CN113350492A - 基于给予免疫原性的应激蛋白的治疗性癌症疫苗 - Google Patents

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Abstract

本发明描述了一种用于制备包含肿瘤细胞应激蛋白的组合物的方法，所述方法包括以下步骤：将肿瘤细胞置于培养基中；使i)中的肿瘤细胞经历应激，结果是这些细胞响应于所述应激产生应激蛋白；获得或回收应激的肿瘤细胞和/或应激蛋白；用能够给予所述应激蛋白免疫原性的分子或过程(优选为半抗原或半抗原化过程)处理获得的所述应激的肿瘤细胞和/或应激蛋白。本发明还描述了一种药物组合物，所述药物组合物包含肿瘤细胞应激蛋白和/或含有应激蛋白的肿瘤细胞，以及药用赋形剂，这些应激蛋白被给予免疫原性，并且尤其是被半抗原化。

Description

基于给予免疫原性的应激蛋白的治疗性癌症疫苗
本申请是申请日为2014年10月15日、申请号为2014800569260、发明名称为“基于给予免疫原性的应激蛋白的治疗性癌症疫苗”的分案申请。
技术领域
本发明涉及基于应激蛋白、包括如HSP(热休克蛋白)和/或GRP(葡萄糖调节蛋白)这样的类型的伴侣蛋白或抗性机制(LRP、CTL4、PD-L1等)中涉及的其他蛋白的癌症治疗的新型治疗方法。本发明尤其涉及用于制备药物组合物或治疗性疫苗的方法、所述药物组合物或治疗性疫苗本身以及用于癌症的治疗性治疗的治疗方法。
背景技术
免疫系统基于两种防御机制，即：先天性免疫，其迅速但无特异性；以及获得性免疫，其较慢但有特异性并且具有记忆。这两种互补机制通过在细胞-介导的免疫应答期间直接地亦或在体液免疫应答期间通过活性分子(如免疫球蛋白、细胞因子等类型)的分泌动员细胞以提供抵抗内部“侵袭”的能力。
癌症的发生和发展大量地涉及免疫。根据三阶段理论(3E)，致癌作用响应于消除机制，基于双重免疫功能、旨在破坏肿瘤细胞的保护性免疫监视过程以及抗癌细胞的“选择”。三阶段理论包括被称为消除阶段的第一阶段，在该阶段期间免疫系统抵抗肿瘤增殖，引起与肿瘤相关的组织参与和环境变化(非特异性细胞(巨噬细胞、NK、sDC)的动员)，抗增殖、凋亡、血管生成抑制的分子的分泌，细胞因子的产生，CD4和CD8的动员和激活。在被称为响应于免疫系统的平衡阶段的第二阶段期间，“敏感的”肿瘤细胞被消除并且导致最具抗性的细胞的免疫选择。调动起来的抗性机制为抵抗细胞凋亡，抑制细胞因子(TGF-β、IL-10、PGE2、IDO)的分泌，改变抗原呈递(主要组织相容性复合体(MHC)I类的表达的部分或全部丧失)，中和分子的分泌，以及MICA和MICB表达，通过表达Fas-L，导致T淋巴细胞死亡的PD-L1，“反攻”细胞介导的免疫系统。在此阶段期间，破环的肿瘤细胞的数量与抗性细胞的数量均衡。此均衡阶段与在治疗期间观察到的缓解阶段对应，这也是通过毒性最强的克隆抵抗免疫防御系统或治疗的能力来选择毒性最强的克隆的选择阶段。在被称为逃逸阶段的第三阶段期间，已经发展一种或多种逃逸手段的抵抗免疫系统的各种保护机制的细胞在无任何控制下增殖。然后癌细胞发展为肿瘤块，这是生理逃逸现象的临床表现。在抵抗治疗的现象期间，在癌症的晚期和转移期也观察到相关的逃逸现象。
抗癌治疗包括外科手术，其中，目标主要是移除或减小肿瘤，但是这种“机械性”行为对致癌作用没有任何实际抑制效果并且通常通过旨在“消除”癌症起源的各种不同的治疗疗法来补充。在肿瘤细胞的情况下，放射疗法的目的是导致快速增殖细胞的DNA改变。放射疗法的副作用是双重的：甚至会照射健康细胞，从而引起健康细胞的破坏或能够导致其癌变的遗传变异，并且肿瘤细胞凭借产生伴侣蛋白或分子伴侣(HSP、GRP等)发展抗辐射诱导的细胞凋亡的抗性，从而引起逃逸现象。化学疗法旨在通过作用于细胞本身或通过抑制具体的代谢途径来消除肿瘤细胞：与DNA的直接相互作用(亲电子剂、嵌入剂、分裂剂)、与DNA的间接相互作用(DNA合成的抑制剂，例如，抗代谢物、拓扑异构酶抑制剂；纺锤体形成抑制剂)、新血管形成抑制剂、蛋白酶体抑制剂。肿瘤细胞在这里再次发展抵抗机制，并且尽管实施的多化疗策略，但伴随着大量肿瘤增殖、适应性的证据以及可以认为类似于自然逃逸现象的细胞选择，如免疫系统涉及的3E理论所述，观察到复发现象。
免疫疗法包括：被动免疫疗法，其由提供大量效应物组成；以及主动免疫疗法，其目的是引起特异性免疫应答。被动免疫疗法基于注射抗体以便阻断受体，引起细胞溶解，刺激细胞毒性，提高细胞凋亡的抑制(西妥昔单抗-
Figure BDA0003112484670000021
贝伐单抗-
Figure BDA0003112484670000022
利妥昔单抗-
Figure BDA0003112484670000023
等)。使用细胞因子是刺激抗肿瘤的保护性免疫应答的另一种策略(IL2、Infγ等)。主动免疫疗法或接种疫苗的免疫作用的目的是根据以下不同的策略使患者对癌症免疫：通过激活树突状细胞、TLR激动剂、肿瘤细胞裂解物、修饰或非修饰的非增殖肿瘤细胞来激活免疫系统。这些方法构成新的先进疗法医药产品(ATMP)。它们很有希望并且得到很好的结果，如果它们与其他治疗结合效果会更好。已经被食品与药品管理局(FDA)批准的第一种主动免疫疗法治疗是通过在存在特异性肿瘤抗原的情况下培养，基于患者的T淋巴细胞(TL)的激活的前列腺癌疫苗(Sipuleucel-T)
Figure BDA0003112484670000031
然而，这些治疗也一样，观察到与涉及免疫系统的3E理论中所述的自然逃离现象类似的逃逸现象。
因此仍然需要提供用于治疗癌症的新型治疗策略，其能够提供特异性的固有有效性和/或有助于多种治疗策略。
各种不同的抗肿瘤机制，尽管有多种，但均得到直接或间接攻击肿瘤细胞的基本策略的支持，而最后的步骤是细胞溶解或细胞死亡。因此，抗细胞凋亡因子似乎是关键现象，因为它通过保护肿瘤细胞以抵抗破坏的中间机制来诱导直接逃逸(抑制诱导的细胞凋亡)或间接逃逸。
许多研究已经提供了更好地理解抗性现象，并且尤其是“伴侣蛋白”或应激蛋白在抗细胞凋亡中的作用的手段。尤其是，已知的效果是热休克蛋白(HSP110、HSP 90、HSP 70、HSP 60、HSP 20和泛素)以及主要位于内质网(也归在应激蛋白家族下)中的GRP(葡萄糖调节蛋白)GRP 94、GRP 78(BiP)和GRP 58的保护效果。重点也已经放在更具体地涉及在其中包括多药耐药蛋白(MRP)，如GP 170、VMP1和LRP的各种治疗(多种药物抗性)的抗性因子上。
对应激尤其是热休克的抗性机制似乎是通用的并且存在于所有活的生物体(细菌、植物、动物)中。HSP的功能的特征为某些蛋白和酶通过形成分子复合物的保护或修复活动，这些分子复合物抑制“不适当的键”由于“代谢攻击”(低氧、低碳水化合物浓度等)、侵略性物理攻击(热、辐射)、或化学/药物攻击而引起的变性和形成。
目前，存在使用HSP作为治疗靶标的新的策略。尤其是，已经开发了一些分子以便尝试抑制HSP 90，但是结果喜忧参半并且具有高的毒性水平。更先进的治疗方法之一是使用小分子17-AAG(坦螺旋霉素或17-烯丙基氨基-17-去甲氧基格尔德霉素；Len Neckers，热休克蛋白90：癌症分子伴侣(Heat shock protein 90:the cancer chaperone)J Biosci32(3)2007年4月，517-530,Indian Academiy of Sciences)，其抑制HSP 90的分子伴侣功能并且其临床活性很有希望，但是有许多副作用。类似地，小分子Ganetespid(STA-9090)，HSP 90的ATP位点的抑制剂，目前在黑素瘤中进行测试，就像对功能或HSP 90位点起作用一样的其他分子(新生霉素、Shepherdine、同种型抑制剂等等)。研究考虑的另一个耙标是通过作用于HSP 70来提升对细胞凋亡的抑制。在考虑中的产品是ADD70(氨基酸分子)、PES(2-苯基亚乙基磺酰胺)、VER-155 008(腺苷衍生物)MKT077(小分子)。最后，抵抗HSP 27和丛生蛋白的“反义OGX-427”的使用已经成为若干临床研究的主题。
此外，已经参考自体使用HSP 70或其衍生物的参考文献作为抵抗小鼠的肿瘤细胞的免疫因子。A Ménoret和Le Pendu(Protéines de choc thermique et antig è nestumoraux(热休克蛋白和肿瘤抗原)，Medecine/Sciences 1994；10:665-71)描述了针对与肿瘤多肽相关的条件显示免疫原性的纯化的HSP 70制剂的小鼠免疫。Wirth D等人(安娜医学兽医学(Ann.Med Vet).2002,146,201-216)提及了以下研究，这些研究已经表明用HSP制剂接种小鼠或转移由肿瘤得到的HSP 70基因，使小鼠对施用自体的肿瘤细胞免疫并且诱导已经发展的肿瘤细胞的消退。
然而，目前看起来这些方法具有集中于一种应激蛋白或另一种应激蛋白的特异性靶点，而不提供集中于抑制肿瘤细胞发展的“整套”保护机制的组合策略。因此，已经提到通过刺激如HSP 27和HSP 70的其他HSP(热休克应答)的分泌从而增强对细胞凋亡的抗性并且通过诱导化学保护(如上所述的A M é noret和J.Le Pendu 1994)，抑制HSP 90也会引起产生防御信号。
发明内容
本发明的目的是提供全面的整体方法，也就是说，该方法提供了同时作用于多种抗性机制，优选为肿瘤细胞发展的整套这些机制的能力。
本发明的目的还提供这种方法尤其是在对患者施用治疗方案的过程中适用于肿瘤细胞在体内经历的一种或多种应激的可能性。
本发明的目的还提出一种方法，该方法提供与使用细胞系相关的标准化。
因此，本发明的目的还涉及确保该方法将肿瘤细胞的类型和/或阶段，尤其是正在接受治疗的患者的肿瘤细胞的类型和/或阶段考虑在内。
因此，本发明的目的还提出就其本身而言可以构成治疗方案或作为另一种治疗方案的辅助方案的这样的方法。
本发明的另一个目的还提出具有患者特异性的这样的方法。
本发明的目的是通过已经被给予免疫原性的应激蛋白刺激免疫系统，尤其是通过半抗原化，以便引起表达所述抗性因子(应激蛋白)的细胞的消除。该免疫学治疗旨在消除或控制可以表达这些抗性因子的细胞。提出的治疗性方法旨在尤其是基于以下几点用于抵抗癌症：
-肿瘤细胞在它们被自然(免疫系统)“应激”或通过治疗性方案(放射疗法、化学疗法、免疫疗法等)“应激”时发展用于抵抗或逃逸的机制；
-抵抗机制引起多种类型的应激蛋白如HSP、GRP和其他蛋白/糖蛋白的参与；
-应激蛋白本身在体内不会自然产生免疫原性，尽管它们在某些条件下可以通过接种疫苗产生“免疫保护”；
-特异性抗-HSP(或抗-抗性因子)方法似乎也会发生逃逸现象；
-蛋白环境(辅因子、底物等)似乎是被考虑到的要素以便通过接种疫苗产生抗肿瘤保护效果。
本发明因此具体地涉及一种用于制备包含应激蛋白的组合物的方法，所述应激蛋白通过在肿瘤细胞的培养物上在体外施加应激来诱导。更具体地讲，所述方法产生免疫原性形式的这样的应激蛋白，也就是说，能够被患者的免疫系统识别并且能够导致患者的免疫系统形成针对这些蛋白和存在这些蛋白的肿瘤细胞的免疫应答。该方法有利地包括使肿瘤细胞灭活以便使肿瘤细胞不增殖的步骤。本发明还涉及包含这样的蛋白的组合物，特别是药物组合物或治疗性疫苗。本发明还涉及通过有原则的治疗策略或者与另一种治疗方案(特别是佐剂)组合的方式施用这样的组合物的抗癌治疗方法。
本发明涉及一种方法并且该方法提供了制备药物组合物的能力，该药物组合物包括在施加到肿瘤细胞的应激的条件下由肿瘤细胞表达应激蛋白中的多种或所有或大部分。这构成获得的结果产物的一个优点，该结果产物通过代表多种应激蛋白，使得药物组合物包含给予免疫原性的各种各样的应激蛋白，这些应激蛋白构成患者的免疫系统将能够与其反应的另外的免疫原性元件，然后靶向整组肿瘤细胞，并且抵消在免疫系统和/或施加的处理的压力下由这些肿瘤细胞不同地发展的抗性机制。
一般来讲，将在根据本发明的组合物中发现一种或多种以下形式的这些应激蛋白：在游离状态下，在与肿瘤细胞的膜相关的状态下(包含内膜)，存在于肿瘤细胞的表面上，存在于肿瘤细胞的内部，与肿瘤细胞的碎片或与肿瘤肽相关。
因此，根据本发明的组合物将优选地包括迄今为止并且在给定时间点记载的一种或多种识别的应激蛋白。以下部分提供了本领域技术人员已知的应激蛋白的若干个家族。
HSP根据它们的分子量分为6个家族，但是它们在同一个家族内的构象和特性似乎可根据它们的起源变化。因此，HSP 70(其包括HSP 72和73)可以分为响应于热休克的那些(HSP 70)和受热休克的影响非常微弱的那些(HSP70)。
在正常细胞中微弱表达的HSP 25/HSP 27在肿瘤细胞中超表达，并且将在抵抗某些治疗并且促进增殖的肿瘤细胞的生长和发育中起作用。另一种作用将通过与涉及半胱天冬酶-3的途径相互作用、调节TNF-α的产生等抑制细胞凋亡。
HSP 47家族是最近识别的一个家族，并且具有尚未充分确定的作用。它将主要参与结缔组织的发育，特别是在产生胶原期间。通过包括在“热休克蛋白”中，它参与抵抗肿瘤细胞抗性，尤其是它在肿瘤的新血管形成期间参与。HSP 40也将起到与HSP70结合的“辅伴侣分子(co-chaperone)”的作用。
HSP 60(伴侣蛋白)已经在细菌(GroEL代表生长大肠杆菌大蛋白)中鉴别并且在植物中发现。这些伴侣蛋白参与蛋白结构的三级构象。HSP的这个家族将在免疫并且特别是在自身免疫性疾病中发挥作用。
HSP 70的家族是研究最多的家族之一并且它连同应用最广泛的HSP 90一起。存在将由“正常”状态下的细胞表达或在应激之后直接诱导的若干个亚类。这些HSP的特性特征包括它们在其翻译(折叠)期间与其他蛋白相互作用的能力、它们在膜运输中的参与以及作为伴侣蛋白抑制细胞凋亡。HSP 70的分子伴侣活性很复杂并且引起牵涉若干个因子，如HSP40、Hip(Hsc相互作用蛋白)、Hop(Hsc-HSP 90组织蛋白)，其使得ATP酶活性对形成“分子伴侣-底物”复合物成为必要的。HSP-70的抗细胞凋亡作用是，它似乎是多层面的并且涉及对半胱天冬酶前体9、8、3途径(抑制)的众多抑制/激活机制，与p53途径的相互作用(抗P53蛋白的稳定化)，前-凋亡因子(Bax)的抑制，细胞色素C的规则化等。
HSP 90是组成性表达最多的并且存在于所有真核细胞中。它们也在应激现象期间超表达并且靶向蛋白的稳定化和复性。根据它们的位置、它们的起源和它们的功能已经识别了若干种同种型。二聚化之后的HSP 90具有与共-分子伴侣相互作用的能力并且因此形成蛋白复合物，这些蛋白复合物允许细胞的肿瘤转化中涉及的分子突变和保护(特异性蛋白的稳定化)：P90参与细胞凋亡的调节(抑制Bcl-2和Apaf-1)，参与细胞增殖和转移(hTERT、MMP2)，抑制p53，参与通过修改，然后稳定化蛋白的突变。
HSP 110(或105)主要由于在应激之后被诱导。它们将参与在热休克期间特别敏感的核糖体的保护。它们的保护作用主要是使蛋白聚合物离解，它们的再增溶作用允许这些蛋白的再激活。HSP 110好像是HSP 70的亚组，具有相同的结合域以及因此具有某些类似的性质。
GRP(葡萄糖调节蛋白)构成其他主要组的应激蛋白。通常与HSP关联，它们在抗性机制中的主要作用是涉及保护蛋白结构。因此，GRP 78(BiP)将具有通常畸形蛋白被破坏的分子伴侣的作用，从而解释癌细胞的抗性。被称为“致死蛋白”的GRP 75将在正常细胞中具有抗增殖的作用，在其失调之后会参与到细胞的癌化，同时通过参与细胞凋亡调节的p53的失活导致相反的作用。GRP 94还参与三维构象不完美的未完全组装的蛋白的保护。与HSP70有关，它参与抵抗某些抗癌剂。
其他蛋白抵抗因子，描述为“多种药物抗性”，例如，GP 170、MPR(七种不同的类型)、LRP，并且最近VMP1参与治疗性逃逸。
具体实施方式
1.制备方法
因此，本发明的目的涉及一种用于制备包含肿瘤细胞的应激蛋白的组合物的方法，所述方法包括以下步骤：
i)将肿瘤细胞置于(放置)在培养基中；
ii)使i)中的肿瘤细胞经历应激并且确保这些细胞响应于所述应激产生应激蛋白的结果；
iii)获得或回收应激的肿瘤细胞和/或应激蛋白；
iv)用能够给予所述应激蛋白免疫原性的分子或过程，优选为半抗原化过程处理在iii)中获得的所述应激的肿瘤细胞和/或应激蛋白。
培养基可以是使得其可以维持细胞的生存力和/或其生长或增殖的培养基。可以使用本领域的技术人员熟知的培养基。这些培养基通常包括允许细胞生存的碱性培养基“极限必需培养基”，其中可以通过血清或通过使用确定的生长因子(“合成的无血清”培养基)添加一种或多种促有丝分裂因子。举例来说，可以提到以下常规培养基：DMEM、EMEM、HBSS、EBSS、PBS、RPMI以及用于无血清细胞培养PANSERIN的其他培养基、
Figure BDA0003112484670000081
培养基等，这些培养基补充或未补充谷氨酰胺、胰岛素、HAM's营养物等，如果需要可以向这些培养基中添加血清和/或生长因子。
步骤ii)优选地应用于包含生长期或平台期肿瘤细胞的培养基。本领域的技术人员可以容易地确定细胞处于这些期中的哪一期。首先，可以提前确定使得在确定的时间段后获得这些期的培养条件。还可以确定通过以下方法已经获得的这些期：细胞生长曲线、生存力、倍增时间、代谢物测定或养分消耗等。
在体外施加应激。就化学或物理性质而言，应激可以是任何种类，并且施加应激的时间段可以依据选择的施加的应激的类型、每种应激的性质和施加时间段成比例地变化，以确保肿瘤细胞产生的应激蛋白的水平适合本发明，例如以便考虑到应用于患者的抗癌方案。可以使用以下方法：
-辐射，尤其是约0.25戈瑞(Gray)至约25戈瑞的辐射，优选为低剂量，即约1戈瑞至约5戈瑞，例如约2戈瑞；辐射时间段可以包括约1分钟至约20分钟，优选为约1分钟至约5分钟；
-热休克，例如渐进达到或突然施加高于37℃并且足以诱导用于产生热应激蛋白的目的的应激的温度；这个温度可以是约38℃至约45℃，优选为约40℃至约43℃；在这个温度的保持时间可以是约20分钟至约100分钟，优选为约30分钟至约60分钟；温度上升可以持续约1分钟至约5分钟，例如，约3分钟，
-使用物质的化学休克，该物质用于诱导用于产生化学应激蛋白的目的的应激；在可提及的物质中可以由以下制备：醇类例如乙醇(通常使用浓度为约10体积％至约50体积％)；化学疗法中使用的抗肿瘤物质，尤其是如烷基化剂，嵌入剂，例如环磷酰胺、阿霉素，DNA断裂剂，例如，顺铂等这样类型的抗肿瘤物质；在一种实施方式中，使用包括在对于考虑的肿瘤类型为标准的化疗方案中或在应用于患者的方案中使用的药用物质(一种或多种)中的一种或多种或所有；引起接触的时间段的范围可以是约1小时至约48小时，优选为约20小时至约26小时；还可以施加这些化学应激中的至少两种；
-代谢应激，如低氧；pH(尤其是酸化超过pH 6.5)；缺乏对肿瘤细胞的生长或生存有用的物质，例如葡萄糖；缺乏对肿瘤细胞的生长或生存必不可少的物质，例如电解质(钠、钾、钙等的平衡)；还可以施加这些代谢应激中的至少两种；
-这些类型的应激中的至少两种的组合。
可以容易地确定每种应激类型的条件，目标是使这些活细胞应激以便获得应激蛋白的产生，而不诱导肿瘤细胞或肿瘤细胞中的大多数的细胞凋亡或死亡，如上面所描述的。例如，蛋白质印迹和FACS流式细胞术的方法使得可以通过使用针对这些蛋白的抗体来监测特定的应激蛋白，例如，HSP的产生。这样的抗体是可用的，如以下关于HSP的一些实例将进一步讨论的。还可以通过体外常规测试(例如剂量-效应测试)检测应激的条件是否太过激烈，从而导致肿瘤细胞的死亡。
根据特性特征，当施加多于1种应激时，优选地连续施加这些应激。优选地，施加第一种应激，然后在施加后续应激之前随后观察停滞期，并且根据应激的数量以此类推。有利地，在第一种应激之后进行离心，然后清洗、离心，随后添加新鲜培养基，停滞期，然后施加后续应激等。
根据本发明的方法的一个特性特征，可以确认抗性因子或应激蛋白的表达或产生，甚至对其进行量化。本领域技术人员可任意使用能够实现这一点的方法，例如，通过流式细胞术分析，例如，FACS、ELISA、蛋白质印迹等。本领域技术人员可以从这些类型的应激蛋白在特定家族中的成员资格确认这些类型的应激蛋白的表达或产生，甚至识别并定量特定的类型。
根据本发明的方法的特性特征，步骤iii)之后可以是步骤iii-i)，其中根据以下情况(modalities)中的一种或多种处理前一个步骤产生的结果：固体和蛋白质物质(包括应激蛋白和肿瘤细胞及其碎片)的浓度，应激蛋白或肿瘤细胞的分离或纯化，肿瘤细胞和应激蛋白的分离或纯化，应激蛋白的提取。
根据本发明，应激蛋白可以分为胞内应激蛋白、胞外游离的应激蛋白、膜内应激蛋白(细胞或细胞碎片)、细胞或细胞碎片的表面的应激蛋白。一般来讲，应激的癌细胞包括胞内应激蛋白和表面应激蛋白。
根据方法的重要特性特征，在步骤iv)中，执行使得可以给予所述应激蛋白免疫原性或免疫活性的处理过程，也就是说，能够在体内产生针对这些应激蛋白的免疫应答的处理过程。
施加所述应激的步骤结束与后续步骤的开始之间的时间间隔足以使所述肿瘤细胞产生所述应激蛋白。通过改变所述时间间隔并且确定或测量应激蛋白的表达变化可以确定此时间间隔。例如，可以采用使用待监测蛋白的特异性抗体(见下文)的蛋白质印迹和流式细胞术(例如，FACS)的方法。此时间间隔优选为几个小时，并且它可以特别地包括约5小时至约24小时。此时间间隔可以小于5小时，通过使用本文所述的方法，蛋白质印迹和FACS流式细胞术，通过监测应激蛋白的产生可以确定时间间隔。时间间隔也可以大于24小时，但是这么长的时间段可能没必要，通过使用上述措施的方法也可以容易地确定时间间隔。
根据本发明，提供给予所述应激蛋白免疫原性的手段的分子被引入到由iii)或iii-i)产生的产物中。此步骤iv)在体外提供了例如使所述分子与存在的蛋白化学键合的能力，而不论存在的蛋白是游离的还是存在于细胞膜或细胞结构(例如肿瘤细胞或肿瘤细胞碎片)的表面或内部。通常，例如半抗原化的分子是肿瘤细胞或其环境中非天然存在的分子(“非天然出现的分子”)。
本领域技术人员知道可以给予蛋白(特别是半抗原化蛋白)免疫原性并且可以因此无困难地实施此步骤的程序。其是通过使免疫原性分子(“载体”)和与此分子以共价方式键合的半抗原(在这种情况下可用的是应激蛋白)结合而使半抗原具有免疫原性的手段。
可以使用任何载体分子或已知载体分子的混合物。举例来说，可以提到：二硝基苯基、2,4-二硝基氟苯(DNFB)、磺胺酸、N-碘代乙酰基-N'-(5-磺酸-萘基)乙二胺(EDA)、苯胺、对-氨基苯甲酸以及它们的混合物。本领域技术人员可以参考K Landsteiner的作品(血清学反应的特异性(Specificity of Serological Reactions),1945,Chap.V,HarvardUniversity Press)。“载体”分子能够穿透细胞膜并且到达细胞溶胶。在本发明中，游离的应激蛋白、胞内应激蛋白以及与细胞膜结合的这些应激蛋白被半抗原化。
半抗原化步骤包括在体外温育应激的细胞和载体分子。通常，温育可以持续约15分钟至约1小时，特别是约20分钟至约40分钟。
此步骤优选地在轻微搅动下进行并且提供了将细胞保持在悬浮中或处于一定搅动条件下的能力。
根据本发明的方法的一个特性特征，用于给予所述蛋白免疫原性(例如半抗原化)的步骤的步骤iv)之后可以是步骤iv-i)，其中根据以下情况中的一种或多种处理前一个步骤产生的结果：固体和蛋白质物质(包括应激蛋白和肿瘤细胞及其碎片)的浓度，应激蛋白或肿瘤细胞的分离或纯化，肿瘤细胞和应激蛋白的分离或纯化，应激蛋白的提取。
根据应激的性质及其强度，所述肿瘤细胞可以或多或少地分解或成碎片。本发明的主要目的不是使这些细胞分解或成碎片，而是使它们表达它们的整套(panoply)应激蛋白。这表示一定比例的肿瘤细胞可以保持有生存力。
根据本发明的另一个特性特征，这就是为什么可以提供用于使有生存力的细胞灭活的目的的步骤。被称为灭活步骤的此步骤在施加应激的下游并且在足以使细胞表达应激蛋白的时间段之后进行。
根据第一种实施方式，从用于给予蛋白免疫原性的步骤的步骤iv)或步骤iv-i)获得的产物可以被处理，特别是被灭活，(步骤v))，以便使可能存在的肿瘤细胞不可增殖。
根据第二种实施方式，从应激步骤获得的产物可以被处理，特别是被灭活，(步骤v))，以便使可能存在的肿瘤细胞不可增殖。在这种情况下，灭活处于步骤ii)与iv)之间。
可以采用本领域技术人员已知的任何灭活处理，条件是该灭活处理确保当组合物被给药于患者时使肿瘤细胞失去它们在体内增殖的能力的手段。可以特别地通过化学处理过程(乙醇固定)或通过物理处理过程，例如，大剂量辐射(例如，约25戈瑞)，实现这种灭活。通过执行细胞培养测试可以确定用于灭活的正确条件，以便确定引起全部失去生存力的条件。还可以使用提供区分活细胞和死细胞的能力的碘化丙啶，如本领域技术人员所已知的。例如，还可以使用碘化丙啶进行测试，随后进行培养，如下文所述。
根据本发明的另一个特性特征，从步骤iv)或步骤v)获得的产物通过以下方式配制：使给予免疫原性的产物(半抗原化蛋白物质和/或半抗原化细胞和/或半抗原化细胞碎片)与药用溶媒或赋形剂和可能的佐剂混合。优选地，该步骤包括使药用溶媒或赋形剂和佐剂混合。
该方法提供了制备药物组合物的能力，该药物组合物包括在施加到肿瘤细胞的应激的条件下由肿瘤细胞表达的应激蛋白中的多种或所有或大部分。这构成获得的结果产物的第一个优点，该结果产物通过代表多种应激蛋白，使得药物组合物包含给予免疫原性的各种各样的应激蛋白，患者的免疫系统将能够与这些应激蛋白反应，然后靶向整组肿瘤细胞，并且抵消在免疫系统和/或施加的处理的压力下由这些肿瘤细胞不同地发展的抗性机制。
为了使得能够响应各种不同的应激并且维持蛋白环境，将要经历应激的产物优选地由全肿瘤细胞组成。步骤i)中使用的肿瘤细胞可以是：从活组织检查获得的，可能经过培养或维持存活，可能来自各种不同患者的池的患者细胞，特别是异源细胞(相同的细胞类型)；来自患者的细胞(自体细胞)；来自预建立的细胞系或从患者细胞产生的异源细胞，或这些细胞的混合物；这些不同类型的细胞的混合物。
在一种特别合适的实施方式中，这些全细胞有利地来自细胞系，并且特别地来自与待治疗的患者的肿瘤相同类型的细胞系(异源细胞)。这些细胞受到应激因子之一的“刺激”，从而使抗性因子能超表达。例如，细胞系可以在其培养期间经历热休克、化学试剂、辐射、代谢应激或这些应激中的多种。从应激方案获得的“刺激的”细胞系或原始的未处理的产物或处理的产物然后被给予免疫原性以便使免疫系统能识别应激蛋白。为了具有抗性因子的最佳代表性，可以使用几种细胞系，特别是异源细胞系。
在一种实施方式中，来自肿瘤细胞的相同群体，多组细胞经历各种不同的应激。例如，可以使细胞的第一部分经历选自上述应激方案中的一种类型的应激方案，然后使细胞的第二部分经历其他应激方案中的一种(应激的性质可以相同或应激的性质相同但是在相同的条件下)等。这些肿瘤细胞然后可以以成套试剂盒的形式用于给药，给药可以是同时的、分开的或交错的。也可以将所述肿瘤细胞混合。制备可以使用的药物组合物，该药物组合物包含根据施加的应激类型和/或应激条件(例如，辐射应激、热应激、化学应激、代谢应激等)对每种抗性机制潜在地具有特异性的应激蛋白。
在一种实施方式中，该方法应用于异源肿瘤细胞的混合物，也就是说，相同的肿瘤类型，或通过变体形式，该方法单独地应用于异源肿瘤细胞的至少两个群体，然后将获得的已经给予免疫原性的产物混合以便构成药物组合物。本发明因此使得能够提供这样的方案，该方案允许基于肿瘤细胞的类型用于靶向方法，也就是说，使用不同的细胞类型，但是所有的细胞源自同种类型的肿瘤以便加强对由相同的一种给定类型的细胞(异源细胞)的所有这些细胞表达的或由某些肿瘤细胞特异性表达的抗性因子的共同的免疫反应。
在另一种实施方式中，为了维持患者的肿瘤的特异性蛋白环境，从此肿瘤获得的细胞(自体细胞)维持在培养基中，从而提供其生存力和/或生长，然后经历引用的一种(或多种)应激。因此刺激的自体细胞例如在后续半抗原化期间表达应激蛋白，然后应激蛋白被给予免疫活性。
在此实施方式中，该方法应用于自体肿瘤细胞的混合物，也就是说，源自待治疗的患者的肿瘤细胞，或作为变体，该方法单独应用于自体肿瘤细胞的至少两个群体。该肿瘤细胞然后可以以成套试剂盒的形式用于给药，给药可以是同时、分开的或交错的。也可以将该肿瘤细胞混合。本发明因此使得能够提供对已发展肿瘤的个体特异性的个性化治疗方法，以便通过使用自体细胞维持对患者的肿瘤特异性的抗性因子和蛋白环境。
在另一种实施方式中，前面的方案与自体细胞和异源细胞的成套试剂盒或混合物结合，并且自体细胞和异源细胞优选地彼此异源，或与根据本发明的方法给予免疫原性的其产物的混合物结合。
当从患者的肿瘤细胞工作时，优选的是从活组织检查或切除术分离的细胞开始。
优选地，包含免疫原性应激蛋白的组合物，和/或，优选地，灭活的肿瘤细胞是冷冻的或冻干的。
2.根据本发明的组合物
本发明的目的因此还涉及一种通过本发明的方法可以获得或生产的组合物。
本发明的组合物的特征在于，其包含根据本发明给予免疫原性，特别是半抗原化的应激蛋白。该组合物的特征也可以是，它包含作为响应于根据步骤ii)的应激已经产生应激蛋白的那些肿瘤细胞，特别是已经通过所述方法产生的肿瘤细胞和/或这些细胞的碎屑或碎片。该组合物可以包含免疫原性应激蛋白，特别是半抗原化的，游离的和/或免疫原性应激蛋白，特别是存在于肿瘤细胞或其碎片的表面上或内部中的半抗原化的应激蛋白。优选地，本发明的组合物包括灭活的肿瘤细胞以及特别地半抗原化的免疫原性的应激蛋白。
这些组合物包含由于施加到肿瘤细胞的应激而产生的，由肿瘤细胞在体外表达的应激蛋白中的多种或所有或大部分，并且这些应激蛋白为免疫原性形式，特别是半抗原化的。特别地，当谈到“应激蛋白”时，指的是至少两种不同的应激蛋白，优选为2、3、4、5、6、7、8、9或10或甚至更多种应激蛋白，这根据细胞类型以及体外施加的一种或多种应激而变化。
在各种实施方式中，该组合物包含一种或多种热休克蛋白，特别是选自上述热休克蛋白的热休克蛋白，例如，HSP 27、HSP 70或HSP 90；HSP 27、HSP 70和HSP 90；HSP 27和HSP 70；HSP 90和HSP 27；HSP 90和HSP 70。在这些组合物中，这种或这些HSP被给予免疫原性，特别是被半抗原化。
在其他实施方式中，该组合物包含具有多重抗药性的一种或多种蛋白，特别是具有抗化疗性的蛋白(MRP、多药抗性相关蛋白)，例如，GP 170、MPR(七种不同的蛋白)、LRP和/或VMP1。
在其他实施方式中，该组合物包含具有抗辐射性的蛋白或者甚至具有抗代谢应激性的蛋白。
在其他实施方式中，该组合物包含GRP，例如，GRP 78(BiP)、GRP 75和/或GRP 94。
根据本发明的教导，该组合物可以包含这些类别中的几种的应激蛋白。
本发明更特别地涉及包含被给予免疫原性，优选地被半抗原化的应激蛋白的药物组合物或治疗性疫苗或免疫原性组合物。
这些应激蛋白可以是游离状态，与肿瘤细胞的膜相关的状态(包含膜内)，存在于肿瘤细胞的表面上，存在于肿瘤细胞的内部中，和/或与肿瘤细胞的碎片或肿瘤肽相关。
根据一个特性特征，该组合物包含被给予免疫原性，优选地被半抗原化的应激蛋白。
根据另一种特性特征，该组合物包含响应于根据步骤ii)的应激已经产生应激蛋白的那些肿瘤细胞，包括灭活的肿瘤细胞。这些细胞可以包括并且有利地包括根据本发明被半抗原化或者被给予免疫原性的胞内应激蛋白。这些胞内免疫原性应激蛋白在体内特别地通过抗原呈递细胞呈递给免疫系统。
更具体地讲，该组合物包含含有和/或载有免疫原性应激蛋白(优选为半抗原化的免疫原性应激蛋白)的肿瘤细胞和/或这些细胞的碎片。
根据一个特性特征，该组合物包含游离的并且优选地被半抗原化的免疫原性应激蛋白以及含有和/或载有免疫原性应激蛋白(优选为半抗原化的免疫原性应激蛋白)的肿瘤细胞和/或这些细胞的碎片两者。
对于用作能够给药于患者的产物，使这些细胞不能增殖，这被称为灭活。
该组合物还可以包含药用溶媒或赋形剂。
在一种实施方式中，该组合物包含：优选地被半抗原化的免疫原性应激蛋白的群体和/或包含已经经历第一种应激方案的这样的蛋白的细胞；以及优选地被半抗原化的至少一种其他的免疫原性应激蛋白的群体和/或包含已经经历另一种应激方案的这样的蛋白的细胞。
在一种实施方式中，该组合物包含：优选地被半抗原化的免疫原性应激蛋白的群体和/或包含这样的蛋白的细胞；以及优选地被半抗原化的至少一种其他的免疫原性应激蛋白的群体和/或包含这样的蛋白的细胞，这些群体源自初始异源肿瘤细胞并且这些细胞已经作为混合物或单独地经历一种应激方案。
在一种实施方式中，该组合物包含从初始的自体肿瘤细胞获得的免疫原性应激蛋白和/或包含这样的蛋白的细胞，所述应激蛋白优选为半抗原化的应激蛋白。
在一种实施方式中，该组合物包含优选为半抗原化的免疫原性应激蛋白和/或包含这样的蛋白的细胞，所述蛋白是异源的且自体的。
在一种实施方式中，该组合物包含优选为半抗原化的免疫原性应激蛋白和/或包含这样的蛋白的细胞，所述蛋白是异源的且自体的，用于同时、单独或交错的给药。该组合物可以由已经给予免疫原性的多剂量应激蛋白和/或包含已经给予免疫原性的异源应激蛋白的细胞，特别是源自不同细胞系(1,2,3,...系)的细胞，以及已经给予免疫原性的多剂量应激蛋白和/或包含已经给予免疫原性的自体应激蛋白的细胞组成。
根据本发明的组合物可用作抗癌药物。
根据一个特性特征，所述组合物可用作给药于已经接受抗癌治疗的患者的抗癌药物。如本文所述，这种治疗将会引起应激以及因此产生应激蛋白。该患者因此载有呈递应激蛋白的肿瘤细胞。
根据另一个特性特征，所述组合物用作给药于正在或即将接受抗癌治疗的患者的抗癌药物。如本文所述，这种治疗很可能引起应激以及因此产生应激蛋白。正在进行治疗的患者已经具有或疑似具有呈递应激蛋白的肿瘤细胞。
根据一种特性特征，该组合物额外包含佐剂。
佐剂是通过增加疫苗的功效来发挥作用的物质。当此物质与此特异性免疫原结合使用时，此物质可以通过加速、延长和/或增强对免疫原特异性的免疫应答来发挥作用。本领域技术人员可以特别参考疫苗佐剂最近进展(Recent Advances in VaccineAdjuvants)(Singh M&O'Hagan DT,Pharmaceutical Research 2002,Volume 19,issue 6,pp 715-728)。在可使用的佐剂中，可以提到细胞因子和其他免疫调节分子(也就是说，趋化因子和共刺激因子)、源自微生物和植物或化学合成的佐剂物质。根据它们的性质，佐剂可以不仅充当免疫刺激佐剂，而且充当疫苗递送系统。这些递送系统通常是微粒，并且可以提到，特别是，乳状液、微粒(例如，基于聚交酯-乙交酯，PLG)、ISCOM、脂质体，它们主要用于将免疫原定向并引导到抗原呈递细胞。至于免疫刺激佐剂，它们主要是激活免疫系统的微生物来源的分子，例如，脂多糖、单磷酰基脂质A、CpG DNA。佐剂还可以用于通过粘膜途径递送，例如，细菌肠毒素，特别是来自大肠杆菌的细菌肠毒素、不耐热肠毒素、脱毒突变体，例如K63或R72。
除了别的以外，有代表性的可用的佐剂可以提到：氢氧化铝、皂苷(例如，皂树皂苷或Quil A；参见疫苗设计，亚基和佐剂方法(Vaccine Design,The Subunit and AdjuvantApproach),1995,edited by Michael F.Powell and Mark J Newman,Plennum Press,NYand London,p 210)、
Figure BDA0003112484670000171
(疫苗设计第148页)、DDA(二甲基双二十八烷基烷基溴化铵，疫苗设计第157页)、聚磷腈(疫苗设计第204页)、水包油乳状液，特别是包含矿物油、角鲨烷(例如SPT乳状液，疫苗设计第147页)或角鲨烯(例如MF59，疫苗设计第183页)的水包油乳状液，油包水油乳状液，特别是包含可代谢油(特别参见WO9420071)的油包水乳状液、根据US 5,422,109的乳状液或三重乳状液，例如，水包油包水(water-in-oil-in-water)乳状液。
术语“药用的”用于指代用于在产品的保藏期间保留产品的特性特征的同时还可以将免疫原给药于患者而没有任何过敏或其他不良反应的风险的溶媒或赋形剂。它单独地或以混合物的形式包括，例如，水、盐水溶液、磷酸盐缓冲液、蛋白化合物、葡萄糖、蔗糖、甘油、二甲基亚砜、乙醇等。可以提到，例如，含0.9％NaCl的盐水溶液、磷酸盐缓冲液、基于商购可获得的防腐液的混合物。
在一种实施方式中，根据本发明的组合物旨在被冷冻，特别是在-20℃至-80℃下冷冻。然后向组合物添加至少一种低温防护剂，和/或以普通方式制备该组合物以便使其在不对其成分(特别是肿瘤细胞)造成损坏的情况下耐受冷冻。
在另一种实施方式中，根据本发明的组合物旨在被冻干(冷冻干燥)。然后可能需要的是，增加至少一种常用的用于冻干的赋形剂。
溶媒或赋形剂的组合物和/或佐剂的选择可以根据给药的途径而变化，如本领域技术人员所熟知的。
3.用途和治疗方法
本发明开发的产品可以具有一种可变的组合物，然而迄今为止，它具有的例如可以保留的特性特征，那就是它包含已经通过使活的肿瘤细胞经历一种或多种受控的应激而在体外诱导的应激蛋白，这些应激蛋白由于这些肿瘤细胞响应于应激超表达而具有高的浓度水平，并且通常这些应激蛋白具有多种类型，终产物中可以给药于患者的这些应激蛋白被半抗原化或者说是被处理以便使它们具有免疫活性(免疫原性)。
本发明的原理基于免疫系统通过已经给予免疫活性(免疫原性)，例如，被半抗原化的应激蛋白的存在刺激之后发展针对肿瘤细胞的抗性因子(应激蛋白)的特异性应答的容量和能力。消除肿瘤细胞的免疫反应完成在此前的治疗期间开始的活动(根据本发明的组合物的佐剂活动)，或使得能够激活免疫应答作为主要治疗。
本发明的目的还涉及一种治疗性治疗的方法。该方法包括给药有效量的根据本发明的组合物以便引起免疫应答。
给药的剂量例如可以包括105至107个细胞/剂量，特别是至少106±0.5个细胞/剂量。在源于肿瘤的碳(TOC)或就蛋白量化而言，这种细胞的量可以表示成总的肿瘤细胞。
剂量方案可以包括随时间变化分开的一种或多种剂量给药。例如，该方案可以提供在每次给药之间以1天至10天的间隔，间隔给药2、3、4、5、6、7、8、9或10次。
可以采用任何给药途径。因此，可以引用的途径包括口服给药途径、经鼻给药途径、直肠给药途径和非肠胃给药途径。优选非肠胃给药途径，特别是经由肌内注射、静脉注射、腹膜注射、皮下注射和皮内注射。特别地选择皮内注射。
治疗可以用给药任何类型的免疫刺激剂来补充，因此提供增强治疗(细胞因子、生长因子、免疫调节剂、佐剂....)，不论是否已经辅助的治疗组合物。
用于治疗的方法可以包括根据本发明的治疗与以下常规抗癌治疗方案的结合：手术、放射疗法、化学疗法和/或免疫疗法。在一种或多种这些方案之前、期间或之后，将根据本发明的组合物给药于患者。关于免疫应答的诱导，然而，有利的是，在常规方案之前或期间，优选在常规方案之前，给药根据本发明的组合物。
特别可行的是，设想使用已经表达与未来的规治疗有关的应激蛋白的异源细胞系治疗患者，以便提前刺激免疫系统，从而获得针对体内潜在地表达的应激蛋白的应答并且抑制对常规治疗的抗性。例如，根据本发明的组合物的给药在辐射疗法治疗之前包括辐射诱导的应激蛋白和/或表达辐射诱导的应激蛋白的细胞和/或根据本发明的组合物的给药在用抗癌治疗性分子进行化学疗法治疗之前包括，通过优选地使用抗癌治疗性分子作为应激的引发剂，化学诱导的应激蛋白和/或表达化学诱导的应激蛋白的细胞。
附图说明
现在将在通过非限制性实施例的方式提供的实施例的帮助下并且参照附图更加详细地描述本发明。
图1是示出了通过热应激诱导HSP 70表达的蛋白质印迹。为了确保容易阅读，已经圈出了主要的校准点和HSP 70点，后者用附图标记1表示。
图2是示出了通过热应激诱导HSP 70和HSP 70的半抗原化的蛋白质印迹，与对β-肌动蛋白对照进行的蛋白质印迹并行。为了确保容易阅读，已经圈出了主要的点。识别附图标记：HSP 70：(2)；半抗原化的HSP 70：(3)；β-肌动蛋白：(4)；半抗原化的β-肌动蛋白：(5)；分子量标准参照物：(6)；在37℃下处理1小时的CT26WT细胞：(7)；在42℃下处理1小时的CT26WT细胞：(8)；应激的、半抗原化且辐射的疫苗剂量：(9)；分子量标准参照物：(10)；在37℃下处理1小时并且在37℃下处理14小时的CT26WT细胞：(11)；在42℃下处理1小时并且在37℃下处理14小时的CT26WT细胞：(12)；应激的、半抗原化且辐射的疫苗剂量：(13)。
图3和图4是各自均代表被注射赋形剂(“Veh”代表“载体”)的对照小鼠与用根据本发明的疫苗(“The”代表“治疗剂”)处理的小鼠之间的小鼠中诱导的肿瘤体积随时间不断变化的曲线图。
图5和图6是示出了，针对图1和图2中表示的相同的组，在进行切除术时在小鼠中诱导的肿瘤的重量(以g计)(“Veh”代表“载体”或赋形剂；“The”代表“治疗剂”)。
实施例
实施例1：用于生产异源剂量的方法：
·细胞系
这些细胞系源自商购可获得的预建立的细胞系(ATCC类型)或由源自患者样品的细胞系组成得到的，经过表征并检测。举例来说，使用的细胞系包括用于卵巢癌的治疗靶点的Caov、OVCAR-3、ES-2和OV-3。在推荐的条件下对它们进行单独培养。
·患者细胞
从患者分离患者细胞，在培养基中并且在合适的条件下进行培养。
来自细胞系和患者的细胞在它们的成长期或它们的平台期过程中经历应激以便能够超表达抗性因子(应激蛋白)。
施加的应激类型：
·照射2戈瑞
·热休克：温度上升至40℃-43℃，维持30至60分钟
·用乙醇、环磷酰胺、阿霉素或顺铂进行化学休克。
借助流式细胞术、ELISA或蛋白质印迹确认一种或多种抗性因子的表达。特别地，通过使用抗HSP抗体(抗-人HSP 27-FITC；抗-人HSP 60-PE、抗-人HSP 72-FITC；抗-人HSP90-PE)的流式细胞术。
异源细胞表达的抗性因子(应激蛋白)用二硝基苯基(Dinitrophelyl)进行化学标记或标签。作为一种变型，可以使用磺胺酸、N-碘代乙酰基-N'-(5-磺酸-萘基)乙二胺(EDA)、苯胺或对-氨基苯甲酸。
包含半抗原化应激蛋白的异源细胞然后通过高剂量辐射(25戈瑞)给予非增殖性。作为一种变型，可以使用10体积％至50体积％的乙醇固定，或在维持细胞结构完整的同时提供用于抑制细胞增殖的任何其他方法。
异源来源的半抗原化细胞应激蛋白以细胞悬浮液的形式分布在配制培养基中，该配制培养基适用于治疗用途并且允许其在低温(-20℃，-80℃)下保存，然后以包含与蛋白量“HSP阳性”和/或有机物量表达的治疗剂量对应的1至5×106个灭活且半抗原化的细胞/剂量的剂量进行分配。可以存在免疫佐剂，例如，BCG、GM-CSF、IL2。
实施例2：用于生产自体剂量的方法：
细胞得自在切除术之后的患者肿瘤。生物材料在确保细胞的最佳生存力的同时使细胞可以保存的特殊试剂盒中运输。
活组织检查的细胞通过合适的机械方法离解，然后放置于仅供细胞生长或生存的营养培养基的悬浮液中。
按原样使用肿瘤细胞或者在通过细胞分选进行选择之后使用肿瘤细胞。
增殖期或静止期中的肿瘤细胞经历如在异源细胞的生产中定义的应激。
根据如实施例1所述的合适的分析方法确认一种或多种抗性因子的表达。
由自体细胞表达的抗性因子(应激蛋白)通过与针对实施例1的异源细胞所述的方法类似的方法进行化学标记。
包括半抗原化的应激蛋白的自体细胞通过与针对实施例1的异源细胞所使用的方法相同的方法被给予非增殖性。
整合到自体细胞中的半抗原化应激蛋白以细胞悬浮液的形式分布在配制培养基中，该配制培养基适用于治疗用途并且提供这些半抗原化应激蛋白的保存，然后以治疗剂量分配。
实施例3：治疗方法：
治疗性治疗方案包括将以下各项给药：
-一种或多种异源或自体剂量；或
-一种或多种异源和自体剂量，共同或顺序给药。
产品的给药通过皮内注射的方式。还可以使用另一种给药途径，特别是口服。
该产品单独地或与使得治疗强化的任何其他疗法协同地给药。
实施例4：HSP的生产：
CT26-WT细胞系是小鼠结肠癌细胞系，可根据
Figure BDA0003112484670000211
CRL-2638TM获得。细胞容易且迅速生长(倍增时间为22小时)。
HL60细胞系是可得自Sigma-
Figure BDA0003112484670000212
的人细胞系(白人早幼粒细胞白血病)。细胞在增殖之后冷冻。
以冷冻形式接收原始细胞。细胞经过解冻，然后将它们放入合适的培养基中在烧瓶中进行培养。在第D+1天更换培养基。在增殖之后，对活细胞进行计数，然后将浓度调节到约2×106个活细胞/毫升培养基。回收200×106个细胞的池，然后在确认细胞在大约50％融合之后进行清洗。悬浮液然后分入到50ml管中，基于每个管25ml。然后将管浸入到加热至42℃的水浴中。使管在水浴中保持约1小时。然后以2×106个细胞的速率将细胞转移到烧瓶中。此后，细胞在37℃下温育14小时。然后将细胞浓度调节到5×106活细胞/毫升。
然后用0.07％的2,4-二硝基氟苯(DNFB)溶液半抗原化细胞。用FACS标记来显示半抗原化。FACS流式细胞术被选择为分析技术，它提供了给出半抗原化的细胞相对于总的细胞数的百分比的能力。
用冷冻的培养基将细胞悬浮液调节到2至5.106个细胞/毫升的浓度，并且储存在-80℃±3℃的冷冻机中，在检测之前最少存放24小时。
然后，冷冻的细胞经历25戈瑞的X射线辐射，以便灭活肿瘤细胞。
使用两种标准技术检测HSP或半抗原化HSP的表达；凭借对待检测蛋白特异性的抗体，这些相同的技术可以用于检测任何应激蛋白：
-使用对待检测的HSP特异性的抗体进行蛋白质印迹。
-在通过使用特异性抗体标记胞内HSP之后的流式细胞术(FACS，荧光激活细胞分选)。
-特异性抗体，可以使用商购可获得的抗HSP-27抗体、抗HSP 70抗体、抗HSP 90α/β抗体。根据使用的技术，可以进一步使用就其本身而言已知的额外的抗体，小鼠IgG1、结合FITC的绵羊抗-小鼠IgG、对照抗体(抗-KLH-FITC)，DNFB特异性的抗体(抗-TNP FITC)。可使用的市售的抗体可得自Santa Cruz Biotechnology Inc.和BD Biosciences。
对于流式细胞术，解冻半抗原化细胞，随后将它们进行清洗，并且浓度从1×106个细胞/毫升调节到2×106个细胞/毫升。将以下各项置于V型底的96孔板中：
·两孔中5μl对照抗体(抗KLH FITC)，
·两孔中5μl抗体(抗TNP FITC)。
随后每个孔中添加100μl半抗原化细胞悬浮液，将该板在+5℃±3℃下温育15分钟。此后清洗细胞，并且将细胞悬浮液转移到管中，用于通过“FACS Calibur”。根据提前用对照固定的参数通过“DNP-FITC"管。
结果：
1.CT26-WT细胞系：
与在37℃下维持1小时的相同细胞系相比，在蛋白质印迹中，在约70kD处(图1)看到一条带，与根据上述方案在42℃下的应激的细胞中的HSP70对应。
2.HL60细胞系：
在通过以上提及的特异性抗体对HSP 27、70和90进行胞内标记之后，通过流式细胞术进行对照细胞(37℃，1小时应激时间+37℃，14小时恢复时间)和应激的细胞(42℃，1小时应激时间+37℃，14小时恢复时间)的分析。
结果：
Figure BDA0003112484670000231
记录在应激的细胞中HSP，更具体地，HSP 27和70的超表达。
实施例4：动物测试
肿瘤剂量的生产包括使CT26.WT细胞增殖，随后在补充5％DMSO的培养基中冷冻，比率为最终250μl中6.25×104个细胞。
疫苗剂量的生产包括使CT26.WT细胞增殖，然后在两次传代之后，细胞在42℃下经历1小时热应激，随后在37℃下经历14小时的恢复时间。然后，细胞被半抗原化(通过DNFB，二硝基氟苯)，然后基于最终250μl中6.25×105个细胞在-80℃下冷冻，最后照射(25戈瑞)疫苗剂量。
对肿瘤剂量和疫苗剂量进行对照：
肿瘤剂量(动物中肿瘤的产生)：
-血液培养物的灭菌→阴性血液培养物
-内毒素对照→内毒素≤200IU/ml
-细胞数量和肿瘤剂量的生存力的对照→包括的量为5.5×105至6.95×105个细胞，生存力≥95％。
疫苗剂量：
-血液培养物的灭菌→阴性血液培养物
-内毒素对照：2→内毒素≤200IU/ml
-使用抗KLH-TNP抗体标记FACS半抗原化的对照：→半抗原化％≥96％
-肿瘤剂量的细胞数量的对照：→量为5.96×105至6.10×105个细胞
-使用以上提及的特异性抗体对HSP的表达进行流式细胞术的对照：→检测HSP27、70和90的表达。
-使用以上提及的特异性抗体对HSP的检测进行蛋白质印迹的对照：→图2示出了在热应激之后的HSP 70点和半抗原化HSP 70点。
-生存力测试，以便确保疫苗组合物的细胞不增殖：添加碘化丙啶+投入培养；确认构成疫苗剂量的细胞缺乏增殖能力。
实施例5：小鼠体内研究
使用得自Charles River的6至8周龄的BALB/c雄性和雌性小鼠。将5只小鼠放入16×19×35cm的温控笼(22±2℃，交替照明条件(照明12小时，黑暗12小时循环)中，并且随意饮水和进食。在开始实验之前，使小鼠适应环境至少1周。
肿瘤模型是皮下CT26恶性肿瘤(CT26WT，
Figure BDA0003112484670000241
CRL-2638TM)，它是用于研究针对动物癌症的治疗应用，特别是用于测试免疫疗法方案并且研究免疫应答所常用的同基因肿瘤模型。
50只雌性小鼠分成5组，每组10只。在第0天(D0)对每只小鼠皮下(SC)注射5×104个CT26WT肿瘤细胞。治疗方案如下：
-第1组：赋形剂
-第2组：治疗性治疗1
-第3组：治疗性治疗2
在第+2天对第2组和第3组通过腹膜内途径(IP)注射15mg/kg施用环磷酰胺。
第2组的治疗1(BCG IL-2/疫苗)：
-每次皮下注射BCG：2×106CFU(菌落形成单位)
-每次皮下注射重组鼠科IL-2：4 000IU
-通过皮下注射疫苗：5×105CT26WT细胞(辐射并半抗原化)
第3组的治疗2(BCG/GM-CSF/疫苗)：
-通过皮下注射BCG：2×106UFC
-通过皮下注射重组鼠科GM-CSF：25 000IU(国际单位)
-通过皮下注射疫苗：5×105CT26WT细胞(辐射并半抗原化)
方案：
Figure BDA0003112484670000251
在研究过程中测量的参数以及其他规范：
-每天监测小鼠的行为。
-每周监测3次体重和肿瘤体积。使用公式：体积＝[(宽度)2×长度]/2计算肿瘤体积(mm3)。在卡尺的帮助下测量尺寸。
-小鼠在出现意外痛苦体征时被处死。
-当肿瘤达到1000m3时且无论如何在植入肿瘤后不超过40天将小鼠处死。切除肿瘤并测量。
随时间变化的肿瘤体积(以mm3计)的测量结果显示了与对照小鼠相比，两种治疗性疫苗T1和T2的有利影响，参见图3和图4。
在切除术之后的肿瘤的重量的测量结果显示了与对照小鼠相比，疫苗T1和T2的有利影响，参见图5和图6。

Claims (16)

1.一种用于制备包含肿瘤细胞应激蛋白的组合物的方法，所述方法包括以下步骤：
i)将肿瘤细胞置于培养基中；
ii)使i)中的肿瘤细胞在体外经历应激并且确保这些细胞响应于所述应激产生应激蛋白的结果；
iii)获得或回收应激的肿瘤细胞和应激蛋白；
iv)用能够给予所述应激蛋白免疫原性的分子或过程处理在iii)中获得的所述应激的肿瘤细胞和应激蛋白；
其中所述肿瘤细胞在步骤ii)、iii)或iv)之后被灭活。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，在步骤ii)中，所述肿瘤细胞处于生长期或平台期。
3.根据权利要求1或2所述的方法，包括步骤iv)，其中，所述应激的肿瘤细胞和/或应激蛋白被半抗原化。
4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述细胞在选自由以下分子所组成的组中的分子的存在下在体外温育：二硝基苯基、2,4-二硝基氟苯(DNFB)、磺胺酸、N-碘代乙酰基-N'-(5-磺酸-萘基)乙二胺(EDA)、苯胺、对-氨基苯甲酸。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中，所述应激选自由辐射、热休克、化学休克和代谢应激所组成的组。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中，在步骤i)中的所述肿瘤细胞包括来自预先建立的细胞系的异源细胞、来自患者的原始细胞系的细胞、来自预先建立的异源细胞系的细胞和/或来自患者的细胞的组合、患者的细胞或来自异源细胞系的细胞和所述患者的细胞的组合。
7.一种组合物，其通过执行根据前述任一项权利要求所述的方法能够获得。
8.一种药物组合物，包含肿瘤细胞应激蛋白和含有半抗原化的应激蛋白的非增殖性肿瘤细胞，以及药用赋形剂。
9.根据权利要求7或8所述的组合物，包含载有或含有半抗原化的应激蛋白的非增殖性肿瘤细胞或这样的细胞的碎片。
10.根据权利要求7至9中任一项所述的组合物，包含细胞系细胞、来自异源细胞系的细胞的组合、来自患者的细胞、或来自异源细胞系的细胞和患者的细胞的组合，这些非增殖性肿瘤细胞载有或含有半抗原化的应激蛋白。
11.根据权利要求7至10中任一项所述的组合物，包含选自由热休克蛋白、抗辐射蛋白、抗化疗蛋白、抗代谢应激蛋白所组成的组中的应激蛋白。
12.根据权利要求7至11中任一项所述的组合物，进一步包含佐剂。
13.根据权利要求7至12中任一项所述的组合物，用作抗癌药物。
14.一种抗癌治疗方法，包括施用有效量的根据权利要求6至10中任一项所述的组合物。
15.根据权利要求14所述的方法，包括施用至少一剂量的105至107个肿瘤细胞。
16.根据权利要求14或15所述的方法，包括在每次给药之间以1天至10天的间隔，间隔给药2、3、4、5、6、7、8、9或10次。
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