CN1921878B - 属于Bcl-2家族的蛋白和其片段,和它们在癌症患者中的用途 - Google Patents
属于Bcl-2家族的蛋白和其片段,和它们在癌症患者中的用途 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及属于Bcl-2家族的蛋白和其肽片段，其用作药物组合物。所公开的蛋白和肽片段在用于治疗癌症的疫苗组合物方面特别有用。本发明进一步涉及使用所述组合物的治疗方法。本发明的又一个方面是提供特异性识别所公开的蛋白和肽片段的T细胞和T细胞受体。
Description
技术领域
本发明一般地涉及癌症预防和治疗领域。具体地，提供了能够引发抗癌免疫反应的分离的细胞凋亡调节蛋白或其肽片段。具体地，提供了属于Bcl-2蛋白家族的这种蛋白和其免疫原性肽片段在癌症治疗、诊断和预后方面的用途。
背景技术和现有技术
癌细胞发展出对各种各样的化学治疗剂的抗性成为了成功治疗癌症中的主要障碍。在大量的癌细胞类型中观察到了抗药性。许多机制促进了抗药性，包括药物钝化、细胞膜泵排出药物、药物靶点的突变和不能启动细胞凋亡。细胞凋亡的阻止可以由各种情况引起，包括线粒体膜电位的保持和细胞因子刺激。
对与抗药表型有关的蛋白的研究提示了抗细胞凋亡分子Bcl-2。Bcl-2的过量表达在白血病和其他有细胞凋亡倾向的肿瘤的抗药性发展方面，从而引起各种人类癌症的不良预后方面起到了作用。Bcl-2属于Bcl-2蛋白家族，该家族的成员调节细胞凋亡。该家族包括促细胞凋亡和抗细胞凋亡成员。尽管对于Bcl-2如何发挥它的抗细胞凋亡效果的准确情况仍是不清楚的，已经发现在许多癌症，包括肺、结肠直肠、前列腺和乳腺癌症中，以及在白血病和淋巴瘤中它是过量表达的。
因而，Bcl-2是关键的细胞因素(cellular factor)，因为这个蛋白的升高的表达水平赋予了对细胞凋亡刺激的抗性，从而促进了癌症的发病和发展。
哺乳动物免疫系统识别和与外源或异源材料反应的过程是复杂的。该系统的一个重要方面是T细胞反应。这种反应需要T细胞识别细胞表面分子和肽的复合体并与其相互作用，所述细胞表面分子被称为人类白细胞抗原(HLA)，构成人类主要组织相容性复合体(MHC)。所述肽来源于更大的分子，其由细胞加工，所述细胞则呈递(present)HLA/MHC分子。T细胞与HLA/肽的复合体的相互作用是受限的，需要特异于HLA分子和肽的特 定组合的T细胞。如果特异性T细胞不存在，即使存在配偶复合体也没有T细胞反应。类似地，如果缺少特异性复合体但存在T细胞，也没有反应。
T细胞识别细胞异常的机制也与癌症有关。例如，在WO92/20356中，公开了一种基因家族，其被加工成肽，所述肽依次在细胞表面表达，可以引起肿瘤细胞被特异性CTL裂解。这些基因被称为MAGE家族，据称编码“肿瘤排斥抗原前体”或“TRAP”分子，由此衍生的肽被称为“肿瘤排斥抗原”或“TRA”。
在WO94/05304中，公开了与HLA-A1分子结合的九肽。这个参考文献公开了，根据特定肽对于特定HLA分子的已知特异性，人们将预期特定的肽与一个HLA分子而不是其他分子结合。这是重要的，因为不同的个体拥有不同的HLA表型。结果，将特定的肽鉴定为特异性HLA分子的配偶体具有诊断和治疗的后果(ramifications)，这些仅与具有这种特定HLA表型的个体相关。
因而，已经很好地确定了，来源于肿瘤相关抗原(TAA)的肽表位在MHC分子的环境中可被细胞毒T淋巴细胞(CTL)识别为抗原。然而，尽管普遍接受的是，如果不是全部至少大多数肿瘤是抗原性的，但在肿瘤进展可以容易地被免疫系统控制的意义上仅有少数肿瘤实际上是免疫原性的。
为了克服这种限制，已经启动了几项免疫治疗研究，例如用TAA衍生的肽进行疫苗接种。对于黑素瘤，已经表征了最大数量的CTL定义的TAA，已经通过疫苗接种诱导了针对抗原的强大CTL反应，一些患者经历了疾病的完全消退。然而，用于这些疫苗接种试验中的大多数肽表位是黑素细胞特异性的，这些肽不能应用于非黑素瘤来源的肿瘤。此外，这些TAA的表达在来自不同患者的肿瘤之中是异质的，甚至在来自同一患者的不同转移之中也可以不同。然而，在过去两年期间，已经鉴定了在许多不同的癌症中表达的许多肿瘤特异性肽抗原，即，HER-2、Muc-1和端粒酶。
细胞凋亡是一种细胞自杀的遗传程序，已经提出细胞凋亡的抑制是与通过扩展有助于转化突变积累的细胞生命期而形成癌症相关的重要机制。存活蛋白(survivin)是近来鉴定的细胞凋亡抑制物蛋白(IAP)家族的成员。在约4百万个转录物的全局基因表达分析中，存活蛋白被鉴定为在许多种癌症而不是在正常组织中总是被上调的位居前列(top)的基因之一。过量 表达存活蛋白的实体恶性肿瘤包括肺、结肠、乳房、胰腺和前列腺癌症，以及造血恶性疾病。另外，已经报道了系列的黑素瘤和非黑素瘤皮肤癌永久地是存活蛋白阳性。在大多数人类癌症中存活蛋白的过量表达表明了在肿瘤发展中细胞凋亡抑制的普遍作用，由结肠直肠癌和膀胱癌以及成神经细胞瘤的观察结果证实的观点是，存活蛋白的表达与不良的预后有关。相反，存活蛋白在正常成年人组织中是不可检测的。这些特征使得存活蛋白成为用于诊断和治疗目的的适合的TAA。
这样，在过去的十年中，已经鉴定了许多TAA，其由CTL以主要组织相容性复合体(MHC)限制性的方式识别。由于存活蛋白在大多数人类癌症中过量表达，对其功能的抑制引起细胞凋亡提高，这个蛋白可以充当治疗性CTL反应的靶点。在(1)和US 6.245.523中公开了存活蛋白和它可能的诊断和治疗用途，通过引用将其合并在此。存活蛋白是16.5kDa胞浆蛋白，含有单个BIR和高电荷的羧基末端卷曲螺旋区域而没有RING指结构，当转移到B细胞前体中时抑制由生长因子(IL-3)撤退(withdrawal)所诱导的细胞凋亡。编码存活蛋白的基因与效应细胞蛋白酶受体-1(EPR-1)的序列几乎相同，但处在相反的方向上，这表明以头接头结构重复的两个独立基因的存在。因此，存活蛋白可以描述为反义EPR-1产物。在功能上，通过上调其表达的天然反义EPR-1转录产物抑制存活蛋白，引起大量的细胞凋亡和降低的细胞生长。
US 6.245.523公开了纯化存活蛋白的分离，它提供了编码存活蛋白的核酸分子和与存活蛋白结合的抗体和其他分子。US 6.245.523也公开存活蛋白的抗细胞凋亡活性片段和其变体，其中将氨基酸残基插入到公开的存活蛋白序列的N-或C-末端或内部。它具体地公开这种肽应当含有细胞凋亡所需的关键功能性残基，即，位置67的Trp、位置73的Pro和位置84的Cys。
在过去的十年中，许多的临床试验已经显示了在癌症患者中通过肽特异性疫苗接种来诱导抗肿瘤T细胞反应的可能性。然而，患者的临床病程在大多数情况下没有改善。在许多病例中这种差异被解释为肿瘤细胞的免疫逃避机制。对于靶向癌症生长中起到非重要作用的抗原的治疗策略，抗原缺陷性癌细胞的选择是公认的局限。
然而，对乳腺癌患者来说，已经观察到Bcl-2蛋白的反常作用。在原发乳腺肿瘤中，Bcl-2阴性已经与更坏的临床结局相联系。另外，已经报道了， Bcl-2蛋白的过量表达与Bcl-2基因启动子区域中的雌激素受体反应元件介导的雌激素受体阳性肿瘤有关。雌激素阳性肿瘤的预后比雌激素受体阴性肿瘤的更为良好。已经提出了对这些表面上反常的结果的几种可能的解释，例如，Bcl-2对细胞增殖的抑制效果、雌激素对Bcl-2表达的调控、和/或抑制其细胞保护功能的Bcl-2拮抗物的存在。
并且，上述研究还显示，乳腺癌中Bcl-2的过量表达与抗药性有关，通过反义寡核苷酸下调Bcl-2调整了与细胞凋亡有关的药物敏感性。此外，Bcl-2基因转染到乳腺癌细胞系中一致地产生对细胞凋亡的增强的抗性。此外，已经描述了在乳腺癌中另一个细胞凋亡抑制物存活蛋白的存在与Bcl-2的表达强烈相关，并具有降低的细胞凋亡指标(AI)和不良的总体存活率。已经描述了在成神经细胞瘤、胃癌、结肠直肠癌和高级别非霍奇金淋巴瘤中存活蛋白和Bcl-2之间的类似相关性。因而，象大多数其他人类癌症一样，在乳腺癌中，细胞凋亡的抑制是普遍的特征，抗细胞凋亡基因，例如存活蛋白和/或Bcl-2基因的表达可能导致更为显著的抗细胞凋亡效果，如在降低的细胞凋亡指标中所反映的那样。近来，已经显示，在患有各种癌症的患者中存活蛋白是自发T细胞反应性的靶点。后来已经证实和加强了这些初步的发现(由我们自己和其他人)。
发明概述
本发明基于这样的发现，MHC I类限制性肽可以来源于与存活蛋白不同种类的细胞凋亡调节蛋白，即Bcl-2蛋白家族，其能够与MHC I类HLA分子结合并且从而在患有癌症疾病的患者中引发CTL免疫反应。这些发现表明，属于Bcl-2蛋白家族的蛋白起TRAP分子的作用，其在体内由细胞加工成具有TRA功能的肽。这些发现打开了可能一般性适用于控制癌症疾病的新治疗和诊断手段的途径。
本发明公开了，Bcl-2是针对一系列癌症疾病的免疫疗法的适合的靶点。Bcl-2是关键的细胞因素，它的表达对于肿瘤细胞的存活具有重要性。因而，Bcl-2是疫苗接种的吸引人靶点，因为通过这个蛋白的表达的下调或丧失而产生的免疫逃避将削弱持续的肿瘤生长。此外，在导致本发明的研究过程中，发明人使用ELISPOT分析探索和检测了PBL中针对乳腺癌患者中的Bcl-2衍生的肽的T细胞反应性。
因此，本发明在第一个方面涉及属于Bcl-2蛋白家族的分离的蛋白或其免疫原性活性肽片段，其用作癌症的预防或治疗中的药物。具体地，本发明涉及来源于属于Bcl-2蛋白家族的蛋白的分离的免疫原性活性肽片段，其用作癌症的预防或治疗中的药物。
在进一步的方面，本发明提供了包含本发明的上述蛋白和/或肽片段的药物组合物。
本发明的再一个方面是提供包含属于Bcl-2蛋白家族的分离的蛋白或其免疫原性活性肽片段或编码所述蛋白或所述肽片段的核酸的疫苗组合物，用作癌症的预防或治疗中的药物。
在本发明的再进一步的方面中涉及诊断试剂盒，用于体外或原位诊断癌症患者中的PBL中或肿瘤组织中与Bcl-2蛋白家族成员有反应性的T细胞的存在，所述试剂盒包含如上定义的本发明的肽片段；本发明的肽片段与I类HLA分子或这种分子的片段的复合体。
本发明的再一个目标是提供在癌症患者中检测Bcl-2蛋白家族成员反应性T细胞的存在的方法，该方法包括使肿瘤组织或血液样品与如上定义的本发明的复合体接触，并检测所述复合体与所述组织或血细胞的结合。
另外，提供了能够与本发明的肽片段的分子特异性结合以及能够阻断这种结合的分子。
在另一个方面，本发明涉及治疗癌症疾病的方法，该方法包括向患有所述疾病的患者施用有效量的本发明的药物组合物、能够特异性结合本发明的肽片段的本发明的分子和/或能够阻断这种结合的本发明的分子。
在又一个方面，本发明提供了在此定义的蛋白或肽片段在制备用于治疗癌症疾病的药物中的用途。
发明的详细内容
本发明的主要目的是提供属于Bcl-2蛋白家族的分离的蛋白或其免疫原性活性肽片段，其用作癌症的预防或治疗中的药物。
Bcl-2蛋白家族包括调节细胞凋亡的几种蛋白。这个家族包括促细胞凋亡和抗细胞凋亡成员。在本说明书中，已经特别参考Bcl-2蛋白研究了这个蛋白家族作为癌症中的药物或诊断活性物质的可能性。此外，还详细描述了Bcl-XL和Mcl-1作为药物和诊断活性物质的可能性。然而，看来很可能 的是，与针对Bcl-2蛋白或其片段所观察到的相类似的免疫反应存在，或可以被导入抗Bcl-2蛋白家族的其他成员例如其他抗细胞凋亡蛋白如Mcl-1或Bcl-XL的癌症患者中，这也与癌症中的抗药性和过量表达有关。因此，本发明涉及Bcl-2蛋白家族的任何成员，优选的是能在癌症患者中引发免疫反应的任何抗细胞凋亡成员，例如，选自由Bcl-2、Bcl-w、Mcl-1、Bfl-1/A1、Bcl-b、Bcl2-L-10和Bcl-XL组成的组的蛋白，优选的选自由Bcl-2、Mcl-1、Bcl-w和Bcl-XL组成的组，更优先的选自由Bcl-2、Mcl-1和Bcl-XL组成的组。
Bcl-2抗细胞凋亡家族成员通过抑制通常注定要死亡的细胞中的细胞凋亡发挥它们的致癌的效果，从而促进了细胞在体内的累积。
Bcl-2蛋白家族的所有成员都含有称为Bcl-2同源性(BH)结构域的四个保守基序(BH1、BH2、BH3和BH4)的至少一个。除了存在BH结构域之外，优选的抗细胞凋亡分子具有羧基末端膜锚定结构域(TM)。抗细胞凋亡成员例如Bcl-2和Bcl-XL含有所有四个BH结构域，以及所述跨膜结构域。多结构域的促细胞凋亡蛋白例如Bax和Bak含有除BH4外的所有结构域。促细胞凋亡蛋白的第二种亚群，称为“仅BH3结构域”蛋白(例如，Bad和Bid)，由仅含BH3结构域并缺少其他BH结构域的分子组成。促细胞凋亡蛋白，例如Bcl-XS和Mcl-1S，分别代表了bcl-x和mcl-1基因的可选剪接形式，缺少BH1和BH2结构域。另外，Mcl-1S缺少跨膜结构域。属于Bcl-2家族的蛋白例如在参考文献6中描述的那些。
即便优选的是属于Bcl-2蛋白家族的蛋白具有抗细胞凋亡性质，还包括在本发明内的是，属于Bcl-2家族的蛋白可以是促细胞凋亡蛋白，例如选自由Bax、Bok/Mtd、Bad、Bik/Nbk、Bid、Hrk/DP5、Bim、Noxa、Bmf和PUMA/bbc3组成的组的蛋白。
在本发明的一个优选的实施方式中，所述属于Bcl-2蛋白家族的蛋白是Bcl-2，优选的是人类Bcl-2，更优选的是SwissProt数据库中原始登录号为P10415的序列的Bcl-2。
在本发明的另一个优选的实施方式中，所述属于Bcl-XL蛋白家族的蛋白是Bcl-XL，优选的是人类Bcl-XL，更优选的是具有SwissProt数据库中原始登录号为Q07817的序列的Bcl-XL。
在本发明的又一个优选的实施方式中，所述属于Bcl-2蛋白家族的蛋白是Mcl-1，优选的是人类Mcl-1，更优选的是具有SwissProt数据库中原始登录号为Q07820的序列的Mcl-1。
因为许多人类癌症表达高水平的Bcl-2和Bcl-2家族的其他成员，针对这些抗原的免疫治疗策略可能具有广泛的临床应用。这种手段的主要关注点是诱导自体反应性免疫反应。因而，基于这个蛋白家族的成员疫苗接种的前景将取决于治疗效力和可能伴随免疫的副作用的类型。当来源于黑素细胞分化抗原的肽首先被用于治疗患有IV期黑素瘤的患者时，预想的是这可能导致黑素细胞的显著破坏，其在临床上表现为例如白斑病或视网膜炎。然而，临床经验表明，在接受疫苗接种的患者中白斑病的发病率没有显著地高于接受其他形式治疗的患者中黑素瘤相关性染色不足(hypopigmentation)的发病率。另外，在针对自体抗原的各种疫苗接种试验中没有报道严重的副作用。
在一个有用的实施方式中，提供了新的MHC I类限制性肽片段(在此也称为“肽”)，其被表征为具有几种特征的至少一种，特征之一是以一定亲合性与其受限于(restricted to)的I类HLA分子结合的能力，所述亲合性通过导致I类HLA分子(C50值)的半最大量回收(recovery)的肽的量来测定，通过如在此描述的装配结合分析测定至多是50μM。这种装配分析如早先描述的(2)进行，它是基于在将肽加载到肽转运蛋白缺陷细胞系T2后HLA分子的稳定化。随后，使用构象依赖性抗体对正确折叠的稳定HLA重链进行免疫沉淀，并定量肽的结合。
这种分析提供了根据以上述亲合性与给定HLA等位分子相结合的能力来筛选候选肽的简单方法。在优选的实施方式中，本发明的肽片段是具有至多30μM的C50值，例如，至多20μM的C50值，包括至多10μM、至多5μM和至多2μM的C50值的肽片段。
然而，根据本发明更优选的肽是由ELISPOT分析测定能够提高特异性T细胞反应的肽，所述ELISPOT分析例如以下在实施例1，第4节描述的ELISPOT分析。尽管某些肽不以高亲合性与MHC结合，仍然可能提高由ELISPOT所测定的T细胞反应。能够以高亲合性结合MHC的其他肽也提高由ELISPOT所测定的T细胞反应。这两种肽都是根据本发明优选的肽。
因此，根据本发明优选的肽是能够提高由ELISPOT分析所测定的特异性T细胞反应的肽，其中相对于每108个细胞、更优选的每107个、更优选每106个、更优选的每105个细胞，例如每104个细胞，测定到超过50个肽特异性印迹(blot)。
如上所述，HLA系统代表人类主要组织相容性(MHC)系统。一般地，MHC系统控制了一系列特征：移植抗原、胸腺依赖性免疫反应、某些补体因子(complement factors)和某些疾病的易感性。更具体地，MHC编码三种不同类型的分子，即，I、II和III类分子，其决定了MHC的更一般的特征。在这些分子中，I类分子是在大多数有核细胞和血小板的表面存在的所谓的HLA-A、HLA-B和HLA-C分子。
本发明的肽通过它们与具体MHC I类HLA分子结合(受特定MHC I类分子限制)的能力来表征。因而，在一个实施方式中，所述肽是受MHCI类HLA-A分子限制的肽，所述MHC I类HLA-A分子包括HLA-A1、HLA-A2、HLA-A3、HLA-A9、HLA-A10、HLA-A11、HLA-Aw19、HLA-A23(9)、HLA-A24(9)、HLA-A25(10)、HLA-A26(10)、HLA-A28、HLA-A29(w19)、HLA-A30(w19)、HLA-A31(w19)、HLA-A32(w19)、HLA-Aw33(w19)、HLA-Aw34(10)、HLA-Aw36、HLA-Aw43、HLA-Aw66(10)、HLA-Aw68(28)、HLA-A69(28)。在整个文献中还使用了更简单的名称，其中仅使用原始的数字名称，例如用HLA-A19或HLA-A24分别替代HLA-Aw19和HLA-A24(49)。在具体实施方式中，本发明的肽受选自由HLA-A1、HLA-A2、HLA-A3、HLA-A11和HLA-A24组成的组发MHC I类HLA种类的限制。
本发明的肽可以，例如，来源于Bcl-2蛋白家族成员的已知序列(3)。在本发明的优选的实施方式中，所述肽包含(或更优先的由其组成)来自Bcl-2蛋白家族的上述成员之一，优选来自SwissProt数据库中原始登记登陆号为P10415的Bcl-2、原始登记登陆号为Q07820的Mcl-1或原始登记登陆号为Q07817的Bcl-XL的至多200个、优选的至多100个、更优选的至多50个、更优选至多25个、更优选至多20个、更优选至多15个、例如至多10个，例如在9到10个的范围内的连续氨基酸。
可以通过与结合给定HLA分子的已知序列进行比对，从而揭示肽中具体位置上几个有关氨基酸的优势度(predominance)，来选择对可能具有与特 定HLA分子结合的能力的肽。这种优势氨基酸残基在此也称为“锚残基”或“锚残基基序”。通过利用基于可以在可用数据库中找到的已知序列数据进行这种相对简单的程序，可以从Bcl-2蛋白家族分子得到可能与特定HLA分子结合的肽。在下表中给出对一系列HLA分子进行这种分析的代表性实例：
| HLA等位 基因 | 位置1 | 位置2 | 位置3 | 位置5 | 位置6 | 位置7 | C-末端 |
| HLA-A1 HLA-A2 HLA-A3 HLA-A11 HLA-A23 HLA-A24 HLA-A25 HLA-A26 HLA-A28 HLA-A29 HLA-A30 HLA-A31 HLA-A32 HLA-A33 HLA-A34 HLA-A66 HLA-A68 HLA-A69 HLA-A74 HLA-B5 HLA-B7 HLA-B8 HLA-B14 HLA-B15 (B62) HLA-B17 HLA-B27 HLA-B35 HLA-B37 HLA-B38 HLA-B39 HLA-B40 (B60，61) HLA-B42 HLA-B44 HLA-B46 HLA-B48 HLA-B51 HLA-B52 HLA-B53 HLA-B54 HLA-B55 | E，DE，D E，DE，D * | T，SL，ML，V，MY，I，F，YI，YYM，A，TV，T，I，L，FV，A，LEY，L，F，V I，LY，I，L，VV，LT，VT，VV，T，ATA，PP R，KQ，L，K，P，H，V，I，M，S，T RPD，EHR，HE L，PEM，I，L，VQ，KA，P，GQPPP | D，E F，Y M，L，F，Y，I I L，M，F，Y F，Y K D，E F，I，V F，Y | I，V K，R | V F I，L，V | L | Y L，V K，Y，F K，R W，I I，L，F W Y，F A，R Y，L Y R W R R R，K R，K V，L V，L I，L L，F L L，V F，Y，W L，V Y，K，F，L I，L，M，Y I，L，M F，L L，F L，V，A，W， M，T，R Y，L F，Y，W Y，F L F，Y，I，V I，V W，F，L A，V |
[0047]
| HLA-B56 HLA-B57 HLA-B58 HLA-B67 HLA-B73 HLA-Cw1 HLA-Cw2 HLA-Cw3 HLA-Cw4 HLA-Cw6 HLA-Cw6 HLA-Cw8 HLA-Cw16 | P A，T，S A，T，S P R A，L A，L A，L Y，P，F Y Y A，L | A，VF，W，YF，W，YLPLF，YL，ML，M，F，YL，I，V，YL，Y，FL，I，L，V |
*在一个实施方式中，对于这个位置没有特异性锚残基，然而在优选的实施方式该锚残基是R或A。
因而，举例来说，可能具有与HLA-A1相结合的能力的九肽将具有以下序列之一：Xaa-T-D-Xaa-Xaa-Xaa-L-Xaa-Y、Xaa-T-E-Xaa-Xaa-Xaa-L-Xaa-Y；Xaa-S-D-Xaa-Xaa-Xaa-L-Xaa-Y或Xaa-S-E-Xaa-Xaa-Xaa-L-Xaa-Y(Xaa表示任何氨基酸残基)。按类似的方式，可以设计可能具有与其他任何HLA分子结合的能力的序列。
要理解的是，本领域的普通技术人员将能够鉴定给定HLA分子的其它“锚残基基序”。
因而，在有用的实施方式中，本发明的肽包括肽，对于在表中所列的每个具体HLA等位基因，所述肽的序列包含如表中所示的任何氨基酸残基。
因而，本发明的肽可以是包含来自Bcl-2蛋白家族成员的连续序列的任何上述的肽，其中1到10个、优选的1到5个、更优选的1到3个、更优选1到2个，更优选1个氨基酸已经被其它氨基替换，优选的以这样一种方式替换，其使所述肽包含如上表所示的给定HLA-A特异性肽的一个或多个，优选所有的锚残基。
在实施例3中“修饰的肽反应”一节描述了如何制备包含给定HLA-A特异性肽锚残基的Bcl-2蛋白家族成员的肽的非限制性实例。因而，在本发明的一个实施方式中，所述肽可以是任何肽，其包含至多200个、优选的至多100个、更优选的至多50个、更优选至多25个、更优选至多20个、更优选至多15个、更优选至多10个氨基酸，并包含(或更优选的由以下组成)选自由RLKRDWLVK(SEQ ID NO：62)、QSDEIISRY(SEQ ID NO：63 )和QSEEIISRY(SEQ ID NO：64)组成的组，更优先的选自由RLKRDWLVK(SEQ ID NO：62)组成的组的序列。
因而，鉴定本发明的肽的简单方法包括以下步骤：选择具体的HLA分子，例如，在给定群体中以高频率发生的一种，进行如上所述的比对分析来鉴定Bcl-2蛋白家族蛋白中的“锚残基基序”，分离或构建包含一个或多个所鉴定的锚残基的大小适合的肽，并检测所产生的肽的(i)结合特定HLA分子的能力，其中使用在此描述的装配分析(assembly assay)，(ii)以每104 个PBL至少1个频率在癌症患者的PBL群体中引发IFN-γ生产细胞的所述肽的能力，其通过在此描述的ELISPOT分析测定，和/或(iii)所述肽在与待检测的表位肽有反应性的肿瘤组织CTL中进行原位受检能力。
在特定实施方式中，本发明的肽是HLA-A2限制的Bcl-2衍生的肽，具有选自以下的序列：ALVGACITL(SEQ ID NO：1)、ALSPVPPVV(SEQ IDNO：2)、SLALVGACI(SEQ ID NO：3)、KTLLSLALV(SEQ ID NO：4)、LLSLALVGA(SEQ ID NO：5)、WLSLKTLLSL(SEQ ID NO：6)、AAAGPALSPV(SEQ ID NO：7)、PLFDFSWLSL(SEQ ID NO：8)、FTARGRFATV(SEQ ID NO：9)、YLNRHLHTWI(SEQ ID NO：10)、NIALWMTEYL(SEQ ID NO：11)。
在优选的实施方式中，所述肽可以是任何肽，其由至多200个、优选的至多100个、更优选的至多50个、更优选至多25个、更优选至多20个、更优选至多15个、更优选至多10个氨基酸组成，并包含这样的序列(或更优选的由其组成)，所述序列选自由ALVGACITL(SEQ ID NO：1)、ALSPVPPVV(SEQ ID NO：2)、SLALVGACI(SEQ ID NO：3)、KTLLSLALV(SEQ ID NO：4)、LLSLALVGA(SEQ ID NO：5)、WLSLKTLLSL(SEQ IDNO：6)、AAAGPALSPV(SEQ ID NO：7)、PLFDFSWLSL(SEQ ID NO：8)、FTARGRFATV(SEQ ID NO：9)、YLNRHLHTWI(SEQ ID NO：10)、NIALWMTEYL(SEQ ID NO：11)组成的组，更优选的选自由NIALWMTEYL(SEQ ID NO：11)、YLNRHLHTWI(SEQ ID NO：10)、PLFDFSWLSL(SEQID NO：8)和WLSLKTLLSL(SEQ ID NO：6)组成的组，更优选选自由PLFDFSWLSL(SEQ ID NO：8)和WLSLKTLLSL(SEQ ID NO：6)组成的组。
在另一个优选的实施方式中，所述肽可以是任何肽，其由至多200个、优选的至多100个、更优选的至多50个、更优选至多25个、更优选至多20个、更优选至多15个、更优选至多10个氨基酸组成，并包含这样的序列(或更优选的由其组成)，所述序列选自由EMQVLVSRI(SEQ ID NO：44)、TAYQSFEQV(SEQ ID NO：43)、YLNDHLEPWI(SEQ ID NO：42)、RIAAWMATYL(SEQ ID NO：45)、WMATYLNDHL(SEQ ID NO：46)、VLVSRIAAWM(SEQ ID NO：48)和VAFFSFGGAL(SEQ ID NO：49)组成的组，更优选的选自由TAYQSFEQV(SEQ ID NO：43)、YLNDHLEPWI(SEQID NO：42)、RIAAWMATYL(SEQ ID NO：45)、WMATYLNDHL(SEQ IDNO：46)、VLVSRIAAWM(SEQ ID NO：48)和VAFFSFGGAL(SEQ ID NO：49)组成的组，更优选选自由TAYQSFEQV(SEQ ID NO：43)、VAFFSFGGAL(SEQ ID NO：49)、VLVSRJAAWM(SEQ ID NO：48)和RIAAWMATYL(SEQ ID NO：45)组成的组或选自由TAYQSFEQV(SEQ ID NO：43)和WMATYLNDHL(SEQ ID NO：46)组成的组或选自由YLNDHLEPWI(SEQID NO：42)组成的组。
在又一个优选的实施方式中，所述肽可以是任何肽，其由至多200个、优选的至多100个、更优选的至多50个、更优选至多25个、更优选至多20个、更优选至多15个、更优选至多10个氨基酸组成，并包含(或更优选的由以下组成)选自由RIAAWMATY(SEQ ID NO：50)和ALCVESVDK(SEQ ID NO：51)组成的组，更优选的选自由RIAAWMATY(SEQ ID NO：50)组成的组的序列。
在又一个优选的实施方式中，所述肽可以是任何肽，其由至多200个、优选的至多100个、更优选的至多50个、更优选至多25个、更优选至多20个、更优选至多15个、更优选至多10个氨基酸组成，并包含(或更优选的由以下组成)选自由YLREQATGAK(SEQ ID NO：52)、SITDVLVRTK(SEQ ID NO 53)、LISFGAFVAK(SEQ ID NO 54)、RLLFFAPTR(SEQ IDNO：55)、RTKRDWLVK(SEQ ID NO：56)和DIKNEDDVK(SEQ ID NO：57)组成的组，更优先的选自由RLLFFAPTR(SEQ ID NO：55)和RTKRDWLVK(SEQ ID NO：56)组成的组的序列。
在又一个优选的实施方式中，所述肽可以是任何肽，其由至多200个、优选的至多100个、更优选的至多50个、更优选至多25个、更优选至多 20个、更优选至多15个、更优选至多10个氨基酸组成，并包含(或更优选的由以下组成)选自由PAEEEEDDLY(SEQ ID NO：58)、SPEEELDGY(SEQ ID NO：59)、QSLEIISRY(SEQ ID NO：60)和AGVGAGLAY(SEQ IDNO：61)组成的组，更优先的选自由PAEEEEDDLY(SEQ ID NO：58)和QSLEIISRY(SEQ ID NO：60)组成的组的序列。
在进一步有用的实施方式中，本发明的肽是一种肽，其受到MHC I类HLA-B分子的限制，所述分子包括以下的任何分子：HLA-B5、HLA-B7、HLA-B8、HLA-B12、HLA-B13、HLA-B14、HLA-B15、HLA-B16、HLA-B17、HLA-B18、HLA-B21、HLA-Bw22、HLA-B27、HLA-B35、HLA-B37、HLA-B38、HLA-B39、HLA-B40、HLA-Bw41、HLA-Bw42、HLA-B44、HLA-B45、HLA-Bw46和HLA-Bw47。在具体的实施方式中，本发明的肽能够与之结合的MHC I类HLA-B种类选自HLA-B7、HLA-B35、HLA-B44、HLA-B8、HLA-B15、HLA-B27和HLA-B51。
在其它有用的实施方式中，本发明的肽是一种肽，其受到MHC I类HLA-B分子的限制，所述分子包括以下的任何分子：HLA-Cw1、HLA-Cw2、HLA-Cw3、HLA-Cw4、HLA-Cw5、HLA-Cw6、HLA-Cw7和HLA-Cw1。
优选的，本发明的肽片段包含少于50个氨基酸残基，更优选的它包含至多20个氨基酸残基，例如至多10个氨基酸残基。在具体的实施方式中，所述肽是七肽、八肽、九肽、十肽或十一肽。
如上所述，本发明的肽来源于Bcl-2蛋白家族成员或是其片段。可以衍生出所述肽的蛋白可以是来自任何表达该蛋白的物种的任何Bcl-2蛋白家族成员。在优选的实施方式中，起始蛋白来自哺乳动物物种，包括啮齿动物物种、兔和灵长类物种，例如人类。根据选定蛋白的序列，可以通过对所述蛋白起始材料的适当的化学或酶处理产生如上所述大小适合的肽，来得到本发明的肽，或可以通过本领域技术人员熟知的任何常规的肽合成过程来合成。
本发明的肽可以具有这样的序列，所述序列是衍生出该肽的Bcl-2蛋白家族成员的天然序列。然而，例如，在如上所述根据给定HLA分子鉴定锚残基基序的方法的基础上，可以通过取代、删除或添加至少一个氨基酸残基来修饰序列，从这种天然序列得到具有对任何给定HLA分子更高亲合性的肽。
本发明的肽的重要特征是它识别或引发INF-γ生产效应T细胞，即细胞毒性T细胞(CTL)的能力，所述细胞特异性地识别癌症患者的PBL群体或肿瘤细胞(靶细胞)中的具体多肽。通过对患者的PBL或肿瘤细胞进行如参考文献(4)和以下实施例描述的ELISPOT分析，可以容易地确定这种活性。在分析之前，有利的是通过使待测试的肽与细胞接触来刺激待分析的PBL群体或肿瘤细胞。优选的，根据在此使用的ELISPOT分析所测定的，所述肽能够以每104个PBL至少1个的频率引发或识别产生INF-γ的T细胞。更优选的，所述频率是每104个PBL至少5个，最优选的是每104 个PBL至少10个，例如每104个PBL至少50或100个。
ELISPOT分析代表了监视Bcl-2家族衍生的肽特异性T细胞反应的有力工具。然而，尽管在已经显示了大多数情况下ELISPOT反应性与CTL裂解靶细胞的能力相关，这个观点的结论性证据只能是直接地给出的。因此，保温的发现的主要含意是，本发明的肽可以被表达并与癌细胞上的HLA分子复合。这使得这些癌细胞对CTL的破坏敏感，并强调了Bcl-2家族蛋白免疫对控制赘生物生长的有用性。在来自乳腺癌患者的PBL中对HLA限制性Bcl-2衍生的肽表位的自发性CTL反应的存在，证实了不仅在乳腺癌患者中而且在广泛的癌症疾病中这些肿瘤抗原的免疫治疗有效性，因为Bcl-2蛋白家族成员在许多癌症包括肺、结肠直肠、前列腺癌症和在白血病和淋巴瘤中过量表达。
因此，在另一个优选的实施方式中，本发明的肽能够引发癌症疾病患者的PBL群体中的产生INF-γ的细胞，在所述癌症疾病中表达Bcl-2蛋白家族，所述癌症疾病包括造血恶性疾病(haematopoietic malignancy)，例如慢性淋巴白血病(chronic lymphatic leukemia)和慢性髓细胞性白血病(chronicmyeloid leukemia)、黑素瘤(melanoma)、乳腺癌(breast cancer)、宫颈癌(cervixcancer)、卵巢癌(ovary cancer)、肺癌(lung cancer)、结肠癌(colon cancer)、胰腺癌(pancreas cancer)和前列腺癌(prostate cancer)。
除了在PBL群体中引发免疫反应的能力之外，还预期本发明的肽能够引发原位的细胞溶解免疫反应，即，在实体肿瘤组织中。通过提供HLA-肽复合体，例如，多聚化的和具有可检测标记的形式，并使用这样的复合体进行免疫组织化学染色来检测肿瘤组织中与本发明的表位肽有反应性的 CTL。因此，本发明的肽的进一步的重要特征是，能够在肿瘤组织中原位检测与所述表位肽有反应性的CTL。
还考虑的是，除了与HLA分子结合引起HLA和肽的复合体在细胞表面呈递(其中的复合体随后起细胞溶解性T细胞的表位或靶点的作用)的能力之外，本发明的肽还能引发其他类型的免疫反应，例如引起产生针对所述复合体的抗体的B细胞反应和/或延迟型超敏性(Delayed TypeHypersensitivity，DTH)反应。后一种类型的免疫反应被定义为在注射本发明的肽的位置的发红和明显硬化(palpable induration)。
根据本发明的疫苗组合物可以包含编码属于Bcl-2蛋白家族的蛋白或其肽片段的核酸。因而所述核酸可以编码任何上述的蛋白和肽片段。例如，所述核酸可以是DNA、RNA、LNA、HNA、PNA，优选的所述核酸是DNA或RNA。
本发明的核酸可以被包含在任何适合的载体，例如表达载体内。许多的载体是可获得的，技术人员能够根据具体目的选择有用的载体。例如，所述载体可以是质粒、粘粒、病毒粒子或人工染色体的形式。可以通过各种方法将适合的核酸序列插入到载体中，例如，可以使用本领域公知的技术将DNA插入到适合的限制性内切酶位点中。除了根据本发明的核酸序列之外，所述载体可以另外包含一个或多个信号序列、复制起点、一个或多个标记基因、增强子元件、启动子和转录终止序列。载体也可以包含其他序列。构建含有一种或多种这些成分的适合的载体采用本领域技术人员已知的标准连接技术。所述载体优选的是表达载体，包含与指导核酸在适合的细胞中表达的调节核酸序列可操作连接的核酸。在本发明的范围内，所述调节核酸序列一般地应当能够直接在哺乳动物细胞中、优选的在人类细胞中、更优选的在抗原呈递细胞中表达。
在一个优选的实施方式中，所述载体是病毒载体。除了编码Bcl-2蛋白家族成员或其肽片段的核酸之外，所述病毒载体可以包含编码T细胞刺激多肽(T-cell stimulatory polypeptide)的第二核酸序列。T细胞刺激多肽优选的选自由B7.1、ICAM-1和LFA-3组成的组。
所述载体也可以是细菌载体，例如减毒的细菌载体。可以使用减毒的细菌载体来在感染和存留(persistence)的位置诱导持续的粘膜免疫反应。可以使用不同的重组细菌作为载体，例如细菌载体可以选自由Salmonella、 Lactococcus和Listeria组成的组。一般地，可以显示出针对异源抗原HPV16L1或E7的免疫的诱导，在小鼠中有强烈的CTL诱导和肿瘤衰退。
本发明还涉及多部分的试剂盒(kit-of-parts)，包括
i)在此描述的任何疫苗组合物和/或
ii)在此描述的属于Bcl-2蛋白家族的任何蛋白和/或
iii)在此描述的ii)的蛋白的任何肽片段和/或
iv)编码ii)的蛋白或iii)的肽的任何核酸
和另外的抗癌试剂。
多部分试剂盒的成分优选的被包含在单独的组合物中，然而包含在本发明的范围内的是，多部分试剂盒的成分都被包含在相同的组合物中。因而可以同时地或按任何顺序次序地施用多部分试剂盒的成分。
抗癌试剂可以是用于化疗或基因治疗的试剂、免疫刺激物质或抗体。举例来说，免疫刺激物质可以是细胞因子，例如，选自由GM-CSF、I型IFN、白细胞介素12和白细胞介素15组成的组的细胞因子。所述抗体优选的是免疫刺激抗体，例如抗CD40或抗CTLA-4抗体。免疫刺激物质也可以是能够耗尽免疫抑制细胞(例如，调节T细胞)或因子的物质，例如所述物质可以是E3遍在蛋白连接酶。E3遍在蛋白连接酶(HECT、RING和U-盒蛋白)已经显现出是免疫细胞功能的关键的分子调节物，通过靶向蛋白水解破坏的特异性抑制分子，每一种都可能涉及感染期间的免疫反应的调节。几种HECT和RING E3蛋白现在也已经与免疫自身耐受性的诱导和维持联系起来：c-Cbl、Cbl-b、GRAIL、Itch和Nedd4各自负调节T细胞生长因子产生和增殖。
显然，本发明的发现提供了本发明的蛋白和肽片段的治疗以及诊断应用的基础。
因此，在本发明的进一步的方面提供了一种药物组合物，其包含本发明的蛋白或肽片段，特别是一种药物组合物，当被施用给癌症患者时，能够引发针对所述癌症疾病的免疫反应，包括在接种的患者中引发具有对癌细胞的细胞毒效应的效应T细胞的产生。
如公知的，不同的HLA分子在主要的人类人群中具有不同的流行度，存在着鉴定限制于几种HLA I类分子的肽表位的需求，以扩展可以根据本发明的方法治疗的患者群。具有不同HLA限制元件的多Bcl-2表位的表征， 以两种重要的途径扩展了这种靶点抗原的临床可能性：(i)它提高了适合于根据Bcl-2衍生的肽的免疫疗法的患者数目。HLA-A2抗原由约50％的白种人和亚洲人群体表达，HLA-A1和HLA-A3抗原都由约25％的白种人和5％的亚洲人表达，而HLA-A11抗原由约15％的白种人和30％的亚洲人表达。即使由于共表达这些数字不能加和，受多种这些抗原限制的肽的组合当然地包括了大多数癌症患者，(ii)在每个患者中集合地靶向几种限制元件很可能降低由HLA等位基因缺少所带来的免疫逃避的风险。单个HLA等位基因的缺失是描述癌细胞的MHC改变的重要成分，而I类表达的全部缺失是更为罕见的事件。因而，鉴定受限于不同HLA等位基因的Bcl-2表位，将有可能在具有等位重叠的患者中靶向超过一个的HLA分子。
因而，有可能开发高免疫原性的多表位疫苗。优选的，设计这种疫苗以便促进最适的Bcl-2衍生的肽与其他适合的肽和/或以下描述的佐剂的任选组合的同时递送。本发明涵盖了这样的多表位疫苗，其包含Bcl-2衍生的肽，其中任选地组合其它不属于或不来源于Bcl-2蛋白家族的蛋白或肽片段和/或以下描述的佐剂和/或以下描述的II类MHC限制性表位。
尽管肿瘤一般不表达II类MHC，对于引发肿瘤特异性T辅助细胞免疫(即用II类MHC限制性表位的免疫接种)的关注提高。这是基于新近的发现，疫苗诱导的抗肿瘤反应的诱导和效力在很多情况下需要肿瘤特异性CD4阳性Th细胞的协作。因而，推动具有更复杂的组成的疫苗的开发的重要因素是，例如，通过设计包含或编码一组经仔细选择的CTL或Th细胞表位的疫苗，来靶向多个肿瘤抗原的需要。
明显地，多表位疫苗构成了提高针对来源于几种不同抗原的表位的免疫力的有效方法，而不需要导入可能危险的蛋白例如癌蛋白(oncoprotein)(或其编码基因)。这种疫苗还允许选择性的诱导针对亚优势的和隐藏的T细胞表位的免疫，在对肿瘤相关自身抗原存在耐受性的情况下对于在正常组织中显著存在的表位来说这是特别重要的。此外，由于抗原呈递细胞的免疫蛋白酶体和大多数肿瘤细胞中存在的“组成型”蛋白酶体之间的功能差异，抗原呈递细胞可能不能呈递某些在肿瘤细胞上表达的表位。对于基于肽的疫苗来说，可以以“MHC-预备(MHC-ready)”的形式施用这种表位，这允许通过外源加载来呈递，其独立于由宿主抗原呈递细胞进行的抗原摄取和加工。
由于本发明的肽是相对小的分子，在这种组合物中可能需要将所述肽与各种材料，例如佐剂组合，来产生疫苗、免疫原性组合物等。佐剂，广泛地定义，是促进免疫反应的物质。常见地，可选的佐剂是弗氏完全或不完全佐剂，或与例如白矾沉淀的抗原共同使用的灭活的B.pertussis有机体。在Goding，Monoclonal Antibodies：Principles & Practice(2nd edition，1986)第61-63页提供了佐剂的一般性论述。然而，Goding认为，当目标抗原具有低分子量、或是低免疫原性时，推荐与免疫原性载体偶联。这种载体分子的实例包括匙孔血蓝蛋白、牛血清白蛋白、卵清蛋白和禽类免疫球蛋白。还建议了各种皂角苷提取物可用作免疫原性组合物中的佐剂。近来，已经建议使用公知的细胞因子粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)作为佐剂(WO 97/28816)。
根据本发明的疫苗组合物优选的包含佐剂和/或载体。有用的佐剂和载体的实例在以下给出。因而组合物中存在的属于Bcl-2蛋白家族的蛋白或其肽片段可以与载体相连，所述载体诸如蛋白或抗原呈递细胞，例如，能向T细胞呈递Bcl-2蛋白家族或其肽片段的树突细胞(DC)。
佐剂是任何物质，其混合到疫苗组合物中提高了或改变了对Bcl-2蛋白家族或其肽片段的免疫反应。载体是支架结构的，例如多肽或多聚糖，Bcl-2蛋白家族或其肽片段能够与之相连。
举例来说，佐剂可以选自以下物质组成的组：AlK(SO4)2、AlNa(SO4 )2、AlNH4(SO4)、硅质、白矾、Al(OH)3、Ca3(PO4)2、高岭土、碳、氢氧化铝、胞壁酰二肽、N-乙酰-胞壁酰基-L-苏氨酰-D-异谷氨酰胺(thr-DMP)、N-乙酰-nornuramyl-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺(CGP 11687，也称为nor-MDP)、N-acetylmuramyul-L-丙氨酰-D-异谷氨酰基-L-丙氨酸-2-(1′2′-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-羟基磷酰基氧(hydroxphosphoryloxy))-乙胺(CGP 19835A，也称为MTP-PE)、2％角鲨烯/Tween-80.RTM乳剂中的RIBI(MPL+TDM+CWS)、脂多糖和它的各种衍生物，包括脂质A、弗氏完全佐剂(FCA)、弗氏不完全佐剂、Merck佐剂65、多核苷酸(例如，聚IC和聚AU酸)、来自结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis)的wax D、在短小棒状杆菌(Corynebacterium parvum)、百日咳杆菌(Bordetella pertussis)和布鲁氏菌(Brucella)属的成员中发现的物质，脂质体或其他脂质乳剂、Titermax、ISCOMS、Quil A、ALUN(参见US 58767和5,554,372)、脂质A衍生物、霍乱毒素衍生物、HSP衍生物、LPS衍生物、合成的肽基质或GMDP、白细胞介素1、白细胞介素2、Montanide ISA-51和QS-21。用于本发明的优选的佐剂包括基于油/表面活性剂的佐剂，例如Montanide佐剂(可从Seppic，Belgium获得)，优选的是Montanide ISA-51。其他优选的佐剂是基于细菌DNA的佐剂，例如包括CpG寡核苷酸序列的佐剂。其他优选的佐剂是基于病毒dsRNA的佐剂，例如聚I:C。咪唑喹啉(Imidazochinilines)是优选的佐剂的又一个实例。此外，优选的佐剂是脂质体。最优选的佐剂是适合于人类使用的佐剂。
Montanide佐剂(都可从Seppic，Belgium获得)，可以选自由Montanide ISA-51、Montanide ISA-50、Montanide ISA-70、Montanide ISA-206、Montanide ISA-25、Montanide ISA-720、Montanide ISA-708、Montanide ISA-763A、Montanide ISA-207、Montanide ISA-264、Montanide ISA-27、MontanideISA-35、Montanide ISA 51F、Montanide ISA-016D和Montanide IMS组成的组，优选的选自由Montanide ISA-51、Montanide ISA IMS和Montanide ISA-720组成的组，更优选的选自由Montanide ISA-51组成的组。Montanide ISA-51(Seppic，Inc.)是基于油/表面活性剂的佐剂，其中不同的表面活性剂与非可代谢矿物油、可代谢油、或两者的混合物组合。制备它们用作具有包含属于Bcl-2蛋白家族的蛋白或其肽片段的水溶液的乳剂。表面活性剂是二缩甘露醇油酸(mannide oleate)。QS-21(抗原性的；Aquila Biopharmaceuticals，Framingham，MA)是用作水溶液的高度纯化的、水溶性的皂角苷。QS-21和Montanide ISA-51佐剂可以以无菌、单次使用的小瓶形式提供。
在Goding，Monoclonal Antibodies：Principles & Practice(2nd edition，1986)第61-63页提供了佐剂的一般性论述。然而，Goding认为，当目标抗原具有低分子量、或是低免疫原性时，推荐与免疫原性载体偶联。这种载体分子的实例包括匙孔血蓝蛋白、牛血清白蛋白、卵清蛋白和禽类免疫球蛋白。还建议了各种皂角苷提取物作为免疫原性组合物中的佐剂是有用的。近来，已经建议使用公知的细胞因子粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)作为佐剂(WO 97/28816)。
能够根据本发明使用的佐剂的所需功能在下表中列出。
表1.佐剂作用的模式
| 作用 | 佐剂类型 | 益处 |
| 1.免疫调节 2.呈递 3.CTL诱导 4.靶向 5.贮池产生 | 一般地是修饰细胞因子网络的小分子或蛋白一般是与天然构象的免疫原反应的两亲性分子或复合体· 能结合或包封免疫原，且能与细胞膜融合或破坏细胞膜的粒子· 直接将肽附着到细胞表面MHC-1的w/o乳剂· 结合免疫原的微粒佐剂。中和库弗细胞的佐剂· 靶向巨噬细胞和DC上的凝集素的糖类佐剂短期应用的微球体或长期应用的纳米球体采用w/o乳剂 | 上调免疫反应。选择TH1或TH2。 提高中和抗体反应。更长的反应持续时间。蛋白的细胞溶胶加工产生正确的1类限制性肽 如果混杂的肽已知，简单处理有效使用佐剂和免疫原 如上。如果靶向是选择性的，也可以确定反应的类型效力单剂量疫苗的可能性 |
来源：Cox，J.C.，and Coulter，A.R.(1997).Vaccine 15，248-56.
根据本发明的疫苗组合物可以包含超过一种不同的佐剂。此外，本发明涵盖进一步包含任何佐剂物质的治疗组合物，所述佐剂物质包括任何上述的佐剂或其组合。还考虑的是，属于Bcl-2蛋白家族的蛋白或其肽片段和所述佐剂可以以任何适合的顺序单独地施用。
载体可以独立于佐剂存在。例如，载体的功能是提高具体是肽片段的分子量以提高它们的活性或免疫原性，赋予稳定性，提高生物学活性，或提高血清半衰期。此外，载体可以帮助向T细胞呈递属于Bcl-2家族的蛋白或其肽片段。所述载体可以是本领域技术人员已知的任何适合的载体，例如，蛋白或抗原呈递细胞。载体蛋白可以是但不限于钥孔血蓝素，血清蛋白，例如转铁蛋白、牛血清白蛋白、人血清白蛋白、甲状腺球蛋白或卵清蛋白，免疫球蛋白，或激素，例如胰岛素或棕榈酸。对于人类的免疫，载体必须是人类可接受的生理学可接受载体并且是安全的。然而，在本发明的一个实施方式中破伤风类毒素和/或白喉类毒素是适合的载体。做为选择，载体可以是葡聚糖，例如琼脂糖。
因此，本发明涵盖进一步包含佐剂物质的治疗组合物，所述佐剂物质包括任何上述的佐剂或其组合。还考虑的是，抗原，即本发明的肽和佐剂可以同时地或以任何适合的顺序分开地施用。
本发明的药物组合物中抗原的选择将取决于可由本领域技术人员测定的参数。如已经提及的，本发明的每种不同的肽由特定的HLA分子呈递在细胞表面。因而，如果根据HLA表型对待治疗的受试者进行了分型，选择已知与该具体HLA分子结合的肽。
做为选择，根据在给定群体中各种HLA表型的流行度选择目标抗原。举例来说，HLA-A2是白种人群体中最流行的表型，因此，含有结合HLA-A2的存活蛋白衍生的肽的组合物在该群体的大部分中是有活性的。然而，本发明组合物也可含有两种或多种存活蛋白衍生的肽的组合，每一种与不同的HLA分子特异性地相互作用以便覆盖目标群体的更大的部分。因而，作为实例，药物组合物可以含有受HLA-A分子限制的肽和受HLA-B分子限制的肽的组合，例如，包括相应于目标群体中的HLA表型流行度的HLA-A和HLA-B分子，例如，HLA-A2和HLA-B35。另外，组合物可以包括受HLA-C分子限制的肽。
本发明的有用免疫原性组合物，除在此定义的Bcl-2蛋白家族成员衍生的肽之外，可以包含免疫有效量的如在此定义的Bcl-2蛋白家族成员或其免疫原性片段。
根据具体的应用，在药物组合物中本发明的免疫原性肽的数量可以变化。然而，免疫原的单个剂量优选的在约10μg到约5000μg之间、更优选的约50μg到约2500μg之间，例如约100μg到约1000μg之间。施用的模式包括经皮内、皮下和静脉内的施用，以定时释放制剂形式植入，等等。在此涵盖了任何和所有的本领域已知的施用形式。还涵盖了适合于配置可注射的免疫原性肽组合物的、本领域已知的任何和所有的常规剂型，例如冻干的形式和溶液、悬浮液或乳剂形式，如果需要，其可含有常规的药学上可接受的载体、稀释剂、防腐剂、佐剂缓冲成分，等等。
可以使用本领域技术人员已知的任何常规方案制备和施用药物组合物。在实施例5中，给出了制备根据本发明的疫苗组合物的非限制性实例，以及作为疫苗施用的非限制性实例。需要理解的是，通过本领域的技术人员，这种方案可以容易地适用于在此描述的任何疫苗组合物。
在本发明的进一步的实施方式中，本发明的药物组合物对于治疗癌症患者是有用的，其中，在该患者的癌症发展中，癌细胞已经发展出对化疗活性抗癌药物和/或放疗的降低的敏感性。
本发明的药物组合物可有利地包含至少一种其它免疫原性蛋白或其肽片段，其选自不属于或不来源于Bcl-2蛋白家族的蛋白或肽片段，包括在细胞凋亡的调控的蛋白或由其衍生的肽片段。作为一个实例，这种蛋白或肽是以上定义的存活蛋白或其肽片段。在具体的实施方式中，进一步的免疫原性的存活蛋白衍生的肽是具有选自下组的序列的HLA-A2限制性的肽：FLKLDRERA(存活蛋白101-109)(SEQ ID NO：12)、TLPPAWQPFL(存活蛋白5-14)(SEQ ID NO：13)、ELTLGEFLKL(存活蛋白95-104)(SEQ ID NO：14)、LLLGEFLKL(SEQ ID NO：15)和LMLGEFLKL(SEQ ID NO：16)。(括号中的名称表示在如US 6.245.523中公开的存活蛋白中残基的位置。)LLLGEFLKL(SEQ ID NO：15)是通过用“L”取代肽的位置2上的“T”衍生自存活蛋白96-104的序列，LMLGEFLKL(SEQ ID NO：16)是通过用“M”取代位置2上的“T”而衍生自存活蛋白96-104的序列。在进一步的特定实施方式中，其它免疫原性存活蛋白衍生的肽是HLA-B35限制性的衍生自存活蛋白的肽，具有选自以下的序列：CPTENEPDL(存活蛋白46-54)(SEQ IDNO：17)、EPDLAQCFF(存活蛋白51-59)(SEQ ID NO：18)、CPTENEPDY(SEQID NO：19)和EPDLAQCFY(SEQ ID NO：20)。(括号中的名称表示在如US6.245.523中公开的存活蛋白中残基的位置。)CPTENEPDY(SEQ ID NO：19)是通过用“Y”取代肽的C-末端中的“L”而衍生自存活蛋白46-54的序列，EPDLAQCFY(SEQ ID NO：20)是通过用“Y”取代C-末端2上的“F”而衍生自存活蛋白51-59的序列。
在又进一步的实施方式中，另外的肽是HLA-A1限制性的肽，具有选自下组的序列：存活蛋白38-46(Sur38Y9)(在P9处C变成Y，MAEAGFIHY)(SEQ ID NO：21)、存活蛋白47-56(Sur47Y10)(在P10处Q变成Y，PTENEPDLAY(SEQ ID NO：22))、存活蛋白92-101(Sur92-101)(QFEELTLGEF)(SEQ ID N.：23)，和存活蛋白93-101(Sur93T2(在P2处E变成T，FTELTLGEF(SEQ ID NO：24))。本发明的肽也可以是HLA-A3限制性的肽，例如存活蛋白18-24(Sur18K10)(在P10处F变成K，RISTFKNWPK(SEQ ID NO：25)，和/或HLA-A11限制性的肽，例如存活蛋白53-62(Sur53-62)(DLAQCFFCFK)(SEQ ID NO：26)，和/或HLA-A2限制性的肽，例如存活蛋白18-28(Sur18-28)(RISTFKNWPFL)(SEQ ID NO：27)。
然而，在本发明的一个优选的实施方式中，疫苗组合物不包含存活蛋白或其片段。
其他有用的肽包括已知的细胞凋亡抑制物多肽ML-IAP，其表达的选择性更高，并且在黑素瘤中检出。因而，能够引发特异性T细胞反应，即细胞毒T细胞反应或辅助细胞T细胞反应的ML-IAP的片段，可以任选地包括在本发明的组合物中。ML-IAP的有用的肽片段包括在专利申请WO2004/089980中描述的任何ML-IAP片段，通过完全引用将其合并在此，优选的包括ML-IAP245(RLQEERTCKV)(SEQ ID NO：28)、ML-IAP280 (QLCPICRAPV)(SEQ ID NO：29)、ML-IAP90(RLASFYDWPL)(SEQ IDNO：30)、ML-IAP154(LLRSKGRDFV)(SEQ ID NO：31)、ML-IAP230 (VLEPPGARDV)(SEQ ID NO：32)、ML-IAP98(PLTAEVPPEL)(SEQ IDNO：33)、ML-IAP34(SLGSPVLGL)(SEQ ID NO：34)、ML-IAP54 (QILGQLRPL)(SEQ ID NO：35)、ML-IAP99(LTAEVPPEL)(SEQ IDNO：36)、ML-IAP83(GMGSEELRL)(SEQ ID NO：37)和ML-IAP200 (ELPTPRREV)(SEQ ID NO：38)。
其他有用的进一步的肽包括TRAG-3和其肽片段。TRAG-3以至少两种可选剪接的形式存在，所有TRAG-3剪接形式的肽作为进一步的肽是有用的。具体地，任何TRAG-3剪接形式的片段都可以任选地包括在本发明的组合物中，其中所述片段能够引发特异性T细胞反应，即，细胞毒T细胞反应或辅助T细胞反应。
另外，根据本发明的组合物可以作为包含如上定义的I类限制性表位和II类限制性表位的多表位疫苗来提供。
本发明的组合物的免疫保护效果可以使用几种方法，例如，在WO97/28816同上中描述的方法来测定。也可以通过免疫后DTH反应的发生和/或检测特异性识别疫苗组合物的肽的抗体来测定成功的免疫反应。
在优选的实施方式中，本发明的药物组合物是疫苗组合物。因而，药物组合物可以是能够引发针对癌症疾病的免疫反应的免疫原性组合物或疫苗。如在此使用的，术语“免疫原性组合物或疫苗”是指引发针对癌细胞的至少一种免疫反应的组合物。因而，这种免疫反应可以是任何上述的类型：CTL反应，其中产生能够识别细胞表面上呈递的HLA/肽复合体的CTL，从而引起细胞裂解，即，疫苗在接种的受试者中引发了具有针对癌细胞的 细胞毒效应的效应T细胞的产生；引起抗癌抗体产生的B细胞反应；和/或免疫反应的DTH型。
在有用的实施方式中，通过施用本发明的肽来引发针对癌症疾病的免疫原性反应，所述施用通过将MHC I类分子加载到来自患者的抗原呈递细胞(APC)上，通过从患者分离PBL并在将所述细胞注射回患者之前将细胞和肽进行保温，或通过从患者分离前体APC并在将所述细胞注射回患者之前用细胞因子和抗原使细胞分化成专业的APC来进行。
因而本发明的一个方面是提供包含属于Bcl-2蛋白家族的蛋白或其肽片段或编码所述蛋白或所述肽片段的核酸的抗原呈递细胞。抗原呈递细胞可以是能将抗原呈递给T细胞的任何细胞。优选的抗原呈递细胞是树突细胞。根据任何适合的方案，例如如下所描述的，可以制备树突细胞(DC)并用于治疗过程中。要理解的是，本领域的技术人员可以修改所述方案用于具有不同HLA类型和不同疾病的患者。
用50μg/ml HLA限制性肽(以GMP品质合成)在37℃对树突细胞(DC)脉冲1h。在第1和14天经皮下施用所述肽和5×106个细胞，随后每4周施用一次，在5次疫苗接种后进行白细胞除去法(leukapheresis)。用于临床用途的DC的产生和质量控制可以基本上按参考文献5中描述的进行。
因而，在本发明的一个实施方式中，治疗癌症患者的方法是这样一种方法，其中通过在体外将肽呈递给患者的抗原呈递细胞(APC)然后将如此处理的APC注射回患者，来施用所述肽。存在至少两种可选择的方法来进行。一种选择是从癌症患者分离APC，保温(加载)MHC I类分子和肽。加载MHC I类分子是指保温APC和肽，使得具有特异于所述肽的MHC I类分子的APC与所述肽结合，从而能够将它呈递给T细胞。随后，将APC注射回患者。另一种选择性方法依靠树突细胞生物学领域取得的新近的发现。在这种情况中，从患者分离单核细胞(为树突细胞前体)，通过使用细胞因子和抗原使单核细胞在体外分化成专业APC(或树突细胞)。随后，将体外产生的DC用肽脉冲，并注射到患者中。
由于Bcl-2蛋白家族的成员在广泛的癌症形式中表达，很可能可以提供本发明的疫苗来控制表达这种蛋白的任何类型的癌症疾病。例如，本发明的疫苗组合物针对造血恶性疾病，包括慢性的淋巴细胞性白血病和慢性髓 细胞性白血病、黑素瘤、乳腺癌、宫颈癌、卵巢癌、肺癌、结肠癌、胰腺癌和前列腺癌是有免疫活性的。
根据以上说明，技术人员将容易地认识到，本发明的蛋白和/或肽作为癌症诊断工具是有用的。因此，本发明的肽提供了开发针对癌症疾病的广泛适用的诊断和预测方法的基础。因而，在另一个有用的实施方式中，本发明的组合物是用于在癌症患者中体外或原位诊断癌症存在的组合物，例如，基于在PBL或肿瘤组织中对Bcl-2蛋白家族成员反应性T细胞的检测。
因此，在更进一步的方面，提供了诊断试剂盒，用于体外或原位诊断癌症患者中Bcl-2家族成员反应性T细胞在包含本发明的一种或多种多肽的PBL或肿瘤组织中的存在，提供了在癌症患者中诊断这种反应性T细胞的存在的方法，该方法包括使肿瘤组织或血液样品接触本发明的肽与I类HLA分子或这种分子的片段的复合体，并检测所述复合体与所述组织或血液细胞的结合。
另一种有用的诊断或预测方法是基于异源动物物种中抗体的产生，所述抗体例如，针对本发明的人类Bcl-2蛋白家族成员衍生的肽的鼠抗体，然后其可被用于，例如，诊断呈现所述肽的癌细胞的存在。对于这种免疫目的，肽的量可以少于在体内治疗，例如以上所述的体内治疗的过程中使用的量。一般地，优选的剂量可以是从约1μg到约750μg的肽。还可能的是基于用本发明的肽进行免疫来产生单克隆抗体。因此，本发明还涉及一种分子，特别是单克隆或多克隆抗体，包括其片段，其能够特异性结合本发明的肽，以及能阻断这种结合的分子，例如，相对于针对本发明的肽的单克隆或多克隆抗体而产生的抗体。本发明进一步涉及能够特异性结合本发明的肽或蛋白的分离的T细胞受体以及编码它们的分离的核酸。例如，这种T细胞受体可以使用技术人员公知的标准技术从蛋白或肽特异性T细胞克隆。
在本发明的一个方面还涉及分离的T细胞，其包含能特异性结合在此描述的属于Bcl-2家族的蛋白和/或其肽片段的T细胞受体。所述分离的T细胞优选的是已经在体外扩展了的T细胞。体外扩展T细胞的方法是技术人员公知的。这种T细胞在通过适应性转移或自体细转移来治疗癌症方面是特别有用的。因而，本发明还涉及治疗方法，包括向个体，例如患有癌症的人类施用T细胞，所述T细胞包含能特异性结合属于Bcl-2家族的蛋白 或其肽片段的T细胞受体。本发明还涉及T细胞用于制备治疗癌症的药物的用途，所述T细胞包含能特异性结合属于Bcl-2家族的蛋白或其肽片段的T细胞受体。可以基本上按参考文献7描述的进行自体细胞转移。
在一个方面，本发明提供了本发明的肽与I类HLA分子或这种分子的片段的复合体，其作为例如以上描述的诊断剂是有用的。这种复合体可以是单体的或多聚体的形式。
本发明提供了减轻或治愈癌症疾病的方法。因此，本发明的进一步的方面提供了治疗与Bcl-2蛋白家族成员的表达有关的癌症疾病的方法，所述疾病的实例包括：造血恶性疾病包括慢性淋巴细胞增多症和慢性髓细胞性白血病，黑素瘤，乳腺癌，宫颈癌，卵巢癌，肺癌，结肠癌，胰腺癌，和前列腺癌，该方法包括向患有所述疾病的患者施用有效量的根据本发明的组合物、能特异性结合本发明的肽的分子和/或能阻断这种分子的结合的分子。
在某些情况下，将本发明的治疗方法与常规的癌症治疗组合是适当的，例如化疗、放疗、用免疫刺激物质的治疗、基因治疗、用抗体的治疗和使用树突细胞的治疗。由于在肿瘤细胞中Bcl-2蛋白家族成员的表达升高与抗药性有关，将本发明公开的基于Bcl-2的免疫疗法与细胞毒化疗组合可能是治疗癌症的有效手段。
在本发明的一个方面涉及监视免疫的方法，所述方法包括步骤：
i)提供来自个体的血液样品
ii)提供属于Bcl-2蛋白家族的蛋白或其肽片段，其中所述蛋白或肽可以是在此描述的任何蛋白或肽
iii)确定所述血液样品是否包含抗体或T细胞，所述T细胞包含特异性结合所述蛋白或肽的T细胞受体
iv)从而确定在所述个体中是否产生了针对所述蛋白或肽的免疫反应。
所述个体优选是人类，例如，已经用属于Bcl-2蛋白家族的蛋白或其肽片段或编码所述蛋白或肽的核酸免疫了的人类。
现在将通过以下非限制性的实例和图说明本发明，其中：
图1显示了来自Bcl-2的HLA-A2结合肽的鉴定。使用Phosphorimager对I类MHC重链条带定量。稳定的HLA-A2重链的数量与添加的肽的结合亲合力直接相关。HLA-A2限制性阳性对照肽HIV Pol476(黑色方块)的结 合与肽Bcl172(黑色三角形)、Bcl180(黑色圆圈)和Bcl200(白色圆圈)和进行比较。
图2说明了针对肽Bcl172、Bcl180、Bcl208和Bcl214的T细胞反应。分析了来自15位乳腺癌患者的PBL。在有或没有肽时以105细胞每孔一式三份铺板之前，用肽刺激T淋巴细胞一次。使用ImmunoSpotSeries 2.0 Analyzer(CTL Analyzers，LLC，Cleveland，US)对每个患者计算肽特异性印迹(减去没有添加的肽的印迹之后)的平均数量。
图3说明了由INF-γ ELISPOT测量的针对Bcl-2的T细胞反应。分析了来自十位HLA-A2阳性CLL患者、三位HLA-A2阳性AML患者和两位胰腺癌患者(PC)的PBL。检测肽Bcl208(A)和Bcl214(B)。在有或没有肽的情况下，以105细胞每孔一式三份铺板之前，用肽刺激T淋巴细胞一次。使用ImmunoSpotSeries 2.0 Analyzer(CTL Analyzers，LLC，Cleveland，US)对每个患者计算肽特异性印迹(减去没有添加的肽的印迹之后)的平均数量。应答者(定义为抗原特异性印迹的平均数±
标准误差＞25每105个淋巴细胞)标记为黑色方块，而非应答个体标记为白色方块。
图4说明了通过granzyme B ELISPOT检测Bcl-2特异性CTL。在有或没有肽Bcl208(A)或者Bcl214(B)的情况下，以105细胞每孔一式三份铺板前，用肽刺激来自四位不同的晚期乳腺癌患者(b19、b20、b22、b16)的和健康对照(h1)的T淋巴细胞一次。使用ImmunoSpo(Series 2.0 Analyzer(CTL Analyzers，LLC，Cleveland，US)对每个患者计算肽特异性Granzyme B印迹(减去没有添加的肽的印迹之后)的平均数量。应答者(定义为抗原特异性印迹的平均数±
标准误差＞25每105个淋巴细胞)标记为黑色方块，而非应答个体标记为白色方块。
图5说明了Bcl-2特异性CTL的细胞溶解能力。使用HLA-A2/bcl208包被的磁珠从来自乳腺癌患者的PBL分离bcl208反应性CTL。A)分析分离的批量培养物对有(黑色方块)或没有(白色方块)bcl208肽的T2细胞的特异性裂解。B)被bcl208分离的T细胞裂解的HLA-A2阳性乳腺癌细胞系MDA-MB-231(黑色圆圈)和HLA-A2阴性乳腺癌细胞系ZR75-1(白色圆圈)。
图6说明了由INF-γ ELISPOT测定的针对Bcl-XL的HLA-A2限制性T细胞反应。分析了来自十二位健康个体、十八位患有乳腺癌的患者(BC患 者)、六位黑素瘤患者和两位胰腺癌患者(PC患者)的PBL。所有的个体都是HLA-A2阳性。检查了肽Bcl-XL173-182(YLNDHLEPWI)(SEQ ID NO：48)(A)、Bcl-XL141-150(VAFFSFGGAL)(SEQ ID NO：49)(B)、Bcl-XL161-170 (VLVSRIAAWM)(SEQ ID NO：48)(C)和Bcl-XL165-174(RIAAWMATYL)(SEQ ID NO：45)(D)。在有或没有相关肽的情况下，以105细胞每孔一式三份铺板之前，用肽刺激T淋巴细胞一次。使用ImmunoSpot
Series 2.0Analyzer(CTL Analyzers，LLC，Cleveland，US)对每个患者计算肽特异性印迹(减去没有添加的肽的印迹之后)的平均数量。应答者(定义为抗原特异性印迹的平均数±
标准误差＞25每105个淋巴细胞)标记为黑色方块，而非应答个体标记为白色方块。
图7说明了通过granzyme B ELISPOT检测Bcl-XL特异性CTL。在有或没有肽Bcl-XL173-182(YLNDHLEPWI)时以3×105细胞每孔一式三份铺板之前，用肽刺激来自三位不同乳腺癌患者的T淋巴细胞(BC35、BC36和BC17)一次。使用ImmunoSpotSeries 2.0 Analyzer(CTL Analyzers，LLC，Cleveland，US)对每个患者计算肽特异性Granzyme B印迹(减去没有添加的肽的印迹之后)的平均数量。应答者(定义为抗原特异性印迹的平均数±
标准误差＞25每105个淋巴细胞)标记为黑色方块，而非应答个体标记为白色方块。
图8说明了对来自乳腺癌患者的PBL中CD8阳性细胞的Bcl-XL特异性的分析。在体外用Bcl-XL173-182刺激来自患者BC36的PBL一次，进行分析前分离CD8+细胞。使用抗CD8抗体和HLA-A2/Bcl-XL173-182的五聚体复合体对培养物进行FACS染色表明，95.5％的细胞是CD8阳性的，这些中的0.24％是五聚物阳性的(A)。HLA-A2/HIV五聚物用作阴性对照(B)。通过ELISPOT的方法对细胞培养物进行另外的分析(C)。
图9说明了由INF-γ ELISPOT测量的针对Bcl-XL的HLA-A2限制性T细胞反应。分析了来自十二位健康个体、十八位患有乳腺癌的患者(BC患者)、六位黑素瘤患者和两位胰腺癌患者(PC患者)的PBL。所有的个体都是HLA-A2阳性。检查了肽Bcl-XL118-126(TAYQSFEQV)(SEQ ID NO：43)(A)和Bcl-XL169-178(WMATYLNDHL)(SEQ ID NO：46)(B)。在有或没有相关肽时以105细胞每孔一式三份铺板之前，用肽刺激T淋巴细胞一次。使用ImmunoSpotSeries 2.0 Analyzer(CTL Analyzers，LLC，Cleveland，US)对每个患者计算肽特异性印迹(减去没有添加的肽的印迹之后)的平均数 量。应答者(定义为抗原特异性印迹的平均数±
标准误差＞25每105个淋巴细胞)标记为黑色方块，而非应答个体标记为白色方块。
图10说明了由INF-γ ELISPOT测量的针对Bcl-XL的HLA-A3限制性T细胞反应。在有或没有肽Bcl-XL165-173(RIAAWMATY)(SEQ ID NO：50)的情况下，以105细胞每孔一式三份铺板之前，用肽刺激T淋巴细胞一次。检查了来自七位健康个体、五位患有乳腺癌的患者、四位黑素瘤患者、两位胰腺癌患者和五位患有多发性骨髓瘤的患者的PBL。所有的个体都是HLA-A3阳性。使用ImmunoSpotSeries 2.0 Analyzer(CTL Analyzers，LLC，Cleveland，US)对每个患者计算肽特异性印迹(减去没有添加的肽的印迹之后)的平均数量。
图11说明了由INF-γ ELISPOT测量的针对Mcl-1的HLA-A3限制性T细胞反应。在有或没有肽时以3×105细胞每孔一式三份铺板之前，用肽刺激T淋巴细胞一次。相对于Mcl-195-103肽(左)和Mcl-1300-308肽(右)检查了来自十位健康个体、六位患有乳腺癌的患者(BC)、两位胰腺癌(PC)患者和六位患有CLL的患者的PBL。所有的个体都是HLA-A3阳性。使用ImmunoSpot
Series 2.0 Analyzer(CTL Analyzers，LLC，Cleveland，US)对每个患者计算肽特异性印迹(减去没有添加的肽的印迹之后)的平均数量。应答者(定义为抗原特异性印迹的平均数±标准误差＞25每105个淋巴细胞)标记为黑色方块，而非应答个体标记为白色方块。
图12说明了由INF-γELISPOT测量的针对Mcl-1的HLA-A1限制性T细胞反应。在有或没有肽Mcl-1166-175或Mcl-1177-185时以3×105细胞每孔一式三份铺板之前，用肽刺激T淋巴细胞一次。相对于Mcl-195-103肽(左)和Mcl-1300-308肽(右)检查了来自六位健康个体、四位患有乳腺癌的患者(BC)和七位黑素瘤患者的PBL。所有的个体都是HLA-A1阳性。使用ImmunoSpot
Series 2.0 Analyzer(CTL Analyzers，LLC，Cleveland，US)对每个患者计算肽特异性印迹(减去没有添加的肽的印迹之后)的平均数量。应答者(定义为抗原特异性印迹的平均数±标准误差＞25每105个淋巴细胞)标记为黑色方块，而非应答个体标记为白色方块。
实施例
实施例1
在乳腺癌患者中针对Bcl-2的免疫反应
材料和方法
1.患者
从乳腺癌患者采集外周血淋巴细胞(PBL)。使用Lymphoprep分离来分离PBL，进行HLA分型(Department of Clinical Immunology，UniversityHospital，Copenhagen，Denmark)并在含10％DMSO的FCS中冷冻。在对血液采样之前所有患者都没有接受免疫疗法。
2.与MHC I类分子结合的肽的装配分析
如早先描述的，在装配分析中，测定合成的肽(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)与用[35S]-甲硫氨酸代谢性标记的HLA-A2分子的结合亲合性。该分析是基于在细胞裂解时从TAP缺陷细胞系T2释放的空HLA分子的肽介导的稳定性。使用HLA I类特异性的、构象依赖性的mAb W6/32对稳定折叠的HLA分子进行免疫沉淀，并通过等电点聚焦(IEF)凝胶电泳分离。使用ImageGauge Phosphorimager程序(FUJI photo film Co.，Carrollton，TX，USA)对MHC重链条带进行定量。条带的强度与分析期间回收的肽结合的I类MHC复合体的量直接相关。随后，HLA-A2的稳定性程度与添加的肽的结合亲合性直接相关。在存在50、5、0.5、0.05μM相关肽的情况下测量HLA-A2的回收。作为足以半最大化稳定性的肽浓度，为每个肽计算C50值。
3.PBL的抗原刺激
为了扩展ELISPOT分析的敏感性，在分析之前体外刺激PBL一次。在第0天，解冻PBL或压碎的淋巴结，并以2×106细胞的浓度以2ml/孔铺板于24孔平板(Nunc，Denmark)中，所述板10μM肽的X-vivo培养基(BioWhittaker，Walkersville，Maryland)、5％热钝化人类血清和2mM L-谷氨酰胺中。两天后，向培养物添加20IU/ml的重组白细胞介素-2(IL-2)(Chiron，Ratingen，Germany)。在第12天在ELISPOT中检测培养的细胞的反应性。
4.ELISPOT分析
如早先描述的(4)，ELISPOT被用于定量释放肽表位特异性干扰素-γ的效应细胞。简言之，用抗IFN-γ抗体(1-D1K，Mabtech，Nacka，Sweden)包被底部是硝化纤维的96孔板(MultiScreen MAIP N45，Millipore，Hedehusene，Denmark)。洗涤加样孔，用X-vivo培养基封闭，以不同的细胞浓度一式双份地添加细胞。然后向每个加样孔中添加肽，将平板保温过夜。在接下来的一天，丢弃培养基，在添加生物素化的次级抗体(7-B6-1-Biotin，Mabtech)之前洗涤加样孔。将平板保温2小时，洗涤，向每个加样孔添加生物素-酶结合物(AP-Avidin，Calbiochem，Life Technologies)。在RT将平板保温1小时，向每个加样孔添加酶底物NBT/BCIP(Gibco，Life Technologies)并在RT保温5-10分钟。在出现暗紫色印迹时用自来水洗涤来终止反应。使用immunospot
Series 2.0 Analyzer(CTL Analyzers，LLC，Cleveland，US)对印迹进行计数，根据印迹形成细胞数量可以计算肽特异性CTL的频率。对每种肽抗原所有的分析进行一式三份。
5.结果
Rcl-2衍生的肽与HLA-A2的结合
使用主要HLA-A2特异性锚残基(2)，在Bcl-2蛋白的氨基酸序列中筛选最可能的HLA-A2九肽和十肽表位。合成了十三种Bcl-2衍生的肽，通过装配分析与来自HIV-1 pol476-484(ILKEPVHGV)(SEQ ID NO：39)的HLA-A2高亲合性阳性对照表位进行比较，检查与HLA-A2的结合。装配分析是基于向TAP缺陷细胞系T2加载不同浓度的肽后I类分子的稳定性。随后使用构象依赖性抗体对正确折叠的稳定MHC重链进行免疫沉淀。如图1所例示的，I类MHC分子的稳定程度与添加的肽的结合亲合性直接相关。对于HIV-1 pol476-484，I类MHC分子的半最大回收所需的肽浓度(C50值)是0.7μM(表1)。八种Bcl-2衍生肽以与阳性对照几乎相似高的亲合性结合；Bcl224、Bc185、Bcl222、Bcl218、Bcl220、Bcl214、Bcl124和Bcl172(分别地，C50＝0.7、1、1、2、1、3、1和2μM)(表1)。肽Bcl80、Bcl208和Bcl180仅以中间的或弱的亲合性结合(分别为，C50＝36、7和20μM)。所检测的两种肽 (Bcl216、Bcl200)根本不与HLA-A2结合。包括在这项研究种的肽的列表在表1中示出。
表1.在这项研究中检测的肽
| 蛋白a | 序列 | SEQ ID NO | C50(μM)b |
| HIV-1 pol476 | ILKEPVHGV | 39 | 0.7 |
| Bcl224 Bcl85 bcl222 bcl218 bcl220 bcl214 bcl80 bcl216 bcl208 bcl124 bcl180 bcl172 bcl200 | A L V G A C I T L A L S P V P P V V S L A L V G A C I K T L L S L A L V L L S L A L V G A W L S L K T L L S L A A A G P A L S P V S L K T L L S L A L P L F D F S W L S L F T A R G R F A T V Y L N R H L H T W I N I A L W M T E Y L E L Y G P S M R P L | 1 2 3 4 5 6 7 40 8 9 10 11 41 | 0.7 1 1 2 1 3 36 不结合 7 1 15 2 不结合 |
a以下标列出的数值范围表示序列中第一个氨基酸的位置
b C50值是与HLA-A2的半最大结合所需的肽的浓度。
在经化疗治疗的乳腺癌患者中针对Bcl-2衍生的肽的CTL反应
利用ELISPOT IFN-γ分泌分析，我们检查了来自乳腺癌患者的外周血T细胞中针对Bcl-2衍生的肽的特异性T细胞反应的存在。当在癌症患者中鉴定肿瘤特异性CTL时，这种方法早先是高度有效的。
在ELISPOT中进行检查之前，对来自15位HLA-A2阳性乳腺癌患者的PBL进行一次体外刺激。如所述的(4)，选择这种方法来扩展ELISPOT的敏感性。由于许多描述的CTL表位实际上是低亲合性的肽，在第一个系列的实验中我们包括了所有十三种Bcl-2导出的肽。检测了针对Bcl172、Bcl180、Bcl208和Bcl214的反应，在图2中仅给出了来自这些肽的数据。检测来自八位患者的PBL中针对Bcl172自发的CTL反应(50％)，和四位患者中 针对Bcl180自发的CTL反应(≈25％)(图2)。然而，相对于Bcl208和Bcl214 检测到了最常见的反应，因为十二位(≈80％)患者具有(host)相对Bcl208 的可检测的CTL反应，十一位患者(≈75％)具有Bcl214反应(图2)。
实施例2
在癌症患者中Bcl-2的免疫原性
概要
在此，我们描述了在来自患有不相关的肿瘤类型，即，胰腺癌、AML和CLL的患者的外周血中，相对Bcl-2的自发T细胞反应性。另外，我们显示了，这些Bcl-2反应性T细胞实际上是肽特异性细胞毒效应细胞。因而，Bcl-2可以充当用于抗癌免疫治疗策略，例如，在与常规的放疗和化疗的组合中的重要的和广泛适用的靶点。
引言
Bcl-2家族包含细胞凋亡的调控中几种关键的参与者，包括促细胞凋亡分子和抗细胞凋亡分子。Bcl-2是促进癌症的发病和发展的关键细胞因素。在本研究中，我们检查了在癌症患者中Bcl-2的天然的细胞免疫原性。
方法
患者
使用Lymphoprep分离来分离PBL，进行HLA分型(Department ofClinical Immunology，University Hospital，Copenhagen，Denmark)并在含10％DMSO的FCS中冷冻。在对血液采样之前所有患者都没有接受免疫疗法。在进行任何这些测量之前，从患者处得到了知情同意书。
从十三位HLA-A2阳性乳腺癌患者采集外周血淋巴细胞(PBL)，所述患者表现出具有定义IV期疾病的远处转移的进行性疾病；大多数患者具有超过一个肿瘤位置(8/13患者)。在先的治疗包括化疗、内分泌治疗和放射疗法。八位患者先用化疗进行治疗，而五位患者仅接受了内分泌治疗并且在研究之前没有接受化疗。此外，包括了具有可手术的局部化乳腺癌的十 二位HLA-A2阳性患者，在初次手术和化疗之前采集了血液样品。另外，从两位HLA-A2阳性胰腺癌患者采集PBL，所述患者表现出具有定义IV期疾病的远处转移的进行性疾病。最后，在治疗前采集来自十位HLA-A2新近诊断的CLL患者和三位AML的PBL。来自十二位HLA-A2阳性健康个体的PBL充当对照。
Granzyme B ELISPOT
如所描述的，Granzyme B(GrB)ELISPOT分析被用于测量抗原特异性CTL细胞毒性。简要地，用GrB俘获抗体(BD Biosciences，Brondby，Denmark)包被底部是硝化纤维的96孔板(MultiScreen MAIP N45，Millipore)。洗涤加样孔，通过有5％人类血清的X-vivo培养基封闭。以不同的细胞浓度添加细胞。然后将T2细胞和肽添加到每个加样孔，将平板保温4小时，丢弃培养基，在添加GrB检测抗体(BD Biosciences)之前洗涤平板。将平板保温2小时，洗涤，向每个加样孔添加抗生物素蛋白辣根过氧化酶(BDBiosciences)。在RT将平板保温1小时，向每个加样孔添加AEC底物试剂(BD Biosciences)并在RT保温5-10分钟。在出现红色印迹时用自来水洗涤来终止反应。对印迹计数，象对IFN-γ ELISPOT一样计算肽特异性CTL频率。对每种肽抗原所有的分析以一式两份或一式三份进行。
肽特异性T细胞的分离
通过早先描述的Bcl208/HLA-A2包被的磁珠的方法分离抗原特异性细胞。通过在室温将2.5μg单体与5×106个珠子在40μl PBS中保温20分钟，将生物素化的单体(ProImmune，Oxford，UK)与链霉抗生物素包被的磁珠(Dynabeads M-280，Dynal A/S，Oslo，Norway)偶联。在磁场中(Dynal A/S，Oslo，Norway)在PBS中将磁性复合体洗涤三次，随后与PBL以1∶10的比例在含5％BSA的PBS中混合，非常轻柔地旋转1h。将与磁性复合体结合的抗原特异性CD8+T细胞轻轻地洗涤三次。将分离的细胞在含5％HS的X-vivo中重悬浮多次，在释放磁珠并从细胞悬液移除之前保温2小时。分离的细胞培养在48孔板中，其中有X-vivo，5％HS和106个基于人工细胞的抗原呈递细胞(K32/41BBL)(由Dr.Carl H.June，Department of Pathologyand Laboratory Medicine，University of Pennsylvania馈赠)，所述细胞表达 4-1BB配体(4-1BBL)表达并由抗CD28、抗CD3包被。在分离后一天，添加20单位/ml IL-2，在第5天在标准51Cr释放分析中检测这些细胞杀伤靶细胞的能力。
通过限制稀释来进行克隆
在96孔板中，使用经照射的PBMC作为饲养细胞(feeder cell)，在存在40IU/ml IL-2和1μg/ml PHA的情况下，于含5％HS的X-vivo中，通过限制稀释从分离的培养物建立CTL克隆。每3-4天向克隆中添加新鲜培养基和IL-2。
细胞毒性分析
如在其它部分所述对CTL介导的细胞毒性进行常规[51Cr]-释放分析。靶细胞是有或没有相关肽的T2细胞、HLA-A2阳性乳腺癌细胞系MDA-MB-231，和HLA-A2阴性乳腺癌细胞系ZR75-1。如逆转录PCR分析所检测的，两个乳腺癌细胞系都表达Bcl-2(数据未显示)。
结果
针对Bcl-2衍生的肽的CTL反应
为了检测Bcl-2特异性T细胞是否也存在于来自白血病患者的PBL中，我们检测了来自十位HLA-A2阳性CLL患者和三位AML患者的PBL针对两种肽bcl208和bcl214的反应性。Bcl-2反应存在于五位CLL患者和两位AML患者中(图3)。此外，我们检查了来自两例胰腺癌的PBL，并确定了两位患者都具有针对bcl208和bcl214肽的CTL反应性(图3)。类似地，检测了来自12位健康HLA-A2阳性个体的PBL。令人惊讶地，在健康个体的一位中检测到针对bcl208肽的弱CTL反应(数据未显示)。
PBL中Bcl-2特异性Granzyme B的释放
利用GrB ELISPOT，我们评定了在PBL中检测出的bcl-2特异性T细胞是否显示细胞毒功能。因而，分析了来自三位bcl-2反应性乳腺癌患者(pt.no.：19、20和22)的PBL针对两种表位bcl208和bcl214的反应性(图4)。在所有三位患者中，可以以每105个PBL约50-140个肽特异性CTL的 频率检测到针对两种肽的反应。作为对照，我们收入了一位患者(pt.no.：16)和健康对照(h1)，在所述患者中我们仅能在INF-γELISPOT中检测到针对bcl172的反应，而没有针对bcl208和bcl214的反应。正如所料，在乳腺癌患者no.16中和健康对照中都没有检测到针对bcl208或bcl214的GrB释放。
Bcl-2反应性CTL的功能能力
为了进一步表征Bcl-2反应性CTL的功能能力，如所述通过用HLA-A2/bcl208复合体包被的磁珠的手段富集这些细胞。在分离之前，在体外用肽刺激细胞一次。通过限制稀释克隆分离的细胞的一小部分。在GrBELISPOT中检测扩增的培养物对没有肽或经bcl208脉冲的T2细胞的识别。这些克隆的一些显示了对bcl208脉冲的T2细胞的特异性识别(数据未显示)。然而，遗憾的是，我们没能扩增这些克隆用于进一步的分析。
在分离后一天，将IL-2添加给余下的细胞，在第5天在标准51Cr释放分析中测试这些细胞杀伤加载了肽的T2细胞的能力。由此，未加载的T2细胞或用bcl208肽加载的T2细胞可作为靶点。这个分析表明，仅用bcl208 脉冲的T细胞被杀死(图5a)。将这些富集的和体外刺激的bcl208反应性T细胞进一步用于检测杀伤HLA-A2阳性、表达Bcl-2的乳腺癌细胞系MDA-MB-231的能力。富集的T细胞有效地裂解MDA-MB-231细胞，而相反的，对于表达Bcl-2且HLA-A2阴性的乳腺癌细胞系ZR75-1没有观察到细胞毒性(图5b)。
实施例3
在癌症患者中Bcl-X(L)的免疫原性
概要
在此，我们证明了在癌症患者中Bcl-XL是T细胞识别的靶点。由此，通过ELISPOT和流式细胞计数染色，我们描述了针对来源于Bcl-XL的肽表位的自发性HLA-A2和HLA-A3限制性细胞毒T细胞反应。由此，针对如Bcl-2家族蛋白的细胞凋亡抑制物的细胞免疫反应看来代表了癌症中的普遍现象，因此，这组蛋白是用于抗癌免疫疗法的有吸引力的通用靶蛋白。另外，由于在细胞中这些蛋白的表达升高与抗药性有关，免疫疗法与细胞毒性化疗的组合是治疗癌症的非常有吸引力的途径。
引言
抗细胞凋亡蛋白是从bcl-x基因的长可选剪接形式产生的，而促细胞凋亡的Bcl-XS来自相同基因的短可选剪接形式。Bcl-XL在癌症中起到重要作用，因为它与对常规治疗形式的抗性和不良预后直接相关。对Bcl-XL的功能性抑制恢复了细胞凋亡过程，并使得赘生性细胞对化疗和放疗敏感，而多种癌细胞系表达高水平的Bcl-XL引起了多药物抗性的表型。已经报道了在各种不同的恶性肿瘤，包括AML和多发性骨髓瘤，以及实体癌症象膀胱癌、乳腺癌、胰腺癌和黑素瘤中Bcl-XL的表达升高。
免疫疗法的理想靶点是在正常组织中沉默、在癌细胞中过量表达并直接参与肿瘤细胞存活和发展的基因产物。
材料和方法
患者
从患有不同起源的癌症的患者和健康对照收集外周血淋巴细胞(PBL)，使用Lymphoprep分离来分离，进行HLA分型(Department of ClinicalImmunology，University Hospital，Copenhagen，Denmark)在含10％DMSO的FCS中冷冻。在对血液采样之前所有患者都没有接受免疫疗法。在进行任何这些测定之前，从患者处得到了知情同意书。
流式细胞计数(FACS)
使用相关肽在体外刺激来自乳腺癌患者的PBL一次，在第七天使用Dynal CD8阴性分离试剂盒(Dynal Biotech ASA，Oslo，Norway)从PBL分离CD8+细胞。用PE偶联Pro5TM MHC五聚物(ProImmune，Oxford，UK)对产生的CD8阳性T细胞培养物进行染色，随后用偶联了荧光染料的mAbs：CD8-APC和CD3-FITC(Becton Dickinson，Immunocytometry Systems，San Jose，CA)进行抗体染色。两次染色都在4℃、暗处在PBS+2％FCS中进行30min。使用的Pro5TM MHC五聚物复合体是：HLA-A2/Bcl-XL173-182 (YLNDHLEPWI)(SEQ ID NO：42)和HLA-A2/HIV-1 pol476-484 (ILKEPVHGV)(SEQ ID NO：39)。使用DIVA软件(BD，San Jose，CA)在BD FACS aria上分析样品。
结果
针对Bcl-XL衍生的肽的自发性CTL反应
bcl-x基因通过可选剪接转录成两种mRNA。抗细胞凋亡蛋白是从长的可选剪接形式产生的，而促细胞凋亡Bcl-XS来自这个基因的短的可选剪接形式。较大的Bcl-XL的蛋白产物与Bcl-XS蛋白的不同在于插入的区域(氨基酸126-188)。由此，为了研究在癌症患者中Bcl-XL是否是T细胞的天然靶点，我们利用主要HLA-A2特异性锚残基仔细检测了这个插入的区域(包括每个末端的九个氨基酸)的推定的HLA-A2表位。随后，我们合成了七种由Bcl-XL得出的肽(Bcl-XL158-166(EMQVLVSRI)(SEQ ID NO：44)、Bcl-XL118-126(TAYQSFEQV)(SEQ ID NO：43)、Bcl-XL173-182(YLNDHLEPWI)(SEQ ID NO：42)、Bcl-XL165-174(RIAAWMATYL)(SEQ ID NO：45)、Bcl-XL169-178(WMATYLNDHL)(SEQ ID NO：46)、Bcl-XL161-170 (VLVSRIAAWM)(SEQ ID NO：48)、Bcl-XL141-150(VAFFSFGGAL)(SEQID NO：49))，并通过针对这些肽的ELISPOT的方法，仔细检测了来自HLA-A2+不同起源癌症患者的PBL。早先已经证明这种方法对于鉴定癌症患者中的肿瘤特异性CTL是高度有效的。实际上，在不同来源的癌症患者中检测到针对检测肽中的四种(Bcl-XL173-182、Bcl-XL141-150、Bcl-XL161-170和Bcl-XL165-174)的强烈和常见的CTL反应(图6)。总的说来，十八位HLA-A2+乳腺癌患者中的十五位具有针对这四种Bcl-XL肽的至少一种的免疫反应(应答者定义为抗原特异性细胞的平均数±
标准误差＞25每105个细胞)。同样地，六位受检黑素瘤患者中的四位和两位受检胰腺癌患者中的一位具有针对这四种肽的至少一种的免疫反应。由此，十八位受检乳腺癌患者中的九位具有针对Bcl-XL173-182的免疫反应，而六位受检HLA-A2+黑素瘤患者中的两位具有针对这个肽的免疫反应(图6a)。十八位受检乳腺癌患者中的四位具有针对Bcl-XL141-150的免疫反应，而我们在来自两位受检胰腺癌患者中的一位的PBL中检测到反应。在来自所检测的五位黑素瘤患者的任何一位的PBL中我们未能检测到针对这个肽的反应(图6b)。同样地，在来自六位乳腺癌患者和一位所检测的胰腺癌患者的PBL中，我们检测到针对Bcl-XL161-170的反应(图6c)。最后，四位乳腺癌患者、两位黑素瘤患者和一位胰腺癌患者具有针对Bcl-XL165-174的反应(图6d)。作为对照，检测了来自12位健康HLA-A2+个体的PBL。重要地，在任何健康的个体中没有检测 到针对Bcl-XL173-182、Bcl-XL141-150、Bcl-XL161-170或Bcl-XL165-174肽的反应(图6)。
PBL中的Bcl-XL特异性Granzyme B释放
利用GrB ELISPOT，我们评定了在PBL中检测出的Bcl-XL特异性T细胞是否显示细胞毒功能。因而，分析了来自两位Bcl-XL反应性乳腺癌患者(pt.no.：35和36)的PBL针对Bcl-XL173-182的反应性(图7)。在两位患者中，可以以每3×105个细胞约50-100个肽特异性CTL的频率检测到针对Bcl-XL173-182的反应。作为对照，我们收入了一位患者(pt.no.：17)，其中在INF-γ ELISPOT中我们仅能检测到针对Bcl-XL141-150的反应，而没有针对Bcl-XL173-182的反应。正如所料，在乳腺癌患者no.17中没有检测到针对Bcl-XL173-182的GrB释放。
Bcl-XL特异性T细胞的FACS分析
使用FACS分析和Pro5TM MHC五聚物染色进一步评估了来自乳腺癌患者的PBL中Bcl-XL173-182特异性CTL的自发性出现。在体外用肽刺激来自乳腺癌患者no.36的PBL一次，分离CD8阳性细胞。用HLA-A2 BCL-X五聚物复合体对这个培养物进行染色。FACS分析显示了容易检测的、构成了CD8+T细胞的0.24％的五聚物阳性T细胞群体(图8a)。比较起来，当通过ELISPOT分析分泌IFNγ的CD8+T细胞时，相同的CD8+T细胞显示了约1.4％的Bcl-XL173-182特异性。
针对Bcl-X(L)的其他HLA-A2限制性表位
针对Bcl XL118-126(TAYQSFEQV)(SEQ ID NO：43)(图9a)和Bcl-XL169-178(WMATYLNDHL)(SEQ ID NO：46)(图9b)，我们通过ELISPOT仔细检测了来自不同起源的HLA-A2+癌症患者的PBL，鉴定出在不同起源癌症患者中针对两种肽的弱的自发性CTL反应。
针对Bcl-X(L)的HLA-A3限制性反应
另外，我们利用HLA-A3特异性锚残基仔细检测了插入的区域(包括每个末端九个氨基酸)的推定的HLA-A3表位。随后，我们合成了两种肽：Bcl-XL165-173(RJAAWMATY)(SEQ ID NO：50)和Bcl-XL149-157(ALCVESVDK)(SEQ ID NO 51)。然后，针对Bcl-XL165-173(RIAAWMATY)(SEQ ID NO：50)和Bcl-XL149-157(ALCVESVDK)(SEQ ID NO：51)肽，我们通过ELISPOT仔细检测了来自HLA-A3+癌症患者的PBL。早先已经证明这种方法对于鉴 定癌症患者中的肿瘤特异性CTL是高度有效的。实际上，在不同起源的癌症患者中我们检测到针对Bcl-XL165-173(RIAAWMATY)(SEQ ID NO：50)的强烈的和常见的CTL反应。在五位受检乳腺癌患者中的四位(应答者定义为抗原特异性细胞的平均数±标准误差＞25每105细胞)、四位受检黑素瘤患者中的四位、两位受检胰腺癌患者中的两位以及四位受检多发性骨髓瘤患者中的一位的HLA-A3+PBL中，我们能检测到针对Bcl-XL165-173的反应(图10)。重要地，在我们作为对照检测的七位HLA-A3+健康个体中的任一位中，我们未能检测到反应(图10)。
实施例4
在癌症患者中Mcl-1的免疫原性
概要
在此，我们证明了在癌症患者中Mcl-1是T细胞识别的靶点。由此，通过ELISPOT，我们描述了针对来源于Mcl-1的肽表位的自发性HLA-A1和HLA-A3限制性细胞毒T细胞反应。
引言
骨髓细胞因子-1(Mcl-1)是Bcl-2家族的死亡抑制成员，其在单核细胞分化的早期表达，提高转染变成不成熟骨髓细胞的生存力。转基因小鼠中的Mcl-1促进了一定谱系的造血细胞类型的存活和骨髓细胞的永生化。对于许多人类癌症，包括前列腺癌、胰腺癌、黑素瘤、乳腺癌、卵巢癌患者，和子宫颈癌，以及B细胞慢性淋巴细胞性白血病(B-CLL)和在复发的AML和ALL中，已经报道了Mcl-1水平的升高。在B-CLL患者中，较高水平的Mcl-1与单试剂治疗后不能达到完全缓解强烈地相关。在多发性骨髓瘤中，Mcl-1在恶性细胞的存活方面起了重要作用。在这点上，已经证明了表达在其自己的启动子控制下的Mcl-1转基因的小鼠发展出高频率的B细胞瘤形成，从滤泡性淋巴瘤到弥漫性的大的细胞淋巴瘤。
针对Mcl-1的HLA-A3限制性反应
为了研究在癌症患者中Mcl-1是否是T细胞的天然靶点，我们利用HLA-A3特异性锚残基检测了蛋白序列的最可能的HLA-A3九肽和十肽表位。随后，我们合成了六种Mcl-1得出的肽(Mcl-1185-194(YLREQATGAK)(SEQ ID NO：52)、Mcl-1293-302(SITDVLVRTK)(SEQ ID NO：53)、 Mcl-1267-276(LISFGAFVAK)(SEQ ID NO：54)、Mcl-195-103(RLLFFAPTR)(SEQ ID NO：55)、Mcl-1300-308(RTKRDWLVK)(SEQ ID NO：56)、Mcl-1236-244(DIKNEDDVK)(SEQ ID NO：57))，并利用ELISPOT分析仔细检测了来自不同起源的HLA-A3+癌症患者的PBL对这些肽的反应性。早先已经证明这种方法对于鉴定癌症患者中的肿瘤特异性CTL是高度有效的。实际上，在不同起源的癌症患者中检测到针对两种Mcl-1衍生的肽的强烈的和常见的CTL反应(Mcl-195-103和Mcl-1300-308)(图11)。总的说来，六位受检HLA-A3+乳腺癌患者中的五位具有针对这两种Mcl-1肽的免疫反应。由此，五位乳腺癌患者具有针对Mcl-195-103的反应(应答者定义位抗原特异性细胞的平均数±
标准误差＞25每105细胞)，三位患者具有针对Mcl-1300-308 的反应(图11)另外，两位受检HLA-A3+胰腺癌患者中的两位具有针对Mcl-195-103肽的免疫反应，而他们中的一位也与Mcl-1300-308反应。另外，我们检测了来自患有B-CLL的六位患者的PBL，并在这些患者中的两位中鉴定了针对Mcl-195-103的反应。作为对照，检测了来自10位健康HLA-A3+个体的PBL。重要地，在任何健康供体中没有检测到针对Mcl-195-103或Mcl-1300-308肽的反应(图11)。类似地，在任何癌症患者或健康对照中没有检测到针对任何其他四种Mcl-1衍生的肽的反应(数据未显示)。
针对Mcl-1的HLA-A1限制性反应
为了研究在癌症患者中Mcl-1是否是T细胞的天然靶点，我们利用HLA-A1特异性锚残基检测了蛋白序列的最可能的HLA-A1九肽和十肽表位。随后，我们合成了四个Mcl-1得出的肽(Mcl-1166-175(PAEEEEDDLY)(SEQ ID NO：58)、Mcl-1121-129(SPEEELDGY)(SEQ ID NO：59)、Mcl-1177-185 (QSLEIISRY)(SEQ ID NO：60)、Mcl-1339-347(AGVGAGLAY)(SEQ IDNO：61))，并利用ELISPOT分析仔细检测了来自HLA-Al+不同起源癌症患者的PBL对这些肽的反应性。实际上，在不同起源的癌症患者中检测到针对两种Mcl-1衍生的肽的强烈的和常见的CTL反应(Mcl-1166-175和Mcl-1177-185)(图12)。总的说来，四位受检HLA-A1+乳腺癌患者中的三位具有针对Mcl-1177-185的免疫反应，其中的一位另外具有针对Mcl-1166-175的反应(图12)。另外，七位黑素瘤患者中的一位具有针对Mcl-1177-185肽的免疫反应，其中的另一位具有针对Mcl-1166-175的反应。作为对照，检测了来 自六位健康HLA-A1+个体的PBL。重要地，在任何健康供体中没有检测到针对Mcl-1166-175或Mcl-1177-185肽的反应(图12)。
修改的肽反应。
HLA-A3限制性肽Mcl-1300-308的免疫原性通过用更好的HLA-A3锚残基，即亮氨酸替换位置2的苏氨酸而提高(Mcl-1300-308L2(RLKRDWLVK)(SEQ ID NO：62))。在两位乳腺癌患者中检测到针对Mcl-1300-308L2的自发性免疫反应(数据未显示)。同样地，为了产生更具免疫原性的表位，我们在位置3修饰了HLA-A1限制性肽Mcl-1177-185(QSLEIISRY)(SEQ ID NO：60)，产生两种肽Mcl-1177-185D3(QSDEIISRY)(SEQ ID NO：63)和Mcl-1177-185E3(QSEEIISRY)(SEQ ID NO：64)。
讨论
几乎所有的恶性肿瘤以细胞凋亡信号方面的缺陷为特征。这使得恶性细胞对内源的细胞凋亡刺激、以及外源的刺激，例如化疗药物和放疗有抗性。在人类癌症中所见的缺陷性细胞凋亡常由Bcl-2蛋白家族中的抗细胞凋亡蛋白的过量表达引起，即，Bcl-2、Bcl-XL和Mcl-1、Bcl-w、Bfl-1A1、Bcl-b和Bcl2-L-10。使用这种细胞凋亡蛋白的抑制物用于疫苗接种目的是有益的，因为这些蛋白的表达的下调或丧失作为某种形式的免疫逃避将削弱持续的肿瘤生长，因为肿瘤细胞的存活需要Bcl-2家族的功能活性成员。对于治疗策略，靶向在肿瘤细胞生长和存活中起重要作用的抗原，选择抗原缺陷性肿瘤，有公认的局限性。此外，由于在细胞中Bcl-2家族蛋白的表达升高与抗药性有关，基于Bcl-2家族的免疫疗法与细胞毒性化疗的组合是治疗癌症的非常激励人心的新途径。
我们扫描了Bcl-2、Bcl-X(L)和Mcl-1蛋白中肽结合基序的存在，使用这些来在癌症患者中研究特异性T细胞。为此，通过ELISPOT，在患有不相关的肿瘤类型，即，胰腺癌、乳腺癌、黑素瘤AML和CLL的患者中，检测了针对Bcl-2家族的所有成员的自发性T细胞反应性。通过CD8/五聚物FACS确认了在来自癌症患者的PBL中Bcl-XL特异性CD8+细胞的存在。联系起来，这些数据显示了，来自这些蛋白的CTL定义的表位可以广泛地适用于针对癌症的治疗性疫苗接种，并因而具有实际上的免疫治疗价值。
此外，十一位乳腺癌患者具有Bcl-2特异性CTL，这些患者中的八位早先用至少一种化疗治疗了。在两位患者(pt.no：14和17)中，没有检测到对四种不同的Bcl-2肽的CTL反应。这两位患者早先都接受了抗激素治疗，而没有化疗。类似地，在化疗前患有原发的局部乳腺癌的患者中，我们未能检测到任何反应。由此，在乳腺癌中，仅在已经接受了化疗的患者中检测到Bcl-2反应。虽然肿瘤负荷可能起了重要作用，这说明作为治疗诱导的Bcl-2表达增加的结果，导入或提高了免疫反应。这指出了一种方案，其中基于Bcl-2家族的免疫疗法与细胞毒性化疗的组合可能协同地改善当前的响应速率。没有得到检测了Bcl-X(L)和Mcl-1反应的患者的治疗状况。
在当前的研究中，我们利用了GrB ELISPOT分析来证明了，患者PBL中的Bcl-2或Bcl-X(L)特异性CTL实际上是细胞毒效应细胞。为了进一步证明这个观点，我们从患者PBL富集了Bcl-2反应性T细胞，显示了产生的T细胞系能够在常规的51Cr释放分析中裂解肽脉冲的T2细胞。此外，这种Bcl-2反应性T细胞系能杀死HLA匹配的乳腺癌细胞系，而HLA-A2阴性靶细胞未被杀死。这些发现显示，癌细胞实际上在HLA-A2分子的背景中加工和呈递Bcl-2肽。最后，我们能够克隆这些分离的细胞，并说明了它们高度特异性地与Bcl-2肽表位反应。
当来源于黑素细胞分化抗原的肽首先被用于治疗患有IV期黑素瘤的患者时，预想的是这可能导致黑素细胞的明显破坏，这接下来临床上表现为，即，白斑病或视网膜炎。然而，临床经验表明，在接受疫苗接种的患者中白斑病的发病率没有显著地高于接受其他形式治疗的患者中黑素瘤相关的染色不足的发病率。另外，在针对自体抗原的各种疫苗接种实验中没有报道严重的副作用。我们的数据合起来证明了，针对Bcl-2家族蛋白组的细胞免疫反应是癌症中的普遍特征。在尝试最大化免疫疗法的影响时，激动人心的策略是考虑待治疗的具体疾病或疾病阶段中选定靶点的表达分布型和预后显著性。由此，虽然在某些癌症、或疾病的特定阶段中见到Bcl-2、Mcl-1和Bcl-XL的共表达，其他癌症展现出一种或其他蛋白的独占性表达。由此，在某些疾病象卵巢癌中，Mcl-1的表达而不是Bcl-2的表达与进展的阶段和不良存活率有关，因此Mcl-1可能是最初的抗原，而在例如CLL的疾病中，Bcl-2和Mcl-1是共同过量表达的，同时靶向两种蛋白可能是比靶向单个分子更有效的策略。类似地，Tanaka等描述了在乳腺癌中另一个细胞凋亡抑 制物存活蛋白的存在与Bcl-2的表达，降低的细胞凋亡指标(AI)和不良的总体存活率强烈相关。已经在成神经细胞瘤、胃癌、结肠直肠癌和高级非Hodgkin’s淋巴瘤中描述了存活蛋白和Bcl-2之间的类似相关性。在针对癌症的治疗性疫苗接种中存活蛋白衍生的肽的安全性和可能性当前已经在I/II期临床试验中进行研究(J.Becker，personal communication)。由此，激动人心的免疫治疗策略是靶向Bcl-2蛋白家族和存活蛋白，因为它们通过不同的细胞途径行使了它们的抗细胞凋亡功能。
实施例5
肽疫苗
例如，利用游离酰胺NH2末端和游离酸COOH末端，Bcl-2蛋白家族的肽可以在例如UVA Biomolecular Core Facility合成。每种都作为冻干的肽提供，然后在无菌水中溶解，用终浓度67-80％的Lactated Ringer’s水溶液(LR，Baxter Healthcare，Deerfield，IL)作为缓冲液来稀释。然后对这些溶液进行无菌过滤，放入硅酸硼玻璃小瓶中，根据FDA指南，如IND 6453中规定的，进行一系列的质量保证研究，包括同一性、无菌性、一般安全和纯度的确认。肽稳定性的测试表明，当这些肽被保存在-20℃、3年时，在纯度或肽浓度方面没有下降。
在实践的情况下，患者将接受疫苗，其包含约100μg I类HLA限制性肽，有或者没有II类HLA限制性辅助肽。例如，用佐剂中的约100μg I类HLA肽单独地免疫患者，或用例如约100μg HLAI类限制性肽加上190μg II类限制性辅助肽免疫患者。计算更高剂量的辅助肽，以提供等摩尔量的辅助表位和细胞毒表位。另外，可以用包含两种肽的较长的氨基酸序列来免疫患者。
上述的肽，在1ml水溶液中，可以作为含约100μg QS-2l的溶液/悬浮液，或作为含约1ml Montanide ISA-51佐剂的乳剂来施用。
在第0天和第1、2、3、6、9和12月，用肽加上佐剂免疫患者，总共进行七次免疫。除了少数例外，每个疫苗的接种都施用到同一手臂上。优先的s.c.施用所述肽。
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Claims (25)
1.包含至多15个氨基酸的、来源于Bcl-2蛋白的分离的免疫原性活性肽，其包含选自由WLSLKTLLSL(SEQ ID NO：6)、PLFDFSWLSL(SEQ IDNO：8)、YLNRHLHTWI(SEQ ID NO：10)、NIALWMTEYL(SEQ ID NO：11)组成的组的序列，其中所述肽用作癌症治疗中的药物。
2.权利要求1的肽，其中所述肽是MHC I类限制肽，具有以下性质中的至少一种：
(i)能够以一定亲合性与对其限制的I类HLA分子结合，所述亲合性通过能够导致I类HLA分子的半最大量回收的肽的量来测定，所述肽的量通过本文所述的与MHC I类分子结合的肽的装配分析测定为至多是50μM，
(ii)根据ELISPOT分析测定的，能够以每104个PBL至少1个的频率在癌症患者的PBL群体中引发产生INF-γ的细胞，和/或
(iii)能够原位检测肿瘤组织中与所述表位肽有反应性的CTL。
3.权利要求2的肽，具有至多30μM的C50值。
4.权利要求2的肽，具有至多20μM的C50值。
5.权利要求2的肽，具有至多10μM的C50值。
6.权利要求1的肽，其能够在癌症患者中引发细胞免疫反应。
7.权利要求1的肽，其受MHC I类HLA-A分子的限制。
8.权利要求7的肽，其受HLA-A2的限制。
9.权利要求1的肽，其是九肽或十肽。
10.权利要求1的肽，其通过取代、缺失或添加至少一个氨基酸残基而由天然的Bcl-2衍生而来。
11.权利要求1的肽，其能够以每104个PBL至少10个的频率在癌症患者的PBL群体中引发产生INF-γ的细胞。
12.权利要求1的肽，其能够在患有表达Bcl-2蛋白的癌症疾病的患者的PBL群体中引发产生INF-γ的细胞。
13.权利要求12的肽，其中所述癌症疾病选自造血恶性疾病包括慢性淋巴细胞性白血病和慢性髓细胞性白血病、黑素瘤、乳腺癌、宫颈癌、卵巢癌、肺癌、结肠癌、胰腺癌和前列腺癌组成的组。
14.一种疫苗组合物，包含权利要求1的来源于Bcl-2的分离的免疫原性活性肽或编码所述肽的核酸，其中所述肽是MHC I类限制肽，其具有以下性质中的至少一种：
(i)能够以一定亲合性与对其限制的I类HLA分子结合，所述亲合性通过能够导致I类HLA分子的半最大量回收的肽的量来测定，所述肽的量通过本文所述的与MHC I类分子结合的肽的装配分析测定为至多是50μM，
(ii)根据ELISPOT分析测定的，能够以每104个PBL至少1个的频率在癌症患者的PBL群体中引发产生INF-γ的细胞，和/或
(iii)能够原位检测肿瘤组织中与所述表位肽有反应性的CTL，
其中所述疫苗组合物用作癌症治疗中的药物。
15.权利要求14的疫苗组合物，其中所述疫苗引发具有抗癌细胞的细胞毒效应的效应T细胞在被免疫接种的患者中的产生。
16.权利要求14的疫苗组合物，包含受MHC I类HLA-A分子限制的肽。
17.权利要求14的疫苗组合物，其中所述组合物包含佐剂。
18.权利要求17的疫苗组合物，其中所述佐剂选自由基于细菌DNA的佐剂、基于油/表面活性剂的佐剂、基于病毒dsRNA的佐剂和咪唑喹啉组成的组。
19.一种多部分试剂盒，包含根据权利要求14的疫苗组合物，和另外的抗癌试剂。
20.权利要求19的多部分试剂盒，其中所述抗癌试剂是抗体。
21.权利要求19的多部分试剂盒，其中所述抗癌试剂是细胞因子。
22.权利要求1的肽或权利要求14的疫苗组合物在制备用于治疗表达Bcl-2蛋白家族成员的癌症疾病的药物中的用途。
23.权利要求22的用途，其中所述癌症疾病选自由造血恶性疾病，包括慢性淋巴细胞性白血病和慢性髓细胞性白血病、黑素瘤、乳腺癌、宫颈癌、卵巢癌、肺癌、结肠癌、胰腺癌和前列腺癌组成的组。
24.权利要求22的用途，其中所述药物包含另外的抗癌试剂。
25.权利要求24的用途，其中另外的抗癌试剂选自由用于化疗、用免疫刺激物质的治疗、基因治疗、和用抗体的治疗中所使用的另外的试剂组成的组。
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