ES2900004T3 - Nueva inmunoterapia contra diversos tumores como el cáncer de pulmón, incluido el carcinoma de pulmón amicrocítico (NSCLC) - Google Patents

Nueva inmunoterapia contra diversos tumores como el cáncer de pulmón, incluido el carcinoma de pulmón amicrocítico (NSCLC) Download PDF

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Abstract

Péptido, a) consistente en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo consistente en la SEQ ID N.º 2, o b) consistente en una secuencia de aminoácidos que comprende una secuencia de aminoácidos acorde con la SEQ ID N.º 2 y dotado de una longitud total de hasta 14 aminoácidos, o una sal farmacéuticamente aceptable de a) o b)

Description

DESCRIPCIÓN
Nueva inmunoterapia contra diversos tumores como el cáncer de pulmón, incluido el carcinoma de pulmón amicrocítico (NSCLC)
La presente invención se refiere a péptidos, ácidos nucleicos y células para la utilización en métodos inmunoterapéuticos. En concreto, la presente invención se refiere a la inmunoterapia contra el cáncer. La presente descripción se refiere, además, a epítopos peptídicos de linfocitos T citotóxicos (c Tl ) asociados a tumor, solos o en combinación con otros péptidos asociados a tumor que sirven como principios activos farmacéuticos de composiciones vacunales que estimulan respuestas inmunitarias antitumorales. La presente descripción se refiere a 67 nuevas secuencias peptídicas y sus variantes derivadas de moléculas HLA de clase I y clase II de células tumorales humanas que pueden ser utilizadas en composiciones vacunales para desencadenar respuestas inmunitarias antitumorales.
Antecedentes de la invención
El cáncer de pulmón es el responsable de la mayoría de las muertes por cáncer en hombres y mujeres. Es el tipo de cáncer más importante en el mundo, tanto en términos de incidencia como de mortalidad. En el año 2008 se produjeron 1,61 millones de casos nuevos y 1,38 millones de muertes a causa del mismo. Europa y Norteamérica presentan las tasas más altas.
Desde 1987 el número de mujeres que fallece cada año a causa del cáncer de pulmón supera el de las fallecidas por cáncer de mama. En cambio, la mortalidad masculina ha descendido notablemente desde 1991 hasta 2003, con un ritmo aproximado del 1,9% anual. La mortalidad femenina por cáncer de pulmón se está estabilizando después de haber aumentado sin cesar durante varias décadas. Dichas tendencias en la mortalidad por cáncer de pulmón reflejan el descenso del consumo de tabaco en los últimos 30 años.
Según los cálculos del Instituto Nacional del Cáncer de Estados Unidos (NCI), en 2013 se producirán en ese país 230.
000 casos nuevos de cáncer de pulmón y 160. 000 muertes relacionadas con el mismo.
A efectos del tratamiento, el cáncer de pulmón se clasifica en microcítico o de células pequeñas (13%; SCLC, por sus siglas en inglés) y en amicrocítico o de células no pequeñas (87%; NSCLC, por sus siglas en inglés). El pronóstico es por lo general malo. En las personas con cáncer de pulmón, la supervivencia cinco años después del diagnóstico ronda el 15%. Con frecuencia en el momento del diagnóstico el cáncer ya presenta un estadio avanzado. En el diagnóstico, el 30%-40% de los casos de NSCLC se encuentra en el estadio IV y el 60% de los de SCLC se halla en ese mismo estadio IV.
El tratamiento depende del tipo (microcítico o amicrocítico) y del estadio tumoral y comprende: cirugía, radioterapia, quimioterapia y terapias biológicas dirigidas como bevacizumab (AVASTIN®) y erlotinib (TARCEVA®). El tratamiento de elección para los tumores localizados suele ser la cirugía. Estudios recientes indican que la administración de quimioterapia después de la cirugía mejora la supervivencia en los casos en que el cáncer de pulmón amicrocítico se encuentra en estadios iniciales. Como el cáncer suele estar diseminado en el momento en que es descubierto, con frecuencia se recurre simultáneamente a la radioterapia y la quimioterapia, a veces combinadas con la cirugía. El tratamiento de elección contra el cáncer de pulmón microcítico consiste en quimioterapia sola o combinada con radiación; con este régimen un gran porcentaje de pacientes experimenta remisión, que en ciertos casos es prolongada.
La supervivencia relativa a 1 año en el cáncer de pulmón ha mejorado ligeramente, pasando del 37% en 1975-1979 al 42% en 2002, en gran medida gracias a los avances en la técnica quirúrgica y los tratamientos combinados. No obstante, la supervivencia a 5 años en todos los estadios combinados apenas alcanza el 16%. Si el cáncer de pulmón se detecta cuando todavía está localizado la supervivencia aumenta hasta el 49%, pero solo el 16% de los casos se diagnostican en ese estadio inicial.
A la vista de esta situación, existe la necesidad de nuevas opciones terapéuticas eficaces y seguras contra las neoplasias malignas como el cáncer de pulmón, en particular contra el cáncer de pulmón amicrocítico (NSCLC), el cáncer gástrico y los tumores cerebrales de diversos fenotipos, que mejoren el bienestar del paciente reduciendo el número de quimioterápicos y otros agentes que pueden causar efectos secundarios graves.
La presente descripción emplea péptidos que estimulan el sistema inmunitario del paciente y que actúan como agentes antitumorales de forma no invasiva.
US2008/107668 A1 se refiere en general a la presentación de péptidos inmunogénicos que comprenden péptidos de epítopos derivados de proteínas que son expresadas por células cancerosas y a usos de dichos inmunógenos en el desencadenamiento de respuestas de linfocitos T citotóxicos (CTL) para el tratamiento del cáncer.
US2011/229504 A1, WO2009/153992 A1, WO2011/089921 A1 y EP1760088 A1, se refieren al uso de vacunas peptídicas basadas en péptidos asociados a tumores para el tratamiento del cáncer.
WO2009/111507 A1 da a conocer polipéptidos y comenta la participación de la MMP-12 en el cáncer. Hofmann et al. (2005) dan a conocer que la MMP-12 se expresa con profusión en tumores de NSCLC pero no en tejido pulmonar de control y que la expresión de la MMP-12 en el tumor NSCLC aparece correlacionada positivamente con el potencial metastásico, así como con un intervalo sin recidiva más corto en pacientes con NSCLC.
Yang et al. (2010) da a conocer anticuerpos MHC, composiciones farmacéuticas de los mismos y su uso para tratar el cáncer.
Ninguno de esos documentos da a conocer un péptido que comprenda una secuencia de aminoácidos conforme a la SEQ ID N.° 2 dotada de una longitud total de 14 aminoácidos.
Resumen de la invención
La presente invención se refiere a un péptido consistente en o que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N.° 2 como se deine en la reivindicación 1 anexa. Otros aspectos de la invención se definen en las reivindicaciones anexas.
En un primer aspecto se da a conocer un péptido que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo integrado por la SEQ ID N.° 2 o una secuencia variante de las mismas que es homóloga al menos en un 80%, preferiblemente al menos un 90% (preferiblemente idéntica al menos en un 80% o al menos en un 90%) a la SEQ ID N.° 2, en que dicha variante estimula linfocitos T que presentan reacción cruzada con dicho péptido, o con una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, no siendo dicho péptido un polipéptido entero.
También se da a conocer un péptido que comprende una secuencia seleccionada del grupo consistente en las SEQ ID N.° 2 o una variante de las mismas, que es homóloga al menos un 80%, preferiblemente al menos un 90%, (preferiblemente idéntica al menos en un 80% o al menos en un 90%) a la SEQ ID N.° 2, en que dicho péptido o variantes del mismo tiene una longitud total en el caso de la SEQ ID N.° 2 de entre 8 y 100, preferiblemente entre 8 y 30, y más preferiblemente de entre 8 y 14 aminoácidos.
La tabla siguiente muestra el péptido tal como se da conocer en la presente memoria, sus respectivas SEQ ID N.°, y las posibles proteínas originarias de este péptido.
Así pues, la presente descripción se refiere en concreto a un péptido de la presente descripción que comprende una secuencia conforme a la SEQ ID N.° 2 o una variante de la misma, que es homóloga al menos un 80%, preferiblemente al menos un 90%, (preferiblemente idéntica al menos en un 80% o al menos en un 90%) a la SEQ ID N.° 2, en que dicho péptido o variante del mismo tiene una longitud total de entre 12 y 100, preferiblemente de hasta 14 aminoácidos. La presente descripción se refiere en concreto a un péptido de la presente descripción consistente en la secuencia conforme a la SEQ ID N.° 2.
T l 1: El i l r n inv n i n
Figure imgf000003_0001
La presente descripción se refiere, además, a los péptidos dados a conocer en la presente memoria que tienen la capacidad de unirse a una molécula del complejo mayor de histocompatibilidad humano (MHC) de clase I o clase II. La presente descripción se refiere, además, a los péptidos dados a conocer en la presente memoria en que dichos péptidos consisten o consisten esencialmente en una secuencia de aminoácidos conforme a las SEQ ID N.° 2. La presente descripción se refiere, además, a los péptidos dados a conocer en la presente memoria, en que dicho péptido está modificado y/o incluye enlaces no peptídicos.
La presente descripción se refiere, además, a los péptidos dados a conocer en la presente memoria, en que dicho péptido forma parte de una proteína de fusión, en concreto fusionado con los aminoácidos N-terminales de la cadena invariable (Ii)asociada al antígeno HLA-DR, o fusionado con un anticuerpo (o integrado en la secuencia del mismo), como por ejemplo un anticuerpo que es específico de células dendríticas.
La presente descripción se refiere, además, a un ácido nucleico que codifica los péptidosdados a conocer en la presente memoria.
La presente descripción se refiere, además, al ácido nucleico dado a conocer en la presente memoria que es ADN, ADNc, APN, ARN o combinaciones de los mismos.
La presente descripción se refiere, además, a un vector de expresión capaz de expresar un ácido nucleico dado a conocer en la presente memoria.
La presente descripción se refiere, además, a un péptido dado a conocer en la presente memoria, a un ácido nucleico dado a conocer en la presente memoria o a un vector de expresión dado a conocer en la presente memoria para el uso en medicina.
La presente descripción se refiere, además, a anticuerpos dados a conocer en la presente memoria y a métodos para fabricarlos.
La presente descripción se refiere, además, a receptores de linfocitos T (TCR), en concreto TCR solubles (sTCR), dados a conocer en la presente memoria, así como a métodos para fabricarlos.
La presente descripción se refiere, además, a una célula hospedadora que comprende un ácido nucleico dado a conocer en la presente memoria o a un vector de expresión como el descrito antes.
La presente descripción se refiere, además, a la célula hospedadora dada a conocer en la presente memoria que es una célula presentadora de antígeno.
La presente descripción se refiere, además, a la célula hospedadora dada a conocer en la presente memoria en que la célula presentadora de antígeno es una célula dendrítica.
La presente descripción se refiere, además, a un método para la producción de un péptido dado a conocer en la presente memoria, comprendiendo dicho método el cultivo de la célula hospedadora dada a conocer en la presente memoria, y el aislamiento del péptido a partir de la célula hospedadora o de su medio de cultivo.
La presente descripción se refiere, además, a un método in vitro para la producción de linfocitos T citotóxicos (CTL) activados, comprendiendo el método la puesta en contacto in vitro de CTL con moléculas MHC de clase I o II humanas cargadas con antígeno expresadas en la superficie de una célula presentadora de antígeno adecuada durante el tiempo suficiente para activar dicho CTL de una manera específica del antígeno, siendo dicho antígeno cualquier péptido dado a conocer en la presente memoria.
La presente descripción se refiere, además, al método dado a conocer en la presente memoria, en que el antígeno se carga en moléculas MHC de clase I o II expresadas en la superficie de una célula presentadora de antígeno adecuada poniendo en contacto una cantidad suficiente de antígeno con la célula presentadora de antígeno.
La presente descripción se refiere, además, al método dado a conocer en la presente memoria en que la célula presentadora de antígeno comprende un vector de expresión capaz de expresar dicho péptido, el cual contiene las SEQ ID N.° 1 a SEQ ID N.° 92, preferiblemente las SEQ ID N.° 2, o secuencias de aminoácidos variantes de las mismas.
La presente descripción se refiere, además, a linfocitos T citotóxicos (CTL) activados, producidos con el método dado a conocer en la presente memoria, que reconocen selectivamente una célula que expresa de forma aberrante un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos dada a conocer en la presente memoria.
La presente descripción se refiere, además, a un método para destruir células diana en un paciente cuyas células diana expresan de forma aberrante un polipéptido que comprende cualquiera de las secuencias de aminoácidos dadas a conocer en la presente memoria, conteniendo el método de administración al paciente un número eficaz de linfocitos T citotóxicos (CTL) dados a conocer en la presente memoria.
La presente descripción se refiere, además, al uso como medicamento o en el proceso de fabricación de un medicamento de cualquiera de los péptidos descritos, de un ácido nucleico dado a conocer en la presente memoria, de un vector de expresión dado a conocer en la presente memoria, de una célula dada a conocer en la presente memoria, o de un linfocito T citotóxico activado dado a conocer en la presente memoria.
La presente descripción se refiere, además, a un uso dado a conocer en la presente memoria, en el que dicho medicamento es una vacuna.
La presente descripción se refiere, además, a un uso dado a conocer en la presente memoria, en el que el medicamento es activo contra el cáncer.
La presente descripción se refiere, además, a un uso dado a conocer en la presente memoria, en el que dichas células cancerosas son células de cáncer de pulmón, gástrico, gastrointestinal, colorrectal, de páncreas o de riñón, así como células de glioblastoma.
La presente descripción se refiere, además, a proteínas marcadoras y biomarcadores concretos basados en los péptidos dados a conocer en la presente memoria que pueden ser utilizados para el diagnóstico y/o el pronóstico del cáncer de pulmón, gástrico, gastrointestinal, colorrectal, de páncreas o de riñón, así como el glioblastoma.
Además, la presente descripción se refiere al uso de estas nuevas dianas para el tratamiento del cáncer.
La estimulación de la respuesta inmunitaria depende de la presencia de antígenos que sean reconocidos como extraños por el sistema inmunitario del hospedador. El descubrimiento de la existencia de antígenos asociados a tumor brinda la posibilidad de utilizar el sistema inmunitario del hospedador para contrarrestar el crecimiento tumoral. En la actualidad se están estudiando varios mecanismos para aprovechar los componentes humoral y celular del sistema inmunitario en la inmunoterapia contra el cáncer.
Elementos específicos de la respuesta inmunitaria celular son capaces de reconocer y destruir específicamente las células tumorales. El aislamiento de linfocitos T citotóxicos (CTL) a partir de poblaciones de células infiltradas en el tumor o de la sangre periférica apunta a su importante papel en la defensa inmunitaria natural contra el cáncer. En concreto, en dicha respuesta desempeñan un papel importante los linfocitos T CD8-positivos, los cuales reconocen péptidos incorporados en las moléculas de clase I del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC), que normalmente están compuestos por 8 a 10 residuos de aminoácidos procedentes de proteínas o productos ribosómicos defectuosos (DRIP) localizados en el citosol. Las moléculas MHC humanas también se denominan antígenos leucocitarios humanos (HLA).
Existen dos clases de moléculas MHC: Las moléculas MHC de clase I están presentes en la mayoría de las células nucleadas. Las moléculas MHC están compuestas por una cadena pesada alfa y beta-2-microglobulina (receptores de MHC de clase I) o por una cadena alfa y una cadena beta (receptores de MHC de clase II). La conformación tridimensional da como resultado una hendidura de unión que interviene en la interacción no covalente con los péptidos. Las MHC de clase I presentan péptidos derivados de la proteólisis de proteínas principalmente endógenas, DRIP y péptidos grandes. Las moléculas MHC de clase II se encuentran principalmente en células presentadoras de antígeno (APC) especializadas, donde básicamente presentan péptidos de proteínas exógenas o transmembrana que son adquiridos por las APC durante el proceso de endocitosis y después procesados. Los complejos formados por un péptido y moléculas MHC de clase I son reconocidos por linfocitos T citotóxicos CD8-positivos portadores del adecuado TCR (receptor de linfocito T), mientras que los complejos formados por un péptido y moléculas MHC de clase II son reconocidos por linfocitos T colaboradores CD4-positivos portadores del t Cr adecuado. Es sabido que los TCR, los péptidos y las MHC están presentes en una relación estequiométrica de 1:1:1.
Los linfocitos T colaboradores CD4-positivos desempeñan un papel importante en la inducción y en el mantenimiento de respuestas eficaces por parte de los linfocitos T citotóxicos CD8-positivos. La identificación de epítopos derivados de antígenos asociados a tumor (TAA) que sean reconocidos por los linfocitos T CD4-positivos reviste suma importancia para el desarrollo de medicamentos que estimulen una respuesta inmunitaria antitumoral (Kobayashi et al., 2002; Qin et al., 2003; Gnjatic et al., 2003).
Los linfocitos T colaboradores generan en el seno del tumor un entorno de citocinas que es propicio para los CTL (Mortara et al., 2006) y que atrae a las células efectoras, como por ejemplo los propios CTL, células NK, macrófagos, granulocitos (Hwang et al., 2007).
En ausencia de inflamación, la expresión de las moléculas MHC de clase II se circunscribe principalmente a las células del sistema inmunitario, en concreto a las células presentadoras de antígeno (APC) especializadas, como por ejemplo monocitos, células derivadas de monocitos, macrófagos y células dendríticas. En pacientes con cáncer se ha descubierto con sorpresa que las células tumorales expresan moléculas MHC de clase II (Dengjel et al., 2006).
En modelos de mamífero como el ratón se ha demostrado que los linfocitos T CD4-positivos pueden inhibir la manifestación de los tumores sin el concurso de las células efectoras CTL (los linfocitos T CD8-positivos) a través de la inhibición de la angiogénesis mediante la secreción de interferón gamma (IFN-y).
Además se ha demostrado que los linfocitos T CD4-positivos pueden contrarrestar la progresión tumoral mediante la inducción de respuestas de anticuerpos al reconocer péptidos de antígenos asociados a tumor presentados por moléculas HLA de clase II.
A diferencia de lo que sucede con los péptidos asociados a tumor reconocidos por moléculas HLA de clase I, hasta la fecha el número descrito de ligandos de clase II derivados de antígenos asociados a tumor (TAA) es pequeño.
Puesto que la expresión constitutiva de las moléculas HLA de clase II solo se da normalmente en las células inmunitarias, se creía imposible aislar péptidos de clase II directamente de los tumores primarios. Pero Dengjel et al. descubrieron varios epítopos de MHC de clase II en tumores (WO 2007/028574, EP 1760 088 B1; (Dengjel et al., 2006).
Los antígenos que son reconocidos por los linfocitos T citotóxicos específicos de tumor, es decir, sus epítopos, pueden ser moléculas derivadas de cualquier clase de proteína, como enzimas, receptores, factores de transcripción, etc. que se expresan y, en comparación con células inalteradas del mismo origen, están reguladas al alza en células del tumor correspondiente.
Como ambos tipos de respuesta, la dependiente de CD8 y la de CD4, contribuyen de modo conjunto y sinérgico al efecto antitumoral, la identificación y caracterización de los antígenos asociados a tumor que son reconocidos por los CTL CD8+ (ligando: molécula MHC de clase I epítopo peptídico) o por los linfocitos T colaboradores CD4-positivos (ligando: molécula MHC de clase II epítopo peptídico) es importante para el desarrollo de vacunas antitumorales.
La presente descripción también se refiere a dos nuevos y sumamente útiles péptidos MHC de clase II (conforme a las SEQ ID N.° 76 y 77). Estos péptidos son especialmente útiles para el diagnóstico y/o el tratamiento del cáncer gástrico, el NSCLC y otros tipos de cáncer que sobreexpresan y/o presentan en exceso la MMP12 y el POSTN, respectivamente.
La presente descripción también se refiere a las denominadas variantes de longitud de los péptidos MHC de clase II de la invención conformes a las SEQ ID N.° 76 o 77. Tal y como se ha mencionado antes, el péptido conforme a la SEQ ID N.° 76 consiste en la secuencia de aminoácidos INNYTPDMNREDVDYAIR (péptido de MMP12), y el péptido conforme a la SEQ ID N° 77 consiste en la secuencia de aminoácidos TNGVIHVVDKLLYPADT (péptido de Po St N-002). Las variantes de longitud son, en general, péptidos alargados por los extremos N- y/o C-terminal (entre 1 y 5, preferiblemente 1 a 10 aminoácidos) o acortados por los extremos N- y/o C-terminales (entre 1 y 5 aminoácidos), que pueden unirse a MHC y desencadenar una respuesta inmunitaria celular como se describe en la presente memoria. Es conocido en la técnica que los péptidos que se unen a proteínas de clase II no tienen limitaciones de tamaño y su longitud puede variar entre 11 y 30 aminoácidos. La hendidura de unión al péptido de las moléculas MHC de clase II está abierta por ambos extremos, lo que permite la unión de péptidos relativamente largos. Aunque el segmento «central» de nueve residuos de longitud es el principal implicado en el reconocimiento del péptido, las regiones situadas a ambos lados también son importantes para definir la especificidad del péptido con el alelo de clase II (véase, por ejemplo, Meydan C, et al., Prediction of peptides binding to MHC class I and II alleles by temporal motif mining. BMC Bioinformatics. 2013;14 Suppl 2:S13. Epub 2013 Jan 21). Por medio de las numerosas herramientas informáticas disponibles, como las susodichas, la persona versada en la técnica podrá identificar el motivo de unión y determinar así las posibilidades de extensión y/o deleción de los péptidos MHC de clase II conforme a las SEQ ID N.° 76 o 77, con el fin de crear variantes de longitud.
Para que un péptido desencadene una respuesta inmunitaria celular debe unirse a una molécula MHC. Este proceso depende del alelo de la molécula MHC y de polimorfismos específicos de la secuencia de aminoácidos del péptido. Los péptidos de unión a MHC de clase I suelen tener de 8 a 12 residuos de aminoácido de longitud y normalmente contienen en su secuencia dos residuos conservados («anclajes») que interactúan con la hendidura de unión correspondiente de la molécula MHC. De este modo cada alelo MHC posee un «motivo de unión» que determina qué péptidos se pueden unir específicamente a la hendidura de unión.
En la reacción inmunitaria dependiente de las MHC de clase I, los péptidos no solo tienen que ser capaces de unirse a ciertas moléculas MHC de clase I expresadas por las células tumorales, también tienen que ser reconocidos por linfocitos T portadores de receptores TCR específicos.
Los antígenos que son reconocidos por los linfocitos T citotóxicos específicos de tumor, esto es, sus epítopos, pueden ser moléculas derivadas de cualquier clase de proteína, como enzimas, receptores, factores de transcripción, etc. que se expresan y, en comparación con las células inalteradas del mismo origen, están reguladas al alza en células del tumor correspondiente.
La clasificación actual de los antígenos asociados a tumor comprende los siguientes grupos principales:
a) Antígenos cáncer-testículo: Los primeros TAA descubiertos que pueden ser reconocidos por linfocitos T pertenecen a esta clase, que inicialmente se denominó antígenos cáncer-testículo (CT) porque sus miembros se expresan en tumores humanos histológicamente diferentes y en los tejidos normales solo se encuentran en los espermatocitos/espermatogonias del testículo y ocasionalmente en la placenta. Como las células del testículo no expresan moléculas HLA de clase I y II, estos antígenos no pueden ser reconocidos por los linfocitos T de los tejidos normales y por tanto se consideran como específicos de tumor desde el punto de vista inmunológico. Ejemplos conocidos de antígenos CT son los miembros de la familia MAGE y el NY-ESO-1.
b) Antígenos de diferenciación: Estos TAA está presentes tanto en los tumores como en el tejido normal del que deriva el tumor; la mayoría se encuentran en melanomas y en melanocitos normales. Muchas de esas proteínas relacionadas con el linaje melanocítico participan en la biosíntesis de la melanina y no son específicas de tumor, lo que no impide que sean muy utilizadas en la inmunoterapia contra el cáncer. Algunos ejemplos son la tirosinasa y Melan-A/MART-1 en el melanoma y el PSA en el cáncer de próstata.
c) TAA sobreexpresados: Se han detectado genes que codifican TAA de amplia expresión en tumores histológicamente distintos y en numerosos tejidos normales, en general con niveles de expresión más bajos. Es posible que muchos de los epítopos procesados y posiblemente presentados por los tejidos normales lo sean por debajo del límite necesario para ser reconocidos por los linfocitos T, pero que la sobreexpresión por parte de las células tumorales rompa la tolerancia vigente hasta ese momento y desencadene la respuesta antitumoral.
Ejemplos destacados de esta clase de TAA son Her-2/neu, survivina, telomerasa o WT1.
d) Antígenos específicos de tumor: Estos TAA únicos son fruto de mutaciones de genes normales (como pcatenina, CDK4, etc.). Algunos de esos cambios moleculares están relacionados con la transformación neoplásica y/o su progresión. Los antígenos específicos de tumor generalmente son capaces de inducir potentes respuestas inmunitarias sin riesgo de reacciones autoinmunitarias contra los tejidos normales. Por otro lado, casi siempre estos TAA solo son relevantes para el mismo tumor exacto en el que fueron identificados y normalmente no se encuentran en muchos otros tumores de su tipo.
e) TAA resultantes de modificaciones postraduccionales anormales: Estos TAA pueden surgir a partir de proteínas que no son específicas ni se sobreexpresan en los tumores, pese a lo cual aparecen asociados a tumores por procesos postraduccionales que se activan principalmente en los tumores. Ejemplos de este tipo surgen a raíz de patrones de glucosilación alterados que generan epítopos nuevos en tumores como MUC1 o fenómenos como el ayuste de proteínas durante la degradación que en algunos casos pueden ser específicos de tumor.
f) Proteínas de oncovirus: Estos TAA son proteínas virales que podrían desempeñar un papel crítico en el proceso oncogénico y que, como extrañas a causa de su origen no humano, pueden desencadenar una respuesta de los linfocitos T. Ejemplos de tales proteínas son las proteínas E6 y E7 del virus del papiloma humano de tipo 16, que se expresan en el carcinoma cervical.
Para que las proteínas sean reconocidas por los linfocitos T citotóxicos como antígenos específicos o asociados a tumor y puedan ser utilizadas como tratamiento han de cumplir ciertos requisitos. El antígeno ha de expresarse principalmente en células tumorales y no en tejidos normales sanos, o de no ser así ha de hacerlo en cantidades comparativamente pequeñas; en otra forma de realización preferida el péptido debe ser presentado en exceso por células tumorales en comparación con los tejidos normales sanos. Además, no solo es conveniente que el antígeno esté presente en un tipo de tumor, sino que lo esté en concentraciones elevadas (número de copias del correspondiente péptido por célula). Los antígenos específicos de tumor y los asociados a tumor proceden con frecuencia de proteínas que intervienen directamente en la transformación de la célula normal en tumoral debido a su función en el control del ciclo celular o en la supresión de la apoptosis. Además, las dianas posteriores de las proteínas directamente responsables de la transformación pueden estar reguladas al alza y, por ende, estar vinculadas indirectamente con el tumor. Tales antígenos asociados indirectamente al tumor también pueden ser dianas de las vacunas antitumorales (Singh-Jasuja et al., 2004). En ambos casos es esencial que la secuencia de aminoácidos del antígeno contenga epítopos para que ese péptido («péptido inmunógeno») derivado de un antígeno asociado a tumor desencadene la respuesta de los linfocitos T en condiciones in vitro o in vivo.
Básicamente cualquier péptido capaz de unirse a una molécula MHC puede actuar como un epítopo de linfocito T. Un requisito para la inducción de la respuesta de los linfocitos T in vitro o in vivo es la presencia de linfocitos T dotados de un TCR adecuado y la ausencia de inmunotolerancia hacia ese epítopo concreto.
Por consiguiente, los TAA son un punto de partida para el desarrollo de una vacuna antitumoral. Los métodos de identificación y caracterización de los TAA están basados en el uso de CTL que pueden ser aislados de pacientes o de sujetos sanos, o bien están basados en la generación de perfiles de transcripción o patrones de expresión peptídica que difieren entre los tumores y los tejidos normales.
No obstante, la identificación de genes sobreexpresados o expresados selectivamente en tejidos tumorales o en estirpes de células tumorales humanas no aporta información precisa acerca del uso de los antígenos transcritos de esos genes en la inmunoterapia. Ello se explica porque solo una subpoblación individual de epítopos de esos antígenos resulta adecuada para aplicaciones de ese tipo, puesto que ha de haber un linfocito T con el TCR correspondiente y la inmunotolerancia hacia ese epítopo concreto ha de ser mínima o nula. En una forma de realización muy preferida de la descripciónes importante por tanto seleccionar únicamente aquellos péptidos que sean presentados en exceso o de forma selectiva contra los cuales se encuentre un linfocito T funcional y/o proliferativo. Ese linfocito T funcional se define como todo linfocito T que tras la estimulación con un antígeno específico experimenta expansión clonal y es capaz de ejecutar funciones efectoras («linfocito T efector»).
En el caso de los TCR y de los anticuerpos dados a conocer en la presente memoria la inmunogenicidad de los péptidos subyacentes es secundaria. En los TCR y en los anticuerpos dados a conocer en la presente memoria la presentación es el factor determinante.
Los linfocitos T colaboradores desempeñan un papel importante en la organización de la función efectora de los CTL en la inmunidad antitumoral. Los epítopos de linfocito T colaborador que desencadenan la respuesta de los linfocitos T colaboradores de tipo Thi sustentan las funciones efectoras de los linfocitos T citotóxicos CD8-positivos, que incluyen funciones citotóxicas contra las células tumorales que exhiben en su superficie complejos de péptido asociado a tumor/MHC. De ese modo los epítopos peptídicos asociados a tumor de los linfocitos T colaboradores, solos o en combinación con otros péptidos asociados a tumor, pueden servir como principios activos farmacéuticos de composiciones vacunales que estimulan respuestas inmunitarias antitumorales.
En la siguiente descripción de las proteínas de los péptidos dados a conocer en la presente memoria se dan a conocer diversas utilizaciones contra otros tipos de cáncer.
Descripción detallada de la invención
En la presente memoria todos los términos corresponden a la definición indicada a continuación, salvo en los casos en que se indique otra cosa.
El término «péptido» tal y como se utiliza en la presente memoria designa una serie de residuos de aminoácidos, conectados entre sí normalmente mediante enlaces peptídicos entre los grupos amino-alfa y carbonilo de los aminoácidos adyacentes. Los péptidos tienen preferiblemente 9 aminoácidos de longitud, pero pueden tener 8 aminoácidos y hasta 10, 11, 12, 13 o 14 de longitud, y, en el caso de los péptidos de MHC de clase II pueden tener hasta 15, 16, 17, 18, 19 o 20 aminoácidos de longitud.
Además, el término «péptido» incluye sales de una serie de residuos de aminoácidos, conectados entre sí normalmente por enlaces peptídicos entre los grupos amino-alfa y carbonilo de los aminoácidos adyacentes. Preferentemente las sales son sales farmacéuticamente aceptables.
El término «péptido» incluye «oligopéptido». El término «oligopéptido» tal y como se utiliza en la presente memoria designa una serie de residuos de aminoácidos, conectados entre sí normalmente por enlaces peptídicos entre los grupos amino-alfa y carbonilo de los aminoácidos adyacentes. La longitud del oligopéptido no es crucial para la invención, siempre que se mantenga el epítopo o epítopos adecuados. Los oligopéptidos suelen tener menos una longitud inferior a unos 30 y mayor de 15 residuos de aminoácidos, aproximadamente.
El término «los péptidos de la presente descripción" incluirá el péptido del que consiste o comprende un péptido tal y como se ha definido antes según las SEQ ID N.° 1 a SEQ ID N.° 92.
El término «polipéptido» designa una serie de residuos de aminoácidos conectados entre sí normalmente por enlaces peptídicos entre los grupos amino-alfa y carbonilo de los aminoácidos adyacentes. La longitud del polipéptido no es crucial para ladescripción, siempre que contenga los epítopos adecuados. A diferencia de los términos «péptido» y «oligopéptido», el término «polipéptido» se refiere a moléculas que contengan más de unos 30 residuos de aminoácidos de longitud.
Un péptido, oligopéptido, proteína o polinucleótido que codifica dicha molécula es «inmunogénico» (y, por lo tanto, es un «inmunógeno» en la presente descripción) si es capaz de inducir una respuesta inmunitaria. En el caso de la presente descripción, la inmunogenicidad se define más específicamente como la capacidad para desatar una respuesta por parte de los linfocitos T. Por lo tanto, un «inmunógeno» sería una molécula que es capaz de inducir una respuesta inmunitaria, y en el caso de la presente descripción, una molécula capaz de inducir una respuesta de los linfocitos T. En otro aspecto, el inmunógeno puede ser el péptido, el complejo del péptido con MHC, el oligopéptido y/o la proteína que es utilizado para generar anticuerpos o TCR específicos contra él.
Un «epítopo» de linfocito T de clase I requiere un péptido corto que esté unido a un receptor MHC de clase I, formando un complejo ternario (cadena alfa de m Hc de clase I, beta-2-microglobulina y péptido) que puede ser reconocido por un linfocito T que lleve un receptor de linfocito T que coincida y que se una al complejo MHC/péptido con la afinidad adecuada. Los péptidos que se unen a las moléculas MHC de clase I suelen tener una longitud de entre 8 y 14 aminoácidos, y habitualmente de 9.
En el ser humano hay tres locus genéticos diferentes que codifican las moléculas MHC de clase I (las moléculas MHC del ser humano también se denominan antígenos leucocitarios humanos (HLA)):HLA-A, HLA-B y HLA-C. HLA-A*01, HLA-A*02 y HLA-B*07 son ejemplos de distintos alelos de MHC de clase I que se pueden expresar a partir de esos locus.
Tabla 2 : Frecuencias de expresión F del HLA*A02 y de los serotipos HLA-DR más frecuentes. Las frecuencias se infieren de las frecuencias haplotípicas Gf en la población norteamericana adaptadas de Mori y cols. (Mori et al., 1997) empleando la fórmula de Hardy-Weinberg F=1-(1-Gf)2. Las combinaciones de A*02 con determinados alelos HLA-DR podrían ser más abundantes o menos de lo esperado a partir de sus frecuencias aisladas debido al ili ri li mi n . P r m ll v h n k l . h n k l. 2 4.
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continuación
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Por tanto, a efectos terapéuticos y de diagnóstico sería muy deseable contar con un péptido que se una, con la afinidad adecuada, a varios receptores HLA de clase II distintos. Un péptido que se une a varias moléculas HLA de clase II distintas recibe el nombre de ligando promiscuo.
En la presente memoria, la referencia a una secuencia de ADN incluye tanto el ADN monocatenario como el bicatenario. Por lo tanto, la secuencia específica, a menos que el contexto indique otra cosa, se refiere al ADN monocatenario de dicha secuencia, a la doble cadena formada por dicha secuencia con su complementaria (ADN bicatenario) y a la cadena complementaria de dicha secuencia. El término «región codificante» hace referencia a la porción de un gen que, o bien de forma natural o normal, codifica el producto de expresión de dicho gen en su ambiente genómico natural, por ejemplo, la región que codifica in vivo el producto de expresión natural del gen.
La región codificante puede formar parte de un gen normal, mutado o alterado, o incluso puede provenir de una secuencia de ADN, o gen, sintetizada íntegramente en el laboratorio con métodos bien conocidos por los expertos en la síntesis de ADN.
El término «secuencia nucleotídica» hace referencia a un heteropolímero de desoxirribonucleótidos.
La secuencia nucleotídica que codifica un péptido, oligopéptido o polipéptido, en particular puede ser natural o estar construida de forma sintética. Generalmente, los segmentos de a Dn que codifican los péptidos, polipéptidos y proteínas de la presente descripción se ensamblan a partir de fragmentos de ADNc y ligadores cortos de oligonucleótidos, o a partir de una serie de oligonucleótidos, con el fin de proporcionar un gen sintético capaz de ser expresado en una unidad transcripcional recombinante que comprenda elementos reguladores derivados de un operón microbiano o vírico.
Tal y como se utiliza en la presente memoria el término «un nucleótido que codifica un péptido» se refiere a una secuencia de nucleótidos que codifica el péptido y que incluye codones artificiales (sintetizados por el hombre) de inicio y terminación compatibles con el sistema biológico en el que la secuencia va a expresarse.
El término «producto de expresión» define al polipéptido o a la proteína que es el producto de traducción natural de la traducción del gen y cualquier secuencia de ácidos nucleicos que codifiquen los equivalentes resultantes de la degeneración del código genético y, por tanto, que codifican el mismo aminoácido o aminoácidos.
El término «fragmento», cuando se refiere a una secuencia codificante, define una porción de ADN que no comprende la región codificante entera, cuyo producto de expresión retiene esencialmente la misma actividad o función biológica que el producto de expresión de la región codificante completa.
El término «segmento de ADN» hace referencia a un polímero de ADN, en forma de un fragmento separado o como componente de un constructo de ADN mayor, que deriva de ADN aislado por lo menos una vez en una forma sustancialmente pura, es decir, sin materiales endógenos contaminantes y en una cantidad o concentración que permite la identificación, la manipulación y la recuperación del segmento y de sus secuencias de nucleótidos constituyentes mediante métodos bioquímicos estándar como, por ejemplo, mediante un vector de clonación. Dichos segmentos se suministran en forma de un marco de lectura abierto sin interrupciones por secuencias internas no traducidas, o intrones, que suelen estar presentes en los genes eucariotas. Las secuencias de ADN no traducidas pueden estar presentes en dirección 3' (downstream) desde el marco de lectura abierto, donde no interfieren con la manipulación o la expresión de las regiones codificantes.
El término «cebador» define una secuencia corta de ácidos nucleicos que puede aparearse con una cadena de ADN y que proporciona un extremo 3'OH libre en el que una polimerasa de ADN puede comenzar la síntesis de una cadena de desoxirribonucleótidos.
El término «promotor» define una región de ADN implicada en la unión de la polimerasa de ARN para iniciar la transcripción.
El término «aislado» define el material que se extrae de su entorno original (por ejemplo, el entorno natural si ocurre de forma natural). Por ejemplo, un polinucleótido o un polipéptido natural presente en un animal vivo no está aislado, pero el mismo polinucleótido o polipéptido, separado de parte o de todos los materiales coexistentes en el sistema natural, está aislado. Dichos polinucleótidos podrían ser parte de un vector y/o dichos polinucleótidos o polipéptidos podrían ser partes de una composición y seguir estando aislados de forma que dicho vector o composición no fuera parte de su entorno natural.
Los polinucleótidos, y los polipéptidos recombinantes o inmunógenos, descritos de acuerdo con la presente descripción también pueden presentarse en una forma «purificada». El término «purificado» no implica pureza absoluta; más bien, se utiliza como definición relativa y puede incluir preparaciones altamente purificadas o preparaciones tan sólo parcialmente purificadas, tal y como los expertos en la materia entienden dichos términos. Por ejemplo, los clones individuales aislados de una genoteca de ADNc se han purificado de manera convencional hasta obtener una homogeneidad electroforética. Se contempla expresamente la purificación del material de inicio o del material natural hasta, al menos, un orden de magnitud; preferiblemente, dos o tres órdenes de magnitud; y, con mayor preferencia, cuatro o cinco órdenes de magnitud. Además, se contempla expresamente el polipéptido reivindicado que tiene una pureza de, preferiblemente, el 99,999%, o, al menos, del 99,99% o el 99,9%; y, más convenientemente, del 99% por peso o mayor.
Los productos de expresión de los polipéptidos y los ácidos nucleicos descritosen la presente memoria, así como los vectores de expresión que contienen dichos ácidos nucleicos y/o dichos polipéptidos, pueden utilizarse en «forma enriquecida». Tal y como se usa aquí, el término «enriquecido» significa que la concentración del material es, al menos, unas 2, 5, 10, 100 o 1000 veces su concentración natural (por ejemplo), más ventajosamente 0,01% por peso, y, preferiblemente, aproximadamente de 0,1% al menos, por peso. También se contemplan preparaciones enriquecidas de alrededor del 0,5%, 1%, 5%, 10% y 20% por peso. Las secuencias, constructos, vectores, clones y otros materiales que comprenden la presente descripción pueden utilizarse, según convenga, en su forma enriquecida o aislada.
El término «fragmento activo» define un fragmento que genera una respuesta inmunitaria(es decir, que posee actividad inmunógena) cuando se administra - solo u, opcionalmente, con un adyuvante adecuado - a un animal, que puede ser un mamífero como, por ejemplo, un conejo o un ratón, sin excluir a un ser humano; dicha respuesta inmunitaria adopta la forma de estimulación de una respuesta de linfocitos T en el animal receptor como, por ejemplo, el ser humano. De forma alternativa, el «fragmento activo» también se puede usar para inducir una respuesta de linfocitos T in vitro.
Tal y como se usan aquí, los términos «porción», «segmento» y «fragmento», cuando se utilizan en relación a los polipéptidos, hacen referencia a una secuencia continua de residuos, como residuos de aminoácidos, secuencia que es un subconjunto de una secuencia mayor. Por ejemplo, si un polipéptido se somete a un tratamiento con cualquiera de las endopeptidasas habituales, como la tripsina o la quimotripsina, los oligopéptidos resultantes de dicho tratamiento representarán porciones, segmentos o fragmentos del polipéptido inicial. Utilizados en relación con los polinucleótidos, dichos términos se refieren a los productos generados por el tratamiento de dichos polinucleótidos con cualquiera de las endonucleasas habituales.
Conforme a la presente descripción, el término «identidad porcentual» o «porcentaje idéntico», al referirse a una secuencia, significa que una secuencia se compara con una secuencia reivindicada o descrita después de alinear la secuencia que se va a comparar (la «secuencia comparada») con la secuencia descrita o reivindicada (la «secuencia de referencia»). La identidad porcentual se determina entonces con la siguiente fórmula:
Identidad porcentual = 100 [1 -(C/R)]
donde C es el número de diferencias entre la secuencia de referencia y la secuencia comparada a lo largo de la alineación entre la secuencia de referencia y la secuencia comparada, donde
(i) cada base o aminoácido de la secuencia de referencia que no tiene una base o aminoácido alineados en la secuencia comparada y
(ii) cada hueco de la secuencia de referencia y
(iii) cada base o aminoácido alineado de la secuencia de referencia que difiere de una base o aminoácido alineado de la secuencia comparada, constituye una diferencia y
(iiii) la alineación tiene que comenzar en la posición 1 de las secuencias alineadas;
y R es el número de bases o aminoácidos de la secuencia de referencia a lo largo de la alineación con la secuencia comparada con cualquier hueco creado en la secuencia de referencia, también contabilizado como una base o un aminoácido.
Si existe una alineación entre la secuencia comparada y la secuencia de referencia para la que la identidad porcentual, calculada como se ha especificado arriba, es aproximadamente igual o mayor que una identidad porcentual mínima especificada, entonces la secuencia comparada guarda la identidad porcentual mínima especificada con la secuencia de referencia, aunque puedan existir alineaciones en las que la identidad porcentual calculada arriba resulte menor que la identidad porcentual especificada.
Los péptidos originales (no modificados) descritos aquí se pueden modificar mediante la sustitución de uno o más residuos en sitios diferentes, posiblemente selectivos, dentro de la cadena peptídica, si no se especifica de otra manera.
Preferentemente tales sustituciones estarían situadas al final de la cadena de aminoácidos. Dichas sustituciones pueden ser de naturaleza conservadora como, por ejemplo, si un aminoácido es reemplazado por un aminoácido de estructura y características similares, como en el caso de un aminoácido hidrofóbico que es sustituido por otro aminoácido hidrofóbico. Aún más conservador sería el reemplazo de aminoácidos de tamaño y naturaleza química igual o similar como, por ejemplo, si una leucina se reemplaza por isoleucina. En diversos estudios de variaciones de secuencias en familias de proteínas homólogas naturales, determinadas sustituciones de aminoácidos se toleran con más frecuencia que otras, y éstas muestran a menudo una correlación con similitudes de tamaño, carga, polaridad e hidrofobicidad entre el aminoácido original y su reemplazo, siendo ésta la base para la definición de las «sustituciones conservadoras».
Las sustituciones conservadoras se definen como intercambios dentro de uno de los cinco grupos siguientes: Grupo 1: residuos alifáticos pequeños, no polares o ligeramente polares (Ala, Ser, Thr, Pro, Gly); Grupo 2: residuos polares cargados negativamente y sus amidas (Asp, Asn, Glu, Gln); Grupo 3: residuos polares cargados positivamente (His, Arg, Lys); Grupo 4: residuos alifáticos grandes no polares (Met, Leu, Ile, Val, Cys); y Grupo 5: residuos grandes aromáticos (Phe, Tyr, Trp).
Las sustituciones menos conservadoras pueden implicar el reemplazo de un aminoácido por otro con características similares pero diferenciado de alguna manera en el tamaño, como en el reemplazo de un residuo de isoleucina por alanina. Los reemplazos muy poco o nada conservadores pueden implicar la sustitución de un aminoácido ácido por otro polar, o incluso por uno de carácter básico. Estas sustituciones «radicales» no se pueden descartar, sin embargo, como potencialmente inefectivas, ya que los efectos químicos no son totalmente predecibles y las sustituciones radicales bien pueden provocar efectos inesperados imposibles de predecir de otra forma a partir de principios químicos simples.
Naturalmente, dichas sustituciones pueden implicar otras estructuras distintas de los aminoácidos L habituales. De esta forma, aminoácidos D podrían sustituir a los aminoácidos L que habitualmente se encuentran en los péptidos antigénicos de la descripción y, aún así, quedar englobados en la descripción de la presente memoria. Además, los aminoácidos que contienen grupos R no estándar (es decir, grupos R distintos de los que se encuentran en los 20 aminoácidos comunes de las proteínas naturales) también se pueden usar para hacer sustituciones, con el fin de producir inmunógenos y polipéptidos inmunógenosdados a conocer en la presente memoria.
Si se descubre que las sustituciones en más de una posición resultan en un péptido con actividad antigénica sustancialmente equivalente o mayor, como se define más abajo, entonces las combinaciones de dichas sustituciones se probarán para determinar si las sustituciones combinadas provocan efectos aditivos o sinérgicos en la antigenicidad del péptido. Como máximo, se sustituirán hasta 4 posiciones simultáneamente dentro del péptido.
Los péptidos de la descripción se pueden alargar hasta cuatro aminoácidos, es decir, se pueden añadir 1, 2, 3 o 4 aminoácidos en cualquier combinación entre 4:0 y 0:4.
En la Tabla 3 se exponen combinaciones de las elongaciones dadas a conocer en la presente memoria:
C-terminal N-terminal
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Los aminoácidos para la elongación pueden ser péptidos de la secuencia original de la proteína o cualquier otro aminoácido. La elongación tiene por finalidad mejorar la estabilidad o la solubilidad de los péptidos.
El término «respuesta de linfocitos T» define la proliferación y la activación específicas de las funciones efectoras inducidas por un péptido in vitro o in vivo. En el caso de los linfocitos T citotóxicos (CTL) restringidos a MHC de clase I, las funciones efectoras pueden consistir en la lisis de células diana presentadoras naturales de péptido o bien sensibilizadas de manera repetida con un péptido o con un precursor del mismo; la secreción de citocinas, preferiblemente de interferón gamma, TNF-alfa o IL-2 inducida por péptido; la secreción de moléculas efectoras, preferiblemente granzimas o perforinas inducidas por péptido; o la desgranulación.
Preferiblemente, cuando los CTL específicos para un péptido de la SEQ ID N.° 1 a la SEQ ID N.° 92 se prueben contra los péptidos sustituidos, la concentración de péptido a la cual los péptidos sustituidos consiguen la mitad del aumento máximo de la lisis respecto al valor de fondo es como máximo de alrededor de 1 mM, preferiblemente como máximo de alrededor de 1 jM, más preferiblemente como máximo de alrededor de 1 nM, y aún más preferentemente como máximo de alrededor de 100 pM, y más preferentemente como máximo de alrededor de 10 pM. También se prefiere que el péptido sustituido sea reconocido por los CTL de más de un individuo, de al menos dos, y más preferiblemente de tres individuos.
Así pues, los epítopos de la presente descripción pueden ser idénticos a los epítopos específicos de tumor o asociados a tumor naturales o pueden incluir epítopos que difieran como máximo en 4 residuos del péptido de referencia, siempre que conserven básicamente la misma actividad antigénica.
La estimulación de la respuesta inmunitaria depende de la presencia de antígenos, reconocidos como extraños por el sistema inmunitario del hospedador. El descubrimiento de la existencia de antígenos asociados a tumores ha abierto la posibilidad de utilizar el sistema inmunitario del hospedador para intervenir en el crecimiento del tumor. En la inmunoterapia del cáncer, actualmente se están explorando diversos mecanismos para aprovechar las ramas humoral y celular del sistema inmunitario.
Elementos específicos de la respuesta inmunitaria celular son capaces de reconocer y destruir las células tumorales. El aislamiento de linfocitos T citotóxicos (CTL) entre poblaciones de células infiltradas en el tumor o en sangre periférica sugiere que dichas células desempeñan una función importante en las defensas inmunitarias naturales contra el cáncer. En particular, en esta respuesta desempeñan una importante función los linfocitos T CD8 positivos (CD8+), los cuales reconocen moléculas de clase I de los péptidos portadores del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) de entre, normalmente, 8 y 12 residuos, que derivan de proteínas o de productos ribosómicos defectuosos (DRIP) localizados en el citosol. Las moléculas MHC humanas también se designan antígenos leucocitarios humanos (HLA).
Las moléculas MHC de clase I se encuentran en la mayoría de las células nucleadas que presentan péptidos resultantes de la escisión proteolítica de proteínas principalmente endógenas, citosólicas o nucleares, DRIPS y péptidos más largos. A pesar de lo anterior, en las moléculas MHC de clase I también se suelen encontrar péptidos derivados de compartimentos endosómicos o fuentes exógenas. En la bibliografía sobre el tema, a esta forma de presentación de clase I poco habitual se la denomina presentación cruzada.
Teniendo en cuenta que ambos tipos de respuesta, la dependiente de CD8 y de CD4, contribuyen conjuntamente y de forma sinérgica al efecto antitumoral, el desarrollo de vacunas antitumorales requiere de la identificación y caracterización de antígenos asociados a tumor que sean reconocidos por los linfocitos T citotóxicos CD8+ (molécula MHC de clase I) o CD4+ (molécula MHC de clase II). Un objeto de la presente descripción es, por tanto, proporcionar composiciones de péptidos dotadas de péptidos que se unan a complejos MHC de ambas clases.
A la luz de los efectos secundarios graves y los gastos que supone el tratamiento contra el cáncer es evidente la urgente necesidad de mejora de los métodos pronósticos y diagnósticos. Así pues, existe la necesidad de descubrir otros factores que puedan servir como biomarcadores para el cáncer en general y el cáncer de pulmón en particular. Existe igualmente la necesidad de identificar factores que puedan ser utilizados en el tratamiento contra el cáncer en general y contra el cáncer de pulmón en particular.
La presente descripción proporciona péptidos que son útiles para el tratamiento de cánceres/tumores, preferentemente de pulmón, más preferentemente de carcinoma de pulmón amicrocítico (NSCLC) que sobrepresentan o presentan exclusivamente los péptidos de la descripción. Con técnicas de espectrometría de masas se ha demostrado la presentación natural por moléculas HLA de estos péptidos en muestras de cáncer de pulmón primario humano (véanse ejemplo 1 y figura 1).
Se ha demostrado que el gen o proteína originarios (también denominados «proteína entera» o «proteína subyacente») de la que derivan los péptidos están altamente sobreexpresados en el carcinoma de pulmón amicrocítico, y en el caso de las SEQ ID N.° 66 a 75 en el cáncer gástrico y en el glioblastoma en comparación con tejidos normales (véase ejemplo 2 y figura 2 para el NSCLC) lo que demuestra el alto grado de asociación con el tumor de los genes originarios. Además, los propios péptidos están fuertemente sobrepresentados en el tejido tumoral pero no en los tejidos normales (véanse ejemplo 3 y figura 3). .
Los péptidos de unión a HLA pueden ser reconocidos por el sistema inmunitario, específicamente por los linfocitos T. Los linfocitos T destruyen las células que presentan el complejo HLA/péptido reconocido, p. ej. células de cáncer de pulmón que presentan los péptidos derivados.
Los péptidos de la presente descripción han demostrado su capacidad para estimular las respuestas de los linfocitos T y/o están sobrepresentados y, por tanto, pueden ser utilizados para la producción de anticuerpos y/o TCR, en concreto TCR solubles, dados a conocer en la presente memoria (véanse ejemplo 4 y figura 4). Asimismo, cuando los péptidos están acomplejados con el MHC correspondiente pueden ser utilizados para la producción de anticuerpos y/o TCR, en concreto t Cr solubles, dados a conocer en la presente memoria también. Los métodos pertinentes son conocidos por los expertos y también se pueden hallar en la bibliografía pertinente. Así pues, los péptidos de la presente descripción son útiles para generar en un paciente una respuesta inmunitaria con la que destruir células tumorales. La respuesta inmunitaria se puede inducir en el paciente con la administración directa de los péptidos descritos o de sustancias precursoras adecuadas (p. ej. péptidos alargados, proteínas o ácido nucleicos que codifiquen dichos péptidos), idealmente en combinación con un agente que potencie la inmunogenicidad (un adyuvante). Cabe esperar que la respuesta inmunitaria generada por esa vacunación terapéutica sea muy específica contra las células tumorales porque los tejidos normales no contienen los péptidos diana de la presente descripción en un número comparable de copias, lo cual evita el riesgo de reacciones autoinmunitarias perjudiciales contra las células normales del paciente.
Las composiciones farmacéuticas comprenden los péptidos en forma libre o en forma de una sal farmacéuticamente aceptable. Tal y como se utiliza aquí, una «sal aceptable desde el punto de vista farmacéutico» hace referencia a un derivado de los péptidos revelados en el que el péptido se modifica elaborando sales ácidas o básicas del agente. Por ejemplo, las sales ácidas se preparan a partir de la base libre (normalmente la forma neutra del fármaco tiene un grupo -N H 2 neutro), lo que implica la reacción con un ácido adecuado. Los ácidos adecuados para preparar sales ácidas incluyen tanto los ácidos orgánicos, como por ejemplo ácido acético, propiónico, glicólico, pirúvico, oxálico, málico, malónico, succínico, maléico, fumárico, tartárico, cítrico, benzoico, cinnámico, mandélico, metanosulfónico, etanosulfónico, p-toluenosulfónico, salicílico y similares, como también los inorgánicos, como por ejemplo clorhídrico, bromhídrico, sulfúrico, nítrico, fosfórico y similares. A la inversa, las sales básicas de fracciones ácidas que pueden estar presentes en un péptido se preparan utilizando una base aceptable desde el punto de vista farmacéutico, como por ejemplo hidróxido de sodio, hidróxido de potasio, hidróxido de amonio, hidróxido de calcio, trimetilamina o similares.
En una forma de realización especialmente preferida, las composiciones farmacéuticas comprenden los péptidos en forma de sales de ácido acético (acetatos), trifluoroacetatos o ácido clorhídrico (cloruros).
Además de su utilidad para el tratamiento del cáncer, los péptidos de la presente descripción también son útiles con fines diagnósticos. Debido a que los péptidos se generaron a partir de células de cáncer de pulmón y a que se determinó que no estaban o que estaban presentes en cantidades inferiores en los tejidos normales, estos péptidos pueden usarse para diagnosticar la presencia de un cáncer.
La presencia de los péptidos reivindicados en biopsias de tejidos puede ayudar al patólogo en el diagnóstico del cáncer. El patólogo puede saber si el tejido es maligno o está inflamado o afectado en general por medio de la detección de determinados péptidos con anticuerpos, espectrometría de masas u otros métodos conocidos por los expertos en la materia. La presencia de grupos de péptidos puede permitir la clasificación o subclasificación de los tejidos afectados.
La detección de péptidos en muestras de tejido enfermo permite decidir acerca del beneficio de terapias que impliquen al sistema inmunitario, especialmente si se sabe o se espera que los linfocitos T intervengan en el mecanismo de acción. La pérdida de expresión de MHC es un mecanismo bien conocido mediante el cual las células malignas o infectadas escapan a la vigilancia del sistema inmunitario. De esta forma, la presencia de los péptidos demuestra que las células analizadas no hacen uso de este mecanismo.
Los péptidos de la presente descripción pueden utilizarse para analizar las respuestas de los linfocitos contra dichos péptidos, como las respuestas de los linfocitos T o de los anticuerpos contra el péptido o el péptido unido a moléculas MHC. Estas respuestas linfocitarias pueden usarse como marcadores de pronóstico para decidir las siguientes etapas de la terapia. Estas respuestas también pueden usarse como marcadores indirectos en enfoques inmunoterapéuticos dirigidos a inducir respuestas de linfocitos por medios distintos, como, por ejemplo, mediante vacunación con proteínas, ácidos nucleicos, material autólogo o la transferencia de linfocitos a un receptor. En la terapia génica, las respuestas de los linfocitos contra los péptidos se pueden tener en cuenta en el momento de valorar los efectos secundarios. La monitorización de las respuestas de los linfocitos también puede ser una herramienta valiosa en los estudios de seguimiento de terapias de trasplante como, por ejemplo, para detectar las enfermedades de injerto contra el hospedador y del hospedador contra el injerto.
Los péptidos de la presente descripción pueden usarse para generar y desarrollar anticuerpos específicos contra complejos MHC/péptido. Estos pueden ser utilizados como terapia para dirigir toxinas o sustancias radiactivas contra el tejido enfermo. Otra aplicación de estos anticuerpos consistiría en dirigir radionúclidos contra el tejido enfermo en aplicaciones de diagnóstico por la imagen como la TEP. Este uso puede ayudar a detectar metástasis pequeñas o determinar el tamaño y la ubicación precisa de los tejidos enfermos.
Por tanto, existe otro aspecto de la descripción que proporciona un método para producir un anticuerpo recombinante que se une específicamente a un complejo mayor de histocompatibilidad humano (MHC) de clase I o II que forma un complejo con un antígeno restringido a HLA, comprendiendo dicho método: inmunizar un mamífero no humano modificado genéticamente que comprenda células que expresen dicho complejo mayor de histocompatibilidad humano (MHC) de clase I o II con una forma soluble de una molécula MHC de clase I o II unida a dicho antígeno restringido a HLA; aislamiento de moléculas de ARNm a partir de células productoras de anticuerpos de dicho mamífero no humano; producción de una fagoteca que contenga moléculas proteicas codificadas por dichas moléculas de ARNm; y aislamiento de al menos un fago de dicha fagoteca, en que al menos ese fago contenga dicho anticuerpo que se une específicamente al citado complejo mayor de histocompatibilidad humano (MHC) de clase I o II unido con dicho antígeno restringido a HLA.
Existe otro aspecto más de la descripción que proporciona un anticuerpo que se une específicamente a un complejo mayor de histocompatibilidad humano (MHC) de clase I o II que forma un complejo con un antígeno restringido a HLA, en el que el anticuerpo es preferentemente un anticuerpo policlonal, anticuerpo monoclonal, anticuerpo biespecífico y/o un anticuerpo quimérico.
Existe otro aspecto más de la presente descripción relacionado con un método para producir dicho antígeno que se une específicamente a un complejo mayor de histocompatibilidad humano (MHC) de clase I o II que forma un complejo con un antígeno restringido a HLA, comprendiendo dicho método: inmunizar un mamífero no humano modificado genéticamente que comprende células que expresan dicho complejo mayor de histocompatibilidad humano (MHC) de clase I o II con una forma soluble de una molécula MHC de clase I o II que forma un complejo con dicho antígeno restringido a HLA; aislamiento de moléculas de ARNm a partir de células productoras de anticuerpos de dicho mamífero no humano; producción de una fagoteca que contenga moléculas proteicas codificadas por dichas moléculas de ARNm; y aislamiento de al menos un fago de dicha fagoteca, en que al menos ese fago contenga dicho anticuerpo que puede unirse específicamente al citado complejo mayor de histocompatibilidad humano (MHC) de clase I o II formando un complejo con dicho antígeno restringido a HLA. Métodos pertinentes para la producción de tales anticuerpos y de complejos mayores de histocompatibilidad de clase I monocatenarios, así como de otras herramientas para la producción estos anticuerpos se revelan en WO 03/068201, WO 2004/084798,WO 01/72768, WO 03/070752, y en Cohen CJ, Denkberg G, Lev A, Epel M, Reiter Y. Recombinant antibodies with MHC-restricted, peptide-specific, T-cell receptor-like specificity: new tools to study antigen presentation and TCR-peptide-MHC interactions. J Mol Recognit. 2003 Sep-Oct;16(5):324-32. ; Denkberg G, Lev A, Eisenbach L, Benhar I, Reiter Y. Selective targeting of melanoma and APCs using a recombinant antibody with TCR-like specificity directed toward a melanoma differentiation antigen. J Immunol. 2003 Sep 1;171(5):2197-207; y en Cohen CJ, Sarig O, Yamano Y, Tomaru U, Jacobson S, Reiter Y. Direct phenotypic analysis of human MHC class I antigen presentation: visualization, quantitation, and in situ detection of human viral epitopes using peptide-specific, MHC-restricted human recombinant antibodies. J Immunol.
2003 Apr 15; 170(8):4349-61.
Preferiblemente el anticuerpo se une al complejo con una afinidad de unión inferior a 20 nanomolar, preferentemente a 10 nanomolar, lo cual se considera «específico» en el contexto de la presente descripción.
Otro aspecto de la descripción proporciona un método para producir un receptor de linfocito T soluble que reconoce un complejo de péptido-MHC específico. Dichos receptores de linfocitos T solubles se pueden generar a partir de clones de linfocitos T específicos, cuya afinidad se puede incrementar por mutagénesis dirigida a las regiones determinantes de complementariedad. Para la selección del receptor de linfocito T se puede utilizar un fagoteca (US 2010/0113300, Liddy N, Bossi G, Adams KJ, Lissina A, Mahon TM, Hassan NJ, et al. Monoclonal TCR-redirected tumor cell killing. Nat Med 2012 Jun;18(6):980-987). A fin de estabilizar los receptores de linfocito T en la fagoteca y en caso de uso práctico como fármaco, las cadenas alfa y beta se pueden enlazar por ejemplo mediante enlaces de sulfuro no nativos, otros enlaces covalentes (receptor de linfocito T monocatenario), o mediante dominios de dimerización (véanse Boulter JM, Glick M, Todorov Pt, Baston E, Sami M, Rizkallah P, et al. Stable, soluble T-cell receptor molecules for crystallization and therapeutics. Protein Eng 2003 Sep;16(9):707-711.; Card KF, Price-Schiavi SA, Liu B, Thomson E, Nieves E, Belmont H, et al. A soluble single-chain T-cell receptor IL-2 fusion protein retains MHC-restricted peptide specificity and IL-2 bioactivity. Cancer Immunol Immunother 2004 Apr;53(4):345-357; y Willcox BE, Gao GF, Wyer JR, O'Callaghan CA, Boulter JM, Jones EY, et al. Production of soluble alphabeta T-cell receptor heterodimers suitable for biophysical analysis of ligand binding. Protein Sci 1999 Nov; 8 (11):2418-2423). El receptor de linfocito T se puede enlazar con toxinas, fármacos, citocinas (véase US 2013/0115191), dominios que recluten células efectoras como un dominio anti-CD3, etc., con el fin de ejecutar funciones particulares en células diana. Asimismo, se puede expresar en linfocitos T destinados a la transferencia a un receptor.
Se puede encontrar más información en WO 2004/033685A1 y WO 2004/074322A1. En WO 2012/056407A1 aparece descrita una combinación de TCR solubles. Otros métodos de producción se revelan en WO 2013/057586A1.
Además, se pueden utilizar para verificar el diagnóstico histopatológico de cáncer basado en una muestra de biopsia.
Para seleccionar los péptidos sobrepresentados se calcula un perfil de presentación que muestra la presentación mediana de la muestra así como la variación de los duplicados. El perfil yuxtapone muestras de la entidad tumoral de interés con muestras de tejido normal de referencia. Cada uno de esos perfiles se puede después consolidar en una puntuación de sobrepresentación calculando el valor p de un modelo lineal de efectos mixtos (J. Pinheiro, D. Bates, S. DebRoy, Sarkar D., R Core team. nlme: Linear and Nonlinear Mixed Effects Models. 2008) adjusting for multiple testing by False Discovery Rate (Y. Benjamini and Y. Hochberg. Controlling the False Discovery Rate: A Practical and Powerful Approach to Multiple Testing. Journal of the Royal Statistical Society. Series B (Methodological), Vol. 57 (No.
1):289-300, 1995).
Para la identificación y la cuantificación relativa de los ligandos HLA mediante espectrometría de masas se purificaron moléculas HLA de muestras de tejido criogenizadas y se aislaron los péptidos asociados a HLA. Los péptidos aislados se separaron y se identificaron sus secuencias mediante cromatografía de líquidos-espectrometría de masas con ionización por nano-electronebulización (nanoESI) en línea. Las secuencias peptídicas resultantes se verificaron comparando el patrón de fragmentación de los TUMAP naturales registrados a partir de muestras de NSCLC con los patrones de fragmentación de péptidos sintéticos de referencia de secuencia idéntica. Dado que los péptidos se identificaron directamente como ligandos de moléculas HLA de tumores primarios, estos resultados proporcionan pruebas directas del procesamiento y la presentación natural de los péptidos identificados en el tejido tumoral primario obtenido de pacientes con NSCLC.
La plataforma para el descubrimiento de fármacos patentada XPRESIDENT® v2. 1 (véase por ejemplo US 2013­ 0096016) permite la identificación y la selección de candidatos a vacuna peptídica que están sobrepresentados en función de la cuantificación relativa de los niveles de péptidos restringidos a HLA en tejidos cancerosos respecto a diversos tejidos y órganos normales. Ello se consiguió mediante el desarrollo de la cuantificación diferencial sin marcaje con los datos adquiridos de CL-EM procesados con una plataforma de análisis de datos patentada que combina algoritmos para identificación de secuencias, agrupamiento de espectros, recuento iónico, alineamiento del tiempo de retención, deconvolución del estado de carga y normalización.
Se calcularon los niveles de presentación incluyendo estimaciones de error para cada péptido y cada muestra. Se identificaron los péptidos presentados exclusivamente en tejido tumoral y los péptidos sobrepresentados en tejido tumoral respecto a los tejidos y órganos no cancerosos.
Se purificaron los complejos HLA-péptido procedentes de 50 muestras de tejido tumoral de NSCLC criogenizadas, se aislaron los péptidos asociados a HLA y se analizaron con CL-EM.
Todos los TUMAP contenidos en la presente solicitud se identificaron con esta estrategia en muestras de tumores primarios de NSCLC para confirmar su presentación en el NSCLC primario.
Los TUMAP identificados en múltiples tejidos tumorales NSCLC y normales se cuantificaron con recuento iónico de los datos de CL-EM sin marcaje. El método supone que las áreas de señal de CL-EM de un péptido están correlacionadas con su abundancia en la muestra. Todas las señales cuantitativas producidas por cada péptido en varios experimentos de CL-EM se normalizaron con medidas de tendencia central, se promediaron por muestra y se combinaron en un diagrama de barras, llamado perfil de presentación. El perfil de presentación combina diversos métodos de análisis como la búsqueda en bases de datos de proteínas, agrupación de espectros, deconvolución del estado de carga (descarga) y alineamiento del tiempo de retención y normalización.
La presente descripción se refiere por tanto a un péptido que comprende una secuencia seleccionada del grupo consistente en la SEQ ID N.° 2 o una variante de las mismas que es al menos un 90% homóloga (preferiblemente idéntica) a la SEQ ID N.° 2 o una variante de las mismas que induce la reacción cruzada de linfocitos T con dicho péptido, en que dicho péptido no es un polipéptido entero.
La presente descripción se refiere, además, a un péptido que comprende una secuencia seleccionada del grupo consistente en las SEQ ID N.° 2, en que dicho péptido o dicha variante tiene una longitud total de entre 8 y 100, preferiblemente entre 8 y 30, y más preferiblemente entre 8 y 14 aminoácidos.
La presente descripción se refiere, además, al péptido conforme a la presente invención que tiene la capacidad de unirse a una molécula del complejo mayor de histocompatibilidad humano (MHC) de clase I.
La presente descripción se refiere, además, al péptido dado a conocer en la presente memoria en que dicho péptido consiste o consiste esencialmente en una secuencia de aminoácidos conforme a la SEQ ID N.° 2.
La presente descripción se refiere, además, a los péptidos dados a conocer en la presente memoria, en que dicho péptido está modificado y/o incluye enlaces no peptídicos.
La presente descripción se refiere, además, a los péptidos dados a conocer en la presente memoria, en que el péptido es una proteína de fusión, que en particular comprende aminoácidos N-terminales de la cadena invariable asociada a antígeno HLA-DR (Ii), o en que el péptido está fusionado (o integrado) con un anticuerpo, como por ejemplo, un anticuerpo que es específico para células dendríticas.
La presente descripción se refiere, además, a un ácido nucleico que codifica los péptidos dados a conocer en la presente memoria, siempre que el péptido no sea la proteína humana entera.
La presente descripción se refiere, además, al ácido nucleico dado a conocer en la presente memoria que es ADN, ADNc, APN, ARN o combinaciones de los mismos.
La presente descripción se refiere, además, a un vector de expresión capaz de expresar un ácido nucleico dado a conocer en la presente memoria.
La presente descripción se refiere, además, a un péptido dado a conocer en la presente memoria, a un ácido nucleico dado a conocer en la presente memoria o a un vector de expresión dado a conocer en la presente memoria para el uso en medicina.
La presente descripción se refiere, además, a una célula hospedadora que comprende un ácido nucleico dado a conocer en la presente memoria o un vector de expresión dado a conocer en la presente memoria.
La presente descripción se refiere, además, a la célula hospedadora dada a conocer en la presente memoria que es una célula presentadora de antígeno.
La presente descripción se refiere, además, a la célula hospedadora dado a conocer en la presente memoria en que la célula presentadora de antígeno es una célula dendrítica.
La presente descripción se refiere, además, a un método para la producción de un péptidodado a conocer en la presente memoria, comprendiendo dicho método el cultivo de la célula hospedadora descrita y el aislamiento del péptido a partir de la célula hospedadora o de su medio de cultivo.
La presente descripción se refiere, además, a un método in vitro para la producción de linfocitos T citotóxicos (CTL) activados, comprendiendo el método la puesta en contacto in vitro de CTL con moléculas MHC de clase I o II humanas cargadas con antígeno expresadas en la superficie de una célula presentadora de antígeno adecuada durante un período de tiempo suficiente para activar dicho CTL de una manera específica del antígeno, en que dicho antígeno es cualquier péptidodado a conocer en la presente memoria.
La presente descripción se refiere además al método descrito, en que dicho antígeno se carga en moléculas MHC de clase I o II expresadas en la superficie de una célula presentadora de antígeno adecuada poniendo en contacto una cantidad suficiente de antígeno con la célula presentadora de antígeno.
La presente descripción se refiere, además, al métododado a conocer en la presente memoria, en que la célula presentadora de antígeno comprende un vector de expresión capaz de expresar dicho péptido que contiene la SEQ ID N.° 2, o dicha secuencia de aminoácidos variante.
La presente descripción se refiere, además, a linfocitos T citotóxicos (CTL) activados, producidos por el método conforme a la invención, que reconocen selectivamente una célula que expresa de forma aberrante un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos descrita.
La presente descripción se refiere, además, a un método para destruir células diana en un paciente cuyas células diana expresan de forma aberrante un polipéptido que comprende cualquiera de las secuencias de aminoácidos dadas a conocer en la presente memoria, comprendiendo dicho método la administración al paciente de un número eficaz de linfocitos T citotóxicos (CTL)dados a conocer en la presente memoria.
La presente descripción se refiere, además, al uso de cualquier péptido dado a conocer en la presente memoria, un ácido nucleico dado a conocer en la presente memoria, un vector de expresión dado a conocer en la presente memoria, una célula dada a conocer en la presente memoria, o un linfocito T citotóxico activado dado a conocer en la presente memoria como medicamento o en la fabricación de un medicamento.
La presente descripción se refiere, además, al uso dado a conocer en la presente memoria, en que dicho medicamento es una vacuna.
La presente descripción se refiere, además, aun uso dado a conocer en la presente memoria en el que el medicamento es activo contra el cáncer.
La presente descripción se refiere, además, a un uso dado a conocer en la presente memoria en que dichas células cancerosas son células de cáncer de pulmón, gástrico, gastrointestinal, colorrectal, páncreas o riñón.
La presente descripción se refiere, además, a unas proteínas marcadoras y biomarcadores particulares que pueden ser utilizados para el pronóstico del cáncer de pulmón.
Además, la presente descripción se refiere al uso de nuevas dianas dadas a conocer en la presente memoria para el tratamiento del cáncer.
El término «anticuerpo» o «anticuerpos» se utiliza en la presente memoria en sentido amplio e incluye tanto anticuerpos policlonales como monoclonales. Además de las moléculas de inmunoglobulina intactas o «enteras», el término «anticuerpos» también incluye fragmentos o polímeros de esas moléculas de inmunoglobulina y versiones humanizadas de moléculas de inmunoglobulina, siempre que exhiban cualquiera de las propiedades deseadas (p. ej. la unión específica de un polipéptido marcador de cáncer de pulmón, liberación de una toxina en una célula de cáncer de pulmón que exprese en un nivel elevado un gen marcador del cáncer de pulmón, y/o inhibir la actividad de un polipéptido marcador del cáncer de pulmón) dadas a conocer en la presente memoria.
Si es posible los anticuerpos de la descripción se podrán adquirir de fuentes comerciales. Los anticuerpos de la descripción también se pueden fabricar con métodos consabidos. La persona versada en la técnica entiende que para fabricar los anticuerpos de la descripción se pueden emplear tanto los polipéptidos marcadores del cáncer de pulmón enteros como fragmentos de los mismos. El polipéptido necesario para generar un anticuerpo de la descripción se puede purificar parcial o completamente de una fuente natural o se puede producir con técnicas de ADN recombinante.
Por ejemplo, un ADNc que codifique ABCA13, MMP12, DST, MXRA5, CDK4, HNRNPH, TANC2, 1RNF213, SMYD3 y SLC34A2 , o cualquier otro polipéptido de las SEQ ID N.° 2, o un fragmento de los mismos, se puede expresar en células procariotas (p. ej. bacterias) o eucariotas (p. ej. células de levadura, insecto o mamífero), a partir de la cual se purificará una proteína recombinante con la que se generará una preparación de anticuerpo monoclonal o policlonal que se una específicamente al polipéptido marcador del cáncer de pulmón utilizado para generar el anticuerpo dado a conocer en la presente memoria.
Una persona versada en la técnica sabrá que la generación de dos o más conjuntos diferentes de anticuerpos monoclonales o policlonales maximiza la probabilidad de obtener un anticuerpo dotado de la especificidad y la afinidad necesarias para el uso previsto (p. ej. ELISA, inmunohistoquímica, técnicas de imagen in vivo, tratamiento con inmunotoxinas). Los anticuerpos son analizados para buscar la actividad deseada con métodos conocidos, de acuerdo con el fin previsto para los anticuerpos (p. ej. ELISA, inmunohistoquímica, inmunoterapia, etc.; para más detalles sobre la generación y el análisis de anticuerpos, véase por ejemplo, Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., 1988, new 2nd edition 2013). Por ejemplo, los anticuerpos pueden ser analizados con pruebas ELISA, Western blot, tinción inmunohistoquímica de cortes de tejido de cáncer de pulmón congelados o fijados en formol. Después de la caracterización in vitro inicial, los anticuerpos destinados a uso terapéutico o diagnóstico in vivo se analizan con métodos de ensayo clínico conocidos.
El término «anticuerpo monoclonal» tal y como se utiliza en la presente memoria se refiere a un anticuerpo obtenido a partir de una población notablemente homogénea de anticuerpos, es decir; los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto por mutaciones posiblemente naturales que pueden estar presentes en pequeño número. Los anticuerpos monoclonales de la presente memoria incluyen específicamente anticuerpos «quiméricos» en los que una parte de la cadena pesada y/o ligera es idéntica u homóloga a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie concreta o pertenecientes a una clase o subclase concreta de anticuerpos, mientras que el resto de la cadena o cadenas es idéntica u homóloga a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otras especies o pertenecientes a otra clase o subclase de anticuerpos, así como a fragmentos de tales anticuerpos, en tanto que exhiban la actividad antagonista deseada (N.° pat. de EE. UU.
4.816.567).
Los anticuerpos monoclonales de la descripción se pueden preparar con métodos basados en hibridomas. En dichos métodos un ratón u otro animal hospedador adecuado es vacunado con un agente inmunizante que estimula a los linfocitos que produce o que se capaces de producir anticuerpos que se unen específicamente al agente inmunizante. Otra alternativa consiste en inmunizar los linfocitos in vitro.
Los anticuerpos monoclonales también se pueden fabricar con métodos de ADN recombinante, como los descritos en la Pat. de EE. UU. N.° 4. 816. 567. El ADN que codifica los anticuerpos monoclonales de la descripción puede ser fácilmente aislado y secuenciado con procedimientos convencionales (p. ej. con sondas oligonucleotídicas capaces de unirse específicamente a los genes que codifican las cadenas pesadas y ligeras de anticuerpos de ratón).
Los métodos in vitro también son adecuados para la preparación de anticuerpos monovalentes. La digestión de anticuerpos para producir fragmentos de los mismos, en particular fragmentos Fab, se puede llevar a cabo con técnicas ordinarias conocidas por los expertos en la materia. Por ejemplo, la digestión se puede realizar con papaína. Ejemplos de la digestión de papaína aparecen descritos en WO 94/29348, publicada el 22 de diciembre de 1994 y en la Pat. de EE. UU. N.° 4. 342. 566. La digestión de anticuerpos con papaína normalmente produce dos fragmentos de unión a antígeno idénticos llamados fragmentos Fab, cada uno dotado de un sitio de unión al antígeno, así como un fragmento residual Fe. El tratamiento con pepsina da como resultado un fragmento dotado de dos sitios de unión a antígeno, pese a lo cual es capaz de unirse al antígeno.
Los fragmentos de anticuerpo, estén unidos a otras secuencias o no, también pueden incluir inserciones, deleciones, sustituciones y otras modificaciones seleccionadas de regiones particulares o de residuos de aminoácidos específicos, siempre que la actividad de los fragmentos no se vea significativamente alterada o afectada respecto al anticuerpo o el fragmento de anticuerpo intactos. Estas modificaciones pueden ofrecer alguna propiedad adicional, como eliminar o añadir aminoácidos capaces de establecer puentes de sulfuro para aumentar la biolongevidad, alterar las características de secreción, etc. En cualquier caso el fragmento de anticuerpo debe poseer una propiedad bioactiva, como actividad de unión, regulación de unión al dominio de unión, etc. Las regiones activas o funcionales del anticuerpo pueden ser identificadas por mutagénesis de una región específica de la proteína, seguida por la expresión y el análisis del polipéptido expresado. Tales métodos son obvios para toda persona versada en la técnica y pueden incluir la mutagénesis dirigida del ácido nucleico que codifica el fragmento de anticuerpo.
Los anticuerpos de la descripción también pueden comprender anticuerpos humanizados o anticuerpos humanos. Las formas humanizadas de anticuerpos no humanos (p. ej. de ratón) son inmunoglobulinas quiméricas, cadenas de inmunoglobulina o fragmentos de las mismas (como Fv, Fab, Fab' u otras secuencias de unión a antígeno de los anticuerpos) que contienen una pequeña secuencia derivada de inmunoglobulinas no humanas. Los anticuerpos humanizados incluyen inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en que los residuos de una región determinante de complementariedad (CDR) del receptor son sustituidos por residuos de una CDR de una especie no humana (anticuerpo donante) como ratón, rata o conejo que está dotada de la especificidad, la afinidad y la capacidad deseadas. En algunos casos, los residuos estructurales (FR) del fragmento Fv de la inmunoglobulina humana son sustituidos por residuos no humanos correspondientes. Los anticuerpos humanizados también pueden comprender residuos que no están presentes ni en el anticuerpo receptor ni en el CDR importado o en las secuencias estructurales. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá casi todas de al menos uno, y normalmente de dos dominios variables, en los que todas o casi todas las regiones CDR corresponderán a las de la inmunoglobulina no humana y todas o casi todas las regiones FR serán las de una secuencia consenso de la inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado idealmente también comprenderá al menos una porción de una región constante de la inmunoglobulina (Fc), normalmente de una inmunoglobulina humana.
Los métodos para humanizar anticuerpos no humanos son bien conocidos en la técnica. En general, a un anticuerpo humanizado se le introducen uno o varios residuos de aminoácidos de origen no humano. Estos residuos de aminoácidos no humanos con frecuencia son denominados residuos «importados», que normalmente se extraen del dominio variable «importado». La humanización se puede llevar a cabo básicamente sustituyendo la o las secuencias CDR de roedor por las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano. Por tanto, tales anticuerpos «humanizados» son anticuerpos quiméricos (Pat. EE. UU. N.° 4. 816. 567), en los que una parte notablemente más pequeña que un dominio variable humano intacto ha sido sustituida por la secuencia correspondiente de una especie no humana. En la práctica, los anticuerpos humanizados normalmente son anticuerpos humanos en los que se han sustituido algunos residuos CDR y posiblemente algunos residuos FR por residuos de sitios análogos de anticuerpos de roedor.
Se pueden emplear animales transgénicos (p. ej. ratones) que tras la inmunización sean capaces de producir un repertorio completo de anticuerpos humanos sin producir inmunoglobulinas endógenas. Por ejemplo, se ha descrito que la deleción homocigota del gen de la región de unión de la cadena pesada del anticuerpo en ratones quiméricos y mutantes germinales provoca la inhibición completa de la producción endógena de anticuerpos. La transferencia de la matriz génica de la inmunoglobulina de la línea germinal humana a dichos ratones mutantes de la línea germinal dará como resultado la producción de anticuerpos humanos tras la exposición al antígeno. También se pueden producir anticuerpos humanos en fagotecas.
Los anticuerpos de la descripción se administran preferiblemente a un sujeto incorporándolos en un vehículo farmacéuticamente aceptable. Normalmente a la formulación se le añade una cantidad apropiada de una sal farmacéuticamente aceptable para que sea isotónica. Ejemplos de vehículos farmacéuticamente aceptables son solución salina, solución Ringer y solución de dextrosa. Es preferible que el pH de la solución oscile aproximadamente entre 5 y 8, y más preferiblemente entre 7 y 7,5 aproximadamente. Otros vehículos incluyen preparaciones de liberación prolongada como matrices semipermeables de polímeros hidrofóbicos sólidos que contengan el anticuerpo, en matrices con forma modelada, p. ej. películas, liposomas o micropartículas. Para las personas versadas en la técnica será evidente que son preferibles ciertos vehículos dependiendo, por ejemplo, de la vía de administración y de la concentración del anticuerpo que se va a administrar.
Los anticuerpos se pueden administrar al sujeto, paciente o células mediante inyección (intravenosa, intraperitoneal, subcutánea, intramuscular, etc.), o con otros métodos como la infusión que aseguren su liberación en el torrente sanguíneo. Los anticuerpos también se pueden administrar por vía intratumoral o peritumoral para ejercer un efecto terapéutico a la par sistémico y local. Se prefiere la inyección local o intravenosa.
Las dosis y pautas de administración más adecuadas se pueden determinar empíricamente; la toma de decisiones a este respecto forma parte de los conocimientos de la materia. Las personas versadas en la materia saben que la dosis de anticuerpos a administrar depende, por ejemplo, del sujeto que va a recibir al anticuerpo, la vía de administración, el tipo concreto de anticuerpo y de otros medicamentos que se le estén administrando. La dosis diaria típica de anticuerpo cuando se utiliza sólo puede oscilar entre 1 pg/kg hasta 100 mg/kg de peso corporal o más por día, dependiendo de los susodichos factores. Tras la administración del anticuerpo como tratamiento contra el cáncer de pulmón, su eficacia se puede evaluar de varios modos bien conocidos por el médico especialista. Por ejemplo se puede controlar el tamaño, el número y/o la distribución del cáncer de pulmón en el sujeto receptor del tratamiento utilizando técnicas de imagen oncológicas estándar. Todo anticuerpo administrado con fines terapéuticos que detenga el crecimiento del tumor, reduzca su extensión y/o impida la aparición de nuevos tumores en contraste con la evolución de la enfermedad si no se produjera la administración del anticuerpo, es un anticuerpo eficaz para el tratamiento del cáncer de pulmón.
Como los marcadores tumorales de pulmón ABCA13 y MMP12 de la descripción se expresan mucho en las células de cáncer de pulmón y se expresan poquísimo en las células normales, la inhibición de la expresión de ABCA13 y MMP12 o de la actividad de sus polipéptidos se puede integrar en cualquier estrategia terapéutica para el tratamiento o la prevención del NSCLC.
El principio de la terapia antisentido se basa en la hipótesis de que es posible suprimir la expresión génica de secuencias específicas (ya sea por vía transcripcional o traduccional) mediante la hibridación en el interior de la célula del ADN genómico o del ARNm con una molécula antisentido complementaria a ellos. La formación de ese ácido nucleico bicatenario híbrido trastoca la transcripción del ADN genómico que codifica el antígeno tumoral que constituye la diana, o altera el procesamiento/transporte/traducción y/o estabilidad del ARNm del antígeno tumoral diana.
Los ácidos nucleicos antisentido se pueden hacer llegar a las células con diversas estrategias. Por ejemplo, a un sujeto se le pueden administrar directamente oligonucleótidos antisentido o ARN antisentido (p. ej., por inyección intravenosa) de una forma que les permitan ser absorbidos por las células tumorales. Otra alternativa consiste en la introducción en células in vivo de vectores virales o plasmídicos que codifiquen ARN antisentido (o fragmentos de ARN). Los efectos antisentido también se pueden inducir con secuencias codificantes, pero la magnitud de los cambios fenotípicos es muy variable. Los cambios fenotípicos inducidos por la terapia antisentido se valoran en función de los cambios en, p. ej. las concentraciones del ARNm diana, concentraciones de la proteína diana y/o niveles de actividad de dicha proteína.
En un ejemplo concreto, la inhibición de la función del marcador tumoral pulmonar con terapia génica antisentido se puede lograr con la administración directa de ARN antisentido del marcador tumoral pulmonar a un sujeto. El ARN antisentido del marcador tumoral se puede producir y aislar con una técnica estándar, pero se produce más fácilmente con la transcripción in vitro utilizando un ADNc antisentido del marcador tumoral controlado con un promotor eficiente (p. ej. el promotor de T7). La administración a células del ARN antisentido del marcador tumoral se puede efectuar con cualquiera de los métodos de administración directa de ácidos nucleicos descritos a continuacióN.
Una estrategia alternativa para inhibir la función del ABCA13 y de la MMP12 con terapia génica consiste en utilizar la expresión intracelular de un anticuerpo anti-ABCA13, MMP12 o una porción de un anticuerpo anti-ABCA13, MMP12. Por ejemplo, el gen (o fragmento de gen) que codifica un anticuerpo monoclonal que se une específicamente a un polipéptido de ABCA13, MMP12 y que inhibe su actividad biológica se sitúa bajo el control transcripcional de una secuencia reguladora específica (p. ej. específica de tejido o de tumor), dentro de un vector de expresión de ácidos nucleicos. El vector se administra a continuación al sujeto de tal modo que es asimilado por las células de cáncer de pulmón u otras células, que segregarán los anticuerpos anti-ABCA13, MMP12 y bloquearán la actividad biológica de los polipéptidos ABCA13 y MMP12. Preferentemente, los polipéptidos ABCA13 y MMP12 están presentes en la superficie extracelular de células de cáncer gástrico.
En los métodos susodichos, que incluyen la administración y la absorción de ADN exógeno por las células del sujeto (transducción o transfección génica), los ácidos nucleicos de la presente descripción pueden estar incorporados en un vector en forma de ADN o de ácidos nucleicos desnudos para suministrar los ácidos nucleicos a las células para inhibir la expresión de la proteína marcadora del tumor gástrico. El vector puede estar disponible en una preparación comercial, como un vector adenovírico (Quantum Biotechnologies Inc., Laval, Quebec, Canadá). La liberación del ácido nucleico o del vector en las células se puede materializar a través de varios mecanismos. Como ejemplo, puede ser a través de liposomas con preparaciones comerciales de liposomas como LIPOFECTIN, LIPOFECTAMINE (GIBCO-25 BRL, Inc., Gaithersburg, Md., EE. UU.), SUPERFECT (Qiagen, Inc. Hilden, Alemania) y TRANSFECTAM (Promega Biotec, Inc., Madison, Wis., EE. UU.), así como otros liposomas desarrollados según los procedimientos habituales en la técnica. Asimismo, el ácido nucleico o el vector de esta descripción se pueden suministrar in vivo mediante electroporación, una tecnología que ofrece Genetronics, Inc. (San Diego, Calif., EE. UU.) o mediante un aparato SONOp OrATION (ImaRx Pharmaceutical Corp., Tucson, Arizona, EE. UU.).
Como ejemplo, el vector puede ser un sistema viral, como un sistema de vector retrovírico que puede encapsidar un genoma retrovírico recombinante. El retrovirus recombinante infecta las células y con ello inocula un ácido nucleico antisentido que inhibe la expresión de ABCA13, MMP12. El método exacto para introducir el ácido nucleico alterado en células de mamífero no se limita al uso de vectores retrovíricos. Existen otras técnicas comunes para llevar a cabo este procedimiento, tales como vectores adenovíricos, vectores víricos adenoasociados (AAV), vectores lentivíricos, vectores retrovíricos seudotipados. También se pueden utilizar técnicas de transducción física, como liposomas y a través de receptores y otros mecanismos de endocitosis. La presente descripción se puede utilizar en conjunción con cualquiera de estos y de otros métodos usuales de transferencia génica.
Los anticuerpos también se pueden utilizar para ensayos diagnósticos in vivo. En general, el anticuerpo se marca con un radionucleótido (como 111In, 99Tc, 14C, 131I, 3H, 32P o 35S) de modo que el tumor puede ser localizado con inmunogammagrafía. En una forma de realización, anticuerpos o fragmentos de los mismos se unen a los dominios extracelulares de dos o más dianas ABCA13, MMP12 y el valor de afinidad (Kd) es inferior a 1 x 10 pM.
Los anticuerpos para uso diagnóstico pueden ser marcados con sondas adecuadas para posibilitar la detección con diferentes métodos ópticos. Los métodos para la detección de sondas incluyen, entre otros, microscopía de fluorescencia, óptica, confocal y electrónica; resonancia magnética y espectroscopia; radioscopia, tomografía computadorizada y tomografía por emisión de positrones. Las sondas adecuadas incluyen, entre otras, fluoresceína, rodamina, eosina y otros fluoróforos, radioisótopos, oro, gadolinio y otros lantánidos, hierro paramagnético, flúor-18 y otros radionúclidos emisores de positrones. Además, las sondas pueden ser bi o multifuncionales y ser detectables por más de uno de los métodos enumerados. Los anticuerpos pueden marcarse directa o indirectamente con dichas sondas. La fijación de sondas a los anticuerpos incluye la unión covalente de la sonda, la incorporación de la sonda en el anticuerpo, y la unión covalente de un compuesto quelante para unir la sonda, entre otros métodos consabidos en la técnica. Para las técnicas de inmunohistoquímica, la muestra de tejido patológico puede ser fresca o congelada o puede estar incluida en parafina y fijada con un conservante como formol. El corte fijado o incluido que contiene la muestra se pone en contacto con un anticuerpo primario marcado y un anticuerpo secundario, de modo que el anticuerpo se emplea para detectar la expresión in situ de las proteínas ABCA13 y MMP12.
La presente descripción proporciona pues un péptido que comprende una secuencia seleccionada del grupo consistente en las SEQ ID N.° 2 o una variante de las mismas que es homóloga en un 90% a las SEQ ID N.° 2 o una variante de las mismas que inducirá la reacción cruzada de los linfocitos T con dicho péptido.
Los péptidos de la descripción tienen la capacidad de unirse a una molécula del complejo mayor de histocompatibilidad humano (MHC) de clase I y/o clase II.
En la presente descripción el término «homólogo» se refiere al grado de identidad (véase antes Identidad porcentual) entre las secuencias de dos secuencias de aminoácidos, es decir secuencias peptídicas o polipeptídicas. La susodicha «homología» se determina comparando las dos secuencias alineadas en condiciones óptimas con las secuencias a comparar. La homología de secuencia se puede calcular creando una alineación con el algoritmo ClustalW, por ejemplo. Bases de datos públicas proporcionan software para el análisis de secuencias, en concreto, Vector NTI, GENETYXy otras herramientas de análisis.
Una persona versada en la materia será capaz de valorar si los linfocitos T inducidos por una variante del péptido específico serán capaces de reaccionar con el propio péptido (Fong et al., 2001); (Zaremba et al., 1997; Colombetti et al., 2006; Appay et al., 2006).
Por «variante» de la secuencia de aminoácidos los inventores quieren decir que las cadenas laterales de, por ejemplo, uno o dos de los residuos de aminoácidos están alteradas (por ejemplo sustituyéndolas con la cadena lateral de otro residuo de aminoácido natural o alguna otra cadena lateral) de modo que el péptido sigue siendo capaz de unirse a una molécula HLA básicamente de la misma manera que un péptido que consiste de la secuencia de aminoácidos indicada en la SEQ ID N.° 2. Por ejemplo, un péptido se puede modificar para que mejore o al menos mantenga la capacidad para interaccionar y unirse a la hendidura de unión de una molécula MHC adecuada, como HLA-A*02 o -dR, y de un modo que mejore o al menos mantenga la capacidad para unirse al TCR de CTL activados.
Estos CTL pueden después reaccionar con células y matar las que expresen un polipéptido que contenga la secuencia de aminoácidos natural del péptido afín definido en los aspectos de la descripción. Como se puede deducir de la bibliografía (Rammensee et al., 1997) y de las bases de datos científicas (Rammensee et al., 1999), ciertas posiciones de los péptidos de unión a HLA son normalmente residuos de anclaje que forman una secuencia central que encaja en el motivo de unión del receptor HLA, que está definida por las propiedades polares, electrofísicas, hidrofóbicas y espaciales de las cadenas polipeptídicas que constituyen la hendidura de unión. Así pues, una persona versada en la técnica será capaz de modificar las secuencias de aminoácidos expuestos en las SEQ ID N.° 2, manteniendo los residuos de anclaje conocidos, y será capaz de determinar si tales variantes mantienen la capacidad de unión a moléculas MHC de clase I o II. Las variantes de la presente descripción conservan la capacidad para unirse a los TCR de los CTL activados, que después pueden reaccionar con células y matar las que expresan un polipéptido que contenga la secuencia de aminoácidos natural del péptido afín definido en los aspectos de la descripción.
Aquellos residuos de aminoácidos que no contribuyen sustancialmente a las interacciones con el receptor del linfocito T pueden ser modificados sustituyéndolos por otros aminoácidos cuya incorporación no afecte sustancialmente a la reactividad de los linfocitos T y no suprima la unión al MHC pertinente. Así pues, aparte de la condición indicada, el péptido de la descripción puede ser cualquier péptido (en cuyo término los inventores incluyen oligopéptidos o polipéptidos), que incluya las secuencias de aminoácidos o una porción o una variante de las mismas tal y como se indican.
T l 4 : V ri n m iv l i n l E ID N.° 2
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continuación
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También pueden ser adecuados péptidos más largos. Asimismo es posible generar epítopos de MHC de clase I, que aunque suelen tener entre 8 y 11 aminoácidos de longitud, mediante el procesamiento peptídico de péptidos más largos o proteínas que incluyan el epítopo en cuestión. Se prefiere que los residuos que flanquean el epítopo de interés sean residuos que no afecten sustancialmente a la digestión proteolítica necesaria para exponer el epítopo durante el procesamiento.
En consecuencia, la presente descripción también proporciona péptidos y variantes de epítopos de MHC de clase I en los que el péptido o variante tienen una longitud total de entre 8 y 100, preferiblemente entre 8 y 30, y más preferiblemente entre 8 y 14, esto es 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 aminoácidos, que en el caso de los péptidos de unión de clase II también puede ser de 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 o 33 aminoácidos.
Naturalmente el péptido o variante dado a conocer en la presente memoria tendrá la capacidad para unirse a una molécula del complejo mayor de histocompatibilidad humano (MHC) de clase I. La unión de un péptido o una variante a un complejo MHC se puede analizar con métodos conocidos en la técnica.
En una forma de realización preferida de la descripción el péptido consiste o consiste esencialmente en una secuencia de aminoácidos conforme a las SEQ ID N.° 2.
Consiste esencialmente en» significa que un péptido dado a conocer en la presente memoria, además de la secuencia conforme a la SEQ ID N.° 2 o una variante de la misma contiene segmentos adicionales de aminoácidos en los extremos N- y/o C-terminal que no forman parte necesariamente del péptido que funciona como un epítopo para el epítopo de moléculas MHC.
No obstante, dichos segmentos pueden ser importantes para facilitar la introducción eficaz del péptido dado a conocer en la presente memoria en las células. En una forma de realización de la presente descripción, el péptido es una proteína de fusión que comprende, por ejemplo, los 80 aminoácidos N-terminales de la cadena invariable asociada al antígeno HLA-DR (p33, en lo sucesivo «Ii») tal y como aparece en el NCBI, número de acceso de GenBank X00497. En otras fusiones, los péptidos de la presente descripción se pueden fusionar con un anticuerpo tal y como se describe en la presente memoria, o con una parte funcional del mismo, en particular integrándolo en la secuencia del anticuerpo, para que vayan dirigidos específicamente por dicho anticuerpo, o por ejemplo, con un anticuerpo que es específico para las células dendríticas.
Asimismo, el péptido o variante pueden ser modificados más para mejorar la estabilidad y/o la unión a las moléculas MHC con objeto de desencadenar una respuesta inmunitaria más potente. En la técnica se conocen métodos para ese tipo de optimización de la secuencia peptídica, entre ellos, por ejemplo, la introducción de enlaces peptídicos inversos o de enlaces no peptídicos.
En un enlace peptídico inverso los residuos de aminoácido no están unidos por enlaces peptídicos (-CO-NH-) sino que el enlace está invertido. Estos seudopéptidos de tipo retro-inverso se pueden sintetizar con métodos conocidos en la técnica, por ejemplo los descritos por Meziere et al. (1997) J. Immunol. 159, 3230-3237. Esta estrategia implica sintetizar seudopéptidos que contengan cambios que afectan al esqueleto principal pero no a la orientación de las cadenas laterales. Meziere et al. (1997) demuestran que estos seudopéptidos son útiles para la unión al MHC y las respuestas de los linfocitos T cooperadores. Los péptidos retro-inversos contienen enlaces NH-CO en lugar de enlaces peptídicos CO-NH y son mucho más resistentes a la proteólisis.
Ejemplos de enlaces no peptídicos son: -CH2-NH, -CH2S-, -CH2CH2-, -CH=CH-, -COCH2-, -CH(OH)CH2- y -CH2SO-. La patente de EE. UU. 4. 897. 445 proporciona un método para la síntesis en fase sólida de enlaces no peptídicos (-CH2-NH) en cadenas polipeptídicas que implica la síntesis de polipéptidos con procedimientos ordinarios y la síntesis del enlace no peptídico con la reacción de un aminoaldehído con un aminoácido en presencia de NaCNBHa.
Péptidos que comprenden las susodichas secuencias se pueden sintetizar con grupos químicos adicionales en sus extremos amino y/o carboxilo con el fin de mejorar su estabilidad, biodisponibilidad y/o afinidad. Por ejemplo, a los extremos amino de los péptidos se les pueden añadir grupos hidrofóbicos como carbobenzoxilo, dansilo o tbutiloxicarbonilo. De modo similar, se puede colocar en los extremos amino de los péptidos un grupo acetilo o un grupo 9-fluorenilmetoxi-carbonilo. Además a los extremos carboxilo de los péptidos se les pueden añadir un grupo hidrofóbico, el t-butiloxicarbonilo, o un grupo amido.
Además, los péptidos de la descripción pueden ser sintetizados de tal forma que se altere su configuración estérica. Por ejemplo, se puede utilizar el D-isómero de uno varios residuos de aminoácido del péptido en lugar del L-isómero habitual. Y todavía más, se puede sustituir al menos uno de los residuos de aminoácido de los péptidos de la descripción por uno de los consabidos aminoácidos no presentes en la naturaleza. Alteraciones de ese tipo pueden servir para mejorar la estabilidad, la biodisponibilidad y/o la capacidad de unión de los péptidos de la descripción.
De forma similar, un péptido o variante de la descripción puede ser modificado químicamente haciendo reaccionar aminoácidos específicos antes o después de la síntesis del péptido. Ejemplos de tales modificaciones son bien conocidos en la técnica y se resumen p. ej. en R. Lundblad, Chemical Reagents for Protein Modification, 3rd ed. CRC Press, 2005. La modificación química de aminoácidos incluye, entre otros tipos, la modificación por acilación, amidinación, piridoxilación de lisina, alquilación reductiva, trinitrobenzilación de grupos amino con ácido 2,4,6-trinitrobenzenosulfónico (TNBS), modificación amida de los grupos carboxilo y modificación del grupo sulfhidrilo mediante oxidación con ácido perfórmico para transformar la cisteína en ácido cisteico, formación de derivados mercuriales, formación de disulfuros mixtos con otros compuestos tiol, relación con maleimida, carboximetilación con ácido yodoacético o yodoacetamida y carbamoilación con cianato en pH alcalino, sin limitación a los anteriores. A este respecto, se remite a la persona versada en la técnica al Capítulo 15 de Current Protocols In Protein Science, Eds. Coligan et al. (John Wiley and Sons NY 1995-2000) donde podrá obtener una metodología más extensa en relación con la modificación química de proteínas.
En resumen, la modificación de p. ej. los residuos arginilos de las proteínas se basa a menudo en la reacción de compuestos dicarbonilo adyacentes como fenilglioxal, 2,3-butanediona, y 1,2-ciclohexanediona para formar un aducto. Otro ejemplo es la reacción de metilglioxal con residuos de arginina. La cisteína se puede modificar sin la modificación simultánea de otros sitios nucleofílicos como sucede con la lisina y la histidina. Así pues, para la modificación de la cisteína hay disponible un gran número de reactivos. Las páginas web de empresas como Sigma-Aldrich (http://www.sigma-aldrich.com) ofrecen información sobre reactivos concretos.
La reducción selectiva de los puentes disulfuro de las proteínas también es habitual. El tratamiento térmico al cual se someten los productos biofarmacéuticos a veces genera y oxida puentes disulfuro.
El reactivo K de Woodward se puede utilizar para modificar residuos de ácido glutámico concretos. Se puede emplear N-(3-(dimetilamino)propil)-N'-etilcarbodiimida para formar enlaces cruzados intramoleculares entre un residuo de lisina y un residuo de ácido glutámico.
Por ejemplo, el dietilpirocarbonato es un reactivo empleado para la modificación de residuos histidilo en proteínas. La histidina también puede ser modificada con 4-hidroxi-2-nonenal.
La reacción de los residuos de lisina y otros grupos a-amino es útil, por ejemplo, para la unión de péptidos a superficies o para la formación de enlaces cruzados entre proteínas/péptidos. La lisina es el sitio de fijación del poli(etilen)glicol y el principal sitio de modificación en la glucosilación de proteínas.
Los residuos de metionina de las proteínas se pueden modificar por ejemplo con yodoacetamida, bromoetilamina y cloramina T.
Los residuos tirosilo se pueden modificar con tetranitrometano y N-acetilimidazol. La formación de enlaces cruzados por medio de la formación de ditirosina se puede consumar con peróxido de hidrógeno/iones de cobre.
En estudios recientes sobre la modificación del triptófano se han empleado N-bromosuccinimida, 2-hidroxi-5-nitrobenzilbromuro o 3-bromo-3-metil-2-(2-nitrofenilmercapto)-3H-indol (BPNS-escatol).
La modificación de proteínas y de péptidos terapéuticos con PEG prolonga a menudo la semivida en circulación, mientras que la conjugación de proteínas con glutaraldehido, polietilenglicol diacrilato y formaldehido por medio de enlaces cruzados se emplea para la preparación de hidrogeles. La modificación química de alérgenos destinados a inmunoterapia se efectúa a menudo con la carbamilación con cianato de potasio.
Un péptido o variante que está modificado o que incluye enlaces no peptídicos es una forma de realización preferida de ladescripción. En general, se pueden sintetizar péptidos y variantes (al menos las que contienen enlaces peptídicos que unen residuos de aminoácidos) con la síntesis peptídica Fmoc-poliamida en fase sólida, tal y como muestran Lu et al (1981) y las referencias incluidas en el mismo. La protección provisional del grupo N-amino se consigue con el grupo 9-fluorenilmetiloxicarbonilo (Fmoc). La escisión repetida de este grupo protector muy sensible al pH básico se lleva a cabo con piperidina al 20% en N,N-dimetilformamida. Los grupos funcionales de las cadenas laterales se podrían proteger si se transformaran en éteres de butilo (en el caso de la serina, treonina y tirosina), ésteres de butilo (en el caso del ácido glutámico y aspártico), derivados butiloxicarbonílicos (en la lisina y la histidina), derivados tritilados (en la cisteína) y derivados 4-metoxi-2,3,6-trimetilbenzenosulfonílicos (en la arginina). Cuando los residuos C-terminales son glutamina o asparragina se utiliza el grupo 4,4'-dimetoxibenzhidrilo para proteger los grupos funcionales amido de la cadena lateral. El soporte en fase sólida se basa en un polímero de polidimetil-acrilamida constituido por los tres monómeros dimetilacrilamida (monómero estructural), bisacriloiletilendiamina (entrelazante) y acriloilsarcosina metiléster (funcionalizador). El agente escindible que mantiene unido el péptido a la resina es un derivado del ácido 4-hidroximetilfenoxiacético, sensible a pH ácido. Todos los derivados de aminoácidos se añaden en forma de derivados anhídridos simétricos preformados salvo la asparragina y la glutamina, que se añaden utilizando un procedimiento de acoplamiento inverso con N,N-diciclohexil-carbodiimida/1-hidroxibenzotriazol. Todas las reacciones de acoplamiento y desprotección se controlan con procedimientos de ensayo con ninhidrina, ácido trinitrobencenosulfónico o isotina. Una vez completada la síntesis, los péptidos se separan del soporte de resina y al mismo tiempo se eliminan los grupos protectores de las cadenas laterales mediante el tratamiento con ácido trifluoroacético al 95% con una mezcla de capturadores (scavengers) al 50%. Los capturadores utilizados normalmente son etanditiol, fenol, anisol y agua, dependiendo de la elección exacta de los aminoácidos constituyentes del péptido que se está sintetizando. La síntesis de péptidos también es posible combinando metodologías de fase sólida y de fase en solución (véase por ejemplo (Bruckdorfer et al., 2004) y las referencias citadas en la misma).
El ácido trifluoroacético se elimina por evaporación en vacío y se procede a la trituración con dietiléter para obtener el péptido bruto. Todos los capturadores (scavengers) se eliminan con un procedimiento de extracción simple que con la liofilización de la fase acuosa proporciona el péptido bruto exento de ellos. Los reactivos para la síntesis de péptidos se pueden conseguir en general por ejemplo de Calbiochem-Novabiochem (UK) Ltd, Nottingham NG7 2QJ, Reino Unido.
La purificación se puede practicar con una técnica o una combinación de técnicas como recristalización, cromatografía por exclusión de tamaño, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía por interacción hidrofóbicaa y, normalmente, cromatografía de líquidos de alto rendimiento con fase inversa, por ejemplo con elución con gradiente de acetonitrilo/agua.
El análisis de los péptidos se puede llevar a cabo utilizando cromatografía en capa fina, electroforesis, en concreto electroforesis capilar, extracción en fase sólida (CSPE), cromatografía de líquidos de alto rendimiento con fase inversa, análisis de aminoácidos tras hidrólisis ácida y mediante análisis por espectrometría de masas por bombardeo con átomos rápidos (FAB), así como análisis por espectrometría de masas MALDI y ESI-Q-TOF.
Otro aspecto de la descripción proporciona un ácido nucleico (por ejemplo un polinucleótido) que codifica un péptido o una variante peptídica de la descripción. El polinucleótido puede ser, por ejemplo, ADN, ADNc, APN, a Rn o combinaciones de los mismos, monocatenarios y/o bicatenarios, o formas nativas o estabilizadas de polinucleótidos, como por ejemplo, polinucleótidos con un esqueleto de fosforotioato y que pueden contener intrones siempre que codifique el péptido. Por supuesto, el polipéptido solo puede codificar péptidos que contengan residuos de aminoácidos naturales unidos por enlaces peptídicos naturales. Otro aspecto más de la descripción proporciona un vector de expresión capaz de expresar un polipéptidodado a conocer en la presente memoria.
Se han desarrollado diversos métodos para unir polinucleótidos, especialmente ADN, a vectores, por ejemplo a través de extremos cohesivos complementarios. Por ejemplo, al segmento de ADN se le pueden añadir prolongaciones de homopolímeros complementarios para insertarlo en el vector de ADN. El vector y el segmento de ADN se unen a continuación por medio de puentes de hidrógeno entre las colas homopoliméricas complementarias para formar moléculas de ADN recombinante.
Otro método alternativo para unir el segmento de ADN a los vectores son los ligadores sintéticos que contienen uno o más sitios de restricción. Existen ligadores sintéticos comerciales que contienen diversos sitios para las endonucleasas de restricción que facilitan varios proveedores como International Biotechnologies Inc. New Haven, CN, EE. UU.
Un método deseable para modificar el ADN que codifica el polipéptido de la descripción emplea la reacción en cadena de la polimerasa tal y como exponen (Saiki et al., 1988)). Este método puede ser utilizado para introducir el ADN en un vector adecuado, por ejemplo diseñando los sitios de restricción adecuados, o puede ser empleado para modificar el ADN de otros modos útiles conocidos en la técnica. Si se opta por vectores virales, son preferibles los vectores poxvíricos o adenovíricos.
El ADN (o ARN en el caso de los vectores retrovíricos) se puede expresar en un hospedador adecuado para producir un polipéptido que comprenda el péptido o variante de la descripción. Así pues, el ADN que codifica el péptido o variante de la descripción puede ser utilizado conforme a técnicas conocidas, modificado adecuadamente siguiendo las enseñanzas contenidas en la presente memoria para construir un vector de expresión que se emplee para transformar una célula hospedadora a fin de que exprese y produzca el polipéptido de ladescripción. Tales técnicas incluyen las reveladas en las patentes de EE. UU. N.° 4. 440. 859, 4. 530. 901, 4. 582. 800, 4. 677. 063, 4. 678. 751, 4. 704. 362, 4. 710. 463, 4. 757. 006, 4. 766. 075 y 4. 810. 648.
El ADN (o ARN en el caso de los vectores retrovíricos) que codifica el polipéptido que constituye el compuesto de la descripción se puede unir con una amplia variedad de secuencias de ADN distintas para introducirlo en un hospedador adecuado. El ADN acompañante dependerá de la naturaleza del hospedador, el modo de introducir el ADN en su interior y de si se pretende que se integre o que se mantenga como un episoma.
En general el ADN se inserta en un vector de expresión, como un plásmido, con la orientación adecuada y el marco de lectura correcto para posibilitar la expresión. Si es preciso el aDn se puede unir a secuencias de nucleótidos de control que regularán la transcripción y la traducción y que son reconocidas por el hospedador deseado, aunque el vector de expresión ya suele incorporar tales controles. A continuación el vector se introduce en el hospedador mediante técnicas estándar. En general, el vector no consigue transformar todos los hospedadores, lo que hará necesario seleccionar las células hospedadoras que hayan quedado transformadas. Una técnica de selección consiste en incorporar en el vector de expresión una secuencia de aDn con los elementos de control necesarios que codifique un rasgo seleccionable en la célula transformada, como por ejemplo de resistencia a antibióticos.
Otra alternativa consiste en incorporar el gen de ese rasgo seleccionable en otro vector con el que se cotransforma la célula hospedadora.
Las células hospedadoras que hayan sido transformadas con el ADN recombinante de la descripción se cultivarán durante el tiempo suficiente y en las condiciones apropiadas que las personas versadas en la técnica conocen a la vista de las enseñanzas reveladas en la presente memoria para que el polipéptido pueda expresarse y, finalmente, ser recuperado.
Son muchos los sistemas de expresión conocidos, como bacterias (E. coli, Bacillus subtilis, etc.), levaduras (Saccharomyces cerevisiae, etc.), hongos filamentosos (género Aspergillus, etc.), células vegetales, animales o de insectos. Preferiblemente el sistema consistirá en células de mamífero, como las células CHO disponibles de la ATCC Cell Biology Collection.
La presente descripción también se refiere a una célula hospedadora transformada con un vector polinucleotídico de la presentedescripción. La célula hospedadora puede ser procariota o eucariota. Las células bacterianas pueden ser las células hospedadoras procariotas más adecuadas en determinadas circunstancias; normalmente son cepas de E. coli, como por ejemplo las cepas DH5 disponibles de Bethesda Research Laboratories Inc., Bethesda, MD, EE. UU., y RR1 disponibles de la American Type Culture Collection (ATCC) de Rockville, MD, EE. UU. (N. ° ATCC 31343). Las células hospedadoras eucariotas preferidas son células de levadura, de insecto y de mamífero, preferiblemente células de vertebrado como estirpes celulares de colon y de fibroblastos de ratón, rata, mono o ser humano. Las células hospedadoras de levadura incluyen YPH499, YPH500 y YPH501, que en general están disponibles de Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA 92037, EE. UU. Las células hospedadoras de mamífero preferidas incluyen las células de ovario de hámster chino (CHO) disponibles de la ATCC como CCL61, las células embrionarias de ratón suizo NIH/3T3 disponibles de la ATCC como CRL 1658, las células COS-1 de riñón de mono disponibles de la ATCC como CRL 1650 y las células 293 que son células renales embrionarias humanas. Las células de insecto preferidas son las células Sf9 que se pueden transfectar con vectores de expresión baculovíricos. Se puede encontrar una revisión general referente a la elección de las células hospedadoras más adecuadas por ejemplo en el manual de Paulina Balbás y Argelia Lorence «Methods in Molecular Biology Recombinant Gene Expression, Reviews and Protocols», Part One, Second Edition, ISBN 978-1-58829-262-9, y otra bibliografía conocida por las personas versadas en la materia.
La transformación de las células hospedadoras adecuadas con el constructo de ADN de la presente descripción se consuma con métodos consabidos que normalmente dependen del tipo de vector utilizado. En lo referente a la transformación de células hospedadoras procariotas, véanse por ejemplo Cohen et al (1972) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69, 2110, y Sambrook et al (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, EE. UU. La transformación de células de levadura aparece descrita en Sherman et al (1986) Methods In Yeast Genetics, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY, Ee. UU. El método de Beggs (1978) Nature 275,104-109 también resulta útil. En lo que concierne a los reactivos adecuados para transfectar las células de vertebrados, por ejemplo el fosfato de calcio y el DEAE-dextrano o las formulaciones con liposomas, se pueden adquirir de Stratagene Cloning Systems, o Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD 20877, EE. UU. La electroporación también es útil para la transformación y/o transfeccion de las células y es perfectamente conocida su aplicación en la transformación de células de levadura, bacteria, insecto y vertebrado.
Las células transformadas con éxito, es decir, las que contengan un constructo de ADN de la presentedescripción, se pueden identificar con técnicas bien conocidas como la PCR. Otra alternativa consiste en detectar la presencia de la proteína en el sobrenadante por medio de anticuerpos.
Se apreciará que ciertas células hospedadoras de la descripción son útiles para la preparación de péptidos de la descripción, por ejemplo las células bacterianas, de levadura e insecto. Con todo, para ciertos métodos terapéuticos pueden ser útiles otras células hospedadoras. Por ejemplo, se pueden utilizar células presentadoras de antígeno como las células dendríticas para expresar los péptidos de la invención de tal forma que puedan ser cargados en las moléculas MHC oportunas. Así pues, la presente descripción proporciona una célula hospedadora que comprende un ácido nucleico o un vector de expresión dado a conocer en la presente memoria.
En una forma de realización preferida la célula hospedadora es una célula presentadora de antígeno, en particular una célula dendrítica o célula presentadora de antígeno. Las APC cargadas con una proteína de fusión recombinante que contiene ácido prostático fosfatasa (PAP) son en la actualidad objeto de investigación como tratamiento contra el cáncer de próstata (Sipuleucel-T) (Small et al., 2006; Rini et al., 2006).
Otro aspecto de la descripción proporciona un método para la producción de un péptido o de su variante, comprendiendo dicho método el cultivo de una célula hospedadora y el aislamiento del péptido a partir de dicha célula o de su medio de cultivo.
En otra forma de realización el péptido, el ácido nucleico o el vector expresión de la descripción se emplean en medicina. Por ejemplo, el péptido o su variante se pueden preparar para ser administrados por inyección intravenosa (i. v.), inyección subcutánea (s. c.), inyección intradérmica (i. d.), inyección intraperitoneal (i. p.), inyección intramuscular (i. m.). Los métodos preferidos para la inyección del péptido incluyen s. c., i. d., i. p., i. m. e i. v. Los métodos preferidos para la inyección del ADN incluyen i. d., i. m., s. c., i. p. e i. v. Se pueden administrar dosis de péptido o de ADN de por ejemplo entre 50 jg y 1,5 mg, preferiblemente 125 |jg a 500 |jg, dependiendo del péptido o ADN de que se trate. Dosis en esos intervalos se han empleado con éxito en varios ensayos (Walter et al Nature Medicine 18, 1254-1261 (2012)).
Otro aspecto de la presente descripción incluye un método in vitro para producir linfocitos T activados, comprendiendo dicho método la puesta en contacto en condiciones in vitro de linfocitos T con moléculas MHC humanas cargadas con antígeno expresadas en la superficie de una célula presentadora de antígeno adecuada durante un periodo de tiempo suficiente para activar los linfocitos T de una manera específica de antígeno, siendo el antígeno un péptido dado a conocer en la presente memoria. Preferentemente se emplea una cantidad suficiente del antígeno con una célula presentadora de antígeno.
Preferentemente la célula de mamífero carece o presenta un nivel o función reducida del transportador de péptidos TAP. Las células adecuadas que carecen del transportador de péptidos TAP incluyen las células T2, RMA-S y de Drosophila. TAP es el transportador relacionado con el procesamiento de los antígenos.
La estirpe celular humana deficiente en carga de péptidos T2 está disponible en la American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, Ee. UU. con el N.° de catálogo CRL 1992; la estirpe de células de Drosophila Schneider line 2 está disponible en la ATCC con el N. ° de catálogo CRL 19863; la estirpe de células de ratón RMA-S está descrita en Karre et al 1985.
Preferentemente, la célula hospedadora no expresa sustancialmente moléculas MHC de clase I antes de la transfección. También es preferible que la célula estimuladora exprese una molécula importante que proporcione una señal coestimuladora para los linfocitos T, como B7. 1, B7. 2, ICAM-1 y LFA3. Las secuencias de ácidos nucleicos de numerosas moléculas MHC de clase I y de las moléculas co-estimuladoras están disponibles públicamente en las bases de datos GenBank y EMBL.
Si se utiliza como antígeno un epítopo de MHC de clase I, los linfocitos T son CTL CD8-positivos.
Si una célula presentadora de antígeno es transfectada para expresar un epítopo de ese tipo, la célula comprenderá preferentemente un vector de expresión capaz de expresar un péptido que contenga la SEQ ID N.° 2, o una variante de la secuencia de aminoácidos de la misma.
Existen otros métodos para generar CTL in vitro. Por ejemplo, los métodos descritos en Peoples et al (1995) y Kawakami et al (1992) emplean linfocitos autólogos infiltrados en el tumor para generar los CTL. Plebanski et al (1995) recurre a linfocitos autólogos de sangre periférica (PLB) para la preparación de los CTL. Jochmus et al (1997) describen la producción de CTL autólogos estimulando células dendríticas con el péptido o el polipéptido, o a través de la infección con virus recombinantes. Hill et al (1995) y Jerome et al (1993) emplean linfocitos B para la producción de CTL autólogos. Asimismo, para la preparación de CTL autólogos se pueden usar macrófagos estimulados con péptido o polipéptido o infectados con virus recombinantes. S. Walter et al. 2003 describe la sensibilización in vitro de linfocitos T mediante células presentadoras de antígeno artificiales (aAPC), que es otro modo adecuado para generar linfocitos T contra el péptido de elección. En este estudio, las aAPC se generaron adhiriendo complejos MHC:péptido preformados a la superficie de partículas de poliestireno (microperlas) con biotina:estreptavidina. Este sistema permite controlar con exactitud la densidad de MHC en las aAPC, lo que permite desencadenar respuestas de linfocitos T específicas de antígeno con una avidez alta o baja a partir de muestras de sangre, de una forma selectiva y altamente eficaz. Además de los complejos MHC:péptido, las aAPC deben incorporar acopladas en su superficie otras proteínas con actividad co-estimuladora como anticuerpos anti-CD28. Tales sistemas de aAPC también precisan a menudo el concurso de factores solubles adecuados, por ejemplo citocinas como la interleucina-12.
Para la preparación de linfocitos T también se pueden utilizar células alogénicas; en WO 97/26328 se describe detalladamente un método. Por ejemplo, además de células de Drosophila y células T2, para presentar antígenos se pueden usar otras células tales como células CHO, células de insecto infectadas con baculovirus, bacterias, levaduras, células diana infectadas con vaccinia. Asimismo se pueden utilizar virus vegetales (véase por ejemplo Porta et al (1994)) que describe el desarrollo del virus del mosaico del chícharo como sistema de alto rendimiento para la presentación de péptidos extraños.
Los linfocitos T activados que están dirigidos contra los péptidos de la descripción son útiles como tratamiento. Así pues, otro aspecto de la descripción proporciona linfocitos T activados obtenibles por los susodichos métodos de ladescripción.
Los linfocitos T activados producidos con el susodicho método reconocerán selectivamente una célula que expresa de forma aberrante un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de las SEQ ID N.° 1 a SEQ ID N.° 92, preferiblemente de la secuencia SEQ ID N.° 2.
Preferiblemente el linfocito T reconoce la célula interaccionando a través de su TCR con el complejo HLA/péptido, por ejemplo uniéndosele. Los linfocitos T son útiles en un método para destruir células diana en un paciente cuyas células diana expresen de forma aberrante un polipéptido que comprenda una secuencia de aminoácidos de la descripción y al cual se le administre un número eficaz de linfocitos T activados. Los linfocitos T que le se administran al paciente pueden proceder de él mismo y ser activados del modo antes descrito, es decir, son linfocitos T autólogos. Otra alternativa consiste en que los linfocitos T no sean del paciente y procedan de otro individuo. Por supuesto, es preferible que dicho individuo esté sano. Por «individuo sano» los inventores entienden un individuo que goce de buen estado de salud general, preferentemente con un sistema inmunitario competente y, más preferentemente, no sufra ninguna enfermedad que analizada se le detecte.
En condiciones in vivo, las células diana de los linfocitos T CD8-positivos dados a conocer en la presente memoria pueden ser células del tumor (que a veces expresan MHC de clase II) y/o células estromales circundantes al tumor (células tumorales) (que en ocasiones también expresan MHC de clase II; (Dengjel et al., 2006)).
Los linfocitos T de la presente descripción se pueden usar como principios activos de una composición terapéutica. Por tanto, la descripción también proporciona un método para destruir células diana en un paciente cuyas células diana expresan de forma aberrante un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de ladescripción, comprendiendo dicho método la administración al paciente de un número eficaz de linfocitos T como los definidos arriba.
Por «expresado de forma aberrante» los inventores también quieren decir que el polipéptido está sobreexpresado en comparación con los niveles normales de expresión o que el gen está reprimido en el tejido del que deriva el tumor pero en cambio se expresa en éste. Por «sobreexpresado» los inventores quieren decir que el nivel del polipéptido es como mínimo 1,2 veces mayor que el nivel en el tejido normal; preferiblemente como mínimo 2 veces mayor, y más preferiblemente como mínimo 5 o 10 veces mayor que el del tejido normal.
Los linfocitos T se pueden obtener por métodos conocidos en la materia, como por ejemplo los antes descritos.
Los protocolos para la llamada transferencia de linfocitos T a un receptor son perfectamente conocidos en la técnica. Se pueden encontrar revisiones en (Gattinoni et al., 2006) y (Morgan et al., 2006).
Cualquier molécula de ladescripción, ya sea péptido, ácido nucleico, anticuerpo, vector de expresión, célula, CTL activado, receptor de linfocito T o el ácido nucleico que los codifique es útil para el tratamiento de trastornos caracterizados por células que eluden la respuesta inmunitaria. Por consiguiente, cualquier molécula de la presente descripción puede ser utilizada como medicamento o en la fabricación de un medicamento. La molécula puede ser utilizada sola o combinada con otra molécula o moléculas de la descripción o con cualquier o cualesquier moléculas conocidas.
Preferiblemente, el medicamento de la presente descripción es una vacuna. Puede administrarse directamente al paciente, en el órgano afectado o sistémicamente por vía i. d., i. m., s. c., i. p. e i. v., o aplicarse ex vivo en células derivadas del paciente o de una estirpe celular humana que después se administra al paciente, o utilizarse in vitro para seleccionar una subpoblación de células inmunitarias derivadas del paciente, al que luego se le vuelven a administrar. Si el ácido nucleico se administra a células in vitro, puede ser útil que las células sean transfectadas para que expresen simultáneamente citocinas inmunoestimuladoras como la interleucina-2. El péptido puede ser esencialmente puro o combinarse con un adyuvante inmunoestimulador (véase abajo) o puede ser utilizado en combinación con citocinas inmunoestimuladoras, o ser administrado con un sistema de liberación adecuado como, por ejemplo, liposomas. El péptido también se puede conjugar con un vehículo apropiado como la hemocianina de lapa californiana (KLH) o el manano (véase WO 95/18145 y Longenecker, 1993). El péptido también podrá estar etiquetado, o ser una proteína de fusión o una molécula híbrida. Se espera que los péptidos cuya secuencia se revela en la presente descripción estimulen los linfocitos T CD4 o CD8. No obstante, la estimulación de los CTL CD8 es más eficiente si cuenta con la ayuda de los linfocitos T cooperadores CD4. Así, para epítopos de MHC de clase I que estimulan los CTL CD8, las secciones o la pareja de fusión de una molécula híbrida proporciona de forma adecuada epítopos que estimulan a los linfocitos T CD4+. Los epítopos estimuladores de CD4 y CD8 son conocidos en la materia e incluyen a los identificados en la presentedescripción.
En un aspecto, la vacuna comprende al menos un péptido dotado de la secuencia de aminoácidos expuesta en las SEQ ID N.° 1 a SEQ ID N.° 92 y al menos otro péptido adicional, preferiblemente dos a 50, más preferiblemente dos a 25, incluso más preferiblemente dos a 20 y más preferiblemente dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce, quince, dieciséis, diecisiete o dieciocho péptidos. Los péptidos pueden derivar de uno o más TAA específicos y se pueden unir a moléculas MHC de clase I.
En otro aspecto, la vacuna comprende al menos un péptido dotado de la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID N.° 2 y al menos un péptido adicional, preferiblemente dos a 50, más preferiblemente dos a 25, incluso más preferiblemente dos a 20 y como más preferible dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce, quince, dieciséis, diecisiete o dieciocho péptidos. Los péptidos pueden derivar de uno o más TAA específicos y se pueden unir a moléculas MHC de clase I.
El polinucleótido puede ser básicamente puro, o estar contenido en un vector o un sistema de liberación adecuado. El ácido nucleico puede ser ADN, ADNc, APN, ARN o una combinación de los mismos. Los métodos para diseñar e introducir ese ácido nucleico son bien conocidos por los expertos en la materia. Se puede consultar una revisión general por ejemplo en (Pascolo et al., 2005). Las vacunas polinucleotídicas son fáciles de preparar, pero el mecanismo por el cual tales vectores inducen la respuesta inmunitaria no se conoce con exactitud. Los vectores y sistemas de liberación adecuados incluyen ADN y/o ARN viral, como los basados en adenovirus, virus vaccinia, retrovirus, herpesvirus, virus adenoasociados o híbridos que contengan elementos de más de un virus. Los sistemas de liberación no víricos como lípidos catiónicos y polímeros catiónicos son conocidos por los entendidos en la materia. También se pueden utilizar métodos físicos como una «pistola génica». El péptido o péptidos codificados por el ácido nucleico pueden ser una proteína de fusión, por ejemplo con un epítopo que estimule los linfocitos T para el respectivo CDR opuesto tal y como se ha indicado antes.
Los adyuvantes preferidos son imiquimod, resiquimod, GM-CSF, ciclofosfamida, sunitinib, bevacizumab, interferón alfa, oligonucleótidos CpG y derivados, poli-(I:C) y derivados, ARN, sildenafilo, y formulaciones de partículas con PLG o virosomas.
En una forma de realización preferida de la composición farmacéutica dada a conocer en la presente memoria, el adyuvante se selecciona del grupo consistente en factores estimuladores de colonias, como el factor estimulador de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF, sargramostim), ciclofosfamida, imiquimod, resiquimod e interferón alfa.
En una forma de realización preferida, en la composición farmacéutica dada a conocer en la presente memoria el adyuvante se selecciona del grupo consistente en factores estimuladores de colonias, como el factor estimulador de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF, sargramostim), ciclofosfamida, imiquimod y resiquimod.
En una forma de realización preferida de la composición farmacéutica dada a conocer en la presente memoria el adyuvante es ciclofosfamida, imiquimod o resiquimod.
Los adyuvantes más preferidos son: Montanide IMS 1312, Montanide ISA 206, Montanide ISA 50V, Montanide ISA-51, poli-ICLC (Hiltonol®) y AcM anti-CD40 o combinaciones de los anteriores.
Esta composición se destina a la administración por vía parenteral como, por ejemplo, subcutánea, intradérmica o intramuscular, o bien por vía oral. Para ello, los péptidos y, opcionalmente, otras moléculas son disueltos o suspendidos en un vehículo farmacéuticamente aceptable y preferiblemente acuoso. Además, la composición puede contener excipientes como soluciones tamponadoras, aglutinantes, disgregantes, diluyentes, aromas, lubricantes, etc. Los péptidos también pueden administrase junto con sustancias estimulantes de la respuesta inmunitaria, como las citocinas. Una lista completa de excipientes utilizables para esta composición aparece, por ejemplo, en A. Kibbe, Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3a Ed., 2000, American Pharmaceutical Association and Pharmaceutical Press. La composición puede usarse para la prevención, profilaxis y/o tratamiento de enfermedades adenomatosas o cancerosas. Las formulaciones preferidas se pueden encontrar en EP2113253, por ejemplo.
No obstante dependiendo del número y de las características fisicoquímicas de los péptidos de la descripción se precisa más investigación para ofrecer formulaciones con ciertas combinaciones de péptidos, en especial combinaciones con más de 20 péptidos que sean estables durante más de 12 a 18 meses.
La presente descripción proporciona un medicamento que es útil para el tratamiento del cáncer, en particular carcinoma de pulmón amicrocítico, cáncer gástrico, carcinoma de células renales, cáncer de colon, adenocarcinoma, cáncer de próstata, neoplasia benigna y melanoma maligno.
La presente descripción también contempla un equipo que comprende:
(a) un contenedor con una composición farmacéutica como la descrita más arriba, en forma de solución o liofilizada; (b) opcionalmente, un segundo contenedor con solución reconstituyente o diluyente para la formulación liofilizada; y
(c) , opcionalmente, instrucciones de (I) uso de la solución o de (II) reconstitución y/o uso de la formulación liofilizada.
El equipo puede constar, además, de uno o varios (III)tampones, (IV) diluyentes, (V) filtros, (VI) agujas o (v) jeringuillas. Se prefiere que el contenedor sea un frasco, un vial, una jeringuilla o un tubo de ensayo; puede ser multiuso. Se prefiere que la composición farmacéutica esté liofilizada.
Los equipos de la presente descripción comprenden, preferiblemente, una formulación liofilizada de la presente descripción en un contenedor adecuado e instrucciones para su reconstitución y/o uso. Entre los contenedores apropiados se incluyen, por ejemplo, frascos, viales (viales de cámara doble, p. ej.), jeringuillas (como jeringuillas de cámara doble) y tubos de ensayo. El contenedor puede estar hecho de una variedad de materiales, como vidrio o plástico. Se prefiere que el equipo y/o el contenedor disponga(n) de instrucciones relacionadas con el contenedor que indiquen cómo utilizarlos y/o realizar la reconstitución. Por ejemplo, la etiqueta puede indicar que la formulación liofilizada debe reconstituirse para obtener las concentraciones de péptido descritas más arriba. La etiqueta también puede indicar que la formulación es útil o está destinada para su administración subcutánea.
El recipiente que contenga la formulación puede ser un vial multiuso, lo que permite administraciones repetidas (de 2 a 6 administraciones, p. ej.) de la formulación reconstituida. El equipo puede constar, además, de un segundo contenedor que comprenda un diluyente adecuado (por ejemplo, una solución de bicarbonato sódico).
Al mezclar el diluyente y la formulación liofilizada, la concentración final de péptidos en la formulación reconstituida es, preferiblemente, de al menos 0,15 mg/ml/péptido (= 75 |jg) y, preferiblemente, no mayor de 3 mg/ml/péptido (= 1500 jg). El equipo también puede incluir otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y del usuario, como otros tamponadores, diluyentes, filtros, agujas, jeringuillas y folletos con instrucciones de uso.
Los equipos de la presente descripción pueden constar de un solo recipiente que contenga la formulación de las composiciones farmacéuticas dadas a conocer en la presente memoria junto con otros componentes o sin ellos (por ejemplo, otros compuestos o composiciones farmacéuticas de estos otros compuestos), o, por el contrario, pueden constar de recipientes distintos para cada uno de los componentes.
Preferiblemente, los equipos de la descripción incluyen una formulación de la descripción embalada para su uso en combinación con la administración conjunta de un segundo compuesto (como adyuvantes [p. ej., GM-CSF], un agente quimioterapéutico, un producto natural, una hormona o un antagonista, un inhibidor de la angiogénesis, un agente de inducción de apoptosis o un quelante) o una composición farmacéutica de la misma. Los componentes del equipo pueden estar previamente combinados o bien cada componente puede estar contenido en un recipiente distinto antes de la administración al paciente. Los componentes del equipo pueden proporcionarse en una o varias soluciones líquidas, preferiblemente en una solución acuosa y, con mayor preferencia, en una solución acuosa estéril. Los componentes del equipo también se pueden proporcionar en forma de sólido, que se podrán convertir en líquidos mediante la adición de disolventes adecuados, que se suministrarán, preferiblemente, en un contenedor distinto.
El contenedor de un equipo terapéutico puede ser un vial, un tubo de ensayo, un matraz, un frasco, una jeringuilla o cualquier otro recipiente que pueda contener un sólido o un líquido. Normalmente, cuando hay más de un componente, el equipo contendrá un segundo vial u otro contenedor, lo que permite la dosificación por separado. El equipo también puede contener otro recipiente con un líquido farmacéuticamente aceptable. Preferiblemente, el equipo terapéutico contendrá una serie de aparatos (por ejemplo, una o varias agujas, jeringuillas, cuentagotas, pipetas, etc.) que permitan la administración de los agentes de la descripción que componen el presente equipo.
La formulación farmacéutica de la presente descripción es aquella adecuada para la administración de los péptidos por cualquier vía adecuada como la oral (enteral), nasal, oftálmica, subcutánea, intradérmica, intramuscular, intravenosa o transdérmica. Se prefiere la administración subcutánea y, con mayor preferencia, la intradérmica. Se puede utilizar una bomba de infusión para la administración.
Puesto que los péptidos de la descripción proceden del cáncer de pulmón amicrocítico (NSCLC), el medicamento de la descripción debe utilizarse preferentemente para tratar ese tipo de cáncer. En una forma de realización preferida, puesto que los péptidos derivados de ABCA13 y de MMP12 se aislaron del cáncer de pulmón amicrocítico (NSCLC), el medicamento de la descripción debe utilizarse preferentemente para tratar ese tipo de cáncer.
El péptido con las secuencias SEQ ID N.° 78 a 92 también se aislaron del carcinoma de células de Merkel, y por tanto pueden ser utilizados para tratar ese tipo de carcinoma.
Descripción breve de los dibujos
Figura 1: Ejemplo de espectro de masa de ABCA13-001 que demuestra su presencia en la muestra 898 de NSCLC primario. Se llevó a cabo una cromatografía de líquidos acoplada a espectrometría de masas nanoESI con una mezcla de péptidos eluida de la muestra de NSCLC número 898. El cromatograma de masas de m/z 543,8318 ± 0,001 Da, z = 2 muestra un pico de péptido en el tiempo de retención 86,36 min. B). El pico detectado en el cromatograma de masa a los 86,36 min reveló una señal de m/z 543,8318 en el espectro de EM. C) El espectro de masas resultante de la desintegración inducida por colisiones del precursor seleccionado m/z 543. 8318 registrado en el experimento de CL-EM nanoESI en el tiempo de retención indicado confirmó la presencia de ABCA13-001 en la muestra de tumor NSCLC898. D) Para verificar la secuencia se registró el patrón de fragmentación del péptido de referencia sintético ABCA13-001 y se comparó con el patrón de fragmentación generado por el TUMAp natural mostrado en C.
Figure 2: Perfiles de expresión de ARNm de proteínas seleccionadas en muestras de tejidos normales y en 21 muestras de cáncer de pulmón
a) ABCA13 (Probeset ID: 1553605_a_at)
b) MMP12 (Probeset ID: 204580_at)
Figura 3: Perfiles de presentación de péptidos HLA de clase I seleccionados. Se calculó un perfil de presentación de cada péptido que exponía la presentación media de la muestra así como las variaciones de los duplicados. El perfil yuxtapone muestras de la entidad tumoral de interés con muestras de tejido normal de referencia.
a) ABCA13-001
b) DST-001
c) MXRA5-001
Figura 4: Ejemplos de resultados de la inmunogenicidad in vitro específica de péptido de TUMAP de clase I. Linfocitos T CD8+ específicos se tiñeron con multímeros HLA unidos a dos fluorocromos distintos. Los diagramas de puntos revelan las poblaciones de multímero MHC-doble-positivo para el péptido estimulado (cuadros de la izquierda) y la correspondiente estimulación del control negativo (cuadros de la derecha).
Figura 5: Propiedades de unión de POSTN-002 y MMP12-002 a los haplotipos HLA investigados: El diagrama muestra las puntuaciones de unión de POSTN-002 y MMP12-002 a los 6 haplotipos HLA-DR analizados.
Figura 6: Estabilidad de los complejos HLA-POSTN-002 y MMP12-002 después de 24 h a 37°C: El diagrama muestra los cocientes de las puntuaciones de unión detectados a las 0 h y después de 24 h a 37°C de POSTN-002 y de MMP12-002 con la molécula HLA correspondiente.
Figure 7: Ejemplo de respuesta de los linfocitos T CD4 generada por la vacuna contraCEA-006 en un ensayo de tinción intracelular de citocinas (ICS) con la clase II. Después de la sensibilización in vitro se analizaron PBMC del paciente 36-031 para detectar las respuestas de los linfocitos T CD4 contra el antígeno CEA-006 (cuadro superior) y otro ficticio (cuadro inferior) en el momento combinado V8/FdE. Las células fueron estimuladas con los péptidos correspondientes y teñidas con marcadores de vialidad, anti-CD3, anti-CD8, anti-CD4 y efectores (de derecha a izquierda: CD154, TNF-alfa, IFN-gama, IL-2, IL-10), respectivamente. Los linfocitos T CD4 viables fueron analizados para determinar la proporción de células positivas para una o varias moléculas efectoras.
Figura 8: Inmunogenicidad de varios péptidos de clase II: El diagrama muestra la tasa de respuesta inmunitaria a 5 péptidos de clase II distintos detectados en 16 pacientes en el caso de los péptidos IMA950 y en 71 pacientes en el de los péptidos IMA910 en un ensayo de tinción intracelular de citocinas.
EJEMPLOS
EJEMPLO 1:
Identificación y cuantificación de los péptidos asociados a tumor presentados en la superficie celular
Muestras de tejido
Los tejidos tumorales de pacientes fueron facilitados por la Universidad de Heidelberg, Heidelberg, Alemania. Los pacientes otorgaron su consentimiento informado por escrito antes de la intervención quirúrgica. Los tejidos se criogenizaron en nitrógeno líquido inmediatamente después de la operación y permanecieron a -80°C hasta el aislamiento de los TUMAP.
Aislamiento de los péptidos HLA de las muestras de tejido
Las mezclas de péptidos HLA de las muestras de tejido criogenizadas se obtuvieron por inmunoprecipitación de los tejidos sólidos siguiendo un protocolo ligeramente modificado (Falk, K., 1991; Seeger, F. H. T., 1999) con el anticuerpo específico de HLA-A*02 b B7. 2, el anticuerpo específico de HLA-A, B y C W6/32, sefarosa activada con CNBr, tratamiento con ácido y ultrafiltración.
Métodos
Las mezclas de péptidos HLA se separaron en función de su hidrofobicidad con cromatografía en fase invertida (sistema Acquity UPLC, Waters) y los péptidos eluidos se analizaron con un espectrómetro de masas híbrido LTQ-Orbitrap (ThermoElectron) equipado con una fuente ESI. Las mezclas de péptidos se cargaron directamente en una columna microcapilar de sílice fundido (75 pm d. i. x 250 mm) rellena con material de fase invertida C18 1,7 pm (Waters) aplicando un caudal de 400 nl por minuto. Posteriormente los péptidos se separaron con un gradiente binario de 180 minutos en dos fases con 10% al 33% de B con un caudal de 300 nl por minuto. El gradiente estaba compuesto por solvente A (ácido fórmico al 0,1% en agua) y solvente B (ácido fórmico al 0,1% en acetonitrilo). Para la introducción en la fuente nanoESI se empleó un capilar de vidrio recubierto de oro (PicoTip, New Objective). El espectrómetro de masas LTQ-Orbitrap se hizo operar en el modo dependiente de datos con el método TOP5. En resumen, se inició un ciclo de barrido con un barrido completo de alta precisión de masa en el orbitrap (R = 30000), al que siguieron barridos EM/EM también en el orbitrap (R = 7500) con los 5 iones precursores más abundantes y exclusión dinámica de los iones preseleccionados. Los espectros de masas en tándem se interpretaron con SEQUEST y control manual adicional. La secuencia peptídica identificada se confirmó comparando el patrón de fragmentación generado por el péptido natural con el patrón de fragmentación de un péptido de referencia sintético de idéntica secuencia. La Fig. 1 muestra un ejemplo de espectro obtenido de tejido tumoral correspondiente al péptido asociado a MHC-I ABCA13-001 y su perfil de elución en el sistema de UPLC.
La cuantificación relativa de la CL-EM sin marcaje se efectuó por recuento iónico, es decir por extracción y análisis de las características CL-EM (Mueller et al. 2007a). El método supone que el área de la señal del péptido en la CL-EM está relacionada con su abundancia en la muestra. La características extraídas se procesaron además con deconvolución del estado de carga y alineamiento del tiempo de retención (Mueller et al. 2007b; Sturm et al. 2008). Por último, todas las características CL-EM se cotejaron con los resultados de la identificación de secuencias para combinar los datos cuantitativos de muestras y tejidos diferentes con los perfiles de presentación de péptidos. Los datos cuantitativos se normalizaron en proporción dos tercios de acuerdo con la tendencia central para tener en cuenta la variacion entre los duplicados técnicos y biológicos. De ese modo cada péptido identificado se puede asociar con datos cuantitativos que permiten la cuantificación relativa entre muestras y tejidos. Asimismo, todos los datos cuantitativos adquiridos de los candidatos peptídicos se revisaron manualmente para comprobar la coherencia de los datos y verificar la exactitud del análisis automático. Se calculó un perfil de presentación de cada péptido que mostraba la presentación media de la muestra así como las variaciones de los duplicados. El perfil yuxtapone muestras de NSCLC con muestras de tejido normal de referencia.
En la figura 3 se muestran perfiles de presentación de péptidos sobrepresentados a modo de ejemplo.
EJEMPLO 2
Perfiles de expresión de genes que codifican los péptidos de la invención
No todos los péptidos identificados como presentes en la superficie de las células tumorales a través de las moléculas MHC son adecuados para la inmunoterapia, porque la mayoría de ellos proceden de proteínas celulares normales que se expresan en multitud de tipos de células. Muy pocos de esos péptidos están asociados a tumores y probablemente sean capaces de estimular los linfocitos T con una alta especificidad de reconocimiento contra el tumor del cual derivan. A fin de descubrir esos péptidos y de minimizar el riesgo de que la vacuna genere autoinmunidad los inventores se centraron en los péptidos derivados de proteínas que aparecen sobreexpresadas en las células tumorales en comparación con la mayoría de los tejidos normales.
El péptido ideal sería el derivado de una proteína que sea exclusiva del tumor y no esté presente en ningún otro tejido. Para identificar los péptidos que derivaban de genes dotados con un perfil de expresión similar al ideal los péptidos identificados se asignaron a las proteínas y después a los genes originarios y se generaron los perfiles de expresión de dichos genes.
Fuentes de ARN y preparación
Las muestras de tejido extirpado fueron facilitadas por la Universidad de Heidelberg, Heidelberg, Alemania (véase Ejemplo 1); todos los pacientes otorgaron su consentimiento informado por escrito. Las muestras de tejido tumoral se criogenizaron en nitrógeno líquido inmediatamente después de la operación y se homogeneizaron a mano en un mortero con nitrógeno líquido. El ARN total se preparó a partir de estas muestras con TRI Reagent (Ambion, Darmstadt, Alemania) y después se purificaron con RNeasy (QIAGEN, Hilden, Alemania); ambos métodos se efectuaron siguiendo las instrucciones del fabricante.
El ARN total de tejidos humanos sanos se obtuvo por canales comerciales (Ambion, Huntingdon, Reino Unido; Clontech, Heidelberg, Alemania; Stratagene, Amsterdam, Holanda; BioChain, Hayward, CA, EE. UU.). El ARN de varios individuos (de 2 a 123 individuos) se mezcló de tal modo que el ARN de cada uno de ellos estuviera representado en la misma proporción.
La calidad y la cantidad de las muestras de ARN se valoró con Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent, Waldbronn, Alemania) y el RNA 6000 Pico LabChip Kit (Agilent).
Experimentos con micromatrices
El análisis de la expresión génica de todas las muestras de ARN de tejido tumoral y normal se efectuó con micromatrices oligonucleotídicas Affymetrix Human Genome (HG) U133A o HG-U133 Plus 2. 0 (Affymetrix, Santa Clara, CA, EE. UU.). Todos los pasos se llevaron a cabo siguiendo el manual de Affymetrix. En resumen, a partir de 5-8 |jg de ARN total se sintetizó ADNc bicatenario con SuperScript RTII (Invitrogen) y el cebador oligo-dT-T7 (MWG Biotech, Ebersberg, Alemania) siguiendo las indicaciones del manual. La transcripción in vitro se llevó a cabo con el BioArray High Yield RNA Transcript Labelling Kit (ENZO Diagnostics, Inc., Farmingdale, NY, EE. UU.) en el caso de las matrices U133A y con el GeneChip IVT Labelling Kit (Affymetrix) en el de las matrices U133 Plus 2. 0, y después se procedió a la fragmentación del ARNc, a su hibridación y tinción con estreptavidina-ficoeritrina y un anticuerpo antiestreptavidina biotinilado (Molecular Probes, Leiden, Holanda). Las imágenes se analizaron con el Agilent 2500A GeneArray Scanner (U133A) o con el Affymetrix Gene-Chip Scanner 3000 (U133 Plus 2. 0), y los datos se analizaron con el software GCOS (Affymetrix), aplicando los ajustes por defecto en todos los parámetros. Para la normalización se utilizaron 100 genes constitutivos (Housekeeping) suministrados por Affymetrix. Los valores de expresión relativa se calcularon a partir de los ratios logarítmicos de señal dados por el software y la muestra de riñón normal se ajustó de forma arbitraria en 1,0.
En la Fig. 2 se exponen ejemplos de perfiles de expresión de genes originarios de la presente descripción que aparecen muy sobreexpresados o se expresan exclusivamente en el carcinoma de pulmón amicrocítico.
EJEMPLO 4
Inmunogenicidad in vitro de péptidos del NSCLC presentados por MHC de clase I
A fin de recabar información sobre la inmunogenicidad de los TUMAP de la presente descripción llevamos a cabo estudios con un ensayo de sensibilización in vitro de linfocitos T basado en estimulaciones reiteradas de linfocitos T CD8+ con células presentadoras de antígeno artificiales (aAPC) cargadas con complejos péptido/MHC y anticuerpo anti-CD28. De ese modo hemos podido demostrar hasta el momento la inmunogenicidad de 9 TUMAP restringidos al HLA-A*0201 de la descripción, lo cual prueba que estos péptidos son epítopos de linfocitos T contra los cuales existen linfocitos T precursores CD8+ en el ser humano.
Sensibilización in vitro de linfocitos T CD8+
Para llevar a cabo estimulaciones in vitro con células presentadoras de antígeno artificiales cargadas con complejo péptido-MHC (pMHC) y anticuerpo anti-CD28, primero aislamos linfocitos T CD8+ de productos de leucoféresis HlA-A*02 por selección positiva con microperlas de CD8 (Miltenyi Biotec, Bergisch-Gladbach, Alemania) de donantes sanos obtenidas de Transfusion Medicine Tuebingen, Alemania, tras el preceptivo consentimiento informado.
Los linfocitos CD8+ o PBMC aislados se incubaron hasta su utilización en medio para linfocitos T (TCM) consistente en RPMI-Glutamax (Invitrogen, Karlsruhe, Alemania) complementado con suero Ab humano termoinactivado al 10% (PAN-Biotech, Aidenbach, Alemania), penicilina 100 U/ml / estreptomicina 100 jg/m l (Cambrex, Colonia, Alemania), piruvato sódico 1 mM (CC Pro, Oberdorla, Alemania), gentamicina 20 jg/m l (Cambrex). En este paso también se añadieron al medio TCM IL-7 2,5 ng/ml (PromoCell, Heidelberg, Alemania) e IL-2 10 U/ml (Novartis Pharma, Nurenberg, Alemania).
La fabricación de las microperlas tapizadas con pMHC/anti-CD28, la estimulaciones de los linfocitos T y la lectura se llevaron a cabo en un sistema in vitro muy definido con cuatro moléculas pMHC distintas en cada condición de estimulación y 8 moléculas pMHC distintas en cada condición de lectura.
Todos los complejos pMHC utilizados para cargar las aAPC y en la lectura en el citómetro se fabricaron con el método de intercambio de ligandos del MHC por inducción con UV (Rodenko et al., 2006) con pequeñas modificaciones. Para determinar la cantidad de monómero pMHC obtenida con el intercambio realizamos ensayos ELISA en sándwich con estreptavidina (Rodenko et al., 2006).
El Ab 9. 3, una IgG2a de ratón anti-CD28 humano co-estimuladora purificada (Jung et al., 1987) se biotiniló químicamente con sulfo-N-hidroxisuccinimidobiotina siguiendo las recomendaciones del fabricante (Perbio, Bonn, Alemania). Las microperlas eran partículas de poliestireno de 5,6 pm de diámetro tapizadas con estreptavidina (Bangs Laboratories, Illinois, EE. UU.).
Los pMHC empleados para la estimulación de los controles positivo y negativo fueron A*0201/MLA-001 (péptido ELAGIGILTV de Melan-A/MART-1 modificado) y A*0201/DDX5-001 (YLLPAIVHI de DDX5), respectivamente.
Placas de 96 pocillos se tapizaron con 800. 000 microperlas / 200 pl en presencia de 4 x 12,5 ng de diferentes pMHC biotinilados, se lavaron y después se les añadió 600 ng de anti-CD28 biotinilado en un volumen de 200 pl. Las estimulaciones se iniciaron en las placas de 96 pocillos incubando simultáneamente 1x106 linfocitos T CD8+ con 2x105 microperlas tapizadas y lavadas con 200 pl de TCM complementado con 5 ng/ml de IL-12 (PromoCell) durante 3-4 días a 37°C. A continuación, la mitad del medio se recambió por TCM fresco complementado con IL-2 80 U/ml y la incubación prosiguió otros 3-4 días a 37°C. Este ciclo de estimulación se efectuó tres veces en total. Para la lectura de los multímeros pMHC con 8 moléculas pMHC distintas por condición se empleó una estrategia de codificación combinatoria bidimensional según lo descrito en otro lugar (Andersen et al., 2012), con pequeñas modificaciones que comprenden el acoplamiento con 5 fluorocromos distintos. Por último, los análisis de los multímeros se llevaron a cabo tiñendo las células con el colorante vital Live/dead®near IR dye (Invitrogen, Karlsruhe, Alemania), con anticuerpo anti-CD8-FITC clon SK1 (BD, Heidelberg, Alemania) y multímeros pMHC fluorescentes. Para el análisis se equipó un citómetro BD LSRII SORP con los filtros y láseres adecuados. Las células específicas de cada péptido se calcularon como porcentaje del número total de linfocitos CD8+. La evaluación del análisis multimérico se efectuó con el software FlowJo (Tree Star, Oregón, EE. UU.). La sensibilización in vitro de los linfocitos CD8+ multímero+ específicos se detectó comparándola con las estimulaciones del control negativo. El criterio de inmunogenicidad del antígeno dado era el siguiente: detección de al menos un pocillo estimulado in vitro evaluable de un donante sano que contuviera una estirpe de linfocitos T CD8+ específicos tras la estimulación in vitro (esto es, el pocillo contiene como mínimo un 1% de linfocitos T multímero+ específicos entre los linfocitos T CD8+ y el porcentaje de células multímero+ específicas es como mínimo 10x la mediana de las estimulaciones del control negativo).
Inmunogenicidad in vitro de péptidos del NSCLC
La inmunogenicidad in vitro de los péptidos de HLA de clase I estudiados se puede demostrar generando estirpes de linfocitos T específicos para cada péptido. En la Figura 4 se muestran a modo de ejemplo los resultados de la citometría de flujo de dos péptidos de la descripción tras la tinción de multímeros específicos de TUMAP junto con la de los controles negativos correspondientes. Los resultados de 25 péptidos de la descripción se resumen en la Tabla 4.
Tabla 5: Inmunogenicidad in vitro del péptido de HLA de clase I de la descripción. Ejemplos de resultados de experimentos de inmunogenicidad in vitro realizados por el solicitante con los péptidos de la invención. <20 % = ;
20 % - 49 % = + 50 % - 70 %= ++ > 70 % = +++
Figure imgf000032_0001
EJEMPLO 5
Síntesis de péptidos
Todos los péptidos se sintetizaron mediante síntesis en fase sólida estándar y contrastada con el método de Fmoc. Después de la purificación con RP-HPLC preparativa, se llevó a cabo un procedimiento de intercambio iónico para incorporar contraiones que fueran fisiológicamente compatibles (por ejemplo trifluoroacetato, acetato, amonio o cloruro).
La identidad y la pureza de cada péptido se determinaron con espectrometría de masas y RP-HPLC analítica. Tras el procedimiento de intercambio iónico se obtuvieron los péptidos en forma de liofilizado blanco o casi blanco con una pureza de entre el 90% y el 99,7%.
Todos los TUMAP se administraron preferiblemente como sales de trifluoroacetato o de acetato, aunque también es factible con otros tipos de sales. En las mediciones del ejemplo 4 se utilizaron sales trifluoroacéticas de los péptidos.
EJEMPLO 6
Intercambio de ligandos por UV
Los péptidos candidatos para las vacunas dados a conocer en la presente memoria se siguieron analizando para comprobar su inmunogenicidad mediante ensayos de sensibilización in vitro. Los diferentes complejos de péptido-MHC necesarios para estos ensayos se produjeron con intercambio de ligandos por UV, técnica en la que un péptido sensible a los rayos UV se escinde tras exponerlo a dicha radiación y se intercambia por el péptido de interés que se pretende analizar. Sólo los candidatos peptídicos que pueden unirse y estabilizar las moléculas de MHC receptoras del péptido evitan la disociación de los complejos MHC. Para determinar el rendimiento de la reacción de intercambio se llevó a cabo un ELISA basado en la detección de la cadena ligera (p2m) de los complejos MHC estabilizados. El ensayo se efectuó siguiendo en líneas generales el modo descrito por Rodenko et al. (Rodenko B, Toebes M, Hadrup SR, van Esch WJ, Molenaar AM, Schumacher TN, Ovaa H. Generation of peptide-MHC class I complexes through UV-mediated ligand exchange. Nat Protoc. 2006;1(3):1120-32.).
Placas MAXISorp de 96 pocillos (NUNC) se incubaron toda la noche con estreptavidina 2 pg/ml en PBS a temperatura ambiente, se lavaron 4x y se bloquearon durante 30 min a 37°C con un tampón de bloqueo que contenía BSA al 2%. Como patrones se emplearon monómeros HLA-A*0201/MLA-001 replegados, en el intervalo de 8-500 ng/ml. Los mónomeros de péptido-MHC resultantes de la reacción de intercambio por UV se diluyeron 100x con tampón de bloqueo. Las muestras se incubaron durante 1 h a 37°C, se lavaron cuatro veces, se incubaron con anticuerpo antip2m conjugado con HRP 2 pg/ml durante 1h a 37°C, se lavaron de nuevo y se revelaron con solución de TMB que se detuvo con NH2SO4. La absorción se midió a 450 nm.
T l : In r m i li n r V
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Los péptidos candidatos que presentan un rendimiento de intercambio elevado (superior al 40%, preferiblemente superior al 50%, más preferiblemente superior al 70%, y como más preferible superior al 80%) se prefieren en general para la generación y la producción de anticuerpos o de fragmentos de los mismos, y/o receptores de linfocitos T o de fragmentos de los mismos, ya que muestran la suficiente avidez hacia las moléculas MHC y evitan la disociación de los complejos MHC.
EJEMPLO 7
Unión e inmunogenicidad de los péptidos de MHC de clase II seleccionados
Las proteínas HLA de clase II se dividen en 3 isotipos principales, a saber, HLA-DR, DP y DQ, que están codificados por numerosos haplotipos. La combinación de varias cadenas a y p aumenta la diversidad de las proteínas HLA de clase II que se encuentran en una población arbitraria. Por tanto, los TUMAP de HLA de clase II seleccionados tienen que unirse a varias moléculas HLA-DR distintas (mostrar una capacidad de unión promíscua) para ser capaces de contribuir a una respuesta eficaz de los linfocitos T en un porcentaje sustancial de pacientes.
En un ensayo de unión in vitro llevado a cabo por un proveedor externo se analizó la unión promíscua de POSTN-002 y de MMP12-002 a varios haplotipos HLA-Dr y la estabilidad de los complejos formados del modo indicado a continuación.
Materiales y métodos
Lista de haplotipos HLA-DR investigados
Los 7 haplotipos HLA-DR investigados se han seleccionado conforme a sus frecuencias en una población de norteamericanos HLA-A*02 positivos (Tabla 6)
Los datos proceden del análisis de 1,35 millones de voluntarios HLA-tipados registrados en el Programa nacional de donantes de médula ósea de EE. UU. (Mori et al., 1997). La población analizada se dividió en los grupos étnicos siguientes: americanos de raza blanca (N=997.193), afroamericanos (N=110.057), americanos de origen asiático (N=81.139), latinoamericanos (N=100.128) y nativos americanos (N=19.203).
Tabla 7.1 Frecuencias haplotípicas en norteamericanos positivos para el HLA-A*02: Los haplotipos analizados se muestran subrayados en gris.
Figure imgf000033_0002
continuación
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Tabla 7.2 Frecuencias haplotípicas en norteamericanos positivos para el HLA-A*24:Los haplotipos analizados se muestran subrayados en gris.
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Fundamento de la prueba
El ensayo de unión de MHC-péptido ProImmune REVEAL® determina la capacidad de cada péptido candidato para unirse al haplotipo HLA de clase II seleccionado y de estabilizar el complejo HLA-péptido. Así, los péptidos candidatos se ensamblan in vitro con una proteína HLA de clase II concreta. El grado de incorporación de cada péptido a las moléculas HLA se mide mediante la presencia o la ausencia de la conformación nativa del complejo HLA-péptido ensamblado en el momento 0 después de concluir el procedimiento de replegamiento (denominado en asociación, onrate).
La capacidad de unión del péptido candidato a una molécula HLA concreta se compara con la de otro con propiedades de unión muy fuertes (control positivo) y ello da como resultado la puntuación de unión MHC-péptido de REVEAL®. El péptido de control positivo es seleccionado y suministrado por ProImmune a partir de su experiencia con cada haplotipo HLA.
Aparte de la afinidad del péptido por la molécula HLA concreta, el otro factor crucial para que se desencadene la respuesta inmunitaria es la estabilidad duradera del complejo HLA-péptido. En consecuencia, el complejo HLA-péptido formado se cuantificó después de permanecer en incubación 24 h a 37°C. La estabilidad del complejo MHC-péptido formado se calculó en forma de cociente porcentual de las puntuaciones de unión al cabo de 24 h y las puntuaciones de unión observadas justo después del replegamiento (esto es, en el momento 0).
Resultados
El análisis de POSTN-002 y de MMP12-002 en la prueba de unión MHC-péptido REVEAL® demostró que ambos péptidos se unen a varios haplotipos HLA. Quedó demostrado que POSTN-002 y MMP12-002 formaban complejos con 5 y con 4 de los 7 haplotipos HLA investigados, respectivamente (Figura 5). Ninguno de los dos péptidos se unió a HLA-DR3 ni a HLA-DR6. Las puntuaciones de unión detectadas se hallaban en el intervalo de entre el 0,02% y aproximadamente el 2,5% respecto al control positivo, puntuaciones claramente superiores a las de los péptidos que no se unían.
El análisis de la estabilidad de los complejos HLA-POSTN-002 y HLA-MMP12-002 formados reveló que 3 y 2 de los 7 complejos HLA-péptido investigados eran estables tras permanecer 24 h a 37°C, respectivamente (Figura 6).
La comparación de la puntuación de unión de este péptido con la de otro de inmunogenicidad conocida permite extraer conclusiones acerca de la inmunogenicidad de un péptido a tenor de su capacidad de unión a una molécula HLA. Así pues, para hacer una comparación de ese tipo se seleccionaron cinco péptidos investigados a fondo cuya inmunogenicidad se conocía. La inmunogenicidad de dichos péptidos se había determinado ex vivo en muestras de sangre de pacientes vacunados mediante linfocitos T CD4 sometidos a tinción intracelular de citocinas (ICS).
En principio, las pruebas ICS analizan la calidad de los linfocitos T específicos en lo relativo a sus funciones efectoras. Por lo tanto, se cultivaron in vitro células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y a continuación se reestimularon con el péptido de interés, un péptido de referencia y un control negativo (aquí designado Mock, «ficticio» en inglés). Después las células sometidas a reestimulación se tiñeron para detectar la producción de FN-gamma, TNF-alfa, IL-2 e IL-10, así como la expresión de la molécula coestimuladora CD154. El recuento de las células afectadas se hizo con un citómetro de flujo (Figura 7). ¡Error! No se encuentra el origen de la referencia.
Los análisis de la inmunogenicidad revelaron una respuesta inmunitaria del 100% tras la vacunación con los péptidos IMA950 (BIR-002 y MET-005) en 16 pacientes y del 44% al 86% tras la vacunación con los péptidos IMA910 (CEA-006, Tg Fb I-004 y MMP-001 ) en 71 pacientes.
Referencias bibliográficas
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Claims (14)

REIVINDICACIONES
1. Péptido, a) consistente en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo consistente en la SEQ ID N.° 2, o b) consistente en una secuencia de aminoácidos que comprende una secuencia de aminoácidos acorde con la SEQ ID N.° 2 y dotado de una longitud total de hasta 14 aminoácidos, o una sal farmacéuticamente aceptable de a) o b)
2. El péptido acorde con la reivindicación 1, en el que dicho péptido incluye enlaces no peptídicos.
3. El péptido acorde con las reivindicaciones 1 o 2, en que dicho péptido forma parte de una proteína de fusión fusionado con los aminoácidos N-terminales de la cadena invariable (li) asociada al antígeno HLA-DR, o está fusionado con un anticuerpo.
4. Ácido nucleico que codifica un péptido acorde con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que es ADN, ADNc, APN, ARN o combinaciones de los mismos, o un vector de expresión que expresa dicho ácido nucleico.
5. El péptido acorde con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, el ácido nucleico o el vector de expresión acorde con la reivindicación 4 para la utilización en medicina.
6. Célula hospedadora, que comprende el ácido nucleico o el vector de expresión acordes con la reivindicación 4.
7. Anticuerpo o fragmento del mismo, receptor de linfocito T (TCR) o receptor de linfocito T soluble (sTCR) o fragmento de los mismos, en que dicho anticuerpo o fragmento del mismo o dicho TCR, sTCR o fragmento de los mismos se une específicamente al péptido acorde con la reivindicación 1 cuando está formando un complejo con una molécula del MHC.
8. Composición farmacéutica que comprende el péptido acorde con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, el ácido nucleico o el vector de expresión acordes con la reivindicación 4, o el agente de unión aislado acorde con la reivindicación 7, y al menos otro componente seleccionado del grupo de vehículos y/o excipientes farmacéuticamente aceptables, preferentemente acuosos.
9. Método in vitro para producir un linfocito T citotóxico (CTL) o un linfocito T cooperador (linfocito Th), método que comprende la puesta en contacto in vitro de un CTL o de un linfocito Th con moléculas de MHC de clase I humanas cargadas con un antígeno y expresadas en la superficie de una célula presentadora de antígeno adecuada durante un período de tiempo suficiente para activar dichos CTL de un modo específico del antígeno, siendo dicho antígeno un péptido acorde con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.
10. El método acorde con la reivindicación 9, en que dicho antígeno es cargado en moléculas de MHC de clase I expresadas en la superficie de una célula presentadora de antígeno adecuada mediante la puesta en contacto de una cantidad suficiente de dicho antígeno con dicha célula presentadora de antígeno.
11. Linfocito T citotóxico (CTL) activado o linfocito T cooperador (linfocito Th), producidos con el método acorde con la reivindicación 9 o 10, donde dicho CTL o linfocito Th reconoce selectivamente una célula que expresa un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos dada en la reivindicación 1 o 2.
12. Linfocito T citotóxico (CTL) activado o linfocito T cooperador (linfocito Th) humanos autólogos o alogénicos, transfectados mediante técnicas de ADN recombinante con un receptor de linfocito T acorde con la reivindicación 7.
13. El péptido acorde con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, el ácido nucleico o el vector de expresión acordes con la reivindicación 4, la célula acorde con la reivindicación 6, el linfocito T citotóxico activado acorde con la reivindicación 11 o el TCR o sTCR acordes con la reivindicación 7 para el uso como un medicamento que es activo contra el cáncer.
14. El péptido acorde con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, el ácido nucleico o el vector de expresión acordes con la reivindicación 4, la célula acorde con la reivindicación 6, el linfocito T citotóxico activado acorde con la reivindicación 11, o el anticuerpo o TCR o sTCR acordes con la reivindicación 7 para el uso acorde con la reivindicación 13, en que dicho medicamento es una vacuna.
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