CN102827278A

CN102827278A - 抗肿瘤蛋白p53单克隆抗体及其用途

Info

Publication number: CN102827278A
Application number: CN2012102746493A
Authority: CN
Inventors: 何为无; 马东辉; 袁克湖; 陈坚; 王超; 陈思; 袁丽; 龚世妍; 周春
Original assignee: WUXI AORUI DONGYUAN BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: Beijing Sino fir Jinqiao Biological Technology Co Ltd
Priority date: 2012-08-03
Filing date: 2012-08-03
Publication date: 2012-12-19
Anticipated expiration: 2032-08-03
Also published as: CN102827278B

Abstract

本发明公开了一种杂交瘤细胞株（保藏编号为CGMCC No.6136），以及由此杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体2C4。本发明还涉及单克隆抗体2C4在制备用于检测p53蛋白的免疫检测工具中的应用，含单克隆抗体2C4的免疫组化试剂盒，以及单克隆抗体2C4在制备用于诊断p53相关性肿瘤的试剂盒中的应用。本发明所述单克隆抗体可与p53蛋白特异性结合，而与细胞内其他蛋白无交叉反应，显著提高了p53蛋白免疫检测的特异性和可靠性。

Description

抗肿瘤蛋白P53单克隆抗体及其用途

技术领域

本发明涉及抗肿瘤蛋白P53的单克隆抗体及其在检测P53蛋白中的应用。

背景技术

P53基因是一种抑癌基因，是迄今发现与人类肿瘤相关性最高的基因，分为野生型和突变型两种，其蛋白产物为定位于人类染色体17p13.1，由393个氨基酸组成的核内磷酸化蛋白，其分子量为53kD，因此被称为p53蛋白（Tumor protein p53）。P53蛋白分为野生型和突变型，野生型p53蛋白极不稳定，半衰期仅数分钟，并具有反式激活功能和广谱的肿瘤抑制作用；突变型p53蛋白稳定性增加，半衰期延长，可被免疫组化方法检测出来。

p53基因的突变、缺失是人类肿瘤的常见事件，与肿瘤的发生、发展关系密切。目前研究认为引起肿瘤形成或细胞转化的p53蛋白是p53基因突变的产物，是一种肿瘤促进因子，它可以消除正常p53的功能；而野生型p53基因是一种抑癌基因，它的失活对肿瘤形成起重要作用。一般认为，突变型p53的过表达与肿瘤的转移、复发及不良预后相关。

p53蛋白临床意义包括：(1)肝癌患者有一定比例的p53蛋白过表达，p53基因突变可能与肝癌的恶性分化程度有关；(2)p53突变还可见于胃癌、肝癌、大肠癌、膀胱癌、乳腺癌、前列腺癌、淋巴造血系统肿瘤、胶质细胞瘤、软组织肉瘤等恶性肿瘤。

因此目前临床上在进行肿瘤治疗之前，通常通过免疫组织化学（IHC）病理实验确定肿瘤细胞中突变型p53的表达水平，起到辅助诊断的目的。IHC实验的核心为特异性结合p53的单克隆抗体，其性能的优劣直接决定着整个检测的灵敏度和特异性。因此，研制出一种结合特异性较高的抗P53蛋白的单克隆抗体具有重要的意义。

发明内容

本发明要解决的技术问题为提供一种结合特异性较高的抗P53蛋白的单克隆抗体，及其在制备用于检测p53蛋白的免疫检测工具中的应用。

为解决上述技术问题，本发明提供了一种杂交瘤细胞株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称为CGMCC），保藏日期为2012年5月16日，保藏编号为CGMCC No.6136。

本发明还提供了一种特异性结合P53蛋白的单克隆抗体2C4，由上述杂交瘤细胞株产生。

本发明所述单克隆抗体的制备方法如下：

（1）重组表达载体的构建：根据p53基因的ORF全序列（如SEQID No.1所示）设计引物进行PCR扩增，基因两侧分别引入限制性内切酶位点SgfI和MluI，并在其C末端引入Myc-DDK标签序列（如SEQ ID No.2所示），插入表达载体pCMV6-Entry，构建p53重组表达质粒；

（2）P53重组蛋白的表达与纯化：以该质粒转染HEK293T细胞，裂解离心取上清，DDK亲和层析柱纯化，获得纯化的P53重组蛋白；

（3）单抗的筛选与制备：采用上述P53重组蛋白免疫BALB/c小鼠，取小鼠脾脏细胞与SP2/0细胞进行融合，有限稀释法获得单克隆，ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞，获得能分泌抗P53特异性抗体的杂交瘤细胞株，命名为2C4，亚型鉴定为IgG1；制备小鼠腹水，通过亲和层析柱纯化P53单抗2C4。分别通过Western Blot、免疫组化实验、免疫荧光验证该单抗的灵敏度和特异性。

上述单克隆抗体的特异性验证：

OriGene高密度蛋白芯片上包含10400个HEK293T细胞蛋白过表达裂解物，每种蛋白裂解液在芯片上具有两个拷贝的重复。蛋白裂解液被印迹在硝酸纤维素膜上。每一钟蛋白裂解液的定位可以通过Excel文件进行准确定位。蛋白芯片上蛋白分为40个亚矩阵，每个亚矩阵上有一些参照，通过参照，可以定量每个芯片点上蛋白的含量，监控每次免疫反应数据的重复性，以及定位阳性信号的方向。

将本发明单克隆抗体2C4与上述芯片杂交并确定阳性信号位点，结果显示：本发明单克隆抗体2C4特异性结合P53蛋白，与其他蛋白无交叉反应。

本发明还提供了单克隆抗体2C4在制备用于检测P53蛋白的免疫检测工具中的应用。

具体地，所述免疫检测工具为试剂盒、芯片或试纸。

在具体的实施例中，本发明提供了一种免疫组化检测试剂盒，包括上述单克隆抗体2C4；可检测组织细胞中突变型p53的表达状况。

本发明还提供了上述单克隆抗体在制备用于诊断p53相关性肿瘤的病理诊断试剂盒中的应用。由于突变型p53的表达增高与肿瘤的发生、发展关系密切，因此使用本发明单克隆抗体检测突变型p53的水平高低，可用于辅助诊断p53相关性肿瘤。

所述p53相关性肿瘤为胃癌、肝癌、大肠癌、膀胱癌、乳腺癌、前列腺癌、淋巴造血系统肿瘤、胶质细胞瘤、软组织肉瘤等恶性肿瘤。

保藏信息

用于保藏的杂交瘤细胞株的科学描述为：抗人TP53单克隆抗体杂交瘤细胞株2C4；

保藏单位全称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；

保藏单位简称：CGMCC；

保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；

保藏日期：2012年5月16日；

保藏编号：CGMCC No.6136。

附图说明

图1为Western blot验证p53重组质粒在HEK293T细胞中的表达；左边泳道的上样样品为转染pCMV6空载体的HEK293T细胞裂解液，右边泳道的上样样品为转染重组质粒pCMV6-p53的HEK293T细胞裂解液，杂交所用一抗为DDK标签抗体；

图2为p53重组蛋白的SDS-PAGE鉴定图；

图3为单克隆抗体2C4在9种不同细胞系中的Western blot结果；

图4为免疫组化检测肺癌组织中突变型P53蛋白的表达（以2C4单抗为一抗）。

具体实施方式

为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。

实施例1抗p53单克隆抗体的制备

一、p53重组表达质粒的构建

以从ATCC获得的质粒BC003596（含SEQ ID No.1所示p53ORF序列）为模板，设计两条引物并分别引入酶切位点SgfI、MluI，以及C末端Myc-DDK标签（标签序列如SEQ ID No.2所示），并克隆入表达载体pCMV6-Entry，构建p53重组表达质粒。

二、p53重组蛋白的表达与纯化

1、转染HEK293T细胞

HEK293T细胞以1:3传至直径10cm的细胞培养皿中继续培养；取7.5ml DMEM（无血清及抗生素）培养基至50ml管中，加入300μlPEI MegaTran1.0混匀，然后加入75μg上述p53重组质粒DNA混匀并静置30分钟；分别取515μl上述混合液至上述各细胞培养皿中，于37℃、5%CO₂培养箱中继续培养。转染24小时后，每培养皿细胞添加25μl 2M丁酸钠至终浓度5mM。

2、裂解细胞

转染48小时后，进行细胞裂解。吸去培养基，加入1ml PBS进行漂洗，吸去PBS。加入1ml裂解缓冲液，使用前加入蛋白酶抑制剂PI和PMSF。置于冰盒中在摇床上振荡，收集所有培养皿中得裂解液，4℃离心，收集上清。

3、DDK亲和层析柱纯化

以孔径为0.45μm,直径为33mm的PVDF膜滤器过滤离心后的裂解液上清并转入15ml管中，加入混合好的Sepharose Beads 1ml，封口后放入360度混匀器中,于4℃结合2小时；取出15ml管,将裂解液倒入BIO-RAD层析柱中,并接住穿透液,滴尽后穿透液取样WB检测，见图1（图1显示：p53重组质粒在HEK293T细胞中正常表达）；以裂解缓冲液冲洗柱料1-2次，滴尽后再用TBST冲洗Beads 3次,滴尽后用0.1M Glycine（pH3.5）洗脱，第一次200μl,滴尽不收集，第二、三次各500μl,第四次250μl,收集至一个1.5ml Tube中，并迅速加入NaH₂PO₄（pH=11.0）中和至pH7.0左右，每管加入甘油至终浓度为10%，Tween-80至终浓度为0.1%。纯化后的p53重组蛋白用SDS-PAGE鉴定，结果见图2。

三、单抗的筛选与制备

1、动物免疫：上述纯化的p53重组蛋白以完全弗氏佐剂乳化，采用皮下或腹腔注射方法免疫6-8周龄BALB/c小鼠，免疫剂量为50μg/只，间隔两周后进行第二次免疫，以不完全弗氏佐剂乳化，免疫剂量为50μg/只。免疫两次后取尾血以ELISA法梯度稀释测定血清效价；根据结果确定是否加强免疫，选取抗体效价最高的小鼠进行细胞融合。

2、细胞融合：骨髓瘤细胞采用BALB/c小鼠来源的sp2/0，融合时处于对数生长期；取上述免疫的小鼠脾脏，制成淋巴细胞单细胞悬液；免疫小鼠脾淋巴细胞与骨髓瘤细胞以1:5-1:10混合，滴加37℃的50%PEG（PH 8.0）1ml，加入不完全培养基及其余终止液，离心弃上清后加入HAT培养基悬浮混匀，MC定容到50ml，分装到3.5cm培养皿中，放于湿盒中，置于37℃、5％CO₂恒温培养箱中进行培养。

3、筛选和克隆：融合7-10天内挑选细胞克隆，使用上述纯化的p53重组蛋白进行ELISA测试，标记细胞株号。对阳性孔细胞进行有限稀释，每次有限稀释后5-6天测定ELISA值，挑取OD280阳性值较高的单克隆孔进行有限稀释，直至ELISA测定96孔板全板结果为阳性；挑取阳性值高的单克隆定株，其对应融合板细胞株为2C4。

4、腹水单抗的制备与纯化：10-12周龄的雄性BALB/c小鼠腹腔注射0.5ml降植烷，一周后每只小鼠用1ml注射器腹腔注射经PBS洗涤重悬的单克隆细胞悬液，细胞用量为5×10⁶/只，每株抗体打2只小鼠。待小鼠腹水积聚后收集腹水，离心取上清，亲和层析法进行腹水纯化，根据抗体亚型选择相应柱料，单抗2C4亚型为IgG 1，采用proteinG进行纯化。纯化后的单抗浓度测定、分装、冻存在-20℃。

以单抗2C4为一抗，对HepG2、HeLa、SVT2、A549、COS7、Jurkat、MDCK、PC 12、MCF7九种细胞系的蛋白裂解液进行杂交、显色，其结果如图3所示，由图3可见：p53蛋白在细胞系HepG2、HeLa、COS7中有不同程度的表达。

实施例2以单抗2C4为一抗对肺癌组织进行免疫组化检测

1、取肺癌组织进行石蜡包埋，使用Finesse组织切片机进行切片，组织厚度为6μm；

2、脱蜡与水化：分析纯二甲苯3次×10min，无水乙醇3次×10min，95％乙醇5min，85％乙醇5min，75％乙醇5min，去离子水浸泡3min×3次；

3、加入抗原修复液（0.01M，pH6.0枸橼酸钠缓冲液）高压锅高压热修复2min，待高压锅温度降至约90℃时，打开高压锅，取出标本，然后自然冷却至室温。去离子水浸泡3min×3次。

4、使用3%过氧化氢灭活组织内源性过氧化物酶，室温静置10min。去离子水浸泡5min×3次。

5、加上封闭液（PBS+5%脱脂奶粉+5%正常山羊血清），37℃孵育60min。

6、去除封闭液，勿冲洗，加入1:150比例稀释的本发明单抗2C4；置于湿盒中，37℃孵育60min。PBST（含0.1%Tween-20）洗涤2次，每次洗涤5min。PBST（含0.02%Tween-20）洗涤1次，每次洗涤5min。

7、滴加Polink-试剂盒2（Catlog No.D37-15）中的试剂1，37℃孵育10-20分钟。使用PBS洗涤3次，每次5min。滴加Polink-2试剂盒（Catlog No.D37-15）中的试剂2，37℃孵育10-20分钟，使用PBS洗涤3次，每次5min。

8、应用DAB溶液（中杉金桥ZLI-9019）显色，显色3~10min。蒸馏水洗涤。

9、苏木精复染细胞核2min，蒸馏水漂洗，1%盐酸分化。蒸馏水漂洗3次，室温静置1min。

10、脱水和透明：75％乙醇5min，100%乙醇5min×3次，85％乙醇5min，95％乙醇5min，100％乙醇3×5min；二甲苯3×5min，中性树胶封片。

11、镜检，见图4。

由图4可见：肺癌组织可见大量棕黄色颗粒，为p53蛋白表达阳性细胞。

实施例3、单克隆抗体2C4的特异性检测

以下为使用OriGene蛋白（OriGene Cat PA100001）芯片对2C4单克隆抗体进行特异性鉴定的具体步骤：

1、将一张蛋白芯片放在50ml离心管中，使用40ml去离子水浸润芯片，置于摇床上，室温混合30分钟；弃掉去离子水，使用10mlPBST平衡芯片，室温处理10分钟。

2、向50ml离心管中加入40ml 5%脱脂牛奶（用PBST进行稀释）置于摇床上，室温封闭30分钟。

3、使用封闭液（5%脱脂牛奶）稀释一抗2C4（稀释比例1：200）。

4、将洁净的封口膜粘贴到实验台上，滴加250-300μl上述稀释一抗在封口膜上。

5、将蛋白芯片从封闭液中抽出，将蛋白芯片NC膜的一面朝下，从芯片的一边接触抗体，慢慢滑下，依靠液体表面张力，抗体将慢慢浸润芯片NC膜，直至整张NC膜浸润在一抗溶液中。整个操作过程避免产生气泡。将芯片移到4度环境下，静置，一抗孵育过夜。在芯片上加盖培养皿盖，其上黏附一张湿纸巾，以防止长时间孵育导致抗体蒸发。

6、第二天将芯片移至50ml离心管中，使用PBST漂洗芯片两次，去除多余的抗体。使用40ml PBST（0.1%Tween-20）洗涤芯片，置于摇床上混合均匀，洗涤三次，每次洗涤5min。

7、使用封闭液(5%脱脂牛奶)稀释二抗DyLight649-conjugatedAffiniPure Fragment Goat-anti-Mouse IgG，稀释比例为1：400。

8、按照上述步骤4，步骤5进行二抗孵育操作。室温孵育1小时。在芯片上方用铝箔纸遮盖，以防止发生信号漂白。

9、按照上述步骤6，使用PBST洗涤芯片。

10、使用去离子水冲洗芯片，以去除残余的盐分和变性剂。

11、室温干燥芯片，确保芯片完全干燥。

12、使用芯片扫描仪读取荧光信号。

13、根据B SA-Cy3以及BSA-Cy5确定芯片方向以及阳性信号的位点。

14、根据阳性信号位点找出对应蛋白裂解液ID，根据裂解液数据库信息，查找到对应蛋白名称，NCBI录入号（accession number），蛋白ID，蛋白大小等信息。

以单纯封闭液替代单克隆抗体2C4作为空白对照组，芯片杂交结果显示：实验组芯片上出现两个阳性信号点，对应蛋白分别为TP53和UNC5A；空白对照组的芯片上出现了一个阳性信号位点，对应蛋白为UNC5A，因此，UNC5A为假阳性信号位点；结论：本发明单克隆抗体2C4仅特异性结合TP53蛋白，而与其他蛋白无交叉反应。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种特异性结合P53蛋白的单克隆抗体2C4，由保藏编号为CGMCC No.6136的杂交瘤细胞株产生。

2.一种杂交瘤细胞株，其保藏编号为CGMCC No.6136。

3.如权利要求1所述的单克隆抗体在制备用于检测P53蛋白的免疫检测工具中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述免疫检测工具为试剂盒、芯片或试纸。

5.一种免疫组化检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的单克隆抗体。

6.如权利要求1所述的单克隆抗体在制备用于诊断p53相关性肿瘤的病理诊断试剂盒中的应用。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述p53相关性肿瘤为胃癌、肝癌、大肠癌、膀胱癌、乳腺癌、前列腺癌、淋巴造血系统肿瘤、胶质细胞瘤、软组织肉瘤。