CN111556757A - 用于全身递送的平台溶瘤载体 - Google Patents

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斯蒂芬·H·索恩
丹尼尔·J·伯德
张明瑞
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Abstract

本公开提供了经修饰的溶瘤病毒，其可以含有在病毒基因组中的修饰和编码蛋白质的外源核酸。经修饰的溶瘤病毒可用作用于全身递送的平台载体。

Description

用于全身递送的平台溶瘤载体
交叉引用
本申请要求2017年10月31日提交的第62/579,517号美国临时申请的权益，该美国临时申请通过引用整体并入本文。
援引并入
本说明书中所提及的所有出版物、专利、专利申请和NCBI登录与均通过引用并入本文，其程度犹如具体地且单独地指出每个单独的出版物、专利或专利申请均通过引用而并入，并且犹如以其整体阐述。在本文所用的术语与所并入的参考文献中定义的术语之间存在冲突的情况下，以本公开的定义为准。
发明内容
本公开的一个方面提供了经修饰的溶瘤病毒，其包含编码趋化因子受体、可能能够降解透明质酸的膜结合蛋白、能够降解透明质酸的微生物蛋白质或其任意组合的外源核酸。
在一些实施方案中，所述趋化因子可包括CXCR4和CCR2中的至少一种。
在一些实施方案中，所述经修饰的溶瘤病毒可包含可以编码膜结合蛋白的外源核酸。在一些实施方案中，所述编码膜结合蛋白的外源核酸可以编码透明质酸酶。在一些实施方案中，所述透明质酸酶可以是PH-20。在一些实施方案中，所述PH-20可以是GPI锚定的。在一些实施方案中，所述经修饰的溶瘤病毒可包含可以编码微生物蛋白质的外源核酸。在一些实施方案中，所述微生物蛋白质包括分泌的透明质酸酶。在一些实施方案中，所述分泌的透明质酸酶包括HysA、lin、sko、rv中的至少一种或其任意组合。在一些实施方案中，所述微生物蛋白质包括HysA。
在一些实施方案中，所述修饰可以增强所述病毒的包膜细胞外形式(EEV)的产生。
在一些实施方案中，所述经修饰的溶瘤病毒可以在病毒的基因组中包含修饰。在一些实施方案中，所述修饰可包含B5R基因的突变或缺失，其中所述缺失是部分缺失。在一些实施方案中，所述修饰可包括B5R基因的SCR区域中的突变或缺失，其中所述SCR区域包含SCR1、SCR3、SCR4或其任意组合，并且其中所述SCR区域不包含SCR2。
在一些实施方案中，所述经修饰的溶瘤病毒可包含B5R基因的缺失，并且所述缺失可以是B5R基因的部分缺失。
在一些实施方案中，所述经修饰的溶瘤病毒可以在所述病毒的基因组中包含修饰，其中所述修饰可包含A52R基因的突变或缺失。在一些实施方案中，所述修饰可包含A52R基因的缺失。
在一些实施方案中，所述经修饰的溶瘤病毒进一步在所述病毒的基因组中包含至少一个额外的修饰，其中所述额外的修饰可包括另外的病毒基因的突变或缺失。
在一些实施方案中，所述另外的病毒基因可包括F13L、A36R、A34R、A33R、B8R、B18R、SPI-1、SPI-2、B15R、VGF、E3L、K3L、A41L、K7R和N1L及其功能域或片段或变体中的至少一种，或其任意组合。
在一些实施方案中，所述经修饰的溶瘤病毒可以进一步包含至少一种额外的外源核酸。
在一些实施方案中，所述至少一种额外的外源核酸可包含编码蛋白质或其片段的核酸序列，所述蛋白质或其片段：调节NFκB(NF-kappaB)信号传导，促进肿瘤中的组织液压力(IFP)的降低，调节STAT3介导的基因激活，促进T细胞活化，促进NK细胞向病毒感染的细胞的吸引，调节病毒感染的细胞的代谢程序，调节病毒感染的细胞对脂肪酸的摄取，促进MDSC的治疗靶向，或其任意组合。
在一些实施方案中，所述至少一种额外的外源核酸可包括编码HMGB1、PIAS3、IL15、IL15-Rα、LIGHT、ITAC、CXXXC趋化分子、CCL5及其功能域或片段或变体中的至少一种或其任意组合的核酸。
在一些实施方案中，所述经修饰的溶瘤病毒可包含：(a)编码CXCR4和CCR2中的至少一种的外源核酸；和(b)编码透明质酸酶的外源核酸。
在一些实施方案中，所述经修饰的溶瘤病毒可包含：(a)编码CXCR4和CCR2中的至少一种的外源核酸；和(b)B5R基因的突变或缺失。
在一些实施方案中，所述经修饰的溶瘤病毒可包含：(a)编码透明质酸酶的外源核酸；和(b)B5R基因的突变或缺失。
在一些实施方案中，所述经修饰的溶瘤病毒可包含：(a)编码CXCR4和CCR2中的至少一种的外源核酸；(b)编码透明质酸酶的外源核酸；和(c)B5R基因的突变或缺失。
在一些实施方案中，所述经修饰的溶瘤病毒可包含：(a)编码CXCR4和CCR2中的至少一种的外源核酸；和(b)所述另外的病毒基因的突变或缺失，所述另外的病毒基因可包括F13L、A36R、A34R、A33R、B8R、B18R、SPI-1、SPI-2、B15R、VGF、E3L、K3L、A41L、K7R、N1L及其功能域或片段或变体中的至少一种，或其任意组合。
在一些实施方案中，所述经修饰的溶瘤病毒可包含：(a)编码透明质酸酶的外源核酸；和(b)所述另外的病毒基因的突变或缺失，所述另外的病毒基因可包括F13L、A36R、A34R、A33R、B8R、B18R、SPI-1、SPI-2、B15R、VGF、E3L、K3L、A41L、K7R、N1L及其功能域或片段或变体中的至少一种，或其任意组合。
在一些实施方案中，所述经修饰的溶瘤病毒可包含：(a)编码CXCR4和CCR2中的至少一种的外源核酸；(b)编码透明质酸酶的外源核酸；和(c)所述另外的病毒基因的突变或缺失，所述另外的病毒基因可包括F13L、A36R、A34R、A33R、B8R、B18R、SPI-1、SPI-2、B15R、VGF、E3L、K3L、A41L、K7R、N1L及其功能域或片段或变体中的至少一种，或其任意组合。
在一些实施方案中，所述经修饰的溶瘤病毒可包含：(a)编码CXCR4和CCR2中的至少一种的外源核酸；(b)B5R基因的突变或缺失；和(c)所述另外的病毒基因的突变或缺失，所述另外的病毒基因可包括F13L、A36R、A34R、A33R、B8R、B18R、SPI-1、SPI-2、B15R、VGF、E3L、K3L、A41L、K7R、N1L及其功能域或片段或变体中的至少一种，或其任意组合。
在一些实施方案中，所述经修饰的溶瘤病毒可包含：(a)编码透明质酸酶的外源核酸；(b)B5R基因的突变或缺失；和(c)所述另外的病毒基因的突变或缺失，所述另外的病毒基因可包括F13L、A36R、A34R、A33R、B8R、B18R、SPI-1、SPI-2、B15R、VGF、E3L、K3L、A41L、K7R、N1L及其功能域或片段或变体中的至少一种，或其任意组合。
在一些实施方案中，所述经修饰的溶瘤病毒可包含：(a)编码CXCR4和CCR2中的至少一种的外源核酸；(b)编码透明质酸酶的外源核酸；(c)B5R基因的突变或缺失；和(d)所述另外的病毒基因的突变或缺失，所述另外的病毒基因可包括F13L、A36R、A34R、A33R、B8R、B18R、SPI-1、SPI-2、B15R、VGF、E3L、K3L、A41L、K7R、N1L及其功能域或片段或变体中的至少一种，或其任意组合。
在一些实施方案中，所述经修饰的溶瘤病毒可包含：(a)编码CXCR4和CCR2中的至少一种的外源核酸；和(b)至少一种额外的外源核酸，其编码HMGB1、PIAS3、IL15、IL15-Rα、LIGHT、ITAC、CXXXC趋化分子、CCL5及其功能域或片段或变体中的至少一种，或其任意组合。
在一些实施方案中，所述经修饰的溶瘤病毒可包含：(a)编码透明质酸酶的外源核酸；和(b)至少一种额外的外源核酸，其编码HMGB1、PIAS3、IL15、IL15-Rα、LIGHT、ITAC、CXXXC趋化分子、CCL5及其功能域或片段或变体中的至少一种，或其任意组合。
在一些实施方案中，所述经修饰的溶瘤病毒可包含：(a)编码CXCR4和CCR2中的至少一种的外源核酸；(b)编码透明质酸酶的外源核酸；和(c)至少一种额外的外源核酸，其编码HMGB1、PIAS3、IL15、IL15-Rα、LIGHT、ITAC、CXXXC趋化分子、CCL5及其功能域或片段或变体中的至少一种，或其任意组合。
在一些实施方案中，所述经修饰的溶瘤病毒可包含：(a)编码CXCR4和CCR2中的至少一种的外源核酸；(b)B5R基因的突变或缺失；和(c)至少一种额外的外源核酸，其编码HMGB1、PIAS3、IL15、IL15-Rα、LIGHT、ITAC、CXXXC趋化分子、CCL5及其功能域或片段或变体中的至少一种，或其任意组合。
在一些实施方案中，所述经修饰的溶瘤病毒可包含：(a)编码透明质酸酶的外源核酸；(b)B5R基因的突变或缺失；和(c)至少一种额外的外源核酸，其编码HMGB1、PIAS3、IL15、IL15-Rα、LIGHT、ITAC、CXXXC趋化分子、CCL5及其功能域或片段或变体中的至少一种，或其任意组合。
在一些实施方案中，所述经修饰的溶瘤病毒可包含：(a)编码CXCR4和CCR2中的至少一种的外源核酸；(b)编码透明质酸酶的外源核酸；(c)B5R基因的突变或缺失；和(d)至少一种额外的外源核酸，其编码HMGB1、PIAS3、IL15、IL15-Rα、LIGHT、ITAC、CXXXC趋化分子、CCL5及其功能域或片段或变体中的至少一种，或其任意组合。
在一些实施方案中，所述经修饰的溶瘤病毒可包含：(a)编码CXCR4和CCR2中的至少一种的外源核酸；(b)编码透明质酸酶的外源核酸；(c)B5R基因的突变或缺失；(d)所述另外的病毒基因的突变或缺失，所述另外的病毒基因可包括F13L、A36R、A34R、A33R、B8R、B18R、SPI-1、SPI-2、B15R、VGF、E3L、K3L、A41L、K7R、N1L及其功能域或片段或变体中的至少一种，或其任意组合；和(e)至少一种额外的外源核酸，其编码HMGB1、PIAS3、IL15、IL15-Rα、LIGHT、ITAC、CXXXC趋化分子、CCL5及其功能域或片段或变体中的至少一种，或其任意组合。
在一些实施方案中，所述透明质酸酶包括PH-20。在一些实施方案中，所述透明质酸酶包括HysA。在一些实施方案中，所述经修饰的溶瘤病毒可进一步包含编码病毒VH1蛋白的外源核酸。
在一些实施方案中，所述经修饰的溶瘤病毒可包含编码病毒VH1蛋白的外源核酸，其中所述外源核酸可来自痘病毒的基因组，其中所述痘病毒可能不是痘苗病毒。在一些实施方案中，所述痘病毒可包括麻疹病毒、脊髓灰质炎病毒、痘病毒、痘苗病毒、腺病毒、腺相关病毒、单纯疱疹病毒、水疱性口炎病毒、呼肠孤病毒、新城疫病毒、塞内卡病毒、慢病毒、门哥病毒或粘液瘤病毒(myxomavir)。
在一些实施方案中，所述病毒基因组可包含胸苷激酶基因。在一些实施方案中，所述病毒基因组中可以缺失胸苷激酶基因。
在一些实施方案中，所述经修饰的溶瘤病毒可进一步包含来自单纯疱疹病毒的胸苷激酶基因。
在一些实施方案中，与其他方面相同但不包含本文公开的修饰的溶瘤病毒相比，所述经修饰的溶瘤病毒表现出增强的肿瘤内和肿瘤间扩散、增强的免疫逃避、增强的肿瘤特异性复制、增强的肿瘤靶向递送。
在一些实施方案中，所述经修饰的溶瘤病毒可包括痘苗病毒、腺相关病毒、腺病毒、呼肠孤病毒、慢病毒、单纯疱疹病毒、水疱性口炎病毒、门哥病毒或粘液瘤病毒。在一些实施方案中，所述经修饰的溶瘤病毒可以是痘苗病毒。
本公开的另一方面提供了一种溶瘤痘苗病毒，其可以包含以下至少两项：(a)增强所述病毒的肿瘤内和肿瘤间扩散的修饰；(b)增强所述病毒的全身递送的修饰；(c)增强所述病毒的肿瘤特异性复制的修饰；和(d)增强所述病毒的免疫逃避的修饰。
本公开的又一方面提供了一种溶瘤痘苗病毒，其可包含编码蛋白质或其片段的外源核酸，该蛋白质或其片段增强肿瘤的细胞外基质(ECM)的降解。
在所述溶瘤痘苗病毒的一些实施方案中，所述增强ECM降解的蛋白质或其片段可以是透明质酸酶。在一些实施方案中，所述透明质酸酶可以是膜结合的透明质酸酶，如PH-20。在一些实施方案中，所述PH-20可以是GPI锚定的。在一些实施方案中，所述透明质酸酶可以是微生物透明质酸酶，如HysA。
在一些实施方案中，所述溶瘤痘苗病毒可包含以下至少一项：(a)增强所述病毒的肿瘤内和肿瘤间扩散的修饰；(b)增强所述病毒的全身递送的修饰；(c)增强所述病毒的肿瘤特异性复制的修饰；和(d)增强所述病毒的免疫逃避的修饰。
本公开的又一方面提供了一种溶瘤痘苗病毒，其可包含编码趋化因子受体的外源核酸，其中从所述病毒表达所述趋化因子受体增强了所述病毒的全身递送。
在一些实施方案中，所述趋化因子可包括CXCR4和CCR2中的至少一种。
在一些实施方案中，所述溶瘤痘苗病毒可包含编码所述趋化因子受体的外源核酸，并且可进一步包含以下至少之一：(a)增强肿瘤的ECM的降解的修饰；和(b)增强EEV形式的所述病毒的产生的修饰。
本公开的又一方面提供了一种溶瘤痘苗病毒，其可以在所述病毒的基因组中包含增强EEV形式的所述病毒的产生的第一修饰，并且包含至少一种以下进一步的修饰：(a)增强所述病毒的肿瘤内和肿瘤间扩散的修饰；(b)增强所述病毒的全身递送的修饰；(c)增强所述病毒的肿瘤特异性复制的修饰；和(d)增强所述病毒的免疫逃避的修饰。
在一些实施方案中，所述第一修饰可包含B5R基因的突变或缺失。
在一些实施方案中，所述溶瘤痘苗病毒可包含另外的病毒基因的突变或缺失，其中所述另外的病毒基因可包括F13L、A36R、A34R、A33R、B8R、B18R、SPI-1、SPI-2、B15R、VGF、E3L、K3L、A41L、K7R、N1L和A52R及其功能域或片段或变体中的至少一种，或其任意组合。
在一些实施方案中，所述溶瘤痘苗病毒可进一步包含编码蛋白质或其片段的核酸序列，所述蛋白质或其片段：调节NFκB信号传导，促进组织液压力(IFP)的降低，调节STAT3介导的基因激活，促进T细胞活化，促进NK细胞向病毒感染的细胞的吸引，调节病毒感染的细胞的代谢程序，调节病毒感染的细胞对脂肪酸的摄取，促进MDSC的治疗靶向，或其任意组合。
在一些实施方案中，所述至少一种额外的外源核酸可包括编码HMGB1、PIAS3、IL15、IL15-Rα、LIGHT、ITAC、CXXXC趋化分子、CCL5及其功能域或片段或变体中的至少一种或其任意组合的核酸。
在一些实施方案中，所述溶瘤痘苗病毒可包含：(a)编码CXCR4和CCR2中的至少一种的外源核酸；和(b)编码透明质酸酶的外源核酸。
在一些实施方案中，所述溶瘤痘苗病毒可包含：(a)编码CXCR4和CCR2中的至少一种的外源核酸；和(b)B5R基因的突变或缺失。
在一些实施方案中，所述溶瘤痘苗病毒可包含：(a)编码透明质酸酶的外源核酸；和(b)B5R基因的突变或缺失。
在一些实施方案中，所述溶瘤痘苗病毒可包含：(a)编码CXCR4和CCR2中的至少一种的外源核酸；(b)编码透明质酸酶的外源核酸；和(c)B5R基因的突变或缺失。
在一些实施方案中，所述溶瘤痘苗病毒可包含：(a)编码CXCR4和CCR2中的至少一种的外源核酸；和(b)所述另外的病毒基因的突变或缺失，所述另外的病毒基因可包括F13L、A36R、A34R、A33R、B8R、B18R、SPI-1、SPI-2、B15R、VGF、E3L、K3L、A41L、K7R、N1L、A52R及其功能域或片段或变体中的至少一种，或其任意组合。
在一些实施方案中，所述溶瘤痘苗病毒可包含：(a)编码透明质酸酶的外源核酸；和(b)所述另外的病毒基因的突变或缺失，所述另外的病毒基因可包括F13L、A36R、A34R、A33R、B8R、B18R、SPI-1、SPI-2、B15R、VGF、E3L、K3L、A41L、K7R、N1L、A52R及其功能域或片段或变体中的至少一种，或其任意组合
在一些实施方案中，所述溶瘤痘苗病毒可包含：(a)编码CXCR4和CCR2中的至少一种的外源核酸；(b)编码透明质酸酶的外源核酸；和(c)所述另外的病毒基因的突变或缺失，所述另外的病毒基因可包括F13L、A36R、A34R、A33R、B8R、B18R、SPI-1、SPI-2、B15R、VGF、E3L、K3L、A41L、K7R、N1L、A52R及其功能域或片段或变体中的至少一种，或其任意组合。
在一些实施方案中，所述溶瘤痘苗病毒可包含：(a)编码CXCR4和CCR2中的至少一种的外源核酸；(b)B5R基因的突变或缺失；和(c)所述另外的病毒基因的突变或缺失，所述另外的病毒基因可包括F13L、A36R、A34R、A33R、B8R、B18R、SPI-1、SPI-2、B15R、VGF、E3L、K3L、A41L、K7R、N1L、A52R及其功能域或片段或变体中的至少一种，或其任意组合。
在一些实施方案中，所述溶瘤痘苗病毒可包含：(a)编码透明质酸酶的外源核酸；(b)B5R基因的突变或缺失；和(c)所述另外的病毒基因的突变或缺失，所述另外的病毒基因可包括F13L、A36R、A34R、A33R、B8R、B18R、SPI-1、SPI-2、B15R、VGF、E3L、K3L、A41L、K7R、N1L、A52R及其功能域或片段或变体中的至少一种，或其任意组合。
在一些实施方案中，所述溶瘤痘苗病毒可包含：(a)编码CXCR4和CCR2中的至少一种的外源核酸；(b)编码透明质酸酶的外源核酸；(c)B5R基因的突变或缺失；和(d)所述另外的病毒基因的突变或缺失，所述另外的病毒基因可包括F13L、A36R、A34R、A33R、B8R、B18R、SPI-1、SPI-2、B15R、VGF、E3L、K3L、A41L、K7R、N1L、A52R及其功能域或片段或变体中的至少一种，或其任意组合。
在一些实施方案中，所述溶瘤痘苗病毒可包含：(a)编码CXCR4和CCR2中的至少一种的外源核酸；和(b)至少一种额外的外源核酸，其编码HMGB1、PIAS3、IL15、IL15-R、LIGHT、ITAC、CXXXC趋化分子、CCL5及其功能域或片段或变体中的至少一种，或其任意组合。
在一些实施方案中，所述溶瘤痘苗病毒可包含：(a)编码透明质酸酶的外源核酸；和(b)至少一种额外的外源核酸，其编码HMGB1、PIAS3、IL15、IL15-R、LIGHT、ITAC、CXXXC趋化分子、CCL5及其功能域或片段或变体中的至少一种，或其任意组合。
在一些实施方案中，所述溶瘤痘苗病毒可包含：(a)编码CXCR4和CCR2中的至少一种的外源核酸；(b)编码透明质酸酶的外源核酸；和(c)至少一种额外的外源核酸，其编码HMGB1、PIAS3、IL15、IL15-R、LIGHT、ITAC、CXXXC趋化分子、CCL5及其功能域或片段或变体中的至少一种，或其任意组合。
在一些实施方案中，所述溶瘤痘苗病毒可包含：(a)编码CXCR4和CCR2中的至少一种的外源核酸；(b)B5R基因的突变或缺失；和(c)至少一种额外的外源核酸，其编码HMGB1、PIAS3、IL15、IL15-R、LIGHT、ITAC、CXXXC趋化分子、CCL5及其功能域或片段或变体中的至少一种，或其任意组合。
在一些实施方案中，所述溶瘤痘苗病毒可包含：(a)编码透明质酸酶的外源核酸；(b)B5R基因的突变或缺失；和(c)至少一种额外的外源核酸，其编码HMGB1、PIAS3、IL15、IL15-R、LIGHT、ITAC、CXXXC趋化分子、CCL5及其功能域或片段或变体中的至少一种，或其任意组合。
在一些实施方案中，所述溶瘤痘苗病毒可包含：(a)编码CXCR4和CCR2中的至少一种的外源核酸；(b)编码透明质酸酶的外源核酸；(c)B5R基因的突变或缺失；和(d)至少一种额外的外源核酸，其编码HMGB1、PIAS3、IL15、IL15-R、LIGHT、ITAC、CXXXC趋化分子、CCL5及其功能域或片段或变体中的至少一种，或其任意组合。
在一些实施方案中，所述溶瘤痘苗病毒可包含：(a)编码CXCR4和CCR2中的至少一种的外源核酸；(b)编码透明质酸酶的外源核酸；(c)B5R基因的突变或缺失；(d)所述另外的病毒基因的突变或缺失，所述另外的病毒基因可包括F13L、A36R、A34R、A33R、B8R、B18R、SPI-1、SPI-2、B15R、VGF、E3L、K3L、A41L、K7R、N1L、A52R及其功能域或片段或变体中的至少一种，或其任意组合；和(e)至少一种额外的外源核酸，其编码HMGB1、PIAS3、IL15、IL15-Rα、LIGHT、ITAC、CXXXC趋化分子、CCL5及其功能片段或域或变体中的至少一种，或其任意组合。
一个方面提供了一种溶瘤痘苗病毒，其包含可编码趋化因子受体、能够降解透明质酸的蛋白质或其任意组合的外源核酸。在一些实施方案中，所述蛋白质是能够降解透明质酸的蛋白质，其中该蛋白质包括PH-20或HysA。
一个方面提供了一种经修饰的溶瘤病毒，其可包含A52R基因的突变或缺失。在一些实施方案中，所述经修饰的溶瘤病毒可包含A52R基因的缺失。
在一些实施方案中，所述经修饰的溶瘤病毒可包含可编码趋化因子受体、能够降解透明质酸的蛋白质或其任意组合的外源核酸。在一些实施方案中，所述经修饰的溶瘤病毒可包含可编码趋化因子受体的外源核酸，其中所述趋化因子受体可包括CXCR4或CCR2。在一些实施方案中，所述经修饰的溶瘤病毒可包含编码能够降解透明质酸的蛋白质的外源核酸，其中所述蛋白质可包括膜结合的透明质酸酶或分泌的透明质酸酶。在一些实施方案中，所述经修饰的溶瘤病毒可包含可编码膜结合的透明质酸酶的外源核酸，其中所述膜结合的透明质酸酶可以是PH-20。在一些实施方案中，所述PH-20可以是GPI锚定的。在一些实施方案中，所述经修饰的溶瘤病毒可包含可编码分泌的透明质酸酶的外源核酸，其中所述分泌的透明质酸酶可以是HysA。
一个方面提供了一种经修饰的溶瘤病毒，其可包含K7R基因的突变或缺失。在一些实施方案中，所述经修饰的溶瘤病毒可包含K7R基因的缺失。在一些实施方案中，所述经修饰的溶瘤病毒可进一步包含可编码细胞因子的外源核酸、可编码细胞因子受体的外源核酸和可编码趋化因子的外源核酸中的至少一种。在一些实施方案中，所述经修饰的溶瘤病毒包含可编码细胞因子的外源核酸，其中所述细胞因子可包括IL15。在一些实施方案中，所述经修饰的溶瘤病毒可包含可编码细胞因子受体的外源核酸，其中所述细胞因子受体可包括IL15-Rα。在一些实施方案中，所述经修饰的溶瘤病毒可包含可编码趋化因子的外源核酸，其中所述趋化因子可包括CCL5。在一些实施方案中，所述经修饰的溶瘤病毒可进一步包含编码HMGB1、PIAS3、LIGHT、ITAC、CXXXC趋化分子及其功能域或片段或变体中的至少一种或其任意组合的外源核酸。在一些实施方案中，所述经修饰的溶瘤病毒可进一步包含另外的病毒基因的突变或缺失，所述另外的病毒基因包括F13L、A36R、A34R、A33R、B8R、B18R、SPI-1、SPI-2、B15R、VGF、E3L、K3L、A41L、N1L、A52R及其功能域或片段或变体中的至少一种，或其任意组合。
一个方面提供了一种经修饰的溶瘤病毒，其可包含可编码IL15和IL15-Rα的外源核酸。一个方面提供了一种经修饰的溶瘤病毒，其可包含可编码IL15和CCL5的外源核酸。一个方面提供了一种经修饰的溶瘤病毒，其可包含可编码以下至少一种的外源核酸：IL15、IL15-Rα、ITAC、CXXXC趋化分子及其功能域或片段或变体，或其任意组合。在一些实施方案中，所述病毒可表现出增强的自然杀伤细胞活化和吸引。
在一些实施方案中，与其他方面相同但不包含本文公开的修饰的溶瘤病毒相比，所述经修饰的溶瘤病毒可以表现出增强的肿瘤内和肿瘤间扩散、增强的免疫逃避、增强的肿瘤特异性复制、增强的肿瘤靶向递送。在一些实施方案中，所述经修饰的溶瘤病毒可包括痘病毒、腺相关病毒、腺病毒、呼肠孤病毒、慢病毒、单纯疱疹病毒、水疱性口炎病毒、门哥病毒或粘液瘤病毒。在一些实施方案中，所述经修饰的溶瘤病毒可包括痘病毒。在一些实施方案中，所述痘病毒可以是痘苗病毒。在一些实施方案中，所述经修饰的溶瘤病毒可以适合于全身递送。
在一些实施方案中，与其他方面相同但不包含本文公开的修饰的痘苗病毒相比，所述溶瘤痘苗病毒可以表现出增强的肿瘤内和肿瘤间扩散、增强的免疫逃避、增强的肿瘤特异性复制、增强的肿瘤靶向递送。
在一些实施方案中，所述溶瘤痘苗病毒可以适合于全身递送。
在一些实施方案中，所述溶瘤痘苗病毒可能能够发生免疫逃避。
在一些实施方案中，所述全身递送可包括口服施用、肠胃外施用、鼻内施用、舌下施用、直肠施用、透皮施用或其任意组合。
在一些实施方案中，所述肠胃外递送可包括静脉内注射。
在一些实施方案中，所述溶瘤痘苗病毒可以适合于瘤内递送。
在一些实施方案中，所述溶瘤痘苗病毒可包含编码病毒VH1蛋白的外源核酸。
在一些实施方案中，所述外源核酸可以来自痘病毒的基因组，其中该痘病毒可以不是痘苗病毒。在一些实施方案中，所述痘病毒可包括β昆虫痘病毒(betaentomopoxvirus)、亚塔痘病毒(yatapoxvirus)、鹿痘病毒(cervidpoxvirus)、γ昆虫痘病毒(gammaentomopoxvirus)、野兔痘病毒(leporipoxvirus)、猪痘病毒(suipoxvirus)、软疣痘病毒(molluscipoxvirus)、鳄痘病毒(crocodylidpoxvirus)、α昆虫痘病毒(alphaentomopoxvirus)、山羊痘病毒(capripoxvirus)、禽痘病毒、副痘病毒。
在一些实施方案中，所述病毒基因组可包含胸苷激酶基因。在一些实施方案中，所述病毒基因组中可以缺失胸苷激酶基因。
在一些实施方案中，所述溶瘤痘苗病毒可包含来自单纯疱疹病毒的胸苷激酶基因。
本公开的又一方面提供了一种药物组合物，其可包含如本文公开的经修饰的溶瘤病毒或如本文公开的溶瘤痘苗病毒。在一些实施方案中，所述药物组合物可包含增溶剂和赋形剂。在一些实施方案中，所述赋形剂可包括缓冲剂、稳定剂、抗氧化剂、粘合剂、稀释剂、分散剂、速率控制剂、润滑剂、助流剂、崩解剂、增塑剂、防腐剂或其任意组合中的一种或多种。在一些实施方案中，所述赋形剂可包括二水合磷酸氢二钠、二水合磷酸二氢钠、氯化钠、肌醇、山梨醇或其任意组合。在一些实施方案中，所述药物组合物不包含防腐剂。在一些实施方案中，所述药物组合物可包含防腐剂、稀释剂和载体中的一种或多种。在一些实施方案中，所述药物组合物可包含额外的活性成分或其盐。在一些实施方案中，所述增溶剂可以是无菌水。在一些实施方案中，所述药物组合物可包含额外的活性成分，其中所述额外的活性成分可以是另外的溶瘤病毒。本公开的另一方面提供了一种在将溶瘤病毒全身递送给受试者时增强所述病毒的治疗效果的方法，该方法包括全身施用如本文公开的经修饰的溶瘤病毒、如本文公开的溶瘤痘苗病毒或如本文公开的药物组合物。
在一些实施方案中，所述全身施用可包括口服施用、肠胃外施用、鼻内施用、舌下施用、直肠施用、透皮施用或其任意组合。在一些实施方案中，所述肠胃外施用可包括静脉内注射。
本公开的又一方面提供了一种对经修饰的溶瘤病毒进行工程化的方法，该方法可包括：(i)获得经修饰的溶瘤病毒DNA骨架载体，所述经修饰的溶瘤病毒DNA骨架载体可包含一个或多个如本文公开的修饰；(ii)进一步修饰所述经修饰的溶瘤病毒DNA载体以产生工程化DNA载体；(iii)用所述工程化DNA载体转染哺乳动物细胞；(iv)在适合病毒复制的条件下培养所述哺乳动物细胞；以及(v)收获病毒颗粒。
本公开的又一方面提供了一种对溶瘤痘苗病毒进行工程化的方法，该方法可包括：(i)获得溶瘤痘苗病毒DNA骨架载体，所述溶瘤痘苗病毒DNA骨架载体可包含一个或多个如本文公开的修饰；(ii)进一步修饰所述溶瘤痘苗病毒DNA载体以产生工程化DNA载体；(iii)用所述工程化DNA载体转染哺乳动物细胞；(iv)在适合病毒复制的条件下培养所述哺乳动物细胞；以及(v)收获病毒颗粒。
本公开的又一方面提供了一种产生如本文公开的经修饰的溶瘤病毒的方法，其包括：(i)生成经修饰的溶瘤病毒DNA载体，所述经修饰的溶瘤病毒DNA载体可包含如本文公开的的修饰；(ii)用所述经修饰的溶瘤病毒DNA载体转染哺乳动物细胞；(iii)在适合病毒复制的条件下培养所述哺乳动物细胞；以及(iv)收获病毒颗粒。
本公开的又一方面提供了一种产生如本文公开的溶瘤痘苗病毒的方法，其包括：(i)生成溶瘤痘苗病毒DNA载体，所述溶瘤痘苗病毒DNA载体可包含如本文公开的的修饰；(ii)用所述溶瘤痘苗病毒DNA载体转染哺乳动物细胞；(iii)在适合病毒复制的条件下培养所述哺乳动物细胞；以及(iv)收获病毒颗粒。在一些实施方案中，所述哺乳动物细胞包括HeLa细胞、293细胞或Vero细胞。
本公开的又一方面提供了一种试剂盒，其可包含：如本文公开的经修饰的溶瘤病毒、如本文公开的溶瘤痘苗病毒或如本文公开的药物组合物，以及关于施用所述经修饰的溶瘤病毒、溶瘤痘苗病毒或药物组合物的说明书；以及关于将所述药物组合物施用于受试者以治疗与病理性血管生成相关的病症的说明书。
本公开的又一方面提供了一种试剂盒，其包含：如本文公开的经修饰的溶瘤病毒、如本文公开的溶瘤痘苗病毒或如本文公开的药物组合物，以及关于施用所述经修饰的溶瘤病毒、溶瘤痘苗病毒或药物组合物的说明书；容器；以及关于将所述药物组合物施用于受试者以治疗与病理性血管生成相关的病症的说明书。
本公开的又一方面提供了一种用于治疗癌症的试剂盒，其包含：如本文公开的经修饰的溶瘤病毒、如本文公开的溶瘤痘苗病毒或如本文公开的药物组合物，以及关于施用所述经修饰的溶瘤病毒、溶瘤痘苗病毒或药物组合物的说明书；以及关于将所述药物组合物施用于受试者以治疗与病理性血管生成相关的病症的说明书。
本公开的又一方面提供了一种用于治疗癌症的试剂盒，其包含：如本文公开的经修饰的溶瘤病毒、如本文公开的溶瘤痘苗病毒或如本文公开的药物组合物，以及关于施用所述经修饰的溶瘤病毒、溶瘤痘苗病毒或药物组合物的说明书；容器；以及关于将所述药物组合物施用于受试者以治疗与病理性血管生成相关的病症的说明书。在一些实施方案中，所述癌症可以是实体瘤、白血病或淋巴瘤。
本公开的又一方面提供了一种用于治疗肿瘤的试剂盒，其包含：如本文公开的经修饰的溶瘤病毒、如本文公开的溶瘤痘苗病毒或如本文公开的药物组合物，以及关于施用所述经修饰的溶瘤病毒、溶瘤痘苗病毒或药物组合物的说明书；以及关于将所述药物组合物施用于受试者以治疗与病理性血管生成相关的病症的说明书。
本公开的又一方面提供了一种用于治疗肿瘤的试剂盒，其包含：如本文公开的经修饰的溶瘤病毒、如本文公开的溶瘤痘苗病毒或如本文公开的药物组合物，以及关于施用所述经修饰的溶瘤病毒、溶瘤痘苗病毒或药物组合物的说明书；容器；以及关于将所述药物组合物施用于受试者以治疗与病理性血管生成相关的病症的说明书。在一些实施方案中，所述肿瘤可以是实体瘤、白血病或淋巴瘤。在一些实施方案中，所述受试者可能需要所述治疗。在一些实施方案中，所述受试者可以是人。在一些实施方案中，所述关于施用的说明书可包括关于全身施用的说明书。在一些实施方案中，所述全身施用可包括口服施用、肠胃外施用、鼻内施用、舌下施用、直肠施用、透皮施用或其任意组合。在一些实施方案中，所述肠胃外施用可包括静脉内注射。
本公开的又一方面提供了一种治疗肿瘤的方法，其包括：向受试者施用治疗有效量的如本文公开的经修饰的溶瘤病毒，如本文公开的溶瘤痘苗病毒，或如本文公开的药物组合物。
在一些实施方案中，所述治疗肿瘤的方法可包括向受试者施用治疗有效量的如本文公开的经修饰的溶瘤病毒，如本文公开的溶瘤痘苗病毒，或如本文公开的药物组合物，其中所述肿瘤可以是实体瘤、白血病或淋巴瘤。
本公开的又一方面提供了一种治疗癌症的方法，其包括：向受试者施用治疗有效量的如本文公开的经修饰的溶瘤病毒，如本文公开的溶瘤痘苗病毒，或如本文公开的药物组合物。
在一些实施方案中，所述治疗癌症的方法可包括向受试者施用治疗有效量的如本文公开的经修饰的溶瘤病毒，如本文公开的溶瘤痘苗病毒，或如本文公开的药物组合物，其中所述癌症可以是实体瘤、白血病或淋巴瘤。
在一些实施方案中，所述治疗癌症的方法可包括向受试者施用治疗有效量的如本文公开的经修饰的溶瘤病毒，如本文公开的溶瘤痘苗病毒，或如本文公开的药物组合物，其中所述方法进一步可包括施用另外的疗法。
在一些实施方案中，所述另外的疗法可包括化学疗法、放射疗法、使用额外的病毒的溶瘤病毒疗法、使用免疫调节蛋白的治疗、CAR T细胞疗法(嵌合抗原受体T细胞疗法)、抗癌剂或其任意组合。
在一些实施方案中，所述另外的疗法可包括施用可包含抗CD33抗体及其可变区、抗CD11b抗体及其可变区、COX2抑制剂、细胞因子、趋化因子、抗CTLA4抗体或其抗原结合片段、抗PD-1抗体或其抗原结合片段、抗PD-L1抗体或其抗原结合片段或TLR激动剂的免疫调节剂。
在一些实施方案中，所述治疗癌症的方法可包括施用所述另外的疗法，其中所述另外的疗法可包括施用所述抗癌剂，其中所述抗癌剂可以是化疗剂。在一些实施方案中，所述化疗剂可以是前药。在一些实施方案中，在将所述前药与所述溶瘤痘苗病毒、经修饰的痘苗病毒或可包含该病毒的药物组合物联合施用时，所述前药可转化为活性形式。在一些实施方案中，所述前药可包含更昔洛韦。在一些实施方案中，所述治疗癌症的方法可包括施用所述另外的疗法，其中所述另外的疗法可以同时或顺序地施用。在一些实施方案中，所述治疗癌症的方法可包括顺序施用所述另外的疗法，其中所述另外的疗法可以在施用如本文公开的经修饰的溶瘤病毒、如本文公开的溶瘤痘苗病毒或如本文公开的药物组合物之前施用。在一些实施方案中，所述治疗癌症的方法可包括顺序施用所述另外的疗法，其中所述另外的疗法可以在施用如本文公开的经修饰的溶瘤病毒、如本文公开的溶瘤痘苗病毒或如本文公开的药物组合物之后施用。
本公开的又一方面提供了一种在癌细胞中产生毒性作用的方法，其包括：向癌细胞施用治疗有效量的如本文公开的经修饰的溶瘤病毒，如本文公开的溶瘤痘苗病毒，或如本文公开的药物组合物。在一些实施方案中，所述癌细胞可以存在于受试者中。在一些实施方案中，所述受试者可能需要在癌细胞中产生毒性作用的方法。
本公开的又一方面提供了一种治疗受试者的方法，其包括通过向癌细胞施用治疗有效量的如本文公开的经修饰的溶瘤病毒、如本文公开的溶瘤痘苗病毒或如本文公开的药物组合物，在可能存在于受试者中的癌细胞中产生毒性作用。在一些实施方案中，所述受试者可能需要所述治疗。
本公开的又一方面提供了一种治疗受试者的癌症的方法，其包括通过施用治疗有效量的如本文公开的经修饰的溶瘤病毒、如本文公开的溶瘤痘苗病毒或如本文公开的药物组合物感染所述受试者的癌细胞，其中所述施用可以是全身施用。
本公开的又一方面提供了一种治疗受试者的癌症的方法，其包括施用用如本文公开的经修饰的溶瘤病毒或如本文公开的溶瘤痘苗病毒感染的细胞。
在一些实施方案中，所述癌症可包括黑素瘤、肝细胞癌、乳腺癌、肺癌、腹膜癌、前列腺癌、膀胱癌、卵巢癌、白血病、淋巴瘤、肾癌、胰腺癌、上皮癌、胃癌、结肠癌、十二指肠癌、胰腺腺癌、间皮瘤、多形性胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、多发性骨髓瘤、前列腺癌、肝细胞癌、胆管肉瘤、胰腺腺癌、头颈部鳞状细胞癌、结直肠癌、肠型胃腺癌、宫颈鳞状细胞癌、骨肉瘤、上皮性卵巢癌、急性淋巴母细胞淋巴瘤、骨髓增生性赘生物或肉瘤。
在一些实施方案中，所述癌细胞可存在于受试者选自下组的器官中：膀胱、血液、骨骼、骨髓、脑、乳腺、结肠、食道、胃肠、牙龈、头、肾、肝、肺、鼻咽、颈、卵巢、前列腺、皮肤、胃、睾丸、舌或子宫。在一些实施方案中，所述癌症可以是转移性的。
本公开的又一方面提供了一种治疗受试者的癌症的方法，其包括：与化疗前药联合施用如本文公开的经修饰的溶瘤病毒或可包含该病毒的药物组合物。
本公开的又一方面提供了一种治疗受试者的癌症的方法，其包括：与化疗前药联合施用如本文公开的溶瘤痘苗病毒或可包含该病毒的药物组合物。
本公开的又一方面提供了一种治疗受试者的癌症的方法，其包括：(i)施用如本文公开的经修饰的溶瘤病毒或可包含该病毒的药物组合物；(ii)测定从所述受试者分离的第一和第二生物样品中的病毒滴度，其中所述第一生物样品可包含癌细胞，并且所述第二生物样品可包含非癌细胞；以及(iii)如果所述第二样品中的病毒滴度可等于或高于所述第一样品中的病毒滴度，则施用化疗前药，其中所述化疗前药的施用导致所述经修饰的溶瘤病毒在所述受试者中的复制受到抑制。
本公开的又一方面提供了一种治疗受试者的癌症的方法，其包括：(i)施用如本文公开的溶瘤痘苗病毒或可包含该病毒的药物组合物；(ii)测定从所述受试者分离的第一和第二生物样品中的病毒滴度，其中所述第一生物样品可包含癌细胞，并且所述第二生物样品可包含非癌细胞；以及(iii)如果所述第二样品中的病毒滴度可等于或高于所述第一样品中的病毒滴度，则施用化疗前药，其中所述化疗前药的施用导致所述溶瘤痘苗病毒在所述受试者中的复制受到抑制。
在一些实施方案中，所述治疗受试者的癌症的方法可提高基于溶瘤病毒的癌症疗法的功效。在一些实施方案中，所述治疗受试者的癌症的方法可包括施用如本文公开的经修饰的溶瘤病毒，如本文公开的溶瘤痘苗病毒，或如本文公开的药物组合物，其中所述经修饰的溶瘤病毒、溶瘤痘苗病毒或药物组合物可以以可包含约106PFU/mL至约1010PFU/mL的所述溶瘤痘苗病毒的剂量施用。
在一些实施方案中，所述治疗受试者的癌症的方法可包括施用如本文公开的经修饰的溶瘤病毒，如本文公开的溶瘤痘苗病毒，或如本文公开的药物组合物，其中所述经修饰的溶瘤病毒、溶瘤痘苗病毒或药物组合物可以以可包含约5x 109PFU/mL的所述溶瘤痘苗病毒的剂量施用。
在一些实施方案中，所述治疗受试者的癌症的方法可包括施用如本文公开的经修饰的溶瘤病毒，如本文公开的溶瘤痘苗病毒，或如本文公开的药物组合物，其中所述经修饰的溶瘤病毒、溶瘤痘苗病毒或药物组合物可以独立地以初始剂量施用第一时间段、以中间剂量施用第二时间段并以高剂量施用第三时间段。在一些实施方案中，所述治疗受试者的癌症的方法可包括独立地施用所述初始剂量、所述中间剂量和所述高剂量，其中所述初始剂量可以低于所述中间剂量，并且所述中间剂量可以低于所述高剂量。
在一些实施方案中，其中所述第一时间段、所述第二时间段和所述第三时间段可以各自为约1周至约3周。在一些实施方案中，所述治疗受试者的癌症的方法可包括施用如本文公开的经修饰的溶瘤病毒，如本文公开的溶瘤痘苗病毒，或如本文公开的药物组合物，其中所述经修饰的溶瘤病毒、溶瘤痘苗病毒和药物组合物可以独立地构成液体剂型，该液体剂型可以以约1mL至约5mL、约5mL至10mL、约15mL至约20mL、约25mL至约30mL、约30mL至约50mL、约50mL至约100mL、约100mL至150mL、约150mL至约200mL、约200mL至约250mL、约250mL至约300mL、约300mL至约350mL、约350mL至约400mL、约400mL至约450mL、约450mL至500mL、约500mL至750mL或约750mL至1000mL的体积施用。
在一些实施方案中，所述治疗受试者的癌症的方法可包括施用如本文公开的经修饰的溶瘤病毒，如本文公开的溶瘤痘苗病毒，或如本文公开的药物组合物，其中所述经修饰的溶瘤病毒、溶瘤痘苗病毒或药物组合物可以以液体剂型、固体剂型、可吸入剂型、鼻内剂型、脂质体制剂、可包含纳米颗粒的剂型、可包含微粒的剂型、聚合物剂型或其任意组合施用。
在一些实施方案中，所述治疗受试者的癌症的方法可包括施用如本文公开的经修饰的溶瘤病毒，如本文公开的溶瘤痘苗病毒，或如本文公开的药物组合物，其中所述经修饰的溶瘤病毒、溶瘤痘苗病毒或药物组合物可以施用持续约1周、约2周、约3周、约4周、约6周、约7周、约8周、约9周、约10周或约12周。
在一些实施方案中，所述治疗受试者的癌症的方法可包括施用如本文公开的经修饰的溶瘤病毒，如本文公开的溶瘤痘苗病毒，或如本文公开的药物组合物，其中所述经修饰的溶瘤病毒、溶瘤痘苗病毒或药物组合物可以每日一次、每日两次、每周一次、每两周一次或每三周一次施用。
在一些实施方案中，所述治疗受试者的癌症的方法可包括施用如本文公开的经修饰的溶瘤病毒，如本文公开的溶瘤痘苗病毒，或如本文公开的药物组合物，其中所述经修饰的溶瘤病毒、溶瘤痘苗病毒或药物组合物可以经静脉内、腹膜内或通过瘤内注射施用。
在一些实施方案中，所述治疗受试者的癌症的方法可包括施用如本文公开的经修饰的溶瘤病毒，如本文公开的溶瘤痘苗病毒，或如本文公开的药物组合物，其中所述经修饰的溶瘤病毒、溶瘤痘苗病毒或药物组合物可以以团注或缓慢输注的方式施用。
在一些实施方案中，所述治疗受试者的癌症的方法可包括施用如本文公开的经修饰的溶瘤病毒，如本文公开的溶瘤痘苗病毒，或如本文公开的药物组合物，其中所述经修饰的溶瘤病毒、溶瘤痘苗病毒或药物组合物的施用在自施用第一剂量起约1小时至约3天后导致第一峰值病毒载量，并且在约3天至约10天后导致第二峰值病毒载量。
在一些实施方案中，所述治疗受试者的癌症的方法可包括施用所述另外的疗法，其中所述另外的疗法可以施用持续约1周、约2周、约3周、约4周、约6周、约7周、约8周、约9周、约10周或约12周。在一些实施方案中，所述治疗受试者的癌症的方法可包括施用所述另外的疗法，其中所述另外的疗法可以每日一次、每周一次、每两周一次或每三周一次施用。在一些实施方案中，所述治疗受试者的癌症的方法可包括施用所述另外的疗法，其中所述另外的疗法可以以液体剂型、固体剂型、可吸入剂型、鼻内剂型、脂质体制剂、可包含纳米颗粒的剂型、可包含微粒的剂型、聚合物剂型或其任意组合施用。在一些实施方案中，所述治疗受试者的癌症的方法可包括施用所述另外的疗法，其中所述另外的疗法可经口服、静脉内、通过瘤内注射或通过辐射施用。在一些实施方案中，所述治疗受试者的癌症的方法可包括将如本文公开的经修饰的溶瘤病毒、如本文公开的溶瘤痘苗病毒或如本文公开的药物组合物施用于有需要的受试者，其中所述受试者可以是人。在一些实施方案中，所述治疗受试者的癌症的方法可包括将如本文公开的经修饰的溶瘤病毒、如本文公开的溶瘤痘苗病毒或如本文公开的药物组合物施用于有需要的受试者，其中在施用所述经修饰的溶瘤病毒、溶瘤痘苗病毒或药物组合物之前，所述受试者已被诊断为患有癌症。在一些实施方案中，所述治疗受试者的方法可包括将如本文公开的经修饰的溶瘤病毒、如本文公开的溶瘤痘苗病毒或如本文公开的药物组合物施用于有需要的受试者，其中在施用所述经修饰的溶瘤病毒、溶瘤痘苗病毒或药物组合物之前，所述受试者已被诊断为具有肿瘤。在一些实施方案中，所述治疗受试者的癌症的方法可包括将如本文公开的经修饰的溶瘤病毒、如本文公开的溶瘤痘苗病毒或如本文公开的药物组合物与所述另外的疗法联合施用于有需要的受试者，其中在施用所述经修饰的溶瘤病毒、溶瘤痘苗病毒或药物组合物或另外的疗法之前，所述受试者已被诊断为患有癌症或肿瘤。在一些实施方案中，所述治疗受试者的方法可包括将如本文公开的经修饰的溶瘤病毒、如本文公开的溶瘤痘苗病毒或如本文公开的药物组合物与所述另外的疗法联合施用于有需要的受试者，其中在施用所述经修饰的溶瘤病毒、溶瘤痘苗病毒或药物组合物或另外的疗法之前，所述受试者已被诊断为具有肿瘤。
附图说明
本公开的新颖特征在所附权利要求书中具体阐述。通过参考以下对利用本公开的原理的说明性实施方案加以阐述的详细描述以及附图，将会对本公开的特征和优点获得更好的理解，在这些附图中：
图1显示了在B5R基因中含有示例性突变的本公开的示例性经修饰的痘苗病毒对肿瘤生长的影响。该图量化了在荷有皮下RENCA肿瘤的BALB/c小鼠中，相对于植入后天数的相对肿瘤大小，这些小鼠用静脉内注射的单剂量的对照痘苗病毒(对照(IV))、瘤内注射的经修饰的WR.TK-GMCSF痘苗病毒(其中TK基因缺失，并添加了编码GMCSF的外源核酸)(WR.TK-GMCSF(IT))或者静脉内注射(WR.B5Rmut.TK-(IV))或瘤内注射(WR.B5Rmut.TK-(IT))的示例性经修饰的痘苗病毒(其中TK基因缺失，并在B5R基因中引入了突变)(WR.B5Rmut.TK-)处理。
图2A-2B显示了B5R基因中的示例性突变对示例性经修饰的痘苗病毒(WR.B5RmutTK-病毒)(在图2A和2B中称为B5R)在肿瘤中的递送和扩散的影响。图2A和图2B是显示分别从荷有B16肿瘤的未免疫和免疫的C57/BL6小鼠收集的每克肿瘤中的病毒基因组的定量的图。将用单次注射WR.B5RmutTK-病毒处理的小鼠与用另一种经修饰的痘苗病毒WR.TK-A34R K151E处理的小鼠进行比较，在WR.TK-A34R K151E中，TK缺失，并且病毒A34R基因通过K151到E的氨基酸改变进行了突变(在图2A和2B中称为WI)。
图3A-3B显示了B5R基因中的示例性突变对示例性经修饰的痘苗病毒(WR.B5RmutTK-病毒)(在图3A和3B中称为B5R)在肿瘤中的复制的影响。图3A和图3B是量化病毒WR.TK-A34R K151E和B5R在体外噬斑测定中对于每克收集的肿瘤的噬斑形成能力(PFU/g)的图，在WR.TK-A34R K151E中，TK缺失，并且病毒A34R基因通过K151到E的氨基酸改变进行了突变(在图3A和3B中称为WI)。
图4显示了具有编码CXCR4或CCR5的外源核酸的示例性经修饰的痘苗病毒对肿瘤中萤光素酶的病毒表达的影响。该图通过在荷有正位(乳腺脂肪垫)4T1肿瘤的小鼠中的生物发光成像，量化了肿瘤中萤光素酶介导的光子强度。用单剂量的经修饰的痘苗病毒(其中TK基因缺失，并添加了编码小鼠CCR5的外源核酸)(mCCR5/TK-病毒)、经修饰的痘苗病毒(其中TK基因缺失，并添加了编码小鼠CXCR4的示例性外源核酸)(mCXCR4/TK-病毒)或TK-病毒(其中TK基因缺失)对小鼠进行了处理。所有病毒都被工程改造为表达萤光素酶。
图5A-5B显示了含有编码CXCR4或CCR5的外源核酸的示例性经修饰的痘苗病毒对肿瘤生长和动物存活的影响。图5A包括显示在荷有正位(乳腺脂肪垫)4T1肿瘤的小鼠中，相对肿瘤大小相对于植入后天数的图，这些小鼠用单剂量的经修饰的痘苗病毒(其中TK基因缺失，并添加了编码小鼠CCR5的外源核酸)(CCR5-病毒)、经修饰的痘苗病毒(其中TK基因缺失，并添加了编码小鼠CXCR4的示例性外源核酸)(CXCR4-病毒)或TK-病毒(其中TK基因缺失)处理。图5A还包括列出了每对比较的统计差异的图表。图5B显示了这些小鼠的存活曲线。
图6A-6B显示了编码CXCR4或CCR5的示例性外源核酸的表达对肿瘤中萤光素酶的病毒表达的影响。图6A是在荷有B16肿瘤的C57/BL6小鼠的生物发光成像过程中，量化肿瘤中萤光素酶介导的光子强度的图。用单剂量的经修饰的痘苗病毒(其中TK基因缺失，并添加了编码小鼠CCR5的外源核酸)(mCCR5/TK-病毒)、经修饰的痘苗病毒(其中TK基因缺失，并添加了编码小鼠CXCR4的示例性外源核酸)(mCXCR4/TK-病毒)或TK-病毒(其中TK基因缺失)对小鼠进行了处理。图6B是代表性图片，其显示了注射后第1天，用病毒处理的小鼠的生物发光成像的发光信号。所有病毒都被工程改造为表达萤光素酶。
图7显示了编码CXCR4或CCR5的示例性外源核酸的表达对肿瘤生长的影响。该图量化了相对于痘苗病毒处理后的天数，皮下荷有B16肿瘤的C57/BL6小鼠中的肿瘤体积。用单剂量的经修饰的痘苗病毒(其中TK基因缺失，并添加了编码小鼠CCR5的外源核酸)(mCCR5/TK-病毒)、经修饰的痘苗病毒(其中TK基因缺失，并添加了编码小鼠CXCR4的示例性外源核酸)(mCXCR4/TK-病毒)或TK-病毒(其中TK基因缺失)或PBS对小鼠进行了处理。
图8A-8D显示了编码CCR5的示例性外源核酸的表达对肿瘤中的病毒复制的影响。图8A和图8B中的图显示了分别从感染复数0.1(4T1-MOI0.1)和1(4T1-MOI1)开始，三种不同病毒(mCCR5/TK-病毒、mCXCR4/TK-病毒和TK-病毒)在肿瘤细胞系4T1中的噬斑形成能力的定量。图8C和图8D是类似的图，其显示了分别从MOI 0.1(B16-MOI0.1)和1(B16-MOI1)开始，三种不同病毒(mCCR5/TK-病毒、mCXCR4/TK-病毒和TK-病毒)在肿瘤细胞系B16中的噬斑形成能力的定量。
图9A-9C显示了在用具有编码CXCR4的示例性外源核酸的示例性经修饰的痘苗病毒处理的肿瘤中，B细胞消耗对萤光素酶的病毒表达增加的影响。图9A、图9B、图9C是分别对病毒注射后24小时、48小时和72小时测量的肿瘤中萤光素酶介导的光子强度进行定量的图。Balb/C小鼠是具有B细胞的野生型小鼠，而JH小鼠是B细胞耗竭的小鼠。向小鼠注射单剂量的经修饰的痘苗病毒(其中TK基因缺失，并添加了编码小鼠CCR5的外源核酸)(mCCR5/TK-病毒)、经修饰的痘苗病毒(其中TK基因缺失，并添加了编码小鼠CXCR4的示例性外源核酸)(mCXCR4/TK-病毒)或TK-病毒(其中TK基因缺失)。
图10A-10C显示了具有编码CXCR4的示例性外源核酸的示例性经修饰的痘苗病毒对肿瘤中的B细胞积累的影响。图10A、图10B和图10C是在荷有皮下4T1肿瘤的BALB/c小鼠中，分别对从脾脏、淋巴结(LN)和肿瘤收集的淋巴细胞中B细胞的百分比进行定量的图。用单剂量的经修饰的痘苗病毒(其中TK基因缺失，并添加了编码小鼠CXCR4的示例性外源核酸)(mCXCR4/TK-病毒)、TK-病毒(其中TK基因缺失)或PBS对小鼠进行了处理。
图11A-11B显示了具有编码CXCR4的示例性外源核酸的示例性经修饰的痘苗病毒对T细胞活化的影响。图11A和图11B是分别对T细胞响应于肿瘤细胞4T1裂解物和与肿瘤细胞4T1裂解物混合的灭活痘苗病毒(VV)的IFNγ释放进行定量的图。从荷有4T1肿瘤的小鼠收集T细胞，所述小鼠用单剂量的经修饰的痘苗病毒(其中TK基因缺失，并添加了编码小鼠CXCR4的示例性外源核酸)(mCXCR4/TK-病毒)或TK-病毒(其中TK基因缺失)或PBS进行了处理。14天后从脾脏中回收T细胞。
图12A-12B显示了具有编码透明质酸酶PH-20或基质金属蛋白酶MMP8的示例性外源核酸的示例性经修饰的痘苗病毒对肿瘤中萤光素酶的病毒表达的影响。图12A是代表性的图片，其显示了三只荷有RENCA肿瘤的BALB/c小鼠中的发光信号，这些小鼠分别用单剂量的未修饰的痘苗病毒(WR)、具有编码MMP8的示例性外源核酸的经修饰的痘苗病毒(WRMMP8)或具有编码PH-20的示例性外源核酸的经修饰的痘苗病毒(WR PH20病毒)进行了处理。图12B是量化病毒注射后第2天小鼠中的光子强度的图。
图13A-13B显示了具有编码透明质酸酶PH-20的示例性外源核酸的示例性经修饰的痘苗病毒的治疗效果。图13A是在用经修饰的痘苗病毒(其中TK基因缺失(TK-))或经修饰的痘苗病毒(其中TK基因缺失，并具有编码PH-20TK-PH20DCK病毒的示例性外源核酸)处理的荷有4T1肿瘤的BALB/c小鼠中，相对于病毒注射后的天数量化萤光素酶介导的光子强度的图。图13B是在用PBS、单独的吉西他滨、单独的TK-PH20 DCK病毒、单独的TK-病毒、TK-病毒联合吉西他滨或TK-PH20DCK病毒联合吉西他滨处理的小鼠中，相对于病毒注射后的天数量化相对肿瘤体积的图，而图13C则显示了这些小鼠的存活曲线。
图14显示了在病毒注射示例性经修饰的痘苗病毒后45天的治疗效果，该病毒具有以各种组合或单独地编码透明质酸酶PH-20和GMCSF的示例性外源核酸。该图量化了在经瘤内(IT)或静脉内(IV)用模拟对照、经修饰的痘苗病毒(其中TK基因缺失，并且具有编码PH-20的示例性外源核酸)(WR.TK-PH20病毒)(其中PH-20具有或不具有GPI锚)、经修饰的痘苗病毒(其中TK基因缺失，并且具有编码GMCSF的示例性外源核酸)(WR.TK-GMCSF)进行处理的小鼠中，在病毒注射后45天的肿瘤体积。
图15显示了具有经修饰的VH1基因的示例性经修饰的痘苗病毒对肿瘤生长的影响。该图量化了在经静脉内(IV)用模拟对照、经瘤内(IT)用经修饰的痘苗病毒(其中TK基因缺失，并具有编码GMCSF的示例性外源核酸)(WR.TK-GMCSF)或经瘤内用经修饰的痘苗病毒(其中TK基因缺失，并具有经修饰的VH1基因)(WR.TK-.VH1mut)处理的小鼠中，相对于肿瘤植入后的天数的相对肿瘤体积。
图16显示了缺失A52R并插入编码小鼠CXCR4的外源核酸对经修饰的痘苗病毒向肿瘤的递送的影响。皮下荷有RENCA肿瘤的BALB/c小鼠通过单次静脉内注射(1x 107PFU)四种经修饰的病毒之一进行处理。24小时后收获肿瘤，并通过qPCR量化每毫克组织的病毒基因组数目。
图17显示了缺失A52R且插入编码小鼠CXCR4的外源核酸的经修饰的痘苗病毒对肿瘤生长的影响。皮下荷有RENCA肿瘤的BALB/c小鼠通过在第1天和第4天静脉内注射(1x107PFU)相同四种经修饰的病毒之一进行处理，并且监测肿瘤体积。
图18A-18D显示，TK缺失并插入编码HysA或MMP8的外源核酸的经修饰的痘苗病毒感染MC38癌细胞的培养物，复制，扩散，并防止癌细胞的扩充。将MC38细胞以每孔5x 103个细胞的密度接种在96孔板中。次日，将细胞用不同的表达GFP的病毒以MOI为0.002进行感染，并使用IncuCyte进行成像，以测量相位汇合(phase confluence)(图18A)、GFP面积(GFParea)(图18B)、GFP强度(图18C)和病毒感染性(图18D)。
图19A-19D显示了TK缺失并插入编码HysA或MMP8的外源核酸的经修饰的痘苗病毒感染HCT116癌细胞的培养物，复制，扩散，并防止癌细胞的扩充。将HCT116细胞以每孔5x103个细胞的密度接种在96孔板中。次日，将细胞用不同的表达GFP的病毒以MOI为0.002进行感染，并使用IncuCyte进行成像，以测量相位汇合(图19A)、GFP面积(图19B)、GFP强度(图19C)和病毒感染性(图19D)。
图20显示了HysA的表达对经修饰的痘苗病毒向肿瘤的递送的影响。使用的病毒为：(i)TK-HysA修饰的病毒，(ii)TK-MMP8修饰的病毒，(iii)表达TK-PH20的经修饰的病毒，(iv)不添加外源酶的TK-修饰的病毒，和(v)媒介物配制的缓冲液(VFB)。皮下荷有RENCA肿瘤的BALB/c小鼠用单次静脉内注射(1x 107PFU)一种病毒进行处理。24小时后收获肿瘤，并通过qPCR量化每毫克组织的病毒基因组数目。
图21显示了缺失TK-且插入编码HysA、MMP8或PH20(在图21中标记为SPAM1)的外源核酸的经修饰的痘苗病毒对肿瘤生长的影响。皮下荷有RENCA肿瘤的BALB/c小鼠通过一次瘤内注射(1x 107PFU)TK-HysA、TK-MMP8、TK-PH20或TK-修饰的病毒进行处理，并且监测肿瘤体积。
图22A-22D显示，TK或A52R缺失并插入编码HysA的外源核酸的经修饰的痘苗病毒感染MC38和LLC癌细胞的培养物，复制，扩散，并防止癌细胞的扩充。将LLC或MC38细胞以每孔5x 103个细胞的密度接种在96孔板中。次日，将细胞用不同的表达GFP的病毒以MOI为1进行感染，并使用IncuCyte进行成像，以测量相位汇合(图22A和图22C)和GFP面积(图22B和图22D)。
图23显示，具有示例性突变以促进NK细胞活性的示例性痘苗病毒在鼠肿瘤模型中显示出增强的治疗效果。皮下荷有RENCA肿瘤的BALB/c小鼠通过单次瘤内注射(1x 108PFU)K7R-IL15+CCL5+、TK-LIGHT+或TK-GMCSF+进行处理。在处理后第34天对肿瘤体积进行定量。
图24显示，具有示例性突变以促进NK细胞活性的示例性痘苗病毒在鼠肿瘤模型中显示出增强的治疗效果。在另一个实验中，皮下荷有RENCA肿瘤的BALB/c小鼠用单次瘤内注射(1x 107PFU)TK-LIGHT+、TK-GMCSF+、TK-ITAC+fractalkine(CX3CL1)+、A52R-IL15+IL15A+、TK-ITAC+LIGHT+A52R-IL15+IL15A+或被称为VFB的媒介物配制的缓冲液进行处理，并随时间监测肿瘤体积。
图25A-25B显示，具有编码趋化因子受体和细胞外基质降解酶的示例性外源核酸的示例性痘苗病毒显示出在癌细胞之间扩散并杀死癌细胞。将LLC细胞以每孔5x 103个细胞的密度接种在96孔板中。次日，将细胞用不同的病毒以MOI为1进行感染，并使用IncuCyte进行成像，以测量相位汇合(图25A)和GFP面积(图25B)。
图26A-26D显示，具有示例性SCR1缺失的示例性经修饰的EEV高产痘苗病毒显示出在癌细胞之间扩散并杀死癌细胞。开发了经修饰的IHDJ病毒，其中EEV表面上的中和抗体结合位点(B5R SCR1)缺失(IHDJ-B5RcoΔSCR1)。将MC38或HCT116细胞以每孔5x 103个细胞的密度接种在96孔板中。次日，将细胞用不同的病毒以MOI为0.002进行感染，并使用IncuCyte进行成像，以测量相位汇合，如图26A(MC38细胞)和图26B(HCT116细胞)所示。图26C显示了噬斑测定的结果，其证明了IHDJ和IHDJ-B5RcoΔSCR1病毒在癌细胞之间扩散并杀死癌细胞的能力。图26D显示了彗尾测定的结果，其证明了WR IHDJ和IHDJ-B5RcoΔSCR1病毒在癌细胞之间扩散并杀死癌细胞的能力。
具体实施方式
虽然本文已经示出并描述了本公开的优选实施方案，但对于本领域技术人员明显的是，这些实施方案仅以示例的方式提供。在不脱离本公开的情况下，本领域技术人员现将想到许多变化、改变和替换。应当理解，在实施本公开中可以采用本文所述本公开的实施方案的各种替代方案。旨在以所附权利要求书限定本公开的范围，并且由此涵盖这些权利要求范围内的方法和结构及其等同物。
某些定义
本文使用的术语仅用于描述特定情况的目的，而非限制性的。除非上下文另有明确规定，否则如本文所用的单数形式“一个”、“一种”和“该”可包括复数形式。此外，就具体实施方式和/或权利要求书中使用的术语“含有”、“包括”、“包含”、“具有”或其变化形式而言，这些术语旨在以与术语“包含”类似的方式为包含性的。
术语“约”或“大约”可意指在本领域普通技术人员测定的特定值的可接受误差范围内，该可接受误差范围将部分取决于该值如何测量或测定，例如，测量系统的局限性。例如，根据给定值的实践，“约”可以表示在1个或大于1个标准差内。在本申请和权利要求书中描述特定值的情况下，除非另有说明，否则术语“约”应被认为意指该特定值的可接受误差范围，例如由术语“约”修饰的值的±10％。
术语“个体”、“患者”或“受试者”可互换使用。这些术语都不需要或局限于以卫生保健工作者(例如，医生、注册护士、从业护士、医师助理、护理员或临终关怀工作人员)的监护(例如，持续的或间歇的)为特征的情形。在一些实施方案中，患者、受试者或个体可以在医疗保健工作者的监督之下。
如本文所用的，与特定病毒相关的术语“异源核酸序列”或“外源核酸序列”或“转基因”可指源自除指定病毒之外的来源的核酸序列。
如本文所用的，术语“突变”可指缺失、异源核酸的插入、倒位或置换，包括本领域通常理解的消除突变的开放阅读框。
如本文所用的，术语“基因”可指编码单个蛋白质或RNA的核酸区段(也称为“编码序列”或“编码区”)，其任选地与相关联的调节区如启动子、操纵子、终止子等在一起，该调节区可以位于编码序列的上游或下游。
如在本文中可互换使用的，术语“突变病毒”和“经修饰的病毒”可指在其基因组中包含一个或多个突变的病毒，该突变包括但不限于缺失、异源核酸的插入、倒位、置换或其组合。
如本文关于病毒使用的术语“天然存在的”可表示该病毒可以在自然界中发现，即它可以从自然界中的来源分离并且未经有意修饰。
本文提及的术语“抑制”、“减少”或“防止”或这些术语的任何变化可包括任何可测量的减少或完全抑制以实现期望的结果。
如本文所用的，“启动子”可以是控制序列，该控制序列是控制转录起始和转录速率的核酸序列区域。在某些实施方案中，启动子可含有遗传元件，在此处调节蛋白质和分子可以结合，如RNA聚合酶和其他转录因子。术语“可操作地定位”、“可操作地连接”、“在控制下”和“在转录控制下”可意指启动子相对于核酸序列处于正确的功能位置和/或方向，以控制该序列的转录起始和/或表达。在某些实施方案中，启动子可以与或者可以不与“增强子”结合使用，“增强子”是指参与核酸序列的转录激活的顺式作用调节序列。
如本文所用的，术语“同源性”可以是两个或更多个核苷酸或氨基酸序列之间的“同源性”或“同源性百分比”的计算，其可以通过为了最佳比较目的而对序列进行比对来确定(例如，可以在第一序列的序列中引入空位)。然后可以比较相应位置处的核苷酸，并且两个序列之间的同一性百分比可以是序列共有的相同位置数目的函数(即，％同源性＝相同位置的数目/位置的总数目x 100)。例如，如果第一序列中的位置可以被与第二序列中的相应位置相同的核苷酸占据，则分子在该位置处是相同的。两个序列之间的同源性百分比可以是序列共有的相同位置的数目的函数，其中考虑为了两个序列的最佳比对而需要引入的空位的数目和每个空位的长度。在一些实施方案中，为了比较目的而比对的序列的长度可以是参考序列长度的至少约：30％、40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或95％。
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搜索可以确定两个序列之间的同源性。同源性可以在两个序列的整个长度之间或在两个序列的整个长度的部分之间。这两个序列可以是基因、核苷酸序列、蛋白质序列、肽序列、氨基酸序列或其片段。两个序列的实际比较可以通过公知的方法来完成，例如，使用数学算法。这样的数学算法的非限制性实例可描述于Karlin,S.和Altschul,S.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90-5873-5877(1993)中。如Altschul,S.等人,Nucleic Acids Res.,25:3389-3402(1997)中所述，这样的算法可以并入NBLAST和XBLAST程序(2.0版)中。当使用BLAST和Gapped BLAST程序时，可以使用相应程序(例如，NBLAST)的任何相关参数。例如，用于序列比较的参数可以设置为得分＝100，字长＝12，或者可以变化(例如，W＝5或W＝20)。其他实例包括Myers和Miller,CABIOS(1989)的算法、ADVANCE、ADAM、BLAT和FASTA。在另一个实施方案中，两个氨基酸序列之间的同一性百分比可以使用例如GCG软件包(Accelrys,Cambridge,UK)中的GAP程序来完成。
术语“受试者”可指动物，包括但不限于灵长类(例如，人)、牛、绵羊、山羊、马、狗、猫、兔、大鼠或小鼠。术语“受试者”和“患者”在本文中提及例如哺乳动物受试者如人类受试者时可互换使用。
术语“治疗”和“处理”可意在包括减轻或消除病症、疾病或病况，或一种或多种与该病症、疾病或病况相关的症状；或减轻或根除该病症、疾病或病况的病因本身。治疗的理想效果可包括但不限于预防疾病的发生或复发、减轻症状、减少疾病的任何直接或间接的病理后果、预防转移、降低疾病进展的速度、改善或缓和疾病状态，以及缓解或预后改善。
术语“治疗有效量”可指当施用时，可能足以防止所治疗的病症、疾病或病况的一种或多种症状的发展或将其减轻一定程度的化合物的量。术语“治疗有效量”还可指足以引发研究者、兽医、医生或临床医师所寻找的细胞、组织、系统、动物或人的生物学或医学反应的化合物的量。
术语“药学上可接受的载体”、“药学上可接受的赋形剂”、“生理学上可接受的载体”或“生理学上可接受的赋形剂”可指药学上可接受的材料、组合物或媒介物，如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂或包封材料。在与药物制剂的其他成分相容的意义上来讲，组分可以是“药学上可接受的”。它还适合与人和动物的组织或器官接触使用，而没有过度的毒性、刺激、变态反应、免疫原性或其他问题或并发症，对应合理的受益/风险比。参见Remington:The Science and Practice of Pharmacy,第21版；Lippincott Williams&Wilkins:Philadelphia,PA,2005；Handbook of Pharmaceutical Excipients,第5版；Rowe等人编著,The Pharmaceutical Press and the American PharmaceuticalAssociation:2005；和Handbook of Pharmaceutical Additives,第3版；Ash and Ash编著,Gower Publishing Company:2007；Pharmaceutical Preformulation andFormulation,Gibson编著,CRC Press LLC:Boca Raton,FL,2004。
术语“药物组合物”可指本文公开的化合物与其他化学组分如稀释剂或载体的混合物。该药物组合物可以有助于将该化合物施用于生物体。本领域存在多种施用化合物的技术，包括但不限于口服、注射、气雾剂、肠胃外和局部施用。药物组合物还可以通过使化合物与诸如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸、水杨酸等无机酸或有机酸反应来获得。
如本文所用的，“抗癌剂”可指能够负面地影响受试者中的癌症的药剂或疗法，例如，通过杀死癌细胞、诱导癌细胞中的凋亡、降低癌细胞的生长速率、减少转移的发生率或次数、减小肿瘤大小、抑制肿瘤生长、减少对肿瘤或癌细胞的血液供应、促进针对癌细胞或肿瘤的免疫应答、预防或抑制癌症的进展或延长患有癌症的受试者的寿命。抗癌剂的非限制性实例可包括生物制剂(生物疗法)、化疗剂和放疗剂。
如本文所用的，术语“溶瘤”可指由药剂，如溶瘤痘病毒，如溶瘤痘苗病毒，来杀死癌细胞或肿瘤细胞，例如，该杀死是通过经由刺激针对所述细胞的免疫应答、凋亡、表达毒性蛋白质、自噬和停止蛋白质合成、诱导抗肿瘤免疫或其任意组合来直接裂解所述细胞。由药剂如溶瘤痘苗病毒感染的癌细胞或肿瘤细胞的直接裂解可以是该病毒在所述细胞内的复制的结果。在某些实例中，术语“溶瘤”可指在不裂解所述细胞的情况下杀死癌细胞或肿瘤细胞。
如本文所用的术语“溶瘤病毒”可指优先感染并杀死肿瘤细胞的病毒。在某些非限制性情况下，应当理解，溶瘤病毒可通过双重机制促进抗肿瘤应答，所述双重机制不仅依赖于肿瘤细胞的选择性杀伤，而且还依赖于宿主抗肿瘤免疫应答的刺激。
在一些实施方案中，溶瘤病毒可以包括但不限于：(i)优先在癌细胞中自然复制并且通常由于对先天抗病毒信号转导的敏感性提高或对致癌信号转导途径的依赖性而在人类中不致病的病毒；和(ii)经过遗传操作以供使用的病毒。在一些实施方案中，所述溶瘤病毒可以是麻疹病毒、脊髓灰质炎病毒、痘病毒、痘苗病毒、腺病毒、腺相关病毒、单纯疱疹病毒、水疱性口炎病毒、呼肠孤病毒、新城疫病毒、塞内卡病毒、慢病毒、门哥病毒或粘液瘤病毒。在某些实施方案中，所述溶瘤病毒可以是痘病毒。在某些实施方案中，所述溶瘤病毒可以是痘苗病毒。
如本文所用的，术语“经修饰的溶瘤病毒”可指包含对其成分的修饰的溶瘤病毒，该修饰例如是但不限于病毒的天然基因组(“骨架”)中的修饰，如病毒基因的突变或缺失，外源核酸的引入，病毒核酸或病毒蛋白质的化学修饰，以及外源蛋白质或经修饰的病毒蛋白质向病毒衣壳的引入。通常，溶瘤病毒可以被修饰(也被称为“工程化”)以便获得针对肿瘤细胞的改善的治疗效果。在某些实施方案中，所述经修饰的溶瘤病毒可以是经修饰的痘病毒。在某些实施方案中，所述经修饰的溶瘤病毒可以是经修饰的痘病毒。
在本文中可互换使用的术语“全身递送”和“全身施用”在一些情况下可指将药物、溶瘤病毒或其他物质施用至循环系统内的途径。所述全身施用可包括口服施用、肠胃外施用、鼻内施用、舌下施用、直肠施用、透皮施用或其任意组合。
经修饰的溶瘤病毒
在一些实施方案中，本文提供了可以具有一个或多个修饰的经修饰的溶瘤病毒，与其他方面相同但不含该修饰的病毒相比，所述修饰可以导致针对肿瘤细胞的更好的治疗效果。更好的治疗效果的一些非限制性实例可以包括以下每一种或任意组合：病毒增强的免疫逃逸，病毒增强的肿瘤靶向全身递送，病毒增强的肿瘤内和肿瘤间扩散，以及病毒增强的肿瘤特异性复制。在一些情况下，本公开的经修饰的溶瘤病毒可用作用于全身递送的平台载体。
本文提供了具有一个或多个修饰的经修饰的溶瘤病毒，在一些实施方案中，所述修饰可导致病毒增强的免疫逃逸，病毒增强的肿瘤靶向全身递送，病毒增强的肿瘤内和肿瘤间扩散，以及病毒增强的肿瘤特异性复制。
在本公开的一些实施方案中，提供了经修饰的溶瘤病毒，其包含可以增强该病毒的免疫逃避的修饰。病毒感染经常可以诱导宿主体针对病毒侵入的免疫应答，因此，该免疫应答可以消耗已接种的病毒，或者削弱病毒在治疗环境中预期对肿瘤细胞产生的毒性作用。因此，适当的免疫逃避可以显著提高溶瘤病毒在治疗性应用中的功效。
在本公开的一些实施方案中，提供了经修饰的溶瘤病毒，其包含可以增强该病毒的肿瘤靶向全身递送的修饰。通常，溶瘤病毒可以(a)全身施用或(b)局部接种在肿瘤上，或者在许多情况下，直接注射到肿瘤中(“瘤内递送”)。相信溶瘤病毒的全身递送可提供同时治疗原发性肿瘤和任何明显或未诊断的转移性沉积物的机会。因此，该递送方法可能是治疗晚期/转移性疾病患者或病变不可及的患者如胰腺癌或脑癌患者的极具吸引力的选择，这些病变例如由于生理屏障如血脑屏障而难以接近。然而，许多溶瘤病毒在成功全身递送方面可能存在障碍。例如，在一些情况下，如上所述，宿主防御限制了大多数溶瘤病毒在全身施用后感染肿瘤的能力。血细胞、补体、抗体和抗病毒细胞因子，以及其他组织如肺、肝和脾的非特异性摄取，组织驻留的巨噬细胞，以及病毒从血管区室的逃逸不佳，是溶瘤病毒全身递送的主要障碍。为了有效地全身施用，在许多情况下，溶瘤病毒可能需要在循环中持续存在，而不会消耗或降解，同时选择性感染肿瘤细胞。在本公开的一些实施方案中，所公开的溶瘤病毒可包含修饰，该修饰可以至少通过如上所述增强免疫逃避来促进病毒在循环系统中的持久存在。另一方面，在某些情况下，病毒增强的肿瘤靶向递送也可能是理想的，因为它不仅可以提高针对癌症的治疗效果，而且还可以由于可以限制非肿瘤感染而减轻关于病毒介导的肿瘤治疗的安全性担心，从而避免病毒感染的不希望的副作用。本文的某些实施方案涉及这样的溶瘤病毒，其包含可促进该病毒的肿瘤靶向递送的修饰。
在本公开的一些实施方案中，提供了经修饰的溶瘤病毒，其包含可以增强该病毒的肿瘤内和肿瘤间扩散的修饰。溶瘤病毒在肿瘤内和肿瘤间的增强扩散可能是通过增加被病毒感染的癌细胞数目来提高治疗功效的有效方式。
在本公开的一些实施方案中，提供了经修饰的溶瘤病毒，其包含可以增强该病毒的肿瘤特异性复制的修饰。通过增强溶瘤病毒在肿瘤细胞中的选择性复制，可以改善溶瘤病毒的治疗性应用的安全性和有效性。
在一些实施方案中，本文提供了经修饰的溶瘤病毒，其可以包含外源核酸。在一些实施方案中，本文提供了经修饰的溶瘤病毒，其可以在病毒的基因组中包含修饰。在一些实施方案中，本文提供了经修饰的溶瘤病毒，其可以包含外源核酸并且在病毒的基因组中包含修饰。
外源核酸
在一些实施方案中，本文提供了经修饰的溶瘤病毒，其包含可编码趋化因子受体的外源核酸，在本文中也称为转基因。在一些情况下，该外源核酸可以是治疗性转基因。在一些实施方案中，本文提供了经修饰的溶瘤病毒，其包含可编码膜结合蛋白的外源核酸，该膜结合蛋白可以降解透明质酸，如透明质酸酶。在一些实施方案中，本文提供了经修饰的溶瘤病毒，其包含可编码趋化因子受体和透明质酸酶的外源核酸。
趋化因子是趋化性细胞因子，其通过激活七跨膜趋化因子受体来调节细胞的运输和定位。在一些情况下，根据前两个N端半胱氨酸残基的位置，趋化因子可分为四个亚家族，包括CC、CXC、CX3C和XC亚家族。趋化因子受体在白细胞上的差异表达可导致特定细胞类型在特定条件下的选择性募集，从而提供适合感染病原体或外来伤害的适当而有效的免疫应答。在许多情况下，趋化因子除了在免疫细胞向炎症部位的协同迁移中起关键作用外，还可以在淋巴组织的发育、免疫细胞的成熟以及适应性免疫应答的产生和传递中起重要作用。
肿瘤越来越被认为是由许多不同细胞类型组成的复杂微环境，它们共同存在并在复杂的信号传导网络中相互通信。趋化因子是细胞迁移和细胞间相互作用的重要协调物，因此对肿瘤的发展有很大影响。在肿瘤微环境中，与肿瘤相关的宿主细胞和癌细胞释放一系列不同的趋化因子，从而导致不同细胞类型的募集和活化，从而介导抗肿瘤与促肿瘤反应之间的平衡。除了它们作为化学引诱物的主要作用外，趋化因子在许多情况下还参与其他与肿瘤相关的过程，包括肿瘤细胞生长、血管生成和转移。
肿瘤细胞已显示出获得产生促进生长的趋化因子的能力。例如，已经发现黑素瘤表达许多趋化因子，包括CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL8、CCL2和CCL5，它们与肿瘤生长和进展有关。在从人类患者中分离出的神经母细胞瘤细胞系和原发性肿瘤细胞中可发现CCL2水平升高。免疫染色研究还提示CXCL12在多种癌症中的表达水平升高，这些癌症包括乳腺癌、类癌、宫颈癌、结直肠癌、子宫内膜癌、肝癌、肺癌、淋巴瘤、黑素瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、胃癌。
趋化因子受体是与趋化因子相互作用的在某些细胞表面上发现的细胞因子受体。在人类中已经发现了20种不同的趋化因子受体。每种具有7跨膜结构，并与G蛋白偶联以供在细胞内进行信号转导，使其成为G蛋白偶联受体的大蛋白质家族的成员。在与它们的特定趋化因子配体相互作用之后，趋化因子受体可以触发细胞内钙(Ca2+)离子的流出(钙信号传导)。这可以导致细胞应答，包括被称为趋化性的过程的开始，该过程将细胞运输到生物体内的所需位置。通常，如本文所用的术语“趋化因子受体”可指膜结合蛋白，其选择性结合趋化因子配体并诱导朝向趋化因子配体的趋化性。
应当理解，本文公开的趋化因子受体在一些情况下不仅可指在人体中鉴定出的天然存在的趋化因子受体，而且包括来自其他来源的趋化因子受体，例如但不限于：(1)在动物如猪、狗、牛、绵羊中鉴定出的天然存在的趋化因子受体；(2)非天然存在的趋化因子受体，如突变蛋白质、嵌合受体、对某些类型的趋化因子具有结合亲和力的设计蛋白质。在一些实例中，如果在天然存在的趋化因子受体的片段中保留结合并响应相应趋化因子并指导细胞趋化性的功能，则该片段也可以被认为是趋化因子受体。如本文提供的，在一些实施方案中，当病毒劫持宿主细胞的基因表达机器时，包含编码趋化因子受体的外源核酸的病毒可迫使病毒感染的细胞表达趋化因子受体。
在一些情况下，经修饰的溶瘤病毒可包含外源核酸，该外源核酸可编码其同源细胞因子可在肿瘤微环境中表达的细胞因子受体(例如，IL15-R可具有在肿瘤微环境中表达的同源细胞因子IL15)。在某些情况下，经修饰的溶瘤病毒可以表达其同源趋化因子可能在肿瘤上表达的选定趋化因子受体(例如，CXCR4可以在肿瘤上表达同源趋化因子CXCL12；CCR2可以在肿瘤上表达目标CCL2)，并且可以作为裸病毒全身递送。在经修饰的溶瘤病毒通过全身递送进入血流后，该病毒可以感染淋巴细胞，如B细胞，并且可以将感染的B细胞重新引导至肿瘤，从而导致肿瘤中的病毒载量显著增加。在某些实施方案中，可以在全身递送后不久实现肿瘤中病毒载量的增加。以全身方式递送本文公开的经修饰的溶瘤病毒的能力可以提供优于溶瘤病毒的传统瘤内递送方法的优点。尽管瘤内递送可以有助于治疗容易接近的肿瘤，但在一些情况下，治疗难以接近的或转移性的癌症至关重要，据称这类癌症是疾病死亡的主要原因。在这种情况下，依靠瘤内递送的溶瘤病毒可能是无效的，因为在施用至远端部位后需要全身传播。然而，这种传播通常可能是短暂的和无效的，至少部分是由于对病毒感染的免疫应答的发展。
趋化因子受体可分为不同的家族。如本文所述，趋化因子受体的非限制性实例可包括CXC趋化因子受体、CC趋化因子受体、CX3C趋化因子受体和XC趋化因子受体，它们对应于它们所结合的趋化因子的4个不同的亚家族。在CXC趋化因子受体中，CXCR1和CXCR2密切相关，而CXCR1与CXCL8和CXCL6结合，CXCR2与CXCL1和CXCL7结合；CXCR3与CXCL9、CXCL10和CXCL11结合；CXCR4与CXCL12(或SDF-1)结合；CXCR5与CXCL13结合；CXCR6与CXCL16结合。在CC趋化因子受体中，CCR1的配体包括CCL4、CCL5、CCL6、CCL14、CCL15、CCL16、CCL23；CCR2的配体包括CCL2、CCL8和CCL16；CCR3的配体包括CCL11、CCL26、CCL7、CCL13、CCL15、CCL24、CCL5、CCL28和CCL18；CCR4的配体包括CCL3、CCL5、CCL17和CCL22；CCR5的配体包括CCL3、CCL4、CCL5、CCL8、CCL11、CCL13、CCL14和CCL16；CCR6的配体包括CCL20；CCR7的配体包括CCL19和CCL21。CX3C趋化因子受体CX3CR1具有配体CXCL1。XC趋化因子受体XCR1与XCL1和XCL2均结合。
本公开的非限制性实施方案提供了经修饰的溶瘤病毒，其包含可以编码趋化因子受体的外源核酸。在一些实施方案中，该趋化因子受体可以是CXC趋化因子受体、CC趋化因子受体、CX3C趋化因子受体、XC趋化因子受体或其任意组合。在一些实施方案中，该趋化因子受体可以是CXCR1、CXCR2、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR5、CXCR6、CXCR7、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CX3CR1、XCR1或其任意组合。
在某些实施方案中，经修饰的溶瘤病毒包含表达CXCR4的外源核酸。在某些实施方案中，经修饰的溶瘤病毒包含表达CCR2的外源核酸。某些实施方案公开了经修饰的溶瘤病毒，其包含同时编码CXCR4和CCR2的外源核酸，并且这两种趋化因子均从同一病毒表达。在某些情况下，通常在肿瘤微环境中表达的CXCL12和/或CCL2可吸引被经修饰的溶瘤病毒感染的表达CXCR4和/或CCR2的淋巴细胞或其他迁移细胞，从而增强经修饰的溶瘤病毒的肿瘤靶向递送。
在一些实施方案中，溶瘤病毒的修饰可导致与其他方面相同但不包含该修饰的溶瘤病毒相比，病毒的肿瘤靶向全身递送功效增加至少约1.1、1.2、1.5、1.8、2、2.2、2.5、2.8、3、3.2、3.5、3.8、4、4.2、4.5、4.8、5、5.2、5.5、5.8、6、6.2、6.5、6.8、7、7.2、7.5、7.8、8、8.2、8.5、8.8、9、9.2、9.5、9.8、10、12、14、15、16、18、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、250、500、800、1000、2500、5000、104、2.5x 104、5x 104、7.5x104、2.5x105、5x105、7.5x105、106、2.5x106、5x106、7.5x106、107、2.5x 107、5x 107、7.5x 107、108、2.5x108、5x108、7.5x108、109、2.5x 109、5x109、7.5x 109、1010倍或甚至更多倍。在某些实施方案中，可以通过量化感染肿瘤细胞的病毒，并且任选地，与感染体内非肿瘤细胞的病毒相比较，来测量该病毒的肿瘤靶向全身递送的功效。例如，在一些情况下，可以通过对组织切片中的病毒颗粒进行染色或在白血病、淋巴瘤或骨髓瘤的情况下对血涂片进行染色来进行病毒的定量。在一些情况下，这样的定量可以通过被工程改造为由病毒表达的报告分子例如萤光素酶和荧光蛋白来进行。在一些情况下，这样的定量可以通过量化肿瘤中的病毒基因组来进行。非限制性地，还可以通过量化肿瘤细胞中病毒感染的某些下游效应，例如响应于病毒感染的细胞因子或淋巴细胞积累，来测量病毒的肿瘤靶向全身递送。在一些实施方案中，溶瘤病毒包含可编码CXCR4、CCR2或两者的外源核酸，并且该外源核酸的存在可导致与其他方面相同但不包含该外源核酸的溶瘤病毒相比，病毒的肿瘤靶向全身递送功效增加约5至10倍。
在一些实施方案中，本文提供了经修饰的溶瘤病毒，其包含可以编码趋化因子受体的外源核酸，并且经修饰的溶瘤病毒对趋化因子受体的强制表达可以导致针对感染的肿瘤的免疫应答增强。感染肿瘤后，经修饰的溶瘤病毒可在肿瘤细胞中复制，并导致趋化因子受体在肿瘤细胞表面上的表达。这些膜受体可以充当诱饵受体，结合并隔离肿瘤内的免疫抑制趋化因子(例如，CXCL12和/或CCL2)。因此，与其他方面相同但不包含编码该趋化因子受体的核酸的病毒相比，可以改变肿瘤中的免疫抑制微环境，从而导致经修饰的溶瘤病毒的免疫治疗活性增强。在一些实施方案中，该免疫治疗活性的增加可以是至少约1.1、1.1、1.2、1.5、1.8、2、2.2、2.5、2.8、3、3.2、3.5、3.8、4、4.2、4.5、4.8、5、5.2、5.5、5.8、6、6.2、6.5、6.8、7、7.2、7.5、7.8、8、8.2、8.5、8.8、9、9.2、9.5、9.8、10、12、14、15、16、18、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、250、500、800、1000、2500、5000、104、2.5x 104、5x 104、7.5x 104、2.5x 105、5x 105、106倍或甚至更多倍。非限制性地，增加的免疫治疗活性可以通过肿瘤中增加的B细胞积累、增加的对肿瘤相关免疫原的T细胞应答或两者来反映出来。例如，B细胞积累可以通过量化肿瘤中的B细胞来测量，而T细胞免疫活性可以通过例如ELISPOT测定中的干扰素-γ(干扰素-gamma)分泌来测量。
在一些实施方案中，本文提供了经修饰的溶瘤病毒，其包含可以编码趋化因子受体的外源核酸，并且经修饰的溶瘤病毒对趋化因子受体的强制表达可以导致与其他方面相同但不包含编码该趋化因子受体的核酸的病毒相比，病毒在肿瘤细胞中的复制增加。在某些实施方案中，经修饰的溶瘤病毒可包含表达CCR2的外源核酸，其可以增加病毒的肿瘤特异性复制。在一些实施方案中，经修饰的溶瘤病毒可包含表达CCR5的外源核酸，其可以增加病毒的肿瘤特异性复制。在一些实施方案中，该肿瘤特异性复制的增加可以是至少约1.1、1.1、1.2、1.5、1.8、2、2.2、2.5、2.8、3、3.2、3.5、3.8、4、4.2、4.5、4.8、5、5.2、5.5、5.8、6、6.2、6.5、6.8、7、7.2、7.5、7.8、8、8.2、8.5、8.8、9、9.2、9.5、9.8、10、12、14、15、16、18、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、250、500、800、1000、2500、5000、104、2.5x 104、5x 104、7.5x 104、2.5x 105、5x 105、106倍或甚至更多倍。用于测量病毒递送和在肿瘤中的扩散增加的示例性方法可以包括但不限于报告基因表达的基于荧光或生物发光的成像，用于检测病毒基因组的肿瘤浓度的定量PCR，或噬菌斑形成单位的噬斑确定或病毒蛋白质的免疫组化。
在一些实施方案中，经修饰的溶瘤病毒包含可编码作为嵌合蛋白的趋化因子受体的外源核酸。其胞外域的至少一部分可以来自促进病毒的肿瘤靶向递送的趋化因子受体，并且其胞内域的至少一部分可以来自促进肿瘤特异性复制、抑制免疫抑制活性或提供其他一些有益效果的趋化因子受体，反之亦然。例如，经修饰的溶瘤病毒可包含编码具有CCR5的胞内GTP酶结构域和CXCR4或CCR2的胞外趋化因子结合域的蛋白质的核酸。在一些情况下，通过组合具有不同功能性的结构域，可以进一步实现经修饰的溶瘤病毒的治疗性能的改善。本公开的一个实施方案是，经修饰的溶瘤病毒可包含可编码至少一种趋化因子受体的外源核酸。在一些情况下，经修饰的溶瘤病毒可包含可编码两种或更多种不同趋化因子受体的外源核酸，所述趋化因子受体可被病毒同时表达。可从本文所述的经修饰的溶瘤病毒同时表达的示例性趋化因子受体可包括CXCR4和CCR2。在表达超过一种趋化因子受体的经修饰的溶瘤病毒中，就溶瘤病毒的治疗性应用而言，可以实现针对肿瘤细胞的组合或协同效应。
溶瘤病毒的治疗效果通常可受其在实体瘤内和实体瘤之间无效扩散的限制，至少部分原因是肿瘤中存在大量的细胞外基质(ECM)和高组织液压力(IFP)。本公开的某些实施方案涉及经修饰的溶瘤病毒，其包含可以编码降解肿瘤的ECM的蛋白质的外源核酸。可以降解ECM的示例性蛋白质可以是膜结合蛋白。在一些情况下，膜结合蛋白可包含糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚。
透明质酸(HA)是ECM的重要结构元素，是由重复的二糖单元组成的高分子量直链糖胺聚糖。它可以广泛分布在结缔组织、上皮组织和神经组织中，并且其表达水平可以在许多类型的肿瘤中显著升高。透明质酸酶是催化HA降解的酶家族。迄今为止在人类中鉴定出至少五种功能性透明质酸酶：HYAL1、HYAL2、HYAL3、HYAL4和HYAL5(也称为PH-20或SPAM1)，其中PH-20是迄今为止已知的唯一在相对中性pH下起作用的酶。在本公开的一些实施方案中，将透明质酸酶与其他肿瘤靶向治疗剂(如转基因，在本文中也称为外源核酸)组合可以至少通过减少ECM并增强治疗剂在肿瘤内和肿瘤之间的转运来促进经修饰的溶瘤病毒的治疗效果。
本文的一些实施方案公开了经修饰的溶瘤病毒，其可包含编码膜结合蛋白的外源核酸，该膜结合蛋白能够降解透明质酸，如透明质酸酶。应当注意，如本文所用的术语“透明质酸酶”可指催化肿瘤中HA的降解的任何酶或其片段，包括但不限于PH-20及其来自其他物种的同源物，以及其他具有类似酶功能的工程化/设计蛋白质。如本文所用的，透明质酸酶可指一类透明质酸降解酶。透明质酸酶可包括细菌透明质酸酶(EC4.2.2.1或EC4.2.99.1)，来自水蛭、其他寄生虫和甲壳类的透明质酸酶(EC 3.2.1.36)，以及哺乳动物型透明质酸酶(EC 3.2.1.35)。透明质酸酶可以是任何非人类来源的，包括但不限于鼠、犬、猫、兔、禽类、牛、绵羊、猪、马、鱼、蛙、细菌，以及来自水蛭、其他寄生虫和甲壳类的任何动物。示例性的非人类透明质酸酶包括来自牛、黄蜂(yellow jacket wasp)、蜜蜂、白脸大黄蜂、胡蜂、小鼠、猪、大鼠、兔、绵羊、黑猩猩、恒河猴、猩猩、食蟹猴、豚鼠、节杆菌(Arthrobacter sp.)(菌株FB24)、食菌蛭弧菌(Bdellovibrio bacteriovorus)、疮疱丙酸杆菌(Propionibacterium acnes)、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)；菌株MRSA252、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、猪链球菌(Streptococcussuis)、费氏弧菌(Vibriofischeri)和Streptomyces hyaluronolyticus透明质酸酶的透明质酸酶，这些酶对透明质酸具有特异性，并且不会裂解软骨素或硫酸软骨素。
在一些实施方案中，所述经修饰的溶瘤病毒可包含可以编码PH-20的外源核酸。在一些实施方案中，所述经修饰的溶瘤病毒可包含可编码PH-20的外源核酸，其中该PH-20可包括GPI锚。在一些实施方案中，所述经修饰的溶瘤病毒可包含可编码PH-20的外源核酸，其中该PH-20可缺乏GPI锚。GPI可以充当蛋白质在细胞膜上的锚，因此，通常，含GPI的PH-20可以锚定到细胞膜上，而不具有GPI的PH-20可以是分泌形式。
在一些实施方案中，PH-20的示例性氨基酸序列可以是SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:130，或可以与SEQ ID NO:36或SEQ ID NO:130约70％、约75％、约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％相同的序列。
本公开确定，C端GPI锚的保留出乎意料地改善了表达含GPI锚的PH-20的溶瘤病毒在肿瘤微环境内的扩散。在一些实例中，与其他方面相同但可包含可编码缺少GPI锚的PH-20的外源核酸的病毒相比，包含可编码GPI锚定PH-20的外源核酸的经修饰的溶瘤病毒可出乎意料地降解肿瘤ECM，并更大程度地促进病毒扩散。在一些其他实施方案中，经修饰的溶瘤病毒可包含可编码GPI锚定的PH-20和无GPI锚的分泌性PH-20的核酸。
在一些情况下，从经修饰的溶瘤痘苗病毒表达GPI锚定的PH-20可具有以下至少一种作用：(i)PH-20可以并入EEV外壳中，从而可以允许EEV更有效地扩散，(ii)病毒感染可导致受感染细胞的移动，如果它们在其表面上表达PH20，则可以得到增强。本公开的一些实施方案确定，不含GPI锚的PH-20的分泌形式在促进EEV形式的病毒的产生中可能活性较低。
在一些实施方案中，至少一些编码透明质酸酶的核酸可以来源于人类以外的其他来源。不同物种中的透明质酸酶可以以不同的方式、不同的效率及其组合来水解肿瘤HA。本文的一些实施方案涉及经修饰的溶瘤病毒，其可包含编码来自不同物种的多种透明质酸酶的外源核酸。该组合可以提供更大的ECM降解能力，随后导致增强的治疗效果。
在一些实施方案中，所述溶瘤病毒可包含可以编码微生物来源的透明质酸酶的外源核酸。在一些实例中，微生物来源的透明质酸酶可以是来自金黄色葡萄球菌的HysA、来自Loxosceles intermedia的Lin、来自Streptomyceskoganeiensis的sko、来自结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)的rv。在一些实例中，微生物来源的透明质酸酶可以是分泌的透明质酸酶。在一些实例中，外源核酸hysA可包含如GenBank:CP020020.1所示的序列(金黄色葡萄球菌金黄色亚种，菌株ATCC 6538，染色体，完整基因组)，核苷酸范围：2244602至2250899)。在一些情况下，外源核酸hysA可以编码包含如SEQ ID NO:122所示的氨基酸序列的蛋白质。在一些情况下，外源核酸hysA可以编码包含如UniProtKB登录号Q59801(HYAS_STAA8)(SEQ ID NO:123)所示的氨基酸序列的蛋白质。在一些实施方案中，分泌的透明质酸酶如HysA的表达增强了如本文所述的经修饰的溶瘤病毒的复制、扩散、治疗活性(例如，癌细胞杀伤潜力)。在一些情况下，外源核酸lin可以编码包含如SEQ ID NO:124或SEQ ID NO:127所示的氨基酸序列的蛋白质。在一些情况下，外源核酸rv可以编码包含如SEQ ID NO:125或SEQ ID NO:128所示的氨基酸序列的蛋白质。在一些情况下，外源核酸sko可以编码包含如SEQ ID NO:126或SEQ ID NO:129所示的氨基酸序列的蛋白质。在一些实施方案中，微生物透明质酸酶的示例性氨基酸序列可以是SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:123、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:125、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:127、SEQ ID NO:128或SEQ ID NO:129，或可以与SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:123、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:125、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:127、SEQ ID NO:128或SEQ ID NO:129约70％、约75％、约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％相同的序列。
此外，在一些实施方案中，所述经修饰的溶瘤病毒可包含可以编码透明质酸酶和基质金属蛋白酶两者的外源核酸。总体而言，基质金属蛋白酶能够降解所有种类的ECM蛋白。基质金属蛋白酶的添加可以进一步增强ECM降解效果并促进病毒扩散。基质金属蛋白酶的一个实例可以是MMP8。其他实例可以包括但不限于MMP1、MMP2、MMP3、MMP7、MMP9、MMP10、MMP11、MMP12、MMP13、MMP14、MMP15、MMP17、MMP18、MMP19、MMP20、MMP21、MMP23A、MMP23B、MMP24、MMP25、MMP26、MMP27和MMP28。
在一些实施方案中，与其他方面相同但不包含编码透明质酸酶的核酸的病毒相比，包含可编码透明质酸酶的核酸的经修饰的溶瘤病毒可具有增加的病毒在肿瘤中和肿瘤之间的扩散。在一些实施方案中，这种增加可以是至少约1.1、1.1、1.2、1.5、1.8、2、2.2、2.5、2.8、3、3.2、3.5、3.8、4、4.2、4.5、4.8、5、5.2、5.5、5.8、6、6.2、6.5、6.8、7、7.2、7.5、7.8、8、8.2、8.5、8.8、9、9.2、9.5、9.8、10、12、14、15、16、18、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、250、500、800、1000、2500、5000、104、2.5x 104、5x104、7.5x 104、2.5x 105、5x 105、106倍或甚至更多倍。在某些实施方案中，经修饰的溶瘤病毒包含编码PH-20的外源核酸，并且与其他方面相同但不包含编码PH-20的核酸的病毒相比，在肿瘤内的病毒扩散可以增加至少约100倍。用于测量病毒扩散增加的示例性方法可以包括但不限于报告基因表达的基于荧光或生物发光的成像、用于检测病毒基因组的肿瘤浓度的定量PCR或噬菌斑形成单位的噬斑确定或病毒蛋白质的免疫组化。
VH1是一种病毒蛋白质，被鉴定为针对含磷酸丝氨酸和磷酸酪氨酸的底物的双重特异性磷酸酶。特别地，VH1可以至少部分地通过减少抗原呈递来抑制STAT1的磷酸化和核易位，STAT1是对许多免疫因子如干扰素α和干扰素γ具有反应性的转录因子，抑制对病毒感染的细胞的免疫应答。由病毒表达的更具活性的VH1可对病毒感染的细胞具有更好的免疫抑制效果。
在一些实施方案中，所述经修饰的溶瘤病毒可包含可以编码病毒VH1蛋白的外源核酸。在一些实施方案中，编码病毒VH1蛋白的外源核酸可以来自与经修饰的溶瘤病毒不同物种的痘病毒基因组。在一些实施方案中，所述痘病毒可包括β昆虫痘病毒(betaentomopoxvirus)、亚塔痘病毒(yatapoxvirus)、鹿痘病毒(cervidpoxvirus)、γ昆虫痘病毒(gammaentomopoxvirus)、野兔痘病毒(leporipoxvirus)、猪痘病毒(suipoxvirus)、软疣痘病毒(molluscipoxvirus)、鳄痘病毒(crocodylidpoxvirus)、α昆虫痘病毒(alphaentomopoxvirus)、山羊痘病毒(capripoxvirus)、禽痘病毒或副痘病毒。在一些实施方案中，经修饰的溶瘤病毒可包含天然VH1基因的部分或完全缺失，并且可包含编码VH1的外源核酸。VH1蛋白还可以是具有来自不同物种的组分的嵌合/融合蛋白，人工设计/工程化的，或可以保留磷酸酶活性的天然存在的VH1蛋白的仅功能片段。由外源核酸编码的VH1蛋白可比骨架溶瘤病毒的天然VH1蛋白更具活性。
在一些实施方案中，经修饰的溶瘤病毒可包括痘苗病毒，其中其天然VH1基因可以从基因组中缺失，并且来自其他痘病毒的VH1基因可以插入其基因组中。在这种情况下，更具活性的VH1蛋白可导致病毒的毒性较低。备选地或另外地，其可以导致更大的治疗益处，这至少部分是由于更积极地靶向肿瘤抗原的适应性免疫应答，且靶向病毒抗原的有效性较低。
在一些实施方案中，所述经修饰的溶瘤病毒可包含可以编码治疗性蛋白质的外源核酸。可以由本文所述的经修饰的溶瘤痘苗病毒所含的外源核酸编码的治疗性蛋白质的实例可以包括但不限于抗体或其抗原结合片段、细胞因子、生长因子、肽激素、细胞因子、凝血因素、血浆蛋白质、融合蛋白。在一些实施方案中，经修饰的溶瘤病毒可包含编码蛋白质或其片段的外源核酸，该蛋白质或其片段是免疫检查点抑制剂、T细胞激活剂、治疗性纳米抗体、趋化因子和免疫激活剂、前药转化酶、直接细胞毒性化合物或其任意组合。这些蛋白质中的每一种或任意组合可有助于骨架溶瘤病毒的更大治疗益处。
在一些情况下，所述外源核酸可以编码转基因，该转基因包括人源化抗CD20单克隆抗体(例如，Gazyva)、VEGFR Fc-融合体(例如，Eylea)、CTLA-4Fc-融合体(例如，Nulojix)、胰高血糖素样肽1受体激动剂Fc融合体(例如，Trulicity)、VEGFR Fc融合体(例如，Zaltrap)、重组因子IX Fc融合体(例如，Alprolix)、重组因子VIII Fc融合体(例如，Eloctate)、GLP-1受体激动剂-白蛋白融合体(例如，Tanzeum)、重组因子IX白蛋白融合体(例如，Idelvion)、PEG化的IFNβ-1a(例如，Plegridy)、PEG化的重组因子VIII(例如，Adynovate)、与emtansine缀合的人源化抗HER2/neu(例如，Kadcyla)、小鼠/人嵌合抗CD30(例如，Adcetris)、抗人表皮生长因子受体2(HER2)(例如，Perjeta)、抗IL-6受体(Actemra)、抗CD20(例如，阿托珠单抗；Gazyva)、抗整联蛋白a4b7(LPAM-1)(例如，Entyvio)、抗PD-1(例如，Keytruda)、抗达比加群(例如，Praxbind)、抗IL-5(例如，Nucala)、抗CD319(SLAMF7)(例如，Empliciti)、抗IL-17a(例如，Taltz)、抗IL-5(例如，Cinqair)、抗PD-L1(例如，Tecentriq)、抗CD25(例如，Zinbryta)、抗CD30(例如，Adcetris)、抗IL-6(例如，Sylvant)、抗GD2(例如，Unituxin)、抗炭疽芽孢杆菌(anti-Bacillus anthracis)(例如，Anthim)、抗TNFα(例如，Inflectra)、人抗B细胞活化因子(BAFF)(例如，贝利木单抗)、人抗CTLA-4(例如，伊匹木单抗)、CTLA-4Fc融合体(例如，贝拉西普)、人源化抗人表皮生长因子受体2(HER2)(例如，帕妥珠单抗)、VEGFR Fc融合体(例如，ziv-afilbercept))、G-CSF(例如，tbo-filgrastim)、人抗VEGFR2(KDR)(例如，雷莫芦单抗)、小鼠/人嵌合抗IL-6(例如，司妥昔单抗)、派姆单抗、小鼠双特异性抗CD19/抗CD3(例如，blintumomab)、纳武单抗、甲状旁腺素、小鼠/人类嵌合抗GD2(例如，dinutuximab)、人抗CD38(例如，达雷木单抗)、人抗表皮生长因子受体(EGFR)(例如，奈昔木单抗)、人源化抗CD319(SLAMF7)(例如，依洛珠单抗)、阿特朱单抗。在一些实施方案中，经修饰的溶瘤病毒可包含编码蛋白质或其片段的外源核酸，该蛋白质或其片段：可以调节NFκB信号传导，可以促进肿瘤中的组织液压力(IFP)的降低，可以调节STAT3介导的基因激活，可以促进T细胞活化，可以促进K细胞向病毒感染的细胞的吸引，可以调节病毒感染的细胞的代谢程序，可以调节病毒感染的细胞对脂肪酸的摄取，可以促进MDSC的治疗靶向，或其任意组合。
在一些实施方案中，经修饰的溶瘤病毒可包含可以编码HMGB1、PIAS3、IL15、CCL5、其片段中的至少一种或其任意组合的外源核酸。这些蛋白质中的每一种或任意组合可有助于骨架溶瘤病毒的更大治疗益处。
在一些实施方案中，经修饰的溶瘤病毒可包含编码CXXXC趋化分子(如CX3CL1)、ITAC(如CXCL11)、LIGHT(如肿瘤坏死因子超家族成员14或TNFSF14)、其片段或其任意组合的外源核酸。这些蛋白质中的每一种或任意组合可有助于骨架溶瘤病毒的更大治疗益处。
在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂可指诸如但不限于PD-1、PD-L1、PD-L2、CTLA4、TIM-3、LAG-3、CEACAM-1、CEACAM-5、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD 160、2B4、TGFR-beta及其任意组合的免疫检查点分子的抑制剂。
在一些实施方案中，T细胞激活剂可以包括但不限于白介素-1、白介素-2、白介素-4、白介素-5、白介素-6、白介素-7、白介素-11、白介素-12、白介素-13、白介素-15(IL15/IL-15)、IL15-α(IL15-alpha)、IL15受体(IL15-R)、IL15-Rα(IL15受体α)、干扰素-α、干扰素-γ、肿瘤坏死因子、抗CD3抗体、抗CD28抗体、抗CTLA4抗体、抗TGF-β抗体、抗4-lBB抗体、基于细胞的疫苗肽疫苗、DNA疫苗、生长因子、植物血凝素、伴刀豆球蛋白-A、佛波酯及其任意组合。
在一些实施方案中，治疗性纳米抗体可指由单个单体可变抗体域组成并且对肿瘤细胞或肿瘤具有治疗作用的抗体片段。
在一些实施方案中，其他细胞因子、趋化因子和免疫激活剂可指属于对应类别的其他任何蛋白质，其可以对肿瘤细胞或肿瘤具有治疗作用。
在一些实施方案中，前药转化酶可指将对靶标具有较低活性的分子转化为对靶标具有较高活性的分子的酶。在一些情况下，该靶标可以是肿瘤细胞或肿瘤。前药转化酶可以包括但不限于胞嘧啶脱氨酶、尿嘧啶磷酸核糖基转移酶、胸苷激酶及其任意组合。
在一些实施方案中，直接细胞毒性化合物可指对肿瘤细胞具有直接细胞毒性而不通过其他细胞或化合物来实现的任何分子。在一些实施方案中，直接细胞毒性化合物可以包括但不限于可以从添加至经修饰的溶瘤病毒的外源核酸表达的蛋白质、肽、mRNA或寡聚物。
在各个实例中，经修饰的溶瘤病毒可包含上述一种或多种可以编码如上所述的蛋白质的外源核酸，其中所述蛋白质可以是全长蛋白质、全长蛋白质的截短形式、全长蛋白质的功能域、全长蛋白质的片段或全长蛋白质的变体、截短形式、功能域或片段。在一些实例中，变体可包含氨基酸置换(保守或非保守的)、缺失、添加、修饰或其任意组合。
病毒基因组的修饰
本公开的一些实施方案可包括经修饰的溶瘤病毒，其可以在病毒的基因组中包含修饰。在一些实施方案中，所述经修饰的溶瘤病毒可以在病毒的基因组中包含至少一个修饰。在一些实施方案中，所述经修饰的溶瘤病毒可以在病毒的基因组中包含至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20个或甚至更多个修饰。病毒基因组的修饰可包括病毒基因的突变、缺失或两者。病毒基因的缺失可包括病毒基因的部分或完全缺失。应当指出，如本文所用的，“部分缺失”或“突变”可以分别指内源病毒基因的原位部分缺失或突变。或者，它们可指用其他方面相同但缺少基因的一部分(“部分缺失”)或在基因中具有一个或多个核苷酸改变(“突变”)的外源核酸替换内源病毒基因。
许多病毒(包括痘病毒)的复制涉及若干阶段，各个阶段具有不同的形态。一个非限制性实例可以是痘苗病毒，它是可以在被感染细胞的细胞质内完全复制的大型DNA病毒。通常，痘苗病毒具有复杂的形态发生途径，最终形成被不同数目的膜包围的两个不同的感染性病毒体。产生的第一个病毒体被称为细胞内成熟病毒(IMV)，被单个膜包围，并保留在细胞内直至细胞裂解。另一个病毒体被第二膜包围，并在细胞死亡之前从细胞中输出。如果该病毒体保留在细胞表面上，则被称为细胞缔合的包膜病毒(CEV)，如果其从细胞表面释放，则被称为细胞外包膜病毒(EEV)。
在溶瘤痘苗病毒的治疗性应用中，与单膜包裹的IMV相比，EEV形式的病毒体的第二膜可以显著降低病毒对循环系统和其他组织环境中存在的中和抗体和补体的敏感性。此外，由于EEV为释放形式，因此EEV的施用可以使病毒更容易在肿瘤内和肿瘤之间扩散，从而增加感染肿瘤细胞的机会。因此，当溶瘤病毒，如痘病毒，例如溶瘤痘苗病毒、其他溶瘤痘病毒或其他类似病毒在临床环境中使用时，增加EEV的产量可产生更大的治疗益处。本文的一些实施方案公开了经修饰的溶瘤病毒，其可以在病毒基因组中包含修饰，该修饰可以增强EEV形式的病毒的产生，从而增强病毒在肿瘤内和肿瘤之间的扩散。B5R、F13L、A36R、A34R、A33R是EEV特异性膜蛋白的实例。
在一些实施方案中，经修饰的溶瘤病毒可以在病毒B5R基因中包含修饰，条件是所述修饰不在SCR2结构域中。B5R蛋白包括以下区域：(信号肽)-(短共有重复(SCR)区域1至4(跨膜域)-(细胞质尾)。SCR1结构域可以包含在EEV上发现的中和抗体表位。SCR3可以包含P189S突变位点，该位点可以导致EEV释放增加。
在一些实例中，本公开的经修饰的溶瘤病毒可以在B5R基因的SCR1、SCR3和SCR4结构域中的至少一个中包含修饰。例如，该修饰可以是B5R基因的部分缺失。在一些情况下，B5R基因的修饰，例如SCR3和SCR4结构域的缺失，可以至少部分地破坏中和抗体与B5R的结合。因此，根据本公开的经修饰的溶瘤病毒可以至少部分地抵抗中和。
B5R SCR区域中的其他修饰也包括在本公开中，从而可以针对EEV释放、复制和抗体逃避优化经修饰的溶瘤病毒。B5R突变，例如，B5R SCR1中的抗体结合位点的去除，可以与其他EEV增强突变(例如，A34R中的随机诱变)组合使用。在一些情况下，这样的修饰组合可以导致增加的EEV产量。
在一些实施方案中，所述修饰包括B5R中的缺失或突变。该缺失可以是完全缺失或部分缺失。
在一些实施方案中，经修饰的溶瘤病毒可以在病毒基因B5R、F13L、A36R、A34R、A33R或其任意组合中包含增加EEV产量的修饰。在一些实施方案中，经修饰的溶瘤病毒可包含一种或多种以下突变：A33R的部分缺失，A34R Lys151至Glu(K 151E)；B5R的完全或部分缺失；和/或A36R的突变/缺失。
在一些实施方案中，经修饰的溶瘤病毒可包含另外的病毒基因的突变或缺失。所述另外的病毒基因可包括编码某些分泌的细胞因子结合蛋白的基因，例如B8R或B18R。或者，它可以包括可能负责免疫抑制活性的基因，例如N1L或A41L。它还可以包括编码具有NFκB(NF-kappaB)抑制功能的蛋白质的基因，例如K7R、B15R、A52R。或者，经修饰的溶瘤病毒也可能包含可以编码B8R、B18R、SPI-1、SPI-2、B15R、VGF、E3L、K3L、A41L、K7R、N1L或A52R的基因中的任何一种或组合的突变或缺失。在一些实施方案中，蛋白质B8R可指与IFN-γ受体具有同源性的分泌的病毒蛋白质，其在一些情况下可以抑制宿主IFN-γ与其受体之间的相互作用，从而抵消宿主IFNγ的抗病毒作用。在一些实施方案中，蛋白质B18R可指病毒锚蛋白样蛋白质，其被分泌并且在一些情况下可以与1型干扰素结合。在一些实施方案中，蛋白质SPI-1可指病毒丝氨酸蛋白酶抑制剂1，而SPI-2可指病毒丝氨酸蛋白酶抑制剂2。在一些实施方案中，蛋白质B15R(在痘苗病毒株Copenhagen中也称为B14R)可指这样的病毒蛋白质，其在一些情况下可以与IKK复合物的IKBKB亚单位结合，从而阻止响应于促炎性刺激物如TNF-α或IL1B的宿主NF-κB活化。在一些实施方案中，蛋白质VGF可指可以刺激被感染细胞周围的细胞增殖的促痘苗生长因子。在一些实施方案中，蛋白质E3L可指这样的病毒蛋白质，其在一些情况下可以结合并隔离在病毒感染期间合成的双链RNA(dsRNA)，从而阻止dsRNA被EIF2AK2/PKR识别及随后被其激活。在一些实施方案中，蛋白质K3L可指这样的病毒蛋白质，其在一些情况下可以充当EIF2AK2/PKR的假底物，从而抑制PKR激酶激活eIF2a，并阻止宿主细胞中的翻译关闭。在一些实施方案中，蛋白质A41L可指分泌的病毒趋化因子结合蛋白，其在一些情况下可与某些细胞趋化因子相互作用，以干扰细胞表面的趋化因子-糖胺聚糖(GAG)相互作用，从而改变附近反应性细胞的趋化性。在一些实施方案中，蛋白质K7R可指病毒Bcl-2样蛋白，其在一些情况下可以与Toll样受体-衔接子蛋白和DEAD-盒RNA解旋酶DDX3结合，从而抑制NFκB和干扰素调节因子3的活化。在一些实施方案中，蛋白质N1L可指另一种病毒Bcl-2样蛋白，其在一些情况下可以与促凋亡Bcl-2家族蛋白质的BH3肽结合。在一些情况下，N1L可以抑制NFκB活化和宿主细胞凋亡。在一些实施方案中，蛋白质A52R可指另一种病毒Bcl-2样蛋白，其在一些情况下可靶向宿主toll样受体信号传导复合物以抑制先天免疫应答，在一些情况下可与宿主TRAF6相互作用以激活p38并随后诱导若干细胞因子如IL-10的表达，并且在一些情况下可以与宿主IRAK2相互作用以抑制NF-κB信号传导。在一些情况下，在施用经修饰的溶瘤病毒后，在一些实施方案中，N1L基因中的缺失可导致记忆T细胞应答增加。在一些实施方案中，另外的作用可以包括以下一种或多种：在一些实施方案中，A41L的缺失可导致CTL应答增加；在一些实施方案中，K7R缺失可导致自然杀伤细胞和T细胞应答增加，在一些实施方案中，经修饰的B15R可减少NFκB活化，并且在一些实施方案中，B15R基因的缺失可增强免疫应答，在一些实施方案中，经修饰的A52R可减少NFκB活化，并且在一些实施方案中，A52R基因的缺失可增强免疫应答。
在一些实施方案中，所述经修饰的溶瘤病毒可包含可以编码LIGHT的外源核酸。在一些实施方案中，所述经修饰的溶瘤病毒可包含可以编码IL15的外源核酸。在一些实施方案中，所述经修饰的溶瘤病毒可包含可以编码IL15的外源核酸，和可以编码CCL5的外源核酸。在一些实施方案中，所述经修饰的溶瘤病毒可包含可以编码IL15的外源核酸，和可以编码IL15-Rα的外源核酸。在一些实施方案中，所述经修饰的溶瘤病毒可包含可以编码ITAC(CXCL11)的外源核酸，和可以编码CXXXC趋化分子(CX3CL1)的外源核酸。在一些实施方案中，所述经修饰的溶瘤病毒可包含可以编码ITAC(CXCL11)的外源核酸、可以编码CXXXC趋化分子(CX3CL1)的外源核酸、可以编码IL15的外源核酸和可以编码IL15-Rα的外源核酸。
在一些实施方案中，所述经修饰的溶瘤病毒可包含K7R基因的突变或缺失，并且可进一步包含可以编码细胞因子如IL15的外源核酸。在一些实施方案中，所述经修饰的溶瘤病毒可包含K7R基因的突变或缺失，并且可进一步包含可以编码趋化因子如IL15的外源核酸和可以编码趋化因子如CCL5的外源核酸。在一些实施方案中，所述经修饰的溶瘤病毒可包含K7R基因的突变或缺失，并且可进一步包含可以编码细胞因子如IL15的外源核酸和可以编码细胞因子受体如IL15Rα的外源核酸。在一些实施方案中，所述经修饰的溶瘤病毒可包含K7R基因的突变或缺失，并且可进一步包含可以编码LIGHT的外源核酸。在一些实施方案中，所述经修饰的溶瘤病毒可包含K7R基因的突变或缺失，并且可进一步包含可以编码ITAC(CXCL11)的外源核酸。在一些实施方案中，所述经修饰的溶瘤病毒可包含K7R基因的突变或缺失，并且包含可以编码CXXXC趋化分子(CX3CL1)的外源核酸。在一些实施方案中，所述经修饰的溶瘤病毒可包含K7R基因的突变或缺失，并且可进一步包含可以编码ITAC(CXCL11)的外源核酸和可以编码CXXXC趋化分子(CX3CL1)的外源核酸。
在一些实施方案中，所述经修饰的溶瘤病毒可包含A52R基因的突变或缺失，并且可进一步包含可以编码细胞因子如IL15的外源核酸。在一些实施方案中，所述经修饰的溶瘤病毒可包含A52R基因的突变或缺失，并且可进一步包含可以编码趋化因子如IL15的外源核酸和可以编码趋化因子如CCL5的外源核酸。在一些实施方案中，所述经修饰的溶瘤病毒可包含A52R基因的突变或缺失，并且可进一步包含可以编码细胞因子如IL15的外源核酸和可以编码细胞因子受体如IL15Rα的外源核酸。在一些实施方案中，所述经修饰的溶瘤病毒可包含A52R基因的突变或缺失，并且可进一步包含可以编码LIGHT的外源核酸。在一些实施方案中，所述经修饰的溶瘤病毒可包含A52R基因的突变或缺失，并且可进一步包含可以编码ITAC(CXCL11)的外源核酸。在一些实施方案中，所述经修饰的溶瘤病毒可包含A52R基因的突变或缺失，并且包含可以编码CXXXC趋化分子(CX3CL1)的外源核酸。在一些实施方案中，所述经修饰的溶瘤病毒可包含A52R基因的突变或缺失，并且可进一步包含可以编码ITAC(CXCL11)的外源核酸和可以编码CXXXC趋化分子(CX3CL1)的外源核酸。
在一些实例中，从经修饰的溶瘤病毒共表达细胞因子(例如，IL15)及其受体(例如，IL15-Rα)在一些情况下可导致溶瘤病毒的免疫调节作用增强，例如，由于由IL15和IL15-Rα形成的复合物(IL15:IL15-R复合物)激活自然杀伤细胞并促进T细胞应答的能力提高。不受任何具体理论的束缚，可以预期可以将IL15:IL15-Rα复合物中的IL15呈递给展示在T细胞和自然杀伤(NK)细胞表面上的IL15-Rβγ(IL15-受体βγ复合物)，从而赋予NK细胞和T细胞有效的免疫调节作用。
在某些实施方案中，提供了经修饰的溶瘤病毒，其中A52R基因可以被突变或缺失，并且进一步地，其中经修饰的溶瘤病毒可包含可以编码分泌的透明质酸酶如HysA的外源核酸。在某些实施方案中，提供了经修饰的溶瘤病毒，其中A52R基因可以被突变或缺失，并且进一步地，其中经修饰的溶瘤病毒可包含可以编码趋化因子受体如CXCR4的外源核酸。在某些实施方案中，提供了经修饰的溶瘤病毒，其中A52R基因可以被突变或缺失，并且进一步地，其中经修饰的溶瘤病毒可包含可以编码趋化因子受体如CXCR4的外源核酸，和可以编码分泌的透明质酸酶如HysA的外源核酸。
在某些实施方案中，提供了经修饰的溶瘤病毒，其中A52R基因可以被突变或缺失，并且进一步地，其中经修饰的溶瘤病毒可包含可以编码膜结合透明质酸酶如PH-20(也称为SPAM-1)的外源核酸。在某些实施方案中，提供了经修饰的溶瘤病毒，其中A52R基因可以被突变或缺失，并且进一步地，其中经修饰的溶瘤病毒可包含可以编码趋化因子受体如CXCR4的外源核酸。在某些实施方案中，提供了经修饰的溶瘤病毒，其中A52R基因可以被突变或缺失，并且进一步地，其中经修饰的溶瘤病毒可包含可以编码趋化因子受体如CXCR4的外源核酸，和可以编码膜结合透明质酸酶如PH-20(或SPAM-1)的外源核酸。
在某些实施方案中，经修饰的溶瘤病毒可包含病毒胸苷激酶(TK)基因的完全或部分缺失。根据某些实施方案，在本文公开的经修饰的溶瘤病毒的基因组中，将一种或多种外源核酸插入缺失的TK基因的基因座中。表3提供了本文公开的病毒基因的示例性核酸序列，以及由所述基因编码的蛋白质的氨基酸序列。
在一些实施方案中，在经修饰的溶瘤病毒中，例如在溶瘤痘苗病毒中，病毒TK基因可以用来自单纯疱疹病毒的TK基因(HSV-TK)替代。HSV TK可以充当缺失的TK的替代物，并且可以具有多方面的优势。例如，(i)HSV TK可以用作在肿瘤中将更昔洛韦(GCV)转化为其细胞毒性代谢物的额外的治疗性前药转化酶。除了增加的治疗效果外，该修饰还可以充当自杀基因，例如，表达痘苗的细胞可以通过添加GCV而被有效杀死，从而在发生不良事件或复制不受控制的情况下关闭病毒。因此，在一些情况下，本公开的经修饰的溶瘤病毒可以充当安全性开关。在另外的实例中，HSV TK的突变形式可用来允许对标记的底物进行PET成像，其灵敏度大大提高。因此，在一些情况下，包含可在PET成像中使用的HSV TK的经修饰的溶瘤病毒可充当体内病毒复制的报告子，以在治疗后早期确定治疗活性。
在一些情况下，经修饰的溶瘤病毒可包含上述全长病毒骨架基因或病毒骨架蛋白质，或其截短形式，或其功能域，或其片段，或其变体。在各种实例中，如上所述，经修饰的溶瘤病毒可包含一种或多种病毒骨架基因或病毒骨架蛋白质的突变或缺失。病毒骨架基因和病毒骨架蛋白质的突变可包括核酸序列中的核苷酸和蛋白质序列中的氨基酸的插入、缺失、置换或修饰。在一些实例中，缺失可包括病毒骨架基因或蛋白质的完全或部分缺失。
癌症靶标
在本公开的实施方案中，考虑了通过递送经修饰的溶瘤病毒如本文所述的溶瘤痘苗病毒来治疗过度增生性疾病如癌症或肿瘤的方法。可以通过如本文所述的经修饰的溶瘤病毒来治疗的癌症可包括但不限于黑素瘤、肝细胞癌、乳腺癌、肺癌、腹膜癌、前列腺癌、膀胱癌、卵巢癌、白血病、淋巴瘤、肾癌、胰腺癌、上皮癌、胃癌、结肠癌、十二指肠癌、胰腺腺癌、间皮瘤、多形性胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、多发性骨髓瘤、前列腺癌、肝细胞癌、胆管肉瘤、胰腺腺癌、头颈部鳞状细胞癌、结直肠癌、肠型胃腺癌、宫颈鳞状细胞癌、骨肉瘤、上皮性卵巢癌、急性淋巴母细胞淋巴瘤、骨髓增生性赘生物和肉瘤。
可以通过本公开的方法治疗的癌细胞包括来自膀胱、血液、骨骼、骨髓、脑、乳腺、结肠、食道、胃肠、牙龈、头、肾、肝、肺、鼻咽、颈、卵巢、前列腺、皮肤、胃、睾丸、舌或子宫的细胞。另外，所述癌症可具体地属于以下组织学类型，但不限于这些组织学类型：恶性赘生物；癌；未分化癌；巨细胞癌和梭形细胞癌；小细胞癌；乳头状癌；鳞状细胞癌；淋巴上皮癌；基底细胞癌；毛基质癌；移行细胞癌；乳头状移行细胞癌；腺癌；恶性胃泌素瘤；胆管上皮癌；肝细胞癌；混合型肝细胞癌和胆管上皮癌；小梁腺癌；腺样囊性癌；腺瘤性息肉中的腺癌；家族性结肠息肉腺癌；实体癌；恶性类癌瘤；细支气管腺泡状腺癌；乳头状腺癌；嫌色细胞癌；嗜酸性细胞癌；嗜酸性腺癌；嗜碱性细胞癌；透明细胞腺癌；颗粒细胞癌；滤泡性腺癌；乳头状和滤泡性腺癌；非包膜性硬化癌；肾上腺皮质癌；子宫内膜样癌；皮肤附件癌；大汗腺腺癌；皮脂性腺癌；盯聍腺癌；粘液表皮样癌；囊腺癌；乳头状囊腺癌；乳头状浆液性囊腺癌；粘液性囊腺癌；粘液腺癌；印戒细胞癌；浸润性导管癌；髓样癌；小叶癌；炎性癌；乳腺佩吉特病(paget's disease)；腺泡细胞癌；腺鳞状癌；腺癌伴鳞状化生；恶性胸腺瘤；恶性卵巢间质瘤；恶性泡膜细胞瘤；恶性粒层细胞瘤；恶性男性母细胞瘤；塞尔托利细胞癌(sertoli cellcarcinoma)；恶性莱迪希细胞瘤；恶性脂质细胞瘤；恶性副神经节瘤；恶性乳腺外副神经节瘤；嗜铬细胞瘤；血管球肉瘤；恶性黑素瘤；无黑色素性黑素瘤；浅表扩散性黑素瘤；巨大色素痣内恶性黑素瘤；上皮样细胞黑素瘤；恶性蓝痣；肉瘤；纤维肉瘤；恶性纤维组织细胞瘤；粘液肉瘤；脂肪肉瘤；平滑肌肉瘤；横纹肌肉瘤；胚胎性横纹肌肉瘤；肺泡横纹肌肉瘤；间质肉瘤；恶性混合瘤；苗勒混合瘤(mullerian mixed tumor)；肾母细胞瘤；肝母细胞瘤；癌肉瘤；恶性间叶瘤；恶性布伦纳瘤(brenner tumor)；恶性叶状瘤；滑膜肉瘤；恶性间皮瘤；无性细胞瘤；胚胎性癌；恶性畸胎瘤；恶性卵巢甲状腺肿；绒毛膜癌；恶性中肾瘤；血管肉瘤；恶性血管内皮瘤；卡波西肉瘤；恶性血管外皮细胞瘤；淋巴管肉瘤；骨肉瘤；近皮质骨肉瘤；软骨肉瘤；恶性软骨母细胞瘤；间质性软骨肉瘤；骨巨细胞瘤；尤因肉瘤；恶性牙源性肿瘤；成釉细胞牙肉瘤；恶性成釉细胞瘤；成釉细胞纤维肉瘤；恶性松果体瘤；脊索瘤；恶性神经胶质瘤；室管膜瘤；星形细胞瘤；原浆性星形细胞瘤；纤维性星形细胞瘤；星形母细胞瘤；胶质母细胞瘤；少突神经胶质瘤；成少突神经胶质细胞瘤；原始神经外胚层瘤；小脑肉瘤；成神经节细胞瘤；神经母细胞瘤；视网膜母细胞瘤；嗅神经源性肿瘤；恶性脑膜瘤；神经纤维肉瘤；恶性神经鞘瘤；恶性颗粒细胞瘤；恶性淋巴瘤；霍奇金病；霍奇金症；副肉芽肿；恶性小淋巴细胞性淋巴瘤；恶性弥漫性大细胞淋巴瘤；恶性滤泡性淋巴瘤；蕈样真菌病；其他指定的非霍奇金淋巴瘤；恶性组织细胞增生症；多发性骨髓瘤；肥大细胞肉瘤；免疫增生性小肠病；白血病；淋巴样白血病；浆细胞白血病；红白血病；淋巴肉瘤细胞性白血病；髓样白血病；嗜碱性白血病；嗜酸性白血病；单核细胞白血病；肥大细胞白血病；巨核母细胞性白血病；髓样肉瘤；以及多毛细胞白血病。在一些情况下，可以使用本公开的经修饰的溶瘤病毒，例如有利于全身递送的经修饰的溶瘤痘苗病毒，来治疗转移性实体癌。在一些情况下，可以使用本公开的经修饰的溶瘤病毒，例如有利于全身递送的经修饰的溶瘤痘苗病毒，来治疗不可接近或难以接近的实体癌，例如出于瘤内递送治疗剂的目的。在一些实例中，可以使用本公开的经修饰的溶瘤病毒，例如有利于全身递送并且形成增加的EEV量的经修饰的溶瘤痘苗病毒，来治疗与游离脂肪酸表达增加相关的癌症。
本公开还考虑了抑制或预防任何类型的原发性癌症的局部侵袭或转移或两者的方法。例如，该原发性癌症可以是黑素瘤、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、肺癌、肝癌、视网膜母细胞瘤、星形细胞瘤、胶质母细胞瘤、牙龈癌、舌癌、白血病、神经母细胞瘤、头部癌症、颈部癌症、乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌、肾癌、骨癌、睾丸癌、卵巢癌、间皮瘤、宫颈癌、胃肠癌、淋巴瘤、脑癌、结肠癌或膀胱癌。在某些实施方案中，该原发性癌症可以是肺癌。例如，该肺癌可以是非小细胞肺癌。此外，本公开可用来预防癌症或治疗癌前病变或恶化前的细胞，包括化生、发育不良和增生。它还可用来抑制不希望但为良性的细胞，如鳞状化生、发育不良、良性前列腺增生细胞、增生性病变等。在一些实施方案中，可通过涉及本文讨论的经修饰的溶瘤病毒的本公开的方法来停止、破坏或延迟向癌症或更严重形式的癌症的进展。
此外，可以施用本文公开的经修饰的溶瘤病毒，以治疗在肿瘤微环境中具有游离脂肪酸的高生物利用度的肿瘤。在一些情况下，由肥胖患者的肿瘤中的脂肪细胞释放的游离脂肪酸可以供给肿瘤内经修饰的溶瘤病毒并增强其复制，以及EEV形式的病毒的形成。在非肥胖患者，尤其是患有腹膜癌的患者中，也可以实现这一优点。例如，几种腹膜癌可以是使用本公开的经修饰的溶瘤病毒的疗法的靶标，因为这些癌倾向于在网膜壁中生长并且可以由脂肪细胞供给，并且如上所述，由肿瘤中的脂肪细胞释放的游离脂肪酸可以供给肿瘤内经修饰的溶瘤病毒并增强其复制。本文公开的经修饰的溶瘤病毒可以在具有游离脂肪酸的高生物利用度的肿瘤中形成滴度提高的细胞外包膜病毒(EEV)。
治疗方法和测定功效和药代动力学的方法
本公开提供了通过施用一种或多种如本文公开的经修饰的溶瘤病毒来治疗受试者的方法。如本文中可互换使用的“个体”或“受试者”是指人或非人类受试者。非人类受试者的非限制性实例包括非人灵长类动物、狗、猫、小鼠、大鼠、豚鼠、兔、猪、禽、马、牛、山羊、绵羊、鲸等。在一些实施方案中，受试者是人。
提供了在癌细胞中产生毒性作用的方法，该方法包括向癌细胞施用治疗有效量的如上所述的经修饰的病毒，如溶瘤痘苗病毒，或含有该病毒的药物组合物。本公开进一步提供了抑制第二癌细胞的生长和增殖中的至少一种的方法，该方法包括向第一癌细胞施用如上所述的经修饰的溶瘤病毒，使得第一癌细胞被所述病毒感染。因此，在本文公开的方法的一些实施方案中，预期并非每种癌细胞或肿瘤细胞都在施用治疗有效量的如本文所述的溶瘤痘苗病毒或含有该病毒的药物组合物后被感染，并且可以在没有直接感染的情况下抑制未感染细胞的生长。
在一些实例中，为了使用本公开的方法和组合物来诱导溶瘤、杀死细胞、抑制生长、抑制转移、减小肿瘤大小以及以其他方式逆转或减少肿瘤细胞的恶性表型，可以使癌细胞或肿瘤与治疗有效剂量的如本文所述的示例性溶瘤痘苗病毒或含有该病毒的药物组合物接触。在某些实施方案中，本公开的经修饰的溶瘤病毒例如如本文所述的溶瘤痘苗病毒或其药物组合物的有效量可包括足以诱导癌细胞的溶瘤、破坏或裂解，或癌细胞的生长或大小的抑制或减少的量。例如，癌细胞生长的减慢可以表现为细胞死亡，或包含该细胞的肿瘤的复制速率或生长速率降低，或含有癌细胞的受试者的存活期延长。
在一些实施方案中，提供了治疗患有癌症或肿瘤的受试者的方法，该方法包括向该受试者施用有效量的如上所述的经修饰的病毒。这样的方法中的有效量可包括减缓癌症的生长速率或扩散，或延长受试者存活期的量。本公开提供了减少肿瘤生长的方法，该方法可包括向肿瘤施用有效量的如上所述的经修饰的溶瘤病毒。在某些实施方案中，经修饰的病毒或其药物组合物的有效量可包括足以诱导肿瘤生长或大小的减缓、抑制或减少的量，并且可包括根除肿瘤。例如，肿瘤生长的减慢可以表现为生长速率降低或含有肿瘤的受试者的存活期延长。
本公开还提供了确定如本文所述的溶瘤痘苗病毒的感染性或抗肿瘤活性或肿瘤特异性病毒复制量的方法，该方法可包括：(i)向受试者施用单独或与另外的疗法联合的治疗有效量的根据本公开的溶瘤痘苗病毒或药物组合物，其进一步表达萤光素酶报告基因；(ii)在施用该病毒后立即从受试者采集第一生物样品并确定第一生物样品中萤光素酶报告基因的水平；(iii)在步骤(ii)中施用后从受试者采集第二生物样品；并且(iii)检测第二生物样品中萤光素酶报告基因的水平，其中如果在步骤(iii)中萤光素酶的水平高于步骤(ii)，则确定该溶瘤痘苗病毒具有感染性、显示出抗肿瘤活性、表现出肿瘤特异性病毒复制。在步骤(i)中施用后约30分钟、约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约9小时、约10小时、约12小时、约15小时、约24小时、约36小时、约48小时、约72小时、约4天、约5天、约6天、约7天、约8天、约9天、约10天、约11天、约12天、约13天、约14天、约15天、约1个月至约2个月采集第二生物样品。在一些实施方案中，上述方法可进一步包括在步骤(i)和(iii)中检测在向受试者施用治疗有效量的本公开的经修饰的溶瘤病毒例如如本文所述的溶瘤痘苗病毒或包含该病毒的药物组合物后从所述受试者采集的血浆样品中一种或多种测定细胞因子(例如，IL-2、IL-7、IL-8、IL-10、IFN-γ、GM-CSF、TNF-α、IL-6、IL-4、IL-5和IL-13)的水平。在本公开的一些实施方案中，与其他方面相同但不包含经修饰的溶瘤病毒中的修饰的病毒相比，本文所述的经修饰的溶瘤病毒在上述步骤(ii)和(iv)之间的萤光素酶生物发光的增加更高。用于在施用经修饰的溶瘤病毒后检测和监测病毒载量的其他示例性技术包括实时定量PCR。
进一步提供了在施用治疗有效量的根据本公开的经修饰的溶瘤病毒例如如本文所述的溶瘤痘苗病毒或含有该痘苗病毒的药物组合物后监测药代动力学的方法。用于监测药代动力学的示例性方法可包括以下步骤：(i)向受试者施用单独或与另外的疗法联合的治疗有效量的溶瘤痘苗病毒或包含该病毒的药物组合物；(ii)在步骤(i)中施用后选自约15分钟、约30分钟、约45分钟、约60分钟、约75分钟、约90分钟、约120分钟、约180分钟和约240分钟、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约9小时、约10小时、约12小时、约15小时、约24小时、约36小时、约48小时、约72小时、约4天、约5天、约6天、约7天、约8天、约9天、约10天、约11天、约12天、约13天、约14天、约15天、约1个月至约2个月的一个或多个时间点从受试者采集生物样品，以及(iii)检测在上述时间点采集的生物样品中病毒基因组(或插入病毒基因组内的报告基因，如萤光素酶基因)的量。在一些情况下，在15分钟时间点采集的样品中病毒基因组拷贝/mL可以是最高的，并且进一步地，在240分钟时间点采集的样品可能不包含可检测量的病毒基因组。因此，在一些情况下，在施用后约15分钟可以观察到病毒峰值，并且大部分病毒可在约240分钟(或4小时)后从受试者的系统中清除。在一些情况下，在施用后约15分钟可以观察到第一病毒峰值，并且在随后的时间点(例如，在约30分钟、约45分钟、约60分钟或约90分钟)采集的生物样品中可以观察到第二病毒峰值。在示例性实施方案中，该生物样品可以是血液，并且可通过定量PCR或其他合适的技术来确定每mL中的病毒基因组的量。在一些实例中，在施用后约15分钟可以观察到第一病毒峰值，并且在施用本公开的经修饰的溶瘤病毒例如如本文所述的溶瘤痘苗病毒后约30分钟、约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约9小时、约10小时、约12小时、约15小时、约24小时、约36小时、约48小时、约72小时、约4天、约5天、约6天、约7天、约8天、约9天、约10天、约11天、约12天、约13天、约14天、约15天、约1个月至约2个月后可以观察到第二病毒峰值。
在一些情况下，可通过使用报告基因如萤光素酶基因来测量经修饰的病毒如溶瘤痘苗病毒的肿瘤选择性复制。在一些实施方案中，可将萤光素酶基因插入病毒的基因组中，并且可以用该病毒感染肿瘤细胞。可以测量感染的肿瘤细胞中的生物发光，以监测肿瘤选择性复制。一些实例显示，与其他方面相同但不包含经修饰的溶瘤病毒中的修饰的溶瘤痘苗病毒相比，本公开的经修饰的溶瘤病毒中的萤光素酶报告分子生物发光增加。
经修饰的溶瘤病毒的递送
在一些实施方案中，向受试者施用的本公开的经修饰的溶瘤病毒如溶瘤痘苗病毒的量可以是约103至1012个感染性病毒颗粒或噬斑形成单位(PFU)，或约105至1010PFU，或约105至108PFU或约108至1010PFU。在一些实施方案中，向受试者施用的本公开的经修饰的溶瘤病毒如溶瘤痘苗病毒的量可以是约103至1012个病毒颗粒或噬斑形成单位(PFU)，或约105至1010PFU，或约105至108PFU或约108至1010PFU。在一些实施方案中，本公开的经修饰的溶瘤病毒，如溶瘤痘苗病毒，可以以一定的剂量施用，该剂量可包含约103PFU/剂至约104PFU/剂、约104PFU/剂至约105PFU/剂、约105PFU/剂至约106PFU/剂、约107PFU/剂至约108PFU/剂、约109PFU/剂至约1010PFU/剂、约1010PFU/剂至约1011PFU/剂、约1011PFU/剂至约1012PFU/剂、约1012PFU/剂至约1013PFU/剂、约1013PFU/剂至约1014PFU/剂或约1014PFU/剂至约1015PFU/剂。在一些实施方案中，本公开的经修饰的溶瘤病毒，如溶瘤痘苗病毒，可以以一定的剂量施用，该剂量可包含约2x 103PFU/剂、3x 103PFU/剂、4x 103PFU/剂、5x 103PFU/剂、6x 103PFU/剂、7x 103PFU/剂、8x 103PFU/剂、9x 103PFU/剂、约104PFU/剂、约2x 104PFU/剂、约3x104PFU/剂、约4x 104PFU/剂、约5x 104PFU/剂、约6x 104PFU/剂、约7x 104PFU/剂、约8x 104PFU/剂、约9x 104PFU/剂、约105PFU/剂、2x 105PFU/剂、3x 105PFU/剂、4x 105PFU/剂、5x 105PFU/剂、6x 105PFU/剂、7x 105PFU/剂、8x 105PFU/剂、9x 105PFU/剂、约106PFU/剂、约2x 106PFU/剂、约3x 106PFU/剂、约4x 106PFU/剂、约5x 106PFU/剂、约6x 106PFU/剂、约7x 106PFU/剂、约8x 106PFU/剂、约9x 106PFU/剂、约107PFU/剂、约2x 107PFU/剂、约3x 107PFU/剂、约4x107PFU/剂、约5x 107PFU/剂、约6x 107PFU/剂、约7x 107PFU/剂、约8x 107PFU/剂、约9x107PFU/剂、约108PFU/剂、约2x 108PFU/剂、约3x 108PFU/剂、约4x 108PFU/剂、约5x 108PFU/剂、约6x 108PFU/剂、约7x 108PFU/剂、约8x 108PFU/剂、约9x 108PFU/剂、约109PFU/剂、约2x109PFU/剂、约3x 109PFU/剂、约4x 109PFU/剂、约5x 109PFU/剂、约6x 109PFU/剂、约7x109PFU/剂、约8x 109PFU/剂、约9x 109PFU/剂、约1010PFU/剂、约2x 1010PFU/剂、约3x1010PFU/剂、约4x 1010PFU/剂、约5x1010 PFU/剂、约6x 1010PFU/剂、约7x 1010PFU/剂、约8x1010PFU/剂、约9x 1010PFU/剂、约1010PFU/剂、约2x1010PFU/剂、约3x 1010PFU/剂、约4x1010PFU/剂、约5x 1010PFU/剂、约6x 1010PFU/剂、约7x 1010PFU/剂、约8x 1010PFU/剂、约9x1010PFU/剂、约1011PFU/剂、约2x 1011PFU/剂、约3x 1011PFU/剂、约4x1011PFU/剂、约5x1011PFU/剂、约6x 1011PFU/剂、约7x 1011PFU/剂、约8x 1011PFU/剂、约9x 1011PFU/剂或约1012PFU/剂、约1012PFU/剂至约1013PFU/剂、约1013PFU/剂至约1014PFU/剂或约1014PFU/剂至约1015PFU/剂。在一些实施方案中，本公开的经修饰的溶瘤病毒，如溶瘤痘苗病毒，可以以一定的剂量施用，该剂量可包含5x 109PFU/剂。在一些实施方案中，本公开的经修饰的溶瘤病毒，如溶瘤痘苗病毒，可以以一定的剂量施用，该剂量可包含至多5x 109PFU/剂。
在一些实施方案中，本公开的经修饰的溶瘤病毒，如溶瘤痘苗病毒，可以以一定的剂量施用，该剂量可包含约103个病毒颗粒/剂至约104个病毒颗粒/剂、约104个病毒颗粒/剂至约105个病毒颗粒/剂、约105个病毒颗粒/剂至约106个病毒颗粒/剂、约107个病毒颗粒/剂至约108个病毒颗粒/剂、约109个病毒颗粒/剂至约1010个病毒颗粒/剂、约1010个病毒颗粒/剂至约1011个病毒颗粒/剂、约1011个病毒颗粒/剂至约1012个病毒颗粒/剂、约1012个病毒颗粒/剂至约1013个病毒颗粒/剂、约1013个病毒颗粒/剂至约1014个病毒颗粒/剂，或1014个病毒颗粒/剂至约1015个病毒颗粒/剂。
在一些实施方案中，本公开的经修饰的溶瘤病毒可以以一定的剂量施用，该剂量可包含约103PFU/kg至约104PFU/kg、约104PFU/kg至约105PFU/kg、约105PFU/kg至约106PFU/kg、约107PFU/kg至约108PFU/kg、约109PFU/kg至约1010PFU/kg、约1010PFU/kg至约1011PFU/kg、约1011PFU/kg至约1012PFU/kg、约1012PFU/kg至约1013PFU/kg、约1013PFU/kg至约1014PFU/kg或约1014PFU/kg至约1015PFU/kg。在一些实施方案中，本公开的经修饰的溶瘤病毒，如溶瘤痘苗病毒，可以以一定的剂量施用，该剂量可包含约2x 103PFU/kg、3x 103PFU/kg、4x103PFU/kg、5x 103PFU/kg、6x 103PFU/kg、7x 103PFU/kg、8x 103PFU/kg、9x 103PFU/kg、约104PFU/kg、约2x 104PFU/kg、约3x104 PFU/kg、约4x 104PFU/kg、约5x 104PFU/kg、约6x104PFU/kg、约7x 104PFU/kg、约8x 104PFU/kg、约9x 104PFU/kg、约105PFU/kg、2x 105PFU/kg、3x 105PFU/kg、4x 105PFU/kg、5x 105PFU/kg、6x 105PFU/kg、7x 105PFU/kg、8x 105PFU/kg、9x 105PFU/kg、约106PFU/kg、约2x 106PFU/kg、约3x 106PFU/kg、约4x 106PFU/kg、约5x106PFU/kg、约6x 106PFU/kg、约7x 106PFU/kg、约8x 106PFU/kg、约9x 106PFU/kg、约107PFU/kg、约2x 107PFU/kg、约3x 107PFU/kg、约4x 107PFU/kg、约5x 107PFU/kg、约6x 107PFU/kg、约7x 107PFU/kg、约8x 107PFU/kg、约9x 107PFU/kg、约108PFU/kg、约2x 108PFU/kg、约3x108PFU/kg、约4x 108PFU/kg、约5x 108PFU/kg、约6x 108PFU/kg、约7x 108PFU/kg、约8x108PFU/kg、约9x 108PFU/kg、约109PFU/kg、约2x 109PFU/kg、约3x 109PFU/kg、约4x 109PFU/kg、约5x 109PFU/kg、约6x 109PFU/kg、约7x 109PFU/kg、约8x 109PFU/kg、约9x 109PFU/kg、约1010PFU/kg、约2x 1010PFU/kg、约3x 1010PFU/kg、约4x 1010PFU/kg、约5x1010 PFU/kg、约6x 1010PFU/kg、约7x 1010PFU/kg、约8x 1010PFU/kg、约9x 1010PFU/kg、约1010PFU/kg、约2x1010PFU/kg、约3x 1010PFU/kg、约4x 1010PFU/kg、约5x 1010PFU/kg、约6x 1010PFU/kg、约7x1010PFU/kg、约8x 1010PFU/kg、约9x 1010PFU/kg、约1011PFU/kg、约2x 1011PFU/kg、约3x1011PFU/kg、约4x 1011PFU/kg、约5x 1011PFU/kg、约6x 1011PFU/kg、约7x 1011PFU/kg、约8x 1011PFU/kg、约9x 1011PFU/kg或约1012PFU/kg、约1012PFU/kg至约1013PFU/kg、约1013PFU/kg至约1014PFU/kg或约1014PFU/kg至约1015PFU/kg。在一些实施方案中，本公开的经修饰的溶瘤病毒，如溶瘤痘苗病毒，可以以一定的剂量施用，该剂量可包含5x 109PFU/kg。在一些实施方案中，本公开的经修饰的溶瘤病毒，如溶瘤痘苗病毒，可以以一定的剂量施用，该剂量可包含至多5x 109PFU/kg。
在一些实施方案中，本公开的经修饰的溶瘤病毒可以以一定的剂量施用，该剂量可包含约103个病毒颗粒/kg至约104个病毒颗粒/kg、约104个病毒颗粒/kg至约105个病毒颗粒/kg、约105个病毒颗粒/kg至约106个病毒颗粒/kg、约107个病毒颗粒/kg至约108个病毒颗粒/kg、约109个病毒颗粒/kg至约1010个病毒颗粒/kg、约1010个病毒颗粒/kg至约1011个病毒颗粒/kg、约1011个病毒颗粒/kg至约1012个病毒颗粒/kg、约1012个病毒颗粒/kg至约1013个病毒颗粒/kg、约1013个病毒颗粒/kg至约1014个病毒颗粒/kg，或约1014个病毒颗粒/kg至约1015个病毒颗粒/kg。
在某些实施方案中，如本文所述的溶瘤痘苗病毒的液体剂型可包含约103PFU/mL至约104PFU/mL、约104PFU/mL至约105PFU/mL、约105PFU/mL至约106PFU/mL、约107PFU/mL至约108PFU/mL、约109PFU/mL至约1010PFU/mL、约1010PFU/mL至约1011PFU/mL、约1011PFU/mL至约1012PFU/mL、约1012PFU/mL至约1013PFU/mL、约1013PFU/mL至约1014PFU/mL或约1014PFU/mL至约1015PFU/mL的病毒剂量。在一些实施方案中，本公开的经修饰的溶瘤病毒，如溶瘤痘苗病毒，可以以一定的剂量施用，该剂量可包含约2x 103PFU/mL、3x 103PFU/mL、4x 103PFU/mL、5x 103PFU/mL、6x 103PFU/mL、7x 103PFU/mL、8x103PFU/mL、9x 103PFU/mL、约104PFU/mL、约2x 104PFU/mL、约3x104 PFU/mL、约4x 104PFU/mL、约5x 104PFU/mL、约6x 104PFU/mL、约7x104PFU/mL、约8x 104PFU/mL、约9x 104PFU/mL、约105PFU/mL、2x 105PFU/mL、3x 105PFU/mL、4x 105PFU/mL、5x 105PFU/mL、6x105PFU/mL、7x 105PFU/mL、8x 105PFU/mL、9x 105PFU/mL、约106PFU/mL、约2x 106PFU/mL、约3x 106PFU/mL、约4x 106PFU/mL、约5x 106PFU/mL、约6x106PFU/mL、约7x 106PFU/mL、约8x 106PFU/mL、约9x 106PFU/mL、约107PFU/mL、约2x 107PFU/mL、约3x 107PFU/mL、约4x 107PFU/mL、约5x 107PFU/mL、约6x 107PFU/mL、约7x 107PFU/mL、约8x 107PFU/mL、约9x 107PFU/mL、约108PFU/mL、约2x 108PFU/mL、约3x 108PFU/mL、约4x108PFU/mL、约5x 108PFU/mL、约6x 108PFU/mL、约7x 108PFU/mL、约8x 108PFU/mL、约9x108PFU/mL、约109PFU/mL、约2x 109PFU/mL、约3x 109PFU/mL、约4x 109PFU/mL、约5x 109PFU/mL、约6x 109PFU/mL、约7x 109PFU/mL、约8x 109PFU/mL、约9x 109PFU/mL、约1010PFU/mL、约2x 1010PFU/mL、约3x 1010PFU/mL、约4x 1010PFU/mL、约5x1010PFU/mL、约6x 1010PFU/mL、约7x 1010PFU/mL、约8x 1010PFU/mL、约9x 1010PFU/mL、约1010PFU/mL、约2x 1010PFU/mL、约3x1010PFU/mL、约4x 1010PFU/mL、约5x 1010PFU/mL、约6x 1010PFU/mL、约7x 1010PFU/mL、约8x1010PFU/mL、约9x 1010PFU/mL、约1011PFU/mL、约2x 1011PFU/mL、约3x 1011PFU/mL、约4x1011PFU/mL、约5x 1011PFU/mL、约6x 1011PFU/mL、约7x 1011PFU/mL、约8x 1011PFU/mL、约9x1011PFU/mL或约1012PFU/mL、约1012PFU/mL至约1013PFU/mL、约1013PFU/mL至约1014PFU/mL或约1014PFU/mL至约1015PFU/mL。在一些实施方案中，本公开的经修饰的溶瘤病毒，如溶瘤痘苗病毒，可以以一定的剂量施用，该剂量可包含5x 109PFU/mL。在一些实施方案中，本公开的经修饰的溶瘤病毒，如溶瘤痘苗病毒，可以以一定的剂量施用，该剂量可包含至多5x109PFU/mL。
在一些情况下，在通过注射施用经修饰的溶瘤病毒时，剂量可包含每次注射约103个病毒颗粒、每次注射104个病毒颗粒、每次注射105个病毒颗粒、每次注射106个病毒颗粒、每次注射107个病毒颗粒、每次注射108个病毒颗粒、每次注射109个病毒颗粒、每次注射1010个病毒颗粒、每次注射1011个病毒颗粒、每次注射1012个病毒颗粒、每次注射2x 1012个病毒颗粒、每次注射1013个病毒颗粒、每次注射1014个病毒颗粒或每次注射1015个病毒颗粒。在进一步的情况下，在通过注射施用经修饰的溶瘤病毒时，剂量可包含每次注射约103个感染性病毒颗粒、每次注射104个感染性病毒颗粒、每次注射105个感染性病毒颗粒、每次注射106个感染性病毒颗粒、每次注射107个感染性病毒颗粒、每次注射108个感染性病毒颗粒、每次注射109个感染性病毒颗粒、每次注射1010个感染性病毒颗粒、每次注射1011个感染性病毒颗粒、每次注射1012个感染性病毒颗粒、每次注射2x 1012个感染性病毒颗粒、每次注射1013个感染性病毒颗粒、每次注射1014个感染性病毒颗粒或每次注射1015个感染性病毒颗粒。在另外的实施方案中，本公开的经修饰的溶瘤病毒可以以一定的剂量施用，该剂量可以是约103组织培养抑制剂剂量50％(TCID50)/kg、104TCID50/kg、104TCID50/kg、104TCID50/kg、104TCID50/kg、104TCID50/kg、104TCID50/kg、104TCID50/kg、104TCID50/kg、104TCID50/kg、104TCID50/kg、104TCID50/kg、104TCID50/kg、3x108 TCID50/kg、4x108 TCID50/kg、5x108TCID50/kg、3x109 TCID50/kg、4x109 TCID50/kg、5x109 TCID50/kg、3x1010 TCID50/kg、4x1010TCID50/kg或4x1010 TCID50/kg。注意，此处10x另外被表示为1eX。在某些实施方案中，经修饰的溶瘤病毒可以以一个或多个剂量施用。在某些实施方案中，该病毒可以以一定的量施用，该量足以诱导肿瘤中至少约20％的细胞、肿瘤中至少约30％的细胞、肿瘤中至少约40％的细胞、肿瘤中至少约50％的细胞、肿瘤中至少约60％的细胞、肿瘤中至少约70％的细胞、肿瘤中至少约80％的细胞或肿瘤中至少约90％的细胞发生溶瘤。在某些实施方案中，单剂量的病毒可指在1、2、5、10、15、20或24小时的时期内施用于受试者或肿瘤的量。在某些实施方案中，该剂量可以随时间或通过单独的注射来扩散。在某些实施方案中，可以向受试者施用多个剂量(例如，2、3、4、5、6个或更多个剂量)的痘苗病毒，例如，第二次治疗可在第一次治疗后的1、2、3、4、5、6、7天或周内进行。在某些实施方案中，可以在1、2、3、4、5、6、7天或更多天或周的时期内向受试者施用多个剂量的经修饰的溶瘤病毒。在某些实施方案中，如本文所述的溶瘤痘苗病毒或药物组合物可以在约1周至约2周、约2周至约3周、约3周至约4周、约4周至约5周、约6周至约7周、约7周至约8周、约8周至约9周、约9周至约10周、约10周至约11周、约11周至约12周、约12周至约24周、约24周至约48周、约48周或约52周或更长的时期内施用。在某些情况下，如本文所述的溶瘤痘苗病毒或药物组合物的施用频率可以是每日一次、每日两次、每周一次、每三周一次、每四周一次(或每月一次)、每8周一次(或每2个月一次)、每12周一次(或每3个月一次)或每24周一次(每6个月一次)。在本文公开的方法的一些实施方案中，该溶瘤痘苗病毒或药物组合物可以独立地以初始剂量施用第一时间段、以中间剂量施用第二时间段并且以高剂量施用第三时间段。在一些实施方案中，初始剂量低于中间剂量，并且中间剂量低于高剂量。在一些实施方案中，第一时间段、第二时间段和第三时间段可以独立地为约1周至约2周、约2周至约3周、约3周至约4周、约4周至约5周、约6周至约7周、约7周至约8周、约8周至约9周、约9周至约10周、约10周至约11周、约11周至约12周、约12周至约24周、约24周至约48周、约48周或约52周，或更长。
在一些实例中，根据本文所述的任何治疗方法，可以在施用如本文所述的经修饰的溶瘤病毒如溶瘤痘苗病毒或包含该病毒的药物组合物之前、同时和之后使所述受试者进食碳水化合物减少的饮食，例如生酮饮食。在某些实施方案中，使所述受试者进食这样的饮食，该饮食可包括食用每天少于500克的碳水化合物、每天少于450克的碳水化合物、每天少于450克的碳水化合物、每天少于400克的碳水化合物、每天少于350克的碳水化合物、每天少于300克的碳水化合物、每天少于250克的碳水化合物、每天少于200克的碳水化合物、每天少于150克的碳水化合物、每天少于100克的碳水化合物、每天少于90克的碳水化合物、每天少于80克的碳水化合物、每天少于70克的碳水化合物、每天少于60克的碳水化合物、每天少于50克的碳水化合物、每天少于40克的碳水化合物、每天少于30克的碳水化合物、每天少于20克的碳水化合物，或每天少于10克的碳水化合物。
用于将本公开的经修饰的溶瘤病毒例如本文所述的溶瘤痘苗病毒或包含该病毒的药物组合物递送至癌细胞或肿瘤细胞的示例性方法可以通过瘤内注射。然而，也可以使用替代的施用方法，例如静脉内、通过输注、肠胃外、静脉内、皮内、肌肉内、透皮、直肠、尿道内、阴道内、鼻内、鞘内或腹膜内。施用途径可随肿瘤的位置和性质而不同。在某些实施方案中，施用途径可以是牙内、透皮、肠胃外、静脉内、肌肉内、鼻内、皮下、局部(例如，在肿瘤附近，特别是肿瘤的脉管系统或相邻脉管系统)、经皮、鞘内、气管内、腹膜内、动脉内、膀胱内、瘤内、吸入、灌注、通过灌洗或口服。可注射剂量的溶瘤病毒可以以团注或缓慢输注的形式施用。在某些实施方案中，可从植入患者中的来源向患者施用经修饰的溶瘤病毒。在某些实施方案中，经修饰的溶瘤病毒的施用可以通过在选定的一段时间内连续输注来进行。在一些情况下，如本文所述的溶瘤痘苗病毒或包含该病毒的药物组合物可以通过在约15分钟、约30分钟、约45分钟、约50分钟、约55分钟、约60分钟、约75分钟、约90分钟、约100分钟或约120分钟或更长的时间段内输注而以治疗有效剂量施用。本公开的溶瘤痘苗病毒或药物组合物可以以液体剂量的形式施用，其中施用的总体积为约1mL至约5mL、约5mL至10mL、约15mL至约20mL、约25mL至约30mL、约30mL至约50mL、约50mL至约100mL、约100mL至150mL、约150mL至约200mL、约200mL至约250mL、约250mL至约300mL、约300mL至约350mL、约350mL至约400mL、约400mL至约450mL、约450mL至500mL、约500mL至750mL或约750mL至1000mL。
药物组合物
含有经修饰的病毒例如如本文所述的溶瘤痘苗病毒的药物组合物可制备成溶液，在甘油、液体聚乙二醇中的分散体，及其在油中的任何组合，固体剂型、可吸入剂型、鼻内剂型、脂质体制剂、包含纳米颗粒的剂型、包含微粒的剂型、聚合物剂型，或它们的任意组合。在一些实施方案中，如本文所述的药物组合物可包含稳定剂和缓冲液。在一些实施方案中，如本文所述的药物组合物可包含增溶剂，如无菌水、Tris缓冲液。在一些实施方案中，如本文所述的药物组合物可包含赋形剂。赋形剂可以是Handbook of PharmaceuticalExcipients,American Pharmaceutical Association(1986)中描述的赋形剂。合适的赋形剂的非限制性实例可包括缓冲剂、防腐剂、稳定剂、粘合剂、压实剂、润滑剂、螯合剂、分散增强剂、崩解剂、调味剂、甜味剂、着色剂。
在一些实施方案中，赋形剂可以是缓冲剂。合适的缓冲剂的非限制性实例可包括柠檬酸钠、碳酸镁、碳酸氢镁、碳酸钙和碳酸氢钙。作为缓冲剂，碳酸氢钠、碳酸氢钾、氢氧化镁、乳酸镁、葡糖酸镁、氢氧化铝、柠檬酸钠、酒石酸钠、乙酸钠、碳酸钠、多磷酸钠、多磷酸钾、焦磷酸钠、焦磷酸钾、磷酸氢二钠、磷酸氢二钾、磷酸三钠、磷酸三钾、偏磷酸钾、氧化镁、氢氧化镁、碳酸镁、硅酸镁、乙酸钙、甘油磷酸钙、氯化钙、氢氧化钙和其他钙盐或其组合可以在药物制剂中使用。
在一些实施方案中，赋形剂可包括防腐剂。合适的防腐剂的非限制性实例可包括抗氧化剂，如α-生育酚和抗坏血酸盐，以及抗微生物剂，如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇和苯酚。抗氧化剂可以进一步包括但不限于EDTA、柠檬酸、抗坏血酸、丁羟甲苯(BHT)、丁羟茴醚(BHA)、亚硫酸钠、对氨基苯甲酸、谷胱甘肽、没食子酸丙酯、半胱氨酸、甲硫氨酸、乙醇和N-乙酰半胱氨酸。在一些情况下，防腐剂可包括有效霉素A、TL-3、原钒酸钠、氟化钠、N-a-甲苯磺酰基-Phe-氯甲基酮、N-a-甲苯磺酰基-Lys-氯甲基酮、抑肽酶、苯甲基磺酰氟、氟磷酸二异丙酯、激酶抑制剂、磷酸酶抑制剂、胱天蛋白酶抑制剂、粒酶抑制剂、细胞粘附抑制剂、细胞分裂抑制剂、细胞周期抑制剂、脂质信号传导抑制剂、蛋白酶抑制剂、还原剂、烷化剂、抗微生物剂、氧化酶抑制剂或其他抑制剂。
在一些实施方案中，如本文所述的药物组合物可包含粘合剂作为赋形剂。合适的粘合剂的非限制性实例可包括淀粉、预胶化淀粉、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、乙基纤维素、聚丙烯酰胺、聚乙烯基噁唑烷酮(polyvinyloxoazolidone)、聚乙烯醇、C12-C18脂肪酸醇、聚乙二醇、多元醇、糖类、寡糖及其组合。可在药物制剂中使用的粘合剂可选自淀粉，如马铃薯淀粉、玉米淀粉、小麦淀粉；糖，如蔗糖、葡萄糖、右旋糖、乳糖、麦芽糖糊精；天然树胶和合成树胶；明胶；纤维素衍生物，如微晶纤维素、羟丙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素；聚乙烯吡咯烷酮(聚维酮)；聚乙二醇(PEG)；蜡类；碳酸钙；磷酸钙；醇类，如山梨醇、木糖醇、甘露醇，以及水，或它们的组合。
在一些实施方案中，如本文所述的药物组合物可包含润滑剂作为赋形剂。合适的润滑剂的非限制性实例可包括硬脂酸镁、硬脂酸钙、硬脂酸锌、氢化植物油、sterotex、聚氧乙烯单硬脂酸酯、滑石、聚乙二醇、苯甲酸钠、十二烷基硫酸钠、十二烷基硫酸镁和轻质矿物油。可在药物制剂中使用的润滑剂可选自金属硬脂酸盐(如硬脂酸镁、硬脂酸钙、硬脂酸铝)、脂肪酸酯(如硬脂酰富马酸钠)、脂肪酸(如硬脂酸)、脂肪醇、山萮酸甘油酯、矿物油、石蜡、氢化植物油、亮氨酸、聚乙二醇(PEG)、金属十二烷基硫酸盐(如十二烷基硫酸钠、十二烷基硫酸镁)、氯化钠、苯甲酸钠、乙酸钠和滑石，或它们的组合。
在一些实施方案中，药物制剂可包含分散增强剂作为赋形剂。合适的分散剂的非限制性实例可包括淀粉、海藻酸、聚乙烯吡咯烷酮、瓜尔胶、高岭土、膨润土、纯化木纤维素、羟基乙酸淀粉钠、同晶硅酸盐(isoamorphous silicate)和微晶纤维素作为高HLB乳化剂表面活性剂。
在一些实施方案中，如本文所述的药物组合物可包含崩解剂作为赋形剂。在一些实施方案中，崩解剂可以是非泡腾崩解剂。合适的非泡腾崩解剂的非限制性实例可包括淀粉如玉米淀粉、马铃薯淀粉、其预胶化和改性淀粉、甜味剂、粘土如膨润土、微晶纤维素、藻酸盐、羟基乙酸淀粉钠、树胶如琼脂、瓜尔胶、刺槐豆胶、刺梧桐胶、果胶和黄蓍胶。在一些实施方案中，崩解剂可以是泡腾崩解剂。合适的泡腾崩解剂的非限制性实例可包括碳酸氢钠与柠檬酸的组合，以及碳酸氢钠与酒石酸的组合。
在一些实施方案中，赋形剂可包括调味剂。掺入外层的调味剂可选自合成调味油和调味芳香剂；天然油；植物、叶、花和果实的提取物；及其组合。在一些实施方案中，调味剂可选自肉桂油；冬青油；薄荷油；三叶草油；干草油；茴香油；桉；香草；柑橘油，如柠檬油、橙油、葡萄油和葡萄柚油；以及水果香精，包括苹果、桃、梨、草莓、覆盆子、樱桃、李子、菠萝和杏的香精。
在一些实施方案中，赋形剂可包括甜味剂。合适的甜味剂的非限制性实例可包括葡萄糖(玉米糖浆)、右旋糖、转化糖、果糖及其混合物(当不用作载体时)；糖精及其各种盐，如钠盐；二肽甜味剂，如阿斯巴甜；二氢查尔酮化合物、甘草甜素；甜叶菊(SteviaRebaudiana)(甜菊甙)；蔗糖的氯衍生物如三氯蔗糖；以及糖醇如山梨醇、甘露醇、木糖醇(sylitol)等。
在一些情况下，如本文所述的药物组合物可包含着色剂。合适的着色剂的非限制性实例可包括食品、药物和化妆品着色剂(FD&C)，药物和化妆品着色剂(D&C)，以及外用药物和化妆品着色剂(Ext.D&C)。着色剂可用作染料或其相应的色淀。
在一些情况下，如本文所述的药物组合物可包含螯合剂。在一些情况下，螯合剂可以是杀真菌螯合剂。实例可包括但不限于：乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸(EDTA)；EDTA的二钠、三钠、四钠、二钾、三钾、二锂和二铵盐；EDTA的钡、钙、钴、铜、镝、铕、铁、铟、镧、镁、锰、镍、钐、锶或锌螯合物；反式-1,2-环己烷-N,N,N',N'-四乙酸一水合物；N,N-双(2-羟乙基)甘氨酸；1,3-二氨基-2-羟基丙烷-N,N,N',N'-四乙酸；1,3-二氨基丙烷-N,N,N',N'-四乙酸；乙二胺-N,N'-二乙酸；乙二胺-N,N'-二丙酸二盐酸盐；乙二胺-N,N'-双(亚甲基膦酸)半水合物；N-(2-羟乙基)乙二胺-N,N',N'-三乙酸；乙二胺-N,N,N',N'-四(亚甲基膦酸)；O,O'-双(2-氨基乙基)乙二醇-N,N,N',N'-四乙酸；N,N-双(2-羟基苄基)乙二胺-N,N-二乙酸；1,6-六亚甲基二胺-N,N,N',N'-四乙酸；N-(2-羟乙基)亚氨基二乙酸；亚氨基二乙酸；1,2-二氨基丙烷-N,N,N',N'-四乙酸；次氮基三乙酸；次氮基三丙酸；次氮基三(亚甲基磷酸)的三钠盐；7,19,30-三氧杂-1,4,10,13,16,22,27,33-八氮杂双环[11,11,11]三十五烷六氢溴化物；或三乙烯四胺-N,N,N',N",N'",N'"-六乙酸。
还涉及组合产品，其包含一种或多种本文公开的经修饰的溶瘤病毒和一种或多种其他抗微生物剂或抗真菌剂，例如，多烯如两性霉素B、两性霉素B脂质复合物(ABCD)、脂质体两性霉素B(L-AMB)和脂质体制霉菌素、唑类和三唑类如伏立康唑、氟康唑、酮康唑、伊曲康唑、泊沙康唑等；葡聚糖合酶抑制剂如卡泊芬净、米卡芬净(FK463)和V-棘白菌素(LY303366)；灰黄霉素；烯丙胺类如特比萘芬；氟胞嘧啶或其他抗真菌剂，包括本文所述的那些。另外，预期肽可以与局部抗真菌剂如环吡酮胺、卤普罗近、托萘酯、十一烯酸酯、局部制霉菌素、阿莫罗芬、布替萘芬、萘替芬、特比萘芬和其他局部药剂组合。在一些情况下，药物组合物可包含额外的药剂。在一些情况下，额外的药剂可以以治疗有效量存在于药物组合物中。
在普通的储存和使用条件下，如本文所述的药物组合物可包含防腐剂以防止微生物的生长。在某些实例中，如本文所述的药物组合物可不包含防腐剂。适合注射使用的药物形式可包括无菌的水溶液或分散液和用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。药物组合物可包含载体，该载体是溶剂或分散介质，其包含例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)和/或植物油，或其任意组合。例如，可通过使用诸如卵磷脂等涂层，在分散体的情况下通过维持所需的颗粒大小，以及通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。可通过各种抗细菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等来阻止微生物的作用。在许多情况下，优选包含等渗剂，例如糖或氯化钠。通过在组合物中使用延迟吸收剂，例如单硬脂酸铝和明胶，可以引起可注射组合物的延长吸收。
例如，对于在水溶液中的肠胃外施用，如有必要，可以将液体剂型适当地缓冲，并且用足够的盐水或葡萄糖使液体稀释剂等渗。液体剂型特别适用于静脉内、肌肉内、皮下、瘤内和腹膜内施用。在这方面，根据本公开内容，可采用的无菌水性介质是本领域技术人员已知的。例如，可将一个剂量溶解于1mL至20mL的等渗NaCl溶液中，并且添加至100mL至1000mL的流体(例如，碳酸氢钠缓冲盐水)中，或在建议的输注部位处注射。
在某些实施方案中，可通过按需要将根据本公开的经修饰的溶瘤病毒例如如本文所述的溶瘤痘苗病毒或含有该病毒的药物组合物以所需的量掺入具有上文列举的各种其他成分的适当溶剂中，然后过滤除菌来制备无菌可注射溶液。通常，通过将各种灭菌的活性成分掺入无菌媒介物中来制备分散体，该无菌媒介物含有基础分散介质和来自上文列举的那些成分中的所需其他成分。本文公开的组合物可配制成中性或盐形式。药学上可接受的盐包括酸加成盐(通过蛋白质的游离氨基形成)，并且该盐是用无机酸例如盐酸或磷酸，或有机酸如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等形成的。通过游离羧基形成的盐还可以衍生自无机碱，例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁，以及有机碱，如异丙胺、三甲胺、组氨酸、普鲁卡因等。在配制时，药物组合物可以以与剂量制剂相容的方式和治疗有效的量施用。
在某些实施方案中，本公开的药物组合物可包含有效量的本文公开的经修饰的病毒，以及药学上可接受的载体。如本文所用的，“药学上可接受的”包括不干扰活性成分的生物活性的有效性并且/或者对其所施用至的患者无毒的任何载体。合适的药物载体的非限制性实例包括磷酸盐缓冲盐水溶液、水、乳液如油/水乳液、各种类型的润湿剂和无菌溶液。药学上相容的载体的其他非限制性实例可包括凝胶、生物可吸收的基质材料、含有经修饰的溶瘤病毒的植入元件，或其他任何合适的媒介物、递送或分配工具或材料。这样的载体可通过常规方法配制，并且可以以有效量施用于受试者。
生产方法
可以通过本领域技术人员已知的方法来产生本公开的经修饰的溶瘤病毒。在某些实施方案中，经修饰的溶瘤病毒可以在合适的宿主细胞(例如，HeLa细胞、293细胞或Vero细胞)中繁殖，从宿主细胞中分离，并在有利于病毒的稳定性和完整性的条件下储存，从而使感染性随时间的丧失最小化。在某些示例性方法中，使用细胞堆叠器(cell stack)、滚瓶或灌注生物反应器在宿主细胞中繁殖经修饰的溶瘤病毒。在一些实例中，用于纯化经修饰的溶瘤病毒的下游方法可包括过滤(例如，深层过滤、切向流过滤或其组合)、超速离心或色谱捕获。例如，可以通过冷冻或干燥，如通过冻干，来储存经修饰的溶瘤病毒。在某些实施方案中，在施用之前，可以在药学上可接受的载体中重建(如果被干燥以供储存)并稀释所储存的经修饰的溶瘤病毒以供施用。
一些实施方案提供了与其他方面相同但不包含经修饰的溶瘤病毒中的修饰的病毒相比，本文所述的经修饰的溶瘤病毒在HeLa细胞和293细胞中表现出更高的滴度。在某些情况下，在经修饰的溶瘤病毒中观察到在HeLa细胞和293细胞中的较高滴度。
联合疗法
在某些实施方案中，本公开的方法包括在一种或多种另外的疗法之前、之后或与其联合地施用如本文公开的经修饰的溶瘤病毒或含有该病毒的药物组合物。所述另外的疗法的实例可包括但不限于化学疗法、放射疗法、采用额外的病毒的溶瘤病毒疗法、采用免疫调节蛋白的治疗、抗癌剂或其任意组合。相对于经修饰的病毒如溶瘤痘苗病毒的施用，所述另外的疗法可以同时或顺序地施用。在某些实施方案中，本公开的方法可包括在一种或多种抗癌剂或癌症疗法之前、之后或与其联合地施用如本文公开的经修饰的溶瘤病毒。抗癌剂可包括但不限于化疗剂、放疗剂、细胞因子、免疫检查点抑制剂、抗血管生成剂、凋亡诱导剂、抗癌抗体和/或抗细胞周期蛋白依赖性激酶剂。在某些实施方案中，癌症疗法可包括化学疗法、生物疗法、放射疗法、免疫疗法、激素疗法、抗血管疗法、冷冻疗法、毒素疗法和/或手术或其组合。在某些实施方案中，本公开的方法可包括在本公开的经修饰的溶瘤病毒之前、之后或与其联合地施用本文公开的经修饰的病毒。经修饰的溶瘤痘苗病毒与化学疗法的联合实现了协同效应，该协同效应在不包含所述经修饰的溶瘤病毒中的修饰的经修饰的溶瘤病毒中未观察到。上述联合的协同效应可有利地用来降低化学疗法如
Figure BDA0002564394690000741
的剂量。因此，本文公开的使用经修饰的病毒的治疗方法可以降低与化学疗法相关的毒性，例如，对化学疗法有反应但在治疗剂量下发生副作用的患者。在某些情况下，与单独的化学疗法或单独的溶瘤痘苗病毒相比，协同效应可导致肿瘤生长降低。肿瘤生长的示例性降低可以是约2％至约50％，如约5％、约10％、约20％、约25％、约35％、约45％或约50％。
在某些实施方案中，使用经修饰的溶瘤病毒的治疗可单独使用或与一种或多种免疫调节剂联合使用。免疫调节剂可包括能够抑制与肿瘤或癌症相关的抗病毒免疫的任何化合物、分子或物质。在某些实施方案中，免疫调节剂可能能够抑制对经修饰的病毒的先天免疫或适应性免疫。免疫调节剂的非限制性实例包括抗CD33抗体或其可变区、抗CD11b抗体或其可变区、COX2抑制剂(例如，塞来昔布)、细胞因子如IL-12、GM-CSF、IL-2、IFN3和IFNγ，以及趋化因子如MIP-1、MCP-1和IL-8。在某些实施方案中，免疫调节剂可包括免疫检查点调节剂，例如但不限于抗CTLA4、抗PD-1和抗PD-L1和TLR激动剂(例如，聚I:C)。在一些实例中，免疫调节剂可包括免疫检查点抑制剂，如PD-1的拮抗剂(例如，与PD-1结合的拮抗剂抗体)、PD-L1的拮抗剂(例如，与PD-L1结合的拮抗剂抗体)、CTLA-4的拮抗剂(例如，与CTLA-4结合的拮抗剂抗体)、A2AR的拮抗剂(例如，与A2AR结合的拮抗剂抗体)、B7-H3的拮抗剂(例如，与B7-H3结合的拮抗剂抗体)、B7-H4的拮抗剂(例如，与B7-H4结合的拮抗剂抗体)、BTLA的拮抗剂(例如，与BTLA结合的拮抗剂抗体)、IDO的拮抗剂(例如，与IDO结合的拮抗剂抗体)、KIR的拮抗剂(例如，与KIR结合的拮抗剂抗体)、LAG3的拮抗剂(例如，与LAG3结合的拮抗剂抗体)、TIM-3的拮抗剂(例如，与TIM3结合的拮抗剂抗体)。在一些实施方案中，所述另外的疗法可包括施用免疫检查点调节剂。在一个实例中，该免疫检查点调节剂可以是TGN1412。在一个实例中，该免疫检查点调节剂可以是NKTR-214。在一个实例中，该免疫检查点调节剂可以是MEDI0562。在一个实例中，该免疫检查点调节剂可以是MEDI6469。在一个实例中，该免疫检查点调节剂可以是MEDI6383。在一个实例中，该免疫检查点调节剂可以是JTX-2011。在一个实例中，该免疫检查点调节剂可以是Keytruda(派姆单抗)。在一个实例中，该免疫检查点调节剂可以是Opdivo(纳武单抗)。在一个实例中，该免疫检查点调节剂可以是Yervoy(伊匹木单抗)。在一个实例中，该免疫检查点调节剂可以是曲美木单抗。在一个实例中，该免疫检查点调节剂可以是Tecentriq(阿特朱单抗)。在一个实例中，该免疫检查点调节剂可以是MGA271。在一个实例中，该免疫检查点调节剂可以是indoximod。在一个实例中，该免疫检查点调节剂可以是Epacadostat。在一个实例中，该免疫检查点调节剂可以是lirilumab。在一个实例中，该免疫检查点调节剂可以是BMS-986016。在一个实例中，该免疫检查点调节剂可以是MPDL3280A。在一个实例中，该免疫检查点调节剂可以是avelumab。在一个实例中，该免疫检查点调节剂可以是durvalumab。在一个实例中，该免疫检查点调节剂可以是MEDI4736。在一个实例中，该免疫检查点调节剂可以是MEDI4737。在一个实例中，该免疫检查点调节剂可以是TRX518。在一个实例中，该免疫检查点调节剂可以是MK-4166。在一个实例中，该免疫检查点调节剂可以是urelumab(BMS-663513)。在一个实例中，该免疫检查点调节剂可以是PF-05082566(PF-2566)。
在某些实例中，在所述另外的疗法是放射疗法的情况下，示例性的剂量可以是5,000Rad(50Gy)至100,000Rad(1000Gy)，或50,000Rad(500Gy)，或所述范围内的其他合适的剂量。或者，放射剂量可以是约30至60Gy、约40至约50Gy、约40至48Gy或约44Gy，或所述范围内的其他合适的剂量，其中该剂量例如通过如上所述的剂量学研究来确定。如本文所用的“Gy”可指等于100Rad的辐射的特定吸收剂量的单位。Gy是“戈瑞(Gray)”的缩写。
在某些实例中，在所述另外的疗法是化学疗法的情况下，示例性的化疗剂可包括但不限于烷化剂(例如，氮芥衍生物、乙烯亚胺、烷基磺酸酯、肼和三嗪、亚硝基脲和金属盐)、植物生物碱(例如，长春花生物碱、紫杉烷、鬼臼毒素和喜树碱类似物)、抗肿瘤抗生素(例如，蒽环类、色霉素类等)、抗代谢物(例如，叶酸拮抗剂、嘧啶拮抗剂、嘌呤拮抗剂和腺苷脱氨酶抑制剂)、拓扑异构酶I抑制剂、拓扑异构酶II抑制剂和各种其他抗肿瘤药(例如，核糖核苷酸还原酶抑制剂、肾上腺皮质类固醇抑制剂、酶、抗微管剂和类视黄醇)。示例性的化疗剂可以包括但不限于阿那曲唑
Figure BDA0002564394690000761
比卡鲁胺
Figure BDA0002564394690000762
硫酸博来霉素
Figure BDA0002564394690000763
白消安
Figure BDA0002564394690000764
白消安注射液
Figure BDA0002564394690000765
卡培他滨
Figure BDA0002564394690000766
N4-戊氧羰基-5-脱氧-5-氟胞苷、卡铂
Figure BDA0002564394690000767
卡莫司汀
Figure BDA0002564394690000768
苯丁酸氮芥
Figure BDA0002564394690000769
顺铂
Figure BDA00025643946900007610
克拉屈滨
Figure BDA00025643946900007611
环磷酰胺(
Figure BDA00025643946900007612
或
Figure BDA00025643946900007613
)、阿糖胞苷、胞嘧啶阿糖核苷
Figure BDA0002564394690000771
阿糖胞苷脂质体注射液
Figure BDA0002564394690000772
达卡巴嗪
Figure BDA0002564394690000773
更生霉素(放线菌素D、Cosmegan)、盐酸柔红霉素
Figure BDA0002564394690000774
柠檬酸柔红霉素脂质体注射液
Figure BDA0002564394690000775
地塞米松、多西他赛
Figure BDA0002564394690000776
盐酸多柔比星
Figure BDA0002564394690000777
依托泊苷
Figure BDA0002564394690000778
磷酸氟达拉滨
Figure BDA0002564394690000779
5-氟尿嘧啶
Figure BDA00025643946900007710
氟他胺
Figure BDA00025643946900007711
替扎他滨、吉西他滨(二氟脱氧胞苷)、羟基脲
Figure BDA00025643946900007712
伊达比星
Figure BDA00025643946900007713
异环磷酰胺
Figure BDA00025643946900007714
伊立替康
Figure BDA00025643946900007715
L-天冬酰胺酶
Figure BDA00025643946900007716
甲酰四氢叶酸钙、美法仑
Figure BDA00025643946900007717
6-巯基嘌呤
Figure BDA00025643946900007718
甲氨蝶呤
Figure BDA00025643946900007719
米托蒽醌
Figure BDA00025643946900007720
麦罗塔、紫杉醇
Figure BDA00025643946900007721
phoenix(Yttrium90/MX-DTPA)、喷司他汀、聚苯丙生20与卡莫司汀植入物
Figure BDA00025643946900007722
柠檬酸他莫昔芬
Figure BDA00025643946900007723
替尼泊苷
Figure BDA00025643946900007724
6-硫鸟嘌呤、噻替派、替拉扎明
Figure BDA00025643946900007725
注射用盐酸拓扑替康
Figure BDA00025643946900007726
长春碱
Figure BDA00025643946900007727
长春新碱
Figure BDA00025643946900007728
和长春瑞滨
Figure BDA00025643946900007729
依鲁替尼、艾代拉利司(idelalisib)和维本妥昔单抗(brentuximabvedotin)。
示例性的烷化剂可以包括但不限于氮芥、乙烯亚胺衍生物、烷基磺酸酯、亚硝基脲和三氮烯(triazenes)：尿嘧啶氮芥
Figure BDA00025643946900007730
Figure BDA00025643946900007731
Figure BDA00025643946900007732
盐酸氮芥
Figure BDA00025643946900007733
环磷酰胺(
Figure BDA00025643946900007734
RevimmuneTM)、异环磷酰胺
Figure BDA00025643946900007735
美法仑
Figure BDA00025643946900007736
苯丁酸氮芥
Figure BDA00025643946900007737
哌泊溴烷
Figure BDA00025643946900007738
三亚乙基三聚氰胺
Figure BDA00025643946900007739
三亚乙基硫代磷酰胺、替莫唑胺
Figure BDA00025643946900007740
噻替派
Figure BDA00025643946900007741
白消安
Figure BDA00025643946900007742
卡莫司汀
Figure BDA00025643946900007743
洛莫司汀
Figure BDA00025643946900007744
链脲菌素
Figure BDA00025643946900007745
和达卡巴嗪
Figure BDA00025643946900007746
另外的示例性烷化剂包括但不限于奥沙利铂
Figure BDA00025643946900007747
替莫唑胺(
Figure BDA00025643946900007748
和
Figure BDA00025643946900007749
)；更生霉素(也称为放线菌素-D，
Figure BDA0002564394690000781
)；美法仑(也称为L-PAM、L-溶肉瘤素(L-sarcolysin)和苯丙氨酸氮芥，
Figure BDA0002564394690000782
)；六甲蜜胺(也称为六甲基三聚氰胺(HMM)，
Figure BDA0002564394690000783
)；卡莫司汀
Figure BDA0002564394690000784
苯达莫司汀
Figure BDA0002564394690000785
白消安(
Figure BDA0002564394690000786
和
Figure BDA0002564394690000787
)；卡铂
Figure BDA0002564394690000788
洛莫司汀(也称为CCNU，
Figure BDA0002564394690000789
)；顺铂(也称为CDDP，
Figure BDA00025643946900007810
和
Figure BDA00025643946900007811
)；苯丁酸氮芥
Figure BDA00025643946900007812
环磷酰胺(
Figure BDA00025643946900007813
和
Figure BDA00025643946900007814
)；达卡巴嗪(也称为DTIC、DIC和咪唑甲酰胺，
Figure BDA00025643946900007815
)；六甲蜜胺(也称为六甲基三聚氰胺(HMM)，
Figure BDA00025643946900007816
)；异环磷酰胺
Figure BDA00025643946900007817
泼尼氮芥(Prednumustine)；丙卡巴肼
Figure BDA00025643946900007818
二氯甲基二乙胺(也称为氮芥、盐酸氮芥(mustine)和二氯甲基二乙胺盐酸盐，
Figure BDA00025643946900007819
)；链脲菌素
Figure BDA00025643946900007820
噻替哌(也称为硫代磷酰胺、TESPA和TSPA，
Figure BDA00025643946900007821
)；环磷酰胺
Figure BDA00025643946900007822
Figure BDA00025643946900007823
以及盐酸苯达莫司汀
Figure BDA00025643946900007824
示例性的蒽环类可包括但不限于，例如，多柔比星(
Figure BDA00025643946900007825
和
Figure BDA00025643946900007826
)；博来霉素
Figure BDA00025643946900007827
柔红霉素(盐酸柔红霉素、道诺霉素和盐酸红比霉素，
Figure BDA00025643946900007828
)；柔红霉素脂质体(柠檬酸柔红霉素脂质体，
Figure BDA00025643946900007829
)；米托蒽醌(DHAD，
Figure BDA00025643946900007830
)；表柔比星(EllenceTM)；伊达比星
Figure BDA00025643946900007831
丝裂霉素C
Figure BDA00025643946900007832
格尔德霉素；除莠霉素；拉维霉素(ravidomycin)；以及去乙酰基拉维霉素(desacetylravidomycin)。
示例性的长春花生物碱可包括但不限于酒石酸长春瑞滨
Figure BDA00025643946900007833
长春新碱
Figure BDA00025643946900007834
和长春地辛
Figure BDA00025643946900007835
长春碱(也称为硫酸长春碱、长春花碱和VLB，
Figure BDA00025643946900007836
和
Figure BDA00025643946900007837
)；以及长春瑞滨
Figure BDA00025643946900007838
示例性的蛋白酶体抑制剂可以是但不限于硼替佐米
Figure BDA00025643946900007839
卡非佐米(PX-171-007，(S)-4-甲基-N-((S)-1-(((S)-4-甲基-1-((R)-2-甲基环氧乙烷-2-基)-1-氧代戊-2-基)氨基)-1-氧代-3-苯基丙-2-基)-2-((S)-2-(2-吗啉代乙酰胺基)-4-苯基丁酰胺基)-戊酰胺)；marizomib(NPI-0052)；柠檬酸艾沙佐米(MLN-9708)；delanzomib(CEP-18770)；以及O-甲基-N-[(2-甲基-5-噻唑基)羰基]-L-丝氨酰基-O-甲基-N-[(1S)-2-[(2R)-2-甲基-2-环氧乙烷基]-2-氧代-1-(苯基甲基)乙基]-L-丝氨酰胺(ONX-0912)。
如本文所用的，“与......联合”意指将经修饰的病毒，例如如本文所述的溶瘤痘苗病毒或包含该病毒的药物组合物，与另外的疗法如包含一种或多种药剂的另外的疗法作为治疗方案或计划的一部分施用于受试者。在某些实施方案中，联合使用并不要求在施用前将经修饰的溶瘤病毒与一种或多种药剂物理混合，也不要求其在同一时间范围内施用。例如，非限制性地，经修饰的溶瘤病毒和一种或多种药剂可以同时施用于所治疗的受试者，或者可以同一时间施用或以任何顺序或在不同的时间点顺序施用。
在多个实施方案中，所述另外的疗法可以以液体剂型、固体剂型、栓剂、可吸入剂型、鼻内剂型、脂质体制剂、包含纳米颗粒的剂型、包含微粒的剂型、聚合物剂型或其任意组合施用。在某些实施方案中，所述另外的疗法在约1周至约2周、约2周至约3周、约3周至约4周、约4周至约5周、约6周至约7周、约7周至约8周、约8周至约9周、约9周至约10周、约10周至约11周、约11周至约12周、约12周至约24周、约24周至约48周、约48周或约52周或更长的时期内施用。在某些情况下，所述另外的疗法的施用频率可以是每日一次、每日两次、每周一次、每三周一次、每四周一次(或每月一次)、每8周一次(或每2个月一次)、每12周一次(或每3个月一次)或每24周一次(每6个月一次)。在某些实施方案中，治疗患有癌症的受试者的方法可包括向该受试者施用有效量的本公开的经修饰的溶瘤病毒，例如经修饰的痘苗病毒。在某些实施方案中，本公开的方法可进一步包括向受试者施用有效量的一种或多种药剂。例如，非限制性地，该药剂可以是如上所述的抗癌剂、免疫调节剂或其任意组合。
试剂盒
在实施方案中，本公开提供了用于施用如本文所述的经修饰的溶瘤病毒的试剂盒。在某些实施方案中，本公开的试剂盒可包括经修饰的溶瘤病毒或包含如上所述的经修饰的溶瘤病毒的药物组合物。在某些实施方案中，本公开的试剂盒可进一步包含一种或多种组成部分，如使用说明书、装置和额外的试剂，以及用于执行以上公开的方法的组成部分，如管、容器和注射器。在某些实施方案中，本公开的试剂盒可进一步包含一种或多种药剂，例如抗癌剂、免疫调节剂或其任意组合中的至少一种，该药剂可以与经修饰的病毒联合施用。
在某些实施方案中，本公开的试剂盒可包含一个或多个容纳本文公开的经修饰的病毒的容器。例如，非限制性地，本公开的试剂盒可包含一个或多个容纳本公开的经修饰的溶瘤病毒的容器。
在某些实施方案中，本公开的试剂盒可包含使用说明书、用于向受试者施用经修饰的溶瘤病毒的装置或用于向受试者施用额外的药剂或化合物的装置。例如，非限制性地，说明书可包括对经修饰的溶瘤病毒和可选的试剂盒中包含的其他组成部分，以及施用方法的描述，该施用方法包括用于确定受试者的适当状态、适当剂量的方法以及用于施用经修饰的病毒的适当施用方法。说明书还可包括在治疗时间的期间内监测受试者的指南。
在某些实施方案中，本公开的试剂盒可包含用于向受试者施用经修饰的溶瘤病毒的装置。本领域已知用于施用药物和药物组合物的多种装置中的任一种可包含在本文提供的试剂盒中。例如，非限制性地，这类装置包括皮下注射针、静脉注射针、导管、无针注射装置、吸入器和液体分配器如点眼药器。在某些实施方案中，有待例如通过静脉内注射、瘤内注射、腹膜内注射来全身递送的经修饰的溶瘤病毒可包含在具有皮下注射针和注射器的试剂盒中。
实施例
以下实施例进一步说明所描述的实施方案，而非限制本公开的范围。
实施例1：在B5R基因中具有突变的示例性经修饰的痘苗病毒在鼠肿瘤模型中显示 出增强的治疗效果
本研究的目的是探索根据本公开的示例性经修饰的痘苗病毒与没有示例性B5R突变的痘苗病毒相比在鼠肿瘤模型中的效果，在所述经修饰的痘苗病毒中，向病毒B5R基因的SCR3和SCR4区域中引入了示例性突变，并且病毒胸苷激酶(TK)基因缺失(在本文中称为WR.B5RmutTK-)。
在一项实验中，将WR.B5RmutTK-病毒与媒介物(缓冲盐水)对照和另一种经修饰的痘苗病毒进行了比较，在后者中，TK基因缺失，并添加了编码GMCSF的外源核酸(在本文中称为WR.TK-GMCSF)。施用单剂量的三种病毒之一(1x107 PFU)以治疗皮下植入预先建立的RENCA肿瘤的BALB/c小鼠(图1)。如图1所示，通过卡尺测量来监测肿瘤体积(每组n＝10-15)。注意到，与静脉内(“IV”)施用的对照病毒相比，如预期的，以给定剂量瘤内(“IT”)施用的WR.TK-GMCSF病毒没有延迟肿瘤体积随时间的增加。然而，通过瘤内或静脉内递送以相同剂量的WR.B5RmutTK-病毒处理均导致肿瘤体积生长显著延迟，证明了具有示例性B5R突变的示例性经修饰的痘苗病毒的治疗效果增强。
在另一项实验中，使用不同的小鼠肿瘤模型，即荷有皮下B16肿瘤的C57/BL6小鼠，来测试具有示例性B5R突变的示例性痘苗病毒的效果(图2A-2B)。将小鼠分为两组，一组通过在肿瘤植入前3周注射一次WR.TK-病毒(其中TK基因从基因组中缺失)而接受痘苗病毒的免疫(“免疫的小鼠”)(图2B)，另一组未免疫(“未免疫的小鼠”)(图2A))。与另一种经修饰的痘苗病毒WR.TK-A34R K151E相比较，检查了WR.B5RmutTK-病毒(在图中称为B5R)，在WR.TK-A34R K151E中，TK缺失，并且病毒A34R基因通过K151到E的氨基酸改变进行了突变(在图中称为WI)。肿瘤植入后96小时，对小鼠单独静脉注射任一种病毒(1x 108PFU/小鼠，n＝5/组/时间点)，然后在注射1天或2天后处死小鼠。收集肿瘤以通过Q-PCR对每克肿瘤的病毒基因组数目进行定量。观察到，WR.B5RmutTK-病毒在免疫和未免疫的小鼠中均表现出显著增强的在肿瘤中的积累，提示示例性B5R突变可促进经修饰的痘苗病毒在肿瘤中的递送和扩散。在噬斑测定中也观察到肿瘤中病毒复制的增加(图3A-3B)，该测定对病毒在所收集的肿瘤中的噬菌斑形成能力进行了定量，提示示例性B5R突变可促进经修饰的痘苗病毒在肿瘤中的复制。
实施例2：具有编码趋化因子受体的示例性外源核酸的示例性经修饰的痘苗病毒 在癌细胞细胞和小鼠肿瘤模型中显示出增强的治疗效果
本研究的目的是探索根据本公开的几种示例性经修饰的痘苗病毒与没有示例性外源核酸的痘苗病毒相比在癌细胞系和鼠肿瘤模型中的效果，在每种经修饰的痘苗病毒中，均添加了编码趋化因子受体的示例性外源核酸。。
在一项实验中，在皮下荷有正位(乳腺脂肪垫)4T1肿瘤的小鼠中测试了三种不同的经修饰的痘苗病毒。在一种在此称为mCCR5/TK-病毒的痘苗病毒中，TK基因从基因组中缺失，并添加了编码小鼠CCR5的外源核酸。在另一种在此称为mCXCR4/TK-病毒的痘苗病毒中，TK基因缺失，并添加了编码小鼠CXCR4的外源核酸。在第三种在此称为TK-病毒的痘苗病毒中，TK基因缺失。所有三种病毒还被工程改造为表达萤光素酶作为报告分子。通过以1x108PFU的剂量单次注射这三种病毒中的任一种来处理每只小鼠。在注射三天后的每一天，通过生物发光成像和体内萤光素酶活性测定来量化肿瘤中的病毒数(图4)。观察到，与接受mCCR5/TK-病毒或TK-病毒的小鼠相比，接受mCXCR4/TK-病毒的小鼠在肿瘤中显示出明显更高的光子强度，提示CXCR4的表达可促进病毒向肿瘤的递送。相反，在全部三天测量中，CCR5/TK-在三者中显示出相对较低的光子强度，提示CCR5的表达可减少病毒向肿瘤的递送。
还检查了病毒的治疗效果。如上所述监测肿瘤体积(图5A)，表明与其他两种病毒和PBS模拟对照相比，mCXCR4/TK-病毒显著延迟了肿瘤体积生长。此外，如图5B所示，通过施用mCXCR4/TK-病毒(在图5B中表示为CXCR4)，小鼠存活百分比也显著提高。
在另一项实验中，在不同的肿瘤模型，即皮下荷有B16肿瘤的C57/BL6小鼠中测试了相同的三种病毒。如图6A中的定量图和图6B中的来自生物发光成像的代表性照片所见，与用TK-病毒或mCCR5/TK-病毒处理的小鼠相比，在用mCXCR4/TK-病毒处理的小鼠中观察到增加的光子强度。类似地，施用mCXCR4/TK-病毒显著延迟了肿瘤体积生长(图7)。这些结果以及以上结果提示，将编码CXCR4的外源核酸添加到痘苗病毒中导致针对肿瘤的治疗效果增强。
接下来，通过噬斑测定检查了三种病毒在体外在不同的癌细胞系中的病毒复制能力。将病毒添加到细胞系后，每24小时对噬菌斑形成进行定量。如图8A-8D所示，在两种不同的感染复数(MOI 0.1，如图8A和8C中，和MOI 1，如图8B和8D中)下，mCCR5/TK-病毒在所测试的两种癌细胞系(4T1和B16)中均显示出复制增加，但mCXCR4/TK-病毒则未显示，提示CCR5的表达可促进癌细胞中的病毒复制，而CXCR4的表达则不能促进。这进一步表明，CXCR4尽管在体外的复制没有增加，但在体内可表现出增强的效果，并且示例性经修饰的溶瘤痘苗病毒的增强效果可归因于递送，例如改善的全身递送。
为了开始理解由CXCR4表达所导致的增强的治疗效果的潜在机制，使用B细胞被耗尽的转基因小鼠(在此称为JH)进行了实验。对具有B细胞的Balb/C小鼠和不具有B细胞的JH小鼠施用上述病毒，这两种小鼠均已皮下植入了预先建立的4T1肿瘤。如图9A-9C所示，与上述数据一致，如通过生物发光成像辐射率所测量的，在Balb/C小鼠中，mCXCR4/TK-病毒表现出在肿瘤中的积累增加。然而，在JH小鼠中未观察到这种增加，提示mCXCR4/TK-在肿瘤中的积累增加至少部分地依赖于B细胞。另一方面，流式细胞术实验表明，在皮下荷有4T1肿瘤的BALB/c小鼠中，施用mCXCR4/TK-病毒导致B细胞进入肿瘤增多，但其他器官如脾脏或淋巴结(LN)则未增多(图10A-10C)。这些数据表明，B细胞可以充当痘苗病毒在体内被递送至肿瘤的媒介物。
此外，在mCXCR4/TK-病毒处理的小鼠中也观察到增强的T细胞功能。如图11A-11B所示，从皮下植入了4T1肿瘤的小鼠中收集T细胞，随后如上所述进行处理，并通过ELISpot测定检查其免疫活性，该测定检测它们响应于不同免疫原的干扰素-γ(IFNγ)释放。注射病毒14天后，从脾脏中回收测试的T细胞。与来自PBS处理的小鼠的T细胞相比，来自TK-病毒处理的小鼠的T细胞对肿瘤免疫原(4T1细胞裂解物)表现出一定的免疫应答，而来自mCXCR4/TK-病毒处理的小鼠的T细胞表现出增强的免疫应答(图11A)。相反，CXCR4表达似乎并未增强针对痘苗病毒的T细胞功能，因为图11B显示，响应于与肿瘤细胞4T1裂解物混合的灭活痘苗病毒(VV)的干扰素-γ释放在来自TK-病毒处理的小鼠和mCXCR4/TK-病毒处理的小鼠的T细胞之间没有显著差异。这些数据表明，CXCR4表达可导致增强的针对肿瘤的免疫应答，从而至少部分地有助于示例性经修饰的痘苗病毒的增强的治疗益处。
使用另一种示例性的编码CXCR4的经修饰的痘苗病毒进行了其他实验。在这些实验中，所用的痘苗病毒如下：(i)A52R基因缺失并添加了编码小鼠CXCR4的外源核酸的经修饰的病毒，称为A52R-CXCR4+；(ii)TK基因缺失并添加了编码小鼠GMCSF的外源核酸的经修饰的病毒，称为TK-GMCSF+；(iii)TK基因缺失且未添加外源核酸的经修饰的病毒，称为TK-，和(iv)媒介物配制的缓冲液，称为VFB。在一项实验中，皮下荷有RENCA肿瘤的BALB/c小鼠通过单次静脉内注射(1x 107PFU)四种经修饰的病毒之一进行处理。24小时后收获肿瘤，并通过qPCR量化每毫克组织的病毒基因组数目(图16)。与其他经修饰的病毒相比，在肿瘤中发现了更高数目的A52R-CXCR4+基因组，支持以上结论，即病毒CXCR4表达可以增强病毒向肿瘤的递送。
在另一项实验中，皮下荷有RENCA肿瘤的BALB/c小鼠通过在第1天和第4天静脉内注射(1x 107PFU)相同四种经修饰的病毒之一进行处理，并且如上所述监测肿瘤体积。静脉内递送的A52R-CXCR4+病毒显著延迟了肿瘤体积生长(图17)，进一步支持了添加编码CXCR4的外源核酸可导致抗癌治疗效果增强的观点。
实施例3：具有编码细胞外基质降解酶的示例性外源核酸的示例性痘苗病毒在鼠 肿瘤模型中显示出增强的治疗效果
本研究的目的是探索根据本公开的示例性经修饰的痘苗病毒与没有示例性外源核酸的痘苗病毒相比在鼠肿瘤模型中的效果，在所述经修饰的痘苗病毒中，添加了编码细胞外基质降解酶(如透明质酸酶)的示例性外源核酸。
在一项实验中，相比于其中仅缺失TK基因而没有添加PH-20基因的仅WR.TK-病毒，以及具有编码MMP8的外源核酸并且TK基因缺失的另一种示例性痘苗病毒(在本文中称为WR.TK-mmp8)，测试了具有编码透明质酸酶PH-20的外源核酸并且TK基因缺失的示例性经修饰的痘苗病毒(在本文中称为WR.TK-PH20)。所有三种病毒还被工程改造为表达萤光素酶作为报告分子。向皮下荷有RENCA肿瘤的BALB/c小鼠单次注射任一种病毒。通过生物发光成像测量病毒萤光素酶活性，跟踪病毒的随后积累和扩散。如图12A-12B所示，发现与另外两种病毒相比，WR.TK-Ph20病毒在体内肿瘤中显示出明显更多的积累，而与仅WR.TK-相比，WR.TK-mmp8病毒也相对较高。这些数据表明，PH-20的表达可通过ECM的降解和IFP的降低来增强病毒向肿瘤的递送和扩散。
接下来，还针对PH-20的病毒表达检查了对肿瘤的治疗效果。在第一项实验中，皮下植入4T1肿瘤的BALB/c小鼠用WR.TK-病毒或另一种示例性痘苗病毒WR.TK-PH20DCK静脉内处理，在WR.TK-PH20DCK中，TK基因缺失，并添加了编码PH20的外源核酸和编码脱氧胞苷激酶(DCK)的外源核酸。这两种病毒均表达萤光素酶，并通过生物发光成像测量了肿瘤内病毒萤光素酶的表达。如图13A所示，类似于RENCA模型中的WR.TK-PH20病毒，注射WR.TK-PH20DCK病毒的小鼠显示出明显更高的在肿瘤内的萤光素酶活性(n＝10)，提示与WR.TK-病毒相比，WR.TK-PH20DCK病毒在肿瘤中的病毒积累增强。
在第二项实验中，对皮下荷有4T1肿瘤的BALB/c小鼠进行了联合疗法的测试。使用六组小鼠。每组小鼠接受一次静脉注射WR.TK-病毒或WR.TK-PH20DCK病毒或对照PBS，然后在病毒注射后第3天和第7天腹膜内注射化疗药物吉西他滨或水。如图13B和图13C所示，存在所有三次注射均接受水的对照组，不接受病毒注射但注射吉西他滨的吉西他滨组，接受WR.TK-注射但不注射吉西他滨的TK-w组，接受WR.TK-PH20DCK注射但不注射吉西他滨的TK-PH20DCK w组，接受WR.TK-和吉西他滨注射的TK-+吉西他滨组，以及接受WR.TK-PH20CK和吉西他滨注射的TK-PH20DCK+吉西他滨组。继续监测肿瘤体积(n＝10，监测直至该组中有超过4只小鼠死亡)和存活曲线(*，与PBS组相比，P<0.05；#，与TK-vv+吉西他滨组相比，P<0.05；**，与TK-组相比，P<0.05)均显示，WR.TK-PH20DCK病毒和吉西他滨的联合治疗产生最佳效果，提示PH20介导的降低的组织液压力可增强化疗药物的递送，从而产生更好的治疗效果。
在第三项实验中，检查并比较了具有编码具有GPI锚的PH-20的外源核酸的示例性痘苗病毒和具有编码无GPI锚的PH-20的外源核酸的痘苗病毒。皮下荷有RENCA肿瘤的BALB/c小鼠通过瘤内(IT)或静脉内(IV)递送用单剂量的1x 107PFU病毒进行处理，并在注射病毒后45天测量其肿瘤体积。在该时间点检查了七组小鼠(图14)：一组对照组小鼠接受无病毒模拟对照的静脉内注射；WR.TK-PH20+(IT)组接受瘤内注射WR.TK-PH20+病毒，其中病毒表达的PH20具有GPI锚；WR.TK-GMCSF(IT)组接受瘤内注射WR.TK-GMCSF病毒，其中不表达PH20，而表达GMCSF；WR.TK-PH20+(无-gpi)(IT)组接受瘤内注射WR.TK-PH20+(无-gpi)病毒，其中病毒表达的PH20没有GPI；WR.TK-PH20+(IV)组接受静脉内注射WR.TK-PH20+病毒，WR.TK-GMCSF(IV)组接受静脉内注射WR.TK-GMCSF病毒的，而WR.TK-PH20+(无-gpi)(IV)组接受静脉内注射WR.TK-PH20+(无-gpi)病毒。值得注意的是，在后续时间，如注射病毒后45天，每只表达PH-20的病毒处理的动物(IT或IV)仍然存活，而对照组和WR.TK-GMCSF病毒处理的小鼠均被处死，因为它们的肿瘤已生长到大于1500mm3。如图14所示，引人注目的是，与WR.TK-PH20+(无-gpi)病毒的情况下无GPI相比，WR.TK-PH20+病毒处理的小鼠中GPI锚的存在似乎更加增强了对肿瘤生长的抑制作用。这是出乎意料的结果，因为考虑到GPI将PH-20锚定到细胞膜上，而在ECM中更自由地存在的没有GPI锚的分泌型PH-20被认为在降解ECM和降低IFP方面更有效。
使用表达分泌型透明质酸酶的示例性经修饰的痘苗病毒进行了其他实验，以确定这些酶如何影响病毒递送、扩散、细胞杀伤和治疗功效。
构建了经修饰的病毒，其中TK基因缺失，并添加了编码透明质酸酶(HysA、lin或sko)的外源核酸；这些经修饰的病毒分别被称为TK-HysA、TK-lin和TK-sko。
在最初的实验中，使用透明质酸酶活性ELISA来确定由上述经修饰的病毒表达的分泌型透明质酸酶的活性。HysA显示出最大的活性，如表3所示。
表3
Figure BDA0002564394690000871
在另一项实验中，将培养的细胞用以下之一进行感染：TK-修饰的病毒，TK-HysA修饰的病毒，或上述TK-MMP8修饰的病毒，它们各自也表达GFP。在感染的MC38癌细胞的培养物中，TK-HysA和TK-MMP8病毒比TK-病毒更能复制、扩散并阻止癌细胞扩充，提示HysA或MMP8表达可增强溶瘤病毒复制、扩散和癌细胞杀伤(图18A-18D)。在感染的HCT116癌细胞的培养物中，TK-HysA和TK-MMP8病毒比TK-病毒更能复制和扩散，并且TK-HysA病毒比TK-病毒更有效地阻止了癌细胞扩充，从而支持了HysA在增强溶瘤病毒复制、扩散和癌细胞杀伤中的作用(图19A-19D)。
使用以下病毒进行了其他实验：(i)TK-HysA修饰的病毒，(ii)TK-MMP8修饰的病毒，(iii)上述表达TK-PH20的经修饰的病毒(TK-PH20/TK-SPAM1)，(iv)未添加外源酶的TK-修饰的病毒，和(v)媒介物配制的缓冲液(VFB)。皮下荷有RENCA肿瘤的BALB/c小鼠通过单次静脉内注射(1x 107PFU)五种病毒之一进行处理。24小时后收获肿瘤，并通过qPCR量化每毫克组织的病毒基因组数目(图20)。与其他病毒相比，在肿瘤中发现了更高数目的TK-HysA基因组，提示HysA表达可增强经修饰的痘苗病毒向肿瘤的递送。
在另一项实验中，皮下荷有RENCA肿瘤的BALB/c小鼠通过一次瘤内注射(1x107PFU)TK-HysA、TK-MMP8、TK-PH20(在图21中标记为SPAM1)或TK-修饰的病毒进行处理，并且如上所述监测肿瘤体积。瘤内递送的TK-HysA、TK-MMP8和TK-PH20比TK-病毒更加延迟了肿瘤生长，提示HysA、MMP8或PH20的表达可增强溶瘤病毒的抗肿瘤功效(图21)。
为了进一步研究HysA在溶瘤病毒中的潜在效用，产生了经修饰的病毒，其中A52R基因缺失，并且将编码HysA的外源核酸插入A52R基因座(A52R-HysA)(在图22A-D中标记为WR.A52R-EL hysA GFP1MOI)。像TK-HysA(在图22A-D中标记为WR.TK-EL hysA GFP1MOI)修饰的病毒一样，A52R-HysA修饰的病毒成功地在LLC或MC38癌细胞的培养物中扩散，并且癌细胞的扩充有限(图22A-22D)。这些结果进一步支持了HysA在增强溶瘤病毒复制、扩散和癌细胞杀伤中的作用，并证明了A52R缺失的经修饰的病毒可以用作溶瘤病毒。
总体而言，这些数据表明，细胞外基质降解酶如PH20、HysA或MMP8的表达可以增强溶瘤病毒的复制、扩散、癌症杀伤和治疗效果。
实施例4：具有示例性经修饰的VH1基因的示例性痘苗病毒在鼠肿瘤模型中显示出 增强的治疗效果
本研究的目的是探索根据本公开的示例性经修饰的痘苗病毒与没有该示例性修饰的痘苗病毒相比在鼠肿瘤模型中的效果，在所述经修饰的痘苗病毒中，将痘苗病毒VH1基因替换为来自不同痘病毒的突变VH1基因。
在一项实验中，皮下荷有RENCA肿瘤的BALB/c小鼠通过单次瘤内注射(1x 107PFU)WR.TK-GMCSF病毒、WR.TK-VH1mut病毒或模拟对照进行了处理。在这种情况下，WR.TK-VH1mut病毒的TK基因缺失，并将VH1基因替换为不同种类痘病毒的VH1基因，其也用某些突变进行修饰以便更具活性。WR.TK-GMCSF病毒的TK基因已缺失，并具有编码GMCSF的外源核酸，但没有VH1基因的修饰。如图15所示在病毒注射后随时间通过卡尺测量监测肿瘤体积生长。与其他两组相比，WR.TK-VH1mut病毒显著地延迟了肿瘤生长，提示病毒VH1基因的示例性修饰可导致针对肿瘤的治疗效果增强。
实施例5：示例性经修饰的痘苗病毒在转移性癌症患者中的临床研究
在转移性癌症患者中进行了如本文公开的示例性痘苗病毒(WR.TK-PH20.CXCR4)的1B/2期开放标签研究。
研究设计：
该研究是一项开放标签的1B/2期研究，其在转移性癌症患者中评价了经修饰的痘苗病毒WR.TK-PH20.CXCR4。该研究分为两个阶段：剂量递增/确认阶段(1b期)和扩展阶段(2期)，扩展阶段对每个群组采用Simon 2阶段设计。
经修饰的痘苗病毒WR.TK-PH20.CXCR4是Western Reserve痘苗病毒，其包含TK基因的缺失、编码PH20和CXCR4的外源核酸。正如在动物研究中所示的，痘苗病毒中TK的缺失以及PH20和CXCR4的表达可导致更大的抗癌治疗效果。
1B期(剂量递增阶段)
目的：
剂量
确定WR.TK-PH20.CXCR4病毒的剂量限制毒性(DLT)和最大耐受剂量(MTD)或推荐的2期剂量(RP2D)。
如通过临床不良事件(AE)和实验室参数所测量的，评价WR.TK-PH20.CXCR4病毒的安全性和耐受性。
WR.TK-PH20.CXCR4病毒的起始剂量(剂量水平1)最高为一次静脉内注射5x109PFU。
如果剂量水平1无法耐受，则将WR.TK-PH20.CXCR4病毒的剂量水平1设置为一次最高5x107 PFU。
剂量递增阶段的每个剂量水平招募6至12名可评价的患者。
表1.剂量递增示意表
Figure BDA0002564394690000901
安全性
在研究过程中，通过记录AE、临床实验室检查、身体检查、生命体征测量、心电图(ECG)和其他相关程序来评估安全性。
任何检测到的累积毒性可能需要在以后酌情降低剂量和/或对给药方案进行其他更改，包括进一步完善RP2D。
如果最高达5x 109PFU的剂量超过MTD，则评价较低的剂量。研究调查人员使用美国(US)国家癌症研究所(NCI)的“不良事件通用术语标准”(CTCAE)4.03版评估毒性。在完成每个群组的大部分安全性评估后，由医学监察员与研究调查人员协商，决定是否继续进行下一个剂量水平。
在完成该研究的剂量递增/确认阶段，确定了MTD/RP2D之后，开始该研究的2期部分。
2期
2期(扩展)：在扩展阶段，使用在转移性癌症患者中的剂量递增/确认阶段确定的RP2D评价WR.TK-PH20.CXCR4病毒。在2期部分中，将转移性癌症患者以2:1的比例随机分配以接受WR.TK-PH20.CXCR4病毒(在RP2D下)或安慰剂。通过iRECIST评估，该随机化部分的主要终点是无进展生存期(PFS)。次要终点包括持久缓解率(DRR)、无治疗间隔(TFI)、生活质量(QoL)、总缓解率(ORR)、总生存期(OS)和安全性。2期部分的样本量为100-150名患者，这可以在单侧p＝0.1的情况下导致90％的功效，以检测PFS获益，危害比(HR)约为0.5。测试组的治疗持续时间为6个月、9个月、12个月或18个月，而对照组的治疗持续时间为4-6个月。估计获益(Accrual)需要花费12个月，计划试验持续时间为2-3年。
实施例6：示例性经修饰的痘苗病毒在癌症患者中的临床研究
在癌症患者中进行了如本文公开的示例性痘苗病毒(WR.TK-PH20.CXCR4)的1B/2期开放开放标签研究。
研究设计：
该研究是一项开放标签的1B/2期研究，其在癌症患者中评价了经修饰的痘苗病毒WR.TK-PH20.CXCR4。该研究分为两个阶段：剂量递增/确认阶段(1b期)和扩展阶段(2期)，扩展阶段对每个群组采用Simon2阶段设计。
经修饰的痘苗病毒WR.TK-PH20.CXCR4是Western Reserve痘苗病毒，其包含TK基因的缺失、编码PH20和CXCR4的外源核酸。正如在动物研究中所示的，痘苗病毒中TK的缺失以及PH20和CXCR4的表达可导致更大的抗癌治疗效果。
1B期(剂量递增阶段)
目的：
剂量
确定WR.TK-PH20.CXCR4病毒的剂量限制毒性(DLT)和最大耐受剂量(MTD)或推荐的2期剂量(RP2D)。
如通过临床不良事件(AE)和实验室参数所测量的，评价WR.TK-PH20.CXCR4病毒的安全性和耐受性。
WR.TK-PH20.CXCR4病毒的起始剂量(剂量水平1)最高为一次静脉内注射5x109PFU。
如果剂量水平1无法耐受，则将WR.TK-PH20.CXCR4病毒的剂量水平1设置为一次最高5x107 PFU。
剂量递增阶段的每个剂量水平招募6至12名可评价的患者。
表2.剂量递增示意表
群组 受试者数目 WR.TK-PH20.CXCR4剂量
-1 6-12 5X10<sup>9</sup>PFU
1 6-12 5X10<sup>8</sup>PFU
安全性
在研究过程中，通过记录AE、临床实验室检查、身体检查、生命体征测量、心电图(ECG)和其他相关程序来评估安全性。
任何检测到的累积毒性可能需要在以后酌情降低剂量和/或对给药方案进行其他更改，包括进一步完善RP2D。
如果最高达5x 109PFU的剂量超过MTD，则评价较低的剂量。研究调查人员使用美国(US)国家癌症研究所(NCI)的“不良事件通用术语标准”(CTCAE)4.03版评估毒性。在完成每个群组的大部分安全性评估后，由医学监察员与研究调查人员协商，决定是否继续进行下一个剂量水平。
在完成该研究的剂量递增/确认阶段，确定了MTD/RP2D之后，开始该研究的2期部分。
2期
2期(扩展)：在扩展阶段，使用在癌症患者中的剂量递增/确认阶段确定的RP2D评价WR.TK-PH20.CXCR4病毒。在2期部分中，将癌症患者以2:1的比例随机分配以接受WR.TK-PH20.CXCR4病毒(在RP2D下)或安慰剂。通过iRECIST评估，该随机化部分的主要终点是无进展生存期(PFS)。次要终点包括持久缓解率(DRR)、无治疗间隔(TFI)、生活质量(QoL)、总缓解率(ORR)、总生存期(OS)和安全性。2期部分的样本量为100-150名患者，这可以在单侧p＝0.1的情况下导致90％的功效，以检测PFS获益，危害比(HR)约为0.5。测试组的治疗持续时间为6个月、9个月、12个月或18个月，而对照组的治疗持续时间为4-6个月。估计获益(Accrual)需要花费12个月，计划试验持续时间为2-3年。
实施例7：具有示例性突变以促进NK细胞活性的示例性痘苗病毒在鼠肿瘤模型中 显示出增强的治疗效果
为了测试具有为了促进NK细胞活性而设计的突变的溶瘤病毒是否表现出抗癌效果，产生了以下经修饰的病毒：(i)K7R缺失并插入了编码IL15和CCL5的外源核酸的病毒，被称为K7R-IL15 CCL5，(ii)TK缺失并插入了编码LIGHT的外源核酸的病毒，被称为TK-LIGHT，(iii)TK缺失并插入了编码ITAC和CXXXC趋化分子(也称为CX3CL1)的外源核酸的病毒，被称为TK-ITAC fractalkine，(iv)A52R缺失并插入了编码IL15和IL15-Rα的外源核酸的病毒，被称为A52R-IL15/IL15-Rα，和(v)A52R缺失并插入了编码ITAC、LIGHT、IL15和IL15Rα的外源核酸的病毒，被称为TK-ITAC LIGHT A52R-IL15/IL15-Rα。
在一项实验中，皮下荷有RENCA肿瘤的BALB/c小鼠通过通过单次瘤内注射(1x108PFU)K7R-IL15+CCL5+、TK-LIGHT+或TK-GMCSF+病毒进行处理。对照小鼠接受静脉内注射对照缓冲液。在处理后第34天对肿瘤体积进行定量。在已经接受K7R-IL15+CCL5+或TK-LIGHT+修饰的病毒的小鼠中，肿瘤体积较小，提示为了促进NK细胞活性而设计的溶瘤病毒中的突变可以导致增强的抗癌治疗效果(图23)。
在另一项实验中，皮下荷有RENCA肿瘤的BALB/c小鼠通过通过单次瘤内注射(1x107PFU)TK-LIGHT+、TK-GMCSF+、TK-ITAC+fractalkine+、A52R-IL15+/IL15R-α+、TK-ITAC+LIGHT+A52R-IL15+/IL15-Rα或赋形剂配制的缓冲液(称为VFB)进行处理，并且如上所述随时间监测肿瘤体积。瘤内递送的TK-LIGHT+、TK-ITAC+fractalkine+、A52R-IL15+/IL15-Rα和TK-ITAC+LIGHT+A52R-IL15+/IL15-Rα+延缓了肿瘤生长，提示为了促进K细胞活性而设计的溶瘤病毒中的突变导致增强的抗肿瘤治疗效果(图24)。
实施例8：具有编码趋化因子受体和细胞外基质降解酶的示例性外源性核酸的示 例性痘苗病毒显示出在癌细胞之间扩散并杀死癌细胞
为了测试组合以上公开的经修饰的溶瘤病毒的元件的可行性，开发了一种经修饰的病毒，其中A52R基因和TK基因缺失，并插入了编码HysA和CXCR4的外源核酸(TK-HysAA52R-CXCR4)。用TK-(在图25A-25B中标记为WR TK-GFP 1MOI)、A52R-HysA(在图25A-25B中标记为WR A52R-EL HysA GFP 1MOI)或TK-HysA A52R-CXCR4(在图25A-25B中标记为WRA52R-7.5CXCR4 TK-EL HysA)修饰的病毒感染培养中的LLC癌细胞，每种病毒也表达GFP。A52R-HysA和TK-HysA A52R-CXCR4病毒能够在癌细胞之间扩散并减少癌细胞扩充(图25A-25B)。这些数据提供了非限制性实例，证明可以产生包含本文公开的多个经修饰元件的溶瘤病毒，并且其可以具有抗癌活性，包括在癌细胞之间扩散并杀死癌细胞。
实施例9：具有示例性SCR1缺失的示例性经修饰的EVV高表达痘苗病毒显示出在癌 细胞之间扩散并杀死癌细胞
选择IHDJ作为示例性EEV高产病毒，以评价溶瘤潜能。开发了经修饰的IHDJ病毒，其中EEV表面上的中和抗体结合位点(B5R SCR1)缺失(IHDJ-B5RcoΔSCR1)。感染MC38和HCT116癌细胞的培养物表明，IHDJ和IHDJ-B5RcoΔSCR1(均表达GFP)能够在癌细胞之间扩散并减少癌细胞扩充(图26A-26B)。噬斑测定进一步支持了IHDJ和IHDJ-B5RcoΔSCR1病毒在癌细胞之间扩散并杀死癌细胞的能力(图26C)。在另一项实验中，进行了彗尾测定，其中癌细胞单层以低感染复数进行感染并在液体培养基下孵育。在该测定中，病毒的扩散导致细长的“彗尾”形噬斑。IHDJ和IHDJ-B5RcoΔSCR1病毒产生明显的彗尾，这与有效的EEV产生一致(图26D)。这些实验证明，EEV高表达痘苗病毒，包括EEV表面上中和抗体结合位点缺失的示例性经修饰病毒，可具有抗癌活性，包括在癌细胞之间扩散并杀死癌细胞。
表4提供了病毒骨架基因和病毒蛋白质的示例性序列。进一步提供了由各种外源核酸序列表达的蛋白质的示例性序列，这些序列可以插入本文所述的经修饰的溶瘤病毒中。在一些情况下，本文所述的经修饰的溶瘤病毒中的上述病毒骨架基因和病毒蛋白质可包含与表4中提供的病毒骨架基因和病毒蛋白质的示例性序列约70％、约75％、约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％相同的序列。在一些情况下，从本文所述的经修饰的溶瘤病毒中的外源核酸序列表达的上述蛋白质可以包含与表4中提供的示例性蛋白质序列约70％、约75％、约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％相同的序列。
表4
Figure BDA0002564394690000951
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Claims (206)

1.经修饰的溶瘤病毒，其包含编码趋化因子受体、能够降解透明质酸的膜结合蛋白、能够降解透明质酸的微生物蛋白质或其任意组合的外源核酸。
2.根据权利要求1所述的经修饰的溶瘤病毒，其包含编码趋化因子受体的外源核酸，其中所述趋化因子受体包括CXCR4和CCR2中的至少一种。
3.根据权利要求1或2所述的经修饰的溶瘤病毒，其包含编码膜结合蛋白的外源核酸。
4.根据权利要求3所述的经修饰的溶瘤病毒，其中所述膜结合蛋白包括膜结合的透明质酸酶。
5.根据权利要求4所述的经修饰的溶瘤病毒，其中所述膜结合的透明质酸酶包括PH-20。
6.根据权利要求5所述的经修饰的溶瘤病毒，其中所述PH-20是GPI锚定的。
7.根据权利要求1所述的经修饰的溶瘤病毒，其包含编码微生物蛋白质的外源核酸，其中所述微生物蛋白质包括分泌的透明质酸酶。
8.根据权利要求7所述的经修饰的溶瘤病毒，其中所述分泌的透明质酸酶包括HysA、lin、sko和rv中的至少一种或其任意组合。
9.根据权利要求1或2所述的经修饰的溶瘤病毒，其包含编码微生物蛋白质的外源核酸。
10.根据权利要求9所述的经修饰的溶瘤病毒，其中所述微生物蛋白质包括HysA。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的经修饰的溶瘤病毒，其进一步在所述病毒的基因组中包含修饰，其中所述修饰增强所述病毒的包膜细胞外形式(EEV)的产生。
12.根据权利要求9所述的经修饰的溶瘤病毒，其在所述病毒的基因组中包含修饰，其中所述修饰包括B5R基因的突变或缺失。
13.根据权利要求9所述的经修饰的溶瘤病毒，其在所述病毒的基因组中包含修饰，其中所述修饰包括B5R基因的SCR区域中的突变或缺失，其中所述SCR区域包含SCR1、SCR3、SCR4或其任意组合，并且其中所述SCR区域不包含SCR2。
14.根据权利要求12所述的经修饰的溶瘤病毒，其包含B5R基因的缺失，其中所述缺失是B5R基因的部分缺失。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的经修饰的溶瘤病毒，其进一步在所述病毒的基因组中包含修饰，其中所述修饰增强了所述病毒的复制、增加了所述病毒的肿瘤细胞杀伤潜能或其任意组合。
16.根据权利要求15所述的经修饰的溶瘤病毒，其在所述病毒的基因组中包含修饰，其中所述修饰包括A52R基因的突变或缺失。
17.根据权利要求16所述的经修饰的溶瘤病毒，其包含A52R基因的缺失。
18.根据权利要求1-17中任一项所述的经修饰的溶瘤病毒，其进一步在所述病毒的基因组中包含至少一个额外的修饰，其中所述额外的修饰包括另外的病毒基因的突变或缺失。
19.根据权利要求18所述的经修饰的溶瘤病毒，其包含所述另外的病毒基因的突变或缺失，其中所述另外的病毒基因包括F13L、A36R、A34R、A33R、B8R、B18R、SPI-1、SPI-2、B15R、VGF、E3L、K3L、A41L、K7R和N1L及其功能域或片段或变体中的至少一种，或其任意组合。
20.根据权利要求1-19中任一项所述的经修饰的溶瘤病毒，其进一步包含至少一种额外的外源核酸。
21.根据权利要求20所述的经修饰的溶瘤病毒，其中所述至少一种额外的外源核酸包含编码蛋白质或其片段的核酸序列，所述蛋白质或其片段：调节NFκB信号传导，促进肿瘤中的组织液压力(IFP)的降低，调节STAT3介导的基因激活，促进T细胞活化，促进NK细胞向病毒感染的细胞的吸引，调节病毒感染的细胞的代谢程序，调节病毒感染的细胞对脂肪酸的摄取，促进MDSC的治疗靶向，或其任意组合。
22.根据权利要求20或21所述的经修饰的溶瘤病毒，其中所述至少一种额外的外源核酸包括编码HMGB1、PIAS3、IL15、IL15-Rα、LIGHT、ITAC、CXXXC趋化分子、CCL5及其功能域或片段或变体中的至少一种或其任意组合的核酸。
23.根据权利要求2-22中任一项所述的经修饰的溶瘤病毒，其包含：
(a)编码CXCR4和CCR2中的至少一种的外源核酸；和
(b)编码透明质酸酶的外源核酸。
24.根据权利要求12-22中任一项所述的经修饰的溶瘤病毒，其包含：
(a)编码CXCR4和CCR2中的至少一种的外源核酸；和
(b)B5R基因的突变或缺失。
25.根据权利要求12-22中任一项所述的经修饰的溶瘤病毒，其包含：
(a)编码透明质酸酶的外源核酸；和
(b)B5R基因的突变或缺失。
26.根据权利要求12-22中任一项所述的经修饰的溶瘤病毒，其包含：
(a)编码CXCR4和CCR2中的至少一种的外源核酸；
(b)编码透明质酸酶的外源核酸；和
(c)B5R基因的突变或缺失。
27.根据权利要求19-22中任一项所述的经修饰的溶瘤病毒，其包含：
(a)编码CXCR4和CCR2中的至少一种的外源核酸；和
(b)所述另外的病毒基因的突变或缺失，所述另外的病毒基因包括F13L、A36R、A34R、A33R、B8R、B18R、SPI-1、SPI-2、B15R、VGF、E3L、K3L、A41L、K7R、N1L及其功能域或片段或变体中的至少一种，或其任意组合。
28.根据权利要求19-22中任一项所述的经修饰的溶瘤病毒，其包含：
(a)编码透明质酸酶的外源核酸；和
(b)所述另外的病毒基因的突变或缺失，所述另外的病毒基因包括F13L、A36R、A34R、A33R、B8R、B18R、SPI-1、SPI-2、B15R、VGF、E3L、K3L、A41L、K7R、N1L及其功能域或片段或变体中的至少一种，或其任意组合。
29.根据权利要求22所述的经修饰的溶瘤病毒，其包含：
(a)编码CXCR4和CCR2中的至少一种的外源核酸；
(b)编码透明质酸酶的外源核酸；和
(c)所述另外的病毒基因的突变或缺失，所述另外的病毒基因包括F13L、A36R、A34R、A33R、B8R、B18R、SPI-1、SPI-2、B15R、VGF、E3L、K3L、A41L、K7R或N1L、其功能域中的至少一种，或其任意组合。
30.根据权利要求19-22中任一项所述的经修饰的溶瘤病毒，其包含：
(a)编码CXCR4和CCR2中的至少一种的外源核酸；
(b)B5R基因的突变或缺失；和
(c)所述另外的病毒基因的突变或缺失，所述另外的病毒基因包括F13L、A36R、A34R、A33R、B8R、B18R、SPI-1、SPI-2、B15R、VGF、E3L、K3L、A41L、K7R、N1L及其功能域或片段或变体中的至少一种，或其任意组合。
31.根据权利要求19-22中任一项所述的经修饰的溶瘤病毒，其包含：
(a)编码透明质酸酶的外源核酸；
(b)B5R基因的突变或缺失；和
(c)所述另外的病毒基因的突变或缺失，所述另外的病毒基因包括F13L、A36R、A34R、A33R、B8R、B18R、SPI-1、SPI-2、B15R、VGF、E3L、K3L、A41L、K7R或N1L、其功能域中的至少一种，或其任意组合。
32.根据权利要求19-22中任一项所述的经修饰的溶瘤病毒，其包含：
(a)编码CXCR4和CCR2中的至少一种的外源核酸；
(b)编码透明质酸酶的外源核酸；
(c)B5R基因的突变或缺失；和
(d)所述另外的病毒基因的突变或缺失，所述另外的病毒基因包括F13L、A36R、A34R、A33R、B8R、B18R、SPI-1、SPI-2、B15R、VGF、E3L、K3L、A41L、K7R、N1L及其功能域或片段或变体中的至少一种，或其任意组合。
33.根据权利要求22所述的经修饰的溶瘤病毒，其包含：
(a)编码CXCR4和CCR2中的至少一种的外源核酸；和
(b)至少一种额外的外源核酸，其编码HMGB1、PIAS3、IL15、IL15-Rα、LIGHT、ITAC、CXXXC趋化分子、CCL5及其功能域或片段或变体中的至少一种，或其任意组合。
34.根据权利要求22所述的经修饰的溶瘤病毒，其包含：
(a)编码透明质酸酶的外源核酸；和
(b)至少一种额外的外源核酸，其编码HMGB1、PIAS3、IL15、IL15-Rα、LIGHT、ITAC、CXXXC趋化分子、CCL5及其功能域或片段或变体中的至少一种，或其任意组合。
35.根据权利要求22所述的经修饰的溶瘤病毒，其包含：
(a)编码CXCR4和CCR2中的至少一种的外源核酸；
(b)编码透明质酸酶的外源核酸；和
(c)至少一种额外的外源核酸，其编码HMGB1、PIAS3、IL15、IL15-Rα、LIGHT、ITAC、CXXXC趋化分子、CCL5及其功能域或片段或变体中的至少一种，或其任意组合。
36.根据权利要求22所述的经修饰的溶瘤病毒，其包含：
(a)编码CXCR4和CCR2中的至少一种的外源核酸；
(b)B5R基因的突变或缺失；和
(c)至少一种额外的外源核酸，其编码HMGB1、PIAS3、IL15、IL15-Rα、LIGHT、ITAC、CXXXC趋化分子、CCL5及其功能域或片段或变体中的至少一种，或其任意组合。
37.根据权利要求22所述的经修饰的溶瘤病毒，其包含：
(a)编码透明质酸酶的外源核酸；
(b)B5R基因的突变或缺失；和
(c)至少一种额外的外源核酸，其编码HMGB1、PIAS3、IL15、IL15-Rα、LIGHT、ITAC、CXXXC趋化分子、CCL5及其功能域或片段或变体中的至少一种，或其任意组合。
38.根据权利要求22所述的经修饰的溶瘤病毒，其包含：
(a)编码CXCR4和CCR2中的至少一种的外源核酸；
(b)编码透明质酸酶的外源核酸；
(c)B5R基因的突变或缺失；和
(d)至少一种额外的外源核酸，其编码HMGB1、PIAS3、IL15、IL15-Rα、LIGHT、ITAC、CXXXC趋化分子、CCL5、其功能域或片段或变体中的至少一种，或其任意组合。
39.根据权利要求22所述的经修饰的溶瘤病毒，其包含：
(a)编码CXCR4和CCR2中的至少一种的外源核酸；
(b)编码透明质酸酶的外源核酸；
(c)B5R基因的突变或缺失；
(d)所述另外的病毒基因的突变或缺失，所述另外的病毒基因包括F13L、A36R、A34R、A33R、B8R、B18R、SPI-1、SPI-2、B15R、VGF、E3L、K3L、A41L、K7R或N1L及其功能域或片段或变体中的至少一种，或其任意组合；和
(e)至少一种额外的外源核酸，其编码HMGB1、PIAS3、IL15、IL15-Rα、LIGHT、ITAC、CXXXC趋化分子、CCL5、其功能域或片段或变体中的至少一种，或其任意组合。
40.根据权利要求23-39中任一项所述的经修饰的溶瘤病毒，其中所述透明质酸酶包括PH-20。
41.根据权利要求23-39中任一项所述的经修饰的溶瘤病毒，其中所述透明质酸酶包括HysA。
42.根据权利要求23-41中任一项所述的经修饰的溶瘤病毒，其包含A52R的突变或缺失。
43.根据权利要求1-42中任一项所述的经修饰的溶瘤病毒，其进一步包含编码病毒VH1蛋白的外源核酸。
44.根据权利要求43所述的经修饰的溶瘤病毒，其包含编码病毒VH1蛋白的外源核酸，其中所述外源核酸来自痘病毒的基因组，其中所述痘病毒不是痘苗病毒。
45.根据权利要求44所述的经修饰的溶瘤病毒，其中所述痘病毒包括麻疹病毒、脊髓灰质炎病毒、痘病毒、痘苗病毒、腺病毒、腺相关病毒、单纯疱疹病毒、水疱性口炎病毒、呼肠孤病毒、新城疫病毒、塞内卡病毒、慢病毒、门哥病毒或粘液瘤病毒。
46.根据权利要求1-45中任一项所述的经修饰的溶瘤病毒，其中所述病毒基因组包含胸苷激酶基因。
47.根据权利要求1-45中任一项所述的经修饰的溶瘤病毒，其中所述病毒基因组中缺失胸苷激酶基因。
48.根据权利要求1-47中任一项所述的经修饰的溶瘤病毒，其中所述病毒基因组包含来自单纯疱疹病毒的胸苷激酶基因。
49.根据权利要求1-48中任一项所述的经修饰的溶瘤病毒，其中与其他方面相同但不包含权利要求1-48中任一项的修饰的溶瘤病毒相比，所述病毒表现出增强的肿瘤内和肿瘤间扩散、增强的免疫逃避、增强的肿瘤特异性复制、增强的肿瘤靶向递送。
50.根据权利要求1-49中任一项所述的经修饰的溶瘤病毒，其中所述溶瘤病毒包括痘病毒、腺相关病毒、腺病毒、呼肠孤病毒、慢病毒、单纯疱疹病毒、水疱性口炎病毒、门哥病毒或粘液瘤病毒。
51.根据权利要求50所述的经修饰的溶瘤病毒，其中所述溶瘤病毒是痘病毒。
52.根据权利要求50所述的经修饰的溶瘤病毒，其中所述痘病毒是痘苗病毒。
53.一种溶瘤痘苗病毒，其包含以下至少两项：
(a)增强所述病毒的肿瘤内和肿瘤间扩散的修饰；
(b)增强所述病毒的全身递送的修饰；
(c)增强所述病毒的肿瘤特异性复制的修饰；和
(d)增强所述病毒的免疫逃避的修饰。
54.一种溶瘤痘苗病毒，其包含编码蛋白质或其片段的外源核酸，该蛋白质或其片段增强肿瘤的细胞外基质(ECM)的降解。
55.根据权利要求54所述的溶瘤痘苗病毒，其中所述增强ECM降解的蛋白质或其片段是透明质酸酶。
56.根据权利要求55所述的溶瘤痘苗病毒，其中所述透明质酸酶包括膜结合的透明质酸酶或微生物透明质酸酶，并且其中所述膜结合的透明质酸酶是PH-20。
57.根据权利要求56所述的溶瘤痘苗病毒，其中所述PH-20是GPI锚定的。
58.根据权利要求55所述的溶瘤痘苗病毒，其中所述透明质酸酶包括微生物透明质酸酶，并且其中所述微生物透明质酸酶是HysA。
59.根据权利要求54-58中任一项所述的溶瘤痘苗病毒，其进一步包含以下至少之一：
(a)增强所述病毒的肿瘤内和肿瘤间扩散的修饰；
(b)增强所述病毒的全身递送的修饰；
(c)增强所述病毒的肿瘤特异性复制的修饰；和
(d)增强所述病毒的免疫逃避的修饰。
60.一种溶瘤痘苗病毒，其包含编码趋化因子受体的外源核酸，其中从所述病毒表达所述趋化因子受体增强了所述病毒的全身递送。
61.根据权利要求60所述的溶瘤痘苗病毒，其中所述趋化因子受体包括CXCR4和CCR2中的至少一种。
62.根据权利要求60或61所述的溶瘤痘苗病毒，其包含编码所述趋化因子受体的外源核酸，其进一步包含以下至少之一：
(a)增强肿瘤的ECM的降解的修饰；和
(b)增强EEV形式的所述病毒的产生的修饰。
63.一种溶瘤痘苗病毒，其在所述病毒的基因组中包含增强EEV形式的所述病毒的产生的第一修饰，并且包含至少一种以下进一步的修饰：
(a)增强所述病毒的肿瘤内和肿瘤间扩散的修饰；
(b)增强所述病毒的全身递送的修饰；
(c)增强所述病毒的肿瘤特异性复制的修饰；和
(d)增强所述病毒的免疫逃避的修饰。
64.根据权利要求63所述的溶瘤痘苗病毒，其中所述第一修饰包括B5R基因的突变或缺失，其中所述缺失包括完全或部分缺失，其中所述B5R基因的突变或缺失是SCR区域中的突变或缺失，其中所述SCR区域包含SCR1、SCR3、SCR4或其任意组合，并且其中所述SCR区域不包含SCR2。
65.根据权利要求53-64中任一项所述的溶瘤痘苗病毒，其包含另外的病毒基因的突变或缺失，其中所述另外的病毒基因包括F13L、A36R、A34R、A33R、B8R、B18R、SPI-1、SPI-2、B15R、VGF、E3L、K3L、A41L、K7R、N1L和A52R及其功能域或片段或变体中的至少一种，或其任意组合。
66.根据权利要求53-65中任一项所述的溶瘤痘苗病毒，其进一步包含编码蛋白质或其片段的核酸序列，所述蛋白质或其片段：调节NFκB信号传导，促进组织液压力(IFP)的降低，调节STAT3介导的基因激活，促进T细胞活化，促进NK细胞向病毒感染的细胞的吸引，调节病毒感染的细胞的代谢程序，调节病毒感染的细胞对脂肪酸的摄取，促进MDSC的治疗靶向，或其任意组合。
67.根据权利要求66所述的溶瘤痘苗病毒，其中所述至少一种额外的外源核酸包括编码HMGB1、PIAS3、IL15、IL15-Rα、LIGHT、ITAC、CXXXC趋化分子、CCL5及其功能域或片段或变体中的至少一种或其任意组合的核酸。
68.根据权利要求53-67中任一项所述的溶瘤痘苗病毒，其包含：
(a)编码CXCR4和CCR2中的至少一种的外源核酸；和
(b)编码透明质酸酶的外源核酸。
69.根据权利要求53-67中任一项所述的溶瘤痘苗病毒，其包含：
(a)编码CXCR4和CCR2中的至少一种的外源核酸；和
(b)B5R基因的突变或缺失。
70.根据权利要求53-67中任一项所述的溶瘤痘苗病毒，其包含：
(a)编码透明质酸酶的外源核酸；和
(b)B5R基因的突变或缺失。
71.根据权利要求53-67中任一项所述的溶瘤痘苗病毒，其包含：
(a)编码CXCR4和CCR2中的至少一种的外源核酸；
(b)编码透明质酸酶的外源核酸；和
(c)B5R基因的突变或缺失。
72.根据权利要求53-67中任一项所述的溶瘤痘苗病毒，其包含：
(a)编码CXCR4和CCR2中的至少一种的外源核酸；和
(b)所述另外的病毒基因的突变或缺失，所述另外的病毒基因包括F13L、A36R、A34R、A33R、B8R、B18R、SPI-1、SPI-2、B15R、VGF、E3L、K3L、A41L、K7R、N1L、A52R及其功能域或片段或变体中的至少一种，或其任意组合。
73.根据权利要求53-67中任一项所述的溶瘤痘苗病毒，其包含：
(a)编码透明质酸酶的外源核酸；和
(b)所述另外的病毒基因的突变或缺失，所述另外的病毒基因包括F13L、A36R、A34R、A33R、B8R、B18R、SPI-1、SPI-2、B15R、VGF、E3L、K3L、A41L、K7R、N1L、A52R及其功能域或片段或变体中的至少一种，或其任意组合。
74.根据权利要求53-67中任一项所述的溶瘤痘苗病毒，其包含：
(a)编码CXCR4和CCR2中的至少一种的外源核酸；
(b)编码透明质酸酶的外源核酸；和
(c)所述另外的病毒基因的突变或缺失，所述另外的病毒基因包括F13L、A36R、A34R、A33R、B8R、B18R、SPI-1、SPI-2、B15R、VGF、E3L、K3L、A41L、K7R、N1L、A52R及其功能域或片段或变体中的至少一种，或其任意组合。
75.根据权利要求53-67中任一项所述的溶瘤痘苗病毒，其包含：
(a)编码CXCR4和CCR2中的至少一种的外源核酸；
(b)B5R基因的突变或缺失；和
(c)所述另外的病毒基因的突变或缺失，所述另外的病毒基因包括F13L、A36R、A34R、A33R、B8R、B18R、SPI-1、SPI-2、B15R、VGF、E3L、K3L、A41L、K7R、N1L、A52R及其功能域或片段或变体中的至少一种，或其任意组合。
76.根据权利要求53-67中任一项所述的溶瘤痘苗病毒，其包含：
(a)编码透明质酸酶的外源核酸；
(b)B5R基因的突变或缺失；和
(c)所述另外的病毒基因的突变或缺失，所述另外的病毒基因包括F13L、A36R、A34R、A33R、B8R、B18R、SPI-1、SPI-2、B15R、VGF、E3L、K3L、A41L、K7R、N1L、A52R及其功能域或片段或变体中的至少一种，或其任意组合。
77.根据权利要求53-67中任一项所述的溶瘤痘苗病毒，其包含：
(a)编码CXCR4和CCR2中的至少一种的外源核酸；
(b)编码透明质酸酶的外源核酸；
(c)B5R基因的突变或缺失；和
(d)所述另外的病毒基因的突变或缺失，所述另外的病毒基因包括F13L、A36R、A34R、A33R、B8R、B18R、SPI-1、SPI-2、B15R、VGF、E3L、K3L、A41L、K7R、N1L、A52R及其功能域或片段或变体中的至少一种，或其任意组合。
78.根据权利要求53-67中任一项所述的溶瘤痘苗病毒，其包含：
(a)编码CXCR4和CCR2中的至少一种的外源核酸；和
(b)至少一种额外的外源核酸，其编码HMGB1、PIAS3、IL15、IL15-R、LIGHT、ITAC、CXXXC趋化分子、CCL5及其功能域或片段或变体中的至少一种，或其任意组合。
79.根据权利要求53-67中任一项所述的溶瘤痘苗病毒，其包含：
(a)编码透明质酸酶的外源核酸；和
(b)至少一种额外的外源核酸，其编码HMGB1、PIAS3、IL15、IL15-Rα、LIGHT、ITAC、CXXXC趋化分子、CCL5及其功能片段或域或变体中的至少一种，或其任意组合。
80.根据权利要求53-67中任一项所述的溶瘤痘苗病毒，其包含：
(a)编码CXCR4和CCR2中的至少一种的外源核酸；
(b)编码透明质酸酶的外源核酸；和
(c)至少一种额外的外源核酸，其编码HMGB1、PIAS3、IL15、IL15-Rα、LIGHT、ITAC、CXXXC趋化分子、CCL5、其功能域或片段或变体中的至少一种，或其任意组合。
81.根据权利要求53-67中任一项所述的溶瘤痘苗病毒，其包含：
(a)编码CXCR4和CCR2中的至少一种的外源核酸；
(b)B5R基因的突变或缺失；和
(c)至少一种额外的外源核酸，其编码HMGB1、PIAS3、IL15、IL15-Rα、LIGHT、ITAC、CXXXC趋化分子、CCL5及其功能域或片段或变体中的至少一种，或其任意组合。
82.根据权利要求53-67中任一项所述的溶瘤痘苗病毒，其包含：
(a)编码透明质酸酶的外源核酸；
(b)B5R基因的突变或缺失；和
(c)至少一种额外的外源核酸，其编码HMGB1、PIAS3、IL15、IL15-Rα、LIGHT、ITAC、CXXXC趋化分子、CCL5、其功能域或片段或变体中的至少一种，或其任意组合。
83.根据权利要求53-67中任一项所述的溶瘤痘苗病毒，其包含：
(a)编码CXCR4和CCR2中的至少一种的外源核酸；
(b)编码透明质酸酶的外源核酸；
(c)B5R基因的突变或缺失；和
(d)至少一种额外的外源核酸，其编码HMGB1、PIAS3、IL15、IL15-Rα、LIGHT、ITAC、CXXXC趋化分子、CCL5及其功能域或片段或变体中的至少一种，或其任意组合。
84.根据权利要求53-67中任一项所述的溶瘤痘苗病毒，其包含：
(a)编码CXCR4和CCR2中的至少一种的外源核酸；
(b)编码透明质酸酶的外源核酸；
(c)B5R基因的突变或缺失；
(d)所述另外的病毒基因的突变或缺失，所述另外的病毒基因包括F13L、A36R、A34R、A33R、B8R、B18R、SPI-1、SPI-2、B15R、VGF、E3L、K3L、A41L、K7R、N1L、A52R及其功能域或片段或变体中的至少一种，或其任意组合；和
(e)至少一种额外的外源核酸，其编码HMGB1、PIAS3、IL15、IL15-Rα、LIGHT、ITAC、CXXXC趋化分子、CCL5及其功能域或片段或变体中的至少一种，或其任意组合。
85.一种溶瘤痘苗病毒，其包含编码趋化因子受体、能够降解透明质酸的蛋白质或其任意组合的外源核酸。
86.根据权利要求85所述的经修饰的溶瘤痘苗病毒，其包含能够降解透明质酸的蛋白质，其中所述蛋白质包括PH-20或HysA。
87.一种经修饰的溶瘤病毒，其包含A52R基因的突变或缺失。
88.根据权利要求87所述的经修饰的溶瘤病毒，其包含A52R基因的缺失。
89.根据权利要求87或88所述的经修饰的溶瘤病毒，其进一步包含编码趋化因子受体、能够降解透明质酸的蛋白质或其任意组合的外源核酸。
90.根据权利要求89所述的经修饰的溶瘤病毒，其包含编码趋化因子受体的外源核酸，其中所述趋化因子受体包括CXCR4或CCR2。
91.根据权利要求89或90所述的经修饰的溶瘤病毒，其包含编码能够降解透明质酸的蛋白质的外源核酸，其中所述蛋白质包括膜结合的透明质酸酶或分泌的透明质酸酶。
92.根据权利要求91所述的经修饰的溶瘤病毒，其包含编码膜结合的透明质酸酶的外源核酸，其中所述膜结合的透明质酸酶是PH-20。
93.根据权利要求92所述的经修饰的溶瘤病毒，其中所述PH-20是GPI锚定的。
94.根据权利要求91所述的经修饰的溶瘤病毒，其包含编码分泌的透明质酸酶的外源核酸，其中所述分泌的透明质酸酶是HysA。
95.一种经修饰的溶瘤病毒，其包含K7R基因的突变或缺失。
96.根据权利要求95所述的经修饰的溶瘤病毒，其包含K7R基因的缺失。
97.根据权利要求95或96所述的经修饰的溶瘤病毒，其进一步包含编码细胞因子的外源核酸、编码细胞因子受体的外源核酸和编码趋化因子的外源核酸中的至少一种。
98.根据权利要求97所述的经修饰的溶瘤病毒，其包含编码细胞因子的外源核酸，其中所述细胞因子包括IL15。
99.根据权利要求97或98所述的经修饰的溶瘤病毒，其包含编码细胞因子受体的外源核酸，其中所述细胞因子受体包括IL15-Rα。
100.根据权利要求97-99中任一项所述的经修饰的溶瘤病毒，其包含编码趋化因子的外源核酸，其中所述趋化因子包括CCL5。
101.根据权利要求97-100中任一项所述的经修饰的溶瘤病毒，其进一步包含编码HMGB1、PIAS3、LIGHT、ITAC、CXXXC趋化分子及其功能域或片段或变体中的至少一种或其任意组合的外源核酸。
102.根据权利要求97-101中任一项所述的经修饰的溶瘤病毒，其进一步包含另外的病毒基因的突变或缺失，所述另外的病毒基因包括F13L、A36R、A34R、A33R、B8R、B18R、SPI-1、SPI-2、B15R、VGF、E3L、K3L、A41L、N1L、A52R及其功能域或片段或变体中的至少一种，或其任意组合。
103.一种经修饰的溶瘤病毒，其包含编码IL15和IL15-Rα的外源核酸。
104.一种经修饰的溶瘤病毒，其包含编码IL15和CCL5的外源核酸。
105.一种经修饰的溶瘤病毒，其包含编码以下至少一种的外源核酸：IL15、IL15-Rα、ITAC、CXXXC趋化分子及其功能域或片段或变体，或其任意组合。
106.根据权利要求95-105中任一项所述的经修饰的溶瘤病毒，其中所述病毒表现出增强的自然杀伤细胞活化和吸引。
107.根据权利要求1-52和87-106中任一项所述的经修饰的溶瘤病毒，其中与其他方面相同但不包含权利要求1-52和87-106中任一项的修饰的痘苗病毒相比，所述病毒表现出以下至少一项：增强的肿瘤内和肿瘤间扩散、增强的免疫逃避、增强的肿瘤特异性复制、增强的肿瘤靶向递送。
108.根据权利要求1-52和87-106中任一项所述的经修饰的溶瘤病毒，其中所述溶瘤病毒包括痘病毒、腺相关病毒、腺病毒、呼肠孤病毒、慢病毒、单纯疱疹病毒、水疱性口炎病毒、门哥病毒或粘液瘤病毒。
109.根据权利要求108所述的经修饰的溶瘤病毒，其中所述溶瘤病毒是痘病毒。
110.根据权利要求109所述的经修饰的溶瘤病毒，其中所述痘病毒是痘苗病毒。
111.根据权利要求108-110中任一项所述的经修饰的溶瘤病毒，其中与其他方面相同但不包含权利要求108-110中任一项的修饰的痘苗病毒相比，所述病毒表现出以下至少一项：增强的肿瘤内和肿瘤间扩散、增强的免疫逃避、增强的肿瘤特异性复制、增强的肿瘤靶向递送。
112.根据权利要求1-52和87-111中任一项所述的经修饰的溶瘤病毒，其中所述病毒适合于全身递送。
113.根据权利要求53-84中任一项所述的溶瘤痘苗病毒，其中与其他方面相同但不包含权利要求53-86中任一项的修饰的痘苗病毒相比，所述病毒表现出以下至少一项：增强的肿瘤内和肿瘤间扩散、增强的免疫逃避、增强的肿瘤特异性复制、增强的肿瘤靶向递送。
114.根据权利要求53-85中任一项所述的溶瘤痘苗病毒，其中所述病毒适合于全身递送。
115.根据权利要求53-85中任一项所述的溶瘤痘苗病毒，其中所述病毒能够发生免疫逃避。
116.根据权利要求114或115所述的溶瘤痘苗病毒，其中所述全身递送包括口服施用、肠胃外施用、鼻内施用、舌下施用、直肠施用、透皮施用或其任意组合。
117.根据权利要求116所述的溶瘤痘苗病毒，其中所述肠胃外施用包括静脉内注射。
118.根据权利要求53-85中任一项所述的溶瘤痘苗病毒，其中所述病毒适合于瘤内递送。
119.根据权利要求53-85和113-118中任一项所述的溶瘤痘苗病毒，其进一步包含编码病毒VH1蛋白的外源核酸。
120.根据权利要求119所述的溶瘤痘苗病毒，其包含编码病毒VH1蛋白的外源核酸，其中所述外源核酸来自痘病毒的基因组，其中所述痘病毒不是痘苗病毒。
121.根据权利要求120所述的溶瘤痘苗病毒，其中所述痘病毒包括β昆虫痘病毒、亚塔痘病毒、鹿痘病毒、γ昆虫痘病毒、野兔痘病毒、猪痘病毒、软疣痘病毒、鳄痘病毒、α昆虫痘病毒、山羊痘病毒、禽痘病毒、副痘病毒。
122.根据权利要求53-85和113-121中任一项所述的溶瘤痘苗病毒，其中所述病毒基因组包含胸苷激酶基因。
123.根据权利要求122所述的溶瘤痘苗病毒，其中所述病毒基因组中缺失胸苷激酶基因。
124.根据权利要求53-85和113-123中任一项所述的溶瘤痘苗病毒，其进一步包含来自单纯疱疹病毒的胸苷激酶基因。
125.一种药物组合物，其包含权利要求1-52和87-112中任一项限定的经修饰的溶瘤病毒或权利要求53-86和113-124中任一项限定的溶瘤痘苗病毒。
126.根据权利要求125所述的药物组合物，其进一步包含增溶剂和赋形剂。
127.根据权利要求126所述的药物组合物，其中所述赋形剂包括缓冲剂、稳定剂、抗氧化剂、粘合剂、稀释剂、分散剂、速率控制剂、润滑剂、助流剂、崩解剂、增塑剂、防腐剂或其任意组合中的一种或多种。
128.根据权利要求127所述的药物组合物，其中所述赋形剂包括二水合磷酸氢二钠、二水合磷酸二氢钠、氯化钠、肌醇、山梨醇或其任意组合。
129.根据权利要求125-128中任一项所述的药物组合物，其不包含防腐剂。
130.根据权利要求125-129中任一项所述的药物组合物，其进一步包含防腐剂、稀释剂和载体中的一种或多种。
131.根据权利要求125-130中任一项所述的药物组合物，其进一步包含额外的活性成分或其盐。
132.根据权利要求125-131中任一项所述的药物组合物，其中所述增溶剂是无菌水。
133.根据权利要求125-133中任一项所述的药物组合物，其包含额外的活性成分，其中所述额外的活性成分是另外的溶瘤病毒。
134.一种在将溶瘤病毒全身递送给受试者时增强所述病毒的治疗效果的方法，该方法包括全身施用权利要求1-52和87-112中任一项限定的经修饰的溶瘤病毒，权利要求53-86和113-124中任一项限定的溶瘤痘苗病毒，或权利要求125-133中任一项限定的药物组合物。
135.根据权利要求134所述的方法，其中所述全身施用包括口服施用、肠胃外施用、鼻内施用、舌下施用、直肠施用、透皮施用或其任意组合。
136.根据权利要求135所述的方法，其中所述肠胃外施用包括静脉内注射。
137.一种对经修饰的溶瘤病毒进行工程化的方法，其包括：(i)获得经修饰的溶瘤病毒DNA骨架载体，所述经修饰的溶瘤病毒DNA骨架载体包含一个或多个如权利要求1-52和87-112中任一项限定的修饰；(ii)进一步修饰所述经修饰的溶瘤病毒DNA载体以产生工程化DNA载体；(iii)用所述工程化DNA载体转染哺乳动物细胞；(iv)在适合病毒复制的条件下培养所述哺乳动物细胞；以及(v)收获病毒颗粒。
138.一种对溶瘤痘苗病毒进行工程化的方法，其包括：(i)获得溶瘤痘苗病毒DNA骨架载体，所述溶瘤痘苗病毒DNA骨架载体包含一个或多个如权利要求53-86和113-124中任一项限定的修饰；(ii)进一步修饰所述溶瘤痘苗病毒DNA载体以产生工程化DNA载体；(iii)用所述工程化DNA载体转染哺乳动物细胞；(iv)在适合病毒复制的条件下培养所述哺乳动物细胞；以及(v)收获病毒颗粒。
139.一种产生如权利要求1-52和87-112中任一项限定的经修饰的溶瘤病毒的方法，其包括：(i)生成经修饰的溶瘤病毒DNA载体，所述经修饰的溶瘤病毒DNA载体包含根据权利要求1-52和87-112中任一项的修饰；(ii)用所述经修饰的溶瘤病毒DNA载体转染哺乳动物细胞；(iii)在适合病毒复制的条件下培养所述哺乳动物细胞；以及(iv)收获病毒颗粒。
140.一种产生如权利要求53-86和113-124中任一项限定的溶瘤痘苗病毒的方法，其包括：(i)生成溶瘤痘苗病毒DNA载体，所述溶瘤痘苗病毒DNA载体包含根据权利要求53-86和113-124中任一项的修饰；(ii)用所述溶瘤痘苗病毒DNA载体转染哺乳动物细胞；(iii)在适合病毒复制的条件下培养所述哺乳动物细胞；以及(iv)收获病毒颗粒。
141.根据权利要求137-140中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物细胞包括HeLa细胞、293细胞或Vero细胞。
142.一种试剂盒，其包含：根据权利要求1-52和87-112中任一项的经修饰的溶瘤病毒，如权利要求53-86和113-124中任一项限定的溶瘤痘苗病毒，或如权利要求125-133中任一项限定的药物组合物，以及关于施用所述经修饰的溶瘤病毒、溶瘤痘苗病毒或药物组合物的说明书；以及关于将所述药物组合物施用于受试者以治疗与病理性血管生成相关的病症的说明书。
143.一种试剂盒，其包含：根据权利要求1-52和87-112中任一项的经修饰的溶瘤病毒，如权利要求53-86和113-124中任一项限定的溶瘤痘苗病毒，或如权利要求125-133中任一项限定的药物组合物，以及关于施用所述经修饰的溶瘤病毒、溶瘤痘苗病毒或药物组合物的说明书；容器；以及关于将所述药物组合物施用于受试者以治疗与病理性血管生成相关的病症的说明书。
144.一种用于治疗癌症的试剂盒，其包含：根据权利要求1-52和87-112中任一项的经修饰的溶瘤病毒，如权利要求53-86和113-124中任一项限定的溶瘤痘苗病毒，或如权利要求125-133中任一项限定的药物组合物，以及关于施用所述经修饰的溶瘤病毒、溶瘤痘苗病毒或药物组合物的说明书；以及关于将所述药物组合物施用于受试者以治疗与病理性血管生成相关的病症的说明书。
145.一种用于治疗癌症的试剂盒，其包含：根据权利要求1-52和87-112中任一项的经修饰的溶瘤病毒，如权利要求53-86和113-124中任一项限定的溶瘤痘苗病毒，或如权利要求125-133中任一项限定的药物组合物，以及关于施用所述经修饰的溶瘤病毒、溶瘤痘苗病毒或药物组合物的说明书；容器；以及关于将所述药物组合物施用于受试者以治疗与病理性血管生成相关的病症的说明书。
146.根据权利要求142-145中任一项所述的试剂盒，其中所述癌症为实体瘤、白血病或淋巴瘤。
147.一种用于治疗肿瘤的试剂盒，其包含：根据权利要求1-52和87-112中任一项的经修饰的溶瘤病毒，如权利要求53-86和113-124中任一项限定的溶瘤痘苗病毒，或如权利要求125-133中任一项限定的药物组合物，以及关于施用所述经修饰的溶瘤病毒、溶瘤痘苗病毒或药物组合物的说明书；以及关于将所述药物组合物施用于受试者以治疗与病理性血管生成相关的病症的说明书。
148.一种用于治疗肿瘤的试剂盒，其包含：根据权利要求1-52和87-112中任一项的经修饰的溶瘤病毒，如权利要求53-86和113-124中任一项限定的溶瘤痘苗病毒，或如权利要求125-133中任一项限定的药物组合物，以及关于施用所述经修饰的溶瘤病毒、溶瘤痘苗病毒或药物组合物的说明书；容器；以及关于将所述药物组合物施用于受试者以治疗与病理性血管生成相关的病症的说明书。
149.根据权利要求147或148所述的试剂盒，其中所述肿瘤为实体瘤、白血病或淋巴瘤。
150.根据权利要求142-149中任一项所述的试剂盒，其中所述受试者需要所述治疗。
151.根据权利要求142-150中任一项所述的试剂盒，其中所述受试者是人。
152.根据权利要求142-151中任一项所述的试剂盒，其中所述关于施用的说明书包括关于全身施用的说明书。
153.根据权利要求152所述的试剂盒，其中所述全身施用包括口服施用、肠胃外施用、鼻内施用、舌下施用、直肠施用、透皮施用或其任意组合。
154.根据权利要求153所述的试剂盒，其中所述肠胃外施用包括静脉内注射。
155.一种治疗肿瘤的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的根据权利要求1-52和87-112中任一项的经修饰的溶瘤病毒，如权利要求53-86和113-124中任一项限定的溶瘤痘苗病毒，或如权利要求125-133中任一项限定的药物组合物。
156.根据权利要求155所述的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的根据权利要求1-52和87-112中任一项的经修饰的溶瘤病毒，如权利要求53-86和113-124中任一项限定的溶瘤痘苗病毒，或如权利要求125-133限定的药物组合物，其中所述肿瘤为实体瘤、白血病或淋巴瘤。
157.一种治疗癌症的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的根据权利要求1-52和87-112中任一项的经修饰的溶瘤病毒，如权利要求53-86和113-124中任一项限定的溶瘤痘苗病毒，或如权利要求125-133中任一项限定的药物组合物。
158.根据权利要求157所述的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的根据权利要求1-52和87-112中任一项的经修饰的溶瘤病毒，如权利要求53-86和113-124中任一项限定的溶瘤痘苗病毒，或如权利要求125-133中任一项限定的药物组合物，其中所述癌症为实体瘤、白血病或淋巴瘤。
159.根据权利要求155-158中任一项所述的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的根据权利要求1-52和87-112中任一项的经修饰的溶瘤病毒，如权利要求53-86和113-124中任一项限定的溶瘤痘苗病毒，或如权利要求125-133中任一项限定的药物组合物，其中所述方法进一步包括施用另外的疗法。
160.根据权利要求159所述的方法，其中所述另外的疗法包括化学疗法、放射疗法、使用额外的病毒的溶瘤病毒疗法、使用免疫调节蛋白的治疗、CAR T细胞疗法、抗癌剂或其任意组合。
161.根据权利要求159所述的方法，其中所述另外的疗法包括施用包含抗CD33抗体及其可变区、抗CD11b抗体及其可变区、COX2抑制剂、细胞因子、趋化因子、抗CTLA4抗体或其抗原结合片段、抗PD-1抗体或其抗原结合片段、抗PD-L1抗体或其抗原结合片段或TLR激动剂的免疫调节剂。
162.根据权利要求159所述的方法，其包括施用所述另外的疗法，其中所述另外的疗法包括施用所述抗癌剂，其中所述抗癌剂是化疗剂。
163.根据权利要求162所述的方法，其中所述化疗剂是前药。
164.根据权利要求163所述的方法，其中在将所述前药与所述溶瘤痘苗病毒、经修饰的痘苗病毒或包含该病毒的药物组合物联合施用时，所述前药转化为活性形式。
165.根据权利要求164所述的方法，其中所述前药包含更昔洛韦。
166.根据权利要求159-165中任一项所述的方法，其包括施用所述另外的疗法，其中所述另外的疗法同时或顺序地施用。
167.根据权利要求166所述的方法，其包括顺序施用所述另外的疗法，其中所述另外的疗法在施用根据权利要求1-52和87-112中任一项的经修饰的溶瘤病毒、如权利要求53-86和113-124中任一项限定的溶瘤痘苗病毒或如权利要求125-133中任一项限定的药物组合物之前施用。
168.根据权利要求167所述的方法，其包括顺序施用所述另外的疗法，其中所述另外的疗法在施用根据权利要求1-52和87-112中任一项的经修饰的溶瘤病毒、如权利要求53-86和113-124中任一项限定的溶瘤痘苗病毒或如权利要求125-133中任一项限定的药物组合物之后施用。
169.一种在癌细胞中产生毒性作用的方法，该方法包括向癌细胞施用治疗有效量的根据权利要求1-52和87-112中任一项的经修饰的溶瘤病毒，如权利要求53-86和113-124中任一项限定的溶瘤痘苗病毒，或如权利要求125-133中任一项限定的药物组合物。
170.根据权利要求169所述的方法，其中所述癌细胞存在于受试者中。
171.根据权利要求170所述的方法，其中所述受试者需要在癌细胞中产生毒性作用的方法。
172.一种治疗受试者的方法，该方法包括通过向癌细胞施用治疗有效量的根据权利要求1-52和87-112中任一项的经修饰的溶瘤病毒、如权利要求53-86和113-124中任一项限定的溶瘤痘苗病毒或如权利要求125-133中任一项限定的药物组合物，在所述受试者中存在的癌细胞中产生毒性作用。
173.根据权利要求172所述的方法，其中所述受试者需要所述治疗。
174.一种治疗受试者的癌症的方法，其包括通过施用治疗有效量的根据权利要求1-52和87-112中任一项的经修饰的溶瘤病毒、如权利要求53-86和113-124中任一项限定的溶瘤痘苗病毒或如权利要求125-133中任一项限定的药物组合物感染所述受试者的癌细胞，其中所述施用是全身施用。
175.根据权利要求174所述的方法，其中所述全身施用包括口服施用、肠胃外施用、鼻内施用、舌下施用、直肠施用、透皮施用或其任意组合。
176.根据权利要求175所述的方法，其中所述肠胃外施用包括静脉内注射。
177.一种治疗受试者的癌症的方法，其包括施用用根据权利要求1-52和87-112中任一项的经修饰的溶瘤病毒或如权利要求53-86和113-124中任一项限定的溶瘤痘苗病毒感染的细胞。
178.根据权利要求155-177中任一项所述的方法，其中所述癌症包括黑素瘤、肝细胞癌、乳腺癌、肺癌、腹膜癌、前列腺癌、膀胱癌、卵巢癌、白血病、淋巴瘤、肾癌、胰腺癌、上皮癌、胃癌、结肠癌、十二指肠癌、胰腺腺癌、间皮瘤、多形性胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、多发性骨髓瘤、前列腺癌、肝细胞癌、胆管肉瘤、胰腺腺癌、头颈部鳞状细胞癌、结直肠癌、肠型胃腺癌、宫颈鳞状细胞癌、骨肉瘤、上皮性卵巢癌、急性淋巴母细胞淋巴瘤、骨髓增生性赘生物或肉瘤。
179.根据权利要求155-178中任一项所述的方法，其中所述癌细胞存在于受试者选自下组的器官中：膀胱、血液、骨骼、骨髓、脑、乳腺、结肠、食道、胃肠、牙龈、头、肾、肝、肺、鼻咽、颈、卵巢、前列腺、皮肤、胃、睾丸、舌或子宫。
180.根据权利要求155-179中任一项所述的方法，其中所述癌症是转移性的。
181.一种治疗受试者的癌症的方法，其包括与化疗前药联合施用根据权利要求48所述的经修饰的溶瘤病毒或包含该病毒的药物组合物。
182.一种治疗受试者的癌症的方法，其包括与化疗前药联合施用根据权利要求124所述的溶瘤痘苗病毒或包含该病毒的药物组合物。
183.一种治疗受试者的癌症的方法，其包括：(i)施用根据权利要求48所述的经修饰的溶瘤病毒或包含该病毒的药物组合物；(ii)测定从所述受试者分离的第一和第二生物样品中的病毒滴度，其中所述第一生物样品包含癌细胞，并且所述第二生物样品包含非癌细胞；以及(iii)如果所述第二样品中的病毒滴度等于或高于所述第一样品中的病毒滴度，则施用化疗前药，其中所述化疗前药的施用导致所述经修饰的溶瘤病毒在所述受试者中的复制受到抑制。
184.一种治疗受试者的癌症的方法，其包括：(i)施用根据权利要求124所述的溶瘤痘苗病毒或包含该病毒的药物组合物；(ii)测定从所述受试者分离的第一和第二生物样品中的病毒滴度，其中所述第一生物样品包含癌细胞，并且所述第二生物样品包含非癌细胞；以及(iii)如果所述第二样品中的病毒滴度等于或高于所述第一样品中的病毒滴度，则施用化疗前药，其中所述化疗前药的施用导致所述溶瘤痘苗病毒在所述受试者中的复制受到抑制。
185.根据权利要求155-184中任一项所述的方法，其中所述方法提高基于溶瘤病毒的癌症疗法的功效。
186.根据权利要求155-185中任一项所述的方法，其包括施用根据权利要求1-52和87-112中任一项的经修饰的溶瘤病毒，如权利要求53-86和113-124中任一项限定的溶瘤痘苗病毒，或如权利要求125-133中任一项限定的药物组合物，其中所述经修饰的溶瘤病毒、溶瘤痘苗病毒或药物组合物以包含约106PFU/mL至约1010PFU/mL的所述溶瘤痘苗病毒的剂量施用。
187.根据权利要求155-186中任一项所述的方法，其包括施用根据权利要求1-52和87-112中任一项的经修饰的溶瘤病毒，如权利要求53-86和113-124中任一项限定的溶瘤痘苗病毒，或如权利要求125-133中任一项限定的药物组合物，其中所述经修饰的溶瘤病毒、溶瘤痘苗病毒或药物组合物以包含约5x 109PFU/mL的所述溶瘤痘苗病毒的剂量施用。
188.根据权利要求155-187中任一项所述的方法，其包括施用根据权利要求1-52和87-112中任一项的经修饰的溶瘤病毒，如权利要求53-86和113-124中任一项限定的溶瘤痘苗病毒，或如权利要求125-133中任一项限定的药物组合物，其中所述经修饰的溶瘤病毒、溶瘤痘苗病毒或药物组合物独立地以初始剂量施用第一时间段、以中间剂量施用第二时间段并以高剂量施用第三时间段。
189.根据权利要求188所述的方法，其包括独立地施用所述初始剂量、所述中间剂量和所述高剂量，其中所述初始剂量低于所述中间剂量，并且所述中间剂量低于所述高剂量。
190.根据权利要求188或189所述的方法，其中所述第一时间段、所述第二时间段和所述第三时间段各自为约1周至约3周。
191.根据权利要求155-190中任一项所述的方法，其包括施用根据权利要求1-52和87-112中任一项的经修饰的溶瘤病毒，如权利要求53-86和113-124中任一项限定的溶瘤痘苗病毒，或如权利要求125-133中任一项限定的药物组合物，其中所述经修饰的溶瘤病毒、溶瘤痘苗病毒和药物组合物独立地构成液体剂型，该液体剂型以约1mL至约5mL、约5mL至10mL、约15mL至约20mL、约25mL至约30mL、约30mL至约50mL、约50mL至约100mL、约100mL至150mL、约150mL至约200mL、约200mL至约250mL、约250mL至约300mL、约300mL至约350mL、约350mL至约400mL、约400mL至约450mL、约450mL至500mL、约500mL至750mL或约750mL至1000mL的体积施用。
192.根据权利要求155-191中任一项所述的方法，其包括施用根据权利要求1-52和87-112中任一项的经修饰的溶瘤病毒，如权利要求53-86和113-124中任一项限定的溶瘤痘苗病毒，或如权利要求125-133中任一项限定的药物组合物，其中所述经修饰的溶瘤病毒、溶瘤痘苗病毒或药物组合物以液体剂型、固体剂型、可吸入剂型、鼻内剂型、脂质体制剂、包含纳米颗粒的剂型、包含微粒的剂型、聚合物剂型或其任意组合施用。
193.根据权利要求155-192中任一项所述的方法，其包括施用根据权利要求1-52和87-112中任一项的经修饰的溶瘤病毒，如权利要求53-86和113-124中任一项限定的溶瘤痘苗病毒，或如权利要求125-133中任一项限定的药物组合物，其中所述经修饰的溶瘤病毒、溶瘤痘苗病毒或药物组合物施用持续约1周、约2周、约3周、约4周、约6周、约7周、约8周、约9周、约10周或约12周。
194.根据权利要求155-193中任一项所述的方法，其包括施用根据权利要求1-52和87-112中任一项的经修饰的溶瘤病毒，如权利要求53-86和113-124中任一项限定的溶瘤痘苗病毒，或如权利要求125-133中任一项限定的药物组合物，其中所述经修饰的溶瘤病毒、溶瘤痘苗病毒或药物组合物每日一次、每日两次、每周一次、每两周一次或每三周一次施用。
195.根据权利要求155-194中任一项所述的方法，其包括施用根据权利要求1-52和87-112中任一项的经修饰的溶瘤病毒，如权利要求53-86和113-124中任一项限定的溶瘤痘苗病毒，或如权利要求125-133中任一项限定的药物组合物，其中所述经修饰的溶瘤病毒、溶瘤痘苗病毒或药物组合物经静脉内、腹膜内或通过瘤内注射施用。
196.根据权利要求155-195中任一项所述的方法，其包括施用根据权利要求1-52和87-112中任一项的经修饰的溶瘤病毒，如权利要求53-86和113-124中任一项限定的溶瘤痘苗病毒，或如权利要求125-133中任一项限定的药物组合物，其中所述经修饰的溶瘤病毒、溶瘤痘苗病毒或药物组合物以团注或缓慢输注的方式施用。
197.根据权利要求155-196中任一项所述的方法，其包括施用根据权利要求1-52和87-112中任一项的经修饰的溶瘤病毒，如权利要求53-86和113-124中任一项限定的溶瘤痘苗病毒，或如权利要求125-133中任一项限定的药物组合物，其中所述经修饰的溶瘤病毒、溶瘤痘苗病毒或药物组合物的施用在自施用第一剂量起约1小时至约3天后导致第一峰值病毒载量，并且在约3天至约10天后导致第二峰值病毒载量。
198.根据权利要求155-197中任一项所述的方法，其包括施用所述另外的疗法，其中所述另外的疗法施用持续约1周、约2周、约3周、约4周、约6周、约7周、约8周、约9周、约10周或约12周。
199.根据权利要求155-198中任一项所述的方法，其包括施用所述另外的疗法，其中所述另外的疗法每日一次、每周一次、每两周一次或每三周一次施用。
200.根据权利要求155-199中任一项所述的方法，其包括施用所述另外的疗法，其中所述另外的疗法以液体剂型、固体剂型、可吸入剂型、鼻内剂型、脂质体制剂、包含纳米颗粒的剂型、包含微粒的剂型、聚合物剂型或其任意组合施用。
201.根据权利要求155-200中任一项所述的方法，其包括施用所述另外的疗法，其中所述另外的疗法经口服、静脉内、通过瘤内注射或通过辐射施用。
202.根据权利要求155-201中任一项所述的方法，其包括将根据权利要求1-52和87-112中任一项所述的经修饰的溶瘤病毒、如权利要求53-86和113-124中任一项限定的溶瘤痘苗病毒或如权利要求125-133中任一项限定的药物组合物施用于有需要的受试者，其中所述受试者是人。
203.根据权利要求155-202中任一项所述的方法，其包括将根据权利要求1-52和87-112中任一项的经修饰的溶瘤病毒、如权利要求53-86和113-124中任一项限定的溶瘤痘苗病毒或如权利要求125-133中任一项限定的药物组合物施用于所述有需要的受试者，其中在施用所述经修饰的溶瘤病毒、溶瘤痘苗病毒或药物组合物之前，所述受试者已被诊断为患有癌症。
204.根据权利要求155-203中任一项所述的方法，其包括将根据权利要求1-52和87-112中任一项的经修饰的溶瘤病毒、如权利要求53-86和113-124中任一项限定的溶瘤痘苗病毒或如权利要求125-133中任一项限定的药物组合物与另外的疗法联合施用于所述有需要的受试者，其中在施用所述经修饰的溶瘤病毒、溶瘤痘苗病毒或药物组合物或所述另外的疗法之前，所述受试者已被诊断为患有癌症。
205.根据权利要求155-202中任一项所述的方法，其包括将根据权利要求1-52和87-112中任一项的经修饰的溶瘤病毒、如权利要求53-86和113-124中任一项限定的溶瘤痘苗病毒或如权利要求125-133中任一项限定的药物组合物施用于所述有需要的受试者，其中在施用所述经修饰的溶瘤病毒、溶瘤痘苗病毒或药物组合物之前，所述受试者已被诊断为具有肿瘤。
206.根据权利要求155-202和205中任一项所述的方法，其包括将根据权利要求1-52和87-112中任一项的经修饰的溶瘤病毒、如权利要求53-86和113-124中任一项限定的溶瘤痘苗病毒或如权利要求125-133中任一项限定的药物组合物与另外的疗法联合施用于所述有需要的受试者，其中在施用所述经修饰的溶瘤病毒、溶瘤痘苗病毒或药物组合物或所述另外的疗法之前，所述受试者已被诊断为患有癌症。
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Applicant after: Caliwell immunotherapy

Address before: Pennsylvania, USA

Applicant before: Carliwell immunotherapy Co.,Ltd.

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