體或抗體片段係阿維魯單抗、德瓦魯單抗或阿替珠單抗。在實施例中，檢查點抑制劑係抗CTLA4抗體或抗體片段。在實施例中，抗CTLA4抗體係伊匹單抗或曲美目單抗。在實施例中，該方法包含投與抗PD1抗體及抗CTLA4抗體。在實施例中，檢查點抑制劑之投與係在開始投與肽、多核苷酸、載體、組合物、抗體或細胞之前開始。在實施例中，檢查點抑制劑之投與係在開始投與肽、多核苷酸、載體、組合物、抗體或細胞之後開始。在實施例中，檢查點抑制劑之投與係與開始投與肽、多核苷酸、載體、組合物、抗體或細胞同時開始。在實施例中，肽、多核苷酸、載體、組合物、抗體或細胞係以靜脈內或皮下方式投與。在實施例中，檢查點抑制劑係以靜脈內或皮下方式投與。在實施例中，檢查點抑制劑係在肽、多核苷酸、載體、組合物、抗體或細胞之投與位置處約2cm內以皮下方式投與。在實施例中，肽、多核苷酸、載體、組合物、抗體或細胞係投與與檢查點抑制劑相同之匯流淋巴結。

本文提供套組，其包含本文所闡述之肽、多核苷酸、載體、組合物、抗體、細胞或組合物。在實施例中，癌症係選自由以下組成之群：腎 上腺癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、神經膠質母細胞瘤、頭頸癌、腎難染性癌、腎透明細胞癌、乳頭狀腎癌、肝癌、肺腺癌、肺鱗狀細胞癌、卵巢癌、胰臟癌、黑色素瘤、胃癌、子宮體子宮內膜癌及子宮癌肉瘤。在實施例中，癌症係選自由以下組成之群：前列腺癌、膀胱癌、肺鱗狀細胞癌、NSCLC、乳癌、頭頸癌、肺腺癌、GBM、神經膠質瘤、CML、AML、幕上室管膜瘤(supretentorial ependyomas)、急性前骨髓細胞性白血病、單發性纖維瘤及耐克唑替尼(crizotinib)性癌症。在實施例中，癌症係選自由以下組成之群：CRC、頭頸癌、胃癌、肺鱗狀細胞癌、肺腺癌、前列腺癌、膀胱癌、胃癌、腎細胞癌及子宮癌。在實施例中，癌症係選自由以下組成之群：黑色素瘤、肺鱗狀細胞癌、DLBCL、子宮癌、頭頸癌、子宮癌、肝癌及CRC。在實施例中，癌症係選自由以下組成之群：淋巴樣癌；柏基特淋巴瘤、神經胚細胞瘤、前列腺腺癌、結腸直腸腺癌；子宮/子宮內膜腺癌；MSI+；子宮內膜漿液性癌；子宮內膜癌肉瘤-惡性中胚層混合型腫瘤；神經膠質瘤；星細胞瘤；GBM、與MDS相關之急性骨髓樣白血病；慢性淋巴球性白血病-小淋巴球性淋巴瘤；骨髓發育不良症候群；急性骨髓樣白血病；乳房之管腔NS癌；慢性骨髓樣白血病；胰臟之導管癌；慢性骨髓單核球性白血病；骨髓纖維化；骨髓發育不良症候群；前列腺腺癌；原發性血小板增多症；及髓成肌母細胞瘤。在實施例中，癌症選自由以下組成之群：結腸直腸癌、子宮癌、子宮內膜癌及胃癌。在實施例中，癌症係選自由以下組成之群：子宮頸癌、頭頸癌、肛門癌、胃癌、柏基特氏淋巴瘤(Burkitt’s lymphoma)及鼻咽癌。在實施例中，癌症係選自由以下組成之群：膀胱癌、結腸直腸癌及胃癌。在實施例中，癌症係選自由以下組成之群：肺癌、CRC、黑色素瘤、乳癌、 NSCLC及CLL。在實施例中，個體對檢查點抑制劑療法部分地反應或不反應。在實施例中，癌症係選自由以下組成之群：膀胱尿路上皮癌(BLCA)、乳房侵襲性癌(BRCA)、乳癌、子宮頸鱗狀細胞癌及子宮頸內腺癌(CESC)、慢性淋巴球性白血病(CLL)、結腸直腸癌(CRC)、多形性神經膠母細胞瘤(GBM)、頭頸部鱗狀細胞癌(HNSC)、腎乳頭狀細胞癌(KIRP)、肝細胞癌(LIHC)、肺腺癌(LUAD)、肺鱗狀細胞癌(LUSC)、胰臟腺癌(PAAD)、前列腺癌、皮膚黑色素瘤(SKCM)、胃腺癌(STAD)、甲狀腺腺癌(THCA)及子宮體子宮內膜樣癌(UCEC)。在實施例中，癌症選自由以下組成之群：結腸直腸癌、子宮癌、子宮內膜癌症、胃癌及林奇症候群(Lynch syndrome)。在實施例中，癌症係MSI+癌症。

本發明係關於表1中所定義之包含腫瘤特異性新表位之經分離新抗原肽，其中該經分離新抗原肽不為天然多肽。本發明亦係關於包含腫瘤特異性新表位且如表1中所定義之經分離新抗原肽。

在一些實施例中，經分離新抗原肽之長度在約8至約50個胺基酸之間。在另一實施例中，經分離新抗原肽之長度在約15至約35個胺基酸之間。在另一實施例中，經分離新抗原肽之長度為約15個胺基酸或更小。在另一實施例中，經分離新抗原肽之長度在約8個與約11個胺基酸之間。在另一實施例中，經分離新抗原肽之長度為9或10個胺基酸。在另一實施例中，經分離新抗原肽結合I類主要組織相容性複合體(MHC)。在另一實施例中，經分離新抗原肽結合I類MHC，且結合親和力小於約500nM。

在一些實施例中，經分離新抗原肽之長度為約30個胺基酸或更小。在另一實施例中，經分離新抗原肽之長度在約6個與約25個胺基酸之間。在另一實施例中，經分離新抗原肽之長度在約15個與約24個胺基酸之 間。在另一實施例中，經分離新抗原肽之長度在約9個與約15個胺基酸之間。在另一實施例中，經分離新抗原肽結合II類MHC。在另一實施例中，經分離新抗原肽結合II類MHC，且結合親和力小於約1000nM。

在一些實施例中，經分離新抗原肽進一步包含側翼胺基酸。在另一實施例中，側翼胺基酸不為天然側翼胺基酸。在另一實施例中，經分離新抗原肽係連接至至少第二新抗原肽。在另一實施例中，肽係使用聚-甘胺酸或聚-絲胺酸連接體連接。在另一實施例中，第二新抗原肽結合I類或II類MHC，且結合親和力小於約1000nM。在另一實施例中，第二新抗原肽結合I類或II類MHC，且結合親和力小於約500nM。在另一實施例中，兩種新表位均結合至人類白血球抗原(HLA)-A、-B、-C、-DP、-DQ或-DR。在另一實施例中，經分離新抗原肽結合I類HLA且第二新抗原肽結合II類HLA。在另一實施例中，經分離新抗原肽結合II類HLA且第二新抗原肽結合I類HLA。

在一些實施例中，經分離新抗原肽進一步包含增加活體內半衰期、細胞靶向、抗原攝取、抗原處理、MHC親和力、MHC穩定性或抗原呈遞之修飾。在另一實施例中，修飾係偶聯至載體蛋白、偶聯至配體、偶聯至抗體、聚乙二醇化、聚唾液酸化羥乙基澱粉化、重組體PEG模擬物、Fc融合、白蛋白融合、奈米粒子附接、奈米微粒囊封、膽固醇融合、鐵融合、醯化、醯胺化、醣基化、側鏈氧化、磷酸化、生物素化、添加表面活性材料、添加胺基酸模擬物或添加非天然胺基酸。在另一實施例中，經靶向之細胞係抗原呈遞細胞。在另一實施例中，抗原呈遞細胞係樹突細胞。在另一實施例中，樹突細胞係使用以下來靶向：DEC205、XCR1、CD197、CD80、CD86、CD123、CD209、CD273、CD283、CD289、CD184、 CD85h、CD85j、CD85k、CD85d、CD85g、CD85a、CD141、CD11c、CD83、TSLP受體、Clec9a或CD1a標記物。在另一實施例中，樹突細胞係使用以下來靶向：CD141、DEC205或XCR1標記物。

在一些實施例中，本發明提供包含本文所闡述之經分離新抗原肽之活體內遞送系統。在另一實施例中，遞送系統包括細胞穿透肽、奈米微粒囊封、類病毒顆粒或脂質體。在另一實施例中，細胞穿透肽係TAT肽、單純皰疹病毒VP22、轉運素或Antp。

在一些實施例中，本發明係關於包含本文所闡述之經分離新抗原肽之細胞。在另一實施例中，細胞係抗原呈遞細胞。在另一實施例中，細胞係樹突細胞。

在一些實施例中，本發明係關於包含本文所闡述之經分離新抗原肽之組合物。在另一實施例中，組合物包含至少2種、至少3種、至少4種、至少5種、至少6種、至少7種、至少8種、至少9種、至少10種、至少11種、至少12種、至少13種、至少14種、至少15種、至少16種、至少17種、至少18種、至少19種、至少20種、至少21種、至少22種、至少23種、至少24種、至少25種、至少26種、至少27種、至少28種、至少29種或至少30種如表1或2中所定義之包含腫瘤特異性新表位之經分離新抗原肽。在另一實施例中，組合物包含介於2種與20種之間之新抗原肽。在另一實施例中，組合物進一步包含至少1種、至少2種、至少3種、至少4種、至少5種、至少6種、至少7種、至少8種、至少9種、至少10種、至少11種、至少12種、至少13種、至少14種、至少15種、至少16種、至少17種、至少18種、至少19種、至少20種、至少21種、至少22種、至少23種、至少24或至少25種、至少26種、至少27種、至少28種、至少29種或 至少30種其他新抗原肽。在另一實施例中，組合物包含介於約4種與約20種之間之其他新抗原肽。在另一實施例中，其他新抗原肽對個別患者之腫瘤具有特異性。在另一實施例中，患者特異性新抗原肽係藉由鑑別在患者腫瘤試樣之基因體、外顯子體及/或轉錄體與非腫瘤試樣之基因體、外顯子體及/或轉錄體之間之序列差異來選擇。在另一實施例中，試樣係新鮮的或福馬林固定的石蠟包埋之腫瘤組織、剛分離之細胞或循環腫瘤細胞。在另一實施例中，序列差異係藉由次世代定序來測定。

在一些實施例中，本發明係關於編碼本文所闡述之經分離新抗原肽之經分離多核苷酸。在另一實施例中，經分離多核苷酸係RNA，視情況自擴增RNA。在另一實施例中，RNA經修飾以增加穩定性、增加細胞靶向、增加轉譯效率、佐劑性、胞質液可及性及/或降低細胞毒性。在另一實施例中，修飾係偶聯至載體蛋白、偶聯至配體、偶聯至抗體、密碼子最佳化、增加GC-含量、納入經修飾核苷、納入5'-端帽或端帽類似物及/或納入未遮蔽聚-A序列。

在一些實施例中，本發明係關於包含本文所闡述之多核苷酸之細胞。

在一些實施例中，本發明係關於包含本文所闡述之多核苷酸之載體。在另一實施例中，多核苷酸可操作連接至啟動子。在另一實施例中，載體包含自擴增RNA複製子、質體、噬菌體、轉位子、黏粒、病毒或病毒粒子。在另一實施例中，載體係腺相關病毒、皰疹病毒、慢病毒屬或其假型。

在一些實施例中，本發明係關於包含本文所闡述之經分離多核苷酸之活體內遞送系統。在另一實施例中，遞送系統包括球形核酸、病毒、類 病毒顆粒、質體、細菌質體或奈米粒子。

在一些實施例中，本發明係關於包含本文所闡述之載體或遞送系統之細胞。在另一實施例中，細胞係抗原呈遞細胞。在另一實施例中，細胞係樹突細胞。在另一實施例中，細胞係未成熟的樹突細胞。

在一些實施例中，本發明係關於包含至少一種本文所闡述之多核苷酸之組合物。在另一實施例中，組合物包含至少2種、至少3種、至少4種、至少5種、至少6種、至少7種、至少8種、至少9種、至少10種、至少11種、至少12種、至少13種、至少14種、至少15種、至少16種、至少17種、至少18種、至少19種、至少20種、至少21種、至少22種、至少23種、至少24種、至少25種、至少26種、至少27種、至少28種、至少29或至少30種經分離多核苷酸。在另一實施例中，組合物包含介於約2種至約20種之間之編碼新抗原肽之多核苷酸。在另一實施例中，組合物進一步包含至少1種、至少2種、至少3種、至少4種、至少5種、至少6種、至少7種、至少8種、至少9種、至少10種、至少11種、至少12種、至少13種、至少14種、至少15種、至少16種、至少17種、至少18種、至少19種、至少20種、至少21種、至少22種、至少23種、至少24種、至少25種、至少26種、至少27種、至少28種、至少29種或至少30種編碼其他新抗原肽之其他新抗原多核苷酸。在一些實施例中，組合物包含介於約4與約20種之間之其他新抗原多核苷酸。在一些實施例中，經分離多核苷酸及其他新抗原多核苷酸係連接的。在一些實施例中，多核苷酸係使用編碼聚-甘胺酸或聚-絲胺酸連接體之核酸連接。在一些實施例中，其他新抗原肽中之至少一者對個別患者之腫瘤具有特異性。在一些實施例中，患者特異性新抗原肽係藉由鑑別在患者腫瘤試樣之基因體、外顯子體及/或轉錄體與非腫 瘤試樣之基因體、外顯子體及/或轉錄體之間之序列差異來選擇。在一些實施例中，試樣係新鮮的或福馬林固定的石蠟包埋之腫瘤組織、剛分離之細胞或循環腫瘤細胞。在一些實施例中，序列差異係藉由次世代定序來測定。

在一些實施例中，本發明係關於能結合至少一種本文所述新抗原肽之T細胞受體(TCR)。在一些實施例中，在I類或II類MHC之情形下TCR能結合經分離新抗原肽。

在一些實施例中，本發明係關於嵌合抗原受體，其包含：(i)T細胞活化分子；(ii)跨膜區；及(iii)能結合本文所闡述之經分離新抗原肽之抗原識別部分。在一些實施例中，嵌合抗原受體含有CD3-ζ作為T細胞活化分子。在一些實施例中，嵌合抗原受體進一步包含至少一個共刺激信號傳導結構域。在一些實施例中，信號傳導結構域係CD28、4-1BB、ICOS、OX40、ITAM或Fc ε RI-γ。在一些實施例中，在I類或II類MHC之情形下抗原識別部分能結合經分離新抗原肽。在一些實施例中，嵌合抗原受體包含CD3-ζ、CD28、CTLA-4、ICOS、BTLA、KIR、LAG3、CD137、OX40、CD27、CD40L、Tim-3、A2aR或PD-1跨膜區。在一些實施例中，腫瘤特異性表位位於腫瘤相關多肽之細胞外結構域中。

在一些實施例中，本發明係關於包含本文所闡述之T細胞受體或嵌合抗原受體之T細胞。在一些實施例中，T細胞係輔助T細胞或細胞毒性T細胞。

在一些實施例中，本發明係關於包含可操作連接至編碼本文所闡述之T細胞受體之多核苷酸之啟動子的核酸。在一些實施例中，在I類或II類主要組織相容性複合體(MHC)之情形下TCR能結合至少一種新抗原肽。在 另一實施例中，核酸包含可操作連接至編碼本文所闡述之嵌合抗原受體之多核苷酸之啟動子。在另一實施例中，在I類或II類主要組織相容性複合體(MHC)之情形下抗原識別部分能結合至少一種新抗原肽。在一些實施例中，腫瘤特異性表位位於腫瘤相關多肽之細胞外結構域中。在一些實施例中，核酸包含CD3-ζ、CD28、CTLA-4、ICOS、BTLA、KIR、LAG3、CD137、OX40、CD27、CD40L、Tim-3、A2aR或PD-1跨膜區。

在一些實施例中，本發明係關於能結合至少一種本文所述新抗原肽之抗體。

在一些實施例中，本發明係關於經本文所闡述之核酸轉染或轉導之經修飾細胞。在一些實施例中，經修飾細胞係T細胞、腫瘤浸潤淋巴球、NK-T細胞、TCR表現細胞、CD4⁺ T細胞、CD8⁺ T細胞或NK細胞。

在一些實施例中，本發明係關於包含本文所闡述之T細胞受體或嵌合抗原受體之組合物。在一些實施例中，組合物包含含有T細胞受體或嵌合抗原受體之自體患者T細胞。在一些實施例中，組合物進一步包含免疫檢查點抑制劑。在一些實施例中，組合物進一步包含至少兩種免疫檢查點抑制劑。在一些實施例中，免疫檢查點抑制劑中之每一者抑制選自由以下組成之群之檢查點蛋白：CTLA-4、PDL1、PDL2、PD1、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、TIM3、GAL9、LAG3、VISTA、KIR、2B4、CD160、CGEN-15049、CHK 1、CHK2、A2aR及B-7家族配體或其組合。在一些實施例中，免疫檢查點抑制劑中之每一者與選自由以下組成之群之檢查點蛋白之配體相互作用：CTLA-4、PDL1、PDL2、PD1、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、TIM3、GAL9、LAG3、VISTA、KIR、2B4、CD160、CGEN-15049、CHK 1、CHK2、A2aR及B-7家族配體或 其組合。

在一些實施例中，組合物進一步包含免疫調節劑或佐劑。在另一實施例中，免疫調節劑係共刺激配體、TNF配體、Ig超家族配體、CD28、CD80、CD86、ICOS、CD40L、OX40、CD27、GITR、CD30、DR3、CD69或4-1BB。在另一實施例中，免疫調節劑係至少一種癌細胞或癌細胞提取物。在另一實施例中，癌細胞對需要組合物之個體係自體細胞。在另一實施例中，癌細胞已進行溶解或已暴露於UV輻射。在另一實施例中，佐劑誘導體液性在投與個體時。在另一實施例中，佐劑在投與個體時誘導1型T輔助細胞。

在一些實施例中，本發明係關於抑制表現本文所闡述之腫瘤特異性新表位之腫瘤細胞生長之方法，其包含使腫瘤細胞與本發明之肽、多核苷酸、遞送系統、載體、組合物、抗體或細胞接觸。

在一些實施例中，本發明係關於在有需要之個體中治療癌症或發動、增強或延長抗腫瘤反應之方法，其包含向個體投與本文所闡述之肽、多核苷酸、載體、組合物、抗體或細胞。

在一些實施例中，癌症係選自腎上腺癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、神經膠質母細胞瘤、頭頸癌、腎難染性癌、腎透明細胞癌、腎乳頭狀癌、肝癌、肺腺癌、肺鱗狀細胞癌、卵巢癌、胰臟癌、黑色素瘤、胃癌、子宮體子宮內膜癌及子宮癌肉瘤。

在一些實施例中，癌症係選自以下各項的群：前列腺癌、膀胱癌、肺鱗狀細胞癌、NSCLC、乳癌、頭頸癌、肺腺癌、GBM、神經膠質瘤、CML、AML、幕上室管膜瘤、急性前骨髓細胞性白血病、單發性纖維瘤及耐克唑替尼性癌症。

在一些實施例中，癌症係選自由以下組成之群：CRC、頭頸癌、胃癌、肺鱗狀細胞癌、肺腺癌、前列腺癌、膀胱癌、胃癌、腎細胞癌及子宮癌。

在一些實施例中，癌症係選自由以下組成之群：黑色素瘤、肺鱗狀細胞癌、DLBCL、子宮癌、頭頸癌、子宮癌、肝癌及CRC。

在一些實施例中，癌症係選自由以下組成之群：淋巴樣癌；柏基特淋巴瘤、神經胚細胞瘤、前列腺腺癌、結腸直腸腺癌；子宮/子宮內膜腺癌；MSI⁺；子宮內膜漿液性癌；子宮內膜癌肉瘤-惡性中胚層混合型腫瘤；神經膠質瘤；星細胞瘤；GBM、與MDS相關之急性骨髓樣白血病；慢性淋巴球性白血病-小淋巴球性淋巴瘤；骨髓發育不良症候群；急性骨髓樣白血病；乳房之管腔NS癌；慢性骨髓樣白血病；胰臟之導管癌；慢性骨髓單核球性白血病；骨髓纖維化；骨髓發育不良症候群；前列腺腺癌；原發性血小板增多症；及髓成肌母細胞瘤。

在一些實施例中，癌症係選自由結腸直腸癌、子宮癌、子宮內膜癌及胃癌組成之群。

在一些實施例中，癌症係選自由以下組成之群：子宮頸癌、頭頸癌、肛門癌、胃癌、柏基特氏淋巴瘤及鼻咽癌。

在一些實施例中，癌症係選自由膀胱癌、結腸直腸癌及胃癌組成之群。

在一些實施例中，癌症係選自由以下組成之群：肺癌、CRC、黑色素瘤、乳癌、NSCLC及CLL。

在一些實施例中，癌症係選自由以下組成之群：腎上腺皮質癌(ACC)、急性前骨髓細胞性白血病、急性骨髓性白血病(AML)、與骨髓發 育不良症候群(MDS)相關之AML、肛門癌、星細胞瘤、膀胱癌、膀胱尿路上皮癌(BLCA)、乳癌、乳房侵襲性癌(BRCA)、柏基特淋巴瘤、去勢抵抗性去勢抵抗性前列腺癌、子宮頸癌、子宮頸鱗狀細胞癌及子宮頸內腺癌(CESC)、慢性淋巴球性白血病-小淋巴球性淋巴瘤、慢性淋巴球性白血病(CLL)、慢性骨髓樣白血病(CML)、慢性骨髓單核球性白血病、結腸直腸腺癌、結腸直腸癌(CRC)、耐克唑替尼性非小細胞肺癌(NSCLC)、瀰漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)、胰臟之導管癌、子宮內膜癌肉瘤-惡性中胚層混合型腫瘤、子宮內膜漿液性癌、原發性血小板增多症、多形性神經膠母細胞瘤(GBM)、神經膠質瘤、頭頸癌、頭頸部鱗狀細胞癌(HNSC)、侵襲性小葉癌(ILC)LumA乳癌、腎難染性癌(KICH)、腎透明細胞癌(KIRC)、腎乳頭狀細胞癌(KIRP)、急性骨髓性白血病(LAML)、肝細胞癌(LIHC)、肝癌、肺腺癌(LUAD)、肺鱗狀細胞癌(LUSC)、乳房之管腔NS癌、肺癌、淋巴樣癌、髓成肌母細胞瘤、黑色素瘤、微衛星不穩定性(MSI)⁺結腸直腸癌(CRC)、MSI⁺子宮內膜樣癌、MSI⁺胃癌、MSI⁺子宮癌/子宮內膜癌症、骨髓發育不良症候群、骨髓纖維化、鼻咽癌、神經胚細胞瘤、非小細胞肺癌(NSCLC)、卵巢漿液性囊腺癌(OV)、胰臟腺癌(PAAD)、前列腺腺癌(PRAD)、前列腺癌、腎細胞癌、皮膚黑色素瘤(SKCM)、單發性纖維瘤、胃腺癌(STAD)、胃癌、幕上室管膜瘤、甲狀腺腺癌(THCA)、子宮體子宮內膜樣癌(UCEC)或子宮癌肉瘤(UCS)、子宮癌及子宮/子宮內膜腺癌。

在一些實施例中，癌症係選自由以下組成之群：膀胱尿路上皮癌(BLCA)、乳房侵襲性癌(BRCA)、乳癌、子宮頸鱗狀細胞癌及子宮頸內腺癌(CESC)、慢性淋巴球性白血病(CLL)、結腸直腸癌(CRC)、多形性神經 膠母細胞瘤(GBM)、頭頸部鱗狀細胞癌(HNSC)、腎乳頭狀細胞癌(KIRP)、肝細胞癌(LIHC)、肺腺癌(LUAD)、肺鱗狀細胞癌(LUSC)、胰臟腺癌(PAAD)、前列腺癌、皮膚黑色素瘤(SKCM)、胃腺癌(STAD)、甲狀腺腺癌(THCA)及子宮體子宮內膜樣癌(UCEC)。

在一些實施例中，個體為人類。在另一實施例中，個體患有癌症。在另一實施例中，癌症係選自由以下組成之群：泌尿生殖、婦科、肺、胃腸、頭頸癌、惡性神經膠母細胞瘤、惡性間皮瘤、非轉移或轉移乳癌、惡性黑色素瘤、默克爾細胞癌或骨與軟組織肉瘤、血液性贅瘤形成、多發性骨髓瘤、急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、骨髓發育不良症候群及急性淋巴母細胞性白血病、非小細胞肺癌(NSCLC)、乳癌、轉移結腸直腸癌、激素敏感性或激素抵抗性前列腺癌、結腸直腸癌、卵巢癌、肝細胞癌、腎細胞癌、胰臟癌、胃癌、食道癌、肝細胞癌、膽管細胞癌、頭頸鱗狀細胞癌軟組織肉瘤及小細胞肺癌。在另一實施例中，個體已進行腫瘤之手術移除。在另一實施例中，肽、多核苷酸、載體、組合物或細胞係經由靜脈內、腹膜內、腫瘤內、真皮內或皮下投與來投與。在另一實施例中，肽、多核苷酸、載體、組合物或細胞係投與至解剖學位置處從而匯流至淋巴結池中。在另一實施例中，投與至多個淋巴結池中。在另一實施例中，投與係藉由皮下或真皮內途徑進行。

在該方法之一些實施例中，投與肽。在另一實施例中，投與係腫瘤內投與。在該方法之另一實施例中，投與多核苷酸，視情況RNA。在另一實施例中，以靜脈內方式投與多核苷酸。在該方法之一些實施例中，投與細胞。在另一實施例中，細胞係T細胞或樹突細胞。在另一實施例中，肽或多核苷酸包含抗原呈遞細胞靶向部分。

在該方法之另一實施例中，亦向個體投與至少一種免疫檢查點抑制劑。在另一實施例中，檢查點抑制劑係生物治療劑或小分子。在另一實施例中，檢查點抑制劑係選自由以下組成之群：單株抗體、人類化抗體、全人類抗體及融合蛋白或其組合。在另一實施例中，檢查點抑制劑抑制選自由以下組成之群之檢查點蛋白：CTLA-4、PDL1、PDL2、PD1、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、TIM3、GAL9、LAG3、VISTA、KIR、2B4、CD160、CGEN-15049、CHK 1、CHK2、A2aR及B-7家族配體或其組合。在另一實施例中，檢查點抑制劑與選自由以下組成之群之檢查點蛋白之配體相互作用：CTLA-4、PDL1、PDL2、PD1、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、TIM3、GAL9、LAG3、VISTA、KIR、2B4、CD160、CGEN-15049、CHK 1、CHK2、A2aR及B-7家族配體或其組合。在另一實施例中，投與兩種或更多種檢查點抑制劑。在另一實施例中，檢查點抑制劑係：(i)伊匹單抗或曲美目單抗及(ii)尼沃魯單抗。在另一實施例中，檢查點抑制劑及組合物係同時或以任一順序依序投與。在另一實施例中，新抗原肽、多核苷酸、載體、組合物或細胞係在檢查點抑制劑之前投與。在另一實施例中，肽、多核苷酸、載體、組合物或細胞係在檢查點抑制劑之後投與。在另一實施例中，檢查點抑制劑在新抗原肽、多核苷酸、載體、組合物或細胞療法中始終持續。在另一實施例中，新抗原肽、多核苷酸、載體、組合物或細胞療法係投與對檢查點抑制劑療法僅部分反應或不反應之個體。在另一實施例中，組合物係以靜脈內或皮下方式投與。在另一實施例中，檢查點抑制劑係以靜脈內或皮下方式投與。在另一實施例中，檢查點抑制劑係在組合物之投與位之約2cm內點以皮下方式投與。在另一實施例中，組合物係投與與檢查點抑制劑相同之匯流淋巴結 中。

在該方法之一些實施例中，投與另一藥劑。在另一實施例中，該藥劑係化學治療劑、免疫調節藥物、免疫代謝改良藥物、靶向療法、輻射抗血管生成劑或降低免疫抑制之藥劑。在另一實施例中，化學治療劑係烷基化劑、拓樸異構酶抑制劑、抗代謝物或抗有絲分裂劑。在另一實施例中，另一藥劑係抗糖皮質激素誘導之腫瘤壞死因子家族受體(GITR)激動性抗體或抗體片段、依魯替尼、多西他賽、順鉑或環磷醯胺。在另一實施例中，投與引發CD4⁺ T細胞免疫反應。在另一實施例中，投與引發CD4⁺ T細胞免疫反應及CD8⁺ T細胞免疫反應。

在一些實施例中，本發明係關於刺激個體之免疫反應之方法，其包含投與有效量之本文所闡述之經修飾細胞或組合物。在另一實施例中，免疫反應係細胞毒性及/或體液性免疫反應。在另一實施例中，該方法在個體中刺激T細胞調介之免疫反應。在另一實施例中，T細胞調介之免疫反應係針對靶細胞。在另一實施例中，靶標細胞係腫瘤細胞。在另一實施例中，經修飾細胞係在活體內經轉染或轉導。在另一實施例中，經修飾細胞係離體經轉染或轉導。在另一實施例中，經修飾細胞係自體患者T細胞。在另一實施例中，自體患者T細胞係自已接受新抗原肽或核酸疫苗之患者獲得。在另一實施例中，新抗原肽或核酸疫苗包含至少一種個人化新抗原。在另一實施例中，新抗原肽或核酸疫苗包含至少一種其他本文所述新抗原肽。在另一實施例中，患者在接受新抗原肽或核酸疫苗之前及/或期間接受化學治療劑、免疫調節藥物、免疫代謝改良藥物、靶向療法或輻射。在另一實施例中，患者接受至少一種檢查點抑制劑之治療。在另一實施例中，自體T細胞係自已接受至少一輪含有新抗原之T細胞療法之患者 獲得。在另一實施例中，該方法進一步包含過繼性T細胞療法。在另一實施例中，過繼性T細胞療法包含自體T細胞。在另一實施例中，自體T細胞係靶向腫瘤抗原。在另一實施例中，過繼性T細胞療法進一步包含同種異體T細胞。在另一實施例中，同種異體T細胞靶向腫瘤抗原。在另一實施例中，過繼性T細胞療法係在檢查點抑制劑之前投與。

在一些實施例中，本發明係關於評估治療之效能之方法，其包含：(i)在投與經修飾細胞之前量測自個體獲得之第一試樣中之靶細胞之數量或濃度，(ii)在投與經修飾細胞後量測自個體獲得之第二試樣中之靶細胞之數量或濃度，及(iii)確定與第一試樣中之靶細胞之數量或濃度相比，第二試樣中之靶細胞之數量或濃度之增加或降低。在另一實施例中，治療效能係藉由監測以下各項來測定：臨床結果；T細胞對抗腫瘤活性之增加、增強或延長；與治療前之數量相比，抗腫瘤T細胞或經活化T細胞之數量之增加；B細胞活性；CD4 T細胞活性；或其組合。在另一實施例中，治療效能係藉由監測生物標記來測定。在另一實施例中，生物標記係選自由以下組成之群：CEA、Her-2/neu、膀胱腫瘤抗原、甲狀腺球蛋白、α-胎兒蛋白、PSA、CA125、CA19.9、CA15.3、瘦素、泌乳素、骨橋蛋白、IGF-II、CD98、肌成束蛋白、sPIgR、14-3-3η、肌鈣蛋白I及b型利鈉肽。在另一實施例中，臨床結果係選自由以下組成之群：腫瘤消退；腫瘤縮小；腫瘤壞死；由免疫系統引起之抗腫瘤反應；腫瘤擴增、復發或擴散；或其組合。在另一實施例中，治療效應係藉由T細胞之存在或藉由指示T細胞發炎之基因印記之存在或其組合來預測。

在一些實施例中，本發明係關於在有需要之個體中治療癌症或發動、增強或延長抗腫瘤反應之方法，其包含向個體投與：(a)本文所闡述 之肽、多核苷酸、載體、組合物、抗體或細胞；及(b)至少一種檢查點抑制劑。在另一實施例中，該方法進一步包含投與免疫調節劑或佐劑。在另一實施例中，免疫調節劑或佐劑係選自由以下組成之群：聚(I：C)、聚-ICLC、STING激動劑、1018 ISS、鋁鹽、阿普利瓦、AS15、BCG、CP-870,893、CpG7909、CyaA、dSLIM、GM-CSF、IC30、IC31、咪喹莫特、ImuFact IMP321、IS Patch、ISS、ISCOMATRIX、JuvImmune、LipoVac、MF59、單磷醯脂質A、Montanide IMS 1312 VG、Montanide ISA 206 VG、Montanide ISA 50 V2、Montanide ISA 51 VG、OK-432、OM-174、OM-197-MP-EC、ISA-TLR2激動劑、ONTAK、PepTel®載體系統、PLG微粒、雷西莫特、SRL172、病毒體及其他類病毒顆粒、YF-17D、VEGF阱、R848、β-葡聚糖、Pam3Cys、Pam3CSK4、丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物、馬來酸酐之共聚物及QS21刺激子共刺激配體、TNF配體、Ig超家族配體、CD28、CD80、CD86、ICOS、CD40L、OX40、CD27、GITR、CD30、DR3、CD69或4-1BB。在另一實施例中，免疫調節劑或佐劑係聚-ICLC。在另一實施例中，檢查點抑制劑係抗PD1抗體或抗體片段。在另一實施例中，PD-1路徑之抑制劑係尼沃魯單抗。在另一實施例中，檢查點抑制劑係抗CTLA4抗體或抗體片段。在另一實施例中，抗CTLA4抗體係伊匹單抗或曲美目單抗。在另一實施例中，方法包含投與抗PD1抗體及抗CTLA4抗體。在另一實施例中，檢查點抑制劑之投與係在開始投與肽、多核苷酸、載體、組合物、抗體或細胞之前開始。在另一實施例中，檢查點抑制劑之投與係在開始投與肽、多核苷酸、載體、組合物、抗體或細胞之後開始。在另一實施例中，檢查點抑制劑之投與係與開始投與肽、多核苷酸、載體、組合物、抗體或 細胞同時開始。在另一實施例中，肽、多核苷酸、載體、組合物、抗體或細胞係以靜脈內或皮下方式投與。在另一實施例中，檢查點抑制劑係以靜脈內或皮下方式投與。在另一實施例中，檢查點抑制劑係在肽、多核苷酸、載體、組合物、抗體或細胞之投與位置處約2cm內以皮下方式投與。在另一實施例中，肽、多核苷酸、載體、組合物、抗體或細胞係投與至與檢查點抑制劑相同的匯流淋巴結中。

在治療方法之一些實施例中，另一治療劑係(例如)化學治療劑或生物治療劑、輻射或免疫療法。可投與任一適於具體癌症之治療性治療。化學治療及生物治療劑之實例包括(但不限於)血管生成抑制劑，例如羥基血管抑素K 1-3、DL-a-二氟甲基-鳥胺酸、內皮抑素(endostatiii)、煙麴黴素(fumagillin)、金雀異黃酮、米諾四環素(minocycline)、星狀孢菌素(staurosporine)及沙利竇邁(thalidomide)；DNA嵌入劑/交聯劑，例如博來黴素(Bleomycin)、卡鉑(Carboplatin)、卡米斯美(Carrmistme)、氮芥苯丁酸(Chlorambucil)、環磷醯胺(Cyclophosphamide)、順式-二胺鉑(D)二氯化物(順鉑)、美法侖(Melphalan)、米托蒽醌(Mitoxantrone)及奧沙利鉑(Oxaliplatin)；DNA合成抑制劑，例如(±)-胺甲喋呤(Amethopterin)(胺甲喋呤(Methotrexate))、3-胺基-1,2,4-苯并三嗪1,4-二氧化物、胺喋呤、胞嘧啶β-D-阿拉伯呋喃糖苷(arabinofuranoside)、5-氟-5'-去氧尿苷、5-氟尿嘧啶、更昔洛韋(Ganciclovir)、羥基脲及絲裂黴素C(Mitomycin C)；DNA-RNA轉錄調節劑，例如放線菌素D(Actinomycin D)、柔紅黴素(Dau orubicin)、多柔比星(Doxorubicin)、高三尖杉酯鹼(Homoharringtonine)及伊達比星(Idarubicin)；oη/.γηκ；抑制劑，例如S(-i-)-喜樹鹼(Camptothecm)、薑黃素、(-)-登古木(Deguelm)、5,6-二氯 苯并咪唑1-β-D-呋喃核糖苷、依託泊苷(Etoposide)、福美坦(Formestane)、福司曲星(Fostriecin)、西司皮定(Hispidin)、2-亞胺基-1-咪唑啶乙酸(環肌酸(Cyclocreatine))、美夫諾林(Mevinolin)、曲古抑菌素A(Trichostatin A)、酪胺酸磷酸化抑制劑AG 34及酪胺酸磷酸化抑制劑AG 879；基因調節劑，例如5-氮雜-2'-去氧胞苷、5-氮胞苷、膽鈣化醇(維生素D3)、4-羥基他莫昔芬(4-Hydroxytamoxifen)、褪黑激素(Melatonin)、美服培酮(Mifepristone)、雷洛昔芬(Raloxifene)、所有反式-視黃醛(維生素A醛)、所有反式視黃酸(維生素A酸)、9-順式-視黃酸、13-順式-視黃酸、視黃醇(維生素A)、他莫昔芬及曲格列酮(Troglitazone)；微管抑制劑，例如秋水仙鹼(Colchicine)、多西他賽、多拉斯他汀15(Dolastatins 15)、諾考達唑(Nocodazole)、太平洋紫杉醇(Paclitaxel)、鬼臼毒素(Podophyllotoxin)、利索新(Rhizoxin)、長春鹼(Vinblastine)、長春新鹼(Vincristine)、長春地辛(Vindesine)及長春瑞濱(Vinorelbine)(溫諾平(Navelbine))；及未分類之治療劑，例如17-(烯丙基胺基)-1 7-去甲氧基格爾德黴素(geldanamycin)、4-胺基-1,8-萘二甲醯亞胺、芹菜配質(Apigenin)、佈雷菲德菌素A(Brefeldin A)、希美替定(Cimetidine)、二氯亞甲基-二膦酸、柳培林(Leuprolide)(亮丙瑞林(Leuprorelin))、黃體促素釋放激素、皮斐松-a(Pifithrin-a)、雷帕黴素(Rapamycin)、性激素-結合球蛋白、毒胡蘿蔔內酯(Thapsigargin)及尿胰蛋白酶抑制劑片段(比庫寧蛋白(Bikunin))。治療劑可為六甲蜜胺(altretamine)、阿米福汀(amifostine)、天冬醯胺酶、卡培他濱(capecitabine)、克拉屈濱(cladribine)、西沙比利(cisapride)、西拉赫斯(cyiarahirse)、達卡巴嗪(dacarbazine)(DT1C)、放線菌素D、四氫大麻酚(dronabinol)、依泊亭α (epoetin alpha)、非格司亭(filgrastim)、氟達拉濱(fludarabine)、吉西他濱(gemcitabine)、格拉司瓊(granisetron)、異環磷醯胺(ifosfamide)、伊立替康(irinotecan)、蘭索拉唑(lansoprazole)、左旋咪唑(levamisole)、甲醯四氫葉酸(leucovorin)、甲地孕酮(megestrol)、美司鈉(mesna)、甲氧氯普胺(metoclopramide)、米托坦(mitotane)、奧美拉唑(omeprazole)、昂丹司瓊(ondansetron)、毛果芸香鹼(pilocarpine)、普魯氯嗪(prochloroperazine)或鹽酸托泊替康(topotecan hydrochloride)。治療劑可為單株抗體，例如利妥昔單抗(rituximab)(瑞圖宣®(Rituxan®))、阿倫單抗(alemtuzumab)(坎帕斯®(Campath®))、貝伐珠單抗(Bevacizumab)(癌思停®(Avastin®))、西妥昔單抗(Cetuximab)(爾必得舒®(Erbitux®))、帕尼單抗(panitumumab)(維必施®(Vectibix®))及曲妥珠單抗(trastuzumab)(賀癌平®(Herceptin®))、威羅菲尼(Vemurafenib)(日沛樂®(Zelboraf®))、甲磺酸伊馬替尼(imatinib mesylate)(基利克®(Gleevec®))、厄洛替尼(erlotinib)(得舒緩®(Tarceva®))、吉非替尼(gefitinib)(艾瑞莎®(Iressa®))、維莫德吉(Vismodegib)(愛維德^TM(Erivedge^TM))、90Y-替伊莫單抗(90Y-ibritumomab tiuxetan)、1311-托西莫單抗(1311-tositumomab)、阿多-曲妥珠單抗艾坦辛(ado-trastuzumab emtansine)、拉帕替尼(lapatinib)(泰嘉®(Tykerb®))、帕妥珠單抗(pertuzumab)(賀疾妥^TM(Perjeta^TM))、阿多-曲妥珠單抗艾坦辛(阿卡拉^TM(adcyla^TM))、瑞格菲尼(regorafenib)(Stivarga®(斯蒂瓦佳®))、舒尼替尼(sunitinib)(舒癌特®(Sutent®))、地諾單抗(Denosumab)(西格瓦®(Xgeva®))、索拉菲尼(sorafenib)(蕾莎瓦®(Nexavar®))、帕唑帕尼(pazopanib)(沃曲特®(Votrient®))、阿西替尼(axitinib)(伊尼他®(Inita®))、達沙替尼 (dasatinib)(施達塞®(Sprycel®))、尼羅替尼(nilotinib)(泰息安®(Tasigna®))、伯舒替尼(bosutinib)(Bosulif®(伯舒麗夫®))、奧法木單抗(ofatumumab)(阿澤拉(Arzerra®))、奧妥珠單抗(obinutuzumab)(佳紮瓦^TM(Gazyva^TM))、依魯替尼(伊布弗卡^TM(Imbruvica^TM))、艾代拉裡斯(idelalisib)(紮德力格®(Zydelig®))、克唑替尼(沙庫麗(Xalkori®))、厄洛替尼(得舒緩®)、雙馬來酸鹽阿法替尼(afatinib dimaleate)(吉曲夫(Giiotrif®))、色瑞替尼(ceritinib)(LDK378/紮卡第(Zykadia))、托西莫單抗及1311-托西莫單抗(百克沙®(Bexxar®))、替伊莫單抗(澤娃靈®(Zevalin®))、貝倫妥單抗維多汀(brentuximab vedotin)(阿西曲斯(Adcetris®))、硼替佐米(bortezomib)(萬科®(Velcade®))、司妥昔單抗(siltuximab)(斯萬特(Sylvant^TM))、曲美替尼(trametinib)(艾尼斯特(ekinist®))、達拉菲尼(dabrafenib)(他氟拉(Tafmlar®))、皮落株單抗(pembrolizumab)(克曲達(Keytruda®))、卡非佐米(carfilzomib)(卡羅麗斯(Kyprolis®))、雷莫蘆單抗(Ramucirumab)(卡拉紮Cyramza^TM))、卡博替尼(Cabozantinib)(庫美曲(Cometriq^TM))、凡德他尼(vandetanib)(卡瑞沙(Caprelsa®))，視情況，治療劑係新抗原。治療劑可為細胞介素，例如干擾素(INF)、介白素(IL)或造血生長因子。治療劑可為INF-α、IL-2、阿地介白素(Aldesleukin)、IL-2、促紅血球生成素、顆粒球-巨噬細胞群落-刺激因子(GM-CSF)或顆粒球群落-刺激因子。治療劑可為靶向療法，例如托瑞米芬(toremifene)(弗瑞斯®(Fareston®))、氟維司群(fulvestrant)(法洛德®(Faslodex®))、阿那曲唑(anastrozole)(安美達®(Arimidex®))、依西美坦(exemestane)(諾曼癌素®(Aromasin®))、來曲唑(letrozole)(複乳納®(Femara®))、ziv-阿柏西普(ziv-aflibercept) (紮曲普®(Zaltrap®))、阿曲諾英(Alitretinoin)(盤瑞替(Panretin®))、替西羅莫司(temsirolimus)(特癌適®(Torisel®))、維甲酸(Tretinoin)(凡諾德(Vesanoid®))、地尼白介素2(denileukin diftitox)(昂他克(Ontak®))、伏立諾他(vorinostat)(左伊紮®(Zoiinza®))、羅米地辛(romidepsin)(伊達克斯(Istodax®))、貝沙羅汀(bexarotene)(他瑞替(Targretin®))、普拉曲沙(pralatrexate)(弗沃替(Foiotyn®))、來那度胺(lenalidomide)(瑞複美®(Revlimid®))、貝林司他(belinostat)(貝來達(Beleodaq^TM))、來那度胺®(瑞複美®)、泊馬竇邁(pomalidomide)(泊馬斯特(Pomalyst®))、卡巴他賽(Cabazitaxel)(吉他那(Jevtana®))、恩雜魯胺(enzalutamide)(西坦地(Xtandi®))、乙酸阿比特龍(abiraterone acetate)(紮替佳(Zytiga®))、氯化鐳223(西非格(Xofigo®))或依維莫司(everolimus)(阿尼奧(Afiniior®))。另外，治療劑可為後生靶向藥物，例如HDAC抑制劑、激酶抑制劑、DNA甲基轉移酶抑制劑、組織蛋白去甲基酶抑制劑或組織蛋白甲基化抑制劑。後生藥物可為阿紮胞苷(Azacitidine)(委丹紮(Vidaza))、地西他濱(Decitabine)(達珂(Dacogen))、伏立諾他(Vorinostat)(左紮(Zoiinza))、羅米地辛(Romidepsin)(伊達克斯(Istodax))或魯索替尼(Ruxolitinib)(加卡非(Jakafi))。對於前列腺癌治療，太平洋紫杉醇(紫杉醇(TAXOL))為可與抗CTLA-4組合之較佳化學治療劑。

在一些實施例中，本發明係關於包含本文所闡述之任一新抗原治療劑之套組。

若本發明之態樣或實施例係就Markush組或替代物之其他分組而言闡述，則本發明不僅涵蓋整體列舉之整個組、個別組之每一成員及主要組之 所有可能亞組亦及不存在一或多個組成員之主要組。本發明亦構想明確排除所主張本發明中之任何群成員中之一或多者。

以引用方式併入

本說明書中所提及之所有公開案、專利及專利申請案皆出於所有目的以全文引用方式併入本文中，其併入程度如同明確地且個別地指示將每一個別公開案、專利或專利申請案以引用方式併入一般。例如，本文所提及之所有公開案及專利皆以全文引用方式併入本文中用於闡述及揭示公開案中所闡述之套組、組合物及方法之目的，該等可結合本文所闡述之方法、套組及組合物使用。本文中所論述的文件僅因為其揭示內容先於本申請案的申請日期而提供。本文中之內容皆不應視為根據先前發明或出於任何其他原因而承認本文所闡述之本發明沒有資格早於該揭示內容。

圖1繪示所合成的對所選I類HLA分子之預測親和力在1nM與100,000nM之間(繪製於x軸上)之562種肽之實例性圖形。實際親和力(IC₅₀(nM))係如所闡述來量測(y軸)。粗的垂直及水平線分別表示在所預測之弱及極弱結合劑與所觀察結合劑之間之500nM截止值。對角虛線繪示最佳擬合(Graphpad Prism)，其中R²為0.45。

圖2繪示圖1之275種肽之實例性圖形，測試該等肽對其各別I類HLA分子之穩定性(T_1/2；hr)。根據自圖1觀察之親和力對肽進行分倉。顯示每一倉之中值及四分位距。

圖3A繪示與加載有TMPRSS2：：ERG融合新表位(ALNSEALSV(SEQ ID NO：140)；HLA-A02：01)之單核球源樹突細胞一起共培養10天之HLA-A02：01⁺ T細胞之實例性圖形。使用多聚體分析CD8⁺ T細胞對 TMPRSS2：：ERG融合新表位之抗原特異性(初始：BV421及PE)。

圖3B繪示與加載有TMPRSS2：：ERG融合新表位(ALNSEALSV(SEQ ID NO：140)；HLA-A02：01)之單核球源樹突細胞一起共培養10天之HLA-A02：01⁺ T細胞之實例性圖形。使用多聚體分析CD8⁺ T細胞對TMPRSS2：：ERG融合新表位之抗原特異性(驗證：APC及BUV396)。

圖4A繪示與加載有GATA3框移新表位(SMLTGPPARV(SEQ ID NO：141)；HLA-A02：01)之單核球源樹突細胞一起共培養10天之HLA-A02：01⁺ T細胞之實例性圖形。使用多聚體分析CD8⁺ T細胞對GATA3框移新表位之抗原特異性(初始：APC及BUV396)。

圖4B繪示與加載有GATA3框移新表位(SMLTGPPARV(SEQ ID NO：141)；HLA-A02：01)之單核球源樹突細胞一起共培養10天之HLA-A02：01⁺ T細胞之實例性圖形。使用多聚體(驗證：PE及BV421)分析CD8⁺ T細胞對GATA3框移新表位之抗原特異性。

圖5A繪示與加載有β2M框移新表位(LLCVWVSSI(SEQ ID NO：142)；HLA-A02：01)之單核球源樹突細胞一起共培養10天之HLA-A02：01⁺ T細胞之實例性圖形。使用多聚體分析CD8⁺ T細胞對β2M框移新表位之抗原特異性(初始：PE及APC)。

圖5B繪示與單核球源樹突細胞加載有β2M框移新表位(LLCVWVSSI(SEQ ID NO：143)；HLA-A02：01)一起共培養10天之HLA-A02：01⁺ T細胞之實例性圖形。使用多聚體(驗證：PE及BV421)分析CD8⁺ T細胞對β2M框移新表位之抗原特異性。

圖6A繪示與加載有KRAS G12C新表位(KLVVVGACGV(SEQ ID NO：143)；HLA-A02：01)之單核球源樹突細胞一起共培養10天之HLA- A02：01⁺ T細胞之實例性圖形。使用多聚體分析CD8⁺ T細胞對KRAS G12C框移新表位之抗原特異性(初始：BUV396及BV421)。

圖6B繪示與單核球源樹突細胞加載有KRAS G12C新表位(KLVVVGACGV；HLA-A02：01)一起共培養10天之HLA-A02：01⁺ T細胞之實例性圖形。使用多聚體分析CD8⁺ T細胞對KRAS G12C框移新表位之抗原特異性(驗證：APC及BUV396)。

圖7繪示與加載β2M框移新肽之單核球源樹突細胞一起共培養20天(在第20天用新鮮單核球源樹突細胞再刺激)之T細胞之實例性圖形。與沒有肽之對照(左側)相比，在用加載有β2M框移肽之單核球源樹突細胞再刺激24小時之後(右側)藉由細胞內細胞介素染色來分析CD4⁺ T細胞之抗原特異性。

圖8繪示與加載BTK C481S新肽之單核球源樹突細胞一起共培養20天(在第20天用新鮮單核球源樹突細胞再刺激)之T細胞之實例性圖形。與對照野生型BTK肽(左側)相比，在用加載有BTK C481S新肽之單核球源樹突細胞再刺激24小時之後(右側)藉由細胞內細胞介素染色分析CD4⁺ T細胞之抗原特異性。

圖9繪示與加載GATA3框移新肽之單核球源樹突細胞一起共培養20天(在第20天用新鮮單核球源樹突細胞再刺激)之T細胞之實例性圖形。與沒有肽之對照(左側)相比，在用加載有GATA3框移肽之單核球源樹突細胞再刺激24小時之後(右側)藉由細胞內細胞介素染色分析CD4⁺ T細胞之抗原特異性。

交叉參考

本申請案主張以下各申請案之優先權：在2016年3月31日提出申請之美國臨時申請案第62/316,530號、在2016年3月31日提出申請之美國臨時申請案第62/316,533號、在2016年3月31日提出申請之美國臨時申請案第62/316,547號、在2016年3月31日提出申請之美國臨時申請案第62/316,552號、在2016年4月1日提出申請之美國臨時申請案第62/316,567號及在2016年4月1日提出申請之美國臨時申請案第62/316,571號，該等案件中之每一者係以全文引用方式併入本文中。

本文闡述基於由個體腫瘤獨有的突變事件引起之新抗原之發現之新穎免疫治療劑及其用途。因此，本文所闡述之本發明提供肽、編碼肽之多核苷酸及肽結合劑，其可用於(例如)刺激對腫瘤相關抗原之免疫反應，以產生免疫原性組合物或癌症疫苗以用於治療疾病。

I.定義

本文所用術語僅出於闡述具體情形之目的且並非意欲具有限制性。除非上下文另外明確指明，否則如本文所用單數形式「一(a、an)」及「該」亦意欲包括複數形式。此外，就在詳細說明及/或申請專利範圍中使用術語「包括(including)」、「包括(includes)」、「具有(having、has、with)」或其變化形式而言，該等術語意欲以類似於術語「包含(comprising)」之方式係包含性的。

術語「約」或「大約」可指在如熟習此項技術者測定之具體值之可接受誤差範圍內，該誤差範圍將部分地取決於該值係如何量測或測定的(亦即量測系統之限值)。例如，根據業內之實踐，「約」可指在1個或1個以上標準偏差內。另一選擇為，「約」可指給定值之至多20%、至多10%、至多5%或至多1%之範圍。另一選擇為，特別是關於生物系統或過 程，該術語可指在數值之數量級內、在5倍內，且更佳地在2倍內。倘若在申請案及申請專利範圍中闡述具體值，則除非另有闡述，否則應假定術語「約」意指在具體值之可接受之誤差範圍內。

為便於理解本發明，下文將定義多個術語及片語。

「新抗原」意指由由蛋白質之腫瘤特異性變化產生的一類腫瘤抗原。新抗原涵蓋(但不限於)由(例如)蛋白質序列之取代、框移突變、融合多肽、框內缺失、插入、內源性反轉錄病毒多肽之表現及多肽之腫瘤特異性過表現產生之腫瘤抗原。

「腫瘤特異性新表位」係指不存在於諸如正常非癌性或種系細胞等參考中但見於癌細胞中之表位。此具體而言包括在正常非癌性或種系細胞中發現相應表位之情形，然而，由於癌細胞中之一或多種突變，表位之序列被改變以引起新表位。

「參考」可用於將在本發明方法中獲得之結果與腫瘤樣品相關聯及比較。通常，「參考」可基於一或多個正常樣品、具體而言自患者或一或多個不同的個體(例如，健康個體)、具體而言相同物種之個體獲得且不受癌症疾病影響之樣品獲得。「參考」可藉由測試數量足夠大的正常樣品憑經驗來確定。

術語「突變」係指與參考相比核酸序列之變化或差異(核苷酸取代、添加或缺失)。「體細胞突變」可在身體中除生殖細胞(精子及卵)以外之任一種細胞中發生且因此不會傳給兒童。該等變化可能(但不總是)引起癌症或其他疾病。在一些實施例中，突變是非同義突變。術語「非同義突變」係指不引起轉譯產物之胺基酸變化(例如胺基酸取代)之突變，例如，核苷酸取代。「框移」在突變破壞基因密碼子週期(亦稱為「閱讀框」)之 正相時發生，從而轉譯非天然蛋白質序列。基因中不同的突變可達成相同的閱讀框變化。

如本文所用術語「親和力」係指結合對之兩個成員(例如，HLA結合肽與I或II類HLA)之間之結合強度之量度。K_D係解離常數且具有莫耳濃度單位。親和力常數係解離常數之倒數。親和力常數有時作為通用術語來闡述此化學實體。其係結合能量之直接量度。親和力可藉由(例如)表面電漿共振(SPR)使用市售Biacore SPR單元以實驗方式來測定。親和力亦可表示為抑制濃度50(IC₅₀)，該濃度為50%之肽經置換之濃度。同樣，ln(IC₅₀)係指IC₅₀之自然log。K_off係指例如用於解離HLA結合肽及I或II類HLA之離解速率常數。

在整個此揭示內容中，「結合數據」結果可表示為「IC₅₀」。IC₅₀係在結合分析中觀察到經標記參考肽之結合之50%抑制之測試肽濃度。鑒於運行分析之條件(即，限制性HLA蛋白及經標記參考肽濃度)，該等值約等於K_D值。測定結合之分析在業內熟知且詳細闡述於例如以下文獻中：PCT公開案WO 94/20127及WO 94/03205及其他公開案，例如Sidney等人，Current Protocolsin Immunology 18.3.1(1998)；Sidney等人，J.Immunol.154：247(1995)；及Sette等人，Mol.Immunol.31：813(1994)。另一選擇為，結合可相對於參考標準肽之結合來表示。例如，可基於其相對於參考標準肽之IC₅₀之IC₅₀。

結合亦可使用其他分析系統來測定，該等其他分析系統包括使用以下各項之彼等：肝臟細胞(例如，Ceppellini等人，Nature 339：392(1989)；Christnick等人，Nature 352：67(1991)；Busch等人，Int.Immunol.2：443(1990)；Hill等人，J.Immunol.147：189(1991)；del Guercio等人，J.Immunol.154：685(1995))、使用清潔劑溶解物之無細胞系統(例如，Cerundolo等人，J.Immunol.21：2069(1991))、固定純化之MHC(例如，Hill等人，J.Immunol.152,2890(1994)；Marshall等人，J.Immunol.152：4946(1994))、ELISA系統(例如，Reay等人，EMBO J.11：2829(1992))、表面電漿共振(例如，Khilko等人，J.Biol.Chem.268：15425(1993))；高通量可溶相分析(Hammer等人，J.Exp.Med.180：2353(1994))及I類MHC穩定或組裝之量測(例如，Ljunggren等人，Nature 346：476(1990)；Schumacher等人，Cell 62：563(1990)；Townsend等人，Cell 62：285(1990)；Parker等人，J.Immunol.149：1896(1992))。

「交叉反應性結合」指示肽係由一個以上HLA分子結合；同義詞係簡併結合。

術語「衍生之」在用於論述表位時係「製備之」的同義詞。衍生之表位可自天然來源分離或其可根據業內之標準方案來合成。合成表位可包含人工胺基酸殘基「胺基酸模擬物」，例如天然L胺基酸殘基或非天然胺基酸殘基(例如環己基丙胺酸)之D異構物。衍生或製備之表位可為天然表位之類似物。

「稀釋劑」包括無菌液體，例如水及油，包括石油、動物、植物或合成來源之彼等，例如花生油、大豆油、礦物油、芝麻油及諸如此類。水亦係用於醫藥組合物之稀釋劑。例如在可注射溶液中，亦可採用鹽水溶液及右旋糖及甘油水溶液作為稀釋劑。

「表位」係分子之共同特徵，例如一級、二級及三級肽結構及電荷，其一起形成由(例如)免疫球蛋白、T細胞受體、HLA分子或嵌合抗原 受體識別之位點。另一選擇為，表位可定義為一組參與具體免疫球蛋白之識別之胺基酸殘基，或在T細胞之情況下T細胞受體蛋白、嵌合抗原受體及/或主要組織相容性複合體(MHC)受體之識別所必需之彼等殘基。表位可藉由自天然來源分離來製備或其可根據業內之標準方案來合成。合成表位可包含人工胺基酸殘基、「胺基酸模擬物」，例如天然L胺基酸殘基或非天然胺基酸殘基(例如環己基丙胺酸)之D異構物。在整個本揭示內容中，表位在一些情形下可稱作肽或肽表位。

應瞭解包含本文所闡述之表位或類似物以及其他胺基酸之蛋白質或肽仍在本發明之界限內。在某些實施例中，肽包含抗原之片段。

在某些實施例中，對本發明肽之長度有限制。長度受限之實施例係在包含本文所述表位之蛋白質或肽包含與天然序列具有100%一致性之區(即，一系列鄰接胺基酸殘基)時存在。為避免將來自閱讀框之表位限定在(例如)全部天然分子上，對與天然肽序列具有100%一致性之任一區之長度加以限制。因此，對於包含本文所述表位及與天然肽序列具有100%一致性之區之肽，與天然序列具有100%一致性之區通常具有以下長度：小於或等於600個胺基酸殘基、小於或等於500個胺基酸殘基、小於或等於400個胺基酸殘基、小於或等於250個胺基酸殘基、小於或等於100個胺基酸殘基、小於或等於85個胺基酸殘基、小於或等於75個胺基酸殘基、小於或等於65個胺基酸殘基及小於或等於50個胺基酸殘基。在某些實施例中，本文所闡述之「表位」包含在具有一區之肽內，該區與天然肽序列具有100%一致性且以低至5個胺基酸殘基之任一增量具有少於51個胺基酸殘基；例如50個、49個、48個、47個、46個、45個、44個、43個、42個、41個、40個、39個、38個、37個、36個、35個、34個、33個、32個、31 個、30個、29個、28個、27個、26個、25個、24個、23個、22個、21個、20個、19個、18個、17個、16個、15個、14個、13個、12個、11個、10個、9個、8個、7個、6個、5個、4個、3個、2個或1個胺基酸殘基。

「人類白血球抗原」或「HLA」係人類I類或II類主要組織相容性複合體(MHC)蛋白(例如，參見Stites等人，Immunology，第8版，Lange Publishing,Los Altos,Calif.(1994))。

如本文所用「HLA超型或HLA家族」闡述基於共有之肽-結合特異性分組之HLA分子之集合。將對具有某些胺基酸基序之肽共有幾分類似的結合親和力的I類HLA分子分組至該等HLA超型中。術語HLA超家族、HLA超型家族、HLA家族及HLA xx樣分子(其中「xx」表示具體HLA類型)係同義詞。

術語「一致」或「一致性」百分比在兩個或更多個肽序列或抗原片段之情況中係指，在比較窗口內針對最大對應進行比較及比對時，兩個或更多個序列或子序列係相同的或具有指定的相同胺基酸殘基之百分比，如使用序列比較演算法或藉由人工比對及目視檢查所量測。

「免疫原性」肽或「免疫原性」表位或「肽表位」係包含等位基因特異性基序使得肽將結合HLA分子並誘導細胞調介性或體液性反應(例如，細胞毒性T淋巴球(CTL)、輔助T淋巴球(HTL)及/或B淋巴球反應)之肽。因此，本文所闡述之免疫原性肽能結合至適當HLA分子且此後誘導對肽之CTL(細胞毒性)反應或HTL(及體液性)反應。

如本文所用「嵌合抗原受體」或「CAR」係指抗原結合蛋白，其包括免疫球蛋白抗原結合結構域(例如，免疫球蛋白可變結構域)及T細胞受 體(TCR)恆定結構域。如本文所用TCR多肽之「恆定結構域」包括膜近端TCR恆定結構域，且亦可包括TCR跨膜結構域及/或TCR胞質尾區。例如，在一些實施例中，CAR係包括以下之二聚體：第一多肽，其包含連接至TCR.β.恆定結構域之免疫球蛋白重鏈可變結構域；及第二多肽，其包含連接至TCRα恆定結構域之免疫球蛋白輕鏈可變結構域(例如，κ或λ可變結構域)。在一些實施例中，CAR係包括以下之二聚體：第一多肽，其包含連接至TCRα恆定結構域之免疫球蛋白重鏈可變結構域；及第二多肽，其包含連接至TCRβ恆定結構域之免疫球蛋白輕鏈可變結構域(例如，κ或λ可變結構域)。

片語「經分離」或「生物純」係指實質上或基本上不含通常伴隨如以天然狀態發現之材料之組份之材料。因此，本文所闡述之經分離肽不含通常與其原位環境中之肽相關之材料之一部分或所有。「經分離」表位係指不包括衍生表位之抗原之整體序列之表位。通常，「經分離」表位不會使產生在天然序列之整個長度內具有100%一致性之序列之其他胺基酸殘基附接至其。天然序列可為諸如衍生表位之腫瘤相關性抗原等序列。因此，術語「經分離係指自其原有環境(例如，若其為天然存在則為天然環境)移出之材料。例如，活動物中所存在之天然多核苷酸或多肽並非分離的，但自天然系統中之一些或所有共存材料分離之相同多核苷酸或肽係分離的。此一多核苷酸可為載體之一部分，及/或此一多核苷酸或肽可為組合物之一部分，且仍係「分離的」，其中該載體或組合物不為其天然環境之一部分。經分離RNA分子包括活體內或活體外之本文所述DNA分子之RNA轉錄本，且進一步包括以合成方式產生之該等分子。

「主要組織相容性複合體」或「MHC」係在控制負責生理免疫反應 之細胞相互作用中起作用之基因簇。在人類中，MHC複合體亦稱為人類白血球抗原(HLA)複合體。對於MHC及HLA複合體之詳細闡述，參見Paul,FUNDAMENTAL Immunology,3.sup.RD ED.,Raven Press,New York(1993)。

「天然」或「野生型」序列係指在自然界中發現之序列。此一序列實質上可包含較長序列。

「T細胞表位」應理解為意指可由呈肽呈遞MHC分子或MHC複合體形式之I或II類MHC分子結合且然後以此形式分別被細胞毒性T-淋巴球或T-輔助細胞識別及結合之肽序列。

「受體」應理解為意指能結合配體之生物分子或分子群組。受體可用於在細胞、細胞形成或生物體中傳遞資訊。受體包含至少一個受體單元，例如，其中每一受體單元可由蛋白分子組成。受體具有與配體之結構互補之結構且可作為結合伴侶與配體複合。資訊具體而言係藉由在將配體複合於細胞之表面上之後改變受體之構象來傳遞。在一些實施例中，受體應理解為具體而言意指能與配體、具體而言具有適宜長度之肽或肽片段形成受體/配體複合體之I類及II類MHC之蛋白質。

「配體」應理解為意指具有與受體之結構互補之結構且能與此受體形成複合體之分子。在一些實施例中，配體應理解為意指在胺基酸序列中具有適宜長度及適宜結合基序，使得肽或肽片段能與I類MHC或II類MHC之蛋白形成複合體之肽或肽片段。

在一些實施例中，「受體/配體複合體」亦應理解為意指包括I類或II類肽呈遞或肽片段呈遞MHC分子之「受體/肽複合體」或「受體/肽片段複合體」。

「主要組織相容性複合體(MHC)之蛋白質或分子」、「MHC分子」、「MHC蛋白」或「HLA蛋白」應理解為意指能結合自蛋白質抗原之蛋白質水解裂解產生之肽且代表潛在淋巴球表位(例如，T細胞表位及B細胞表位)之蛋白質，其將該等肽運輸至細胞表面並在此將其呈遞至特定細胞、具體而言細胞毒性T-淋巴球、T-輔助細胞或B細胞。基因體中之主要組織相容性複合體包含遺傳區，在細胞表面上表現之該遺傳區基因產物對於結合及呈遞內源性及/或外來抗原及因此調控免疫過程至關重要。將主要組織相容性複合體歸類為編碼不同蛋白質之兩個基因組，即I類MHC之分子及II類MHC之分子。兩個MHC類別之細胞生物學及表現型式適於該等不同的作用。

術語「肽」及「肽表位」可與「寡肽」在本說明書中可互換使用以指定一系列彼此通常由毗鄰胺基酸殘基之α-胺基與羧基之間之肽鍵連接之殘基。

「合成肽」係指自非天然來源獲得之(例如人造的)肽。該等肽可使用諸如化學合成或重組體DNA技術等方法產生。「合成肽」包括「融合蛋白」。

「PanDR結合」肽、「PanDR結合表位」係結合一種以上II類HLA DR分子之分子之家族之成員。

「醫藥上可接受」通常係指非毒性、惰性及/或生理上相容的組合物或組合物之組份。

「醫藥賦形劑」或「賦形劑」包含諸如佐劑、載劑、pH調節劑及緩衝劑、張力調節劑、潤濕劑、防腐劑及諸如此類等材料。「醫藥賦形劑」係在醫藥上可接受之賦形劑。

術語「基序」係指具有經定義長度之胺基酸序列中之殘基型式，例如，對於I類HLA基序而言長度小於約15個胺基酸殘基或長度小於約13個胺基酸殘基(例如，約8至約13個胺基酸殘基(例如，8、9、10、11、12或13個))之肽，及對於II類HLA基序而言約6至約25個胺基酸殘基(例如，6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25個)，其係由特定HLA分子識別。對於由給定人類HLA等位基因編碼之每一HLA蛋白，基序通常係不同的。該等基序之一級及二級錨定殘基之型式有所不同。在一些實施例中，I類MHC基序鑑別具有9、10或11個胺基酸殘基之長度之肽。

「超基序」係由兩個或更多個HLA等位基因編碼之HLA分子之共有之肽結合特異性。在一些實施例中，本文所闡述之具有超基序之肽可以高的或中等親和力(如本文所定義)由兩種或更多種HLA抗原識別。

如本文所用術語「天然」係指自然界中可發現之物體之事實。例如，存在於有機體(包括病毒)中可自自然界中之來源分離且未由人在實驗室中有意修飾之肽或核苷酸序列係天然存在的。

根據本發明，術語「疫苗」係指在投與後會誘導免疫反應(例如，細胞或體液性免疫反應)之醫藥製劑(醫藥組合物)或產物，其可識別並攻擊病原體或患病細胞(例如癌細胞)。疫苗可用於預防或治療疾病。術語「個別化癌症疫苗」或「個人化癌症疫苗」係關於具體癌症患者，且意味著癌症疫苗適於個別癌症患者之需要或特殊情況。

「保護性免疫反應」或「治療性免疫反應」係指對衍生自致病性抗原(例如，腫瘤抗原)之抗原之CTL及/或HTL反應，其以一定方式預防或至少部分地阻止疾病症狀、副作用或進展。免疫反應亦可包括可藉由刺激輔 助T細胞來促進之抗體反應。

「抗原處理」或「處理」係指將多肽或抗原降解為處理產物(該等處理產物係該多肽或抗原之片段(例如，將多肽降解為肽))及使該等片段中之一或多者(例如，經由結合)與MHC分子締合以由細胞(例如，抗原呈遞細胞)呈遞至特異性T細胞。

「抗原呈遞細胞」(APC)係呈遞與其細胞表面上之MHC分子締合之蛋白質抗原之肽片段之細胞。一些APC可活化抗原特異性T細胞。專業抗原呈遞細胞在內化抗原方面非常有效，其係藉由吞噬作用或受體調介之胞吞作用且然後在其膜上展現結合至II類MHC分子之抗原之片段達成。T細胞識別抗原呈遞細胞膜上之抗原-II類MHC分子複合體並與其相互作用。然後藉由抗原呈遞細胞產生另一共刺激信號，引起T細胞之活化。共刺激分子之表現係專業抗原呈遞細胞之定義性特徵。

專業抗原呈遞細胞之主要類型係樹突細胞，其具有最廣泛範圍的抗原呈遞，且可能係最重要的抗原呈遞細胞；巨噬細胞、B細胞及某些經活化上皮細胞。

樹突細胞(DC)係經由I類及II類MHC抗原呈遞路徑呈遞捕獲在T細胞之周邊組織中之抗原之白血球群。眾所周知樹突細胞係免疫反應之有效誘導物且該等細胞之活化係誘導抗腫瘤免疫性之關鍵步驟。

將樹突細胞方便性地分類為「不成熟的」及「成熟的」細胞，其可用作區分兩個經充分描述表型之簡單方式。然而，此命名不應視為排除分化之所有可能的中間階段。

不成熟的樹突細胞描述為具有高抗原攝取及處理能力之抗原呈遞細胞，其與Fey受體及甘露糖受體之高表現相關。成熟表型通常藉由該等標 記物之較低表現及負責T細胞活化之細胞表面分子(例如I類及II類MHC)、黏著分子(例如CD54及CD1 1)及共刺激分子(例如CD40、CD80、CD86及4-1 BB)之高表現來描述。

術語「殘基」係指藉由醯胺鍵或醯胺鍵模擬物納入肽或蛋白質中之胺基酸殘基或胺基酸模擬殘基或編碼胺基酸或胺基酸模擬物之核酸(DNA或RNA)。

用於闡述肽或蛋白質之命名法遵循習用實踐，其中每一胺基酸殘基之胺基存在於左側(胺基-或N-末端)且羧基存在於右側(羧基-或C-末端)。當在肽表位中提及胺基酸殘基位置時，以胺基至羧基方向對其進行編號，其中1位係位於表位或表位為一部分之肽或蛋白之胺基末端處之殘基。

在代表本發明之所選特定實施例之式中，胺基-末端及羧基-末端基團儘管未明確顯示，但除非另外指定，否則其呈在生理pH值下可假定之形式。在胺基酸結構式中，每一殘基通常由標準三字母或單字母名稱來表示。胺基酸殘基之L-形式係由大寫單字母或三字母符號之大寫第一字母表示，且彼等具有D-形式之胺基酸殘基之D-形式係由小寫單字母或小寫三字母符號來表示。然而，當使用沒有大寫字母的三字母符號或全名時，其可指L胺基酸殘基。甘胺酸沒有不對稱碳原子且簡單地稱作「Gly」或「G」。本文所述肽之胺基酸序列通常係使用標準單字母符號來命名。(A，丙胺酸；C，半胱胺酸；D，天冬胺酸；E，麩胺酸；F，苯丙胺酸；G，甘胺酸；H，組胺酸；I，異白胺酸；K，離胺酸；L，白胺酸；M，甲硫胺酸；N，天冬醯胺；P，脯胺酸；Q，麩醯胺酸；R，精胺酸；S，絲胺酸；T，蘇胺酸；V，纈胺酸；W，色胺酸；及Y，酪胺酸)。

術語「多核苷酸」及「核酸」在本文中可互換使用且係指具有任一 長度之核苷酸之聚合物，且包括DNA及RNA，例如，mRNA。核苷酸可為去氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、經修飾核苷酸或鹼基及/或其類似物或可藉由DNA或RNA聚合酶納入聚合物中之任何受質。在一些實施例中，多核苷酸及核酸可為活體外轉錄之mRNA。在一些實施例中，使用本發明方法投與之多核苷酸係mRNA。

術語「一致」或「一致性」百分比在兩種或更多種核酸或多肽之情況下係指在比較並比對(若需要，引入空位)以獲得最大對應性時，兩個或更多個序列或子序列相同或具有指定百分比之相同核苷酸或胺基酸殘基，而不將任何保守胺基酸取代視為序列一致性之一部分。一致性百分比可使用序列比較軟體或算法或藉由目視檢查來量測。可用於比對胺基酸或核苷酸序列之各種算法及軟體已為業內所熟知。該等包括(但不限於)BLAST、ALIGN、Megalign、BestFit、GCG Wisconsin Package及其變化形式。在一些實施例中，本文所闡述之兩種核酸或多肽實質上一致，意味著當比較並比對以獲得最大對應性時，其具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%之核苷酸或胺基酸殘基一致性且在一些實施例中具有至少95%、96%、97%、98%、99%之核苷酸或胺基酸殘基一致性，如使用序列比較算法或藉由目視檢查所量測。在一些實施例中，在具有至少約10、至少約20、至少約40至60個殘基、至少約60至80個殘基之長度或期間之任一整數值個殘基之序列之區中存在一致性。在一些實施例中，在長於60-80個殘基(例如至少約80-100個殘基)之區中存在一致性，且在一些實施例中，在所比較序列之全長(例如核苷酸序列之編碼區)內序列實質上一致。

保守胺基酸取代係一個胺基酸殘基經具有類似側鏈之另一胺基酸殘 基替代者。業內已定義具有類似側鏈之胺基酸殘基之家族，包括具有鹼性側鏈之胺基酸(例如，離胺酸、精胺酸、組胺酸)、具有酸性側鏈之胺基酸(例如，天冬胺酸、麩胺酸)、具有不帶電極性側鏈之胺基酸(例如，甘胺酸、天冬醯胺、麩醯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、半胱胺酸)、具有非極性側鏈之胺基酸(例如，丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸、色胺酸)、具有β分枝側鏈之胺基酸(例如，蘇胺酸、纈胺酸、異白胺酸)及具有芳香族側鏈之胺基酸(例如，酪胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、組胺酸)。例如，用苯丙胺酸取代酪胺酸係保守取代。鑑別不消除肽功能之核苷酸及胺基酸保守取代之方法已為業內所熟知。

如本文所用「載體」意指構築體，其能在宿主細胞中遞送且通常表現一或多種所關注基因或序列。載體之實例包括(但不限於)病毒載體、裸DNA或RNA表現載體、質體、黏粒或噬菌體載體、與陽離子縮合劑相關之DNA或RNA表現載體、囊封於脂質體中之DNA或RNA表現載體。

「經分離之」多肽、抗體、多核苷酸、載體、細胞或組合物係呈在自然界中未發現之形式之多肽、抗體、多核苷酸、載體、細胞或組合物。經分離多肽、抗體、多核苷酸、載體、細胞或組合物包括已純化到不再呈在自然界中發現之形式之程度的彼等。在一些實施例中，經分離之多肽、抗體、多核苷酸、載體、細胞或組合物實質上係純的。在一些實施例中，「經分離之多核苷酸」涵蓋包含在PCR或定量PCR反應中擴增之多核苷酸之PCR或定量PCR反應。

如本文所用術語「實質上純」係指為至少50%純(即，不含污染物)、至少90%純、至少95%純、至少98%純或至少99%純之材料。

術語「個體」係指任一動物(例如，哺乳動物)，包括(但不限於)人 類、非人類靈長類動物、犬、貓、齧齒類動物及諸如此類，其係具體治療之接受者。通常，術語「個體」及「患者」在本文中在提及人類個體時可互換使用。

術語「有效量」或「治療有效量」或「治療效應」係指有效「治療」個體或哺乳動物之疾病或病症之治療劑之量。治療有效量之藥物具有治療效應且因此可預防疾病或病症之發生；減慢疾病或病症之發生；減慢疾病或病症之進展；在一定程度上減輕與疾病或病症相關之症狀中之一或多者；降低發病率及死亡率；改良生活品質；或該等效應之組合。

術語「治療(treating或treatment或to treat)」或「緩和(alleviating或to alleviate)」係指1)治癒、減慢、減輕經診斷病理學病況或病症之症狀及/或停止該經診斷病理學病況或病症之進展之治療措施及2)預防或減慢靶向病理學病況或病症之發生之防禦或預防措施。因此，需要治療之彼等包括已患病症之彼等；易於患該病症之彼等；及在其中應預防該病症之彼等。

除非上下文另外明確指示，否則本發明及隨附申請專利範圍中所用單數形式「一(a或an)」及「該」包括複數形式。

應瞭解諸如「包含(comprises、comprised、comprising)」及諸如此類等術語可具有在美國專利法中所賦予其之含義；例如，其可指「包括(includes、included、including)」及諸如此類；且諸如「基本上由……組成(consisting essentially of及consists essentially of)」等術語具有在美國專利法中所賦予其之含義，例如，其容許未明確列舉之要素，但不包括在先前技術中發現或影響本發明之基本或新穎特徵之要素。本文中之內容皆不欲作為允諾。

如本文中在諸如「A及/或B」等片語中使用之術語「及/或」意欲包括A及B、A或B、A(單獨)及B(單獨)。同樣，如在諸如「A、B及/或C」等片語中使用之術語「及/或」意欲涵蓋以下實施例中之每一者：A、B及C；A,B或C；A或C；A或B；B或C；A及C；A及B；B及C；A(單獨)；B(單獨)；及C(單獨)。

II.新抗原

研發治癒性及腫瘤特異性免疫療法之關鍵障礙之一係鑑別及選擇用以避免自體免疫性的高度特異性及侷限性腫瘤抗原。在惡性細胞內因遺傳改變(例如，倒轉、易位、缺失、誤義突變、剪接位點突變等)會產生腫瘤新抗原，其代表腫瘤特異性最強的抗原種類。由於鑑別出新抗原、選擇最佳化抗原及產生用於疫苗或免疫原性組合物中之新抗原中之技術困難，因此新抗原極少用於癌症疫苗或免疫原性組合物。該等問題可藉由以下來解決：鑑別贅瘤形成/腫瘤中之突變，該等突變是以DNA層面存在於腫瘤中但不存在於大部分患癌個體之匹配種系試樣中；用一或多種肽-MHC結合預測算法分析經鑑別突變以生成複數個在贅瘤形成/腫瘤內表現且結合至大部分患者之HLA等位基因之新抗原T細胞表位；及合成複數種選自所有新抗原肽之系列及預測結合肽之新抗原肽用於適合治療大部分患癌個體之癌症疫苗或免疫原性組合物中。

例如，將肽測序資訊轉換為治療性疫苗可包括預測可結合至大部分個體之HLA分子之突變肽。有效選擇哪些具體突變可用作免疫原需要能預測哪些突變肽可有效結合至大部分患者之HLA等位基因。最近，使用經驗證結合肽及非結合肽之基於神經網絡之學習方法提高了用於主要HLA-A及-B等位基因之預測算法之準確度。然而，即使使用先進的基於神經網絡 之算法來編碼HLA-肽結合規則，若干因素限制預測HLA等位基因上存在之肽之能力。

例如，將肽測序資訊轉換為治療性疫苗可包括將藥物調配為長肽之多表位疫苗。靶向與實際上儘可能多的突變表位利用免疫系統之巨大容量防止藉由下調免疫靶向基因產物而發生免疫逃逸之機會，及補償表位預測方法之已知不準確性。合成肽提供有用之有效製備多種免疫原並將突變體表位之鑑別快速轉換為有效疫苗之方式。肽可輕易地以化學方式合成且可輕易地利用不含污染性細菌或動物物質之試劑加以純化。小尺寸容許充分聚焦於蛋白質之突變區上且亦減少與其他組份(未突變蛋白或病毒載體抗原)不相關抗原性競爭。

例如，將肽測序資訊轉換為治療性疫苗可包括與強疫苗佐劑組合。有效疫苗可能需要強佐劑來發動免疫反應。例如，TLR3及MDA5及RIG3之RNA解旋酶-結構域之激動劑聚-ICLC已顯示疫苗佐劑之若干令人滿意的性質。該等性質包括在活體內誘導免疫細胞之局部及全身活化，產生刺激性趨化介素及細胞介素，及刺激DC之抗原-呈遞。此外，聚-ICLC可在人類中誘導持久CD4+及CD8+反應。重要地，在接種有聚-ICLC之個體及已接受高度有效的複製勝任性黃熱病疫苗之志願者中觀察到轉錄及信號轉導路徑上調之驚人相似性。另外，在最近的1期研究中，>90%之經聚-ICLC與NYESO-1肽疫苗(除Montanide以外)之組合免疫之卵巢癌患者顯示CD4+及CD8+ T細胞之誘導，以及對該肽之抗體反應。同時，聚ICLC迄今已在25個以上臨床試驗中廣泛測試且展現相對良性毒性概況。

申請者已在以下基因中發現了突變事件：ABL1、AC011997、ACVR2A、AFP、AKT1、ALK、ALPPL2、 ANAPC1、APC、ARID1A、AR、AR-v7、ASCL2、β2M、BRAF、BTK、C15ORF40、CDH1、CLDN6、CNOT1、CT45A5、CTAG1B、DCT、DKK4、EEF1B2、EEF1DP3、EGFR、EIF2B3、env、EPHB2、ERBB3、ESR1、ESRP1、FAM111B、FGFR3、FRG1B、GAGE1、GAGE10、GATA3、GBP3、HER2、IDH1、JAK1、KIT、KRAS、LMAN1、MABEB16、MAGEA1、MAGEA10、MAGEA4、MAGEA8、MAGEB17、MAGEB4、MAGEC1、MEK、MLANA、MLL2、MMP13、MSH3、MSH6、MYC、NDUFC2、NRAS、PAGE2、PAGE5、PDGFRa、PIK3CA、PMEL、pol蛋白、POLE、PTEN、RAC1、RBM27、RNF43、RPL22、RUNX1、SEC31A、SEC63、SF3B1、SLC35F5、SLC45A2、SMAP1、SMAP1、SPOP、TFAM、TGFBR2、THAP5、TP53、TTK、TYR、UBR5、VHL、XPOT、EEF1DP3：FRY融合多肽、EGFR：SEPT14融合多肽、EGFRVIII缺失多肽、EML4：ALK融合多肽、NDRG1：ERG融合多肽、AC011997.1：LRRC69融合多肽、RUNX1(ex5)-RUNX1T1融合多肽、TMPRSS2：ERG融合多肽、NAB：STAT6融合多肽、NDRG1：ERG融合多肽、PML：RARA融合多肽、PPP1R1B：STARD3融合多肽、MAD1L1：MAFK融合多肽、FGFR3：TAC融合多肽、FGFR3：TACC3融合多肽、BCR：ABL融合多肽、C11orf95：RELA融合多肽、CBFB：MYH11融合多肽、CBFB：MYH11融合多肽、CD74：ROS1融合多肽、CD74：ROS1融合多肽、ERVE-4：蛋白酶、ERVE-4：反轉錄酶、ERVE-4：反轉錄酶、ERVE-4：未知、ERVH-2基質蛋白、ERVH-2：gag、ERVH-2：反轉錄病毒基質、ERVH48-1：外殼蛋白、ERVH48-1：合胞素、ERVI-1套膜蛋白、 ERVK-5 gag、ERVK-5 env、ERVK-5 pol、EBV A73、EBV BALF3、EBV BALF4、EBV BALF5、EBV BARF0、EBV LF2、EBV RPMS1、HPV-16、HPV-16 E7及HPV-16 E6。

在一些實施例中，本文所闡述之新抗原係由β2M、BTK、EGFR、GATA3、KRAS、MLL2、TMPRSS2：ERG融合多肽或TP53中之突變事件引起的。

新抗原多肽

在態樣中，本發明提供包含表1或2之腫瘤特異性突變之經分離肽。該等肽及多肽在本文中稱作「新抗原肽」或「新抗原多肽」。術語「肽」在本說明書中可與「突變體肽」及「新抗原肽」互換使用以指定一系列彼此通常藉由在毗鄰胺基酸之α-胺基與羧基之間之肽鍵連接之殘基(通常L-胺基酸)。類似地，術語「多肽」在本說明書中可與「突變體多肽」及「新抗原多肽」互換使用以指定一系列彼此通常藉由在毗鄰胺基酸之α-胺基與羧基之間之肽鍵連接之殘基(例如L-胺基酸)。多肽或肽可具有各個長度，其呈中性(不帶電)形式或呈作為鹽之形式，且不含諸如醣基化、側鏈氧化或磷酸化等修飾或含有該等修飾，經受修飾不破壞如本文所闡述之多肽之生物活性之條件。

在一些實施例中，使用測序方法來鑑別腫瘤特異性突變。根據本發明可使用任一適宜測序方法，例如，次世代定序(NGS)技術。未來第三代測序方法可能取代NGS技術以提高該方法之測序步驟之速度。出於澄清目的：術語「次世代定序」或「NGS」在本發明之上下文中意味著所有新穎高通量測序技術皆與稱為Sanger化學之「習用」測序方法相反，其係藉由沿整個基因體將整個基因體斷裂為小碎片隨機平行讀取核酸模板。該等 NGS技術(亦稱為大量平行測序技術)能在極短時間段內(例如在1-2週內，例如，在1-7天內或在短於24小時內)遞送全基因體、外顯子體、轉錄體(基因體之所有轉錄序列)或甲基體(methylome)(基因體之所有甲基化序列)之核酸序列資訊，且原則上容許單細胞測序方法。在本發明之上下文中可使用可自市面購得或在文獻中提及之多個NGS平臺，例如在WO 2012/159643中詳細闡述之彼等。

在某些實施例中，本文所闡述之新抗原肽分子可包含(但不限於)約5個、約6個、約7個、約8個、約9個、約10個、約11個、約12個、約13個、約14個、約15個、約16個、約17個、約18個、約19個、約20個、約21個、約22個、約23個、約24個、約25個、約26個、約27個、約28個、約29個、約30個、約31個、約32個、約33個、約34個、約35個、約36個、約37個、約38個、約39個、約40個、約41個、約42個、約43個、約44個、約45個、約46個、約47個、約48個、約49個、約50個、約60個、約70個、約80個、約90個、約100個、約110個、約120個或更多個胺基酸殘基，及其中衍生之任一範圍。在具體實施例中，新抗原肽分子等於或小於100個胺基酸。

在一些實施例中，本文針對I類MHC所闡述之新抗原肽及多肽具有13個殘基或更小之長度且通常由介於約8個與約11個之間之殘基、具體而言9或10個殘基組成。在一些實施例中，本文針對II類MHC所闡述之新抗原肽及多肽具有9-24個殘基之長度。

可以若干方式設計較長新抗原肽。在一些實施例中，當預測或已知HLA結合肽時，較長新抗原肽可由以下組成：(1)朝向每一相應基因產物之N-及C-末端延伸2-5個胺基酸之個別結合肽；或(2)結合肽中之一部分或 全部與各自之延伸序列拼接。在其他實施例中，當測序揭露存在於腫瘤中之長(>10個殘基)新表位序列(例如歸因於產生新穎肽序列之框移、通讀或內含子納入)時，較長新抗原肽可由整段呈單一較長肽或若干重疊較長肽之新穎腫瘤特異性胺基酸組成。在一些實施例中，推測使用較長肽容許患者細胞進行內源性處理且可引起T細胞反應之更有效抗原呈遞及誘導。在一些實施例中，可使用兩種或更多種肽，其中該等肽重疊且平鋪於長的新抗原肽上方。

在一些實施例中，新抗原肽及多肽結合HLA蛋白(例如，I類HLA或II類HLA)。在特定實施例中，新抗原肽及多肽以大於相應野生型肽之親和力結合HLA蛋白。在特定實施例中，新抗原肽或多肽具有至少小於5000nM、至少小於500nM、至少小於100nM、至少小於50nM或更小之IC₅₀。

在一些實施例中，新抗原肽可具有約8及約50個胺基酸殘基之長度或約8及約30個、約8及約20個、約8及約18個、約8及約15個或約8及約12個胺基酸殘基之長度。在一些實施例中，新抗原肽可具有約8及約500個胺基酸殘基之長度或約8及約450個、約8及約400個、約8及約350個、約8及約300個、約8及約250個、約8及約200個、約8及約150個、約8及約100個、約8及約50個或約8及約30個胺基酸殘基之長度。

在一些實施例中，新抗原肽可具有至少8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個、30個、31個、32個、33個、34個、35個、36個、37個、38個、39個、40個、41個、42個、43個、44個、45個、46個、47個、48個、49個、50個或更多個胺基 酸殘基之長度。在一些實施例中，新抗原肽可具有至少8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個、30個、31個、32個、33個、34個、35個、36個、37個、38個、39個、40個、41個、42個、43個、44個、45個、46個、47個、48個、49個、50個、55個、60個、70個、80個、90個、100個、150個、200個、250個、300個、350個、400個、450個、500個或更多個胺基酸殘基之長度。在一些實施例中，新抗原肽可具有至多8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個、30個、31個、32個、33個、34個、35個、36個、37個、38個、39個、40個、41個、42個、43個、44個、45個、46個、47個、48個、49個、50個或更少胺基酸殘基之長度。在一些實施例中，新抗原肽可具有至多8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個、30個、31個、32個、33個、34個、35個、36個、37個、38個、39個、40個、41個、42個、43個、44個、45個、46個、47個、48個、49個、50個、55個、60個、70個、80個、90個、100個、150個、200個、250個、300個、350個、400個、450個、500個或更少胺基酸殘基之長度。

在一些實施例中，新抗原肽之總長度為至少8個、至少9個、至少10個、至少11個、至少12個、至少13個、至少14個、至少15個、至少16個、至少17個、至少18個、至少19個、至少20個、至少21個、至少22個、至少23個、至少24個、至少25個、至少26個、至少27個、至少28 個、至少29個、至少30個、至少40個、至少50個、至少60個、至少70個、至少80個、至少90個、至少100個、至少150個、至少200個、至少250個、至少300個、至少350個、至少400個、至少450個或至少500個胺基酸。

在一些實施例中，新抗原肽之總長度為至多8個、至多9個、至多10個、至多11個、至多12個、至多13個、至多14個、至多15個、至多16個、至多17個、至多18個、至多19個、至多20個、至多21個、至多22個、至多23個、至多24個、至多25個、至多26個、至多27個、至多28個、至多29個、至多30個、至多40個、至多50個、至多60個、至多70個、至多80個、至多90個、至多100個、至多150個、至多200個、至多250個、至多300個、至多350個、至多400個、至多450個或至多500個胺基酸。

在一些實施例中，新抗原肽可具有約0.5及約12、約2至約10或約4及約8之pI值。在一些實施例中，新抗原肽可具有至少4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5或更大之pI值。在一些實施例中，新抗原肽可具有至多4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5或更小之pI值。

在一些實施例中，新抗原肽可具有介於約1pM與約1mM、約100pM與約500μM、約500pM與約10μM、約1nM與約1μM或約10nM與約1μM之間之HLA結合親和力。在一些實施例中，新抗原肽可具有至少2μM、3μM、4μM、5μM、6μM、7μM、8μM、9μM、10μM、15μM、20μM、25μM、30μM、35μM、40μM、45μM、50μM、55μM、60μM、65μM、70μM、75μM、80μM、85μM、90μM、95μM、100μM、150μM、200μM、250μM、300μM、350μM、400μM、450 μM、500μM、550μM、600μM、700μM、800μM、900μM或更大之HLA結合親和力。在一些實施例中，新抗原肽可具有至多2μM、3μM、4μM、5μM、6μM、7μM、8μM、9μM、10μM、15μM、20μM、25μM、30μM、35μM、40μM、45μM、50μM、55μM、60μM、65μM、70μM、75μM、80μM、85μM、90μM、95μM、100μM、150μM、200μM、250μM、300μM、350μM、400μM、450μM、500μM、550μM、600μM、700μM、800μM、900μM之HLA結合親和力。

在一些實施例中，本文所闡述之新抗原肽可包含業內熟知之彼等載劑，例如，甲狀腺球蛋白、白蛋白(例如人類血清白蛋白)、破傷風類毒素、聚胺基酸殘基(例如聚L-離胺酸)、聚L-麩胺酸、流行性感冒病毒蛋白、B型肝炎病毒核心蛋白及諸如此類。

在一些實施例中，本文所闡述之新抗原肽可藉由末端-NH₂醯化(例如藉由烷醯基(C₁-C₂₀)或巰基乙醯基乙醯化)、末端-羧基醯胺化(例如，氨、甲胺等)來修飾。在一些實施例中，該等修飾可提供用於連接至載體或其他分子之位點。

在一些實施例中，本文所闡述之新抗原肽可含有諸如(但不限於)以下之修飾：醣基化、側鏈氧化、生物素化、磷酸化、添加表面活性材料(例如脂質)或可經化學修飾，例如，乙醯化等。此外，肽中之鍵可能與肽鍵不同，例如，共價鍵、酯或醚鍵、二硫鍵、氫鍵、離子鍵等。

在一些實施例中，本文所闡述之新抗原肽可含有用於改變所得肽之物理性質(例如，穩定性或溶解性)之取代。例如，新抗原肽可藉由用α-胺基丁酸(「B」)取代半胱胺酸(C)來修飾。由於半胱胺酸之化學性質，其傾 向於形成二硫橋且在結構上充分改變肽以便降低結合能力。用α-胺基丁酸取代C不僅緩和此問題，且在某些情況中實際上改良結合及交叉結合能力。用α-胺基丁酸取代半胱胺酸可在新抗原肽之任一殘基處進行，例如，在肽內表位或類似物之錨定或非錨定位置或在肽之其他位置進行。

在一些實施例中，本文所闡述之新抗原肽可包含胺基酸模擬物或非天然胺基酸殘基，例如D-或L-萘基丙胺酸；D-或L-苯基甘胺酸；D-或L-2-噻吩基丙胺酸；D-或L-1、-2、3-或4-芘基丙胺酸；D-或L-3噻吩基丙胺酸；D-或L-(2-吡啶基)-丙胺酸；D-或L-(3-吡啶基)-丙胺酸；D-或L-(2-吡嗪基)-丙胺酸；D-或L-(4-異丙基)-苯基甘胺酸；D-(三氟甲基)-苯基甘胺酸；D-(三氟-甲基)-苯丙胺酸；D-ρ-氟苯丙胺酸；D-或L-ρ-聯苯-苯丙胺酸；D-或L-ρ-甲氧基聯苯苯丙胺酸；D-或L-2-吲哚(烯丙基)丙胺酸；及D-或L-烷基丙胺酸，其中烷基可經甲基、乙基、丙基、己基、丁基、戊基、異丙基、異丁基、第二異丁基、異戊基或非酸性胺基酸殘基取代或未經取代。非天然胺基酸之芳香族環包括(例如)噻唑基、噻吩基、吡唑基、苯并咪唑基、萘基、呋喃基、吡咯基及吡啶基芳香族環。具有各種胺基酸模擬物或非天然胺基酸殘基之經修飾肽尤其有用，乃因其往往表現增加之活體內穩定性。該等肽亦可具有改良之儲放壽命或製造性質。

可以多種方式分析肽穩定性。例如，已使用肽酶及各種生物培養基(例如人類血漿及血清)來測試穩定性。例如參見，Verhoef等人，Eur.J.Drug Metab.Pharmacokinetics 11：291(1986)。本文所闡述肽之半衰期可便捷地使用25%人類血清(v/v)分析來測定。方案係如下：使用前藉由離心破壞彙集之人類血清(AB型，非熱去活化)。然後用RPMI-1640或另一適宜組織培養基將血清稀釋至25%。以預定時間間隔，移除少量反應溶液並 將其添加至6%三氯乙酸(TCA)水溶液或乙醇中。使渾濁反應試樣冷卻(4℃)15分鐘且然後旋轉以使經沈澱血清蛋白成團。然後藉由反相HPLC使用穩定性特異性層析條件確定肽之存在。

在一些實施例中，本文所闡述之新抗原肽可呈溶液、凍乾形式或可呈晶體形式。

在一些實施例中，本文所闡述之新抗原肽可藉由重組體DNA技術或化學合成以合成方式製備或可自天然來源(例如天然腫瘤或致病性生物體)分離。表位可個別地合成或在肽中直接或間接接合。儘管本文所闡述之新抗原肽將實質上不含其他天然宿主細胞蛋白及其片段，但在一些實施例中，肽可以合成方式偶聯以與天然片段或粒子接合。

在一些實施例中，本文所闡述之新抗原肽可以眾多種方式來製備。在一些實施例中，肽可在溶液中或在固體載體上根據習用技術合成。各種自動合成器可自市面購得且可根據已知方案使用。(例如參見，Stewart及Young,SOLID PHASE PEPTIDE SYNTHESIS,2D.ED.,Pierce Chemical Co.,1984)。另外，個別肽可使用化學連接來接合以產生仍在本發明之界限內之較大肽。

另一選擇為，可採用重組DNA技術，其中編碼肽之核苷酸序列係插入表現載體中、轉變或轉染至適當宿主細胞中且在適於表現之條件下培養。該等程序通常為業內已知，通常如Sambrook等人，MOLECULAR CLONING,A LABORATORY MANUAL,Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989)中所闡述。因此，可使用包含一或多種本文所述表位或由其組成之重組肽來呈遞適當T細胞表位。

在一態樣中，本文所闡述之本發明亦提供包含一種、至少兩種或兩 種以上新抗原肽之組合物。在一些實施例中，本文所闡述之組合物含有至少兩種不同的肽。在一些實施例中，該至少兩不同的肽係自同一多肽衍生。不同多肽意味著肽之長度、胺基酸序列或二者有變化。肽係衍生自任一已知或發現含有腫瘤特異性突變之多肽。

在一些實施例中，經分離新抗原肽係由具有引起天然肽之胺基酸取代之點突變之基因編碼。

在一些實施例中，經分離新抗原肽係由ABL基因編碼。在相關實施例中，A_xB_yC_z係

(SEQ ID NO：1)、

(SEQ ID NO： 12)

(SEQ ID NO：3)、

(SEQ ID NO：4)或

(SEQ ID NO：5)。

在一些實施例中，經分離新抗原肽係由ALK基因編碼。在相關實施例中，A_xB_yC_z係

(SEQ ID NO：6)或

(SEQ ID NO：7)。

在一些實施例中，經分離新抗原肽係由BRAF基因編碼。在相關實施例中，A_xB_yC_z係

(SEQ ID NO：8)。在一些相關實施例中，新抗原肽不為DFGLATEKSR(SEQ ID NO：144)或FGLATEKSRW(SEQ ID NO：145)。

在一些實施例中，經分離新抗原肽係由BTK基因編碼。在相關實施例中，A_xB_yC_z係

(SEQ ID NO：9)。

在一些實施例中，經分離新抗原肽係由EEF1B2基因編碼。在相關實施例中，A_xB_yC_z係MGFGDLKSPAGLQVLNDYLADKSYIEGYVPSQADVAVFEAVSGPPPAD LCHALRWYNHIKSYEKEKASLPGVKKALGKYGPADVEDTTGSGAT(SEQ ID NO：10)。在一些相關實施例中，新抗原肽不為EAVSGPPPA(SEQ ID NO：146),FEAVSGPPP(SEQ ID NO：147)或FEAVSGPPPA(SEQ ID NO：148)。

在一些實施例中，經分離新抗原肽係由EGFR基因編碼。在相關實施例中，A_xB_yC_z係

(SEQ ID NO：149)或

(SEQ ID NO：12)。

在一些實施例中，經分離新抗原肽係由ERBB3基因編碼。在相關實施例中，A_xB_yC_z係EFSTLPLPNLRMVRGTQVYDGKF(SEQ ID NO：150)。在一些相關實施例中，新抗原肽不為RMVRGTQVY(SEQ ID NO：151)、LPLPNLRMV(SEQ ID NO：152)、LRMVRGTQV(SEQ ID NO：153)、TLPLPNLRMV(SEQ ID NO：154)、NLRMVRGTQV(SEQ ID NO：155)或LRMVRGTQVY(SEQ ID NO：156)。

在一些實施例中，經分離新抗原肽係由ESR1基因編碼。在相關實施例中，A_xB_yC_z係

(SEQ ID NO：14)、

(SEQ ID NO：15)、

(SEQ ID NO：16)、

(SEQ ID NO：17)或

(SEQ ID NO：18)。

在一些實施例中，經分離新抗原肽係由FGFR3基因編碼。在相關實施例中，A_xB_yC_z係

(SEQ ID NO：19)。在一些相關實施例中，新抗原肽不為DVLERCPHR(SEQ ID NO：157)、LERCPHRPI(SEQ ID NO：158)、CPHRPILQA(SEQ ID NO：159)或LERCPHRPIL(SEQ ID NO：160)。

在一些實施例中，經分離新抗原肽係由FRG1B基因編碼。在相關實施例中，A_xB_yC_z係

(SEQ ID NO：20)。在一些相關實施例中，新抗原肽不為SASNSCFIR(SEQ ID NO：161)、LSASNSCFI(SEQ ID NO：162)、ALSASNSCF(SEQ ID NO：163)或FQNGKMALSA(SEQ ID NO：164)。

在一些實施例中，經分離新抗原肽係由HER2基因編碼。在相關實施例中，A_xB_yC_z係

(SEQ ID NO：21)。

在一些實施例中，經分離新抗原肽係由IDH1基因編碼。在相關實施例中，A_xB_yC_z係

(SEQ ID NO：22)、

(SEQ ID NO：23)、

(SEQ ID NO：24)或

(SEQ ID NO：25)。在一些相關實施例中，新抗原肽不為PIIIGHHAY(SEQ ID NO：165)、GHHAYGDQY(SEQ ID NO：166)、 KPIIIGHHAY(SEQ ID NO：167)、IGHHAYGDQY(SEQ ID NO：168)、PIIIGCHAY(SEQ ID NO：169)、GCHAYGDQY(SEQ ID NO：170)、KPIIIGCHAY(SEQ ID NO：171)、IGCHAYGDQY(SEQ ID NO：172)、PIIIGGHAY(SEQ ID NO：173)、GGHAYGDQY(SEQ ID NO：174)、KPIIIGGHAY(SEQ ID NO：175)或IGGHAYGDQY(SEQ ID NO：176)。

在一些實施例中，經分離新抗原肽係由KIT基因編碼。在相關實施例中，A_xB_yC_z係

(SEQ ID NO：26)或

(SEQ ID NO：26)。

在一些實施例中，經分離新抗原肽係MEK基因。在相關實施例中，A_xB_yC_z係

(SEQ ID NO：27)或

(SEQ ID NO：28)。

在一些實施例中，經分離新抗原肽係由MYC基因編碼。在相關實施例中，A_xB_yC_z係 MPLNVSFTNRNYDLDYDSVQPYFYCDEEENFYQQQQQSDLQPPAPSEDIWKKFELLPTPPLSPSRRSGLCSPSYVAVTPFSLRGDNDGG(SEQ ID NO：29)、

(SEQ ID NO：30)或

(SEQ ID NO：31)。

在一些實施例中，經分離新抗原肽係由PDGFRa基因編碼。在相關實施例中，A_xB_yC_z係

(SEQ ID NO：32)。

在一些實施例中，經分離新抗原肽係由PIK3CA基因編碼。在相關實施例中，A_xB_yC_z係

(SEQ ID NO：33)、

(SEQ ID NO：34)或LFINLFSMMLGSGMPELQSFDDIAYIRKTLALDKTEQEALEYFMKQM NDARHGGWTTKMDWIFHTIKQHALN(SEQ ID NO：35)。在一些相關實施例中，新抗原肽不為ISTRDPLSK(SEQ ID NO：177)、STRDPLSKI(SEQ ID NO：178)、LSKITEQEK(SEQ ID NO：179)、AISTRDPLSK(SEQ ID NO：180)、SKITEQEKDF(SEQ ID NO：181)、SEITKQEKDF(SEQ ID NO：182)、KQEKDFLWSH(SEQ ID NO：183)、FMKQMNDAR(SEQ ID NO：184)、KQMNDARHG(SEQ ID NO：185)、RHGGWTTKM(SEQ ID NO：186)、YFMKQMNDAR(SEQ ID NO：187)、FMKQMNDARH(SEQ ID NO：188)、KQMNDARHGG(SEQ ID NO：189)、QMNDARHGGW(SEQ ID NO：190)或ARHGGWTTKM(SEQ ID NO：191)。

在一些實施例中，經分離新抗原肽係由POLE基因編碼。在相關實施例中，A_xB_yC_z係

(SEQ ID NO：36)。在一些相關實施例中，新抗原肽不為TTKLPLKFR(SEQ ID NO：192)、RDAETDQIM(SEQ ID NO：193)、KFRDAETDQI(SEQ ID NO：194)、ETTKLPLKFR(SEQ ID NO：195)或RDAETDQIMM(SEQ ID NO：196)。

在一些實施例中，經分離新抗原肽係由PTEN基因編碼。在相關實施例中，A_xB_yC_z係

(SEQ ID NO：37)。在一些相關實施例中，新抗原肽不為 QTGVMICAY(SEQ ID NO：197)、GKGQTGVMI(SEQ ID NO：198)、GQTGVMICAY(SEQ ID NO：199)或KAGKGQTGVM(SEQ ID NO：200)。

在一些實施例中，經分離新抗原肽係由RAC1基因編碼。在相關實施例中，A_xB_yC_z係MQAIKCVVVGDGAVGKTCLLISYTTNAFSGEYIPTVFDNYSANVMVDGKPVNLGLWDTAGQEDYDRLRPLSYPQTVGET(SEQ ID NO：38)。在一些相關實施例中，新抗原肽不為TTNAFSGEY(SEQ ID NO：201)、FSGEYIPTV(SEQ ID NO：202)、SGEYIPTVF(SEQ ID NO：203)、YTTNAFSGEY(SEQ ID NO：204)、TTNAFSGEYI(SEQ ID NO：205)或FSGEYIPTVF(SEQ ID NO：206)。

在一些實施例中，經分離新抗原肽係由TP53基因編碼。在相關實施例中，A_xB_yC_z係

(SEQ ID NO：39)、

(SEQ ID NO：40)、

(SEQ ID NO：41)、

(SEQ ID NO：42)或

(SEQ ID NO：43)。在一些相關實施例中，新抗原肽不為SSCMGSMNR(SEQ ID NO：207)、GSMNRRPIL(SEQ ID NO：208)、MGSMNRRPI(SEQ ID NO：209)、CNSSCMGSM(SEQ ID NO：210)、SMNRRPILTI(SEQ ID NO：211)、SSCMGSMNRR(SEQ ID NO：212)、NSSCMGSMNR(SEQ ID NO：213)、MGSMNRRPIL(SEQ ID NO：214)、MCNSSCMGSM(SEQ ID NO：215)、CMGSMNRRPI(SEQ ID NO：216)、TEVVRHCPH(SEQ ID NO：217)、VVRHCPHHER(SEQ ID NO：218)、SQHMTEVVRH(SEQ ID NO：219)、MNQRPILTI(SEQ ID NO：220)、NQRPILTII(SEQ ID NO：221)、CMGGMNQRPI(SEQ ID NO：222)、GMNQRPILTI(SEQ ID NO：223)、SSCMGGMNQR(SEQ ID NO：224)、NQRPILTIIT(SEQ ID NO：225)、NWRPILTII(SEQ ID NO：226)、SSCMGGMNW(SEQ ID NO：227)、MGGMNWRPI(SEQ ID NO：228)、MNWRPILTI(SEQ ID NO：229)、CMGGMNWRPI(SEQ ID NO：230)、GMNWRPILTI(SEQ ID NO：231)、SSCMGGMNWR(SEQ ID NO：232)、MNWRPILTII(SEQ ID NO：233)、NSSCMGGMNW(SEQ ID NO：234)、NSFEVCVCA(SEQ ID NO：235)、EVCVCACPGR(SEQ ID NO：236)或FEVCVCACPG(SEQ ID NO：237)。

在一些實施例中，經分離新抗原肽係由具有框移突變之基因編碼。

在一些實施例中，經分離新抗原肽係由ACVR2A基因編碼。在相關實施例中，A_xB_yC_z係GVEPCYGDKDKRRHCFATWKNISGSIEIVKQGCWLDDINCYDRTDCVEKKRQP(SEQ ID NO：83)或

(SEQ ID NO：84)。

在一些實施例中，經分離新抗原肽係C15ORF40基因。在相關實施例中，A_xB_yC_z係

(SEQ ID NO：85)。

在一些實施例中，經分離新抗原肽係由CNOT1基因編碼。在相關實施例中，A_xB_yC_z係LSVIIFFFVYIWHWALPLILNNHHICLMSSIILDCNSVRQSIMSVCFFFFSVIFSTRCLTDSRYPNICWFK(SEQ ID NO：86)或LSVIIFFFVYIWHWALPLILNNHHICLMSSIILDCNSVRQSIMSVCFFFFCYILNTMFDR(SEQ ID NO：87)。

在一些實施例中，經分離新抗原肽係由EIF2B3基因編碼。在相關實施例中，A_xB_yC_z係

(SEQ ID NO：88)。

在一些實施例中，經分離新抗原肽係由EPHB2基因編碼。在相關實施例中，A_xB_yC_z係

(SEQ ID NO：89)。

在一些實施例中，經分離新抗原肽係由ESRP1基因編碼。在相關實施例中，A_xB_yC_z係LDFLGEFATDIRTHGVHMVLNHQGRPSGDAFIQMKSADRAFMAAQKCHKKKHEGQIC(SEQ ID NO：90)或LDFLGEFATDIRTHGVHMVLNHQGRPSGDAFIQMKSADRAFMAAQKCHKKT(SEQ ID NO：91)。

在一些實施例中，經分離新抗原肽係由FAM11B基因編碼。在相關實施例中，A_xB_yC_z係GALCKDGRFRSDIGEFEWKLKEGHKKIYGKQSMVDEVSGKVLEMDISKKKHYNRKISIKKLNRMKVPLMKLITRV(SEQ ID NO：92)。在一些相關實施例中，新抗原肽不為KLNRMKVPL(SEQ ID NO：238)、PLMKLITRV(SEQ ID NO：239)、RMKVPLMKL(SEQ ID NO：240)、ISKKKHYNR(SEQ ID NO：241)、SKKKHYNRK(SEQ ID NO：242)、KHYNRKISI(SEQ ID NO：243)、HYNRKISIK(SEQ ID NO：244)、YNRKISIKK(SEQ ID NO：245)、KISIKKLNR(SEQ ID NO：246)、SIKKLNRMK(SEQ ID NO：247)、LNRMKVPLM(SEQ ID NO：248)、ISIKKLNRM(SEQ ID NO：249)、MKVPLMKLI(SEQ ID NO：250)、KLNRMKVPLM(SEQ ID NO：251)、RMKVPLMKLI(SEQ ID NO： 252)、ISIKKLNRMK(SEQ ID NO：253)、ISKKKHYNRK(SEQ ID NO：254)、KHYNRKISIK(SEQ ID NO：255)、HYNRKISIKK(SEQ ID NO：256)、KISIKKLNRM(SEQ ID NO：257)、SIKKLNRMKV(SEQ ID NO：258)、LNRMKVPLMK(SEQ ID NO：259)、KVPLMKLITR(SEQ ID NO：260)、DISKKKHYNR(SEQ ID NO：261)、KKHYNRKISI(SEQ ID NO：262)、KKLNRMKVPL(SEQ ID NO：263)或VPLMKLITRV(SEQ ID NO：264)。

在一些實施例中，經分離新抗原肽係由GBP3基因編碼。在相關實施例中，A_xB_yC_z係RERAQLLEEQEKTLTSKLQEQARVLKERCQGESTQLQNEIQKLQKTLKKKPRDICRIS(SEQ ID NO：93)。

在一些實施例中，經分離新抗原肽係由JAK1基因編碼。在相關實施例中，A_xB_yC_z係VNTLKEGKRLPCPPNCPDEVYQLMRKCWEFQPSNRTSFQNLIEGFEALLKTSN(SEQ ID NO：94)或CRPVTPSCKELADLMTRCMNYDPNQRPFFRAIMRDINKLEEQNPDIVSEKNQQLKWTPHILKSAS(SEQ ID NO：95)。

在一些實施例中，經分離新抗原肽係由LMAN1基因編碼。在相關實施例中，A_xB_yC_z係DDHDVLSFLTFQLTEPGKEPPTPDKEISEKEKEKYQEEFEHFQQELDKKKRGIPEGPPRPPRAACGGNI(SEQ ID NO：96)或DDHDVLSFLTFQLTEPGKEPPTPDKEISEKEKEKYQEEFEHFQQELDKKKRNSRRATPTSKGSLRRKYLRV(SEQ ID NO：97)。

在一些實施例中，經分離新抗原肽係由MSH3基因編碼。在相關實施例中，A_xB_yC_z係TKSTLIGEDVNPLIKLDDAVNVDEIMTDTSTSYLLCISENKENVRDKKKGQHFYWHCGSAACHRRGCV(SEQ ID NO：98)或LYTKSTLIGEDVNPLIKLDDAVNVDEIMTDTSTSYLLCISENKENVRDKKRATFLLALWECSLPQARLCLIVSRTLLLVQS(SEQ ID NO：99)。

在一些實施例中，經分離新抗原肽係由NDUFC2基因編碼。在相關實施例中，A_xB_yC_z係LPPPKLTDPRLLYIGFLGYCSGLIDNLIRRRPIATAGLHRQLLYITAFFFCWILSCKT(SEQ ID NO：100)或SLPPPKLTDPRLLYIGFLGYCSGLIDNLIRRRPIATAGLHRQLLYITAFFLLDIIL(SEQ ID NO：101)。

在一些實施例中，經分離新抗原肽係由RBM27基因編碼。在相關實施例中，A_xB_yC_z係

(SEQ ID NO：102)。

在一些實施例中，經分離新抗原肽係由RPL22基因編碼。在相關實施例中，A_xB_yC_z係MAPVKKLVVKGGKKKEASSEVHS(SEQ ID NO：103)或MAPVKKLVVKGGKKRSKF(SEQ ID NO：104)。在一些相關實施例中，新抗原肽不為VVKGGKKRSK(SEQ ID NO：265)或VKGGKKRSK(SEQ ID NO：266)。

在一些實施例中，經分離新抗原肽係由SEC31A基因編碼。在相關實 施例中，A_xB_yC_z係MPSHQGAEQQQQQHHVFISQVVTEKEFLSRSDQLQQAVQSQGFINYCQKKN(SEQ ID NO：105)或MPSHQGAEQQQQQHHVFISQVVTEKEFLSRSDQLQQAVQSQGFINYCQKKLMLLRLNLRKMCGPF(SEQ ID NO：106)。

在一些實施例中，經分離新抗原肽係由SEC63基因編碼。在相關實施例中，A_xB_yC_z係AEVFEKEQSICAAEEQPAEDGQGETNKNRTKGGWQQKSKGPKKTAKSKKKETFKKKTYTCAITTVKATETKAGKWSRWE(SEQ ID NO：107)或MAEVFEKEQSICAAEEQPAEDGQGETNKNRTKGGWQQKSKGPKKTAKSKKRNL(SEQ ID NO：108)。

在一些實施例中，經分離新抗原肽係由SLC35F5基因編碼。在相關實施例中，A_xB_yC_z係NIMEIRQLPSSHALEAKLSRMSYPVKEQESILKTVGKLTATQVAKISFFFALCGFWQICHIKKHFQTHKLL(SEQ ID NO：109)。

在一些實施例中，經分離新抗原肽係由SMAP1基因編碼。在相關實施例中，A_xB_yC_z係YEKKKYYDKNAIAITNISSSDAPLQPLVSSPSLQAAVDKNKLEKEKEKKKGREKERKGARKAGKTTYS(SEQ ID NO：110)或

(SEQ ID NO：111)。在一些相關實施例中，新抗原肽不為 ALKKLRSPL(SEQ ID NO：267)、KISNWSLKK(SEQ ID NO：268)、SLKKVPALK(SEQ ID NO：269)、KLRSPLWIF(SEQ ID NO：270)、KKRKRKREK(SEQ ID NO：271)、RKREKRSQK(SEQ ID NO：272)、RSQKSRQNH(SEQ ID NO：273)、SQKSRQNHL(SEQ ID NO：274)、KSRQNHLQL(SEQ ID NO：275)、RRKISNWSL(SEQ ID NO：276)、RKISNWSLK(SEQ ID NO：277)、KVPALKKLR(SEQ ID NO：278)、HLQLKSCRR(SEQ ID NO：279)、WSLKKVPAL(SEQ ID NO：280)、RQNHLQLKS(SEQ ID NO：281)、KKVPALKKL(SEQ ID NO：282)、LKKLRSPLW(SEQ ID NO：283)、KKLRSPLWI(SEQ ID NO：284)、KISNWSLKKV(SEQ ID NO：285)、KSRQNHLQLK(SEQ ID NO：286)、SLKKVPALKK(SEQ ID NO：287)、WSLKKVPALK(SEQ ID NO：288)、KRKREKRSQK(SEQ ID NO：289)、RSQKSRQNHL(SEQ ID NO：290)、HLQLKSCRRK(SEQ ID NO：291)、RRKISNWSLK(SEQ ID NO：292)、CRRKISNWSL(SEQ ID NO：293)、NWSLKKVPAL(SEQ ID NO：294)、QKSRQNHLQL(SEQ ID NO：295)、RQNHLQLKSC(SEQ ID NO：296)、LQLKSCRRKI(SEQ ID NO：297)、ALKKLRSPLW(SEQ ID NO：298)或KKLRSPLWI(SEQ ID NO：284)。

在一些實施例中，經分離新抗原肽係由TFAM基因編碼。在相關實施例中，A_xB_yC_z係IYQDAYRAEWQVYKEEISRFKEQLTPSQIMSLEKEIMDKHLKRKAMTKKKRVNTAWKTKKTSFSL(SEQ ID NO：112)或IYQDAYRAEWQVYKEEISRFKEQLTPSQIMSLEKEIMDKHLKRKAMT KKKS(SEQ ID NO：113)。

在一些實施例中，經分離新抗原肽係由TGFBR2基因編碼。在相關實施例中，A_xB_yC_z係KPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKAW(SEQ ID NO：114)或EKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKSLVRLSSCVPVALMSAMTTSSSQKNITPAILTCC(SEQ ID NO：115)。

在一些實施例中，經分離新抗原肽係由THAP5基因編碼。在相關實施例中，A_xB_yC_z係VPSKYQFLCSDHFTPDSLDIRWGIRYLKQTAVPTIFSLPEDNQGKDPSKKNPRRKTWKMRKKYAQKPSQKNHLY(SEQ ID NO：116)。

在一些實施例中，經分離新抗原肽係由TTK基因編碼。在相關實施例中，A_xB_yC_z係GTTEEMKYVLGQLVGLNSPNSILKAAKTLYEHYSGGESHNSSSSKTFEKKGEKNDLQLFVMSDTTYKIYWTVILLNPCGNLHLKTTSL(SEQ ID NO：117)。

在一些實施例中，經分離新抗原肽係由XPOT基因編碼。在相關實施例中，A_xB_yC_z係QQLIRETLISWLQAQMLNPQPEKTFIRNKAAQVFALLFVTEYLTKWPKFFLTFSQ(SEQ ID NO：118)。

在一些實施例中，經分離新抗原肽係由APC基因編碼。在相關實施例中，C_z係 AKFQQCHSTLEPNPADCRVLVYLQNQPGTKLLNFLQERNLPPKVVLRHPKVHLNTMFRRPHSCLADVLLSVHLIVLRVVRLPAPFRVNHAVEW(SEQ ID NO：44)、APVIFQIALDKPCHQAEVKHLHHLLKQLKPSEKYLKIKHLLLKRERVDLSKLQ(SEQ ID NO：45)或MLQFRGSRFFQMLILYYILPRKVLQMDFLVHPA(SEQ ID NO：46)。在一些相關實施例中，新抗原肽不為ADVLLSVHL(SEQ ID NO：299)、ADVLLSVHLI(SEQ ID NO：300)、APFRVNHAV(SEQ ID NO：301)、ARHKAVEFL(SEQ ID NO：302)、CLADVLLSV(SEQ ID NO：303)、CLADVLLSVH(SEQ ID NO：304)、DVLLSVHLI(SEQ ID NO：305)、DVLLSVHLIV(SEQ ID NO：306)、FLQERNLPPK(SEQ ID NO：307)、FRVNHAVEW(SEQ ID NO：308)、HLIVLRVVR(SEQ ID NO：309)、HLIVLRVVRL(SEQ ID NO：310)、HLNTMFRRPH(SEQ ID NO：311)、HPKVHLNTM(SEQ ID NO：312)、HPKVHLNTMF(SEQ ID NO：313)、KAVEFLQER(SEQ ID NO：314)、KVHLNTMFR(SEQ ID NO：315)、KVHLNTMFRR(SEQ ID NO：316)、KVVLRHPKV(SEQ ID NO：317)、LLSVHLIVL(SEQ ID NO：318)、LLSVHLIVLR(SEQ ID NO：319)、LPAPFRVNH(SEQ ID NO：320)、LPAPFRVNHA(SEQ ID NO：321)、LQERNLPPKV(SEQ ID NO：322)、LRVVRLPAPF(SEQ ID NO：323)、LSVHLIVLR(SEQ ID NO：324)、LSVHLIVLRV(SEQ ID NO：325)、MFRRPHSCL(SEQ ID NO：326)、MFRRPHSCLA(SEQ ID NO：327)、NLPPKVVLR(SEQ ID NO：328)、NTMFRRPHSC(SEQ ID NO：329)、QERNLPPKV(SEQ ID NO：330)、RHPKVHLNTM(SEQ ID NO： 331)、RNLPPKVVL(SEQ ID NO：332)、RNLPPKVVLR(SEQ ID NO：333)、RPHSCLADV(SEQ ID NO：334)、RPHSCLADVL(SEQ ID NO：335)、RVVRLPAPF(SEQ ID NO：336)、RVVRLPAPFR(SEQ ID NO：337)、SARHKAVEFL(SEQ ID NO：338)、SVHLIVLRV(SEQ ID NO：339)、SVHLIVLRVV(SEQ ID NO：340)、TMFRRPHSC(SEQ ID NO：341)、TMFRRPHSCL(SEQ ID NO：342)、VEFLQERNL(SEQ ID NO：343)、VLLSVHLIV(SEQ ID NO：344)、VLLSVHLIVL(SEQ ID NO：345)、VLRHPKVHL(SEQ ID NO：346)、VLRVVRLPA(SEQ ID NO：347)、VVRLPAPFR(SEQ ID NO：348)或VVRLPAPFRV(SEQ ID NO：349)。

在一些實施例中，經分離新抗原肽係由ARID1A基因編碼。在相關實施例中，C_z係

(SEQ ID NO：47)、AHQGFPAAKESRVIQLSLLSLLIPPLTCLASEALPRPLLALPPVLLSLAQDHSRLLQCQATRCHLGHPVASRTASCILP(SEQ ID NO：48)、

(SEQ ID NO：49)、

(SEQ ID NO：50)、RTNPTVRMRPHCVPFWTGRILLPSAASVCPIPFEACHLCQAMTLRCPNTQGCCSSWAS(SEQ ID NO：51)或TNQALPKIEVICRGTPRCPSTVPPSPAQPYLRVSLPEDRYTQAWAPTSRTPWGAMVPRGVSMAHKVATPGSQTIMPCPMPTTPVQAWLEA(SEQ ID NO：52)。在一些相關實施例中，新抗原肽不為AAWRSCIAL(SEQ ID NO：350)、AAWRSCIALW(SEQ ID NO：351)、AETVSLHPL(SEQ ID NO：352)、AETVSLHPLA(SEQ ID NO：353)、AHMALLPSG(SEQ ID NO：354)、ALWCASSVT(SEQ ID NO：355)、AMPILPLPQL(SEQ ID NO：356)、APLLAAPSPA(SEQ ID NO：357)、APRTNFHSS(SEQ ID NO：358)、APRTNFHSSL(SEQ ID NO：359)、ASNKLPSLPL(SEQ ID NO：360)、AWRSCIALW(SEQ ID NO：361)、CAGRWLWYCW(SEQ ID NO：362)、CIALWCASSV(SEQ ID NO：363)、CPQPSPSLPA(SEQ ID NO：364)、CRRAVSATSW(SEQ ID NO：365)、CTACHTALGR(SEQ ID NO：366)、DQQAAPRTNF(SEQ ID NO：367)、ETVSLHPLA(SEQ ID NO：368)、FHSSLAETV(SEQ ID NO：369)、GMYSPSRYPR(SEQ ID NO：370)、GQWMAHMAL(SEQ ID NO：371)、GQWMAHMALL(SEQ ID NO：372)、GRCTACHTAL(SEQ ID NO：373)、GTAWQLVPL(SEQ ID NO：374)、HMALLPSGT (SEQ ID NO：375)、HMALLPSGTK(SEQ ID NO：376)、HPLAPMPSK(SEQ ID NO：377)、HSSLAETVSL(SEQ ID NO：378)、HTALGRGSL(SEQ ID NO：379)、IALWCASSV(SEQ ID NO：380)、ILATPPSAA(SEQ ID NO：381)、ILATPPSAAW(SEQ ID NO：382)、IPMAISSPP(SEQ ID NO：383)、IPMAISSPPK(SEQ ID NO：384)、ISSPPKAPL(SEQ ID NO：385)、ISSPPKAPLL(SEQ ID NO：386)、ITSGQWMAHM(SEQ ID NO：387)、KGRCTACHT(SEQ ID NO：388)、KGRCTACHTA(SEQ ID NO：389)、KLPSLPLSK(SEQ ID NO：390)、KLPSLPLSKM(SEQ ID NO：391)、KMYTTSMAM(SEQ ID NO：392)、KMYTTSMAMP(SEQ ID NO：393)、LAAPSPASR(SEQ ID NO：394)、LAAPSPASRL(SEQ ID NO：395)、LAETVSLHPL(SEQ ID NO：396)、LATPPSAAW(SEQ ID NO：397)、LATPPSAAWR(SEQ ID NO：398)、LLAAPSPASR(SEQ ID NO：399)、LLLSADQQAA(SEQ ID NO：400)、LLSADQQAA(SEQ ID NO：401)、LPASNKLPS(SEQ ID NO：402)、LPASNKLPSL(SEQ ID NO：403)、LPLPQLLLS(SEQ ID NO：404)、LPLPQLLLSA(SEQ ID NO：405)、LPSLPLSKM(SEQ ID NO：406)、LPSLPLSKMY(SEQ ID NO：407)、LQCINSNSRI(SEQ ID NO：408)、LQCRRAVSA(SEQ ID NO：409)、LQCRRAVSAT(SEQ ID NO：410)、LSADQQAAPR(SEQ ID NO：411)、LSKMYTTSM(SEQ ID NO：412)、LSKMYTTSMA(SEQ ID NO：413)、LWCASSVTER(SEQ ID NO：414)、LWYCWPTWL(SEQ ID NO：415)、LWYCWPTWLR(SEQ ID NO：416)、MAHMALLPS(SEQ ID NO：417)、MALLPSGTK(SEQ ID NO：418)、MPILPLPQL(SEQ ID NO：419)、MPILPLPQLL(SEQ ID NO：420)、MYSPSRYPR(SEQ ID NO：421)、MYTTSMAMPI(SEQ ID NO：422)、PMAISSPPK(SEQ ID NO：423)、QLVPLQCRR(SEQ ID NO：424)、QQAAPRTNF(SEQ ID NO：425)、QQAAPRTNFH(SEQ ID NO：426)、QWMAHMALL(SEQ ID NO：427)、RAVSATSWA(SEQ ID NO：428)、RAVSATSWAS(SEQ ID NO：429)、RCAGRWLWY(SEQ ID NO：430)、RCTACHTAL(SEQ ID NO：431)、RGTAWQLVPL(SEQ ID NO：432)、RLQCINSNSR(SEQ ID NO：433)、RRAVSATSW(SEQ ID NO：434)、RTNFHSSLA(SEQ ID NO：435)、RTNFHSSLAE(SEQ ID NO：436)、RTRCAGRWL(SEQ ID NO：437)、RTRCAGRWLW(SEQ ID NO：438)、RWLWYCWPT(SEQ ID NO：439)、RWLWYCWPTW(SEQ ID NO：440)、SAAWRSCIA(SEQ ID NO：441)、SAAWRSCIAL(SEQ ID NO：442)、SGQWMAHMAL(SEQ ID NO：443)、SKMYTTSMA(SEQ ID NO：444)、SKMYTTSMAM(SEQ ID NO：445)、SMAMPILPL(SEQ ID NO：446)、SNKLPSLPL(SEQ ID NO：447)、SPASRLQCI(SEQ ID NO：448)、SPPKAPLLAA(SEQ ID NO：449)、SPSLPASNKL(SEQ ID NO：450)、SRITSGQWM(SEQ ID NO：451)、SSCPQPSPSL(SEQ ID NO：452)、SSLAETVSL(SEQ ID NO：453)、SSNDMIPMAI(SEQ ID NO：454)、SSSNDMIPM(SEQ ID NO：455)、SSSSNDMIPM(SEQ ID NO：456)、SSSSSSNDM(SEQ ID NO：457)、SSSSSSSNDM(SEQ ID NO：458)、TACHTALGR(SEQ ID NO：459)、TERTRCAGRW(SEQ ID NO：460)、TSMAMPILPL(SEQ ID NO：461)、TTSMAMPIL(SEQ ID NO：462)、TVSLHPLAPM(SEQ ID NO：463)、TWLRGTAWQL(SEQ ID NO：464)、VPLQCRRAV (SEQ ID NO：465)、VSLHPLAPM(SEQ ID NO：466)、VTERTRCAGR(SEQ ID NO：467)、WLRGTAWQL(SEQ ID NO：468)、WLRGTAWQLV(SEQ ID NO：469)、WLWYCWPTW(SEQ ID NO：470)、WLWYCWPTWL(SEQ ID NO：471)、WMAHMALLPS(SEQ ID NO：472)、WPTWLRGTA(SEQ ID NO：473)、WPTWLRGTAW(SEQ ID NO：474)、WYCWPTWLR(SEQ ID NO：475)、YPRSSSSSS(SEQ ID NO：476)、YPRSSSSSSS(SEQ ID NO：477)、YTTSMAMPI(SEQ ID NO：478)或YTTSMAMPIL(SEQ ID NO：479)。

在一些實施例中，經分離新抗原肽係由β2M基因編碼。在相關實施例中，C_z係RMERELKKWSIQTCLSARTGLSISCTTLNSPPLKKMSMPAV(SEQ ID NO：53)或LCSRYSLFLAWRLSSVLQRFRFTHVIQQRMESQIS(SEQ ID NO：54)。在一些相關實施例中，新抗原肽不為ALAVLALLSF(SEQ ID NO：480)、ALLSFWPGGY(SEQ ID NO：481)、DSGLLTSSSR(SEQ ID NO：482)、ELLCVWVSSI(SEQ ID NO：483)、EWKVKFPEL(SEQ ID NO：484)、FPELLCVWV(SEQ ID NO：485)、FWPGGYPAY(SEQ ID NO：486)、GLLTSSSREW(SEQ ID NO：487)、KFPELLCVW(SEQ ID NO：488)、KFPELLCVWV(SEQ ID NO：489)、KVKFPELLC(SEQ ID NO：490)、KVKFPELLCV(SEQ ID NO：491)、LAVLALLSF(SEQ ID NO：492)、LAVLALLSFW(SEQ ID NO：493)、LLCVWVSSI(SEQ ID NO：142)、LLCVWVSSIR(SEQ ID NO：494)、LLSFWPGGY(SEQ ID NO：495)、LLTSSSREW(SEQ ID NO：496)、LLTSSSREWK(SEQ ID NO：497)、LSFWPGGYPA(SEQ ID NO：498)、LTSSSREWK(SEQ ID NO：499)、LTSSSREWKV(SEQ ID NO：500)、REWKVKFPE(SEQ ID NO：501)、REWKVKFPEL(SEQ ID NO：502)、SFWPGGYPA(SEQ ID NO：503)、SFWPGGYPAY(SEQ ID NO：504)、SSREWKVKF(SEQ ID NO：505)、SSSREWKVK(SEQ ID NO：506)、SSSREWKVKF(SEQ ID NO：507)、TSSSREWKV(SEQ ID NO：508)、TSSSREWKVK(SEQ ID NO：509)、VKFPELLCV(SEQ ID NO：510)、VKFPELLCVW(SEQ ID NO：511)、WKVKFPELL(SEQ ID NO：512)或YPAYSKDSGL(SEQ ID NO：513)。

在一些實施例中，經分離新抗原肽係由CDH1基因編碼。在相關實施例中，C_z係RSACVTVKGPLASVGRHSLSKQDCKFLPFWGFLEEFLLC(SEQ ID NO：55)、IQWGTTTAPRPIRPPFLESKQNCSHFPTPLLASEDRRETGLFLPSAAQKMKKAHFLKTWFRSNPTKTKKARFSTASLAKELTHPLLVSLLLKEKQDG(SEQ ID NO：56)、PTDPFLGLRLGLHLQKVFHQSHAEYSGAPPPPPAPSGLRFWNPSRIAHISQLLSWPQKTEERLGYSSHQLPRK(SEQ ID NO：57),FCCSCCFFGGERWSKSPYCPQRMTPGTTFITMMKKEAEKRTRTLT(SEQ ID NO：58)或

(SEQ ID NO：59)。

在一些實施例中，經分離新抗原肽係由GATA3基因編碼。在相關實施例中，C_z係

(SEQ ID NO：60)或 PRPRRCTRHPACPLDHTTPPAWSPPWVRALLDAHRAPSESPCSPFRLAFLQEQYHEA(SEQ ID NO：61)。在一些相關實施例中，新抗原肽不為AALSRHNVL(SEQ ID NO：514)、ADAPAIQPV(SEQ ID NO：515)、ADAPAIQPVL(SEQ ID NO：516)、AESKIMFAT(SEQ ID NO：517)、AESKIMFATL(SEQ ID NO：518)、AIQPVLWTT(SEQ ID NO：519)、ALQPLQPHA(SEQ ID NO：520)、APAIQPVLW(SEQ ID NO：521)、ARVPAVPFDL(SEQ ID NO：522)、ATLQRSSLW(SEQ ID NO：523)、AVPFDLHFCR(SEQ ID NO：524)、CSMLTGPPA(SEQ ID NO：525)、CSMLTGPPAR(SEQ ID NO：526)、DLHFCRSSI(SEQ ID NO：527)、DLHFCRSSIM(SEQ ID NO：528)、EPHLALQPL(SEQ ID NO：529)、ESKIMFATL(SEQ ID NO：530)、FATLQRSSL(SEQ ID NO：531)、FATLQRSSLW(SEQ ID NO：532)、FCRSSIMKPK(SEQ ID NO：533)、FDLHFCRSSI(SEQ ID NO：534)、FLKAESKIM(SEQ ID NO：535)、FLKAESKIMF(SEQ ID NO：536)、GPPARVPAV(SEQ ID NO：537)、GYMFLKAESK(SEQ ID NO：538)、HADAPAIQPV(SEQ ID NO：539)、HAHADAPAI(SEQ ID NO：540)、HFCRSSIMK(SEQ ID NO：541)、HLALQPLQPH(SEQ ID NO：542)、HMSSLSHISA(SEQ ID NO：543)、HPLQHGHRH(SEQ ID NO：544)、HPPSSLSFW(SEQ ID NO：545)、HRHGLEPCSM(SEQ ID NO：546)、IMFATLQRS(SEQ ID NO：547)、IMFATLQRSS(SEQ ID NO：548)、IMKPKRDGY(SEQ ID NO：549)、IMKPKRDGYM(SEQ ID NO：550)、KAESKIMFA(SEQ ID NO：551)、KIMFATLQR(SEQ ID NO：552)、KPKRDGYMF(SEQ ID NO：553)、KPKRDGYMFL(SEQ ID NO：554)、LALQPLQPH(SEQ ID NO：555)、LHFCRSSIM(SEQ ID NO：556)、LHFCRSSIMK(SEQ ID NO：557)、LKAESKIMF(SEQ ID NO：558)、LQHGHRHGL(SEQ ID NO：559)、LQPHADHAH(SEQ ID NO：560)、LQRSSLWCL(SEQ ID NO：561)、LQRSSLWCLC(SEQ ID NO：562)、LSFGPHHPL(SEQ ID NO：563)、LSFGPHPPL(SEQ ID NO：564)、LSFWTTPPL(SEQ ID NO：565)、LSHISALQPL(SEQ ID NO：566)、MFATLQRSSL(SEQ ID NO：567)、MFLKAESKI(SEQ ID NO：568)、MFLKAESKIM(SEQ ID NO：569)、MHPPSSLSFW(SEQ ID NO：570)、MKPKRDGYMF(SEQ ID NO：571)、MLTGPPARV(SEQ ID NO：572)、MSSLSHISA(SEQ ID NO：573)、MSSLSHISAL(SEQ ID NO：574)、NPAALSRHNV(SEQ ID NO：575)、PARVPAVPF(SEQ ID NO：576)、PAVPFDLHF(SEQ ID NO：577)、PEPHLALQPL(SEQ ID NO：578)、PPARVPAVPF(SEQ ID NO：579)、QPVLWTTPPL(SEQ ID NO：580)、RHGLEPCSM(SEQ ID NO：581)、RHNVLPEPHL(SEQ ID NO：582)、RSSIMKPKR(SEQ ID NO：583)、SALQPLQPH(SEQ ID NO：584)、SHISALQPL(SEQ ID NO：585)、SIMKPKRDGY(SEQ ID NO：586)、SLSFGPHHPL(SEQ ID NO：587)、SLSFGPHPPL(SEQ ID NO：588)、SLSFWTTPPL(SEQ ID NO：589)、SMLTGPPAR(SEQ ID NO：590)、SMLTGPPARV(SEQ ID NO：141)、SSLSHISAL(SEQ ID NO：591)、TLQRSSLWCL(SEQ ID NO：592)、TTPPLQHGHR(SEQ ID NO：593)、VLPEPHLAL(SEQ ID NO：594)、VPAVPFDLHF(SEQ ID NO：595)、VPFDLHFCR(SEQ ID NO：596)、YMFLKAESK(SEQ ID NO：597)或YMFLKAESKI(SEQ ID NO：598)。

在一些實施例中，經分離新抗原肽係由MLL2基因編碼。在相關實施例中，C_z係

(SEQ ID NO：62)。在一些相關實施例中，新抗原肽不為APGPRGRTC(SEQ ID NO：599)、CHYLRSRNSA(SEQ ID NO：600)、CLRSHTCPPR(SEQ ID NO：601)、CLWCHACLHR(SEQ ID NO：602)、CPHLGSHPC(SEQ ID NO：603)、CPHRLRSLPR(SEQ ID NO：604)、CPLGLKSPL(SEQ ID NO：605)、CPPGLRNRI(SEQ ID NO：606)、CPPGLRSHTY(SEQ ID NO：607)、CPPRLRDHI(SEQ ID NO：608)、CPPSLRSHAY(SEQ ID NO：609)、CPRSCRCPH(SEQ ID NO：610)、CPRSCRCPHL(SEQ ID NO：611)、CSLPLGNHPY(SEQ ID NO：612)、CTCPPRLRSR(SEQ ID NO：613)、DHICPLSLR(SEQ ID NO：614)、EESPMSPHL(SEQ ID NO：615)、ESPMSPHLR(SEQ ID NO：616)、ESPMSPHLRY(SEQ ID NO：617)、EVSRLSPCL(SEQ ID NO：618)、GLKSPLRSQA(SEQ ID NO：619)、GLRNRICPL(SEQ ID NO：620)、GLRNRICPLS(SEQ ID NO：621)、GLRSHTYLR(SEQ ID NO：622)、GLRSHTYLRR(SEQ ID NO：623)、GLRSRTCPPG(SEQ ID NO：624)、HACPPGLRNR(SEQ ID NO：625)、HAYALCLRSH(SEQ ID NO：626)、HHLRTHLLPH(SEQ ID NO：627)、HLGSHPCRL(SEQ ID NO：628)、HLLPHHRRTR(SEQ ID NO：629)、HLRLHASPH(SEQ ID NO：630)、HLRLHASPHH(SEQ ID NO：631)、HLRSCPCSL(SEQ ID NO：632)、HLRTHLLPH(SEQ ID NO：633)、HLRTHLLPHH(SEQ ID NO：634)、HLRTPPHPH(SEQ ID NO：635)、HLRTPPHPHH(SEQ ID NO：636)、HLRYRAYPP(SEQ ID NO：637)、HLRYRAYPPC(SEQ ID NO：638)、HPCCHYLRSR(SEQ ID NO：639)、HPHHLRTHL(SEQ ID NO：640)、HPHHLRTHLL(SEQ ID NO：641)、HRLRSLPRPL(SEQ ID NO：642)、HTYLRRLRS(SEQ ID NO：643)、HTYLRRLRSH(SEQ ID NO：644)、HYLRSRNSA(SEQ ID NO：645)、KSPLRSQANA(SEQ ID NO：646)、LESQPCLSL(SEQ ID NO：647)、LHLRLHASPH(SEQ ID NO：648)、LHLRSCPCSL(SEQ ID NO：649)、LLPHHRRTR(SEQ ID NO：650)、LPCPHRLRSL(SEQ ID NO：651)、LPHHRRTRS(SEQ ID NO：652)、LPHHRRTRSC(SEQ ID NO：653)、LPLGNHPYL(SEQ ID NO：654)、LPRPLHLRL(SEQ ID NO：655)、LRLHASPHHL(SEQ ID NO：656)、LRNCTCPPRL(SEQ ID NO：657)、LRNHTCPPSL(SEQ ID NO：658)、LRNRICPLSL(SEQ ID NO：659)、LRSCPCSLPL(SEQ ID NO：660)、LRSHACPPGL(SEQ ID NO：661)、LRSHACPPNL(SEQ ID NO：662)、LRSHAYALCL(SEQ ID NO：663)、LRSHTCPPRL(SEQ ID NO：664)、LRSHTCPPSL(SEQ ID NO：665)、LRSHTYLRRL(SEQ ID NO：666)、LRSLPRPLHL(SEQ ID NO：667)、LRSQANALHL(SEQ ID NO：668)、LRTPPHPHHL(SEQ ID NO：669)、LRYRAYPPCL(SEQ ID NO：670)、LSLGNHLCPL(SEQ ID NO：671)、LSLRSHPCPL(SEQ ID NO：672)、LWCHACLHRL(SEQ ID NO：673)、MSPHLRYRA(SEQ ID NO：674)、MSPHLRYRAY(SEQ ID NO：675)、NLPCPHRLR(SEQ ID NO：676)、NLRNHTCPP(SEQ ID NO：677)、PMSPHLRYR(SEQ ID NO：678)、PPRLRSRTCL(SEQ ID NO：679)、PPSLRSHAY(SEQ ID NO：680)、RAYPPCLWCH(SEQ ID NO：681)、RDHICPLSL(SEQ ID NO：682)、RGRTCHPGL(SEQ ID NO：683)、RGRTCHPGLR(SEQ ID NO：684)、RLHASPHHL(SEQ ID NO：685)、RLHASPHHLR(SEQ ID NO：686)、RLRDHICPL(SEQ ID NO：687)、RLRDHICPLS(SEQ ID NO：688)、RLRNLPCPH(SEQ ID NO：689)、RLRNLPCPHR(SEQ ID NO：690)、RLRSHTCPP(SEQ ID NO：691)、RLRSHTCPPS(SEQ ID NO：692)、RLRSLPRPL(SEQ ID NO：693)、RLRSLPRPLH(SEQ ID NO：694)、RLRSRTCLL(SEQ ID NO：695)、RLRSRTCLLC(SEQ ID NO：696)、RLSPCLWCHA(SEQ ID NO：697)、RNHTCPPSL(SEQ ID NO：698)、RNHTCPPSLR(SEQ ID NO：699)、RNLPCPHRLR(SEQ ID NO：700)、RNRICPLSL(SEQ ID NO：701)、RNRICPLSLR(SEQ ID NO：702)、RPLHLRLHA(SEQ ID NO：703)、RPLHLRLHAS(SEQ ID NO：704)、RSCPCRWRSH(SEQ ID NO：705)、RSCPCSLPL(SEQ ID NO：706)、RSHACPPGL(SEQ ID NO：707)、RSHACPPGLR(SEQ ID NO：708)、RSHACPPNL(SEQ ID NO：709)、RSHACPPNLR(SEQ ID NO：710)、RSHAYALCL(SEQ ID NO：711)、RSHAYALCLR(SEQ ID NO：712)、RSHPCCHYL(SEQ ID NO：713)、RSHPCCHYLR(SEQ ID NO：714)、RSHPCPLGL(SEQ ID NO：715)、RSHPCPLGLK(SEQ ID NO：716)、RSHTCPPRL(SEQ ID NO：717)、RSHTCPPRLR(SEQ ID NO：718)、RSHTCPPSL(SEQ ID NO：719)、RSHTCPPSLR(SEQ ID NO：720)、RSHTYLRRL(SEQ ID NO：721)、RSHTYLRRLR(SEQ ID NO：722)、RSLPRPLHL(SEQ ID NO：723)、RSLPRPLHLR(SEQ ID NO：724)、RSQANALHL(SEQ ID NO：725)、RSQANALHLR(SEQ ID NO：726)、RSRNSAPGP(SEQ ID NO：727)、RSRNSAPGPR(SEQ ID NO：728)、RSRTCLLCL(SEQ ID NO：729)、RSRTCLLCLR(SEQ ID NO：730)、RSRTCPPGL(SEQ ID NO：731)、RSRTCPPGLR(SEQ ID NO：732)、RTCHPGLRSR(SEQ ID NO：733)、RTHLLPHHR(SEQ ID NO：734)、RTHLLPHHRR(SEQ ID NO：735)、RTPPHPHHL(SEQ ID NO：736)、RTPPHPHHLR(SEQ ID NO：737)、RTRSCPCRW(SEQ ID NO：738)、RTRSCPCRWR(SEQ ID NO：739)、RWRSHPCCH(SEQ ID NO：740)、RWRSHPCCHY(SEQ ID NO：741)、RYRAYPPCL(SEQ ID NO：742)、RYRAYPPCLW(SEQ ID NO：743)、SHAYALCLR(SEQ ID NO：744)、SLGNHLCPL(SEQ ID NO：745)、SLPLGNHPY(SEQ ID NO：746)、SLPLGNHPYL(SEQ ID NO：747)、SLPRPLHLR(SEQ ID NO：748)、SLPRPLHLRL(SEQ ID NO：749)、SLRNCTCPPR(SEQ ID NO：750)、SLRSHACPPG(SEQ ID NO：751)、SLRSHAYAL(SEQ ID NO：752)、SLRSHAYALC(SEQ ID NO：753)、SLRSHPCPL(SEQ ID NO：754)、SLRSHPCPLG(SEQ ID NO：755)、SPHHLRTPP(SEQ ID NO：756)、SPHHLRTPPH(SEQ ID NO：757)、SPHLRYRAY(SEQ ID NO：758)、SPLRSQANAL(SEQ ID NO：759)、SPMSPHLRY(SEQ ID NO：760)、SPMSPHLRYR(SEQ ID NO：761)、SQANALHLR(SEQ ID NO：762)、SQANALHLRS(SEQ ID NO：763)、VSRLSPCLW(SEQ ID NO：764)、WRSHPCCHY(SEQ ID NO：765)、WRSHPCCHYL(SEQ ID NO：766)、YLPCLESQPC(SEQ ID NO：767)、YLRRLRSHTC(SEQ ID NO：768)、YLRSRNSAP(SEQ ID NO：769)或YLRSRNSAPG(SEQ ID NO：770)。

在一些實施例中，經分離新抗原肽係由PTEN基因編碼。在相關實施例中，C_z係SWKGTNWCNDMCIFITSGQIFKGTRGPRFLWGSKDQRQKGSNYSQSEALCVLL(SEQ ID NO：63)、KRTKCFTFG(SEQ ID NO：64)、PIFIQTLLLWDFLQKDLKAYTGTILMM(SEQ ID NO：66)、QKMILTKQIKTKPTDTFLQILR(SEQ ID NO：67)、GFWIQSIKTITRYTIFVLKDIMTPPNLIAELHNILLKTITHHS(SEQ ID NO：68)、NYSNVQWRNLQSSVCGLPAKGEDIFLQFRTHTTGRQVHVL或YQSRVLPQTEQDAKKGQNVSLLGKYILHTRTRGNLRKSRKWKSM(SEQ ID NO：69)。在一些相關實施例中，新抗原肽不為KMLKRTKCF(SEQ ID NO：771)、MLKRTKCFT(SEQ ID NO：772)、LKRTKCFTF(SEQ ID NO：773)、MLKRTKCFTF(SEQ ID NO：774)、 KQNKMLKRTK(SEQ ID NO：775)、KMLKRTKCFT(SEQ ID NO：776)或NKMLKRTKCF(SEQ ID NO：777)。

在一些實施例中，經分離新抗原肽係由TP53基因編碼。在相關實施例中，C_z係SSQNARGCSPRGPCTSSSYTGGPCTSPLLAPVIFCPFPENLPGQLRFPSGLLAFWDSQVCDLHVLPCPQQDVLPTGQDLPCAAVG(SEQ ID NO：70)、GAAPTMSAAQIAMVWPLLSILSEWKEICVWSIWMTETLFDIVWWCPMSRLRLALTVPPSTTTTCVTVPAWAA(SEQ ID NO：71)、

(SEQ ID NO：73)、CCPRTILNNGSLKTQVQMKLPECQRLLPPWPLHQQLLHRRPLHQPPPGPCHLLSLPRKPTRAATVSVWASCILGQPSL(SEQ ID NO：74)、VRKHFQTYGNYFLKTTFCPPCRPKQWMI(SEQ ID NO：75)或LARTPLPSTRCFANWPRPALCSCGLIPHPRPAPASAPWPSTSSHST(SEQ ID NO：76)。在一些相關實施例中，新抗原肽不為APASAPWPST(SEQ ID NO：778)、APPWPLHQQL(SEQ ID NO：779)、APWPSTSSH(SEQ ID NO：780)、ASCILGQPSL(SEQ ID NO：781)、ATVSVWASCI(SEQ ID NO：782)、CQRLLPPWPL(SEQ ID NO：783)、HQPPPGPCHL(SEQ ID NO：784)、HQQLLHRRPL(SEQ ID NO：785)、IEQWFTEDQV(SEQ ID NO：786)、KLPECQRLL(SEQ ID NO：787)、 KPTRAATVSV(SEQ ID NO：788)、KTYQGSYGFV(SEQ ID NO：789)、KTYQGSYVS(SEQ ID NO：790)、KTYQGSYVSV(SEQ ID NO：791)、LLSLPRKPTR(SEQ ID NO：792)、LPPWPLHQQL(SEQ ID NO：793)、LPRKPTRAA(SEQ ID NO：794)、LPRKPTRAAT(SEQ ID NO：795)、LSLPRKPTR(SEQ ID NO：796)、MKLPECQRL(SEQ ID NO：797)、MKLPECQRLL(SEQ ID NO：798)、MPEAAPPWPL(SEQ ID NO：799)、PEAAPPWPL(SEQ ID NO：800)、PTRAATVSV(SEQ ID NO：801)、QMKLPECQR(SEQ ID NO：802)、QQLLHRRPL(SEQ ID NO：803)、QQLLHRRPLH(SEQ ID NO：804)、QRLLPPWPL(SEQ ID NO：805)、QWFTEDQVQM(SEQ ID NO：806)、RAATVSVWA(SEQ ID NO：807)、RLLPPWPLH(SEQ ID NO：808)、RMPEAAPPW(SEQ ID NO：809)、RPAPASAPW(SEQ ID NO：810)、SLPRKPTRA(SEQ ID NO：811)、SLPRKPTRAA(SEQ ID NO：812)、SQKTYQGSYV(SEQ ID NO：813)、STPRPAPASA(SEQ ID NO：814)、SYGFVWASC(SEQ ID NO：815)、SYGFVWASCI(SEQ ID NO：816)、SYVSVWASC(SEQ ID NO：817)、SYVSVWASCI(SEQ ID NO：818)、TEDQVQMKL(SEQ ID NO：819)、TPRPAPASA(SEQ ID NO：820)、TPRPAPASAP(SEQ ID NO：821)、TRAATVSVW(SEQ ID NO：822)、TVSVWASCI(SEQ ID NO：823)、TVSVWASCIL(SEQ ID NO：824)、TYQGSYGFV(SEQ ID NO：825)、TYQGSYGFVW(SEQ ID NO：826)、TYQGSYVSV(SEQ ID NO：827)、TYQGSYVSVW(SEQ ID NO：828)、VSVWASCIL(SEQ ID NO：829)、WPLHQQLLH(SEQ ID NO：830)、WPSTSSHST(SEQ ID NO：831)、YGFVWASCI(SEQ ID NO：832)、YGFVWASCIL(SEQ ID NO：833)、YQGSYGFVW(SEQ ID NO：834)、YQGSYGFVWA(SEQ ID NO：835)、YQGSYVSVW(SEQ ID NO：836)、YQGSYVSVWA(SEQ ID NO：837)、YVSVWASCI(SEQ ID NO：838)或YVSVWASCIL(SEQ ID NO：839)。

在一些實施例中，經分離新抗原肽係由VHL基因編碼。在相關實施例中，C_z係ELQETGHRQVALRRSGRPPKCAERPGAADTGAHCTSTDGRLKISVETYTVSSQLLMVLMSLDLDTGLVPSLVSKCLILRVK(SEQ ID NO：77)、KSDASRLSGA(SEQ ID NO：78)、RTAYFCQYHTASVYSERAMPPGCPEPSQA(SEQ ID NO：79)、TRASPPRSSSAIAVRASCCPYGSTSTASRSPTQRCRLARAAASTATEVTFGSSEMQGHTMGFWLTKLNYLCHLSMLTDSLFLPISHCQCIL(SEQ ID NO：80)、SSLRITGDWTSSGRSTKIWKTTQMCRKTWSG(SEQ ID NO：81)或

(SEQ ID NO：82)。在一些相關實施例中，新抗原肽不為CHLSMLTDSL(SEQ ID NO：840)、EMQGHTMGF(SEQ ID NO：841)、FLPISHCQC(SEQ ID NO：842)、FLPISHCQCI(SEQ ID NO：843)、FRDAGHTMGF(SEQ ID NO：844)、FWLTKLNYL(SEQ ID NO：845)、GFWLTKLNY(SEQ ID NO：846)、GFWLTKLNYL(SEQ ID NO：847)、GSSEMQGHTM(SEQ ID NO：848)、HLSMLTDSL(SEQ ID NO：849)、HLSMLTDSLF(SEQ ID NO：850)、HSYRGHLGSS(SEQ ID NO： 851)、HTMGFWLTK(SEQ ID NO：852)、HTMGFWLTKL(SEQ ID NO：853)、KERCLQLSGA(SEQ ID NO：854)、KLNYLCHLSM(SEQ ID NO：855)、LFRDAGHTM(SEQ ID NO：856)、LNYLCHLSM(SEQ ID NO：857)、LNYLCHLSML(SEQ ID NO：858)、LPISHCQCI(SEQ ID NO：859)、LPISHCQCIL(SEQ ID NO：860)、LSMLTDSLF(SEQ ID NO：861)、LSMLTDSLFL(SEQ ID NO：862)、LTDSLFLPI(SEQ ID NO：863)、LTKLNYLCHL(SEQ ID NO：864)、MGFWLTKLNY(SEQ ID NO：865)、MLTDSLFLPI(SEQ ID NO：866)、MQGHTMGFW(SEQ ID NO：867)、MQGHTMGFWL(SEQ ID NO：868)、NYLCHLSML(SEQ ID NO：869)、RDAGHTMGF(SEQ ID NO：870)、RDAGHTMGFW(SEQ ID NO：871)、RGHLGSSEM(SEQ ID NO：872)、RIHSYRGHLG(SEQ ID NO：873)、SEMQGHTMG(SEQ ID NO：874)、SEMQGHTMGF(SEQ ID NO：875)、SLFLPISHC(SEQ ID NO：876)、SMLTDSLFL(SEQ ID NO：877)、SSEMQGHTM(SEQ ID NO：878)、TKLNYLCHL(SEQ ID NO：879)、TLKERCLQL(SEQ ID NO：880)、TMGFWLTKL(SEQ ID NO：881)、WLFRDAGHT(SEQ ID NO：882)、WLFRDAGHTM(SEQ ID NO：883)、YLCHLSMLT(SEQ ID NO：884)或YRGHLGSSEM(SEQ ID NO：885)。

在一些實施例中，經分離新抗原肽係由第一基因與第二基因之融合物編碼。在一些實施例中，經分離新抗原肽係由第一基因與第二基因之框內融合物編碼。

在一些實施例中，經分離新抗原肽係由BCR基因及ABL基因編碼。在相關實施例中，A_xB_yC_z係

(SEQ ID NO：119)或

(SEQ ID NO：120)。

在一些實施例中，經分離新抗原肽係由C11orf95基因及RELA基因編碼。在相關實施例中，A_xB_yC_z係

(SEQ ID NO：121)。

在一些實施例中，經分離新抗原肽係由CBFB基因及MYH11基因編碼。

(SEQ ID NO：122)。

在一些實施例中，經分離新抗原肽係由CD74基因及ROS1基因編碼。在相關實施例中，A_xB_yC_z係

(SEQ ID NO：123)。

在一些實施例中，經分離新抗原肽係由EGFR基因及SEPT14基因編碼。在相關實施例中，A_xB_yC_z係由基因編碼之第一天然多肽係且第二天 然多肽係由

(SEQ ID NO：124)編碼。

在一些實施例中，經分離新抗原肽係由EGFR基因及EGFR基因編碼。在相關實施例中，A_xB_yC_z係MRPSGTAGAALLALLAALCPASRALEEKKGNYVVTDHGSCVRACGADSYEMEEDGVRKCKKCEGPCRKVCNGIGIGEFKD(SEQ ID NO：125)。

在一些實施例中，經分離新抗原肽係由EML4基因及ALK基因編碼。在相關實施例中，A_xB_yC_z係

(SEQ ID NO：126)。

在一些實施例中，經分離新抗原肽係由FGFR3基因及TACC3基因編碼。在相關實施例中，A_xB_yC_z係

(SEQ ID NO：127)。

在一些實施例中，經分離新抗原肽係由NAB基因及STAT6基因編碼。在相關實施例中，A_xB_yC_z係

(SEQ ID NO：128)。

在一些實施例中，經分離新抗原肽係由NDRG1基因及ERG基因編碼。在相關實施例中，A_xB_yC_z係MSREMQDVDLAEVKPLVEKGETITGLLQEFDVQEALSVVSEDQSLFECAYGTPHLAKTEMTASSSSDYGQTSKMSPRVPQQDW(SEQ ID NO：129)。

在一些實施例中，經分離新抗原肽係由TMPRSS2基因及ERG基因編碼。在相關實施例中，A_xB_yC_z係MALNSEALSVVSEDQSLFECAYGTPHLAKTEMTASSSSDYGQTSKMSPRVPQQDW(SEQ ID NO：130)。

在一些實施例中，經分離新抗原肽係由PML基因及RARA基因編碼。在相關實施例中，A_xB_yC_z係

(SEQ ID NO：131)或

(SEQ ID NO：132)。

在一些實施例中，經分離新抗原肽係由RUNX1基因及CBFA2T1(RUNX1T1)基因編碼。在相關實施例中，A_xB_yC_z係

(SEQ ID NO：133)。

在一些實施例中，經分離新抗原肽係由第一基因與第一基因之剪接變體之外顯子之融合物編碼。在一些實施例中，經分離新抗原肽係由第一基因與第一基因之隱藏外顯子之融合物編碼。

在一些實施例中，經分離新抗原肽係由AR-v7基因及由AR-v7基因編碼之隱藏外顯子編碼。在一些實施例中，經分離新抗原肽係由包含AR基因之剪接變體之外顯子之AR-v7基因編碼。在相關實施例中，A_xB_yC_z係SCKVFFKRAAEGKQKYLCASRNDCTIDKFRRKNCPSCRLRKCYEAGMTLGEKFRVGNCKHLKMTRP(SEQ ID NO：134)。

在一些實施例中，經分離新抗原肽係由第一基因與第二基因之融合物編碼，其中肽包含由融合產生之框外序列編碼之胺基酸序列。

在一些實施例中，經分離新抗原肽係由AC011997.1基因及LRRC69基因編碼。在相關實施例中，y為1。在相關實施例中，A_xB_yC_z係MAGAPPPASLPPCSLISDCCASNQRDSVGVGPSEPGNNIKICNESASRK(SEQ ID NO：135)。

在一些實施例中，經分離新抗原肽係由EEF1DP3基因及FRY基因編碼。在相關實施例中，y為1。在相關實施例中，A_xB_yC_z係HGWRPFLPVRARSRWNRRLDVTVANGRSWKYGWSLLRVPQVNGIQVLNVSLKSSSNVISY(SEQ ID NO：136)。

在一些實施例中，經分離新抗原肽係由MAD1L1基因及MAFK基因編碼。在相關實施例中，y為0。在相關實施例中，A_xB_yC_z係RLKEVFQTKIQEFRKACYTLTGYQIDITTENQYRLTSLYAEHPGDCLIFKLRVPGSSVLVTVPGL(SEQ ID NO：137)。

在一些實施例中，經分離新抗原肽係由PPP1R1B基因及STARD3基 因編碼。在相關實施例中，y為1。在相關實施例中，A_xB_yC_z係

(SEQ ID NO：138)。

在一些實施例中，經分離新抗原肽包含表1中所繪示之肽序列中之一或多者。在一些實施例中，經分離新抗原肽包含表1A、表1B、表1C、表1D、表1E及/或表1F中所繪示之肽序列中之一或多者。在一些實施例中，經分離新抗原肽不包含表2中所繪示之肽序列中之一或多者。在一些實施例中，經分離新抗原肽不包含表2A、表2B、表2C及/或表2D中所繪示之肽序列中之一或多者。

新抗原多核苷酸

編碼本文所闡述肽中之每一者之多核苷酸亦為本發明之一部分。如熟習此項技術者所瞭解，各種核酸序列由於遺傳密碼之冗餘性可編碼同一肽。該等核酸中之每一者在本發明之範圍內。核酸編碼肽可為DNA或RNA，例如，mRNA或DNA及RNA之組合。在一些實施例中，編碼肽之核酸係自擴增mRNA。(Brito等人，Adv.Genet.2015；89：179-233)。編碼本文所闡述肽之任一適宜多核苷酸在本發明之範圍內。

術語「RNA」包括「mRNA」且在一些實施例中係指「mRNA」。術語「mRNA」意指「信使-RNA」且係指藉由使用DNA模板生成之「轉錄本」且編碼肽或多肽。通常，mRNA包含5'-UTR、蛋白編碼區及3'-UTR。mRNA在細胞內及活體外僅具有有限半衰期。在一些實施例中，mRNA係自擴增mRNA。在本發明之上下文中，mRNA可藉由從DNA模板活體外轉錄來生成。活體外轉錄方法已為熟習此項技術者知曉。例如，存 在市售的各種活體外轉錄套組。

若需要可修飾RNA之穩定性及轉譯效率。例如，RNA可藉由一或多種具有穩定效應及/或增加RNA之轉譯效率之修飾來穩定及增加其轉譯。該等修飾闡述於(例如)PCT/EP2006/009448中，該案係以引用方式併入本文中。為增加根據本發明使用之RNA之表現，可在編碼區(亦即編碼表現之肽或蛋白之序列)內修飾該RNA，而不改變表現之肽或蛋白之序列，以便增加GC-含量以增加mRNA穩定性及實施密碼子最佳化，且因此，增強細胞中之轉譯。

術語「修飾」在本發明中所用RNA之情況中包括天然存在於該RNA中之RNA之任一修飾。在本發明之一些實施例中，根據本發明使用之RNA不具有經脫帽之5'-三磷酸。該等經脫帽5'-三磷酸之移除可藉由用磷酸酶處理RNA來達成。本發明之RNA可具有經修飾之核糖核苷酸以便增加其穩定性及/或降低細胞毒性。例如，在一些實施例中，在根據本發明使用之RNA中，用5-甲基胞苷部分地或完全地(例如，完全地)取代胞苷。另一選擇為或另外，在一些實施例中，在根據本發明所使用之RNA中，用假尿苷部分地或完全地(例如，完全地)取代尿苷。

在一些實施例中，術語「修飾」係指提供具有5'-端帽或5’-端帽類似物之RNA。術語「5'-端帽」係指見於mRNA分子之5'-端上之帽結構且其通常由經由一般5'至5'三磷酸鏈接連接至mRNA之鳥苷核苷酸組成。在一些實施例中，此鳥苷係在7-位經甲基化。術語「習用5'-端帽」係指天然RNA 5'-端帽，指7-甲基鳥苷帽(m G)。在本發明之上下文中，術語「5'-端帽」包括類似於RNA帽結構且經修飾以具有穩定RNA及/或增強活體內及/或細胞內RNA轉譯(若與RNA附接)之能力之5'-端帽類似物。

在某些實施例中，將編碼本發明之新抗原肽之mRNA投與有需要之個體。在一些實施例中，本發明提供包含經修飾核苷之RNA、寡核糖核苷酸及聚核糖核苷酸分子、包含其之基因療法載體、包含其之基因療法方法及基因轉錄沉默方法。在一些實施例中，欲投與之mRNA包含至少一種經修飾之核苷。

編碼本文所闡述肽之多核苷酸可藉由化學技術(例如，Matteucci等人，J.Am.Chem.Soc.103：3185(1981)之磷酸三酯方法)來合成。編碼包含類似物或由其組成之肽之多核苷酸可單純藉由用適當及期望核酸鹼基取代編碼天然表位之彼等製得。

大量適於產生及投與本文所闡述之新抗原肽之載體及宿主系統已為熟習此項技術者習知且可自市面購得。以舉例方式提供以下載體。細菌：pQE70、pQE60、pQE-9(Qiagen)、pBS、pD10、phagescript、psiX174、pBluescript SK、pbsks、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A(Stratagene)；ptrc99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5(Pharmacia)；pCR(Invitrogen)。真核：pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1、pSG(Stratagene)pSVK3、pBPV、pMSG、pSVL(Pharmacia)；p75.6(Valentis)；pCEP(Invitrogen)；pCEI(Epimmune)。然而，可使用任何其他質體或載體，只要其在宿主中可複製且有活力即可。

作為適當宿主之代表性實例，可提及以下：細菌細胞，例如大腸桿菌(E.coli)、枯草桿菌(Bacillus subtilis)、鼠傷寒沙門桿菌(Salmonella typhimurium)及假單胞菌屬(Pseudomona)內之各種物種、鏈黴菌屬(Streptomyces)及葡萄球菌屬(Staphylococcus)；真菌細胞，例如酵母；昆 蟲細胞例如果蠅屬(Drosophila)及Sf9；動物細胞，例如Gluzman,Cell 23：175(1981)闡述之猴腎纖維母細胞之COS-7系，及能表現相容性載體之其他細胞系，例如，C127、3T3、CHO、HeLa及BHK細胞系或人黑色素瘤(Bowes melanoma)；植物細胞等。根據本文之教示，適當宿主之選擇被認為在熟習此項技術者之範圍內。

因此，本發明亦係關於載體，及可用於產生及投與本文所闡述之新抗原肽之表現載體，且關於包含該等載體之宿主細胞。

宿主細胞係用可為(例如)選殖載體或表現載體之載體進行遺傳改造(轉導或轉變或轉染)。載體可呈(例如)質體、病毒顆粒、噬菌體等之形式。可在經改良為適合於活化啟動子、選擇轉變體或擴增多核苷酸之習用營養培養基中培養經改造宿主細胞。諸如溫度、pH及諸如此類等培養條件係先前與經選擇用於表現之宿主細胞一起使用之彼等，且將為熟習此項技術者所明瞭。

為表現本文所闡述之新抗原肽，編碼序列經提供以可操作連接發動及終止密碼子、啟動子及終止子區，且在一些實施例中，及複製系統以提供在期望細胞宿主中表現之表現載體。例如，在含有便於期望編碼序列插入之限制位點之質體中提供與細菌宿主相容之啟動子序列。將所得表現載體轉變至適宜細菌宿主中。

通常，重組體表現載體將包括複製起點及允許宿主細胞之轉變之可選標記物(例如，大腸桿菌之胺苄青黴素抗性基因及啤酒酵母TRP1基因)，及用以引導下游結構序列之轉錄之衍生自高度表現之基因之啟動子。該等啟動子可衍生自編碼醣解酶(尤其例如3-磷酸甘油酯激酶(PGK)、酸性磷酸酶或熱休克蛋白)之操縱子。異源結構序列係在適當階段用轉譯 發動及終止序列及在一些實施例中能指導經轉譯蛋白分泌至周質空間或細胞外培養基中之前導序列來組裝。視情況，異源序列可編碼包括賦予期望特徵(例如，穩定或簡化經表現重組體產物之純化)之N-末端鑑別肽之融合蛋白。

亦可使用採用適宜載體及控制序列之酵母、昆蟲或哺乳動物細胞宿主。哺乳動物表現系統之實例包括Gluzman,Cell 23：175(1981)闡述之猴腎纖維母細胞之COS-7系；及能表現相容性載體之其他細胞系，例如，C127、3T3、CHO、HeLa及BHK細胞系。哺乳動物表現載體將包含複製起點、適宜啟動子及增強子，亦及任何必需的核糖體結合位點、多聚腺苷酸化位點、剪接供體及受體位點、轉錄終止序列及5'側翼非轉錄之序列。該等啟動子亦可衍生自病毒來源，例如，人類巨細胞病毒(CMV-IE啟動子)或1型單純皰疹病毒(HSV TK啟動子)。可使用衍生自SV40剪接之核酸序列及多聚腺苷酸化位點來提供所需要的非轉錄遺傳元件。

本文所闡述之編碼新抗原肽之多核苷酸亦可包含泛蛋白化信號序列及/或靶向序列(例如內質網(ER)信號序列)以促進所得肽至內質網中之移動。

本文所闡述之多核苷酸可在人類細胞(例如，免疫細胞，包括樹突細胞)中投與及表現。可使用人類密碼子使用表引導每一胺基酸之密碼子選擇。該等多核苷酸在表位及/或類似物(例如上文所闡述之彼等)之間包含間隔體胺基酸殘基，或可毗鄰表位及/或類似物(及/或CTL、HTL及B細胞表位)包含天然側翼序列。

在一些實施例中，本文所闡述之新抗原肽亦可藉由病毒或細菌載體來投與/表現。表現載體之實例包括減弱之病毒宿主，例如牛痘或雞痘。 作為此方法之實例，使用牛痘病毒作為載體來表現編碼本文所闡述之新抗原肽之核苷酸序列。可用於免疫方案中之牛痘載體及方法闡述於(例如)美國專利第4,722,848號中。另一載體係BCG(卡介苗(Bacille Calmette Guerin))。BCG載體係由Stover等人，Nature 351：456-460(1991)來闡述。熟習此項技術者自本文之闡述將明瞭可用於治療性投與或免疫本文所闡述之新抗原多肽之眾多種其他載體(例如腺及腺相關病毒載體、反轉錄病毒載體、傷寒沙門桿菌(Salmonella typhi)載體、去毒炭疽毒素載體、仙台病毒載體(Sendai virus vector)、痘病毒載體、金絲雀痘載體及雞痘載體及諸如此類)。在一些實施例中，載體係改良型安卡拉牛痘(Vaccinia Ankara，VA)(例如巴伐利亞諾迪克(Bavarian Noridic)(MVA-BN))。

載體中可包括已為熟習此項技術者熟知之標準調節序列以確保在人類靶細胞中之表現。期望若干載體元件：具有用於多核苷酸(例如，袖珍基因插入)之下游選殖位點之啟動子；用於有效轉錄終止之多聚腺苷酸化信號；大腸桿菌複製起點；及大腸桿菌可選標記物(例如胺苄青黴素或康黴素抗性)。多種啟動子可用於此目的，例如，人類巨細胞病毒(hCMV)啟動子。其他適宜啟動子序列參見(例如)美國專利第5,580,859號及第5,589,466號。在一些實施例中，啟動子係CMV-IE啟動子。

本文所闡述之多核苷酸可在轉錄區中包含一或多種合成或天然內含子。亦可考慮在哺乳動物細胞中納入mRNA穩定序列及複製用序列來增加多核苷酸表現。

另外，本文所闡述之多核苷酸可包含免疫刺激序列(ISS或CpG)。該等序列可包括在多核苷酸編碼序列之外的載體內以增強免疫原性。

在一些實施例中，至少一種抗原性肽分子之大小可包含(但不限於)約 8個、約9個、約10個、約11個、約12個、約13個、約14個、約15個、約16個、約17個、約18個、約19個、約20個、約21個、約22個、約23個、約24個、約25個、約26個、約27個、約28個、約29個、約30個、約31個、約32個、約33個、約34個、約35個、約36個、約37個、約38個、約39個、約40個、約41個、約42個、約43個、約44個、約45個、約46個、約47個、約48個、約49個、約50個、約60個、約70個、約80個、約90個、約100個、約110個、約120個或更多個胺基分子殘基及其中衍生之任一範圍。

在一些實施例中，抗原性肽分子等於或小於50個胺基酸。在一些實施例中，抗原性肽分子等於約20至約30個胺基酸。可以若干方式設計較長肽。例如，預測或已知當HLA-結合區時，較長肽可由以下組成：朝向每一相應基因產物之N-及C-末端延伸0-10個胺基酸之個別結合肽。較長肽亦可由結合肽中之一部分或全部與各自之延伸序列之拼接組成。在另一情形下，當測序揭露存在於患病組織中之長(>10個殘基)表位序列(例如歸因於產生新穎肽序列之框移、通讀或內含子納入)時，較長肽可由整段新穎疾病特異性胺基酸組成。在兩種情形下，較長肽之使用需要藉由專業抗原呈遞細胞(例如樹突細胞)進行內源性處理且可引起更有效的抗原呈遞及T細胞反應之誘導。在一些實施例中，延伸序列經改變以改良多肽之生物化學性質(性質例如溶解性或穩定性)或改良有效蛋白酶體處理肽之可能性。

抗原性肽及多肽可結合HLA蛋白。在一些實施例中，抗原性肽可以大於相應的天然/野生型肽之親和力結合HLA蛋白。抗原性肽可具約小於1000nM、約小於500nM、約小於250nM、約小於200nM、約小於150 nM、約小於100nM或約小於50nM之IC₅₀。在一些實施例中，抗原性肽在投與個體時不誘導自體免疫反應及/或引起免疫耐受性。

本發明亦提供包含複數種抗原性肽之組合物。所提及之抗原性肽包括可將肽引入個體之細胞中之任一適宜遞送模式(例如，核酸)。在一些實施例中，組合物包含至少2種或更多種抗原性肽。在一些實施例中，組合物含有至少約3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種、11種、12種、13種、14種、15種、16種、17種、18種、19種、20種、21種、22種、23種、24種、25種、26種、27種、28種、29種、30種、31種、32種、33種、34種、35種、36種、37種、38種、39種、40種、41種、42種、43種、44種、45種、46種、47種、48種、49種、50種、55種、60種、70種、80種、90種、100種、150種、200種、250種、300種、350種、400種、450種或500種不同的肽。在一些實施例中，組合物含有至少一種來自表1之肽。在一些實施例中，組合物含有至少一種來自表1之肽及至少一種來自表1之其他肽。在一些實施例中，組合物含有至少一種來自表1之肽及至少一種來自表2之其他肽。在一些實施例中，組合物含有至少20種不同肽。在一些實施例中，組合物含有至多20種不同肽。根據本發明，該等不同肽中之2者或更多者可衍生自同一多肽。例如，若抗原性突變編碼多肽，則抗原性肽中之兩者或更多者可衍生自多肽。在一些實施例中，該兩種或更多種衍生自多肽之抗原性肽可包含跨越多肽之鋪瓦式陣列(tiled array)(例如，抗原性肽可包含跨越多肽之一部分或全部之一系列重疊抗原性肽)。抗原性肽可衍生自任一蛋白質編碼基因。抗原性肽可衍生自人類癌症中之突變或衍生自傳染原或自體免疫疾病。

抗原性肽、多肽及類似物可進一步經修飾以含有通常不為蛋白質之 一部分之其他化學部分。彼等衍生之部分可改良蛋白質之溶解性、生物半衰期、吸收或結合親和力。該等部分亦可減少或消除蛋白質之任何不合意副作用及諸如此類。彼等部分之概述可參見Remington's Pharmaceutical Sciences，第20版，Mack Publishing Co.,Easton,PA(2000)。例如，具有期望活性之抗原性肽及多肽可經修飾(若需要)以提供某些期望屬性，例如改良之藥理學特徵，同時增加或至少保留未經修飾肽之實質上所有的生物活性以結合期望MHC分子並活化適當T細胞。例如，可使抗原性肽及多肽經受各種改變，例如取代(保守或非保守的)，其中該等改變可在該等抗原性肽及多肽之使用中提供某些優點，例如改良之MHC結合。該等保守取代可涵蓋用在生物上及/或化學上類似之另一胺基酸殘基替代胺基酸殘基，例如，用一種疏水殘基替代另一疏水殘基或用一種極性殘基替代另一極性殘基。單一胺基酸取代之效應亦可使用D-胺基酸來探查。該等修飾可使用肽合成程序來製備，如例如以下文獻中所闡述：Merrifield,Science 232：341-347(1986),Barany及Merrifield,The Peptides,Gross及Meienhofer編輯(N.Y.,Academic Press)，第1頁至第284頁(1979)；及Stewart及Young,Solid Phase Peptide Synthesis,(Rockford,III.,Pierce),第2版(1984)。

抗原性肽亦可藉由延伸或減少化合物之胺基酸序列(例如，藉由胺基酸之添加或缺失)來修飾。抗原性肽、多肽或類似物亦可藉由改變某些殘基之順序或組成來修飾。熟習此項技術者將瞭解通常無法在對生物活性無不良效應之情況下改變生物活性必需之某些胺基酸殘基(例如，在關鍵接觸位點之彼等或保守殘基)。非關鍵胺基酸無需限於天然存在於蛋白質中之彼等，例如L-a-胺基酸或其D-異構物，但亦可可包括非天然胺基酸，例 如β-γ-δ-胺基酸，以及L-a-胺基酸之許多衍生物。

可藉由使用一系列具有單一胺基酸取代之肽最佳化抗原肽來測定靜電荷、疏水性等對MHC結合之效應。例如，可沿肽之長度進行一系列帶正電荷(例如，Lys或Arg)或帶負電荷(例如，Glu)之胺基酸之取代，從而揭露針對各種MHC分子及T細胞受體之不同敏感性型式。另外，可採用多個使用小的、相對中性部分(例如Ala、Gly、Pro或類似殘基)之取代。取代可為同源寡聚物或異源寡聚物。經取代或添加之殘基之數量及類型取決於必需接觸點之間之間距及所尋求之某些功能屬性(例如，疏水性對親水性)。與母體肽之親和力相比，增加之對MHC分子或T細胞受體之結合親和力亦可藉由該等取代達成。在任一事件中，該等取代應採用經選擇以避免(例如)可破壞結合之空間及電荷干擾之胺基酸殘基或其他分子片段。胺基酸取代通常為單一殘基。可組合取代、缺失、插入或其任一組合來達成最終肽。

抗原性肽可經修飾以提供期望屬性。例如，可藉由鏈接至含有至少一個能誘導T輔助細胞反應之表位之序列增強肽誘導CTL活性之能力。在一些實施例中，免疫原性肽/T輔助偶聯物係藉由間隔體分子連接。在一些實施例中，間隔體包含在生理條件下實質上不帶電之相對小的中性分子，例如胺基酸或胺基酸模擬物。間隔體可選自(例如)Ala、Gly或非極性胺基酸或中性極性胺基酸之其他中性間隔體。將瞭解視情況存在之間隔體無需包括相同殘基且因此可為異源或同源寡聚物。抗原性肽可在直接或經由肽之胺基或羧基末端之間隔體連接至T輔助肽。抗原性肽或T輔助肽之胺基末端可經醯化。實例性T輔助肽包括破傷風類毒素830-843、流行性感冒307-319、瘧疾環子孢子382-398及378-389。

本發明至少部分地基於用一或多種疾病特異性抗原呈遞患者之免疫系統之能力。熟習此項技術者自本揭示內容及業內知識將瞭解存在各種產生該等疾病特異性抗原之方式。一般而言，該等疾病特異性抗原可在活體外或活體內產生。疾病特異性抗原可在活體外以肽或多肽形式產生，其然後可調配成疫苗或免疫原性組合物並投與個體。如本文中更詳細地描述，該活體外產生可藉由熟習此項技術者已知之各種方法進行，例如在各種細菌、真核或病毒重組體表現系統中之任一者中自DNA或RNA分子合成肽或表現肽/多肽，隨後純化表現之肽/多肽。另一選擇為，疾病特異性抗原可在活體內藉由以下產生：將編碼疾病特異性抗原之分子(例如，DNA、RNA、病毒表現系統及諸如此類)引入個體中，此後表現所編碼之疾病特異性抗原。本文亦進一步闡述活體外及活體內產生抗原之方法，乃因其與療法之醫藥組合物及遞送方法相關。

在一些實施例中，本發明包括經修飾抗原性肽。修飾可包括不改變抗原性肽本身之主要胺基酸序列之共價化學修飾。修飾可產生具有期望性質之肽，例如，延長活體內半衰期、增加穩定性、降低清除率、改變免疫原性或致敏性、使得能夠提高具體抗體、細胞靶向、抗原攝取、抗原處理、MHC親和力、MHC穩定性或抗原呈遞。可實施之抗原性肽之改變包括(但不限於)偶聯至載體蛋白、偶聯至配體、偶聯至抗體、聚乙二醇化、聚唾液酸化羥乙基澱粉化、重組體PEG模擬物、Fc融合、白蛋白融合、奈米粒子附接、奈米微粒囊封、膽固醇融合、鐵融合、醯化、醯胺化、醣基化、側鏈氧化、磷酸化、生物素化、添加表面活性材料、添加胺基酸模擬物或添加非天然胺基酸。

與血漿半衰期短或易於發生蛋白酶降解相關之問題可藉由各種修飾 來克服，該等修飾包括將多肽序列偶聯或連接至各種非蛋白質性聚合物(例如，聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇或聚氧化烯)中之任一者(例如參見，通常經由連接部分共價結合至蛋白質及非蛋白質性聚合物(例如，PEG))。該等PEG偶聯生物分子已顯示具有臨床有用之性質，包括更好的物理及熱穩定性、保護免予易發生酶促降解、增加之溶解性、延長之活體內循環半衰期及減少之清除、降低之免疫原性及抗原性，及降低之毒性。

適於偶聯至多肽序列之PEG通常在室溫下溶於水中，且具有通式R(O-CH2-CH2)nO-R，其中R係氫或保護基團(例如烷基或烷醇基團)，且其中n係1至1000之整數。當R係保護基團時，其通常具有1至8個碳。偶聯至多肽序列之PEG可為直鏈或具支鏈的。本揭示內容涵蓋具支鏈PEG衍生物、「星形PEG」及多臂PEG。

本揭示內容亦涵蓋偶聯物之組合物，其中PEG具有不同n值且因此各種不同的PEG係以特定比率存在。例如，一些組合物包含其中n=1、2、3及4之偶聯物之混合物。在一些組合物中，其中n=1之偶聯物之百分比為18-25%，其中n=2之偶聯物之百分比為50-66%，其中n=3之偶聯物之百分比為12-16%，且其中n=4之偶聯物之百分比為至多5%。該等組合物可藉由業內已知之反應條件及純化方法產生。例如，可使用陽離子交換層析分離偶聯物，且然後鑑別含有(例如)附接有期望數量PEG之偶聯物之流份，自未經修飾蛋白質序列及自附接有其他數量PEG之偶聯物純化。

PEG可經由末端反應性基團(「間隔體」)結合至本揭示內容之多肽。間隔體係(例如)調介多肽序列中之一或多者之游離胺基或羧基與聚乙二醇之間之鍵之末端反應性基團。具有可結合至游離胺基之間隔體之PEG包括N-羥基琥珀醯亞胺聚乙二醇，其可藉由用N-羥基琥珀醯亞胺活化聚乙二 醇之琥珀酸酯來製備。可結合至游離胺基之另一經活化聚乙二醇係2,4-雙(O-甲氧基聚乙二醇)-6-氯-s-三嗪，其可藉由使聚乙二醇單甲醚與氰尿醯氯反應來製備。結合至游離羧基之經活化聚乙二醇包括聚氧乙烯二胺。

本揭示內容之多肽序列中之一或多者至具有間隔體之PEG之偶聯可藉由各種習用方法來偶聯。例如，偶聯反應可在4℃至室溫之溫度下在5至10之pH下之溶液中利用4：1至30：1之試劑對蛋白之莫耳比實施30分鐘至20小時。反應條件可經選擇以指導反應朝向主要產生期望之取代程度。一般而言，低溫、低pH(例如，pH=5)及短反應時間往往減少所附接PEG之數量，而高溫、中性至高pH(例如，pH>7)及較長反應時間往往增加所附接PEG之數量。可使用業內已知之各種方式來終止反應。在一些實施例中，反應係藉由酸化反應混合物並在(例如)-20℃下冷凍來終止。

本揭示內容亦涵蓋PEG模擬物之使用。已研發出保留PEG之屬性(例如，增強之血清半衰期)同時賦予若干其他有利性質之重組體PEG模擬物。舉例而言，能夠形成類似於PEG之經延伸構象之簡單多肽鏈(包含(例如)Ala、Glu、Gly、Pro、Ser及Thr)可以重組方式產生且已融合至所關注肽或蛋白質藥物(例如，Amunix' XTEN technology；Mountain View,CA)。此避免了在製程期間對額外偶聯步驟之需要。此外，已確立之分子生物學技術使得能夠控制多肽鏈之側鏈組成，從而容許最佳化免疫原性及製造性質。

醣基化可影響蛋白質之物理性質且亦可在蛋白穩定性、分泌及亞細胞定位中具有重要意義。適當醣基化對於生物活性可能至關重要。實際上，來自真核生物體之一些基因在缺乏用於醣基化蛋白之細胞處理之細菌(例如，大腸桿菌)中表現時，回收到因醣基化之缺乏而具有極少活性或沒 有活性之蛋白質。醣基化位點之添加可藉由改變胺基酸序列來實現。可藉由(例如)添加一或多個絲胺酸或蘇胺酸殘基(對於O-連接之醣基化位點而言)或天冬醯胺殘基(對於N-連接之醣基化位點而言)或經其取代作出多肽之改變。見於每一類型中之N-連接及O-連接之寡醣之結構及糖殘基可能不同。通常見於二者上之一類糖係N-乙醯基神經胺酸(下文稱為唾液酸)。唾液酸通常係N-連接及O-連接之寡醣之末端殘基，且由於其負電荷，可賦予醣蛋白酸性性質。本揭示內容之實施例包含N-醣基化變體之生成及使用。

本揭示內容之多肽序列可視情況藉助改變DNA含量來改變，特別是藉由在預選擇之鹼基處使編碼多肽之DNA突變，使得生成將轉譯為期望胺基酸之密碼子來改變。增加多肽上之碳水化合物部分之數量之另一方式係藉由將糖苷化學或酶促偶合至多肽進行。碳水化合物之移除可以化學方式或酶促方式或藉由取代編碼經醣基化之胺基酸殘基之密碼子實現。化學去醣基化技術已為人知曉，且多肽上之碳水化合物部分之酶促裂解可藉由使用各種內切及外切醣苷酶達成。

用於偶聯之其他適宜組份及分子包括(例如)靶向淋巴系統之分子，甲狀腺球蛋白；白蛋白，例如人類血清白蛋白(HAS)；破傷風類毒素；白喉類毒素；聚胺基酸例如聚(D-離胺酸：D-麩胺酸)；輪狀病毒之VP6多肽；流行性感冒病毒血球凝集素，流行性感冒病毒核蛋白；鑰孔端帽貝血藍蛋白(KLH)；及B型肝炎病毒核心蛋白及表面抗原；或前述各項之任一組合。

白蛋白與本揭示內容之一或多種多肽之融合可藉由(例如)遺傳操縱來達成，使得編碼HSA或其片段之DNA接合至編碼該一或多種多肽序列之 DNA。此後，適宜宿主可經呈(例如)適宜質體形式之融合之核苷酸序列轉變或轉染，以便表現融合多肽。該表現可在活體外自(例如)原核或真核細胞或在活體內自(例如)轉基因生物體實現。在本揭示內容之一些實施例中，融合蛋白之表現係在哺乳動物細胞系(例如，CHO細胞系)中實施。轉變在本文中概括地用於指細胞由於自其環境直接攝取、納入及表現外源性遺傳材料(外源性DNA)及藉助細胞膜吸收所致之遺傳變化。轉變在一些細菌物種中天然地進行，但其在其他細胞中亦可藉由人工方式來實現。此外，白蛋白本身可經修飾以延長其循環半衰期。經修飾白蛋白與一或多種多肽之融合可藉由上文所闡述之遺傳操縱技術或藉由化學偶聯達成；所得融合分子之半衰期超過與未經修飾白蛋白之融合之半衰期。(參見WO2011/051489)。已研發出若干白蛋白-結合策略作為直接融合之替代，包括藉助偶聯之脂肪酸鏈之白蛋白結合(醯化)。由於血清白蛋白係脂肪酸之運輸蛋白，故該等具有白蛋白-結合活性之天然配體已用於小蛋白治療劑之半衰期延長。例如，經批准用於糖尿病之產品地特胰島素(insulin detemir)(LEVEMIR)包含偶聯至遺傳經修飾之胰島素之肉豆蔻基鏈，得到長效胰島素類似物。

另一類型修飾係在多肽序列之N-末端及/或C-末端偶聯(例如，連接)一或多種額外組份或分子，例如另一蛋白質(例如，具與本發明蛋白異源之有胺基酸序列之蛋白質)或載劑分子。因此，可提供實例性多肽序列作為與另一組份或分子之偶聯物。

偶聯物修飾可產生保留活性且具有第二分子之額外或互補功能或活性之多肽序列。例如，多肽序列可偶聯至分子，例如以提高溶解性、促進儲存、增加活體內或儲放半衰期或穩定性、降低免疫原性、促進活體內延 遲或控制釋放等等。其他功能或活性包括相對於未偶聯多肽序列降低毒性之偶聯物、較未偶聯多肽序列更有效地靶向一種類型細胞或器官之偶聯物，或進一步抵抗與如本文所陳述之病症或疾病(例如，糖尿病)相關之病因或效應之藥物。

多肽亦可偶聯至大的、代謝穩定之巨分子，例如蛋白質；多醣，例如瓊脂糖凝膠、瓊脂醣、纖維素、珠狀纖維素；聚合胺基酸，例如聚麩胺酸、聚離胺酸；胺基酸共聚物；去活化之病毒粒子；去活化之細菌毒素，例如來自白喉、破傷風、霍亂、白血球毒素分子之類毒素；去活化之細菌；及樹突細胞。

用於偶聯之其他候選組份及分子包括適於分離或純化之彼等。具體非限制性實例包括結合分子，例如生物素(生物素-抗生物素蛋白特異性結合對)、抗體、受體、配體、凝集素或包含固體載體之分子，該固體載體包括(例如)塑膠或聚苯乙烯珠粒、板或珠粒、磁性珠粒、測試條及膜。可使用諸如陽離子交換層析等純化方法藉由電荷差異來分離偶聯物，此可有效將偶聯物按其各個分子量分離。可使用習用方法(例如，質譜術、SDS-PAGE或用於按分子量分離分子實體之其他已知方法)藉由分子量來鑑別藉由陽離子交換層析獲得之流份之含量。

在一些實施例中，可將本揭示內容之多肽序列之胺基-或羧基-末端與免疫球蛋白Fc區(例如，人類Fc)融合以形成融合偶聯物(或融合分子)。Fc融合偶聯物已顯示可增加生物藥之全身半衰期，且因此生物醫藥產物可能需要較不頻繁的投與。

Fc結合至內襯血管之內皮細胞中之新生Fc受體(FcRn)，且在結合之後，保護Fc融合分子免受降解且其再釋放至循環中，從而使該分子在循環 中保持更久。據信此Fc結合為內源性IgG保留其長血漿半衰期之機制。較近的Fc-融合技術將單拷貝之生物醫藥連接至抗體之Fc區，以與傳統Fc-融合偶聯物相比最佳化生物醫藥之藥物動力學及藥效學性質。

本揭示內容涵蓋多肽之目前已知或未來研發之其他修飾之用途，其用於改良一或多種性質。一種用於延長循環半衰期、提高穩定性、降低清除率或改變本揭示內容之多肽免疫原性或致敏性之該方法涉及藉由羥乙基澱粉化修飾多肽序列，其利用連接至其他分子之羥乙基澱粉衍生物來修改分子之特徵。羥乙基澱粉化之各種態樣闡述於(例如)美國專利申請案第2007/0134197號及第2006/0258607號中。

蛋白質或肽可藉由熟習此項技術者已知之任一技術來製備，該技術包括藉助標準分子生物技術表現蛋白質、多肽或肽，自天然來源分離蛋白質或肽，活體外轉譯或化學合成蛋白質或肽。

肽可易於利用不含污染性細菌或動物物質之試劑以化學方式來合成(Merrifield RB：Solid phase peptide synthesis.I.The synthesis of a tetrapeptide.J.Am.Chem.Soc.85：2149-54,1963)。在一些實施例中，抗原性肽係藉由以下來製備：(1)在多通道儀器上使用一致合成及裂解條件進行平行固相合成；(2)在RP-HPLC管柱上純化且對管柱進行汽提；及在肽之間再洗滌，但不更換；隨後(3)利用資訊最豐富分析之有限組進行分析。優良藥品製造規範(Good Manufacturing Practices，GMP)足跡可界定在個別患者之肽組周圍，因此僅在不同患者之肽合成之間需要成套轉換程序。

另一選擇為，可使用編碼本發明之抗原性肽之核酸(例如，多核苷酸)在活體外產生抗原性肽。多核苷酸可為(例如)單鏈及/或雙鏈之DNA、 cDNA、PNA、CNA、RNA或多核苷酸之天然或經穩定形式(例如具有硫代磷酸酯主鏈之多核苷酸)或其組合，且其可或可不含內含子，只要其編碼肽即可。在一些實施例中，使用活體外轉譯產生肽。亦可製備能表現多肽之表現載體。用於不同細胞類型之表現載體為業內所熟知且可無需過多實驗即選擇。通常，將DNA以適當定向及正確閱讀框插入表現載體(例如質體)中用於表現。若需要，可將DNA連接至由期望宿主(例如，細菌)識別之適當的轉錄及轉譯調節控制核苷酸序列，但該等控制通常用於表現載體中。然後使用標準技術將載體引入宿主細菌中用於選殖(例如，參見Sambrook等人(1989)Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.)。

本文亦涵蓋包含經分離多核苷酸之表現載體以及含有表現載體之宿主細胞。抗原性肽可以編碼期望抗原性肽之RNA或cDNA分子之形式提供。本發明之一或多種抗原性肽可藉由單一表現載體來編碼。

在一些實施例中，多核苷酸可包含疾病特異性抗原性肽之編碼序列，該編碼序列與輔助(例如)自宿主細胞表現及/或分泌多肽之多核苷酸(例如，用作用於控制自細胞轉運多肽之分泌序列之前導序列)融合於同一閱讀框中。具有前導序列之多肽係前體蛋白且可具有由宿主細胞裂解以形成該多肽之成熟形式之前導序列。

在一些實施例中，多核苷酸可包含疾病特異性抗原性肽之編碼序列，該編碼序列與容許(例如)純化經編碼多肽之標記物序列融合於同一閱讀框中，其然後可納入個人化疾病疫苗或免疫原性組合物中。例如，在細菌宿主之情形下，標記物序列可為由pQE-9載體供應之六組胺酸標籤(SEQ ID NO：1834)以提供與該標記物融合之成熟多肽之純化，或當使用 哺乳動物宿主(例如，COS-7細胞)時，標記物序列可為衍生自流行性感冒血球凝集素蛋白之血球凝集素(HA)標籤。其他標籤包括(但不限於)攜鈣蛋白標籤、FLAG標籤、Myc標籤、S標籤、SBP標籤、Sof標籤1、Sof標籤3、V5標籤、Xpress標籤、Isopeptag、SpyTag、生物素羧基載體蛋白(BCCP)標籤、GST標籤、螢光蛋白標籤(例如，綠色螢光蛋白標籤)、麥芽糖結合蛋白標籤、Nus標籤、Strep標籤、硫氧還蛋白標籤、TC標籤、Ty標籤及諸如此類。

在一些實施例中，多核苷酸可包含一或多種疾病特異性抗原性肽之編碼序列，該編碼序列融合於同一閱讀框中以產生能產生多種抗原性肽之單一多聯體化抗原性肽構築體。

在一些實施例中，可提供與編碼本發明之疾病特異性抗原性肽具有至少60%一致、至少65%一致、至少70%一致、至少75%一致、至少80%一致、至少85%一致、至少90%一致、至少95%一致或至少96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列之經分離核酸分子。

本文所闡述之經分離疾病特異性抗原性肽可藉由業內已知之任何適宜方法在活體外(例如，在實驗室中)產生。該等方法涵蓋從直接蛋白質合成方法至構築編碼經分離多肽序列之DNA序列並在適宜轉變之宿主中表現彼等序列。在一些實施例中，DNA序列係使用重組技術藉由分離或合成編碼所關注野生型蛋白之DNA序列來構築。視情況，序列可藉由位點特異性誘變來誘變以提供其功能類似物。例如參見Zoeller等人，Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 81：5662-5066(1984)及美國專利第4,588,585號。

在一些實施例中，編碼所關注多肽之DNA序列可藉由化學合成使用寡核苷酸合成器來構築該等寡核苷酸可基於期望多肽之胺基酸序列且選擇 彼等在產生所關注重組多肽之宿主細胞中有利之密碼子來設計。可應用標準方法來合成編碼所關注經分離多肽之經分離聚核苷酸序列。例如，可使用完全胺基酸序列來構築反向轉譯基因。另外，可合成含有編碼具體經分離多肽之核苷酸序列之DNA寡聚物。例如，可合成若干種編碼期望多肽之部分之小寡核苷酸且然後將其連接。個別寡核苷酸通常含有互補總成之5’或3’懸突。

在組裝(例如，藉由合成、定點誘變或另一方法)之後，將編碼所關注具體經分離多肽之聚核苷酸序列插入表現載體中且視情況可操作連接至適合於在期望宿主中表現該蛋白質之表現控制序列。適當總成可藉由核苷酸測序、限制酶圖譜分析及生物活性多肽在適宜宿主中之表現來證實。亦如業內熟知，為在宿主中獲得高表現程度之轉染基因，可將該基因可操作連接至在所選表現宿主中起作用之轉錄及轉譯表現控制序列。

可使用重組表現載體擴增並表現編碼疾病特異性抗原性肽之DNA。重組表現載體係可複製DNA構築體，其具有編碼疾病特異性抗原性肽或生物等效類似物之合成或cDNA源DNA片段，該等DNA片段可操作連接至源自哺乳動物、微生物、病毒或昆蟲基因之適宜轉錄或轉譯調節元件。轉錄單元通常包含以下各項之總成：(1)在基因表現中具有調節作用之遺傳元件，例如轉錄啟動子或增強子，(2)轉錄為mRNA且轉譯為蛋白質之結構或編碼序列，及(3)適當轉錄及轉譯發動及終止序列，如本文所詳述。該等調節元件可包括操縱子序列以控制轉錄。可另外納入通常藉由複製起點賦予之在宿主中複製之能力及促進識別轉變體之選擇基因。DNA區在功能上彼此相關時係可操作連接的。例如，若信號肽(分泌前導序列)之DNA表現為參與多肽分泌之前體，則其可操作連接至該多肽之DNA； 若啟動子控制編碼序列之轉錄，則該啟動子可操作連接至該序列；或若核糖體結合位點之定位允許轉譯，則其可操作連接至編碼序列。通常，可操作連接意指鄰接，且在分泌前導序列之情形中意指鄰接且在閱讀框中。意欲用於酵母表現系統中之結構元件包括使得宿主細胞能細胞外分泌經轉譯蛋白質之前導序列。另一選擇為，倘若在無前導序列或轉運序列之情況下表現重組蛋白，則其可包括N-末端甲硫胺酸殘基。此殘基隨後可視情況自所表現重組蛋白裂解以提供最終產物。

可用於真核宿主、尤其哺乳動物或人類之表現載體包括(例如)包含來自SV40、牛乳頭瘤病毒、腺病毒及巨細胞病毒之表現控制序列之載體。可用於細菌宿主之表現載體包括已知細菌質體，例如來自大腸桿菌之質體(包括pCR 1、pBR322、pMB9及其衍生物)、更寬宿主範圍之質體(例如M13及絲狀單鏈DNA噬菌體)。

適於表現多肽之宿主細胞包括在適當啟動子控制下之原核生物、酵母、昆蟲或高等真核細胞。原核生物包括革蘭氏陰性(gram negative)或革蘭氏陽性有機體，例如大腸桿菌或桿菌屬(bacilli)。高等真核細胞包括哺乳動物來源之已確立細胞系。亦可採用無細胞轉譯系統。與細菌、真菌、酵母及哺乳動物細胞宿主一起使用之適當選殖及表現載體為業內所熟知(參見Pouwels等人，Cloning Vectors：A Laboratory Manual,Elsevier,N.Y.,1985)。

亦有利地採用各種哺乳動物或昆蟲細胞培養系統來表現重組蛋白。可在哺乳動物細胞中實施重組蛋白之表現，此乃因該等蛋白質一般正確摺疊，經適當修飾且功能完整。適宜哺乳動物宿主細胞系之實例包括Gluzman闡述之猴腎細胞COS-7系(Cell 23：175,1981)，及能表現適當載 體之其他細胞系，包括例如L細胞、C127、3T3、中國倉鼠卵巢(CHO)、293、HeLa及BHK細胞系。哺乳動物表現載體可包含非轉錄元件，例如複製起點、連接至欲表現基因之適宜啟動子及增強子及其他5'或3'側翼非轉錄序列及5'或3'非轉譯序列，例如必需的核糖體結合位點、多聚腺苷酸化位點、剪接供體及受體位點及轉錄終止序列。用於在昆蟲細胞中產生異源蛋白質之桿狀病毒系統綜述於Luckow及Summers,Bio/Technology6：47(1988)中。

由經轉變宿主產生之蛋白質可根據任何適宜方法來純化。該等標準方法包括層析(例如，離子交換層析、親和層析及粒度分級管柱層析及諸如此類)、離心、差別溶解度或用於蛋白質純化之任何其他標準技術。可將親和性標籤(例如六組胺酸(SEQ ID NO：1834)、麥芽糖結合結構域、流行性感冒外殼序列、麩胱甘肽-S-轉移酶及諸如此類)附接至蛋白質以容許藉由通過適當親和管柱容易地純化。亦可使用諸如蛋白質分解、核磁共振及x射線結晶學等技術以物理方式表徵經分離蛋白質。例如，來自將重組蛋白分泌至培養基中之系統之上清液可首先使用市售蛋白質濃縮過濾器(例如Amicon或Millipore Pellicon超濾單元)來濃縮。在濃縮步驟後，可將濃縮物施加至適宜純化基質。另一選擇為，可採用陰離子交換樹脂，例如具有懸垂二乙基胺基乙基(DEAE)基團之基質或基材。基質可為丙烯醯胺、瓊脂醣、聚葡萄糖、纖維素或通常用於蛋白質純化中之其他類型。另一選擇為，可採用陽離子交換步驟。適宜陽離子交換劑包括各種包含磺丙基或羧基甲基之不溶性基質。最後，可採用一或多個採用疏水RP-HPLC介質(例如具有懸垂甲基或其他脂肪族基團之矽膠)之反相高效液相層析(RP-HPLC)步驟進一步純化癌症幹細胞蛋白質-Fc組合物。亦可採用呈各 種組合之一些或所有前述純化步驟來提供均質重組蛋白。

在細菌培養中產生之重組蛋白可藉由以下方式來分離：首先自細胞糰粒萃取，之後進行一或多個濃縮、鹽析、水性離子交換或粒徑篩析層析步驟。可採用高效液相層析(HPLC)用於最後純化步驟。用於表現重組蛋白之微生物細胞可藉由任何便捷方法來破裂，包括冷凍-解凍循環、超音波處理、機械破裂或使用細胞溶解劑。

本發明亦涵蓋核酸分子之用途，其用作向需要其之個體活體內遞送抗原性肽/多肽之媒介，其係呈(例如)DNA/RNA疫苗之形式(例如，參見WO2012/159643及WO2012/159754，其以全文引用方式併入本文中)。

在一些實施例中，可藉由使用質體將抗原投與需要其之患者。該等質體係通常由強病毒啟動子組成以驅動所關注基因(或互補DNA)之活體內轉錄及轉譯之質體(Mor等人，(1995).The Journal of Immunology 155(4)：2039-2046)。有時可包括內含子A以改良mRNA穩定性且因此增加蛋白表現(Leitner等人(1997).The Journal of Immunology 159(12)：6112-6119)。質體亦包括強多聚腺苷酸化/轉錄終止信號，例如牛生長激素或兔β-球蛋白多聚腺苷酸化序列(Alarcon等人，(1999).Adv.Parasitol.Advances in Parasitology 42：343-410；Robinson等人，(2000).Adv.Virus Res.Advances in Virus Research 55：1-74；Böhmet等人，(1996).Journal of Immunological Methods 193(1)：29-40)。有時構築多順反子載體以表現一種以上免疫原，或表現免疫原及免疫刺激蛋白(Lewis等人，(1999).Advances in Virus Research(Academic Press)54：129-88)。

可藉由多種不同的方法將質體引入動物組織中。兩種最常用方法係使用標準皮下注射針注射鹽水中之DNA，及基因槍遞送。構築DNA疫苗 質體及其隨後藉由該兩種方法遞送至宿主中之示意性概述闡釋Scientific American(Weiner等人，(1999)Scientific American 281(1)：34-41)中。鹽水中之注射通常係以肌內(IM)方式在骨骼肌中或以真皮內(ID)方式實施，且將DNA遞送至細胞外間隙中。此可藉由電穿孔用肌肉毒素(例如布比卡因(bupivacaine))暫時損壞肌肉纖維來輔助；或藉由使用鹽水或蔗糖之高滲溶液來輔助(Alarcon等人，(1999).Adv.Parasitol.Advances in Parasitology 42：343-410)。對此遞送方法之免疫反應可受許多因素影響，包括針類型、針對齊、注射速度率、注射體積、肌肉類型及經注射動物之年齡、性別及生理狀況(Alarcon等人，(1999).Adv.Parasitol.Advances in Parasitology 42：343-410)。

另一種常用遞送方法基因槍遞送使用壓縮氦作為加速劑，以彈道學方式將已吸附至金或鎢微粒上之質體DNA(pDNA)加速遞送至靶細胞中(Alarcon等人，(1999).Adv.Parasitol.Advances in Parasitology 42：343-410；Lewis等人，(1999).Advances in Virus Research(Academic Press)54：129-88)。

替代遞送方法可包括在黏膜表面(例如鼻及肺黏膜)上氣溶膠滴注裸DNA(Lewis等人，(1999).Advances in Virus Research(Academic Press)54：129-88)及將pDNA局部投與眼及引導黏膜(Lewis等人，(1999)Advances in Virus Research(Academic Press)54：129-88)。黏膜表面遞送亦已使用陽離子脂質體-DNA製劑、生物可降解微球體、用於經口投與腸黏膜之減弱之志賀桿菌屬(Shigella)或李氏菌屬(Listeria)載體及重組腺病毒載體來達成。亦可在溫和機械破壞細胞膜，從而暫時可滲透化處理細胞後，將DNA或RNA遞送至細胞。對膜之此一溫和機械破壞可藉由溫和 地迫使細胞穿過小縫隙來完成(Ex Vivo Cytosolic Delivery of Functional Macromolecules to Immune Cells,Sharei等人，PLOS ONE｜DOI：10.1371/journal.pone.0118803，2015年4月13日)。

在一些實施例中，疾病特異性疫苗或免疫原性組合物可包括編碼(例如)一或多種抗原性肽/多肽之單獨DNA質體。如本文所論述，表現載體之確切選擇可取決於欲表現之肽/多肽，且為熟習此項技術者所熟知。預期DNA構築體(例如，在肌肉細胞中呈游離型非複製非整合形式)之預期持久性提供延長之保護持續時間。

本發明之一或多種抗原性肽可在活體內使用基於病毒之系統(例如，腺病毒系統、腺相關病毒(AAV)載體、痘病毒或慢病毒屬)編碼並表現。在一些實施例中，疾病疫苗或免疫原性組合物可包括用於有需要之人類患者中之基於病毒之載體，例如腺病毒。先前已闡述可用於腺相關病毒、腺病毒及慢病毒遞送之質體(例如，參見美國專利第6,955,808號及第6,943,019號以及美國專利申請案第20080254008號，其係以引用方式併入本文中)。

本發明之肽及多肽亦可藉由載體表現，例如如本文所論述之核酸分子(例如RNA或DNA質體)、病毒載體(例如痘病毒，例如正痘病毒、禽痘病毒；或腺病毒、AAV或慢病毒)。此方法涉及使用載體來表現編碼本發明肽之核苷酸序列。在引入急性或慢性經感染之宿主或引入未經感染宿主中之後，載體表現免疫原性肽，且因此引發宿主CTL反應。

在可用於實踐本發明之載體中，使用反轉錄病毒基因轉移方法在細胞之宿主基因體中整合係可能的，通常導致長期表現所插入轉基因。在一些實施例中，反轉錄病毒係慢病毒。另外，已在多種不同細胞類型及靶組 織中觀察到高轉導效率。反轉錄病毒之向性可藉由納入外來套膜蛋白擴大靶細胞之潛在靶群體來改變。反轉錄病毒亦可經改造以容許所插入轉基因之條件性表現，使得僅某些細胞類型被慢病毒感染。可使用細胞類型特異性啟動子靶向在特定細胞類型中之表現。慢病毒載體係反轉錄病毒載體(且因此可使用慢病毒及反轉錄病毒載體來實踐本發明)。此外，慢病毒載體能轉導或感染非分裂細胞且通常產生高病毒效價。因此，反轉錄病毒基因轉移系統之選擇可取決於靶標組織。反轉錄病毒載體包括具有對最高6-10kb之外來序列之包裝容量之順式作用長末端重複序列。最小順式作用LTR足以用於複製並包裝載體，然後其用於將期望核酸整合至靶細胞中以提供持久表現。可用於實踐本發明之廣泛使用之反轉錄病毒載體包括基於以下之彼等：鼠類白血病病毒(MuLV)、長臂猿白血病病毒(GaLV)、猿猴免疫缺失病毒(SIV)、人類免疫缺失病毒(HIV)及其組合(例如，參見Buchscher等人，(1992)J.Virol.66：2731-2739；Johann等人，(1992)J.Virol.66：1635-1640；Sommnerfelt等人，(1990)Virol.176：58-59；Wilson等人，(1998)J.Virol.63：2374-2378；Miller等人，(1991)J.Virol.65：2220-2224；PCT/US94/05700)。

亦可用於實踐本發明者係最小非靈長類動物慢病毒載體，例如基於馬傳染性貧血病毒(EIAV)之慢病毒載體。載體可具有驅動靶標基因之表現之巨細胞病毒(CMV)啟動子。因此，本發明在可用於實踐本發明之載體中涵蓋：病毒載體，包括反轉錄病毒載體及慢病毒載體。

在本文之實施例中，遞送係經由慢病毒進行。劑量(例如，具有1×10⁹個轉導單位(TU)/mL之效價之10μl重組體慢病毒)可針對在本發明中使用反轉錄病毒或慢病毒載體經調整或外推。對於在諸如腦等組織中之轉 導，需要使用極小體積，因此藉由超速離心濃縮病毒製劑。可使用諸如超濾或結合至基質及自基質溶析等其他濃縮方法。在其他實施例中，所投與慢病毒之量可為1×10⁵或約1×10⁵個噬菌斑形成單位(PFU)、5×10⁵或約5×10⁵PFU、1×10⁶或約1×10⁶PFU、5×10⁶或約5×10⁶PFU、1×10⁷或約1×10⁷PFU、5×10⁷或約5×10⁷PFU、1×10⁸或約1×10⁸PFU、5×10⁸或約5×10⁸PFU、1×10⁹或約1×10⁹PFU、5×10⁹或約5×10⁹PFU、1×10¹⁰或約1×10¹⁰PFU或5×10¹⁰或約5×10¹⁰PFU，其作為平均75kg之人類之總單一劑量，或針對個體之重量及大小及物種進行調節。熟習此項技術者可確定適宜劑量。可憑經驗確定適於病毒之劑量。

亦可用於實踐本發明者係腺病毒載體。一個優點係重組腺病毒能在各種哺乳動物細胞及組織中在活體外及活體內有效轉移並表現重組基因，導致經轉移核酸之高表現。另外，有效感染靜止細胞之能力擴大了重組腺病毒載體之實用性。另外，高表現程度確保核酸產物將表現至足夠程度以生成免疫反應(例如，參見美國專利第7,029,848號，其以引用方式併入本文中)。關於可用於實踐本發明之腺病毒載體，提及美國專利第6,955,808號。所用腺病毒載體可選自由以下組成之群：Ad5、Ad35、Ad11、C6及C7載體。腺病毒5(「Ad5」)基因體之序列已經公開。(Chroboczek,J.、Bieber,F.及Jacrot,B.(1992)The Sequence of the Genome of Adenovirus Type 5 and Its Comparison with the Genome of Adenovirus Type 2,Virology 186,280-285；其內容以引用方式併入本文中)。Ad35載體闡述於美國專利第6,974,695號、第6,913,922號及第6,869,794號中。Ad11載體闡述於美國專利第6,913,922中號。C6腺病毒載體闡述於以下專利中：美國專利第6,780,407號；第6,537,594號；第6,309,647號；第 6,265,189號；第6,156,567號；第6,090,393號；第5,942,235號及第5,833,975號中。C7載體闡述於美國專利第6,277,558號中。亦可使用E1-缺損或缺失、E3-缺損或缺失及/或E4-缺損或缺失之腺病毒載體。某些在E1區具有突變之腺病毒具有改良之安全界限，此乃因E1-缺損腺病毒突變體在非受納細胞中係複製缺損的，或至少經顯著減弱。在E3區具有突變之腺病毒可因破壞腺病毒借之下調I類MHC分子之機制而具有增強之免疫原性。具有E4突變之腺病毒可由於抑制晚期基因表現而具有降低之腺病毒載體之免疫原性。該等載體在期望利用相同載體反覆進行疫苗再接種時可能尤其有用。根據本發明可使用在E1、E3、E4、E1及E3以及E1及E4中缺失或突變之腺病毒載體。此外，根據本發明亦可使用所有病毒基因皆缺失之「無病毒基因的」腺病毒載體。該等載體需要輔助病毒用於其複製且需要表現E1a及Cre之專用人類293細胞系，此條件在天然環境中不存在。該等「無病毒基因的」載體無免疫原性且因此該等載體可多次接種用於疫苗再接種。「無病毒基因的」腺病毒載體可用於插入異源插入/基因(例如本發明之轉基因)，且甚至可用於共遞送大量異源插入/基因。在一些實施例中，遞送係經由腺病毒進行，該腺病毒可為單一加強劑量。在一些實施例中，腺病毒係遞由多個劑量送經。就活體內遞送而言，AAV由於低毒性及因不整合至宿主基因體中引起之低的致插入誘變機率而優於其他病毒載體。AAV具有4.5或4.75Kb之包裝極限。大於4.5或4.75Kb之構築體可顯著減少病毒產生。有許多啟動子可用於驅動核酸分子表現。AAV ITR可用作啟動子且有利於消除對另一啟動子元件之需要。對於全身性表現，可使用以下啟動子：CMV、CAG、CBh、PGK、SV40、鐵蛋白重鏈或輕鏈等。對於腦表現，可使用以下啟動子：用於所有神經元之突觸蛋白 I、用於興奮性神經元之CaMKIIα、用於γ-胺基丁酸能神經元之GAD67或GAD65或VGAT等。用於驅動RNA合成之啟動子可包括：Pol III啟動子，例如U6或H1。Pol II啟動子及內含子盒之使用可用於表現嚮導RNA(gRNA)。關於可用於實踐本發明之AAV載體，提及美國專利第5658785號、第7115391號、第7172893號、第6953690號、第6936466號、第6924128號、第6893865號、第6793926號、第6537540號、第6475769及第6258595號及其中所引用之文件。關於AAV，AAV可為AAV1、AAV2、AAV5或其任一組合。可針對欲靶向之細胞選擇AAV；例如，可選擇AAV血清型1、2、5或雜合衣殼AAV1、AAV2、AAV5或其任一組合用於靶向腦或神經元細胞；且可選擇AAV4用於靶向心臟組織。AAV8可用於遞送至肝臟。在一些實施例中，遞送係經由AAV進行。可調節劑量以針對副作用平衡治療益處。

在一些實施例中，有效活化疾病疫苗或免疫原性組合物之細胞免疫反應可藉由在疫苗中表現相關抗原或在非致病性微生物中表現免疫原性組合物達成。該等微生物之熟知實例係牛分枝桿菌(Mycobacterium bovis)BCG、沙門桿菌屬(Salmonella)及假單胞菌屬(參見美國專利第6,991,797號，其以全文引用方式併入本文中)。

在一些實施例中，在疾病疫苗或免疫原性組合物中使用痘病毒。該等痘病毒包括正痘病毒、禽痘、牛痘、MVA、NYVAC、金絲雀痘、ALVAC、雞痘、TROVAC等(參見例如，Verardiet等人，Hum Vaccin Immunother.2012年7月；8(7)：961-70；及Moss,Vaccine.2013；31(39)：4220-4222)。痘病毒表現載體闡述於1982年且迅速廣泛用於疫苗研發以及多個領域的研究。該等載體之優點包括簡單構築、能接納大量外來 DNA及高表現程度。關於可用於實踐本發明之痘病毒之資訊，例如脊椎動物痘病毒亞科(Chordopoxvirinae subfamily)痘病毒(脊椎動物之痘病毒)，例如正痘病毒及禽痘病毒，例如牛痘病毒(例如，惠氏(Wyeth)株、WR株(例如，ATCC^® VR-1354)、哥本哈根(Copenhagen)株、NYVAC、NYVAC.1、NYVAC.2、MVA、MVA-BN)、金絲雀痘病毒(例如，惠特利(Wheatley)C93株、ALVAC)、雞痘病毒(例如，FP9株、韋伯斯特(Webster)株、TROVAC)、鴿痘(dovepox)、鴿痘(pigeonpox)、鵪鶉痘及浣熊痘，尤其其合成或非天然重組體、其用途及該等重組體之製備及使用方法可參見科學及專利文獻。

在一些實施例中，在疾病疫苗或免疫原性組合物中使用牛痘病毒來表現抗原。(Rolph等人，Recombinant viruses as vaccines and immunological tools.Curr Opin Immunol 9：517-524,1997)。重組牛痘病毒能在經感染宿主細胞之細胞質內複製且因此所關注多肽可誘導免疫反應。此外，痘病毒已廣泛用作疫苗或免疫原性組合物載體，此乃因其能藉由I類主要組織相容性複合體路徑藉由直接感染免疫細胞、尤其抗原呈遞細胞來靶向用於處理之所編碼抗原，但亦係由於其能自輔助。

在一些實施例中，在疾病疫苗或免疫原性組合物中使用ALVAC作為載體。ALVAC係可經修飾以表現外來轉基因且已用作對抗原核及真核抗原之疫苗接種方法之金絲雀痘病毒(Horig H、Lee DS、Conkright W等人，Phase I clinical trial of a recombinant canarypoxvirus(ALVAC)vaccine expressing human carcinoembryonic antigen and the B7.1 co-stimulatory molecule.Cancer Immunol Immunother 2000；49：504-14；von Mehren M、Arlen P、Tsang KY等人，Pilot study of a dual gene recombinant avipox vaccine containing both carcinoembryonic antigen(CEA)and B7.1 transgenes in patients with recurrent CEA-expressing adenocarcinomas.Clin Cancer Res 2000；6：2219-28；Musey L、Ding Y、Elizaga M等人，HIV-1 vaccination administered intramuscularly can induce both systemic and mucosal T cell immunity in HIV-1-uninfected individuals.J Immunol 2003；171：1094-101；Paoletti E.Applications of pox virus vectors to vaccination：an update.Proc Natl Acad Sci U S A 1996；93：11349-53；美國專利第7,255,862號)。在I期臨床試驗中，表現腫瘤抗原CEA之ALVAC病毒在所選患者中顯示優良安全性概況且引起增加之CEA特異性T細胞反應；然而，未觀察客觀臨床反應(Marshall JL、Hawkins MJ、Tsang KY等人Phase I study in cancer patients of a replication-defective avipox recombinant vaccine that expresses human carcinoembryonic antigen.J Clin Oncol 1999；17：332-7)。

在一些實施例中，可使用改良型安卡拉牛痘(MVA)病毒作為抗原疫苗或免疫原性組合物之病毒載體。MVA係正痘病毒家族之成員且已藉由牛痘病毒之安卡拉株(CVA)在雞胚胎纖維母細胞上約570次連續傳代來生成(綜述參見Mayr,A.等人，Infection 3,6-14,1975)。由於該等傳代，所得MVA病毒所含基因體資訊與CVA相比少31千鹼基，且高度受限於宿主細胞(Meyer,H.等人，J.Gen.Virol.72,1031-1038,1991)。MVA之特徵在於其極端減弱，即特徵為減小之毒力或感染能力，但仍保持優良免疫原性。當在多種動物模型中測試時，證實MVA無毒力，甚至在免疫抑制個體中亦無毒力。此外，MVA-BN^®-HER2係候選免疫療法，其經設計用於 治療HER-2陽性乳癌且目前處於臨床試驗中。(Mandl等人，Cancer Immunol Immunother.Jan 2012；61(1)：19-29)。已闡述製備及使用重組體MVA之方法(例如，參見國專利第8,309,098號及第5,185,146號，其全文併入本文中)。

在一些實施例中，將疫苗或免疫原性組合物之重組體病毒顆粒投與需要其之患者。

新抗原結合肽

在某些實施例中，本發明提供能以高親和力結合至新抗原肽：人類白血球抗原(HLA)複合體之結合蛋白(例如，抗體或其抗原結合片段)或T細胞受體(TCR)或嵌合抗原受體(CAR)。在一些實施例中，本發明提供能以高親和力結合至衍生自蛋白質之細胞外結構域之新抗原肽之CAR。在某些實施例中，如本文所闡述之新抗原特異性結合蛋白或TCR或CAR包括在天然胺基酸序列中具有一或多個胺基酸取代、插入或缺失之變體多肽物質，條件係結合蛋白保留或實質上保留其特異性結合功能。胺基酸之保守取代已為人熟知且可天然進行或在結合蛋白或TCR係重組產生時可被引入。可使用業內已知之誘變方法將胺基酸取代、缺失及添加引入蛋白質中(例如，參見Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual,第3版，Cold Spring Harbor Laboratory Press,N Y,2001)。可採用寡核苷酸引導之位點特異性(或區段特異性)誘變程序來提供具有根據期望之取代、缺失或插入改變之特定密碼子之經改變多核苷酸。另一選擇為，可使用隨機或飽和誘變技術(例如丙胺酸掃描誘變、易錯聚合酶鏈式反應誘變及寡核苷酸引導之誘變)來製備免疫原多肽變體(例如，參見Sambrook等人，見上文)。

熟習此項技術者已知之各種準則指示在肽或多肽之特定位置經取代之胺基酸是否保守(或類似)。例如，類似胺基酸或保守胺基酸取代係其中胺基酸殘基經具有類似側鏈之胺基酸殘基替代者。類似胺基酸可包括在以下類別中：具有鹼性側鏈之胺基酸(例如，離胺酸、精胺酸、組胺酸)；具有酸性側鏈之胺基酸(例如，天冬胺酸、麩胺酸)；具有不帶電極性側鏈之胺基酸(例如，甘胺酸、天冬醯胺、麩醯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、半胱胺酸、組胺酸)；具有非極性側鏈之胺基酸(例如，丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸、色胺酸)；具有β-具支鏈側鏈之胺基酸(例如，蘇胺酸、纈胺酸、異白胺酸)及具有芳香族側鏈之胺基酸(例如，酪胺酸、苯丙胺酸、色胺酸)。被視為較難分類之脯胺酸與具有脂肪族側鏈之胺基酸(例如，白胺酸、纈胺酸、異白胺酸及丙胺酸)共有性質。在某些情況下，用麩醯胺酸取代麩胺酸或用天冬醯胺取代天冬胺酸可視為類似的取代，因為麩醯胺酸及天冬醯胺分別係麩胺酸及天冬胺酸之醯胺衍生物。如業內所瞭解，兩種多肽之間之「類似性」可藉由將多肽之胺基酸序列及其保守胺基酸取代物與第二多肽之序列進行比較來測定(例如，使用GENEWORKS、Align、BLAST算法或本文所闡述及業內所實踐之其他算法)。

在某些實施例中，新抗原特異性結合蛋白、TCR或CAR能(a)獨立地或在不存在CD8下特異性結合至細胞表面上之新抗原：HLA複合體。在某些實施例中，新抗原特異性結合蛋白係T細胞受體(TCR)、嵌合抗原受體或TCR之抗原結合片段，其任一者均可為嵌合、經人類化或人類的。在其他實施例中，TCR之抗原結合片段包含單鏈TCR(scTCR)。

在某些實施例中，提供組合物，其包含根據上文實施例中之任一者 之新抗原特異性結合蛋白或高親和力重組TCR及醫藥上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑。

舉例而言，可用於分離及純化重組產生之可溶性TCR之方法可包括自將重組可溶性TCR分泌至培養基中之適宜宿主細胞/載體系統獲得上清液，及然後使用市售過濾器濃縮培養基。在濃縮之後，可將濃縮物施加至適宜純化基質或施加至一系列適宜基質，例如親和性基質或離子交換樹脂。可採用一或多個反相HPLC步驟來進一步純化重組多肽。當自天然環境分離免疫原時，亦可採用該等純化方法。大規模產生本文所闡述之經分離/重組可溶性TCR中之一或多者之方法包括分批細胞培養，其可經監測及控制以維持適當培養條件。可溶性TCR之純化可根據本文所闡述及業內已知之方法來實施。

III.免疫原性及疫苗組合物

在一些實施例中，本發明係關於能提高新抗原特異性反應(例如，體液性或細胞調介之免疫反應)之免疫原性組合物，例如，疫苗組合物。在一些實施例中，免疫原性組合物包含對應於本文所鑑別之腫瘤特異性新抗原之本文所闡述之新抗原治療劑(例如，肽、多核苷酸、TCR、CAR、含有TCR或CAR之細胞、含有多肽之樹突細胞、含有多核苷酸之樹突細胞、抗體等)。

在一些實施例中，免疫原性肽係自一或多個患有疾病或病況之個體鑑別。在一些實施例中，免疫原性肽對一或多個患有疾病或病況之個體具有特異性。在一些實施例中，免疫原性肽可結合至與一或多個患有疾病或病況之個體之HLA單倍型相匹配之HLA。

熟習此項技術者將能藉由測試以下來選擇新的抗原治療劑：例如活 體外T細胞之生成以及其效率及總體存在，某些T細胞對某些肽之增殖、親和力及擴增，及T細胞之功能性，例如藉由分析藉由T細胞之IFN-γ產生或腫瘤殺死。然後可將最有效的肽組合為免疫原性組合物。

在本發明之一些實施例中，選擇不同的新抗原肽及/或多肽使得一種免疫原性組合物包含能與不同的MHC分子(例如不同的I類MHC分子)締合之新抗原肽及/或多肽。在一些實施例中，免疫原性組合物包含能與最常出現之I類MHC分子締合之新抗原肽及/或多肽。因此，本文所闡述之免疫原性組合物包含能與至少2種、至少3種或至少4種I類或II類MHC分子締合之不同肽。

在一些實施例中，本文所闡述之免疫原性組合物能提高特異性細胞毒性T細胞反應、特異性輔助T細胞反應或B細胞反應。

在一些實施例中，本文所闡述之免疫原性組合物可進一步包含佐劑及/或載劑。有用佐劑及載劑之實例係於下文給出。組合物中之多肽及/或多核苷酸可與諸如(例如)能將肽呈遞至T細胞或B細胞之蛋白質或抗原呈遞細胞(例如樹突細胞(DC))等載劑締合。在其他實施例中，使用DC結合肽作為載劑以將新抗原肽及編碼新抗原肽之多核苷酸靶向樹突細胞(Sioud等人FASEB J 27：3272-3283(2013))。

在實施例中，新抗原多肽或多核苷酸可以含有該等多肽或多核苷酸之抗原呈遞細胞(例如，樹突細胞)之形式提供。在其他實施例中，使用該等抗原呈遞細胞來刺激用於患者中之T細胞。

在一些實施例中，抗原呈遞細胞係樹突細胞。在相關實施例中，樹突細胞係經新抗原肽或核酸脈衝之自體樹突細胞。新抗原肽可為引起適當T細胞反應之任一適宜肽。使用經來自腫瘤相關抗原之肽脈衝之自體樹突 細胞之T細胞療法揭示於Murphy等人，(1996)The Prostate 29,371-380及Tjua等人，(1997)The Prostate 32,272-278中。在一些實施例中，T細胞係CTL。在一些實施例中，T細胞係HTL。

因此，本發明之一個實施例提供免疫原性組合物，其含有至少一種經一或多種本文所闡述之新抗原多肽或多核苷酸脈衝或經該等加載之抗原呈遞細胞(例如，樹突細胞)。在實施例中，該等APC係自體的(例如，自體樹突細胞)。另一選擇為，可用新抗原肽或多核苷酸離體加載自患者分離之末梢血單核細胞(PBMC)。在相關實施例中，將該等APC或PBMC注射回至患者中。

多核苷酸可為任何能轉導樹突細胞，因此呈遞新抗原肽並誘導免疫性之適宜多核苷酸。在一些實施例中，多核苷酸可為被細胞藉由被動加載吸收之裸DNA。在另一實施例中，多核苷酸係遞送媒介(例如，脂質體、類病毒顆粒、質體或表現載體)之一部分。在另一實施例中，多核苷酸係藉由無載體遞送系統(例如，高效電穿孔及高速細胞變形)來遞送。在實施例中，使用該等抗原呈遞細胞(APC)(例如，樹突細胞)或末梢血單核細胞(PBMC)來刺激T細胞(例如，自體T細胞)。在相關實施例中，T細胞係CTL。在其他相關實施例中，T細胞係HTL。然後將該等T細胞注射至患者中。在一些實施例中，將CTL注射至患者中。在一些實施例中，將HTL注射至患者中。在一些實施例中，將CTL及HTL二者注射至患者中。任一治療劑之投與均可同時或依序且以任一順序來實施。

本文所闡述用於治療性治療之醫藥組合物(例如，免疫原性組合物)預期用於非經腸、局部(topical)、經鼻、經口或局部(local)投與。在一些實施例中，本文所闡述之醫藥組合物係以非經腸方式(例如，以靜脈內、皮 下、真皮內或肌內方式)來投與。在實施例中，可在腫瘤內投與組合物。可在手術切除之位點投與組合物以誘導對腫瘤之局部免疫反應。在一些實施例中，本文所闡述用於非經腸投與之組合物，該等組合物包含新抗原肽及免疫原性組合物溶解或懸浮於可接受之載劑(例如，水性載劑)中之溶液。可使用各種水性載劑，例如，水、緩衝水、0.9%鹽水、0.3%甘胺酸、玻尿酸及諸如此類。該等組合物可藉由習用、眾所周知之滅菌技術來滅菌或可進行無菌過濾。可將所得水溶液包裝以供按原樣使用或將其凍乾，將凍乾製劑在投與之前與無菌溶液合併。組合物可含有為適當生理條件所需要之醫藥上可接受之輔助物質，例如pH調節劑及緩衝劑、張力調節劑、潤濕劑及諸如此類，例如，乙酸鈉、乳酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、去水山梨醇單月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯等。

在醫藥調配物中本文所闡述之新抗原肽及多核苷酸之濃度可廣泛變化，即自小於約0.1重量%(通常為約2%或至少約2%)至多達20重量%至50重量%或更多，且其將根據所選擇之具體投與模式藉由流體體積、黏度等來選擇。

本文所闡述之新抗原肽及多核苷酸亦可經由脂質體來投與，該等脂質體將該等肽靶向特定細胞組織，例如淋巴樣組織。脂質體亦可用於延長肽之半衰期。脂質體包括乳液、發泡體、膠束、不溶性單層、液晶、磷脂分散液、層狀層及諸如此類。在該等製劑中，將欲遞送之肽作為脂質體之一部分單獨或連同結合至(例如)盛行於淋巴細胞中之受體之分子(例如結合至DEC205抗原之單株抗體)一起或與其他治療劑或免疫原性組合物一起納入。因此，可將用本文所闡述之期望肽或多核苷酸填充之脂質體引導至淋巴樣細胞之位點，其中脂質體然後遞送所選擇之治療劑/免疫原性多肽/ 多核苷酸組合物。脂質體可自標準成囊泡脂質形成，該標準成囊泡脂質通常包括中性及帶負電之磷脂及固醇，例如，膽固醇。脂質之選擇通常係藉由考慮(例如)脂質體大小、酸不穩定性及脂質體在血流中之穩定性來指導。可使用各種方法來製備脂質體，如(例如)Szoka等人，Ann.Rev.Biophys.Bioeng.9；467(1980)、美國專利4,235,871號、第4,501,728號、第4,501,728號、第4,837,028號及第5,019,369號中所闡述。

為靶向免疫細胞，將針對期望免疫系統細胞之細胞表面決定子之新抗原多肽或多核苷酸納入脂質體中。含有肽之脂質體懸浮物可以靜脈內方式、以局部方式(locally)、以局部方式(topically)等來投與，其劑量尤其隨投與方式、所遞送之多肽或多核苷酸及所治療疾病之階段而變化。

在一些實施例中，新抗原多肽及多核苷酸係靶向樹突細胞。在一些實施例中，新抗原多肽及多核苷酸係使用標記物DEC205、XCR1、CD197、CD80、CD86、CD123、CD209、CD273、CD283、CD289、CD184、CD85h、CD85j、CD85k、CD85d、CD85g、CD85a、TSLP受體、Clec9a或CD1a靶向樹突細胞。

對於固體組合物，可使用習用或奈米粒子無毒性固體載劑，其包括(例如)醫藥級甘露醇、乳糖、澱粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、滑石粉、纖維素、葡萄糖、蔗糖、碳酸鎂及諸如此類。對於經口投與，醫藥上可接受之無毒性組合物係藉由納入通常採用賦形劑中之任一者(例如先前所列示之彼等載劑)及通常10-95%之活性成分(亦即25%-75%濃度之一或多種本文所闡述之新抗原多肽或多核苷酸)形成。

對於氣溶膠投與，新抗原多肽或多核苷酸可連同表面活性劑及推進劑一起以微細形式供應。代表該等藥劑者係含有6至22個碳原子之脂肪酸 (例如己酸、辛酸、月桂酸、棕櫚酸、硬脂酸、亞油酸、亞麻酸、油硬脂酸及油酸)與脂肪族多元醇或其環酐形成之酯或偏酯。可採用混合酯(例如混合型或天然甘油酯)。表面活性劑可構成組合物之0.1重量%至20重量%或0.25%至5%。組合物之其餘部分可為推進劑。若期望亦可包括載劑(如同例如卵磷脂)用於鼻內遞送。

遞送本文所闡述之新抗原多核苷酸之其他方法已為業內熟知。例如，可以「裸DNA」形式直接遞送核酸。此方法闡述於(例如)Wolff等人，Science 247：1465-1468(1990)以及美國專利第5,580,859號及第5,589,466號中。亦可使用彈道遞送投與核酸，如(例如)美國專利第5,204,253號中所闡述。可投與僅包括DNA之粒子。另一選擇為，可將DNA黏著至粒子，例如金粒子。

出於治療或免疫目的，亦可將編碼新抗原肽之mRNA或肽結合劑投與患者。在一些實施例中，mRNA係自擴增式RNA。在另一實施例中，自擴增RNA係合成脂質奈米粒子調配物之一部分(Geall等人，Proc Natl Acad Sci U S A.109：14604-14609(2012))。

核酸亦可與陽離子化合物(例如陽離子脂質)複合遞送。脂質調介之基因遞送方法闡述於例如以下文獻中：WO 96/18372、WO 93/24640；Mannino & Gould-Fogerite,BioTechniques 6(7)：682-691(1988)；美國專利第5,279,833號；WO 91/06309；及Felgner等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：7413-7414(1987)。

本文所闡述之新抗原肽及多肽亦可藉由減毒病毒(例如牛痘或雞痘)來表現。此方法涉及使用牛痘病毒作為載體來表現編碼本文所述肽之核苷酸序列。在引入急性或慢性經感染之宿主中或引入未經感染宿主中之後，重 組牛痘病毒表現免疫原性肽，且藉此引發宿主CTL反應。可用於免疫方案中之牛痘載體及方法闡述於(例如)美國專利第4,722,848號中。另一載體係BCG(卡介苗)。BCG載體闡述於Stover等人之(Nature 351：456-460(1991))中。熟習此項技術者自本文之闡述將明瞭眾多種可用於治療性投與或免疫本文所述肽之其他載體。

佐劑係任何在混合至免疫原性組合物中增加或以其他方式修改對治療劑之免疫反應之物質。載劑係新抗原多肽或多核苷酸能與其締合之支架結構，例如多肽或多醣。視情況，佐劑係共價或非共價偶聯至本文所闡述之多肽或多核苷酸。

佐劑增加對抗原之免疫反應之能力通常表現為免疫調介之反應顯著增加或疾病症狀減輕。例如，體液性免疫性增加可表現為針對抗原產生之抗體之效價顯著增加，且T細胞活性增加可表現為增加之細胞增殖或細胞毒性或細胞介素分泌。佐劑亦可(例如)藉由使原發性體液性或2型T輔助細胞反應變為原發性細胞或1型T輔助細胞反應來改變免疫反應。

適宜佐劑為業內熟知(參見WO 2015/095811)且包括(但不限於)聚(I：C)、聚-ICLC、STING激動劑、1018 ISS、鋁鹽、阿普利瓦、AS15、BCG、CP-870,893、CpG7909、CyaA、dSLIM、GM-CSF、IC30、IC31、咪喹莫特、ImuFact IMP321、IS Patch、ISS、ISCOMATRIX、JuvImmune、LipoVac、MF59、單磷醯脂質A、Montanide IMS 1312、Montanide ISA 206、Montanide ISA 50V、Montanide ISA-51、OK-432、OM-174、OM-197-MP-EC、ONTAK、PepTel®載體系統、PLG微粒、雷西莫特、SRL172、病毒體及其他類病毒顆粒、YF-17D、VEGF阱、R848、β-葡聚糖、Pam3Cys、Pam3CSK4、源於皂素之Aquila QS21 刺激子(Aquila Biotech,Worcester,Mass.,USA)、分枝桿菌提取物及合成細菌細胞壁模擬物及其他專有佐劑(例如Ribi之Detox.Quil或Superfos)。佐劑亦包括不完全弗羅因德氏佐劑(incomplete Freund's)或GM-CSF。樹突細胞特異之若干免疫佐劑(例如，MF59)及其製劑已在先前闡述(Dupuis M等人，Cell Immunol.1998；186(1)：18-27；Allison A C；Dev Biol Stand.1998；92：3-11)(Mosca等人Frontiers in Bioscience,2007；12：4050-4060)(Gamvrellis等人Immunol & Cell Biol.2004；82：506-516)。亦可使用細胞介素。若干細胞介素與以下各項直接相關：影響樹突細胞至淋巴樣組織之遷移(例如，TNF-α)、加速樹突細胞至T-淋巴球之有效抗原呈遞細胞之成熟(例如，GM-CSF、PGE1、PGE2、IL-1、IL-1b、IL-4、IL-6及CD40L)(美國專利第5,849,589號，其以全文引用方式併入本文中)及充當免疫佐劑(例如，IL-12)(Gabrilovich D I等人，J Immunother Emphasis Tumor Immunol.1996(6)：414-418)。

亦已報導CpG免疫刺激性寡核苷酸可增強佐劑在疫苗環境中之效應。不受限於理論，CpG寡核苷酸藉由經由類鐸受體(TLR)(主要TLR9)活化先天(非適應性)免疫系統來起作用。CpG觸發之TLR9活化增強對眾多種抗原之抗原特異性體液性及細胞反應，該等抗原包括預防性及治療性免疫原性醫藥組合物中二者之肽或蛋白質抗原、活的或經殺死病毒、樹突細胞免疫原性醫藥組合物、自體細胞免疫原性醫藥組合物及多醣偶聯物。重要地，其增強樹突細胞成熟及分化，引起增強之TH1細胞活化及強細胞毒性T-淋巴球(CTL)生成(即使在CD4 T輔助細胞不存在下)。由TLR9刺激誘導之TH1偏差即使在通常促進TH2偏差之佐劑(例如明礬(alum)或不完全弗氏佐劑(IFA))存在下亦可維持。CpG寡核苷酸在與其他佐劑一起調配或 共投時或在調配物(例如微粒、奈米粒子、脂質乳液或類似調配物)中顯示甚至更大的佐劑活性，其尤其為抗原相對較弱時誘導強反應所需。其亦加速免疫反應且使得抗原劑量能夠降低，且在一些實驗中抗體反應與不含CpG之全劑量免疫原性醫藥組合物相當(Arthur M.Krieg,Nature Reviews,Drug Discovery,2006年6月5日，471-484)。美國專利第6,406,705 B1號闡述組合使用CpG寡核苷酸、非核酸佐劑及抗原來誘導抗原特異性免疫反應。市售CpG TLR9拮抗劑係dSLIM(雙莖環免疫調節劑)(Mologen,Berlin,GERMANY)，其係本文所述醫藥組合物之組份。亦可使用其他TLR結合分子，例如RNA結合性TLR 7、TLR 8及/或TLR 9。

有用佐劑之其他實例包括(但不限於)化學修飾之CpG(例如CpR,Idera)、聚(I：C)(例如polyi：CI2U)、非CpG細菌DNA或RNA、用於TLR8之ssRNA40，以及免疫活性小分子及抗體，例如環磷醯胺、舒尼替尼、貝伐珠單抗、西樂葆(celebrex)、NCX-4016、西地那非(sildenafil)、他達拉非(tadalafil)、伐地那非(vardenafil)、索拉菲尼、XL-999、CP-547632、帕唑帕尼、ZD2171、AZD2171、伊匹單抗、曲美目單抗及SC58175，其可用於治療及/或用作佐劑。在本發明之背景下可使用之佐劑及添加劑之量及濃度可容易地由熟習此項技術者無需過多實驗來測定。其他佐劑包括群落-刺激因子，例如顆粒球巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF，沙格司亭(sargramostim))。

在一些實施例中，本發明之免疫原性組合物可包含一種以上不同的佐劑。此外，本發明涵蓋包含任何佐劑物質(包括上文中之任一者或其組合)之治療性組合物。本發明亦涵蓋新抗原治療劑(例如，體液性或細胞調介之免疫反應)。在一些實施例中，免疫原性組合物包含新的抗原治療劑 (例如，肽、多核苷酸、TCR、CAR、含有TCR或CAR之細胞、含有多肽之樹突細胞、含有多核苷酸之樹突細胞、抗體等)，且佐劑可以任一適當順序分開投與。

載劑可獨立於佐劑存在。載劑之功能可為(例如)增加特定突變體之分子量以便增加其活性或免疫原性、賦予穩定性、增加生物活性或延長血清半衰期。此外，載劑可輔助將肽呈遞至T細胞。載劑可為熟習此項技術者已知之任一適宜載劑，例如蛋白質或抗原呈遞細胞。載體蛋白可為(但不限於)鑰孔端帽貝血藍蛋白、血清蛋白例如運鐵蛋白、牛血清白蛋白、人類血清白蛋白、甲狀腺球蛋白或卵白蛋白、免疫球蛋白或激素，例如胰島素或棕櫚酸。在一些實施例中，載劑包含人類III型纖維連接蛋白結構域(Koide等人Methods Enzymol.2012；503：135-56)。為免疫人類，載劑必須係可為人類接受且安全之生理上可接受之載劑。然而，破傷風類毒素及/或白喉類毒素在本發明之一些實施例中係適宜載劑。另一選擇為，載劑可為聚葡萄糖，例如瓊脂糖凝膠。

在一些實施例中，多肽可作為將多肽偶合至載劑之替代之多連接之肽來合成以增加免疫原性。該等分子亦稱為多抗原性肽(MAPS)。

誘導免疫反應之新抗原在與可接受之載劑或賦形劑組合時可作為組合物使用。該等組合物可用於活體外或活體內分析或用於活體內或離體投與個體以治療患有疾病之個體。

因此，醫藥組合物除活性成分以外可包括醫藥上可接受之賦形劑、載劑、緩衝劑、穩定劑或熟習此項技術者熟知之其他材料。該等材料應無毒性且應不干擾活性成分之效能。載劑或其他材料之精確性質將取決於投與途徑。

可藉由將具有期望純度之新抗原與可選的生理上可接受之載劑、賦形劑或穩定劑混合(Remington’s Pharmaceutical Sciences，第16版，Oslo,A.編輯(1980))來製備包含所關注蛋白質(例如本文所闡述之新抗原)之醫藥調配物用於以凍乾之調配物或水溶液之形式儲存。可接受之載劑、賦形劑或穩定劑係在所採用之劑量及濃度下對接受者無毒之彼等，且包括緩衝劑，例如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸及甲硫胺酸；防腐劑(例如十八烷基二甲基苄基氯化銨；氯化六甲雙銨；氯苄烷銨；氯化苯銨松寧((benzethonium chloride))；苯酚；丁醇或苄醇；對羥基苯甲酸烷基酯，例如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯；兒茶酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇；及間甲酚)；低分子量(少於約10個殘基)多肽；蛋白質，例如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，例如聚乙烯吡咯啶酮；胺基酸，例如甘胺酸、麩胺醯胺、天冬醯胺、組胺酸、精胺酸或離胺酸；單糖、二糖及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；鼇合劑，例如EDTA；糖，例如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；鹽形成抗衡離子，例如鈉；金屬錯合物(例如Zn-蛋白質錯合物)；及/或非離子型表面活性劑，例如TWEEN^®、PLURONICS^®或聚乙二醇(PEG)。

可接受之載劑對於經投與患者係生理上可接受的且保留與該等載劑一起或在該等載劑中投與之化合物之治療性質。可接受之載劑及其調配物通常闡述於(例如)Remington’ Pharmaceutical Sciences(第18版，編者A.Gennaro，Mack Publishing Co.,Easton,PA 1990)中。一種實例性載劑係生理鹽水。醫藥上可接受之載劑係具有以下功能之醫藥上可接受之材料、組合物或媒劑(例如液體或固體填充劑、稀釋劑、賦形劑、溶劑或囊 封材料)：參與將本發明化合物自身體之一個器官或部分之投與位點攜載或轉運至身體之另一器官或部分或在活體外分析系統中攜載或轉運本發明化合物。可接受之載劑與調配物之其他成分係相容的且對投與其之個體無害。可接受之載劑亦不會改變新抗原之比活性。

在一態樣中，本文提供醫藥上可接受之或生理上可接受之組合物，其包括與醫藥投與相容之溶劑(水性或非水性)、溶液、乳液、分散介質、包衣、等滲劑及吸收促進劑或延遲劑。因此，醫藥組合物或醫藥調配物係指適於在個體中醫藥使用之組合物。醫藥組合物及調配物包括一定量之新抗原(或編碼新抗原之多核苷酸)及醫藥上或生理上可接受之載劑。組合物可經調配以與具體投與途徑(即，全身或局部)相容。因此，組合物包括適於藉由各種途徑投與之載劑、稀釋劑或賦形劑。

在一些實施例中，組合物進一步包含可接受之添加劑以便改良新抗原在組合物中之穩定性及/或控制組合物之釋放速率。可接受之添加劑不改變新抗原之比活性。實例性可接受添加劑包括(但不限於)糖，例如甘露醇、山梨醇、葡萄糖、木糖醇、海藻糖、山梨糖、蔗糖、半乳糖、聚葡萄糖、右旋糖、果糖、乳糖及其混合物。可接受之添加劑可與可接受之載劑及/或賦形劑(例如右旋糖)組合。另一選擇為，實例性可接受之添加劑包括(但不限於)表面活性劑(例如聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80)以增加肽之穩定性並降低溶液之膠凝。表面活性劑可以溶液之0.01%至5%之量添加至組合物中。添加該等可接受之添加劑增加組合物之儲存穩定性及半衰期。

可藉由(例如)注射投與醫藥組合物。用於注射之組合物包括水溶液(倘若具有水溶性)或分散液及用於臨時製備無菌可注射溶液或分散液之無菌粉末。以靜脈內投與而言，適宜載劑包括生理鹽水、抑菌水或磷酸鹽緩 衝鹽水(PBS)。載劑可為溶劑或分散介質，其含有(例如)水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇及液體聚乙二醇及諸如此類)及其適宜混合物。可(例如)藉由使用包衣(例如卵磷脂)、在分散液情形下藉由維持所需粒徑，及藉由使用表面活性劑來維持流動性。抗細菌劑及抗真菌劑包括(例如)對羥苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗壞血酸及硫柳汞。組合物中可包括等滲藥劑(例如，糖、多元醇(例如甘露醇、山梨醇)及氯化鈉)。可將所得溶液包裝以供按原樣使用或將其凍乾；稍後可將凍乾製劑在投與之前與無菌溶液合併。以靜脈內注射或在病痛位置處注射而言，活性成分係呈無熱原且具有適宜pH、等滲性及穩定性之非經腸可接受之水溶液之形式。熟習此項技術者完全能使用(例如)等滲媒劑(例如氯化鈉注射液、林格氏注射液(Ringer’s Injection)、乳酸化林格氏注射液)來製備適宜溶液。若有需要，可包括防腐劑、穩定劑、緩衝劑、抗氧化劑及/或其他添加劑。無菌可注射溶液可藉由以下方式來製備：將所需量之活性成分與上文所列舉成分中之一者或組合納入適當溶劑中，視需要隨後過濾滅菌。通常，分散液係藉由將活性成分納入至含有基本的分散介質及來自彼等上文所列舉者之所需其他成分之無菌媒劑中來製備。在用於製備無菌可注射溶液之無菌粉末之情形下，較佳製備方法係真空乾燥及冷凍乾燥，從而產生活性成分加來自先前經滅菌過濾之其溶液之任一額外期望成分之粉末。

組合物可照慣例以靜脈內方式、例如藉由注射單位劑量來投與。為進行注射，活性成分可呈實質上無熱原且具有適宜pH、等滲性及穩定性之非經腸可接受之水溶液之形式。可使用(例如)等滲媒劑(例如氯化鈉注射液、林格氏注射液、乳酸化林格氏注射液)製備適宜溶液。可包括防腐劑、穩定劑、緩衝劑、抗氧化劑及/或其他添加劑(若需要)。另外，可經由 氣溶膠化投與組合物。

在一些實施例中，將組合物凍乾以(例如)延長儲存之儲放壽命。當組合物被視為可用於藥劑或本文所提供方法中之任一者中時，預計組合物可實質上不含熱原，使得組合物在投與人類患者時將不引起發炎反應或不安全的過敏反應。測試組合物之熱原及製備實質上不含熱原之組合物已為人們或熟習此項技術者充分瞭解且可使用市售套組來實現。

可接受之載劑可含有穩定、增加或延遲吸收或增加或延遲清除之化合物。該等化合物包括(例如)碳水化合物，例如葡萄糖、蔗糖或聚葡萄糖；低分子量蛋白；減少肽之清除或水解之組合物；或賦形劑或其他穩定劑及/或緩衝劑。延遲吸收之藥劑包括(例如)單硬脂酸鋁及明膠。亦可使用清潔劑來穩定或增加或降低醫藥組合物(包括脂質體載劑)之吸收。為保護免予消化，化合物可與組合物複合以使得其耐受酸性及酶促水解，或化合物可在適當抗性之載劑(例如脂質體)中複合。

組合物可以與劑量調配物相容之方式且以治療有效量來投與。欲投與之量取決於欲治療之個體、個體之免疫系統利用活性成分之能力，及期望之結合能力。投與所需活性成分之精確量取決於從業醫師之判斷且為每一個體所特有。用於初始投與及加強注射之適宜方案亦係可變的，但以下列方式為典型：在初始投與之後以一或多個小時之間隔藉由後續注射或其他投與來重複投藥。另一選擇為，涵蓋足以在血液中維持濃度之連續靜脈內輸注。

基於肽之免疫原性醫藥組合物可使用如業內所瞭解之適宜的熟知技術、載劑及賦形劑中之任一者來調配。多肽可為多種含有相同序列之多肽之混合劑或不同多肽之多個拷貝之混合劑。肽可藉由(例如)脂質化或附接 至載體蛋白來修飾。脂質化可為將脂質基團共價附接至多肽。脂質化肽或脂質化多肽可穩定結構且可增強治療之效能。

可將脂質化分為若干不同的類型，例如N-肉豆蔻醯基化、棕櫚醯基化、GPI-錨添加、戊二烯化及若干額外類型之修飾。N-肉豆蔻醯基化係肉豆蔻酸酯(C₁₄飽和酸)至甘胺酸殘基之共價附接。棕櫚醯基化係長鏈脂肪酸(C₁₆)至半胱胺酸殘基之硫酯鏈接。GPI-錨添加係經由醯胺鍵之糖基-磷脂醯肌醇(GPI)鏈接。戊二烯化係類異戊二烯脂質(例如法尼基(farnesyl)(C-15)、香葉基香葉基(C-20))至半胱胺酸殘基之硫醚鏈接。額外類型之修飾可包括S-二醯基甘油藉由半胱胺酸之硫原子之附接、經由絲胺酸或蘇胺酸殘基之O-辛醯基偶聯、至半胱胺酸殘基之S-古菌醇(S-archaeol)偶聯及膽固醇附接。

用於生成脂質化肽之脂肪酸可包括C₂至C₃₀飽和、單不飽和或多不飽和脂肪醯基。實例性脂肪酸可包括棕櫚醯基、肉豆蔻醯基、硬脂醯基及癸醯基。在一些情形中，將具有佐劑性質之脂質部分附接至所關注多肽以在不存在外在佐劑下引發或增強免疫原性。脂質化肽或脂肽可稱作自佐劑脂肽。上文及本文別處所闡述之脂肪酸中之任一者可引發或增強所關注多肽之免疫原性。可引發或增強免疫原性之脂肪酸可包括棕櫚醯基、肉豆蔻醯基、硬脂醯基、月桂醯基、辛醯基及癸醯基。

可將諸如裸肽或脂質化肽等多肽納入脂質體中。有時，可將脂質化肽納入脂質體中。例如，脂質化肽之脂質部分可自發整合至脂質體之脂質雙層中。因此，脂肽可存在於脂質體之「表面」上。

適於納入調配物中之實例性脂質體包括(但不限於)多層囊泡(MLV)、寡層囊泡(OLV)、單層囊泡(UV)、小的單層囊泡(SUV)、中型單層囊泡 (MUV)、大的單層囊泡(LUV)、巨大單層囊泡(GUV)、多泡囊泡(MVV)、藉由反相蒸發方法製得之單一或寡層囊泡(REV)、藉由反相蒸發方法製得之多層囊泡(MLV-REV)、穩定複層囊泡(SPLV)、冷凍及解凍MLV(FATMLV)、藉由擠出法製備之囊泡(VET)、藉由法式濾壓壺(French press)製備之囊泡(FPV)、藉由融合製備之囊泡(FUV)、去水-再水合囊泡(DRV)及泡狀體(bubblesome)(BSV)。

端視製備方法，脂質體可為單層或多層，且脂質體之大小可有所變化且直徑在0.02μm至大於約10μm之範圍內。脂質體可吸附許多類型之細胞且然後釋放納入之藥劑(例如，本文所述肽)。在一些情形下，脂質體與靶細胞融合，藉此脂質體之內容物然後排空至靶細胞中。脂質體可被吞噬性細胞吞噬。在胞吞作用之後可為溶酶體內降解脂質體脂質並釋放囊封之藥劑。

本文所提供之脂質體亦可包含載劑脂質。在一些實施例中，載劑脂質係磷脂。能形成脂質體之載劑脂質包括(但不限於)二棕櫚醯基磷酯醯膽鹼(DPPC)、磷酯醯膽鹼(PC；卵磷脂)、磷脂酸(PA)、磷脂醯基甘油(PG)、磷脂醯乙醇胺(PE)、磷酯醯絲胺酸(PS)。其他適宜磷脂進一步包括二硬脂醯基磷酯醯膽鹼(DSPC)、二肉豆蔻醯基磷酯醯膽鹼(DMPC)、二棕櫚醯基磷酯醯甘油(DPPG)、二硬脂醯基磷酯醯甘油(DSPG)、二肉豆蔻醯基磷脂醯基甘油(DMPG)、二棕櫚醯基磷脂酸(DPPA)；二肉豆蔻醯基磷脂酸(DMPA)、二硬脂醯基磷脂酸(DSPA)、二棕櫚醯基磷酯醯絲胺酸(DPPS)、二肉豆蔻醯基磷酯醯絲胺酸(DMPS)、二硬脂醯基磷酯醯絲胺酸(DSPS)、二棕櫚醯基磷酯醯乙醇胺(DPPE)、二肉豆蔻醯基磷脂醯乙醇胺(DMPE)、二硬脂醯基磷脂醯乙醇胺(DSPE)及諸如此類或其組合。在一些 實施例中，脂質體進一步包含調節脂質體形成之固醇(例如，膽固醇)。載劑脂質可為任一已知之非磷酸酯極性脂質。

醫藥組合物可使用熟知技術囊封在脂質體內。亦可使用生物可降解微球體作為本發明醫藥組合物之載劑。

醫藥組合物可在脂質體或微球體(或微粒)中投與。製備用於投與患者之脂質體及微球體之方法已為熟習此項技術者熟知。必不可少地，將材料溶解於水溶液中，若需要連同表面活性劑一起添加適當磷脂及脂質，且若需要對材料實施透析或超音波處理。

由聚合物或蛋白質形成之微球體已為熟習此項技術者熟知，且可經調整以供通過胃腸道直接進入血流中。或者，可納入化合物且植入微球體或微球體複合體以供經在數天至數月範圍內之時間段緩慢釋放。

亦可將多肽附接至載體蛋白用於遞送。載體蛋白可為免疫原性載劑元件且可藉由任一重組技術附接。實例性載體蛋白包括海水養殖鑰孔端帽貝血藍蛋白(mcKLH)、聚乙二醇化mcKLH、藍色載劑*蛋白、牛血清白蛋白(BSA)、陽離子化BSA、卵白蛋白及細菌蛋白(例如破傷風類毒素(TT))。

多肽亦可作為多抗原性肽(MAP)來製備。肽可在N-末端或C-末端附接至小的非免疫原性核心。在此核心上構建之肽可提供高度局部化之肽密度。該核心可為由雙功能單元構成之樹突核心殘基或基質。用於構築MAP之適宜核心分子可包括氨、乙二胺、天冬胺酸、麩胺酸及離胺酸。例如，離胺酸核心分子可經由肽鍵藉助其胺基中之每一者附接至兩個額外離胺酸。

多肽可以化學方式合成或在細胞系統或無細胞之系統中重組表現。 肽可藉由(例如)液相合成、固相合成或藉由微波輔助之肽合成來合成。多肽可藉由例如以下方式來修飾：醯化、烷基化、醯胺化、精胺醯基化、聚麩胺醯基化、聚甘胺醯基化、丁醯基化、γ-羧基化、醣基化、丙二醯基化、羥基化、碘化、核苷酸添加(例如ADP-核糖基化)、氧化、磷酸化、腺苷醯化、丙醯基化、S-麩胱甘肽化、S-亞硝醯基化、琥珀醯基化、硫酸化、醣化、棕櫚醯基化、肉豆蔻醯基化、異戊二烯化或戊二烯化(例如法尼基化或香葉基香葉基化)、糖基磷脂醯肌醇化、硫辛醯化(lipoylation)、附接黃素部分(例如FMN或FAD)、附接血紅素C、磷酸泛醯巰基乙胺基化、亞視黃基席夫鹼(Schiffbase)形成、白喉醯胺形成、乙醇胺磷甘油附接、羥腐胺離胺酸形成、生物素化、聚乙二醇化、ISG化、SUMU化、泛蛋白化、Nedd化、Pup化、瓜胺酸化、去醯胺、消除化、胺甲醯基化或其組合。

在生成多肽之後，可使多肽經受一或多輪純化步驟以去除雜質。純化步驟可為利用分離方法(例如基於親和力者、基於尺寸排除者、基於離子交換者或諸如此類)之層析步驟。在一些情形下，多肽為至多30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%、99.9%或100%純或不存在雜質。在一些情形下，多肽為至少30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%、99.9%或100%純或不存在雜質。

多肽可包括天然胺基酸、非天然胺基酸或其組合。胺基酸可指含有胺基及羧基二者之分子。適宜胺基酸包括(但不限於)天然存在之胺基酸之D-異構物及L-異構物二者、以及藉由有機合成或其他代謝途徑製備之非天然存在之胺基酸。本文所用術語胺基酸包括(但不限於)α-胺基酸、天然胺基酸、非天然胺基酸及胺基酸類似物。

術語「α-胺基酸」可指含有結合至指定為α-碳之碳之胺基及羧基二者的分子。

術語「β-胺基酸」可指以β構形含有胺基及羧基二者的分子。

「天然胺基酸」可指通常見於自然界中合成之肽中且以一個字母縮寫A、R、N、C、D、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y及V為人所知之20種胺基酸中之任一者。顯示天然胺基酸之性質之概要之表可參見(例如)美國專利申請公開案第20130123169號，其係以引用方式併入本文中。

本文所提供之肽可包含一或多種疏水性、極性或帶電胺基酸。「疏水性胺基酸」包括小疏水性胺基酸及大疏水性胺基酸。「小疏水性胺基酸」可為甘胺酸、丙胺酸、脯胺酸及其類似物。「大疏水性胺基酸」可為纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸、色胺酸及其類似物。「極性胺基酸」可為絲胺酸、蘇胺酸、天門冬醯胺酸、麩醯胺酸、半胱胺酸、酪胺酸及其類似物。「帶電胺基酸」可為離胺酸、精胺酸、組胺酸、天門冬胺酸鹽、麩胺酸鹽及其類似物。

本文所提供之肽可包含一或多種胺基酸類似物。「胺基酸類似物」可為與胺基酸結構類似且可在肽模擬物巨環之形成中取代胺基酸之分子。胺基酸類似物包括(但不限於)β-胺基酸及其中胺基或羧基經類似反應性基團取代(例如，用二級或三級胺取代一級胺或用酯取代羧基)之胺基酸。

本文所提供之肽可包含一或多種非天然胺基酸。「非天然胺基酸」可為不為常見於自然界中合成之肽中且以一個字母縮寫A、R、N、C、D、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y及V為人所知之二十種胺基酸中之一者的胺基酸。非天然胺基酸或胺基酸類似物包括揭示於 (例如)美國專利申請公開案第20130123169號中之結構，該案係以引用方式併入本文中。

胺基酸類似物包括β-胺基酸類似物。β-胺基酸類似物以及丙胺酸、纈胺酸、甘胺酸，白胺酸、精胺酸、離胺酸、天冬胺酸、麩胺酸，半胱胺酸，甲硫胺酸、苯丙胺酸、酪胺酸、脯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸及色胺酸之類似物之實例可包括揭示於(例如)美國專利申請公開案第20130123169號中之結構，該案係以引用方式併入本文中。

胺基酸類似物可為外消旋的。在一些情形中，使用胺基酸類似物之D異構物。在一些情形下，使用胺基酸類似物之L異構物。在一些情形中，胺基酸類似物包含呈R或S構形之手性中心。有時，β-胺基酸類似物之胺基經保護基團(例如，第三丁氧基羰基(BOC基團)、9-茀基甲氧基羰基(FMOC)、甲苯磺醯基及諸如此類)取代。有時，對β-胺基酸類似物之羧酸官能基實施保護，例如，作為其酯衍生物。在一些情形下，使用胺基酸類似物之鹽。

「非必需」胺基酸殘基可為可自多肽之野生型序列改變而不廢止或實質上改變其基本生物或生物化學活性(例如，受體結合或活化)之殘基。「必需」胺基酸殘基可為當自多肽之野生型序列改變時廢止或實質上廢止多肽之基本生物或生物化學活性之殘基。

「保守胺基酸取代」可為胺基酸殘基經具有類似側鏈之胺基酸殘基替代者。業內已界定具有類似側鏈之胺基酸殘基之家族。此等家族可包括具有鹼性側鏈(例如，K、R、H)、酸性側鏈(例如，D、E)及不帶電極性側鏈(例如，G、N、Q、S、T、Y、C)、非極性側鏈(例如，A、V、L、I、P、F、M、W)、β-具支鏈側鏈(例如，T、V、I)及芳族側鏈(例如，Y、 F、W、H)之胺基酸。因此，舉例而言，多肽中之預期非必需胺基酸殘基可經來自同一側鏈家族之另一胺基酸殘基替代。可接受之取代之其他實例可為基於等排考慮(例如對於甲硫胺酸為正白胺酸)或其他性質(例如對於苯丙胺酸為2-噻吩基丙胺酸，或對於色胺酸為6-Cl-色胺酸)之取代。

亦可將基於核酸之免疫原性醫藥組合物投與個體。基於核酸之免疫原性醫藥組合物可使用如業內所瞭解之適宜的熟知技術、載劑及賦形劑中之任一者來調配。核酸可為DNA、基因體DNA或cDNA、RNA或雜合物，其中核酸可含有去氧核糖-及核糖-核苷酸之組合及鹼基(包括尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鳥嘌呤、肌苷、黃嘌呤、次黃嘌呤、異胞嘧啶及異鳥嘌呤)之組合。核酸可藉由化學合成方法或重組方法獲得。免疫原性醫藥組合物可為基於DNA之免疫原性醫藥組合物、基於RNA之免疫原性醫藥組合物、基於雜合DNA/RNA之免疫原性醫藥組合物或基於雜合核酸/肽之免疫原性醫藥組合物。肽可為自表1或2中之肽衍生之肽、具有與表1或2中之肽具有至少40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或更大之序列同源性之序列之肽，或具有與表1或2中之肽具有至多40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或更小之序列同源性之序列之肽。

本文所闡述之核酸可含有磷酸二酯鍵，但在一些情形下，如下文(例如在引子及探針(例如標記探針)之構築中)所概述，包括可具有替代主鏈之核酸類似物，該等替代主鏈包含(例如)磷醯胺、硫代磷酸酯、O-甲基亞磷醯胺鏈接及肽核酸主鏈及鏈接。其他類似物核酸包括具有包括鎖核酸、正電主鏈及非核糖主鏈之二環結構之彼等。含有一或多種碳環糖之核酸亦包括在核酸之定義內。鎖核酸(LNA)亦包括在核酸類似物之定義內。LNA 係其中核糖環係藉由連接2’-O原子與4’-C原子之亞甲基橋「鎖定」之一類核酸類似物。可進行核糖-磷酸酯主鏈之該等修飾以增加該等分子在生理環境中之穩定性及半衰期。例如，PNA：DNA及LNA-DNA雜合物可展現較高穩定性且因此可用於一些實施例中。核酸可為所指定之單鏈或雙鏈序列，或含有雙鏈或單鏈序列之部分。端視應用而定，核酸可為DNA(包括(例如)基因體DNA、粒線體DNA及cDNA)、RNA(包括(例如)mRNA及rRNA)或雜合物，其中核酸含有去氧核糖-及核糖-核苷酸之任一組合及鹼基(包括尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鳥嘌呤、肌苷、黃嘌呤、次黃嘌呤、異胞嘧啶、異鳥嘌呤等)之任一組合。

基於核酸之免疫原性醫藥組合物可呈載體之形式。載體可為環形質體或線性核酸。環形質體或線性核酸可能夠指導具體核苷酸序列在適當個體細胞中之表現。載體可具有可操作連接至多肽編碼核苷酸序列之啟動子，該啟動子可操作連接至終止信號。載體可含有為核苷酸序列之適當轉譯所需要之序列。包含所關注核苷酸序列之載體可為嵌合的，意味著該載體組份中之至少一者可能與其其他組份中之至少一者異源。表現盒中之核苷酸序列之表現可處於組成型啟動子或可誘導型啟動子之控制之下，該啟動子可能僅在宿主細胞暴露於一些特定內部或外部刺激物時發動轉錄。

載體可為質體。質體可用於用編碼多肽之核酸轉染細胞，且可在表現多肽之條件下培養並維持經轉變宿主細胞。

質體可包含編碼各種本文所揭示多肽中之一或多者之核酸序列。單一質體可含有用於單一多肽之編碼序列或用於一種以上多肽之編碼序列。有時，質體可進一步包含編碼佐劑(例如免疫刺激分子，例如細胞介素)之編碼序列。

質體可進一步包含發動密碼子，其可在編碼序列之上游；及終止密碼子，其可在編碼序列之下游。發動及終止密碼子可在具有編碼序列之框中。質體亦可包含可操作連接至編碼序列之啟動子及在編碼序列上游之增強子。增強子可為人類肌動蛋白、人類肌凝蛋白、人類血紅素、人類肌肉肌酸或病毒增強子(例如來自CMV、FMDV、RSV或EBV者)。

質體亦可包含哺乳動物複製起點以便在染色體外維持質體並在細胞中產生質體之多個拷貝。質體亦可包含調節序列，該調節序列可特別適於在投與質體之細胞中表現基因。編碼序列可包含可容許在宿主細胞中較有效轉錄編碼序列之密碼子。

基於核酸之免疫原性醫藥組合物亦可為線性核酸免疫原性醫藥組合物或直鏈表現盒，其能經由電穿孔有效遞送至個體且表現一或多種本文所揭示之多肽。

亦可將基於細胞之免疫原性醫藥組合物投與個體。例如，基於抗原呈遞細胞(APC)之免疫原性醫藥組合物可使用如業內所瞭解之適宜的熟知技術、載劑及賦形劑中之任一者來調配。APC包括單核球、單核球源細胞、巨噬細胞及樹突細胞。有時，基於APC之免疫原性醫藥組合物可為基於樹突細胞之免疫原性醫藥組合物。

基於樹突細胞之免疫原性醫藥組合物可藉由業內熟知之任一方法來製備。在一些情形下，基於樹突細胞之免疫原性醫藥組合物可藉助離體或活體內方法來製備。離體方法可包含在投與患者之前使用離體經本文所闡述之多肽脈衝之自體DC來活化或加載DC。活體內方法可包含使用與本文所闡述之多肽偶聯之抗體靶向特定DC受體。基於DC之免疫原性醫藥組合物可進一步包含DC活化劑，例如TLR3、TLR-7-8及CD40激動劑。基於 DC之免疫原性醫藥組合物可進一步包含佐劑及醫藥上可接受之載劑。

佐劑可用於在接受免疫原性醫藥組合物之患者中增強所引發之免疫反應(體液性及/或細胞)。有時，佐劑可引發Th1型反應。其他時候，佐劑可引發Th2型反應。Th1型反應之特徵可為產生諸如IFN-γ等細胞介素，相反，Th2型反應之特徵可為產生諸如IL-4、IL-5及IL-10等細胞介素。

在一些態樣中，基於脂質之佐劑(例如MPLA及MDP)可與本文所揭示之免疫原性醫藥組合物一起使用。例如，單磷醯脂質A(MPLA)係使得脂質體抗原至特定T淋巴球之呈遞增加之佐劑。另外，胞壁醯二肽(MDP)亦可作為適宜佐劑與本文所闡述之免疫原性醫藥調配物聯合使用。

佐劑亦可包含諸如細胞介素等刺激分子。細胞介素之非限制性實例包括：CCL20、α-干擾素(IFN-α)、β-干擾素(IFN-β)、γ-干擾素、血小板源性生長因子(PDGF)、TNFa、TNFp、GM-CSF、表皮生長因子(EGF)、皮膚T細胞虜獲趨化介素(CTACK)、上皮胸腺表現之趨化介素(TECK)、黏膜相關性上皮趨化介素(MEC)、IL-12、IL-15、、IL-28、MHC、CD80、CD86、IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-18、MCP-1、MIP-la、MIP-1-、IL-8、L-選擇素、P-選擇素、E-選擇素、CD34、GlyCAM-1、MadCAM-1、LFA-1、VLA-1、Mac-1、pl50.95、PECAM、ICAM-1、ICAM-2、ICAM-3、CD2、LFA-3、M-CSF、G-CSF、IL-18之突變體形式、CD40、CD40L、血管生長因子、纖維母細胞生長因子、IL-7、神經生長因子、血管內皮生長因子、Fas、TNF受體、Fit、Apo-1、p55、WSL-1、DR3、TRAMP、Apo-3、AIR、LARD、NGRF、DR4、DRS、KILLER、TRAIL-R2、TRICK2、DR6、半胱天冬酶ICE、Fos、c-jun、Sp-1、Ap-1、Ap-2、p38、p65Rel、MyD88、 IRAK、TRAF6、IkB、無活性NIK、SAPK、SAP-I、JNK、干擾素反應基因、NFkB、Bax、TRAIL、TRAILrec、TRAILrecDRC5、TRAIL-R3、TRAIL-R4、RANK、RANK配體、Ox40、Ox40配體、NKG2D、MICA、MICB、NKG2A、NKG2B、NKG2C、NKG2E、NKG2F、TAPI及TAP2。

額外佐劑包括：MCP-1、MIP-la、MIP-lp、IL-8、RANTES、L-選擇素、P-選擇素、E-選擇素、CD34、GlyCAM-1、MadCAM-1、LFA-1、VLA-1、Mac-1、pl50.95、PECAM、ICAM-1、ICAM-2、ICAM-3、CD2、LFA-3、M-CSF、G-CSF、IL-4、IL-18之突變體形式、CD40、CD40L、血管生長因子、纖維母細胞生長因子、IL-7、IL-22、神經生長因子、血管內皮生長因子、Fas、TNF受體、Fit、Apo-1、p55、WSL-1、DR3、TRAMP、Apo-3、AIR、LARD、NGRF、DR4、DR5、KILLER、TRAIL-R2、TRICK2、DR6、半胱天冬酶ICE、Fos、c-jun、Sp-1、Ap-1、Ap-2、p38、p65Rel、MyD88、IRAK、TRAF6、IkB、無活性NIK、SAPK、SAP-1、JNK、干擾素反應基因、NFkB、Bax、TRAIL、TRAILrec、TRAILrecDRC5、TRAIL-R3、TRAIL-R4、RANK、RANK配體、Ox40、Ox40配體、NKG2D、MICA、MICB、NKG2A、NKG2B、NKG2C、NKG2E、NKG2F、TAP1、TAP2及其功能片段。

在一些態樣中，佐劑可為類鐸受體之調節劑。類鐸受體之調節劑之實例包括TLR-9激動劑且不限於類鐸受體之小分子調節劑(例如咪喹莫特)。與本文所闡述之免疫原性醫藥組合物組合使用之佐劑之其他實例可包括(但不限於)皂素、CpG ODN及諸如此類。有時，佐劑選自細菌類毒 素、聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段聚合物、鋁鹽、脂質體、CpG聚合物、水包油乳液或其組合。有時，佐劑係水包油乳液。水包油乳液可包括至少一種油及至少一種表面活性劑，且該等油及表面活性劑係生物可降解的(可代謝的)且生物相容的。乳液中之油小滴可具有小於5μm之直徑，且甚至可具有次微米直徑，且該等小尺寸係利用微流化劑達成以提供穩定乳液。可使具有小於220nm之大小之小滴經受過濾滅菌。

在一些情形中，免疫原性醫藥組合物可包括載劑及賦形劑(包括(但不限於)緩衝液、碳水化合物、甘露醇、蛋白質、多肽或諸如甘胺酸等胺基酸、抗氧化劑、抑菌劑、螯合劑、懸浮劑、增稠劑及/或防腐劑)、水、油(包括具有石油、動物、植物或合成來源之彼等，例如花生油、大豆油、礦物油、芝麻油及諸如此類)、鹽水溶液、右旋糖和甘油水性溶液、矯味劑、著色劑、防黏劑及其他可接受之添加劑、佐劑或黏合劑、在接近生理條件下需要的其他醫藥上可接受之輔助物質(例如pH緩衝劑、張力調節劑、乳化劑、潤濕劑及諸如此類)。賦形劑之實例包括澱粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、水稻、麵粉、白堊、矽膠、硬脂酸鈉、單硬脂酸甘油酯、滑石粉、氯化鈉、脫脂奶粉、甘油、丙二醇、水、乙醇及諸如此類。在另一實施例中，醫藥製劑實質上不含防腐劑。在其他情形中，醫藥製劑可含有至少一種防腐劑。儘管可採用熟習此項技術者已知之任何適宜載劑來投與本文所闡述之醫藥組合物，但載劑類型將視投與模式而變。

免疫原性醫藥組合物可包括等防腐劑諸如硫柳汞或2-苯氧乙醇。在一些情形中，免疫原性醫藥組合物實質上不含(例如<10μg/ml)含汞材料，不含例如硫柳汞。可使用α-生育酚琥珀酸酯作為含汞化合物之替代。

為控制張力，免疫原性醫藥組合物中可包括諸如鈉鹽等生理鹽。其 他鹽可包括氯化鉀、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉及/或氯化鎂或諸如此類。

免疫原性醫藥組合物之滲透壓可介於200mOsm/kg與400mOsm/kg之間、介於240mOsm/kg至360mOsm/kg之間或在290mOsm/kg至310mOsm/kg之範圍內。

免疫原性醫藥組合物可包含一或多種緩衝劑，例如Tris緩衝劑；硼酸鹽緩衝劑；琥珀酸鹽緩衝劑；組胺酸緩衝劑(具體而言具有氫氧化鋁佐劑)；或檸檬酸鹽緩衝劑。在一些情形下，緩衝劑係以5-20mM範圍包括在內。

免疫原性醫藥組合物之pH可介於約5.0與約8.5之間、介於約6.0與約8.0之間、介於約6.5與約7.5之間或介於約7.0與約7.8之間。

免疫原性醫藥組合物可為無菌的。免疫原性醫藥組合物可為非致熱原，例如每劑量含有<1EU(內毒素單位，標準量度)，且可為每劑量<0.1EU。組合物可不含麩質。

免疫原性醫藥組合物可包括清潔劑，例如聚氧乙烯山梨糖醇酯表面活性劑(稱為「Tween」)或辛苯醇醚(例如辛苯醇醚-9(Triton X-100)或第三辛基苯氧基聚乙氧基乙醇)。清潔劑可僅以痕量存在。免疫原性醫藥組合物可包括小於1mg/ml之辛苯醇醚-10及聚山梨醇酯80中之每一者。抗生素(例如新黴素(neomycin)、康黴素(kanamycin)、多黏菌素B(polymyxin B))可為痕量之其他剩餘組份。

可在業內熟知之適宜媒劑中將免疫原性醫藥組合物調配為無菌溶液或懸浮物。該等醫藥組合物可藉由習用、熟知之滅菌技術來滅菌或可進行無菌過濾。可將所得水溶液包裝以供按原樣使用或將其凍乾，將凍乾製劑在投與之前與無菌溶液合併。

免疫原性醫藥組合物可用一或多種醫藥上可接受之鹽來調配。醫藥上可接受之鹽可包括具有無機離子(例如鈉、鉀、鈣、鎂離子及諸如此類)之彼等。該等鹽可包括用無機酸或有機酸(例如鹽酸、氫溴酸、磷酸、硝酸、硫酸、甲磺酸、對甲苯磺酸、乙酸、富馬酸、琥珀酸、乳酸、扁桃酸、蘋果酸、檸檬酸、酒石酸或馬來酸)形成之鹽。另外，若藥劑含有羧基或其他酸性基團，則該基團可與無機鹼或有機鹼轉化為醫藥上可接受之加成鹽。適宜鹼之實例包括氫氧化鈉、氫氧化鉀、氨、環己胺、二環己胺、乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺及諸如此類。

包含(例如)活性劑(例如本文所闡述之肽、核酸、抗體或其片段及/或APC)與一或多種佐劑之組合之醫藥組合物可經調配以包含某些莫耳比。例如，可使用活性劑(例如本文所闡述之肽、核酸、抗體或其片段及/或APC)與一或多種佐劑之組合之約99：1至約1：99之莫耳比。在一些情形中，活性劑(例如本文所闡述之肽、核酸、抗體或其片段及/或APC)與一或多種佐劑之組合之莫耳比之範圍可選自約80：20至約20：80；約75：25至約25：75、約70：30至約30：70、約66：33至約33：66、約60：40至約40：60；約50：50；及約90：10至約10：90。活性劑(例如肽、核酸、抗體或其片段)及/或本文所闡述之APC與一或多種佐劑之組合之莫耳比可為約1：9，且在一些情形下可為約1：1。可將活性劑(例如肽、核酸、抗體或其片段)及/或本文所闡述之APC與一或多種佐劑之組合以相同劑量單位在(例如)一個小瓶、栓劑、錠劑、膠囊、氣溶膠噴霧劑中調配在一起；或可將每一藥劑、形式及/或化合物調配在分開單元中，例如，兩個小瓶、栓劑、錠劑、兩個膠囊、錠劑及小瓶、氣溶膠噴霧劑及諸如此類。

在一些情形中，免疫原性醫藥組合物可與另一藥劑一起投與。另一 藥劑之選擇可至少部分地取決於所治療之病況。另一藥劑可包括(例如)對病原體感染(例如病毒感染)具有治療效應之任何藥劑，包括(例如)用於治療發炎病況(例如NSAID)之藥物，例如，布洛芬(ibuprofen)、萘普生(naproxen)、乙醯胺酚、酮洛芬(ketoprofen)或阿斯匹林(aspirin)。作為另一實例，調配物可另外含有一或多種補充劑，例如維生素C、E或其他抗氧化劑。

包含活性劑(例如本文所闡述之肽、核酸、抗體或其片段及/或APC)與一或多種佐劑之組合之醫藥組合物可以習用方式使用一或多種生理上可接受之載劑(包含賦形劑、稀釋劑及/或助劑)來調配，例如，該等載劑有利於將活性劑處理成可投與之製劑。適當調配物可至少部分取決於所選投與途徑。本文所闡述之藥劑可使用多種投與途徑或模式(包括經口、經頰、經局部、經直腸、經皮、經黏膜、經皮下、靜脈內及肌內施加以及藉由吸入)遞送至患者。

活性藥劑可經調配用於非經腸投與(例如藉由注射，例如濃注或連續輸注)且可以單位劑型以安瓿(ampoule)、預填充注射器、小體積輸注器形式或以添加防腐劑之多劑量容器形式呈現。組合物可呈諸如於油性或水性媒劑中之懸浮液、溶液或乳液等形式，例如，於水性聚乙二醇中之溶液。

對於可注射調配物，媒劑可選自業內已知為適宜之彼等，包括水性溶液或油懸浮液或乳液，其含有芝麻油、玉米油、棉籽油或花生油，以及酏劑、甘露醇、右旋糖或無菌水性溶液及類似醫藥媒劑。調配物亦可包含生物可降解的生物相容性聚合物組合物，例如聚(乳酸-共-羥乙)酸。可將該等材料製成微球體或奈米球，其載有藥物且進一步經包覆或衍生以提供優良的持續釋放性能。適於眼周或眼內注射之媒劑包括(例如)治療劑於注 射級水、脂質體及適於親脂性物質之媒劑中之懸浮液。用於眼周或眼內注射之其他媒劑已為業內所熟知。

在一些情形中，將醫藥組合物按照常規程序調配成適於靜脈內投與人類之醫藥組合物。通常，用於靜脈內投與之組合物係於無菌等滲水性緩衝液中之溶液。若需要，該組合物亦可包括增溶劑及局部麻醉劑(例如利多卡因(lidocaine))以減輕注射位置處之疼痛。通常，該等成分可分開地或混合在一起以單位劑型提供，例如，作為乾燥凍乾粉末或不含水之濃縮物存於諸如安瓿或藥囊等標明活性劑之量的密封容器中。倘若組合物係藉由輸注來投與，則可用含有無菌醫藥級水或鹽水之輸注瓶對其進行分配。若組合物係藉由注射來投與，則可提供含有注射用無菌水或鹽水之安瓿以使得可在投與之前混合各成分。

當藉由注射來投與時，活性劑可調配成水溶液，特別是在生理上相容之緩衝劑(例如漢克斯溶液(Hanks solution)、林格氏溶液或生理鹽水緩衝劑)中進行調配。溶液可含有調配劑，例如懸浮劑、穩定劑及/或分散劑。或者，活性化合物可呈粉劑形式，以在使用之前使用適宜媒劑(例如無菌無熱原水)構造。在另一實施例中，醫藥組合物不包含佐劑或添加任何其他物質來增強由肽刺激之免疫反應。在另一實施例中，醫藥組合物包含抑制對肽之免疫反應之物質。

除先前所闡述之調配物以外，活性藥劑亦可調配成儲積製劑形式。該等長效調配物可藉由植入或經皮遞送(例如皮下或肌內)、肌內注射或使用透皮貼劑來投與。因此，例如，該等藥劑可用適宜聚合或疏水性材料(例如作為於可接受油中之乳液)或離子交換樹脂來調配，或作為微溶衍生物(例如，作為微溶鹽)。

在情形下，包含一或多種藥劑之醫藥組合物可在局部投與或在特定感染位置處或靠近該位置處注射時發揮局部及區域性效應。直接局部施加(例如)黏性液體、溶液、懸浮液、基於二甲基亞碸(DMSO)之溶液、脂質體調配物、凝膠、膠凍劑、乳霜、洗劑、軟膏劑、栓劑、泡沫劑或氣溶膠噴霧劑可用於局部投與以產生(例如)局部及/或區域性效應。用於該調配物之醫藥適宜媒劑包括(例如)低級脂肪醇、聚二醇(例如，甘油或聚乙二醇)、脂肪酸之酯、油、脂肪、矽酮及諸如此類。該等製劑亦可包括防腐劑(例如對羥基苯甲酸酯)及/或抗氧化劑(例如抗壞血酸及生育酚)。亦參見Dermatological Formulations：Percutaneous absorption,Barry(編輯),Marcel Dekker Incl,1983。在另一實施例中，使用包含轉運蛋白、載劑或離子通道抑制劑之局部/局部(local/topical)調配物來治療表皮或黏膜病毒感染。

醫藥組合物可含有美容或皮膚病學可接受之載劑。該等載劑與皮膚、指甲、黏膜、組織及/或毛髮相容，且可包括滿足該等要求之任何常用之美容或皮膚病學載劑。熟習此項技術者可容易地選擇該等載劑。在調配皮膚軟膏劑時，可將藥劑或藥劑之組合調配於油狀烴基質、無水吸收基質、油包水吸收基質、水包油驅水基質及/或水溶性基質中。該等載劑及賦形劑之實例包括(但不限於)保濕劑(例如尿素)、二醇(例如丙二醇)、醇(例如乙醇)、脂肪酸(例如油酸)、表面活性劑(例如肉豆蔻酸異丙酯及月桂基硫酸鈉)、吡咯啶酮、單月桂酸甘油酯、亞碸、萜(例如甲醇)、胺、醯胺、烷烴、烷醇、水、碳酸鈣、磷酸鈣、各種糖、澱粉、纖維素衍生物、明膠及諸如聚乙二醇等聚合物。

舉例而言，軟膏及乳霜可在添加適宜增稠劑及/或膠凝劑下使用水性 或油性基質來調配。洗劑可使用水性或油性基質調配且其通常亦將含有一或多種乳化劑、穩定劑、分散劑、懸浮劑、增稠劑或著色劑。經皮貼劑用於遞送醫藥劑之構築及使用已為業內熟知。該等貼劑可經構築用於連續、脈動或按需遞送醫藥劑。

可用於形成醫藥組合物及劑型之潤滑劑可包括(但不限於)硬脂酸鈣、硬脂酸鎂、礦物油、輕質礦物油、甘油、山梨醇、甘露醇、聚乙二醇、其他二醇、硬脂酸、月桂基硫酸鈉、滑石粉、氫化植物油(例如，花生油、棉籽油、葵花籽油、芝麻油、橄欖油、玉米油及大豆油)、硬脂酸鋅、油酸乙酯、月桂酸乙酯、瓊脂或其混合物。其他潤滑劑包括(例如)賽羅伊德(syloid)矽膠、合成矽膠之凝固氣溶膠或其混合物。潤滑劑可視情況以佔醫藥組合物約1重量%以下的量來添加。

醫藥組合物可呈任何適於局部施加之形式，包括水性、水性-醇性或油性溶液、洗劑或血清分散液、水性、無水或油性凝膠、藉由將脂肪相分散於水性相中獲得之乳液(O/W或水包油)或相反形式(W/O或油包水)、離子型及/或非離子型微乳液或者微膠囊、微粒或脂質囊泡分散液。該等醫藥組合物可根據習用方法來製備。組合物之各種組份之量係業內照慣例使用之彼等。該等組合物具體而言構成保護、治療或護理乳霜、乳劑、洗劑、凝膠或泡沫劑用於臉、手、身體及/或用於黏膜或用於清潔皮膚。組合物亦可由構成肥皂或潔膚皂(cleansing bar)之固體製劑組成。

醫藥組合物可含有佐劑，例如親水或親脂性膠凝劑、親水或親脂性活性劑、防腐劑、抗氧化劑、溶劑、香味劑、填充劑、防曬劑、氣味吸收劑及染料。該等不同佐劑之量為所涉及領域中照慣例使用之量，且(例如)佔組合物總重量之約0.01%至約20%。端視該等佐劑之性質，可將其引入 脂肪相中、引入水性相中及/或引入脂質囊泡中。

在涉及局部(topical/local)施加之情形中，醫藥組合物可包括一或多種滲透增強劑。例如，調配物可包含增加滲透或幫助遞送本發明之藥劑或藥劑之組合穿過滲透障壁(例如，皮膚)之適宜固體或凝膠相載劑或賦形劑。許多該等滲透增強化合物已為局部調配領域所知，且包括(例如)水、醇(例如，萜樣甲醇、乙醇、2-丙醇)、亞碸(例如，二甲基亞碸、癸基甲基亞碸、十四烷基甲基亞碸)、吡咯啶酮(例如，2-吡咯啶酮、N-甲基-2-吡咯啶酮、N-(2-羥乙基)吡咯啶酮)、月桂氮卓酮(laurocapram)、丙酮、二甲基乙醯胺、二甲基甲醯胺、四氫呋喃醇、L-α-胺基酸、陰離子型、陽離子型、兩性離子型或非離子型表面活性劑(例如，肉豆蔻酸異丙酯和月桂基硫酸鈉)、脂肪酸、脂肪醇(例如，油酸)、胺、醯胺、氯貝酸醯胺、六亞甲基月桂醯胺、蛋白水解酶、α-沒藥醇、d-檸檬烯、尿素及N,N-二乙基-間甲苯甲醯胺及諸如此類。其他實例包括保濕劑(例如尿素)、二醇(例如丙二醇和聚乙二醇)、單月桂酸甘油酯、烷烴、烷醇、透明質酸酶(ORGELASE)、碳酸鈣、磷酸鈣、各種糖、澱粉、纖維素衍生物、明膠及/或其他聚合物。在另一實施例中，醫藥組合物將包括一或多種該等滲透增強劑。

用於局部(local/topical)施加之醫藥組合物可包括一或多種抗微生物防腐劑，例如四級銨化合物、有機汞製劑、對羥基苯甲酸鹽、芳香醇、氯丁醇及諸如此類。

可將醫藥組合物調配成氣溶膠溶液、懸浮液或乾燥粉末。可藉助呼吸系統或鼻道投與氣溶膠。舉例而言，熟習此項技術者將認識到，可將本發明之組合物懸浮或溶解於適宜載劑(例如醫藥上可接受之推進劑)中，且 可使用噴鼻劑或吸入劑直接投與肺中。舉例而言，可將包含轉運蛋白、載劑或離子通道抑制劑之氣溶膠調配物溶解、懸浮或乳化於推進劑或溶劑及推進劑之混合物中，以用於(例如)作為噴鼻劑或吸入劑來投與。氣溶膠調配物可在壓力下含有任何可接受之推進劑，例如業內照慣例使用之美容或皮膚病學或醫藥上可接受之推進劑。

用於經鼻投與之氣溶膠調配物通常可為經設計以滴劑或噴霧劑形式投與鼻道之水溶液。鼻用溶液與鼻分泌物之類似之處可在於其通常具有等滲性且經輕度緩衝以維持約5.5至約6.5之pH，但另外可使用此範圍以外的pH值。調配物中亦可包括抗微生物劑或防腐劑。

用於吸入之氣溶膠調配物及吸入劑可經設計使得藥劑或藥劑之組合在藉由鼻或口腔呼吸途徑投與時被攜載至個體之呼吸樹中。吸入溶液可藉由(例如)噴霧器來投與。可將包含精細粉化藥物或液體藥物之吸入物或吹入物以藥劑或藥劑組合於推進劑中之溶液或懸浮液的醫藥氣溶膠形式遞送至呼吸系統中，從而(例如)輔助分配。推進劑可為液化氣體，包括鹵烴，例如碳氟化合物，例如氟化氯化烴、氫氯氟烴和含氫氯化烴，以及烴及烴醚。

鹵烴推進劑包括所有氫都經氟替代的碳氟化合物推進劑、所有氫都經氯和至少一個氟替代的含氯氟烴推進劑、含氫碳氟化合物推進劑和含氫含氯氟烴推進劑。可用於本發明中之烴推進劑包括(例如)丙烷、異丁烷、正丁烷、戊烷、異戊烷及新戊烷。亦可使用烴摻合物作為推進劑。醚推進劑包括(例如)二甲醚以及醚。本發明之氣溶膠調配物亦可包含一種以上推進劑。舉例而言，氣溶膠調配物可包含一種以上來自相同種類之推進劑，例如兩種或兩種以上碳氟化合物；或一種以上、兩種以上、三種以上來自 不同種類之推進劑，例如氟代烴及烴。本發明之醫藥組合物亦可用加壓氣體(例如惰性氣體，例如二氧化碳、氧化亞氮或氮)來分配。

氣溶膠調配物亦可包括其他組份，例如乙醇、異丙醇、丙二醇，以及表面活性劑或其他組份，例如油及清潔劑。該等組份可用於穩定調配物及/或潤滑閥門組件。

可在壓力下包裝氣溶膠調配物，且可使用溶液、懸浮液、乳液、粉劑及半固體製劑將其調配為氣溶膠。例如，溶液氣溶膠調配物可包含本發明藥劑(例如轉運蛋白、載劑或離子通道抑制劑)於(實質上)純的推進劑或推進劑及溶劑之混合物中之溶液。該溶劑可用於溶解藥劑及/或延遲推進劑之蒸發。溶劑可包括(例如)水、乙醇及二醇。可使用適宜溶劑之任一組合，其視情況與防腐劑、抗氧化劑及/或其他氣溶膠組份組合。

氣溶膠調配物可為分散液或懸浮液。懸浮液氣溶膠調配物可包含本發明之藥劑或藥劑組合(例如，轉運蛋白、載劑或離子通道抑制劑)及分散劑之懸浮液。分散劑可包括(例如)去水山梨醇三油酸酯、油醇、油酸、卵磷脂及玉米油。懸浮液氣溶膠調配物亦可包括潤滑劑、防腐劑、抗氧化劑及/或其他氣溶膠組份。

可以類似方式將氣溶膠調配物調配為乳液。乳液氣溶膠調配物可包括(例如)醇(例如乙醇)、表面活性劑、水及推進劑以及本發明之藥劑或藥劑組合，例如，轉運蛋白、載劑或離子通道。所用表面活性劑可為非離子型、陰離子型或陽離子型。乳液氣溶膠調配物之一個實例包含(例如)乙醇、表面活性劑、水及推進劑。乳液氣溶膠調配物之另一實例包含(例如)植物油、單硬脂酸甘油酯及丙烷。

醫藥化合物可經調配以供作為栓劑來投與。首先熔化低熔點蠟，例 如甘油三酯混合物、脂肪酸甘油酯、Witepsol S55(Dynamite Nobel Chemical,Germany之商標)或可可脂，且藉由(例如)攪拌使活性組份均勻分散。然後將該熔化之均勻混合物傾倒至大小合適之模具中，使其冷卻並固化。

醫藥組合物可經調配用於陰道投與。子宮端帽、陰道塞(塞子)、乳膏、凝膠、膏糊、泡沫或噴霧劑除含有活性成分外亦含有該等如此項技術中已知適宜之載劑。

醫藥組合物可以可釋放方式附接至生物相容性聚合物以用於在插入物上、在插入物中或附接至插入物的持續釋放調配物，以供局部、眼內、眼周或全身性投與。自生物相容性聚合物受控釋放亦可以水溶性聚合物來使用以形成可滴入調配物。自生物相容性聚合物(例如PLGA微球體或奈米球體)受控釋放亦可用於適合眼內植入或注射以供持續釋放投與之調配物中。可使用任何適宜的生物可降解且生物相容性的聚合物。

IV. CTL肽及HTL肽之組合

具有免疫刺激活性且包含本文所闡述之新抗原多肽及多核苷酸或其類似物之免疫原性或疫苗組合物可經修飾以提供期望屬性(例如改良之血清半衰期)或增強免疫原性。

例如，可藉由將肽連接至含有至少一個能誘導T輔助細胞反應之表位之序列來增強新抗原肽誘導CTL活性之能力。在一些實施例中，CTL表位/HTL表位偶聯物係藉由間隔體分子連接。間隔體通常包括在生理條件下實質上不帶電之相對小的中性分子，例如胺基酸或胺基酸模擬物。間隔體通常選自(例如)Ala、Gly或非極性胺基酸或中性極性胺基酸之其他中性間隔體。將瞭解視情況存在之間隔體無需包括相同殘基且因此其可為異源 -或同源寡聚物。在存在時，間隔體通常將為至少一個或兩個殘基，更通常3至6個殘基。另一選擇為，CTL肽可不用間隔體連接至T輔助肽。

儘管CTL肽表位可直接連接至T輔助肽表位，但CTL表位/HTL表位偶聯物可藉由間隔體分子連接。間隔體通常包括在生理條件下實質上不帶電之相對小的中性分子，例如胺基酸或胺基酸模擬物。間隔體通常選自(例如)Ala、Gly或非極性胺基酸或中性極性胺基酸之其他中性間隔體。將瞭解視情況存在之間隔體無需包括相同殘基且因此其可為異源-或同源寡聚物。在存在時，間隔體通常將為至少一個或兩個殘基，更通常3至6個殘基。CTL肽表位可直接或經由CTL肽之胺基或羧基末端之間隔體連接至T輔助肽表位。免疫原性肽或T輔助肽之胺基末端可經醯化。

HTL肽表位亦可經修飾以改變其生物性質。例如，包含HTL表位之肽可含有D-胺基酸以增加其對蛋白酶之耐受性且因此延長其血清半衰期。另外，表位肽可偶聯至其他分子(例如脂質、蛋白質或糖或任何其他合成化合物)以增加其生物活性。例如，T輔助肽可在胺基或羧基末端偶聯至一或多個棕櫚酸鏈。

在某些實施例中，T輔助肽係由存在於大多數群體中之T輔助細胞識別者。此可藉由選擇結合至許多、大多數或所有II類HLA分子之胺基酸序列實現。該等序列稱為「鬆散HLA限制性」或「混雜」T輔助序列。混雜胺基酸序列之實例包括來自以下抗原之序列：例如破傷風類毒素之位置830-843(QYIKANSKFIGITE(SEQ ID NO：886))、惡性瘧原蟲(Plasmodium falciparum)CS蛋白之位置378-398(DIEKKIAKMEKASSVFNVVNS(SEQ ID NO：887))及鏈球菌屬(Streptococcus)18kD蛋白之位置116(GAVDSILGGVATYGAA(SEQ ID NO：888))。其他實例包括具有DR 1-4-7超基序或DR3基序中之任一者之肽。

另一選擇為，可使用自然界中未發現之胺基酸序列來製備能以鬆散HLA限制方式刺激T輔助淋巴球之合成肽(例如，參見PCT公開案WO 95/07707)。該等合成化合物稱為Pan-DR-結合表位(例如，PADRE,Epimmune,Inc.,San Diego,CA)，其經設計以結合大多數HLA-DR(人類II類HLA)分子。例如，pan-DR-結合表位肽具有下式：aKXVWANTLKAAa(SEQ ID NO：889)，其中「X」係環己基丙胺酸、苯丙胺酸或酪胺酸，且a係D-丙胺酸或L-丙胺酸，已發現無論HLA類型如何，該pan-DR-結合表位肽結合至大多數HLA-DR等位基因，且刺激大多數個體之T輔助淋巴球之反應。pan-DR結合表位之替代包含所有「L」天然胺基酸且可以編碼該表位之核酸之形式提供。

在一些實施例中，可期望在醫藥組合物(例如，免疫原性組合物)中包括新抗原治療劑(例如，肽、多核苷酸、TCR、CAR、含有TCR或CAR之細胞、含有多肽之樹突細胞、含有多核苷酸之樹突細胞、抗體等)，該等醫藥組合物之至少一個組份啟動細胞毒性T淋巴球。脂質已經鑑別為能活體內啟動CTL對抗病毒抗原之藥劑。例如，棕櫚酸殘基可附接至離胺酸殘基之ε-及α-胺基且然後經由(例如)一或多個連接殘基(例如Gly、Gly-Gly-、Ser、Ser-Ser或諸如此類)連接至免疫原性新抗原肽。脂質化肽然後可以納入脂質體中或在佐劑中乳化之膠束或粒子形式來直接投與。在一些實施例中，尤其有效之免疫原性構築體包含附接至Lys之ε-及α-胺基之棕櫚酸，該棕櫚酸係經由鏈接(例如，Ser-Ser)附接至免疫原性肽之胺基末端。

作為CTL反應之脂質啟動之另一實例，當共價附接至適當肽時，可 使用大腸桿菌脂蛋白(例如三棕櫚醯基-S-甘油基半胱胺醯基絲胺醯基-絲胺酸(P3CSS))啟動病毒特異性CTL。(例如，參見Deres等人，Nature 342：561,1989)。例如，可將本文所闡述之新抗原肽偶聯至P3CSS，並向個體投與脂肽以特定地啟動對靶標抗原之CTL反應。此外，由於中和抗體之誘導亦可用P3CSS-偶聯表位來啟動，因此可合併該兩種組合物以更有效地引發對感染之體液性及細胞調介之反應。

如本文所述，可將其他胺基酸添加至新抗原肽之末端以使肽易於彼此連接、偶聯至載劑載體或較大肽、改變肽或寡肽之物理或化學性質或諸如此類。可在肽或寡肽之C-末端或N-末端引入胺基酸(例如酪胺酸、半胱胺酸、離胺酸、麩胺酸或天冬胺酸或諸如此類)。然而，應注意在一些情形下，在T細胞表位之羧基末端之修飾可改變肽之結合特徵。另外，肽或寡肽序列與天然序列之不同之處在於藉由末端-NH2醯化(例如，藉由烷醯基(C1-C20)或巰基乙醯基乙醯化)、末端-羧基醯胺化(例如，氨、甲胺等)經修飾。在一些情形中，該等修飾可提供用於連接至載體或其他分子之位點。

本文所闡述之免疫原性組合物之實施例包含向來自患者血液之PBMC或與其分離之DC離體投與具有表位之新抗原多肽或多核苷酸之混合劑。可使用有利於收穫樹突細胞(DC)之醫藥，包括GM-CSF、IL-4、IL-6、IL-1β及TNFα。在用肽或編碼該肽之多核苷酸脈衝DC之後，且在再輸注至患者之前，洗滌DC以去除未結合之肽。在此實施例中，疫苗或免疫原性組合物包含肽脈衝之DC，該等DC將與HLA分子複合之經脈衝肽表位呈遞於其表面上。然後將組合物投與患者。在其他實施例中，使用該等經脈衝DC來刺激適用於T細胞療法中之T細胞。

V.多表位免疫原性組合物

可利用多種容許同時遞送多個表位之不同方法。編碼本文所闡述之新抗原肽之核酸係本發明之尤其有用之實施例。在一些實施例中，核酸係RNA。在一些實施例中，使用編碼本文所闡述包含一或多個表位之新抗原肽之袖珍基因構築體來投與編碼本文所述新抗原肽之核酸。

多表位袖珍基因之使用闡述於以下文獻中：An,L.及Whitton,J.L.，J.Virol.71：2292,1997；Thomson,S.A.等人，J.Immunol.157：822,1996；Whitton,J.L.等人，J.Virol.67：348,1993；Hanke,R.等人，Vaccine 16：426,1998。例如，可改造編碼具有超基序及/或基序之新抗原肽、通用輔助T細胞表位(或多個腫瘤相關性抗原HTL表位)及內質網易位信號序列之多表位DNA質體。

可在轉基因小鼠中測試多表位袖珍基因之免疫原性來評估對抗測試表位誘導之免疫反應之量級。另外，活體內DNA編碼之表位之免疫原性可能與活體外特定CTL系對抗經DNA質體轉染之靶細胞之反應相關。因此，該等實驗可顯示袖珍基因雙雙用於：1.)生成細胞調介之及/或體液性反應及2.)經誘導免疫細胞識別表現經編碼表位之細胞。

例如，為產生用於在人類細胞中表現之編碼所選新表位(袖珍基因)之DNA序列，可反轉譯表位之胺基酸序列。可使用人類密碼子使用表來指導每一胺基酸之密碼子選擇。可將該等編碼新表位之DNA序列直接聯接，使得在轉譯時產生連續多肽序列。為最佳化表現及/或免疫原性，可將其他元件納入袖珍基因設計中。可反轉譯且包括在袖珍基因序列內之胺基酸序列之實例包括：I類HLA表位、II類HLA表位、泛蛋白化信號序列及/或內質網靶向信號。另外，CTL及HTL表位之HLA呈遞可藉由包括合 成(例如聚-丙胺酸)或毗鄰CTL或HTL表位之天然側翼序列來改良；該等包含表位之較大肽在本發明之範圍內。

可藉由組裝編碼袖珍基因之正鏈及負鏈之寡核苷酸來將袖珍基因序列轉化為DNA。可使用熟知技術在適當條件下合成重疊寡核苷酸(30-100個鹼基長)，使其磷酸化、純化並退火。可使用(例如)T4 DNA連接酶接合寡核苷酸之末端。然後可將編碼表位多肽之此合成袖珍基因選殖至期望表現載體中。

可使熟習此項技術者熟知之標準調節序列包括在載體中以確保在靶細胞中表現。例如，具有供袖珍基因插入之下游選殖位點之啟動子；用於有效轉錄終止之多聚腺苷酸化信號；大腸桿菌複製起點；及大腸桿菌可選標記物(例如胺苄青黴素或康黴素抗性)。多種啟動子可用於此目的，例如，人類巨細胞病毒(hCMV)啟動子。其他適宜啟動子序列例如參見美國專利第5,580,859號及第5,589,466號。

可使用額外載體修飾來最佳化袖珍基因表現及免疫原性。在一些情形下，有效基因表現需要內含子，且可將一或多種合成或天然內含子納入袖珍基因之轉錄區中。亦可考慮在哺乳動物細胞中納入mRNA穩定序列及複製序列來增加袖珍基因表現。

在選擇表現載體之後，可將袖珍基因選殖至啟動子下游之多連接體區中。將此質體轉變至適當大腸桿菌菌株中，並使用標準技術製備DNA。袖珍基因以及包括在載體內之所有其他元件之定向及DNA序列皆可使用限制酶圖譜分析及DNA序列分析來證實。具有正確質體之細菌細胞可作為種源細胞庫及工作細胞庫來儲存。

另外，免疫調節序列似乎在DNA疫苗之免疫原性中起作用。若期望 增強免疫原性，則可使該等序列包括在袖珍基因編碼序列之外的載體內。在一些實施例中，該等序列具有免疫刺激性。在另一實施例中，該等序列係ISS或CpG。

在一些實施例中，可使用容許產生袖珍基因編碼之表位及第二蛋白質(包括在內以增強或降低免疫原性)之雙順反子表現載體。若共表現，則可有益地增強免疫反應之蛋白質或多肽之實例包括細胞介素(例如，IL-2、IL-12、GM-CSF)、細胞介素誘導性分子(例如，LeIF)、共刺激分子，或對於HTL反應包括pan-DR結合蛋白。輔助(HTL)表位可接合至細胞內靶向信號並與經表現之CTL表位分開表現；此容許將HTL表位引導至與CTL表位不同的細胞隔室。若需要，此可促進HTL表位更有效進入II類HLA路徑中，藉此改良HTL誘導。與HTL或CTL誘導相反，藉由免疫抑制分子(例如TGF-β)之共表現特異性降低免疫反應可在某些疾病中有益。

可藉由(例如)在大腸桿菌中發酵、隨後純化產生治療量之質體DNA。使用來自工作細胞庫之等分試樣來接種生長培養基，且根據熟知技術使其在搖瓶或生物反應器中生長至飽和。可使用標準生物分離技術(例如由QIAGEN,Inc.(Valencia,California)供應之固相陰離子交換樹脂)純化質體DNA。若需要，可使用凝膠電泳或其他方法使超螺旋DNA與開環及線性形式分離。

可製備經純化質體DNA以使用各種調配物進行注射。該等方法中之最簡單者係在無菌磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中重構凍乾DNA。此方法稱為「裸DNA」，目前其用於在臨床試驗中進行肌內(IM)投與。為最大化袖珍基因DNA疫苗之免疫治療效應，可使用調配經純化質體DNA之替代方法。已闡述各種方法，且可利用新技術。陽離子脂質亦可用於調配物中 (例如，參見如藉由WO 93/24640所闡述；Mannino及Gould-Fogerite,BioTechniques6(7)：682(1988)；美國專利第5,279,833號；WO 91/06309；及Felgner等人，Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 84：7413(1987)。另外，亦可複合醣酯、致融性脂質體、肽及化合物(共同稱作保護性、相互作用性、非凝聚性化合物(PINC))來純化質體DNA以影響諸如穩定性、肌內分散或至特定器官或細胞類型之運輸等變量。

在另一實施例中，藉由使用高速細胞變形將核酸引入細胞中。在高速變形期間，擠壓細胞使得暫時破壞細胞膜，因此容許核酸進入細胞中。另一選擇為，可自表現載體例如在細菌表現載體中產生蛋白質，且然後可將蛋白質遞送至細胞。

靶細胞敏化可用作袖珍基因編碼之CTL表位之表現及I類HLA呈遞之功能分析。例如，將質體DNA引入適宜作為標準CTL鉻釋放分析之靶標之哺乳動物細胞系中。所用轉染方法將取決於最終調配物。對於「裸」DNA可使用電穿孔，而陽離子脂質容許直接活體外轉染。可共轉染表現綠色螢光蛋白(GFP)之質體以容許使用螢光活化細胞分選(FACS)富集經轉染細胞。然後對該等細胞進行鉻-51(⁵¹Cr)標記且使用其作為表位特異性CTL系之靶細胞；細胞溶解(藉由⁵¹Cr釋放檢測)指示袖珍基因編碼之CTL表位之產生及HLA呈遞。HTL表位之表現可使用用以評價HTL活性之分析以類似方式來評估。

活體內免疫原性係用於袖珍基因DNA調配物之功能測試之第二方法。用DNA產物對表現適當人類HLA蛋白之轉基因小鼠進行免疫。投與之劑量及途徑具有調配物依賴性(例如，對於於PBS中之DNA用IM，對於脂質複合之DNA用腹膜內(IP))。實例性方案係：在免疫後21天，收穫脾 細胞並在編碼所測試之每一表位之肽存在下再刺激1週。此後，對於CTL效應細胞，使用標準技術分析加載肽之⁵¹Cr標記之靶細胞之細胞溶解。由加載有對應於袖珍基因編碼之表位之肽表位的HLA敏化之靶細胞之溶解證實活體內誘導CTL之DNA疫苗功能。HTL表位之免疫原性係在轉基因小鼠中以類似方式評估。

另一選擇為，可使用彈道遞送投與核酸，如例如美國專利第5,204,253號中所闡述。使用此技術，投與僅包括DNA之粒子。在另一替代實施例中，可將DNA黏著至粒子，例如金粒子。

Ⅵ.用於本發明中之細胞

在一態樣中，本發明亦提供表現活化免疫反應細胞之新抗原識別受體(例如，T細胞受體(TCR)或嵌合抗原受體(CAR))之細胞，及使用該等細胞治療需要增強之免疫反應之疾病之方法。

該等細胞包括表現結合本文所述新抗原肽中之一者之抗原識別受體(例如，TCR或CAR)之經遺傳修飾之免疫反應細胞(例如，T細胞、天然殺手(NK)細胞、細胞毒性T淋巴球(CTL)細胞、輔助T淋巴球(HTL)細胞)，及因此用於治療贅瘤形成及期望抗原特異性免疫反應增加之其他病理之方法。T細胞活化係由靶向抗原之TCR或CAR調介的。

本發明提供表現活化免疫反應細胞(例如，TCR、CAR)之抗原識別受體及嵌合共刺激受體(CCR)之組合之細胞，及使用該等細胞治療需要增強之免疫反應之疾病之方法。在一些實施例中，使用腫瘤抗原特異性T細胞、NK細胞、CTL細胞或其他免疫反應細胞作為用於選擇性富集一或多種共刺激配體之穿梭物用於治療或預防贅瘤形成。將該等細胞投與需要其之人類個體用於治療或預防特定癌症。

在一些實施例中，可用於本發明方法中之腫瘤抗原特異性人類淋巴球包括(但不限於)經遺傳修飾以表現嵌合抗原受體(CAR)之周邊供體淋巴球(Sadelain,M.等人2003 Nat Rev Cancer 3：35-45)、經遺傳修飾以表現包含a及p異二聚體之全長腫瘤抗原識別T細胞受體複合體之周邊供體淋巴球(Morgan,R.A.等人2006 Science 314：126-129)、衍生自腫瘤生檢中之腫瘤浸潤淋巴球(TIL)之淋巴球培養物(Panelli,M.C.等人2000 J Immunol 164：495-504；Panelli,M.C.等人2000 J Immunol 164：4382-4392)及採用人工抗原呈遞細胞(AAPC)或經脈衝樹突細胞之選擇性地活體外擴增之抗原特異性末梢血白血球(Dupont,J.等人2005 Cancer Res 65：5417-5427；Papanicolaou,G.A.等人2003 Blood 102：2498-2505)。T細胞可為自體的、同種異體的或活體外自經改造祖細胞或幹細胞衍生的。

在一些實施例中，免疫治療係經改造受體。在一些實施例中，經改造受體係嵌合抗原受體(CAR)、T細胞受體(TCR)或B細胞受體(BCR)、過繼性T細胞療法(ACT)或其衍生物。在其他態樣中，經改造受體係嵌合抗原受體(CAR)。在一些態樣中，CAR係第一代CAR。在其他態樣中，CAR係第二代CAR。在再其他態樣中，CAR係第三代CAR。

在一些態樣中，CAR包含細胞外部分、跨膜部分及細胞內部分。在一些態樣中，細胞內部分包含至少一個T細胞共刺激結構域。在一些態樣中，T細胞共刺激結構域係選自由以下組成之群：CD27、CD28、TNFRS9(4-1BB)、TNFRSF4(OX40)、TNFRSF8(CD30)、CD40LG(CD40L)、ICOS、ITGB2(LFA-1)、CD2、CD7、KLRC2(NKG2C)、TNFRS18(GITR)、TNFRSF14(HVEM)或其任一組合。

在一些態樣中，經改造受體結合靶標。在一些態樣中，結合對特異 於一或多種罹患疾病或病況之個體之肽具有特異性。

在一些態樣中，免疫治療劑係如本文所詳述之細胞。在一些態樣中，免疫治療係包含特異性結合肽之受體之細胞。在一些態樣中，免疫治療係與本發明之肽/核酸組合使用之細胞。在一些實施例中，細胞係患者細胞。在一些實施例中，細胞係T細胞。在一些實施例中，細胞係腫瘤浸潤淋巴球。

在一些態樣中，基於個體之T細胞受體譜治療患有病況或疾病之個體。在一些實施例中，基於個體之T細胞受體譜選擇抗原疫苗。在一些實施例中，用表現對抗原或肽具有特異性之TCR之T細胞治療個體。在一些實施例中，用對TCR(例如，個體特異性TCR)具有特異性之抗原或肽治療個體。在一些實施例中，用對表現TCR(例如，個體特異性TCR)之T細胞具有特異性之抗原或肽治療個體。在一些實施例中，用對個體特異性TCR具有特異性之抗原或肽治療個體。

在一些實施例中，基於在一或多個個體中鑑別之TCR選擇免疫原性抗原組合物或疫苗。在一些實施例中，使用T細胞譜之鑑別及功能分析中之測試來確定欲投與一或多個患有病況或疾病之個體之免疫原性組合物或疫苗。在一些實施例中，免疫原組合物係抗原疫苗。在一些實施例中，抗原疫苗包含個體特異性抗原肽。在一些實施例中，基於結合至抗原之個體特異性TCR之量化選擇欲包括在抗原疫苗內之抗原肽。在一些實施例中，基於肽與TCR之結合親和力選擇抗原肽。在一些實施例中，選擇係基於量及結合親和力之組合。例如，在功能分析中強力結合至抗原但在TCR譜中未高度代表之TCR可為抗原疫苗之良好候選者，乃因表現TCR之T細胞可有利地被擴增。

在一些實施例中，基於與TCR之結合選擇抗原以投與一或多個個體。在一些實施例中，可擴增T細胞，例如來自患有疾病或病況之個體之T細胞。可將表現對免疫原性抗原肽具有特異性之TCR之經擴增之T細胞返回投與個體。在一些實施例中，用多核苷酸轉導或轉染適宜細胞(例如，PBMC)用於表現對免疫原性抗原肽具有特異性之TCR並將其投與個體。可擴增表現對免疫原性抗原肽具有特異性之TCR之T細胞並將其返回投與個體。在一些實施例中，可擴增在與自體患病組織一起培育時產生細胞溶解活性且表現對免疫原性抗原肽具有特異性之TCR之T細胞，並將該等T細胞投與個體。在一些實施例中，可擴增在功能分析中使用之導致結合至免疫原性抗原肽之T細胞並將其投與個體。在一些實施例中，可在T細胞中表現已確定結合至個體特異性免疫原性抗原肽之TCR並將其投與個體。

共刺激配體

在一些實施例中，本發明之細胞與至少一種共刺激配體一起提供，該共刺激配體係對於免疫細胞之完全活化至關重要之非抗原特異性信號。共刺激配體包括(但不限於)腫瘤壞死因子(TNF)配體、細胞介素(例如IL-2、IL-12、IL-15或IL21)及免疫球蛋白(Ig)超家族配體。

腫瘤壞死因子(TNF)係參與全身發炎之細胞介素且刺激急性期反應。其主要作用係調控免疫細胞。腫瘤壞死因子(TNF)配體共有多種共同特徵。大多數配體係作為含有短細胞質區段及相對長的細胞外區之II型跨膜蛋白來合成。TNF配體包括(但不限於)神經生長因子(NGF)、CD4OL(CD4OL)/CD154、CD137L/4-1BBL、腫瘤壞死因子α(TNFα)、CD134L/OX4OL/CD252、CD27L/CD70、Fas配體(FasL)、 CD3OL/CD153、腫瘤壞死因子β(TNF(3)/淋巴毒素-α(LTa)、淋巴毒素-β(ur(3)、CD257/B細胞活化因子(BAFF)/Blys/THANK/Ta11-1、糖皮質激素誘導之TNF受體配體(GITRL)及TNF相關性細胞凋亡誘導性配體(TRAIL)、LIGHT(TNFSF14)。免疫球蛋白(Ig)超家族係一大群參與細胞之識別、結合或黏著過程之細胞表面及可溶性蛋白質。該等蛋白質與免疫球蛋白共有結構特徵--其具有免疫球蛋白結構域(摺疊)。免疫球蛋白超家族配體包括(但不限於)CD80及CD86(CD28之兩種配體)。

可將包含本發明之經遺傳修飾之免疫反應細胞之組合物全身或直接提供給個體用於治療贅瘤形成。在一些實施例中，將本發明之細胞直接注射至所關注器官(例如，受腫瘤影響之器官)中。另一選擇為，將包含經遺傳修飾之免疫反應細胞之組合物間接提供給所關注器官，例如，藉由投與循環系統(例如，腫瘤血管系統)中達成。可在投與細胞之前、在此期間或在此之後提供擴增劑及分化劑以增加活體外或活體內T細胞、NK細胞或CTL細胞之產生。

可在任何生理上可接受之媒劑中、通常在血管內投與經修飾細胞，但亦可將其引入骨骼或其中細胞可發現適當的再生及分化位點之其他便利位點(例如，胸腺)中。本發明之經遺傳修飾之免疫反應細胞可包含經純化之細胞群體。熟習此項技術者可使用各種熟知方法(例如螢光活化細胞分選(FACS))容易地測定群體中經遺傳修飾之免疫反應細胞之百分比。熟習此項技術者可容易地調節劑量(例如，純度降低可需要劑量增加)。可藉由注射、導管或諸如此類引入該等細胞。若期望，亦可包括包括(但不限於)以下之因子：介白素(例如IL-2、IL-3、IL-6及IL-11)以及其他介白素、群落刺激因子(例如G-CSF、M-CSF及GM-CSF)、干擾素(例如γ-干擾素)及 促紅血球生成素。

本發明之組合物包括包含經遺傳修飾之免疫反應細胞或其祖細胞及醫藥上可接受之載劑之醫藥組合物。投與可為自體或異源的。例如，免疫反應細胞或祖細胞可自一個個體獲得，且可投與同一個個體或不同的相容性個體。本發明之末梢血源性免疫反應細胞或其後代(例如，活體內、離體或活體外源性)可經由局部注射來投與，包括導管投與、全身注射、局部注射、靜脈內注射或非經腸投與。當投與本發明之治療性組合物(例如，含有經遺傳修飾之免疫反應細胞之醫藥組合物)時，其通常係調配成單位劑量可注射形式(溶液、懸浮物、乳液)。

VII.使用方法及醫藥組合物

本文所闡述之新抗原治療劑(例如，肽、多核苷酸、TCR、CAR、含有TCR或CAR之細胞、含有多肽之樹突細胞、含有多核苷酸之樹突細胞、抗體等)可用於各種應用中，包括(但不限於)治療性治療方法，例如癌症之治療。在一些實施例中，治療性治療方法包含免疫療法。在某些實施例中，新抗原肽可用於活化、促進、增加及/或增強免疫反應、更改現有對新靶標之免疫反應、增加腫瘤之免疫原性、抑制腫瘤生長、減小腫瘤體積、增加腫瘤細胞凋亡及/或降低腫瘤之致瘤性。該等使用方法可為活體外、離體或在活體內方法。

在一些態樣中，本發明提供使用本文所闡述之新抗原治療劑活化個體之免疫反應之方法。在一些實施例中，本發明提供使用本文所闡述之新抗原治療劑促進個體之免疫反應之方法。在一些實施例中，本發明提供使用本文所闡述之新抗原肽增加個體之免疫反應之方法。在一些實施例中，本發明提供使用新抗原肽增強免疫反應之方法。在一些實施例中，免疫反 應之活化、促進、增加及/或增強包含增加細胞調介之免疫性。在一些實施例中，免疫反應之活化、促進、增加及/或增強包含增加T細胞活性或體液性免疫性。在一些實施例中，免疫反應之活化、促進、增加及/或增強包含增加CTL或HTL活性。在一些實施例中，免疫反應之活化、促進、增加及/或增強包含增加NK細胞活性。在一些實施例中，免疫反應之活化、促進、增加及/或增強包含增加T細胞活性及增加NK細胞活性。在一些實施例中，免疫反應之活化、促進、增加及/或增強包含增加CTL活性及增加NK細胞活性。在一些實施例中，免疫反應之活化、促進、增加及/或增強包含抑制或降低Tregs之抑制活性。在一些實施例中，免疫反應係抗原刺激之結果。在一些實施例中，抗原刺激係腫瘤細胞。在一些實施例中，抗原刺激係癌症。

在一些實施例中，本發明提供使用本文所闡述之新抗原治療劑活化、促進、增加及/或增強免疫反應之方法。在一些實施例中，方法包含向有需要之個體投與治療有效量之新抗原治療劑，該新抗原治療劑向腫瘤細胞遞送新抗原多肽或多核苷酸。在一些實施例中，方法包含向有需要之個體投與治療有效量之新抗原治療劑，該新抗原治療劑結合腫瘤相關抗原且由腫瘤細胞內化。在一些實施例中，方法包含向有需要之個體投與治療有效量之新抗原多肽，該新抗原多肽由腫瘤細胞內化，且該新抗原肽由該細胞進行處理。在一些實施例中，方法包含向有需要之個體投與治療有效量之新抗原多肽，該新抗原多肽由腫瘤細胞內化，且該抗原性肽係呈遞於腫瘤細胞之表面上。在一些實施例中，方法包含向有需要之個體投與治療有效量之新抗原多肽，該新抗原多肽由腫瘤細胞內化，由該細胞進行處理，且抗原性肽係呈遞於腫瘤細胞之表面上。

在一些實施例中，方法包含向有需要之個體投與治療有效量之本文所闡述之新抗原多肽或多核苷酸，該新抗原多肽或多核苷酸將包含至少一種抗原性肽之外源性多肽遞送至腫瘤細胞，其中該抗原性肽係呈遞於腫瘤細胞之表面上。在一些實施例中，抗原性肽係呈遞於與I類MHC分子複合之腫瘤細胞之表面上。在一些實施例中，抗原性肽係呈遞於與II類MHC分子複合之腫瘤細胞之表面上。

在一些實施例中，方法包含使腫瘤細胞與本文所闡述之新抗原多肽或多核苷酸接觸，該新抗原多肽或多核苷酸將包含至少一種抗原性肽之外源性多肽遞送至腫瘤細胞，其中該抗原性肽係呈遞於腫瘤細胞之表面上。在一些實施例中，抗原性肽係呈遞於與I類MHC分子複合之腫瘤細胞之表面上。在一些實施例中，抗原性肽係呈遞於與II類MHC分子複合之腫瘤細胞之表面上。

在一些實施例中，方法包含向有需要之個體投與治療有效量之本文所闡述之新抗原多肽或多核苷酸，該新抗原多肽或多核苷酸將包含至少一種抗原性肽之外源性多肽遞送至腫瘤細胞，其中該抗原性肽係呈遞於腫瘤細胞之表面上，且誘導對抗腫瘤細胞之免疫反應。在一些實施例中，對抗腫瘤細胞之免疫反應有所增加。在一些實施例中，新抗原多肽或多核苷酸將包含至少一種抗原性肽之外源性多肽遞送至腫瘤細胞，其中該抗原性肽係呈遞於腫瘤細胞之表面上，且抑制腫瘤生長。

在一些實施例中，方法包含向有需要之個體投與治療有效量之本文所闡述之新抗原多肽或多核苷酸，該新抗原多肽或多核苷酸將包含至少一種抗原性肽之外源性多肽遞送至腫瘤細胞，其中該抗原性肽係呈遞於腫瘤細胞之表面上，且誘導針對腫瘤細胞之T細胞殺死。在一些實施例中，針 對腫瘤細胞之T細胞殺死有所增強。在一些實施例中，針對腫瘤細胞之T細胞殺死有所增加。

在一些實施例中，增加個體之免疫反應之方法包含向個體投與治療有效量之本文所闡述之新抗原治療劑，其中該藥劑係特異性結合本文所闡述之新抗原之抗體。在一些實施例中，增加個體之免疫反應之方法包含向個體投與治療有效量之抗體。

本發明提供之方法更改對腫瘤之現有免疫反應。在一些實施例中，更改對腫瘤之現有免疫反應之方法包含向個體投與治療有效量之本文所闡述之新抗原治療劑。在一些實施例中，現有免疫反應係對抗病毒。在一些實施例中，病毒係選自由以下組成之群：麻疹病毒、水痘帶狀皰疹病毒(VZV；水痘病毒)、流行性感冒病毒、腮腺炎病毒、脊髓灰白質炎病毒、德國麻疹病毒、輪狀病毒、肝炎A病毒(HAV)、B型肝炎病毒(HBV)、艾伯斯坦-巴爾病毒(Epstein Barr virus，EBV)及巨細胞病毒(CMV)。在一些實施例中，病毒係水痘帶狀皰疹病毒。在一些實施例中，病毒係巨細胞病毒。在一些實施例中，病毒係麻疹病毒。在一些實施例中，現有免疫反應係在自然病毒感染之後獲取。在一些實施例中，現有免疫反應係在對抗病毒之疫苗接種之後獲取。在一些實施例中，現有免疫反應係細胞調節之反應。在一些實施例中，現有免疫反應包含細胞毒性T細胞(CTL)或HTL。

在一些實施例中，在個體中更改對腫瘤之現有免疫反應之方法包含投與包含以下之融合蛋白：(i)特異性結合新抗原之抗體及(ii)至少一種本文所述新抗原肽，其中(a)融合蛋白係在結合至腫瘤相關性抗原之後由腫瘤細胞內化；(b)新抗原肽經處理且呈遞於與I類MHC分子締合之腫瘤細胞 之表面上；及(c)新抗原肽/I類MHC複合體係由細胞毒性T細胞識別。在一些實施例中，細胞毒性T細胞係記憶T細胞。在一些實施例中，記憶T細胞係用新抗原肽進行疫苗接種之結果。

本發明提供增加腫瘤之免疫原性之方法。在一些實施例中，增加腫瘤之免疫原性之方法包含使腫瘤或腫瘤細胞與有效量之本文所闡述之新抗原治療劑接觸。在一些實施例中，增加腫瘤之免疫原性之方法包含向個體投與治療有效量之本文所闡述之新抗原治療劑。

本發明亦提供使用本文所闡述之新抗原治療劑抑制腫瘤之生長之方法。在某些實施例中，抑制腫瘤之生長之方法包含在活體外使細胞混合物與新抗原治療劑接觸。例如，在添加新抗原肽之培養基中培養永生化細胞系或癌細胞系與免疫細胞(例如，T細胞)之混合物。在一些實施例中，自患者試樣(例如，組織生檢、胸膜滲出液或血液試樣)分離腫瘤細胞，與免疫細胞(例如，T細胞)混合，並在添加新抗原治療劑之培養基中培養。在一些實施例中，新抗原治療劑增加、促進及/或增強免疫細胞之活性。在一些實施例中，新抗原治療劑抑制腫瘤細胞生長。在一些實施例中，新抗原治療劑活化腫瘤細胞之殺死。

在某些實施例中，個體係人類。在某些實施例中，個體具有腫瘤或個體之腫瘤至少部分地被去除。

在一些實施例中，抑制腫瘤生長之方法包含更改對新靶標之現有免疫反應，其包含向個體投與治療有效量之新抗原治療劑，其中該現有免疫反應係對抗由新抗原肽遞送至腫瘤細胞之抗原性肽。

在某些實施例中，腫瘤包含癌症幹細胞。在某些實施例中，腫瘤中之癌症幹細胞之頻率係藉由投與新抗原治療劑來降低。在一些實施例中， 提供降低個體腫瘤中之癌症幹細胞之頻率之方法，其包含向個體投與治療有效量之新抗原治療劑。

另外，在一些態樣中，本發明提供降低個體之腫瘤之致瘤性之方法，其包含向個體投與治療有效量之本文所闡述之新抗原治療劑。在某些實施例中，腫瘤包含癌症幹細胞。在一些實施例中，腫瘤之致瘤性係藉由降低腫瘤中之癌症幹細胞之頻率來降低。在一些實施例中，該等方法包含使用本文所闡述之新抗原治療劑。在某些實施例中，腫瘤中之癌症幹細胞之頻率係藉由投與本文所闡述之新抗原治療劑來降低。

在一些實施例中，腫瘤係實體腫瘤。在某些實施例中，腫瘤係選自由以下組成之群之腫瘤：結腸直腸腫瘤、胰臟腫瘤、肺腫瘤、卵巢腫瘤、肝腫瘤、乳腫瘤、腎腫瘤、前列腺腫瘤、神經內分泌腫瘤、胃腸腫瘤、黑色素瘤、子宮頸腫瘤、膀胱腫瘤、神經膠母細胞瘤及頭頸腫瘤。在某些實施例中，腫瘤係結腸直腸腫瘤。在某些實施例中，腫瘤係卵巢腫瘤。在一些實施例中，腫瘤係乳腫瘤。在一些實施例中，腫瘤係肺腫瘤。在某些實施例中，腫瘤係胰臟腫瘤。在某些實施例中，腫瘤係黑色素瘤腫瘤。在一些實施例中，腫瘤係實體腫瘤。

本發明進一步提供治療個體之癌症之方法，其包含向個體投與治療有效量之本文所闡述之新抗原治療劑。

在一些實施例中，治療癌症之方法包含更改對新靶標之現有免疫反應，該方法包含向個體投與治療有效量之新抗原治療劑，其中該現有免疫反應係對抗由新抗原肽遞送至癌細胞之抗原性肽。

本發明提供治療癌症之方法，其包含向個體(例如，需要治療之個體)投與治療有效量之本文所闡述之新抗原治療劑。在某些實施例中，個體係 人類。在某些實施例中，個體患有癌性腫瘤。在某些實施例中，個體之腫瘤至少部分地被去除。

在某些實施例中，癌症係選自由以下組成之群之癌症：結腸直腸癌、胰臟癌、肺癌、卵巢癌、肝癌、乳癌、腎癌、前列腺癌、胃腸癌症、黑色素瘤、子宮頸癌、神經內分泌癌、膀胱癌、神經膠母細胞瘤及頭頸癌。在某些實施例中，癌症係胰臟癌。在某些實施例中，癌症係卵巢癌。在某些實施例中，癌症係結腸直腸癌。在某些實施例中，癌症係乳癌。在某些實施例中，癌症係前列腺癌。在某些實施例中，癌症係肺癌。在某些實施例中，癌症係黑色素瘤。在一些實施例中，癌症係實體癌症。在一些實施例中，癌症包含實體腫瘤。

在一些實施例中，癌症係血液癌。在一些實施例中，癌症係選自由以下組成之群：急性骨髓性白血病(AML)、霍奇金氏淋巴瘤(Hodgkin lymphoma)、多發性骨髓瘤、T細胞急性淋巴母細胞性白血病(T-ALL)、慢性淋巴球性白血病(CLL)、毛細胞白血病、慢性骨髓性白血病(CML)、非霍奇金氏淋巴瘤、瀰漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)、外套細胞淋巴瘤(MCL)及皮膚T細胞淋巴瘤(CTCL)。

在一些實施例中，新抗原治療劑係作為組合療法投與。具有兩種或更多種治療劑之組合療法使用藉由不同的作用機制起作用之藥劑，但此並非必需。使用作用機制不同的藥劑之組合療法可引起加性或協同效應。組合療法可容許每一藥劑之劑量低於在單一療法中所使用之劑量，藉此降低毒性副作用及/或增加藥劑之治療指數。組合療法可降低發展抗性癌細胞之可能性。在一些實施例中，組合療法包含影響免疫反應(例如，增強或活化反應)之治療劑及影響(例如，抑制或殺死)腫瘤/癌細胞之治療劑。

癌症包括(但不限於)B細胞癌症，例如，多發性骨髓瘤、瓦登斯特隆巨球蛋白血症(Waldenstrom'smacroglobulinemia)、重鏈病(例如α鏈疾病、γ鏈疾病及μ鏈疾病)、良性單株球蛋白症及免疫細胞類澱粉變性、黑色素瘤、乳癌、肺癌、支氣管癌、結腸直腸癌、前列腺癌(例如，轉移、激素抵抗性前列腺癌)、胰臟癌、胃癌、卵巢癌、膀胱癌、腦或中樞神經系統癌症、周圍神經系統癌、食道癌、子宮頸癌、子宮癌或子宮內膜癌、口腔或咽之癌症、肝癌、腎癌、睪丸癌、膽道癌、小腸或闌尾癌、唾液腺癌、甲狀腺癌、腎上腺癌、骨肉瘤、軟骨肉瘤、血液組織之癌症及諸如此類。適用於本發明所涵蓋方法之癌症類型之其他非限制性實例包括人類肉瘤及癌，例如，纖維肉瘤、黏液肉瘤、脂肪肉瘤、軟骨肉瘤、骨原性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、內皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管內皮肉瘤、滑膜瘤、間皮瘤、尤因氏腫瘤(Ewing's tumor)、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、結腸癌、結腸直腸癌、胰臟癌、乳癌、卵巢癌、鱗狀細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭狀癌、乳頭狀腺癌、囊腺癌、髓樣癌、支氣管癌、腎細胞癌、肝細胞瘤、膽管癌、肝癌、絨毛膜癌、精原細胞瘤、胚胎性癌、威爾姆氏腫瘤(Wilms'腫瘤)、子宮頸癌、骨癌、腦瘤、睪丸癌、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神經膠質瘤、星細胞瘤、髓母細胞瘤、顱咽管瘤、室管膜瘤、松果體瘤、血管母細胞瘤、聽神經瘤、寡樹突神經膠細胞瘤、腦脊髓膜瘤、黑色素瘤、神經胚細胞瘤、視網膜母細胞瘤；白血病，例如，急性淋巴球性白血病及急性骨髓細胞性白血病(骨髓母細胞性、前髓細胞性、骨髓單核球性、單核球形及紅血球性白血病)；慢性白血病(慢性骨髓細胞性(粒細胞性)白血病及慢性淋巴球性白血病)；及真性多血症、淋巴瘤(霍奇金氏病及非霍奇金氏病)、多發性骨髓 瘤、瓦登斯特隆巨球蛋白血症及重鏈病。在一些實施例中，表型可藉由本發明之方法確定之癌症係上皮癌，例如(但不限於)膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、結腸癌、婦科癌症、腎癌、喉癌症、肺癌、口腔癌、頭頸癌、卵巢癌、胰臟癌、前列腺癌或皮膚癌。在其他實施例中，癌症係乳癌、前列腺癌、肺癌或結腸癌。在再其他實施例中，上皮癌症係非小細胞肺癌、非乳頭狀腎細胞癌、子宮頸癌、卵巢癌(例如，漿液性卵巢癌)或乳癌。上皮癌之特徵可能在於各種其他方式，包括(但不限於)漿液性、子宮內膜樣、黏液樣、透明細胞、布倫納型(brenner)或未分化。在一些實施例中，本發明用於淋巴瘤或其亞型(包括(但不限於)外套細胞淋巴瘤)之治療、診斷及/或預後。淋巴增殖性病症亦被視為增殖性疾病。

在一些實施例中，本文所述藥劑及至少一種其他治療劑之組合產生加性或協同結果。在一些實施例中，組合療法使得藥劑治療指數之增加。在一些實施例中，組合療法使得其他治療劑之治療指數增加。在一些實施例中，組合療法使得藥劑之毒性及/或副作用降低。在一些實施例中，組合療法使得其他治療劑之毒性及/或副作用降低。

在某些實施例中，除投與本文所闡述之新抗原治療劑以外，該方法或治療進一步包含投與至少一種其他治療劑。另一治療劑可在投與藥劑之前、與此並行及/或在此之後投與。在一些實施例中，至少一種其他治療劑包含1種、2種、3種或更多種其他治療劑。

可與本文所闡述之新抗原治療劑組合投與之治療劑包括化學治療劑。因此，在一些實施例中，該方法或治療涉及與化學治療劑組合或與化學治療劑之混合劑組合投與本文所述藥劑。利用藥劑之治療可在投與化學療法之前、與此並行或在此之後進行。組合投與可包括以單一醫藥調配物 或使用分開調配物進行共投與，或以任一順序連續投與，但通常在一定時間段內進行使得所有活性劑皆可同時發揮其生物活性。該等化學治療劑之製備及投藥時間表可根據製造商之說明書使用或由熟習此項技術者根據經驗來確定。該等化學療法之製備及投藥時間表亦闡述於The Chemotherapy Source Book，第4版，2008,M.C.Perry編輯，Lippincott,Williams & Wilkins,Philadelphia,PA中。

有用類別之化學治療劑包括(例如)抗微管蛋白藥劑、奧裡斯他汀(auristatin)、DNA小溝結合劑、DNA複製抑制劑、烷基化劑(例如，鉑複合體，例如順鉑、單(鉑)、雙(鉑)及三核鉑複合體及卡鉑)、蒽環、抗生素、抗葉酸劑、抗代謝物、化學療法敏化劑、多卡米星(duocarmycin)、依託泊苷、氟化嘧啶、離子載體、來西托辛(lexitropsin)、亞硝基脲、鉑帝爾(platinol)、嘌呤抗代謝物、嘌呤黴素(puromycin)、輻射敏化劑、類固醇、紫杉烷、拓樸異構酶抑制劑、長春花生物鹼(vinca alkaloid)或諸如此類。在某些實施例中，第二治療劑係烷基化劑、抗代謝物、抗有絲分裂劑、拓樸異構酶(topoisomerase)抑制劑或血管生成抑制劑。

可用於本發明中之化學治療劑包括(但不限於)烷基化劑，例如噻替派(thiotepa)及環磷醯胺(癌得星(CYTOXAN))；磺酸烷基酯，例如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)及哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶，例如苯并多巴(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、美妥替哌(meturedopa)及烏瑞替哌(uredopa)；次乙亞胺及甲基蜜胺，包括六甲蜜胺(altretamine)、三乙烯三聚氰胺、三伸乙基磷醯胺、三伸乙基硫代磷醯胺及三羥甲基蜜胺；氮芥，例如(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、氯磷醯胺、雌氮芥、異環磷醯胺、甲基二氯乙基胺、氫氯酸氧氮芥(mechiorethamine oxide hydrochloride)、美法侖、新氮芥(novembichin)、膽甾醇對苯乙酸氮芥(phenesterine)、潑尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥(uracil mustard)；亞硝基脲，例如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)、雷莫司汀(ranimnustine)；抗生素，例如阿克拉黴素(aclacinomysin)、放線菌素、歐洛黴素(authramycin)、偶氮絲胺酸、博萊黴素(bleomycin)、放線菌素c、卡奇黴素(calicheamicin)、卡柔比星(carabicin)、卡波黴素(carnomycin)、嗜癌黴素(carzinophilin)、色黴素(chromomycin)、放線菌素D、道諾黴素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-二偶氮-5-側氧基-L-正白胺酸、多柔比星、泛艾黴素(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊達比星、麻西羅黴素(marcellomycin)、絲裂黴素、黴酚酸(mycophenolic acid)、諾拉黴素(nogalamycin)、橄欖黴素(olivomycins)、培洛黴素(peplomycin)、泊非黴素(potfiromycin)、嘌呤黴素、三鐵阿黴素(quelamycin)、羅多比星(rodorubicin)、鏈黑黴素(streptonigrin)、鏈脲黴素(streptozocin)、殺結核菌素(tubercidin)、烏苯美司(ubenimex)、淨司他汀(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代謝物，例如胺甲喋呤及5-氟尿嘧啶(5-FU)；葉酸類似物，例如二甲葉酸、胺甲喋呤、蝶羅呤(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤類似物，例如氟達拉濱、6-巰嘌呤、硫咪嘌呤、硫鳥嘌呤；嘧啶類似物，例如安西他濱(ancitabine)、阿紮胞苷、6-氮雜尿苷、卡莫氟(carmofur)、胞嘧啶阿拉伯糖苷、二去氧尿苷、去氧尿苷(doxifluridine)、依諾他濱(enocitabine)、氟尿苷、5-FU；雄激素，例如卡普睪酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮 (dromostanolone propionate)、環硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睪內酯；抗腎上腺，例如胺魯米特(aminoglutethimide)、米托坦、曲洛司坦(trilostane)；葉酸補充劑，例如醛葉酸；醋葡醛內酯；醛磷醯胺醣苷；胺基乙醯丙酸；安吖啶(amsacrine)；貝拉布昔(bestrabucil)；比生群(bisantrene)；依達曲沙(edatraxate)；地磷醯胺(defofamine)；秋水仙胺(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；伊爾福尼辛(elformithine)；依利醋銨(elliptinium acetate)；依託格魯(etoglucid)；硝酸鎵；羥基脲；香菇多醣；氯尼達明(lonidamine)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌；莫哌達醇(mopidamol)；硝胺丙吖啶(nitracrine)；噴司他汀(pentostatin)；蛋胺氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；足葉草酸(podophyllinic acid)；2-乙基醯肼；丙卡巴肼(procarbazine)；PSK；雷佐生(razoxane)；西佐喃(sizofuran)；鍺螺胺(spirogermanium)；替奴佐酸(tenuazonic acid)；三亞胺醌；2,2',2"-三氯三乙胺；胺基甲酸酯；長春地辛；達卡巴嗪；甘露莫司汀(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴衛矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；加賽特辛(gacytosine)；阿糖胞苷(arabinoside)(Ara-C)；類紫杉醇，例如太平洋紫杉醇(紫杉醇)及多西他賽(剋癌易(TAXOTERE))；氮芥苯丁酸；吉西他濱；6-硫鳥嘌呤；巰嘌呤；鉑類似物，例如順鉑及卡鉑；長春鹼；鉑；依託泊苷(VP-16)；異環磷醯胺；絲裂黴素C；米托蒽醌；長春新鹼；長春瑞濱；溫諾平；能滅瘤(novantrone)；替尼泊苷(teniposide)；道諾黴素；胺喋呤；伊班膦酸鹽(ibandronate)；CPT11；拓樸異構酶抑制劑RFS 2000；二氟甲基鳥胺酸(DMFO)；視黃酸；埃斯培拉黴素(esperamicin)；卡培他濱(希羅達 (XELODA))；及任一上述之醫藥上可接受之鹽、酸或衍生物。化學治療劑亦包括調控或抑制激素對腫瘤之作用之抗激素劑，例如抗雌激素，包括(例如)他莫昔芬、雷洛昔芬、芳香酶抑制性4(5)-咪唑、4羥基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、可昔芬(keoxifene)、LY117018、奧那司酮(onapristone)及托瑞米芬(弗瑞斯)；及抗雄激素，例如氟他胺(flutamide)、尼魯米特(nilutamide)、比卡魯胺(bicalutamide)、亮丙瑞林及戈舍瑞林(goserelin)；及任一上述之醫藥上可接受之鹽、酸或衍生物。在某些實施例中，其他治療劑係順鉑。在某些實施例中，其他治療劑係卡鉑。

在某些實施例中，化學治療劑係拓樸異構酶抑制劑。拓樸異構酶抑制劑係干擾拓樸異構酶(例如，拓樸異構酶I或II)之作用之化學治療劑。拓樸異構酶抑制劑包括(但不限於)鹽酸多柔比星、檸檬酸道諾黴素、鹽酸米托蒽醌、放線菌素D、依託泊苷、鹽酸托泊替康、替尼泊苷(VM-26)及伊立替康，以及該等化合物中之任一者之醫藥上可接受之鹽、酸或衍生物。在一些實施例中，該其他治療劑係伊立替康。

在某些實施例中，化學治療劑係抗代謝物。抗代謝物係具有與正常生物化學反應所需代謝物類似之結構之化學品，但不同的係足以干擾細胞之一或多種正常功能，例如細胞分裂。抗代謝物包括(但不限於)吉西他濱、氟尿嘧啶、卡培他濱、胺甲喋呤鈉、雷替曲塞(ralitrexed)、培美曲塞(pemetrexed)、替加氟(tegafur)、胞嘧啶阿拉伯糖苷、硫鳥嘌呤、5-氮胞苷、6巰嘌呤、硫唑嘌呤、6-硫鳥嘌呤、噴司他汀、磷酸氟達拉濱及克拉屈濱、以及該等化合物中之任一者之醫藥上可接受之鹽、酸或衍生物。在某些實施例中，其他治療劑係吉西他濱。

在某些實施例中，化學治療劑係抗有絲分裂劑，包括(但不限於)結合微管蛋白之藥劑。在一些實施例中，藥劑係紫杉烷。在某些實施例中，藥劑係太平洋紫杉醇或多西他賽或太平洋紫杉醇或多西他賽之醫藥上可接受之鹽、酸或衍生物。在某些實施例中，藥劑係太平洋紫杉醇(紫杉醇)、多西他賽(剋癌易)、白蛋白結合之太平洋紫杉醇(亞伯杉烷(ABRAXANE))、DHA-太平洋紫杉醇或PG-太平洋紫杉醇。在某些替代實施例中，抗有絲分裂劑包含長春花生物鹼，例如長春新鹼、長春鹼、長春瑞濱或長春地辛或其醫藥上可接受之鹽、酸或衍生物。在一些實施例中，抗有絲分裂劑係驅動蛋白Eg5之抑制劑或有絲分裂激酶之抑制劑(例如奧羅拉A(Aurora A)或Plk1)。在某些實施例中，其他治療劑係太平洋紫杉醇。在一些實施例中，其他治療劑係白蛋白結合之太平洋紫杉醇。

在一些實施例中，另一治療劑包含諸如小分子等藥劑。例如，治療可涉及本發明藥劑與充當對抗腫瘤相關性抗原之抑制劑之小分子(包括(但不限於)EGFR、HER2(ErbB2)及/或VEGF)之組合投與。在一些實施例中，本發明藥劑係與選自由以下組成之群之蛋白激酶抑制劑組合投與：吉非替尼(艾瑞莎)、厄洛替尼(得舒緩)、舒尼替尼(舒癌特)、拉帕替尼、凡德他尼(ZACTIMA)、AEE788、CI-1033、西地尼布(cediranib)(瑞斯汀)、索拉菲尼(蕾莎瓦)及帕唑帕尼(GW786034B)。在一些實施例中，另一治療劑包含mTOR抑制劑。在另一實施例中，其他治療劑係減少Treg細胞之數量之化學療法或其他抑制劑。在某些實施例中，治療劑係環磷醯胺或抗CTLA4抗體。在另一實施例中，其他治療劑減少骨髓樣源抑制劑細胞之存在。在另一實施例中，其他治療劑係卡鉑紫杉醇。在另一實施例中，其他治療劑將細胞移位至1型T輔助細胞反應。在另一實施例中，其 他治療劑係依魯替尼。

在一些實施例中，另一治療劑包含生物分子，例如抗體。例如，治療可涉及本發明藥劑與對抗腫瘤相關性抗原之抗體(包括(但不限於)結合EGFR、HER2/ErbB2及/或VEGF之抗體)之組合投與。在某些實施例中，其他治療劑係對癌症幹細胞標記物具有特異性之抗體。在某些實施例中，其他治療劑係為血管生成抑制劑之抗體(例如，抗VEGF或VEGF受體抗體)。在某些實施例中，其他治療劑係貝伐珠單抗(癌思停)、雷莫蘆單抗、曲妥珠單抗(賀癌平)、帕妥珠單抗(奧密塔克(OMNITARG))、帕尼單抗(維必施)、尼妥珠單抗(nimotuzumab)、紮魯木單抗(zalutumumab)或西妥昔單抗(爾必得舒)。

本文所提供之藥劑及組合物可單獨或與習用治療方案(例如手術、輻照、化學療法及/或骨髓移植(自體、同基因、同種異體或不相關))組合使用。例如，在大部分癌症患者中可使用一組腫瘤抗原。

在一些實施例中，除包含免疫原性疫苗之組合物以外，可投與至少一或多種化學治療劑。在一些實施例中，該一或多種化學治療劑可屬不同類別之化學治療劑。

化學治療劑之實例包括(但不限於)烷基化劑，例如氮芥(例如甲基二氯乙基胺(氮芥)、氮芥苯丁酸、環磷醯胺(癌得星®)、異環磷醯胺及美法侖)；亞硝基脲(例如N-亞硝基-N-甲基脲、鏈脲黴素、卡莫司汀(BCNU)、洛莫司汀及司莫司汀)；磺酸烷基酯(例如白消安)；四嗪(例如達卡巴嗪(DTIC)、米托唑胺(mitozolomide)及替莫唑胺(特莫多®)(temozolomide(Temodar®))；氮丙啶(例如噻替派、絲裂黴素C及地吖醌)；及鉑藥物(例如順鉑、卡鉑及奧沙利鉑)；非古典烷基化劑，例如丙卡巴肼及六甲蜜胺 (六甲基三聚氰胺)；抗代謝劑，例如5-氟尿嘧啶(5-FU)、6-巰嘌呤(6-MP)、卡培他濱(截瘤達®)、克拉屈濱、氯法拉濱(clofarabine)、阿糖胞苷(Ara-C®)、地西他濱、氟尿苷、氟達拉濱、奈拉濱(nelarabine)、吉西他濱(健擇®(Gemzar®))、羥基脲、胺甲喋呤、培美曲塞(愛甯達®(Alimta®))、噴司他汀、硫鳥嘌呤、委丹紮；抗微管藥劑，例如長春花生物鹼(例如長春新鹼、長春鹼、長春瑞濱、長春地辛及長春氟寧(vinflunine))；紫杉烷(例如太平洋紫杉醇(紫杉醇®)、多西他賽(剋癌易®))；鬼臼毒素(例如依託泊苷及替尼泊苷)；埃博黴素(epothilone)(例如伊沙匹隆(易莎平®)(ixabepilone(Ixempra®)))；雌氮芥(癌卡特®(Emcyt®))；抗腫瘤抗生素，例如蒽環(例如道諾黴素、多柔比星(阿德力黴素®(Adriamycin®)、泛艾黴素、伊達比星)；放線菌素-D；及博來黴素；拓樸異構酶I抑制劑，例如托泊替康及伊立替康(CPT-11)；拓樸異構酶II抑制劑，例如依託泊苷(VP-16)、替尼泊苷、米托蒽醌、新生黴素(novobiocin)、麥爾巴隆(merbarone)及阿柔比星(aclarubicin)；皮質類固醇，例如普賴松(prednisone)、甲基普賴蘇濃(索魯美卓Solumedrol®)(methylprednisolone(Solumedrol®))及地塞米松(德卡德隆®(Decadron®))；L-天冬醯胺酶；硼替佐米(萬科®)；免疫治療劑，例如利妥昔單抗(瑞圖宣®)、阿倫單抗(坎帕斯®)、沙利竇邁、雷利竇邁(lenalidomide)(瑞複美®)、BCG、介白素-2、干擾素-α及癌症疫苗(例如普萬吉®(Provenge®))；激素治療劑，例如氟維司群(法洛德®)、他莫昔芬、托瑞米芬(弗瑞斯®)、阿那曲唑(安美達®)、依西美坦(諾曼癌素®)、來曲唑(複乳納®)、乙酸甲地孕酮(梅格施®(Megace®))、雌激素、比卡魯胺(可蘇多®(Casodex®))、氟他胺(艾樂辛®(Eulexin®))、尼魯米特(尼蘭 德龍®(Nilandron®))、柳培林(柳菩林®(Lupron®))及戈舍瑞林(諾雷德®(Zoladex®))；分化劑，例如類視色素、維甲酸(ATRA或阿曲林®(Atralin®))、貝沙羅汀(他瑞替®)及三氧化砷(阿森諾®(Arsenox®))；及靶向治療劑，例如伊馬替尼(基利克®(Gleevec®))、吉非替尼(艾瑞莎®)及舒尼替尼(舒癌特®)。在一些實施例中，化學療法係雞尾酒療法。雞尾酒療法之實例包括(但不限於)CHOP/R-CHOP(瑞圖宣、環磷醯胺、羥基多柔比星、長春新鹼及普賴松)、EPOCH(依託泊苷、普賴松、長春新鹼、環磷醯胺、羥基多柔比星)、Hyper-CVAD(環磷醯胺、長春新鹼、羥基多柔比星、地塞米松)、FOLFOX(氟尿嘧啶(5-FU)、甲醯四氫葉酸、奧沙利鉑)、ICE(異環磷醯胺、卡鉑、依託泊苷)、DHAP(高劑量阿糖胞苷[ara-C]、地塞米松、順鉑)、ESHAP(依託泊苷、甲基普賴蘇濃、阿糖胞苷[ara-C]、順鉑)及CMF(環磷醯胺、胺甲喋呤、氟尿嘧啶)。

在某些實施例中，另一治療劑包含第二免疫治療劑。在一些實施例中，該另一疫治療劑包括(但不限於)群落刺激因子、介白素、阻斷免疫抑制功能之抗體(例如，抗CTLA-4抗體、抗CD28抗體、抗CD3抗體、抗PD-1抗體、抗PD-L1抗體、抗TIGIT抗體)、增強免疫細胞功能之抗體(例如，抗GITR抗體、抗OX-40抗體、抗CD40抗體或抗4-1BB抗體)、類鐸受體(例如，TLR4,TLR7,TLR9)、可溶性配體(例如，GITRL,GITRL-Fc,OX-40L,OX-40L-Fc,CD40L,CD40L-Fc,4-1BB配體或4-1BB配體-Fc)或B7家族之成員(例如，CD80,CD86)。在一些實施例中，該另一免疫治療劑靶向CTLA-4、CD28、CD3、PD-1、PD-L1、TIGIT、GITR、OX-40、CD-40或4-1BB。

在一些實施例中，該另一治療劑係免疫檢查點抑制劑。在一些實施 例中，免疫檢查點抑制劑係抗PD-1抗體、抗PD-L1抗體、抗CTLA-4抗體、抗CD28抗體、抗TIGIT抗體、抗LAG3抗體、抗TIM3抗體、抗GITR抗體、抗4-1BB抗體或抗OX-40抗體。在一些實施例中，該另一治療劑係抗-TIGIT抗體。在一些實施例中，該另一治療劑係選自由以下組成之群之抗PD-1抗體：尼沃魯單抗(歐普迪沃(OPDIVO))、派姆單抗(KEYTRUDA)、匹地珠單抗(pidilzumab)、MEDI0680、REGN2810、BGB-A317及PDR001。在一些實施例中，該另一治療劑係選自由以下組成之群之抗PD-L1抗體：BMS935559(MDX-1105)、阿特利珠單抗(atexolizumab)(MPDL3280A)、德瓦魯單抗(MEDI4736)及阿維魯單抗(MSB0010718C)。在一些實施例中，該另一治療劑係選自由伊匹單抗(益伏)及曲美目單抗組成之群之抗CTLA-4抗體。在一些實施例中，該另一治療劑係選自由BMS-986016及LAG525組成之群之抗LAG-3抗體。在一些實施例中，該另一治療劑係選自由MEDI6469、MEDI0562及MOXR0916組成之群之抗OX-40抗體。在一些實施例中，該另一治療劑係選自由PF-05082566組成之群之抗4-1BB抗體。

在一些實施例中，新抗原治療劑可與選自由以下組成之群之生物分子組合投與：腎上腺髓質素(AM)、血管生成素(Ang)、BMP、BDNF、EGF、促紅血球生成素(EPO)、FGF、GDNF、顆粒球群落刺激因子(G-CSF)、顆粒球-巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF)、巨噬細胞群落刺激因子(M-CSF)、幹細胞因子(SCF)、GDF9、HGF、HDGF、IGF、遷移刺激因子、肌肉生長抑制素(GDF-8)、NGF、神經營養素、PDGF、促血小板生成素、TGF-α、TGF-β、TNF-α、VEGF、PlGF、γ-IFN、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12、IL-15及IL-18。

在一些實施例中，利用本文所述新抗原治療劑之治療可伴有手術移除腫瘤、移除癌細胞或治療醫師認為必需的任何其他手術療法。

在某些實施例中，治療涉及與放射療法組合投與本文所闡述之新抗原治療劑。利用藥劑之治療可在投與放射療法之前、與此並行或在此之後進行。該放射療法之投藥時間表可來由熟練的開業醫師來確定。

組合投與可包括以單一醫藥調配物或使用分開調配物進行共投與，或以任一順序連續投與，但通常在一段時間內進行使得所有活性劑皆可同時發揮其生物活性。

將瞭解本文所述新抗原治療劑及至少一種其他治療劑之組合可以任一順序或同時來投與。在一些實施例中，將該藥劑投與先前已進行第二治療劑治療之患者。在某些其他實施例中，將實質上同時或並行投與新抗原治療劑及第二治療劑。例如，可在進行利用第二治療劑(例如，化學療法)之療程之同時給予個體藥劑。在某些實施例中，將在利用第二治療劑治療之1年內投與新抗原治療劑。將進一步瞭解可在幾小時或幾分鐘內(即，實質上同時)將兩種(或更多種)藥劑或治療投與個體。

對於疾病之治療，本文所述新抗原治療劑之適當劑量取決於欲治療疾病之類型、疾病之嚴重性及病程、疾病之反應性、投與藥劑係用於治療抑或預防目的、先前療法、患者之病史等等，所有該等因素皆經過治療醫師的慎重考慮。可一次性投與新抗原治療劑或經一系列持續數天至數月之治療進行投與，或直至實現治癒或達成疾病狀態減輕(例如，腫瘤大小減小)為止。最佳投藥時間表可根據患者體內藥物累積之量測來計算且將端視個別藥劑之相對功效而變化。投與醫師可確定最佳劑量、投藥方法及重複率。

在一些實施例中，新抗原治療劑可以初始較高之「加載」劑量隨後一或多個較低之劑量來投與。在一些實施例中，亦可改變投與頻率。在一些實施例中，投藥方案可包含投與初始劑量，隨後一週一次、每兩週一次、每三週一次或每月一次投與額外劑量(或「維持」劑量)。例如，投藥方案可包含投與初始加載劑量，隨後每週投與(例如)初始劑量之一半之維持劑量。或投藥方案可包含投與初始加載劑量，隨後每隔一週投與維持劑量，例如初始劑量之一半。或投藥方案可包含3週投與三個初始劑量，隨後每隔一週投與(例如)相同量之維持劑量。

如熟習此項技術者已知，任一治療劑之投與可導致副作用及/或毒性。在一些情形下，副作用及/或毒性如此嚴重以致阻礙以治療有效劑量投與具體藥劑。在一些情形下，必須中斷療法，且可嘗試其他藥劑。然而，同一治療類別中之許多藥劑展現類似的副作用及/或毒性，意味著患者必須終止療法或(若可能)遭受與治療劑相關之令人不快的副作用。

在一些實施例中，投藥時間表可限於特定的投與數量或「循環」。在一些實施例中，該藥劑係投與3個、4個、5個、6個、7個、8個或更多個循環。例如，該藥劑每2週投與6個循環，該藥劑每3週投與6個循環，該藥劑每2週投與4個循環，該藥劑每3週投與4個循環等等。投藥時間表可由熟習此項技術者來決定且隨後由其進行修改。

本發明提供向個體投與本文所闡述之新抗原治療劑之方法，其包含使用間歇投藥策略來投與一或多種藥劑，此可降低與藥劑、化學治療劑等之投與相關之副作用及/或毒性。在一些實施例中，治療人類個體之癌症之方法包含與治療有效劑量之化學治療劑組合向個體投與治療有效劑量之新抗原治療劑，其中該等藥劑中之一者或二者係根據間歇投藥策略來投 與。在一些實施例中，治療人類個體之癌症之方法包含與治療有效劑量之第二免疫治療劑組合向個體投與治療有效劑量之新抗原治療劑，其中該等藥劑中之一者或二者係根據間歇投藥策略來投與。在一些實施例中，間歇投藥策略包含向個體投與初始劑量之新抗原治療劑，及約每2週一次投與後續劑量之藥劑。在一些實施例中，間歇投藥策略包含向個體投與初始劑量之新抗原治療劑，及約每3週一次投與後續劑量之藥劑。在一些實施例中，間歇投藥策略包含向個體投與初始劑量之新抗原治療劑，及約每4週一次投與後續劑量之藥劑。在一些實施例中，該藥劑係使用間歇投藥策略來投與且該另一治療劑係每週進行投與。

本發明提供包含本文所闡述之新抗原治療劑之組合物。本發明亦提供包含本文所闡述之新抗原治療劑及醫藥上可接受之媒劑之醫藥組合物。在一些實施例中，醫藥組合物可用於免疫療法中。在一些實施例中，組合物可用於抑制腫瘤生長。在一些實施例中，醫藥組合物可用於抑制個體(例如，人類患者)之腫瘤生長。在一些實施例中，組合物可用於治療癌症。在一些實施例中，醫藥組合物可用於治療個體(例如，人類患者)之癌症。

藉由組合本發明之新抗原治療劑與醫藥上可接受之媒劑(例如，載劑或賦形劑)來製備調配物用於儲存及使用。熟習此項技術者通常視醫藥上可接受之載劑、賦形劑及/或穩定劑為調配物或醫藥組合物之無活性成分。實例性調配物列示於WO 2015/095811中。

適宜醫藥上可接受之媒劑包括(但不限於)無毒性緩衝劑，例如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸；鹽，例如氯化鈉；抗氧化劑，包括抗壞血酸及甲硫胺酸；防腐劑，例如十八烷基二甲基苄基氯化銨、氯化六羥季銨、 氯化苄烷銨、氯化本索寧(benzethonium chloride)、苯酚、丁醇或苄醇，對羥苯甲酸烷基酯，例如對羥苯甲酸甲基酯或丙基酯、兒茶酚、間苯二酚、環己醇、3-戊醇及間甲酚；低分子量多肽(例如，小於約10個胺基酸殘基)；蛋白質，例如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，例如聚乙烯基吡咯啶酮；胺基酸，例如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺、組胺酸、精胺酸或離胺酸；碳水化合物，例如單醣、二醣、葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，例如EDTA；糖，例如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成鹽相對離子，例如鈉；金屬錯合物，例如Zn-蛋白質錯合物；及非離子型表面活性劑，例如TWEEN或聚乙二醇(PEG)。(Remington：The Science and Practice of Pharmacy，第22版，2012,Pharmaceutical Press,London.)。在一些實施例中，媒劑係5%右旋糖水溶液。

本文所闡述之醫藥組合物可以任何數量之方式投與用於局部或全身治療。投與可藉由經表皮或經皮貼劑、軟膏劑、洗劑、乳霜、凝膠、滴劑、栓劑、噴霧劑、液體及粉末之局部投與；藉由吸入或吹入粉末或氣溶膠(包括藉由霧化器、氣管內及鼻內)之經肺投與；經口投與；或非經腸投與，包括靜脈內、動脈內、腫瘤內、皮下、腹膜內、肌內(例如，注射或輸注)或顱內(例如，鞘內或室內)投與。

治療調配物可呈單位劑型。該等調配物包括錠劑、丸劑、膠囊、粉末、顆粒、於水或非水性培養基中之溶液或懸浮物或栓劑。

本文所闡述之新抗原肽亦可裝入微膠囊中。該等微膠囊分別藉由(例如)凝聚技術或藉由界面聚合來製備，例如，羥甲基纖維素或明膠-微膠囊及聚-(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊，於膠體藥物遞送系統中(例如，脂質體、白蛋白微球體、微乳液、奈米粒子及奈米膠囊)或於巨乳液中，如 Remington：The Science and Practice of Pharmacy，第22版，2012,Pharmaceutical Press,London中所闡述。

在某些實施例中，醫藥調配物包括與脂質體複合之本文所闡述之新抗原治療劑。用於產生脂質體之方法已為熟習此項技術者熟知。例如，一些脂質體可藉由反相蒸發利用包含磷酯醯膽鹼、膽固醇及PEG衍生之磷脂醯乙醇胺(PEG-PE)之脂質組合物來生成。經由具有界定孔徑之濾膜可擠出脂質體以獲得具有期望直徑之脂質體。

在某些實施例中，可產生包含本文所闡述之新抗原肽之持續釋放型製劑。持續釋放型製劑之適宜實例包括含有藥劑之固體疏水性聚合物之半透性基質，其中基質呈成形物件之形式(例如，膜或微膠囊)。持續釋放型基質之實例包括聚酯、水凝膠(例如，聚(甲基丙烯酸-2-羥基乙酯)或聚(乙烯醇))、聚乳酸、L-麩胺酸與L-麩胺酸7乙酯之共聚物、不可降解之乙烯-乙酸乙烯酯、可降解之乳酸-乙醇酸共聚物(例如柳菩林DEPOT^TM，由乳酸-乙醇酸共聚物及乙酸亮丙瑞林構成之可注射微球體)及聚-D-(-)-3-羥基丁酸。

本揭示內容提供包含免疫原性疫苗之治療方法。提供治療疾病(例如癌症或病毒感染)之方法。方法可包含向個體投與有效量之包含免疫原性抗原之組合物。在一些實施例中，抗原包含病毒抗原。在一些實施例中，抗原包含腫瘤抗原。

可製備之疫苗之非限制性實例包括基於肽之疫苗、基於核酸之疫苗、基於抗體之疫苗、基於T細胞之疫苗及基於抗原呈遞細胞之疫苗。

疫苗組合物可使用一或多種促進活性劑處理成可在醫藥上使用之製劑之生理上可接受之載劑(包括賦形劑及助劑)來調配。適當調配物可取決 於所選投與途徑。可如業內所瞭解使用適宜的熟知技術、載劑及賦形劑中之任一者。

在一些情形下，疫苗組合物係調配為基於肽之疫苗、基於核酸之疫苗、基於抗體之疫苗或基於細胞之疫苗。例如，疫苗組合物可包括於陽離子脂質調配物中之裸cDNA；脂肽(例如，Vitiello,A.等人，J.Clin.Invest.95：341,1995)、囊封在(例如)聚(DL-乳酸交酯-共-乙交酯)(「PLG」)微球體中之裸cDNA或肽(例如，參見Eldridge等人，Molec.Immunol.28：287-294,1991：Alonso等人，Vaccine 12：299-306,1994；Jones等人，Vaccine 13：675-681,1995)；含於免疫刺激複合體(ISCOMS)中之肽組合物(例如，Takahashi等人，Nature 344：873-875,1990；Hu等人，Clin Exp Immunol.113：235-243,1998)；或多抗原肽系統(MAP)(見例如Tam,J.P.,Proc.Natl Acad.Sci.U.S.A.85：5409-5413,1988；Tarn,J.P.,J.Immunol.Methods 196：17-32,1996)。有時，疫苗係調配為基於肽之疫苗或基於核酸之疫苗，其中核酸編碼多肽。有時，疫苗係調配為基於抗體之疫苗。有時，疫苗係調配為基於細胞之疫苗。

可使用經鑑別疾病特異性免疫原性新抗原肽之胺基酸序列來研發醫藥上可接受之組合物。抗原之來源可為(但不限於)天然或合成蛋白，包括醣蛋白、肽及超抗原；抗體/抗原複合體；脂蛋白；RNA或其轉譯產物；及DNA或由DNA編碼之多肽。抗原之來源亦可包含未轉變、經轉變、經轉染或經轉導之細胞或細胞系。細胞可使用可用於表現重組抗原之熟習此項技術者已知之各種表現或反轉錄病毒載體中之任一者來轉變、轉染或轉導。表現亦可在已經含有編碼重組抗原之DNA分子之表現或反轉錄病毒載體轉變、轉染或轉導之任一適當宿主細胞中達成。可使用任何數量之為 熟習此項技術者已知之轉染、轉變及轉導方案。可使用經牛痘載體感染之重組牛痘載體及細胞作為抗原之來源。

組合物可包含合成的疾病特異性免疫原性新抗原肽。組合物可包含兩種或更多種疾病特異性免疫原性新抗原肽。組合物可包含疾病特異性免疫原性肽之前體(例如蛋白質、肽、DNA及RNA)。疾病特異性免疫原性肽之前體可生成經鑑別之疾病特異性免疫原性新抗原肽或根據該新抗原肽來生成。在一些實施例中，治療性組合物包含免疫原性肽之前體。疾病特異性免疫原性肽之前體可為前藥。在一些實施例中，包含疾病特異性免疫原性新抗原肽之組合物可進一步包含佐劑。例如，可利用新抗原肽作為疫苗。在一些實施例中，免疫原性疫苗可包含醫藥上可接受之免疫原性新抗原肽。在一些實施例中，免疫原性疫苗可包含免疫原性新抗原肽之醫藥上可接受之前體(例如蛋白質、肽、DNA及RNA)。在一些實施例中，治療方法包含向個體投與有效量之特異性識別免疫原性新抗原肽之抗體。在一些實施例中，治療方法包含向個體投與有效量之特異性識別免疫原性新抗原肽之可溶性TCR或TCR類似物。

本文所闡述之方法在個人化醫學背景中尤其有用，其中使用免疫原性新抗原肽為相同個體研發治療劑(例如疫苗或治療性抗體)。因此，治療個體之疾病之方法可包含根據本文所闡述之方法在個體中鑑別免疫原性新抗原肽；及合成肽(或其前體)；及向個體投與肽或特異性識別該肽之抗體。在一些實施例中，免疫原性新抗原表現型式可用作患者特異性疫苗之生成之必要基礎。在一些實施例中，免疫原性新抗原之表現型式可用作一組患有特定疾病之患者之疫苗之生成之必要基礎。因此，可在患者群組中選擇性地治療特定疾病(例如，特定類型腫瘤)。

在一些實施例中，本文所闡述之肽係結構上正常(「共有」)之抗原，其可在大患者群組中被自體抗疾病T細胞識別。在一些實施例中，確定疾病表現結構上正常(「共有」)之新抗原之一組患病個體之抗原-表現型式。

存在產生免疫原性新抗原之各種方式。可藉由熟習此項技術者已知之任一技術來製備蛋白質或肽，該技術包括藉助標準分子生物技術表現蛋白質、多肽或肽、自天然來源分離蛋白質或肽、活體外轉譯或化學合成蛋白質或肽。一般而言，該等疾病特異性新抗原可在活體外或活體內產生。免疫原性新抗原可在活體外以肽或多肽之形式產生，然後可將該等肽或多肽調配成個人化疫苗或免疫原性組合物並將其投與個體。免疫原性新抗原之活體外產生可包含肽合成或在各種細菌、真核或病毒重組體表現系統中之任一者中自DNA或RNA分子表現肽/多肽，隨後純化所表現肽/多肽。另一選擇為，可藉由以下在活體內產生免疫原性新抗原：將編碼免疫原性新抗原之分子(例如，DNA、RNA及病毒表現系統)引入個體中，此後表現所編碼之免疫原性新抗原。在一些實施例中，可使用編碼免疫原性新抗原肽之多核苷酸在活體外產生新抗原肽。

在一些實施例中，多核苷酸包含與編碼免疫原性新抗原之多核苷酸具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性之序列。

多核苷酸可為(例如)單鏈及/或雙鏈之DNA、cDNA、PNA、CAN、RNA、多核苷酸之天然或經穩定形式或其組合。編碼免疫原性新抗原肽之核酸可或可不含內含子，只要其編碼肽即可。在一些實施例中，使用活體外轉譯產生肽。

本發明亦涵蓋包含編碼新抗原之序列之表現載體以及含有表現載體之宿主細胞。適用於本發明中之表現載體可包含至少一個可操作連接至核酸序列之表現控制元件。表現控制元件係插入載體中以控制並調控核酸序列之表現。表現控制元件之實例已為業內熟知且包括(例如)lac系統、λ噬菌體之操縱子及啟動子區、酵母啟動子及衍生自多瘤、腺病毒、反轉錄病毒或SV40之啟動子。其他操縱元件包括(但不限於)前導序列、終止密碼子、多聚腺苷酸化信號及對於在宿主系統中適當的轉錄及後續轉譯核酸序列所必需或較佳之任何其他序列。熟習此項技術者將瞭解表現控制元件之正確組合將取決於所選宿主系統。將進一步瞭解表現載體應含有為在宿主系統中轉移及後續複製含有核酸序列之表現載體所必需之其他元件。該等元件之實例包括(但不限於)複製起點及可選標記物。

新抗原肽可以編碼期望新抗原肽之RNA或cDNA分子之形式提供。一或多種本發明新抗原肽可由單一表現載體編碼。通常，將DNA以適當定向及正確閱讀框插入表現載體(例如質體)中用於表現，若需要，則可將DNA連接至由期望宿主(例如，細菌)識別之適當轉錄及轉譯調節控制核苷酸序列，但該等控制通常用於表現載體中。然後將載體引入宿主細菌中以使用標準技術進行選殖。可用於真核宿主、尤其哺乳動物或人類之表現載體包括(例如)包含來自SV40、牛乳頭瘤病毒、腺病毒及巨細胞病毒之表現控制序列之載體。可用於細菌宿主之表現載體包括已知細菌質體，例如來自大腸桿菌之質體(包括pCR 1、pBR322、pMB9及其衍生物)、更寬宿主範圍之質體(例如M13及絲狀單鏈DNA噬菌體)。

在實施例中，編碼所關注多肽之DNA序列可藉由使用寡核苷酸合成器進行化學合成來構築。該等寡核苷酸可基於期望多肽之胺基酸序列且藉 由選擇彼等在產生所關注重組多肽之宿主細胞中有利之密碼子來設計。可應用標準方法來合成編碼所關注經分離多肽之經分離之聚核苷酸序列。

適於表現多肽之宿主細胞包括在適當啟動子控制下之原核生物、酵母、昆蟲或高等真核細胞。原核生物包括革蘭氏陰性或革蘭氏陽性有機體，例如大腸桿菌或桿菌屬。高等真核細胞包括哺乳動物來源之已確立細胞系。亦可採用無細胞轉譯系統。適於與細菌、真菌、酵母及哺乳動物細胞宿主一起使用之選殖及表現載體已為業內所熟知。可採用各種哺乳動物或昆蟲細胞培養系統來表現重組蛋白。實例性哺乳動物宿主細胞系包括(但不限於)COS-7、L細胞、C127、3T3、中國倉鼠卵巢(CHO)、293、HeLa及BHK細胞系。哺乳動物表現載體可包含非轉錄元件，例如複製起點、連接至欲表現基因之適宜啟動子及增強子及其他5’或3’側翼非轉錄序列及5’或3’非轉譯序列，例如必需的核糖體結合位點、多聚腺苷酸化位點、剪接供體及受體位點及轉錄終止序列。

由經轉變宿主產生之蛋白質可根據任何適宜方法來純化。該等標準方法包括層析(例如，離子交換、親和性及粒度分級管柱層析及諸如此類)、離心、差別溶解度或藉由用於蛋白質純化之任何其他標準技術。可將親和性標籤(例如六組胺酸(SEQ ID NO：1834)、麥芽糖結合結構域、流行性感冒外殼序列、麩胱甘肽-S-轉移酶及諸如此類)附接至蛋白質以容許藉由通過適當親和管柱容易地純化。亦可使用諸如蛋白質分解、核磁共振及x射線結晶學等技術以物理方式表徵經分離蛋白質。

疫苗可包含結合本文所闡述之多肽序列之實體。該實體可為抗體。可使用如業內所瞭解之適宜的熟知技術、載劑及賦形劑中之任一者調配基於抗體之疫苗。在一些實施例中，可使用本文所闡述之肽來製備新抗原特 異性治療劑(例如抗體治療劑)。例如，可使用新抗原來提高及/或鑑別特異性識別新抗原之抗體。該等抗體可用作治療劑。抗體可為天然抗體、嵌合抗體、人類化抗體或可為抗體片段。抗體可識別本文所述多肽中之一或多者。抗體可識別具有與本文所述多肽具有至多40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或更小之序列同源性之序列之多肽。抗體可識別具有與本文所述多肽具有至少40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或更大之序列同源性之序列之多肽。抗體亦可識別序列長度為本文所述多肽之序列長度之至少30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或更大之多肽。抗體可識別序列長度為本文所述多肽之序列長度之至多30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或更小之多肽。

本發明亦涵蓋核酸分子之用途，其係作為媒劑以(例如)DNA/RNA疫苗之形式在活體內向有需要之個體遞送新抗原肽/多肽。

在一些實施例中，疫苗係核酸疫苗。在一些實施例中，可藉由使用質體向個體投與新抗原。可藉由多種不同的方法將質體引入動物組織中，例如，將裸DNA注射或氣溶膠滴注於黏膜表面(例如鼻及肺黏膜)上。在一些實施例中，可使用例如利用「基因槍」之物理遞送。表現載體之確切選擇可取決於欲表現之肽/多肽，且已為熟習此項技術者熟知。

在一些實施例中，核酸編碼免疫原性肽或肽前體。在一些實施例中，核酸疫苗包含側接編碼免疫原性肽或肽前體之序列之序列。在一些實施例中，核酸疫苗包含一個以上免疫原性表位。在一些實施例中，核酸疫苗係基於DNA之疫苗。在一些實施例中，核酸疫苗係基於RNA之疫苗。在一些實施例中，基於RNA之疫苗包含mRNA。在一些實施例中，基於RNA之疫苗包含裸mRNA。在一些實施例中，基於RNA之疫苗包含經修 飾mRNA(例如，經保護免予魚精蛋白降解之mRNA、含有經修飾5’帽結構之mRNA或含有經修飾核苷酸之mRNA)。在一些實施例中，基於RNA之疫苗包含單鏈mRNA。

多核苷酸可實質上純淨或含於適宜載體或遞送系統中。適宜載體及遞送系統包括病毒，例如基於腺病毒、牛痘病毒、反轉錄病毒、皰疹病毒、腺相關病毒或含有一種以上病毒之要素之雜合病毒之系統。非病毒遞送系統包括陽離子脂質及陽離子聚合物(例如，陽離子脂質體)。

可使用基於病毒之系統在活體內編碼及表現一或多種新抗原肽。在本發明中可使用病毒載體作為重組載體，其中使病毒基因體之一部分缺失以引入新基因而不破壞病毒之感染性。本發明之病毒載體係非致病性病毒。在一些實施例中，病毒載體在哺乳動物中具有特定細胞類型之向性。在另一實施例中，本發明之病毒載體能感染專業抗原呈遞細胞(例如樹突細胞及巨噬細胞)。在本發明之再一實施例中，病毒載體能感染哺乳動物中之任一細胞。病毒載體亦可感染腫瘤細胞。用於本發明中之病毒載體包括(但不限於)痘病毒(例如牛痘病毒、禽痘病毒、雞痘病毒及高度減弱之牛痘病毒(安卡拉或MVA))、反轉錄病毒、腺病毒、桿狀病毒及諸如此類。

可經由各種途徑遞送疫苗。遞送途徑可包括經口(包括經頰及經舌下)、經直腸、經鼻、局部、經皮貼劑、經肺、經陰道、栓劑或非經腸(包括肌內、動脈內、鞘內、真皮內、腹膜內、皮下及靜脈內)投與，或呈適於藉由氣溶膠化、吸入或吹入投與之形式。關於藥物遞送系統之一般資訊可參見Ansel等人，Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems(Lippencott Williams & Wilkins,Baltimore Md.(1999)。本文 所闡述之疫苗可投與肌肉或可經由真皮內或皮下注射或以經皮方式(例如藉由離子電滲)來投與。可採用疫苗之表皮投與。

在一些情形中，亦可調配疫苗用於經由鼻道投與。載劑為固體之適於經鼻投與之調配物可包括粒徑(例如)在約10微米至約500微米範圍內之粗粉末，其係以採取鼻煙之方式來投與，即經由鼻道自保持緊靠鼻子之粉末容器快速吸入。調配物可為鼻噴霧劑、鼻滴劑或藉由霧化器之氣溶膠投與。調配物可包括疫苗之水性或油性溶液。

疫苗可為液體製劑，例如懸浮液、糖漿或酏劑。疫苗亦可為用於非經腸、皮下、真皮內、肌內或靜脈內投與(例如，可注射投與)之製劑，例如無菌懸浮液或乳液。

疫苗可包括用於單次免疫之材料，或可包括用於多次免疫之材料(即「多劑量」套組)。較佳以多劑量佈置納入防腐劑。作為在多劑量組合物中納入防腐劑之替代(或除此之外)，可將組合物含於具有用於移除材料之無菌連接器之容器中。

疫苗可以約0.5mL之劑量體積投與，但兒童可投與一半劑量(即約0.25mL)。有時，疫苗可以較高劑量(例如約1ml)投與。

疫苗可以1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個或更多個劑量療程之方案來投與。有時，疫苗係以1個、2個、3個或4個劑量療程之方案來投與。有時，疫苗係以1個劑量療程之方案來投與。有時，疫苗係以2個劑量療程之方案來投與。

第一劑量及第二劑量之投與可間隔約0天、1天、2天、5天、7天、14天、21天、30天、2個月、4個月、6個月、9個月、1年、1.5年、2年、3年、4年或更多年。

本文所闡述之疫苗可每1年、2年、3年、4年、5年、6年、7年、8年、9年10年或更多年來投與。有時，本文所闡述之疫苗係每2年、3年、4年、5年、6年、7年或更多年來投與。有時，本文所闡述之疫苗係每4年、5年、6年、7年或更多年來投與。有時，本文所闡述之疫苗係投與一次。

劑量實例並非進行限制且僅用於例示用於投與本文所述疫苗之特定投藥方案。可根據動物模型來確定用於人類之有效量。舉例而言，可調配人用劑量以達成已發現在動物中有效的循環、肝、局部及/或胃腸濃度。基於動物數據及其他類型之類似數據，熟習此項技術者可確定適用於人類之疫苗組合物之有效量。

在提及藥劑或藥劑之組合時，有效量通常將意指已由醫療或醫藥業界中之各種管理或顧問組織(例如FDA、AMA)中之任一者或由製造商或供應商推薦或批准之劑量範圍、投與模式、調配物等。

在一些態樣中，本文所闡述之疫苗及套組可在2℃及8℃下儲存。在一些情形中，疫苗不冷凍儲存。在一些情形中，疫苗係儲存在例如-20℃或-80℃之溫度下。在一些情形中，疫苗係遠離日光儲存。

VIII.套組

本文所闡述之新抗原治療劑可連同投與說明書一起以套組形式提供。通常，套組可於容器中包括呈單位劑型之期望新抗原治療劑及投與說明書。其他治療劑(例如，細胞介素、淋巴介質、檢查點抑制劑、抗體)亦可包括在套組內。亦可能合意之其他套組組份包括(例如)無菌注射器、加強劑量及其他期望賦形劑。

本文亦提供套組及製品以與本文所闡述之一或多種方法一起使用。 套組可含有一或多種新抗原多肽。套組亦可含有編碼本文所闡述之多肽中之一或多者之核酸、識別本文所闡述之多肽中之一或多者之抗體或經本文所闡述之多肽中之一或多者活化之基於APC之細胞。套組可進一步含有製備及遞送疫苗所需之佐劑、試劑及緩衝劑。

套組亦可包括載劑、包裝或間隔化以容納一或多個容器(例如小瓶、管及諸如此類)之容器，每一容器包含欲用於本文所述方法中之單獨要素(多肽及佐劑)中之一者。適宜容器包括(例如)瓶、小瓶、注射器及測試管。容器可由各種材料(例如玻璃或塑膠)形成。

本文所提供之製品含有包裝材料。醫藥包裝材料之實例包括(但不限於)泡罩包、瓶、管、袋、容器、瓶及適於所選調配物及預期投與模式及治療之任何包裝材料。套組通常包括列示內容物之標記及/或使用說明書以及具有使用說明書之包裝插頁。亦將包括一套說明書。

本發明將藉助特定實例來更詳細地闡述。以下實例係出於說明目的來提供，且並非意欲以任何方式限制本發明。熟習此項技術者將容易地認識到各個非關鍵參數，可對該等參數進行改變或修改以獲得根據本發明之替代實施例。本文所列示之所有專利、專利申請案及印刷之公開案皆以全文引用方式併入本文中。

實例 實例1：具有免疫原性潛能之之突變序列之鑑別

申請者已發現在癌症患者中復發之突變。參見表1及2。

本文所闡述之新抗原肽可衍生自表1及2中所列示之突變。例如，新抗原肽可衍生自取代突變，例如，KRAS G12V突變。新抗原肽可為包含蛋白質之5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、 15個、16個、17個、18個、19個、20個、25個、30個、35個、40個、45個、50個、60個、70個、80個、90個或100個胺基酸殘基之肽，例如，包括取代(G12V)之KRAS。取代可位於沿新抗原肽之長度之任一地方。例如，其可位於新抗原肽之N末端三分之一、新抗原肽之中心三分之一或新抗原肽之之C末端三分之一。在另一實例中，經取代殘基經定位遠離N末端2-5個殘基或遠離C末端2-5個殘基。新抗原肽可類似地衍生自腫瘤特異性插入突變，其中新抗原肽包含插入殘基中之一或多個或全部。

新抗原肽亦可衍生自框移突變、融合多肽、框內缺失及剪接變體。由該等突變產生之腫瘤特異性多肽之特徵可在於在由種系編碼之多肽序列與由腫瘤特異性突變編碼之腫瘤特異性突變體多肽之間存在轉變點。新抗原肽可為涵蓋種系編碼之天然序列與腫瘤特異性多肽序列之間之轉變點且具有約5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、25個、30個、35個、40個、45個、50個、60個、70個、80個、90個或100個胺基酸殘基之肽。轉變點可位於沿新抗原肽之長度之任一地方。例如，其可位於新抗原肽之N末端三分之一、新抗原肽之中心三分之一或新抗原肽之C末端三分之一。在另一實例中，轉變點經定位遠離N末端2-5個殘基或遠離C末端2-5個殘基。衍生自框移突變及剪接變體之新抗原肽亦可為由腫瘤特異性突變殘基組成之肽。

對於表1及2中列示之每一突變事件，推導出突變蛋白之全長胺基酸序列。將未見於種系蛋白質序列中之任一組成型9聚體或10聚體標記為新肽且使用可用算法對6個常見HLA等位基因(HLA-A01：01、HLA-A02：01、HLA-A03：01、HLA-A11：01、HLA-A24：02、HLA-B07：02及 HLA-B08：01)之結合潛能進行評分。對評分好於1000nM之任一肽進行提名。所提名肽列示於表1及2中，後面括號內為評分高之HLA等位基因。

¹加下劃線之AA代表非天然AA

²加粗之AA代表由兩個融合基因中之第二個編碼之胺基酸序列之天然AA

³加粗且加下劃線之AA代表由框移引起之兩個融合基因中之第二個編碼之胺基酸序列之非天然AA。

¹加下劃線之AA代表非天然AA

²加粗之AA代表由兩個融合基因中之第二個編碼之胺基酸序列之天然AA

³加粗且加下劃線之AA代表由框移引起之兩個融合基因中之第二個編碼之胺基酸序列之非天然AA。

在上表中，對於實例性融合中之一或多者，第一個「：」之前的序列屬由第一基因編碼之多肽之外顯子序列，第二個「：」之後的序列屬由第二基因編碼之多肽之外顯子序列，且在「：」符號之間出現的胺基酸係由在由第一基因編碼之多肽之外顯子序列與由第二基因編碼之多肽之外顯子序列之間分離之密碼子編碼。

然而，在一些實施例中，例如，NAB：STAT6，NAB外顯子係連接至STAT6之5’ UTR且在接合後出現之第一胺基酸係STAT6之正常發動密碼子(在此位點不存在框(因為其通常不被轉譯))。

在一些實施例中，亦可將上表中之AR-V7視為編碼缺乏見於全長AR中之配體結合結構域之蛋白質之AR基因之剪接變體。

實例2：I類及II類HLA結合分析

結合至HLA分子之肽之以下實例證實I類及II類HLA肽之結合親和力之量化。可用具有基序或沒有基序之肽實施結合分析。

使用艾司坦-巴爾病毒(Epstein-Barr virus，EBV)轉變之同型接合細胞系、纖維母細胞、CIR或721.22轉染子作為I類HLA分子之來源。製備細胞溶解物並根據所揭示之方案純化HLA分子(Sidney等人，Current Protocolsin Immunology 18.3.1(1998)；Sidney等人，J.Immunol.154：247(1995)；Sette等人，Mol.Immunol.31：813(1994))。藉由親和層析自溶解物純化HLA分子。使溶解物通過與適當抗體偶合之瓊脂糖凝膠CL-4B珠粒之管柱。然後用於1% NP-40、PBS及含有0.4%正辛基糖苷之PBS中之10mM Tris-HCL(pH 8.0)洗滌抗HLA管柱，並用於含有0.4%正辛基糖苷之0.15M NaCl中之50mM二乙胺(pH 11.5)溶析HLA分子。將1/25體積之2.0M Tris(pH 6.8)添加至溶析物中以使pH降低至約8.0。然後藉由在Centriprep 30濃縮器(Amicon,Beverly,MA)中離心來濃縮溶析物。藉由BCA蛋白分析(Pierce Chemical Co.,Rockford,IL)評估蛋白含量並藉由SDS-PAGE來證實。

已公開用於量測肽與I類及II類MHC之結合親和力之方案之詳細闡述(Sette等人，Mol.Immunol.31：813,1994；Sidney等人，Current Protocolsin Immunology,Margulies編輯，John Wiley & Sons,New York,Section 18.3,1998)。簡言之，在含有0.05% Nonidet P-40(NP40)(或20% w/v毛地黃皂苷(對於H-2 IA分析))之PBS中在蛋白酶抑制劑混合劑存在下，將經純化MHC分子(5nM至500nM)與各種未標記之肽抑制劑及1-10nM ¹²⁵I-放射性標記之探針肽一起培育48h。所有分析皆在pH 7.0下實施，在pH 4.5下實施之DRB1*0301及在pH 5.0下實施之DRB1*1601(DR2w21β1)及DRB4*0101(DRw53)除外。

在培育後，藉由在7.8mm×15cm TSK200管柱(TosoHaas 16215,Montgomeryville,PA)上凝膠過濾使MHC-肽複合體與游離肽分離。由於用於DRB1*1501(DR2w2β1)分析之放射性標記之肽之大尺寸使得結合峰與未結合峰在該等條件下較難分離，故所有DRB1*1501(DR2w2β1)分析 皆使用7.8mm×30cm TSK2000管柱以0.6mL/min溶析實施。使來自TSK管柱之溶析物通過Beckman 170放射性同位素檢測器，並繪製放射性之圖形並使用Hewlett-Packard 3396A積分器進行積分，且測定結合肽之分數。

使用氯胺-T方法碘化放射性標記之肽。通常，在預備實驗中，在固定量之放射性標記之肽存在下滴定每一MHC製劑以測定結合總放射性之10-20%所需要之HLA分子之濃度。所有後續抑制及直接結合分析接係使用該等HLA濃度來實施。

由於在該等條件下[標記]<[HLA]及IC₅₀

[HLA]，因此經量測IC₅₀值係真實K_D值之合理近似值。肽抑制劑通常係在120μg/ml至1.2ng/ml範圍內之濃度下測試，且係在兩個至四個完全獨立的實驗中測試。為容許比較在不同實驗中獲得之數據，藉由將陽性對照之抑制IC₅₀除以每一測試肽(通常放射性標記之探針肽之未標記型式)之IC₅₀來計算每一肽之相對結合數字。出於資料庫及實驗間比較之目的，編譯相對結合值。隨後可藉由將陽性對照之抑制IC₅₀ nM除以所關注肽之相對結合將該等值轉變回IC₅₀ nM值。已證實此數據編譯方法可最準確且一致的用於比較在不同日期或利用不同批次的經純化MHC測試之肽。

由於用於HLA-DR純化之抗體(LB3.1)係α-鏈特異的，因此不使β1分子與β3(及/或β4及β5)分子分離。在未表現β3之DRB1*0101(DR1)、DRB1*0802(DR8w2)及DRB1*0803(DR8w3)之情形下，結合分析之β1特異性係明顯的。對於DRB1*0301(DR3)及DRB3*0101(DR52a)、DRB1*0401(DR4w4)、DRB1*0404(DR4w14)、DRB1*0405(DR4w15)、DRB1*1101(DR5)、DRB1*1201(DR5w12)、DRB1*1302 (DR6w19)及DRB1*0701(DR7)，亦已證實。藉由使用纖維母細胞回避對DRB1*1501(DR2w2β1)、DRB5*0101(DR2w2β2)、DRB1*1601(DR2w21β1)、DRB5*0201(DR51Dw21)及DRB4*0101(DRw53)分析之β鏈特異性之問題。先前已闡述了關於DRβ分子特異性之分析之研發及驗證(例如，參見Southwood等人，J.Immunol.160：3363-3373,1998)。

已公開用於量測肽與I類MHC之結合穩定性之方案之詳細闡述(Harndahl等人J Immunol Methods.374：5-12,2011)。簡言之，在大腸桿菌中表現編碼生物素化MHC-I重鏈及輕鏈之合成基因並使用標準方法自包涵體純化。用碘(¹²⁵I)放射性標記輕鏈(β2m)，並在18℃下將其與經純化之MHC-I重鏈及所關注肽合併以發動pMHC-I複合體形成。該等反應係在鏈黴抗生物素蛋白塗佈之微板中實施以將生物素化MHC-I重鏈結合至表面並容許量測放射性標記之輕鏈以監測複合體形成。藉由添加較高濃度之未標記輕鏈開始解離並在37℃下培育。穩定性係定義為一半複合體解離所花費之時長(以小時計)，如藉由閃爍計數所量測。

亦可使用基於活細胞/流式細胞術之分析，例如，利用TAP缺陷型雜交瘤細胞系T2(美國模式培養物保藏所(American Type Culture Collection)(ATCC登錄號CRL-1992),Manassas,Va.)之分析。此細胞系中之TAP缺乏導致ER中MHCI之無效加載及空MHCI之過量。Salter及Cresswell,EMBO J.5：943-49(1986)；Salter,Immunogenetics 21：235-46(1985)。空MHCI極其不穩定且短命。當在降低之溫度下培養T2細胞時，空MHCI瞬時出現在細胞表面上，其中該等空MHCI可藉由外源性添加MHCI結合肽來穩定。為實施此結合分析，藉由將10⁷個T2細胞之等分試樣在26℃下在單獨的無血清之AIM-V培養基中或在含有遞增濃度(0.1至 100μM)之肽之培養基中培養過夜來誘導肽接受性MHCI。然後用PBS將細胞洗滌兩次，且隨後與螢光標記之HLA-A0201特異性單株抗體BB7.2一起培育以量化細胞表面表現。在FACS Calibur儀器(Becton Dickinson)上獲取試樣且使用隨附Cellquest軟體測定平均螢光強度(MFI)。

實例3：I類HLA結合親和力

使用HLA結合分析來評估給定表位與所選HLA分子之相互作用之親和力或穩定性。該等量測中之每一者例如指示表位引發CD8+ T細胞反應之能力。

合成來自表1之肽之子集(n=562)且如所闡述量測其對其給定I類HLA分子之親和力。值顯示於表3中。在圖1中繪製量測對預測親和力之圖形。該等數據顯示預測與量測之間之強關係(虛線表示最佳擬合，R²=0.45)，從而證實預測之值。然而，離群值證實該等量測之重要性。粗的垂直線及水平線係在500nM下分別針對預測親和力及觀察親和力來顯示。500nM在本領域內通常被接受為對I類HLA為「弱結合劑」之表位之最大親和力。因此，右下象限中之點(預測大於500nM，量測小於500nM)係被視為極弱結合劑但被觀察到在可接受之範圍內結合之表位。此象限中之表位(n=75)佔藉由預測不被視為結合劑之表位(右下象限及右上象限之組合，n=246)之30.5%。

實例4：I類HLA結合穩定性

用於親和力量測之肽之子集亦用於使用所闡述之分析量測穩定性(n=275)。該等數據顯示於表3中。在圖2中根據4個倉繪製該等數據之圖形，其中中值及四分位間隔重疊。小於50nM被本領域視為強結合劑，50-150nM被視為中間結合劑，150-500nM被視為弱結合劑，且大於500nM被視為極弱結合劑。所觀察穩定性與所觀察親和力之間之聯繫因橫跨該等分倉穩定性間隔之中值穩定性降低而明顯。然而，在各個倉之間存在顯著重疊，且重要的是在所有倉中皆存在表位，且在多小時範圍內觀察到 穩定性，包括極弱結合劑。

實例5：免疫原性分析

使用免疫原性分析來測試每一測試肽擴增T細胞之能力。以下列方式製備成熟專業的APC用於該等分析。使用基於珠粒之套組(Miltenyi)自健康人類供體PBMC富集單核球。將經富集細胞平鋪於GM-CSF及IL-4中以誘導不成熟的DC。5天後，將不成熟的DC在37℃下與每一肽一起培育1小時，之後添加細胞介素成熟混合劑(GM-CSF,IL-1β,IL-4,IL-6,TNFα,PGE1β)。將細胞在37℃下培育成為成熟DC。

在DC成熟後，將PBMC(整體或富集T細胞)與增殖細胞介素一起添加至成熟樹突細胞中。使用功能分析及/或四聚體染色之組合監測培養物之肽特異性T細胞。利用經修飾及母體肽之平行免疫原性分析容許比較肽擴增肽特異性T細胞之相對效率。

四聚體染色.MHC四聚體係購得的或現場製造的，且在免疫原性分析中用於量測肽特異性T細胞擴增。為進行評價，根據製造商之說明書將四聚體在含有1% FCS及0.1%疊氮化鈉之PBS(FACS緩衝液)中添加至1×10⁵個細胞中。在室溫下在黑暗中將細胞培育20分鐘。然後將對T細胞標記物(例如CD8)具有特異性之抗體添加至製造商所建議之最終濃中度，並將細胞在4℃下在黑暗中培育20分鐘。用冷的FACS緩衝液洗滌細胞並將其再懸浮於含有1%甲醛之緩衝液中。在FACS Calibur(Becton Dickinson)儀器上獲取細胞，並藉由使用Cellquest軟體(Becton Dickinson)進行分析。為分析四聚體陽性細胞，自前部及側向散佈圖取淋巴球門。數據報告為作為CD8⁺/四聚體⁺之細胞之百分比。

細胞內細胞介素染色.在不存在用於鑑別抗原特異性T細胞群之充分 確立之四聚體染色下，可使用細胞介素產生之評價使用充分確立之流式細胞術分析來估計抗原特異性。簡言之，用所關注肽刺激T細胞並將其與對照相比較。在刺激後，藉由細胞內染色評價藉由CD4⁺ T細胞之細胞介素產生(例如，IFNγ及TNFα)。該等細胞介素(尤其IFNγ)可用於鑑別經刺激細胞。

ELISPOT. 使用ELISPOT分析(BD Biosciences)功能性計數肽特異性T細胞，該分析基於單細胞量測T細胞之IFNγ釋放。在37℃下用10μM肽將靶細胞(T2或HLA-A0201轉染之C1R)脈衝1小時，並洗滌三次。在ELISPOT板孔中與取自免疫原性培養物之不同濃度之T細胞(5×10²個至2×10³個)一起共培養1×10⁵個肽脈衝之靶標。根據製造商之方案對板進行顯影，並在ELISPOT讀取器(Cellular Technology Ltd.)上利用隨附軟體進行分析。將對應於產生IFNγ之T細胞之數量之點報告為絕對點數/經平鋪T細胞數。不僅針對其識別用經修飾肽脈衝之靶標之能力且亦針對其識別用母體肽脈衝之靶標之能力來測試在經修飾肽上擴增之T細胞。

CD107染色.在用同源肽活化之後，在CD8⁺ T細胞之細胞表面上表現CD107a及b。T細胞之溶解顆粒具有含有溶酶體相關膜醣蛋白(「LAMP」)之脂質雙層，該等溶酶體相關膜醣蛋白包括分子CD107a及b。當藉助T細胞受體活化細胞毒性T細胞時，該等溶解顆粒之膜流動並與T細胞之質膜融合。顆粒內容物得以釋放，且此導致靶細胞死亡。在顆粒膜與質膜融合時，C107a及b於細胞表面上暴露，且因此係脫粒之標記物。由於如藉由CD107 a及b染色量測之脫粒係在單一細胞基礎上報告的，故該分析可用於功能性計數肽特異性T細胞。為實施該分析，將肽添加至HLA-A0201轉染之細胞C1R中至20μM之最終濃度，將細胞在37℃ 下培育1小時，並洗滌三次。將1×10⁵個肽脈衝之C1R細胞等分至管中，且將對CD107 a及b具有特異性之抗體添加至由製造商(Becton Dickinson)建議之最終濃度中。在添加T細胞前添加抗體以便「捕獲」CD107分子，因為該等CD107分子在分析過程期間係瞬時出現於表面上。接下來添加來自免疫原性培養物之1×10⁵個T細胞，並將試樣在37℃下培育4小時。針對其他細胞表面分子(例如CD8)對T細胞進一步染色且該等T細胞在FACS Calibur儀器(Becton Dickinson)上獲取的。使用隨附Cellquest軟體分析數據，且將結果報告為CD8⁺ CD107 a及b⁺細胞之百分比。

細胞毒性分析.使用鉻釋放分析量測細胞毒性活性。在37℃下用Na⁵¹Cr將靶標T2細胞標記1小時且然後將經洗滌5×10³靶標T2細胞添加至來自免疫原性培養物之不同數量之T細胞中。在37℃下培育4小時之後在收穫之上清液中量測鉻釋放。如下計算特異性溶解之百分比：實驗釋放-自發釋放/總釋放-自發釋放×100

實施免疫原性分析來評價每一肽是否可藉由抗原特異性擴增來引發T細胞反應。但目前方法不完善，且因此陰性結果並非暗示肽不能誘導反應，但陽性結果證實肽可誘導T細胞反應。測試表3之若干肽引發CD8⁺ T細胞反應之能力，多聚體讀出如所闡述。利用第二多聚體製劑量測每一陽性結果以避免任何製備偏差。陽性多聚體染色之若干實例顯示於圖3至6中，且顯示多聚體陰性細胞(左側)及抗原特異性(多聚體-雙陽性)細胞(右側)。

將HLA-A02：01⁺ T細胞與負載有TMPRSS2：：ERG融合新表位(ALNSEALSV(SEQ ID NO：140)；HLA-A02：01)之單核球源樹突細胞一起共培養10天。使用多聚體分析CD8⁺ T細胞對TMPRSS2：：ERG融合新表 位之抗原特異性(初始：BV421及PE；驗證：APC及BUV396)(圖3)。

將HLA-A02：01⁺ T細胞與負載有GATA3框移新表位(SMLTGPPARV(SEQ ID NO：141)；HLA-A02：01)之單核球源樹突細胞一起共培養10天。使用多聚體分析CD8⁺ T細胞對GATA3框移新表位之抗原特異性(初始：APC及BUV396；驗證：PE及BV421)(圖4)。

將HLA-A02：01⁺ T細胞與負載有β2M框移新表位(LLCVWVSSI(SEQ ID NO：142)；HLA-A02：01)之單核球源樹突細胞一起共培養10天。使用多聚體分析CD8⁺ T細胞對β2M框移新表位之抗原特異性(初始：PE及APC；驗證：PE及BV421)(圖5)。

將HLA-A02：01⁺ T細胞與負載有KRAS G12C新表位(KLVVVGACGV(SEQ ID NO：143)；HLA-A02：01)之單核球源樹突細胞一起共培養10天。使用多聚體分析CD8⁺ T細胞對KRAS G12C框移新表位之抗原特異性(初始：BUV396及BV421；驗證：APC及BUV396)(圖6)。

儘管使用充分確立之I類HLA多聚體技術容易評價抗原特異性CD8⁺ T細胞反應，但由於II類HLA多聚體技術尚未充分確立，所以CD4⁺ T細胞反應需要單獨的分析來評估。為評價CD4⁺ T細胞反應，用所關注肽再刺激T細胞並將其與對照相比較。在完全新穎序列(例如，由框移或融合產生)之情形下，對照無肽。在點突變之情形下，對照為WT肽。在刺激後，藉由細胞內染色評價藉由CD4⁺ T細胞之細胞介素產生(例如，IFNγ及TNFα)。該等細胞介素(尤其IFNγ)可用於鑑別經刺激細胞。抗原特異性CD4⁺ T細胞反應相對於對照顯示增加之細胞介素產生。針對新肽生成之抗原特異性CD4⁺ T細胞反應之實例顯示於圖7至9中。

將T細胞與加載β2M框移新肽之單核球源樹突細胞一起共培養20天(在第20天用新鮮單核球源樹突細胞再刺激)。與沒有肽之對照相比，在用加載有β2M框移肽之單核球源樹突細胞再刺激24小時之後藉由細胞內細胞介素染色分析CD4⁺ T細胞之抗原特異性(圖7)。

將幼稚T細胞與加載BTK C481S新肽之單核球源樹突細胞一起共培養20天(在第20天用新鮮單核球源樹突細胞再刺激)。與對照野生型BTK肽相比，在用加載有BTK C481S新肽之單核球源樹突細胞再刺激24小時之後藉由細胞內細胞介素染色分析CD4⁺ T細胞之抗原特異性(圖8)。

將幼稚T細胞與加載GATA3框移新肽之單核球源樹突細胞一起共培養20天(在第20天用新鮮單核球源樹突細胞再刺激)。與沒有肽之對照相比，在用加載有GATA3框移肽之單核球源樹突細胞再刺激24小時之後藉由細胞內細胞介素染色分析CD4⁺ T細胞之抗原特異性(圖9)。

實例6：納入腫瘤特異性疫苗中之CTL及HTL表位之選擇.

此實例闡釋針對本發明之疫苗組合物選擇肽表位之程序。組合物中之肽可呈編碼肽之核酸序列(單一序列或一或多個序列(即，袖珍基因))之形式或可為單一表位及/或多表位肽。

選擇表位，其在投與之後，觀察到與腫瘤清除相關之模擬免疫反應。例如，疫苗可包括來自至少一個腫瘤抗原區之1至2個表位。來自一個區之表位可與來自一或多個其他腫瘤抗原區之表位組合使用。

可選擇(例如)對I類HLA分子具有500nM或更小之IC₅₀或對II類HLA分子具有1000nM或更小之IC₅₀之結合親和力之表位。

當產生多表位組合物(例如袖珍基因)時，通常期望生成涵蓋所關注表位之可能最小的肽。所採用之原理與在選擇包含嵌套型表位之肽時所採用 之彼等係類似的(若不同)。然而，另外，在確定欲以袖珍基因提供之核酸序列時，分析由該袖珍基因編碼之肽序列以確定是否已產生任何「接合表位」。接合表位係潛在HLA結合表位，例如，如藉由基序分析所預測。接合表位通常應避免，乃因接受者可結合至HLA分子且生成對天然蛋白質序列中不存在之表位之免疫反應。

納入疫苗組合物中之肽表位選自(例如)各表中列示之彼等。包括所選肽之疫苗組合物在投與時係安全有效的，且引發類似於抑制腫瘤生長之免疫反應之量級之免疫反應。

實例7：用於預防或治療用途之肽組合物

使用本發明之免疫原性或疫苗組合物來抑制腫瘤生長。例如，向具有腫瘤之個體投與含有多個CTL及HTL表位之多表位組合物(或包含其之核酸)。對於70kg患者而言，用於免疫之肽之劑量為約1μg至約50,000μg，通常100μg至5,000μg。可在初始投與之後4週時投與加強劑量，隨後藉由確定PBMC試樣中表位特異性CTL群體之存在之技術來評估患者之免疫反應之量級。若需要，投與額外加強劑量。發現組合物可安全且有效地抑制腫瘤生長。

另一選擇為，可根據業內已知及本文所揭示之方法以核酸形式(例如以RNA形式)來投與多表位組合物。

可根據業內已知及本文所揭示之方法來投與新抗原結合劑(例如TCR或CAR)。該等結合劑可作為細胞療法之一部分以編碼結合劑之多核苷酸形式(例如DNA或RNA)來投與。另一選擇為，可將結合劑製備為能識別偶合至細胞毒性劑之特定肽：MHC複合體的抗體或其片段或能將患者T細胞再引導至表現各表中所列示表位之腫瘤細胞的T細胞結合劑。

新抗原肽、多核苷酸、結合劑或表現該等分子之細胞可經由業內已知之多種方法遞送至相同患者，且可進一步與其他癌症療法(例如，化學療法、手術、輻射、檢查點抑制劑等)組合。

實例8：使用樹突細胞投與組合物

包含本發明表位之疫苗可使用樹突細胞來投與。在此實例中，可向患者投與肽脈衝或核酸脈衝之樹突細胞以刺激活體內CTL反應。在此方法中，分離、擴增樹突細胞，並用包含肽或編碼本發明之DNA或RNA CTL及HTL表位之疫苗對其進行脈衝。將樹突細胞輸注回至患者中以引發活體內CTL及HTL反應。經誘導之CTL及HTL然後破壞(CTL)具有衍生疫苗中之表位之蛋白質的特異性靶標腫瘤細胞或促進該等細胞之毀壞(HTL)。

另一選擇為，可藉由連同抗原呈遞細胞之來源(例如樹突細胞)及適當免疫原性肽或核酸一起在組織培養中培育患者之或遺傳上相容之CTL或HTL前體細胞來誘導對特定腫瘤相關性抗原之離體CTL或HTL反應。在其中前體細胞經活化並擴增成效應細胞之適當培育時間(通常約7-28天)之後，將該等細胞輸注回至患者中，其中該等細胞將破壞(CTL)其特異性靶細胞(即腫瘤細胞)或促進該等靶細胞之毀壞(HTL)。

實例9：新表位之鑑別

含有改變胺基酸序列之不同遺傳變化之癌細胞可生成潛在的新穎T細胞表位，例如各表中所顯示之彼等。鑑別哪些患者之腫瘤含有如各表中所鑑別之腫瘤特異性新表位可包含DN突變之鑑別。作為一種方法，可使用充分確立之腫瘤技術對來自患者之匹配種系試樣實施全基因體或全外顯子體測序。作為另一方法，亦可實施腫瘤及適當匹配之正常試樣之RNA測序。作為另一方法，亦可實施基於靶向測序(次世代定序技術或充分確立 之Sanger測序)之特定分析。另外，可研發基於高度特異性聚合酶鏈式反應之分析。

實例10：CD8 ⁺ 或CD4 ⁺ 細胞之新抗原肽識別之特異性

在各個實施例中，本教示包括藉由疫苗誘導之CD8⁺細胞揭示突變序列與野生型序列之間之區別。為測定疫苗誘導之T細胞是否可識別天然處理之抗原，可用編碼納入疫苗中之肽之突變(MUT)或野生型(WT)序列之多袖珍基因構築體轉導腫瘤細胞系。每一袖珍基因可由編碼MUT或WT序列之21個aa組成。可與表現MUT或WT之癌細胞一起培育對含有特定突變之蛋白質具有特異性之疫苗誘導之細胞，可在培育24h之後收集上清液，且可在上清液中藉由ELISA量測由該等細胞產生之IFN-y。

突變及野生型肽之新抗原特異性細胞識別亦可在標準4h ⁵¹Cr-釋放分析中測定。

<110> 美商百歐恩泰美國公司(BIONTECH US INC.)

<120> 新抗原及其使用方法

<130> 50401-705.601

<140> TW 106111296

<141> 2017-03-31

<150> 62/316,571

<151> 2016-04-01

<150> 62/316,567

<151> 2016-04-01

<150> 62/316,552

<151> 2016-03-31

<150> 62/316,547

<151> 2016-03-31

<150> 62/316,533

<151> 2016-03-31

<150> 62/316,530

<151> 2016-03-31

<160> 1834

<170> PatentIn版本3.5

<210> 1

<211> 101

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成多肽

<400> 1

<210> 2

<211> 101

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<213> 人工序列

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<223> 人工序列之描述：合成多肽

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<223> 人工序列之描述：合成多肽

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<223> 人工序列之描述：合成多肽

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<223> 人工序列之描述：合成多肽

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<223> 人工序列之描述：合成多肽

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<223> 人工序列之描述：合成多肽

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<223> 人工序列之描述：合成多肽

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<213> 人工序列

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<223> 人工序列之描述：合成多肽

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<223> 人工序列之描述：合成多肽

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<223> 人工序列之描述：合成多肽

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<220>

<223> 人工序列之描述：合成多肽

<400> 12

<210> 13

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成多肽

<400> 13

<210> 14

<211> 101

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成多肽

<400> 14

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<211> 101

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成多肽

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<212> PRT

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<220>

<223> 人工序列之描述：合成多肽

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<220>

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<220>

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<220>

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<220>

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<220>

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<220>

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<220>

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<220>

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<220>

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<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成多肽

<400> 81

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

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<213> 人工序列

<220>

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<213> 人工序列

<220>

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<213> 人工序列

<220>

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<213> 人工序列

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<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成多肽

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<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成多肽

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成多肽

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<213> 人工序列

<220>

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<213> 人工序列

<220>

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<213> 人工序列

<220>

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<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成多肽

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<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成多肽

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成多肽

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成多肽

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成多肽

<400> 102

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成肽

<400> 103

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成多肽

<400> 105

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<211> 65

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成多肽

<400> 106

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<211> 79

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成多肽

<400> 107

<210> 108

<211> 53

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成多肽

<400> 108

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<211> 71

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成多肽

<400> 109

<210> 110

<211> 68

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成多肽

<400> 110

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成多肽

<400> 111

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<211> 65

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成多肽

<400> 112

<210> 113

<211> 51

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成多肽

<400> 113

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<211> 52

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成多肽

<400> 114

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<211> 84

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成多肽

<400> 115

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<211> 74

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成多肽

<400> 116

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<211> 88

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成多肽

<400> 117

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<211> 55

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成多肽

<400> 118

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<211> 100

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成多肽

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成多肽

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<211> 101

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成多肽

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成多肽

<400> 122

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成多肽

<400> 123

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<211> 100

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成多肽

<400> 124

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成多肽

<400> 125

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<211> 101

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成多肽

<400> 126

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成多肽

<400> 127

<210> 128

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成多肽

<400> 128

<210> 129

<211> 83

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成多肽

<400> 129

<210> 130

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成多肽

<400> 130

<210> 131

<211> 101

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成多肽

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成多肽

<400> 132

<210> 133

<211> 101

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成多肽

<400> 133

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成多肽

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成多肽

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成多肽

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成多肽

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<212> PRT

<213> 人工序列

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<213> 人工序列

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<213> 人工序列

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

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<212> PRT

<213> 人工序列

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成肽

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成肽

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<212> PRT

<213> 人工序列

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<223> 人工序列之描述：合成肽

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<212> PRT

<213> 人工序列

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

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<220>

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<212> PRT

<213> 人工序列

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<213> 人工序列

<220>

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<220>

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<213> 人工序列

<220>

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<212> PRT

<213> 人工序列

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<212> PRT

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<220>

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

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<220>

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<220>

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<213> 人工序列

<220>

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<213> 人工序列

<220>

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

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<213> 人工序列

<220>

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

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<213> 人工序列

<220>

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

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<213> 人工序列

<220>

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<213> 人工序列

<220>

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<212> PRT

<213> 人工序列

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

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<220>

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<220>

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<400> 202

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<212> PRT

<213> 人工序列

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<212> PRT

<213> 人工序列

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<400> 205

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<213> 人工序列

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<213> 人工序列

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<400> 215

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<212> PRT

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<212> PRT

<213> 人工序列

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成肽

<400> 220

<210> 221

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成肽

<400> 221

<210> 222

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成肽

<400> 222

<210> 223

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成肽

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<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成肽

<400> 224

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<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成肽

<400> 225

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成肽

<400> 226

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成肽

<400> 227

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成肽

<400> 228

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成肽

<400> 229

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<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成肽

<400> 230

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<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成肽

<400> 231

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<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成肽

<400> 232

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<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成肽

<400> 233

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<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成肽

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成肽

<400> 235

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<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成肽

<400> 236

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<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成肽

<400> 237

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成肽

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成肽

<400> 239

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<213> 人工序列

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<213> 人工序列

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<213> 人工序列

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<223> 人工序列之描述：合成肽

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<213> 人工序列

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<223> 人工序列之描述：合成肽

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<213> 人工序列

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<223> 人工序列之描述：合成肽

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<213> 人工序列

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<210> 811

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成肽

<400> 811

<210> 812

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成肽

<400> 812

<210> 813

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成肽

<400> 813

<210> 814

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成肽

<400> 814

<210> 815

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成肽

<400> 815

<210> 816

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成肽

<400> 816

<210> 817

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成肽

<400> 817

<210> 818

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成肽

<400> 818

<210> 819

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成肽

<400> 819

<210> 820

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成肽

<400> 820

<210> 821

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成肽

<400> 821

<210> 822

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成肽

<400> 822

<210> 823

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成肽

<400> 823

<210> 824

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成肽

<400> 824

<210> 825

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成肽

<400> 825

<210> 826

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成肽

<400> 826

<210> 827

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成肽

<400> 827

<210> 828

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成肽

<400> 828

<210> 829

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成肽

<400> 829

<210> 830

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成肽

<400> 830

<210> 831

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成肽

<400> 831

<210> 832

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成肽

<400> 832

<210> 833

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成肽

<400> 833

<210> 834

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成肽

<400> 834

<210> 835

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成肽

<400> 835

<210> 836

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成肽

<400> 836

<210> 837

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成肽

<400> 837

<210> 838

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成肽

<400> 838

<210> 839

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成肽

<400> 839

<210> 840

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成肽

<400> 840

<210> 841

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成肽

<400> 841

<210> 842

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成肽

<400> 842

<210> 843

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成肽

<400> 843

<210> 844

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成肽

<400> 844

<210> 845

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成肽

<400> 845

<210> 846

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成肽

<400> 846

<210> 847

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成肽

<400> 847

<210> 848

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成肽

<400> 848

<210> 849

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成肽

<400> 849

<210> 850

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成肽

<400> 850

<210> 851

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成肽

<400> 851

<210> 852

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成肽

<400> 852

<210> 853

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成肽

<400> 853

<210> 854

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成肽

<400> 854

<210> 855

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成肽

<400> 855

<210> 856

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成肽

<400> 856

<210> 857

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成肽

<400> 857

<210> 858

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成肽

<400> 858

<210> 859

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成肽

<400> 859

<210> 860

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成肽

<400> 860

<210> 861

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成肽

<400> 861

<210> 862

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成肽

<400> 862

<210> 863

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成肽

<400> 863

<210> 864

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成肽

<400> 864

<210> 865

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成肽

<400> 865

<210> 866

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成肽

<400> 866

<210> 867

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成肽

<400> 867

<210> 868

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成肽

<400> 868

<210> 869

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成肽

<400> 869

<210> 870

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成肽

<400> 870

<210> 871

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成肽

<400> 871

<210> 872

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成肽

<400> 872

<210> 873

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成肽

<400> 873

<210> 874

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成肽

<400> 874

<210> 875

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成肽

<400> 875

<210> 876

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成肽

<400> 876

<210> 877

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成肽

<400> 877

<210> 878

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成肽

<400> 878

<210> 879

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成肽

<400> 879

<210> 880

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成肽

<400> 880

<210> 881

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成肽

<400> 881

<210> 882

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成肽

<400> 882

<210> 883

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成肽

<400> 883

<210> 884

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成肽

<400> 884

<210> 885

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成肽

<400> 885

<210> 886

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成肽

<400> 886

<210> 887

<211> 21

<212> PRT

<213> Plasmodium falciparum

<400> 887

<210> 888

<211> 16

<212> PRT

<213> Streptococcus sp.

<400> 888

<210> 889

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成肽

<220>

<221> MOD_RES

<222> (1)..(1)

<223> D-alanine or L-alanine

<220>

<221> MOD_RES

<222> (3)..(3)

<223> Cyclohexylalanine,phenylalanine,or tyrosine

<220>

<221> MOD_RES

<222> (13)..(13)

<223> D-alanine or L-alanine

<400> 889

<210> 890

<211> 101

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成多肽

<400> 890

<210> 891

<211> 61

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成多肽

<400> 891

<210> 892

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成肽

<400> 892

<210> 893

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成肽

<400> 893

<210> 894

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成肽

<400> 894

<210> 895

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成肽

<400> 895

<210> 896

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成肽

<400> 896

<210> 897

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成肽

<400> 897

<210> 898

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成肽

<400> 898

<210> 899

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成肽

<400> 899

<210> 900

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成肽

<400> 900

<210> 901

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成肽

<400> 901

<210> 902

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成肽

<400> 902

<210> 903

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成肽

<400> 903

<210> 904

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成肽

<400> 904

<210> 905

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成肽

<400> 905

<210> 906

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成肽

<400> 906

<210> 907

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成肽

<400> 907

<210> 908

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成肽

<400> 908

<210> 909

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成肽

<400> 909

<210> 910

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成肽

<400> 910

<210> 911

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成肽

<400> 911

<210> 912

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成肽

<400> 912

<210> 913

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成肽

<400> 913

<210> 914

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成肽

<400> 914

<210> 915

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成肽

<400> 915

<210> 916

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成肽

<400> 916

<210> 917

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成肽

<400> 917

<210> 918

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成肽

<400> 918

<210> 919

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成肽

<400> 919

<210> 920

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成肽

<400> 920

<210> 921

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成肽

<400> 921

<210> 922

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成肽

<400> 922

<210> 923

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

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<213> 人工序列

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<213> 人工序列

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<212> PRT

<213> 人工序列

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<223> 人工序列之描述：合成肽

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<213> 人工序列

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<223> 人工序列之描述：合成肽

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<213> 人工序列

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<223> 人工序列之描述：合成肽

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<213> 人工序列

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<223> 人工序列之描述：合成肽

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<212> PRT

<213> 人工序列

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<223> 人工序列之描述：合成肽

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成肽

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成肽

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<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

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<223> 人工序列之描述：合成肽

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<223> 人工序列之描述：合成肽

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<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成肽

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<213> 人工序列

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<220>

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<213> 人工序列

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<213> 人工序列

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<213> 人工序列

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<212> PRT

<213> 人工序列

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<213> 人工序列

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<212> PRT

<213> 人工序列

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<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成肽

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<212> PRT

<213> 人工序列

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<212> PRT

<213> 人工序列

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<212> PRT

<213> 人工序列

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<212> PRT

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<213> 人工序列

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<213> 人工序列

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<223> 人工序列之描述：合成肽

<400> 1143

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<212> PRT

<213> 人工序列

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<223> 人工序列之描述：合成肽

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成肽

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成肽

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<212> PRT

<213> 人工序列

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<223> 人工序列之描述：合成肽

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<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成肽

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<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成肽

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<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成肽

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<213> 人工序列

<220>

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<213> 人工序列

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<213> 人工序列

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<212> PRT

<213> 人工序列

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<223> 人工序列之描述：合成肽

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<212> PRT

<213> 人工序列

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<223> 人工序列之描述：合成肽

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<212> PRT

<213> 人工序列

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<223> 人工序列之描述：合成肽

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<212> PRT

<213> 人工序列

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<223> 人工序列之描述：合成肽

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<212> PRT

<213> 人工序列

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<223> 人工序列之描述：合成肽

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成肽

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成肽

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<212> PRT

<213> 人工序列

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<223> 人工序列之描述：合成肽

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<212> PRT

<213> 人工序列

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<223> 人工序列之描述：合成肽

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<212> PRT

<213> 人工序列

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<223> 人工序列之描述：合成肽

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<212> PRT

<213> 人工序列

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<213> 人工序列

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<223> 人工序列之描述：合成肽

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<212> PRT

<213> 人工序列

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<223> 人工序列之描述：合成肽

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<213> 人工序列

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<223> 人工序列之描述：合成肽

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<213> 人工序列

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<223> 人工序列之描述：合成肽

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成肽

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<212> PRT

<213> 人工序列

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<223> 人工序列之描述：合成肽

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<212> PRT

<213> 人工序列

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<223> 人工序列之描述：合成肽

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<223> 人工序列之描述：合成肽

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<213> 人工序列

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<213> 人工序列

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<213> 人工序列

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<213> 人工序列

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<213> 人工序列

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<213> 人工序列

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<213> 人工序列

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<213> 人工序列

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<213> 人工序列

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<223> 人工序列之描述：合成肽

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<213> 人工序列

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<223> 人工序列之描述：合成肽

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<223> 人工序列之描述：合成肽

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<213> 人工序列

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<223> 人工序列之描述：合成肽

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<213> 人工序列

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<223> 人工序列之描述：合成肽

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<220>

<223> 人工序列之描述：合成肽

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<213> 人工序列

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<213> 人工序列

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<213> 人工序列

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<223> 人工序列之描述：合成肽

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<223> 人工序列之描述：合成肽

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<210> 1813

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成肽

<400> 1813

<210> 1814

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成肽

<400> 1814

<210> 1815

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成肽

<400> 1815

<210> 1816

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成肽

<400> 1816

<210> 1817

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成肽

<400> 1817

<210> 1818

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成肽

<400> 1818

<210> 1819

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成肽

<400> 1819

<210> 1820

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成肽

<400> 1820

<210> 1821

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成肽

<400> 1821

<210> 1822

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成肽

<400> 1822

<210> 1823

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成肽

<400> 1823

<210> 1824

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成肽

<400> 1824

<210> 1825

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成肽

<400> 1825

<210> 1826

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成肽

<400> 1826

<210> 1827

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成肽

<400> 1827

<210> 1828

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成肽

<400> 1828

<210> 1829

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成肽

<400> 1829

<210> 1830

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成肽

<400> 1830

<210> 1831

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成肽

<400> 1831

<210> 1832

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成肽

<400> 1832

<210> 1833

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成肽

<400> 1833

<210> 1834

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成六組胺酸標籤

<400> 1834

Claims (10)

1. 一種用於治療個體之癌症的醫藥組合物，其包含：(i)重組或合成之匹配之HLA之新抗原肽，辨識重組或合成之腫瘤特異性新抗原肽的腫瘤特異性新表位(neoepitope)之T細胞受體(TCR)的T細胞，或編碼該重組新抗原肽之多核苷酸；及(ii)醫藥上可接受之載劑；其中該新抗原肽之長度為8至100個胺基酸且編碼自GATA3基因中的框移(frameshift)突變所產生的序列，其中由GATA3基因中的框移突變所產生的該序列編碼以下序列：

   

   

   (SEQ ID NO：60)，其中該新抗原肽包含由該個體之癌細胞的GATA3基因所編碼或由該個體之癌細胞所表現的腫瘤特異性新表位，且其中該腫瘤特異性新表位並非由該個體之非癌細胞所表現，亦非由該非癌細胞之GATA3基因所編碼；且其中：(a)該個體表現由HLA-B07：02等位基因(allele)所編碼之MHC，且該腫瘤特異性新表位為EPHLALQPL或MFATLQRSSL；(b)該個體表現由HLA-B08：01等位基因所編碼之MHC，且該腫瘤特異性新表位為EPHLALQPL、FLKAESKIMF、IMKPKRDGYM、LHFCRSSIM、MFATLQRSSL或YMFLKAESKI；(c)該個體表現由HLA-A24：02等位基因所編碼之MHC，且該腫瘤 特異性新表位為MFLKAESKI或YMFLKAESKI；(d)該個體表現由HLA-A02：01等位基因所編碼之MHC，且該腫瘤特異性新表位為VLPEPHLAL；及/或(e)該個體表現由HLA-A03：01等位基因所編碼之MHC，且該腫瘤特異性新表位為VLWTTPPLQH。
2. 如請求項1之醫藥組合物，其中該腫瘤特異性新表位以500nM或更小結合親和力結合I類MHC分子。
3. 如請求項1之醫藥組合物，其中該醫藥組合物包含至少兩種不同之新抗原肽，其中編碼該至少兩種不同之新抗原肽之每一者之該腫瘤特異性新表位的基因為GATA3。
4. 如請求項1之醫藥組合物，其中：(i)該腫瘤特異性新表位具有VLWTTPPLQH(SEQ ID NO：1430)之序列，且該個體表現由A03：01 HLA等位基因所編碼之MHC分子；(ii)該腫瘤特異性新表位具有EPHLALQPL(SEQ ID NO：529)之序列，且該個體表現由B07：02或B08：01 HLA等位基因所編碼之MHC分子；(iii)該腫瘤特異性新表位具有FLKAESKIMF(SEQ ID NO：536)之序列，且該個體表現由B08：01 HLA等位基因所編碼之MHC分 子；(iv)該腫瘤特異性新表位具有IMKPKRDGYM(SEQ ID NO：550)之序列，且該個體表現由B08：01 HLA等位基因所編碼之MHC分子；(v)該腫瘤特異性新表位具有LHFCRSSIM(SEQ ID NO：556)之序列，且該個體表現由B08：01 HLA等位基因所編碼之MHC分子；(vi)該腫瘤特異性新表位具有MFATLQRSSL(SEQ ID NO：567)之序列，且該個體表現由B07：02或B08：01 HLA等位基因所編碼之MHC分子；(vii)該腫瘤特異性新表位具有MFLKAESKI(SEQ ID NO：568)之序列，且該個體表現由A24：02 HLA等位基因所編碼之MHC分子；(viii)該腫瘤特異性新表位具有VLPEPHLAL(SEQ ID NO：594)之序列，且該個體表現由A02.01 HLA等位基因所編碼之MHC分子；或(ix)該腫瘤特異性新表位具有YMFLKAESKI(SEQ ID NO：598)之序列，且該個體表現由A24：02或HLA等位基因所編碼之MHC分子。
5. 如請求項1之醫藥組合物，其中該癌症為乳癌，視情況其中該乳癌係 選自由以下組成之群：轉移乳癌、乳房侵襲性癌、乳房之管腔NS癌、HER-2陽性乳癌及MSI⁺乳癌。
6. 如請求項1之醫藥組合物，其中該醫藥組合物進一步包含佐劑、免疫檢查點抑制劑、來曲唑(letrozole)或氟維司群(fulvestrant)。
7. 如請求項1之醫藥組合物，其中該編碼該重組新抗原肽之多核苷酸為DNA或信使RNA(mRNA)。
8. 如請求項7之醫藥組合物，其中該醫藥組合物包含載體，該載體包含編碼該重組新抗原肽之多核苷酸，視情況其中該多核苷酸進一步包含在該新抗原肽之編碼序列之外的免疫調節序列。
9. 如請求項1之醫藥組合物，其中：(i)該重組或合成之匹配之HLA之新抗原肽包含多於10個胺基酸殘基；(ii)該重組或合成之匹配之HLA之新抗原肽在整段中包含疾病特異性胺基酸；(iii)該重組或合成之匹配之HLA之新抗原肽經內源性處理；(iv)該重組或合成之匹配之HLA之新抗原肽序列包含一或多個改變以改良該多肽之生物化學性質； (v)該重組或合成之匹配之HLA之新抗原肽包含一或多個改變以改良有效蛋白酶體處理肽之可能性；或(vi)該重組或合成之匹配之HLA之新抗原肽係經偶聯。
10. 如請求項1之醫藥組合物，其進一步包含多個重組或合成之匹配之HLA之新抗原肽，或編碼該多個重組或合成之匹配之HLA之新抗原肽之多核苷酸。

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