CN116801899A - 通过肿瘤微环境重塑的溶瘤免疫疗法 - Google Patents

Abstract

本公开内容涉及修饰的溶瘤病毒。本公开内容的修饰的溶瘤病毒包含编码外源核酸的病毒基因组中的修饰，以通过重塑肿瘤微环境和以增强的全身递送来增强溶瘤免疫疗法。本公开内容还涉及包含修饰的溶瘤病毒的组合物、包含该溶瘤病毒的药盒以及使用溶瘤病毒的方法。

Description

通过肿瘤微环境重塑的溶瘤免疫疗法

交叉引用

本申请要求于2020年11月19日提交的美国临时申请第63/116,004号的权益，该申请通过引用并入本文。

通过引用并入

本说明书中所提及的所有出版物、专利和专利申请均通过引用并入本文，其程度犹如具体地且单独地指出每个单独的出版物、专利或专利申请通过引用而并入，并且犹如以其整体阐述。在本文所用的术语与所并入的参考文献中定义的术语之间存在冲突的情况下，以本公开内容的定义为准。

序列表

本申请包括序列表，所述序列表已经以ASCII格式电子提交并且特此通过引用以其整体并入。于2021年11月15日生成的所述ASCII副本被命名为199249_703601_SL.txt并且大小为10,425字节。

背景

近年来，免疫疗法已经作为癌症治疗的一种极其有效的工具出现。在实体瘤中，使用单克隆抗体介导的“检查点”阻断程序性死亡1(PD-1)和细胞毒性T淋巴细胞相关抗原(CTLA-4)的免疫疗法产生了持久的应答，导致在多种适应症中得到美国食品药品监督管理局(US Food and Drug Administration)(FDA)的批准(La-Beck等人，2015；Mahoney等人，2015)。这些单剂免疫疗法在大多数患者中不会产生长期持久的益处(Herbst等人，2014；Weber等人，2015)，因为更主要的免疫抑制机制限制了肿瘤微环境中的T细胞功能(Sharma等人，2015)。需要开发一种改善的溶瘤免疫疗法来重塑肿瘤微环境，以增强T细胞功能和分化，并能够增强病毒的全身递送。

概述

本文提供了修饰的溶瘤痘苗病毒，该病毒包含：编码包含代谢调节蛋白或其功能片段或变体的融合蛋白的外源核酸，其中外源核酸编码包含以下的融合蛋白：包含IL-2或其功能片段的多肽，和包含瘦素或其功能片段的多肽；编码趋化因子受体或其功能片段或变体的外源核酸，其中趋化因子受体是CCR2；以及修饰的溶瘤病毒的病毒基因组中的遗传修饰。本文还提供了修饰的溶瘤病毒，其中编码趋化因子受体的外源核酸包括趋化因子受体的人类编码序列的密码子优化变体。本文还提供了修饰的溶瘤病毒，其中融合蛋白还包含细胞因子或其功能片段或变体。本文还提供了修饰的溶瘤病毒，其中病毒主链中的遗传修饰是A52R基因的突变或缺失。本文还提供了修饰的溶瘤病毒，其中缺失是完全或部分缺失。本文还提供了修饰的溶瘤病毒，其中溶瘤病毒还包含胸苷激酶基因的缺失。本文还提供了修饰的溶瘤病毒，其中溶瘤病毒包括麻疹病毒、脊髓灰质炎病毒、痘病毒、痘苗病毒、腺病毒、腺相关病毒、单纯疱疹病毒、水疱性口炎病毒、呼肠孤病毒、新城疫病毒、塞内加病毒(Seneca virus)、慢病毒、门戈病毒(mengovirus)或粘液瘤病毒。本文还提供了修饰的溶瘤病毒，其中溶瘤病毒是痘病毒。本文还提供了修饰的溶瘤病毒，其中痘病毒是痘苗病毒。本文还提供了修饰的溶瘤病毒，其中痘苗病毒是Western Reserve毒株痘苗病毒、Copenhagen毒株、IHD毒株、Wyeth毒株、NYCBOH毒株、Tian Tan毒株、Lister毒株、Ankara毒株、USSR毒株、ACAM2000毒株、Paris毒株、Bern毒株、Temple of Heaven毒株、Dairen毒株、EM-63毒株、Evans毒株、King毒株、Patwadangar毒株或Tash Kent毒株。本文还提供了修饰的溶瘤病毒，其中编码融合蛋白的外源核酸被克隆到胸苷激酶基因的基因座中。本文还提供了修饰的溶瘤病毒，其中编码趋化因子受体的外源核酸被克隆到A52R基因的基因座中。本文还提供了修饰的溶瘤病毒，其中编码IL-2的多肽或其功能片段包含与SEQ ID NO:4的序列至少约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％同源的序列。本文还提供了修饰的溶瘤病毒，其中编码瘦素的多肽或其功能片段包含与SEQ ID NO:5的序列至少约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％同源的序列。本文还提供了修饰的溶瘤病毒，其中编码包含代谢调节蛋白或其功能片段或变体的融合蛋白的外源核酸包含与SEQ ID NO:1的序列至少约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％同源的序列。本文还提供了修饰的溶瘤病毒，其中编码趋化因子受体或其功能片段或变体的外源核酸包含与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的序列至少约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％同源的序列。本文还提供了修饰的溶瘤病毒，其还包含编码透明质酸酶的外源核酸。本文还提供了修饰的溶瘤病毒，其中透明质酸酶为PH-20或HysA。

本文提供了修饰的溶瘤病毒，其包含编码瘦素-白细胞介素(IL)-2融合蛋白的外源核酸；编码CCR2的外源核酸以及A52R基因的缺失。本文还提供了修饰的溶瘤病毒，其中溶瘤病毒包括麻疹病毒、脊髓灰质炎病毒、痘病毒、痘苗病毒、腺病毒、腺相关病毒、单纯疱疹病毒、水疱性口炎病毒、呼肠孤病毒、新城疫病毒、塞内加病毒、慢病毒、门戈病毒或粘液瘤病毒。本文还提供了修饰的溶瘤病毒，其中溶瘤病毒是痘病毒。本文还提供了修饰的溶瘤病毒，其中痘病毒是痘苗病毒。本文还提供了修饰的溶瘤病毒，其中痘苗病毒是WesternReserve毒株痘苗病毒、Copenhagen毒株、IHD毒株、Wyeth毒株、NYCBOH毒株、Tian Tan毒株、Lister毒株、Ankara毒株、USSR毒株、ACAM2000毒株、Paris毒株、Bern毒株、Temple ofHeaven毒株、Dairen毒株、EM-63毒株、Evans毒株、King毒株、Patwadangar毒株或Tash Kent毒株。本文还提供了修饰的溶瘤病毒，其中溶瘤病毒还包含胸苷激酶基因的缺失。本文还提供了修饰的溶瘤病毒，其中编码瘦素-白细胞介素(IL)-2融合蛋白的外源核酸被克隆到胸苷激酶基因的基因座中。本文还提供了修饰的溶瘤病毒，其中编码CCR2的核酸被克隆到A52R基因的基因座中。本文提供了任何先前公开内容的修饰的溶瘤病毒，该病毒还包含选自由以下组成的组的病毒基因的突变或缺失：A1、A2、VH1、A33、I7、K7R、B8R、C12L、B15R、B14R、K1L、N1L、M2L、A49R、A46R、E3L、C4、C16和其功能结构域或片段或变体，或其任何组合。本文还提供了修饰的溶瘤病毒，该病毒还包含编码以下至少一种的外源核酸：HMGB1、PIAS3、LIGHT、分形趋化因子、ITAC、IL15、IL15Rα、CCL5、其功能结构域或片段或变体，或其任何组合。

本文提供了包含根据任何先前公开内容的修饰的溶瘤病毒的药物组合物。本文还提供了药物组合物，其还包含以下至少一种：增溶剂、赋形剂或药学上可接受的运载体。本文还提供了药物组合物，其中赋形剂包括以下一种或更多种：缓冲剂、稳定剂、抗氧化剂、粘合剂、稀释剂、分散剂、速率控制剂、润滑剂、助流剂、崩解剂、增塑剂、防腐剂或其任何组合。本文还提供了药物组合物，其中赋形剂包括磷酸氢二钠二水合物、磷酸二氢钠二水合物、氯化钠、肌醇、山梨醇或其任何组合。本文还提供了药物组合物，其不包含防腐剂。本文还提供了药物组合物，其还包含防腐剂、稀释剂和运载体中的一种或更多种。本文还提供了药物组合物，该药物组合物还包含另外的活性成分或其盐。本文还提供了药物组合物，其中增溶剂是无菌水。本文还提供了还包含另外的活性成分的药物组合物，其中另外的活性成分是抗癌剂或另外的溶瘤病毒。

本文提供了包含任何先前公开内容的修饰的溶瘤病毒的药盒。本文提供了包含任何先前公开内容的药物组合物的药盒。本文还提供了还包含以下至少一种的药盒：抗癌剂或另外的溶瘤病毒。

本文提供了一种方法，该方法在将修饰的溶瘤病毒全身递送至受试者时，相对于包含TK突变但不包含编码融合蛋白的外源核酸或编码趋化因子受体的外源核酸的参考病毒的全身施用，增强修饰的溶瘤病毒的治疗效果，方法包括全身施用根据任何先前公开内容的修饰的溶瘤病毒或如任何先前公开内容中定义的药物组合物。

本文提供了一种治疗方法，该治疗方法包括向受试者施用根据任何先前公开内容的溶瘤病毒，或任何先前公开内容的药物组合物，其中相对于向受试者施用包含胸腺嘧啶激酶基因缺失(TK-)、不包含编码包含代谢调节蛋白或其功能片段或变体的融合蛋白的外源核酸或编码趋化因子受体或其功能片段或变体的外源核酸的参考溶瘤病毒，该施用导致受试者中增强的全身免疫应答。本文还提供了方法，其中施用是全身施用。本文还提供了方法，其中全身施用包括以下至少一种：瘤内、静脉内、肠胃外、皮内、肌肉内、透皮、直肠、尿道内、阴道内、鼻内、鞘内、腹膜内、牙内、皮下、经皮、气管内、动脉内、膀胱内、吸入、口服或其任何组合。本文还提供了方法，其中施用是瘤内的。本文还提供了方法，其中施用是静脉内的。本文还提供了方法，其中受试者患有癌症。

本文提供了治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的任何先前公开内容的修饰的溶瘤病毒。本文还提供了方法，其中癌症是以下至少一种：黑素瘤、肝细胞癌、乳腺癌、肺癌、非小细胞肺癌、腹膜癌、前列腺癌、膀胱癌、卵巢癌、白血病、淋巴瘤、肾细胞癌、胰腺癌、上皮癌、胃/GE结合部腺癌、宫颈癌、结肠癌、结肠直肠癌、十二指肠癌、胰腺癌、腺样囊性癌、肉瘤、间皮瘤、多形性胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、多发性骨髓瘤、前列腺上皮癌、肝细胞癌、胆管癌、胰腺癌、头颈部鳞状细胞癌、宫颈鳞状细胞癌、骨肉瘤、上皮性卵巢癌、急性淋巴母细胞淋巴瘤、骨髓增生性肿瘤或其任何组合。本文还提供了方法，其中修饰的溶瘤病毒或药物组合物以包含约10⁶PFU/mL至约10¹⁰PFU/mL溶瘤病毒的剂量施用。本文还提供了方法，其中修饰的溶瘤病毒或药物组合物以包含约5x10⁹PFU/mL溶瘤病毒的剂量施用。本文还提供了方法，其中修饰的溶瘤病毒或药物组合物独立地以用于第一时间段的初始剂量、以用于第二时间段的中间剂量和以用于第三时间段的高剂量施用。本文还提供了方法，所述方法包括独立地施用初始剂量、中间剂量和高剂量，其中初始剂量低于中间剂量，并且中间剂量低于高剂量。本文还提供了方法，其中第一、第二和第三时间段分别为约1周至约3周。本文还提供了方法，其中修饰的溶瘤病毒和药物组合物独立地包括液体剂型，该液体剂型以约1mL至约5mL、约5mL至10mL、约15mL至约20mL、约25mL至约30mL、约30mL至约50mL、约50mL至约100mL、约100mL至150mL、约150mL至约200mL、约200mL至约250mL、约250mL至约300mL、约300mL至约350mL、约350mL至约400mL、约400mL至约450mL、约450mL至500mL、约500mL至750mL、或约750mL至1000mL的体积施用。本文还提供了方法，其中修饰的溶瘤病毒或药物组合物以液体剂型、固体剂型、可吸入剂型、鼻内剂型、脂质体制剂、包含纳米颗粒的剂型、包含微粒的剂型、聚合物剂型或其任何组合施用。本文还提供了方法，其中修饰的溶瘤病毒或药物组合物被施用约1周、约2周、约3周、约4周、约6周、约7周、约8周、约9周、约10周或约12周的持续时间。本文还提供了方法，其中修饰的溶瘤病毒或药物组合物每天一次、每天两次、每周一次、每两周一次或每三周一次施用。本文还提供了方法，其中修饰的溶瘤病毒或药物组合物静脉内、腹膜内或通过瘤内注射施用。本文还提供了方法，其中修饰的溶瘤病毒或药物组合物作为团注或缓慢输注施用。本文还提供了方法，其中施用修饰的溶瘤病毒或药物组合物在施用第一剂量约1小时至约3天后产生第一峰值病毒载量，并且在施用第一剂量约3天至约10天后产生第二峰值病毒载量。本文还提供了方法，所述方法包括施用另外的疗法，其中另外的疗法被施用约1周、约2周、约3周、约4周、约6周、约7周、约8周、约9周、约10周或约12周的持续时间。本文还提供了方法，其中另外的疗法每天一次、每周一次、每两周一次或每三周一次施用。本文还提供了方法，其中另外的疗法以液体剂型、固体剂型、可吸入剂型、鼻内剂型、脂质体制剂、包含纳米颗粒的剂型、包含微粒的剂型、聚合物剂型或其任何组合施用。本文还提供了方法，其中另外的疗法被施用约1周、约2周、约3周、约4周、约6周、约7周、约8周、约9周、约10周或约12周的持续时间。本文还提供了方法，其中另外的疗法每天一次、每周一次、每两周一次或每三周一次施用。本文还提供了方法，其中另外的疗法以液体剂型、固体剂型、可吸入剂型、鼻内剂型、脂质体制剂、包含纳米颗粒的剂型、包含微粒的剂型、聚合物剂型或其任何组合施用。本文还提供了方法，其中另外的疗法口服、静脉内、通过瘤内注射或通过辐射施用。本文还提供了方法，其中受试者是人类。本文还提供了方法，其中在施用修饰的溶瘤病毒或药物组合物之前，受试者已被诊断患有癌症。本文还提供了方法，其中在施用修饰的溶瘤病毒或药物组合物或另外的疗法之前，受试者已被诊断患有癌症。本文还提供了方法，其中另外的疗法包括化学疗法、放疗、用另外的病毒进行的溶瘤病毒疗法、用免疫调节蛋白治疗、CAR T细胞疗法、抗癌剂或其任何组合。本文还提供了方法，其中另外的疗法包括施用免疫调节剂，所述免疫调节剂包括抗CD33抗体及其可变区、抗CD11b抗体及其可变区、COX2抑制剂、细胞因子、趋化因子、抗CTLA4抗体或其抗原结合片段、抗PD-1抗体或其抗原结合片段、抗PD-L1抗体或其抗原结合片段、或TLR激动剂。本文还提供了方法，所述方法包括施用另外的疗法，其中另外的疗法包括施用抗癌剂，其中抗癌剂是化疗剂。

附图简述

本公开内容的新颖的特征特别地在所附权利要求书中阐述。通过参考以下对利用本公开内容的原理的说明性实施方案加以阐述的详细描述以及附图，将会对本公开内容的特征和优点获得更好的理解，在这些附图中：

图1示出了从痘苗病毒主链中缺失的基因和在相应基因座被取代的外源基因，以工程化本公开内容的示例性修饰的痘苗病毒(缩写为“MMC”)的图解表示。

图2A-图2D示出了修饰以缺失A52R和TK基因并插入CCR2和瘦素-IL-2的示例性修饰的痘苗病毒(缩写为“MMC”)，在LLC(Lewis肺癌)肿瘤模型中示出了增强的治疗效果和全身递送。

图3A-图3B示出了示例性修饰的痘苗病毒(缩写为“MMC”)在LLC肿瘤模型中的预免疫小鼠中示出增强的治疗效果和全身递送。

图4示出了示例性修饰的痘苗病毒(缩写为“MMC”)在RENCA肿瘤模型中示出了增强的治疗效果。

图5A-图5B示出了示例性修饰的痘苗病毒(缩写为“NT428N”)的生物分布研究，其示出了更高的肿瘤选择性和在正常组织中的低积累。

详细描述

定义

本文使用的术语仅用于描述特定情况的目的，并不意图是限制性的。除非上下文另有明确规定，否则如本文所用的单数形式“一个”、“一种”和“该”可包括复数形式。此外，就术语“含有(contains)”、“含有(containing)”、“包括(including)”、“包括(includes)”、“具有(having)”、“具有(has)”、“具有(with)”或其变化形式在详细描述和/或权利要求书中使用的程度而言，这样的术语意图以类似于术语“包含(comprising)”的方式为包含性的。

术语“约(about)”或“大约(approximately)”可以意指在如由本领域普通技术人员确定的特定值的可接受误差范围之内，这将部分地取决于值如何被测量或确定，例如，测量系统的局限性。例如，根据给定值的实践，“约”可以表示在1个或大于1个标准差内。在本申请和权利要求书中描述特定值的情况下，除非另有说明，术语“约”应被假定为意指特定值的可接受误差范围，诸如由术语“约”修饰的值的±10％。

术语“个体”、“患者”或“受试者”可以互换使用。这些术语都不需要或局限于以卫生保健工作者(例如，医生、注册护士、从业护士、医师助理、护理员或临终关怀工作人员)的监护(例如，持续的或间歇的)为特征的情形。在一些实施方案中，患者、受试者或个体可以在医疗保健工作者的监护之下。

如本文所用的，与特定病毒相关的术语“异源核酸序列”或“外源核酸序列”可指源自除指定病毒之外的来源的核酸序列。“异源”基因、核酸、抗原或蛋白被理解为不存在于野生型痘病毒基因组(例如MVA或MVA-BN)中的核酸或氨基酸序列。当存在于诸如MVA或MVA-BN的痘苗病毒中时，“异源基因”可以以这样的方式整合到痘病毒基因组中，即在将修饰的痘苗病毒施用到宿主细胞后，它被表达为相应的异源基因产物，诸如“异源抗原”和/或“异源蛋白”。可以通过将异源基因与允许在痘苗病毒感染的细胞中表达的调控元件可操作地连接来实现表达。调节元件包括天然或合成的痘苗病毒启动子。

如本文所用的，可以互换使用的术语“表达(expressed)”、“表达(express)”、“表达(expression)”等可以表示感兴趣序列的单独的转录以及转录和翻译两者。因此，在提及以DNA形式存在的核苷酸序列的表达时，由该表达产生的产物可以是RNA(仅由待表达序列的转录产生)或多肽序列(由待表达序列的转录和翻译两者产生)。术语“表达”也可以包括RNA和多肽产物都由所述表达产生并在相同的共享环境中保持在一起的可能性。例如，当mRNA翻译成多肽产物后持续存在时，就是这种情况。如本文所用的，术语“表达盒”可以定义为通常用于克隆和/或转化的载体或重组病毒的一部分。表达盒可包含a)一个或更多个编码序列(例如，开放阅读框(ORF)、编码蛋白和/或抗原的基因、核酸)和b)控制一个或更多个编码序列的表达的序列(例如，启动子)。另外，表达盒可以包含3’非翻译区(例如，转录终止子诸如痘苗转录终止子)。“表达盒”可与术语“转录单位”互换使用。

如本文所用的，术语“突变”可指缺失、异源核酸的插入、倒位或取代，包括本领域通常理解的消除突变的开放阅读框。

如本文所用的，术语“基因”可指编码单个蛋白或RNA的核酸区段(也称为“编码序列”或“编码区”)，其任选地与相关联的调节区如启动子、操纵子、终止子等在一起，该调节区可以位于编码序列的上游或下游。

如在本文中可互换使用的，术语“突变病毒”和“修饰的病毒”可指在其基因组中包含一个或更多个突变的病毒，该突变包括但不限于缺失、异源核酸的插入、倒位、取代或其组合。

如本文关于病毒使用的术语“天然存在的”可指示该病毒可以在自然界中发现，即，它可以从自然界中的来源分离并且未经有意修饰。

本文提及的术语“抑制”、“减少”或“防止”或这些术语的任何变化可包括任何可测量的减少或完全抑制以实现期望的结果。

如本文所用的，“启动子”可以是控制转录起始和转录速率的核酸序列区域的控制序列。在某些实施方案中，启动子可含有遗传元件，在该遗传元件处调节蛋白和分子可以结合，如RNA聚合酶和其他转录因子。术语“可操作地定位”、“可操作地连接(operativelylinked)”、“可操作地连接(operably linked)”、“在控制下”和“在转录控制下”可意指启动子相对于核酸序列处于正确的功能位置和/或方向，以控制该序列的转录起始和/或表达。在某些实施方案中，启动子可以与或者可以不与“增强子”联合使用，“增强子”是指参与核酸序列的转录激活的顺式作用调节序列。

如本文所用的，术语“启动子”可表示位于待表达核酸序列上游的核酸(通常为DNA)的调节区，其包含被识别和结合(例如被蛋白转录因子和负责从被启动的基因的编码区合成RNA的聚合酶)的特定DNA序列元件。由于启动子通常紧邻所讨论的基因，启动子中的位置相对于其中特定基因的DNA转录开始的转录起始位点被指定(即，上游位置是从-1开始倒数的负数，例如-100是上游100个碱基对的位置)。因此，启动子序列可以包括直到位置-1的核苷酸。然而，从位置+1的核苷酸不是启动子的一部分，即，在这方面，必须注意翻译起始密码子(ATG或AUG)不是启动子的一部分。“天然痘苗病毒启动子”可以是痘苗病毒基因组的内源启动子。“合成痘苗病毒启动子”可以意指重组工程化启动子，其具有指导待由痘苗病毒(例如，在CEF细胞中的修饰的痘苗病毒)表达的核酸的转录的活性。

如本文所用的，“可操作地连接”意指所描述的组分相互关联，允许它们以其预期的方式发挥作用，例如，使待表达的核酸转录的启动子。当第一核酸序列与第二核酸序列处于功能关系时，第一核酸序列可操作地连接到第二核酸序列。例如，如果启动子被放置在其可以指导编码序列转录的位置，则启动子可操作地连接到编码序列。通常，可操作地连接的DNA序列是连续的，并且在必须连接两个蛋白编码区域时，在同一阅读框中。

术语“核酸”、“核苷酸序列”、“核酸序列”和“多核苷酸”可以互换使用，并指线性或支链的、单链或双链的RNA或DNA、或其杂合体。该术语还涵盖RNA/DNA杂合体。以下是多核苷酸的非限制性实例：基因或基因片段、外显子、内含子、mRNA、tRNA、rRNA、核酶、cDNA、重组多核苷酸、支链多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离的DNA、任何序列的分离的RNA、核酸探针及引物。多核苷酸可以包含修饰的核苷酸，诸如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物、尿嘧啶、其他糖和连接基团，诸如氟代核糖(fluororibose)和硫代酸酯(thioate)，以及核苷酸支链。核苷酸序列可以在聚合后进一步修饰，诸如通过与标记组分缀合。该定义中包括的其他类型的修饰是帽，用类似物取代一个或更多个天然存在的核苷酸，以及引入将多核苷酸附接到蛋白、金属离子、标记组分、其他多核苷酸或固体支持物的工具(means)。多核苷酸可以通过化学合成获得或来源于微生物。

术语“开放阅读框”(ORF)可以指可以被翻译成氨基酸的核苷酸序列。通常，这样的ORF包含起始密码子，随后的区域通常具有3个核苷酸的倍数的长度，但在给定的阅读框中不包含终止密码子(TAG、TAA、TGA、UAG、UAA或UGA)。通常，ORF天然存在或人工构建，诸如通过基因技术手段。ORF可以编码蛋白，其中它可以翻译成的氨基酸形成肽连接链。

如本文所用的，术语“必需ORF”可意指例如在修饰的痘苗病毒中，当被实验性部分或完全缺失时，修饰的痘苗病毒的复制、生长或复制和生长两者都减少(例如与没有缺失的修饰的痘苗病毒相比，在突变体中减少至少15倍)的ORF。本领域技术人员熟知确定MVA病毒复制和病毒生长的方法。例如，方法描述在Vaccinia Virus and Poxvirology,Methodsand Protocols,第269卷，Stuart N.Isaacs编著(Humana Press(2004),参见例如第8章，Growing Poxviruses and determining Virus Titer，Kotwal和Abrahams)。MVA的病毒生长速率可以通过GFP荧光来确定，例如，如描述在Orubu等人(2012)PLOS One 7:e40167中，使用例如CEF细胞或如在Hornemann等人(2003),Journal of Virology 77:8394-8407中描述的方法。

密码子优化是一种可用于通过增加感兴趣基因的翻译效率来最大化生物体中蛋白表达的技术。由于突变偏向和自然选择，不同的生物体通常对编码相同氨基酸的几个密码子中的一个示出特定的偏好。例如，在快速生长的微生物诸如大肠杆菌中，最佳密码子反映了它们各自基因组tRNA库的组成。因此，在快速生长的微生物中，氨基酸的低频率密码子可以被用于相同氨基酸但是高频率的密码子替代。因此，在快速生长的微生物中，优化的DNA序列的表达被改善。如本文提供的，多核苷酸序列可以是密码子优化的，用于在特定生物体诸如人类中的最佳多肽表达。本公开内容的多核苷酸可以包含由于遗传密码而简并的序列，例如，优化的密码子选用或密码子选用适应(codon usage adaptation)以在特定宿主，特别是哺乳动物中表达。如本文所用的，“优化的”或“优化”可指经遗传工程改造以增加其在给定物种中表达的多核苷酸。为了提供编码由本公开内容的修饰的痘苗病毒表达的蛋白(例如趋化因子受体蛋白质)的优化的多核苷酸，趋化因子受体蛋白基因的DNA序列可以被修饰以1)包含特定物种中高度表达的基因偏好的密码子；2)包含在所述物种中基本上发现的核苷酸碱基组成中的A+T或G+C含量；3)形成所述物种的起始序列；或4)消除导致RNA不稳定、不适当的多腺苷酸化、降解和终止的序列，或形成二级结构发夹或RNA剪接位点的序列。通过利用真核生物和原核生物或特定物种中密码子选用的分布频率，可以实现所述物种中趋化因子受体蛋白的增加的表达。术语“偏好密码子选用的频率”可以指特定宿主细胞在使用核苷酸密码子以指定一个给定氨基酸时表现出的偏好。存在20种天然氨基酸，其中大多数由多于一种密码子指定。因此，只要由核苷酸序列编码的蛋白(例如趋化因子受体蛋白质)的氨基酸序列在功能上不变，所有简并核苷酸序列都可以包括在本公开内容中。

当应用于核酸、载体，例如修饰的痘苗病毒载体等时，术语“重组”可以指由核酸序列的两个或更多个本来异源的区段的人工组合制备的核酸、载体等，或者指包含核酸序列的两个或更多个本来异源的区段的这样的人工组合的核酸、载体等。人工组合最常通过使用成熟的遗传工程技术，人工操作分离的核酸区段来完成。通常，如本文描述的“重组”修饰的痘苗病毒可以指可以通过标准遗传工程方法产生的修饰的痘苗病毒。例如，在一些方面，本公开内容的修饰的痘苗病毒因此可以是遗传工程化的或遗传修饰的痘苗病毒。因此，术语“重组MVA”可以包括修饰的痘苗病毒(例如MVA-BN)，其在其基因组中具有稳定整合的重组核酸，例如以转录单位的形式。转录单位可以包括启动子、增强子、终止子和/或沉默子。本公开内容的重组修饰的痘苗病毒可以在诱导调节元件时表达异源抗原决定簇、多肽或蛋白(抗原)。

如本文所用的，“转录终止子”可以包含参与RNA聚合酶对RNA转录物的特异性终止的DNA序列。包含MVA RNA聚合酶的痘苗病毒终止新生RNA中RNA信号(DNA水平上的UUUUUNU、TTTTTNT或T5NT)下游的转录(Earl等人(1990),J.Virol.64:2448-2451)。在文献中，“转录终止子”有时可以被称为“终止信号”，并且因此可以互换使用。

术语“蛋白”、“肽”、“多肽”和“多肽片段”在本文中可以互换使用，并且可以指任何长度的氨基酸残基的聚合物。该聚合物可以是线性的或支链的，它可以包含修饰的氨基酸或氨基酸类似物，并且它可以被氨基酸以外的化学部分中断。这些术语还涵盖天然修饰或通过干预修饰的氨基酸聚合物；例如，二硫键形成、糖基化、脂质化、乙酰化、磷酸化或任何其他操作或修饰，诸如与标记或生物活性组分缀合。

如本文所用的，术语“同源性”可以是两个或更多个核苷酸或氨基酸序列之间的“同源性”或“同源性百分比”的计算，其可以通过为了最佳比较目的而对序列进行比对来确定(例如，可以在第一序列的序列中引入空位)。然后可以比较相应位置处的核苷酸，并且两个序列之间的同一性百分比可以是序列共有的相同位置数目的函数(即，％同源性＝相同位置的数目/位置的总数目x100)。例如，如果第一序列中的位置可以被与第二序列中的相应位置相同的核苷酸占据，则这些分子在该位置处是相同的。两个序列之间的同源性百分比可以是序列共有的相同位置的数目的函数，其中考虑为了两个序列的最佳比对而需要引入的空位的数目和每个空位的长度。在一些实施方案中，为了比较目的而比对的序列的长度可以是参考序列长度的至少约：30％、40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。搜索可以确定两个序列之间的同源性。同源性可以是在两个序列的整个长度之间或在两个序列的整个长度的部分之间。这两个序列可以是基因、核苷酸序列、蛋白序列、肽序列、氨基酸序列或其片段。两个序列的实际比较可以通过公知的方法来完成，例如，使用数学算法。这样的数学算法的非限制性实例可以在Karlin,S.和Altschul,S.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90-5873-5877(1993)中描述。如Altschul，S.等人，Nucleic Acids Res.，25：3389-3402(1997)中描述的，这样的算法可以并入NBLAST和XBLAST程序(版本2.0)中。当使用BLAST和Gapped BLAST程序时，可以使用相应程序(例如，NBLAST)的任何相关参数。例如，用于序列比较的参数可以设置为得分＝100，字长＝12，或者可以变化(例如，W＝5或W＝20)。其他实例包括Myers和Miller,CABIOS(1989)的算法、ADVANCE、ADAM、BLAT和FASTA。在另一种实施方案中，两个氨基酸序列之间的同一性百分比可以使用例如GCG软件包(Accelrys,Cambridge,UK)中的GAP程序来完成。

术语“受试者”可指动物，包括但不限于灵长类(例如，人类)、牛、绵羊、山羊、马、狗、猫、兔、大鼠或小鼠。术语“受试者”和“患者”在本文中提及例如哺乳动物受试者诸如人类受试者时可互换使用。

如本文所用的“动物”可以包括哺乳动物、鸟类等。动物或宿主可以包括哺乳动物和人类。动物可选自由以下组成的组：马科动物(例如，马)、犬科动物(例如，狗、狼、狐狸、郊狼、胡狼)、猫科动物(例如，狮子、老虎、家猫、野猫、其他大型猫以及其他猫科动物，包括猎豹和猞猁)、绵羊类(例如，绵羊)、牛类(例如，牛)、猪类(例如，猪)、山羊类(例如，山羊)、鸟类(例如鸡、鸭、鹅、火鸡、鹌鹑、野鸡、鹦鹉、雀、鹰、乌鸦、鸵鸟、鸸鹋和食火鸡)、灵长类动物(例如，原猴、眼镜猴、猴子、长臂猿、猿)和鱼类。

术语“治疗(treat)”、“治疗(treating)”和“治疗(treatment)”可意在包括减轻或消除紊乱、疾病或状况，或一种或更多种与该紊乱、疾病或状况相关的症状；或减轻或根除该紊乱、疾病或状况的病因本身。合意的治疗效果可包括但不限于预防疾病的发生或复发、减轻症状、减少疾病的任何直接或间接的病理后果、预防转移、降低疾病进展的速度、改善或缓和疾病状态，以及缓解或改进预后。

术语“治疗有效量”可指当施用时，可以足以防止所治疗的紊乱、疾病或状况的一种或更多种症状的发展或将其减轻一定程度的化合物的量。术语“治疗有效量”还可指足以引发研究者、兽医、医生或临床医师所寻求的细胞、组织、系统、动物或人类的生物学或医学反应的化合物的量。

术语“药学上可接受的运载体”、“药学上可接受的赋形剂”、“生理学上可接受的运载体”或“生理学上可接受的赋形剂”可以指药学上可接受的材料、组合物或媒介物，诸如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂或包封材料。在与药物制剂的其他成分相容的意义上来讲，组分可以是“药学上可接受的”。它还可适于与人类和动物的组织或器官接触使用，而没有过度的毒性、刺激、变态反应、免疫原性或其他问题或并发症，对应合理的受益/风险比。参见，Remington:The Science and Practice ofPharmacy，第21版；LippincottWilliams和Wilkins:Philadelphia,PA,2005；Handbook of Pharmaceutical Excipients,第5版；Rowe等人编著，The Pharmaceutical Press and the American PharmaceuticalAssociation:2005；以及Handbook of Pharmaceutical Additives,第三版；Ash和Ash编著，Gower Publishing Company:2007；Pharmaceutical Preformulation andFormulation,Gibson编著，CRC Press LLC:Boca Raton,FL,2004)。

术语“药物组合物”可指本文公开的化合物与其他化学组分诸如稀释剂或运载体的混合物。药物组合物可以有助于向生物体施用化合物。本领域存在施用化合物的多种技术，包括但不限于口服、注射、气雾剂、肠胃外和表面(topical)施用。药物组合物也可通过使化合物与无机酸或有机酸，诸如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸、水杨酸等反应来获得。

“制剂”可以指包含活性药物或生物成分(例如本公开内容的修饰的痘苗病毒)以及一种或更多种另外组分的组合物。术语“制剂”在本文可与术语“药物组合物”、“疫苗组合物”和“疫苗制剂”互换使用。制剂可以是液体或固体(例如，冻干的)。

术语“免疫原性组合物”或“免疫学组合物”可涵盖可针对本文描述的修饰的痘苗病毒表达的感兴趣的抗原引发免疫应答的组合物。术语“疫苗或疫苗组合物”可涵盖可诱导针对感兴趣的抗原的保护性免疫应答或可有效针对感兴趣的抗原提供保护的任何组合物；例如，在施用或注射到动物或人类中后，引发针对抗原的保护性免疫应答或提供针对由修饰的痘苗病毒载体表达的抗原的有效保护。组合物可以单独施用，或可以与其它组合物或治疗组合物顺序施用，从而提供两种或更多种诸如三种、四种、五种或六种组合物的组合组合物、混合物或多价混合物。

如本文所用的，“抗癌剂”可指能够负面地影响受试者中的癌症的剂或疗法，例如，通过杀伤癌细胞、诱导癌细胞中的凋亡、降低癌细胞的生长速率、减少转移的发生率或次数、减小肿瘤大小、抑制肿瘤生长、减少对肿瘤或癌细胞的血液供应、促进针对癌细胞或肿瘤的免疫应答、预防或抑制癌症的进展或延长患有癌症的受试者的寿命。抗癌剂的非限制性实例可包括生物制剂(生物疗法)、化疗剂和放疗剂。

术语“初免-加强疫苗接种”可以指使用靶向特定抗原的疫苗的第一次初免注射，随后间隔地进行相同疫苗的一次或更多次加强注射的疫苗接种策略。初免-加强疫苗接种可以是同源的或异源的。同源初免-加强疫苗接种可以使用包含相同免疫原和载体的疫苗用于初免注射和一次或更多次加强注射两者。异源初免-加强疫苗接种使用包含相同免疫原的疫苗用于初免注射和一次或更多次加强注射两者但使用不同载体用于初免注射和一次或更多次加强注射。例如，同源初免-加强疫苗接种可以使用包含表达感兴趣抗原的相同核酸的修饰的痘苗病毒载体，用于初免注射和一次或更多次加强注射两者。相反，异源初免-加强疫苗接种可以使用包含表达一种抗原蛋白的核酸的修饰的痘苗病毒载体用于初免注射和另一种表达未包含在初免注射中的另一种抗原蛋白的修饰的痘苗病毒载体，或反之亦然。异源初免-加强疫苗接种也可以涵盖各种组合，诸如例如在初免注射中使用编码免疫原的质粒，并且在一次或更多次加强注射中使用编码相同免疫原的修饰的痘苗病毒，或者在初免注射中使用重组蛋白免疫原，并且在一次或更多次加强注射中使用编码相同蛋白免疫原的修饰的痘苗病毒载体。

病毒

本文提供的方法和系统可以适用于制造多种不同的病毒，例如溶瘤病毒，例如重组溶瘤病毒。在一些情况下，本文提供的方法和系统可以适用于制造痘苗病毒，例如重组痘苗病毒。

本文提供的方法和系统适用的示例性溶瘤病毒包括麻疹病毒、脊髓灰质炎病毒、痘病毒、痘苗病毒、腺病毒、腺相关病毒、单纯疱疹病毒、水疱性口炎病毒、呼肠孤病毒、新城疫病毒、塞内加病毒、慢病毒、门戈病毒和粘液瘤病毒。在一些实施方案中，修饰的溶瘤病毒可以包括痘病毒。在某些实例中，溶瘤病毒可以是痘苗病毒。在一些实施方案中，修饰的溶瘤病毒可适用于全身递送。

修饰的痘苗病毒

如本文所用的，术语“修饰的痘苗病毒”或“重组痘苗病毒”可以涉及已经被修饰的痘苗病毒，例如通过诸如引入病毒主链突变的修饰，以表达病原体(引起感染性疾病的病毒、细菌或寄生虫病原体)的基因/表位，表达增加T细胞应答的基因，诸如TRIF表达，表达TRIF途径的其他上游和下游分子。在一些实施方案中，引入病毒主链突变包括一种或更多种毒力基因的完全缺失或部分缺失，或一种或更多种病毒毒力基因的替换(非限制性实例包括已知抑制参与Th1免疫应答或参与先天免疫信号传导的细胞因子的基因，或免疫应答的其他组分的抑制剂，或用来自其他痘病毒的功能相当的或多或少有效基因交换痘苗毒力基因)。

在一些实施方案中，本公开内容的修饰的痘苗病毒可以选自由以下组成的组：野生型痘苗病毒毒株和减毒痘苗病毒毒株。痘苗病毒毒株的非限制性实例可以包括痘苗病毒的Western Reserve毒株(ATCC VR-1354)、胸苷激酶阴性Western Reserve痘苗病毒、Copenhagen毒株、IHD毒株、Wyeth(NYCBOH)毒株(ATCC VR-1536)、Tian Tan毒株、Lister毒株、NYVAC毒株、修饰的痘苗病毒Ankara(MVA)(ATCC VR-1508或ATCC VR-1566)、USSR毒株、ACAM2000毒株、Paris毒株、Bern毒株、Temple of Heaven毒株、Dairen毒株、EM-63毒株、Evans毒株、King毒株、Patwadangar毒株或Tash Kent毒株。

在一些实施方案中，为了开发示出增强的全身递送和肿瘤微环境的免疫重塑以增强T细胞功能和分化的修饰的溶瘤痘苗病毒，通过缺失基因组中的两个非必需区域和添加外来基因组以表达融合蛋白和趋化因子受体来修饰痘苗病毒的Western reserve毒株。痘苗病毒的病毒主链中非必需基因组被缺失的基因座也被工程化以接收外来基因组。

对痘苗病毒主链的修饰

在图1中详细描述了在相应基因座上缺失的区域和添加的外来基因。从病毒主链中缺失的非必需基因的列表包括胸苷激酶基因(示出为“TK-”)和A52R基因(示出为“A52R-”)。因此，在一些实施方案中，修饰的溶瘤痘苗病毒可以包含异源核酸序列，其表现出增强的全身递送和肿瘤微环境的免疫重塑，以增强T细胞功能和分化。因此，在一些实例中，异源核酸可以编码一种或更多种融合蛋白。编码肽或蛋白的异源核酸可以克隆到病毒的胸苷激酶(TK)基因座中。

从病毒主链上完全缺失胸苷激酶基因是美国食品和药物管理局(U.S.Food andDrug administration)公认的一种已知的肿瘤靶向安全性修饰，因为它限制了病毒复制到表达细胞胸苷激酶(其在大多数肿瘤中上调)的细胞。

从病毒主链中缺失A52R基因，一种NF-kB抑制剂，增强了记忆T细胞应答，导致增强的免疫应答(Di Pilato M，等人J Virol 91:e00575-17)。A52R基因的缺失作为癌症疗法是非常有效的，因为与许多其它缺失不同，这不会减少病毒的体外复制。

在同一痘苗病毒主链中组合TK基因和A52R基因的缺失产生了双重安全机制和高效溶瘤载体。

在一些情况下，痘苗主链上A52R基因的缺失基因座可以用编码趋化因子受体的外源核酸取代。更具体地，趋化因子受体可以是CCR2受体，其可以具有在肿瘤上表达的靶CCL2。病毒上的趋化因子受体表达导致基于原位细胞的靶向和增强的全身递送。

在某些情况下，痘苗主链上TK基因的缺失基因座可以用编码融合蛋白的外源核酸取代。更具体地，融合蛋白可以是瘦素-白细胞介素(IL)-2融合蛋白。瘦素-IL-2融合蛋白通过将瘦素更有效地靶向T细胞(以增加活性)和调节性T细胞(以抑制其活性)并远离肿瘤中的基质瘦素受体来增加活性。此外，IL-2与瘦素的融合通过共刺激IL-2受体产生了另外的治疗活性。融合蛋白进一步产生了一个大分子，它将更有效地被捕获在肿瘤中并防止全身效应。融合蛋白的结构和特征描述在WO2019148109(其全部公开内容特此通过引用明确并入本文)中。

其他多于一种修饰

在一些实施方案中，本文提供了包含在病毒基因组(在本文中也称为病毒主链)中含有插入、突变或缺失的修饰的痘苗病毒的疫苗。痘苗病毒被修饰或选择为具有低毒性并在靶组织中积累。在一些实施方案中，病毒主链/病毒基因组中的修饰是使痘苗病毒非复制或包含不良复制能力的修饰。这样的修饰的非限制性实例可包括下列病毒基因中的突变：A1、A2、VH1、A33和I7。

在一些实施方案中，病毒主链突变选自由以下组成的组：B15R基因的完全或部分缺失；K7R基因的完全或部分缺失；B14R基因的完全或部分缺失；N1L基因的完全或部分缺失；K1L基因的完全或部分缺失；M2L基因的完全或部分缺失；A49R基因的完全或部分缺失；VH1基因的完全或部分缺失；A33基因的完全或部分缺失；A1的完全或部分缺失；A2基因的完全或部分缺失；I7基因的完全或部分缺失，以及A46R基因的完全或部分缺失。如本文所用的，提及病毒基因可以通过提及由该基因编码的蛋白来进行(例如，A33基因可以意指编码A33蛋白的基因)。

在一些实施方案中，病毒主链突变，包括取代、插入和缺失的任何组合，可以产生与病毒基因的野生型序列或由该基因编码的病毒蛋白具有小于100％、99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％或更少序列同源性的序列。在一些实施方案中，病毒基因和由其编码的蛋白选自由以下组成的组：B15R、K7R、B14R、N1L、K1L、M2L、A49R、VH1、A33、A1、A2、I7和A46R。

在一些实施方案中，病毒主链可以包含病毒蛋白(例如，病毒抗原)的氨基酸序列中的1种、2种、3种、4种、5种或更多种突变。在一些实例中，病毒抗原选自由以下组成的组：B15R、K7R、B14R、N1L、K1L、M2L、A49R、VH1、A33、A1、A2、I7和A46R。

在一些实施方案中，本公开内容提供了在病毒基因组(病毒主链)中包含一种或更多种突变的修饰的痘苗病毒，使得该突变增加了免疫应答的T细胞臂(T-cell arm)。突变可以是病毒基因组(痘苗病毒的野生型或减毒天然毒株)中一个或更多个核酸的添加、缺失或取代。

在非限制性实例中，突变可以是已知抑制参与Th1免疫应答的细胞因子的基因的完全或部分缺失。作为非限制性实例，突变可以是编码B8R(干扰素γ(IFN-g)结合蛋白)；C12L(白细胞介素-18(IL-18)结合蛋白)的核酸的缺失。

在另一个非限制性实例中，突变可以是先天免疫信号传导中基因的完全或部分缺失。作为非限制性实例，突变可以是编码B18R(I型干扰素(IFN)结合蛋白)；A52R(核因子κB(NF-κB)抑制剂蛋白)；E3L(蛋白激酶(PKR)抑制剂)；C4，C16(STING途径抑制剂)的核酸的缺失。

在另一个非限制性实例中，突变可以是编码用于抑制免疫应答的其他组分的蛋白的基因的完全或部分缺失。作为非限制性实例，突变可以是编码B15、K7、B14、N1、K1、M2、A49、VH1、A46或其组合的核酸的完全或部分缺失。病毒主链突变也可以包括用主要是来自其他痘病毒的功能相当的有效基因取代痘苗毒力基因。

本公开内容的多肽的氨基酸序列变体可以是取代的、插入的或缺失的变体。与野生型相比，编码病毒多肽的基因中的突变可影响多肽的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、50个、51个、52个、53个、54个、55个、56个、57个、58个、59个、60个、61个、62个、63个、64个、65个、66个、67个、68个、69个、70个、71个、72个、73个、74个、75个、76个、77个、78个、79个、80个、81个、82个、83个、84个、85个、86个、87个、88个、89个、90个、91个、92个、93个、94个、95个、96个、97个、98个、99个、100个、110个、120个、130个、140个、150个、160个、170个、180个、190个、200个、210个、220个、230个、240个、250个、275个、300个、325个、350个、375个、400个、425个、450个、475个、500个或更多个非连续或连续氨基酸。

缺失变体可缺少天然或野生型蛋白的一个或更多个残基。单个残基可以被缺失，或结构域(诸如催化或结合结构域)的全部或部分可以被缺失。终止密码子可以被引入(通过取代或插入)编码核酸序列中以产生截短的蛋白。插入突变体通常涉及在多肽的非末端点添加物质。这可以包括插入免疫反应性表位或简单的一个或更多个残基。也可以产生末端添加物，称为融合蛋白。

取代变体通常在蛋白内的一个或更多个位点包含一个氨基酸与另一个氨基酸的交换，并且可以被设计成调节多肽的一个或更多个特性，具有或不具有其他功能或特性的损失。取代可以是保守的，即一个氨基酸被用形状和电荷相似的氨基酸替代。保守取代可以包括，例如，以下的变化：丙氨酸到丝氨酸；精氨酸到赖氨酸；天冬酰胺到谷氨酰胺或组氨酸；天冬氨酸到谷氨酸；半胱氨酸到丝氨酸；谷氨酰胺到天冬酰胺；谷氨酸到天冬氨酸；甘氨酸到脯氨酸；组氨酸到天冬酰胺或谷氨酰胺；异亮氨酸到亮氨酸或缬氨酸；亮氨酸到缬氨酸或异亮氨酸；赖氨酸到精氨酸；甲硫氨酸到亮氨酸或异亮氨酸；苯丙氨酸到酪氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸；丝氨酸到苏氨酸；苏氨酸到丝氨酸；色氨酸到酪氨酸；酪氨酸到色氨酸或苯丙氨酸；以及缬氨酸到异亮氨酸或亮氨酸。可选地，取代可以是非保守的，从而影响多肽的功能或活性。非保守性变化通常包括用化学上不同的残基取代残基，诸如用极性或带电氨基酸取代非极性或不带电氨基酸，并且反之亦然。

本文提供的痘苗病毒包含在病毒基因组中另外的插入、突变、缺失或取代。本公开内容的痘苗病毒可以包含外源核酸的一个或更多个另外插入或部分插入，该外源核酸编码趋化因子受体、TRIF蛋白或其功能结构域中的一种或更多种，或瘦素、白细胞介素-2(IL2)、白细胞介素-15/白细胞介素-15Ra(IL15/IL15Ra)、白细胞介素-7(IL-7)、瘦素-白细胞介素融合蛋白(例如，实施例1中示为L2的瘦素-IL2融合蛋白)中的一种或更多种。诸如趋化因子受体插入的修饰可以是野生型和/或突变型CXCR4、CCR2、CCL2的插入。痘苗病毒还可以包含来自A52R、B15R、K7R、A46R、N1L、E3L、K1L、M2L、C16、N2R、B8R、B18R、VH1以及其功能结构域或片段或变体，或其任何组合的一个或更多个基因的一个或更多个另外缺失或部分缺失。在一些实例中，修饰包括编码趋化因子受体诸如CXC受体、CC受体、CX3C受体、XC受体，其功能片段或其变体或其任何组合的外源核酸。趋化因子受体的实例包括但不限于，CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR5、CXCR6、CXCR7、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CCR10、CX3CR1、XCR1，其功能片段或其变体，或其任何组合。在一些情况下，编码趋化因子受体的外源核酸包括编码多于一种趋化因子受体。例如，核酸可以编码CXCR4和CCR2受体、CXCR2和CCR3受体、CXCR4和CCR10受体或其任何其他组合。在一些情况下，编码趋化因子受体的外源核酸包括用于在病毒中增强表达的密码子优化核酸序列，例如人类趋化因子受体编码序列(诸如人类CCR2编码序列)的密码子优化变体。编码趋化因子受体的核酸的非限制性实例在SEQ ID NO:2和3中提供，并且在一些实施方案中，如本文描述的编码趋化因子受体的外源核酸可以包含与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的序列至少约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％同源的序列。在一些实施方案中，编码如本文描述的融合蛋白(例如瘦素-IL2融合蛋白)的外源核酸包含与SEQ IDNO:1的序列至少约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％同源的序列。

在一些实施方案中，编码本文描述的融合蛋白的外源核酸包含瘦素多肽和IL-2多肽。在一些实施方案中，瘦素多肽包含与SEQ ID NO:4的序列至少约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％同源的序列。在一些实施方案中，IL-2多肽包含与SEQ ID NO:5的序列至少约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％同源的序列。

修饰的溶瘤病毒的递送

本文提供了通过施用本文描述的修饰的溶瘤痘苗病毒来治疗状况的方法。

在一些实施方案中，向受试者施用的本公开内容的修饰的溶瘤痘苗病毒的量可以在约10³和10¹²个感染性病毒颗粒或噬斑形成单位(PFU)之间，或在约10⁵PFU和10¹⁰PFU之间，或在约10⁵PFU和10⁸PFU之间，或在约10⁸PFU和10¹⁰PFU之间。在一些实施方案中，向受试者施用的本公开内容的修饰的溶瘤痘苗病毒的量可以在约10³和10¹²个病毒颗粒或噬斑形成单位(PFU)之间，或在约10⁵PFU和10¹⁰PFU之间，或在约10⁵PFU和10⁸PFU之间，或在约10⁸PFU和10¹⁰PFU之间。在一些实施方案中，本公开内容的修饰的溶瘤痘苗病毒可以以可包含约10³PFU/剂至约10⁴PFU/剂、约10⁴PFU/剂至约10⁵PFU/剂、约10⁵PFU/剂至约10⁶PFU/剂、约10⁷PFU/剂至约10⁸PFU/剂、约10⁹PFU/剂至约10¹⁰PFU/剂、约10¹⁰PFU/剂至约10¹¹PFU/剂、约10¹¹PFU/剂至约10¹²PFU/剂、约10¹²PFU/剂至约10¹³PFU/剂、约10¹³PFU/剂至约10¹⁴PFU/剂、或约10¹⁴PFU/剂至约10¹⁵PFU/剂的剂量施用。在一些实施方案中，本公开内容的修饰的溶瘤痘苗病毒可以以可包含约2x10³PFU/剂、3x10³PFU/剂、4x10³PFU/剂、5x10³PFU/剂、6x10³PFU/剂、7x10³PFU/剂、8x10³PFU/剂、9x10³PFU/剂、约10⁴PFU/剂、约2x10⁴PFU/剂、约3x10⁴PFU/剂、约4x10⁴PFU/剂、约5x10⁴PFU/剂、约6x10⁴PFU/剂、约7x10⁴PFU/剂、约8x10⁴PFU/剂、约9x10⁴PFU/剂、约10⁵PFU/剂、2x10⁵PFU/剂、3x10⁵PFU/剂、4x10⁵PFU/剂、5x10⁵PFU/剂、6x10⁵PFU/剂、7x10⁵PFU/剂、8x10⁵PFU/剂、9x10⁵PFU/剂、约10⁶PFU/剂、约2x10⁶PFU/剂、约3x10⁶PFU/剂、约4x10⁶PFU/剂、约5x10⁶PFU/剂、约6x10⁶PFU/剂、约7x10⁶PFU/剂、约8x10⁶PFU/剂、约9x10⁶PFU/剂、约10⁷PFU/剂、约2x10⁷PFU/剂、约3x10⁷PFU/剂、约4x10⁷PFU/剂、约5x10⁷PFU/剂、约6x10⁷PFU/剂、约7x10⁷PFU/剂、约8x10⁷PFU/剂、约9x10⁷PFU/剂、约10⁸PFU/剂、约2x10⁸PFU/剂、约3x10⁸PFU/剂、约4x10⁸PFU/剂、约5x10⁸PFU/剂、约6x10⁸PFU/剂、约7x10⁸PFU/剂、约8x10⁸PFU/剂、约9x10⁸PFU/剂、约10⁹PFU/剂、约2x10⁹PFU/剂、约3x10⁹PFU/剂、约4x10⁹PFU/剂、约5x10⁹PFU/剂、约6x10⁹PFU/剂、约7x10⁹PFU/剂、约8x10⁹PFU/剂、约9x10⁹PFU/剂、约10¹⁰PFU/剂、约2x10¹⁰PFU/剂、约3x10¹⁰PFU/剂、约4x10¹⁰PFU/剂、约5x10¹⁰PFU/剂、约6x10¹⁰PFU/剂、约7x10¹⁰PFU/剂、约8x10¹⁰PFU/剂、约9x10¹⁰PFU/剂、约10¹⁰PFU/剂、约2x10¹⁰PFU/剂、约3x10¹⁰PFU/剂、约4x10¹⁰PFU/剂、约5x10¹⁰PFU/剂、约6x10¹⁰PFU/剂、约7x10¹⁰PFU/剂、约8x10¹⁰PFU/剂、约9x10¹⁰PFU/剂、约10¹¹PFU/剂、约2x10¹¹PFU/剂、约3x10¹¹PFU/剂、约4x10¹¹PFU/剂、约5x10¹¹PFU/剂、约6x10¹¹PFU/剂、约7x10¹¹PFU/剂、约8x10¹¹PFU/剂、约9x10¹¹PFU/剂、或约10¹²PFU/剂、约10¹²PFU/剂至约10¹³PFU/剂、约10¹³PFU/剂至约10¹⁴PFU/剂、或约10¹⁴PFU/剂至约10¹⁵PFU/剂的剂量施用。在一些实施方案中，本公开内容的修饰的溶瘤痘苗病毒可以以可包含5x10⁹PFU/剂的剂量施用。在一些实施方案中，本公开内容的修饰的溶瘤痘苗病毒可以以可包含高达5x10⁹PFU/剂的剂量施用。

在一些实施方案中，本公开内容的修饰的溶瘤痘苗病毒可以以可包含约10³个病毒颗粒/剂至约10⁴个病毒颗粒/剂、约10⁴个病毒颗粒/剂至约10⁵个病毒颗粒/剂、约10⁵个病毒颗粒/剂至约10⁶个病毒颗粒/剂、约10⁷个病毒颗粒/剂至约10⁸个病毒颗粒/剂、约10⁹个病毒颗粒/剂至约10¹⁰个病毒颗粒/剂、约10¹⁰个病毒颗粒/剂至约10¹¹个病毒颗粒/剂、约10¹¹个病毒颗粒/剂至约10¹²个病毒颗粒/剂、约10¹²个病毒颗粒/剂至约10¹³个病毒颗粒/剂、约10¹³个病毒颗粒/剂至约10¹⁴个病毒颗粒/剂、或约10¹⁴个病毒颗粒/剂至约10¹⁵个病毒颗粒/剂的剂量施用。

在一些实施方案中，本公开内容的修饰的溶瘤痘苗病毒可以以可包含约10³PFU/kg至约10⁴PFU/kg、约10⁴PFU/kg至约10⁵PFU/kg、约10⁵PFU/kg至约10⁶PFU/kg、约10⁷PFU/kg至约10⁸PFU/kg、约10⁹PFU/kg至约10¹⁰PFU/kg、约10¹⁰PFU/kg至约10¹¹PFU/kg、约10¹¹PFU/kg至约10¹²PFU/kg、约10¹²PFU/kg至约10¹³PFU/kg、约10¹³PFU/kg至约10¹⁴PFU/kg、或约10¹⁴PFU/kg至约10¹⁵PFU/kg的剂量施用。在一些实施方案中，本公开内容的修饰的溶瘤痘苗病毒可以以可包含约2x10³PFU/kg、3x10³PFU/kg、4x10³PFU/kg、5x10³PFU/kg、6x10³PFU/kg、7x10³PFU/kg、8x10³PFU/kg、9x10³PFU/kg、约10⁴PFU/kg、约2x10⁴PFU/kg、约3x10⁴PFU/kg、约4x10⁴PFU/kg、约5x10⁴PFU/kg、约6x10⁴PFU/kg、约7x10⁴PFU/kg、约8x10⁴PFU/kg、约9x10⁴PFU/kg、约10⁵PFU/kg、2x10⁵PFU/kg、3x10⁵PFU/kg、4x10⁵PFU/kg、5x10⁵PFU/kg、6x10⁵PFU/kg、7x10⁵PFU/kg、8x10⁵PFU/kg、9x10⁵PFU/kg、约10⁶PFU/kg、约2x10⁶PFU/kg、约3x10⁶PFU/kg、约4x10⁶PFU/kg、约5x10⁶PFU/kg、约6x10⁶PFU/kg、约7x10⁶PFU/kg、约8x10⁶PFU/kg、约9x10⁶PFU/kg、约10⁷PFU/kg、约2x10⁷PFU/kg、约3x10⁷PFU/kg、约4x10⁷PFU/kg、约5x10⁷PFU/kg、约6x10⁷PFU/kg、约7x10⁷PFU/kg、约8x10⁷PFU/kg、约9x10⁷PFU/kg、约10⁸PFU/kg、约2x10⁸PFU/kg、约3x10⁸PFU/kg、约4x10⁸PFU/kg、约5x10⁸PFU/kg、约6x10⁸PFU/kg、约7x10⁸PFU/kg、约8x10⁸PFU/kg、约9x10⁸PFU/kg、约10⁹PFU/kg、约2x10⁹PFU/kg、约3x10⁹PFU/kg、约4x10⁹PFU/kg、约5x10⁹PFU/kg、约6x10⁹PFU/kg、约7x10⁹PFU/kg、约8x10⁹PFU/kg、约9x10⁹PFU/kg、约10¹⁰PFU/kg、约2x10¹⁰PFU/kg、约3x10¹⁰PFU/kg、约4x10¹⁰PFU/kg、约5x10¹⁰PFU/kg、约6x10¹⁰PFU/kg、约7x10¹⁰PFU/kg、约8x10¹⁰PFU/kg、约9x10¹⁰PFU/kg、约10¹⁰PFU/kg、约2x10¹⁰PFU/kg、约3x10¹⁰PFU/kg、约4x10¹⁰PFU/kg、约5x10¹⁰PFU/kg、约6x10¹⁰PFU/kg、约7x10¹⁰PFU/kg、约8x10¹⁰PFU/kg、约9x10¹⁰PFU/kg、约10¹¹PFU/kg、约2x10¹¹PFU/kg、约3x10¹¹PFU/kg、约4x10¹¹PFU/kg、约5x10¹¹PFU/kg、约6x10¹¹PFU/kg、约7x10¹¹PFU/kg、约8x10¹¹PFU/kg、约9x10¹¹PFU/kg、或约10¹²PFU/kg、约10¹²PFU/kg至约10¹³PFU/kg、约10¹³PFU/kg至约10¹⁴PFU/kg、或约10¹⁴PFU/kg至约10¹⁵PFU/kg的剂量施用。在一些实施方案中，本公开内容的修饰的溶瘤痘苗病毒可以以可包含5x10⁹PFU/kg的剂量施用。在一些实施方案中，本公开内容的修饰的溶瘤痘苗病毒可以以可包含高达5x10⁹PFU/kg的剂量施用。

在一些实施方案中，本公开内容的修饰的溶瘤痘苗病毒可以以可包含约10³个病毒颗粒/kg至约10⁴个病毒颗粒/kg、约10⁴个病毒颗粒/kg至约10⁵个病毒颗粒/kg、约10⁵个病毒颗粒/kg至约10⁶个病毒颗粒/kg、约10⁷个病毒颗粒/kg至约10⁸个病毒颗粒/kg、约10⁹个病毒颗粒/kg至约10¹⁰个病毒颗粒/kg、约10¹⁰个病毒颗粒/kg至约10¹¹个病毒颗粒/kg、约10¹¹个病毒颗粒/kg至约10¹²个病毒颗粒/kg、约10¹²个病毒颗粒/kg至约10¹³个病毒颗粒/kg、约10¹³个病毒颗粒/kg至约10¹⁴个病毒颗粒/kg、或约10¹⁴个病毒颗粒/kg至约10¹⁵个病毒颗粒/kg的剂量施用。

在某些实施方案中，如本文描述的修饰的溶瘤痘苗病毒的液体剂型可以包含约10³PFU/mL至约10⁴PFU/mL、约10⁴PFU/mL至约10⁵PFU/mL、约10⁵PFU/mL至约10⁶PFU/mL、约10⁷PFU/mL至约10⁸PFU/mL、约10⁹PFU/mL至约10¹⁰PFU/mL、约10¹⁰PFU/mL至约10¹¹PFU/mL、约10¹¹PFU/mL至约10¹²PFU/mL、约10¹²PFU/mL至约10¹³PFU/mL、约10¹³PFU/mL至约10¹⁴PFU/mL、或约10¹⁴PFU/mL至约10¹⁵PFU/mL的病毒剂量。在一些实施方案中，本公开内容的修饰的溶瘤痘苗病毒可以以可包含约2x10³PFU/mL、3x10³PFU/mL、4x10³PFU/mL、5x10³PFU/mL、6x10³PFU/mL、7x10³PFU/mL、8x10³PFU/mL、9x10³PFU/mL、约10⁴PFU/mL、约2x10⁴PFU/mL、约3x10⁴PFU/mL、约4x10⁴PFU/mL、约5x10⁴PFU/mL、约6x10⁴PFU/mL、约7x10⁴PFU/mL、约8x10⁴PFU/mL、约9x10⁴PFU/mL、约10⁵PFU/mL、2x10⁵PFU/mL、3x10⁵PFU/mL、4x10⁵PFU/mL、5x10⁵PFU/mL、6x10⁵PFU/mL、7x10⁵PFU/mL、8x10⁵PFU/mL、9x10⁵PFU/mL、约10⁶PFU/mL、约2x10⁶PFU/mL、约3x10⁶PFU/mL、约4x10⁶PFU/mL、约5x10⁶PFU/mL、约6x10⁶PFU/mL、约7x10⁶PFU/mL、约8x10⁶PFU/mL、约9x10⁶PFU/mL、约10⁷PFU/mL、约2x10⁷PFU/mL、约3x10⁷PFU/mL、约4x10⁷PFU/mL、约5x10⁷PFU/mL、约6x10⁷PFU/mL、约7x10⁷PFU/mL、约8x10⁷PFU/mL、约9x10⁷PFU/mL、约10⁸PFU/mL、约2x10⁸PFU/mL、约3x10⁸PFU/mL、约4x10⁸PFU/mL、约5x10⁸PFU/mL、约6x10⁸PFU/mL、约7x10⁸PFU/mL、约8x10⁸PFU/mL、约9x10⁸PFU/mL、约10⁹PFU/mL、约2x10⁹PFU/mL、约3x10⁹PFU/mL、约4x10⁹PFU/mL、约5x10⁹PFU/mL、约6x10⁹PFU/mL、约7x10⁹PFU/mL、约8x10⁹PFU/mL、约9x10⁹PFU/mL、约10¹⁰PFU/mL、约2x10¹⁰PFU/mL、约3x10¹⁰PFU/mL、约4x10¹⁰PFU/mL、约5x10¹⁰PFU/mL、约6x10¹⁰PFU/mL、约7x10¹⁰PFU/mL、约8x10¹⁰PFU/mL、约9x10¹⁰PFU/mL、约10¹⁰PFU/mL、约2x10¹⁰PFU/mL、约3x10¹⁰PFU/mL、约4x10¹⁰PFU/mL、约5x10¹⁰PFU/mL、约6x10¹⁰PFU/mL、约7x10¹⁰PFU/mL、约8x10¹⁰PFU/mL、约9x10¹⁰PFU/mL、约10¹¹PFU/mL、约2x10¹¹PFU/mL、约3x10¹¹PFU/mL、约4x10¹¹PFU/mL、约5x10¹¹PFU/mL、约6x10¹¹PFU/mL、约7x10¹¹PFU/mL、约8x10¹¹PFU/mL、约9x10¹¹PFU/mL、或约10¹²PFU/mL、约10¹²PFU/mL至约10¹³PFU/mL、约10¹³PFU/mL至约10¹⁴PFU/mL、或约10¹⁴PFU/mL至约10¹⁵PFU/mL的剂量施用。在一些实施方案中，本公开内容的修饰的溶瘤痘苗病毒可以以可包含5x10⁹PFU/mL的剂量施用。在一些实施方案中，本公开内容的修饰的溶瘤痘苗病毒可以以可包含高达5x10⁹PFU/mL的剂量施用。

在某些情况下，在可以通过注射施用修饰的溶瘤痘苗病毒时，剂量可以包括约每次注射10³个病毒颗粒、每次注射10⁴个病毒颗粒、每次注射10⁵个病毒颗粒、每次注射10⁶个病毒颗粒、每次注射10⁷个病毒颗粒、每次注射10⁸个病毒颗粒、每次注射10⁹个病毒颗粒、每次注射10¹⁰个病毒颗粒、每次注射10¹¹个病毒颗粒、每次注射10¹²个病毒颗粒、每次注射2x10¹²个病毒颗粒、每次注射10¹³个病毒颗粒、每次注射10¹⁴个病毒颗粒、或每次注射10¹⁵个病毒颗粒。在另外的情况下，在通过注射施用修饰的溶瘤痘苗病毒时，剂量可以包括每次注射约10³个感染性病毒颗粒、每次注射10⁴个感染性病毒颗粒、每次注射10⁵个感染性病毒颗粒、每次注射10⁶个感染性病毒颗粒、每次注射10⁷个感染性病毒颗粒、每次注射10⁸个感染性病毒颗粒、每次注射10⁹个感染性病毒颗粒、每次注射10¹⁰个感染性病毒颗粒、每次注射10¹¹个感染性病毒颗粒、每次注射10¹²个感染性病毒颗粒、每次注射2x10¹²个感染性病毒颗粒、每次注射10¹³个感染性病毒颗粒、每次注射10¹⁴个感染性病毒颗粒、或每次注射10¹⁵个感染性病毒颗粒。在另外的实施方案中，本公开内容的修饰的溶瘤痘苗病毒可以以可以是约10³组织培养抑制剂剂量50％(TCID₅₀)/kg、10⁴TCID₅₀/kg、10⁴TCID₅₀/kg、10⁴TCID₅₀/kg、10⁴TCID₅₀/kg、10⁴TCID₅₀/kg、10⁴TCID₅₀/kg、10⁴TCID₅₀/kg、10⁴TCID₅₀/kg、10⁴TCID₅₀/kg、10⁴TCID₅₀/kg、10⁴TCID₅₀/kg、10⁴TCID₅₀/kg、3x10⁸TCID₅₀/kg、4x10⁸TCID₅₀/kg、5x10⁸TCID₅₀/kg、3x10⁹TCID₅₀/kg、4x10⁹TCID₅₀/kg、5x10⁹TCID₅₀/kg、3x10¹⁰TCID₅₀/kg、4x10¹⁰TCID₅₀/kg、或4x10¹⁰TCID₅₀/kg的剂量施用。注意，本文10^x可选地表示为1eX。在某些实施方案中，修饰的溶瘤痘苗病毒可以以一剂或更多剂施用。在某些实施方案中，该病毒可以以足以诱导肿瘤中至少约20％的细胞、肿瘤中至少约30％的细胞、肿瘤中至少约40％的细胞、肿瘤中至少约50％的细胞、肿瘤中至少约60％的细胞、肿瘤中至少约70％的细胞、肿瘤中至少约80％的细胞或肿瘤中至少约90％的细胞发生溶瘤的量施用。

在某些实施方案中，单剂量的病毒可指在1小时、2小时、5小时、10小时、15小时、20小时或24小时的时间段内向受试者或肿瘤施用的量。在某些实施方案中，剂量可以随时间或通过单独的注射来扩展。在某些实施方案中，可以向受试者施用多于一个剂量(例如，2个、3个、4个、5个、6个或更多个剂量)的痘苗病毒，例如，其中第二治疗可以在第一治疗后的1、2、3、4、5、6、7天或周内进行。在某些实施方案中，可以在1、2、3、4、5、6、7或更多天或周的时间段内向受试者施用多于一个剂量的修饰的溶瘤病毒。在某些实施方案中，如本文描述的溶瘤痘苗病毒或药物组合物可以在约1周至约2周、约2周至约3周、约3周至约4周、约4周至约5周、约6周至约7周、约7周至约8周、约8周至约9周、约9周至约10周、约10周至约11周、约11周至约12周、约12周至约24周、约24周至约48周、约48周或约52周或更长的时间段内施用。在某些情况下，如本文描述的溶瘤痘苗病毒或药物组合物的施用频率可以是每日一次、每日两次、每周一次、每三周一次、每四周一次(或每月一次)、每8周一次(或每2个月一次)、每12周一次(或每3个月一次)或每24周一次(每6个月一次)。在本文公开的方法的一些实施方案中，溶瘤痘苗病毒或药物组合物可以独立地以用于第一时间段的初始剂量、以用于第二时间段的中间剂量和以用于第三时间段的高剂量施用。在一些实施方案中，初始剂量可以低于中间剂量，并且中间剂量可以低于高剂量。在一些实施方案中，第一、第二和第三时间段可以独立地为约1周至约2周、约2周至约3周、约3周至约4周、约4周至约5周、约6周至约7周、约7周至约8周、约8周至约9周、约9周至约10周、约10周至约11周、约11周至约12周、约12周至约24周、约24周至约48周、约48周或约52周或更长。在一些实施方案中，本文描述的修饰的溶瘤痘苗病毒可以使用初免-加强方案施用。

在一些实例中，根据本文描述的任何治疗方法，可以在施用如本文描述的修饰的溶瘤痘苗病毒或包含该修饰的溶瘤痘苗病毒的药物组合物之前、同时和之后使受试者进食碳水化合物减少的饮食，例如，生酮饮食。在某些实施方案中，受试者可以进食饮食，该饮食可以包括摄入每天少于500克的碳水化合物、每天少于450克的碳水化合物、每天少于450克的碳水化合物、每天少于400克的碳水化合物、每天少于350克的碳水化合物、每天少于300克的碳水化合物、每天少于250克的碳水化合物、每天少于200克的碳水化合物、每天少于150克的碳水化合物、每天少于100克的碳水化合物、每天少于90克的碳水化合物、每天少于80克的碳水化合物、每天少于70克的碳水化合物、每天少于60克的碳水化合物、每天少于50克的碳水化合物、每天少于40克的碳水化合物、每天少于30克的碳水化合物、每天少于20克的碳水化合物、或每天少于10克的碳水化合物。

用于将本公开内容的修饰的溶瘤痘苗病毒或包含该修饰的溶瘤痘苗病毒的药物组合物递送至癌细胞或肿瘤细胞的示例性方法可以是经由瘤内注射。然而，也可以使用替代的施用方法，例如，静脉内、经由输注、肠胃外、静脉内、皮内、肌肉内、透皮、舌下、直肠、尿道内、阴道内、鼻内、鞘内或腹膜内。施用途径可随肿瘤的位置和性质而不同。在某些实施方案中，施用途径可以是牙内、透皮、肠胃外、腹膜内、静脉内、肌肉内、鼻内、皮下、局部(regional)(例如，在肿瘤附近，特别是肿瘤的血管或邻近血管)、经皮、鞘内、气管内、腹膜内、动脉内、膀胱内、瘤内、吸入、灌注、通过灌洗或口服。可注射剂量的修饰的溶瘤痘苗病毒可以作为团注或缓慢输注施用。在某些实施方案中，修饰的溶瘤痘苗病毒可以从植入患者内的源向患者施用。在某些实施方案中，修饰的溶瘤痘苗病毒的施用可以通过在选定时间段内连续输注来进行。在一些情况下，如本文描述的溶瘤痘苗病毒或包含该溶瘤痘苗病毒的药物组合物可以通过在约15分钟、约30分钟、约45分钟、约50分钟、约55分钟、约60分钟、约75分钟、约90分钟、约100分钟或约120分钟或更长的时间段内输注而以治疗有效剂量施用。本公开内容的修饰的溶瘤痘苗病毒或药物组合物可以作为液体剂量施用，其中施用的总体积为约1mL至约5mL、约5mL至10mL、约15mL至约20mL、约25mL至约30mL、约30mL至约50mL、约50mL至约100mL、约100mL至150mL、约150mL至约200mL、约200mL至约250mL、约250mL至约300mL、约300mL至约350mL、约350mL至约400mL、约400mL至约450mL、约450mL至500mL、约500mL至750mL、或约750mL至1000mL。

组合疗法

在一些方面，本公开内容的方法包括将本文公开的修饰的溶瘤病毒或包含该修饰的溶瘤病毒的药物组合物在一种或更多种另外的疗法之前、之后或与其组合地施用。所述另外的疗法的实例可包括但不限于化学疗法、放射疗法、采用另外的病毒的溶瘤病毒疗法、采用免疫调节蛋白的治疗、抗癌剂或其任何组合。相对于修饰的病毒诸如溶瘤痘苗病毒的施用，另外的疗法可以同时或相继地施用。在某些实施方案中，本公开内容的方法可包括在一种或更多种抗癌剂或癌症疗法之前、之后或与其组合地施用如本文公开的修饰的溶瘤病毒。抗癌剂可包括但不限于化疗剂、放疗剂、细胞因子、免疫检查点抑制剂、抗血管生成剂、凋亡诱导剂、抗癌抗体和/或抗细胞周期蛋白依赖性激酶剂。在某些实施方案中，癌症疗法可包括化学疗法、生物疗法、放射疗法、免疫疗法、激素疗法、抗血管疗法、冷冻疗法、毒素疗法和/或手术或其组合。在某些实施方案中，本公开内容的方法可包括在本公开内容的修饰的溶瘤病毒之前、之后或与其组合地施用本文公开的修饰的病毒。修饰的溶瘤痘苗病毒与化学疗法的组合实现了协同效应，该协同效应在不包含所述修饰的溶瘤病毒中的修饰的修饰的溶瘤病毒中未观察到。上述组合的协同效应可有利地用来降低化学疗法如的剂量。因此，本文公开的使用修饰的病毒的治疗方法可以减少与化学疗法相关的毒性，例如，对化学疗法响应但在治疗剂量发生副作用的患者。在某些情况下，与单独的化学疗法或单独的溶瘤痘苗病毒相比，协同效应可导致肿瘤生长降低。肿瘤生长的示例性降低可以是约2％至约50％，如约5％、约10％、约20％、约25％、约35％、约45％或约50％。

在某些实施方案中，使用修饰的溶瘤病毒的治疗可以单独使用或与一种或更多种免疫调节剂组合使用。免疫调节剂可包括能够抑制与肿瘤或癌症相关的抗病毒免疫的任何化合物、分子或物质。在某些实施方案中，免疫调节剂可以能够抑制对修饰的病毒的先天免疫或适应性免疫。免疫调节剂的非限制性实例包括抗CD33抗体或其可变区，抗CD11b抗体或其可变区，COX2抑制剂(例如，塞来昔布(celecoxib))，细胞因子(诸如IL-12、GM-CSF、IL-2、IFN3和IFNγ)，和趋化因子(诸如MIP-1、MCP-1和IL-8)。在某些实施方案中，免疫调节剂可包括免疫检查点调节剂，例如但不限于抗CTLA4、抗PD-1和抗PD-L1和TLR激动剂(例如，聚I:C)。在一些实例中，免疫调节剂可包括免疫检查点抑制剂，如PD-1的拮抗剂(例如，与PD-1结合的拮抗剂抗体)、PD-L1的拮抗剂(例如，与PD-L1结合的拮抗剂抗体)、CTLA-4的拮抗剂(例如，与CTLA-4结合的拮抗剂抗体)、A2AR的拮抗剂(例如，与A2AR结合的拮抗剂抗体)、B7-H3的拮抗剂(例如，与B7-H3结合的拮抗剂抗体)、B7-H4的拮抗剂(例如，与B7-H4结合的拮抗剂抗体)、BTLA的拮抗剂(例如，与BTLA结合的拮抗剂抗体)、IDO的拮抗剂(例如，与IDO结合的拮抗剂抗体)、KIR的拮抗剂(例如，与KIR结合的拮抗剂抗体)、LAG3的拮抗剂(例如，与LAG3结合的拮抗剂抗体)、TIM-3的拮抗剂(例如，与TIM3结合的拮抗剂抗体)。在一些实施方案中，所述另外的疗法可包括施用免疫检查点调节剂。在一个实例中，免疫检查点调节剂可以是TGN1412。在一个实例中，免疫检查点调节剂可以是NKTR-214。在一个实例中，免疫检查点调节剂可以是MEDI0562。在一个实例中，免疫检查点调节剂可以是MEDI6469。在一个实例中，免疫检查点调节剂可以是MEDI6383。在一个实例中，免疫检查点调节剂可以是JTX-2011。在一个实例中，免疫检查点调节剂可以是Keytruda(派姆单抗(pembrolizumab))。在一个实例中，免疫检查点调节剂可以是Opdivo(纳武单抗(nivolumab))。在一个实例中，免疫检查点调节剂可以是Yervoy(伊匹单抗(ipilimumab))。在一个实例中，免疫检查点调节剂可以是曲美木单抗(tremelimumab)。在一个实例中，免疫检查点调节剂可以是Tecentriq(阿特珠单抗(atezolizumab))。在一个实例中，免疫检查点调节剂可以是MGA271。在一个实例中，免疫检查点调节剂可以是indoximod。在一个实例中，免疫检查点调节剂可以是Epacadostat。在一个实例中，免疫检查点调节剂可以是利瑞鲁单抗(Lirilumab)。在一个实例中，免疫检查点调节剂可以是BMS-986016。在一个实例中，免疫检查点调节剂可以是MPDL3280A。在一个实例中，免疫检查点调节剂可以是阿维鲁单抗(avelumab)。在一个实例中，免疫检查点调节剂可以是德瓦鲁单抗(durvalumab)。在一个实例中，免疫检查点调节剂可以是MEDI4736。在一个实例中，免疫检查点调节剂可以是MEDI4737。在一个实例中，免疫检查点调节剂可以是TRX518。在一个实例中，免疫检查点调节剂可以是MK-4166。在一个实例中，免疫检查点调节剂可以是乌瑞卢单抗(Urelumab)(BMS-663513)。在一个实例中，免疫检查点调节剂可以是PF-05082566(PF-2566)。

在某些实例中，在所述另外的疗法是放射的情况下，示例性的剂量可以是5,000Rad(50Gy)至100,000Rad(1000Gy)，或50,000Rad(500Gy)，或所述范围内的其他合适的剂量。可选地，放射剂量可以是约30至60Gy、约40至约50Gy、约40至48Gy或约44Gy，或所述范围内的其他合适的剂量，其中该剂量例如通过如上所述的剂量学研究来确定。如本文所用的“Gy”可指等于100Rad的放射的特定吸收剂量的单位。Gy是“戈瑞(Gray)”的缩写。

在某些实例中，在所述另外的疗法是化学疗法的情况下，示例性化疗剂可以包括但不限于烷化剂(例如，氮芥衍生物、乙烯亚胺、烷基磺酸盐、肼和三嗪、亚硝基脲(nitrosureas)和金属盐)、植物生物碱(例如，长春花生物碱、紫杉烷类、鬼臼毒素和喜树碱类似物)、抗肿瘤抗生素(例如，蒽环类、色霉素类等)、抗代谢物(例如，叶酸拮抗剂、嘧啶拮抗剂、嘌呤拮抗剂和腺苷脱氨酶抑制剂)、拓扑异构酶I抑制剂、拓扑异构酶II抑制剂和其他抗赘生物剂(miscellaneous antineoplastics)(例如，核糖核苷酸还原酶抑制剂、肾上腺皮质类固醇抑制剂、酶、抗微管剂和类视黄醇)。示例性化疗剂可以包括但不限于阿那曲唑比卡鲁胺/>硫酸博莱霉素/>白消安白消安注射液/>卡培他滨/>N4-戊氧基羰基-5-脱氧-5-氟胞苷、卡铂/>卡莫司汀/>苯丁酸氮芥/>顺铂克拉屈滨/>环磷酰胺(/>或/>)、阿糖胞苷(cytarabine)、阿糖胞苷(cytosine arabinoside)/>阿糖胞苷脂质体注射液/>达卡巴嗪/>更生霉素(放线菌素D，Cosmegan)、盐酸柔红霉素/>枸橼酸柔红霉素脂质体注射液/>地塞米松、多西他赛/>盐酸阿霉素/>依托泊苷/>磷酸氟达拉滨/>5-氟尿嘧啶/> 氟他胺/>tezacitibine、吉西他滨(二氟脱氧胞苷)、羟基脲/>伊达比星/>异环磷酰胺/>伊立替康/>L-天冬酰胺酶/>亚叶酸钙、美法仑/>6-巯基嘌呤/>甲氨蝶呤/>米托蒽醌吉妥单抗(mylotarg)、紫杉醇/>phoenix(Yttrium90/MX-DTPA)、喷司他丁、伴随卡莫司汀植入的聚苯丙生20/>枸橼酸他莫昔芬/>替尼泊苷/>6-硫代鸟嘌呤、塞替派(thiotepa)、替拉扎明/>注射用盐酸拓扑替康/>长春碱/>长春新碱/>和长春瑞滨依鲁替尼(Ibrutinib)、idelalisib和本妥昔单抗(brentuximabvedotin)。

示例性烷化剂可以包括但不限于氮芥、乙烯亚胺衍生物、烷基磺酸盐、亚硝基脲和三氮烯；尿嘧啶氮芥(uracil mustard)(Aminouracil Uracil nitrogen/> )、氮芥(chlormethine)/>环磷酰胺/>Revimmune^TM)、异环磷酰胺/>美法仑/>苯丁酸氮芥/>哌泊溴烷/>三亚乙基蜜胺/>三亚乙基硫代磷酰胺、替莫唑胺/>塞替派/>白消安卡莫司汀/>洛莫司汀/>链脲佐菌素和达卡巴嗪/>另外的示例性烷化剂包括但不限于奥沙利铂替莫唑胺(/>和/>)；更生霉素(又名放线菌素-D，)；美法仑(又名L-PAM、L-沙可来新(L-sarcolysin)和苯丙氨酸氮芥，)；六甲蜜胺(又名六甲三聚氰胺(HMM)，/>)；卡莫司汀/>苯达莫司汀/>白消安(/>和/>)；卡铂/>洛莫司汀(又名CCNU，/>)；顺铂(又名CDDP，/>和/>-AQ)；苯丁酸氮芥环磷酰胺(/>和/>)；达卡巴嗪(又名DTIC、DIC和咪唑甲酰胺，/>)；六甲蜜胺(又名六甲三聚氰胺(HMM)，/>)；异环磷酰胺泼尼莫司汀(Prednimustine)、丙卡巴肼/>二氯甲基二乙胺(又名氮芥(nitrogen mustard)、氮芥(mustine)和盐酸甲氯乙胺(mechloroethaminehydrochloride)，/>)；链脲佐菌素/>塞替派(又名硫代磷酰胺(thiophosphoamide)、TESPA和TSPA，/>)；环磷酰胺 和苯达莫司汀HCl/>

示例性蒽环类可以包括但不限于，例如，阿霉素(和/>)；博莱霉素/>柔红霉素(盐酸柔红霉素、道诺霉素(daunomycin)和盐酸红比霉素，)；柔红霉素脂质体(柔红霉素柠檬酸脂质体，/>)；米托蒽醌(DHAD，/>)；表阿霉素(Ellence^TM)；伊达比星(/>Idamycin/>)；丝裂霉素C/>格尔德霉素；除莠霉素；近灰霉素(ravidomycin)和去乙酰基近灰霉素。

示例性长春花生物碱可以包括但不限于酒石酸长春瑞滨长春新碱/>和长春地辛/>长春碱(也称为硫酸长春碱、长春花碱(vincaleukoblastine)和VLB，Alkaban-/>和/>)和长春瑞滨/>

示例性蛋白酶体抑制剂可以包括但不限于硼替佐米卡非佐米(carfilzomib)(PX-171-007、(S)-4-甲基-N-((S)-1-(((S)-4-甲基-1-((R)-2-甲基环氧乙烷-2-基)-1-氧代戊烷-2-基)氨基)-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基)-2-((S)-2-(2-吗啉代乙酰氨基)-4-苯基丁酰氨基)-戊酰胺)；marizomib(NPI-0052)；柠檬酸伊沙佐米(ixazomibcitrate)(MLN-9708)；delanzomib(CEP-18770)；和O-甲基-N-[(2-甲基-5-噻唑基)羰基]-L-丝氨酸-O-甲基-N-[(1S)-2-[(2R)-2-甲基-2-环氧乙烷基]-2-氧代-1-(苯基甲基)乙基]-L-丝氨酰胺(ONX-0912)。

如本文所用的，“与......组合”可以意指将修饰的病毒，诸如如本文描述的溶瘤痘苗病毒或包含该溶瘤痘苗病毒的药物组合物，与另外的疗法如包含一种或更多种剂的另外的疗法作为治疗方案或计划的一部分施用于受试者。在某些实施方案中，组合使用可以不要求在施用前将修饰的溶瘤病毒与一种或更多种剂物理合并，也不要求其在同一时间范围内施用。例如，非限制性地，修饰的溶瘤病毒和一种或更多种剂可以同时施用于所治疗的受试者，或者可以同一时间施用或以任何顺序或在不同的时间点相继地施用。

在各种实施方案中，另外的疗法可以以液体剂型、固体剂型、栓剂、可吸入剂型、鼻内剂型、脂质体制剂、包含纳米颗粒的剂型、包含微粒的剂型、聚合物剂型或其任何组合施用。在某些实施方案中，另外的疗法经约1周至约2周、约2周至约3周、约3周至约4周、约4周至约5周、约6周至约7周、约7周至约8周、约8周至约9周、约9周至约10周、约10周至约11周，约11周至约12周、约12周至约24周、约24周至约48周、约48周或约52周或更长的时间段施用。在某些情况下，所述另外的疗法的施用频率可以是每日一次、每日两次、每周一次、每三周一次、每四周一次(或每月一次)、每8周一次(或每2个月一次)、每12周一次(或每3个月一次)或每24周一次(每6个月一次)。在某些实施方案中，治疗患有癌症的受试者的方法可包括向该受试者施用有效量的本公开内容的修饰的溶瘤病毒，例如修饰的溶瘤痘苗病毒。在某些实施方案中，本公开内容的方法还可包括向受试者施用有效量的一种或更多种剂。例如，非限制性地，该剂可以是如上所述的抗癌剂、免疫调节剂或其任何组合。

修饰的痘苗病毒的表征

如以上讨论的，在一些实施方案中，本公开内容提供了包含非复制或复制不良的修饰的痘苗病毒的疫苗组合物。在一些实施方案中，为了确定给定的病毒在细胞类型(例如，在成纤维细胞系中)中是有复制能力的还是有复制缺陷的，用代表“输入”滴度的已知量的测试病毒感染该细胞类型。在使用允许细胞通过诸如TCID50方法的方法滴定输入病毒来评估复制特性之前，确定输入滴度。适当稀释病毒接种物以获得期望的输入滴度。选择的细胞类型的感染总共保持约4天，之后通过裂解被感染的细胞制备病毒样品。然后在CEF指示物细胞上滴定这些病毒样品，如下描述。这是“输出”滴度。输出与输入滴度之比低于1指示测试病毒在测试条件下是不能复制的，而输出与输入滴度之比等于或大于1指示测试病毒在测试条件下是有复制能力的。

对于TCID50方法，为了确定测试病毒的复制特性，可以将选择的细胞以约5×10⁵个细胞/孔的浓度接种到6孔板中，并在37℃、5％CO₂在适当培养基(诸如DMEM(Gibco，CatNo.61965-026)加2％的FCS)中孵育过夜。可以去除细胞培养基，并且细胞可以与病毒接种物在37℃、5％CO₂气氛下孵育1小时。用于不同细胞类型的每次感染的病毒量可以为约5×10⁴TCID50。这可以是上述病毒的“输入”滴度。在37℃一小时后，可以通过抽吸去除接种物，并且然后用DMEM洗涤细胞3次，并最后添加1ml DMEM、2％FCS，并让板在37℃、5％CO₂孵育约96小时(4天)。通过在-80℃冷冻板来停止感染，为滴定分析做准备。所得的包含被感染的细胞和孵育培养基的剩余部分的细胞裂解物是待滴定以确定输出滴度的病毒样品。因此，样品包含细胞内病毒以及细胞外病毒。

来自复制分析的病毒样品的滴定分析(用痘苗病毒特异性抗体免疫染色)：为了滴定病毒输出滴度，将CEF细胞以1×10⁴个细胞/孔的浓度接种在96孔板上的RPMI(Gibco，Cat.No.61870-010)、7％FCS、1％抗生素/抗真菌剂(Gibco，Cat.No.15240-062)中，并在37℃、5％CO₂孵育过夜。包含感染实验的6孔板可以冷冻/解冻3次，并且可以使用RPMI生长培养基制备10^-1至10^-12的稀释液。病毒稀释液可以以8个重复分布到测试细胞上，并在37℃、5％CO₂孵育5天，以允许病毒复制。测试细胞可以固定(例如，使用1:1的丙酮/甲醇)10分钟，风干，用洗涤缓冲液(PBS/0.05％Tween20)洗涤一次，并与多克隆痘苗病毒特异性抗体(例如，Quartett Berlin，Cat.No.9503-2057)在室温以1:1000的稀释度在孵育缓冲液(PBS/3％FCS)中孵育1小时。用洗涤缓冲液洗涤两次后，可以在室温在孵育缓冲液中以1:1000的稀释度添加辣根过氧化物酶(HRP)偶联的第二抗兔IgG抗体(Promega Mannheim，Cat.No.W4011)一小时。细胞可以再次用洗涤缓冲液洗涤两次，并与染色溶液(3,3’,5,5’四甲基联苯胺显色底物(1.2mM；Seramun Diagnostic GmbH，目录号S-002-5-TMB/)用PBS以1:2稀释)在室温孵育15min。板可以用洗涤缓冲液洗涤一次。使用显微镜，可以对板上呈现紫色的被感染的细胞进行评分(评分表参考附录3)。每个示出紫色染色的孔可以标志为病毒复制阳性，并且使用Spearman-Kaerber方法(TCID50测定)计算滴度。这是“输出”滴度。利用因此获得的输入滴度和输出滴度两者的值，可以计算输出:输入的放大比率，作为给定病毒在给定细胞类型中的复制程度的指示。使用以上程序，可以容易地确定特定病毒在所选择的细胞系，例如人类成纤维细胞、鸡成纤维细胞、MRC-5细胞中是否具有复制能力，以及具有何种程度的复制能力。

为评估本文描述的修饰的痘苗病毒的复制能力而进行的其他示例性方法可以包括，使用来自用修饰的痘苗病毒感染的哺乳动物或啮齿动物的血清的PCR测定、病毒噬斑测定或其任何组合。

本文提供了一种用于病毒噬斑测定的示例性方法。用痘苗病毒感染组织培养瓶中易感细胞的汇合单层。孵育后，观察到细胞病变效应(CPE)，并可以通过形成清除细胞单层的晕圈或圆形来可视化。细胞培养基可以用增加粘度的溶液替代。替代溶液可以包括但不限于明胶或羧甲基纤维素。易感细胞包括但不限于HeLa、BS-C-1、HuTK-CEF或BHK。可以用增加细胞对比度的试剂染色通过肉眼或通过显微术来可视化病毒噬斑测定。在观察到噬斑之前，感染后的孵育可以持续4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、24小时、36小时、48小时或更多小时。染色剂可以是结晶紫。噬斑的直径可以是至少0.05mm。病毒可以制备为接种物，其中接种物以不同浓度或稀释度的储备病毒制备。可以使用10、100、1000、10000、1000000、1000000或更大的稀释系数来进行稀释。病毒滴度或浓度可测量为噬斑形成单位每mL(pfu/mL)。

本文提供了一种基于PCR的测定的示例性方法。痘苗病毒含量可以使用基于qPCR的方法定量。为了检测痘苗病毒基因组的存在，使用qPCR来扩增DNA。为了检测所述痘苗病毒基因组的表达产物的存在，可以使用RT-qPCR来扩增RNA。qPCR引物可以被设计成扩增痘苗病毒基因组的一个区域。对于RT-qPCR，可以设计引物来检测痘苗基因组的特定表达产物。RT-qPCR和qPCR引物可以相同或可以不同。该区域可以由5个、10个、100个、200个、500个、1000个、5000个或更多个连续碱基对组成。可以使用本领域技术人员已知的方法分离DNA和RNA。对于基于qPCR的方法，使用已知的标准来确定输入中存在的病毒的浓度或滴度。

病毒的产生可能需要对病毒组合物中(诸如在包含本文描述的修饰的痘苗病毒的疫苗组合物中)的病毒含量进行定量。病毒定量可以包括但不限于基于发光、荧光、蛋白或PCR的测定。用于定量的基于荧光的测定可以使用流式细胞术。用于病毒定量的基于PCR的测定可以包括基于PCR的方法。可以定量和测量病毒基因组的存在，以确定组合物中存在的病毒的量。在分离核酸基因组之前，病毒输入可以被裂解或灭活。病毒的定量可以通过测量蛋白含量来实现。在某些情况下，蛋白含量可以通过色谱测定、ELISA、定量免疫印迹或其他合适的蛋白定量测定来测量。所测量的蛋白可以是微生物致病抗原或肿瘤相关抗原。

示例性实施方案

本文提供了一种修饰的溶瘤痘苗病毒，该病毒包含：(a)编码包含代谢调节蛋白或其功能片段或变体的融合蛋白的外源核酸，(b)编码趋化因子受体或其功能片段或变体的外源核酸，和(c)病毒主链中的遗传修饰。本文还提供，其中编码趋化因子受体的外源核酸包括趋化因子受体的人类编码序列的密码子优化变体。本文还提供了修饰的溶瘤痘苗病毒，其中融合蛋白还包含细胞因子或其功能片段或变体。本文还提供了修饰的溶瘤痘苗病毒，其中趋化因子受体包括以下至少一种：CXC受体、CC受体、CX3C受体、XC受体、其功能片段或其变体或其任何组合。本文还提供了修饰的溶瘤痘苗病毒，其中趋化因子受体包含以下至少一种：CXCR1、CXCR2、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR5、CXCR6、CXCR7、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CCR10、CX3CR1、XCR1，其功能片段或其变体，或其任何组合。本文还提供了修饰的溶瘤痘苗病毒，其中趋化因子受体包括CXC受体，并且其中CXC受体包括CXCR4。本文还提供了修饰的溶瘤痘苗病毒，其中趋化因子受体是CCR2。本文还提供了修饰的溶瘤痘苗病毒，其中趋化因子受体包括密码子优化的CCR2。本文还提供了修饰的溶瘤痘苗病毒，其中病毒主链中的遗传修饰是A52R基因的突变或缺失。本文还提供了修饰的溶瘤痘苗病毒，其中缺失是完全或部分缺失。本文还提供了修饰的溶瘤痘苗病毒，其中溶瘤痘苗病毒还包含胸苷激酶基因的缺失。本文还提供了修饰的溶瘤痘苗病毒，其中痘苗病毒是Western Reserve毒株痘苗病毒(ATCC VR-1354)、Copenhagen毒株、IHD毒株、Wyeth毒株(ATCC VR-1536)、NYCBOH毒株、Tian Tan毒株、Lister毒株、Ankara毒株(ATCC VR-1508或ATCC VR-1566)、USSR毒株、ACAM2000毒株、Paris毒株、Bern毒株、Temple of Heaven毒株、Dairen毒株、EM-63毒株、Evans毒株、King毒株、Patwadangar毒株或Tash Kent毒株。本文还提供了修饰的溶瘤痘苗病毒，其中编码融合蛋白的外源核酸被克隆到胸苷激酶基因的基因座中。本文还提供了修饰的溶瘤痘苗病毒，其中编码趋化因子受体的外源核酸被克隆到A52R基因的基因座中。本文还提供了修饰的溶瘤痘苗病毒，其中编码包含代谢调节蛋白或其功能片段或变体的融合蛋白的外源核酸包含与SEQ ID NO:1的序列至少约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％同源的序列。本文还提供了修饰的溶瘤痘苗病毒，其中编码趋化因子受体或其功能片段或变体的外源核酸包含与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的序列至少约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％同源的序列。本文还提供了修饰的溶瘤痘苗病毒，其还包含编码透明质酸酶的外源核酸。本文还提供了修饰的溶瘤痘苗病毒，其中透明质酸酶为PH-20或HysA。

本文提供了修饰的溶瘤痘苗病毒，其包含(a)编码瘦素-白细胞介素(IL)-2融合蛋白的外源核酸；(b)编码CCR2的外源核酸，和(c)A52R基因的缺失。本文还提供了修饰的溶瘤痘苗病毒，其中痘苗病毒是Western Reserve毒株痘苗病毒(ATCC VR-1354)。本文还提供了修饰的溶瘤痘苗病毒，其中溶瘤痘苗病毒还包含胸苷激酶基因的缺失。本文还提供了修饰的溶瘤痘苗病毒，其中编码瘦素-白细胞介素(IL)-2融合蛋白的外源核酸被克隆到胸苷激酶基因的基因座中。本文还提供了修饰的溶瘤痘苗病毒，其中编码CCR2的核酸被克隆到A52R基因的基因座中。本文还提供了修饰的溶瘤痘苗病毒，该病毒还包含选自由以下组成的组的病毒基因的突变或缺失：A1、A2、VH1、A33、I7、K7R、B8R、C12L、B15R、B14R、K1L、N1L、M2L、A49R、A46R、E3L、C4、C16和其功能结构域或片段或变体，或其任何组合。本文还提供了修饰的溶瘤痘苗病毒，该病毒还包含编码以下至少一种的外源核酸：HMGB1、PIAS3、LIGHT、分形趋化因子、ITAC、IL15、IL15Rα、CCL5、其功能结构域或片段或变体，或其任何组合。

本文提供了包含根据本公开内容的修饰的溶瘤病毒的药物组合物。本文还提供了药物组合物，其还包含以下至少一种：增溶剂、赋形剂或药学上可接受的运载体。本文还提供了药物组合物，其中赋形剂包括以下一种或更多种：缓冲剂、稳定剂、抗氧化剂、粘合剂、稀释剂、分散剂、速率控制剂、润滑剂、助流剂、崩解剂、增塑剂、防腐剂或其任何组合。本文还提供了药物组合物，其中赋形剂包括磷酸氢二钠二水合物、磷酸二氢钠二水合物、氯化钠、肌醇、山梨醇或其任何组合。本文还提供了不包含防腐剂的药物组合物。本文还提供了还包含防腐剂、稀释剂和运载体中的一种或更多种的药物组合物。本文还提供了还包含另外的活性成分或其盐的药物组合物。本文还提供了药物组合物，其中增溶剂是无菌水。本文还提供了还包含另外的活性成分的药物组合物，其中另外的活性成分是抗癌剂或另外的溶瘤病毒。

本文提供了包含本公开内容的修饰的溶瘤痘苗病毒的药盒。

本文提供了包含本公开内容的药物组合物的药盒。本文还提供了还包含以下至少一种的所述药盒：抗癌剂或另外的溶瘤病毒。

本文提供了一种方法，该方法在将修饰的溶瘤痘苗病毒全身递送至受试者时，相对于包含TK突变但不包含编码融合蛋白的外源核酸或编码趋化因子受体的外源核酸的参考痘苗病毒的全身施用，增强修饰的溶瘤痘苗病毒的治疗效果，方法包括全身施用根据本公开内容的修饰的溶瘤痘苗病毒或根据本公开内容的药物组合物。

本文提供了一种治疗方法，所述方法包括向受试者施用根据本公开内容的溶瘤痘苗病毒或本公开内容的药物组合物，其中相对于向受试者施用包含胸腺嘧啶激酶基因缺失(TK-)、不包括(a)和(b)中的任何一种的参考溶瘤痘苗病毒，施用导致受试者中增强的全身免疫应答。本文还提供了所述方法，其中施用是全身施用。本文还提供了所述方法，其中全身施用包括以下至少一种：口服施用、静脉内施用、鼻内施用、舌下施用、直肠施用、透皮施用或其任何组合。本文还提供了所述方法，其中受试者患有癌症。

本文提供了一种治疗受试者中癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的本公开内容的修饰的溶瘤痘苗病毒。本文还提供了本公开内容的所述方法，其中癌症是以下至少一种：黑素瘤、肝细胞癌、乳腺癌、肺癌、非小细胞肺癌、腹膜癌、前列腺癌、膀胱癌、卵巢癌、白血病、淋巴瘤、肾细胞癌、胰腺癌、上皮癌、胃/GE结合部腺癌、宫颈癌、结肠癌、结肠直肠癌、十二指肠癌、胰腺癌、腺样囊性癌、肉瘤、间皮瘤、多形性胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、多发性骨髓瘤、前列腺上皮癌、肝细胞癌、胆管癌、胰腺癌、头颈部鳞状细胞癌、宫颈鳞状细胞癌、骨肉瘤、上皮性卵巢癌、急性淋巴母细胞淋巴瘤、骨髓增生性肿瘤或其任何组合。本文还提供了本公开内容的所述方法，其中修饰的溶瘤病毒或药物组合物以包含约10⁶PFU/mL至约10¹⁰PFU/mL溶瘤痘苗病毒的剂量施用。本文还提供了本公开内容的所述方法，其中修饰的溶瘤病毒或药物组合物以包含约5x10⁹PFU/mL溶瘤痘苗病毒的剂量施用。本文还提供了本公开内容的所述方法，其中修饰的溶瘤病毒或药物组合物独立地以用于第一时间段的初始剂量、以用于第二时间段的中间剂量和以用于第三时间段的高剂量施用。本文还提供了所述方法，所述方法包括独立地施用初始剂量、中间剂量和高剂量，其中初始剂量低于中间剂量，并且中间剂量低于高剂量。本文还提供了所述方法，其中第一、第二和第三时间段各自为约1周至约3周。本文还提供了所述方法，其中修饰的溶瘤病毒和药物组合物独立地包括液体剂型，该液体剂型以约1mL至约5mL、约5mL至10mL、约15mL至约20mL、约25mL至约30mL、约30mL至约50mL、约50mL至约100mL、约100mL至150mL、约150mL至约200mL、约200mL至约250mL、约250mL至约300mL、约300mL至约350mL、约350mL至约400mL、约400mL至约450mL、约450mL至500mL、约500mL至750mL、或约750mL至1000mL的体积施用。本文还提供了所述方法，其中修饰的溶瘤病毒、溶瘤痘苗病毒或药物组合物以液体剂型、固体剂型、可吸入剂型、鼻内剂型、脂质体制剂、包含纳米颗粒的剂型、包含微粒的剂型、聚合物剂型或其任何组合施用。本文还提供了所述方法，其中修饰的溶瘤病毒、溶瘤痘苗病毒或药物组合物被施用约1周、约2周、约3周、约4周、约6周、约7周、约8周、约9周、约10周或约12周的持续时间。本文还提供了所述方法，其中修饰的溶瘤病毒或药物组合物每天一次、每天两次、每周一次、每两周一次或每三周一次施用。本文还提供了所述方法，其中修饰的溶瘤病毒或药物组合物静脉内、腹膜内或通过瘤内注射施用。本文还提供了所述方法，其中修饰的溶瘤病毒、溶瘤痘苗病毒或药物组合物作为团注或缓慢输注施用。本文还提供了所述方法，其中施用修饰的溶瘤病毒、溶瘤痘苗病毒或药物组合物在施用第一剂量后约1小时至约3天后产生第一峰值病毒载量，并且在施用第一剂量后约3天至约10天后产生第二峰值病毒载量。本文还提供了所述方法，其包括施用另外的疗法，其中另外的疗法被施用约1周、约2周、约3周、约4周、约6周、约7周、约8周、约9周、约10周或约12周的持续时间。本文还提供了所述方法，其中另外的疗法每天一次、每周一次、每两周一次或每三周一次施用。本文还提供了所述方法，其中另外的疗法以液体剂型、固体剂型、可吸入剂型、鼻内剂型、脂质体制剂、包含纳米颗粒的剂型、包含微粒的剂型、聚合物剂型或其任何组合施用。本文还提供了所述方法，其中另外的疗法被施用约1周、约2周、约3周、约4周、约6周、约7周、约8周、约9周、约10周或约12周的持续时间。本文还提供了所述方法，其中另外的疗法每天一次、每周一次、每两周一次或每三周一次施用。本文还提供了所述方法，其中另外的疗法以液体剂型、固体剂型、可吸入剂型、鼻内剂型、脂质体制剂、包含纳米颗粒的剂型、包含微粒的剂型、聚合物剂型或其任何组合施用。本文还提供了所述方法，其中另外的疗法口服、静脉内、通过瘤内注射或通过辐射施用。本文还提供了所述方法，其中受试者是人类。本文还提供了所述方法，其中在施用修饰的溶瘤病毒、溶瘤痘苗病毒或药物组合物之前，受试者已被诊断患有癌症。本文还提供了所述方法，其中在施用修饰的溶瘤病毒、溶瘤痘苗病毒或药物组合物或另外的疗法之前，受试者已被诊断患有癌症。本文还提供了所述方法，其中另外的疗法包括化学疗法、放疗、用另外的病毒进行的溶瘤病毒疗法、用免疫调节蛋白治疗、CAR T细胞疗法、抗癌剂或其任何组合。本文还提供了所述方法，其中另外的疗法包括施用免疫调节剂，所述免疫调节剂包括抗CD33抗体及其可变区、抗CD11b抗体及其可变区、COX2抑制剂、细胞因子、趋化因子、抗CTLA4抗体或其抗原结合片段、抗PD-1抗体或其抗原结合片段、抗PD-L1抗体或其抗原结合片段、或TLR激动剂。本文还提供了所述方法，其包括施用另外的疗法，其中另外的疗法包括施用抗癌剂，其中抗癌剂是化疗剂。

虽然本文已经示出和描述了本发明的优选实施方案，但对于本领域技术人员将明显的是，这样的实施方案只是以实例的方式提供的。在不脱离本发明的情况下，本领域技术人员现在将会想到许多变化、改变和替换。应当理解，在实践本发明时可以采用本文描述的本发明的实施方案的各种替代选择。所附权利要求意图界定本发明的范围，并且从而涵盖在这些权利要求范围内的方法和结构及其等同物。

实施例

为了更好地理解本公开内容及其许多优点，以说明的方式给出了以下实施例并且不限制本公开内容的范围。

实施例1：修饰为缺失A52R和TK基因并插入CCR2和瘦素-IL-2的示例性修饰的痘苗病毒在LLC肿瘤模型中示出增强的治疗效果和全身递送

本研究的目的是探索本文描述的修饰的痘苗病毒的治疗效果和全身递送。通过缺失A52R基因和胸苷激酶(TK)基因，并插入编码CCR2的外源核酸和编码瘦素-白细胞介素(IL)-2融合蛋白的外源核酸，在痘苗病毒(WR)的Western reserve毒株的基因组中引入修饰(本文称为WR.Tk-.A52R-.CCR2瘦素-IL2；也缩写为“MMC”)。

在LLC肿瘤模型中进行了一项研究，用于比较示例性修饰的痘苗病毒与含有TK缺失的痘苗病毒的Western Reserve毒株(称为WR.TK-)的参考病毒以及作为对照的媒介物(缓冲盐水)。在第0天和第3天，当肿瘤达到50-100MM³的尺寸时，静脉内施用2x10⁷PFU的剂量以治疗皮下植入有LLC肿瘤的小鼠(C57/B6)[结果在图2A、图2B和图2C中示出]。注意到，如图2A中示出的，与对照和参考病毒相比，静脉内施用示例性修饰的痘苗病毒导致肿瘤体积生长的显著延迟。此外，图2B还示出，通过施用示例性修饰的痘苗病毒，小鼠的存活概率也显著提高。结果示出示例性修饰的痘苗病毒的增强的治疗效果。另外，对于接受示例性修饰的痘苗病毒或参考病毒(即WR.TK-病毒)或对照的每一组，在病毒施用后28天测量肿瘤体积[图2C]。在图2A、图2B和图2C中示出的结果展示在施用示例性修饰的痘苗病毒时治疗活性的显著增强。

在LLC肿瘤模型中进行了另一项研究，以比较示例性修饰的痘苗病毒和参考病毒(WR.TK-痘苗病毒毒株)对肿瘤的全身递送。向皮下植入LLC肿瘤的小鼠(C57/B6)静脉内施用1x10⁷PFU的剂量。IV递送后24小时收获肿瘤，并通过qPCR定量每毫克肿瘤的病毒基因组的数量[图2D]。在图2D中示出的结果指示与参考WR.TK-病毒相比，示例性修饰的痘苗病毒的显著增强的全身递送。

以上实施例清楚地指示，示例性修饰的痘苗病毒示出对肿瘤的显著增强的治疗活性和对肿瘤部位的高全身递送。

实施例2-本公开内容的示例性修饰的痘苗病毒在LLC肿瘤模型中的预免疫小鼠中示出增强的治疗效果和全身递送

本研究的目的是探索与未免疫小鼠相比，根据本公开内容的示例性修饰的痘苗病毒在预免疫小鼠中的治疗效果和全身递送。

在本研究中，使用了携带皮下LLC肿瘤的C57/B6小鼠。一组小鼠在肿瘤植入前30天通过一次注射，以1x10⁶PFU的剂量施用参考病毒(其是痘苗病毒毒株WR.TK-)的免疫接种(在图3A中标记为“MMC免疫”)，并且另一组未免疫(在图3A中标记为“MMC”)。

植入后大约10天，当肿瘤达到50-100mm³时，将任一病毒的两次静脉内注射给予小鼠(2次1x10⁷PFU/mL的剂量，间隔3天)。研究的平均肿瘤体积结果在图3A中示出。结果指示，与施用媒介物的小鼠相比，示例性修饰的痘苗病毒在免疫和未免疫小鼠的肿瘤中都展示出良好的治疗活性。

在另一项研究中，研究了LLC肿瘤模型，以比较示例性修饰的痘苗病毒免疫和未免疫小鼠的向肿瘤的全身递送。选择两组携带皮下肿瘤的C57/B6小鼠。一组在肿瘤植入前30天通过一次注射，以1x10⁶PFU的剂量施用参考病毒(其是痘苗病毒毒株WR.TK-)的免疫接种，而另一组是携带皮下LLC肿瘤的幼稚小鼠(naive mice)，并且另一组未免疫。两组都静脉内施用1x10⁷PFU的剂量，并且IV递送后24小时收获肿瘤。研究了通过qPCR定量的每毫克肿瘤的病毒基因组的数量[图3B]。在图3B中示出的结果指示在预免疫组(“MMC免疫”)和非免疫组(“MMC”)两者中示例性修饰的痘苗病毒的良好全身递送。

以上研究表明，相对于对照病毒，示例性修饰的痘苗病毒在有和没有预免疫的情况下都示出增强的递送和治疗效力。

实施例3-本公开内容的示例性修饰的痘苗病毒在RENCA肿瘤模型中示出增强的治疗效果

本研究的目的是探索根据本公开内容的示例性修饰的痘苗病毒(包括如先前实施例中描述的修饰)在RENCA肿瘤模型中的治疗效果。

在RENCA肿瘤模型中进行了研究，用于比较示例性修饰的痘苗病毒与含有TK缺失的痘苗病毒的Western Reserve毒株(称为WR.TK-)的参考病毒以及作为对照的媒介物(缓冲盐水)的治疗活性。当肿瘤达到50-100MM³的尺寸时，静脉内施用病毒或对照的2x10⁷PFU的剂量以治疗植入有皮下RENCA肿瘤的BALB/c小鼠[图4]。在第一次治疗后第14天个体小鼠肿瘤尺寸的结果在图4中示出。图4中的结果示出，与参考痘苗病毒的WR.TK-毒株和对照相比，静脉内施用的示例性修饰的痘苗病毒导致显著更小的肿瘤尺寸。

实施例4-本公开内容的示例性修饰的痘苗病毒的生物分布研究示出了更高的肿瘤选择性和在正常组织中的低积累

本研究的目的是研究，在LLC肿瘤模型中，与所有其他组织相比，示例性修饰的痘苗病毒(在图5A和图5B中标记为NT428N，包含如以上实施例1中描述的修饰)与参考病毒(WR.TK-A52R-)痘苗病毒毒株(在图5A和图5B中示出为NT202N)相比在肿瘤中的生物分布。

在本研究中，以1x10⁷PFU的剂量经由尾静脉递送示例性修饰的痘苗病毒(NT428N)或缺失TK和A52R基因而不表达CCR2或瘦素的痘苗病毒(对照病毒，称为NT202N)给两组小鼠。一组小鼠为没有肿瘤的C57/B6小鼠[图5A]并且另一组为携带皮下LLC肿瘤的C57/B6小鼠[图5B]。在递送后72小时处死小鼠，并收集器官(肝、脾、脑、心、肾、GI道、骨髓、肺和肿瘤)，并通过qPCR对无肿瘤组和LLC肿瘤组的病毒基因组进行滴度[图5A和图5B]。随后，在递送后10天处死小鼠，并收集器官(肝、脾、脑、心、肾、GI道、骨髓、肺和肿瘤)用于H&E染色。进行H&E染色，并获得完整的病理学报告[表1]。

图5A和图5B的生物分布研究示出，与对照病毒(NT202N)相比，示例性修饰的痘苗病毒(NT428N)在所有组织中示出更低的滴度，并且当表达CCR2时，没有组织示出病毒载量的增加。在荷瘤小鼠中，肿瘤中的病毒基因组显著高于任何其他组织或器官。

表1中的病理学研究示出，示例性修饰的痘苗病毒耐受良好，并且预计比目前在临床环境中使用的类似病毒更安全。

表1-治疗后10天的病理学报告

序列

SEQ ID NO：1(瘦素-IL2融合-核酸序列)

SEQ ID NO：2(编码CCR2的核酸序列，变体467)：

SEQ ID NO：3(编码CCR2的核酸序列，变体502)：

SEQ ID NO：4(编码瘦素的核酸序列)

/>

SEQ ID NO：5(编码IL-2的核酸序列)(ENANo.E00257.1)

/>

序列表

<110> 卡利威尔免疫治疗公司

<120> 通过肿瘤微环境重塑的溶瘤免疫疗法

<130> 199249-703601

<140>

<141>

<150> 63/116,004

<151> 2020-11-19

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 969

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸

<400> 1

atgcattggg gaaccctgtg cggattcttg tggctttggc cctatctttt ctatgtccaa 60

gctgtgccca tccaaaaagt ccaagatgac accaaaaccc tcatcaagac aattgtcacc 120

aggatcaatg acatttcaca cacgcagtca gtctcctcca aacagaaagt caccggtttg 180

gacttcattc ctgggctcca ccccatcctg accttatcca agatggacca gacactggca 240

gtctaccaac agatcctcac cagtatgcct tccagaaacg tgatccaaat atccaacgac 300

ctggagaacc tccgggatct tcttcacgtg ctggccttct ctaagagctg ccacttgccc 360

tgggccagtg gcctggagac cttggacagc ctggggggtg tcctggaagc ttcaggctac 420

tccacagagg tggtggccct gagcaggctg caggggtctc tgcaggacat gctgtggcag 480

ctggacctca gccctgggtg cggaggtggc ggatccggcg gaggtggctc aggtggcggt 540

ggatcaggag gaggtggatc agctagcgca cctacttcaa gttctacaaa gaaaacacag 600

ctacaactgg agcatttact gctggattta cagatgattt tgaatggaat taataattac 660

aagaatccca aactcaccag gatgctcaca tttaagtttt acatgcccaa gaaggccaca 720

gaactgaaac atcttcagtg tctagaagaa gaactcaaac ctctggagga agtgctaaat 780

ttagctcaaa gcaaaaactt tcacttaaga cccagggact taatcagcaa tatcaacgta 840

atagttctgg aactaaaggg atctgaaaca acattcatgt gtgaatatgc tgatgagaca 900

gcaaccattg tagaatttct gaacagatgg attacctttt gtcaaagcat catctcaaca 960

ctgacttga 969

<210> 2

<211> 1125

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸

<400> 2

atgctgtcca catctcgttc tcggtttatc agaaatacca acgagagcgg tgaagaagtc 60

accacctttt ttgattatga ttacggtgct ccctgtcata aatttgacgt gaagcaaatt 120

ggggcccaac tcctgcctcc gctctactcg ctggtgttca tctttggttt tgtgggcaac 180

atgctggtcg tcctcatctt aataaactgc aaaaagctga agtgcttgac tgacatttac 240

ctgctcaacc tggccatctc tgatctgctt tttcttatta ctctcccatt gtgggctcac 300

tctgctgcaa atgagtgggt ctttgggaat gcaatgtgca aattattcac agggctgtat 360

cacatcggtt attttggcgg aatcttcttc atcatcctcc tgacaatcga tagatacctg 420

gctattgtcc atgctgtgtt tgctttaaaa gccaggacgg tcacctttgg ggtggtgaca 480

agtgtgatca cctggttggt ggctgtgttt gcttctgtcc caggaatcat ctttactaaa 540

tgccagaaag aagattctgt ttatgtctgt ggcccttatt ttccacgagg atggaataat 600

ttccacacaa taatgaggaa cattttgggg ctggtcctgc cgctgctcat catggtcatc 660

tgctactcgg gaatcctgaa aaccctgctt cggtgtcgaa acgagaagaa gaggcatagg 720

gcagtgagag tcatcttcac catcatgatt gtttactttc tcttctggac tccctataat 780

attgtcattc tcctgaacac cttccaggaa ttcttcggcc tgagtaactg tgaaagcacc 840

agtcaactgg accaagccac gcaggtgaca gagactcttg ggatgactca ctgctgcatc 900

aatcccatca tctatgcctt cgttggggag aagttcagaa gcctttttca catagctctt 960

ggctgtagga ttgccccact ccaaaaacca gtgtgtggag gtccaggagt gagaccagga 1020

aagaatgtga aagtgactac acaaggactc ctcgatggtc gtggaaaagg aaagtcaatt 1080

ggcagagccc ctgaagccag tcttcaggac aaagaaggag cctag 1125

<210> 3

<211> 1125

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸

<400> 3

atgctgtcca catctcgttc tcggtttatc agaaatacca acgagagcgg tgaagaagtc 60

accacctttt ttgattatga ttacggtgct ccctgtcata aatttgacgt gaagcaaatt 120

ggggcccaac tcctgcctcc gctctactcg ctggtgttca tctttggttt tgtgggcaac 180

atgctggtcg tcctcatctt aataaactgc aaaaagctga agtgcttgac tgacatttac 240

ctgctcaacc tggccatctc tgatctgctg ttccttatta ctctcccatt gtgggctcac 300

tctgctgcaa atgagtgggt ctttgggaat gcaatgtgca aattattcac agggctgtat 360

cacatcggtt attttggcgg aatcttcttc atcatcctcc tgacaatcga tagatacctg 420

gctattgtcc atgctgtgtt tgctttaaaa gccaggacgg tcacctttgg ggtggtgaca 480

agtgtgatca cctggttggt ggctgtgttt gcttctgtcc caggaatcat ctttactaaa 540

tgccagaaag aagattctgt ttatgtctgt ggcccttatt ttccacgagg atggaataat 600

ttccacacaa taatgaggaa cattttgggg ctggtcctgc cgctgctcat catggtcatc 660

tgctactcgg gaatcctgaa aaccctgctt cggtgtcgaa acgagaagaa gaggcatagg 720

gcagtgagag tcatcttcac catcatgatt gtttactttc tcttctggac tccctataat 780

attgtcattc tcctgaacac cttccaggaa ttcttcggcc tgagtaactg tgaaagcacc 840

agtcaactgg accaagccac gcaggtgaca gagactcttg ggatgactca ctgctgcatc 900

aatcccatca tctatgcctt cgttggggag aagttcagaa gcctttttca catagctctt 960

ggctgtagga ttgccccact ccaaaaacca gtgtgtggag gtccaggagt gagaccagga 1020

aagaatgtga aagtgactac acaaggactc ctcgatggtc gtggaaaagg aaagtcaatt 1080

ggcagagccc ctgaagccag tcttcaggac aaagaaggag cctag 1125

<210> 4

<211> 3444

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸

<400> 4

gtaggaatcg cagcgccagc ggttgcaagg cccaagaagc ccatcctggg aaggaaaatg 60

cattggggaa ccctgtgcgg attcttgtgg ctttggccct atcttttcta tgtccaagct 120

gtgcccatcc aaaaagtcca agatgacacc aaaaccctca tcaagacaat tgtcaccagg 180

atcaatgaca tttcacacac gcagtcagtc tcctccaaac agaaagtcac cggtttggac 240

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ggaaggaact ctggcttcca ggtatctcca ggattgaaga gcattgcatg gacacccctt 660

atccaggact ctgtcaattt ccctgactcc tctaagccac tcttccaaag gcataagacc 720

ctaagcctcc ttttgcttga aaccaaagat atatacacag gatcctattc tcaccaggaa 780

gggggtccac ccagcaaaga gtgggctgca tctgggattc ccaccaaggt cttcagccat 840

caacaagagt tgtcttgtcc cctcttgacc catctccccc tcactgaatg cctcaatgtg 900

accaggggtg atttcagaga gggcagaggg gtaggcagag cctttggatg accagaacaa 960

ggttccctct gagaattcca aggagttcca tgaagaccac atccacacac gcaggaactc 1020

ccagcaacac aagctggaag cacatgttta tttattctgc attttattct ggatggattt 1080

gaagcaaagc accagcttct ccaggctctt tggggtcagc cagggccagg ggtctccctg 1140

gagtgcagtt tccaatccca tagatgggtc tggctgagct gaacccattt tgagtgactc 1200

gagggttggg ttcatctgag caagagctgg caaaggtggc tctccagtta gttctctcgt 1260

aactggtttc atttctactg tgactgatgt tacatcacag tgtttgcaat ggtgttgccc 1320

tgagtggatc tccaaggacc aggttatttt aaaaagattt gttttgtcaa gtgtcatatg 1380

taggtgtctg cacccagggg tggggaatgt ttgggcagaa gggagaagga tctagaatgt 1440

gttttctgaa taacatttgt gtggtgggtt ctttggaagg agtgagatca ttttcttatc 1500

ttctgcaatt gcttaggatg tttttcatga aaatagctct ttcagggggg ttgtgaggcc 1560

tggccaggca ccccctggag agaagtttct ggccctggct gaccccaaag agcctggaga 1620

agctgatgct ttgcttcaaa tccatccaga ataaaacgca aagggctgaa agccatttgt 1680

tggggcagtg gtaagctctg gctttctccg actgctaggg agtggtcttt cctatcatgg 1740

agtgacggtc ccacactggt gactgcgatc ttcagagcag gggtccttgg tgtgaccctc 1800

tgaatggtcc agggttgatc acactctggg tttattacat ggcagtgttc ctatttgggg 1860

cttgcatgcc aaattgtagt tcttgtctga ttggctcacc caagcaaggc caaaattacc 1920

aaaaatcttg gggggttttt actccagtgg tgaagaaaac tcctttagca ggtggtcctg 1980

agacctgaca agcactgcta ggcgagtgcc aggactcccc aggccaggcc accaggatgg 2040

cccttcccac tggaggtcac attcaggaag atgaaagagg aggtttgggg tctgccacca 2100

tcctgctgct gtgtttttgc tatcacacag tgggtggtgg atctgtccaa ggaaacttga 2160

atcaaagcag ttaactttaa gactgagcac ctgcttcatg ctcagccctg actggtgcta 2220

taggctggag aagctcaccc aataaacatt aagattgagg cctgccctca gggatcttgc 2280

attcccagtg gtcaaaccgc actcacccat gtgccaaggt ggggtattta ccacagcagc 2340

tgaacagcca aatgcatggt gcagttgaca gcaggtggga aatggtatga gctgaggggg 2400

gccgtgccca ggggcccaca gggaaccctg cttgcacttt gtaacatgtt tacttttcag 2460

ggcatcttag cttctattat agccacatcc ctttgaaaca agataactga gaatttaaaa 2520

ataagaaaat acataagacc ataacagcca acaggtggca ggaccaggac tatagcccag 2580

gtcctctgat acccagagca ttacgtgagc caggtaatga gggactggaa ccagggagac 2640

cgagcgcttt ctggaaaaga ggagtttcga ggtagagttt gaaggaggtg agggatgtga 2700

attgcctgca gagagaagcc tgttttgttg gaaggtttgg tgtgtggaga tgcagaggta 2760

aaagtgtgag cagtgagtta cagcgagagg cagagaaaga agagacagga gggcaagggc 2820

catgctgaag ggaccttgaa gggtaaagaa gtttgatatt aaaggagtta agagtagcaa 2880

gttctagaga agaggctggt gctgtggcca gggtgagagc tgctctggaa aatgtgaccc 2940

agatcctcac aaccacctaa tcaggctgag gtgtcttaag ccttttgctc acaaaacctg 3000

gcacaatggc taattcccag agtgtgaaac ttcctaagta taaatggttg tctgtttttg 3060

taacttaaaa aaaaaaaaaa aagtttggcc gggtgcggtg gctcacgcct gtaatcccag 3120

cactttggga ggccaaggtg gggggatcac aaggtcacta gatggcgagc atcctggcca 3180

acatggtgaa accccgtctc tactaaaaac acaaaagtta gctgagcgtg gtggcgggcg 3240

cctgtagtcc cagccactcg ggaggctgag acaggagaat cgcttaaacc tgggaggcgg 3300

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gtcttaaaaa aaaaaaaaaa aaagtttgtt tttaaaaaaa tctaaataaa ataactttgc 3420

cccctgcaaa aaaaaaaaaa aaaa 3444

<210> 5

<211> 418

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸

<400> 5

aattctatgg ctccgacttc aagttctacc aagaagaccc agcttcaatt agaacattta 60

cttctagatt tacaaatgat tctgaatggt atcaacaatt ataagaatcc aaagcttact 120

cgtatgttga cctttaaatt ctatatgcct aagaaggcta ctgaattaaa acacctgcag 180

tgtttagaag aagagctcaa accgttagaa gaagttctga atctggctca atctaaaaac 240

ttccatttac gtccacgaga tcttatctct aatattaacg taatcgtttt ggaacttaaa 300

ggatccgaaa ctaccttcat gtgtgaatat gctgacgaaa ccgctacgat cgtagaattt 360

cttaatcgat ggattacttt ctgtcaatct attatctcta ccttaacttg agtcgacg 418

Claims (74)

1.一种修饰的溶瘤病毒，所述修饰的溶瘤病毒包含：

编码包含代谢调节蛋白或其功能片段或变体的融合蛋白的外源核酸，其中所述外源核酸编码包含以下的所述融合蛋白：

包含IL-2或其功能片段的多肽，和

包含瘦素或其功能片段的多肽；

编码趋化因子受体或其功能片段或变体的外源核酸，其中所述趋化因子受体是CCR2；以及

所述修饰的溶瘤病毒的病毒基因组中的遗传修饰。

2.根据权利要求1所述的修饰的溶瘤病毒，其中编码所述趋化因子受体的外源核酸包括所述趋化因子受体的人类编码序列的密码子优化变体。

3.根据权利要求1所述的修饰的溶瘤病毒，其中所述融合蛋白还包含细胞因子或其功能片段或变体。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的修饰的溶瘤病毒，其中所述遗传修饰是A52R基因的突变或缺失。

5.根据权利要求4所述的修饰的溶瘤病毒，其中所述缺失是完全或部分缺失。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的修饰的溶瘤病毒，其中所述溶瘤病毒还包含胸苷激酶基因的缺失。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的修饰的溶瘤病毒，其中所述溶瘤病毒包括麻疹病毒、脊髓灰质炎病毒、痘病毒、痘苗病毒、腺病毒、腺相关病毒、单纯疱疹病毒、水疱性口炎病毒、呼肠孤病毒、新城疫病毒、塞内加病毒、慢病毒、门戈病毒或粘液瘤病毒。

8.根据权利要求7所述的修饰的溶瘤病毒，其中所述溶瘤病毒是痘病毒。

9.根据权利要求8所述的修饰的溶瘤病毒，其中所述痘病毒是痘苗病毒。

10.根据权利要求9所述的修饰的溶瘤病毒，其中所述痘苗病毒是Western Reserve毒株痘苗病毒、Copenhagen毒株、IHD毒株、Wyeth毒株、NYCBOH毒株、Tian Tan毒株、Lister毒株、Ankara毒株、USSR毒株、ACAM2000毒株、Paris毒株、Bern毒株、Temple of Heaven毒株、Dairen毒株、EM-63毒株、Evans毒株、King毒株、Patwadangar毒株或Tash Kent毒株。

11.根据权利要求10所述的修饰的溶瘤病毒，其中编码所述融合蛋白的外源核酸被克隆到胸苷激酶基因的基因座中。

12.根据权利要求1-11中任一项所述的修饰的溶瘤病毒，其中编码所述趋化因子受体的外源核酸被克隆到A52R基因的基因座中。

13.根据权利要求1-12中任一项所述的修饰的溶瘤病毒，其中编码IL-2或其功能片段的多肽包含与SEQ ID NO:4的序列至少约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％同源的序列。

14.根据权利要求1-12中任一项所述的修饰的溶瘤病毒，其中编码瘦素或其功能片段的多肽包含与SEQ ID NO:5的序列至少约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％同源的序列。

15.根据权利要求1-14中任一项所述的修饰的溶瘤病毒，其中编码包含代谢调节蛋白或其功能片段或变体的所述融合蛋白的外源核酸包含与SEQ ID NO:1的序列至少约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％同源的序列。

16.根据权利要求1-15中任一项所述的修饰的溶瘤病毒，其中编码所述趋化因子受体或其功能片段或变体的外源核酸包含与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的序列至少约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％同源的序列。

17.根据权利要求1-16中任一项所述的修饰的溶瘤病毒，所述修饰的溶瘤病毒还包含编码透明质酸酶的外源核酸。

18.根据权利要求17所述的修饰的溶瘤病毒，其中所述透明质酸酶为PH-20或HysA。

19.一种修饰的溶瘤病毒，所述修饰的溶瘤病毒包含：

编码瘦素-白细胞介素(IL)-2融合蛋白的外源核酸；

编码CCR2的外源核酸，和

A52R基因的缺失。

20.根据权利要求19所述的修饰的溶瘤病毒，其中所述溶瘤病毒包括麻疹病毒、脊髓灰质炎病毒、痘病毒、痘苗病毒、腺病毒、腺相关病毒、单纯疱疹病毒、水疱性口炎病毒、呼肠孤病毒、新城疫病毒、塞内加病毒、慢病毒、门戈病毒或粘液瘤病毒。

21.根据权利要求20所述的修饰的溶瘤病毒，其中所述溶瘤病毒是痘病毒。

22.根据权利要求21所述的修饰的溶瘤病毒，其中所述痘病毒是痘苗病毒。

23.根据权利要求22所述的修饰的溶瘤病毒，其中所述痘苗病毒是Western Reserve毒株痘苗病毒、Copenhagen毒株、IHD毒株、Wyeth毒株、NYCBOH毒株、Tian Tan毒株、Lister毒株、Ankara毒株、USSR毒株、ACAM2000毒株、Paris毒株、Bern毒株、Temple ofHeaven毒株、Dairen毒株、EM-63毒株、Evans毒株、King毒株、Patwadangar毒株或Tash Kent毒株。

24.根据权利要求19至23中任一项所述的修饰的溶瘤病毒，其中所述溶瘤病毒还包含胸苷激酶基因的缺失。

25.根据权利要求24所述的修饰的溶瘤病毒，其中编码所述瘦素-白细胞介素(IL)-2融合蛋白的外源核酸被克隆到所述胸苷激酶基因的基因座中。

26.根据权利要求19-25中任一项所述的修饰的溶瘤病毒，其中编码CCR2的核酸被克隆到A52R基因的基因座中。

27.根据权利要求1-26中任一项所述的修饰的溶瘤病毒，所述修饰的溶瘤病毒还包含选自由以下组成的组的病毒基因的突变或缺失：A1、A2、VH1、A33、I7、K7R、B8R、C12L、B15R、B14R、K1L、N1L、M2L、A49R、A46R、E3L、C4、C16和其功能结构域或片段或变体，或其任何组合。

28.根据权利要求27所述的修饰的溶瘤病毒，所述修饰的溶瘤病毒还包含编码以下至少一种的外源核酸：HMGB1、PIAS3、LIGHT、分形趋化因子、ITAC、IL15、IL15 Rα、CCL5、其功能结构域或片段或变体，或其任何组合。

29.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求1-28中任一项所述的修饰的溶瘤病毒。

30.根据权利要求29所述的药物组合物，所述药物组合物还包含以下至少一种：增溶剂、赋形剂或药学上可接受的运载体。

31.根据权利要求30所述的药物组合物，其中所述赋形剂包括以下一种或更多种：缓冲剂、稳定剂、抗氧化剂、粘合剂、稀释剂、分散剂、速率控制剂、润滑剂、助流剂、崩解剂、增塑剂、防腐剂或其任何组合。

32.根据权利要求30所述的药物组合物，其中所述赋形剂包括磷酸氢二钠二水合物、磷酸二氢钠二水合物、氯化钠、肌醇、山梨醇或其任何组合。

33.根据权利要求29-32中任一项所述的药物组合物，所述药物组合物不包含防腐剂。

34.根据权利要求29-32中任一项所述的药物组合物，所述药物组合物还包含防腐剂、稀释剂和运载体中的一种或更多种。

35.根据权利要求29-34中任一项所述的药物组合物，所述药物组合物还包含另外的活性成分或其盐。

36.根据权利要求30-35中任一项所述的药物组合物，其中所述增溶剂是无菌水。

37.根据权利要求29-36中任一项所述的药物组合物，所述药物组合物还包含另外的活性成分，其中所述另外的活性成分是抗癌剂或另外的溶瘤病毒。

38.一种药盒，所述药盒包含权利要求1至28中任一项所述的修饰的溶瘤病毒。

39.一种药盒，所述药盒包含权利要求29-37所述的药物组合物。

40.根据权利要求38或39所述的药盒，所述药盒还包含以下至少一种：抗癌剂或另外的溶瘤病毒。

41.一种相对于包含TK突变但不包含编码融合蛋白的外源核酸或编码趋化因子受体的外源核酸的参考病毒的全身施用，增强在将修饰的溶瘤病毒全身递送至受试者时所述修饰的溶瘤病毒的治疗效果的方法，所述方法包括全身施用根据权利要求1-28中任一项所述的修饰的溶瘤病毒或如权利要求29-37中任一项定义的药物组合物。

42.一种治疗方法，所述治疗方法包括向受试者施用根据权利要求1-28中任一项所述的溶瘤病毒，或权利要求29-37中任一项所述的药物组合物，其中相对于向受试者施用包含胸腺嘧啶激酶基因缺失(TK-)并且不包含编码包含代谢调节蛋白或其功能片段或变体的融合蛋白的外源核酸或编码趋化因子受体或其功能片段或变体的外源核酸的参考溶瘤病毒，所述施用导致所述受试者中增强的全身免疫应答。

43.根据权利要求42所述的方法，其中所述施用是全身施用。

44.根据权利要求41-43中任一项所述的方法，其中所述全身施用包括以下至少一种：瘤内、静脉内、肠胃外、皮内、肌肉内、透皮、直肠、尿道内、阴道内、鼻内、鞘内、腹膜内、牙内、皮下、经皮、气管内、动脉内、膀胱内、吸入、口服或其任何组合。

45.根据权利要求44所述的方法，其中所述施用是瘤内的。

46.根据权利要求44所述的方法，其中所述施用是静脉内的。

47.根据权利要求41-46中任一项所述的方法，其中所述受试者患有癌症。

48.一种治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的权利要求1-28中任一项所述的修饰的溶瘤病毒。

49.根据权利要求47或48所述的方法，其中所述癌症是以下至少一种：黑素瘤、肝细胞癌、乳腺癌、肺癌、非小细胞肺癌、腹膜癌、前列腺癌、膀胱癌、卵巢癌、白血病、淋巴瘤、肾细胞癌、胰腺癌、上皮癌、胃/GE结合部腺癌、宫颈癌、结肠癌、结肠直肠癌、十二指肠癌、胰腺癌、腺样囊性癌、肉瘤、间皮瘤、多形性胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、多发性骨髓瘤、前列腺上皮癌、肝细胞癌、胆管癌、胰腺癌、头颈部鳞状细胞癌、宫颈鳞状细胞癌、骨肉瘤、上皮性卵巢癌、急性淋巴母细胞淋巴瘤、骨髓增生性肿瘤或其任何组合。

50.根据权利要求41-49中任一项所述的方法，其中所述修饰的溶瘤病毒或所述药物组合物以包含约10⁶PFU/mL至约10¹⁰PFU/mL溶瘤病毒的剂量施用。

51.根据权利要求41-49中任一项所述的方法，其中所述修饰的溶瘤病毒或所述药物组合物以包含约5x10⁹PFU/mL溶瘤病毒的剂量施用。

52.根据权利要求41-51中任一项所述的方法，其中所述修饰的溶瘤病毒或所述药物组合物独立地以用于第一时间段的初始剂量、以用于第二时间段的中间剂量和以用于第三时间段的高剂量施用。

53.根据权利要求52所述的方法，所述方法包括独立地施用所述初始剂量、所述中间剂量和所述高剂量，其中所述初始剂量低于所述中间剂量并且所述中间剂量低于所述高剂量。

54.根据权利要求52或53所述的方法，其中所述第一时间段、所述第二时间段和所述第三时间段各自为约1周至约3周。

55.根据权利要求41-54中任一项所述的方法，其中所述修饰的溶瘤病毒和所述药物组合物独立地包括液体剂型，所述液体剂型以约1mL至约5mL、约5mL至10mL、约15mL至约20mL、约25mL至约30mL、约30mL至约50mL、约50mL至约100mL、约100mL至150mL、约150mL至约200mL、约200mL至约250mL、约250mL至约300mL、约300mL至约350mL、约350mL至约400mL、约400mL至约450mL、约450mL至500mL、约500mL至750mL、或约750mL至1000mL的体积施用。

56.根据权利要求41-55中任一项所述的方法，其中所述修饰的溶瘤病毒或药物组合物以液体剂型、固体剂型、可吸入剂型、鼻内剂型、脂质体制剂、包含纳米颗粒的剂型、包含微粒的剂型、聚合物剂型或其任何组合施用。

57.根据权利要求41-56中任一项所述的方法，其中所述修饰的溶瘤病毒或所述药物组合物被施用约1周、约2周、约3周、约4周、约6周、约7周、约8周、约9周、约10周或约12周的持续时间。

58.根据权利要求41-57中任一项所述的方法，其中所述修饰的溶瘤病毒或所述药物组合物每天一次、每天两次、每周一次、每两周一次或每三周一次施用。

59.根据权利要求41-58中任一项所述的方法，其中所述修饰的溶瘤病毒或所述药物组合物静脉内、腹膜内或通过瘤内注射施用。

60.根据权利要求41-59中任一项所述的方法，其中所述修饰的溶瘤病毒或所述药物组合物作为团注或缓慢输注施用。

61.根据权利要求41-60中任一项所述的方法，其中施用所述修饰的溶瘤病毒或所述药物组合物在施用第一剂量后约1小时至约3天后产生第一峰值病毒载量，并且在施用第一剂量后约3天至约10天后产生第二峰值病毒载量。

62.根据权利要求41-61中任一项所述的方法，所述方法包括施用另外的疗法，其中所述另外的疗法被施用约1周、约2周、约3周、约4周、约6周、约7周、约8周、约9周、约10周或约12周的持续时间。

63.根据权利要求62所述的方法，其中所述另外的疗法每天一次、每周一次、每两周一次或每三周一次施用。

64.根据权利要求62或63所述的方法，其中所述另外的疗法以液体剂型、固体剂型、可吸入剂型、鼻内剂型、脂质体制剂、包含纳米颗粒的剂型、包含微粒的剂型、聚合物剂型或其任何组合施用。

65.根据权利要求62-64中任一项所述的方法，其中所述另外的疗法被施用约1周、约2周、约3周、约4周、约6周、约7周、约8周、约9周、约10周或约12周的持续时间。

66.根据权利要求62-65中任一项所述的方法，其中所述另外的疗法每天一次、每周一次、每两周一次或每三周一次施用。

67.根据权利要求62-66中任一项所述的方法，其中所述另外的疗法以液体剂型、固体剂型、可吸入剂型、鼻内剂型、脂质体制剂、包含纳米颗粒的剂型、包含微粒的剂型、聚合物剂型或其任何组合施用。

68.根据权利要求62-67中任一项所述的方法，其中所述另外的疗法口服、静脉内、通过瘤内注射或通过辐射施用。

69.根据权利要求41-68中任一项所述的方法，其中所述受试者是人类。

70.根据权利要求41-69中任一项的方法，其中在施用所述修饰的溶瘤病毒或所述药物组合物之前，所述受试者已被诊断患有癌症。

71.根据权利要求41-70中任一项所述的方法，其中在施用所述修饰的溶瘤病毒或所述药物组合物或所述另外的疗法之前，所述受试者已被诊断患有癌症。

72.根据权利要求62-71中任一项所述的方法，其中所述另外的疗法包括化学疗法、放疗、用另外的病毒进行的溶瘤病毒疗法、用免疫调节蛋白治疗、CAR T细胞疗法、抗癌剂或其任何组合。

73.根据权利要求72所述的方法，其中所述另外的疗法包括施用免疫调节剂，所述免疫调节剂包括抗CD33抗体及其可变区、抗CD11b抗体及其可变区、COX2抑制剂、细胞因子、趋化因子、抗CTLA4抗体或其抗原结合片段、抗PD-1抗体或其抗原结合片段、抗PD-L1抗体或其抗原结合片段、或TLR激动剂。

74.根据权利要求73所述的方法，所述方法包括施用所述另外的疗法，其中所述另外的疗法包括施用所述抗癌剂，其中所述抗癌剂是化疗剂。