CN110724706B - Oct4泛素化修饰突变体在提高诱导体细胞重编程效率中的应用 - Google Patents

Oct4泛素化修饰突变体在提高诱导体细胞重编程效率中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及Oct4泛素化修饰突变体在提高诱导体细胞重编程效率中的应用。本发明首次揭示了Wwp2催化Oct4泛素化修饰位点，且该催化作用降低Oct4蛋白质稳定性，而对于Oct4的泛素化位点的选择性突变则可以改变这一状况，可以使得Oct4参与的细胞重编程的效率显著性提高。并且，Ash2l‑b也具有提高诱导重编程效率的功能。

Description

Oct4泛素化修饰突变体在提高诱导体细胞重编程效率中的 应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，更具体地，本发明涉及Oct4泛素化修饰突变体在提高诱导体细胞重编程效率中的应用。
背景技术
2006年，日本京都大学Shinya Yamanaka实验室在24种因子中筛选出4个转录因子Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc，将这四种因子组合转入小鼠成纤维细胞中诱导其转化为具有发育多能性的细胞，并命名为诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)。随着该领域研究的深入开展，Oct4在诱导重编程中的核心作用日益凸显。最初确立的重编程四因子中，Klf4和c-Myc能够被Nanog和Lin28或者Esrrb代替。除Oct4以外，Sox2和Klf4都可以被同家族中其他成员代替发挥诱导体细胞重编程的功能。还有研究证明单独Oct4就足够诱导小鼠和人神经干细胞重编程，而小鼠成纤维干细胞也只需导入Oct4一个因子，再结合小分子抑制剂，就可以诱导形成iPSCs。虽然有研究报道核受体Nr5a2(结合Sox2和Klf4)能够代替外源表达Oct4诱导体细胞重编程，而且还有方法不需要任何转入任何外源基因，直接通过小分子化合物就能够实现重编程，但是Oct4在诱导重编程中发挥的关键作用仍然是毋庸置疑。结构生物学研究发现Oct4含有两个由α螺旋连接的POU结构域，α螺旋结构的突变能够抑制重编程，但是不会影响Oct4的其他功能。深入分析发现，α螺旋结构参与介导Oct4蛋白与其他蛋白间的结合，从而招募表观遗传修饰因子到Oct4下游靶基因，激活多能性相关基因的表达，诱导体细胞重编程。
由上可见，Oct4的表达水平调控多能性维持、分化与建立等过程，所以研究如何精确调节Oct4的蛋白水平具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于提供Oct4泛素化修饰突变体在提高诱导体细胞重编程效率中的应用。
在本发明的第一方面，提供一种细胞重编程的方法，所述的细胞重编程方法中，采用包含Oct4的转录因子组合诱导细胞重编程，其中，所述的Oct4的泛素化位点发生突变，所述的泛素化位点包括：第118位，第121位，第133位，第137位或第144位的赖氨酸。
在一个优选例中，所述的氨基酸编号基于SEQ ID NO:2所示的野生型Oct4氨基酸序列。
在另一优选例中，所述的泛素化位点的突变包括：第118位，第121位，第133位，第137位和第144位的突变；或第121位，第133位，第137位和第144位的突变。
在另一优选例中，所述的突变是由赖氨酸突变为不能发生泛素化修饰的氨基酸；较佳地，所述的不能发生泛素化修饰的氨基酸包括：精氨酸。
在另一优选例中，所述的包含Oct4的转录因子组合包括：Oct4，Sox2、Klf4和c-Myc组合；或Oct4，Sox2和Klf4。
在另一优选例中，所述的细胞是体细胞；较佳地，所述的体细胞包括：成纤维细胞，上皮细胞，血液细胞，神经细胞，胚胎细胞，组织或器官来源的细胞。
在另一优选例中，所述的细胞重编程的方法为非治疗性的方法。
在另一优选例中，Oct4的泛素化位点的突变提高重编程过程中H3K4甲基化修饰水平，从而促进重编程；或Oct4的泛素化位点的突变减少Oct4的降解，增强Oct4的蛋白稳定性，从而促进重编程。
在另一优选例中，所述方法还包括：在细胞内过表达外源性Ash2l-b，使Ash2l-b水平上升。
在本发明的另一方面，提供一种Oct4突变体，所述的Oct4的泛素化位点发生突变，所述的泛素化位点包括：第118位，第121位，第133位，第137位或第144位的赖氨酸。
在一个优选例中，所述的泛素化位点的突变包括：第118位，第121位，第133位，第137位和第144位的突变；或所述的泛素化位点的突变包括：第121位，第133位，第137位和第144位的突变。
在另一优选例中，所述的突变是由赖氨酸突变为不能发生泛素化修饰的氨基酸；较佳地，所述的不能发生泛素化修饰的氨基酸包括：精氨酸。
在本发明的另一方面，提供编码前面任一所述Oct4突变体的多核苷酸。
在本发明的另一方面，提供一种表达载体，其中包含编码前面任一所述Oct4突变体的多核苷酸。
在本发明的另一方面，提供一种宿主细胞，其中包含所述的表达载体，或包含编码前面任一所述Oct4突变体的多核苷酸。
在一个优选例中，该宿主细胞中还包括：与Oct4共同诱导细胞重编程的转录因子组合；较佳地，转录因子组合包括：Oct4，Sox2、Klf4和c-Myc的组合；或Oct4，Sox2和Klf4的组合。
在本发明的另一方面，提供前面任一所述的Oct4突变体的用途，用于作为细胞重编程的转录因子。
在本发明的另一方面，提供Ash2l-b的用途，用于促进细胞重编程。
在本发明的另一方面，提供一种用于进行细胞重编程的试剂盒，所述的试剂盒中包括：前面任一所述的Oct4突变体，或能表达该Oct4突变体的表达构建物(如表达载体)。
在一个优选例中，所述的试剂盒中还包括转录因子：Sox2、Klf4、c-Myc组合，Sox2与Klf4的组合，或能表达该Sox2、Klf4和/或c-Myc的表达构建物(如表达载体)；或所述的试剂盒中还包括：Ash2l-b或能重组表达Ash2l-b的表达构建物(如表达载体)。
在本发明的另一方面，提供一种筛选促进细胞重编程的潜在物质的方法，所述方法包括：
(1)将候选物质与Wwp2与Oct4相互作用的体系接触；
(2)检测候选物质对Wwp2与Oct4相互作用的影响；
若所述候选物质可抑制Wwp2与Oct4相互作用，则表明该候选物质是促进细胞重编程的潜在物质。
在一个优选例中，在测试组中，将候选物质加入到Wwp2与Oct4相互作用的体系中；和/或
步骤(2)包括：检测测试组的体系中Wwp2与Oct4相互作用情况，并与对照组比较，其中所述的对照组是不添加所述候选物质的Wwp2与Oct4相互作用的体系；
如果测试组中Wwp2与Oct4相互作用在统计学上弱于对照组，就表明该候选物质是促进细胞重编程的潜在物质。
在另一优选例中，所述的相互作用为：Wwp2催化Oct4发生泛素化修饰(即：所述的抑制相互作用或相互作用弱于，表示Wwp2催化Oct4发生泛素化修饰被抑制或减弱)。
在另一优选例中，所述的体系选自：细胞体系、亚细胞体系、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1、Wwp2催化Oct4泛素化修饰突变体的构建。(A)Oct4泛素化修饰位点鉴定示意图。(B)质谱鉴定发现的五个赖氨酸位点可能是泛素化修饰位点。(C)体外泛素化修饰实验验证五个赖氨酸位点是Oct4泛素化修饰的主要位点。(D)Wwp2催化Oct4泛素化修饰的五个位点在多个哺乳物种(从上到下依次为人、猩猩、猴子、狼、牛、小鼠、大鼠)中序列比对分析，显示出五个位点的进化保守性。
图2、Oct4泛素化突变体能够维持小鼠胚胎干细胞自我更新。(A)表达对照组(不加DOX)和外源野生型Oct4及突变体Oct4(添加DOX)的ZHBTc4细胞形态。(B)Western blot(WB)实验分析各稳定细胞株的核心转录因子蛋白水平，Gapdh作为内参。(C)克隆形成实验检测图2A中细胞的自我更新能力，AP表示碱性磷酸酶。
图3、Oct4泛素化突变体增强重编程效率。(A)诱导重编程流程图。(B)比较O(WT)SK、O(4R)SK和O(5R)SK组EGFP阳性细胞数。
图4、(A)碱性磷酸酶染色实验比较Wwp2基因敲除和野生型MEF的重编程效率。(B)WB分析Wwp2在野生型和基因敲除MEF中的表达。
图5、比较诱导重编程后O(WT)SK、O(K118R)SK和O(E120A)SK实验组GFP阳性细胞数。
图6、(A)PCA分析3、5、7天转入O(WT)SK或O(5R)SK的MEFs及ESCs的基因芯片数据。(B)热图分析3、5、7天转入O(WT)SK或O(5R)SK的MEF中部分上调基因和下调基因的表达。
图7、(A)WB检测分别导入O(WT)SK、O(4R)SK和O(5R)SK的MEF细胞中Oct4蛋白水平，β-Actin作内参。(B)WB实验检测CHX处理0、4、8、12小时后分别转染O(WT)SK、O(4R)SK和O(5R)SK组MEF细胞中Oct4蛋白稳定性，β-Actin作内参。
图8、WB分析重编程第5天和第8天分别导入O(WT)SK、O(4R)SK和O(5R)SK细胞中组蛋白甲基化修饰水平。
图9、催化H3K4组蛋白甲基化修饰的MLL蛋白复合物中核心亚基的mRNA表达情况。
图10、Ash2l-b能够促进重编程。(A)敲低Ash2l抑制重编程。(B)过表达Ash2l-b及OSK能够提高重编程的效率。
具体实施方式
本发明人在广泛研究的基础上，发现Wwp2(WW domain containing E3ubiquitinprotein ligase 2)催化Oct4(Octamer-binding transcription factor 4)泛素化修饰位点，且这一催化作用使得Oct4稳定性降低。而对于Oct4的泛素化位点的选择性突变则可以提升Oct4蛋白稳定性，使得Oct4参与的细胞重编程的效率显著性提高。并且，Ash2l-b(set1/Ash2histone methyltransferase complex subunit ASH2isoform b)也具有提高诱导重编程效率的功能。在此基础上完成了本发明。
在研究前期，本发明人首先以寻找Oct4相互作用蛋白或含有Oct4的蛋白复合体作为重要切入点，建立了在胚胎干细胞水平研究蛋白质之间相互作用的技术平台，发现了若干个与Oct4相互作用的蛋白质，其中，发现一个与Oct4相互作用的新蛋白Wwp2(SEQ ID NO:1或其同功能变体)。通过分析蛋白结构，发现它含有1个C2功能域、4个WW功能域和1个HECT功能域，提示其属于Nedd-4样的泛素连接酶家族。后续实验证明，Wwp2确实具有蛋白泛素化连接酶E3的活性。它不仅能与Oct4特异性地结合，并能催化Oct4的泛素化修饰和抑制Oct4的转录活性。
本发明提供了一种细胞重编程的方法，所述的细胞重编程方法中，采用包含Oct4的转录因子组合诱导细胞重编程，其中，所述的Oct4的泛素化位点发生突变，所述的泛素化位点包括：第118位，第121位，第133位，第137位或第144位的赖氨酸。在本发明的优选方式中，所述的泛素化位点的突变包括：第118位，第121位，第133位，第137位和第144位的突变；或第121位，第133位，第137位和第144位的突变。在本发明的优选方式中，所述的突变是由赖氨酸突变为不能发生泛素化修饰的氨基酸。除非另外说明，本发明所述的氨基酸突变位置的编号基于SEQ ID NO:2所示的野生型Oct4氨基酸序列。
本发明还包括所述Oct4突变体的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的Oct4突变体相同的生物学功能或活性的蛋白。本发明的蛋白片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的蛋白，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的蛋白，或(iii)附加的氨基酸序列融合到此蛋白序列而形成的蛋白(如前导序列或分泌序列或用来纯化此蛋白的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根据本文的定义这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。然而，所述的Oct4突变体及其片段、衍生物和类似物的氨基酸序列中，对应于野生型Oct4，肯定存在本发明上上段所述的任一组泛素化位点的突变。
本发明还提供了编码本发明Oct4突变体或其保守性变异蛋白的多核苷酸序列。本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。
编码所述突变体的成熟蛋白的多核苷酸包括：只编码成熟蛋白的编码序列；成熟蛋白的编码序列和各种附加编码序列；成熟蛋白的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。“编码蛋白的多核苷酸”可以是包括编码此蛋白的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或Oct4突变体编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述蛋白的方法。
本发明中，Oct4突变体多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。
包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。
本发明所述的Oct4突变体作为用于促使细胞重编程的一个转录因子起作用。促使细胞重编程的其它转录因子是本领域了解的，例如，所述的转录因子组合包括：Oct4突变体，Sox2、Klf4和c-Myc组合；或Oct4突变体，Sox2和Klf4。
由于个体中不同种类的细胞具有相同的基因组。因此，多种种类的细胞均具有发生重编程的潜能。较佳地，所述的细胞是哺乳动物体细胞或胚胎细胞。更佳地为比较容易获得的成体细胞，比如皮肤成纤维细胞等。更具体地，所述的体细胞包括：成纤维细胞，上皮细胞，血液细胞，神经细胞，胚胎细胞，组织或器官来源的细胞。
使细胞过表达外源基因(在本发明中为转录因子)的方法是本领域技术人员所熟知的。编码转录因子的多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。另外，也可将转录因子蛋白外源表达后，与细胞共培养而使得转录因子蛋白进入到细胞内。一种可选择的方式例如：将转录因子蛋白与细胞穿透肽融合，由细胞穿透肽介导进入到细胞中。所述的“细胞穿透肽”是指一类具有细胞穿透作用的多肽，其自身或其与其它蛋白的融合蛋白可通过细胞膜进入到细胞内。所述的细胞穿透肽包括：反式激活蛋白(TAT)、Penetratin、基于信号序列的肽、pVEC、Transportan、Amphiphilic model peptide和Arg9等。
本发明人的研究表明，Oct4的泛素化位点的突变提高了重编程过程中H3K4甲基化修饰水平，从而促进重编程。Oct4的泛素化位点的突变减少Oct4的降解，增强Oct4的蛋白稳定性，从而促进重编程。
本发明人还发现，在细胞内重组表达Ash2l-b(SEQ ID NO:3或其同功能变体)，使Ash2l-b水平上升，也能促进重编程。所述的Ash2l-b包括野生型Ash2l-b或其片段、衍生物、类似物或同源物。其中，术语“片段”、“衍生物”、“类似物”或“同源物”是指基本上保持野生型Ash2l-b相同的生物学功能或活性的蛋白。
本发明中，首次披露了Wwp2与Oct4发生相互作用，即Wwp2催化Oct4的泛素化修饰，抑制Oct4的转录活性。基于本发明人的该新发现，可以筛选促进细胞重编程的潜在物质。
因此，本发明提供一种筛选促进细胞重编程的潜在物质的方法，所述方法包括：(1)用候选物质处理Wwp2与Oct4相互作用的体系；和(2)检测所述Wwp2与Oct4相互作用的体系中Wwp2与Oct4相互作用情况；若所述候选物质在统计学上抑制(优选显著抑制，如抑制20％以上，较佳的抑制50％以上；更佳的抑制80％以上)Wwp2与Oct4相互作用，则表明该候选物质是促进细胞重编程的潜在物质。其中，所述的相互作用为：Wwp2催化Oct4发生泛素化修饰，所述的抑制相互作用表示Wwp2催化Oct4发生泛素化修饰被抑制或减弱。
在本发明的优选方式中，在进行筛选时，为了更易于观察到Wwp2与Oct4相互作用变化情况，还可设置对照组，所述的对照组可以是不添加所述候选物质的Wwp2与Oct4相互作用的体系。
作为本发明的优选方式，所述的方法还包括：对获得的潜在物质进行进一步的细胞实验和/或动物实验，以进一步选择和确定对于促进细胞重编程真正有用的物质。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
材料和方法
1、质粒构建
Ash2l和Oct4表达载体的构建：以小鼠胚胎干细胞cDNA为PCR反应模板，利用特异性引物，使用高保真KOD-Plus-Neo DNA聚合酶进行PCR反应，PCR循环：预变性94℃ 4min；变性94℃ 15sec，退火60℃ 30sec(退火温度根据不同引物序列进行调整)，延伸68℃(延伸时间根据不同目的片段的长度进行调整，依照1kb/min的延伸速度进行计算)，30个循环(循环数也可以根据不同目的片段进行调整)；延伸68℃ 10min，4℃保存。将PCR得到的片段Ash2l-a、Ash2l-b、Oct4直接插入到pGEM-T Easy载体中，然后利用双酶切的方法插入pPyCAGIP-adaptor载体和pMXs载体的XhoI和NotI位点中，测序确认后得到相应的质粒。
Ash2l-a扩增引物：
Forward 5’CCGCTCGAGCGGATGGCGGCGGCTGGAGCGG 3’(SEQ ID NO:4)
Reverse 5’TTAGGGTTCCCAGGGTGGACTACGTCTTCCGT 3’(SEQ ID NO:5)
Ash2l-b扩增引物：
Forward 5’CCGCTCGAGCGGATGGATACCCAGGCGGGCTCTGTG3’(SEQ ID NO:6)
Reverse 5’TTAGGGTTCCCAGGGTGGACTACGTCTTCCGT 3’(SEQ ID NO:7)
Oct4扩增引物：
Forward 5’CCGCTCGAGCGGATGGCTGGACACCTGGCTTCAG 3’(SEQ ID NO:8)
Reverse 5’TCAGTTTGAATGCATGGGAGAGCCCAGAGCAGTGACG 3’(SEQ ID NO:9)
用于慢病毒包装的RNAi质粒的构建：根据靶向的不同基因序列，设计特异的shRNA序列。
Ash2l shRNA序列为：
#1：GGAATAGACACGTCGTCATGT(SEQ ID NO:10)；
#2：GGCCAGAAGTGATCCTTTATT(SEQ ID NO:11)；
#3：GCCGGACACCTACAAAGATAA(SEQ ID NO:12)；
#4：CGAGTCTTGTTAGCCCTACAT(SEQ ID NO:13)。
在这四条序列基础上添加酶切位点和发卡结构后，送公司合成。将合成好的两条互补单链序列，加入ddH2O溶解至浓度100uM。溶解后各取两条互补的序列5uL，再加入5uLNEB buffer 2、35uL ddH2O混匀，离心。将50uL反应体系放入PCR仪中，95℃加热5min，然后设置梯度降温，每分钟温度下降1℃，逐渐从95℃降至22℃，使单链序列互补配对形成带有粘性末端的双链DNA序列。然后将这段序列连接插入到酶切反应后的pLKO.1或pLKO.pig慢病毒载体上，用于后续慢病毒包装与感染的实验。
2、细胞培养
小鼠胚胎干细胞系ZHBTc4：用于ZHBTc4细胞培养的培养皿预先用0.1％的明胶包被，37℃培养箱中放置30min或4℃过夜。基础培养基为N2B27，配置方法添加N2(100×，Gibco)的DMEM/F12(Gibco)与添加B27(50×，Gibco)的Neurobasal(Gibco)等体积混合，另添加1uM PD0325901、3uMCHIR99021、1000U/mL LIF。
诱导多能干细胞系和小鼠胚胎干细胞系J1：用于J1细胞培养的培养皿预先用0.1％的明胶包被，37℃培养箱中放置30min或4℃过夜。基础培养基为DMEM(Hyclone)，另添加15％FBS、1000U/mL LIF、2mMGlutamax(Gibco)、0.1mM非必需氨基酸(Gibco)、1mM丙酮酸钠和0.1mMβ-巯基乙醇(Invitrogen)。
Oct4-EGFP MEF细胞系：基础培养基为DMEM(Hyclone)，另添加10％FBS、2mMGlutamax(Gibco)、0.1mM非必需氨基酸(Gibco)、1mM丙酮酸钠和0.1mMβ-巯基乙醇(Invitrogen)。
Plat-E细胞和HEK293FT细胞：基础培养基为DMEM(Hyclone)，另添加10％FBS、2mMGlutamax(Gibco)、0.1mM非必需氨基酸(Gibco)、1mM丙酮酸钠。
3、稳定表达细胞系的建立
稳定表达Oct4-WT、Oct4-4R和Oct4-5R细胞系的建立：利用脂质体转染法将表达Oct4-WT、Oct4-4R和Oct4-5R的质粒转到小鼠胚胎干细胞ZHBTc4中，转染12h后更换新鲜的培养液，转染48h后，添加DOX(100ng/mL)下调Oct4的表达，再24h后加入Puromycin(1ug/mL)筛选，待细胞没有明显的死亡现象后再进行传代。传代后的细胞培养仍添加Puromycin提供选择压力，继续培养3代后的细胞用作稳定表达的细胞系用于后续实验。
4、慢病毒包装与RNAi筛选
当HEK293FT细胞密度达到70-90％时，即可进行质粒转染。转染前12h，HEK293FT细胞更换新鲜的培液。转染时将12ug质粒(Ash2l-shRNA-pLKO.1：psPAX2：pMD2.G＝4:3:1)与200uL Opti-MEM培养液混合，同时将30uLLipofectamine 2000与200uL Opti-MEM培养液混合，室温放置5分钟后再将两组混合液混合在一起，室温静置20分钟后，均匀地逐滴滴加到培养皿中，轻轻混匀。转染12h后更换新鲜培养液。继续培养48h后，小心收集包含病毒的培养液，使用0.45um的滤器过滤后可短期保存在4℃备用或置于-80℃冰箱长期保存。
5、碱性磷酸酶(Alkaline phosphotase，AKP)染色
吸去培养皿中的培液，加入PBS洗一遍，吸去PBS；加入适量4％多聚甲醛(PFA)，盖住皿底即可，室温固定15min；吸去PFA，加入0.2％TritonX-100，透膜室温静置15min；使用碱性磷酸酶染色试剂盒，配置AKP染色剂，5mL Tris-HCl(100mM-200mM，pH8.2-8.5)加AKP染色剂A、B、C各2滴，混匀后避光；吸去透膜液，每孔加入1.5mL配制好的AKP染色剂，避光，37℃温箱染色20-30min；吸出AKP染色剂，加入PBS进行观察、拍照和计数。
6、诱导体细胞重编程
Plat-E细胞铺到10cm培养皿中，培养24h后进行质粒转染；将逆转录病毒质粒与X-tremeGene9转染试剂混合转染到Plat-E细胞中。转染24h后，补加一些培养液；继续培养24h后，收取含有病毒的培养液，用0.45um的滤器过滤，置于冰箱保存备用。
1×105MEF细胞和1mL MEF培养液铺到6孔板中，37℃培养箱培养24h后，加入含有表达各因子的病毒各2mL和Polybrene(5ug/mL)；感染12h后，PBS吸2遍后，加入2mL MEF培养基继续培养36h。在病毒感染后的第3天，用0.25％胰酶将6孔板中的感染过病毒的MEF消化成单细胞，转移到0.1％明胶包被过的10cm培养皿中，换用ES培养基继续培养。重编程早期，隔天换一次培养液，在后期，每天更换培养液。
7、体外泛素化修饰实验
泛素化修饰是一个多步骤的反应过程，至少需要三类酶(E1，E2，E3)，在ATP存在条件下，泛素共价结合到底物上完成泛素化修饰。本发明人通过原核表达融合蛋白，纯化得到连接有GST tag的泛素化连接酶E3(GST-Wwp2，GST-Itch)；从Merk公司购买E1，E2，以及His-Ub。各实验组按以下反应体系进行。
反应体系如下：
Figure BDA0001733291540000121
Figure BDA0001733291540000131
反应体积补加至30μl。
在30℃反应2小时。加入蛋白上样缓冲液终止反应，100℃处理10分钟，样品经SDS-PAGE电泳分离，免疫印迹实验检测泛素化修饰蛋白。
8、基因芯片(Micro-array)
在重编程的不同时间点，分别收集细胞样品，交由上海伯豪公司完成RNA提取，纯化以及后续芯片样品制备和杂交检测。芯片数据利用SBC提供的SAS分析系统和DAVID数据库进行数据挖掘和分析。
9、Wwp2基因敲除的MEF的建立
获取E13.5Wwp2基因敲除的小鼠胚胎，去掉头、四肢和内脏后的组织用0.25％胰酶消化5-10分钟(37℃)，加入含有10％胎牛血清的MEF培养液终止消化。过滤筛去除细胞团块，100g离心5分钟以后弃上清，加入细胞培养液重悬细胞，计数后取一定数量的细胞铺盘培养。
10、数据统计学分析
实施例中所涉及到的统计分析基于三次独立重复实验，数据呈现为平均值±标准差(mean±SD)。使用Student’s t检验对各组数据间差异进行显著性分析。P<0.05被认为两组之间差异具有统计学意义。P<0.05表示为*，P<0.01表示为**，P<0.001表示为***。
实施例
为了研究Wwp2催化Oct4泛素化修饰在诱导体细胞重编程过程中的作用机制，本发明人进行了质谱分析，首先发现了五个泛素化修饰位点，点突变这五个位点得到突变体Oct4-5R(将5个位点由K突变为R)。该突变体与Sox2、Klf4的组合能显著提高诱导小鼠成纤维细胞重编程为iPSC的效率近10倍。具体实验结果如下：
Oct4全长氨基酸序列(SEQ ID NO:2)如下，其中方框呈现五个K位点：
Figure BDA0001733291540000141
实施例1、Wwp2催化Oct4泛素化修饰位点的鉴定与突变体的构建
首先，本发明人利用质谱分析鉴定并通过体外泛素化实验验证了五个Wwp2催化Oct4泛素化修饰位点，分别为K118、K121、K133、K137、K144(图1A，B)。体外泛素化修饰实验证明这五个赖氨酸位点是Oct4泛素化修饰的主要位点(图1C)。然后，多序列比对分析发现，五个位点在进化上非常保守(图1D)，提示这五个位点上Wwp2催化的泛素化修饰很可能影响Oct4的功能。为了深入探究Wwp2催化Oct4泛素化修饰的功能，本发明人利用点突变方式去除泛素化分子在Oct4蛋白上的结合位点，将这五个赖氨酸残基突变为精氨酸，得到泛素化突变体Oct4-5R。其中K118位点既是Oct4泛素化修饰位点，也是Oct4SUMO(smallubiquitin-like modifier)化修饰位点。为了排除SUMO修饰的影响，本发明人将其他四个位点的赖氨酸突变，保留SUMO-1结合的赖氨酸位点，构建了另一个Oct4泛素化突变体Oct4-4R(第118位不突变，后4个位点由K突变为R)。
实施例2、Oct4-5R突变体能代替野生型Oct4维持小鼠胚胎干细胞自我更新
泛素化修饰是主要的蛋白质翻译后修饰方式之一，影响细胞内蛋白质水平、蛋白质定位与转录因子活性等，参与调节细胞增殖、DNA修复和细胞免疫应答等多个生物学过程。本发明人推测泛素化修饰突变可能通过影响Oct4的功能从而影响小鼠胚胎干细胞的自我更新状态。ZHBTc4是由Austin Smith实验室(英国剑桥大学干细胞研究中心)构建的Oct4表达可调控的小鼠胚胎干细胞系，该细胞系内源的Oct4被敲除，并外源转入一个受doxycycline(DOX)调控的Oct4，当细胞培养基中添加DOX后，Oct4的表达被关闭，是用于研究Oct4功能的良好细胞模型。因此本发明人利用ZHBTc4细胞系，添加DOX诱导Oct4表达关闭，同时导入外源性野生型Oct4-WT、泛素化突变体Oct4-4R及Oct4-5R，经过抗性筛选，得到稳定表达突变体的细胞系(图2A)。四组细胞都呈现典型的圆鼓状ES细胞克隆，分子水平检测小鼠胚胎干细胞多能性相关的标志性转录因子，Western blot(WB)实验结果显示四株细胞中蛋白表达量没有明显差异(图2B)。克隆形成实验是检验胚胎干细胞自我更新能力的经典实验，为了探究Wwp2催化(细胞内源的Wwp2起作用)Oct4泛素化修饰是否影响小鼠胚胎干细胞的自我更新状态，本发明人比较了四个稳定细胞株的克隆形成能力。碱性磷酸酶染色结果显示泛素化突变体Oct4-4R和Oct4-5R与野生型相比克隆形成能力相差无异(图2C)，Oct4-4R和Oct4-5R能够代替野生型Oct4维持小鼠胚胎干细胞的自我更新能力，说明Wwp2催化的Oct4泛素化修饰对与维持小鼠胚胎干细胞自我更新不是必须的。
实施例3、Oct4泛素化修饰突变提高诱导重编程效率
已经分化的细胞能够通过外源转入特定的转录因子实现重编程，转变为具有多能性的细胞。根据前述发现，伴随着分化过程，Wwp2催化Oct4泛素化修饰，下调Oct4蛋白水平。进一步地，本发明人推测在诱导重编程的过程中Wwp2催化Oct4泛素化修饰很可能发挥着阻碍作用。为了验证这一假设，本发明人分别将野生型Oct4-WT、Oct4泛素化突变体Oct4-4R、Oct4-5R与Sox2和Klf4(简称O(WT)SK、O(4R)SK和O(5R)SK)共同转入到小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblasts，MEF)中进行诱导重编程。为了指示完全重编程的成功，本发明人使用来自TgOG2小鼠(购自The Jackson Laboratory)的MEF细胞，该转基因小鼠外源转入由Oct4启动子和增强子共同调控的Egfp报告基因。当MEF被重编程后，启动Egfp基因表达，指示内源Oct4激活表达。将表达OSK的病毒上清液加入到MEF细胞中，此时遍定为重编程的第0天，感染24h后，洗去病毒，第3天时将细胞传代，并将细胞培养液换成小鼠胚胎干细胞的培养液，继续培养，在第14天检测GFP阳性克隆的形成效率(图3A)。
通过计数GFP阳性克隆，本发明人发现与O(WT)SK相比，O(5R)SK组合能够提高重编程效率至10倍左右，Oct4-4R突变体也能提高重编程效率近3倍左右(图3B)。另外，由于Wwp2是Oct4特异性的E3泛素连接酶，Wwp2基因的缺失应该和突变Oct4蛋白上泛素分子的结合位点一样影响诱导重编程过程，本发明人研究发现Wwp2基因敲除的MEF重编程效率远远高于野生型(图4A、B)，说明Wwp2催化的Oct4泛素化修饰是重编程中的一大障碍。
本发明人实验室以前的研究发现Oct4的SUMO化修饰能提高其蛋白稳定性，维持mESCs的自我更新状态。然而Oct-5R突变体中同时突变了SUMO化修饰位点，所以为了排除K118位点SUMO化修饰对重编程的影响，本发明人又构建了单独突变Oct4的K118及另一个SUMO化修饰的关键性位点E120的突变体(将118位K突变为R；将120位E突变为A)，将突变体与Sox2、Klf4共同转入到MEF细胞中检测重编程效率(图5)。与Oct4-WT相比，SUMO化突变体对重编程效率没有显著影响，确认是泛素化而不是SUMO化修饰能够增强重编程效率。
为了从组学层面揭示泛素化修饰突变提高诱导重编程效率的作用机制，本发明人利用基因芯片分析在重编程过程中整体基因表达变化情况。本发明人分别在O(WT)SK和O(5R)SK诱导重编程的第3、5、7天收取细胞进行microarray检测，PCA分析显示重编程初期(3天)两组重编程细胞没有明显区别，在第5天及第7天Oct4-5R实验组的重编程细胞与ESC更为接近，提示该组细胞的重编程速率更快(图6A)。热图分析结果显示，在重编程过程中部分上调基因和下调基因在Oct4-5R参与重编程的实验组细胞中，变化更加明显和迅速(图6B)，证明Wwp2催化Oct4泛素化修饰不仅能够促进重编程的效率，还能够提高重编程的速度。
实施例4、Oct4泛素化突变体Oct4-5R能够增强重编过程中Oct4的蛋白稳定性
Oct4泛素化突变体提高诱导重编程效率的分子机制是什么？因为泛素化修饰主要影响细胞内分子的蛋白水平，所以本发明人首先比较重编程过程中外源性Oct4-WT、Oct4-4R和Oct4-5R在诱导重编程过程中细胞内的蛋白水平。本发明人分别在重编程的4、5、6、7天收取细胞，通过WB实验分析Oct4的表达。在诱导重编程第4天时，三组Oct4蛋白水平相差不多，但是Oct-WT组在随后的5、6、7天中，Oct4的蛋白水平逐渐下调，而Oct4-4R和Oct4-5R组则保持在一个比较稳定的水平(图7A)，提示Oct4突变后蛋白质稳定性增强，降解速率减慢，因此本发明人进一步对Oct4蛋白的半衰期进行检测。重编程第5天，在加入CHX抑制合成8h后，Oct4-WT组已经几乎检测不到Oct4蛋白，但是在Oct4-4R和Oct4-5R组，直至12h后也能够检测到一定量的Oct4蛋白表达(图7B)，说明突变Oct4泛素化修饰位点确实能够显著减少Oct4的降解，增强Oct4的蛋白稳定性。
实施例5、泛素化突变体提高重编程过程中H3K4甲基化修饰水平
以上实验结果提示Oct4蛋白水平影响诱导体细胞重编程的效率，但是从本发明人的结果中可以发现，Oct4-4R和Oct4-5R的蛋白水平相差不大，而诱导重编程的效率相差7倍左右，所以本发明人推测除蛋白水平差异外，可能存在其他因素参与调控重编程。诱导重编程过程中另一个重要事件就是表观遗传学修饰的转变。组蛋白修饰是表观遗传学修饰中一种重要方式。本发明人首先检测了重编程第5天和第8天细胞中重要的组蛋白修饰的变化情况。本发明人发现与O(WT)SK和O(4R)SK相比，O(5R)SK组的H3K4me1/2/3甲基化修饰水平上升，而其他组蛋白修饰没有明显的变化(图8)。因此本发明人推测，Oct4-5R促进重编程的作用机制很部分与H3K4甲基化水平升高相关。
H3K4甲基化水平主要由介导甲基化修饰的酶所调节，许多研究已经证明一些组成催化组蛋白修饰酶的亚基在诱导重编程中发挥重要作用。为了研究Oct4-5R介导的H3K4甲基化水平升高主要由哪个因子调控，本发明人进一步检测了催化H3K4甲基化修饰的MLL蛋白复合物中主要亚基表达情况。本发明人发现在Oct4-5R参与重编程的细胞中，Ash2l-b的表达量升高，而其他因子表达水平没有明显变化(图9)。本发明人推测Oct4-5R促进重编程的部分作用机制是通过Ash2l-b介导的H3K4甲基化修饰。
实施例6、Ash2l-b促进诱导体细胞重编程
研究Wwp2催化Oct4泛素化修饰在重编程过程中的功能时，本发明人发现Oct4-5R与野生型相比显著提高重编程效率，并且本发明人在共转Oct4-5R与Sox2、Klf4的重编程细胞中检测到Ash2l-b的高表达，因此本发明人推测Ash2l-b在重编程中发挥促进作用。与本发明人推测相一致，在重编程过程中利用shRNA下调Ash2l的水平，极大下调EGFP阳性克隆数目(图10A)。进一步研究，本发明人分别将Ash2l-a和Ash2l-b与OSK三因子共同转入MEF细胞中，转入Ash2l-b实验组的GFP阳性克隆数目明显高于三因子对照组和转入Ash2l-a的实验组(图10B)。因此，Ash2l-b具有提高诱导重编程效率的功能。
实施例7、筛选方法
构建表达Wwp2和Oct4的MEF细胞，作为筛选试验用的细胞模型，观察Wwp2与Oct4的相互作用。
建立对照组，即表达Wwp2与Oct4的细胞，其中不加入待筛选的候选物。
建立测试组，即表达Wwp2与Oct4的细胞，其中加入待筛选的候选物。
以小分子化合物、Wwp2片段、Oct4片段、根据Wwp2或Oct4设计的小干扰分子等作为候选物。
将测试组细胞中Wwp2对于Oct4泛素化的影响情况与对照组中Wwp2对于Oct4泛素化的影响情况进行比较，如果测试组细胞中Wwp2对于Oct4泛素化的影响情况在统计学上弱于对照组，就表明该候选物是促进细胞重编程的潜在物质。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 中国科学院上海生命科学研究院
上海交通大学医学院
<120> Oct4泛素化修饰突变体在提高诱导体细胞重编程效率中的应用
<130> 184469
<160> 13
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 870
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 1
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1 5 10 15
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20 25 30
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35 40 45
Leu Pro Ser Glu Thr Lys Lys Thr Gly Lys Arg Ile Gly Ser Ser Glu
50 55 60
Leu Leu Trp Asn Glu Ile Ile Val Leu Asn Val Thr Ala Gln Ser His
65 70 75 80
Leu Asp Leu Lys Val Trp Ser Cys His Thr Leu Arg Asn Glu Leu Leu
85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
Gly Ser Val Val Ser Gly Gly Glu Leu Thr Ile Phe Leu Asp Gly Pro
130 135 140
Thr Val Asp Leu Gly Ser Val Pro Asn Gly Ser Ala Val Thr Asp Gly
145 150 155 160
Ser Gln Pro Pro Ser Arg Glu Ser Ser Gly Thr Ala Ile Ala Pro Glu
165 170 175
Thr Arg His Gln Pro Pro Ser Thr Asn Cys Phe Gly Gly Arg Ser Arg
180 185 190
Thr His Arg His Ser Gly Gly Ser Ala Arg Thr Ala Thr Ala Ala Ser
195 200 205
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210 215 220
Ser Ser Ser Ser Gly Leu Ala Asn Gly Thr Val Asn Glu Glu Pro Thr
225 230 235 240
Pro Ala Ser Glu Pro Glu Glu Ser Ser Val Val Gly Val Thr Ser Leu
245 250 255
Pro Ala Ala Ala Leu Ser Val Ser Ser Asn Pro Asn Thr Thr Ser Leu
260 265 270
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275 280 285
Thr Gln Gln Leu Pro Ala Ala Ala Gln Ala Pro Asp Ala Leu Pro Ala
290 295 300
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325 330 335
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<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
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<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
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Asn Leu Thr Trp Gln Ser Arg Thr Gln Asp Glu His Pro Lys Thr Met
85 90 95
Phe Ser Lys Asp Lys Asp Ile Ile Pro Phe Ile Asp Lys Tyr Trp Glu
100 105 110
Cys Met Thr Thr Arg Gln Arg Pro Gly Lys Met Thr Trp Pro Asn Asn
115 120 125
Ile Val Lys Thr Met Ser Lys Glu Arg Asp Val Phe Leu Val Lys Glu
130 135 140
His Pro Asp Pro Gly Ser Lys Asp Pro Glu Glu Asp Tyr Pro Lys Phe
145 150 155 160
Gly Leu Leu Asp Gln Asp Leu Ser Asn Ile Gly Pro Ala Tyr Asp Asn
165 170 175
Gln Lys Gln Ser Ser Ala Val Ser Ala Ser Gly Asn Leu Asn Gly Gly
180 185 190
Ile Ala Ala Gly Ser Ser Gly Lys Gly Arg Gly Ala Lys Arg Lys Gln
195 200 205
Gln Asp Gly Gly Thr Thr Gly Thr Thr Lys Lys Ala Arg Ser Asp Pro
210 215 220
Leu Phe Ser Ala Gln Arg Leu Pro Pro His Gly Tyr Pro Leu Glu His
225 230 235 240
Pro Phe Asn Lys Asp Gly Tyr Arg Tyr Ile Leu Ala Glu Pro Asp Pro
245 250 255
His Ala Pro Asp Pro Glu Lys Leu Glu Leu Asp Cys Trp Ala Gly Lys
260 265 270
Pro Ile Pro Gly Asp Leu Tyr Arg Ala Cys Leu Tyr Glu Arg Val Leu
275 280 285
Leu Ala Leu His Asp Arg Ala Pro Gln Leu Lys Ile Ser Asp Asp Arg
290 295 300
Leu Thr Val Val Gly Glu Lys Gly Tyr Ser Met Val Arg Ala Ser His
305 310 315 320
Gly Val Arg Lys Gly Ala Trp Tyr Phe Glu Ile Thr Val Asp Glu Met
325 330 335
Pro Pro Asp Thr Ala Ala Arg Leu Gly Trp Ser Gln Pro Leu Gly Asn
340 345 350
Leu Gln Ala Pro Leu Gly Tyr Asp Lys Phe Ser Tyr Ser Trp Arg Ser
355 360 365
Lys Lys Gly Thr Lys Phe His Gln Ser Ile Gly Lys His Tyr Ser Ser
370 375 380
Gly Tyr Gly Gln Gly Asp Val Leu Gly Phe Tyr Ile Asn Leu Pro Glu
385 390 395 400
Asp Thr Glu Thr Ala Lys Ser Leu Pro Asp Thr Tyr Lys Asp Lys Ala
405 410 415
Leu Ile Lys Phe Lys Ser Tyr Leu Tyr Phe Glu Glu Lys Asp Phe Val
420 425 430
Asp Lys Ala Glu Lys Ser Leu Lys Gln Thr Pro His Ser Glu Ile Ile
435 440 445
Phe Tyr Lys Asn Gly Val Asn Gln Gly Val Ala Tyr Arg Asp Ile Phe
450 455 460
Glu Gly Val Tyr Phe Pro Ala Ile Ser Leu Tyr Lys Ser Cys Thr Val
465 470 475 480
Ser Ile Asn Phe Gly Pro Ser Phe Lys Tyr Pro Pro Lys Asp Leu Thr
485 490 495
Tyr His Pro Met Ser Asp Met Gly Trp Gly Ala Val Val Glu His Thr
500 505 510
Leu Ala Asp Val Leu Tyr His Val Glu Thr Glu Val Asp Gly Arg Arg
515 520 525
Ser Pro Pro Trp Glu Pro
530
<210> 4
<211> 0
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 4
<210> 5
<211> 32
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 5
ttagggttcc cagggtggac tacgtcttcc gt 32
<210> 6
<211> 36
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 6
ccgctcgagc ggatggatac ccaggcgggc tctgtg 36
<210> 7
<211> 32
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 7
ttagggttcc cagggtggac tacgtcttcc gt 32
<210> 8
<211> 34
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 8
ccgctcgagc ggatggctgg acacctggct tcag 34
<210> 9
<211> 37
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 9
tcagtttgaa tgcatgggag agcccagagc agtgacg 37
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 10
ggaatagaca cgtcgtcatg t 21
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 11
ggccagaagt gatcctttat t 21
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 12
gccggacacc tacaaagata a 21
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 13
cgagtcttgt tagccctaca t 21

Claims (17)

1.一种非治疗性的细胞重编程的方法，其特征在于，所述的细胞重编程方法中，采用包含Oct4的转录因子组合诱导细胞重编程，所述Oct4氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示，其中所述的Oct4的泛素化位点发生突变，所述泛素化位点突变选自：
第118位，第121位，第133位，第137位和第144位的突变；或
第121位，第133位，第137位和第144位的突变；
其中，所述的突变是由赖氨酸突变为不能发生泛素化修饰的精氨酸。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的包含Oct4的转录因子组合包括：Oct4，Sox2、Klf4和c-Myc组合。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的包含Oct4的转录因子组合包括：Oct4，Sox2和Klf4。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的细胞是体细胞。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的体细胞包括：成纤维细胞，上皮细胞，血液细胞，神经细胞，胚胎细胞。
6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的体细胞为组织或器官来源的细胞。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，Oct4的泛素化位点的突变提高重编程过程中H3K4甲基化修饰水平，从而促进重编程；或Oct4的泛素化位点的突变减少Oct4的降解，增强Oct4的蛋白稳定性，从而促进重编程。
8. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：在细胞内过表达外源性Ash2l-b，使Ash2l-b水平上升；所述Ash2l-b的氨基酸序列如SEQ ID NO: 3所示。
9. 一种Oct4突变体，其特征在于，所述Oct4氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示，Oct4突变体中所述的Oct4的泛素化位点发生突变，所述的泛素化位点选自：
第118位，第121位，第133位，第137位和第144位的突变；或
第121位，第133位，第137位和第144位的突变；
其中，所述的突变是由赖氨酸突变为不能发生泛素化修饰的精氨酸。
10.编码权利要求9所述Oct4突变体的多核苷酸。
11.一种表达载体，其中包含编码权利要求9所述Oct4突变体的多核苷酸。
12.一种宿主细胞，其中包含权利要求11所述的表达载体，或包含编码权利要求9所述Oct4突变体的多核苷酸。
13.权利要求9所述的Oct4突变体的用途，用于作为细胞重编程的转录因子。
14.一种用于进行细胞重编程的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中包括：权利要求9所述的Oct4突变体。
15.一种用于进行细胞重编程的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中包括：能表达权利要求9所述的Oct4突变体的表达构建物。
16.如权利要求14或15所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中还包括转录因子：Sox2、Klf4、c-Myc组合，Sox2与Klf4的组合，或能表达该Sox2、Klf4和/或c-Myc的表达构建物。
17. 如权利要求14或15所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中还包括：Ash2l-b或能重组表达Ash2l-b的表达构建物；所述Ash2l-b的氨基酸序列如SEQ ID NO: 3所示。
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