CN113355432A - Bmf作为细胞凋亡标志物的应用 - Google Patents

Bmf作为细胞凋亡标志物的应用 Download PDF

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CN113355432A CN202110518303.2A CN202110518303A CN113355432A CN 113355432 A CN113355432 A CN 113355432A CN 202110518303 A CN202110518303 A CN 202110518303A CN 113355432 A CN113355432 A CN 113355432A
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cells
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李营营
秦士贞
刘婷
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Abstract

本发明涉及细胞凋亡技术领域。本发明提供了Bmf作为细胞凋亡标志物的应用。本申请以体外培养的小尾寒羊卵泡颗粒细胞为模型，通过过表达和干扰实验探索Bmf在颗粒细胞增殖或凋亡过程中的生物学作用及调控机制，为进一步深入研究小尾寒羊颗粒细胞凋亡和卵泡闭锁的分子调控提供理论参考。

Description

Bmf作为细胞凋亡标志物的应用
技术领域
本发明涉及细胞凋亡技术领域，尤其涉及Bmf作为细胞凋亡标志物的应用。
背景技术
细胞凋亡是许多生物体中调节组织稳态和应激反应的重要过程。哺乳动物卵泡发育过程中，受多种因素的调控，包括激素分泌、生长因子、细胞因子作用、凋亡信号通路的参与等。这些因素作用于卵泡的颗粒细胞层，调节颗粒细胞增殖、分化和凋亡；同时，卵泡颗粒细胞与卵母细胞之间的相互作用对卵泡的整体发育和卵子的质量起到重要的调控作用。因此，颗粒细胞凋亡能够引起卵泡闭锁，研究颗粒细胞生长的分子调控机制，对了解卵泡的发育过程是十分必要的。
BCL-2蛋白家族通过调节线粒体外膜通透性来调控线粒体凋亡途径。BCL-2蛋白家族包括三个功能亚群：(1)抗凋亡蛋白，包括BCL-2、BCL-XL、BCL-W、mcl1和BFL-1/A1；(2)促凋亡执行者，包括BAX、BAK、BOK；(3)促凋亡BH3-only蛋白，包括BAD、BID、BIK、BIM、BMF、HRK、NOXA、PUMA等。其中抗凋亡和成孔蛋白含有多BCL-2同源性(BH)结构域，而促凋亡BH3-only蛋白仅含有BH3结构域，通过灭活抗凋亡BCL-2蛋白，作为凋亡程序的启动因子，促进细胞凋亡。BAX和BAK作为细胞凋亡的效应因子，可介导活化后的MOM通透性增加，从线粒体中释放细胞色素c，从而激活caspases。同时，抗凋亡BCL-2蛋白通过与BH3基元互作，并与抗凋亡蛋白表面的同源沟槽相互作用，结合并抑制Bax/Bak和BH3-only蛋白来发挥促生存功能。
在健康细胞中，Bmf通过与动力蛋白轻链2(DCL2)相结合定位于肌动蛋白V马达。一旦某些凋亡刺激影响肌动蛋白的细胞骨架，如细胞附着丢失，导致Bmf的释放，使其移位并结合促生存BCL-2蛋白。BMF最初被报道为仅bh3蛋白的致敏剂，不能直接激活Bak或Bax，但可以抑制抗凋亡BCL2家族蛋白释放直接激活剂或激活Bak/Bax。然而，后来的研究表明Bmf也可以作为一种活化剂。在缺少有效的直接激活剂(BIM和BID)的情况下，Bmf表现出对Bax或Bak的直接激活，并诱导效应剂介导的细胞色素c的释放和脂质体的通透性。
有研究表明小鼠中敲除BMF将会增加原始卵泡数量，延长雌性小鼠的可孕育年限。BMF能够介导小鼠胚胎期卵巢中卵母细胞的丢失，并限制了卵巢发育过程中生殖细胞的数量，但不影响最初卵巢中原始卵泡的数目。出生后20-50天的小鼠，BMF敲除的卵巢中闭锁卵泡数量少于野生小鼠。因此，BMF对卵巢中卵泡及卵母细胞生长发育具有较为重要的影响。然而，有关BMF对家畜，特别是小尾寒羊卵巢中卵泡的生长发育及颗粒细胞增殖的影响还未见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供Bmf作为细胞凋亡标志物的应用，揭示了颗粒细胞凋亡的新机制。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了Bmf作为细胞凋亡标志物的应用。
作为优选，所述细胞为羊颗粒细胞。
本发明提供了Bmf作为细胞凋亡标志物的应用。本申请以体外培养的小尾寒羊卵泡颗粒细胞为模型，通过过表达和干扰实验探索Bmf在颗粒细胞增殖或凋亡过程中的生物学作用及调控机制，为进一步深入研究小尾寒羊颗粒细胞凋亡和卵泡闭锁的分子调控提供理论参考。
附图说明
图1为分离培养的颗粒细胞形态及鉴定；
图2为颗粒细胞HE染色结果；
图3为BMF在细胞中的绿色免疫荧光图；
图4为DAPI染料标记的蓝色DNA分布图；
图5为Mito-Tracker Red CMXRos染料标记的线粒体分布图；
图6为3种荧光融合图；
图7为Tunel法检测细胞凋亡的免疫荧光图；
图8为凋亡率统计图；
图9为检测细胞增殖率的OD值；
图10为siRNA-7257转染后qRT-PCR检测mRNA表达水平；
图11为siRNA-7257转染后WB结果；
图12为siRNA-7257转染后目的蛋白相对表达结果；
图13为Tunel法检细胞凋亡的免疫荧光图；
图14为凋亡率统计图；
图15为检测细胞增殖率的OD值；
图16为BMF过表达实验的qRT-PCR检测mRNA表达水平；
图17为BMF过表达实验的WB结果；
图18为BMF过表达实验的目的蛋白相对表达结果。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1卵泡颗粒细胞的分离培养
成年羊的卵巢采自甘肃省临夏县屠宰场，置于37℃加有100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素(索莱宝)的生理盐水中，保存于保温瓶中带回实验室。
37℃生理盐水清洗多次，用16号针头抽吸直径2～5mm窦状卵泡中的卵泡液，1500r/min室温离心5min，弃上清，获得颗粒细胞；加入DMEM/F12(HyClone)培养液清洗两遍，再用含10％FBS(Gibco)和1％青霉素/链霉素的DMEM/F12培养液清洗并悬浮。后以2×105cell/孔，接种于6孔细胞培养板中，置于CO2恒温培养箱进行细胞培养。
实施例2 RNA干扰和过表达质粒的转染
根据BMF基因序列(Ensembl：ENSOARG00000020116)委托Genechem(上海)公司构建BMF干扰质粒及NC质粒，通过BamHⅠ和HindⅢ酶切将目的片段连接至GV102载体中。所用引物为：siRNA-7256引物siRNA-7256-F和siRNA-7256-R，其中siRNA-7256-F的序列如SEQ IDNo：1所示，siRNA-7256-R的序列如SEQ ID No：2所示；siRNA-7257引物siRNA-7257-F和siRNA-7257-R，其中siRNA-7257-F的序列如SEQ ID No：3所示，siRNA-7257-R的序列如SEQID No：4所示；siRNA-7258引物siRNA-7258-F和siRNA-7258-R，其中siRNA-7258-F的序列如SEQ ID No：5所示，siRNA-7258-R的序列如SEQ ID No：6所示；TTCTCCGAACGTGTCACGT为对照插入序列。
参照BMF基因序列(AccessionNO.：XM_015096939.2)设计引物Bmf-F1和Bmf-R1，Bmf-F1的序列如SEQ ID No：7所示，Bmf-R1的序列如SEQ ID No：8所示。通过PCR、双酶切和重组反应等方法实现目的基因连接至GV146载体中，重组产物通过转化、鉴定、测序、质粒抽提等方法获得并鉴定过表达载体，整个试验交由Genechem(上海)公司完成。
转染前一天，细胞以2×105cell/孔接种于6孔板中，含血清培养液培养24h。后将培养基更换为无血清的Opti-MEM培养基，根据说明书要求加入转染质粒及转染试剂(Genechem,上海)，37℃孵育6h。后除去转染试剂复合液，更换正常培养基，37℃培养48h用于后续试验。
实施例3qRT-PCR
使用Trizol(Invitrogen)试剂提取细胞总RNA，后用Nanodrop 2000(Thermo，美国)结合琼脂糖凝胶电泳进行质检。利用反转录试剂盒(TransGen Biotech，北京)将RNA反转录为cDNA，并使用荧光定量PCR试剂盒(TransGen Biotech，北京)做qRT-PCR实验。所用引物为：Gapdh基因引物Gapdh-F和Gapdh-R，其中Gapdh-F的序列如SEQ ID No：9所示，Gapdh-R的序列如SEQ ID No：10所示；Bmf基因引物Bmf-F2和Bmf-R2，其中Bmf-F2的序列如SEQ IDNo：11所示，Bmf-R2的序列如SEQ ID No：12所示；Bcl-2基因引物Bcl-2-F和Bcl-2-R，其中Bcl-2-F的序列如SEQ ID No：13所示，Bcl-2-R的序列如SEQ ID No：14所示；Bax基因引物Bax-F和Bax-R，其中Bax-F序列如SEQ ID No：15所示，Bax-R序列如SEQ ID No：16所示；PCNA基因引物PCNA-F和PCNA-R，其中PCNA-F的序列如SEQ ID No：17所示，PCNA-R的序列如SEQID No：18所示；Bak基因引物Bak-F和Bak-R，其中Bak-F的序列如SEQ ID No：19所示，Bak-R的序列如SEQ ID No：20所示；Caspase3基因引物Caspase3-F和Caspase3-R，其中Caspase3-F的序列如SEQ ID No：21所示，Caspase3-R的序列如SEQ ID No：22所示。所用序列由上海生工合成，GAPDH做内参，基因相对表达量用2-ΔΔCt法计算。
实施例4 Bmf兔多克隆抗体的制备
参照BMF氨基酸序列(Ensembl：ENSOART00000021901.1)，用载体蛋白KLH偶联Bmf多肽(EPPQCVEELEDDV)，纯化并获得高纯度的免疫原(EPPQCVEELEDDV-Cys-KLH)。后与弗氏佐剂进行乳化，对新西兰大白兔进行皮下多点免疫。免疫剂量为400μg/只，连续5次免疫，间隔2～3周；第4次免疫后10天采集兔血清进行抗体检测，待抗体效价大于1：100000，单独使用多肽进行第5次免疫；免疫后10天收集兔抗血清，采用多肽亲和柱对血清进行纯化，获得针对多肽的兔多克隆抗体，并进行抗体效价、纯度和浓度检测，检测合格后用于后续实验。整个抗体的制备交由西安迈博睿生物公司(Membrane Solutions)完成。
实施例5 Western Blotting
使用含PMSF的RIPA裂解液(索莱宝，北京)提取细胞总蛋白，将蛋白变性后用氨基黑(索莱宝，北京)定量蛋白浓度。用12％SDS-PAGE凝胶(CoWinBiosciences，康为，北京)电泳分离，后将蛋白质转移至NC膜上。封闭液(碧云天，Beyotime，上海)封闭1h后，一抗(Bax，ab32503，abcam；PCNA,ab29，abcam；Bcl-2，mab8272，R&D；β-actin,ap0060，bioworld；及Bmf)4℃孵育过夜。PBST洗涤，二抗室温孵育2h，ECL发光液发光显影。β-actin做内参，3个技术重复。Prism J软件对条带灰度值进行量化，并计算目的蛋白的相对表达丰度。
实施例6细胞免疫组化
FSHR鉴定原代细胞采用免疫组化技术。首先制备细胞爬片，4％多聚甲醛固定。PBS清洗后加入修复液(碧云天，上海)。封闭液(碧云天，上海)封闭1h，一抗(FSHR，ab150557，abcam)4℃孵育过夜，HRP标记的二抗孵育2h。加入TMB显色液，PBS清洗，苏木精室温染色，后加入返蓝液稍微反蓝，PBS清洗后拍照。
Bmf定位试验采用细胞免疫荧光技术，首先在培养基中加入Mito-Tracker RedCMXRos染料(碧云天，上海)37℃孵育4h，制备细胞爬片，后用4％多聚甲醛固定。加入0.1％Tritonx-100(碧云天，上海)透化，PBS清洗。封闭液(碧云天，上海)封闭1h，一抗(Bmf)4℃孵育过夜，FITC标记的二抗孵育2h。PBS清洗，DAPI染色，显微镜观察拍照。
实施例7细胞增殖和凋亡试验
细胞增殖使用CCK8试剂盒(七海，7sea，上海)进行检测。96孔板中每孔接种5×103个细胞，转染24h后，更换培养基，每孔加入10μL CCK-8溶液，37℃孵育2h。用酶标仪测定450nm处的吸光度。
细胞凋亡使用Tunel试剂盒(Beyotime，上海)进行检测。96孔板中每孔接种1×104个细胞，转染24h后，更换培养基。制备细胞爬片，4％多聚甲醛固定，按照说明书进行tunel染色，后DAPI染色，清洗后拍照。
数据分析：利用Image J软件统计细胞数目，并测算WB条带灰度值。GraphpadPrism软件对数据做独立样本T检验分析。所有图由Adobe Illustrator软件绘制。每个实验3次重复，数据以“平均值±标准误”表示。
结果分析：
1.羊颗粒细胞的鉴定
FSHR为颗粒细胞标记蛋白，采用免疫组化方法检测体外培养的细胞中FSHR表达情况，进一步鉴定所培养细胞是否为颗粒细胞。结果如图1所示，FSHR在所有细胞中呈免疫阳性，表明分离培养的细胞为颗粒细胞，纯度达95％以上，排除了膜细胞的污染。HE染色结果如图2所示，显示颗粒细胞呈梭形或不规则的多边形，细胞核明显，呈圆形。
2.BMF在颗粒细胞中定位
正常情况下，BMF存在于胞浆中的细胞骨架上，一旦损伤刺激作用于细胞，BMF从胞浆转移至线粒体，引发线粒体凋亡途径。细胞免疫荧光结果显示，BMF主要分布于羊颗粒细胞的线粒体及细胞骨架上；同时在细胞核处也表现出阳性荧光，这是由于羊颗粒细胞本身的细胞核较明显，占细胞比例较大所致。BMF在羊颗粒细胞中的免疫荧光定位结果如图3～6所示，图3为BMF在细胞中的绿色免疫荧光图，图4为DAPI染料标记的蓝色DNA分布图，图5为Mito-Tracker Red CMXRos染料标记的线粒体分布图，图6为3种荧光融合图。
3.siRNA-7257介导BMF基因敲低影响细胞增殖
设计了3条siRNA序列(siRNA-7256、siRNA-7257和siRNA-7258)，收集转染后48h的颗粒细胞，通过qRT-PCR检测转染效率。结果如表1所示，3条siRNA序列都能够有效敲低Bmf基因，其中siRNA-7257敲低效率最高，可用于后续实验。
表1
Figure BDA0003062962850000071
siRNA-7257转染后细胞增值情况，结果如图7～9和表2所示，图7为Tunel法检测细胞凋亡的免疫荧光图，图8为凋亡率统计图，图9为检测细胞增殖率的OD值。*代表P<0.05，差异显著；**代表P<0.01，差异极显著，BMF敲低后细胞凋亡率与对照组相比显著降低(P<0.05)；相反细胞增殖活性极显著增加(P<0.01)。
表2
Figure BDA0003062962850000072
检测增殖或凋亡相关基因的表达量如图10～12、表3所示，图10为qRT-PCR检测mRNA表达水平，图11为WB结果，图12为目的蛋白相对表达结果。*代表P<0.05，差异显著；**代表P<0.01，差异极显著。PCNA和Bcl-2表达量显著升高(P<0.01或P<0.05)，Bax表达量显著降低(P<0.05)，qPCR与WB结果趋势一致，该结果从基因表达的角度进一步印证了细胞增殖率结果，表明BMF敲低能够提高羊卵巢颗粒细胞增殖。
表3
Figure BDA0003062962850000073
Figure BDA0003062962850000081
4.BMF过表达影响细胞凋亡
BMF过表达后检测细胞增殖和凋亡率，结果显示细胞凋亡率极显著增加(P<0.01)，细胞增殖活性极显著降低(P<0.01)，结果如图13～15、表S7所示。图13为Tunel法检细胞凋亡的免疫荧光图，图14为凋亡率统计图，图15为检测细胞增殖率的OD值。**代表P<0.01，差异极显著。
基因表达量检测结果表明，Bax和Bak基因的mRNA水平表达量显著增高(P<0.05)；Caspase3由于组间差异较大，未表现出显著差异(P>0.05)，结果如图16～18、表4所示。图16为qRT-PCR检测mRNA表达水平，图17为WB结果，图18为目的蛋白相对表达结果。*代表P<0.05，差异显著；**代表P<0.01，差异极显著。Bax蛋白水平由于组间差异较大，未表现出显著差异(P>0.05)。然而增殖相关基因(PCNA和Bcl-2)mRNA和蛋白水平均差异显著(P<0.01或P<0.05)。
表4
Figure BDA0003062962850000082
本研究明确了Bmf在羊颗粒细胞凋亡中起关键作用，同时揭示了颗粒细胞凋亡的新机制。
由以上实施例可知，本发明提供了Bmf作为细胞凋亡标志物的应用。本申请以体外培养的小尾寒羊卵泡颗粒细胞为模型，通过过表达和干扰实验探索Bmf在颗粒细胞增殖或凋亡过程中的生物学作用及调控机制，为进一步深入研究小尾寒羊颗粒细胞凋亡和卵泡闭锁的分子调控提供理论参考。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 甘肃农业大学
<120> Bmf作为细胞凋亡标志物的应用
<160> 22
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gatcccttgc tctctgctga cctgtttctc gagaaacagg tcagcagaga gcaatttttg 60
gat 63
<210> 2
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
agctatccaa aaattgctct ctgctgacct gtttctcgag aaacaggtca gcagagagca 60
agg 63
<210> 3
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gatcccgacc agttccatcg gcttcatctc gagatgaagc cgatggaact ggtctttttg 60
gat 63
<210> 4
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
agctatccaa aaagaccagt tccatcggct tcatctcgag atgaagccga tggaactggt 60
cgg 63
<210> 5
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gatccctggc agatcctcct cttcctactc gagtaggaag aggaggatct gccatttttg 60
gat 63
<210> 6
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
agctatccaa aaatggcaga tcctcctctt cctactcgag taggaagagg aggatctgcc 60
agg 63
<210> 7
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
taccggactc agatctcgag cgccaccatg gagccacccc agtgtgtg 48
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<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
taccgtcgac tgcagaattc tcacctgggg cctgccccat tcc 43
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<211> 22
<212> DNA
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<400> 9
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ccagttccat cggcttcata 20
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
cccattcctg ttctcatctc c 21
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
tggatgaccg agtacctgaa 20
<210> 14
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
gagacagcca ggagaaatca aa 22
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
ttgcttcagg gtttcatcca 20
<210> 16
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
acactcgctc agcttcttg 19
<210> 17
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
aggaggaagc tgttaccata ga 22
<210> 18
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
tactgtagga gacagtggag tg 22
<210> 19
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
cgctacgaca cagagttcc 19
<210> 20
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
tgatgccgct ctcaaaca 18
<210> 21
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
acagaactgg actgtggtat tg 22
<210> 22
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
gaagtctgcc tcaactggta tt 22

Claims (2)

1.Bmf作为细胞凋亡标志物的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述细胞为羊颗粒细胞。
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