CN104136040A - 自体癌细胞疫苗 - Google Patents

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Abstract

自体癌细胞疫苗包含在其细胞表面上表达MHCI和MHCII两者的癌细胞。MHCI呈递癌抗原，且MHCII呈递非自身抗原。根据一个方面，提供了用于制备分离的免疫原性癌细胞的方法，所述方法包括：诱导从受试者分离的癌细胞上MHCII的表达；将所述癌细胞与非自身抗原孵育，使得非自身抗原结合表达的MHCII；和杀死所述癌细胞。

Description

自体癌细胞疫苗
技术领域
本发明涉及癌症的治疗。更具体地，本发明在各个方面涉及分离的和改变的免疫原性癌细胞、包含所述免疫原性癌细胞的免疫原性组合物和疫苗、用于治疗癌症的方法、以及用于制备免疫原性癌细胞、免疫原性组合物和疫苗的方法。
背景技术
在所有脊椎动物中，主要组织相容性复合体(MHC)是由大基因家族编码的细胞表面分子。MHC基因家族被分为三类：I类；II类；和III类。
在机体的每一种有核细胞上发现MHC I类分子。它们的功能是将来自细胞内的胞质蛋白质的片段呈递至细胞毒性T细胞。呈递“自身”肽的细胞将被忽略，而呈递非自身肽的细胞将被细胞毒性T细胞识别并杀死。
仅在抗原呈递细胞(APC)(包括巨噬细胞、树突状细胞和B细胞)上发现MHC II类分子。MHC II类分子将胞外蛋白质的片段呈递至辅助性T细胞。呈递“自身”肽的细胞将被忽略，而呈递非自身肽的细胞将被辅助性T细胞识别，这有助于主要经由产生各种细胞因子而引发适当的免疫应答，这可以包括由于募集吞噬细胞导致的局部炎症和肿胀，或由于B细胞激活导致的抗体介导的免疫应答。
从例如，国际专利申请公开号WO 1995/13092、国际专利申请公开号WO 2001/77301和Berger等人(J.Pharm.Pharmaceut.Sci.,10(2):144-152,2007)已知，干扰素(IFN)可用于增加肿瘤细胞上MHC I类的表达，从而使得细胞可用于癌症疫苗中。然而，用IFN处理之后肿瘤细胞的MHCII表达是高度可变的，其中一些细胞对IFN处理是响应的，而一些对IFN处理不响应。此外，任何表达MHCII的肿瘤细胞只能在MHCI和MHCII的背景下呈递自身或癌抗原。癌抗原不总是免疫原性的，因为许多被识别为自身抗原。在癌症发展和变得更具侵袭性时更是如此。缺乏在MHCII的背景下呈递的高度免疫原性抗原意味着T辅助性细胞不会被活化，并且强烈和稳定的免疫应答不会总是由此产生。
因此，存在对于克服或减轻至少一些现有技术的缺陷的替代疗法的需要。
发明概述
本发明在各个方面涉及分离的免疫原性癌细胞、使用所述免疫原性癌细胞的免疫原性组合物和癌症疫苗、制备此类免疫原性癌细胞、免疫原性组合物和癌症疫苗的方法，以及用于治疗癌症的方法。本发明的组合物和方法涉及已经修饰以在其表面上表达MHCII的分离的癌细胞的用途。一旦癌细胞经修饰以表达MHCII，则通过将MHCII表达细胞与非自身抗原孵育以赋予它们免疫原性。在注入癌细胞由其分离的受试者中之后，以这种方式修饰的癌细胞在MHCI的背景下将癌抗原呈递至CD8+细胞毒性T细胞，并在MHCII的背景下将非自身抗原呈递至CD4+辅助性T细胞。因此，修饰的癌细胞是双功能的，能够活化辅助性T细胞和细胞毒性T细胞两者，导致细胞因子产生并令人惊讶地稳定的和癌症特异性的免疫应答。
可以将以这种方式产生的免疫原性癌细胞掺入免疫原性组合物和疫苗中。此类组合物和疫苗可用于治疗自体受试者的癌症的方法中。
根据一个方面，提供了用于制备分离的免疫原性癌细胞的方法，所述方法包括：
-诱导从受试者分离的癌细胞上MHCII的表达；
-将所述癌细胞与非自身抗原孵育，从而使得非自身抗原结合表达的MHCII；和
-杀死所述癌细胞。
在一个方面，所述方法进一步包括在MHCII诱导后鉴定MHCII阳性细胞。在另一个方面，所述方法进一步包括将MHCII阳性癌细胞与MHCII阴性癌细胞分离，以获得包含MHCII阳性细胞的纯化的组合物。
在另一个方面，所述方法进一步包括从受试者分离癌细胞。在一个方面，在活检程序过程中或在肿瘤的手术去除过程中分离所述细胞。
在另一个方面，所述方法进一步包括冷冻保存癌细胞。
在一个方面，通过致死照射、在不存在冷冻保存剂的情况下冷冻和解冻、或用细胞毒性化合物处理杀死细胞，诸如通过致死照射杀死细胞。
在另一个方面，使用MHCII诱导剂在癌细胞上诱导MHCII。在一个方面，MHCII诱导剂是细胞因子，诸如IFN-α、IFN-β、IFN-γ、IL-4、IL-13、IL-23、TNF-α或其组合，诸如IFN-γ。在另一个方面，MHCII诱导剂是MHCII表达构建体或将与癌细胞融合的MHCII表达细胞。
在另一个方面，非自身抗原是非人抗原。
在另一个方面，非自身抗原选自甲状腺球蛋白、β-半乳糖苷酶、葡聚糖、聚赖氨酸、结核菌素衍生蛋白、卵清蛋白(OVA)、血清白蛋白诸如牛血清白蛋白(BSA)、绵羊血清白蛋白、山羊血清白蛋白、或鱼血清白蛋白和钥孔血蓝蛋白(KLH)及其组合，诸如卵清蛋白或KLH，或诸如BSA。
在另一个方面，所述非自身抗原不是牛抗原如BSA。
在另一个方面，所述诱导步骤是在无BSA的培养基中。
根据另一个方面，提供了在其细胞表面上表达MHCI和MHCII两者的分离的免疫原性癌细胞，其中癌抗原结合所述MHCI且非自身抗原结合所述MHCII。
在一个方面，非自身抗原是非人抗原。
在另一个方面，所述非自身抗原选自甲状腺球蛋白、β-半乳糖苷酶、葡聚糖、聚赖氨酸、结核菌素衍生蛋白、卵清蛋白(OVA)、血清白蛋白诸如牛血清白蛋白(BSA)、绵羊血清白蛋白、山羊血清白蛋白、或鱼血清白蛋白和钥孔血蓝蛋白(KLH)及其组合，诸如非自身抗原是卵清蛋白或KLH，或诸如BSA。
在另一个方面，所述非自身抗原不是牛抗原如BSA。
根据另一个方面，提供了包含在其细胞表面上表达MHCI和MHCII两者的分离的免疫原性癌细胞的免疫原性组合物，其中癌抗原结合所述MHCI且非自身抗原结合所述MHCII。
在一个方面，所述组合物进一步包含至少一种赋形剂、载体、缓冲剂、稳定剂或其组合。
在另一个方面，非自身抗原是非人抗原。
在另一个方面，所述非自身抗原选自甲状腺球蛋白、β-半乳糖苷酶、葡聚糖、聚赖氨酸、结核菌素衍生蛋白、卵清蛋白(OVA)、血清白蛋白诸如牛血清白蛋白(BSA)、绵羊血清白蛋白、山羊血清白蛋白、或鱼血清白蛋白和钥孔血蓝蛋白(KLH)及其组合，诸如卵清蛋白或KLH，或诸如BSA。
在另一个方面，所述非自身抗原不是牛抗原如BSA。
在另一个方面，基于组合物中的总细胞数，所述组合物包含约5％至约100％MHCII阳性癌细胞，诸如至少约50％MHCII阳性癌细胞，至少约90％MHCII阳性癌细胞，或至少约99％MHCII阳性癌细胞。
根据另一个方面，提供了包含在其细胞表面上表达MHCI和MHCII两者的分离的免疫原性癌细胞的自体癌症疫苗，其中癌抗原结合所述MHCI且非自身抗原结合所述MHCII。
在一个方面，所述疫苗进一步包含至少一种佐剂，诸如单磷酰脂质A/合成的海藻糖棒杆菌分枝菌酸二酯(trehalosedicorynomycolate)(MPL-TDM)、AS021/AS02、非离子型嵌段共聚物佐剂、CRL 1005、磷酸铝(AlPO4)、R-848、咪喹莫特、PAM3CYS、聚(I:C)、洛索立宾、卡介苗(BCG)、短小棒杆菌、CpG寡脱氧核苷酸(ODN)、霍乱毒素衍生抗原、CTA 1-DD、脂多糖佐剂、完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂、皂苷、矿物凝胶、氢氧化铝、表面活性物质、溶血卵磷脂、普朗尼克多元醇、聚阴离子、肽、水中的油或烃乳液、MF59、Montanide ISA720，钥孔血蓝蛋白(KLH)、二硝基苯酚及其组合，诸如BCG。
在另一个方面，所述疫苗进一步包含至少一种赋形剂、载体、缓冲剂、稳定剂或其组合。
在一个方面，非自身抗原是非人抗原。
在另一个方面，所述非自身抗原选自甲状腺球蛋白、β-半乳糖苷酶、葡聚糖、聚赖氨酸、结核菌素衍生蛋白、卵清蛋白(OVA)、血清白蛋白诸如牛血清白蛋白(BSA)、绵羊血清白蛋白、山羊血清白蛋白、或鱼血清白蛋白和钥孔血蓝蛋白(KLH)及其组合，诸如卵清蛋白或KLH，或诸如BSA。
在另一个方面，所述非自身抗原不是牛抗原如BSA。
在另一个方面，基于疫苗中的总细胞数，所述疫苗包含约5％至约100％MHCII阳性癌细胞，诸如至少约50％MHCII阳性癌细胞，至少约90％MHCII阳性癌细胞，或至少约99％MHCII阳性癌细胞。
在另一个方面，所述疫苗以用于多次接种的分次剂量，诸如七个分次剂量提供。
在一个方面，每个剂量包含约1x104至约1x109个癌细胞，诸如约1x107个癌细胞。
根据另一个方面，提供了用于治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括向受试者施用分离的免疫原性癌细胞，其中所述细胞对于所述受试者是自体的，且在其细胞表面上表达MHCI和MHCII两者，且其中癌抗原结合所述MHCI且非自身抗原结合所述MHCII。
在一个方面，将细胞配制为免疫原性组合物。在另一个方面，将细胞配制为癌症疫苗。
在另一个方面，非自身抗原是非人抗原。
在另一个方面，所述非自身抗原选自甲状腺球蛋白、β-半乳糖苷酶、葡聚糖、聚赖氨酸、结核菌素衍生蛋白、卵清蛋白(OVA)、血清白蛋白诸如牛血清白蛋白(BSA)、绵羊血清白蛋白、山羊血清白蛋白、或鱼血清白蛋白和钥孔血蓝蛋白(KLH)及其组合，诸如卵清蛋白或KLH，或诸如BSA。
在一个方面，所述非自身抗原不是牛抗原如BSA。
在另一个方面，基于施用的总细胞数，约5％至约100％的施用的癌细胞是MHCII阳性癌细胞，诸如至少约50％的施用的癌细胞是MHCII阳性癌细胞，至少约90％的施用的癌细胞是MHCII阳性癌细胞，或至少约99％的施用的癌细胞是MHCII阳性癌细胞。
在一个方面，细胞与常规化疗、放疗、激素治疗和生物治疗中的至少一种同时或依序施用。
在另一个方面，细胞在手术肿瘤切除之前或之后施用。
在另一个方面，细胞以多剂量施用。
在一个方面，细胞每周施用持续预定周数。在另一个方面，作为继续维持治疗施用细胞。
在一个方面，按每周、每月、每3个月、每6个月、每年或其组合施用细胞。
在另一个方面，当观察到癌症复发迹象时施用细胞。
根据另一个方面，提供了受试者自体的分离的免疫原性癌细胞用于治疗受试者的癌症的用途，其中所述细胞在其细胞表面上表达MHCI和MHCII两者，且其中癌抗原结合所述MHCI且非自身抗原结合所述MHCII。
在一个方面，将细胞配制为免疫原性组合物或癌症疫苗。
在另一个方面，非自身抗原是非人抗原。
在另一个方面，所述非自身抗原选自甲状腺球蛋白、β-半乳糖苷酶、葡聚糖、聚赖氨酸、结核菌素衍生蛋白、卵清蛋白(OVA)、血清白蛋白诸如牛血清白蛋白(BSA)、绵羊血清白蛋白、山羊血清白蛋白、或鱼血清白蛋白和钥孔血蓝蛋白(KLH)及其组合，诸如卵清蛋白或KLH，或诸如BSA。
在另一个方面，所述非自身抗原不是牛抗原，诸如BSA。
在另一个方面，基于总细胞数，所述用途包括使用约5％至约100％MHCII阳性癌细胞，诸如至少约50％MHCII阳性癌细胞，至少约90％MHCII阳性癌细胞，或至少约99％MHCII阳性癌细胞。
在一个方面，细胞与常规化疗、放疗、激素治疗和生物治疗中的至少一种同时或依序使用。
在另一个方面，在手术肿瘤切除之前或之后使用细胞。
在另一个方面，以多剂量使用细胞。
在一个方面，每周使用细胞持续预定周数，或作为继续维持治疗使用细胞。
在另一个方面，按每周、每月、每3个月、每6个月、每年或其组合使用细胞。
在另一个方面，当观察到癌症复发迹象时使用细胞。
根据另一个方面，提供了用于确定患者是否是用分离的免疫原性癌细胞治疗的候选者的方法，所述方法包括：
-用MHCII诱导剂处理来自所述受试者的分离的癌细胞；和
-筛选所述癌细胞以确定表达的MHCII的存在；
-其中所述癌细胞上表达的MHCII的存在表明所述患者是用于该治疗的候选者。
在一个方面，所述方法进一步包括从受试者分离癌细胞。
在另一个方面，在活检程序过程中或在肿瘤的手术去除过程中分离所述细胞。
在另一个方面，MHCII诱导剂是细胞因子，诸如IFN-α、IFN-β、IFN-γ、IL-4、IL-13、IL-23、TNF-α或其组合，诸如IFN-γ。
在另一个方面，MHCII诱导剂是MHCII表达构建体或将与癌细胞融合的MHCII表达细胞。
根据另一个方面，提供了用于免疫具有癌症的受试者的癌症疫苗，所述癌症疫苗包含所述受试者自体的分离的免疫原性癌细胞，其中所述癌细胞已经通过用MHCII诱导剂处理和随后与非自身抗原孵育而修饰，从而在其细胞表面上的MHCII的背景下呈递所述非自身抗原，且其中所述癌症疫苗已经被纯化，以包含增加浓度的MHCII表达细胞。
根据另一个方面，提供了用于制备免疫原性提取物的方法，所述方法包括：
-诱导从受试者分离的癌细胞上MHCII的表达；
-将所述癌细胞与非自身抗原孵育，从而使得非自身抗原结合表达的MHCII；和
-从所述癌细胞提取具有结合的非自身抗原的MHCII。
在一个方面，所述免疫原性提取物是膜部分。在另一个方面，所述免疫原性提取物包含纯化的MHCII。
在另一个方面，所述方法进一步包括在MHCII诱导后鉴定MHCII阳性细胞。
在另一个方面，所述方法进一步包括将MHCII阳性癌细胞与MHCII阴性癌细胞分离，以获得包含MHCII阳性细胞的纯化的组合物。
在另一个方面，所述方法进一步包括从受试者分离癌细胞。在一个方面，在活检程序过程中或在肿瘤的手术去除过程中分离所述细胞。
在另一个方面，所述方法进一步包括冷冻保存癌细胞。
在另一个方面，通过致死照射、在不存在冷冻保存剂的情况下冷冻和解冻、或用细胞毒性化合物处理杀死细胞，诸如通过致死照射杀死细胞。
在另一个方面，使用MHCII诱导剂诱导癌细胞上的MHCII，所述MHCII诱导剂诸如IFN-α、IFN-β、IFN-γ、IL-4、IL-13、IL-23、TNF-α或其组合，诸如IFN-γ。
在另一个方面，MHCII诱导剂是MHCII表达构建体或将与癌细胞融合的MHCII表达细胞。
在另一个方面，非自身抗原是非人抗原。
在一个方面，所述非自身抗原选自甲状腺球蛋白、β-半乳糖苷酶、葡聚糖、聚赖氨酸、结核菌素衍生蛋白、卵清蛋白(OVA)、血清白蛋白诸如牛血清白蛋白(BSA)、绵羊血清白蛋白、山羊血清白蛋白、或鱼血清白蛋白和钥孔血蓝蛋白(KLH)及其组合，诸如卵清蛋白或KLH，或诸如BSA。
在另一个方面，所述非自身抗原不是牛抗原如BSA。
在另一个方面，所述诱导步骤是在无BSA的培养基中。
根据另一个方面，提供了本文所述的细胞的免疫原性提取物，其中所述提取物包含来自细胞的具有结合的非自身抗原的MHCII。
在一个方面，所述提取物是膜部分。在另一个方面，所述提取物包含纯化的MHCII。
根据另一个方面，提供了包含本文所述的提取物的免疫原性组合物。
在一个方面，所述组合物进一步包含至少一种赋形剂、载体、缓冲剂、稳定剂或其组合。
根据另一个方面，提供了包含本文所述的提取物的自体癌症疫苗。
在一个方面，所述疫苗进一步包含至少一种佐剂，诸如单磷酰脂质A/合成的海藻糖杆菌分枝菌酸二酯(MPL-TDM)、AS021/AS02、非离子型嵌段共聚物佐剂、CRL1005、磷酸铝(AlPO4)、R-848、咪喹莫特、PAM3CYS、聚(I:C)、洛索立宾、卡介苗(BCG)、短小棒杆菌、CpG寡脱氧核苷酸(ODN)、霍乱毒素衍生抗原、CTA1-DD、脂多糖佐剂、完全弗氏佐剂、不完全完全弗氏佐剂、皂苷、矿物凝胶、氢氧化铝、表面活性物质、溶血卵磷脂、普朗尼克多元醇、聚阴离子、肽、水中的油或烃乳液、MF59、Montanide ISA720，钥孔血蓝蛋白(KLH)、二硝基苯酚及其组合，诸如BCG。
在另一个方面，所述疫苗进一步包含至少一种赋形剂、载体、缓冲剂、稳定剂或其组合。
根据另一个方面，提供了用于治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用本文所述的提取物，其中所述细胞对于所述受试者是自体的。
在一个方面，将提取物配制为免疫原性组合物。在另一个方面，将提取物配制为癌症疫苗。
在另一个方面，与常规化疗、放疗、激素治疗和生物治疗中的至少一种同时或依序施用提取物。
在另一个方面，在手术肿瘤切除之前或之后施用提取物。
在另一个方面，以多剂量施用提取物。
在另一个方面，每周施用提取物持续预定周数。
在另一个方面，作为继续维持治疗施用提取物。
在另一个方面，按每周、每月、每3个月、每6个月、每年或其组合施用提取物。
在另一个方面，当观察到癌症复发迹象时施用提取物。
根据另一个方面，提供了本文所述的提取物用于治疗受试者的癌症的用途，其中所述细胞对于所述受试者是自体的。
在一个方面，将提取物配制为免疫原性组合物。在另一个方面，将提取物配制为癌症疫苗。
在另一个方面，与常规化疗、放疗、激素治疗和生物治疗中的至少一种同时或依序使用提取物。
在另一个方面，在手术肿瘤切除之前或之后使用提取物。
在另一个方面，以多剂量使用提取物。
在另一个方面，每周使用提取物持续预定周数。
在另一个方面，作为继续维持治疗使用提取物。
在另一个方面，按每周、每月、每3个月、每6个月、每年或其组合使用提取物。
在另一个方面，当观察到癌症复发迹象时使用提取物。
本发明的其它特征和优点将从以下详述变得显而易见。然而，应当理解，同时表明本发明的实施方案的详述和具体实施例仅仅通过示例的方式给出，因为从所述详述，本发明的精神和范围之内的各种改变和修改对于本领域技术人员而言将变得显而易见。
附图说明
本发明将通过下面说明并参考附图来进一步理解，其中：
图1显示了在与不同量的IFN-γ孵育72小时之后来自各种细胞系的MHCII阳性癌细胞的百分比；
图2显示了在与不同量的IFN-γ孵育72小时之后来自各种细胞系的MHCII阳性癌细胞上MHCII表达的水平；
图3显示了用癌活细胞攻击后30天对照小鼠或用自体癌细胞疫苗免疫的小鼠中肿瘤的2维平均肿瘤尺寸和标准差；
图4显示了用癌活细胞攻击后30天对照小鼠或用自体癌细胞疫苗免疫的小鼠中可检测肿瘤的发生率；
图5显示了在与肿瘤细胞孵育后从免疫的或未免疫的小鼠获得的T细胞的T细胞增殖反应；
图6显示了从用IFN-γ处理的细胞中提取的呈递BSA-生物素肽的MHCII；
图7显示了用癌活细胞攻击后对照小鼠或用自体癌细胞疫苗免疫的小鼠中可检测肿瘤的发生率；
图8显示了接受自体癌细胞疫苗的人受试者的存活曲线；
图9显示了手术切除前列腺肿瘤之后和与激素阻断治疗同时接受自体癌细胞疫苗的患者1的前列腺特异性抗原(PSA)的测量；
图10显示了手术切除前列腺肿瘤之后和与激素阻断治疗同时接受自体癌细胞疫苗的患者2的PSA测量；
图11显示了手术切除前列腺肿瘤之后和与激素阻断治疗同时接受自体癌细胞疫苗的患者3的PSA测量；
图12显示了手术切除前列腺肿瘤之后和与激素阻断治疗同时接受自体癌细胞疫苗的患者4的PSA测量。
图13显示了手术切除前列腺肿瘤之后和与激素阻断治疗同时接受自体癌细胞疫苗的患者5的PSA测量；和
图14显示了来自用自体癌细胞疫苗或对照治疗的患者的I/II期临床试验的临床结果。图14A显示了前列腺癌的死亡率；图14B显示了平均血清PSA水平；和图14C显示了7年随访后检测不到的PSA水平(小于0.04ng/ml)的图示。
发明详述
在一个方面，本发明涉及分离的免疫原性癌细胞、包含所述免疫原性癌细胞的免疫原性组合物和疫苗、制备此类免疫原性组合物和疫苗的方法及用于治疗癌症的方法。改变或修饰分离的免疫原性癌细胞，从而使得它们在其表面上的MHCII的背景下呈递非自身抗原，使得MHCII将非自身抗原呈递至辅助性T细胞，导致细胞因子产生。分离的免疫原性癌细胞还在其细胞表面上表达MHCI，所述MHCI将癌抗原呈递至细胞毒性T细胞。出乎意料地，单一修饰的癌细胞从而可以激活自体受试者中的两种类型的T细胞，导致强烈且特异性的抗癌免疫应答。
癌症产生自多种突变，所述突变导致若干恶性特征，诸如不受控制的增殖、凋亡机制的丧失和癌细胞侵袭宿主组织并转移至远处部位的能力。此外，尽管癌细胞经常在其细胞表面上MHCI的背景下表达被CD8+细胞毒性T细胞识别为非自身的肿瘤特异性抗原，但癌细胞经常发展出逃避宿主免疫系统的能力。存在癌细胞可以逃避免疫系统的不同机制，诸如：
a)癌细胞上的MHCI可以下调，使得癌细胞不能被细胞毒性T细胞识别。
b)癌细胞可以丧失被识别为非自身且能够引发免疫应答的肿瘤特异性抗原的表达。
c)癌细胞可能无法诱导细胞毒性T细胞，因为它们不表达共刺激因子或MHCII分子。
d)癌细胞可以产生抑制抗癌免疫应答的分子。
e)某些肿瘤抗原可以诱导对癌细胞的特异性免疫耐受。
增强或恢复抗癌免疫应答的方法已经是癌症免疫学领域中许多研究的主题。
MHCII分子对于CD4+辅助性T细胞的活化是需要的，所述CD4+辅助性T细胞刺激细胞毒性T细胞的去分化。因此，癌特异性T细胞应答的诱导经常需要专职APC的交叉致敏(cross-priming)，所述专职APC表达共刺激因子和MHCII分子。如果此类APC没有充分占用和呈递肿瘤特异性抗原并活化辅助性T细胞，则对于癌细胞特异性的细胞毒性T细胞可能不会形成。
证据表明，抗原诱导的T细胞增殖主要受白介素-2(IL-2)对其特异性细胞表面受体的作用调节。一旦辅助性T细胞被刺激以分泌IL-2，则可溶性IL-2可以与以自分泌方式产生IL-2的细胞相互作用，或者它可以与以旁分泌方式表达IL-2受体的其它细胞相互作用。因此，产生IL-2的抗原活化的辅助性T细胞可以促进其自身克隆扩增，促进细胞毒性T细胞的扩增，促进记忆性T细胞的产生，并促进B细胞和自然杀伤(NK)细胞的产生。在原始的()细胞毒性T细胞中，产生的IL-2的量通常比辅助性T细胞产生的IL-2的量少至少10倍，并且该量通常不足以维持免疫应答，这是为什么辅助性T细胞的共刺激是重要的原因。
因此，为了充分活化免疫系统以对癌症作出反应，通常要求四细胞相互作用模型：1)在MHCI的背景下呈递肿瘤特异性抗原的癌细胞，其中所述抗原被识别为非自身的；2)在MHCII的背景下呈递肿瘤特异性抗原的APC，其中所述抗原被识别为非自身的；3)与MHCI-抗原复合物相互作用的细胞毒性T细胞；和4)与MHCII-抗原复合物相互作用的辅助性T细胞。在这种模型中，通过细胞毒性T细胞识别MHCI-抗原复合物将细胞毒性T细胞活化至其需要IL-2以扩增并防止耐受诱导的状态。IL-2由与细胞毒性T细胞密切接近的活化的辅助性T细胞有效提供。肿瘤细胞经常由于这种四细胞相互作用模型的缺陷逃避免疫系统，通常因为没有足够的与肿瘤细胞密切接近的APC，所述APC在MHCII的背景下将非自身抗原呈递至辅助性T细胞。因此，辅助性T细胞没有被活化且不产生IL-2。
在本发明的各个方面，四细胞模型被三细胞模型替代，从而使癌细胞本身修饰以便在MHCII的背景下将非自身肽呈递至辅助性T细胞，并因此有效地替代APC的功能。修饰的癌细胞被认为是双功能性的，因为它们也将在MHCI的背景下将肿瘤特异性抗原呈递至细胞毒性T细胞。
在本发明的各个方面，从具有癌症的受试者分离癌细胞并培养。修饰细胞以便在它们的细胞表面上表达MHCII，诸如通过用MHCII诱导剂，诸如，例如IFN-γ。然后将已经被鉴定为MHCII阳性的细胞与免疫原性非自身抗原，诸如，例如，牛肽，一起孵育。在孵育过程中，非自身抗原将被癌细胞胞吞、加工、并最终在MHCII的背景下呈现在细胞表面上。然后制备修饰的癌细胞用于注射回自体受试者，所述自体受试者是指癌细胞最初由其分离的受试者。
此类修饰的细胞是免疫原性的，并将针对非自身肽产生强的辅助性T细胞应答，导致辅助性T细胞产生IL-2。同时，已经识别在MHCI的背景下在癌细胞上呈递的肿瘤抗原的细胞毒性T细胞将被IL-2刺激，因为它们将密切接近辅助性T细胞，因为MHCI和MHCII两者在相同癌细胞的表面上。这将导致针对由癌细胞产生的肿瘤抗原的特异性免疫应答。由于许多不同的肿瘤抗原通常由癌细胞表面上的MHCI呈递，所以由修饰的癌细胞生成的免疫应答在性质上通常是多克隆的。
定义：
如本文所用，术语“分离(isolate)”、“分离的(isolated)”和“分离(isolating)”是指从患有癌症的患者身体取出肿瘤细胞。所述细胞可以例如在标准的活检程序过程中或在手术切除癌症过程中进行分离。除非另有说明，否则这些术语并不意味着癌细胞是纯化的或不含其它细胞类型。
如本文所用，且如本领域众所周知的，“治疗”是获得有益或期望的结果，包括临床结果的方式。有益或期望的临床结果可以包括，但不限于，减轻或改善一种或多种症状或病症，减轻疾病程度，稳定(即不恶化)疾病状态，预防疾病扩散，延缓或减慢疾病进展，改善或减轻疾病状态，以及缓解(无论是部分还是全部)，无论是可检测的或是不可检测的。“治疗”也可以指与如果不接受治疗时预期的存活相比延长存活期。
术语“治疗有效量”、“有效量”或“足够量”是指当向受试者(包括哺乳动物，例如人)施用时足以实现期望结果的量，例如有效治疗癌症的量。治疗剂的有效量可以根据多种因素诸如受试者的疾病状态、年龄、性别和体重而变化。如本领域技术人员所理解的，可以调整剂量或治疗方案以提供最佳治疗响应。
此外，用治疗有效量治疗受试者的方案可以由单一施用组成，或者包含一系列的应用。治疗周期的长度取决于多种因素，诸如疾病的严重性、受试者的年龄、癌症疫苗的浓度、患者对癌症疫苗的响应性或其组合。还将理解的是，用于治疗的癌症疫苗的有效剂量可以随着具体治疗方案的过程增加或减少。剂量的变化可以通过本领域已知的标准诊断测定法导致和变得显而易见。在各个方面，本发明的癌症疫苗可以在用常规抗癌剂、放疗、激素治疗、生物治疗和/或手术肿瘤切除治疗之前、期间或之后进行施用。
如本文所用，术语“受试者”是指动物界的任何成员，优选哺乳动物。在一个实施方案中，哺乳动物是狗、猫、仓鼠、小鼠、大鼠、猪、马、牛或人类。在另一个实施方案中，哺乳动物是人类。
术语“自体的”是指从受试者获得并用于治疗该相同受试者的细胞。
术语“自身抗原”或“自身肽”是指源自具体受试者且通常被免疫系统耐受的该受试者体内的抗原。术语“非自身抗原”或“非自身肽”是指非源自具体受试者且通常被免疫系统识别并攻击的受试者体内的抗原。“癌抗原”或“癌肽”是指源自受试者内癌症的受试者体内的抗原。如本领域所理解，癌抗原有时被免疫系统耐受，有时被免疫系统识别并因此被免疫系统攻击。将理解，各个癌细胞将在任何给定时间在其细胞表面上在MHCI的背景下呈递许多不同的癌抗原，其中一些可以被免疫系统耐受，且其中一些可以被免疫系统识别和攻击。
本发明的癌细胞可以被称为“双功能性的”，因为它们表达MHCI和MHCII两者并能够活化辅助性T细胞和细胞毒性T细胞两者，如将描述的。表达MHCI和MHCII的这些双功能性肿瘤细胞也可以被描述为肿瘤呈递细胞(TPC)。
术语“佐剂”是指疫苗中存在且增强对疫苗中存在的抗原的免疫应答的化合物或混合物。例如，佐剂可以增强对如本文所预期的自体癌细胞疫苗中存在的多肽，或对如本文所预期的免疫原性片段或其变体的免疫应答。佐剂可以充当缓慢释放抗原的组织储库，并且也充当非特异性增强免疫应答的淋巴系统激活剂。可以采用的佐剂的实例包括MPL-TDM佐剂(单磷酰脂质A/合成的海藻糖棒杆菌分枝菌酸二酯，例如，购自GSK Biologics)。另一种合适的佐剂是免疫刺激性佐剂AS021/AS02(GSK)。配制这些免疫刺激性佐剂以给出强T细胞应答，并包括一起在脂质或脂质体载体中的QS-21、来自Quillay saponaria的皂苷、TL4配体、单磷酰脂质A。其它佐剂包括，但不限于，非离子型嵌段共聚物佐剂(例如，CRL1005)、磷酸铝(例如，AlPO4)、R-848(Th1样佐剂)、咪喹莫特、PAM3CYS、聚(I:C)、洛索立宾、BCG(卡介苗)和短小棒杆菌、CpG寡脱氧核苷酸(ODN)、霍乱毒素衍生抗原(例如，CTA1-DD)、脂多糖佐剂、完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂、皂苷、矿物凝胶诸如氢氧化铝、表面活性物质诸如溶血卵磷脂、普朗尼克多元醇、聚阴离子、肽、水中的油或烃乳液(例如，可自Novartis Vaccines获得的MF59或Montanide ISA720)、钥孔血蓝蛋白和二硝基苯酚。
术语“纯化的”在本文中用于涵盖通过相对于起始原料提高活性剂浓度的一个或多个纯化步骤从起始原料获得的组合物。例如，在本发明的各个方面，从活检或手术肿瘤样品获得的IFN-γ处理的细胞可以通过细胞分选技术纯化，以提供增加浓度的MHCII阳性细胞。纯化的组合物可以含有，例如，约5％至约100％MHCII阳性细胞，和之间的任何量，诸如约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％或约90％的MHCII阳性细胞。术语“纯化的”还涵盖相对于杂质包含显著量的活性剂的组合物，不论是否通过纯化方法获得。术语“纯化的”不应该被解释为意味着绝对纯度。
在理解本申请的范围中，如本文所用，术语“包含”及其派生词意在是指明所叙述的特征、要素、组分、组群、整体和/或步骤的存在的开放式术语，但并不排除其它未叙述的特征、要素、组分、组群、整体和/或步骤的存在。前述说法也适用于具有类似含义的词语，诸如术语“包括”、“具有”及其派生词。最后，如本文所用，程度术语诸如“基本上”、“约”和“大约”是指所修饰项的合理的偏差量，使得最终结果没有显著改变。这些程度术语应当被解释为包括所修饰项的至少±5％的偏差，如果该偏差不会否定其修饰的词语的含义。
出乎意料地，现在已经显示，可以修饰癌细胞，以便在它们的细胞表面上表达MHCII，使得所述MHCII将非自身抗原呈递至辅助性T细胞，且MHCI将癌抗原呈递至免疫系统的细胞毒性T细胞。如此修饰的癌细胞是免疫原性的，且可以在有效治疗受试者的癌症的自体癌症疫苗组合物中使用。
因此，提供了在其细胞表面上表达MHCI和MHCII两者的分离的免疫原性癌细胞，其中癌抗原结合所述MHCI且非自身抗原结合所述MHCII。
从自体受试者分离癌细胞，这意味着它们将用于治疗癌细胞所来源的相同受试者。或者，癌细胞可以用于HLA匹配的异体受试者中。通常，在活检程序过程中或手术肿瘤切除过程中分离细胞。癌细胞可以源自任何类型的恶性肿瘤，并且在一个方面，它们源自肺癌(包括小细胞肺癌和非小细胞肺癌(例如腺癌))、胰腺癌、结肠癌(例如结肠直肠癌，诸如，例如，结肠腺癌和结肠腺瘤)、食道癌、口腔鳞癌、舌癌、胃癌、肝癌、鼻咽癌、淋巴系的造血系统肿瘤(例如急性淋巴细胞性白血病，B细胞淋巴瘤，伯基特氏淋巴瘤)、非霍奇金氏淋巴瘤(例如套细胞淋巴瘤)、霍奇金氏病、骨髓性白血病(例如，急性髓性白血病(AML)或慢性髓性白血病(CML))、急性成淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、甲状腺滤泡癌、骨髓增生异常综合征(MDS)、间充质来源的肿瘤、软组织肉瘤、脂肪肉瘤、胃肠间质肉瘤、恶性周围神经鞘肿瘤(MPNST)、尤因肉瘤、平滑肌肉瘤、间叶性软骨肉瘤、淋巴肉瘤、纤维肉瘤、横纹肌肉瘤、黑素瘤、畸胎瘤、神经母细胞瘤、脑肿瘤、髓母细胞瘤、神经胶质瘤、皮肤的良性肿瘤(例如角化棘皮瘤)、乳腺癌(例如晚期乳腺癌)、肾癌、肾母细胞瘤、卵巢癌、宫颈癌、子宫内膜癌、膀胱癌、前列腺癌(包括晚期疾病和激素难治性前列腺癌)、睾丸癌、骨肉瘤、头颈癌、表皮癌、多发性骨髓瘤(例如难治性多发性骨髓瘤)，或间皮瘤。在一个方面，癌细胞源自实体瘤。通常，癌细胞源自乳腺癌、结肠直肠癌、黑素瘤、卵巢癌、胰腺癌、胃癌、或前列腺癌。更通常地，癌细胞源自前列腺癌。
尽管大多数癌细胞在其细胞表面上天然不表达许多MHCII(如果有MHCII的话)，但应理解，如果癌细胞源自抗原呈递细胞，诸如例如B细胞癌症，则这些细胞可能已经在其细胞表面上表达MHCII。预期可以从本发明明确排除已经表达MHCII的未修饰的癌细胞。换言之，预期本发明可以涵盖在根据本发明的修饰之前是MHCII阴性、MHCII阳性或两者的癌细胞。或者，本发明中可以包括此类细胞，并且将理解，由于这些细胞已经表达MHCII，所以与MHCII诱导剂一起孵育仅仅是任选的以便增加表达水平。
为了使癌细胞在其细胞表面上表达MHCII，将它们与MHCII诱导剂一起孵育。MHCII诱导剂涵盖，例如，细胞因子、化学试剂和基因构建体。
例如，MHCII诱导剂可以是IFN-γ，或者它可以是用于转染或转导癌细胞的MHCII表达载体。MHCII诱导剂也涵盖表达MHCII的细胞，因为表达MHCII的细胞可以经由细胞融合与癌细胞融合，以便赋予癌细胞MHCII阳性。此类细胞的实例包括B细胞、树突状细胞、巨噬细胞和单核细胞。在另一个方面，MHCII诱导剂可以是活化MHCII反式激活因子(CIITA)序列的试剂。然而，通常，MHCII诱导剂是细胞因子，诸如，例如，IFN-α、IFN-β、IFN-γ、IL-4、IL-13、IL-23或TNF-α。也可以使用细胞因子的组合。在一个具体方面，MHCII诱导剂是IFN-γ。据理解，MHCII诱导剂也可以具有增加癌细胞上MHCI的表达的效果。例如，如果IFN-γ用作MHCII诱导剂，则它也趋向于引起癌细胞表面上MHCI的增加。
与MHCII诱导剂孵育后，可以通过以常规方法筛选分离的癌细胞，以确认MHCII在细胞表面上表达。也可以在该阶段纯化细胞，以增加MHCII阳性细胞的浓度。
一旦修饰癌细胞以表达MHCII，则将它们与非自身抗原孵育，使得它们将在MHCII的背景下呈递非自身抗原。非自身抗原可以是被认为是非自身的并且当被MHCII呈递时能够在受试者中诱导免疫应答的任何抗原。将理解，合适的抗原包括已知可用作半抗原载体的抗原，诸如，例如，甲状腺球蛋白、β-半乳糖苷酶、葡聚糖、聚赖氨酸、结核菌素衍生蛋白、卵清蛋白(OVA)、血清白蛋白诸如牛血清白蛋白(BSA)、绵羊血清白蛋白、山羊血清白蛋白、或鱼血清白蛋白和钥孔血蓝蛋白(KLH)。抗原可以源自与受试者相同的物种或源自不同物种。例如，如果受试者是人，则抗原可以是人或非人抗原。通常，抗原是非人抗原，诸如，例如，牛、兔、鼠、犬或猫抗原。更通常地，抗原是牛抗原，诸如，例如，牛血清抗原(BSA)。KLH和白蛋白是其它常用抗原。在一个方面，本发明通常特别地排除牛抗原。在另一个方面，本发明仅特别地排除BSA。
在各个方面，根据本发明制备的分离的免疫原性癌细胞将在其细胞表面上表达MHCI和MHCII两者。MHCI和MHCII分子将呈递如本领域中理解的许多不同抗原，然而，至少一些MHCI分子将呈递肿瘤特异性抗原，且至少一些MHCII分子将呈递非自身抗原。然后，这些细胞可以用于自体受试者中，用于治疗受试者的癌症。
这些细胞可以活地、减毒地或杀死地使用。通常，在用于受试者之前通过例如致死照射、在不存在冷冻保存剂诸如DMSO的情况下冷冻和解冻、或用细胞毒性化合物诸如化疗剂或毒素处理杀死细胞。如果细胞不用于立即使用，则可以将它们保存，诸如，例如，通过冷冻保存，用于随后向自体受试者施用。
细胞提取物也可以用于自体受试者中治疗受试者的癌症。例如，可以将细胞浸渍、超声或以其它方式破碎，使得它们不是处于其天然完整形式。包含非自身抗原结合的MHCII分子的膜部分可以从细胞中提取，并在免疫原性组合物中提供用于治疗自体受试者的癌症。此外，仅包含非自身抗原结合的MHCII分子的部分可以从细胞中提取，并在免疫原性组合物中提供用于治疗自体受试者的癌症。因此，提供了包含MHCII分子的细胞提取物，其中所述MHCII分子呈递非自身抗原。提取物可以进一步包含膜部分，并且它可以进一步包含MHCI分子，其中所述MHCI分子呈递癌抗原。提取物可以在免疫原性组合物或癌症疫苗中提供，并且可以用于治疗具有癌症的自体受试者。
如所描述地进行修饰以便在MHCII的背景下呈递非自身抗原的癌细胞也可用于免疫原性组合物中以治疗癌症。因此，提供了包含在它们的细胞表面上表达MHCI和MHCII两者的癌细胞的组合物，所述MHCI呈递癌抗原且所述MHCII呈递非自身抗原。此类免疫原性组合物可以用作自体癌细胞疫苗用于治疗自体受试者的癌症。
除了修饰的癌细胞以外，免疫原性组合物和疫苗可以进一步包含一种或多种药学上可接受的赋形剂、载体、缓冲剂、稳定剂、佐剂或其混合物。
本文所述的免疫原性组合物和疫苗可以通过本身已知用于制备可以向受试者施用的药学上可接受的组合物的方法来制备，使得将有效量的活性物质与药学上可接受的介质组合在混合物中。合适的介质描述于，例如，Remington's Pharmaceutical Sciences(Remington'sPharmaceutical Sciences,20th ed.,Mack Publishing Company,Easton,Pa.,USA,2000)。在此基础上，组合物可以包括，但非排除性地包括，与一种或多种药学上可接受的介质或稀释剂结合的癌细胞，并且可以包含在与生理流体等渗的具有合适pH的缓冲溶液中。
药物组合物包括，但不限于，冻干粉末或者水性或非水性无菌可注射溶液或悬浮液，其可以进一步包含抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使所述组合物与受试者的组织或血液基本上相容的溶质。可以存在于此类组合物中的其它组分包括，例如，水、表面活性剂(诸如Tween)、醇、多元醇、甘油和植物油。可以从无菌粉末、颗粒、片剂或者浓缩溶液或悬浮液制备临时注射溶液和悬浮液。药物组合物可以，例如，但不限于，作为在向患者施用前用无菌水或盐水重构的冻干粉末提供。
合适的药学上可接受的载体包括不干扰药物组合物生物活性的有效性的基本上化学惰性且无毒的组合物。合适的药物载体的实例包括，但不限于，水、盐水溶液、甘油溶液、乙醇、N-(1(2,3-二油酰氧基)丙基)N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)、二油酰磷脂酰-乙醇胺(DOPE)和脂质体。此类组合物应当包含治疗有效量的修饰癌细胞，连同合适量的载体，以便提供用于向患者直接施用的形式。
任何合适的佐剂都可用于本发明的疫苗中。例如，合适的佐剂包括，MPL-TDM佐剂、AS021/AS02、非离子型嵌段共聚物佐剂、磷酸铝、R-848、咪喹莫特、PAM3CYS、聚(I:C)、洛索立宾、BCG、短小棒杆菌、CpG寡脱氧核苷酸、霍乱毒素衍生抗原、脂多糖佐剂、完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂、皂苷、矿物凝胶诸如氢氧化铝、表面活性物质诸如溶血卵磷脂、普朗尼克多元醇、聚阴离子、肽、水中的油或烃乳液、钥孔血蓝蛋白和二硝基苯酚。通常，所使用的佐剂是BCG。
在各个方面，本发明的免疫原性组合物和疫苗可以例如通过以下途径施用：肠胃外、静脉内、皮下、皮内、肌内、颅内、眶内、眼、心室内、囊内、脊柱内、脑池内、腹膜内、鼻内、直肠内、气溶胶或口服施用。通常，本发明的组合物皮下、肌内或皮内施用。更通常地，本发明的组合物由于在真皮中发生的特异性抗原加工而在上肢中皮内施用。
在各个方面，本发明的免疫原性组合物和疫苗可以与用于癌症的常规治疗(例如包括化疗、激素治疗、生物治疗和放疗)组合(同时或顺序地)施用。本发明的组合物在适当时可以与此类常规治疗一起制定。
本发明的组合物可以以任何合适的量使用，但通常以包含约1x104至约1x109个癌细胞的剂量提供。例如，在各个方面，本发明的组合物可以包含约1x104、1x105、约1x106、约1x107、约1x108或约1x109个癌细胞。通常，组合物包含约1x107个癌细胞。
此外，用癌细胞接种可以进行一次，或者可以重复数次。例如，根据疾病状态，接种可以每天、每周、每月、每年或以其组合进行。例如，受试者可以每周施用几个剂量以治疗活跃癌症。一旦癌症生长减缓或进入缓解，则可以，例如，每月、每三个月、每六个月或每年提供后续维持剂量。通常，期望继续接种受试者，只要存在可得的生物材料。此外，癌症患者在缓解后通常随访数年，以快速确认任何癌症复发的迹象。如果确定任何此类迹象，则可以根据需要施用癌细胞疫苗的一个或多个后续剂量以治疗复发癌症。
将理解，剂量数仅受限于从患者的肿瘤获得的癌细胞的数量。例如，当从受试者分离癌细胞时，将它们培养一段时间以确保存活力并增加细胞数目。如果期望预定数目的剂量，则可以培养细胞直到存在足够制备预定数目的剂量的细胞数目。一旦用完所有原始细胞材料，则不再制备进一步的剂量，除非获得了进一步的活检或手术样品。
因此，预期可以在培养之后，用MHCII诱导剂和非自身抗原处理之前或之后冷冻保存癌细胞，使得在将来时间(例如，如果癌症复发)需要进一步的剂量时，可以将它们重新培养并扩增细胞数量。在复发的特定情况下，可以获得来自复发癌症的第二活检或手术样品，以便为进一步接种剂量提供额外的生物材料。如果可能，期望的是从复发癌症获得第二活检或手术样品，因为复发癌症可能在MHCI的背景下呈递与初始癌症不同的癌抗原。
尽管上文已经描述了本发明的组合物、疫苗、细胞和方法可用于治疗癌症，但应当理解，它们也可用于预防癌症。在这个方面，可以筛选从受试者获得的肿瘤细胞，以确定在其表面上表达哪些人白细胞抗原(HLA)。可以将这些细胞配制成疫苗用于预防HLA匹配的受试者中的癌症。
上述公开内容总体描述了本发明。可以通过参考以下具体实施例来获得更完整的理解。这些实施例仅仅出于说明性目的进行描述，并不旨在限制本发明的范围。随实际情况可能要求的或变化的，预期进行形式改变和等价替换。尽管本文中已经采用了特定术语，但此类术语旨在是描述性的，而不是用于限制目的。
实施例
实施例1
将人LST174T、LoVo、SW1116、Colo205和HT29结肠癌细胞和人SK-OV-3卵巢癌细胞与不同浓度的IFN-γ培养72小时。然后使用特异性的抗MHCII(DP、DQ和DR)抗体通过流式细胞仪分析细胞，以确定IFN-γ是否诱导这些细胞中的MHCII表达。结果显示在表1和表2和相应的图1和图2中。
表1.本表列出了与IFN-γ孵育72小时之后MHCII阳性细胞的百分比。
IFN-γ(U/mL) LST174T LoVo SW1116 Colo205 OV3 HT29
0 2.70 0.59 2.96 1.35 2.03 0.35
100 0.26 12.41 10.50 26.59 NA 41.87
1000 1.32 19.11 32.54 39.96 40.43 81.60
表2.本表列出了平均通道强度并涉及MHCII阳性细胞上MHCII的表达水平。
IFN-γ(U/mL) LST174T LoVo SW1116 Colo205 OV3 HT29
0 16.7 34.29 25.71 59.89 27.14 35.87
100 41.42 79.86 27.88 53.28 NA 31.91
1000 15.68 108.43 34.91 138.24 45.32 53.76
本实施例表明，可以使不同来源的若干不同类型的细胞在与IFN-γ孵育之后表达MHCII。
实施例2
将小鼠413-BCR乳腺肿瘤细胞与100U/mL IFN-γ孵育48小时和与50μg/mL BSA孵育24小时。更具体地，将细胞置于具有10ml培养基的T25烧瓶中。将细胞与包含IFN-γ的培养基孵育48小时，然后用无血清RPMI1640洗涤三次。然后将细胞与2ml BSA溶液孵育2小时，然后添加包括100U/ml IFN-γ和50μg/ml BSA的完全培养基。将413-BCR细胞进行致死照射并冻存。在激发前第21、14和7天，将BALB/c小鼠用3次注射预免疫，每次注射包含1x105个413-BCR细胞，在无佐剂的情况下i.p.施用。然后将小鼠用2.5X106个413-BCR活细胞的s.c.注射进行激发。30天后，所有预免疫的小鼠都没有形成肿瘤(n＝5)，而所有未处理的对照小鼠(n＝5)都形成肿瘤。
本实施例表明，在小鼠中，用经修饰以便在它们的细胞表面上在MHCII背景下呈递非自身肽的癌细胞进行预免疫针对用自体未修饰癌细胞的激发是保护性的。
实施例3
将20只BALB/c雌性小鼠分为4组，标记为A、B、C和D，每组5只小鼠。如下表3中所示，这些小鼠接受两次预免疫。简而言之，组A用在在它们的细胞表面上的MHCII背景下呈递非自身抗原的癌细胞免疫；组B用在它们的细胞表面上表达MHCII而没有非自身抗原的癌细胞免疫；组C用非自身抗原免疫；且组D用PBS免疫。所有注射s.c.进行，且在激发前第14天时包括Quil-A作为佐剂，在激发前第7天时无佐剂。在第0天，s.c.注射5x105个活413-BCR细胞。
表3.本表描述实施例3中的小鼠组接受的预免疫。
表4和图3和4描述了本研究的结果。表4和相应的图3显示，在其预免疫中接受表达MHCII的癌细胞的组A和B的小鼠具有的肿瘤尺寸小于在其预免疫中没有接受细胞的小鼠的肿瘤尺寸。在第70天时小鼠的宏观评估揭示，组A中没有小鼠具有可检测的肿瘤，而组B、C和D在5只小鼠中分别有1、4和5只小鼠具有可检测的肿瘤(图4)。
表4.本表显示用活肿瘤细胞激发后30天各组中的小鼠之间的二维平均肿瘤尺寸和标准差。
本实施例表明，在小鼠中，用经修饰以便在其细胞表面上的MHCII背景下呈递非自身肽的癌细胞预免疫具有针对用自体未修饰癌细胞的激发的保护性，特别是在降低肿瘤尺寸和发生率方面。
实施例4
将来自实施例3的组A的小鼠处死，并取出其脾脏以进行T细胞增殖测定。来自未免疫动物的脾脏用作对照。在以下试剂或细胞存在的情况下培养来自组A的小鼠的约1.2x105个T细胞/孔：2mg/mL植物凝集素(PHA)(阳性对照)；标准培养基(阴性对照)；104个照射的肿瘤细胞，104个照射的IFN-γ处理的肿瘤细胞，或50μg/mL BSA。将T细胞在37℃孵育48小时，随后与1mCi3H-胸苷孵育20小时。使用固体闪烁测量掺入的活性。
表5和图5显示了本研究的结果，并表明源自免疫小鼠的T细胞响应于肿瘤细胞和BSA增殖，而源自未免疫小鼠的T细胞则没有。这意味着，用癌症疫苗免疫的动物形成了针对肿瘤细胞上的不同肿瘤抗原的独立免疫力，无论这些细胞是否用IFN-γ处理。此外，用癌症疫苗免疫的动物表明针对BSA的免疫力。
表5：本表显示了来自免疫小鼠(A组)相比于未免疫小鼠的T细胞的增殖反应。
实施例5
将106个413-BCR细胞与100U/ml IFN-γ孵育48h。将细胞用PBS洗涤5次，然后使用高生物素摩尔比(1摩尔BSA比20摩尔生物素)与100μg/ml或10μg/ml(2ml)的生物素-BSA孵育2小时。然后将细胞在包含IFN-γ加上生物素-BSA的培养基中孵育24小时。将细胞用PBS洗涤5次，并用Triton-100TM溶解过夜。将抗小鼠MHCI或MHCII(PBS中10ug/ml)捕获抗体包被在96孔ELISA板上。将板用PBS中的3％BSA封闭1小时。将包含溶解的细胞的样品在室温下孵育4小时。将板洗涤，并在37℃下添加链霉亲和素-过氧化物酶偶联物45分钟。然后将板洗涤5次，并添加TMB底物。在450nm测定光密度。对照样品(未处理的细胞)和处理细胞之间的比率显示在图6中。
本实施例表明，BSA能够以剂量依赖性方式结合用IFN-γ预处理的癌细胞表达的MHCII。
实施例6
用人PBL重构的一组SCID-浅褐色小鼠用于体内评估本文所述的自体癌症疫苗。更具体地，用来自部分匹配供体(HLA型A2,B44,DR13)的107hPBL i.p.(0.5mL/小鼠，具有20％v/v基质胶)注射二十五只SCID-浅褐色小鼠(雌性，8-10周)。重构后7和14天采集小鼠血液，以验证hIgG水平。只有hIgG大于10ug/mL的小鼠用于进一步实验。表6显示了重构小鼠的hIgC测量值。
表6：本表显示了重构小鼠的hIgC测量值，并描述哪些小鼠用于进一步研究，而哪些没有。
ND,未测定
到第14天重构17(68％)只SCID-浅褐色小鼠。这些动物然后用于体内评估自体癌症疫苗。如下将这些小鼠随机分为四组用于免疫：
A)N＝5，106个照射的修饰的肿瘤细胞，其中所述肿瘤细胞如上所述通过用100U/ml IFN-γ处理48小时加上用50μg/mL BSA处理24小时而进行修饰；
B)N＝4，106个照射的修饰的肿瘤细胞，其中所述肿瘤细胞通过用IFN-γ处理72小时而进行修饰；
C)N＝4,100ug/小鼠BSA；和
D)N＝4,PBS。
用于免疫和激发的肿瘤细胞来自细胞系SW1116(HLA型A2,23,B44,60,DR11,13,52,DQ6,7)。免疫方案在表7中描述。所有组都用Ribi佐剂i.p.免疫。RiBi由于其毒性而只用于第一次免疫中。
表7：本表描述该体内模型中使用的免疫和激发方案。
天 程序
-14 免疫
-7 免疫
0 肿瘤植入-2.5X106个SW1116细胞,s.c.
+3 免疫
+8 免疫
+15 免疫
本研究的结果描述于表8和图7中。这些结果显示，接受单独的BSA或PBS免疫的所有小鼠到激发后17天都具有可检测的肿瘤。相反，接受修饰的癌细胞的小鼠到激发后17天没有可检测的肿瘤，5只中只有2只到激发后21天具有可检测的肿瘤。
表8：本表显示与用对照制剂接种的小鼠相比，用自体癌症疫苗接种的小鼠中的肿瘤发生率。
实施例7
在人中测试自体癌症疫苗。细胞通过手术或活检程序获得。外科医生收集宏观上看起来包含肿瘤细胞的小块肿瘤(最大约0.5cm3)。当使用针刺活检时，收集多针样品。将细胞立即置于包含运输培养基(RPMI1640，加上20％FBS，加上青霉素，加上链霉素或庆大霉素，加上10mM草酰乙酸，4.5mM丙酮酸盐，和2.0U/ml胰岛素(人或牛))的管中。将收集的样品置于冰上(约2-8℃)直到在收集后30分钟至72小时在细胞培养实验室处理。通常，肿瘤收集和肿瘤处理之间的时间小于约24小时。一旦材料到达实验室，将细胞用冷RPMI1640洗涤3次，并使用玻璃研磨、剪刀或手术刀进行机械解离。细胞也可以使用例如胰蛋白酶酶促解离，然而，使用机械解离是因为它不干扰表面细胞膜蛋白。一些肿瘤本身作为腹水或骨髓样品存在。在这些情况下，不需要机械解离。
将解离的细胞连同一些较小肿瘤块置于使用VAP培养基(RPMI1640，加上10％FBS，加上青霉素，加上链霉素或庆大霉素，加上10mM草酰乙酸，4.5mM丙酮酸盐，和2.0U/ml胰岛素(人或牛))的培养中。使用T25或T75培养瓶。达到至少7x107个细胞的平均时间为28天，但在这些样品中范围为10至91天。基于肿瘤细胞生长特性，每3天或在需要时更换培养基。
一旦存在足够细胞(至少3个汇合的T25烧瓶)，则每个T25烧瓶添加每ml新鲜VAP培养基1000IU IFN-γ(7ml)。将包含IFN-γ的细胞在37℃孵育48小时。然后将细胞用5ml RPMI1640洗涤3次，并在37℃与RPMI1640中的50μg/ml BSA孵育。将包含BSA的培养基去除，并用VAP培养基加上1000U IFN-γ加上50ug/ml BSA替代，并再孵育24小时。这些孵育时间后，将细胞使用刮刀机械收获并用盐水洗涤5次。将洗涤的细胞重悬于无菌PBS中，使得存在至少1x107个细胞/ml，并置于1ml微管中。每份患者样品通过流式细胞术评估，以确认MHCI和MHC II的存在以及表面肿瘤标记物的存在(当可得时)。
然后将样品用200Gy辐射照射。然后将照射的细胞分到7或更多个微管中，每个微管包含150μl细胞(约107个细胞)。将包含样品1和2的管冷藏在2-8℃下，并将剩余的样品冷冻在-80℃。添加107个微生物的BCG(50ul)，使得前两份样品的最终体积为200μl(150μl细胞加上50μl BCG)。然后将样品转移至结核菌素注射器，并在上肢中皮内注射。在不同臂上以7天的中间间隔进行前两次免疫。第一次免疫之前，收集血液用于体液和细胞免疫应答分析(当可得时)。
疫苗的第三剂量仅包含在PBS中稀释的照射的肿瘤细胞(107个细胞)，并在第二剂量后7天接种。在交替臂中以与第三剂量相同的方式进行第四剂量。以30天间隔进行第5和第6剂量。最后，在第六剂量后3个月施用第7剂量。如果生物材料是可获得的，基于患者变化每3个月或2个月施用随后的剂量。在每次剂量时进行临床和生化评估。在所有免疫程序过程中维持标准的癌症治疗。在每次免疫后24、48或72小时测量迟发型超敏(DTH)反应，除了包含BCG的两个初始剂量。如表9中所述，从许多患者和肿瘤部位成功地制备疫苗。
表9：本表显示由其成功制备自体癌细胞疫苗的患者数目和肿瘤部位。
肿瘤部位 患者数目
前列腺 159
乳腺 7
肠 5
肺 5
脑 3
胃 3
黑素瘤 3
卵巢 3
胰腺 3
甲状腺 3
胆囊 3
宫颈癌 2
肝 2
间皮瘤 2
未知部位 2
直肠 2
肾 2
肉瘤 2
头颈 2
骨髓瘤 1
膀胱 1
食道 1
泪腺 1
成功制备疫苗后，该疫苗用于治疗人，并发现是安全和有效的。本研究的结果描述于表10和对应的图8中。
表10：本表描述用自体癌症疫苗治疗的具有各种癌症类型的60位患者的百分生存率。
N 60 26 5 3 3 4 3
月数 总体 前列腺 乳腺 胰腺 黑素瘤 肠和直肠 卵巢
0 100％ 100％ 100％ 100％ 100％ 100％ 100％
1 100％ 100％ 100％ 100％ 100％ 100％ 100％
1.25 100％ 100％ 100％ 100％ 100％ 100％ 100％
1.5 97％ 100％ 100％ 100％ 100％ 100％ 100％
1.75 90％ 96％ 100％ 67％ 100％ 100％ 100％
2 90％ 96％ 100％ 67％ 100％ 100％ 100％
3 80％ 96％ 100％ 33％ 100％ 75％ 67％
4 75％ 88％ 100％ 33％ 100％ 75％ 67％
7 67％ 81％ 80％ 33％ 100％ 75％ 0％
8 58％ 73％ 80％ 0％ 100％ 50％ 0％
9 57％ 69％ 80％ 0％ 100％ 50％ 0％
10 55％ 69％ 80％ 0％ 100％ 50％ 0％
11 53％ 69％ 80％ 0％ 100％ 50％ 0％
12 53％ 69％ 80％ 0％ 100％ 50％ 0％
13 53％ 69％ 80％ 0％ 100％ 50％ 0％
14 50％ 69％ 80％ 0％ 67％ 50％ 0％
15 50％ 69％ 80％ 0％ 67％ 50％ 0％
实施例8
现在描述了对于五位前列腺癌患者的临床试验的病例研究，并提供了在接种之前、期间和之后他们的前列腺特异性抗原(PSA)测量值。疫苗制备和处理如同实施例7中。
患者1：
在手术后第269天开始，患者1每月用激素阻断疗法治疗。自体癌症疫苗的第一剂量在第441天提供，随后剂量在第448、454、461、491、521和611天提供。图9显示，尽管如第373天所测量，激素阻断最初引起PSA水平降低，但它们开始再次上升，并在第463天达到峰值。用自体癌症疫苗治疗引起该患者中的PSA水平进一步持续降低至第587和651天的0.03的低水平。
患者2：
在手术后第14天开始，患者2每月用激素阻断疗法治疗。自体癌症疫苗的第一剂量在第168天提供，随后剂量在第175、182、189、219、249和339天提供。图10显示，尽管如第138天所测量，激素阻断最初引起PSA水平降低，但它们开始再次上升并在第164天达到峰值。用自体癌症疫苗治疗引起PSA水平进一步持续降低直至第402天，此时水平开始再次上升。
患者3：
在手术样品收集前6个月开始，患者3每月用激素阻断疗法治疗。自体癌症疫苗的第一剂量在第68天提供，随后剂量在第74、79、86、107、146、236、400、520和684天提供。图11显示，甚至在激素抗性患者中，联合的激素阻断和接种治疗引起该患者中PSA水平的稳定降低。
患者4：
在手术后第0天开始，患者4每月用激素阻断疗法治疗。自体癌症疫苗的第一剂量在第5天提供，随后剂量在第11、18、26、55、83、和173天提供。图12显示，联合的激素阻断和接种治疗引起该患者中的PSA水平从第44天的354的高水平降低至第136天(记录测量的最后一天)的175的低水平。
患者5：
在大致第30天的手术后就开始，患者5每月用激素阻断疗法治疗。自体癌症疫苗的第一剂量在第141天提供，随后剂量在第148、155、162和192天提供。图13显示，联合的激素阻断和接种治疗引起该患者中的PSA水平从第43天的50.3的高水平降低至第180天(记录测量的最后一天)的1.12的低水平。
实施例9
已经证明本文所述的自体癌症疫苗在局部晚期前列腺癌患者的初始I期临床试验中是安全的。临床试验已经进行到IIb期。IIb期研究的主要终点是局部晚期(T2和T3)前列腺癌患者中的临床响应(PSA水平和生存率)，以安全性和免疫响应作为次要终点。
方法：
收集来自107位前列腺切除术患者的肿瘤细胞(HCPA–PortoAlegre–Brazil)。入组六十三(59％)位具有共病因素的T4、T3或T2期前列腺癌的患者。二十三位患者接受了疫苗，对照组中有40位患者。接种组由具有较晚期肿瘤的患者组成，其中接种组中83％的患者具有T3或T4期前列腺癌，相比之下，对照组为35％。在接种组中，22％患者为N+(扩散到局部淋巴结)，而在对照组中，2.5％患者为N+。接种组中PSA手术前平均值为16.15ng/ml，而对照组中为15.74ng/ml。平均Gleason评分为7.5(接种的)和6.9(未接种的)，且年龄相似，为64(未接种的)和63(接种的)。
自体癌症疫苗根据实施例7制备，并通过皮内注射给予，每周一次，持续4周，然后每月一次持续2个月，然后三个月后一次。自体癌症疫苗的前两次剂量还含有BGC作为佐剂。在不含有BCG的疫苗剂量后48小时测量DTH。在一些患者中，在基线和D54时经由血液成分分离术收集PBMC用于T细胞增殖实验。进行临床随访，并将所有标准护理给予所有患者。
结果：
总体平均随访为7年。注意到没有归因于疫苗的3级或4级毒性。副作用主要限于1级或2级注射部位反应。在73％的接种患者中，DTH为阳性(等于或大于5mm)。接种组中，癌症相关的死亡率为4％(1/23)，未接种组中为10％(4/40)(图14A)。接种组中，7年后的平均PSA水平为20.4ng/ml，未接种组中为42ng/ml(图14B)。随访5年后，70％(16/23)的接种患者中PSA是检测不到的(小于0.04ng/ml)，在42.5％(17/40)的未接种患者中PSA是检测不到的(p＝0.03853)(图14C)。在接种患者中证明了体外特异性T细胞增殖。
结论：
本文所述的自体癌症疫苗是安全和良好耐受的疫苗。在选择患者中存在临床活性和免疫变化的证据。
上述公开内容总体描述了本发明。尽管本文中已经使用了特定术语，但此类术语旨在是描述性的，而不是为了限制目的。
所有出版物、专利和专利申请都以其整体通过引用并入本文，其程度等同于每个单独的出版物、专利或专利申请被特定并单独地表明以其整体通过引用并入本文。
尽管本发明的优选实施方案已经在本文中详细描述，但本领域技术人员将理解，可以在不脱离本发明的精神或所附权利要求的范围的情况下对其进行各种变化。

Claims (159)

1.用于制备分离的免疫原性癌细胞的方法，所述方法包括：
-诱导从受试者分离的癌细胞上MHCII的表达；
-将所述癌细胞与非自身抗原孵育，使得所述非自身抗原结合表达的MHCII；和
-杀死所述癌细胞。
2.权利要求1所述的方法，其进一步包括在MHCII诱导后鉴定MHCII阳性细胞。
3.权利要求2所述的方法，其进一步包括将MHCII阳性癌细胞与MHCII阴性癌细胞分离，以获得包含MHCII阳性细胞的纯化的组合物。
4.权利要求1-3中任一项所述的方法，其进一步包括从受试者分离癌细胞。
5.权利要求4所述的方法，其中在活检程序过程中或在肿瘤的手术去除过程中分离所述细胞。
6.权利要求1-5中任一项所述的方法，其进一步包括冷冻保存所述癌细胞。
7.权利要求1-6中任一项所述的方法，其中通过致死照射、在不存在冷冻保存剂的情况下冷冻和解冻、或用细胞毒性化合物处理来杀死所述细胞。
8.权利要求7所述的方法，其中通过致死照射杀死所述细胞。
9.权利要求1-8中任一项所述的方法，其中使用MHCII诱导剂诱导所述癌细胞上的MHCII。
10.权利要求9所述的方法，其中所述MHCII诱导剂是细胞因子。
11.权利要求10所述的方法，其中所述细胞因子是IFN-α、IFN-β、IFN-γ、IL-4、IL-13、IL-23、TNF-α或其组合。
12.权利要求11所述的方法，其中所述细胞因子是IFN-γ。
13.权利要求9所述的方法，其中所述MHCII诱导剂是MHCII表达构建体。
14.权利要求9所述的方法，其中所述MHCII诱导剂是将与所述癌细胞融合的MHCII表达细胞。
15.权利要求1-14中任一项所述的方法，其中所述非自身抗原是非人抗原。
16.权利要求15所述的方法，其中所述非自身抗原选自甲状腺球蛋白、β-半乳糖苷酶、葡聚糖、聚赖氨酸、结核菌素衍生蛋白、卵清蛋白(OVA)、血清白蛋白诸如牛血清白蛋白(BSA)、绵羊血清白蛋白、山羊血清白蛋白、或鱼血清白蛋白和钥孔血蓝蛋白(KLH)及其组合。
17.权利要求9所述的方法，其中所述非自身抗原是卵清蛋白或KLH。
18.权利要求9所述的方法，其中所述非自身抗原是BSA。
19.权利要求1-14中任一项所述的方法，其中所述非自身抗原不是牛抗原。
20.权利要求19所述的方法，其中所述非自身抗原不是BSA。
21.权利要求1-20中任一项所述的方法，其中所述诱导步骤是在不含BSA的培养基中。
22.其细胞表面上表达MHCI和MHCII两者的分离的免疫原性癌细胞，其中癌抗原结合所述MHCI且非自身抗原结合所述MHCII。
23.权利要求22所述的细胞，其中所述非自身抗原是非人抗原。
24.权利要求23所述的细胞，其中所述非自身抗原选自甲状腺球蛋白、β-半乳糖苷酶、葡聚糖、聚赖氨酸、结核菌素衍生蛋白、卵清蛋白(OVA)、血清白蛋白诸如牛血清白蛋白(BSA)、绵羊血清白蛋白、山羊血清白蛋白、或鱼血清白蛋白和钥孔血蓝蛋白(KLH)及其组合。
25.权利要求24所述的细胞，其中所述非自身抗原是卵清蛋白或KLH。
26.权利要求24所述的细胞，其中所述非自身抗原是BSA。
27.权利要求22所述的细胞，其中所述非自身抗原不是牛抗原。
28.权利要求27所述的细胞，其中所述非自身抗原不是BSA。
29.免疫原性组合物，其包含在其细胞表面上表达MHCI和MHCII两者的分离的免疫原性癌细胞，其中癌抗原结合所述MHCI且非自身抗原结合所述MHCII。
30.权利要求29所述的组合物，其进一步包含至少一种赋形剂、载体、缓冲剂、稳定剂或其组合。
31.权利要求29或30所述的组合物，其中所述非自身抗原是非人抗原。
32.权利要求31所述的组合物，其中所述非自身抗原选自甲状腺球蛋白、β-半乳糖苷酶、葡聚糖、聚赖氨酸、结核菌素衍生蛋白、卵清蛋白(OVA)、血清白蛋白诸如牛血清白蛋白(BSA)、绵羊血清白蛋白、山羊血清白蛋白、或鱼血清白蛋白和钥孔血蓝蛋白(KLH)及其组合。
33.权利要求32所述的组合物，其中所述非自身抗原是卵清蛋白或KLH。
34.权利要求32所述的组合物，其中所述非自身抗原是BSA。
35.权利要求29或30所述的组合物，其中所述非自身抗原不是牛抗原。
36.权利要求35所述的组合物，其中所述非自身抗原不是BSA。
37.权利要求29-36中任一项所述的组合物，基于所述组合物中的总细胞数，所述组合物包含约5％至约100％MHCII阳性癌细胞。
38.权利要求37所述的组合物，其包含至少约50％MHCII阳性癌细胞。
39.权利要求38所述的组合物，其包含至少约90％MHCII阳性癌细胞。
40.权利要求39所述的组合物，其包含至少约99％MHCII阳性癌细胞。
41.自体癌症疫苗，其包含在其细胞表面上表达MHCI和MHCII两者的分离的免疫原性癌细胞，其中癌抗原结合所述MHCI且非自身抗原结合所述MHCII。
42.权利要求41所述的疫苗，其进一步包含至少一种佐剂。
43.权利要求42所述的疫苗，其中所述佐剂选自单磷酰脂质A/合成的海藻糖棒杆菌分枝菌酸二酯(MPL-TDM)、AS021/AS02、非离子型嵌段共聚物佐剂、CRL1005、磷酸铝(AlPO4)、R-848、咪喹莫特、PAM3CYS、聚(I:C)、洛索立宾、卡介苗(BCG)、短小棒杆菌、CpG寡脱氧核苷酸(ODN)、霍乱毒素衍生抗原、CTA1-DD、脂多糖佐剂、完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂、皂苷、矿物凝胶、氢氧化铝、表面活性物质、溶血卵磷脂、普朗尼克多元醇、聚阴离子、肽、水中的油或烃乳液、MF59、Montanide ISA720，钥孔血蓝蛋白(KLH)、二硝基苯酚及其组合。
44.权利要求43所述的疫苗，其中所述佐剂是BCG。
45.权利要求41-44中任一项所述的疫苗，其进一步包含至少一种赋形剂、载体、缓冲剂、稳定剂或其组合。
46.权利要求41-45中任一项所述的疫苗，其中所述非自身抗原是非人抗原。
47.权利要求46所述的疫苗，其中所述非自身抗原选自甲状腺球蛋白、β-半乳糖苷酶、葡聚糖、聚赖氨酸、结核菌素衍生蛋白、卵清蛋白(OVA)、血清白蛋白诸如牛血清白蛋白(BSA)、绵羊血清白蛋白、山羊血清白蛋白、或鱼血清白蛋白和钥孔血蓝蛋白(KLH)及其组合。
48.权利要求47所述的疫苗，其中所述非自身抗原是卵清蛋白或KLH。
49.权利要求47所述的疫苗，其中所述非自身抗原是BSA。
50.权利要求41-45中任一项所述的疫苗，其中所述非自身抗原不是牛抗原。
51.权利要求50所述的疫苗，其中所述非自身抗原不是BSA。
52.权利要求41-51中任一项所述的疫苗，基于所述疫苗中的总细胞数，所述组合物包含约5％至约100％MHCII阳性癌细胞。
53.权利要求52所述的疫苗，其包含至少约50％MHCII阳性癌细胞。
54.权利要求53所述的疫苗，其包含至少约90％MHCII阳性癌细胞。
53.权利要求54所述的疫苗，其包含至少约99％MHCII阳性癌细胞。
54.权利要求41-53中任一项所述的疫苗，其以用于多次接种的分次剂量提供。
55.权利要求54所述的疫苗，其以七个分次剂量提供。
56.权利要求41-55中任一项所述的疫苗，其中每个剂量包含约1x104至约1x109个癌细胞。
57.权利要求56所述的疫苗，其中每个剂量包含约1x107个癌细胞。
58.用于治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用分离的免疫原性癌细胞，其中所述细胞对于所述受试者是自体的，且在其细胞表面上表达MHCI和MHCII两者，且其中癌抗原结合所述MHCI且非自身抗原结合所述MHCII。
59.权利要求58所述的方法，其中将所述细胞配制为免疫原性组合物。
60.权利要求58所述的方法，其中将所述细胞配制为癌症疫苗。
61.权利要求58-60中任一项所述的方法，其中所述非自身抗原是非人抗原。
62.权利要求61所述的方法，其中所述非自身抗原选自甲状腺球蛋白、β-半乳糖苷酶、葡聚糖、聚赖氨酸、结核菌素衍生蛋白、卵清蛋白(OVA)、血清白蛋白诸如牛血清白蛋白(BSA)、绵羊血清白蛋白、山羊血清白蛋白、或鱼血清白蛋白和钥孔血蓝蛋白(KLH)及其组合。
63.权利要求62所述的方法，其中所述非自身抗原是卵清蛋白或KLH。
64.权利要求62所述的方法，其中所述非自身抗原是BSA。
65.权利要求58-60中任一项所述的方法，其中所述非自身抗原不是牛抗原。
66.权利要求65所述的方法，其中所述非自身抗原不是BSA。
67.权利要求58-66中任一项所述的方法，其中基于施用的总细胞数，约5％至约100％的施用的癌细胞是MHCII阳性癌细胞。
68.权利要求67所述的方法，其中至少约50％的施用的癌细胞是MHCII阳性癌细胞。
69.权利要求68所述的方法，其中至少约90％的施用的癌细胞是MHCII阳性癌细胞。
70.权利要求69所述的方法，其中至少约99％的施用的癌细胞是MHCII阳性癌细胞。
71.权利要求58-70中任一项所述的方法，其中与常规化疗、放疗、激素治疗和生物治疗中的至少一种同时或依序施用所述细胞。
72.权利要求58-71中任一项所述的方法，其中在手术肿瘤切除之前或之后施用所述细胞。
73.权利要求58-72中任一项所述的方法，其中以多剂量施用所述细胞。
74.权利要求73所述的方法，其中每周施用所述细胞持续预定周数。
75.权利要求73所述的方法，其中作为继续维持治疗施用所述细胞。
76.权利要求75所述的方法，其中按每周、每月、每3个月、每6个月、每年或其组合施用所述细胞。
77.权利要求58-76中任一项所述的方法，其中当观察到癌症复发迹象时施用所述细胞。
78.受试者自体的分离的免疫原性癌细胞在治疗受试者的癌症中的用途，其中所述细胞在其细胞表面上表达MHCI和MHCII两者，且其中癌抗原结合所述MHCI且非自身抗原结合所述MHCII。
79.权利要求78所述的用途，其中将所述细胞配制为免疫原性组合物。
80.权利要求78所述的用途，其中将所述细胞配制为癌症疫苗。
81.权利要求78-80中任一项所述的用途，其中所述非自身抗原是非人抗原。
82.权利要求81所述的用途，其中所述非自身抗原选自甲状腺球蛋白、β-半乳糖苷酶、葡聚糖、聚赖氨酸、结核菌素衍生蛋白、卵清蛋白(OVA)、血清白蛋白诸如牛血清白蛋白(BSA)、绵羊血清白蛋白、山羊血清白蛋白、或鱼血清白蛋白和钥孔血蓝蛋白(KLH)及其组合。
83.权利要求82所述的用途，其中所述非自身抗原是卵清蛋白或KLH。
84.权利要求82所述的用途，其中所述非自身抗原是BSA。
85.权利要求78-80中任一项所述的用途，其中所述非自身抗原不是牛抗原。
86.权利要求85所述的用途，其中所述非自身抗原不是BSA。
87.权利要求78-86中任一项所述的用途，包括使用基于总细胞数的约5％至约100％的MHCII阳性癌细胞。
88.权利要求87所述的用途，其包括使用至少约50％的MHCII阳性癌细胞。
89.权利要求88所述的用途，其包括使用至少约90％的MHCII阳性癌细胞。
90.权利要求89所述的用途，其包括使用至少约99％的MHCII阳性癌细胞。
91.权利要求78-90中任一项所述的用途，其中与常规化疗、放疗、激素治疗和生物治疗中的至少一种同时或依序使用所述细胞。
92.权利要求78-91中任一项所述的用途，其中在手术肿瘤切除之前或之后使用所述细胞。
93.权利要求78-92中任一项所述的用途，其中以多剂量使用所述细胞。
94.权利要求93所述的用途，其中每周使用所述细胞持续预定周数。
95.权利要求93所述的用途，其中作为继续维持治疗使用所述细胞。
96.权利要求95所述的用途，其中按每周、每月、每3个月、每6个月、每年或其组合使用所述细胞。
97.权利要求78-96中任一项所述的用途，其中当观察到癌症复发迹象时使用所述细胞。
98.用于确定患者是否是用分离的免疫原性癌细胞治疗的候选者的方法，所述方法包括：
-用MHCII诱导剂处理来自所述受试者的分离的癌细胞；且
-筛选所述癌细胞，以确定表达的MHCII的存在；
-其中所述癌细胞上表达的MHCII的存在表明所述患者是该治疗的候选者。
99.权利要求99所述的方法，其进一步包括从受试者分离所述癌细胞。
100.权利要求99所述的方法，其中在活检程序过程中或在肿瘤的手术去除过程中分离所述细胞。
101.权利要求98或100中任一项所述的方法，其中所述MHCII诱导剂是细胞因子。
102.权利要求101所述的方法，其中所述细胞因子是IFN-α、IFN-β、IFN-γ、IL-4、IL-13、IL-23、TNF-α或其组合。
103.权利要求102所述的方法，其中所述细胞因子是IFN-γ。
104.权利要求98-100中任一项所述的方法，其中所述MHCII诱导剂是MHCII表达构建体。
105.权利要求98-100中任一项所述的方法，其中所述MHCII诱导剂是将与所述癌细胞融合的MHCII表达细胞。
106.用于免疫具有癌症的受试者的癌症疫苗，所述癌症疫苗包含所述受试者自体的分离的免疫原性癌细胞，其中所述癌细胞已经通过用MHCII诱导剂处理和随后与非自身抗原孵育而修饰，从而在其细胞表面上的MHCII的背景下呈递所述非自身抗原，且其中所述癌症疫苗已经被纯化以包含增加浓度的MHCII表达细胞。
107.制备免疫原性提取物的方法，所述方法包括：
-诱导从受试者分离的癌细胞上MHCII的表达；
-将所述癌细胞与非自身抗原孵育，使得所述非自身抗原结合表达的MHCII；和
-从所述癌细胞提取具有结合的非自身抗原的MHCII。
108.权利要求107所述的方法，其中所述免疫原性提取物是膜部分。
109.权利要求107所述的方法，其中所述免疫原性提取物包含纯化的MHCII。
110.权利要求107-109中任一项所述的方法，其进一步包括在MHCII诱导后鉴定MHCII阳性细胞。
111.权利要求110所述的方法，其进一步包括将MHCII阳性癌细胞与MHCII阴性癌细胞分离，以获得含有MHCII阳性细胞的纯化的组合物。
112.权利要求107-111中任一项所述的方法，其进一步包括从受试者分离所述癌细胞。
113.权利要求112所述的方法，其中在活检程序过程中或在肿瘤的手术去除过程中分离所述细胞。
114.权利要求107-113中任一项所述的方法，其进一步包括冷冻保存所述癌细胞。
115.权利要求107-114中任一项的方法，其中通过致死照射、在不存在冷冻保存剂的情况下冷冻和解冻、或用细胞毒性化合物处理来杀死所述细胞。
116.权利要求115所述的方法，其中通过致死照射杀死所述细胞。
117.权利要求107-116中任一项所述的方法，其中使用MHCII诱导剂诱导所述癌细胞上的MHCII。
118.权利要求117所述的方法，其中所述MHCII诱导剂是细胞因子。
119.权利要求118所述的方法，其中所述细胞因子是IFN-α、IFN-β、IFN-γ、IL-4、IL-13、IL-23、TNF-α或其组合。
120.权利要求119所述的方法，其中所述细胞因子是IFN-γ。
121.权利要求117所述的方法，其中所述MHCII诱导剂是MHCII表达构建体。
122.权利要求117所述的方法，其中所述MHCII诱导剂是将与所述癌细胞融合的MHCII表达细胞。
123.权利要求107-122中任一项所述的方法，其中所述非自身抗原是非人抗原。
124.权利要求123所述的方法，其中所述非自身抗原选自甲状腺球蛋白、β-半乳糖苷酶、葡聚糖、聚赖氨酸、结核菌素衍生蛋白、卵清蛋白(OVA)、血清白蛋白诸如牛血清白蛋白(BSA)、绵羊血清白蛋白、山羊血清白蛋白、或鱼血清白蛋白和钥孔血蓝蛋白(KLH)及其组合。
125.权利要求117所述的方法，其中所述非自身抗原是卵清蛋白或KLH。
126.权利要求117所述的方法，其中所述非自身抗原是BSA。
127.权利要求107-122中任一项所述的方法，其中所述非自身抗原不是牛抗原。
128.权利要求127所述的方法，其中所述非自身抗原不是BSA。
129.权利要求107-128中任一项所述的方法，其中所述诱导步骤是在不含BSA的培养基中。
130.权利要求22-28中任一项所述的细胞的免疫原性提取物，其中所述提取物包含来自细胞的具有结合的非自身抗原的MHCII。
131.权利要求130所述的提取物，其中所述提取物是膜部分。
132.权利要求130所述的提取物，其中所述提取物包含纯化的MHCII。
133.免疫原性组合物，其包含权利要求130-132中任一项所述的提取物。
134.权利要求133所述的组合物，其进一步包含至少一种赋形剂、载体、缓冲剂、稳定剂或其组合。
135.自体癌症疫苗，其包含权利要求130-132中任一项所述的提取物。
136.权利要求135所述的疫苗，其进一步包含至少一种佐剂。
137.权利要求136所述的疫苗，其中所述佐剂选自单磷酰脂质A/合成的海藻糖棒杆菌分枝菌酸二酯(MPL-TDM)、AS021/AS02、非离子型嵌段共聚物佐剂、CRL1005、磷酸铝(AlPO4)、R-848、咪喹莫特、PAM3CYS、聚(I:C)、洛索立宾、卡介苗(BCG)、短小棒杆菌、CpG寡脱氧核苷酸(ODN)、霍乱毒素衍生抗原、CTA1-DD、脂多糖佐剂、完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂、皂苷、矿物凝胶、氢氧化铝、表面活性物质、溶血卵磷脂、普朗尼克多元醇、聚阴离子、肽、水中的油或烃乳液、MF59、Montanide ISA720，钥孔血蓝蛋白(KLH)、二硝基苯酚及其组合。
138.权利要求137所述的疫苗，其中所述佐剂是BCG。
139.权利要求135-138中任一项所述的疫苗，其进一步包含至少一种赋形剂、载体、缓冲剂、稳定剂或其组合。
140.用于治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用权利要求130-132中任一项所述的提取物，其中所述细胞对于所述受试者是自体的。
141.权利要求140所述的方法，其中将所述提取物配制为免疫原性组合物。
142.权利要求140所述的方法，其中将所述提取物配制为癌症疫苗。
143.权利要求140-142中任一项所述的方法，其中与常规化疗、放疗、激素治疗和生物治疗中的至少一种同时或依序施用所述提取物。
144.权利要求140-143中任一项所述的方法，其中在手术肿瘤切除之前或之后施用所述提取物。
145.权利要求140-144中任一项所述的方法，其中以多剂量施用所述提取物。
146.权利要求145所述的方法，其中每周施用所述提取物持续预定周数。
147.权利要求145所述的方法，其中作为继续维持治疗施用所述提取物。
148.权利要求147所述的方法，其中按每周、每月、每3个月、每6个月、每年或其组合施用所述提取物。
149.权利要求140-148中任一项所述的方法，其中当观察到癌症复发迹象时施用所述提取物。
150.权利要求130-132中任一项所述的提取物在治疗受试者的癌症中的用途，其中所述细胞对于所述受试者是自体的。
151.权利要求150所述的用途，其中将所述提取物配制为免疫原性组合物。
152.权利要求150所述的用途，其中将所述提取物配制为癌症疫苗。
153.权利要求150-152中任一项所述的用途，其中与常规化疗、放疗、激素治疗和生物治疗中的至少一种同时或依序使用所述提取物。
154.权利要求150-153中任一项所述的用途，其中在手术肿瘤切除之前或之后使用所述提取物。
155.权利要求150-154中任一项所述的用途，其中以多剂量使用所述提取物。
156.权利要求155所述的用途，其中每周使用所述提取物持续预定周数。
157.权利要求155所述的用途，其中作为继续维持治疗使用所述提取物。
158.权利要求157所述的用途，其中按每周、每月、每3个月、每6个月、每年或其组合使用所述提取物。
159.权利要求150-158中任一项所述的用途，其中当观察到癌症复发迹象时使用所述提取物。
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