CN107921111B - 用于各种癌症免疫治疗的新型肽、肽组合物和支架 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于免疫治疗方法的肽、蛋白、核酸和细胞。特别是，本发明涉及癌症的免疫疗法。本发明还涉及单独使用或与其他肿瘤相关肽(能够例如作为刺激抗肿瘤免疫反应或体外刺激T细胞并转入患者的疫苗组合物的活性药物成分)联合使用的肿瘤相关T细胞(CTL)肽表位。与主要组织兼容性复合体(MHC)分子结合的肽或与此同类的肽也可以是抗体、可溶性T细胞受体和其他结合分子的靶标。

Description

用于各种癌症免疫治疗的新型肽、肽组合物和支架
本发明涉及用于免疫治疗方法的肽、蛋白质、核酸和细胞。特别是，本发明涉及癌症的免疫疗法。本发明还涉及单独使用或与其他肿瘤相关肽(刺激抗肿瘤免疫反应或体 外刺激T细胞并转入患者的疫苗复合物的活性药物成分)联合使用的肿瘤相关T细胞 (CTL)肽表位。与主要组织兼容性复合体(MHC)分子结合的肽或与此同类的肽也可以 是抗体、可溶性T细胞受体和其他结合分子的靶标。
本发明涉及数种新型肽序列及其变体，它们源自人肿瘤细胞的HLA-I类分子，可用于引发抗肿瘤免疫反应的疫苗组合物中或作为开发药物/免疫活性化合物和细胞的目标。
背景技术
前列腺癌是全球第二大最常见的癌症和男性癌症死亡的第五大最常见的原因。估根 据世界卫生组织(WHO)的资料，癌症是2012年全球范围内四大非传染性致命疾病之一 。同年，结直肠癌、乳腺癌和呼吸道癌症在高收入国家被列为前10位死亡原因内 (http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs310/en/)。
流行病学
2012年，估计全球有1,410万新增癌症病例，3,260万癌症患者(5年之内确诊)，820万癌症死亡病例(Ferlay et al.，2013；Bray et al.，2013)。
在脑癌、白血病和肺癌组群内，本申请特别着重于胶质母细胞瘤(GB)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)和非小细胞和小细胞肺癌(NSCLC和SCLC)。
肺癌是全球范围内最常见的癌症类型，在很多国家是癌症死亡的首要原因。
乳腺癌是一种免疫原性肿瘤实体，原发肿瘤中不同类型的浸润免疫细胞表现出不同 的预后和预测意义。在乳腺癌患者中进行过大量的早期免疫试验。大部分已完成的疫苗接种研究均针对HER2和糖类抗原如MUC-1的，并显示了令人失望的结果。对于在乳 腺癌患者中使用易普利姆玛和其他T细胞活化抗体进行免疫步骤调制的作用，正在出现 临床数据(Emens，2012)。
慢性淋巴细胞白血病
虽然目前CLL不可治愈，很多患者只显示缓慢的病情进展或症状恶化。由于患者并没有从早期治疗中获益，因此最初方法是“观望和等待“(Richards et al.，1999)。对于有 症状或疾病进展迅速的患者，有几种治疗方案可供选择。这些包括化学疗法、靶向治疗、基于免疫的疗法(如单克隆抗体、嵌合抗原受体(CARS)和主动免疫疗法)和干细胞 移植。
单克隆抗体被广泛应用于血液恶性疾病。这是由于基于免疫细胞表面分子良好表征 和血液或骨髓肿瘤细胞可取性了解了合适的抗原。CLL治疗中所用的常见单克隆抗体靶向作用于CD20或CD52。利妥昔单抗是第一个经FDA批准用于治疗NHL的单克隆 抗CD20抗体，现已广泛应用于CLL治疗。与氟达拉滨/环磷酰胺组合治疗相比，利妥 昔单抗/氟达拉滨/环磷酰胺组合治疗带来了更高的CR率并提高了总生存率(OS)，后者 已成为首选治疗方案(Hallek et al.，2008)。Ofatumomab靶向作用于CD20，用于治疗难 治性CLL患者(Wierdaet al.，2011)。Obinutuzumab是与苯丁酸氮芥组合的一线治疗中 使用的另一种单克隆抗CD20抗体(Goede et al.，2014)。
阿仑单抗是一种抗CD52抗体，用于治疗化疗耐药性疾病患者或存在不良预后因素(如del 17p或p53突变)的患者(Parikh et al.，2011)。
新型单克隆抗体靶向作用于CD37(otlertuzumab、BI 836826、IMGN529和 (177)Lu-tetulomab)或CD40(dacetuzumab和lucatumumab)，并在临床前环境中进行了 测试(Robak and Robak，2014)。
一些已完成和正在进行的试验是基于具有CD19特异性的工程自体嵌合抗原受体(CAR)修饰的T细胞(Maus et al.，2014)。到目前为止，只有少数患者显示出可检测到 或持续性的CAR。Porter等人和Kalos等人在CAR T细胞试验中检测到了一例部分反 应(PR)和2例完全反应(CR)(Kalos et al.，2011；Porter et al.，2011)。
主动免疫治疗包括以下策略：基因治疗、整体修饰的肿瘤细胞疫苗、基于DC的疫苗和肿瘤相关抗原(TAA)衍生肽疫苗。
基因治疗方法利用自体基因修饰肿瘤细胞。这些B-CLL细胞用免疫(共同)刺激 基因(如IL-2、IL-12、TNF-o、GM-CSF、CD80、CD40L、LFA-3和ICAM-1)转染， 以提高抗原提呈和T细胞活化(Carballido et al.，2012)。虽然肿瘤细胞中的特异性T细胞 应答和减少是很容易观察到，但是免疫应答仅仅是短暂性的。
几项研究已经使用自体DC作为抗原提呈细胞来引起抗肿瘤反应。DC已经在体外载有肿瘤相关肽、全肿瘤细胞裂解物和肿瘤衍生RNA或DNA。另一种策略采用全肿瘤 细胞与DC融合并产生DC-B-CLL细胞杂合物。转染的DC引发CD4+和CD8+T细胞 应答(Muller etal.，2004)。载有肿瘤细胞裂解物或凋亡体的融合杂合体和DC增加肿瘤 特异性CD8+T细胞应答。显示出临床反应的患者IL-12血清水平增加，Tregs数量减 少(Palma et al.，2008)。
不同的方法使用改变的肿瘤细胞来引发或增加CLL特异性免疫应答。此策略的一个实例是产生三瘤细胞：B-CLL细胞融合至具有抗APC特异性的抗Fc受体表达杂交瘤 细胞。三瘤细胞在体外诱导CLL特异性T细胞应答(Kronenberger et al.，2008)。
另一种策略利用以芽孢杆菌卡介苗作为佐剂的照射自体CLL细胞充当一种疫苗。数名患者显示白细胞水平下降或病情稳定(Hus et al.，2008)。
除了分离的CLL细胞之外，在制备于血液治疗单位后，使用来自CLL患者的全血 作为疫苗。该疫苗引发CLL特异性T细胞反应，并在几名患者中带来部分临床反应或 稳定病情(Spaner et al.，2005)。
几种TAA在CLL中呈过度表达并适于接种。这些包括纤维调节素(Mayr et al.，2005) 、RHAMM/CD 168(Giannopoulos et al.，2006)、MDM2(Mayr et al.，2006)、hTERT(Counter et al.，1995)、癌胚抗原未成熟层黏连蛋白受体蛋白质(OFAiLRP)(Siegel etal.，2003)、脂 肪分化相关蛋白(Schmidt et al.，2004)、生存素(Granziero et al.，2001)、KW1至KW14 (Krackhardt et al.，2002)以及肿瘤衍生的IgVHCDR3区域(Harig etal.，2001；Carballido et al.，2012)。一项I期临床试验使用RHAMM衍生R3肽作为疫苗。6名患者中有5名可 检测到R3特异性CD8+T细胞应答(Giannopoulos et al.，2010)。
结直肠癌
根据所述结直肠癌(CRC)期别，有不同的标准疗法可用于结肠癌和直肠癌。标准方法包括外科手术、放射治疗、化学治疗和靶向治疗CRC(Berman et al.，2015a；Berman etal.，2015b)。
除了化疗药物外，靶向作用于表皮生长因子受体(EGFR、西妥昔单抗、帕尼单抗)或血管内皮生长因子-A(VEGF-A、贝伐单抗)的若干单克隆抗体施用给疾病期别高的 患者。对于二线治疗和之后的治疗，可使用VEGF抑制剂阿柏西普、酪氨酸激酶抑制 剂瑞戈非尼、胸苷酸合成酶抑制剂TAS-102和磷酸酶抑制剂TAS-114(Stintzing，2014； Wilson et al.，2014)。
最近的临床试验分析了主动免疫疗法作为CRC的一种治疗选择。这些治疗策略包括用肿瘤相关抗原(TAA)的肽、全肿瘤细胞、树突状细胞(DC)疫苗和病毒载体进行疫 苗接种(Koido et al.，2013)。
迄今为止的肽疫苗针对癌胚抗原(CEA)、黏蛋白1、EGFR、T细胞识别的鳞状细 胞癌抗原3(SART3)、β-人绒毛膜促性腺激素(β-hCG)、肾母细胞瘤抗原1(WT1)、生存 素-2B、MAGE3、p53、环指蛋白43和线粒体外膜移位酶34(TOMM34)或突变KRAS 。在几项一期和二期临床试验中，患者表现为抗原特异性CTL反应或产生抗体。与免 疫反应相反，许多患者没有从肽疫苗中获得临床水平上的利益(Koido et al.，2013；Miyagi et al.，2001；Moultonet al.，2002；Okuno et al.，2011)。
树突细胞疫苗包括用TAA衍生肽、肿瘤细胞裂解物、凋亡肿瘤细胞脉冲处理的DC或肿瘤RNA或DC肿瘤细胞融合产物。虽然I/II期试验的许多患者表现出特异性免疫 反应，但只有少数人获得临床益处(Koido et al.，2013)。
全肿瘤细胞疫苗由自体肿瘤细胞组成，被修饰以分泌GM-CSF，通过辐射或病毒感染、照射细胞被修饰。多数患者在几项II/III期临床试验中没有表现获得临床利益(Koidoet al.，2013)。
编码CEA以及B7.1、ICAM-1和LFA-3的牛痘病毒或复制缺陷型禽流痘病毒已经 在I期临床试验的病毒载体疫苗中被用作赋形剂。不同的研究使用了编码CEA和B7.1 的非复制型金丝雀痘病毒。除了诱导CEA特异性T细胞应答外，40％的患者表现出客 观临床反应(Horig et al.，2000；Kaufman et al.，2008)。
食管癌
食管癌的主要治疗策略取决于肿瘤分期和位置、组织学类型和患者病情。单纯手术 是不够的，除非用于一小部分的鳞状细胞癌患者。
食管癌免疫治疗方法的数据很少，这是因为只进行了数量很有限的早期阶段临床试 验。在一项I期试验中，晚期食管癌患者被给予一种疫苗，其包含来自三个不同癌症- 睾丸抗原(TTK蛋白激酶、淋巴细胞抗原6复合体基因座K和胰岛素样生长因子 (IGF)-II mRNA结合蛋白3)，结果一般。在一项I/II期研究中，11名患者中有4名患 者自体肿瘤细胞在体外刺激后肿瘤内注入激活的T细胞引起完全或部分肿瘤反应 (Toomey et al.，2013)。
胃癌
胃癌(GC)首先发生于黏膜层内壁，随着生长而扩散至外层。手术是胃癌的主要治疗方法并且是唯一的一种治愈性治疗方法。对于晚期胃癌，当前治疗方案的疗效都较差，导致5年生存率低。免疫疗法可能是改善胃癌患者生存期的另一种方法。在胃癌临床试 验中，肿瘤相关淋巴细胞和细胞因子诱导的杀伤细胞、基于肽的HER2/neu靶向疫苗、 MAGE-3或血管内皮生长因子受体1和2以及基于树突状细胞的HER2/neu靶向疫苗的 过继转移显示出有希望的结果。免疫步骤抑制和工程T细胞可能代表了更多的治疗选择， 目前正在临床前研究和临床研究中进行评估(Matsueda and Graham，2014)。
胶质母细胞瘤
胶质母细胞瘤(WHO IV级)的治疗选择非常有限。根据德国神经学学会发布的指南， 年轻患者的标准治疗包括肿瘤切除或活组织活检、局灶放射治疗以及替莫唑胺或CCNU/洛莫司汀或丙卡巴肼与CCNU和长春新碱(PCV)组合的化学治疗。在美国、加 拿大和瑞士，贝伐单抗(抗VEGF抗体)也被批准用于治疗复发(Leitlinien für Diagnostik undTherapie in der Neurologie，2014)。
不同免疫治疗方法针对胶质母细胞瘤(GB)进行了研究，包括免疫检查点抑制、疫苗接种和工程化T细胞过继转移。
针对抑制T细胞受体或其配体的抗体被证明可有效地提高在不同癌症类型(包括黑 素瘤和膀胱癌)中的T细胞介导抗肿瘤免疫应答。因此，易普利姆玛和nivolumab等T 细胞活化抗体的效果在临床GB试验中进行了评估，但初步数据显示了自身免疫相关不 良事件。
GB患者的不同疫苗接种策略目前正在研究，包括基于肽的疫苗、热休克蛋白疫苗、自体肿瘤细胞疫苗、基于树突状细胞的疫苗以及基于病毒蛋白的疫苗。在这些方法中， 来自GB相关蛋白衍生的肽，如表皮生长因子受体变体III(EGFRvIII)或热休克蛋白或 用自体肿瘤细胞裂解物或巨细胞病毒组分刺激的树突细胞用于诱导GB患者的抗肿瘤 免疫应答。其中一些研究显示出良好的安全性和耐受性以及有前景的疗效数据。
转基因T细胞的过继转移是GB治疗的另一个免疫治疗方法。不同的临床试验目前评估嵌合抗原受体的安全性和有效性，其载有针对HER2、IL-13受体α2和EGFRvIII的 T细胞(Ampie et al.，2015)。
肝癌
疾病管理取决于诊断时肿瘤的阶段以及肝脏的整体状况。如果手术不是一种治疗选 项，可用现有的其他疗法。
最近，对于HCC进行了少量的免疫疗法试验。细胞因子已被用于激活免疫细胞的亚群和/或增加肿瘤免疫原性(Reinisch et al.，2002；Sangro et al.，2004)。其他的试验主要 关注肿瘤浸润性淋巴细胞或活化外周血淋巴细胞的输注(Shi et al.，2004；Takayama et al.， 1991；Takayama et al.，2000b)。
到目前为止，已经进行了少量的治疗性疫苗接种试验。Butterfield等人使用源自甲 胎蛋白(AFP)的肽或载有AFP肽的DC进行了两项体外试验(Butterfield et al.，2003；Butterfield et al.，2006)。在两项不同的研究中，自体树突细胞(DC)用自体肿瘤裂解物(Lee et al.，2005)或肝母细胞瘤细胞系HepG2的裂解物(Palmer et al.，2009)进行体外冲 击。到目前为止，疫苗接种试验仅显示临床结果的有限改善。
黑色素瘤
黑色素瘤的标准疗法是手术完全切除连同周围的健康组织。如果切除不完全或完全 不能切除，则患者接受主要的辐射治疗，这种疗法可以与干扰素α联合使用于晚期疾病(IIB/C和III A-C期)。
增强抗肿瘤免疫反应似乎是晚期黑色素瘤治疗的一种有前景的策略。在美国，免疫 检查点抑制剂易普利姆玛以及BRAF激酶抑制剂vemurafenib和dabrafenib和MEK抑 制剂trametinib已经被批准用于治疗晚期黑色素瘤。这两种方法均可增加患者的抗肿瘤 免疫性——易普利姆玛直接通过减少T细胞抑制起作用，激酶抑制剂间接通过增强黑色 素细胞分化抗原的表达起作用。目前正在临床研究中测试其他检查点抑制剂(nivolumab 和lambrolizumab)，取得了初步令人鼓舞的结果。此外，针对抗肿瘤免疫应答的不同 联合疗法正在临床试验中测试，包括易普利姆玛+nivolumab，易普利姆玛+gp100衍生 肽疫苗，易普利姆玛+达喀尔巴嗪，易普利姆玛+IL-2和易普利姆玛+GM-CSF(Srivastava andMcDermott，2014)。
几种不同的疫苗接种方法已经在晚期黑色素瘤中进行了评估。到目前为止，III期临床试验显示相当令人失望的结果，疫苗接种策略显然需要加以改进。因此，新的临床 试验，如OncoVEX GM-CSF试验或DERMA试验均针对提高临床疗效而不降低耐受性 (http://www.cancerresearchuk.org)。
T细胞过继转移显示了晚期黑色素瘤治疗的巨大潜力。浸润淋巴细胞的体外增大自 体肿瘤以及含有对癌症-睾丸抗原NY-ESO-1具有高亲和力的T细胞受体的T细胞在转 移到黑素瘤患者时具有显著有益的和较低的毒性作用。不幸的是，含有对黑素细胞特异 性抗原MART1和gp100以及癌症-睾丸抗原MAGEA3具有高亲和力T细胞受体的T细 胞在临床试验中诱导相当的毒性作用。因此，T细胞过继转移具有较高的治疗潜力，但 这些治疗的安全性和耐受性需要进一步提高(Phan and Rosenberg，2013；Hinrichs and Restifo，2013)。
非小细胞肺癌
治疗选择根据癌症的类型(小细胞和非小细胞肺癌)和阶段进行确定，包括手术、放疗、化疗、靶向生物治疗，如贝伐单抗、埃罗替尼和吉非替尼。
为了扩大NSCLC的治疗方案，已经研究了或正在研究不同的免疫治疗方法。虽然用L-BLP25或MAGEA3进行疫苗接种未能证明在NSCLC患者中疫苗介导的生存优势， 但是同种异体细胞源性疫苗在临床研究中表现出有希望的结果。此外，针对神经节苷脂 、表皮生长因子受体和其他几个抗原的进一步接种试验目前正在进行中。增强患者抗肿 瘤T细胞反应的另一策略包括使用特异性抗体阻断抑制性T细胞受体或其配体。目前， 正在临床试验中评估上述几种抗体(包括ipilimumab、nivolumab、pembrolizumab、 MPDL3280A和MEDI-4736)在NSCLC中的治疗潜力(Reinmuth et al.，2015)。
卵巢癌
手术切除是早期和晚期卵巢癌的主要治疗方法。手术切除之后使用铂类似物进行全 身化疗，但无手术后化疗适应症的非常低等级的卵巢癌(IA期、1级)除外。
免疫疗法似乎是改善卵巢癌患者治疗的一种有前景的策略，因为存在促炎性肿瘤浸 润淋巴细胞，尤其是CD8阳性T细胞与良好的预后相关，肿瘤相关肽特异性T细胞可 从癌组织中分离。
因此，大量的科学工作均投入到卵巢癌不同免疫疗法的研究中。已经进行了相当多 的临床前研究和临床研究，进一步的研究目前正在进行中。对于细胞因子疗法、接种疫苗、单克隆抗体治疗、细胞过继转移和免疫调节，目前有临床资料。
使用白介素-2、干扰素-α、干扰素-γ或粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的细胞因子治 疗目的在于增强患者自身的抗肿瘤免疫反应，这些治疗已经在小型研究组中显示出有前 景的结果。
使用来自几种肿瘤相关蛋白(HER2/neu、NY-ESO-1、p53、Wilms肿瘤-1)的单个 或多个肽或来自自体肿瘤细胞的全肿瘤抗原的I期和II期疫苗接种研究显示了良好的 安全性和耐受性特性，但临床效果仅为低至中等。
特异性识别肿瘤相关蛋白的单克隆抗体被视为可增强对肿瘤细胞的免疫细胞介导 的杀伤力。抗CA-125抗体或egovomab和abagovomab以及抗EpCAM抗体 catumaxomab在II期和III期研究中取得了有前景的结果。与此相反，抗MUC1抗体 HMFG1在III期研究中未能明确地提高生存期。
另一种方法使用单克隆抗体来靶向作用于并阻止肿瘤细胞上的生长因子和存活受 体。虽然施用曲妥单抗(抗HER2/neu抗体)和MOv18与MORAb-003(抗叶酸受体α 抗体)仅对卵巢癌具有有限的临床益处，但是在标准化疗中加入贝伐单抗(抗VEGF抗 体)对晚期卵巢癌似乎是有利的。
免疫细胞的过继转移实现了临床试验中的异质结果。自体、体外增大的肿瘤浸润性 T细胞的过继转移在中试试验中被证明是一种有希望的方法。相反，转移含有叶酸受体α特异性嵌合抗原受体的T细胞在I期试验中不会诱导显著临床反应。用肿瘤细胞裂解 物或肿瘤相关蛋白体外刺激的树突细胞显示可在转移后增强抗肿瘤T细胞反应，但T细 胞活化的程度与临床效果无关。在II期研究中，自然杀伤细胞的转移造成明显的毒性 。
内在抗肿瘤免疫性以及免疫治疗受免疫抑制肿瘤微环境影响。为了克服这个障碍， 免疫调节药物(如环磷酰胺、抗CD25抗体和聚乙二醇化脂质体多柔比星)与免疫疗法组合进行了测试。增强T细胞活性的易普利姆玛、抗CTLA4抗体目前有最可靠的资料 。易普利姆玛被证明可在卵巢癌患者中产生显著的抗肿瘤效果(Mantia-Smaldone et al.，2012)。
胰腺癌
胰腺癌患者的治疗选择非常有限。有效治疗的一个主要问题是在确诊时通常处于肿 瘤晚期。此外，胰腺癌对化疗药物相当耐药，这可能是由致密和少血管结缔组织增生肿瘤基质引起的。
根据德国抗癌协会、德国癌症援助组织和德国科学医学协会发布的指导方针，切除 肿瘤是唯一可用的有效治疗选择。
疫苗接种策略作为胰腺癌治疗的进一步创新和有前途的替代方法进行了研究。靶向 作用于KRAS突变、活性端粒酶、胃泌素、存活蛋白、CEA和MUC1已经在临床试验 中进行评估，部分显示有希望的结果。此外，针对胰腺癌患者的树突状细胞疫苗、异基 因GM-CSF分泌疫苗和algenpantucel-L临床试验还显示了免疫疗法的有益效果。进一 步研究不同疫苗接种方案效率的临床试验目前正在进行中(Salman et al.，2013)。
前列腺癌
前列腺癌的治疗策略主要取决于癌症的分期。基于树突状细胞的疫苗sipuleucel-T 是FDA批准的第一个抗癌疫苗。由于其对CRPC患者的生存有积极效果，许多努力被 投入到进一步免疫疗法的开发上。关于疫苗接种策略，肽疫苗前列腺特异性抗原(PSA)-TRICOM、个性化肽疫苗PPV、DNA疫苗pTVG-HP以及表达GM-CSF GVAX的 全细胞疫苗在不同的临床试验中均表现出有希望的结果。此外，除了sipuleucel-T外， 基于树突状细胞的疫苗，即BPX-101和DCVAC/Pa被证明可引起前列腺癌患者的临床 反应。免疫步骤抑制剂，如易普利姆玛(ipilimumab)和nivolumab目前正在临床研究 中作为单一疗法以及与其他治疗(包括雄激素剥夺疗法、局部放射治疗、PSA-TRICOM 和GVAX)联合进行评估。在II期临床试验中显著减缓进展和增加无进展生存期的免 疫调节物质tasquinimod目前正在III期临床试验中进行进一步的研究。另一种免疫调节 剂来那度胺在早期临床研究中诱导出有前途的作用，但在III期临床试验中未能改善生 存。尽管有这些令人失望的结果，但是来那度胺的进一步试验正在进行中(Quinn et al.， 2015)。
肾细胞癌
初始治疗最常见是部分或完全切除患病肾脏，仍然是主要的有效治疗方法(Riniet al.，2008)。RCC的已知免疫原性代表了支持在晚期RCC中使用免疫治疗和癌症疫苗的基础。淋巴细胞PD-1表达和RCC晚期分期、分级和预后以及RCC肿瘤细胞选择性 PD-L1表达之间的有趣相关性以及其与较差临床结果的潜在关联性导致新的抗 PD-1/PD-L1制剂的开发，单独使用或与抗血管生成药物或其他免疫治疗方法联合使用 治疗RCC(Massari etal.，2015)。在晚期RCC中，一项名为TRIST研究的III期癌症疫 苗试验评估了TroVax(使用肿瘤相关抗原5T4的疫苗，含痘病毒载体)加入到一线标 准治疗后是否延长局部晚期或mRCC患者的生存期。两组均未达到平均生存期，399名 患者(54％)继续参加研究，但是资料分析证实了之前的临床效果，这表明TroVax具有 免疫活性，5T4-特异性抗体反应强度与生存期改善存在相关性。另外，有几项研究寻找 在RCC中过度表达的使用表位的肽疫苗。
肿瘤疫苗的各种方法已在研究中。采用全肿瘤方法(包括肿瘤细胞裂解物，与肿瘤细胞的树突状细胞融合体或整个肿瘤RNA)的研究在RCC患者中完成，在一些试验中 报告了肿瘤病灶的缓解(Avigan et al.，2004；Holtl et al.，2002；Marten et al.，2002；Su etal.， 2003；Wittig et al.，2001)。
小细胞肺癌
小细胞肺癌(SCLC)的治疗和预后强烈地依赖确诊癌症分期。免疫疗法是癌症治疗的过度研究领域。对于SCLC的治疗研究了各种方法。其中一种方法靶向阻断CTLA-4， 这是一种天然的人免疫抑制物。CTLA-4的抑制旨在增强对抗癌症的免疫系统。最近， 开始研发用于治疗SCLC的有前景的免疫步骤抑制剂。另一种方法基于防癌疫苗，这是 目前可用于临床研究的SCLC治疗方法(American Cancer Society，2015；National Cancer Institute，2015)。
急性髓性白血病
急性髓性白血病(AML)的一种治疗选择是用抗体-药物偶联物(抗CD33+calechiamicin、SGN-CD33a、抗CD33+锕-225)、双特异性抗体(识别CD33+CD3(AMG 330)或CD33+CD16)和嵌合抗原受体(CAR)靶向作用CD33(Estey，2014)。
非霍奇金淋巴瘤
非霍奇金淋巴瘤(NHL)的治疗取决于组织类型和分期(National CancerInstitute， 2015)：在淋巴瘤患者中可观察到肿瘤自发消退。因此，主动免疫疗法是一种治疗选择 (Palomba，2012)。
一种重要的疫苗接种方案包括Id疫苗。B淋巴细胞表达在其重链和轻链可变区以特定的氨基酸序列表达表面免疫球蛋白，每个细胞克隆都是独特的(＝个体基因型，Id) 。个体基因型作为肿瘤相关抗原。
被动免疫包括单独注射重组鼠抗-Id单克隆抗体或与干扰素α、IL2或苯丁酸氮芥联 合使用。
主动免疫包括注射偶联至佐剂(KLH)的重组蛋白(Id)，其与GM-CSF一起作为免 疫佐剂给予。肿瘤特异性Id通过杂交瘤培养物或使用重组DNA技术(质粒)通过细菌 、昆虫或哺乳动物细胞培养物产生。
已经进行了三项III期临床试验(Biovest、Genitope、Favrille)。在两项试验中，患者接受了利妥昔单抗。所有三项试验均给予GM-CSF。Biovest使用了杂交瘤产生的 蛋白质，Genitope和Favrille使用了重组蛋白。在所有三项试验中，Id均偶联至KLH。 只有Biovest获得有意义的结果。
除了Id之外的疫苗包括癌睾丸抗原MAGE、NY-ESO1和PASD-1、B细胞抗原 CD20或细胞疫苗。最新提及的包括凋亡肿瘤细胞脉冲处理的DC、肿瘤细胞裂解物、DC- 肿瘤细胞融合物或肿瘤衍生RNA脉冲处理的DC。
原位接种涉及使用肿瘤内CpG与化疗或在出现GM-CSF和收集/扩展/再灌注T细 胞情况下生长的照射肿瘤细胞联合进行免疫接种。
采用可改变免疫检查点的抗体进行接种包括抗CD40、抗OX40、抗41BB、抗CD27 、抗GITR(直接增强抗肿瘤反应的激动剂抗体)或抗PD1、抗CTLA-4(阻断会妨碍 免疫应答的检查点的阻滞抗体)。实例为易普利姆玛(抗CTLA-4)和CT-011(抗PD1) (Palomba，2012)。
子宫癌
子宫内膜癌的治疗与分期相关。多数子宫内膜癌包括良好至中度分化的子宫内膜腺 癌，其在诊断时通常局限于子宫体并且可以通过全子宫切除术治愈(World CancerReport， 2014)。
宫颈癌的治疗也取决于分期。在早期阶段，切除是标准治疗，也可能与放疗(化疗)结合治疗。在有淋巴结浸润或肿瘤不能切除的病例中，较晚期别(III期及以上)时主 要选择放(化)疗治疗。
目前也正在测试一些免疫治疗方法。在一项I/II期临床试验中，子宫癌患者采用Wilms肿瘤基因1(WT1)mRNA电穿孔的自体树突状细胞(DC)接种。除了一例对佐剂 局部过敏反应的病例，没有观察到不良反应，6名患者中有3名表现出免疫应答 (Coosemans et al.，2013)。
如上所述，HPV感染引发的病变可能最终导致宫颈癌。因此，在高度病变和癌症 中组成性表达且是恶性表型发生和维持所需的HPV病毒癌蛋白E6和E7被视为免疫治 疗方法的有前景的靶标(Hung et al.，2008；Vici et al.，2014)。一项研究在转移性宫颈癌患 者中进行了过继T细胞疗法(ACT)。患者接受E6和E7反应性肿瘤浸润性T细胞(TIL) 输注，9名患者中，2名完全消退，1名有部分反应(Stevanovic et al.，2015)。此外，根 据报告，靶向作用于E7的细胞内抗体可阻止小鼠肿瘤生长(Accardi et al.，2014)。此外， 靶向作用于HPV E6和E7的肽、DNA和基于DC的疫苗也在临床试验中进行研究(Vici et al.，2014)。
胆囊腺癌及胆管癌
由于诊断困难，胆管癌发现时大多数是晚期。胆管癌难以治疗，通常是致命的。
胆囊癌是世界范围内最常见和侵袭性最强的胆道恶性肿瘤。
膀胱癌
膀胱癌的标准治疗包括手术、放射疗法、化学疗法和免疫疗法。
在第0和I期，膀胱癌的治疗方法通常进行经尿道切除术，之后可能进行膀胱内化疗或与BCG(卡介苗)膀胱免疫治疗相结合。
一种有效的免疫治疗方法在治疗侵袭性非肌层浸润性膀胱癌(NMIBC)中得到确定。由此，一种弱化形式的细菌牛型分枝杆菌(卡介苗＝BCG)作为一种膀胱内解决方案 。BCG治疗的主要作用很长期(长达10年)阻止癌症复发并降低进展率。原则上，用 BCG治疗可诱导局部炎症反应，其刺激细胞免疫应答。BCG免疫应答基于以下关键步 骤：通过BCG感染尿路上皮和膀胱癌细胞，之后增加抗原呈递分子的表达，通过细胞 因子释放介导而诱导免疫应答，通过各种免疫细胞(细胞毒性T淋巴细胞、中性粒细胞 、自然杀伤细胞和巨噬细胞)的参与诱导抗肿瘤活性(Fuge et al.，2015；Gandhi et al.，2013) 。
BCG治疗一般患者耐受性良好，但是特别对于免疫缺陷患者可能是致命的。约 30-40％的患者中观察到了BCG的难治性(Fuge et al.，2015；Steinberg et al.，2016a)对于BCG疗法失败的患者，治疗具有挑战性。BCG治疗失败的患者存在发生肌层浸润性疾 病的高风险。根治性膀胱切除是无应答者优选的治疗选择(Steinberg et al.，2016b；vonRundstedt and Lerner，2015)。对于希望保留膀胱的患者，FDA批准的BCG失败NMIBC 二线治疗为戊柔比星化学治疗。其他一些二线疗法目前可获得或正在研究中，包括免疫 治疗方法，如BCG-干扰素联合或BCG-检查点抑制剂治疗，前BCG透皮疫苗接种，草 分枝杆菌细胞壁核酸(MCNA)复合物，单独化疗或配合各种药物如像丝裂霉素C、吉西 他滨、多西他赛、白蛋白结合型紫杉醇、表柔比星联合化疗，丝裂霉素/吉西他滨，吉 西他滨/多西他赛，以及装置辅助化疗如热化疗、放化疗、电疗或光动力疗法(Fuge et al.， 2015；Steinberg et al.，2016b；von Rundstedt and Lerner，2015)。仍然需要在临床试验中进 一步评估现有的治疗。
对于晚期膀胱癌的替代治疗方案在正在进行的临床试验中进行研究。目前的临床试 验集中于分子靶向疗法和免疫疗法的开发。靶向疗法研究致癌相关途径抑制剂(即mTOR、血管内皮、成纤维细胞或表皮生长因子受体、抗血管生成或细胞周期抑制剂) 在治疗膀胱癌中的效果。由于膀胱癌的高度因子多样性，因此，分子靶向治疗的开发仍 具有挑战性。当前免疫治疗的主要焦点是开发检查点阻断剂，如抗PD1单克隆抗体和 过继T细胞转移(Knollman et al.，2015b；Grivas et al.，2015；Jones et al.，2016；Rouanne et al.，2016)。
头颈部鳞状细胞癌
头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)是异构肿瘤，其流行病学、病因和治疗均具有差异(Economopoulou et al.，2016)。
HNSCC被视为是一种免疫抑制疾病，其特征在于免疫活性细胞和受损细胞因子分泌的失调(Economopoulou et al.，2016)。HPV阴性和HPV阳性肿瘤的免疫治疗策略不同 。
对于HPV阳性肿瘤，病毒癌蛋白E6和E7代表着良好的靶标，这是因为他们连续 地通过肿瘤细胞中表达，对于保持HPV阳性癌细胞的转化状态必不可少。几种疫苗疗 法目前正在HPV阳性HNSCC中进行研究，包括DNA疫苗、肽疫苗和涉及树突状细胞 (DC)的疫苗。此外，正在进行的II期临床试验在HPV阳性肿瘤患者中研究了淋巴细 胞耗竭继而自体输注TIL的疗效(Economopoulou et al.，2016)。
在HPV阴性肿瘤中，目前正在使用和研究几种免疫治疗策略。嵌合IgG1抗EGFR 单克隆抗体西妥昔单抗已被FDA批准用于组合化疗，作为复发/转移性HNSCC的标准 一线治疗。其他的抗EGFR单克隆抗体(包括帕尼单抗、尼妥珠单抗和扎妥木单抗)在 HNSCC中进行了评估。一些免疫检查点抑制剂在HNSCC的用途在临床试验中进行了 研究。他们包括以下抗体：易普利姆玛(抗CTLA-4)、tremelimumab(抗CTLA-4) 、pembrolizumab(抗PD-1)、nivolumab(抗PD-1)、durvalumab(抗PD-1)、抗KIR 、urelumab(抗CD137)和抗LAG-3。
HNSCC患者的两项临床研究评估了载有p53肽或凋亡肿瘤细胞的DC的用途。免 疫应答令人满意的，副作用可以接受。
数项研究使用了过继性T细胞疗法(ACT)进行。T细胞被诱导对抗任何辐照的自 体肿瘤细胞或EB病毒。疾病控制和总生存率结果是看好的(Economopoulou et al.，2016) 。
考虑到严重的副作用及与治疗癌症相关的费用，有必要确定可用于总体上治疗癌症， 尤其是治疗肝细胞癌(HCC)、结直肠癌(CRC)、胶质母细胞瘤(GB)、胃癌(GC)、食道 癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、胰腺癌(PC)、肾细胞癌(RCC)、良性前列腺增生(BPH) 、前列腺癌(PCA)、卵巢癌(OC)、黑色素瘤、乳腺癌、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、梅 克尔细胞癌(MCC)、小细胞肺癌(SCLC)、非何杰金氏淋巴瘤(NHL)、急性骨髓性白血 病(AML)、胆囊癌和胆管癌(GBC、CCC)、膀胱癌(UBC)、子宫癌(UEC)、头颈部鳞 状细胞癌(HNSCC)的因子。通常也有必要确定代表癌症生物标志物的因子，尤其是上 述癌症类型，从而更好地诊断癌症、评估预后和预测治疗成功性。
癌症免疫治疗代表了癌症细胞特异性靶向作用的一个选项，同时最大限度地减少副 作用。癌症免疫疗法利用存在的肿瘤相关抗原。
肿瘤相关抗原(TAA)的目前分类主要包括以下几组：
a)癌-睾丸抗原：T细胞能够识别的最先确认的TAA属于这一类抗原，由于其成员表达于组织学相异的人肿瘤中、正常组织中、仅在睾丸的精母细胞/精原细胞中、偶尔 在胎盘中，因此，它最初被称为癌-睾丸(CT)抗原。由于睾丸细胞不表达HLA I类和II 类分子，所以，在正常组织中，这些抗原不能被T细胞识别，因此在免疫学上可考虑为 具有肿瘤特异性。CT抗原大家熟知的例子是MAGE家族成员和NY-ESO-1。
b)分化抗原：肿瘤和正常组织(肿瘤源自该组织)都含有TAA。大多数已知的分 化抗原发现于黑色素瘤和正常黑色素细胞中。许多此类黑色素细胞谱系相关蛋白参与黑 色素的生物合成，因此这些蛋白不具有肿瘤特异性，但是仍然被广泛用于癌症的免疫治 疗。例子包括，但不仅限于，黑色素瘤的酪氨酸酶和Melan-A/MART-1或前列腺癌的PSA 。
c)过量表达的TAA：在组织学相异的肿瘤中以及许多正常组织中都检测到了基因编码被广泛表达的TAA，一般表达水平较低。有可能许多由正常组织加工和潜在提呈 的表位低于T细胞识别的阈值水平，而它们在肿瘤细胞中的过量表达能够通过打破先前 确立的耐受性而引发抗癌反应。这类TAA的典型例子为Her-2/neu、生存素、端粒酶或 WT1。
d)肿瘤特异性抗原：这些独特的TAA产生于正常基因(如β-catenin、CDK4等) 的突变。这些分子变化中有一些与致瘤性转化和/或进展相关。肿瘤特异性抗原一般可 在不对正常组织带来自体免疫反应风险的情况下诱导很强的免疫反应。另一方面，这些 TAA在多数情况下只与其上确认了有TAA的确切肿瘤相关，并且通常在许多个体肿瘤 之间并不都共享TAA。在含有肿瘤特定(相关)同种型蛋白的情况下，如果肽源自肿 瘤(相关)外显子也可能出现肽肿瘤特异性(或相关性)。
e)由异常翻译后修饰产生的TAA：此类TAA可能由肿瘤中既不具有特异性也不过量表达的蛋白产生，但其仍然具有肿瘤相关性(该相关性由主要对肿瘤具有活性的翻译 后加工所致)。此类TAA产生于变糖基化模式的改变，导致肿瘤产生针对MUC1的新 型表位或在降解过程中导致诸如蛋白拼接的事件，这可能具有也可能不具有肿瘤特异性 。
f)肿瘤病毒蛋白：这些TTA是病毒蛋白，可在致癌过程中发挥关键作用，并且由 于它们是外源蛋白(非人源蛋白)，所以能够激发T细胞反应。这类蛋白的例子有人乳 头状瘤16型病毒蛋白、E6和E7，它们在宫颈癌中表达。
基于T细胞的免疫治疗靶向作用于主要组织兼容性复合体(MHC)分子提呈的来源于肿瘤相关蛋白或肿瘤特异性蛋白的肽表位。肿瘤特异性T淋巴细胞所识别的抗原，即 其表位，可以是源自所有蛋白类型的分子，如酶、受体、转录因子等，它们在相应肿瘤 的细胞中被表达，并且与同源未变的细胞相比，其表达通常上调。
MHC分子有两类：MHC I类和MHC II类。MHC I类分子由一条α重链和β-2-微 球蛋白，MHC II类分子由一条α和一条β链组成。其三位构造形成一个结合槽，用于 与肽进行非共价相互作用。
大部分有核细胞上都可发现MHC-I类分子。他们提呈主要为内源性的蛋白、缺陷核糖体产物(DRIP)和较大肽裂解生成的肽。然而，源自内体结构或外源性来源的肽也 经常在MHC-I类分子上发现。这种I-类分子非经典提呈方式在文献中被称为交叉提呈(Brossart and Bevan，1997；Rock et al.，1990)。MHC II类分子主要发现于专业抗原提呈细 胞(APC)上，并且主要提呈，例如，在内吞作用过程中由APC占据并且随后被加工的 外源性或跨膜蛋白的肽。
肽和MHC I类的复合体由负载相应T细胞受体(TCR)的CD8阳性T细胞进行识别， 而肽和MHC II类分子的复合体由负载相应TCR的CD4阳性辅助T细胞进行识别。因 此，TCR、肽和MHC按照1∶1∶1的化学计量呈现，这一点已是共识。
CD4阳性辅助T细胞在诱导和维持CD8阳性细胞毒性T细胞的有效反应中发挥重 要作用。肿瘤相关抗原(TAA)衍生的CD4阳性T细胞表位的识别对开发能引发抗肿瘤 免疫反应的药物产品可能非常重要(Gnjatic et al.，2003)。在肿瘤部位，T辅助细胞维持 着对细胞毒性T细胞(CTL)友好的细胞因子环境(Mortara et al.，2006)并吸引效应细胞， 如CTL、天然杀伤(NK)细胞、巨噬细胞和粒细胞(Hwang et al.，2007)。
在没有炎症的情况下，MHC II类分子的表达主要局限于免疫系统细胞，尤其是专业抗原提呈细胞(APC)，例如，单核细胞、单核细胞源性细胞、巨噬细胞、树突状细胞 。在癌症患者的肿瘤细胞中发现有MHC II类分子的表达(Dengjel et al.，2006)。
本发明的拉长肽可作为MHC-II类活性表位。
MHC-II类表位活化的辅助T细胞在编排抗肿瘤免疫的CTL效应子功能中发挥着 重要作用。触发TH1细胞反应的辅助T细胞表位支援CD8阳性杀伤T细胞的效应子功 能，其中包括直接作用于肿瘤细胞的细胞毒性功能(该类肿瘤细胞表面显示有肿瘤相关 肽/MHC复合体)。这样，肿瘤相关T辅助细胞表位单独使用或与其他肿瘤相关肽结合 使用可作为刺激抗肿瘤免疫反应的疫苗化合物的活性药物成分。
哺乳动物(如小鼠)模型显示，即使没有CD8阳性T淋巴细胞，CD4阳性T细胞 也能通过分泌干扰素-γ(IFNγ)抑制血管生成而足以抑制肿瘤的表现(Beatty and Paterson，2001；Mumberg et al.，1999)。没有CD4 T细胞作为直接抗肿瘤效应因子的证据(Braumuller et al.，2013；Tran et al.，2014)。
由于HLA II类分子的组成性表达通常仅限于免疫细胞，因此，直接从原发肿瘤中分离II类肽之前被认为是不可能的事。然而，Dengjel等人成功地在肿瘤中直接识别了 多个MHC II类表位(WO 2007/028574，EP 1 760 088 B1)。
由于CD8依赖型和CD4依赖型这两种反应共同并协同地促进抗肿瘤作用，因此， 确定和表征由CD8+ T细胞(配体：MHC I类分子+肽表位)或CD4阳性T辅助细胞 (配体：MHC II类分子)识别的肿瘤相关抗原对开发肿瘤疫苗非常重要。
对于MHC I类肽触发(引发)细胞免疫反应的肽，它也必须与MHC分子结合。 这一过程依赖于MHC分子的等位基因以及肽氨基酸序列的特异性多态性。MHC-I类- 结合肽的长度通常为8-12个氨基酸残基，并且在其与MHC分子相应结合沟槽相互作用 的序列中通常包含两个保守残基(”锚”)。这样，每个MHC的等位基因都有”结合基序”， 从而确定哪些肽能与结合沟槽特异性结合。
在MHC-I类依赖性免疫反应中，肽不仅能与肿瘤细胞表达的某些MHC-I类分子结合，而且它们之后还必须能被T细胞负载的特异性T细胞受体(TCR)识别。
对于被T淋巴细胞识别为肿瘤特异性抗原或相关性抗原以及用于治疗的蛋白质，必 须具备特殊的条件。该抗原应主要由肿瘤细胞表达，而不由正常健康组织表达，或表达数量相对较少。在一个优选的实施方案中，与正常健康组织相比，所述肽应在肿瘤细胞 中过度提呈。更为适宜的情况是，该相应抗原不仅出现于一种肿瘤中，而且浓度(即每 个细胞的相应肽拷贝数目)高。肿瘤特异性抗原和肿瘤相关抗原往往是源自直接参与因 细胞周期控制或凋亡抑制中的其功能而发生的正常细胞向肿瘤细胞转化的蛋白。另外， 这些直接导致转化事件的蛋白的下游靶标可能会被上调，因此可能与肿瘤间接相关。这 些间接肿瘤相关抗原也可能是预防接种方法的靶标(Singh-Jasuja et al.，2004)。至关重要 的是，表位存在于抗原氨基酸序列中，以确保这种来自肿瘤相关抗原的肽(”免疫原性 肽”)可导致体外或体内T细胞反应。
基本上，任何能与MHC分子结合的肽都可能充当一个T细胞表位。诱导体外或体 内T细胞反应的前提是存在具有相应TCR的T细胞并且不存在对该特定表位的免疫耐 受性。
因此，TAA是基于T细胞疗法(包括但不限于肿瘤疫苗)研发的起点。识别和表 征TAA的方法通常基于对患者或健康受试者T细胞的使用情况，或基于肿瘤与正常组 织肽之间差别转录特性或差别表达模式的产生。然而，对肿瘤组织或人肿瘤细胞株中过 量表达或选择性表达的基因的识别并不提供在免疫疗法中使用这些基因所转录抗原的 准确信息。这是因为，有着相应TCR的T细胞必须要存在而且对这个特定表位的免疫 耐受性必须不存在或为最低水平，因此，这些抗原的表位只有一部分适合这种应用。因 此，在本发明的一非常优选的实施例中，只选择那些针对可发现功能性和/或增殖性T细 胞情况的过量提呈或选择性提呈肽，这一点非常重要。这种功能性T细胞被定义为在以 特异性抗原刺激后能够克隆地扩展并能够执行效应子功能(”效应子T细胞”)的T细胞 。
在通过根据本发明的特定TCR(例如可溶性TCR)和抗体或其他结合分子(支架) 靶向作用于肽-MHC的情况下，潜在肽的免疫原性是次要的。在这些情况下，提呈是决 定因素。
发明内容
在本发明的第一方面，本发明涉及一种肽或其药用盐，包含选自SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：388的氨基酸序列、或该序列的与SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：388具有至 少77％，优选至少88％同源(优选至少77％或至少88％相同)的变体序列，其中变体 与MHC结合和/或诱导T细胞与所述肽发生交叉反应，其中所述肽不是潜在的全长多 肽。
虽然作为癌症治疗靶目标肽最重要的标准是其在原发肿瘤组织中相比于正常组织 过度提呈，但是，相应基因的RNA表达谱也可有助于选择适当的肽。特别是，由于它 们的化学性质或在细胞上的低拷贝数，部分肽很难通过质谱检测，侧重于肽提呈检测的 筛选方法可能无法识别这些靶标。然而，这些靶标可通过另一种方法来检测，开始分析 正常组织的基因表达，其次评估肿瘤肽提呈和基因表达。这种方法在发明中使用mRNA 数据库(Lonsdale，2013)结合进一步的基因表达数据(包括肿瘤样本)以及肽提呈数据 实现。如果一个基因的mRNA在正常组织中几乎不存在，特别是在重要器官系统中不 存在，通过很有效的策略(例如双特异性亲和力优化的抗体或T细胞受体)靶向作用于 相应肽更可能是安全的。虽然此类肽仅在一小部分肿瘤组织中被发现，但其代表了令人 关注的靶标。常规质谱分析不够敏感，无法在肽水平上评估靶标范围。相反，肿瘤mRNA 表达可用于评估靶标范围。为了检测肽本身，比在常规筛选中敏感度更高的靶向质谱方 法可能是必要的，并可能更好地在肽提呈水平上评估靶标范围。
本发明进一步涉及本发明的肽，包含选自SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：388的序列 、或与SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：388具有至少77％、优选至少88％同源性(优选为 至少77％或至少88％相同)的变体，其中所述肽或其变体的总长度为8至100个、优 选为8至30个、最优选为8至14个氨基酸。
下表显示了根据本发明的肽、它们各自的SEQ ID NO、以及这些肽的可能源(潜在)基因。表1A和表2A中的所有肽均与HLA-A*02结合。表1C和表2B中的所有肽 均与HLA-A*24结合。表1B中的肽与HLA-II类等位基因结合。表3中的肽是与 HLA-A*24结合并可与本发明其他肽组合使用的其他肽。
表1A：与HLA-A*02结合的本发明肽
Figure BDA0001584383410000151
Figure BDA0001584383410000161
Figure BDA0001584383410000171
Figure BDA0001584383410000181
表1B：与HLA-II类结合的本发明肽。
Figure BDA0001584383410000182
表1C：与HLA-A*24类结合的本发明肽。
Figure BDA0001584383410000191
Figure BDA0001584383410000201
Figure BDA0001584383410000211
Figure BDA0001584383410000221
Figure BDA0001584383410000231
Figure BDA0001584383410000241
Figure BDA0001584383410000251
表2A：与HLA-A*02结合的本发明其他肽
Figure BDA0001584383410000252
表2B：与HLA-A*24结合的本发明其他肽
Figure BDA0001584383410000253
Figure BDA0001584383410000261
Figure BDA0001584383410000271
表3：用于癌症疗法(例如个性化癌症疗法)的本发明肽
Figure BDA0001584383410000272
本发明还一般涉及本发明的肽在治疗增殖性疾病中的用途，例如，脑胶质细胞瘤(GB)、乳腺癌(BRCA)、结直肠癌(CRC)、肾细胞癌(RCC)、慢性淋巴细胞白血病(CLL) 、肝细胞癌(HCC)、非小细胞和小细胞肺癌(NSCLC、SCLC)、非霍奇金淋巴瘤(NHL) 、急性骨髓性白血病(AML)、卵巢癌(OC)、胰腺癌(PC)、前列腺癌(PCA)、包括胃食 管交界癌(OSCAR)的食管癌、胆囊癌和胆管癌(GBC、CCC)、黑色素瘤(MEL)、胃 癌(GC)、睾丸癌(TC)、膀胱癌(UBC)、头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)、子宫癌(UEC)。
特别优选的是本发明的肽(单独或组合)，其选自SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：388 。更优选的是所述肽(单独或组合)选自SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：295(见表1A、 B、C)并且其用于免疫治疗脑胶质细胞瘤、乳腺癌、结直肠癌、肾细胞癌、慢性淋巴 细胞性白血病、肝细胞癌、非小细胞和小细胞肺癌、非霍奇金淋巴瘤、急性骨髓性白血 病、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、包括胃食管交界癌的食管癌、胆囊癌和胆管癌、黑色 素瘤、胃癌、睾丸癌、膀胱癌、头颈部鳞状细胞癌或子宫癌。
特别优选的是本发明的肽(单独或组合)，其选自SEQ ID NO：770、80、323和325 。更优选的是所述肽(单独或组合)选自SEQ ID NO：770、80、323和325，并且其用 于免疫治疗脑胶质细胞瘤、乳腺癌、结直肠癌、肾细胞癌、慢性淋巴细胞性白血病、肝 细胞癌、非小细胞和小细胞肺癌、非霍奇金淋巴瘤、急性骨髓性白血病、卵巢癌、胰腺 癌、前列腺癌、包括胃食管交界癌的食管癌、胆囊癌和胆管癌、黑色素瘤、胃癌、睾丸 癌、膀胱癌、头颈部鳞状细胞癌或子宫癌。
特别优选的是本发明的肽(单独或组合)，其选自SEQ ID NO：391和403。更优 选的是所述肽(单独或组合)选自SEQ ID NO：391和403，并且其用于免疫治疗脑胶 质细胞瘤、乳腺癌、结直肠癌、肾细胞癌、慢性淋巴细胞性白血病、肝细胞癌、非小细 胞和小细胞肺癌、非霍奇金淋巴瘤、急性骨髓性白血病、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、 包括胃食管交界癌的食管癌、胆囊癌和胆管癌、黑色素瘤、胃癌、睾丸癌、膀胱癌、头 颈部鳞状细胞癌或子宫癌。
如实施例1所示，其中本发明的许多肽也发现于各种类型肿瘤中，因此也可用于各种适应症的免疫治疗。如实施例2所示，潜在肽在各种癌症中过度表达提示这些肽在各 种其他肿瘤适应症中的有用性。
因此，本发明的另一个方面涉及本发明中肽用于选自脑胶质细胞瘤、乳腺癌、结直肠癌、肾细胞癌、慢性淋巴细胞性白血病、肝细胞癌、非小细胞和小细胞肺癌、非霍奇 金淋巴瘤、急性骨髓性白血病、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、包括胃食管交界癌的食管 癌、胆囊癌和胆管癌、黑色素瘤、胃癌、睾丸癌、膀胱癌、头颈部鳞状细胞癌或子宫癌 组的增殖性疾病的治疗(优选联合疗法)中的用途。
本发明还涉及本发明的肽，其具有与主要组织兼容性复合体(MHC)I或以拉长形式存在的例如长度变化的-MHC-II类分子结合的能力。
本发明进一步涉及本发明中的肽，其中所述肽(每种肽)由或基本由SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：388的氨基酸序列组成。
本发明进一步涉及本发明的肽，其中所述肽被修饰和/或包含非肽键。
本发明进一步涉及本发明的肽，其中所述肽为融合蛋白的一部分，特别是与HLA-DR抗 原相关不变链(Ii)的N-端氨基酸融合，或与抗体(例如，树突状细胞特定抗体)融合，或融合到抗体的序列中。
本发明的另一实施方案涉及一种非天然肽，其中所述肽由或基本由SEQ ID No：1至 SEQ ID No：48的氨基酸序列组成，并经合成产生(即，合成)为药用盐。合成产生肽 的方法是本领域公知的。本发明肽的盐与其体内状态的肽显著不同，因为这些体内产生 的肽不是盐。该肽的非天然盐形式介导肽的溶解度，特别是包含所述肽的药物组合物的 情况下，例如，本文所公开的肽疫苗。为了向需要治疗的受试者有效地提供肽，需要肽 具有充分、至少基本的溶解度。优选地，盐为肽的药用盐。本发明的这些盐包括碱和碱 土盐类，诸如Hofmeister系列的盐，包含阴离子PO4 3-、SO4 2-、CH3COO-、Cl-、Br-、 NO3 -、ClO4 -、I-、SCN-和阳离子NH4 +、Rb+、K+、Na+、Cs+、Li+、Zn2+、Mg2+、Ca2+、Mn2+、Cu2+和Ba2+。特别地，盐选自(NH4)3PO4、(NH4)2HPO4、(NH4)H2PO4、(NH4)2SO4、NH4CH3COO、NH4Cl、NH4Br、NH4NO3、NH4CIO4、NH4I、NH4SCN、Rb3PO4、Rb2HPO4、RbH2PO4、Rb2SO4、Rb4CH3COO、Rb4Cl、Rb4Br、Rb4NO3、Rb4CIO4、Rb4I、Rb4SCN 、K3PO4、K2HPO4、KH2PO4、K2SO4、KCH3COO、KCl、KBr、KNO3、KClO4、KI、 KSCN、Na3PO4、Na2HPO4、NaH2PO4、Na2SO4、NaCH3COO、NaCl、NaBr、NaNO3、 NaCIO4、NaI、NaSCN、ZnCI2 Cs3PO4、Cs2HPO4、CsH2PO4、Cs2SO4、CsCH3COO、CsCl 、CsBr、CsNO3、CsCIO4、CsI、CsSCN、Li3PO4、Li2HPO4、LiH2PO4、Li2SO4、LiCH3COO 、LiCl、LiBr、LiNO3、LiClO4、LiI、LiSCN、Cu2SO4、Mg3(PO4)2、Mg2HPO4、Mg(H2PO4)2、Mg2SO4、Mg(CH3COO)2、MgCl2、MgBr2、Mg(NO3)2、Mg(ClO4)2、MgI2、Mg(SCN)2、MnCl2、Ca3(PO4)，、Ca2HPO4、Ca(H2PO4)2、CaSO4、Ca(CH3COO)2、CaCl2、CaBr2、 Ca(NO3)2、Ca(ClO4)2、CaI2、Ca(SCN)2、Ba3(PO4)2、Ba2HPO4、Ba(H2PO4)2、BaSO4、 Ba(CH3COO)2、BaCl2、BaBr2、Ba(NO3)2、Ba(ClO4)2、BaI2和Ba(SCN)2。特别优选为NH 乙酸、MgCl2、KH2PO4、Na2SO4、KCl、NaCl和CaCl2，例如：氯化物或乙酸酯(三氟 乙酸)盐。
一般来说，肽和变体(至少含氨基酸残基之间的肽联接)可使用Lukas等人(Lukaset al.，1981)以及此处引用的参考文献所披露的固相肽合成Fmoc-聚酰胺模式进行合成。芴甲氧羰基(Fmoc)团对N-氨基提供临时保护。使用N，N-二甲基甲酰胺中的20％二甲 基呱啶中对这种碱高度敏感的保护基团进行重复裂解。由于它们的丁基醚(在丝氨酸苏 氨酸和酪氨酸的情况下)、丁基酯(在谷氨酸和天门冬氨酸的情况下)、叔丁氧羰基衍 生物(在赖氨酸和组氨酸的情况下)、三苯甲基衍生物(在半胱氨酸的情况下)及4- 甲氧基-2，3，6-三甲基苯磺酰基衍生物(在精氨酸的情况下)，侧链功能可能会受到保护 。只要谷氨酰胺和天冬酰胺为C-末端残基，侧链氨基功能保护所使用的是由4，4′-二甲 氧基二苯基团。固相支撑基于聚二甲基丙烯酰胺聚合物，其由三个单体二甲基丙烯酰胺 (骨架单体)、双丙烯酰乙烯二胺(交联剂)和N-丙烯酰肌胺酸甲酯(功能剂)构成。 使用的肽-树脂联剂为酸敏感的4-羟甲基苯氧乙酸衍生物。所有的氨基酸衍生物均作为 其预制对称酸酐衍生物加入，但是天冬酰胺和谷氨酰胺除外，它们使用被逆转的N，N- 二环已基碳二亚胺/1-羟基苯并三唑介导的耦合程序而加入。所有的耦合和脱保护反应用 茚三酮、硝基苯磺酸或isotin测试程序监测。合成完成后，用浓度为95％含50％清道 夫混合物的三氟醋酸，从伴随去除侧链保护基团的树脂支承物中裂解肽。常用的清道夫 混合物包括乙二硫醇、苯酚、苯甲醚和水，准确的选择依据合成肽的氨基酸组成。此外， 固相和液相方法结合使用对肽进行合成是可能的(例如，请参阅(Bruckdorfer et al.，2004) 以及本文引用的参考文献)。
三氟乙酸用真空中蒸发、随后用承载粗肽的二乙基乙醚滴定进行去除。用简单萃取 程序(水相冻干后，该程序制得不含清道夫混合物的肽)清除任何存在的清道夫混合物。肽合成试剂一般可从Calbiochem-Novabiochem(英国诺丁汉)获得。
纯化可通过以下技术的任何一种或组合方法进行，如：再结晶法、体积排阻色谱法、离子交换色谱法、疏水作用色谱法以及(通常)反相高效液相色谱法(如使用乙腈/ 水梯度分离)。
本发明进一步涉及一种核酸，其编码本发明的肽。本发明进一步涉及一种本发明的 核酸，为DNA、cDNA、PNA、RNA，也可以为其组合物。
本发明进一步涉及一种能表达和/或表达本发明核酸的表达载体。
本发明进一步涉及本发明的肽、本发明的核酸或本发明的表达载体在药物中的用途， 特别是用于治疗癌症。
本发明进一步涉及本发明中肽或本发明中所述肽复合体(含有MHC)的特定抗体以及制造这些抗体的方法。
本发明进一步涉及本发明的T细胞受体(TCR)，特别是可溶性TCR(sTCRs)和加工为自体或异体T细胞的克隆TCR，以及制造这些TCR的方法和载有所述TCR或与所 述TCR交叉反应的NK细胞或其他细胞。
抗体和TCR是根据本发明的肽现有免疫治疗用途的另外实施方案。
本发明进一步涉及含本发明核酸或前述表达载体的一种宿主细胞。本发明进一步涉 及本发明的宿主细胞，其为抗原提呈细胞，优选为树突细胞。
本发明进一步涉及制备本发明肽的方法，所述方法包括培养本发明的宿主细胞和从 所述宿主细胞或其培养基中分离肽。
本发明进一步涉及本发明中的方法，其中通过使足量的抗原与抗原提呈细胞接触， 抗原被载在表达于合适抗原提呈细胞或人工抗原呈递细胞表面的I或II类MHC分子上。
本发明进一步涉及本发明的方法，其中抗原提呈细胞包含能表达含SEQ ID NO.1至 SEQ ID NO.388、优选为含SEQ ID No.1至SEQ ID No.295，或其变体氨基酸序列的肽 的表达载体。
本发明进一步涉及以本发明方法制造的激活T细胞，其中所述T细胞有选择性地识别一种细胞，该细胞表达含一种本发明氨基酸序列的多肽。
本发明进一步涉及以本发明方法制造的激活的T细胞，其中所述T细胞有选择性地识 别一种细胞，该细胞表达含本发明氨基酸序列的多肽。
本发明进一步涉及一种杀伤患者中靶细胞的方法，其中患者的靶细胞异常地表达含 本发明任意氨基酸序列的多肽，该方法包括对患者施用本发明方法制造的有效量T细胞。
本发明进一步涉及任何所述肽、本发明的核酸、本发明的表达载体、本发明的细胞、本发明的激活的T淋巴细胞、T细胞受体或抗体或其他肽-和/或肽-MHC结合分子作 为药物或在药物制备中的用途。所述药物优选为具有抗癌活性。
优选情况为，所述药物为基于可溶性TCR或抗体的细胞治疗药物、疫苗或蛋白质 。
本发明还涉及本发明的用途，其中所述癌细胞为脑胶质细胞瘤、乳腺癌、结直肠癌、肾细胞癌、慢性淋巴细胞性白血病、肝细胞癌、非小细胞和小细胞肺癌、非霍奇金淋 巴瘤、急性骨髓性白血病、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、包括胃食管交界癌的食管癌、 胆囊癌和胆管癌、黑色素瘤、胃癌、睾丸癌、膀胱癌、头颈部鳞状细胞癌或子宫癌。
本发明进一步涉及一种基于本发明肽的生物标志物，在此成为“靶标“，其可用于诊 断癌症，优选为脑胶质细胞瘤、乳腺癌、结直肠癌、肾细胞癌、慢性淋巴细胞性白血病 、肝细胞癌、非小细胞和小细胞肺癌、非霍奇金淋巴瘤、急性骨髓性白血病、卵巢癌、 胰腺癌、前列腺癌、包括胃食管交界癌的食管癌、胆囊癌和胆管癌、黑色素瘤、胃癌、 睾丸癌、膀胱癌、头颈部鳞状细胞癌或子宫癌。所述标志物可以是肽本身的过度提呈， 或相应基因的过度表达。标志物也可以用于预测治疗成功的可能性，优选为免疫疗法， 最优选为靶向由该生物标志物识别的相同靶的免疫疗法。例如，抗体或可溶性TCR可 用于对肿瘤切片进行染色以检测是否存在与MHC复合的相关肽。
或者，抗体具有进一步的效应子功能，如免疫刺激域或毒素。
本发明还涉及这些癌症治疗中新靶点的用途。
针对其他癌性疾病的治疗和诊断用途在本发明肽的基础表达产物(多肽)的以下描 述中进行披露。
A4GNT在胰腺癌细胞中频繁表达，但在外周血细胞中并非如此，外周血单核细胞部分中A4GNT mRNA表达的定量分析将有助于检测胰腺癌(Ishizone et al.，2006)。当癌细胞局限于胃黏膜时，A4GNT mRNA可在80％早期胃癌患者中检测到，A4GNT mRNA 的表达水平增加与肿瘤进展相关(Shimizu et al.，2003)。
ABCC2在原发性输卵管癌中的上调表达与较差预后相关(Halon et al.，2013)。
在人类癌症中，ADAM10上调，其水平一般与肿瘤进展和不良结局的参数相关。 在临床前模型中，ADAM10的选择性抑制剂已被证明在减少肿瘤生长的现有疗法中具 有协同作用(Duffy et al.，2009)。
AHCYL2被证明在结肠癌和一部分肺癌组织中下调(Lleonart et al.，2006)。AHCYL2 的mRNA表达被描述为可能与p53功能控制以及ras-MAPK途径、甲基化和转录细胞程序相关，因此，AHCYL2可能是涉及人类结肠和肺肿瘤的调节抑制基因(Lleonart et al.，2006)。
AKR1C1在宫颈癌、卵巢癌和肺癌细胞中起着顺铂的抗性作用，其包括线粒体膜去极化、产生ROS和激活JNK途径(Chen et al.，2015)。对新辅助化疗有反应者与无反应 者相比，发现AKR1C1在前者的瘤内水平显著更高(Hlavac et al.，2014)。
AKR1C3的表达被证明与前列腺癌的Gleason评分升高呈正相关，这表明AKR1C3 可以作为前列腺癌进展的一个有前途的生物标志物(Tian et al.，2014)。AKR1C3被证明 可催化4-雄甾烯-3，17-二酮还原为睾酮，雌酮还原为17β雌二醇，从而分别促进激素依 赖性前列腺癌和乳腺癌的增殖(Byrns et al.，2011)。AKR1C3被证明在乳腺癌、前列腺癌 和皮肤鳞状细胞癌中上调(Byrns et al.，2011；Mantel et al.，2014)。AKR1C3被证明是基因卷标内的一个标志物，其能够辨别局部晚期直肠癌患者放化疗后有反应者和无反应者(Agostini et al.，2015)。AKR1C3通过肿瘤抑制因子PTEN丧失来激活抗凋亡PTEN/Akt 途径被证明与人乳腺癌中的多柔比星抗性有关(Zhong et al.，2015)。AKR1C3被证明与 暴露于燃煤排放的中国县域肺癌患者的较高风险相关(Li et al.，2015a)。AKR1C3被描述 为绒毛膜癌的一个潜在治疗标志物，也与该病的甲氨蝶呤抗性发生有关(Zhao et al.，2014a)。
研究显示ALDH1L1的表达在HCC和脑胶质瘤中下调。ALDH1L1在上述癌症中的 下调与较差的预后和更具侵袭性的表型相关(Chen et al.，2012；Rodriguez et al.，2008)。
与正常组织相比，ALOX15以高水平存在于前列腺癌(PCa)、肺癌、乳腺癌、黑色 素瘤和结肠腺癌中(Kelavkar et al.，2002)。ALOX15酶活性有助于PCa的发生和发展(Kelavkar et al.，2007)。
AR牵涉各种癌症的发生，如前列腺癌、去势抵抗前列腺癌、乳腺癌、胶质母细胞瘤、结肠癌和胃癌(Wang et al.，2009b；Yu et al.，2015b；Mehta et al.，2015；Wang etal.， 2015a；Sukocheva et al.，2015)。除了促进前列腺癌的增殖，通过AR的雄激素信令经由 诱导p21(WAF1/CIP1，一种细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂)的表达导致细胞凋亡(Yehet al.，2000)。
ARMC5突变导致皮质醇结节产瘤、双侧结节样增生、原发性肾上腺结节增生和脑膜瘤(Espiard and Bertherat，2015；Kirschner and Stratakis，2016；Elbelt et al.，2015)。
药物基因组学研究显示，ATAD5和抗癌药物之间存在相互关系(Abaan et al.，2013) 。ATAD5在恶性神经鞘瘤中显著上调(Pasmant et al.，2011)。B型肝炎病毒X蛋白显著 增强ATAD5在HBV相关肝癌中的表达(Ghosh et al.，2016)。ATAD5损失可导致小鼠 胚胎死亡，它充当小鼠和人类的肿瘤抑制因子，并与人范可尼贫血途径组件交互作用。 此外，它可能负责一些与神经纤维瘤病(一种遗传性疾病，伴有肿瘤生长的高风险)相 关的表型(Gazy et al.，2015；Jenne et al.，2001)。ATAD5基因位点的变体与上皮性卵巢癌 风险相关(Kuchenbaecker et al.，2015)。ATAD5具有非小细胞肺癌中至少一种哺乳动物 表型上的支座(Li et al.，2014)。
ATP10B的表达在高度侵袭性胶质瘤细胞中失调，并于侵袭行为相关(Tatenhorstet al.，2004)。
ATP8B4可能是多发性骨髓瘤患者和其他实体中的预后标志物和治疗靶标(美国专利号20070237770 A1)(Ni et al.，2012)。
ATR编码ATR丝氨酸/苏氨酸激酶，其属于PI3/PI4激酶家族。在口腔鳞癌细胞系 中观察到ATR基因的拷贝数增加、扩增或易位(Parikh et al.，2014)。已经证实，子宫内 膜癌截断ATR突变与降低无病和总体生存下降相关(Zighelboim et al.，2009)。
B3GNT5在急性髓性白血病和小鼠胚胎癌中过度表达，其表达与胶质母细胞瘤的激活子甲基化呈负相关(Ogasawara et al.，2011；Etcheverry et al.，2010；Wang et al.，2012)。 B3GNT5通过miRNA-203的下调可能促进下咽鳞状细胞癌的恶性程度(Wang et al.，2015g)。B3GNT5与乳腺癌患者的存活相关(Potapenko et al.，2015)。
在淋巴瘤、乳腺癌、胃癌和前列腺癌子集中Bub1表达增加。Bub1过度表达与不 良临床预后相关(Ricke and van Deursen，2011)。Bub1突变可发现于显示出染色体不稳 定的结直肠癌中(Williams et al.，2007)。
C4A被描述为多囊卵巢综合症和子宫内膜癌的生物标志物，实验数据表明，C4可介导癌症生长(Galazis et al.，2013；Rutkowski et al.，2010)。
在急性单核细胞白血病细胞系JIH3中，染色体缺失包括C7orf10(Pan et al.，2012) 。
C8由人肝癌细胞系HepG2组成性表达，在细胞因子IL-6、IFN-γ和IL-1β刺激后 表达大度增强(Scheurer et al.，1997)。
睾丸癌抗原特异性引物可检测多形性胶质母细胞瘤(恶性程度最高和侵袭性最强的 肿瘤之一，预后很差)中的CASC5。CASC5在N-末端(针对Bub1和BubR1)和C- 末端(针对Zwint-1和hMis14/hNsl1)有特异性结合基序。此连接的破坏可导致肿瘤发 生(Kiyomitsuet al.，2011；Jiang et al.，2014c)。CASC5与肿瘤抑制因子pRb相互作用 (Bogdanov andTakimoto，2008)。CASC5在增殖体细胞、肿瘤和健康人睾丸中高度表达 (Bogdanov andTakimoto，2008；Sasao et al.，2004)。CASC5与细胞生长抑制和成熟增强关 联，其破坏可能是白血病形成的关键因素(Hayette et al.，2000；Bogdanov and Takimoto， 2008；Chinwalla et al.，2003；Kuefer et al.，2003；Yang et al.，2014a)。
CCR4被描述为各种肿瘤的预后标志物，如肾细胞癌、头颈部鳞状细胞癌、胃癌、 乳腺癌、结肠癌和霍奇金淋巴瘤(Ishida et al.，2006；Olkhanud et al.，2009；Yang etal.，2011； Tsujikawa et al.，2013；Al-haidari et al.，2013；Liu et al.，2014a)。研究显示，有CCR4阳性 肿瘤的胃癌患者与有CCR4阴性肿瘤的患者相比预后明显较差(Lee etal.，2009a)。
CCR8表达在尿路上皮和肾癌患者的外周血中的单核细胞和粒髓样细胞亚群中增加。在人膀胱和肾癌组织内也检测到CCR8表达上调，主要限于肿瘤相关巨噬细胞。 CCL1/CCR8轴是癌症相关炎症的一个组成部分，并可能有助于免疫逃避(Eruslanov et al.，2013)。
CD101中的单核苷酸多态性被证明与胰腺癌风险相关，但结果在前列腺癌病例对照和同组列人口中不能被复制，因此，需要未来的研究查明CD101在胰腺癌中的可能 作用(Reid-Lombardo et al.，2011)。CD101被确定为6基因标签中的一个基因，其使用 贝叶斯模型平均方法鉴别慢性期和原始细胞慢性髓细胞性白血病(Oehler et al.，2009)。
CD84被描述为CD抗原，相比于减缓进展和稳定的慢性淋巴细胞白血病，其在进 行性慢性淋巴细胞白血病中差异化丰富表达(Huang et al.，2014)。CD84表达被证明从慢 性淋巴细胞性白血病的早期阶段开始显著升高(Binsky-Ehrenreich et al.，2014)。
CENPE表达与胶质瘤级别显著相关，可能为神经胶质瘤患者预测生存时间补充其他参数(Bie et al.，2011)。与化疗敏感肿瘤相比，CENPE在化疗耐药卵巢上皮性肿瘤中 上调(Ju et al.，2009)。CENPE在浸润性和侵袭-浸润性垂体泌乳素瘤中上调(Wierinckx etal.，2007)。
CLDN14被证明在胃癌中上调(Gao et al.，2013)。CLDN14表达被证明与胃癌淋巴转移有关(Gao et al.，2013)。CLDN14被描述为在小鼠肿瘤血管完整性和血管生成中具 有调节作用(Baker et al.，2013)。
CLDN3在许多人类肿瘤中高度差异化表达，可提供有效的分子工具来特异性识别和靶向作用于生物侵袭性人体癌细胞，因为CLDN3是产气荚膜梭菌肠毒素的高亲和力 受体(Black et al.，2015)。CLDN3在几种瘤中频繁过度表达，包括卵巢癌、乳腺癌、胰 腺癌和前列腺癌(Morin，2005)。CLDN3被确定为前列腺癌生物标志物，因为它在前列 腺癌中高度表达(Amaro et al.，2014)。CLDN3表达下降与完全切除的肺鳞癌预后不良和 EMT相关(Cheet al.，2015)。CLDN3通过Wnt-EMT信令抑制癌症侵袭性，是肝细胞癌 潜在的预后生物标志物(Jiang et al.，2014b)。
CLDN4在许多人类肿瘤中高度差异化表达，可提供有效的分子工具来特异性识别和靶向作用于生物侵袭性人体癌细胞，因为CLDN4是产气荚膜梭菌肠毒素的高亲和力 受体(Black et al.，2015)。CLDN4在几种瘤中频繁过度表达，包括卵巢癌、乳腺癌、胰 腺癌和前列腺癌(Morin，2005)。针对CLDN4胞外域的抗体在膀胱癌中有亲化疗作用 (Kuwada etal.，2015)。CLDN4高表达与更加差异化的肠型胃癌有关，并在低分化弥漫 型胃癌中缺失。CLDN4低表达与淋巴管生成有关(Shareef et al.，2015)。
CLDN6表达被证明与非小细胞肺癌的淋巴结转移和TNM分期有关(Wang et al.，2015f)。此外，CLDN6低表达被证明与非小细胞肺癌患者的显著降低的存活率有关 (Wanget al.，2015f)。因此，CLDN6低表达是一个独立的预后生物标志物，提示非小细 胞肺癌患者的预后较差(Wang et al.，2015f)。CLDN6被证明在宫颈癌和胃癌中下调 (Zhang etal.，2015；Lin et al.，2013)。CLDN6被证明在BRCA1相关乳腺癌和卵巢乳头状 浆液性癌中上调(Wang et al.，2013b；Heerma van Voss et al.，2014)。CLDN6被描述为乳 腺癌的肿瘤抑制因子(Zhang et al.，2015)。宫颈癌细胞系HeLa和C33A中CLDN6表达 增加被证明可在抑制细胞增殖、体外集落形成、体内肿瘤生长，这表明CLDN6可充当 宫颈癌细胞中的肿瘤抑制因子(Zhang et al.，2015)。CLDN6可能在卵巢癌的侵袭和转移 中起着积极作用(Wanget al.，2013b)。CLDN6被证明在生殖细胞瘤中始终如一地表达， 因此，是原始生殖细胞肿瘤的新型诊断标志物(Ushiku et al.，2012)。CLDN6表达被证明 在接受评估的一组非典型畸胎瘤/中枢神经系统横纹肌样瘤大部分肿瘤中呈阳性，且 CLDN6呈强阳性，是疾病结局的潜在的独立预后因子(Dufour et al.，2012)。
CLDN9被证明在转移性Lewis肺癌细胞系p-3LL中、由这些细胞衍生的肿瘤中以 及垂体嗜酸细胞瘤中上调(Sharma et al.，2016；Hong et al.，2014)。转移性Lewis肺癌 p-3LL细胞中CLDN9表达的敲减被证明可导致运动性、体外侵袭性和体内转移显著降 低，而在这些细胞中瞬时过度表达被证明可提高他们的运动性(Sharma et al.，2016)。因 此，CLDN9可能在促进肺癌转移中起重要作用(Sharma et al.，2016)。CLDN9被证明在 宫颈癌组织中下调(Zhu et al.，2015a)。CLDN9表达被发现与宫颈癌淋巴转移有关(Zhu et al.，2015a)。CLDN9被描述为垂体嗜酸细胞瘤中突变和上调最显著的基因，与非侵袭性 嗜酸细胞瘤相比，在侵袭性嗜酸细胞瘤中表达水平较高(Hong et al.，2014)。因此，CLDN9 可能是侵袭性垂体嗜酸细胞瘤的重要生物标志物(Hong et al.，2014)。CLDN9在胃癌细 胞系AGS中的过度表达被证明可提高侵袭能力、细胞迁移和增殖速度，因此足以增强 胃癌细胞系的致瘤性(Zavala-Zendejas et al.，2011)。与肠型胃腺癌相比，CLDN9强表达 被证明与弥漫型胃腺癌的较高死亡率相关，检测值被描述为“肠型“和“弥漫型“胃腺癌一 个有用的预后指标(Rendon-Huerta et al.，2010)。
CLEC5A mRNA表达被证明在原发性急性髓细胞白血病患者的样本中比健康供体的巨噬细胞和粒细胞中明显降低(Batliner et al.，2011)。CLEC5A被描述为单核细胞/巨噬细胞和粒细胞中肿瘤抑制因子PU.1的一个新转录靶标(Batliner et al.，2011)。
DCP2被确定为miR-224靶标，在甲氨蝶呤抗性人结肠癌细胞中差异表达超过2倍(Mencia et al.，2011)。
DCSTAMP表达在乳头状甲状腺癌中增加(Lee et al.，2009b；Kim et al.，2010b)。DCSTAMP下调导致MCF-7细胞集落形成降低，可能的原因是增殖和细胞周期进展下 降以及细胞凋亡增加(Zeng et al.，2015)。DCSTAMP在外周巨噬细胞中过度表达，树突 状细胞和骨髓瘤浆细胞显示出对DCSTAMP的高敏感性并能够转分化成破骨细胞。表 达癌干细胞表型的恶性浆细胞和高转移性能力表达破骨细胞标志物，其激活导致 ERK1/2磷酸化和骨吸收活性激活的β3转录途径(Silvestris et al.，2011)。七叶亭和白菊 抑制c-Fos和活化T细胞c1信号传导途径的核因子，导致抑制DCSTAMP表达，这是 破骨细胞分化的标志物基因(Ihn et al.，2015；Baek et al.，2015；Cicek et al.，2011；Courtial et al.，2012；Kimet al.，2014a)。
DENND1B的SNP与胰腺癌风险显著相关(Cotterchio et al.，2015)。
DNAH17，也称为DNEL2，被描述为黑色素瘤患者中确定的肿瘤抗原的一个同源 物(Ehlken et al.，2004)。DNAH17被描述为几个候选基因之一，他们被映射到与常染色 体显性疾病遗传神经痛肌萎缩和胼胝症中散发性乳腺癌、卵巢肿瘤、食管癌相关的小染 色体间隔(Kalikin et al.，1999)。
DNAH2是在≥10％慢性粒细胞白血病患者中突变的基因之一(Mason et al.，2015) 。编码微管相关蛋白的基因，如DNAH2，在CpG岛甲基化表型阳性肾透明细胞癌中显示有10％或更高的遗传畸变发生率(Arai et al.，2015)。
通过抑制DNMT3B让甲基化沉寂肿瘤抑制基因再表达已成为针对癌症的有效策略(Singh et al.，2013)。
FAM83B mRNA表达在鳞状细胞癌中比在正常肺或腺癌中显著更高，因此， FAM83B是诊断和预后的一种新生物标志物(Okabe et al.，2015)。FAM83B被确定为参 与激活CRAF/MAPK信号和驱动上皮细胞转化的癌基因。表达升高与肿瘤分级升高和 总生存率降低有关(Cipriano et al.，2014)。FAM83B表达升高还激活PI3K/AKT信号传 导途径，并对PI3K、AKT和mTOR抑制剂敏感度降低(Cipriano et al.，2013)。
由于基因突变导致的FANCD2下调和功能障碍在不同癌症类型中报告过，包括乳腺癌、急性淋巴性白血病和睾丸精原细胞瘤，并与癌症发展有关。另外，FANCD2再 次表达和上调被证明与胶质瘤和结直肠癌的肿瘤进展和转移有关(Patil et al.，2014；Shen etal.，2015a；Shen et al.，2015b；Ozawa et al.，2010；Rudland et al.，2010；Zhang etal.，2010a； Smetsers et al.，2012)。PI3K/mTOR/Akt途径促进FANCD2诱导ATM/Chk2检查点作为 DNA损伤应答，并且单泛素化FANCD2激活肿瘤抑制因子TAp63的转录(Shen et al.，2013；Park et al.，2013)。
FOXJ1表达上调，与肿瘤分期、组织学分级和大小有关，并与透明细胞肾细胞癌 患者预后相关(Zhu et al.，2015b)。FOXJ1表达下降与临床分期、淋巴结转移及远处转移 显著相关，较低的FOXJ1表达独立预测胃癌生存期较短(Wang et al.，2015c)。FOXJ1过 度表达可促进肝细胞癌的肿瘤细胞增殖和细胞周期过渡，并与组织学分级和较差预后相 关(Chen et al.，2013)。
高GINS2转录水平预测较差预后，通过乳腺癌患者的乳腺癌干细胞与高组织学分级及内分泌治疗耐药相关(Zheng et al.，2014)。据报告，GINS2以高水平存在于肺腺癌中，并与TNM分期相关(Liu et al.，2013b)。GINS2在许多恶性实体肿瘤(如乳腺癌、 黑色素瘤和肝细胞癌)中大量异常表达。此外，GINS2过度表达可促进白血病细胞系的 增殖(Zhanget al.，2013a)。
相对于正常组织，GPR98在原发性神经内分泌肿瘤中表达增加(Sherman et al.，2013) 。GPR98是与多形性胶质母细胞瘤存活相关的基因之一(Sadeque et al.，2012)。GPR98显 示由糖皮质激素调节的转录物，糖皮质激素用于急性淋巴细胞白血病，因为它们导致细 胞凋亡的诱导(Rainer et al.，2012)。
GTPBP10与胶质母细胞瘤的拷贝数变异、基因表达和患者转归相关(Kong et al.，2016)。
GTSE1表达抑制了凋亡信令，并导致胃癌细胞的顺铂耐药(Subhash et al.，2015)。 GTSE1在子宫平滑肌肉瘤(ULMS)中过度表达并参与细胞周期调控。
H2BFS一贯表达为与低风险急性淋巴细胞白血病亚组相关的重要簇群(Qiu etal.， 2003)。
HIST1H2BJ被证明在脑肿瘤中下调，并描述为可用于开发有诊断或预后价值的分子标志物(Luna et al.，2015)。
HISTH4A乙酰化可能是灭活胚胎肾细胞癌(Wilms肿瘤)的潜在靶标(Yan-Fang etal.，2015)。
HIST1H4C可作为治疗相关骨髓性白血病发生的风险区别因子(Bogni et al.，2006) 。
HIST1H4F被发现在前列腺癌中超甲基化，这也可能与患者的老化相关(Kitchenet al.，2016)。
HIST1H4K高甲基化率发现于高级别无肌层浸润性膀胱癌以及前列腺癌中，因此代表着一种潜在的生物标志物(Payne et al.，2009；Kachakova et al.，2013)。
结果表明，HIST1H4L在ERG+前列腺癌中显著上调(Camoes et al.，2012)。HIST1H4L编码复制依赖组蛋白簇1-H4L，这是组蛋白H4家族的一员(RefSeq，2002) 。
HIST2H4B被确定为是感染了呼肠孤病毒亚型的细胞中关键细胞致病途径的新蛋白，在目前临床试验中作为抗癌溶瘤剂(Berard et al.，2015)。
HIST4H4是以下的基因之一：这些基因显示在使用由特异性靶向作用于表达突变d9-E-钙黏蛋白的细胞的α-发射体和单克隆抗体d9Mab组成的免疫偶联物治疗后在胃癌 细胞中连续下调(Seidl et al.，2010)。组蛋白H4家族其他成员的超甲基化与I期非小细 胞肺癌较短的无复发生存期显著相关(Sandoval et al.，2013)。
HIVEP1被确定为通过淋巴瘤细胞系中人类T淋巴细胞病毒1型融合破坏的细胞基因(Cao et al.，2015)。HIVEP1与11q不良缺失相关，还与慢性淋巴细胞性白血病的不良Binet阶段B和C相关(Aalto et al.，2001)。
HNRNPH2在不同癌症类型(包括胰腺癌、肝癌和胃癌)中上调(Honore et al.，2004； Zeng et al.，2007)。HNRNPH2参与hTERT的β-缺失转录物的剪接，这在癌细胞中高度表达和竞争，从而抑制内源性端粒酶活性(Listerman et al.，2013)。
HOXD11在头颈部鳞状细胞癌中失调，在细胞系和患者肿瘤样本中显示出极高的水平。HOXD11敲减降低了侵袭性(Sharpe et al.，2014)。HOXD11在口腔鳞状细胞癌中 显著上调(Rodini et al.，2012)。HOXD11在人乳腺癌中异常甲基化(Miyamoto et al.，2005) 。HOXD11基因融合至含有t(2；11)(q31；p15)的急性髓性白血病中的NUP98基因 (Taketaniet al.，2002)。
ICOS作为T细胞上程序性死亡-1(PD-1)的配体，诱导癌细胞的免疫逃逸，也充当介导对肿瘤细胞抗凋亡作用的受体(Yang et al.，2015c)。小鼠肿瘤模型为肿瘤生长期间涉及ICOS的多个免疫检查点的靶向作用提供了重要支持(Leung and Suh，2014)。ICOS+ 细胞浸润与患者的不良预后相关，识别ICOS为癌症免疫治疗的新靶标(Faget et al.，2013)。ICOS能在体外和体内增强针对胆管癌的细胞因子诱导杀伤细胞的细胞毒性作用(He etal.，2011)。
IFNG瘤内表达被证明与MHC II类分子表达及其在人黑色素瘤中更具侵袭性的表型相关(Brocker et al.，1988)。自分泌IFNG信令被证明可增强IFNG基因转染哺乳动物 腺癌细胞的实验性转移能力，并可提高对NK细胞的抗性(Lollini et al.，1993)。
与预后不良标志物相关的IGFBP3在三阴性乳腺癌中高表达(Marzec et al.，2015)。 特异性结合至IGFBP3的一种新型细胞死亡受体被确定，并可用于乳腺癌的治疗(Mohanraj and Oh，2011)。IGFBP3显示出体外的促生存和促生长特性(Johnson andFirth， 2014)。IGFBP3是尿路上皮细胞癌复发的独立标志物(Phe et al.，2009)。
IGFBPL1是胰岛素生长因子的调节因子，因异常超甲基化在乳腺癌细胞系下调。IGFBPL1甲基化与较差的总生存率和无病生存率明显相关(Smith et al.，2007)。
IGFLR1在结直肠癌中突变(Donnard et al.，2014)。IGFLR1具有与肿瘤坏死因子受 体家族相似的结构(Lobito et al.，2011)。
IL4I1蛋白表达在肿瘤中非常频繁。IL4I1在不同肿瘤实体的肿瘤相关巨噬细胞、淋 巴瘤肿瘤细胞中检测到，在罕见情况下，在实体癌(主要间皮瘤)中检测到(Carbonnelle-Puscian et al.，2009)。人Th17细胞中IL4I1上调通过阻断参与IL-2激活子活化的分子途径和维持高水平的Tob1限制了它们的T细胞受体(TCR)介导扩张，这影 响进入细胞周期(Santarlasci et al.，2014)。
IQGAP3在肺癌中过度表达，与肿瘤细胞生长、迁移和侵袭相关。此外，它在肝细 胞癌中由染色体扩增上调，IQGAP3表达在p53突变预后差的结直肠癌患者中增加 (Katkooriet al.，2012；Yang et al.，2014b；Skawran et al.，2008)。IQGAP3调制所述 EGFR/Ras/ERK信号级联，并与Rac/Cdc42相互作用(Yang et al.，2014b；Kunimoto et al.， 2009)。
与正常培养的黑色素细胞和非转移性黑色素瘤细胞系相比，ITGA2水平升高发现于高度侵袭性和转移性黑色素瘤细胞系中(van Muijen et al.，1995)。黏附分子ITGA2被黑色素瘤细胞中的IFN-γ、TNF-α和IL-1-β上调(Garbe and Krasagakis，1993)。ITGA2转染入不表达ITGA2的人横纹肌肉瘤细胞增强了各器官转移的频率(Matsuura et al.，1995)。
KCNU1位于经常参与乳腺癌复杂染色体重排区域中的染色体8p上(Gelsi-Boyeret al.，2005)。KCNU1是儿科癌症样本肝母细胞瘤中前25位过度表达的细胞外膜蛋白之一(Orentas et al.，2012)。
KIAA0226L被认为是一种肿瘤抑制基因，在宫颈癌中超甲基化。KIAA0226L重新 激活导致细胞生长、活力和集落形成下降(Huisman et al.，2015；Eijsink et al.，2012；Huisman et al.，2013)。KIAA0226L的甲基化模式可用于分辨前体病变和正常宫颈癌(Milutin et al.，2015)。KIAA0226L的甲基化模式不可用作宫颈癌的特定生物标志物(Sohrabi et al.，2014)。KIAA0226L重新激活部分去甲基化其激活子区域，也降低压制性组蛋白甲基化(Huisman et al.，2013)。
KIAA1244过度表达是乳腺癌细胞激素相关生长中造成雌激素/雌激素受体α信号传导途径活化的重要机制之一(Kim et al.，2009)。KIAA1244和PHB2相互作用的抑制可 能是管腔型乳腺癌的一种新治疗策略(Yoshimaru et al.，2013)。
KIAA1524编码蛋白磷酸酶2A的癌抑制剂(CIP2A)。CIP2A的一个重要角色在NSCLC、HCC、HNSCC、膀胱癌、胰腺癌、宫颈癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌和结 直肠癌中已得到证明(Ventela et al.，2015；Ma et al.，2014；Guo et al.，2015b；Rincon et al.，2015；Guo et al.，2015c；Wu et al.，2015；Peng et al.，2015；Lei et al.，2014；Liu etal.，2014c； Farrell et al.，2014；Fang et al.，2012；He et al.，2012；Bockelman etal.，2012)。
KIF18A被证明在肝细胞癌中过度表达，这与较短的无病生存期和总生存率相关。因此，KIF18A可能是肝癌诊断的生物标志物，并且是手术切除后无病生存和总生存的 独立预测因子(Liao et al.，2014)。KIF18A表达在滑膜肉瘤特定亚型中上调(Przybyl et al.，2014)。雌激素强烈诱导乳腺癌的KIF18A表达，这与增殖增加和细胞凋亡减少相关(Zou etal.，2014)。
在胰腺导管腺癌、黑色素瘤、膀胱癌、非小细胞肺癌和胆管细胞癌中检测到KIF20A过度表达(Imai et al.，2011；Yamashita et al.，2012；Stangel et al.，2015)。最近，据报告， 用KIF20A衍生肽接种的胰腺导管腺癌患者与对照组相比，表现出更好的预后(Asahara et al.，2013)。此外，KIF20A的沉寂导致抑制胰腺癌细胞系的增殖、运动性和侵袭性 (Stangel et al.，2015)。
乳腺癌中KIF26B的高表达与较差预后相关(Wang et al.，2013c)。KIF26B上调与肿 瘤大小显著相关，可用于分析CRC肿瘤组织和癌旁正常黏膜。KIF26B在结直肠癌发生 中起着重要作用，并充当CRC的一种新型预后指标和潜在的治疗靶点(Wang et al.， 2015d)。
KIF2C被证明参与肿瘤细胞的定向迁移和侵袭(Ritter et al.，2015)。KIF2C过度表达 被证明与胃癌和结直肠癌患者的淋巴浸润和淋巴结转移相关(Ritter et al.，2015)。KIF2C 被证明在口腔舌癌中上调(Wang et al.，2014a)。KIF2C高表达被证明与口腔舌鳞状细胞 癌的淋巴结转移和肿瘤分期相关(Wang et al.，2014a)。KIF2C的沉寂被证明可导致人口 腔鳞状细胞癌细胞系Tca8113的增殖和迁移抑制(Wang et al.，2014a)。KIF2C突变被描 述为与结直肠癌相关(Kumar et al.，2013)。
KIFC1被证明是独立来自大量形成的中心体(正常或多余中心体)的纺锤体正确组装、稳定极聚焦和癌细胞生存所需要的。KIFC1表达被证明在乳腺癌，特别是雌激素受 体阴性、孕激素受体阴性和三阴性乳腺癌和8个人乳腺癌细胞系中上调。在雌激素受体 阳性乳腺癌细胞中，KIFC1是由雌激素强烈诱导表达的其他19种动力蛋白之一。在乳 腺癌中，KIFC1过度表达及其核积累被证明与组织学分级有关，并可预测较差的无进展 和总生存期。在乳腺癌细胞系中，KIFC1过度表达被证明可介导对多西他赛的抗性。 KIFC1沉寂负面影响乳腺癌细胞生存力(Zou et al.，2014；Pannu et al.，2015；De et al.，2009； Li etal.，2015b)。KIFC1被证明在卵巢癌中过度表达，其与肿瘤侵袭性、晚期肿瘤分级 和分期相关。KIFC1被确定为三种基因之一，其在原发性NSCLC肿瘤中高表达提示发 生脑转移的风险较高(Grinberg-Rashi et al.，2009)。
KL被描述为一种肿瘤抑制因子，其抑制宫颈癌中上皮至间质的转变，并通过抑制胰岛素/IGF1、p53/p21和Wnt信号充当几种类型人类癌症的肿瘤抑制因子(Xie et al.，2013；Qureshi et al.，2015)。在许多癌症(包括乳腺癌、肺癌和肝细胞癌)中，KL被描 述为一个异常表达基因(Zhou and Wang，2015)。KL被描述为在胰腺癌、肝细胞癌和其 他肿瘤中下调(Zhou and Wang，2015)。KL被描述为癌症的一个新生物标志物，其下调 被描述为可导致促进增殖和减少癌细胞凋亡。在此背景下，Wnt/β-连环蛋白信号是几个 相关信号通路之一(Zhou and Wang，2015)。KL基因多态性被证明与结直肠癌的风险增 加有关(Liu etal.，2015)。
KLHDC7B与宫颈鳞状细胞癌相关，是宫颈鳞状细胞癌的一个潜在生物标志物 (Guoet al.，2015a)。
KLHL基因负责几种门德尔疾病并与癌症相关(Dhanoa et al.，2013)。
在源自指甲基质角质的侵袭性指甲细胞癌中观察到KRT31局灶性表达(Wang etal.， 2015e)。毛母质瘤是模拟毛囊基质细胞分化的肿瘤，显示出皮质分化，顺序性过度表达 KRT35和KRT31角蛋白(Battistella et al.，2014)。
KRT35是毛母质瘤中最常和最强烈表达的毛发角蛋白中的一个。毛母质瘤是模拟毛囊基质细胞分化的肿瘤，显示出皮质分化，顺序性过度表达KRT35和KRT31角蛋白(Battistella et al.，2014)。
LCTL的敲减使hTERT稳定人结肠上皮细胞(Kim et al.，2011)。
研究人员观察到，通过RNA干扰或通过显性负突变体抑制LRBA表达导致癌细胞 的生长抑制。这些发现提示，LRBA表达失调促进癌细胞生长特性的改变(Wang et al.，2004)。
与正常样本相比，LRRC8E在骨肉瘤和神经母细胞瘤组织中过度表达(Orentas etal.， 2012)。
LTA多态性导致癌症风险增加(Huang et al.，2013a)。如LTA等骨吸收因子由某些实体和血液癌产生，也与肿瘤诱导超钙血症相关(Goni and Tolis，1993)。LTA至LtbetaR信号轴和癌症之间存在关联(Drutskaya et al.，2010)。B细胞衍生的淋巴毒素促成去势抗性前列腺癌(Ammirante et al.，2010)。
MACC1在许多癌症实体中，包括胃癌、结直肠癌、肺癌和乳腺癌中过度表达，并 与癌症的进展、转移和患者生存期差有关(Huang et al.，2013b；Ma et al.，2013a；Stein，2013； Wang et al.，2015b；Wang et al.，2015h；Ilm et al.，2015)。MACC1通过靶向作用于β-连环 蛋白和PI3K/AKT信号通路促进致癌作用，从而导致增加c-Met和β-连环蛋白和其下游 靶基因包括c-Myc、细胞周期蛋白D1、胱天蛋白酶9、BAD和MMP9(Zhen et al.，2014；Yao et al.，2015)。
MAGEA10编码MAGE家族成员A10，其牵涉某些遗传性疾病，如先天性角化不 良(RefSeq，2002)。通过针对MAGEA10的疫苗和另外两种癌症-睾丸抗原(所有这些都 是已知的细胞毒性T淋巴细胞应答靶标)，将涵盖三分之二以上的乳腺癌(Taylor et al.， 2007)。MAGEA10在36.7％的肝细胞癌患者肿瘤组织中表达，但是在癌旁组织中不表 达(Chen etal.，2003)。在79种肺癌组织中，MAGEA10表达于14％的这些组织中(Kim et al.，2012)。
MAGEB6被确定为在正常组织(睾丸除外)中不表达而在不同组织学来源的肿瘤 中表达的新MAGE基因(Lucas et al.，2000)。MAGEB6被发现在头颈部鳞状细胞癌中频 繁表达，mRNA阳性表现出与不良结局公认的临床特点显著相关(Zamuner et al.，2015) 。
MCC与β-连环蛋白相互作用，MCC在结肠癌细胞重新表达特异性抑制Wnt信号(Fukuyama et al.，2008)。MCC基因与5号染色体上的腺瘤性结肠息肉病基因密切联系， 5号染色体是结直肠癌中杂合性(LOH)频繁缺失的区域(Kohonen-Corish et al.，2007)。MCC基因的LOH可在早期和晚期阶段的胃癌、肺癌、食管癌和乳腺癌中找到(Wang et al.，1999a；Medeiros et al.，1994)。
MET被证明在去分化脂肪肉瘤中上调，并且与黑素细胞瘤、肝细胞癌、非小细胞 肺癌、遗传性乳头状肾癌和胃腺癌相关(Petrini，2015；Finocchiaro et al.，2015；Steinwayet al.，2015；Bill et al.，2015；Yeh et al.，2015)。
MMP10在口腔鳞状细胞癌中表达密集，在疣状癌中表达中度(Kadeh et al.，2015)。MMP10有助于肝癌形成，与基质衍生因子1/C-X-C趋化因子受体4轴产生新的串扰(Garcia-Irigoyen et al.，2015)。幽门螺杆菌感染通过增加MMP10的表达提升胃癌的侵袭性和转移(Jiang et al.，2014a)。MMP10通过宫颈肿瘤血管生成和细胞凋亡途径的调节促进肿瘤进展(Zhang et al.，2014)。
术前MMP-13升高被发现与食管鳞状细胞癌患者的肿瘤进展和较差预后差相关(Jiao et al.，2014)。PAI-1(miR-143靶基因)通过增强人骨肉瘤细胞中的MMP-13表达 和分泌调节侵袭性和肺转移，这表明这些分子可能是预防骨肉瘤患者肺转移的潜在治疗 靶基因(Hirahata et al.，2016)。MMP13在口腔扁平苔藓(OLP)中上调，OLP被归类为口 腔鳞状细胞癌(OSCC)的癌前疾病(Agha-Hosseini and Mirzaii-Dizgah，2015)。MMP-13在 成骨细胞样细胞再生中可能发挥独特的生理作用(Ozeki et al.，2016)。
MUC5AC在多种癌症类型(包括结直肠癌、胃癌、肺癌和胰腺癌)中失调。结直 肠癌和胃癌中表达损耗或低表达与更侵袭性的行为和较差预后相关。在肺癌中过度表达 导致复发和转移的可能性增加(Yonezawa et al.，1999；Kocer et al.，2002；Kim et al.，2014b； Yu et al.，1996)。
MUC5B在不同癌症实体(包括结直肠癌、肺癌和乳腺癌中)过度表达，并与肿瘤 进展相关(Sonora et al.，2006；Valque et al.，2012；Walsh et al.，2013；Nagashio etal.，2015) 。MUC5B可在甲基化的影响下被抑制，并且由ATF-1、c-Myc、NFκB、Sp1、CREB 、TTF-11和GCR调节(Perrais et al.，2001；Van，I et al.，2000)。
根据报告，MUC6基因变异可改变胃癌发生的风险(Resende et al.，2011)。在涎腺肿 瘤中，MUC6的表达方式似乎与组织病理学肿瘤类型非常密切相关，提示他们可用于提高诊断的准确性(Mahomed，2011)。研究发现，与非肿瘤乳腺组织相比，MUC6在乳腺 癌组织中差异表达(Mukhopadhyay et al.，2011)。
一项中国的研究确定MXRA5为非小细胞肺癌中第二最常见的突变基因(Xiong etal.，2012)。在结肠癌中，MXRA5被证明过度表达，并可能作为早期诊断和网膜转移的 生物标志物(Zou et al.，2002；Wang et al.，2013a)。
MYB可通过几种突变被转换为致癌转化蛋白(Zhou and Ness，2011)。MYB被称为致癌基因，并通过调节关键靶基因(如，环氧合酶-2、Bcl-2、BclX(L)和c-Myc)的表 达与细胞凋亡、细胞周期控制、细胞生长/血管生成和细胞黏附相关(Ramsay et al.，2003；Stenman et al.，2010)。致癌融合蛋白MYB-NFIB和MYB过度表达发现于唾液腺腺样囊 性癌以及乳腺癌、儿童弥散胶质瘤、急性髓细胞性白血病和胰腺癌(Wallrapp etal.，1999；Pattabiraman and Gonda，2013；Nobusawa et al.，2014；Chae et al.，2015；Marchio etal.，2010) 。通过Wnt信号传导期间MYB和β-连环蛋白之间的协同作用，MYB与结肠肿瘤发生有关(Burgess et al.，2011)。由于MYB是雌激素信号的直接靶标，因此考虑抗MYB疗 法来治疗ER阳性乳腺癌(Gonda et al.，2008)。
N4BP2在鼻咽癌的发生中发挥潜在作用。与散发鼻咽癌风险相关的两个不同的单倍型区段存在统计学相关差异。此外，相对于相应正常组织，N4BP2在这些肿瘤组织 中过度表达(Zheng et al.，2007)。
在12518名前列腺癌病例的多期别单纯病例全基因组关联研究中，NAALADL2被 确定为与Gleason评分(疾病侵袭性病理学指标)相关的基因座(Berndt et al.，2015)。NAALADL2在前列腺癌和结肠癌中过度表达，并促进与不良生存相关的迁移前和转移 前表型(Whitaker et al.，2014)。
NCAPG在多发性骨髓瘤、急性骨髓性白血病患者中以及来自血液的白血病细胞或骨髓瘤细胞中下调(Cohen et al.，2014)。NCAPG可能是结直肠癌的多重抗药性基因(Li etal.，2012a)。NCAPG在嫌色亚型人类细胞癌中高度上调，但在常规人类肾细胞癌中不是 这样(Kim et al.，2010a)。NCAPG上调与黑色素瘤进展相关(Ryu et al.，2007)。NCAPG与 葡萄膜黑色素瘤相关相关(Van Ginkel et al.，1998)。NCAPG在不同肿瘤细胞中表现出不 同表达(Jager et al.，2000)。
NRK编码Nik相关激酶，这是可能参与后期胚胎形成中肌动蛋白聚合诱导的JNK 激活所需要的蛋白激酶(RefSeq，2002)。NRK激活c-Jun N-末端激酶信号传导途径，可 能通过丝切蛋白磷酸化参与骨骼肌细胞中肌动蛋白细胞骨架组织的调控(Nakano et al.，2003)。
NUP210被证明是携带结直肠癌风险相关多态性的候选基因(Landi et al.，2012)。 NUP210被证明在宫颈癌中上调，提示在肿瘤发生的早期阶段发挥作用(Rajkumaret al.， 2011)。
ORC1被证明在肿瘤衍生细胞系中过度表达，被预测为前列腺癌以及白血病的生物标志物(Struyf et al.，2003；Zimmerman et al.，2013；Young et al.，2014)。通过与组蛋白乙 酰转移酶(如HBO1)相互作用，ORC1在乳腺癌中发挥致癌功能(Wang et al.，2010) 。
OSCP1中两个SNP杂合突变的非载体可能是非病毒性肝脏癌敏感性的生物标志物(Toda et al.，2014)。
OVOL2诱导导致转移减少的间充质上皮转化(Roca et al.，2013)。OVOL2抑制 c-Myc和Notch1(Wells et al.，2009)。OVOL2在结直肠癌中超甲基化，导致其不能抑制 Wnt信令(Ye et al.，2016)。OVOL2过度表达降低细胞迁移和侵袭型，减少上皮-间质转 化标志物并抑制转移(Ye et al.，2016)。OVOL2在结直肠癌中下调，与肿瘤分期呈负相 关(Ye etal.，2016)。OVOL2由Wnt信号通路调控(Ye et al.，2016)。
OXTR在原发性小肠和胰腺神经内分泌肿瘤、肺小细胞癌、卵巢癌以及前列腺癌中显著过度表达，介导细胞迁移和转移(Morita et al.，2004；Zhong et al.，2010；Carr etal.， 2012；Carr et al.，2013；Pequeux et al.，2002)。但是，OXTR1还具有对上皮、神经或骨来 源的肿瘤细胞增殖的抑制作用，这被认为依赖于膜上的受体定位(Cassoni et al.，2004)。
PAPPA表示转移相关基因，发生于广泛的癌症类型，如NSCLC和肝细胞癌，这与 生长(VEGF和IGF-I)和转录因子(NF-κB p50、NF-κB p65、HIF-1α)正相关(Salim et al.，2013；Iunusova et al.，2013；Engelmann et al.，2015)。PAPPA通过调节乳腺癌和卵巢癌细胞的IGF-1信号通路调控有丝分裂进程，它主要发现于原发位置(Boldt and Conover，2011；Loddo et al.，2014；Becker et al.，2015；Iunusova et al.，2014)。
PGAP1在腺癌细胞系AsPC-1中下调(Yang et al.，2016)。
PGR与乳腺癌发生和发展高度相关，其激活MAPK和PI3K/AKT通路以及生长因 子受体(GFR)的表达(Jaiswal et al.，2014；Piasecka et al.，2015)。PGR(除了HER和雌激 素受体)充当一种分类因子，帮助区分乳腺癌的三种不同亚型(Safarpour and Tavassoli，2015)。
PLA2G7对乳腺癌、卵巢癌、黑色素瘤和前列腺癌细胞的脂质代谢有强烈影响，其中酶堵塞导致癌症致病性受损(Vainio et al.，2011a；Massoner et al.，2013；Kohnz etal.， 2015)。PLA2G7与前列腺癌高度相关，因此代表此类癌症的潜在生物标志物(Vainioet al.， 2011b)。
PPP3R1在影响多达10个不同信号通路的肝细胞癌细胞中上调(Zekri et al.，2008) 。
PRKDC是子宫内膜异位症相关卵巢癌和乳腺癌中常见的突变基因(Er et al.，2016； Wheler et al.，2015)。在结直肠癌中，与正常组织相比，PRKDC在癌组织中上调。PRKDC 高表达的患者表现出较差的总生存期(Sun et al.，2016)。
PSMA7T上调表达发现于转移性肺癌、去势后复发前列腺癌(CRPC)以及原发性结直肠癌中，其增加肝脏转移的风险(Hu et al.，2008；Hu et al.，2009；Romanuik et al.，2010； Cai et al.，2010)。PSMA7T数量还被证明与雄激素/AR介导的前列腺肿瘤生长中雄激素 受体(AR)反式激活相关(Ogiso et al.，2002)。
据证明，PSMC1能够影响细胞生长，因此代表前列腺癌、多发性骨髓瘤和成胶质 细胞瘤细胞中的潜在抗癌靶标(Dahlman et al.，2012；Kim et al.，2008)。
RAD18由于其在DNA损伤旁路、复制后修复和同源重组中众所周知的作用而牵涉肿瘤生成(Ting et al.，2010)。RAD18 Arg302Gln多态性与结直肠癌和非小细胞肺癌的风险相关(Kanzaki et al.，2008；Kanzaki et al.，2007)。RAD18介导对人脑胶质瘤细胞中电离 辐射的抗性，RAD18敲减破坏同源重组介导的修复，导致双链断裂积累增加(Xie etal.， 2014)。黑色素瘤组织微数组表明，与发育不良痣相比，核RAD18表达在原发性和转移性黑色素瘤中上调(Wong et al.，2012)。
RAD51AP1被证明与放射暴露乳头状甲状腺癌相关(Handkiewicz-Junak et al.，2016) 。RAD51AP1扩增被证明与卵巢癌的细胞永生性和较短生存时间相关(Sankaranarayanan et al.，2015)。RAD51AP1被描述通常在肿瘤细胞和组织中过度表达，RAD51AP1功能的 破坏表明是肿瘤靶向治疗一种有前景的方法(Parplys et al.，2014)。RAD51AP1转录被证 明由抑癌因子MEN1直接刺激(Fang et al.，2013)。RAD51AP1被证明在肝内胆管癌、头 颈部人乳头状瘤病毒阳性鳞状细胞癌以及相较于散发性乳腺肿瘤在BRCA1缺陷乳腺 肿瘤中上调(Martinez et al.，2007；Martin et al.，2007；Obama et al.，2008)。RAD51AP1抑 制被证明可导致肝内胆管癌细胞生长抑制，这表明其参与肝内胆管癌的发展和/或进展 (Obama et al.，2008)。
RBM14敲减被证明可阻断体内照射后多形性胶质母细胞瘤再生长(Yuan et al.，2014)。RBM14被证明在肾细胞癌中下调(Kang et al.，2008)。RBM14被描述为肾癌的一 个潜在肿瘤抑制因子，其抑制人肾细胞G(1)-S过渡，并通过下调原癌基因c-myc抑制 锚定非依赖性生长和部分抑制异种移植物肿瘤形成(Kang et al.，2008)。RBM14被证明 参与PEA3和MCF7人类癌细胞的迁移增强作用(Verreman et al.，2011)。RBM14基因被 证明在子集原发性人类癌症(包括非小细胞肺癌、鳞状细胞皮肤癌和淋巴瘤)中扩增(Sui et al.，2007)。
RBM4参与前体信使RNA的调控剪接机制，抑制各种癌细胞的增殖和迁移(Lin etal.，2014；Wang et al.，2014c)。BBM4活性的失调发现于宫颈癌、乳腺癌、肺癌、结肠癌 、卵巢癌和直肠癌(Liang et al.，2015；Markus et al.，2016)。
肝癌患者血清RCOR3水平显著低于中度慢性B型肝炎、轻度慢性B型肝炎患者 (Xueet al.，2011)。
RFWD2下调与胃癌不良预后相关(Sawada et al.，2013)。RFWD2直接与p27相互作用，该相互作用的失调参与肿瘤发生(Choi et al.，2015b；Choi et al.，2015a；Marine，2012) 。RFWD2上调与膀胱癌、胃癌和三阴性乳腺癌不良预后相关(Ouyang et al.，2015；Liet al.， 2016；Li et al.，2012c)。
RIF1在人乳腺肿瘤中高度表达，编码DNA修复所需的抗凋亡因子，是癌症治疗的潜在靶标(Wang et al.，2009a)。RIF1在维持基因组稳定性的作用已经扩大到包括染色质结构、复制时间和S期内检查点的调节(Kumar and Cheok，2014)。
在诊断有内脏多中心婴儿肌纤维瘤病的患者中，发现有RLTPR基因的新纯合变体(Linhares et al.，2014)。
RNF24被证明在食管腺癌中上调，在Barrett食管进展为食管腺癌中起着关键作用(Wang et al.，2014b)。RNF24被证明根据某些风险因素在口腔鳞状细胞癌中差异表达(Cheong et al.，2009)。
RPGRIP1L部分通过有丝分裂步骤蛋白Mad2抑制锚定非依赖性生长，并且是人肝细胞癌的候选肿瘤抑制基因(Lin et al.，2009)。
Rtl1在成年小鼠肝脏中过度表达导致高度渗透肿瘤形成，在30％分析的人肝细胞癌样本中检测到RTL1过度表达(Riordan et al.，2013)。印迹基因RTL1的转录活性在一 组32个Wilms细胞瘤中进行了评估，与正常肾组织相比检测到大量的过度表达 (Hubertus etal.，2011)。
SAPCD2(也称为p42.3或C9orf140)编码最初发现表达于胃癌但不表达于正常胃黏膜的蛋白(Xu et al.，2007)。SAPCD2在不同癌症实体(包括结直肠癌、胃癌、肝细胞 癌和脑癌)中过度表达，SAPCD2高水平与肿瘤进展相关(Sun et al.，2013；Weng et al.， 2014；Wan et al.，2014)。在胃癌蛋白调控网络中SAPCD2基因的最佳途径是Ras蛋、Raf-1 蛋白、MEK、MAPK激酶、MAPK、微管蛋白、纺锤体蛋白、着丝粒蛋白和肿瘤(Zhang et al.，2012a；Weng et al.，2014)。
SEMA3A较低表达被证明与较短的总生存期相关，并在头颈部鳞状细胞癌患者具有独立预后重要性(Wang et al.，2016)。SEMA3A过度表达被证明可抑制迁移、侵袭和 上皮至间质转变，部分原因是头颈部鳞状细胞癌细胞系中NF-κB和SNAI2的抑制 (Wang et al.，2016)。因此，SEMA3A充当头颈部鳞状细胞癌的肿瘤抑制因子，可能是治 疗这种疾病的新靶标(Wang et al.，2016)。SEMA3A表达被证明与肝细胞癌的转移显著 负相关(Yan-Chun etal.，2015)。SEMA3A被描述为在许多类型癌症(包括前列腺癌、乳 腺癌、神经胶质瘤、卵巢癌和胃癌)中下调(Jiang et al.，2015a；Tang et al.，2014)。SEMA3A 低表达被证明与胃癌的低分化、血管浸润、浸润深度、淋巴结转移、远处转移、高级别 TNM分期及预后不良相关(Tang et al.，2014)。SEMA3A被描述为胃癌发生中的候选肿 瘤抑制因子和潜在预后生物标志物(Tang et al.，2014)。
SERPINB10基因的错义变异被证明具有致瘤性特征，导致前列腺癌风险增加(Shioji et al.，2005)。此外，SERPINB10表达在转移性乳腺肿瘤中显著上调(Klopfleischet al.，2010)。
SLC16A14表达水平与无进展生存显著相关，并提出了上皮性卵巢癌进展的一个新型推定标志物(Elsnerova et al.，2016)。
SLC18A1在预后不良的神经母细胞瘤肿瘤类型中相较于预后良好者表达降低(Wilzen et al.，2009)。
SLC25A43被确定为通过乳腺癌细胞系中推定的线粒体检查点作为细胞周期进程和细胞增殖的调节因子(Gabrielson et al.，2016)。SLC25A43影响乳腺癌细胞系药物暴露后的药物疗效和细胞周期调控(Gabrielson and Tina，2013)。
SLC28A3被证明在胰腺导管腺癌下调(Mohelnikova-Duchonova et al.，2013)。SLC28A3与接受紫杉醇和吉西他滨化疗的转移性乳腺癌临床结果、吉西他滨治疗的非 小细胞肺癌总体生存、基于吉西他滨化放疗的胰腺癌的总体生存相关(Li et al.，2012b； Leeet al.，2014b；Marechal et al.，2009)。SLC28A3与慢性淋巴细胞性白血病的氟达拉滨 抗性以及T细胞白血病的耐药性相关(Karim et al.，2011；Fernandez-Calotti et al.，2012)。
SLC2A13在口腔鳞状细胞癌样本原代培养物球形成细胞中持续增加，共焦显微镜检查显示，SLC2A13表达细胞在肿瘤组织局限区域包埋为群集，提示，SLC2A13可能 是癌症干细胞的一个潜在标志物(Lee et al.，2011)。SLC2A13被确定为与非小细胞肺癌 促进和进展有关的基因(Bankovic et al.，2010)。
SLC35A1抑制被证明可减少癌细胞唾液酸化，降低癌细胞的转移可能性(Maggioniet al.，2014)。
SLC7A11被证明是在W1卵巢癌细胞系的耐药变种中下调，从而可能在癌细胞药 物抗性中发挥作用(Januchowski et al.，2013)。SLC7A11被描述为可调节肿瘤微环境，导 致癌症生长优势(Savaskan and Eyupoglu，2010)。SLC7A11被描述为参与胶质瘤的神经 变性过程(Savaskan et al.，2015)。SLC7A11被证明在铁死亡的情况下通过p53抑制， p53-SLC7A11轴被描述为保留于p53(3KR)突变体，并有助于其在不存在经典肿瘤抑制 机制时抑制肿瘤发生(Jiang et al.，2015b)。SLC7A11被描述为系统Xc-的功能性亚基， 其功能在侵袭性乳腺癌细胞中增加(Linher-Melville et al.，2015)。顺铂耐药性膀胱癌中 SLC7A11高膜染色被证明与较差的临床结果相关，并且SLC7A11抑制被描述为本病一 种有前景的治疗方法(Drayton et al.，2014)。SLC7A11被证明在已被暴露于苯和其代谢 物的人早幼粒白血病细胞系HL-60中差异表达，因而强调了SLC7A11与白血病发生的 潜在关联性(Sarmaet al.，2011)。SLC7A11破坏被描述为可导致多种癌症(包括淋巴瘤 、神经胶质瘤、前列腺癌和乳腺癌)的生长抑制(Chen et al.，2009)。SLC7A11抑制被证 明可在体外抑制食管癌细胞系KYSE150的细胞浸润和裸鼠的实验性转移，从而确立了 SLC7A11在肿瘤转移中的作用(Chen et al.，2009)。
SLCO5A1位于质膜，并且可通过影响药物的胞内运输有助于小细胞肺癌的化疗(Olszewski-Hamilton et al.，2011)。SLCO5A1是转移性小细胞肺癌最突出的有机阴离子转运多肽，SLCO5A1的mRNA水平在肝肿瘤和乳腺癌中高度增加(Kindla et al.，2011；Wlcek et al.，2011；Brenner et al.，2015)。口咽鳞状细胞癌的基因融合与SLCO5A1下调相 关(Guo et al.，2016)。
SP5在结直肠癌细胞系β-连环蛋白耗尽后下调，是Wnt信号通路中一种新的直接下游靶标(Takahashi et al.，2005)。SP5过度表达证实了罕见人类胰腺肿瘤β-连环蛋白通路的激活(Cavard et al.，2009)。在显示去调节Wnt信号传导的人结直肠癌细胞中，莫能菌素减少β连环蛋白的细胞内水平，导致Wnt信号靶基因(如SP5)表达减少和增殖速 率降低(Tumova et al.，2014)。
STIL属于在15种皮质醇分泌肾上腺皮质腺瘤中拷贝数变化和杂合性复制中性损失的基因(Ronchi et al.，2012)。融合此基因和相邻基因座的染色体缺失通常发生于T细胞白血病，被认为通过非法的V-(D)-J重组事件产生(Karrman et al.，2009；Alonso etal.， 2012)。
TBC1D7表达升高发现于大多数肺癌，免疫组织化学染色表明TBC1D7表达与 NSCLC患者的不良预后相关(Sato et al.，2010)。TBC7过度表达增强TSC1的泛素化， 并通过位于mTOR信号传导途径的S6激酶增加S6蛋白的磷酸化(Nakashima et al.， 2007)。
TDG经由与转录因子TCF4交互影响以上调方式影响Wnt信号通路，并且被认为 是结直肠癌的潜在生物标志物(Xu et al.，2014)。另一方面，TDG的表达降低导致碱基 切除修复(BER)途径受损且具有较强的致癌特性(van de Klundert et al.，2012)。在早期 乳腺癌、食管鳞状细胞癌(ESCC)以及胃癌中观察到了该蛋白质的下调(Li et al.，2013； Duet al.，2015；Yang et al.，2015a)。
在四个最频繁突变的基因中，TENM4在原发性CNS淋巴瘤中表现出蛋白改变性突变(Vater et al.，2015)。MDA-MB-175细胞系含有一个染色体易位，导致TENM4和ErbB 家族受体融合。在神经母细胞瘤中也发现嵌合基因(Wang et al.，1999b；Boeva et al.，2013)。
TET2是造血干细胞稳态的关键调节因子，其功能障碍导致血液恶性肿瘤(Nakajima and Kunimoto，2014)。TET2突变对预后产生不良影响，并可能有助于证明急性髓细胞 白血病患者风险适应治疗策略的合理性(Liu et al.，2014b)。TET2的核定位在结直肠癌组 织的一个重要部分丢失，与转移相关(Huang et al.，2016)。
TKTL1与多种肿瘤类型的发展和进展有关，诸如食管鳞状细胞癌、口腔鳞状细胞癌、肺癌、结直肠癌和非小细胞肺癌(Kayser et al.，2011；Bentz et al.，2013；Grimm etal.， 2014)。
TMEM67在中心粒迁移至项膜和初级纤毛形成中发挥作用。此基因的缺陷是梅克尔症候群3型(MKS3)和茹贝尔症候群6型(JBTS6)的原因(RefSeq，2002)。TMEM67参 与纤毛形成，有缺陷的纤毛可能导致眼部缺损、舌瘤、髓母细胞瘤(Yang et al.，2015b； Parisi，2009)。
TONSL通过稳定致癌蛋白MMS22L参与肺癌和食管癌形成(Nguyen et al.，2012)。TONSL和BRCA1之间显示出进一步的相互作用，其作为乳腺癌和卵巢肿瘤的一个抑 制基因(Hill et al.，2014)。
TP63易位被描述为间变性淋巴瘤激酶阳性间变性大细胞淋巴瘤子集中的一个事件， 其与疾病的侵袭过程相关(Hapgood and Savage，2015)。TP63被描为由于其参与上皮细 胞分化、细胞周期停滞和细胞凋亡而在癌症中发挥复杂的作用(Lin et al.，2015)。TP63异 构体TAp63被描述为在恶性血液病中过度表达，而TP63错义突变报告发生于淋巴瘤和 一些肺腺癌中的鳞状癌和TP63易位处(Orzol et al.，2015)。导致TP63异构体δNp63过度表达的异常剪接在人类癌症(如，皮肤鳞状细胞癌)中经常发现，其很可能有利于肿 瘤发生和发展(Missero and Antonini，2014；Inoue and Fry，2014)。
TRIM59通过上调细胞周期蛋白促进非小细胞肺癌细胞的增殖和迁移(Zhan etal.， 2015)。与非肿瘤组织相比，推定的泛素连接酶TRIM59在胃癌中上调，TRIM59水平与肿瘤进展和患者存活时间相关。TRIM59与P53相互作用，促进其泛素化和降解， TRIM59可能通过此机制促进胃癌形成(Zhou et al.，2014)。
TRPC4被发现在肺癌、卵巢癌、头颈癌、肾癌和非小细胞肺癌中上调(Zhang etal.， 2010b；Zeng et al.，2013a；Jiang et al.，2013；Park et al.，2016)。
ULBP3在许多肿瘤细胞中表达为可溶性和膜结合异构体。相比成人原始细胞，小儿急性淋巴细胞白血病原始细胞表达显著更高水平的ULBP3(Torelli et al.，2014)。相比于其他白血病细胞系，发现在白血病细胞系K562中ULBP3表达水平高得多。此外， 它可能存在于白血病细胞系和原发性恶性白血病细胞中(Ma et al.，2013b)。ULBP3基因 座在结肠癌细胞系中甲基化(Bormann et al.，2011)。在人肺癌细胞系SW-900中检测到 mRNA水平和ULBP3表面表达水平增加(Park et al.，2011)。ULBP3在白血病细胞中呈 更高的表面表达(Ogbomo et al.，2008)。不同肿瘤细胞系的ULBP3水平与NK细胞细胞 毒性相关，但是，ULBP3似乎不适合作为生物标志物(Wang et al.，2008；Linkov et al.， 2009)。人鼻咽癌细胞系CNE2中不表达ULBP3(Mei et al.，2007)。ULBP3在卵巢癌中 表达，与患者存活呈负相关(Carlsten et al.，2007；McGilvray et al.，2010)。B细胞在非霍 奇金淋巴瘤中表达ULBP3，也可在外周血、骨髓或淋巴结中发现(Catellani et al.，2007) 。ULBP3在乳腺癌、胶质母细胞瘤细胞系U251、人脑肿瘤、头颈部鳞状细胞癌中表达 (Eisele et al.，2006；Butler et al.，2009；Bryant et al.，2011；de Kruijf et al.，2012)。肿瘤细胞 表达可溶性和表面ULBP3以调节NK细胞活性(Mou et al.，2014)。在某些上皮肿瘤中 ULBP3过度表达。此外，与健康供体相比，ULBP3水平在癌症患者血清中升高(Mou et al.，2014)。
VPS13B等位基因在小细胞肺癌中突变(Iwakawa et al.，2015)。在胃癌和结直肠癌中 观察到VPS13B突变(An et al.，2012)。
在微卫星不稳定性胃癌和结直肠癌中发现VPS13C移码突变(An et al.，2012)。
WDR62表达在胃癌组织和细胞系中显著上升，并与分化程度和预后相关。此外，WDR62表达在多药耐药细胞中升高(Zeng et al.，2013b)。WDR62过度表达与中心体扩 增相关，可能是卵巢癌一种新的有用分化生物标志物和潜在治疗靶标(Zhang et al.， 2013b)。
外来体结合WDR92通过降解双调蛋白mRNA抑制乳腺癌细胞侵袭(Saeki et al.，2013)。WDR92增强肿瘤坏死因子-α和放线菌酮诱导的细胞凋亡(Ni et al.，2009)。
WNT5A属于WNT基因家族，由编码分泌信号蛋白且结构上相关的基因组成。这 些蛋白质涉及肿瘤发生和几个发育过程，包括胚胎发育过程中细胞命运和模式的调节。 WNT5A基因编码WNT家族的一员，其通过经典和非经典WNT途径传导信号。这种 蛋白是7跨膜受体卷曲型5和酪氨酸激酶孤儿受体2的配体。该蛋白在胚胎发育过程中 对调节发育途径起着重要作用。这种蛋白质也在癌形成中发挥作用(RefSeq，2002)。 WNT5A在CRC中过度表达，与原发肿瘤和转移部位之间具有76％的一致率(Lee et al.， 2014a)。在人胃癌细胞、鼻咽癌和胰腺癌中，WNT5A上调并且是上皮-间质转化和转移 的关键调节因子(Kanzawa et al.，2013；Zhu et al.，2014；Bo et al.，2013)。
XRN1可能参与星形胶质细胞和星形细胞瘤细胞中的一些调节性mRNA通路 (Moseret al.，2007)。XRN1敲减抑制前列腺癌细胞的雄激素受体表达，并在前列腺腺癌 的miR-204/XRN1轴中起重要作用(Ding et al.，2015)。
全基因组关联研究确定了XXYLT1的基因多态性。研究提出，这些多态性是非小 细胞肺癌发展的易感性基因座(Zhang et al.，2012b)。
ZBTB20通过FoxO1抑制促进非小细胞肺癌的细胞增殖(Zhao et al.，2014b)。ZBTB20表达在肝细胞癌中增加，与不良预后相关(Wang et al.，2011c)。ZBTB20基因多 态性与胃癌有关(Song et al.，2013)。
ZFHX4被认为可调节细胞分化，其抑制与无胶质瘤生存期相关(Chudnovsky etal.， 2014)。松果体区乳头状瘤显示ZFHX4高表达水平(Fevre-Montange et al.，2006)。ZFHX4 被发现是基底细胞癌易感基因(Stacey et al.，2015)。
ZMYM1是ZNF131的主要相互作用因子，其在雌激素信号和乳腺癌细胞增殖中发 挥作用(Oh and Chung，2012；Kim et al.，2016)。
具体实施方式
是否能刺激免疫反应取决于是否存在被宿主免疫系统视为异物的抗原。发现肿瘤相 关抗原的存在增加了运用宿主免疫系统干预肿瘤生长的可能性。目前，针对癌症免疫治疗，正在探索利用免疫系统的体液和细胞进行免疫的各种机制。
细胞免疫反应的特定元素能特异性地识别和破坏肿瘤细胞。从肿瘤浸润细胞群或外 周血中分离出的T-细胞表明，这些细胞在癌症的天然免疫防御中发挥了重要作用。特别是CD8阳性T细胞在这种反应中发挥重要作用，TCD8+能识别通常8至10个源自蛋 白或位于细胞质的缺损核糖体产物(DRIP)的氨基酸残基的主要组织兼容性复合体 (MHC)所载的肽中所含的I类分子。人MHC分子也称为人白细胞-抗原(HLA)。
除非另有说明，否则本文使用的所有术语定义如下。
术语”T细胞反应”应指由一种肽在体外或体内诱导的效应子功能的特异性扩散和激活。对于MHC I类限制性细胞毒性T细胞，效应子功能可能为溶解肽脉冲的、肽前 体脉冲的或天然肽提呈的靶细胞、分泌细胞因子，优选为肽诱导的干扰素-γ，TNF-α或 IL-2，分泌效应分子，优选为肽诱导的颗粒酶或穿孔素，或脱颗粒。
本文所用”肽”这一术语，系指一系列氨基酸残基，通常通过相邻氨基酸的α-氨基和 羰基之间的肽键来连接。这些肽的长度优选为9个氨基酸，但至短可为8个氨基酸长度，至长可为10、11、12、13或14个氨基酸或更长，如果为MHC-II类肽时(本发明肽的 拉长变体)，至长可为15、16、17、18、19或20个氨基酸长度或更长。
因此，”肽”这一术语应包括一系列氨基酸残基的盐，通常通过相邻氨基酸的α-氨基 和羰基之间的肽键来连接。优选的情况是，盐为肽的药用盐，例如：氯化物或乙酸(三 氟乙酸)盐。必须注意的是，本发明肽的盐与其体内状态的肽基本上不同，因为该不是 体内的盐。
术语“肽“应也包括“寡肽“。本文使用的术语”寡肽”是指一系列氨基酸残基，通常通 过相邻氨基酸的α-氨基和羰基之间的肽键来连接。寡肽的长度对于本发明来说并不十分 关键，只要在寡肽中保持正确的表位即可。通常，寡肽长度约小于30个氨基酸残基， 约长于15个氨基酸。
“多肽”这一术语是指一系列氨基酸残基，通常通过相邻氨基酸的α-氨基和羰基之间 的肽键来连接。多肽的长度对于本发明来说并不十分关键，只要保持正确的表位即可。与术语肽或寡肽相对，“多肽”这一术语是指包含多于约30个氨基酸残基的分子。
一种肽、寡肽、蛋白质或编码该分子的核苷酸如果能诱导免疫反应，则具有”免疫原性”(因此是本发明中的一种”免疫原”)。在本发明的情况下，免疫原性的更具体定 义是诱导T细胞反应的能力。因此，”免疫原”是一种能够诱导免疫反应的分子，并且在 本发明的情况下，是一种能诱导T细胞反应的分子。在另一方面，所述免疫原可以是肽， 肽与MHC的复合体、和/或用于提高特异性抗体或TCR抗性的蛋白。
I类T细胞”表位”要求的是一种结合至MHC I类受体上的短肽，从而形成一种三元复合体(MHC I类α链、β-2-微球蛋白和肽)，其可以通过T细胞负载匹配T细胞受体 与具有适当亲和力的MHC/肽复合物结合来识别。结合至MHC I类分子的肽的典型长 度为8-14个氨基酸，最典型为9个氨基酸长度。
在人类中，有三种编码MHC I类分子的不同基因位点(人MHC分子也是指定的人 白细胞抗原(HLA))：HLA-A、HLA-B和HLA-C。HLA-A*01、HLA-A*02和HLA-B*07 是可从这些基因位点表达的不同MHC I类等位基因的实例。
表4：HLA-A*02和HLA-A*24和最常见HLA-DR血清类型的表达频率F。频率根据 Mori等人(Mori et al.，1997)使用的Hardy-Weinberg公式F＝1-(1-Gf)2改编，从美国人 群范围内的单体型频率中推导出。由于连锁不平衡，某些HLA-DR等位基因内的A*02 或A*24组合与其预期单一频率相比，可能是浓缩的或频率较低。有关详细信息，请参 阅Chanock等人的文献(Chanock et al.，2004)。
Figure BDA0001584383410000511
Figure BDA0001584383410000521
本发明的肽，优选当如本文描述纳入本发明的疫苗时优选与所指定的A*02、A*24或II类等位基因结合。疫苗还可能包括泛结合MHC II类肽。因此，本发明的疫苗可用 于治疗A*02阳性患者中的癌症，但不因为这些肽的广泛结核性而必须选择II类MHC 同种异型。
如果本发明的A*02肽与结合至另一等位基因例如A*24的肽组合，与单独的MHC I类等位基因相比，可治疗更高比例的患者群体。虽然在大多数人群中，低于50％的患 者可由单独的等位基因来解决问题，但是本发明中一种含HLA-A*24和HLA-A*02表 位的疫苗可以治疗任何相关人群中至少60％的患者。具体来说，各区域中，以下比例 的患者这些等位基因中的至少一个有肯定效果：美国61％、西欧62％、中国75％、韩 国77％、日本86％(根据www.allelefrequencies.net计算)。
在一项优选的实施方案中，术语”核苷酸序列”系指脱氧核苷酸的杂聚物。
编码特定肽、寡肽或多肽的核苷酸序列可为天然核苷酸序列，也可为合成核苷酸序 列。一般来说，编码肽、多肽以及本发明蛋白的DNA片段由cDNA片段和短寡核苷酸 衔接物，或一系列寡核苷酸组成，以提供一种合成基因，该基因能够在包含源自微生物 或病毒操纵子的调节元素的重组转录单元中被表达。
如本文所用的术语”肽的核苷酸编码”系指对肽进行核苷酸序列编码，其中该肽包括 与将由用于产生TCR的树突细胞或另一细胞系统所表达该序列的生物系统兼容的人工(人造)激活和停止密码子。
本文提到的核酸序列既包括单链核酸也包括双链核酸。因此，除非本文另有所指，否则，例如对于DNA，具体的序列是该序列的单链DNA、该序列与其互补序列的双工 (双链DNA)以及该序列的互补序列。
“编码区”这一术语是指在基因的天然基因组环境中天然或正常编码该基因的表达 产物的那部分基因，即，体内编码该基因的天然表达产物的区域。
编码区可来自非突变(”正常”)基因、突变基因或异常基因，甚至还可以来自DNA序列，完全可在实验室中使用本领域熟知的DNA合成方法合成。
“表达产物”这一术语是指多肽或蛋白，它是基因和遗传码退化并因而编码同样的氨 基酸所造成的任何核酸序列编码同等物的翻译产物。
“片断”这一术语，当指的是一种编码序列时，表示包含非完整编码区的DNA的一部分，其表达产物与完整编码区表达产物基本上具有相同的生物学功能或活性。
“DNA片段”这一术语是指一种DNA聚合物，以单独的片段形式或一种较大DNA 结构的组分形式存在，它们从至少分离过一次的DNA中以基本纯净的形式获得，即不 含污染性内源性材料，并且获得的数量或浓度能够使用标准生化方法，例如使用克隆载 体，进行识别、操纵和回收该片段及其组分核苷酸序列。此类片段以开放阅读框架(未 被内部未翻译序列打断)或内含子(通常提呈于真核基因中)的形式存在。未翻译DNA 序列可能存在于开放阅读框架的下游，在那里其不会干预编码区的操纵或表达。
“引物”这一术语表示一种短核酸序列，其可与一个DNA链配对，并在DNA聚合 酶开始合成脱氧核糖核酸链之处提供一个游离的3′-OH末端。
“激活子”这一术语表示参与RNA聚合酶的结合从而激活转录的DNA区域。
术语”分离”表示一种物质从其原来的环境(例如，如果是天然发生的则是天然环境) 中被移走。例如，活体动物中的天然核苷酸或多肽不是分离的，但是，从天然系统中一些或所有共存物质中分离出来的核苷酸或多肽是分离的。此类多核苷酸可能是载体的一部分和/或此类多核苷酸和多肽可能是一种组合物的一部分，并且由于该载体或组合物 不是其天然环境的一部分，因此它仍然是分离的。
本发明中披露的多核苷酸和重组或免疫原性多肽也可能以”纯化”的形式存在。术语” 纯化”并非要求绝对的纯度；它只是一个相对的定义，可以包括高度纯化或部分纯化的制剂，相关领域技术人员能理解这些术语。例如，各个从已用传统方法纯化为具有电泳 同构型的cDNA库中分离出的各种克隆物。明确考虑到将起始材料或天然物质纯化至少 一个数量级，优选为两或三个数量级，更优选为四或五个数量级。此外，明确涵盖所述 多肽的纯度优选为99.999％，或至少为99.99％或99.9％；甚而适宜为以重量计99％或 更高。
根据本发明公开的核酸和多肽表达产物，以及包含此类核酸和/或多肽的表达载体 可能以”浓缩的形式”存在。本文使用的术语”浓缩”是指材料的浓度至少是其自然浓度的 大约2、5、10、100或1000倍，有优势的是，按重量计为0.01％，优选为至少0.1％。 也明确考虑到，按重量计约为0.5％、1％、5％、10％和20％的浓缩制剂。序列、构型 、载体、克隆物以及包含本发明的其他材料可有优势地以浓缩或分离的形式存在。”活 性片段”这一术语是指产生免疫反应的片段(即具有免疫原性活性)，通常是一种肽、 多肽或核酸序列的片段，不论是单独或可选地与合适的佐剂一起或在载体中给予一种动 物，比如哺乳动物，例如兔子或小鼠，也包括人；这种免疫反应采用的形式是在接受动 物(如：人)体内刺激T细胞反应。或者，”活性片段”也可用于诱导体外T细胞反应。
本文使用的”部分”(portion)、”节段”(segment)、”片段”(fragment)这几个术语，当与 多肽相关地使用时是指残基的连续序列，比如氨基酸残基，其序列形成一个较大序列的 子集。例如，如果一个多肽以任一种肽链内切肽酶(如胰蛋白酶或糜蛋白酶)进行处理，则该处理获得的寡肽会代表起始多肽的部分、节段或片段。当与多核苷酸相关地使用时，这些术语系指用任何核酸内切酶处理所述多核苷酸产生的产物。
根据本发明，术语”等同度百分比”或”等同百分比”，如果指的是序列，则表示在待对比序列(”被对比序列”)与所述序列或权利要求的序列(”参考序列”)对准之后将被 对比序列与所述序列或权利要求的序列进行比较。然后根据下列公式计算等同度百分比：
等同度百分比＝100[1-(C/R)]
其中C是参考序列与被对比序列之间对准长度上参考序列与被对比序列之间的差异数量，其中
(i)参考序列中每个碱基或氨基酸序列在被对比序列中没有对应的对准碱基或氨基 酸；
(ii)参考序列中每个空隙，以及
(iii)参考序列中每个对准碱基或氨基酸与被比对比序列中对准碱基或氨基酸不同， 即构成一个差异以及
(iiii)必须在对准序列的第1位置开始对准；
并且R是参考序列与被对比序列对准长度上在参考序列中产生任何空隙也计算为一个碱基或氨基酸的参考序列中的碱基或氨基酸数目。
如果”被对比序列”和”参考序列”之间存在的一个对准按上述计算的等同度百分比 大致等于或大于指定的最低等同度百分比，则被对比序列与参考序列具有指定的最低等 同度百分比，虽然可能存在按本文上述计算的等同度百分比低于指定等同度百分比的对 准。
因此，如上所述，本发明提出了一种肽，其包括选自SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：388组成的组团的一个序列、或与SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：388具有88％同源性的其变 体、或诱导与该肽发生T细胞交叉反应的一个变体。本发明所述的肽具有与主要组织兼 容性复合体(MHC)I或所述肽拉长版本的II类分子结合的能力。
在本发明中，”同源性”一词系指两个氨基酸序列之间的同一度(参见上文的等同度 百分比，如肽或多肽序列。前文所述的”同源”是通过将理想条件下调整的两个序列与待比较序列进行比对后确定的。此类序列同源性可通过使用ClustalW等算法创建一个排 列而进行计算。也可用使用一般序列分析软件，更具体地说，是Vector NTI、GENETYX 或由公共数据库提供的其他工具。
本领域技术人员能评估特定肽变体诱导的T细胞是否可与该肽本身发生交叉反应(Appay et al.，2006；Colombetti et al.，2006；Fong et al.，2001；Zaremba et al.，1997)。
发明人用给定氨基酸序列的“变体“表示，一个或两个氨基酸残基等的侧链通过被另 一个天然氨基酸残基的侧链或其他侧链取代而发生改变，这样，这种肽仍然能够以含有给定氨基酸序列(由SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：388组成)的肽大致同样的方式与HLA 分子结合。例如，一种肽可能被修饰以便至少维持(如没有提高)其能与HLA-A*02或 -DR等合适MHC分子的结合槽相互作用和结合，以及至少维持(如没有提高)其与激 活T细胞的TCR结合的能力。
随后，这些T细胞可与细胞和杀伤细胞发生交叉反应，这些细胞表达多肽(其中包含本发明中定义的同源肽的天然氨基酸序列)。正如科学文献和数据库(Rammensee etal.， 1999；Godkin et al.，1997)中所述，HLA-A结合肽的某些位点通常为锚定残基，可形成 一种与HLA结合槽的结合模序相称的核心序列，其定义由构成结合槽的多肽链的极性 、电物理、疏水性和空间特性确定。因此，本领域技术人员能够通过保持已知的锚残基 来修饰SEQ ID No：1至SEQ ID NO：388提出的氨基酸序列，并且能确定这些变体是否 保持与MHCI或II类分子结合的能力。本发明的变体保持与激活T细胞的TCR结合的 能力，随后，这些T细胞可与表达一种包含本发明定义的同源肽的天然氨基酸序列的多 肽的细胞发生交叉反应并杀死该等细胞。
如果无另有说明，那么本文公开的原始(未修饰)肽可以通过在肽链内的不同(可能为选择性)位点上取代一个或多个残基而被修饰。优选情况是，这些取代位于氨基酸 链的末端。此取代可能是保守性的，例如，其中一个氨基酸被具有类似结构和特点的另 一个氨基酸所取代，比如其中一个疏水性氨基酸被另一个疏水性氨基酸取代。更保守的 取代是具有相同或类似的大小和化学性质的氨基酸间的取代，例如，亮氨酸被异亮氨酸 取代。在天然同源蛋白质家族序列变异的研究中，某些氨基酸的取代往往比其他氨基酸 更具有耐受性，这些氨基酸往往表现出与原氨基酸的大小、电荷、极性和疏水性之间的 相似性相关，这是确定”保守取代”的基础。
在本文中，保守取代定义为在以下五种基团之一的内部进行交换：基团1-小脂 肪族、非极性或略具极性的残基(Ala，Ser，Thr，Pro，Gly)；基团2-极性、带负电荷的 残基及其酰胺(Asp，Asn，Glu，Gln)；基团3-极性、带正电荷的残基(His，Arg，Lys)； 基团4-大脂肪族非极性残基(Met，Leu，Ile，Val，Cys)以及基团5-大芳香残基(Phe， Tyr，Trp)。
较不保守的取代可能涉及一个氨基酸被另一个具有类似特点但在大小上有所不同 的氨基酸所取代，如：丙氨酸被异亮氨酸残基取代。高度不保守的取代可能涉及一个酸性氨基酸被另一个具有极性或甚至具有碱性性质的氨基酸所取代。然而，这种”激进” 取代不能认为是无效的而不予考虑，因为化学作用是不完全可预测的，激进的取代可能 会带来其简单化学原理中无法预见的偶然效果。
当然，这种取代可能涉及普通L-氨基酸之外的其他结构。因此，D-氨基酸可能被本发明的抗原肽中常见的L-氨基酸取代，也仍在本公开的范围之内。此外，非标准氨 基酸(即，除了常见的天然蛋白原氨基酸)也可以用于取代之目的，以生产根据本发明 的免疫原和免疫原性多肽。
如果在一个以上位置上的取代发现导致肽的抗原活性基本上等于或大于以下定义 值，则对这些取代的组合进行测试，以确定组合的取代是否产生对肽抗原性的迭加或协同效应。肽内被同时取代的位置最多不能超过4个。
基本上由本文所指氨基酸序列组成的一种肽可能有一个或两个非锚定氨基酸(见下 面锚基序相关内容)被交换，而不存在这种情况，即相比于未修饰的肽，与人类主要组织兼容性复合体(MHC)-I或II类分子的能力基本上被改变或受到不利影响。在另一实 施方案中，在基本上由本文所述氨基酸序列组成的肽中，一个或两个氨基酸可与其保守 交换伙伴交换(见下文)，而不存在这种情况，即相比于未修饰的肽，与人类主要组织 兼容性复合体(MHC)-I或II类分子的能力基本上被改变或受到不利影响。
这些基本不与T细胞受体互动的氨基酸残基可通过取代其他几乎不影响T细胞反应并不妨碍与相关MHC结合的氨基酸而得到修饰。因此，除了特定限制性条件外，本 发明的肽可能为任何包括给定氨基酸序列或部分或其变体的肽(发明人所用的这个术语 包括寡肽或多肽)。
表5：根据SEQ ID NO：2、4和6的HLA-A*02肽的优选变体和基序
Figure BDA0001584383410000561
Figure BDA0001584383410000571
Figure BDA0001584383410000581
Figure BDA0001584383410000591
较长(拉长)的肽也可能适合。MHC I类表位(通常长度为8至11个氨基酸)可 能由肽从较长的肽或包含实际表位的蛋白中加工而产生。两侧有实际表位的残基优选为 在加工过程中几乎不影响暴露实际表位所需蛋白裂解的残基。
本发明的肽可被拉长多达四个氨基酸，即1、2、3或4个氨基酸，可按照4∶0与0∶4 之间的任何组合添加至任意一端。本发明的拉长组合可见表7。
表7：本发明肽的拉长组合
C-端 N-端
4 0
3 0或1
2 0或1或2
1 0或1或2或3
0 0或1或2或3或4
N-端 C-端
4 0
3 0或1
2 0或1或2
1 0或1或2或3
0 0或1或2或3或4
拉伸/延长的氨基酸可以是所述蛋白或任何其他氨基酸的原序列肽。拉长可用于增 强所述肽的稳定性或溶解性。
因此，本发明所述的表位可能与天然肿瘤相关表位或肿瘤特异性表位相同，也可能 包括来自参考肽的不超过四个残基的不同肽，只要它们有基本相同的抗原活性即可。
在一项替代实施方案中，肽的一边或双边被拉长4个以上的氨基酸，优选最多30个氨基酸的总长度。这可形成MHC-II类结合肽。结合至MHC II类肽可通过本领域中已 知的方法进行测试。
因此，本发明提出了MHC I类表位的肽和变体，其中所述肽或抗体的总长度为8至100个、优选为8至30个、最优选为8至14个氨基酸长度(即10、11、12、13、14个 氨基酸，如果为拉长II类结合肽时，长度也可为15、16、17、18、19、20、21或22个 氨基酸)。
当然，本发明的肽或变体能与人主要组织兼容性复合体(MHC)I或II类分子结合 。肽或变体与MHC复合物的结合可用本领域内的已知方法进行测试。
优选情况是，当本发明的肽特异性T细胞相比于取代肽受到检测时，如果取代肽在相对于背景肽溶解度增加达到最大值的一半，则该肽浓度不超过约1mM，优选为不超 过约1μM，更优选为不超过约1nM，再优选为不超过约100pM，最优选为不超过约10 pM。也优选为，取代肽被一个以上的T细胞识别，最少为2个，更优选为3个。
在本发明的一个特别优选实施方案中，肽由或基本由SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：388的氨基酸序列组成。
基本由“...组成“系指本发明的肽，除了根据SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：388中的任一序列或其变体组成外，还含有位于其他N和/或C端延伸处的氨基酸，而它们不一 定能形成作为MHC分子表位的肽。
但这些延伸区域对有效将本发明中的肽引进细胞具有重要作用。在本发明的一实施 例中，该肽为融合蛋白的一部分，含来自NCBI、GenBank登录号X00497的HLA-DR抗 原相关不变链(p33，以下称为”Ii”)的80个N-端氨基酸等。在其他的融合中，本发明 的肽可以被融合到本文所述的抗体、或其功能性部分，特别是融合入抗体的序列，以便 所述抗体进行特异性靶向作用，或者，例如进入本文所述的树突状细胞特异性抗体。
此外，该肽或变体可进一步修饰以提高稳定性和/或与MHC分子结合，从而引发更强的免疫反应。肽序列的该类优化方法是本领域内所熟知的，包括，例如，反式肽键和 非肽键的引入。
在反式肽键氨基酸中，肽(-CO-NH-)并未连接其残基，但是其肽键是反向的。这 种逆向反向模拟肽(retro-inverso peptidomimetics)可通过本领域已知的方法制备，例如：Meziere等人在(Meziere et al.，1997)中所述的方法，以引用的方式并入本文。这种方法涉及制备包含骨架(而并非侧链)改变的模拟肽。Meziere等人(Meziere et al.，1997)的研究显示，这些模拟肽有利于MHC的结合和辅助性T细胞的反应。以NH-CO键替代 CO-NH肽键的逆向反向肽大大地提高了抗水解性能。
非肽键为-CH2-NH、-CH2S-、-CH2CH2-、-CH＝CH-、-COCH2-、-CH(OH)CH2-和 -CH2SO-等。美国4897445号专利提出了多肽链中非肽键(-CH2-NH)的非固相合成法， 该方法涉及按标准程序合成的多肽以及通过氨基醛和一种含NaCNBH3的氨基酸相互作 用而合成的非肽键。
含上述序列的肽可与其氨基和/或羧基末端的其他化学基团进行合成，从而提高肽 的稳定性、生物利用度、和/或亲和力等。例如，苄氧羰基、丹酰基等疏水基团或叔丁 氧羰基团可加入肽的氨基末端。同样，乙酰基或9-芴甲氧羰基可能位于肽的氨基末端。 此外，疏水基团、叔丁氧羰基团或氨基团都可能被加入肽的羧基末端。
另外，本发明中的所有肽都可能经合成而改变其空间构型。例如，可能使用这些肽的一个或多个氨基酸残基的右旋体，通常不是其左旋体。更进一步地，本发明中肽的至 少一个氨基酸残基可被熟知的一个非天然氨基酸残基取代。诸如此类的改变可能有助于 增加本发明肽的稳定性、生物利用度和/或结合作用。
同样，本发明中的肽或变体可在合成肽之前或之后通过特异氨基酸的反应而进行化 学修饰。此类修饰的实施例为本领域所熟知，例如，在R.Lundblad所著的《ChemicalReagents for Protein Modification》(3rd ed.CRC Press，2004)(Lundblad，2004)中有概述， 以参考文献的方式并入本文。虽然氨基酸的化学修饰方法无限制，但其包括(但不限于) 通过以下方法修饰：酰基化、脒基化、赖氨酸吡哆基化、还原烷基化、以2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)三硝基苯基化氨基团、通过将半胱氨酸过甲酸氧化为磺基丙氨酸而对羧 基团和巯基进行氨基修饰、形成易变衍生物、与其他巯基化合物形成混合二硫化合物、 与马来酰亚胺反应，与碘乙酸或碘乙酰胺羧甲基化、在碱性pH值下与氰酸盐甲氨酰化 。在这方面，技术人员参考了《Current Protocols In Protein Science》(Eds.Coligan et al.(John Wiley and Sons NY 1995-2000))(Coligan et al.，1995)中第15章所述的在蛋白质化 学修饰相关的广泛方法。
简言之，修饰蛋白质的精氨酰残基等往往基于于邻二羰基化合物(如苯甲酰甲醛、2，3-丁二酮以及1，2-烯巳二酮)的反应而形成加合物。另一个实施例是丙酮醛与精氨酸 残基的反应。半胱氨酸可在赖氨酸和组氨酸等亲核位点不作随同修饰的情况下就得到修 饰。因此，有大量试剂可进行半胱氨酸的修饰。Sigma-Aldrich (http://www.sigma-aldrich.com)等公司的网站含有具体试剂的信息。
蛋白质中二硫键的选择性还原也很普遍。二硫键可在生物制药热处理中形成和氧化 。伍德沃德氏试剂K可用于修饰特定的谷氨酸残基。N-(3-二甲氨基丙基)-N′-乙基- 碳二亚胺可用于形成赖氨酸残基和谷氨酸残基的分子内交联。例如：焦碳酸二乙酯是修 饰蛋白质组氨酸残基的试剂。组氨酸也可使用4-羟基-2-壬烯醛进行修饰。赖氨酸残基 与其他α-氨基团的反应，例如，有利于肽结合到蛋白/肽的表面或交联处。赖氨酸聚是 多(乙烯)乙二醇的附着点，也是蛋白质糖基化的主要修饰位点。蛋白质的蛋氨酸残基 可通过碘乙酰胺、溴乙胺、氯胺T等被修饰。
四硝基甲烷和N-乙酰基咪唑可用于酪氨酸残基的修饰。经二酪氨酸形成的交联可通过过氧化氢/铜离子完成。
对色氨酸修饰的最近研究中使用了N-溴代琥珀酰亚胺、2-羟基-5-硝基苄溴或3-溴 -3-甲基-2-(2-硝苯巯基)-3H-吲哚(BPNS-粪臭素)。
当蛋白与戊二醛、聚乙二醇二丙烯酸酯和甲醛的交联用于配制水凝胶时，治疗性蛋 白和含聚乙二醇的肽的成功修饰往往可延长循环半衰期。针对免疫治疗的变态反应原化 学修饰往往通过氰酸钾的氨基甲酰化实现。
一种肽或变体，其中肽被修饰或含非肽键，优选为本发明的实施例。一般来说，肽和变体(至少含氨基酸残基之间的肽联接)可使用Lukas等人(Lukas et al.，1981)以及 此处引用的参考文献所披露的固相肽合成Fmoc-聚酰胺模式进行合成。芴甲氧羰基 (Fmoc)团对N-氨基提供临时保护。使用N，N-二甲基甲酰胺中的20％二甲基呱啶中对 这种碱高度敏感的保护基团进行重复分裂。由于它们的丁基醚(在丝氨酸苏氨酸和酪氨 酸的情况下)、丁基酯(在谷氨酸和天门冬氨酸的情况下)、叔丁氧羰基衍生物(在赖氨酸 和组氨酸的情况下)、三苯甲基衍生物(在半胱氨酸的情况下)及4-甲氧基-2，3，6-三甲基 苯磺酰基衍生物(在精氨酸的情况下)，侧链功能可能会受到保护。只要谷氨酰胺和天冬 酰胺为C-末端残基，侧链氨基功能保护所使用的是由4，4′-二甲氧基二苯基团。固相支 撑基于聚二甲基丙烯酰胺聚合物，其由三个单体二甲基丙烯酰胺(骨架单体)、双丙烯 酰乙烯二胺(交联剂)和N-丙烯酰肌胺酸甲酯(功能剂)构成。使用的肽-树脂联剂为 酸敏感的4-羟甲基苯氧乙酸衍生物。所有的氨基酸衍生物均作为其预制对称酸酐衍生 物加入，但是天冬酰胺和谷氨酰胺除外，它们使用被逆转的N，N-二环己基碳二亚胺/1- 羟基苯并三唑介导的耦合程序而加入。所有的耦合和脱保护反应用茚三酮、硝基苯磺酸 或isotin测试程序监测。合成完成后，用浓度为95％含50％清道夫混合物的三氟醋酸， 从伴随去除侧链保护基团的树脂支承物中裂解肽。常用的清道夫混合物包括乙二硫醇、 苯酚、苯甲醚和水，准确的选择依据合成肽的氨基酸组成。此外，固相和液相方法结合 使用对肽进行合成是可能的(例如，请参阅(Bruckdorfer et al.，2004)以及本文引用的参 考文献)
三氟乙酸用真空中蒸发、随后用承载粗肽的二乙基乙醚滴定进行去除。用简单萃取 程序(水相冻干后，该程序制得不含清道夫混合物的肽)清除任何存在的清道夫混合物。肽合成试剂一般可从Calbiochem-Novabiochem(英国诺丁汉)获得。
纯化可通过以下技术的任何一种或组合方法进行，如：再结晶法、体积排阻色谱法、离子交换色谱法、疏水作用色谱法以及(通常)反相高效液相色谱法(如使用乙腈/ 水梯度分离)。
可以使用薄层色谱法、电泳特别是毛细管电泳、固相萃取(CSPE)、反相高效液 相色谱法、酸解后的氨基酸分析、快原子轰击(FAB)质谱分析以及MALDI和ESI-Q-TOF 质谱分析进行肽分析。
为了识别本发明的肽，对约3000个正常(健康)组织样本的RNA表达数据库(Lonsdale，2013)进行了筛选在重要器官系统中近乎无表达而在其他重要器官系统中低表达的基因。然后，从这些基因的蛋白质产物衍生的癌相关肽通过使用如本文所述的XPRESIDENTTM平台质谱法识别。
为了选择过度提呈的肽，计算了提呈图，其显示样本中位提呈量以及复制变化。该特点使相关肿瘤实体的样本与正常组织样本的基线值并列。可通过计算调节线性混合效应模型(Pinheiro et al.，2015)的p值将以上每个特点并入过度提呈分数中，从而通过假发现率(Benjamini and Hochberg，1995)调整多项检验(参见实施例1)。
对于通过质谱法对HLA配体的识别和相对定量，对来自冲击冷冻组织样本的HLA分子进行纯化并对HLA相关肽进行分离。分离的肽分开，并通过在线纳米-电喷雾-电 离(nanoESI)液相色谱-谱(LC-MS)实验进行鉴定。由此产生的肽序列的验证方法是， 将癌症样本(N＝来自377个供体的377个A*02阳性样本，N＝204个A*24阳性样本) 中记录的自然肿瘤相关肽(TUMAP)的片段模式与相同序列相应合成参考肽的片段模式 进行比较。由于这些肽被直接鉴定为原发肿瘤HLA分子的配体，因此这些结果为来自 574名癌症患者的原发癌症织上确定肽的自然加工和提呈提供了直接证据。
发现管道
Figure BDA0001584383410000631
v2.1(例如，参见US 2013-0096016，并在此通过引用将其整体并入本文)考虑到识别和选择相关过量提呈的候选肽疫苗，这基于与几种不同的 非癌组织和器官相比癌症或其他受感染组织的HLA限制肽水平直接相对定量结果。这 通过以下方法实现：使用专有数据分析管道处理的LC-MS采集数据、结合序列识别算 法、谱聚类、计算离子、保留时间调整、充电状态卷积以及正态化而开发无标记差异化 定量方法。
为每种肽和样本确立了提呈水平，包括误差估计值。肿瘤组织大量提呈的肽以及肿 瘤与非肿瘤组织和器官中过量提呈的肽已经得到确定。
对来自组织样本的HLA肽复合物进行纯化，并且对HLA相关肽使用LC-MS进行 分离和分析(见实施例)。本申请中包含的所有TUMAP用此方式确定于原发性癌症样 本上，证实它们提呈于原发性脑胶质细胞瘤、乳腺癌、结直肠癌、肾细胞癌、慢性淋巴 细胞性白血病、肝细胞癌、非小细胞和小细胞肺癌、非霍奇金淋巴瘤、急性骨髓性白血 病、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、包括胃食管交界癌的食管癌、胆囊癌和胆管癌、黑色 素瘤、胃癌、睾丸癌、膀胱癌或子宫癌。
在多个癌症和正常组织上确定的TUMAP用无标记LC-MS数据的离子计数方法进 行量化。该方法假定肽的LC-MS信号区域与样本中其丰度相关。各种LC-MS实验中肽 的所有量化信号在集中趋势基础上进行正常化，根据每个样品进行平均，并合并入柱状 图(被称为提呈图)。提呈图整合了不同分析方法，如：蛋白数据库检索、谱聚类、充 电状态卷积(除电)和保留时间校准和正态化。
此外，发现管道
Figure BDA0001584383410000632
v2.1可对癌症或其他感染组织上的MHC-肽(优 选为HLA限制性肽)进行直接的绝对定量。简言之，总细胞计数根据被分析的组织样 本的总DNA含量来计算。组织样本中TUMAP的总肽量用nanoLC-MS/MS测定为天然 TUMAP的比率以及TUMAP同位素标记版本的已知量，称为内部标准。TUMAP分离 效率确定方法：把肽：所有选定TUMAP的MHC在TUMAP分离程序尽早的时间点加 入组织裂解液，并在肽分离成后完成后通过nanoLC-MS/MS检测。总细胞计数和总肽 量根据每份组织样本三次测量值来计算。所述肽特异性隔离效率计算为三次测量10次 加标实验的平均值(见实施例6和表14)。
RNA表达和质谱分析数据的这种组合分析获得本发明的417种肽。
本发明提出了有利于治疗癌肿/肿瘤，优选为治疗过量提呈或只提呈本发明肽的脑 胶质细胞瘤、乳腺癌、结直肠癌、肾细胞癌、慢性淋巴细胞性白血病、肝细胞癌、非小 细胞和小细胞肺癌、非霍奇金淋巴瘤、急性骨髓性白血病、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌 、包括胃食管交界癌的食管癌、胆囊癌和胆管癌、黑色素瘤、胃癌、睾丸癌、膀胱癌、 头颈部鳞状细胞癌或子宫癌。这些肽由质谱分析法直接显示出，而由HLA分子自然提 呈于人原发癌样本中。
与正常组织相比，癌症中高度过量表达肽来源的许多源基因/蛋白质(也指定为“全 长蛋白“或“潜在蛋白“)-本发明相关的“正常组织“应指源自与肿瘤相同器官的健康细胞 或组织或其他正常组织细胞，这表明肿瘤与这些源基因的高度关联性(见实施例2)。 此外，这些肽本身也在肿瘤组织中过度提呈(本发明相关的“肿瘤组织“是指来自癌症患 者的样本)，但不在正常组织中过度提呈(如见实施例1)。
HLA结合肽能够被免疫系统识别，特别是T淋巴细胞。T细胞可破坏提呈被识别HLA/肽复合体的细胞(如：提呈衍生肽的脑胶质细胞瘤、乳腺癌、结直肠癌、肾细胞 癌、慢性淋巴细胞性白血病、肝细胞癌、非小细胞和小细胞肺癌、非霍奇金淋巴瘤、急 性骨髓性白血病、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、包括胃食管交界癌的食管癌、胆囊癌和 胆管癌、黑色素瘤、胃癌、睾丸癌、膀胱癌、头颈部鳞状细胞癌或子宫癌细胞)。
本发明的所有肽已被证明具有刺激T细胞反应的能力，并过量提呈，因而可用于制备本发明的抗体和/或TCR，例如可溶性TCR(参见实施例3)。此外，肽与相应的MHC 组合时，也可用于制备本发明的抗体和/或TCR，特别是sTCR。各个方法均为技术人员 所熟知，并在各个文献中可找到。因此，本发明的肽可用于在患者中产生免疫反应，从 而能够毁灭肿瘤细胞。患者的免疫反应能够通过直接给予患者所述肽或前体物质(如， 加长肽、蛋白或编码这些肽的核酸)，较理想是与加强免疫原性的制剂相结合，而进行 诱导。源自该治疗性疫苗的免疫反应预期能够高度特异性地对抗肿瘤细胞，因为本发明 的目标肽在正常组织上提呈的复制数目较少，防止患者发生对抗正常细胞的不良自体免 疫反应的风险。
本说明书还涉及包含一个α链和一个β链(“α/βTCR”)的T细胞受体(TCR)。还提 供了由MHC分子提呈时可与TCR和抗体结合的肽。本说明书还涉及核酸、载体和用 于表达TCR的宿主细胞和本说明书的肽；以及使用它们的方法。
术语“T细胞受体”(缩写TCR)是指一种异二聚体分子，其包含一个α多肽链(α 链)和一个β多肽链(β链)，其中所述异二聚体受体能够结合由HLA分子提呈的肽 抗原。该术语还包括所谓的γ/δTCR。
在一个实施方案中，本说明书提供了如本文中所描述的产生TCR的方法，该方法包括在适于促进TCR表达的条件下培养能够表达TCR的宿主细胞。
另一个方面，本说明书涉及一种根据本说明书的方法，其中所述抗原通过与足够量 的含抗原提成细胞的抗原结合被载入表达于合适抗原提呈细胞或人工抗原呈递细胞表面的I或II类MHC分子，或该抗原通过四聚化被加载I或II类MHC四聚体/I或II类 MHC复合单体。
α/βTCR的α和β链和γ/δTCR的γ和δ链通常被视为各自有两个”结构域”，即可 变和恒定结构域。可变结构域由可变区(V)和连接区(J)的组合。可变结构域还可能包 括一个前导区(L)。β和δ链还可能包括一个多样区(D)。α和β恒定结构域还可能包括 锚定α和β链至细胞膜的C末端跨膜(TM)结构域。
相对于γ/δ的TCR，如本文所用的术语“TCRγ可变域”是指无前导区(L)的TCRγ V(TRGV)区与TCRγ(TRGJ)区的组合，术语TCRγ恒定结构域是指细胞外TRGC区 域，或C-末端截短TRGC序列。同样地，”TCR δ可变域”是指无前导区(L)的TCRδV (TRDV)区与TCR δD/J(TRDD/TRDJ)区的组合，术语“TCR δ恒定结构域”是指细胞外 TRDC区域，或C-末端截短TRDC序列。
本说明书的TCR优选结合至肽HLA分子复合体，其具有约100μM或更小、约50 μM或更小、约25μM或更小或约10μM或更小的结合亲和力(KD)。更为优选的情况 是具有约1μM或更小、约100nM或更小、约50nM或更小或约25nM或更小结合亲 和力的高亲和力TCR。本发明TCR优选结合亲和力范围的非限制性示例包括约1nM至 约10nM；约10nM至约20nM；约20nM至约30nM；约30nM至约40nM；约40nM 至约50nM；约50nM至约60nM；约60nM至约70nM；约70nM至约80nM；约80 nM至约90nM；以及约90nM至约100nM。
与本说明书TCR相关，本文使用的”特异性结合”及其语法变体用于表示对100μM或更小的肽-HLA分子复合体有结合亲和力(KD)的TCR。
本说明书的α/β异二聚体TCR可能具有其恒定结构域之间的引入二硫键。这种类型的优选TCR包括那些具有一个TRAC恒定域序列和TRBC1或TRBC2恒定域序列 的TCR，除非TRAC的苏氨酸48和TRBC1或TRBC2的丝氨酸57被半胱氨酸残基取 代，所述半胱氨酸形成TRAC恒定域序列和TCR的TRBC1或TRBC2恒定区序列之间 的二硫键。
不论具有或不具有上述的引入链间键，本说明书的α/β杂二聚体TCR可能具有一个TRAC恒定域序列和一个TRBC1或TRBC2恒定结构域序列，并且TRAC恒定结构 域序列和TCR的TRBC1或TRBC2恒定结构域序列可能通过TRAC外显子2的Cys4 和TRBC1或TRBC2外显子2的Cys4之间的天然二硫键相连。
本说明书的TCR可能包括选自由放射性核素、荧光团和生物素组成组中的可检测标记。本说明书的TCR可能共轭至治疗活性剂，如放射性核素、化学治疗剂或毒素。
在一个实施方案中，具有在α链中至少一个突变和/或具有在β链中至少一个突变的TCR与未突变TCR相比，已经修改了糖基化。
在一个实施方案中，在TCRα链和/或TCRβ链中包括至少一个突变的TCR对肽 HLA分子复合体有结合亲和力和/或结合半衰期，其是包含未突变TCRα链和/或未突变 TCRβ链的TCR的结合亲和力的至少两倍。肿瘤特异性TCR亲和力增强及其开发依赖 于存在最佳TCR亲和力的窗口。这样窗口的存在是根据观察结果：HLA-A2限制性病 原体特异性TCR与HLA-A2限制性肿瘤相关自身抗原特异性TCR相比，KD值通常大 约低10倍。现已知，尽管肿瘤抗原可能具有免疫原性，但是因为肿瘤来自个体自身的 细胞，因此仅突变蛋白质或翻译加工改变的蛋白将被免疫系统视为外来物质。上调或过 度表达(所谓的自体抗原)的抗原不一定诱导针对肿瘤的功能免疫应答：表达对这些抗 原具有高度反应性的TCR的T细胞会在一种称为中枢耐受的程序中在胸腺内被不利选 择，也就是说只有对自身抗原具有低亲和力TCR的细胞才仍然存在。因此，本说明书 的TCR或变体对本发明的肽的亲和力可通过本领域熟知的方法来增强。
本说明书还涉及一种识别和分离本发明TCR的一种方法，所述方法包括：用A2/ 肽单体从HLA-A*02阴性健康供体孵育PBMC，用四聚体-藻红蛋白(PE)孵育PBMC 并通过荧光激活细胞分选(FACS)-Calibur方法分析分离高亲和力T细胞。
本说明书还涉及一种识别和分离本发明TCR的一种方法，所述方法包括：获得含整个人体TCRαβ基因位点(1.1and 0.7Mb)的转基因小鼠(其T细胞表达多样化人类 TCR，用于补偿小鼠TCR缺乏)，用相关肽对小鼠进行免疫处理，用四聚体-藻红蛋 白(PE)孵育从转基因小鼠中获得的PBMC，并通过荧光激活细胞分选(FACS)-Calibur 方法分析分离高亲和力T细胞。
一方面，为了获得表达本说明书TCR的T细胞，编码本说明书TCR-α和/或TCR-β 链的核酸被克隆入表达载体，诸如γ反转录病毒或慢病毒。重组病毒产生，然后测试功 能，如抗原专一性和功能性亲合力。然后，最终产品的等分试样被用于转导靶T细胞群 体(一般纯化自患者的PBMC)，在输入患者前展开。另一方面，为了获得表达本说明 书TCR的T细胞，TCRRNA通过本领域中已知的技术(例如，体外转录系统)合成。 然后，体外合成的TCR RNA通过电穿孔来重新表达肿瘤特异性TCR-α和/或TCR-β链 被引入获得自健康供体的初级CD8+ T细胞。
为了增加表达，编码本说明书TCR的核酸在操作上可连接到强激活子，例如逆转录病毒长末端重复序列(LTR)、巨细胞病毒(CMV)、鼠干细胞病毒(MSCV)U3、磷酸 甘油酸激酶(PGK)、β肌动蛋白、泛素蛋白和猿猴病毒40(SV40)/CD43复合激活子、延 伸因子(EF)-1a和脾脏病灶形成病毒(SFFV)激活子。在一优选实施方案中，激活子与 被表达的核酸异源。除了强激活子外，本说明书的TCR表达盒可能含有附加的元素， 可提高转基因表达，包括中枢多聚嘌呤区(CPPT)，其促进了慢病毒构建体的核易位 (Follenzi et al.，2000)，和土拨鼠肝炎病毒转录后调控元素(WPRE)，其通过提高RNA稳 定性增加转基因表达水平(Zufferey et al.，1999)。
本发明TCR的α和β链可由位于分开的载体核酸进行编码，或者可通过位于同一 载体的多核苷酸编码。
实现高水平的TCR表面表达需要引入TCR的TCR-α和TCR-β链高水平转录。为 了实现它，本说明书的TCR-α和TCR-β链可在单一的载体中被克隆入双顺反子构建体， 其已被证明能够克服这一障碍。使用TCR-α和TCR-β链在之间的病毒核糖体间进入位 点(IRES)导致两链的协同表达，因为TCR-α和TCR-β链均由在翻译过程中分成两个蛋 白质的单一转录物产生，从而确保了产生TCR-α和TCR-β链的相等摩尔比。(Schmitt et al.2009)。
编码本说明书TCR的核酸可以是被优化以从宿主细胞增加表达的密码子。遗传密码冗余让一些氨基酸被一个以上的密码子编码，但某些密码子没有其他密码子”优化”， 因为匹配tRNA以及其他因子的相对可用性(Gustafsson et al.，2004)。修改TCR-α和 TCR-β基因序列使得每个氨基酸被用于哺乳动物基因表达的最佳密码子编码，以及消除 mRNA不稳定性基序或隐蔽剪接位点，已显示可显著提高TCR-α和TCR-β基因表达 (Scholten etal.，2006)。
此外，引入的和内源性TCR链之间的错配可能会导致获得特异性，其构成自身免疫的显著风险。例如，混合TCR二聚体的形成可能会减少可用以形成正确配对TCR复 合体的CD3分子数目，因此，可以显著降低表达所引入TCR的细胞的功能性亲合力 (Kuball etal.，2007)。
为了减少错配，本说明书引入的TCR链的C-末端结构域可以进行修改以促进链间亲和力，同时降低引入链与内源TCR配对的能力。这些策略可能包括用鼠配对物取代 人类TCR-α和TCR-βC端结构域(鼠化C端结构域)；通过引入第二个半胱氨酸残基 到引入TCR的TCR-α和TCR-β链产生C末端结构域的第二个链间二硫键(半胱氨酸 修饰)；交换TCR-α和TCR-β链C端结构域的相互作用残基(”杵臼结构”)；直接融 合TCR-α和TCR-β链可变结构域至CD3ζ(CD3ζ融合)(Schmitt et al.2009)。
在一实施方案中，宿主细胞被改变结构以表达本说明书的TCR。在一优选实施方案中，宿主细胞为人T细胞或T细胞祖细胞。在一些实施方案中，T细胞或T细胞祖 细胞从癌症患者中获得。在另一些实施方案中，T细胞或T细胞祖细胞从健康供体中获 得。本说明书的宿主细胞相对于待治疗的患者可以为同种异体或自体的。在一实施方案 中，宿主是被转化以表达α/βTCR的γ/δT细胞。
“药物组合物“是指适合在医疗机构用于人体的组合物。优选地，药物组合物为无菌 状态，并根据GMP指南生产。
药物组合物包括游离形式或以一种药用盐形式存在的肽(也参见上文)。此处使用的”药用盐”系指所公开的肽的一种衍生物，其中该肽由制酸或药剂的碱盐进行改性。例如，用与适合的酸反应的游离碱(通常其中的中性药物有一个中性-NH2基团)制备酸 式盐。适合制备酸盐的酸包括有机酸，如：乙酸、丙酸、羟基酸、丙酮酸、草酸、苹果 酸、丙二酸、丁二酸、马来酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸酸、肉桂酸、扁桃酸 、甲磺酸、甲磺酸、苯磺酸、水杨酸等等、以及无机酸，如：盐酸、氢溴酸、硫酸、硝 酸和磷酸等。相反，可在一种肽上提呈的酸性基团的碱盐制剂使用药用碱基进行制备， 如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙、三甲胺等等。
在特别优选的实施方案中，药物组合物包括乙酸(醋酸盐)，三氟乙酸盐或盐酸(氯化物)形式的肽。
本发明中所述的药剂优选为一种免疫治疗药剂，例如，一种疫苗。该疫苗可直接给到患者的受影响器官，也可i.d.、i.m.、s.c.、i.p.和i.v.注射方式全身给药，或体外应用到来自患者或其细胞株的细胞(随后再将这些细胞注入到患者中)，或体外用于从来自 患者的免疫细胞的一个细胞亚群(然后再将细胞重新给予患者)。如果核酸体外注入细 胞，可能有益于细胞转染，以共同表达免疫刺激细胞因子(如白细胞介素-2)。肽可完 全单独给药，也可与免疫刺激佐剂相结合(见下文)、或与免疫刺激细胞因子联合使用 、或以适当的输送系统给药(例如脂质体)。该肽也可共轭形成一种合适的载体(如钥 孔虫戚血蓝蛋白(KLH)或甘露)到合适的载体(参阅WO 95/18145及(Longenecker et al.，1993))。肽也可能被标记，可能是融合蛋白，或可能是杂交分子。在本发明中给出 序列的肽预计能刺激CD4或CD8 T细胞。然而，在有CD4 T-辅助细胞的帮助时，CD8 T细胞刺激更加有效。因此，对于刺激CD8 T细胞的MHC-I类表位，一种杂合分子的 融合伙伴或片段提供了刺激CD4阳性T细胞的适当表位。CD4-和CD8刺激表位为本 领域所熟知、并包括本发明中确定的表位。
一方面，疫苗包括至少含有SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：388中的一种肽以及至少另外一种肽，优选为2至50个、更优选为2至25个、再优选为2至20个、最优选为2 、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18个肽。肽可能从一 个或多个特定TAA中衍生，并且可能与MHC I类分子结合。
另一方面，本发明提出了一种编码本发明中肽或肽变体的核酸(如多聚核苷酸)。多聚核苷酸可能为，例如，DNA、cDNA、PNA、RNA或其组合物，它们可为单链和/ 或双链、或多聚核苷酸的原生或稳定形式(如：具有硫代磷酸骨架的多聚核苷酸)，并 且只要它编码肽，就可能包含也可能不包含内含子。当然，多聚核苷酸只能编码加入天 然肽键并含有天然氨基酸残基的肽。另一个方面，本发明提出了一种可根据本发明表达 多肽的表达载体。
对于连接多核苷酸，已经开发出多种方法，尤其是针对DNA，可通过向载体补充 可连接性末端等方法进行连接。例如，可向DNA片段加入补充性均聚物轨道，之后DNA 片段被插入到载体DNA。然后，通过补充性均聚物尾巴的氢键结合，将载体和DNA片 段结合，从而形成重组DNA分子。
含有一个或多个酶切位点的合成接头为DNA片段与载体连接提供了另一种方法。含各种限制性核酸内切酶的合成接头可通过多种管道购得，其中包括从国际生物技术公司(International Biotechnologies Inc，New Haven，CN，美国)购得。
编码本发明多肽的DNA理想修饰方法是使用Saiki等人(Saiki et al.，1988)所采用 的聚合酶链反应方法。此方法可用于将DNA引入合适的载体(例如，通过设计合适的 酶切位点)，也可用于本领域已知的其他有用方法修饰DNA。如果使用病毒载体，痘 病毒载体或腺病毒载体为优选。
之后，DNA(或在逆转录病毒载体情况下，RNA)可能表达于合适的宿主，从而 制成含本发明肽或变体的多肽。因此，可根据已知技术使用编码本发明肽或变体的DNA， 用本文所述方法适当修饰后，构建表达载体，然后表达载体用于转化合适宿主细胞，从 而表达和产生本发明中的多肽。此类技术包括那些公开于，例如，美国专利4,440,859 、4,530,901、4,582,800、4,677,063、4,678,751、4,704,362、4,710,463、4,757,006、4,766,075 和4,810,648。
编码含本发明化合物多肽的DNA(或在逆转录病毒载体情况下，RNA)可能被加 入到其他多种DNA序列，从而引入到合适的宿主中。同伴DNA将取决于宿主的性质 、DNA引入宿主的方式、以及是否需要保持为游离体还是要相互结合。
一般来说，DNA可以适当的方向和正确的表达阅读框架附着到一种表达载体(如质粒)中。如有必要，该DNA可能与所需宿主所识别的相应转录和翻译调节控制核苷 酸序列连接，尽管表达载体中一般存在此类控制功能。然后，该载体通过标准方法被引 入宿主。一般来说，并不是所有的宿主都会被载体转化。因此，有必要选择转化过的宿 主细胞。选择方法包括用任何必要的控制元素向表达载体插入一个DNA序列，该序列 对转化细胞中的可选择性属性(如抗生素耐药性)进行编码。
另外，有这种选择属性的基因可在另外一个载体上，该载体用来协同转化所需的宿 主细胞。
然后，本发明中的重组DNA所转化的宿主细胞在本文中所述本领域技术人员熟悉的合适条件下培养足够长的时间，从而表达之后可回收的肽。
有许多已知的表达系统，包括细菌(如大肠杆菌和枯草芽孢杆菌)、酵母(如酵母菌)、丝状真菌(如曲霉菌)、植物细胞、动物细胞及昆虫细胞。该系统可优选为哺乳 动物细胞，如来自ATCC细胞生物学库(Cell Biology Collection)中的CHO细胞。
典型的哺乳动物细胞组成型表达载体质粒包括CMV或含一个合适的多聚A尾巴 的SV40激活子以及抗性标志物(如新霉素)。一个实例为从Pharmacia公司(Piscataway， 新泽西，美国)获得的pSVL。一种可诱导型哺乳动物表达载体的例子是pMSG，也可 以从Pharmacia公司获得。有用的酵母质粒载体是pRS403-406和pRS413-416，一般可 从Stratagene Cloning Systems公司(La Jolla，CA 92037，美国)获得。质粒pRS403、pRS404、pRS405和pRS406是酵母整合型质粒(YIp)，并插入了酵母可选择性标记物HIS3、 TRP1、LEU2和URA3。pRS413-416质粒为酵母着丝粒质粒(Ycp)。基于CMV激活子 的载体(如，来自于Sigma-Aldrich公司)提供了瞬时或稳定的表达、胞浆表达或分泌， 以及FLAG、3xFLAG、c-myc或MATN不同组合物中的N-端或C-端标记。这些融合蛋 白可用于检测、纯化及分析重组蛋白。双标融合为检测提供了灵活性。
强劲的人巨细胞病毒(CMV)激活子调控区使得COS细胞中的组成蛋白表达水平 高达1mg/L。对于较弱的细胞株，蛋白水平一般低于0.1mg/L。SV40复制原点的出现 将导致DNA在SV40复制容纳性COS细胞中高水平复制。例如，CMV载体可包含细 菌细胞中的pMB1(pBR322的衍生物)复制原点、细菌中进行氨苄青霉素抗性选育的钙 -内酰胺酶基因、hGHpolyA和f1的原点。含前胰岛素原引导(PPT)序列的载体可使用 抗FLAG抗体、树脂和板引导FLAG融合蛋白分泌到进行纯化的培养基中。其他与各 种宿主细胞一起应用的载体和表达系统是本领域熟知众所周知的。
在另一个实施方案中，对本发明的两个或更多的肽或肽变体进行编码，因此，以一个连续顺序(类似于”一串珠子”的构建体)表达。在达到目标，所述肽或肽变体可能通 过连接符氨基酸的延伸处(例如LLLLLL)连接或融合一起，也可能他们之间没有任何 附加的肽而被连接。这些构建体也可用于癌症治疗，可诱导涉及MHC I和MHC II类分 子的免疫应答。
本发明还涉及一种宿主细胞，其以本发明的多核苷酸载体构建转化而来。宿主细胞 可为原核细胞，也可为真核细胞。在有些情况下，细菌细胞为优选原核宿主细胞，典型为大肠杆菌株，例如，大肠杆菌菌株DH5(从Bethesda Research Laboratories公司(Bethesda，MD，美国)获得)和RR1(从美国菌种保藏中心(ATCC，Rockville，MD，美 国)，ATCC编号31343获得)。首选的真核宿主细胞包括酵母、昆虫和哺乳动物细胞， 优选为脊椎动物细胞，如：小鼠、大鼠、猴子或人成纤维细胞和结肠癌细胞株中的细胞 。酵母宿主细胞包括YPH499、YPH500和YPH501，一般可从Stratagene Cloning Systems 公司(La Jolla，CA92037，美国)获得。首选哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO) 细胞为ATCC中的CCL61细胞、NIH瑞士小鼠胚胎细胞NIH/3T3为ATCC中的CRL 1658细胞、猴肾源性COS-1细胞为ATCC中的CRL 1650细胞以及人胚胎肾细胞的293 号细胞。首选昆虫细胞为Sf9细胞，可用杆状病毒表达载体转染。有关针对表达选择合 适宿主细胞的概要，可从教科书(Paulina Balbásand Argelia Lorence《Methods in Mo- lecular Biology Recombinant GeneExpression，Reviews and Protocols》Part One，Second Edition，ISBN 978-1-58829-262-9)和技术人员知道的其他文献中查到。
含本发明DNA结构的适当宿主细胞的转化可使用大家熟知的方法完成，通常取决于使用载体的类型。关于原核宿主细胞的转化，请参见，例如，Cohen等人的文献(Cohen etal.，1972)和(Green and Sambrook，2012)。酵母细胞的转化在Sherman等人的文章(Sherman et al.，1986)中进行了描述。Beggs(Beggs，1978)中所述的方法也很有用。对于脊椎动物细胞，转染这些细胞的试剂等，例如，磷酸钙和DEAE-葡聚糖或脂质体配方， 可从Stratagene Cloning Systems公司或Life Technologies公司(Gaithersburg，MD 20877，美国)获得。电穿孔也可用于转化和/或转染细胞，是本领域用于转化酵母细胞、细菌 细胞、昆虫细胞和脊椎动物细胞大家熟知的方法。
被成功转化的细胞(即含本发明DNA结构的细胞)可用大家熟知的方法(如PCR) 进行识别。另外，上清液存在的蛋白可使用抗体进行检测。
应了解，本发明中的某些宿主细胞用于制备本发明中的肽，例如细菌细胞、酵母细胞和昆虫细胞。但是，其他宿主细胞可能对某些治疗方法有用。例如，抗原提呈细胞(如 树突状细胞)可用于表达本发明中的肽，使他们可以加加载相应的MHC分子中。因此， 本发明提出了含本发明中核酸或表达载体的一种宿主细胞。
在一个优选实施方案中，宿主细胞为抗原提呈细胞，尤其是树突状细胞或抗原提呈 细胞。2010年4月29日，美国食品和药物管理局(FDA)批准载有含前列腺酸性磷酸酶(PAP)的重组融合蛋白可用于治疗无症状或症状轻微的转移性HRPC(Rini et al.，2006；Small et al.，2006)。
另一方面，本发明提出了一种配制一种肽及其变体的方法，该方法包括培养宿主细 胞和从宿主细胞或其培养基中分离肽。
在另一个实施方案中，本发明中的肽、核酸或表达载体用于药物中。例如，肽或其变体可制备为静脉(i.v.)注射剂、皮下(s.c.)注射剂、皮内(i.d.)注射剂、腹膜内(i.p.)注射剂、肌肉(i.m.)注射剂。肽注射的优选方法包括s.c.、i.d.、i.p.、i.m.和i.v.注射。DNA注射的优选方法为i.d.、i.m.、s.c.、i.p.和i.v.注射。例如，给予50μg至1.5mg，优选 为125μg至500μg的肽或DNA，这取决于具体的肽或DNA。上述剂量范围在以前的 试验中成功使用(Walter et al.，2012)。
用于主动免疫接种的多聚核苷酸可为基本纯化形式，也可包被于载体或输送系统。 核酸可能为DNA、cDNA、PNA、RNA，也可能为其组合物。这种核酸的设计和引入 方法为本领域所熟知。例如，文献中有其概述(Teufel et al.，2005)。多核苷酸疫苗很容 易制备，但这些载体诱导免疫反应的作用模式尚未完全了解。合适的载体和输送系统包 括病毒DNA和/或RNA，如基于腺病毒、牛痘病毒、逆转录病毒、疱疹病毒、腺相关 病毒或含一种以上病毒元素的混合病毒的系统。非病毒输送系统包括阳离子脂质体和阳 离子聚合物，是DNA输送所属领域内熟知的系统。也可使用物理输送系统，如通过” 基因枪”。肽或核酸编码的肽可以是一种融合蛋白，例如，含刺激T细胞进行上述CDR 的表位。
本发明的药剂也可能包括一种或多种佐剂。佐剂是那些非特异性地增强或加强免疫 反应的物质(例如，通过CD8-阳性T细胞和辅助T(TH)细胞介导的对一种抗原的免疫 应答，因此被视为对本发明的药剂有用。适合的佐剂包括(但不仅限于)1018ISS、铝 盐、
Figure BDA0001584383410000711
AS15、BCG、CP-870，893、CPG7909、CyaA、dSLIM、鞭毛蛋白或 鞭毛蛋白衍生的TLR5配体、FLT3配体、GM-CSF、IC30、IC31、咪喹莫特
Figure BDA0001584383410000712
、resiquimod、ImuFactIMP321、白细胞介素IL-2、IL-13、IL-21、干扰素α或β，或其 聚乙二醇衍生物、IS Patch、ISS、ISCOMATRIX、ISCOMs、
Figure BDA0001584383410000713
LipoVac、 MALP2、MF59、单磷酰脂A、Montanide IMS1312、Montanide ISA 206、Montanide ISA 50V、Montanide ISA-51、水包油和油包水乳状液、OK-432、OM-174、OM-197-MP-EC 、ONTAK、OspA、
Figure BDA0001584383410000714
载体系统、基于聚丙交酯复合乙交酯[PLG]和右旋糖苷微 粒、重组人乳铁传递蛋白SRL172、病毒颗粒和其他病毒样颗粒、YF-17D、VEGF trap 、R848、β-葡聚糖、Pam3Cys、源自皂角苷、分支杆菌提取物和细菌细胞壁合成模拟物 的Aquila公司的QS21刺激子，以及其他专有佐剂，如：Ribi′s Detox、Quil或Superfos 。优选佐剂如：弗氏佐剂或GM-CSF。前人对一些树突状细胞特异性免疫佐剂(如MF59) 及其制备方法进行了描述(Allison and Krummel，1995)。也可能使用细胞因子。一些细 胞因子直接影响树突状细胞向淋巴组织迁移(如，TNF-)，加速树突状细胞成熟为T淋巴细胞的有效抗原提呈细胞(如，GM-CSF、IL-1和IL-4)(美国5849589号专利，特 别以其完整引用形式并入本文)，并充当免疫佐剂(如IL-12、IL-15、IL-23、IL-7、IFN-α 、IFN-β)(Gabrilovich et al.，1996)。
据报告，CpG免疫刺激寡核苷酸可提高佐剂在疫苗中的作用。如果没有理论的约束，CpG寡核苷酸可通过Toll样受体(TLR)(主要为TLR9)激活先天(非适应性) 免疫系统从而起作用。CpG引发的TLR9活化作用提高了对各种抗原的抗原特异性体液 和细胞反应，这些抗原包括肽或蛋白抗原、活病毒或被杀死的病毒、树突状细胞疫苗、 自体细胞疫苗以及预防性和治疗性疫苗中的多糖结合物。更重要的是，它会增强树突状 细胞的成熟和分化，导致TH1细胞的活化增强以及细胞毒性T淋巴细胞(CTL)生成加强， 甚至CD4 T细胞说明的缺失。甚至有疫苗佐剂的存在也能维持TLR9活化作用诱发的 TH1偏移，这些佐剂如：正常促进TH2偏移的明矾或弗氏不完全佐剂(IFA)。CpG寡核苷 酸与以下其他佐剂或配方一起制备或联合给药时，表现出更强的佐剂活性，如微粒、纳 米粒子、脂肪乳或类似制剂，当抗原相对较弱时，这些对诱发强反应尤为必要。他们还 能加速免疫反应，使抗原剂量减少约两个数量级，在有些实验中，对不含CpG的全剂 量疫苗也能产生类似的抗体反应(Krieg，2006)。美国6406705 B1号专利对CpG寡核苷 酸、非核酸佐剂和抗原结合使用促使抗原特异性免疫反应进行了描述。一种CpG TLR9 拮抗剂为Mologen公司(德国柏林)的dSLIM(双干环免疫调节剂)，这是本发明药 物组合物的优选成分。也可使用其他如TLR结合分子，如：RNA结合TLR7、TLR8和 /或TLR9。
其他有用的佐剂例子包括(但不限于)化学修饰性CpG(如CpR、Idera)、dsRNA 模拟物，如，Poly(I:C)及其衍生物(如：AmpliGen、Hiltonol、多聚-(ICLC)、多聚(IC-R) 、多聚(I:C12U))、非CpG细菌性DNA或RNA以及免疫活性小分子和抗体，如：环 磷酰胺、舒尼替单抗、
Figure BDA0001584383410000721
西乐葆、NCX-4016、西地那非、他达拉非、伐地 那非、索拉非尼、替莫唑胺、temsirolimus、XL-999、CP-547632、帕唑帕尼、VEGF Trap 、ZD2171、AZD2171、抗-CTLA4、免疫系统的其他抗体靶向性主要结构(如：抗-CD40 、抗-TGFβ、抗-TNFα受体)和SC58175，这些药物都可能有治疗作用和/或充当佐剂。 技术人员无需过度进行不当实验就很容易确定本发明中有用的佐剂和添加剂的数量和 浓度。
首选佐剂是抗-CD40、咪喹莫特、瑞喹莫德、GM-CSF、环磷酰胺、舒尼替尼、贝 伐单抗、干扰素α、CpG寡核苷酸及衍生物、多聚(I:C)及衍生物、RNA、西地那非和 PLG或病毒颗粒的微粒制剂。
本发明药物组合物的一个优选实施方案中，佐剂从含集落刺激因子制剂中选择，如 粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF，沙格司亭)、环磷酰胺、咪喹莫特、resiquimod和干扰素-α。
本发明药物组合物的一个优选实施方案中，佐剂从含集落刺激因子制剂中选择，如 粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF，沙格司亭)、环磷酰胺、咪喹莫特和resimiquimod。在本发明药物组合物的一个优选实施方案中，佐剂为环磷酰胺、咪喹莫 特或resiquimod。更优选的佐剂是Montanide IMS 1312、Montanide ISA 206、Montanide ISA50V、Montanide ISA-51、聚-ICLC
Figure BDA0001584383410000731
和抗CD40 mAB或其组合物。
此组合药物为非肠道注射使用，如皮下、皮内、肌肉注射，也可口服。为此，肽和 其他选择性分子在药用载体中分解或悬浮，优选为水载体。此外，组合物可包含辅料， 如：缓冲剂、结合剂、冲击剂、稀释剂、香料、润滑剂等。这些肽也可与免疫刺激物质 合用，如：细胞因子。可用于此类组合物的更多辅料可在从A.Kibbe所著的Handbook of PharmaceuticalExcipients(Kibbe，2000)等书中获知。此组合药物可用于阻止、预防和/ 或治疗腺瘤或癌性疾病。例如，EP2112253中有示例制剂。
重要的是要认识到，通过本发明的疫苗引发的免疫应答在不同的细胞阶段和开发的 不同阶段攻击癌症。而且不同的癌症相关信号通路被攻击。这相对于其他疫苗的优势，这些疫苗只针对一个或几个靶标，这可能会导致肿瘤很容易适应于攻击(肿瘤逃逸)。 此外，并非所有的个体肿瘤都表达相同模式的抗原。因此，几个肿瘤相关肽的组合确保 了每个肿瘤都承担至少一些靶标。该组合物以这样的方式设计，预期每个肿瘤可表达几 种抗原并覆盖肿瘤生长和维持所需要的几种独立的途径。因此，疫苗可易于”现成的” 用于较大患者群体。这意味着，预选择接受疫苗治疗的患者可限制为HLA分型，无需 抗原表达的任何额外的生物标志物评估，但仍然确保多个靶标同时被诱导的免疫应答攻 击，这对于疗效很重要(Banchereau et al.，2001；Walter et al.，2012)。
本文所用的”支架”一词是指与(如抗原)决定因子特异性结合的分子。在一项实施方案中，支架是能够引导其所连接的实体(例如，(第二)抗原结合部分)至目标靶 点，例如，至特定类型的肿瘤细胞或承载抗原决定簇的肿瘤基质(如根据目前申请中肽 和MHC的复合体)。在另一项实施例中，支架能够通过其靶抗原(例如T细胞受体复 合体抗原)激活信号通路。支架包括但不限于抗体及其片段，抗体的抗原结合区，其包 含抗体重链可变区和抗体轻链可变区，结合的蛋白包括至少一个锚蛋白重复序列基元和 单域抗原结合(SDAB)分子、适体、(可溶)TCR和(经修饰的)细胞，例如同种异体 或自体T细胞。为了评估某个分子是否是结合至靶点的支架，可进行结合测定。
“特定”结合系指，与其他天然肽-MHC复合体相比，该支架与感兴趣的肽-MHC复 合体更好地结合，结合程度为，拥有能够杀死承载特定靶点细胞的活性分子的支架不能 够杀死无特定靶点但提呈一个或多个其他肽-MHC复合体的另一细胞。如果交叉反应性 肽-MHC的肽并不是天然的，即，并非来自人HLA-多肽组，则结合至其他肽-MHC复 合体是无关紧要的。评估靶细胞杀伤的测试在本领域中是公知的。它们应该含有未改变 的肽-MHC提呈的靶细胞(原发细胞或细胞系)或载有肽的细胞进行，以便达到天然肽 -MHC的水平。
各支架可包括一个标记，其通过确定是否存在或不存在卷标所提供的信号可检测到 结合支架。例如，该支架可用荧光染料或任何其他适用的细胞标记分子进行标记。此类标记分子是本领域中公知的。例如，通过荧光染料进行的荧光标记可通过荧光或激光扫 描显微术或流式细胞术提供结合适体的可视化。
各支架可与第二个活性分子(例如IL-21、抗CD3、抗CD28)共轭。
关于多肽支架的进一步信息，可参阅，例如，在WO 2014/071978A1背景技术部 分，并作为参考文献引用。
本发明还涉及适体。适体(例如，参见WO 2014/191359及其中引用的文献)是短 的单链核酸分子，其可以折迭为所定义的三维结构并识别特定的靶标结构。它们似乎是 开发靶向治疗的合适替代方法。适体已显示可选择性与具有高亲和力和特异性的复合体 靶标相结合。
识别细胞表面分子的适体在过去十年内已经确定，并为开发诊断和治疗方法提供了 手段。由于适体已显示几乎无毒性和免疫原性，因此，它们是生物医学应用中有前景的候选物质。事实上适体，例如前列腺特异性膜抗原识别适体，已被成功地用于靶向治疗 并在体内模型的异种移植物中显示出功能。此外，认识到特定肿瘤细胞系的适体也已确 定。
可选择DNA适体来揭示各种癌细胞的广谱标识属性，特别是那些来自于实体瘤的细胞，而非致瘤和主要健康细胞不被识别。如果所识别的适体不仅识别肿瘤特异性子类型，而且与一系列肿瘤相互作用，这使适体适用于作为所谓的广谱诊断和治疗手段。
此外，用流式细胞仪对细胞结合行为的研究显示，适体在纳摩尔范围内显示出很好 的亲和力。
适体用于诊断和治疗目的。此外，也可能显示，一些适体被肿瘤细胞吸取，因而可作为抗癌剂靶向递送的分子赋形剂，例如siRNA进入肿瘤细胞。
可选择适体针对复合体的靶标，如细胞和组织以及包含、优选包括根据任何SEQID NO 1至SEQ ID NO 388的一个序列、根据当前发明的肽复合体与MHC分子，使用细 胞SELEX(通过指数富集的配体系统进化)技术。
本发明中的肽可用于生成和开发出针对MHC/肽复合物的特定抗体。这些抗体可用于治疗，将毒素或放射性物质靶向病变组织。这些抗体的另一用途是为了成像之目的(如PET)将放射性核素靶向病变组织。这可有助于检测小转移灶或确定病变组织的大小和 准确位置。
因此，本发明的另一方面是提出产生特异性结合至与HLA限制性抗原络合的I或II类人主要组织兼容性复合体(MHC)的一种重组抗体的方法，该方法包括：用可溶形式 的与HLA限制性抗原络合的(MHC)I或II类分子对包含表达所述主要组织兼容性说复 合体(MHC)I或II类的基因工程非人哺乳动物进行免疫；将mRNA分子与产生所述非 人哺乳动物细胞的抗体分离；产生一个噬菌体显示库，显示由所述mRNA分子编码的 蛋白分子；以及将至少一个噬菌体与所述噬菌体显示库分离，所述的至少一个噬菌体显 示所述抗体特异性地结合至与HLA限制性抗原络合的所述人主要组织兼容性说复合体 (MHC)I或II类。
本发明的另一方面提出一种抗体，其特异性结合至与一种HLA限制性抗原络合的I或II类人主要组织兼容性说复合体(MHC)，其中该抗体优选为多克隆抗体、单克隆抗 体、双特异性抗体和/或嵌合抗体。
产生这种抗体和单链I类主要组织兼容性复合物的相应方法，以及产生这些抗体的 其他工具在WO 03/068201、WO 2004/084798、WO 01/72768、WO 03/070752以及出版 物(Cohen et al.，2003a；Cohen et al.，2003b；Denkberg et al.，2003)中进行了披露，为了本 发明之目的，所有参考文献通过引用被完整地并入本文。
优选地，该抗体与复合体的结合亲和力低于20纳摩尔，优选为低于10纳摩尔，这在本发明情况下也被视为具有”特异性”。
本发明涉及一种肽，包含选自SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：388的序列或该序列的与SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：388具有88％同源性(优选为相同)的变体，或诱导与 所述变异肽发生T细胞交叉反应的变体，其中，所述肽不是基本的全长多肽。
本发明进一步涉及一种肽，包含选自SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：388的序列、或 与SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：388具有至少88％同源性(优选为相同)的变体，其中 所述肽或变体的总长度为8至100个、优选为8至30个、最优选为8至14个氨基酸。
本发明进一步涉及本发明的肽，其具有与主要组织兼容性复合体(MHC)I或II类分子结合的能力。
本发明进一步涉及本发明中的肽，其中肽由或基本由SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：388的基酸序列组成。
本发明进一步涉及本发明的肽，其中该肽(在化学上)被修饰，和/或包含非肽键 。
本发明进一步涉及本发明的肽，其中该肽为融合蛋白的一部分，特别包括HLA-DR抗原相关不变链(Ii)的N-端氨基酸，或其中该肽与一种抗体(例如，树突状细胞特定 抗体)融合。
本发明进一步涉及一种核酸，其编码本发明所述肽，前提是该肽并非完整(完全)的人蛋白。
本发明进一步涉及一种本发明的核酸，为DNA、cDNA、PNA、RNA，也可以为 其组合物。
本发明进一步涉及能表达本发明核酸的表达载体。
本发明进一步涉及本发明的肽、本发明的核酸或本发明的表达载体的药用用途，特 别是用于治疗癌症，例如，脑胶质细胞瘤、乳腺癌、结直肠癌、肾细胞癌、慢性淋巴细 胞性白血病、肝细胞癌、非小细胞和小细胞肺癌、非霍奇金淋巴瘤、急性骨髓性白血病 、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、包括胃食管交界癌的食管癌、胆囊癌和胆管癌、黑色素 瘤、胃癌(GC)、睾丸癌(TC)、膀胱癌(UBC)、头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)或子宫癌(UEC) 。
本发明进一步涉及含本发明核酸或本发明表达载体的宿主细胞。
本发明进一步涉及本发明的宿主细胞，其为抗原提呈细胞，优选为树突细胞。
本发明进一步涉及制备本发明肽的方法，所述方法包括培养本发明的宿主细胞和从 所述宿主细胞或其培养基中分离肽。
本发明进一步涉及本发明中的方法，其中通过使足量的抗原与抗原提呈细胞接触， 抗原被载在表达于合适抗原提呈细胞或人工抗原呈递细胞表面的I或II类MHC分子上。
本发明进一步涉及本发明的方法，其中该抗原提呈细胞包括一个表达载体，该载体 有能力表达含SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：388或所述变体氨基酸序列的肽。
本发明进一步涉及以本发明方法制造的激活T细胞，其中所述T细胞有选择性地识别一种细胞，该细胞异常表达含本发明氨基酸序列的多肽。
本发明进一步涉及一种杀伤患者靶细胞的方法，其中患者的靶细胞异常表达含本发 明任何氨基酸序列的多肽，该方法包括给予患者本发明的有效量T细胞。
本发明进一步涉及本发明的任何肽、核酸、本发明的表达载体、本发明的细胞、本发明的激活细胞毒性T淋巴细胞作为药物或在制造药物中的用途。本发明进一步涉及本 发明的用途，其中药物可有效抗癌。
本发明进一步涉及一种本发明的用途，其中该药物为一种疫苗。本发明进一步涉及 一种本发明的用途，其中药物可有效抗癌。
本发明还涉及本发明的用途，其中所述癌细胞为实体或血液肿瘤细胞，如：例如，脑胶质细胞瘤、乳腺癌、结直肠癌、肾细胞癌、慢性淋巴细胞性白血病、肝细胞癌、非 小细胞和小细胞肺癌、非霍奇金淋巴瘤、急性骨髓性白血病、卵巢癌、胰腺癌、前列腺 癌、包括胃食管交界癌的食管癌、胆囊癌和胆管癌、黑色素瘤、胃癌、睾丸癌、膀胱癌 、头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)或子宫癌。
本发明进一步涉及一种基于本发明肽的特定标志物蛋白和生物标志物，在此称为“靶标”，其可用于诊断和/或判断脑胶质细胞瘤、乳腺癌、结直肠癌、肾细胞癌、慢性 淋巴细胞性白血病、肝细胞癌、非小细胞和小细胞肺癌、非霍奇金淋巴瘤、急性骨髓性 白血病、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、包括胃食管交界癌的食管癌、胆囊癌和胆管癌、 黑色素瘤、胃癌、睾丸癌、膀胱癌、头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)或子宫癌的预后。本 发明还涉及这些供癌症治疗使用的新靶点。
本文中术语”抗体”为广义上的定义，既包括多克隆也包括单克隆抗体。除了完整或” 全部”的免疫球蛋白分子，”抗体”这一术语还包括这些免疫球蛋白分子和人源化免疫球 蛋白分子的片段(如，CDR、Fv、Fab和Fc片段)或聚合物，只要它们表现出本发明 的任何期望属性(例如，脑胶质细胞瘤、乳腺癌、结直肠癌、肾细胞癌、慢性淋巴细胞 性白血病、肝细胞癌、非小细胞和小细胞肺癌、非霍奇金淋巴瘤、急性骨髓性白血病、 卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、包括胃食管交界癌的食管癌、胆囊癌和胆管癌、黑色素瘤 、胃癌、睾丸癌、膀胱癌、头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)或子宫癌标志物(多)肽的特 异性结合、将毒素传递给癌症标志物基因表达水平增加时的癌细胞和/或抑制癌标志物 多肽的活性)。
只要有可能，本发明的抗体可从商业来源购买。本发明的抗体也可能使用已知的方 法制得。技术人员会了解全长脑胶质细胞瘤、乳腺癌、结直肠癌、肾细胞癌、慢性淋巴 细胞性白血病、肝细胞癌、非小细胞和小细胞肺癌、非霍奇金淋巴瘤、急性骨髓性白血 病、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、包括胃食管交界癌的食管癌、胆囊癌和胆管癌、黑色 素瘤、胃癌、睾丸癌、膀胱癌、头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)或子宫癌(UEC)标志物多 肽或其片段可用于产生本发明的抗体。用于产生本发明抗体的多肽可部分或全部地由天 然源经纯化而得，也可利用重组DNA技术生产。
例如，本发明的编码肽的cDNA，例如，该肽为根据SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：388多肽的肽，或其中一个变体或片段，可在原核细胞中(如：细菌)或真核细胞(如：酵 母、昆虫或哺乳动物细胞)中表达，之后，可纯化重组蛋白，并用于产生一种特异性结 合用于产生本发明抗体的上述癌症标志物多肽的单克隆或多克隆抗体制剂。
本领域的技术人员会认识到，两种或两种以上不同集合的单克隆抗体或多克隆抗体 能最大限度地增加获得一种含预期用途所需的特异性和亲和力(例如，ELISA法、免疫组织化学、体内成像、免疫毒素疗法)的抗体的可能性。根据抗体的用途，用已知的方 法对其期望活性进行测试(例如，ELISA法、免疫组织化学、免疫治疗等；要获取产生 和测试抗体的进一步指导，请参阅，例如，Greenfield，2014(Greenfield，2014))。例如， 该抗体可用ELISA法或免疫印迹法、免疫组织化学染色福尔马林固定的癌组织或冰冻 的组织切片进行检测。在初次体外表征后，用于治疗或体内诊断用途的抗体根据已知的 临床测试方法进行检测。
此处使用的术语”单克隆抗体”系指从大量同质抗体中获得的一种抗体，即，由相同 的抗体组成的抗体群，但可能少量提呈的自然突变除外。此处所述的单克隆抗体具体包括”嵌合”抗体，其中一部分重链和/或轻链与从特定物种中获得的抗体或属于特定抗体 类型和分类型抗体的相应序列相同(同质)，同时，剩余链与从其他物种中获得的抗体 或属于特定抗体类型和子类型抗体的相应序列以及这些抗体的片段相同(同质)，只要 他们表现出预期的拮抗活性(美国4816567号专利，其在此以其整体并入)。
本发明的单克隆抗体可能使用杂交瘤方法制得。在杂交瘤方法中，老鼠或其他适当 的宿主动物，通常用免疫制剂以引发产生或能产生将特异性结合至免疫制剂的抗体。或者，淋巴细胞可在体外进行免疫。
单克隆抗体也可由DNA重组方法制得，如：美国4816567号专利所述。编码本发 明单克隆抗体的DNA可很容易地使用传统程序进行分离和测序(例如：通过使用能与 编码鼠抗体重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)。
体外方法也适用于制备单价抗体。抗体消化以产生抗体的片段，尤其是Fab片段，可以通过使用本领域已知的常规技术完成。例如，可以通过使用木瓜蛋白酶完成消化。 木瓜蛋白酶消化的实施例在WO 94/29348和美国4342566号专利中有描述。抗体的木 瓜蛋白酶消化通常产生两种相同的抗原结合性片段，称为Fab片段(每个片段都有一个 抗原结合点)和残余Fc片段。胃蛋白酶处理产生一个F(ab′)2片段和一个pFc′片段。
抗体片段，不论其是否附着于其他序列，均可包括特定区域或特定氨基酸残基的插 入、删除、替换、或其他选择性修饰，但前提是，片段的活性与非修饰的抗体或抗体片 段相比没有显著的改变或损害。这些修饰可提供一些额外的属性，如：删除/添加可与 二硫键结合的氨基酸，以增加其生物寿命、改变其分泌特性等。在任何情况下，抗体片 段必须拥有生物活性的特性，如：结合活性、调节结合域的结合力等。抗体的功能性或 活性区域可通过蛋白特定区域的基因突变、随后表达和测试所表达的多肽进行确定。这 些方法为本行业技术人员所熟知，可包括编码抗体片段的核酸的特定位点基因突变。
本发明的抗体可进一步包括人源化抗体或人抗体。非人(如：鼠)抗体的人源化形式为嵌合抗体免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(如：Fv、Fab、Fab′或抗体的其他 抗原结合序列)，其中包含从非人免疫球蛋白中获得的最小序列。人源化抗体包括人免 疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体互补决定区(CDR)的残基被来自非人物种(供 体抗体)(如具有与其特异性、亲和力和能力的小鼠、大鼠或兔子)CDR的残基取代 。在某些情况下，人类免疫球蛋白的Fv框架(FR)残基被相应的非人残基取代。人源化 抗体可能还包括既非受体抗体、也非输入CDR或框架序列中发现的残基。一般来说， 人源化抗体将包括几乎所有的至少一个、通常为二个可变域，其中，全部或几乎全部的 CDR区域均对应于非人免疫球蛋白的区域并且全部或几乎全部的FR区域均为人免疫 球蛋白相同序列的区域。理想情况是，人源化抗体还将包括至少免疫球蛋白恒定区(Fc) 的一部分，通常是人免疫球蛋白的恒定区的一部分。
人源化非人抗体的方法为本行业所熟知。一般来说，人源化抗体具有一个或多个从 非人源头引入的氨基酸残基。这些非人氨基酸残基往往被称为”输入”残基，通常从”输入”可变域中获得。人源化基本上可以通过将啮齿动物CDR或CDR序列取代为相应的 人抗体序列而完成。因此，这种”人源化”抗体为嵌合抗体(美国4816567号专利)，其 中大大少于完整的人可变域被来自于非人物种的相应序列取代。在实践中，人源化抗体 通常为人抗体，其中有些CDR残基以及可能的一些FR残基被来自啮齿动物抗体中的 类似位点的残基取代。
可使用免疫后在内源性免疫球蛋白产生缺失时能产生完整人抗体的转基因动物(如： 小鼠)。例如，它被描述为，嵌合和种系突变小鼠中的抗体重链连接区域基因的纯合性缺失导致内源性抗体生成的完全抑制。在此种系变种小鼠中人种系免疫球蛋白基因数组的转移在抗原挑战后将导致人抗体的生成。人抗体也可在噬菌体展示库中产生。
本发明的抗体优选为通过药用载体的形式给予受试者。通常，在制剂中使用适量的 药用盐，以使制剂等渗。药用载体的例子包括生理盐水、林格氏液和葡萄糖溶液。溶液的pH值优选为约5至8，更优选为约7至7.5。此外，载体还包括缓释制剂，如：含有 抗体的固体疏水性聚合物半透性基质，其中基质为有形物品形式，如：薄膜、脂质体或 微粒。本行业的技术人员熟知，某些载体可能为更优选，取决于例如，抗体的给药途径 和浓度。
该抗体可通过注射(如：静脉内、腹腔内、皮下、肌肉内)或通过输注等其他方法 给予受试者、患者或细胞，确保其以有效的形式传输到血液中。这些抗体也可以通过瘤 内或瘤周途径给予，从而发挥局部和全身的治疗作用。局部或静脉注射为优选。
抗体给药的有效剂量和时间表可根据经验确定，并且作出此类决定属本行业的技术 范围内。本行业的技术人员会明白，必须给予的抗体剂量根据以下因素会有所不同，例如：接受抗体的受试者、给药途径、使用的抗体以及其他正在使用的药物的特定类型。 单独使用的抗体的通常日剂量可能为约1μg/kg至最多100mg/kg体重或更多，这取决 于上述因素。给予抗体，优选为治疗脑胶质细胞瘤、乳腺癌、结直肠癌、肾细胞癌、慢 性淋巴细胞性白血病、肝细胞癌、非小细胞和小细胞肺癌、非霍奇金淋巴瘤、急性骨髓 性白血病、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、包括胃食管交界癌的食管癌、胆囊癌和胆管癌 、黑色素瘤、胃癌、睾丸癌、膀胱癌、头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)或子宫癌后，治疗 抗体的疗效可通过技术人员熟知的不同方法评估。例如：接受治疗的受试者癌症的大小 、数量和/或分布可使用标准肿瘤成像技术进行监测。因治疗而给予的抗体与不给予抗 体时的病程相比，可阻止肿瘤生长、导致肿瘤缩小、和/或阻止新肿瘤的发展，这样的 抗体是一种有效治疗癌症的抗体。
本发明的另一方面提出了制备识别特异性肽-MHC复合物的可溶性T细胞受体(sTCR)的一种方法。这种可溶性T细胞受体可从特异性T细胞克隆中产生，并且它们 的亲和力可以通过互补决定区靶向诱变而增加。为了T细胞受体选择之目的，可以使用 噬菌体展示(美国2010/0113300，(Liddy et al.，2012))。为了在噬菌体展示期间以及实 际使用为药物时稳定T细胞受体之目的，可通过非天然二硫键、其他共价键(单链T细 胞受体)或通过二聚化结构域连接α和β链(Boulter et al.，2003；Card et al.，2004；Willcox et al.，1999)。T细胞受体可以连接到毒素、药物、细胞因子(参见US 2013/0115191) 、域招募效应细胞，如抗CD3域等，以便对靶细胞执行特定的功能。此外，它可能表 达于用于过继转移的T细胞。进一步的信息可在WO 2004/033685A1和WO 2004/074322A1中找到。sTCR的组合在WO2012/056407A1中进行了描述。WO 2013/057586A1中公开了制备的进一步的方法。
此外，可用本发明的肽和/或TCR或抗体或其他结合分子在活检样本的基础上验证病理师对癌症的诊断。
该抗体或TCR也可用于体内诊断实验。一般来说，抗体用放射性核素标记(如：111In、99Tc、14C、131I、3H、32P或35S)，从而可免疫闪烁扫描法使肿瘤局限化。在一 实施方案中，其中的抗体或片段与两个或两个以上选自包括上述蛋白的组的蛋白质靶目 标细胞外域结合，并且亲和力值(Kd)低于1x10μM。
诊断用抗体可通过各种影像学方法使用适合检测的探针进行标记。探针检测方法包 括但不限于，荧光、光、共聚焦和电镜方法；磁共振成像和光谱学技术；透视、计算机 断层扫描和正电子发射断层扫描。合适的探针包括但不限于，荧光素、罗丹明、曙红及 其它荧光团、放射性同位素、黄金、钆和其他稀土、顺磁铁、氟-18和其他正电子发射 放射性核素。此外，探针可能是双功能或多功能的，并且用一种以上的上述方法可进行 检测。这些抗体可用所述的探针直接或间接进行标记。抗体探针的连接，包括探针的共 价连接、将探针融合入抗体、以及螯合化合物的共价连接从而结合探针、以及其他本行 业熟知的方法。对于免疫组织化学方法，疾病组织样本可能是新鲜或冷冻或可能包埋于 石蜡中以及用福尔马林等防腐剂固定。固定或包埋的切片包括与标记一抗和二抗接触的 样本，其中该抗体用于检测原位蛋白的表达。
本发明的另一方面包括一种体外制备激活的T细胞的方法，该方法包括将T细胞与载有抗原的人MHC分子进行体外连接，这些分子在合适的抗原提呈细胞表面表达足 够的一段时间从而以抗原特异性方式激活T细胞，其中所述抗原为根据本发明所述的一 种肽。优选情况是足够量的抗原与抗原提呈细胞一同使用。
优选情况是，哺乳动物细胞的TAP肽转运载体缺乏或水平下降或功能降低。缺乏TAP肽转运载体的适合细胞包括T2、RMA-S和果蝇细胞。TAP是与抗原加工相关的转 运载体。
人体肽载入的缺陷细胞株T2从属美国菌种保藏中心(ATCC，12301ParklawnDrive， Rockville，Maryland 20852，美国)目录号CRL1992；果蝇细胞株Schneider 2号株从属 ATCC目录CRL 19863；小鼠RMA-S细胞株Ljunggren等人描述过(Ljunggren and Karre， 1985、。
优选情况是，宿主细胞在转染前基本上不表达MHC I类分子。刺激因子细胞还优选为表达对T细胞共刺激信号起到重要作用的分子，如，B7.1、B7.2、ICAM-1和LFA 3中的任一种分子。大量MHC I类分子和共刺激分子的核酸序列可从GenBank和EMBL 数据库中公开获得。
当MHC I类表位用作一种抗原时，T细胞为CD8阳性T细胞。
如果抗原提呈细胞受到转染而表达这种表位，则优选的细胞包括一个表达载体，该 载体有能力表达含SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：388的肽或变体氨基酸序列。
可使用其他一些方法来体外生成T细胞。例如，自体肿瘤浸润性淋巴细胞可用于生成CTL。Plebanski等人在(Plebanski et al.，1995)使用自体外周血淋巴细胞(PLB)制得T细胞。另外，也可能用肽或多肽脉冲处理树突状细胞或通过与重组病毒感染而制成自体 T细胞。此外，B细胞可用于制备自体T细胞。此外，用肽或多肽脉冲处理或用重组 病毒感染的巨噬细胞可用于配制自体T细胞。S.Walter等人在(Walter et al.，2003)中描 述了通过使用人工抗原提呈细胞(aAPC)体外激活T细胞，这也是生成作用于所选肽的 T细胞的一种合适方法。在本发明中，根据生物素：链霉素生物化学方法通过将预制的 MHC：肽复合物耦合到聚苯乙烯颗粒(微球)而生成aAPC。该系统实现了对aAPC上 的MHC密度进行精确调节，这使得可以在血液样本中选择地引发高或低亲合力的高效 抗原特异性T细胞反应。除了MHC：肽复合物外，aAPC还应携运含共刺激活性的其 他蛋白，如耦合至表面的抗-CD28抗体。此外，此类基于aAPC的系统往往需要加入适 当的可溶性因子，例如，诸如白细胞介素12的细胞因子。
也可用同种异体细胞制得T细胞，在WO 97/26328中详细描述了一种方法，以参 考文献方式并入本文。例如，除了果蝇细胞和T2细胞，也可用其他细胞来提呈肽，如 CHO细胞、杆状病毒感染的昆虫细胞、细菌、酵母、牛痘感染的靶细胞。此外，也可 使用植物病毒(例如，参阅Porta等人在(Porta et al.，1994)中描述了将豇豆花叶病毒开 发为一种提呈外来肽的高产系统。
被激活的T细胞直接针对本发明中的肽，有助于治疗。因此，本发明的另一方面提出了用本发明前述方法制得的激活T细胞。
按上述方法制成的激活T细胞将会有选择性地识别异常表达含SEQ ID NO：1至SEQ ID NO 388氨基酸序列的多肽。
优选情况是，T细胞通过与其含HLA/肽复合物的TCR相互作用(如，结合)而识 别该细胞。T细胞是杀伤患者靶细胞方法中有用的细胞，其靶细胞异常表达含本发明中 氨基酸序列的多肽。此类患者给予有效量的激活T细胞。给予患者的T细胞可能源自 该患者，并按上述方法激活(即，它们为自体T细胞)。或者，T细胞不是源自该患者， 而是来自另一个人。当然，优选情况是该供体为健康人。发明人使用”健康个人”系指一 个人一般状况良好，优选为免疫系统合格，更优选为无任何可很容易测试或检测到的疾 病。
根据本发明，CD8-阳性T细胞的体内靶细胞可为肿瘤细胞(有时表达MHC-II类抗原)和/或肿瘤周围的基质细胞(肿瘤细胞)(有时也表达MHC-II类抗原；(Dengjel et al.，2006))。
本发明所述的T细胞可用作治疗性组合物中的活性成分。因此，本发明也提出了一种杀伤患者靶细胞的方法，其中患者的靶细胞异常表达含本发明中氨基酸序列的多肽， 该方法包括给予患者上述有效量的T细胞。
发明人所用的”异常表达”的意思还包括，与正常组织表达水平相比，多肽过量表达， 或该基因在从肿瘤获得的组织中未表达而在肿瘤中表达。”过量表达”系指多肽水平至少 为正常组织中的1.2倍；优选为至少为正常组织中的2倍，更优选为至少5或10倍。
T细胞可用本领域已知的方法制得(如，上述方法)。
T细胞继转移方案为本领域所熟知的方案。综述可发现于：Gattioni et al.和Morgan et al.(Gattinoni et al.，2006；Morgan et al.，2006)。
本发明的另一个方面包括使用与MHC复合的肽，以生成T细胞受体，其核酸被克 隆并被引入至宿主细胞，优选为T细胞。然后，该通过基因工程改变的T细胞可转给 患者用于癌症治疗。
本发明的任一分子(即肽、核酸、抗体、表达载体、细胞，激活T细胞、T细胞受 体或编码核酸)都有益于治疗疾病，其特点在于细胞逃避免疫反应的打击。因此，本发 明的任一分子都可用作药剂或用于制造药剂。这种分子可单独使用也可与本发明中的其 他分子或已知分子联合使用。
本发明还涉及一种试剂盒，其包括：
(a)一个容器，包含上述溶液或冻干粉形式的药物组合物；
(b)可选的第二个容器，其含有冻干粉剂型的稀释剂或重构液；和
(c)可选的(i)溶液使用或(ii)重构和/或使用冻干制剂的说明。
该试剂盒还进一步包括一个或多个(iii)缓冲剂，(iv)稀释剂，(v)过滤液，(vi)针， 或(v)注射器。容器最好是瓶子、小瓶、注射器或试管，可以为多用途容器。药物组合 物最好是冻干的。
本发明中的试剂盒优选包含一种置于合适容器中的冻干制剂以及重组和/或使用说 明。适当的容器包括，例如瓶子、西林瓶(如双室瓶)、注射器(如双室注射器)和试管。 该容器可能由多种材料制成，如玻璃或塑料。试剂盒和/或容器最好有容器或关于容器 的说明书，指明重组和/或使用的方向。例如，标签可能表明冻干剂型将重组为上述肽 浓度。该标签可进一步表明制剂用于皮下注射。
存放制剂的容器可使用多用途西林瓶，使得可重复给予(例如，2-6次)重组剂型 。该试剂盒可进一步包括装有合适稀释剂(如碳酸氢钠溶液)的第二个容器。
稀释液和冻干制剂混合后，重组制剂中的肽终浓度优选为至少0.15mg/mL/肽 (＝75μg)，不超过3mg/mL/肽(＝1500μg)。该试剂盒还可包括商业和用户角度来说可取的 其他材料，包括其他缓冲剂、稀释剂，过滤液、针头、注射器和带有使用说明书的包装 插页。
本发明中的试剂盒可能有一个单独的容器，其中包含本发明所述的药物组合物制剂， 该制剂可有其他成分(例如，其他化合物或及其药物组合物)，也可无其他成分，或者每种成分都有其不同容器。
优选情况是，本发明的试剂盒包括与本发明的一种制剂，包装后与第二种化合物(如 佐剂(例如GM-CSF)、化疗药物、天然产品、激素或拮抗剂、抗血管生成剂或抑制剂 、凋亡诱导剂或螯合剂)或其药物组合物联合使用。该试剂盒的成分可进行预络合或每 种成分在给予患者之前可放置于单独的不同容器。该试剂盒的成分可以是一种或多种溶 液，优选为水溶液，更优选为无菌水溶液。该试剂盒的成分也可为固体形式，加入合适 的溶剂后转换为液体，最好放置于另一个不同的容器中。
治疗试剂盒的容器可能为西林瓶、试管、烧瓶、瓶子、注射器、或任何其他盛装固体或液体的工具。通常，当成分不只一种时，试剂盒将包含第二个西林瓶或其他容器， 使之可以单独定量。该试剂盒还可能包含另一个装载药用液体的容器。优选情况是，治 疗试剂盒将包含一个设备(如，一个或多个针头、注射器、滴眼器、吸液管等)，使得 可注射本发明的药物(本试剂盒的组合物)。
本发明的药物配方适合以任何可接受的途径进行肽给药，如口服(肠道)、鼻内、眼内、皮下、皮内、肌内，静脉或经皮给药。优选为皮下给药，最优选为皮内给药，也 可通过输液泵给药。
由于本发明的肽分离自脑胶质细胞瘤、乳腺癌、结直肠癌、肾细胞癌、慢性淋巴细胞性白血病、肝细胞癌、非小细胞和小细胞肺癌、非霍奇金淋巴瘤、急性骨髓性白血病 、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、食管癌(包括胃食管交界癌)、胆囊癌和胆管癌、黑色 素瘤、胃癌、睾丸癌、膀胱癌或子宫癌，因此，本发明的药剂优选用于治疗脑胶质细胞 瘤、乳腺癌、结直肠癌、肾细胞癌、慢性淋巴细胞性白血病、肝细胞癌、非小细胞和小 细胞肺癌、非霍奇金淋巴瘤、急性骨髓性白血病、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、食管癌 (包括胃食管交界癌)、胆囊癌和胆管癌、黑色素瘤、胃癌、睾丸癌、膀胱癌、头颈部 鳞状细胞癌(HNSCC)或子宫癌。
本发明进一步涉及为个体患者制备个体化药物的一种方法，其中包括：制造含选自 预筛选TUMAP存储库至少一种肽的药物组合物，其中药物组合物中所用的至少一种肽选择为适合于个体患者。在一项实施方案中，药物组合物为一种疫苗。该方法也可以改 动以产生下游应用的T细胞克隆物，如：TCR隔离物或可溶性抗体和其他治疗选择。
“个体化药物“系指专门针对个体患者的治疗，将仅用于该等个体患者，包括个体化 活性癌症疫苗以及使用自体组织的过继细胞疗法。
如本文所述，“存储库“应指已经接受免疫原性预筛查和/或在特定肿瘤类型中过量 提呈的一组或一系列肽。“存储库“一词并不暗示，疫苗中包括的特定肽已预先制造并储存于物理设备中，虽然预期有这种可能性。明确预期所述肽可以用于新制造每种个体化 疫苗，也可能被预先制造和储存。存储库(例如，数据库形式)由肿瘤相关肽组成，其 在各种HLA-A HLA-B和HLA-C等位基因脑胶质细胞瘤、乳腺癌、结直肠癌、肾细胞 癌、慢性淋巴细胞性白血病、肝细胞癌、非小细胞和小细胞肺癌、非霍奇金淋巴瘤、急 性骨髓性白血病、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、包括胃食管交界癌的食管癌、胆囊癌和 胆管癌、黑色素瘤、胃癌、睾丸癌、膀胱癌、头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)或子宫癌患 者的肿瘤组织中高度过度表达。其可能含有包括MHC I类和MHC II类肽或拉长的 MHC I类肽。除了从几种癌症组织中采集的肿瘤相关肽外，存储库还可能包含 HLA-A*02和HLA-A*24标记肽。这些肽可对TUMAP诱导的T细胞免疫进行量化比较， 从而可得出疫苗抗肿瘤反应能力的重要结论。其次，在没有观察到来自患者“自身”抗原 TUMAP的任何疫苗诱导的T细胞反应时，它们可作为来自“非自身“抗原的重要阳性对 照肽。第三，它还可对患者的免疫功能状态得出结论。
存储库的TUMAP通过使用一种功能基因组学方法进行鉴定，该方法结合了基因表达分析、质谱法和T细胞免疫学
Figure BDA0001584383410000831
该方法确保了只选择真实存在于高百 分比肿瘤但在正常组织中不表达或仅很少量表达的TUMAP用于进一步分析。对于初始 肽的选择，患者食管癌样本和健康供体的血液以循序渐进的方法进行分析：
1.肿瘤材料的HLA配体用质谱法确定；
2.使用全基因组信使核糖核酸(mRNA)表达分析法用于确定恶性肿瘤组织(食管癌)与 一系列正常器官和组织相比过度表达的基因；
3.确定的HLA配体与基因表达数据进行比较。将肿瘤组织上过度提呈或选择性提呈的 肽，优选为第2步中检测到的选择性表达或过量表达基因所编码的肽，考虑作为多肽疫 苗的合适候选TUMAP；
4.文献检索以确定更多证据以支持确认为TUMP的肽的相关性；
5.mRNA水平过度表达的相关性通过由第3步选定的在肿瘤组织上的TUMAP的重新检测以及在健康组织上的缺乏(或低频率)而确定；
6.为了评估所选定的肽是否诱导体内T细胞反应，使用健康供体以及食管癌患者的人T 细胞进行体外免疫原性测定。
一方面，在将所述肽加入存储库之前，对其进行筛查以了解免疫原性。举例来说(但 不限于此)，纳入存储库的肽的免疫原性的确定方法包括体外T细胞激活，具体为：用装载肽/MHC复合物和抗CD28抗体的人工抗原提呈细胞反复刺激来自健康供体的 CD8+ T细胞。
这种方法优选用于罕见癌症以及有罕见表达谱的患者。与含目前开发为固定组分的 多肽鸡尾酒相反的是，存储库可将肿瘤中抗原的实际表达于疫苗进行更高程度的匹配。在多目标方法中，每名患者将使用几种“现成“肽的选定单一肽或组合。理论上来说，基 于从50抗原肽库中选择例如5种不同抗原肽的一种方法可提供大约170万种可能的药 物产品(DP)组分。
在一方面，选择所述肽用于疫苗，其基于个体患者的适合性，并使用本发明此处或后文所述的方法。
HLA表型、转录和肽组学资料从患者的肿瘤材料和血液样本中收集，以确定最合适每名患者且含有“存储库和患者独特(即突变)TUMAP的肽。将选择的那些肽选择 性地或过度表达于患者肿瘤中，并且可能的情况下，如果用患者个体PBMC进行检测， 则表现出很强的体外免疫原性。
优选的情况是，疫苗所包括的肽的一种确定方法包括：(a)识别由来自个体患者肿瘤样本提呈的肿瘤相关肽(TUMAP)；(b)将(a)中鉴定的肽与上述肽的存储库(数据库) 进行比对；且(c)从存储库(数据库)中选择与患者中确定的肿瘤相关肽相关的至少一 种肽。例如，肿瘤样本提呈的TUMAP的鉴定方法有：(a1)将来自肿瘤样本的表达数据 与所述肿瘤样本组织类型相对应的正常组织样本的表达数据相比对，以识别肿瘤组织中 过量表达或异常表达的蛋白；以及(a2)将表达数据与结合到肿瘤样本中I类MHC和/ 或II类分子的MHC配体序列相关联，以确定来源于肿瘤过量表达或异常表达的蛋白质 的MHC配体。优选情况是，MHC配体的序列的确定方法是：洗脱来自肿瘤样本分离 的MHC分子结合肽，并对洗脱配体进行测序。优选情况是，肿瘤样本和正常组织从同 一患者获得。
除了使用存储库(数据库)模型选择肽以外，或作为一种替代方法，TUMAP可以 在新患者中进行鉴定，然后列入疫苗中。作为一种实施例，患者中的候选TUMAP可通 过以下方法进行鉴定：(a1)将来自肿瘤样本的表达数据与所述肿瘤样本组织类型相对应 的正常组织样本的表达数据相比对，以识别肿瘤组织中过量表达或异常表达的蛋白；以 及(a2)将表达数据与结合到肿瘤样本中I类MHC和/或II类分子的MHC配体序列想关 联，以确定来源于肿瘤过量表达或异常表达的蛋白质的MHC配体。作为另一实施例， 蛋白的鉴定方法为可包含突变，其对于肿瘤样本相对于个体患者的相应正常组织是独特 的，并且TUMAP可通过特异性靶向作用于变异来鉴定。例如，肿瘤以及相应正常组织 的基因组可通过全基因组测序方法进行测序：为了发现基因蛋白质编码区域的非同义突 变，从肿瘤组织中萃取基因组DNA和RNA，从外周血单核细胞(PBMC)中提取正常非 突变基因组种系DNA。运用的NGS方法只限于蛋白编码区的重测序(外显子组重测序) 。为了这一目的，使用供货商提供的靶序列富集试剂盒来捕获来自人样本的外显子DNA， 随后使用HiSeq2000(Illumina公司)进行测序。此外，对肿瘤的mRNA进行测序，以 直接定量基因表达，并确认突变基因在患者肿瘤中表达。得到的数以百万计的序列读数 通过软件算法处理。输出列表中包含突变和基因表达。肿瘤特异性体突变通过与PBMC 衍生的种系变化比较来确定，并进行优化。然后，为了存储库可能测试新确定的肽了解 如上所述的免疫原性，并且选择具有合适免疫原性的候选TUMAP用于疫苗。
在一个示范实施方案中，疫苗中所含肽通过以下方法确定：(a)用上述方法识别由个体患者肿瘤样本提呈的肿瘤相关肽(TUMAP)；(b)将(a)中鉴定的肽与肿瘤中(与相 应的正常组织相比)经过免疫原性和过量提呈预筛查的肽库进行比对；(c)从存储库中 选择与患者中确定的肿瘤相关肽相关的至少一种肽；及(d)可选地选择至少一种在(a)中 新确定的肽，确认其免疫原性。
在一个示范实施方案中，疫苗中所含肽通过以下方法确定：(a)识别由个体患者肿瘤样本提呈的肿瘤相关肽(TUMAP)；以及(b)选择至少一种在(a)中新确定的肽，并确 认其免疫原性。
一旦选定了用于个体化肽疫苗的肽时，则生产疫苗。该疫苗优选为一种液体制剂，包括溶解于20-40％DMSO之间，优选为约30-35％DMSO，例如，约33％DMSO中的 个体肽。
列入产品的每种肽都溶于DMSO中。单个肽溶液浓度的选择取决于要列入产品中的肽的数量。单肽-DMSO溶液均等混合，以实现一种溶液中包含所有的肽，且浓度为 每肽～2.5mg/ml。然后该混合溶液按照1∶3比例用注射用水进行稀释，以达到在33％ DMSO中每肽0.826mg/ml的浓度。稀释的溶液通过0.22μm无菌筛检程序进行过滤。 从而获得最终本体溶液。
最终本体溶液填充到小瓶中，在使用前储存于-20℃下。一个小瓶包含700μL溶液，其中每种肽含有0.578mg。其中的500μL(每种肽约400μg)将用于皮内注射。
本发明的肽除了用于治疗癌症，也可用于诊断。由于肽由脑胶质细胞瘤、乳腺癌、结直肠癌、肾细胞癌、慢性淋巴细胞性白血病、肝细胞癌、非小细胞和小细胞肺癌、非 霍奇金淋巴瘤、急性骨髓性白血病、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、包括胃食管交界癌的 食管癌、胆囊癌和胆管癌、黑色素瘤、胃癌、睾丸癌、膀胱癌、头颈部鳞状细胞癌(HNSCC) 或子宫癌样本产生，并且已确定这些肽在正常组织中不存在或水平较低，因此这些肽可 用于诊断癌症是否存在。
血液样本中组织活检物含权利要求的肽，可有助于病理师诊断癌症。用抗体、质谱或其他本领域内已知的方法检测某些肽可使病理师判断该组织样本为恶性的还是炎症 或一般病变，也可用作脑胶质细胞瘤、乳腺癌、结直肠癌、肾细胞癌、慢性淋巴细胞性 白血病、肝细胞癌、非小细胞和小细胞肺癌、非霍奇金淋巴瘤、急性骨髓性白血病、卵 巢癌、胰腺癌、前列腺癌、包括胃食管交界癌的食管癌、胆囊癌和胆管癌、黑色素瘤、 胃癌、睾丸癌、膀胱癌、头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)或子宫癌的生物标志物。肽基团 的提呈使得能对病变组织进行分类或进一步分成子类。
对病变标本中肽的检测使得能对免疫系统治疗方法的利益进行判断，特别是如果T-淋巴细胞已知或预计与作用机制有关。MHC表达的缺失是一种机制，充分说明了哪 些受感染的恶性细胞逃避了免疫监视。因此，肽的提呈表明，分析过的细胞并没有利用 这种机制。
本发明的肽可用于分析淋巴细胞对肽的反应(如T细胞反应)，或抗体对肽或MHC分子络合的肽发生的反应。这些淋巴细胞反应可以作为预后指标，决定是否采取进一步 的治疗。这些反应也可以用作免疫疗法中的替代反应指标，旨在以不同方式诱导淋巴细 胞反应，如接种蛋白疫苗、核酸、自体材料、淋巴细胞过继转移。基因治疗中，淋巴细 胞对肽发生的反应可以在副作用的评估中考虑。淋巴细胞反应监测也可能成为移植疗法 随访检查中的一种有价值的工具，如，用于检测移植物抗宿主和宿主抗移植物疾病。
下列描述优选方案的实施例将对本发明进行说明，并参照随附图表(但是不仅限于 此)。考虑到本发明的目的，文中引用的所有参考文献通过引用的方式并入在本文中。
附图说明
图1显示了正常组织(白色柱)和不同癌症(黑色柱)中各种肽的过量提呈。图1A)基因符号：IGFBPL1，肽：LLPLLPPLSPSLG(SEQ ID NO：33)-从左至右的组织：1细 胞系(1胰腺癌)，1正常组织(1甲状腺)，22癌组织(5脑癌，1乳腺癌，1结肠癌， 1食管癌，1胆囊癌，1肝癌，10肺癌，1胰腺癌，1胃癌)；图1B)基因符号：HIVEP1， 肽：NYIPVKNGKQF(SEQ ID NO：103)-从左至右的组织：11癌组织(1脑癌，1肝癌， 8肺癌，1前列腺癌)；图1C)基因符号：GET4，肽：EYLDRIGQLFF(SEQ ID NO：131) -从左至右的组织：2正常组织(1肾，1肺)，41癌组织(2脑癌，1肾癌，3肝癌，29 肺癌，2前列腺癌，4胃癌)；图1D)基因符号：N4BP2，肽：FYINGQYQF(SEQ IDNO：176) -从左至右的组织：1细胞系(1前列腺)，3正常组织(1肾脏，1脑垂体，1皮肤)， 67癌组织(4脑癌，2肝癌，42肺癌，12前列腺癌，7胃癌)。图1E)至Z)显示了与正 常组织相比各种肽在不同癌症组织中的过度提呈。分析包括来自440多个正常组织样本 以及526个癌症样本的数据。显示的仅是被发现提呈肽的样本。图1E)基因符号： AKR1C1、AKR1C3，肽：HLYNNEEQV(SEQ ID NO：16)-从左至右的组织：1细胞系 (胰腺)，15癌组织(1胆管癌，1食管癌，6肝癌，5肺癌，2膀胱癌)；图1F)基因符 号：RPS26P39、RPS26P11、RPS26、RPS26P28、RPS26P20，RPS26P15、RPS26P50、 RPS26P2、RPS26P25、RPS26P58，肽：YVLPKLYVKL(SEQ IDNO：35)-从左至右的 组织：1正常组织(1白细胞样本)，8癌组织(1头颈部癌，3白细胞白血病癌症，1 骨髓细胞癌，1胆囊癌，1结肠癌，1淋巴结癌)；图1G)基因符号：CLDN4、CLDN3 、CLDN14、CLDN6、CLDN9，肽：SLLALPQDLQA(SEQ ID NO：40)-从左至右的组 织：21癌组织(1胆管癌，1乳腺癌，3结肠癌，1直肠癌，6肺癌，2卵巢癌，1前列腺 癌，3膀胱癌，3子宫癌)；图1H)基因符号：KLHDC7B，肽：VLSPFILTL(SEQ ID NO：42) -从左至右的组织：18癌组织(1白细胞白血病癌，1骨髓细胞癌，1乳腺癌，1肾癌，6 肺癌，3淋巴结癌，2卵巢癌，2膀胱癌，1子宫癌)；图1I)基因符号：ATR，肽：SLLSHVIVA (SEQ ID NO：53)-从左至右的组织：3细胞系(1血细胞，2胰腺)，21癌组织(1头颈 部癌，1胆管癌，2白细胞白血病癌症，1乳腺癌，2食管癌，1胆囊癌，1肾癌，1肝癌， 2肺癌，4淋巴结癌，1卵巢癌，3皮肤癌，1膀胱癌)；图1J)基因符号：PGAP1，肽：FITDFYTTV(SEQ ID NO：66)-从左至右的组织：1细胞系(皮肤)，1正常组织(1结 肠)，13癌组织(1头颈癌，6脑癌，1结肠癌，1肝癌，2皮肤癌，2膀胱癌)；图1K) 基因符号：ZNF679、SAPCD2，肽：RLLPKVQEV(SEQ ID NO：325)-从左至右的组织： 4细胞系(2血细胞，1肾脏，1大肠)，22癌组织(1骨髓细胞癌，1乳腺癌，1食管癌， 4结肠癌，1直肠癌，10肺癌，2卵巢癌，1胃癌，1膀胱癌)；图1L)基因符号：ZDHHC24， 肽：VLGPGPPPL(SEQ ID NO：339)-从左至右的组织：2细胞系(1肾脏，1脾)，19 癌组织(4白细胞白血病癌症，1骨髓细胞癌，1骨髓癌，2脑癌，1肝癌，2肺癌，6淋 巴结癌，1皮肤癌，1子宫癌)；图1M)基因符号：ORC1，肽：VYVQILQKL(SEQ ID NO：111)-从左至右的组织：1正常组织(1肝脏)，32癌组织(2肝癌，24肺癌，6胃 癌)；图1N)基因符号：RIF1，肽：IYSFHTLSF(SEQ ID NO：113)-从左至右的组织： 28癌组织(1前列腺，1脑癌，25肺癌，2胃癌)；图1O)基因符号：ANKRD5，肽： RYLNKSFVL(SEQ ID NO：115)-从左至右的组织：1正常组织(1胃)，25癌组织(1 脑癌，2肝癌，17肺癌，2前列腺癌，3胃癌)；图1P)基因符号：IGFLR1，肽： RYGLPAAWSTF(SEQ ID NO：121)-从左至右的组织：20癌组织(2肝癌，17肺癌，1 胃癌)；图1Q)基因符号：CCR8，肽：VYALKVRTI(SEQ ID NO：145)-从左至右的组 织：25癌组织(25肺癌)；图1R)基因符号：CLEC5A，肽：SYGTVSQIF(SEQ ID NO：148) -从左至右的组织：5正常组织(1肝脏，3肺，1脑下垂体)，100癌组织(10脑癌，4 肝癌，74肺癌，1前列腺癌，11胃癌)；图1S)基因符号：FOXJ1，肽：IYKWITDNF(SEQ ID NO：155)-从左至右的组织：4正常组织(4肾脏)，53癌组织(10脑癌，1肝癌， 26肺癌，1前列腺癌，15胃癌)；图1T)基因符号：IFNG，肽：KYTSYILAF(SEQ ID NO：162)-从左至右的组织：3细胞系(3前列腺)，4正常组织(1肝脏，1肺，1胰腺， 1胃)，95癌组织(1肾癌，5肝癌，71肺癌，2前列腺癌，16胃癌)；图1U)基因符 号：KLHL11，肽：EYFTPLLSGQF(SEQ ID NO：165)-从左至右的组织：10癌组织(10 肺癌)；图1V)基因符号：TMEM189，肽：LYSPVPFTL(SEQ ID NO：175)-从左至右 的组织：42癌组织(4脑癌，1肝癌，30肺癌，7胃癌)；图1W)基因符号：BUB1， 肽：EYNSDLHQFF(SEQ ID NO：345)-从左至右的组织：13癌组织(3脑癌，10肺癌)； 图1X)基因符号：CASC5，肽：IYVIPQPHF(SEQ ID NO：346)-从左至右的组织：21 癌组织(3脑癌，1肾癌，1肝癌，14肺癌，2胃癌)；图1Y)基因符号：KIF18A，肽： VYNEQIRDLL(SEQ ID NO：354)-从左至右的组织：13癌组织(1脑癌，11肺癌，1胃癌)；图1Z)基因符号：PSMA8、PSMA7，肽：VFSPDGHLF(SEQ ID NO：360)-从左 至右的组织：33癌组织(4肝癌，27肺癌，1前列腺癌，1胃癌)。
图2显示了本发明的源基因的代表性表达特征，这些基因在一系列正常组织(白色柱)的不同癌症中以及不同癌症样本(黑色柱)中高度过度表达或专门表达。图2A)基 因符号：MXRA5-从左到右的组织：61正常组织样本(6动脉，1脑，1心脏，2肝，2 肺，2静脉，1脂肪组织，1肾上腺，5骨髓，1软骨，1结肠，1食管，2胆囊，1肾脏， 6淋巴结，1胰腺，1脑垂体，1直肠，1骨骼肌，1皮肤，1小肠，1脾脏，1胃，1胸腺， 1甲状腺，5气管，1膀胱，1乳腺，5卵巢，3胎盘，1前列腺，1睾丸，1子宫)和70 癌症样本(10乳腺癌，11肺癌，12卵巢癌，11食管癌，26胰腺癌)；图2B)基因符号： KIF26B-从左到右的组织：61正常组织样本(6动脉，1脑，1心脏，2肝，2肺，2静脉，1脂肪组织，1肾上腺，5骨髓，1软骨，1结肠，1食管，2胆囊，1肾脏，6淋巴 结，1胰腺，1脑垂体，1直肠，1骨骼肌，1皮肤，1小肠，1脾脏，1胃，1胸腺，1 甲状腺，5气管，1膀胱，1乳腺，5卵巢，3胎盘，1前列腺，1睾丸，1子宫)和58 癌症样本(10乳腺癌，11肺癌，11食管癌，26胰腺癌)；图2C)基因符号：IL4I1-从 左到右的组织：61正常组织样本(6动脉，1脑，1心脏，2肝，2肺，2静脉，1脂肪组 织，1肾上腺，5骨髓，1软骨，1结肠，1食管，2胆囊，1肾脏，6淋巴结，1胰腺，1 脑垂体，1直肠，1骨骼肌，1皮肤，1小肠，1脾脏，1胃，1胸腺，1甲状腺，5气管， 1膀胱，1乳腺，5卵巢，3胎盘，1前列腺，1睾丸，1子宫)和34癌症样本(11肺癌， 12卵巢癌，11食管癌)；图2D)基因符号：TP63-从左到右的组织：61正常组织样本 (6动脉，1脑，1心脏，2肝，2肺，2静脉，1脂肪组织，1肾上腺，5骨髓，1软骨，1 结肠，1食管，2胆囊，1肾脏，6淋巴结，1胰腺，1脑垂体，1直肠，1骨骼肌，1皮 肤，1小肠，1脾脏，1胃，1胸腺，1甲状腺，5气管，1膀胱，1乳腺，5卵巢，3胎盘， 1前列腺，1睾丸，1子宫)和11个食管癌样本
图3显示了示例性的免疫原性资料：肽特定多聚体染色后流式细胞仪结果。
图4显示了健康HLA-A*02+供体的肽特异性CD8+ T细胞体外反应的示例性结果 。CD8+ T细胞制备的方法为：使用抗CD28 mAb和HLA-A*02涂层的人工APC分别 与SEQ ID NO：2肽(A，左图)、SEQ ID NO：9肽(B，左图)或SEQ ID NO：331肽 (C，左图)合成。经过3个周期的刺激后，用A*02/SEQ ID NO：2(A)、A*02/SEQ ID NO： 9(B)或A*02/SEQ ID NO：331(C)的2D多聚体染色法对肽反应性细胞进行检测。右图 (A、B和C)显示用不相关A*02/肽复合体刺激的细胞对照染色。活单细胞在CD8+淋 巴细胞上得到门控。Boolean门控帮助排除用不同肽特定的多聚体检测的假阳性事件。 提示了特异性多聚体+细胞和CD8+淋巴细胞的频率。
图5显示了健康HLA-A*24+供体的肽特异性CD8+ T细胞体外反应的示例性结果 。CD8+ T细胞制备的方法为：使用抗CD28 mAb和HLA-A*24涂层的人工APC分别 与SEQ ID NO：99肽(A，左图)或SEQ ID NO：119肽(B，左图)、SEQ ID NO：142 肽(C，左图)和SEQ ID NO：174肽(D，左图)合成。经过3个周期的刺激后，用A*24/SEQ ID NO：99(A)、A*24/SEQ ID NO：119(B)、A*24/SEQ ID NO：142(C)或A*24/SEQ ID NO： 174(D)的2D多聚体染色法对肽反应性细胞进行检测。右图(A、B、C和D)显示用 不相关A*24/肽复合体刺激的细胞对照染色。活单细胞在CD8+淋巴细胞上得到门控。 Boolean门控帮助排除用不同肽特定的多聚体检测的假阳性事件。提示了特异性多聚体+ 细胞和CD8+淋巴细胞的频率。
实施例
实施例1
细胞表面提呈的肿瘤相关肽的识别和定量
组织样本
患者的肿瘤组织的获得在所有患者在手术或尸检前都给予了书面知情同意。切除后 组织立即进行冷休克处理，在分离TUMAP前储存于-70℃或以下。
如果以下两个条件是真实的，则选择肽：(1)其潜在转录物和/或外显子表达水平非 常低，对于以下器官，每百万读数每千碱基读数中值(RPKM)要求小于2，且75％百分 位数要求小于5：脑、血管、心脏、肝、肺、血液。此外，对于以下器官的中位RPKM 要求小于10：膀胱、唾液腺、胃、肾上腺、结肠、小肠、脾、骨髓、胰腺、肌肉、脂 肪组织、皮肤、食管、肾、甲状腺、脑垂体、神经。(2)肽与肿瘤相关，即，特异发现 或在肿瘤上或与基线正常组织相比过度表达(参照实施例1)。
HLA-A*02 TUMAP选择的样本数量为：胰腺癌N＝16，肾癌N＝20，结直肠癌N ＝28，包括胃食管交界癌的食管癌N＝15，前列腺肿瘤N＝35，肝细胞癌N＝16，非小 细胞肺癌N＝88，胃癌N＝29，乳腺癌N＝9，黑色素瘤N＝3，卵巢癌N＝20，慢性 淋巴细胞性白血病N＝13(12个供体)，膀胱癌N＝5，睾丸癌N＝1，小细胞肺癌N＝ 18(13个供体)，胆囊癌和胆管癌N＝3，急性骨髓性白血病N＝5(4个供体)，脑胶 质细胞瘤N＝40，子宫癌N＝5。
HLA-A*24 TUMAP选择的样本数量为：胃癌N＝44，前列腺肿瘤N＝37，非小细 胞肺癌N＝88，肝细胞癌N＝15，肾癌N＝2，结直肠癌N＝1，脑胶质细胞瘤N＝17 。
从组织样本中分离HLA肽
根据公开的方案(Falk et al.，1991；Seeger et al.，1999)略加修改，使用HLA-A*02特 异性抗体BB7.2、HLA-A、HLA-B、HLA-C特异性抗体W6/32、HLA-II类特异性抗体L243、CNBr活化的琼脂糖凝胶、酸处理和超滤方法以免疫沉淀法从实体组织中获得了 冷冻组织样本的HLA肽库。
质谱分析
获得的HLA肽库根据其疏水性用反相色谱(nanoAcquity UPLC system，Waters)分离，洗脱肽用装有电喷雾源的LTQ-velos融合杂交质谱(ThermoElectron)进行了分析。 肽库被直接加载填充有1.7μm C18反相材料(Waters)的分析用熔炼石英微毛细管柱(75 μm内径x250mm)，应用流速为400nL每分钟。随后，使用来自流速为300nL每分 钟、浓度为10％至33％溶剂B中的两步180分钟二元梯度法对肽进行分离。梯度由溶 剂A(含0.1％甲酸的水)和溶剂B(含0.1％甲酸的乙腈)。金镀膜玻璃毛细管(PicoTip， New Objective)用于引入到纳升电喷雾源。使用前5(TOP5)策略在数据依赖模式下操作 LTQ-Orbitrap质谱仪。简言之，首先以高精确质量完全扫描在orbitrap开始一个扫描周 期(R＝30000)，之后用先前选定离子的动态排除技术在orbitrap中对5种含量最为丰富 的前体离子进行MS/MS扫描(R＝7500)。串联质谱以SEQUEST和另一种手动控制器 进行解读。生成的自然肽破碎模式与合成序列相同参考肽的破碎模式进行比较后，确保 了被识别的肽序列。
无标记相对LC-MS定量通过离子计数(即通过LC-MS功能提取和分析)来进行(Mueller et al.，2007)。该方法假定肽的LC-MS信号区域与样本中其丰度相关。提取的特征通过充电状态去卷积和保留时间校准进行进一步处理(Mueller et al.，2008；Sturm etal.， 2008)。最后，所有的LC-MS特征与序列鉴定结果交叉引用，以将不同样本和组织的定量数据与肽呈递特征结合。定量数据根据集中数据以两层方式进行正态化处理，以说明 技术和生物学复制变异。因此，每个被识别的肽均可与定量资料相关，从而可得出样本 和组织之间的相对定量。此外，对候选肽获得的所有定量数据进行手动检查，以确保数 据的一致性，并验证自动化分析的准确度。对于每种肽，计算了提呈图，其显示样本平 均提呈量以及复制变化。这些特征使不同样本与正常组织样本的基线值并列。示范性过 度提呈肽的提呈谱示于图1中。
表8(A和B)和表9(A和B)显示了选定肽在各种癌症实体上的提呈，因此显 示所提及的肽特别相关性用于诊断和/或治疗所示的癌症(例如，肽序列ID号1用于膀 胱癌、包括胃食管交界癌的食管癌、肝细胞癌、非小细胞肺癌和胰腺癌，肽序列ID号2 用于肾癌、包括胃食管交界癌的食管癌、脑胶质细胞瘤...等等)。
表8A：本发明选定HLA-A*02结合肿瘤相关肽在各种实体中提呈概述。GB＝胶质母细 胞瘤，BRCA＝乳腺癌，CRC＝结直肠癌，RCC＝肾细胞癌，CLL＝慢性淋巴细胞性白血 病，HCC＝肝细胞癌，NSCLC＝非小细胞肺癌，SCLC＝小细胞肺癌，NHL＝非霍奇金淋巴 瘤(8个样本)，AML＝急性骨髓性白血病，OC＝卵巢癌，PC＝胰腺癌，clPC＝胰腺癌 细胞系，PCA＝前列腺癌和良性前列腺增生，OSCAR＝食管癌，包括胃食管交界处癌， GBC_CCC＝胆囊腺癌和胆管癌，MEL＝黑色素瘤，GC＝胃癌，TC＝睾丸癌，UBC＝膀 胱癌，UEC＝子宫癌。
Figure RE-GDA0003122706420000011
Figure RE-GDA0003122706420000021
Figure RE-GDA0003122706420000031
Figure RE-GDA0003122706420000041
表8B显示选定肽在其他癌症实体中的提呈，因此显示所提及的肽特别相关性用于诊断和/或治疗所示的癌症。
表8B：选定HLA-A*02肽在各种实体中提呈概述。GB＝胶质母细胞瘤，BRCA＝乳腺癌，CRC＝结直肠癌，RCC＝肾细胞癌，CLL＝慢性淋巴细胞性白血病，HCC＝肝细胞癌， NSCLC＝非小细胞肺癌，SCLC＝小细胞肺癌，NHL＝非霍奇金淋巴瘤，AML＝急性骨髓 性白血病，OC＝卵巢癌，PC＝胰腺癌，BPH＝前列腺癌和良性前列腺增生，OSCAR＝食 管癌，包括胃食管交界处癌，GBC_CCC＝胆囊腺癌和胆管癌，MEL＝黑色素瘤，GC＝ 胃癌，UBC＝膀胱癌，UTC＝子宫癌，HNSCC＝头颈部鳞状细胞癌。
Figure RE-GDA0003122706420000042
Figure RE-GDA0003122706420000051
Figure RE-GDA0003122706420000061
表9A：本发明选定HLA-A*24结合肿瘤相关肽在各种实体中提呈概述。GB＝脑胶质细 胞瘤，HCC＝肝细胞癌，NSCLC＝非小细胞肺癌，PCA＝前列腺癌，GC＝胃癌，CRC＝ 结直肠癌，RCC＝肾细胞癌。
SEQ ID NO. 序列 实体
96 LYSPVPFTL HCC,NSCLC,GC,GB
97 TYTFLKETF PCA,HCC,NSCLC,GB
98 VFPRLHNVLF HCC,NSCLC,GC
99 QYILAVPVL NSCLC,GC,GB,PCA
100 VYIESRIGTSTSF GB,HCC,NSCLC,GC
101 IYIPVLPPHL HCC,NSCLC
102 VYPFENFEF GC,NSCLC
103 NYIPVKNGKQF PCA,HCC,NSCLC,GB
104 SYLTWHQQI PCA,HCC,NSCLC
105 IYNETITDLL GC,GB,HCC,NSCLC
106 IYNETVRDLL GC,GB,NSCLC
107 KYFPYLVVI HCC,NSCLC,GC
109 LFITGGQFF HCC,NSCLC,GC
110 SYPKIIEEF GB,HCC,NSCLC,GC
111 VYVQILQKL GC,HCC,NSCLC
112 IYNFVESKL NSCLC,GC
113 IYSFHTLSF NSCLC,GC,GB
114 QYLDGTWSL NSCLC,GC,GB
115 RYLNKSFVL NSCLC,GC,GB,PCA,HCC
Figure BDA0001584383410000971
Figure BDA0001584383410000981
Figure BDA0001584383410000991
Figure BDA0001584383410001001
Figure BDA0001584383410001011
Figure BDA0001584383410001021
表9B显示选定肽在其他癌症实体中的提呈，因此显示所提及的肽特别相关性用于诊断和/或治疗所示的癌症。
表9B.选定HLA-A*24肽在各种实体中提呈概述。GB＝脑胶质细胞瘤，CRC＝结直肠癌，RCC＝肾细胞癌，HCC＝肝细胞癌，NSCLC＝非小细胞肺癌，PCA＝前列腺癌和良性 前列腺增生，GC＝胃癌。
Figure BDA0001584383410001022
Figure BDA0001584383410001031
Figure BDA0001584383410001041
实施例2
编码本发明肽的基因的表达谱
与正常细胞相比在肿瘤细胞上一种肽过度提呈或特定提呈足够其在免疫治疗中有 效使用，一些肽为肿瘤特异性的，尽管存在其源蛋白也存在于正常组织中。但是，mRNA表达谱增加了免疫治疗目标肽选择中其他级别的安全性。特别是对于具有高安全性风险的治疗选择，诸如亲和力成熟的TCR，理想的目标肽将来源于对该肿瘤独一无二且不 出现于正常组织中的蛋白，基因表达高肿瘤-正常比例表提示治疗窗口。此外，尚未进 行肽提呈分析的肿瘤实体源基因过度表达提示某种肽可能在各实体中具有重要性。
对于本发明的HLA-I类肽，根据涵盖大约3000个正常组织样本RNASeq数据的数 据库，所有源基因的正常组织表达被证明是最少的(Lonsdale，2013)。此外，肿瘤与正常 组织的基因表达数据进行了分析，以评估在各种肿瘤实体中靶标覆盖情况。
RNA来源与制备
手术切除组织标本按如上所述(参见实施例1)在获得每名患者的书面知情同意后提供。手术后立即速冻肿瘤组织标本，之后在液态氮中用杵臼匀浆。使用TRI试剂 (Ambion公司，达姆施塔特，德国)之后用RNeasy(QIAGEN公司，希尔登，德国)清 理从这些样本中制备总RNA；这两种方法都根据制造商的方案进行。
用于RNASeq实验来自健康人体组织的总RNA获得自：Asterand(密歇根州，美国&Royston，英国)、Bio-Options Inc.(Brea，加州，美国)、ProteoGenex Inc.(Culver City，加州， 美国)、Geneticist Inc.(Glendale，加州，美国)、Istituto Nazionale Tumori″Pascale″′(那不勒 斯，意大利)、BioServe(Beltsville，马里兰州，美国)、CapitalBioScience Inc.(Rockville，马 里兰州，美国)。
用于RNASeq实验来自肿瘤组织的总RNA获得自：Asterand(Detroit，密歇根州，美国&Royston，Herts，英国)、Bio-Options Inc.(Brea，加州，美国)、BioServe(Beltsville，马 里兰州，美国)、Geneticist Inc.(Glendale，加州，美国)、ProteoGenex Inc.(CulverCity，加 州，美国)、Tissue Solutions Ltd(格拉斯哥，英国)、波恩大学医院(波恩，德国)、海德堡大 学医院(海德堡，德国)、蒂宾根大学医院(蒂宾根，德国)。
所有RNA样本的质量和数量都在Agilent 2100 Bioanalyzer分析仪(Agilent公司， Waldbronn，德国)上使用RNA 6000 Pico LabChip Kit试剂盒(Agilent公司)进行评估。
RNA序列实验
肿瘤和正常组织的RNA样本都通过新一代测序技术(RNAseq)由CeGaT(蒂宾根， 德国)对肿瘤和正常组织的RNA样本进行基因表达分析。简言之，根据供货商的方案(Illumina Inc.，San Diego，加州，美国)，其中包括RNA碎片化、cDNA转化和测序适配 器的加入，利用Illumina HiSeq v4试剂盒准备测序文库。从多个样本获得的文库根据制 造商的说明等摩尔混合并在Illumina HiSeq 2500序列发生器上测序，产生50bp的单端 读数。处理的读数使用STAR软件映像至人类基因组(GRCh38)。根据ENSEMBL序列 数据库的说明(Ensembl77)，表达资料在转录水平设置为RPKM(每百万映射读数每千 碱基读数，由Cufflinks软件生成)并在外显子水平上设置(总读数，由Bedtools软件 生成)。外显子读数被归为外显子长度和校准尺寸，以获得RPKM值。
本发明的代表性源基因在不同癌症中高度过量表达的表达谱如图2所示。根据内部 RNA测序分析，进一步的示例性靶目标表达分数如表10(A和B)所示。其他实体的 表达数据和进一步的示例性肽总结于表11中，其基于TCGA研究网络 http://cancergenome.nih.gov/产生的数据。
表10A：各种肿瘤实体内的靶标覆盖，针对选定肽源基因的表达。过度表达被定义为 相比最高表达该基因的相关正常组织，在肿瘤上的表达超过1.5倍。＜19％过度表达＝I， 20-49％＝II，50-69％＝III，＞70％＝IV。如果一种肽能够从多个源基因获得，最少范围的 基因则是决定性的。基线包括以下相关正常组织：脂肪组织、肾上腺、动脉、骨髓、脑 、软骨、结肠、食道、胆囊、心脏、肾、肝、肺、淋巴结、胰腺、垂体、直肠、骨骼肌 、皮肤、小肠、脾、胃、胸腺、甲状腺、气管、膀胱和静脉。如果获得同一组织类型几 个样本的表达数据，则使用各样本的算术平均值进行计算。
Figure BDA0001584383410001061
Figure BDA0001584383410001071
Figure BDA0001584383410001081
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Figure BDA0001584383410001171
Figure BDA0001584383410001181
表10B：选定肽源基因的靶标范围。过度表达被定义为相比最高表达该基因的相关正常 组织，在肿瘤上的表达超过1.5倍。＜19％过度表达＝I，20-49％＝II，50-69％＝III，＞70％ ＝IV。如果一种肽能够从多个源基因获得，最少范围的基因则是决定性的。基线包括以 下相关正常组织：脂肪组织、肾上腺、动脉、骨髓、脑、软骨、结肠、食道、胆囊、心 脏、肾、肝、肺、淋巴结、胰腺、垂体、直肠、骨骼肌、皮肤、小肠、脾、胃、胸腺、 甲状腺、气管、膀胱和静脉。如果获得同一组织类型几个样本的表达数据，则使用各样 本的算术平均值进行计算。NHL＝非霍奇金淋巴瘤，PCA＝前列腺癌和良性前列腺增生， GC＝胃癌，GBC_CCC＝胆囊腺癌和胆管癌，MEL＝黑色素瘤，UBC＝膀胱癌，UTC＝ 子宫癌，HNSCC＝头颈部小细胞癌。
Figure BDA0001584383410001182
Figure BDA0001584383410001191
Figure BDA0001584383410001201
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Figure BDA0001584383410001251
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Figure BDA0001584383410001301
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Figure BDA0001584383410001361
Figure BDA0001584383410001371
Figure BDA0001584383410001381
实施例3
MHC-I类提呈肽的体外免疫原性
为了获得关于本发明TUMAP的免疫原性信息，发明人使用体外T细胞扩增分析方法进行了研究，其中该分析方法基于使用装载肽/MHC复合物和抗CD28抗体的人工抗 原提呈细胞(aAPC)进行反复刺激。用这种方法，发明人可显示本发明的HLA-A*02:01 和HLA-A*24的免疫原性，这表明这些肽为对抗人CD8+前体T细胞的T细胞表位(表 9)。
CD8+ T细胞体外激活
为了用载有肽-MHC复合物(pMHC)和抗CD28抗体的人工抗原提呈细胞进行体外 刺激，发明人首先从University clinics Mannheim，(德国)中获取健康供体CD8微珠(Miltenyi Biotec，Bergisch-Gladbach，Germany)通过积极选择白细胞清除术后新鲜HLA-A*02产物而分离出CD8+ T细胞。
PBMC和分离出的CD8+淋巴细胞使用前在T细胞培养基(TCM)中培养，培养基 包括RPMI-Glutamax(Invitrogen公司，Karlsruhe，德国)并补充10％热灭活人AB血 清(PAN-Biotech公司，Aidenbach，德国)、1OOU/ml青霉素/100μg/ml链霉素(Cambrex 公司，Cologne，德国)，1mM丙酮酸钠(CC Pro公司，Oberdorla，德国)和20μg/ml 庆大霉素(Cambrex公司)。在此步骤，2.5ng/ml的IL-7(PromoCell公司，海德堡， 德国)和10U/ml的IL-2(Novartis Pharma公司，纽伦堡，德国)也加入TCM。
对于pMHC/抗-CD28涂层珠的生成、T细胞的刺激和读出，使用每刺激条件四个 不同pMHC分子以及每个读出条件8个不同的pMHC分子在高度限定的体外系统中进 行。
纯化的共刺激小鼠IgG2a抗人CD28抗体9.3(Jung et al.，1987)使用制造商(Perbio 公司，波恩，德国)推荐的N-羟基琥珀酰亚胺生物素进行化学生物素化处理。所用珠 为5.6μm的链霉抗生物素蛋白包裹的多聚苯乙烯颗粒(Bangs Labooratories，伊利诺伊州，美国)。
用于阳性和阴性对照刺激物的pMHC分别为A*0201/MLA-001(从 Melan-A/MART-1中修饰制得的肽ELAGIGILTV(SEQ ID NO.418))和 A*0201/DDX5-001(从DDX5中获得的YLLPAIVHI(SEQ ID NO.419))。
800.000珠/200μl包裹于含有4x12.5ng不同生物素-pMHC的96孔板、进行洗涤， 随后加入体积为200μl的600ng生物素抗-CD28。在37℃下，在含5ng/ml IL-12 (PromoCell)的200μl TCM中共培养1x106CD8+T细胞与2x105的清洗涂层珠3天，从 而激活刺激。之后，一半培养基与补充80U/ml IL-2的新鲜TCM进行交换，并且培养 在37℃下持续4天。这种刺激性周期总共进行3次。对于使用每条件8种不同pMHC分 子的pMHC多聚体读出，二维组合编码方法如前述使用(Andersen et al.，2012)，稍作修 饰，涵盖耦合至5种不同的荧光染料。最后，用Live/dead near IR染料(Invitrogen公司， 卡尔斯鲁厄，德国)、CD8-FITC抗体克隆SK1(BD公司，海德堡，德国)和荧光pMHC 多聚体而执行多聚体分析。对于分析，使用了配有合适激光仪和筛检程序的BD LSRII SORP细胞仪。肽特异性细胞以占总CD8+细胞的百分比形式进行计算。多聚体分析结 果使用FlowJo软件(Tree Star公司，俄勒冈州，美国)进行评估。特定多聚体+CD8+淋 巴细胞的体外填装用与阴性对照刺激组比较而进行检测。如果健康供体中的至少一个可 评价的体外刺激孔在体外刺激后发现含有特异性CD8+T细胞株(即该孔包含至少1％ 特定多聚体+CD8+T细胞，并且特定多聚体+的百分比至少为阴性对照刺激中位数的10 倍)，则检测给定抗原的免疫原性。
不同癌症肽体外免疫原性
对于受到测试的HLA-I类肽，可通过肽特异性T细胞株的生成证明其体外免疫原性。TUMAP特异性多聚体对本发明的2种肽染色后流式细胞仪检测的典型结果如图3 所示，同时也含有相应的阴性对照信息。本发明5种肽的结果汇总于表12A。TUMAP 特异性多聚体对本发明的7种肽染色后流式细胞仪检测的典型结果如图4和5所示，同 时也含有相应的阴性对照信息。本发明74种肽的结果汇总于表12B。
表9A：本发明中HLA I类肽的体外免疫原性
申请人对本发明的肽所做的体外免疫原性实验的示例性结果。＜20％＝+；20％-49％＝ ++；50％-69％＝+++；＞＝70％＝++++
Seq ID 序列 孔
393 KYIEAIQWI ++
399 SYIDVLPEF ++
400 KYLEKYYNL ++
407 VYGIRLEHF +++
414 MYPYIYHVL ++
表12B：本发明HLA-I类肽的体外免疫原性
申请人对本发明的肽所做的体外免疫原性实验的示例性结果。＜20％＝+；20％-49％＝ ++；50％-69％＝+++；＞＝70％＝++++
Figure BDA0001584383410001401
Figure BDA0001584383410001411
Figure BDA0001584383410001421
实施例4
肽的合成
所有的肽通过使用Fmoc策略以标准、广为接受的固相肽合成法合成。每个肽的身份和纯度已使用质谱和RP-HPLC分析法确定。用冻干法(三氟乙酸盐)获得白色至类 白色的肽，纯度为＞50％。所有的TUMAP优选作为三氟乙酸盐或乙酸盐进行给药，其 他药用盐形式也可以。
实施例5
MHC结合测定
本发明基于T细胞疗法的候选肽进一步测试其MHC结合能力(亲和性)。单个肽 -MHC复合体通过UV-配体交换产生，其中，紫外线敏感肽经紫外线照射后裂解，与分 析的相关肽交换。只有能够有效地结合并稳定肽接受MHC分子的候选肽才能阻止 MHC复合物的解离。为了确定交换反应的产率，将基于稳定MHC复合物轻链(β2m)的 检测结果进行ELISA测定。检测总体上按照Rodenko等人在(Rodenko et al.，2006)中描 述的方法进行。
96孔Maxisorp板(NUNC)在室温下在PBS中以2ug/ml链霉包被过夜，用4倍洗 涤并在37℃下在含封闭缓冲液的2％BSA中封闭1小时。折迭的 HLA-A*02:01/MLA-001单体作为标准品，涵盖15-500ng/ml的范围。紫外线交换反应 的肽-MHC单体在封闭缓冲液中稀释100倍。样本在37℃下孵育1小时，洗涤四次， 在37℃下以2ug/ml HRP缀合抗-β2m温育1小时，再次洗涤，并以NH2SO4封堵的TMB 溶液进行检测。在450nm处测量吸收。在生成和产生抗体或其片段时和/或T细胞受体 或其片段时，通常优选显示为高交换产率(优选为高于50％，最优选为高于75％)的 候选肽，这是因为它们对MHC分子表现出足够的亲合力，并能防止MHC复合物的解 离。
表13：MHC-I类结合分数。HLA-I类限制肽与HLA-A*02的结合根据肽交换产量进行范围划分：＜20％＝+；20％-49％＝++；50％-75％＝+++；＞＝75％＝++++
Figure BDA0001584383410001431
Figure BDA0001584383410001441
Figure BDA0001584383410001451
Figure BDA0001584383410001461
表14：MHC-I类结合分数。HLA-I类限制肽与HLA-A*24的结合根据肽交换产量进行范围划分：＜20％＝+；20％-49％＝++；50％-75％＝+++；＞＝75％＝++++
Figure BDA0001584383410001462
Figure BDA0001584383410001471
Figure BDA0001584383410001481
Figure BDA0001584383410001491
Figure BDA0001584383410001501
Figure BDA0001584383410001511
Figure BDA0001584383410001521
Figure BDA0001584383410001531
实施例6
细胞表面提呈的肿瘤相关肽的绝对定量
黏合剂例如抗体和/或TCR的产生是一个费力的过程，其可以仅针对一些选定靶标进行。在肿瘤相关和特异性肽的情况下，选择标准包括但不限于排除提呈于细胞表面上 肽的提呈和浓度。除了所述肽的分离和相对定量，发明人也分析了每个细胞的绝对肽拷 贝数，如实施例1所述。实体肿瘤样本中每个细胞的TUMAP拷贝数定量需要分离 TUMAP的绝对定量、TUMAP分离效率和分析的组织样本细胞计数。
nanoLC-MS/MS肽定量
对于通过质谱法对肽的准确定量，使用内标法生成每种肽的校准曲线。内标是每种 肽的双同位素标记的变体，即，TUMAP合成中纳入2个同位素标记的氨基酸。它与肿 瘤相关肽仅在质量上不同，但在其他的物理化学性质方面无差异(Anderson et al.，2012) 。内标被掺入到每个MS样本，所有MS信号均标准化为内标MS信号，以平衡MS实 验之间潜在的技术差异。
校准曲线用至少三种不同的矩阵绘制，即，来自于类似于常规MS样本的天然样本的HLA肽洗脱液，并且每个制备品以重复MS运行进行测量。对于评价，MS信号被 标准化为内标信号，校准曲线通过logistic回归计算。
对于来自组织样本的肿瘤相关肽的定量，各样本也掺有内标；MS信号标准化为内标并使用该肽校正曲线进行定量。
肽/MHC分离的效率
对于任何蛋白质纯化过程，来自组织样本蛋白的分离与相关蛋白的一定损失相关联 。为了确定TUMAP分离的效率，针对选定为绝对定量的所有TUMAP产生了肽/MHC 复合体。为了能够天然肽MHC/复合体与加样物，使用了单同位素标记版本的TUMAP， 即TUMAP合成期间纳入1个同位素标记的氨基酸。这些复合物被掺入新制备的组织 裂解物中，例如，在TUMAP分离过程中最早可能时间点，然后在之后的亲和纯化中像 天然肽MHC/复合物被获取。因此，测量单标记TUMAP的恢复可得到个体TUMAP分 离效率相关的结论。
分离效率使用少量样本进行分析，且这些组织样本可比较。与此相反，个体肽之间的分离效率不同。这表明，分离效率虽然只在有限数量的样本中进行测定，但可外推至 任何其他组织制备品中。但是，由于分离效率不能从一种肽外推至其他肽，因此，有必 要单独分析每个TUMAP。
固体、冷冻组织中细胞计数的测定
为了确定经过绝对肽定量的组织样本的细胞数，发明人采用了DNA含量分析。此方法适用于不同来源的广泛样本，最重要的是，冷冻样本(Alcoser et al.，2011；Forseyand Chaudhuri，2009；Silva et al.，2013)。在肽分离方案期间，组织样本被加工为均匀的裂解 物，从中取一小等份裂解物。样本等分为三份，从中分离DNA被分离(QiaAmp DNA MiniKit，Qiagen，希尔登，德国)。每次DNA分离的总DNA含量至少重复两次使用基于荧 光的DNA定量测定法(Qubit dsDNA HS Assay Kit，Life Technologies，达姆施塔特，德 国)进行定量。
为了计算细胞数，生成了来自单个健康血细胞等分试样的DNA标准曲线，使用一系列指定的细胞数。标准曲线用于计算每次DNA分离总DNA含量的总细胞含量。用 于肽分离的组织样本的平均总细胞计数，在考虑裂解物等份的已知体积和总裂解物体积 的情况下进行推算。
每细胞的肽拷贝数
使用前述实验的数据，发明人以总肽量除以样本总细胞计数计算得出每个细胞的TUMAP拷贝数，随后除以分离效率。选定肽的细胞拷贝数如表15所示。
表15：绝对拷贝数。该表列出了肿瘤样本中绝对肽定量的结果。针对每种肽，每个细 胞的中位拷贝数表示：＜100＝+；＞＝100＝++；＞＝1,000+++；＞＝10,000＝++++.提示样本 数量，其中提供评估的高质量MS资料。
Figure BDA0001584383410001541
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<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 25
Ile Gln Ala Asp Asp Phe Arg Thr Leu
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<210> 26
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 26
Lys Val Asp Gly Val Val Ile Gln Leu
1 5
<210> 27
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 27
Lys Val Phe Gly Asp Leu Asp Gln Val
1 5
<210> 28
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 28
Thr Leu Tyr Ser Met Asp Leu Met Lys Val
1 5 10
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<211> 9
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 29
Thr Leu Cys Asn Lys Thr Phe Thr Ala
1 5
<210> 30
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 30
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<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 31
Ala Leu Ser Asp Glu Thr Lys Asn Asn Trp Glu Val
1 5 10
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<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 32
Ile Leu Ala Asp Glu Ala Phe Phe Ser Val
1 5 10
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<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 33
Leu Leu Leu Pro Leu Leu Pro Pro Leu Ser Pro Ser Leu Gly
1 5 10
<210> 34
<211> 12
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 34
Leu Leu Pro Lys Lys Thr Glu Ser His His Lys Thr
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 35
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<213> 智人(Homo sapiens)
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Lys Leu Tyr Gly Ile Glu Ile Glu Val
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<213> 智人(Homo sapiens)
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<213> 智人(Homo sapiens)
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Lys Met Gln Glu Asp Leu Val Thr Leu
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<213> 智人(Homo sapiens)
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Ser Leu Leu Ala Leu Pro Gln Asp Leu Gln Ala
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<213> 智人(Homo sapiens)
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<211> 9
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Gly Leu Tyr Gln Ala Gln Val Asn Leu
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Thr Leu Asp His Lys Pro Val Thr Val
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Leu Leu Leu Asp Gly Asp Phe Thr Leu
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<211> 9
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<400> 52
Glu Leu Leu Ser Ser Ile Phe Phe Leu
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<400> 53
Ser Leu Leu Ser His Val Ile Val Ala
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<212> PRT
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<400> 54
Phe Ile Asn Pro Lys Gly Asn Trp Leu Leu
1 5 10
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Ile Ala Ser Ala Ile Val Asn Glu Leu
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<400> 59
Ala Leu Thr Lys Ile Leu Ala Glu Leu
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Thr Leu Ser Ser Glu Arg Asp Phe Ala Leu
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<400> 64
Gly Leu Ser Ser Ser Ser Tyr Glu Leu
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Lys Leu Asp Gly Ile Cys Trp Gln Val
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Gly Leu Phe Ser Gln His Phe Asn Leu
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Gly Met Ile Gly Phe Gln Val Leu Leu
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Ile Leu Asp Glu Thr Leu Glu Asn Val
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Ile Leu Asp Asn Val Lys Asn Leu Leu
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<212> PRT
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Ile Leu Leu Asp Glu Ser Asn Phe Asn His Phe Leu
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<212> PRT
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<400> 78
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<400> 79
Ser Leu Val Pro Leu Gln Ile Leu Leu
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<211> 9
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<213> 智人(Homo sapiens)
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<400> 81
Val Leu Phe Leu Gly Lys Leu Leu Val
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<211> 8
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<213> 智人(Homo sapiens)
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Val Leu Leu Arg Val Leu Ile Leu
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<212> PRT
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<400> 84
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<211> 10
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Ser Thr Leu Asp Gly Ser Leu His Ala Val
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<211> 9
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<211> 11
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 88
Ile Leu Leu Asn Thr Glu Asp Leu Ala Ser Leu
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<400> 89
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<211> 11
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 90
Gly Ala Val Ala Glu Glu Val Leu Ser Ser Ile
1 5 10
<210> 91
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 91
Ser Ser Leu Glu Pro Gln Ile Gln Pro Val
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<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 92
Leu Leu Arg Gly Pro Pro Val Ala Arg Ala
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<211> 9
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 93
Ser Leu Leu Thr Gln Pro Ile Phe Leu
1 5
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<211> 18
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 94
Leu Lys Met Glu Asn Lys Glu Val Leu Pro Gln Leu Val Asp Ala Val
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Thr Ser
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<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 95
Gly Leu Tyr Leu Pro Leu Phe Lys Pro Ser Val Ser Thr Ser Lys Ala
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Ile Gly Gly Gly Pro
20
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<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 96
Tyr Tyr Thr Gln Tyr Ser Gln Thr Ile
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 97
Thr Tyr Thr Phe Leu Lys Glu Thr Phe
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<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 98
Val Phe Pro Arg Leu His Asn Val Leu Phe
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 99
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<211> 13
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 100
Val Tyr Ile Glu Ser Arg Ile Gly Thr Ser Thr Ser Phe
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 101
Ile Tyr Ile Pro Val Leu Pro Pro His Leu
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<211> 9
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 102
Val Tyr Pro Phe Glu Asn Phe Glu Phe
1 5
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<211> 11
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 103
Asn Tyr Ile Pro Val Lys Asn Gly Lys Gln Phe
1 5 10
<210> 104
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 104
Ser Tyr Leu Thr Trp His Gln Gln Ile
1 5
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<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 105
Ile Tyr Asn Glu Thr Ile Thr Asp Leu Leu
1 5 10
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<211> 10
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 106
Ile Tyr Asn Glu Thr Val Arg Asp Leu Leu
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<213> 智人(Homo sapiens)
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Lys Tyr Phe Pro Tyr Leu Val Val Ile
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<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 108
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 109
Leu Phe Ile Thr Gly Gly Gln Phe Phe
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<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 110
Ser Tyr Pro Lys Ile Ile Glu Glu Phe
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 111
Val Tyr Val Gln Ile Leu Gln Lys Leu
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 112
Ile Tyr Asn Phe Val Glu Ser Lys Leu
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 113
Ile Tyr Ser Phe His Thr Leu Ser Phe
1 5
<210> 114
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 114
Gln Tyr Leu Asp Gly Thr Trp Ser Leu
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 115
Arg Tyr Leu Asn Lys Ser Phe Val Leu
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 116
Ala Tyr Val Ile Ala Val His Leu Phe
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 117
Ile Tyr Leu Ser Asp Leu Thr Tyr Ile
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<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 118
Lys Tyr Leu Asn Ser Val Gln Tyr Ile
1 5
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<211> 9
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 119
Val Tyr Arg Val Tyr Val Thr Thr Phe
1 5
<210> 120
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 120
Gly Tyr Ile Glu His Phe Ser Leu Trp
1 5
<210> 121
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 121
Arg Tyr Gly Leu Pro Ala Ala Trp Ser Thr Phe
1 5 10
<210> 122
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 122
Glu Tyr Gln Ala Arg Ile Pro Glu Phe
1 5
<210> 123
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 123
Val Tyr Thr Pro Val Leu Glu His Leu
1 5
<210> 124
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 124
Thr Tyr Lys Asp Tyr Val Asp Leu Phe
1 5
<210> 125
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 125
Val Phe Ser Arg Asp Phe Gly Leu Leu Val Phe
1 5 10
<210> 126
<211> 13
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 126
Pro Tyr Asp Pro Ala Leu Gly Ser Pro Ser Arg Leu Phe
1 5 10
<210> 127
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 127
Gln Tyr Phe Thr Gly Asn Pro Leu Phe
1 5
<210> 128
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 128
Val Tyr Pro Phe Asp Trp Gln Tyr Ile
1 5
<210> 129
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 129
Lys Tyr Ile Asp Tyr Leu Met Thr Trp
1 5
<210> 130
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 130
Val Tyr Ala His Ile Tyr His Gln His Phe
1 5 10
<210> 131
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 131
Glu Tyr Leu Asp Arg Ile Gly Gln Leu Phe Phe
1 5 10
<210> 132
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 132
Arg Tyr Pro Ala Leu Phe Pro Val Leu
1 5
<210> 133
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 133
Lys Tyr Leu Glu Asp Met Lys Thr Tyr Phe
1 5 10
<210> 134
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 134
Ala Tyr Ile Pro Thr Pro Ile Tyr Phe
1 5
<210> 135
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 135
Val Tyr Glu Ala Met Val Pro Leu Phe
1 5
<210> 136
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 136
Ile Tyr Pro Glu Trp Pro Val Val Phe Phe
1 5 10
<210> 137
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 137
Glu Tyr Leu His Asn Cys Ser Tyr Phe
1 5
<210> 138
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 138
Val Tyr Asn Ala Val Ser Thr Ser Phe
1 5
<210> 139
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 139
Ile Phe Gly Ile Phe Pro Asn Gln Phe
1 5
<210> 140
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 140
Arg Tyr Leu Ile Asn Ser Tyr Asp Phe
1 5
<210> 141
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 141
Ser Tyr Asn Gly His Leu Thr Ile Trp Phe
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<210> 142
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 143
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<213> 智人(Homo sapiens)
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Val Phe Ala Ser Leu Pro Gly Phe Leu Phe
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<213> 智人(Homo sapiens)
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Lys Tyr Pro Asp Ile Val Gln Gln Phe
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Arg Tyr Leu Glu Ala Ala Leu Arg Leu
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Asn Tyr Glu Asp His Phe Pro Leu Leu
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Val Phe Ile Phe Lys Gly Asn Glu Phe
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Leu Tyr Ser Pro Val Pro Phe Thr Leu
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Asn Tyr Ser Ser Ala Val Gln Lys Phe
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Thr Tyr Ile Pro Val Gly Leu Gly Arg Leu Leu
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Ala Tyr Ala Gln Leu Gly Tyr Leu Leu Phe
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Ile Tyr Ser Val Gly Ala Phe Glu Asn Phe
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Leu Tyr Ser Glu Leu Thr Glu Thr Leu
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Arg Tyr Ser Thr Phe Ser Glu Ile Phe
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Leu Tyr Leu Glu Asn Asn Ala Gln Thr Gln Phe
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Val Tyr Gln Ser Leu Ser Asn Ser Leu
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Ala Tyr Ile Lys Gly Gly Trp Ile Leu
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Ile Phe Thr Asp Ile Phe His Tyr Leu
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<211> 9
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Val Phe Ile His His Leu Pro Gln Phe
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<211> 9
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<213> 智人(Homo sapiens)
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<211> 9
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<213> 智人(Homo sapiens)
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1 5
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<211> 9
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<213> 智人(Homo sapiens)
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<211> 11
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Leu Tyr Ser Asp Ala Phe Lys Phe Ile Val Phe
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<211> 9
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 208
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<211> 10
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<213> 智人(Homo sapiens)
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<210> 210
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 210
Ile Tyr Ala Gly Val Gly Glu Phe Ser Phe
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<211> 9
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<213> 智人(Homo sapiens)
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Val Phe Lys Ser Glu Gly Ala Tyr Phe
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<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
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Ser Tyr Ala Pro Pro Ser Glu Asp Leu Phe
1 5 10
<210> 213
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 213
Ser Tyr Ala Pro Pro Ser Glu Asp Leu Phe Leu
1 5 10
<210> 214
<211> 9
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 214
Lys Tyr Leu Met Glu Leu Thr Leu Ile
1 5
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<211> 9
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 215
Ser Tyr Val Ala Ser Phe Phe Leu Leu
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<211> 9
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 216
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<211> 9
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<213> 智人(Homo sapiens)
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Ile Tyr Ile Ser Asn Ser Ile Tyr Phe
1 5
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<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
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Leu Tyr Ser Glu Leu Asn Lys Trp Ser Phe
1 5 10
<210> 219
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 219
Ser Tyr Leu Lys Ala Val Phe Asn Leu
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<211> 9
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 220
Ser Tyr Ser Glu Ile Lys Asp Phe Leu
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<211> 9
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 221
Lys Tyr Ile Gly Asn Leu Asp Leu Leu
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<211> 9
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His Tyr Ser Thr Leu Val His Met Phe
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Thr Phe Ile Thr Gln Ser Pro Leu Leu
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 224
Pro Tyr Phe Phe Ala Asn Gln Glu Phe
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 225
Thr Tyr Thr Asn Thr Leu Glu Arg Leu
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<211> 9
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Ile Tyr Arg Phe Ile Thr Glu Arg Phe
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<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 228
Ile Tyr Gln Tyr Val Ala Asp Asn Phe
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 229
Ile Tyr Gln Phe Val Ala Asp Ser Phe
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
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Thr Tyr Gly Met Val Met Val Thr Phe
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<211> 9
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 231
Ala Phe Ala Asp Val Ser Val Lys Phe
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 232
Tyr Tyr Leu Ser Asp Ser Pro Leu Leu
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<211> 11
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 233
Gln Tyr Leu Thr Ala Ala Ala Leu His Asn Leu
1 5 10
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<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
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Ser Tyr Leu Pro Ala Ile Trp Leu Leu
1 5
<210> 235
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 235
Val Tyr Lys Asp Ser Ile Tyr Tyr Ile
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<210> 236
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 236
Val Tyr Leu Pro Lys Ile Pro Ser Trp
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 237
Lys Tyr Val Gly Gln Leu Ala Val Leu
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 238
Ser Tyr Leu Glu Lys Val Arg Gln Leu
1 5
<210> 239
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 239
Val Tyr Ala Ile Phe Arg Ile Leu Leu
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 240
Tyr Tyr Phe Phe Val Gln Glu Lys Ile
1 5
<210> 241
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 241
Ser Tyr Val Lys Val Leu His His Leu
1 5
<210> 242
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 242
Val Tyr Gly Glu Pro Arg Glu Leu Leu
1 5
<210> 243
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 243
Ser Tyr Leu Glu Leu Ala Asn Thr Leu
1 5
<210> 244
<211> 12
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 244
Val His Phe Glu Asp Thr Gly Lys Thr Leu Leu Phe
1 5 10
<210> 245
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 245
Leu Tyr Pro Gln Leu Phe Val Val Leu
1 5
<210> 246
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 246
Lys Tyr Leu Ser Val Gln Leu Thr Leu
1 5
<210> 247
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 247
Ser Phe Thr Lys Thr Ser Pro Asn Phe
1 5
<210> 248
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 248
Ala Phe Pro Thr Phe Ser Val Gln Leu
1 5
<210> 249
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 249
Arg Tyr His Pro Thr Thr Cys Thr Ile
1 5
<210> 250
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 250
Lys Tyr Pro Asp Ile Ala Ser Pro Thr Phe
1 5 10
<210> 251
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 251
Val Tyr Thr Lys Ala Leu Ser Ser Leu
1 5
<210> 252
<211> 13
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 252
Ala Phe Gly Gln Glu Thr Asn Val Pro Leu Asn Asn Phe
1 5 10
<210> 253
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 253
Ile Tyr Gly Phe Phe Asn Glu Asn Phe
1 5
<210> 254
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 254
Lys Tyr Leu Glu Ser Ser Ala Thr Phe
1 5
<210> 255
<211> 9
<212> PRT
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Val Tyr Gln Lys Ile Ile Leu Lys Phe
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<211> 9
<212> PRT
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Val Phe Gly Lys Ser Ala Tyr Leu Phe
1 5
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<211> 12
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 257
Ile Phe Ile Asp Asn Ser Thr Gln Pro Leu His Phe
1 5 10
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<213> 智人(Homo sapiens)
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 259
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<213> 智人(Homo sapiens)
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Lys Tyr Ser Asp Val Lys Asn Leu Ile
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Lys Phe Ile Leu Ala Leu Lys Val Leu Phe
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Ser Leu Trp Phe Lys Pro Glu Glu Leu
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Gly Leu Met Asp Gly Ser Pro His Phe Leu
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Lys Val Leu Gly Lys Ile Glu Lys Val
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Leu Leu Tyr Asp Gly Lys Leu Ser Ser Ala
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Ile Tyr Leu Glu His Thr Glu Ser Ile
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Gln Tyr Gly Gly Asp Leu Thr Asn Thr Phe
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Thr Tyr Gly Lys Ile Asp Leu Gly Phe
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Val Tyr Asn Glu Gln Ile Arg Asp Leu Leu
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<211> 9
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<211> 9
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Gln Phe Ile Thr Ser Thr Asn Thr Phe
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Tyr Tyr Ser Glu Val Pro Val Lys Leu
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<211> 9
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<400> 359
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1 5
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<211> 9
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<400> 360
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<212> PRT
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Val Tyr Asn Tyr Ala Glu Gln Thr Leu
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<400> 363
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Lys Tyr Leu Asn Glu Asn Gln Leu Ser Gln Leu
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 365
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Leu Tyr Gln Asp His Met Gln Tyr Ile
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Val Tyr Val Ile Glu Pro His Ser Met Glu Phe
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<400> 373
Gly Tyr Ile Ser Asn Gly Glu Leu Phe
1 5
<210> 374
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 374
Val Phe Leu Pro Arg Val Thr Glu Leu
1 5
<210> 375
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 375
Lys Tyr Thr Asp Tyr Ile Leu Lys Ile
1 5
<210> 376
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 376
Val Tyr Thr Pro Val Ala Ser Arg Gln Ser Leu
1 5 10
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<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 377
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1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
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Val Tyr Ile Ala Glu Leu Glu Lys Ile
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 379
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1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
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Val Tyr Thr Gly Ile Asp His His Trp
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 381
Lys Tyr Pro Ala Ser Ser Ser Val Phe
1 5
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<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 382
Ala Tyr Leu Pro Pro Leu Gln Gln Val Phe
1 5 10
<210> 383
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 383
Arg Tyr Lys Pro Gly Glu Pro Ile Thr Phe
1 5 10
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<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 384
Arg Tyr Phe Asp Val Gly Leu His Asn Phe
1 5 10
<210> 385
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 385
Gln Tyr Ile Glu Glu Leu Gln Lys Phe
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 386
Thr Phe Ser Asp Val Glu Ala His Phe
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<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 387
Lys Tyr Thr Glu Lys Leu Glu Glu Ile
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 388
Ile Tyr Gly Glu Lys Thr Tyr Ala Phe
1 5
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<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 389
Glu Tyr Leu Pro Glu Phe Leu His Thr Phe
1 5 10
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<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 390
Arg Tyr Leu Trp Ala Thr Val Thr Ile
1 5
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<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 391
Leu Tyr Gln Ile Leu Gln Gly Ile Val Phe
1 5 10
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<211> 11
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 392
Arg Tyr Leu Asp Ser Leu Lys Ala Ile Val Phe
1 5 10
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<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 393
Lys Tyr Ile Glu Ala Ile Gln Trp Ile
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 394
Phe Tyr Gln Pro Lys Ile Gln Gln Phe
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 395
Leu Tyr Ile Asn Lys Ala Asn Ile Trp
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 396
Tyr Tyr His Phe Ile Phe Thr Thr Leu
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 397
Ile Tyr Asn Gly Lys Leu Phe Asp Leu
1 5
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<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 398
Ile Tyr Asn Gly Lys Leu Phe Asp Leu Leu
1 5 10
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<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 399
Ser Tyr Ile Asp Val Leu Pro Glu Phe
1 5
<210> 400
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 400
Lys Tyr Leu Glu Lys Tyr Tyr Asn Leu
1 5
<210> 401
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 401
Val Phe Met Lys Asp Gly Phe Phe Tyr Phe
1 5 10
<210> 402
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 402
Val Trp Ser Asp Val Thr Pro Leu Thr Phe
1 5 10
<210> 403
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 403
Thr Tyr Lys Tyr Val Asp Ile Asn Thr Phe
1 5 10
<210> 404
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 404
Arg Tyr Leu Glu Lys Phe Tyr Gly Leu
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 405
Asn Tyr Pro Lys Ser Ile His Ser Phe
1 5
<210> 406
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 406
Thr Tyr Ser Glu Lys Thr Thr Leu Phe
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 407
Val Tyr Gly Ile Arg Leu Glu His Phe
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 408
Gln Tyr Ala Ser Arg Phe Val Gln Leu
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<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 409
Tyr Phe Ile Ser His Val Leu Ala Phe
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 410
Arg Phe Leu Ser Gly Ile Ile Asn Phe
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 411
Val Tyr Ile Gly His Thr Ser Thr Ile
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 412
Ser Tyr Asn Pro Leu Trp Leu Arg Ile
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 413
Asn Tyr Leu Leu Tyr Val Ser Asn Phe
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<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 414
Met Tyr Pro Tyr Ile Tyr His Val Leu
1 5
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<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 415
Ser Tyr Gln Lys Val Ile Glu Leu Phe
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<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 416
Ala Tyr Ser Asp Gly His Phe Leu Phe
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 417
Val Tyr Lys Val Val Gly Asn Leu Leu
1 5
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<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 418
Glu Leu Ala Gly Ile Gly Ile Leu Thr Val
1 5 10
<210> 419
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 419
Tyr Leu Leu Pro Ala Ile Val His Ile
1 5

Claims (23)

1.一种肽及其药用盐，所述肽由SEQ ID No. 174所示的氨基酸序列组成。
2.根据权利要求1所述的肽，其中所述肽有能力与MHC-I类分子结合，其中所述肽与MHC结合时能够被CD8 T细胞识别。
3.一种核酸，编码权利要求1或2所述的肽。
4.根据权利要求3所述的核酸，其连接到异源启动子序列。
5.一种表达载体，表达权利要求3或4所述的核酸。
6.一种重组宿主细胞，其包括权利要求1或2所述的肽、权利要求3或4所述的核酸、权利要求5所述的表达载体，其中所述宿主细胞为抗原提呈细胞。
7.根据权利要求6所述的重组宿主细胞，其中所述抗原提呈细胞为树突状细胞。
8.一种制备权利要求1或2所述的肽的方法，该方法包括培养权利要求6所述的宿主细胞，该宿主细胞提呈权利要求1或2所述的肽、或表达权利要求3所述的核酸、或表达权利要求5所述的表达载体，以及从该宿主细胞或其培养基中分离出所述肽。
9.一种体外制备激活的T淋巴细胞的方法，该方法包括将T细胞与载有抗原的人I类MHC分子体外接触一段时间，该时间足以以抗原特异性的方式激活所述T细胞，人I类MHC分子在合适的抗原提呈细胞表面或模拟抗原提呈细胞的人工构建体表面上表达，其中所述抗原为权利要求1或2所述的肽。
10.根据权利要求1或2所述的肽、根据权利要求3所述的核酸、根据权利要求5所述的表达载体或根据权利要求6所述的重组宿主细胞在制备用于诊断癌症的试剂盒或在制备抗癌药物中的用途，其中所述癌症选自脑胶质细胞瘤和非小细胞肺癌。
11.一种试剂盒，包括：
(a)容器，包含药物组合物，该药物组合物含有根据权利要求1或2所述的肽，以溶液或冻干的形式。
12.根据权利要求11所述的试剂盒，其中所述试剂盒还包含(b)第二个容器，其含有冻干剂型的稀释溶液或重构溶液。
13.根据权利要求11所述的试剂盒，其中所述试剂盒还包含(c)(i)使用溶液的说明书或(ii)重构和/或使用冻干剂型的说明书。
14.一种用于生产针对个体患者的个性化抗癌疫苗的方法，所述方法包括：
a) 识别个体患者的肿瘤样本所提呈的肿瘤相关肽(TUMAP)；
b) 将a)中识别的肽与已经针对免疫原性进行预先筛选和/或与正常组织相比在肿瘤中过度提呈的肽库进行比较，其中所述库包括序列为SEQ ID No.174的肽；
c) 选择库中的与在该患者中识别的TUMAP匹配的至少一种肽；以及
d) 基于步骤c)配制个性化疫苗。
15. 根据权利要求14所述的方法，其中所述TUMAP通过以下方法识别：
a1) 将来自肿瘤样本的表达数据与来自与肿瘤样本组织类型相应的正常组织样本的表达数据进行比较，以识别在肿瘤样本中过表达或异常表达的蛋白；和
a2) 将表达数据与肿瘤样本中与MHC I类分子结合的MHC配体的序列相关联，以识别源自于肿瘤过表达或异常表达的蛋白的MHC配体。
16. 根据权利要求14或15所述的方法，其中MHC 配体的序列是通过从自肿瘤样本分离的MHC分子中洗脱结合肽，并对所洗脱的配体进行测序识别的。
17.根据权利要求14或15所述的方法，其中与肿瘤样本组织类型相应的正常组织样本获得自同一患者。
18.根据权利要求14或15所述的方法，其中包含在库中的肽基于以下步骤进行识别：
aa.通过微阵列或基于测序的表达谱进行全基因组信使核糖核酸(mRNA)表达分析，其包括识别相较于一种或多种正常组织在恶性组织中过表达的基因；
ab.选择步骤 aa 检测到的选择性表达或过表达的基因所编码的肽，以及
ac.通过选定的肽确定诱导体内 T 细胞反应，包括使用来自健康供体或所述患者的人类 T 细胞而进行的体外免疫原性测定；或
ba.用质谱法识别来自所述肿瘤样本的HLA配体；
bb.通过微阵列或基于测序的表达谱进行全基因组信使核糖核酸(mRNA)表达分析，其包括识别相较于一种或多种正常组织在恶性组织中过表达的基因；
bc.比较所识别的HLA配体与该基因表达数据；
bd.选择步骤bc检测到的选择性表达或过表达的基因所编码的肽；
be.重新检测肿瘤组织上且在健康组织上缺乏或不经常检测到的由步骤bd选定的TUMAP，并确定在mRNA水平上过表达的相关性；以及
bf.通过选定的肽确定诱导体内T细胞反应，包括使用来自健康供体或所述患者的人类T 细胞的体外免疫原性测定。
19.根据权利要求14或15所述的方法，其中包含在库中的肽的免疫原性通过包括体外免疫原性检测、针对个别HLA结合性的患者免疫监测、MHC多聚体染色、ELISPOT分析和/或细胞内细胞因子染色的方法而确定。
20. 根据权利要求14或15所述的方法，其还包括，识别与该个体患者的相应正常组织相比对该肿瘤样本具有唯一性的至少一种突变，以及选择与该突变相关的肽以包含在 疫苗中。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述至少一种突变通过全基因组测序而识别。
22.一种药物组合物，其包括至少一种选自以下的活性成分：
a) SEQ ID No. 174的肽；
b) 编码 a)的核酸或包含该核酸的表达载体；
c) 包括b) 中表达载体的宿主细胞；
d) 根据 a) 至c) 中任一项的缀合或标记的肽或支架、以及药学可接受的载体。
23.根据权利要求22所述的药物组合物，其中所述药物组合物包括药学可接受的赋形剂和/或稳定剂。
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