KR20220082025A - 변형된 세포외 외피보유 바이러스 - Google Patents

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KR20220082025A
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스티븐 에이치. 쏜
대니얼 제이. 버드
밍뤼 장
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칼리버 임뮤노쎄라퓨틱스, 인크.
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Abstract

본 개시내용은, 바이러스의 세포외 외피보유 형태의 생산을 증가시키는, 바이러스 게놈에서의 변형을 함유할 수 있는 변형된 종양용해 폭스바이러스, 예컨대 백시니아 바이러스를 제공한다. 변형된 종양용해 폭스바이러스는 전신 전달을 위한 벡터로서 이용될 수 있다. 변형된 종양용해 폭스바이러스를 사용하는 방법이 또한 제공된다.

Description

변형된 세포외 외피보유 바이러스
상호 참조
본 출원은 2019년 10월 16일에 출원된 미국 가출원 번호 62/916,035를 우선권 주장하며, 그 전문은 본원에 참조로 포함된다.
참조로 포함
본 명세서에서 언급된 모든 간행물, 특허, 특허 출원 및 NCBI 등록 번호는 각각의 개별 간행물, 특허 또는 특허 출원이 참조로 포함되는 것으로 구체적으로 및 개별적으로 지시되고 그 전문이 제시된 것과 동일한 정도로 본원에 참조로 포함된다. 본원에 사용된 용어와 포함된 참고문헌에 정의된 용어가 상충하는 경우에, 본 개시내용의 정의가 우선한다.
한 실시양태는 적어도 2개의 돌연변이를 포함하는 A34R 단백질 또는 그의 단편을 코딩하는 핵산을 포함하는 변형된 종양용해 폭스바이러스를 제공하며, 여기서 적어도 2개의 돌연변이는 야생형 백시니아 바이러스 A43R 단백질 (서열식별번호: 4)의 위치 Lys119 및 Lys151에 상응하는 위치에 존재한다. 일부 실시양태에서, 위치 Lys119에 상응하는 위치에서의 돌연변이는 Lys119Glu이다. 일부 실시양태에서, 위치 Lys151에 상응하는 위치에서의 돌연변이는 Lys151Glu이다. 일부 실시양태에서, 야생형 백시니아 바이러스 A43R 단백질 (서열식별번호: 4)의 위치 Lys119 및 Lys151에 상응하는 위치에서의 적어도 2개의 돌연변이는 각각 Lys119Glu 및 Lys151Glu이다.
한 실시양태는 야생형 A34R 단백질 (서열식별번호: 4) 내의 pH 5에서 양으로 하전된 아미노산 잔기에 존재하는 적어도 2개의 비-자연 발생 돌연변이를 포함하는 A34R 단백질 또는 그의 단편을 코딩하는 핵산을 포함하는 변형된 종양용해 폭스바이러스를 제공한다.
또 다른 실시양태는 야생형 A34R 단백질 (서열식별번호: 4)의 위치 110에 존재하지 않는 적어도 2개의 비-자연 발생 돌연변이를 포함하는 A34R 단백질 또는 그의 단편을 코딩하는 핵산을 포함하는 변형된 종양용해 폭스바이러스를 제공한다.
또 다른 실시양태는 야생형 A34R 단백질 (서열식별번호: 4) 내의 아스파르트산 잔기에 존재하지 않는 적어도 2개의 비-자연 발생 돌연변이를 포함하는 A34R 단백질 또는 그의 단편을 코딩하는 핵산을 포함하는 변형된 종양용해 폭스바이러스를 제공한다.
또 다른 실시양태는 야생형 A34R 단백질 (서열식별번호: 4) 내의 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 시스테인, 글루타민, 글루탐산, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 류신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신 또는 발린 잔기에 독립적으로 존재하는 적어도 2개의 비-자연 발생 돌연변이를 포함하는 A34R 단백질 또는 그의 단편을 코딩하는 핵산을 포함하는 변형된 종양용해 폭스바이러스를 제공한다.
또 다른 실시양태는 야생형 A34R 단백질 (서열식별번호: 4)의 위치 Lys151 이외의 위치에 존재하는 리신 잔기에서 비-자연 발생 돌연변이를 포함하는 A34R 단백질 또는 그의 단편을 코딩하는 핵산을 포함하는 변형된 종양용해 폭스바이러스를 제공한다.
또 다른 실시양태는 야생형 A34R 단백질 (서열식별번호: 4)의 위치 Lys119에서 비-자연 발생 돌연변이를 포함하는 A34R 단백질 또는 그의 단편을 코딩하는 핵산을 포함하는 변형된 종양용해 폭스바이러스를 제공한다.
또 다른 실시양태는 야생형 A34R 단백질 (서열식별번호: 4) 내의 pH 5에서 양으로 하전된 아미노산 잔기에 존재하는 적어도 2개의 비-자연 발생 돌연변이를 포함하는 A34R 단백질 또는 그의 단편을 코딩하는 핵산을 포함하는 변형된 종양용해 폭스바이러스를 제공하며, 여기서 변형된 종양용해 폭스바이러스는 적어도 2개의 비-자연 발생 돌연변이를 포함하지 않으면서 그 외에는 동일한 종양용해 바이러스와 비교하여 바이러스 플라크 형성 검정에서 증가된 수의 코멧 테일 유형 플라크를 생성한다.
또 다른 실시양태는 적어도 2개의 비-자연 발생 돌연변이를 포함하는 A34R 단백질 또는 그의 단편을 코딩하는 핵산을 포함하는 변형된 종양용해 폭스바이러스를 제공하며, 여기서 비-자연 발생 돌연변이 중 어느 하나가 야생형 A34R 단백질 (서열식별번호: 4) 내의 위치 110에 존재하는 경우, 코딩된 아미노산은 아스파라긴 잔기가 아니다.
또 다른 실시양태는 종양용해 폭스바이러스의 야생형 균주와 비교하여 중화 항체에 대한 증가된 저항성을 나타내는 변형된 종양용해 폭스바이러스를 제공하며, 여기서 증가된 저항성은 항-L1 NR-45114 항체 또는 항-VIG 항체로의 처리 후 바이러스 플라크 검정에서 변형된 종양용해 폭스바이러스 또는 야생형 균주에 의해 생산된 플라크의 수에 의해 측정되고, 여기서 변형된 종양용해 폭스바이러스는 적어도 약 55,000 플라크 형성 단위/mL를 생산한다.
또 다른 실시양태는 중화 항체로의 처리 후 바이러스 플라크 검정에서 적어도 약 55,000 플라크 형성 단위/mL를 생산하는 변형된 종양용해 폭스바이러스를 제공한다.
일부 실시양태에서, 중화 항체는 항-L1 NR-45114 항체 또는 항-VIG 항체이다. 일부 실시양태에서, A34R 단백질 또는 그의 단편은 야생형 A34R 단백질 (서열식별번호: 4)의 위치 Lys151에서 돌연변이를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, pH 5에서 양으로 하전된 아미노산 잔기는 리신 잔기이다. 일부 실시양태에서, 핵산은 바이러스 유전자 VACWR157 내의 코딩 서열 또는 그의 단편에 대해 적어도 약 80% 상동성인 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 핵산은 서열식별번호: 3으로 제시된 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 약 80% 상동성인 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 2개의 비-자연 발생 돌연변이 중 적어도 하나는 야생형 A34R 단백질 (서열식별번호: 4)의 위치 Lys119에 존재한다. 일부 실시양태에서, 비-자연 발생 돌연변이는 야생형 A34R 단백질 (서열식별번호: 4)의 위치 Lys119에 존재한다. 일부 실시양태에서, 야생형 A34R 단백질 (서열식별번호: 4)의 위치 Lys119에서의 돌연변이는 Lys119Glu이다. 일부 실시양태에서, 2개의 비-자연 발생 돌연변이 중 적어도 하나는 야생형 A34R 단백질 (서열식별번호: 4)의 위치 Lys151에 존재한다. 일부 실시양태에서, 야생형 A34R 단백질 (서열식별번호: 4)의 위치 Lys151에서의 돌연변이는 Lys151Glu이다.
한 실시양태는 돌연변이 Lys119Glu 및 Lys151Glu를 포함하는 A34R 단백질을 발현하는 변형된 종양용해 폭스바이러스를 제공한다.
일부 실시양태에서, 서열식별번호: 3의 위치 305-307은 뉴클레오티드 GAA 또는 GAG를 포함한다. 일부 실시양태에서, 서열식별번호: 3의 위치 451-453은 뉴클레오티드 GAA 또는 GAG를 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 종양용해 폭스바이러스는 적어도 2개의 비-자연 발생 돌연변이를 포함하지 않으면서 그 외에는 동일한 종양용해 바이러스와 비교하여 세포내 성숙 바이러스 형태보다 더 많은 양의 세포외 외피보유 바이러스 형태를 생산한다. 일부 실시양태에서, 변형된 종양용해 폭스바이러스는 비-자연 발생 돌연변이를 포함하지 않으면서 그 외에는 동일한 종양용해 바이러스와 비교하여 세포내 성숙 바이러스 형태보다 더 많은 양의 세포외 외피보유 바이러스 형태를 생산한다. 일부 실시양태에서, 변형된 종양용해 폭스바이러스는 치료 단백질 또는 진단 단백질 중 적어도 하나를 코딩하는 외인성 핵산을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 외인성 핵산은 케모카인 수용체, 막 연관 단백질, 히알루로난을 분해할 수 있는 미생물 단백질, 미생물 단백질, SOCS3, PH-20, HMGB1, PIAS3, IL15, IL15-Rα, LIGHT, ITAC, 프랙탈카인, CCL5, N1L, 면역 체크포인트 조정제, 대사 조정 단백질 중 적어도 하나, 또는 그의 임의의 조합, 예컨대 상기의 임의의 조합을 포함하는 융합 단백질 (예컨대, 대사 조정 단백질 및 시토카인)을 코딩할 수 있다. 일부 실시양태에서, 케모카인 수용체를 코딩하는 외인성 핵산은 CXCR4 및 CCR2 중 적어도 하나를 포함한다. 일부 실시양태에서, 외인성 핵산은 막 연관 단백질을 코딩한다. 일부 실시양태에서, 막 연관 단백질은 막 연관 히알루로니다제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 막 연관 히알루로니다제는 PH-20을 포함한다. 일부 실시양태에서, PH-20은 GPI-앵커링된다. 일부 실시양태에서, 외인성 핵산은 히알루로난을 분해할 수 있는 미생물 단백질을 코딩하며, 여기서 미생물 단백질은 분비된 히알루로니다제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 분비된 히알루로니다제는 HysA, lin, sko 및 rv 중 적어도 하나, 또는 그의 임의의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 외인성 핵산은 미생물 단백질을 코딩한다. 일부 실시양태에서, 미생물 단백질은 HysA를 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 종양용해 폭스바이러스는 바이러스의 게놈에서의 변형을 추가로 포함하며, 여기서 변형은 B5R 유전자의 돌연변이 또는 결실을 포함한다. 일부 실시양태에서, 바이러스의 게놈에서의 변형은 B5R 유전자의 SCR 영역에서의 돌연변이 또는 결실을 포함하고, 상기 SCR 영역은 SCR1, SCR3, SCR4 또는 그의 임의의 조합을 포함하고, SCR 영역은 SCR2를 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 변형된 종양용해 폭스바이러스는 티미딘 키나제 (TK), B8R, B18R, B15R, K7R, C6L, K4L, F8L, F9L, F10L, F17R, E1L, E4L, E6R, E8R, E10R, E11L, O2L, I1L, I2L, I3L, I5L, I7L, I8R, G1L, G3L, G4L, G5.5R, G7L, G9R, L1R, L3L, L4R, L5R, J1R, J4R, J6R, H1L, H2R, H3L, H4L, H5R, H6R, D1R, D2L, D3R, D6R, D7R, D8L, D11L, D12L, D13L, A2.5L, A3L, A4L, A5R, A6L, A7L, A9L, A10L, A13L, A14L, A15L, A16L, A17L, A18R, A21L, A24R, A25L, A26L, A27L, A28L, A29L, A30L, A31R, A34R, A42R, A45R, A46R, A52R 및 그의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 바이러스 유전자의 돌연변이 또는 결실을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 종양용해 폭스바이러스는 바이러스 유전자 A52R의 돌연변이 또는 결실을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 종양용해 폭스바이러스는 (i) CXCR4 및 CCR2 중 적어도 하나를 포함하는 케모카인 수용체를 코딩하는 외인성 핵산; (ii) PIAS3을 코딩하는 외인성 핵산; (iii) 티미딘 키나제 유전자의 돌연변이 또는 결실; (iv) A52R 유전자의 돌연변이 또는 결실을 포함한다. 일부 실시양태에서, 바이러스는 전신 전달에 적합하다. 일부 실시양태에서, 바이러스는 면역 회피를 할 수 있다. 일부 실시양태에서, 전신 전달은 경구 투여, 비경구 투여, 비강내 투여, 설하 투여, 직장 투여, 경피 투여, 또는 그의 임의의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 비경구 투여는 정맥내 주사를 포함한다. 일부 실시양태에서, 바이러스는 종양내 전달에 적합하다. 일부 실시양태에서, 폭스바이러스는 백시니아 바이러스이다.
한 실시양태는 (i) 이전 청구항 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 변형을 포함하는 종양용해 폭스바이러스 DNA 백본 벡터를 수득하는 단계; (ii) 종양용해 바이러스 DNA 벡터를 추가로 변형시켜 조작된 DNA 벡터를 생산하는 단계; (iii) 조작된 DNA 벡터로 포유동물 세포를 형질감염시키는 단계; (iv) 포유동물 세포를 바이러스 복제에 적합한 조건 하에 배양하는 단계; 및 (v) 바이러스 입자를 수거하는 단계를 포함하는, 종양용해 폭스바이러스를 조작하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 포유동물 세포는 HeLa 세포, 293 세포, A549 세포, 또는 Vero 세포를 포함한다.
한 실시양태는 종양용해 폭스바이러스, 용기; 및 병리학적 혈관신생과 연관된 장애를 치료하기 위해 대상체에게 상기 종양용해 바이러스를 투여하는 것에 대한 지침서를 포함하는 키트를 제공한다.
한 실시양태는, 대상체에게 치료 유효량의 본 발명에 따른 종양용해 폭스바이러스를 투여하는 것을 포함하는, 종양을 치료하는 방법을 제공한다.
한 실시양태는, 대상체에게 야생형 A34 단백질 (서열식별번호: 4)의 위치 119 및 151에 돌연변이를 포함하는 A34R 단백질을 발현하는 변형된 종양용해 폭스바이러스로 감염된 환자-유래 백혈구 세포를 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함하며, 여기서 변형된 종양용해 폭스바이러스는 종양 미세환경에서 바이러스 입자의 집단을 생산하는 것인, 종양을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 환자-유래 백혈구 세포는 대식세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 환자-유래 백혈구 세포는 종양-표적화 T 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 바이러스 플라크 검정에서 측정 시 바이러스 입자의 집단의 적어도 약 10% 내지 적어도 약 90%가 EEV 입자이다. 일부 실시양태에서, 방법은 종양 미세환경으로부터 EEV 입자를 수거하고, EEV 입자를 대상체에게 정맥내 투여하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 종양용해 폭스바이러스는 변형된 종양용해 백시니아 바이러스이다.
한 실시양태는, 숙주 세포의 배양물을 적어도 약 10% 내지 적어도 약 90% EEV 입자를 포함하는 변형된 종양용해 폭스바이러스의 집단으로 감염시키는 것을 포함하며, 여기서 변형된 종양용해 폭스바이러스는 야생형 A34 단백질 (서열식별번호: 4)의 위치 119 및 151에 돌연변이를 포함하는 A34R 단백질을 발현하는 것인 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 변형된 종양용해 폭스바이러스는 변형된 종양용해 백시니아 바이러스이다.
한 실시양태는, 환자에게 적어도 2개의 돌연변이를 포함하는 A34R 단백질 또는 그의 단편을 코딩하는 핵산을 포함하는 변형된 종양용해 바이러스를 투여하는 것을 포함하며, 여기서 적어도 2개의 돌연변이는 야생형 백시니아 바이러스 A43R 단백질 (서열식별번호: 4)의 위치 Lys119 및 Lys151에 상응하는 위치에 존재하는 것인, 암을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 야생형 백시니아 바이러스 A43R 단백질 (서열식별번호: 4)의 위치 Lys119 및 Lys151에 상응하는 적어도 2개의 돌연변이 n 위치는 각각 Lys119Glu 및 Lys151Glu이다.
한 실시양태는, 환자에게 적어도 2개의 돌연변이를 포함하는 A34R 단백질 또는 그의 단편을 코딩하는 핵산을 포함하는 변형된 종양용해 바이러스를 투여하는 것을 포함하며, 여기서 적어도 2개의 돌연변이는 야생형 백시니아 바이러스 A43R 단백질 (서열식별번호: 4)의 위치 Lys119 및 Lys151에 상응하는 위치에 존재하는 것인, 종양을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 야생형 백시니아 바이러스 A43R 단백질 (서열식별번호: 4)의 위치 Lys119 및 Lys151에 상응하는 적어도 2개의 돌연변이 n 위치는 각각 Lys119Glu 및 Lys151Glu이다.
일부 실시양태에서, 투여는 종양내 주사, 정맥내 주사 또는 그의 조합을 통한다. 일부 실시양태에서, 투여는 종양내 주사, 정맥내 주사 또는 그의 조합을 통한다.
일부 실시양태에서, 방법은 추가의 요법을 종양용해 폭스바이러스와 조합하여 투여하는 것을 추가로 포함하며, 여기서 추가의 요법은 화학요법, 방사선 요법, 추가 바이러스를 사용한 종양용해 바이러스 요법, 면역조정 단백질을 사용한 치료, CAR T 세포 요법, 항암제, 면역조정제 중 적어도 하나, 또는 그의 임의의 조합을 포함한다.
일부 실시양태에서, 추가의 요법은 항-CD33 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 항-CD11b 항체 또는 그의 항원 결합 단편, COX2 억제제, 시토카인, 케모카인, 항-CTLA4 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 항-PD-1 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 항-PD-L1 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 및 TLR 효능제로 이루어진 군으로부터 선택되는 면역조정제를 포함한다.
본 개시내용의 신규 특색은 첨부된 청구범위에 구체적으로 제시되어 있다. 본 개시내용의 원리가 이용된 예시적인 실시양태를 제시하는 하기 상세한 설명 및 그의 첨부 도면을 참조로 본 개시내용의 특색 및 이점의 보다 양호한 이해가 얻어질 것이다.
도 1은 재조합 바이러스 라이브러리를 제조하기 위한 DNA를 생성하는 예시적인 어셈블리 방식을 도시한다.
도 2는 상이한 백시니아 바이러스 균주들에 의해 형성된 바이러스 플라크 코멧 테일의 비교를 도시한다.
도 3a-3b는 상이한 백시니아 바이러스 균주들을 사용하여 수행된 중화 검정의 결과를 도시한다 (도 3a는 항-L1 NR-45114 항체로의 처리 후 결과를 도시하고, 도 3b는 항-L1R 및 VIG 항체로의 처리 후 결과를 도시함).
도 4는 상이한 백시니아 바이러스 균주들로의 감염 후 세포 생존율의 결과 (상단 패널: MC38 세포; 하단 패널: HCT116 세포)를 도시한다.
도 5는 상이한 백시니아 바이러스 균주들에 대한 암 세포 (상단 패널: HCT116 세포; 하단 패널: MC38 세포)에서의 바이러스 복제 검정의 결과를 도시한다.
본 개시내용의 바람직한 실시양태가 본원에서 제시되고 기재되었지만, 이러한 실시양태가 단지 예로서만 제공된다는 것이 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 본 개시내용을 벗어나지 않으면서 이제 다수의 변경, 변화 및 치환이 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 발생할 것이다. 본원에 기재된 본 개시내용의 실시양태에 대한 다양한 대안이 본 개시내용을 실시하는데 사용될 수 있음을 이해하여야 한다. 하기 청구범위는 본 개시내용의 범주를 규정하고 이들 청구범위의 범주 내의 방법 및 구조물 및 그의 등가물이 이에 의해 포함되는 것으로 의도된다.
특정 정의
본원에 사용된 용어는 특정한 사례를 기재하기 위한 목적일 뿐이고, 제한적인 것으로 의도되지 않는다. 본원에서 사용된 단수 형태는 문맥이 달리 명백하게 나타내지 않는 한 복수 형태를 또한 포함할 수 있다. 추가로, 용어 "함유하다", "함유하는", "포함한", "포함하다", "갖는", "갖는다", "있는" 또는 그의 변형이 상세한 설명 및/또는 청구범위에서 사용되는 한, 이러한 용어는 용어 "포함하는"과 유사한 방식으로 포괄적인 것으로 의도된다.
용어 "약" 또는 "대략적으로"는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 결정된 바와 같은 특정한 값에 대한 허용가능한 오차 범위 내에 있는 것을 의미할 수 있고, 이는 부분적으로 어떻게 값이 측정 또는 결정되는지에, 예를 들어 측정 시스템의 한계에 좌우될 것이다. 예를 들어, "약"은 소정의 값의 실시당 1 또는 1 초과의 표준 편차 이내인 것을 의미할 수 있다. 특정한 값이 본 출원 및 청구범위에 기재되는 경우에, 달리 언급되지 않는 한 용어 "약"은 특정한 값에 대한 허용가능한 오차 범위, 예컨대 용어 "약"이 수식하는 값의 ±10%를 의미하는 것으로 가정되어야 한다.
용어 "개체", "환자" 또는 "대상체"는 상호교환가능하게 사용된다. 이러한 용어 중 어떤 것도 건강 관리 종사자 (예를 들어 의사, 공인 간호사, 간호사, 의사 보조자, 간호조무사, 또는 호스피스 종사자)의 감독 (예를 들어, 일정한 또는 간헐적)을 특징으로 하는 상황을 필요로 하거나 또는 이에 제한되지 않는다. 일부 실시양태에서, 환자, 대상체 또는 개체는 건강 관리 종사자의 감독 하에 있을 수 있다.
특정 바이러스와 관련하여 본원에 사용된 용어 "이종 핵산 서열" 또는 "외인성 핵산 서열" 또는 "트랜스진"은 명시된 바이러스 이외의 공급원으로부터 기원하는 핵산 서열을 지칭할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "돌연변이"는 결실, 이종 핵산의 삽입, 역전 또는 치환, 예컨대 관련 기술분야에서 통상적으로 이해되는 바와 같은 오픈 리딩 프레임 제거 돌연변이를 지칭할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "유전자"는, 임의로 코딩 서열의 상류 또는 하류에 위치할 수 있는 연관된 조절 영역, 예컨대 프로모터, 오퍼레이터, 종결인자 등과 함께, 개별 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산의 절편 ("코딩 서열" 또는 "코딩 영역"으로도 지칭됨)을 지칭할 수 있다.
본원에서 상호교환가능하게 사용된 용어 "돌연변이체 바이러스" 및 "변형된 바이러스"는 그의 게놈 내에 결실, 이종 핵산의 삽입, 역전, 치환, 또는 그의 조합을 포함하나 이에 제한되지는 않는 1개 이상의 돌연변이를 포함하는 바이러스를 지칭할 수 있다.
바이러스에 관하여 본원에 사용된 용어 "자연 발생"은 바이러스가 자연에서 발견될 수 있다는 것, 즉 자연의 공급원으로부터 단리될 수 있고 의도적으로 변형되지 않았다는 것, 예를 들어 야생형 바이러스를 나타낼 수 있다.
바이러스 핵산 서열 또는 바이러스 단백질의 아미노산 서열에서의 하나 이상의 돌연변이와 관련하여 본원에 사용된 용어 "비-자연 발생"은 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 바이러스 균주가 자연에서 발견될 수 없다는 것, 즉 자연의 공급원으로부터 단리될 수 없고, 대신에 의도적으로 변형되었다는 것을 나타낼 수 있다.
본원에 언급된 용어 "억제하는", "감소시키는" 또는 "방지", 또는 이들 용어의 임의의 변형은 목적하는 결과를 달성하기 위한 임의의 측정가능한 감소 또는 완전한 억제를 포함할 수 있다.
본원에 사용된 "프로모터"는 전사의 개시 및 속도가 제어되는 핵산 서열의 영역인 제어 서열일 수 있다. 특정 실시양태에서, 프로모터는 조절 단백질 및 분자, 예컨대 RNA 폴리머라제 및 다른 전사 인자가 결합할 수 있는 유전자 요소를 함유할 수 있다. 용어 "작동적으로 위치한", "작동적으로 연결된", "제어 하의" 및 "전사 제어 하의"는 프로모터가 핵산 서열의 전사 개시 및/또는 발현을 제어하기 위해 핵산 서열과 관련하여 정확한 기능적 위치 및/또는 배향으로 존재하는 것을 의미할 수 있다. 특정 실시양태에서, 프로모터는 "인핸서"와 함께 사용될 수 있거나 또는 그렇지 않을 수 있고, 이는 핵산 서열의 전사 활성화에 수반되는 시스-작용 조절 서열을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "상동성"은 최적의 비교 목적을 위해 서열들을 정렬함으로써 (예를 들어, 제1 서열의 서열에 갭을 도입할 수 있음) 결정될 수 있는 2개 이상의 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열 사이의 "상동성" 또는 "퍼센트 상동성"의 계산일 수 있다. 이어서, 상응하는 위치의 뉴클레오티드들을 비교할 수 있고, 2개의 서열 사이의 퍼센트 동일성은 서열들이 공유하는 동일한 위치의 개수의 함수일 수 있다 (즉, % 상동성 = 동일한 위치의 # / 위치의 총 # x 100). 예를 들어, 제1 서열 내의 위치를 제2 서열 내의 상응하는 위치와 동일한 뉴클레오티드가 차지할 수 있고, 그러면 분자들이 그 위치에서 동일하다. 2개의 서열 사이의 퍼센트 상동성은 2개의 서열의 최적의 정렬을 위해 도입될 필요가 있는 갭의 개수 및 각각의 갭의 길이를 고려하여, 서열들이 공유하는 동일한 위치의 개수의 함수일 수 있다. 일부 실시양태에서, 비교 목적을 위해 정렬된 서열의 길이는 참조 서열의 길이의 적어도 약 30%, 40%, 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 95%이다. BLAST® 검색은 2개의 서열 사이의 상동성을 결정할 수 있다. 상동성은 2개의 서열의 전체 길이 사이 또는 2개의 서열의 전체 길이의 분획 사이의 것일 수 있다. 2개의 서열은 유전자, 뉴클레오티드 서열, 단백질 서열, 펩티드 서열, 아미노산 서열 또는 그의 단편일 수 있다. 2개의 서열의 실제 비교는 널리 공지된 방법, 예를 들어 수학적 알고리즘을 사용하여 달성될 수 있다. 이러한 수학적 알고리즘의 비제한적 예가 문헌 [Karlin, S. and Altschul, S., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90- 5873-5877 (1993)]에 기재되어 있을 수 있다. 이러한 알고리즘이 문헌 [Altschul, S. et al., Nucleic Acids Res., 25:3389-3402 (1997)]에 기재된 바와 같은 NBLAST 및 XBLAST 프로그램 (버전 2.0) 내로 혼입될 수 있다. BLAST 및 갭도입 BLAST 프로그램을 이용하는 경우에, 각각의 프로그램 (예를 들어, NBLAST)의 임의의 관련 파라미터가 사용될 수 있다. 예를 들어, 서열 비교를 위한 파라미터가 점수= 100, 워드 길이= 12로 설정될 수 있거나, 또는 달라질 수 있다 (예를 들어, W=5 또는 W=20). 다른 예는 문헌 [Myers and Miller, CABIOS (1989)]의 알고리즘, ADVANCE, ADAM, BLAT 및 FASTA를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 예를 들어, GCG 소프트웨어 패키지 (엑셀리스(Accelrys), 영국 캠브리지) 내의 GAP 프로그램을 사용하여 2개의 아미노산 서열 사이의 퍼센트 동일성이 달성될 수 있다.
용어 "대상체"는 영장류 (예를 들어, 인간), 소, 양, 염소, 말, 개, 고양이, 토끼, 래트 또는 마우스를 포함하나 이에 제한되지는 않는 동물을 지칭할 수 있다. 용어 "대상체" 및 "환자"는, 예를 들어 포유동물 대상체, 예컨대 인간 대상체와 관련하여 본원에서 상호교환가능하게 사용된다.
용어 "치료하다", "치료하는" 및 "치료"는 장애, 질환 또는 상태, 또는 장애, 질환 또는 상태와 연관된 증상 중 1종 이상을 완화시키거나 제거하는 것; 또는 장애, 질환 또는 상태 자체의 원인(들)을 완화시키거나 근절시키는 것을 포함하는 것으로 의도될 수 있다. 치료의 바람직한 효과는 질환의 발생 또는 재발을 방지하는 것, 증상 완화, 질환의 임의의 직접적 또는 간접적 병리학적 결과를 감소시키는 것, 전이를 방지하는 것, 질환 진행 속도를 감소시키는 것, 질환 상태의 호전 또는 완화, 및 완화 또는 개선된 예후를 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.
용어 "치료 유효량"은 투여되었을 때, 치료될 질환, 장애 또는 상태의 증상 중 1종 이상의 발생을 방지하거나 또는 이를 어느 정도 완화시키는데 충분할 수 있는 화합물의 양을 지칭할 수 있다. 또한 용어 "치료 유효량"은 연구원, 수의사, 의사 또는 임상의가 추구하고 있는 세포, 조직, 계, 동물 또는 인간의 생물학적 또는 의학적 반응을 도출하는데 충분한 화합물의 양을 지칭할 수 있다.
용어 "제약상 허용되는 담체", "제약상 허용되는 부형제", "생리학상 허용되는 담체" 또는 "생리학상 허용되는 부형제"는 제약상 허용되는 물질, 조성물 또는 비히클, 예컨대 액체 또는 고체 충전제, 희석제, 부형제, 용매 또는 캡슐화 물질을 지칭할 수 있다. 성분은 제약 제제의 다른 성분과 상용성이라는 의미에서 "제약상 허용되는" 것일 수 있다. 이는 또한 합리적인 이익/위험 비에 부합하여, 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응, 면역원성 또는 다른 문제 또는 합병증 없이 인간 및 동물의 조직 또는 기관과 접촉하여 사용하는데 적합할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition; Lippincott Williams & Wilkins: Philadelphia, PA, 2005; Handbook of Pharmaceutical Excipients, 5th Edition; Rowe et al., Eds., The Pharmaceutical Press and the American Pharmaceutical Association: 2005; 및 Handbook of Pharmaceutical Additives, 3rd Edition; Ash and Ash Eds., Gower Publishing Company: 2007; Pharmaceutical Preformulation and Formulation, Gibson Ed., CRC Press LLC: Boca Raton, FL, 2004)]을 참조한다.
용어 "제약 조성물"은 본원에 개시된 화합물과 다른 화학적 성분, 예컨대 희석제 또는 담체의 혼합물을 지칭할 수 있다. 제약 조성물은 화합물을 유기체에 투여하는 것을 용이하게 할 수 있다. 경구, 주사, 에어로졸, 비경구 및 국소 투여를 포함하나 이에 제한되지는 않는, 화합물을 투여하는 다수의 기술이 관련 기술분야에 존재한다. 제약 조성물은 화합물을 무기 또는 유기 산, 예컨대 염산, 브로민화수소산, 황산, 질산, 인산, 메탄술폰산, 에탄술폰산, p-톨루엔술폰산, 살리실산 등과 반응시킴으로써 또한 수득될 수 있다.
본원에 사용된 "항암제"는, 예를 들어 암 세포를 사멸시키거나, 암 세포의 아폽토시스를 유도하거나, 암 세포의 성장 속도를 감소시키거나, 전이의 발생 또는 개수를 감소시키거나, 종양 크기를 감소시키거나, 종양 성장을 억제하거나, 종양 또는 암 세포로의 혈액 공급을 감소시키거나, 암 세포 또는 종양에 대한 면역 반응을 촉진하거나, 암의 진행을 방지 또는 억제하거나, 또는 암을 갖는 대상체의 수명을 증가시킴으로써, 대상체 내의 암에 음성적으로 영향을 미칠 수 있는 작용제 또는 요법을 지칭할 수 있다. 항암제의 비제한적 예는 생물학적 작용제 (생물요법), 화학요법제 및 방사선요법제를 포함할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "종양용해"는 암 또는 종양 세포를, 예를 들어 상기 세포의 직접적인 용해, 상기 세포에 대한 면역 반응의 자극, 아폽토시스, 독성 단백질의 발현, 자가포식 및 단백질 합성 중단, 항종양 면역의 유도, 또는 그의 임의의 조합에 의해, 작용제, 예컨대 종양용해 바이러스, 예컨대 종양용해 폭스바이러스, 예컨대 종양용해 백시니아 바이러스에 의해 사멸시키는 것을 지칭할 수 있다. 작용제, 예컨대 종양용해 백시니아 바이러스에 의해 감염된 암 또는 종양 세포의 직접적인 용해는 상기 세포 내에서의 바이러스 복제의 결과일 수 있다. 특정 예에서, 용어 "종양용해"는 암 또는 종양 세포를 상기 세포의 용해 없이 사멸시키는 것을 지칭할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "종양용해 바이러스"는 종양 세포를 우선적으로 감염시키고 사멸시키는 바이러스를 지칭할 수 있다. 특정 비제한적 상황 하에서, 종양용해 바이러스는 종양 세포의 선택적 사멸 뿐만 아니라 숙주 항종양 면역 반응의 자극에 의존적인 이중 메카니즘을 통해 항종양 반응을 촉진할 수 있는 것으로 이해된다.
일부 실시양태에서, 종양용해 바이러스는 (i) 암 세포에서 우선적으로 자연 복제되고 인간에서 종종 선천성 항바이러스 신호전달에 대한 상승된 감수성 또는 종양원성 신호전달 경로에 대한 의존성으로 인해 비-병원성인 바이러스; 및 (ii) 사용을 위해 유전자 조작된 바이러스를 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 종양용해 바이러스는 단순 포진 바이러스 (HSV)를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 종양용해 바이러스는 폭스바이러스를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 폭스바이러스는 레포리폭스바이러스 또는 백시니아 바이러스를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 백시니아 바이러스는 안카라(Ankara) 균주, 웨스턴 리저브(Western Reserve) 균주 (WR), 또는 코펜하겐(Copenhagen) 균주의 백시니아 바이러스를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 백시니아 바이러스는 리스터(Lister), 와이어쓰(Wyeth), 뉴욕 시티 보드 오브 헬쓰(New York City Board of Health), 티안 탄(Tian Tan), 태쉬 켄트(Tash Kent), 또는 USSR 균주를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 레포리폭스바이러스는 점액종 바이러스를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 종양용해 바이러스는 변형될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "변형된 종양용해 바이러스"는 그의 구성성분에 대한 변형, 예컨대 비제한적으로, 바이러스의 천연 게놈 ("백본")에서의 변형, 예컨대 바이러스 유전자의 돌연변이 또는 결실, 외인성 핵산의 도입, 바이러스 핵산 또는 바이러스 단백질의 화학적 변형, 및 외인성 단백질 또는 변형된 바이러스 단백질의 바이러스성 캡시드에의 도입을 포함하는 종양용해 바이러스를 지칭할 수 있다. 일반적으로, 종양 세포에 대한 개선된 치료 효과를 얻기 위해 종양용해 바이러스가 변형 (또한 "조작"으로 공지됨)될 수 있다. 특정 실시양태에서, 변형된 종양용해 바이러스는 변형된 폭스 바이러스일 수 있다. 특정 실시양태에서, 변형된 종양용해 바이러스는 변형된 폭스 바이러스일 수 있다.
본원에서 상호교환가능하게 사용되는 용어 "전신 전달" 및 "전신 투여"는 일부 경우에 의약, 종양용해 바이러스 또는 다른 물질을 순환계 내로 투여하는 경로를 지칭할 수 있다. 전신 투여는 경구 투여, 비경구 투여, 비강내 투여, 설하 투여, 직장 투여, 경피 투여, 또는 그의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
세포외 외피보유 바이러스 형태의 종양용해 백시니아 바이러스
폭스바이러스 (예컨대, 백시니아 바이러스)는 IMV (세포내 성숙 바이러스; 이는 고도로 항원성이지만 안정하고, 폭스바이러스의 숙주 대 숙주 확산에 중요할 수 있음), 및 EEV (세포외 외피보유 바이러스; 이는 숙주 외부에서 불안정할 수 있지만, 바이러스를 숨기는 숙주 세포 유래 외부 외피로 인해 숙주 내에서 확산을 증진시킬 수 있고; 따라서, EEV 형태는 백시니아 바이러스, 예를 들어 종양용해 백시니아 바이러스의 숙주 내 전신 확산에 도움이 될 수 있음)를 포함한 몇몇 형태로 존재할 수 있다.
백시니아의 상이한 균주는 감수성 세포의 감염 후에 IMV 및 EEV 입자를 상이한 비로 생산하는 것으로 공지되어 있으며, 웨스턴 리저브 (WR) 균주는 낮은 EEV 생산 균주이고, 백시니아의 국제보건부(International Health Department) (IHD)-J 균주 (IHD-J)는 높은 EEV 생산 균주이다. IHD-J에는 존재하지만 WR에는 존재하지 않는 백시니아 유전자에서의 점 돌연변이의 한 예는 백시니아 바이러스 유전자 VACWR157에 의해 코딩되는 A34R 단백질 (K151E)에 존재한다. 이러한 돌연변이를 함유하는 WR로부터 유래된 균주 (WR A34R 유전자좌 내로 재조합된 IHD-J로부터의 A34R 유전자를 갖는 WR 바이러스인 WI 균주)는 EEV 생산을 증가시키는 것으로 나타났다 (문헌 [Blasco, R., et al. 1993 J Virol. Jun;67(6):3319-25] 참조).
본 개시내용의 일부 실시양태에서, 변형, 예컨대 바이러스 당단백질 (예를 들어, A34R 단백질; 유니프롯 수탁 번호 P24761로 제공된 야생형 서열; 서열식별번호: 4)에서의 비-자연 발생 돌연변이를 포함할 수 있는 변형된 종양용해 폭스바이러스 (예를 들어, 변형된 종양용해 백시니아 바이러스 균주)가 제공되며, 이는 바이러스의 세포내 성숙 바이러스 (IMV) 형태에 대한 세포외 외피보유 바이러스 (EEV)의 비를 증진시킨다. 예를 들어, 바이러스 당단백질 (예를 들어, A34R 단백질)에 비-자연 발생 돌연변이를 포함하는 변형된 종양용해 백시니아 바이러스 균주는 IMV 입자에 비해 더 많은 양의 EEV 입자를 방출할 수 있다.
일부 실시양태에서, 바이러스 당단백질, 예컨대 A34R에 2개 이상의 비-자연 발생 돌연변이를 포함할 수 있는 변형된 종양용해 백시니아 바이러스 균주가 제공된다. 돌연변이된 A34R 단백질 (본원에서 "WO34"로도 지칭됨)에 대한 예시적인 아미노산 서열은 서열식별번호: 5에 제공된다.
일부 실시양태에서, 2개 이상의 비-자연 발생 돌연변이는 야생형 A34R 단백질 (서열식별번호: 4) 또는 그의 단편 내의 양으로 하전된 아미노산 잔기 (예를 들어, 리신)에 존재할 수 있고, 여기서 양으로 하전된 아미노산 잔기는 pH 5에서 양으로 하전된다. 일부 실시양태에서, 2개 이상의 비-자연 발생 돌연변이 중 적어도 하나는 야생형 A34R 단백질 (서열식별번호: 4) 또는 그의 단편 내의 위치 110에 존재할 수 있다. 일부 예에서, 2개 이상의 돌연변이 중 적어도 하나가 야생형 A34R 단백질 (서열식별번호: 4)의 위치 110에 존재하는 경우, 그 위치에서 돌연변이된 아미노산은 아스파라긴이 아니다.
일부 실시양태에서, 2개 이상의 비-자연 발생 돌연변이는 야생형 A34R 단백질 (서열식별번호: 4) 또는 그의 단편 내의 아스파르트산 잔기에 존재하지 않는다. 일부 실시양태에서, 2개 이상의 비-자연 발생 돌연변이는 야생형 A34R 단백질 (서열식별번호: 4) 또는 그의 단편 내의 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 시스테인, 글루타민, 글루탐산, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 류신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신 또는 발린 잔기에 독립적으로 존재할 수 있다. 일부 실시양태에서, 변형된 종양용해 폭스바이러스에 의해 발현된 A34R 단백질 또는 그의 단편은 리신 잔기에서 비-자연 발생 돌연변이를 포함할 수 있으며, 여기서 리신 잔기는 야생형 A34R 단백질 (서열식별번호: 4) 또는 그의 단편의 위치 Lys151 이외의 위치에 존재한다. 일부 실시양태에서, 변형된 종양용해 폭스바이러스에 의해 발현되는 A34R 단백질 또는 그의 단편은 위치 Lys119에서 비-자연 발생 돌연변이를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 2개 이상의 비-자연 발생 돌연변이는 야생형 A34R 단백질 (서열식별번호: 4) 또는 그의 단편의 잔기 119 및 151에 존재할 수 있다. 일부 실시양태에서, 위치 119에서의 돌연변이는 Lys119Glu (K119E)일 수 있다. 일부 실시양태에서, 위치 151에서의 돌연변이는 Lys151Glu (K151E)일 수 있다.
일부 실시양태에서, 바이러스 단백질, 예컨대 헤마글루티닌, 뉴라미니다제, 스파이크 (S) 당단백질, E1, E2, gp120, gp160, gp41, gp1, gp2, E (이량체), E1 또는 E2에서의 돌연변이를 포함할 수 있는 변형된 종양용해 폭스바이러스 균주가 제공된다.
일부 경우에, 변형된 종양용해 폭스바이러스 A34R 단백질 내의 2개 이상의 비-자연 발생 돌연변이는 바이러스의 세포내 성숙 바이러스 (IMV) 형태에 대한 세포외 외피보유 바이러스 (EEV) 형태의 비를 증가시킬 수 있다.
일부 실시양태에서, 변형된 종양용해 폭스바이러스 A34R 단백질 내의 2개 이상의 비-자연 발생 돌연변이는, A34R 단백질 내의 2개 이상의 비-자연 발생 돌연변이를 포함하지 않으면서 그 외에는 동일한 폭스바이러스 균주와 비교하여, 바이러스의 IMV 형태에 대한 EEV 형태의 비를 증가시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, A34 단백질 내의 적어도 2개의 비-자연 발생 돌연변이를 포함하는 본원에 제공된 변형된 폭스바이러스 균주는, 조직 배양물에서 보다 낮은 수준의 EEV 입자를 방출하는 폭스바이러스 균주 (예를 들어, A34R 단백질 내의 적어도 2개의 비-자연 발생 돌연변이를 포함하지 않는 백시니아 바이러스 균주)에 의해 형성된 조직 배양물 내 큰 원형 플라크와 비교하여, 조직 배양물 내 증가된 코멧 형성에 의해 측정 시 높은 수준의 EEV 입자를 방출한다.
A34R 단백질 내의 적어도 2개의 비-자연 발생 돌연변이를 포함하는 본 개시내용의 변형된 폭스바이러스에 의해 방출된 EEV 입자는 일부 실시양태에서 항체 (중화 항체)에 의한 중화, 및 보체 독성에 저항성이지만, IMV 입자는 그렇지 않다. 따라서, EEV 입자는 시험관내 및 생체내에서 장범위 파종을 매개할 수 있다.
EEV 입자는 또한 IMV 입자와 비교하여 보다 높은 비감염성(specific infectivity)을 가질 수 있다 (보다 낮은 입자/pfu 비에 의해 결정됨). 따라서, 보다 높은 수준의 EEV 입자를 방출하는 변형된 폭스바이러스 균주는 치료 용도를 위한 개선된 바이러스일 수 있다.
일부 실시양태에서, 특정 숙주-세포 유래 단백질은 EEV 제제와 공동-국재화될 수 있지만, IMV와는 그렇지 않고, 세포-유래 단백질의 양은 숙주 세포주 및 바이러스 균주에 의존할 수 있다. 예를 들어, 연구는 WR EEV가 VV IHD-J 균주와 비교하여 더 많은 세포-유래 단백질을 함유한다는 것을 나타낸 바 있다 (문헌 [van Eijl H, Hollinshead M, Smith GL. The vaccinia virus A36R protein is a type lb membrane protein present on intracellular but not extracellular enveloped virus particles. Virology 2000;271 : 26-36] 참조). 일부 경우에, 숙주 세포 유래 단백질은 EEV 입자의 생물학적 효과를 변형시킬 수 있다. 예로서, A34R 단백질 내에 적어도 2개의 비-자연 발생 돌연변이를 포함하는 WR 백시니아 바이러스 균주에 의해 방출된 EEV 입자의 표면에서 숙주 막 단백질 CD55의 혼입은 이들을 보체 독성에 저항성이게 할 수 있다.
백시니아 바이러스의 웨스턴 리저브 (WR) 균주의 경우, 바이러스 입자의 약 1%가 통상적으로 EEV이고, 생산자 세포의 종양용해 전에 배양 상청액 내로 방출된다. 일부 연구는 50배 더 많은 EEV 입자가 백시니아의 IHD-J 균주로부터 방출될 수 있음을 나타낸 바 있다 (문헌 [Blasco R, Sisler JR, Moss B. Dissociation of progeny vaccinia virus from the cell membrane is regulated by a viral envelope glycoprotein : effect of a point mutation in the lectin homology domain of the A34R gene. J Virol 1993;67 : 3319-25] 참조; 또한 문헌 [Mcintosh AA, Smith GL. Vaccinia virus glycoprotein A34R is required for infectivity of extracellular enveloped virus. J Virol 1996;70: 272-81] 참조).
본 개시내용의 변형된 폭스바이러스 (예를 들어, 백시니아 바이러스) 균주는 일부 예에서 그 외에는 동일하지만 적어도 2개의 비-자연 발생 돌연변이 (예를 들어, K151E 및 K119E)를 포함하는 A34R 단백질을 포함하지 않는 폭스바이러스 균주와 비교하여 약 10배 내지 약 200배 더 높은 수준의 EEV 입자를 방출할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 변형된 폭스바이러스 균주는 그 외에는 동일하지만 적어도 2개의 비-자연 발생 돌연변이 (예를 들어, K151E 및 K119E)를 포함하는 A34R 단백질을 포함하지 않는 폭스바이러스 균주와 비교하여 약 10배 내지 약 15배, 약 15배 내지 약 20배, 약 20배 내지 약 25배, 약 25배 내지 약 30배, 약 30배 내지 약 35배, 약 35배 내지 약 40배, 약 40배 내지 약 45배, 약 45배 내지 약 50배, 약 50배 내지 약 55배, 약 55배 내지 약 60배, 약 60배 내지 약 65배, 약 65배 내지 약 70배, 약 75배 내지 약 80배, 약 85배 내지 약 90배, 약 95배 내지 약 100배, 약 100배 내지 약 120배, 약 120배 내지 약 140배, 약 140배 내지 약 160배, 약 160배 내지 약 180배, 약 180배 내지 약 200배 더 많은 EEV 입자를 방출할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 변형된 백시니아 바이러스 균주는 A34R 단백질이 돌연변이 K119E 및 K151E를 포함하는 WR 균주일 수 있고, 그 외에는 동일하지만 돌연변이 K119E 및 K151E를 포함하는 A34R 단백질을 포함하지 않는 WR 백시니아 바이러스 균주와 비교하여 약 10배 내지 약 15배, 약 15배 내지 약 20배, 약 20배 내지 약 25배, 약 25배 내지 약 30배, 약 30배 내지 약 35배, 약 35배 내지 약 40배, 약 40배 내지 약 45배, 약 45배 내지 약 50배, 약 50배 내지 약 55배, 약 55배 내지 약 60배, 약 60배 내지 약 65배, 약 65배 내지 약 70배, 약 75배 내지 약 80배, 약 85배 내지 약 90배, 약 95배 내지 약 100배, 약 100배 내지 약 120배, 약 120배 내지 약 140배, 약 140배 내지 약 160배, 약 160배 내지 약 180배, 약 180배 내지 약 200배 더 많은 EEV 입자를 방출할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 변형된 백시니아 바이러스 균주는 A34R 단백질이 돌연변이 K119E 및 K151E (WO34)를 포함하는 WR 균주일 수 있고, WI 백시니아 바이러스 균주와 비교하여 약 10배 내지 약 15배, 약 15배 내지 약 20배, 약 20배 내지 약 25배, 약 25배 내지 약 30배, 약 30배 내지 약 35배, 약 35배 내지 약 40배, 약 40배 내지 약 45배, 약 45배 내지 약 50배, 약 50배 내지 약 55배, 약 55배 내지 약 60배, 약 60배 내지 약 65배, 약 65배 내지 약 70배, 약 75배 내지 약 80배, 약 85배 내지 약 90배, 약 95배 내지 약 100배, 약 100배 내지 약 120배, 약 120배 내지 약 140배, 약 140배 내지 약 160배, 약 160배 내지 약 180배, 약 180배 내지 약 200배 더 많은 EEV 입자를 방출할 수 있다.
일부 경우에, 본 개시내용의 변형된 폭스바이러스에 의한, IMV 입자와 비교하여 EEV 입자의 방출의 증가는 바이러스 플라크 검정을 수행함으로써 측정될 수 있으며, 여기서 A34R 단백질 내의 2개 이상의 돌연변이를 포함하지 않으면서 그 외에는 동일한 폭스바이러스와 비교하여, A34R 단백질 내의 2개 이상의 비-자연 발생 돌연변이를 포함하는 폭스바이러스에서 더 많은 수의 코멧-테일 형성이 관찰될 수 있다.
일부 경우에, IMV 입자와 비교하여 EEV 입자의 방출의 증가는 중화 검정을 수행함으로써 측정될 수 있으며, 여기서 본 개시내용의 변형된 폭스바이러스 (예를 들어, 백시니아 바이러스 균주)로 감염되고 중화 항체 (예컨대, 항-L1 NR-45114 항체 또는 VIG 항체)에 노출된 세포는 바이러스 플라크 검정에서 시험될 수 있고, 바이러스 플라크 형성 (예를 들어, PFU/mL)은 적절한 대조군 바이러스 (예를 들어, A34R 단백질 내의 적어도 2개의 비-자연 발생 돌연변이를 포함하지 않는 백시니아 바이러스 균주)와 비교될 수 있다. 일부 경우에, 항-L1은 IMV 감염을 중화시키고 차단할 수 있다. 일부 경우에, VIG 항체는 VV 감염을 차단할 수 있다.
일부 경우에, IMV 입자와 비교하여 EEV 입자의 방출의 증가는 코멧 테일 형성의 증가를 관찰함으로써 측정될 수 있다. 일부 경우에, 코멧 테일 형성의 증가를 관찰하는 것은 플레이팅된 공지된 양의 바이러스로부터 생성된 코멧 테일 외관을 갖는 플레이트 상의 콜로니의 수를 계수하고, 또 다른 플레이팅된 등가량의 바이러스를 갖는 플레이트 상의 수와 비교하는 것을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 코멧 형성의 증가는 바이러스 균주의 IMV 형태에 비해 EEV의 양의 증가를 나타낼 수 있다.
일부 경우에, 본 개시내용의 변형된 폭스바이러스 균주는 포스포리파제, 키나제, 인단백질, 폴리머라제, 막 단백질, 비리온 코어 단백질, 글루타레독신, DNA 결합 단백질, RNA 결합 단백질, IMV 단백질, 프로테이나제, 헬리카제, 메탈로프로테이나제, 비리온 구조 단백질, 미리스틸 단백질, 포스파타제, 헤파린 결합 단백질, 당단백질, ATPase, 캡핑 효소, 전사 인자, 전구체 단백질, 서브유닛 단백질, DNA 헬리카제, 팔미틸 단백질, 또는 수용체를 코딩하는 바이러스 게놈의 영역에 하나 이상의 추가의 돌연변이를 포함할 수 있다.
일부 경우에, 하나 이상의 추가의 돌연변이는 폭스바이러스 유전자, 예컨대 폭스바이러스의 TK (티미딘 키나제), B8R, B18R, B15R, K7R, C6L, K4L, F8L, F9L, F10L, F17R, E1L, E4L, E6R, E8R, E10R, E11L, O2L, I1L, I2L, I3L, I5L, I7L, I8R, G1L, G3L, G4L, G5.5R, G7L, G9R, L1R, L3L, L4R, L5R, J1R, J4R, J6R, H1L, H2R, H3L, H4L, H5R, H6R, D1R, D2L, D3R, D6R, D7R, D8L, D11L, D12L, D13L, A2.5L, A3L, A4L, A5R, A6L, A7L, A9L, A10L, A13L, A14L, A15L, A16L, A17L, A18R, A21L, A24R, A25L, A26L, A27L, A28L, A29L, A30L, A31R, A34R, A42R, A45R, A46R, A52R 유전자에 존재할 수 있다.
또한, 일부 실시양태에서, 변형된 종양용해 폭스바이러스 (예를 들어, 바이러스의 EEV 형태를 증가시키는 비-자연 발생 돌연변이, 및 추가로, 비-바이러스 단백질, 예컨대 치료 단백질 또는 진단 단백질을 코딩할 수 있는 외인성 핵산을 포함할 수 있는 백시니아 바이러스 균주)가 본원에 제공된다. 외인성 핵산에 의해 코딩되는 단백질의 비제한적 예는 SOC3, PH-20, HMGB1, PIAS3, IL15, IL15-Rα, LIGHT, ITAC, 프랙탈카인, CXCR4, CCR2, CCL5, N1L, 면역 체크포인트 조정제 (예를 들어, 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체, 항-CTLA4 항체), GM-CSF, IL-12, IL-2, INS, EPO, env, F8, GCG, IFNG, IGHG1, F9, GH1, IL-2, CSF2, TNFRSF1B, ALB, PLAU, IFNB1, CSF3, IFNA2, FSHB, 보툴리눔 독소 유형 A, 알레파셉트, 판크레리파제, 항트롬빈 알파, 아르시투모맙, 항-레서스 (rh)이뮤노글로불린 G, 항흉선세포 글로불린, 알렘투주맙, 압식시맙, 알글루코시다제 알파, 아바타셉트, 페가데마제, 압시티드, 인간 혈청 알부민, 라스부리카제, 베바시주맙, 보툴리눔 독소 유형 B, 비발리루딘, 코리오고나도트로핀 알파, 페그필그라스팀, 콜라게나제 클로스트리디움 히스티올리티쿰, 필그라스팀, 크로탈리다에 다가 면역 Fab, 사르그라모스팀, 도르나제 알파, 데니류킨 디프티톡스, 디곡신 면역 Fab, 에포에틴 알파, 다르베포에틴 알파, 에쿨리주맙, 엔푸비르티드, 엑세나티드, 에팔리주맙, 팔리페르민, 응고 인자 IX, 항혈우병성 인자, 티로트로핀 알파, 폴리트로핀 베타, 응고 인자 VIIa 재조합 인간, 겜투주맙 오조가미신, 갈술파제, 페그비소만트, 이미글루세라제, 소마트로핀, 글루카곤, 아갈시다제 베타, 알글루세라제, 히알루로니다제, 히스트렐린, C형 간염 항원, HIV 항원, B형 간염 표면 항원, HPV 백신, 히알루로니다제, 인터페론 알파-2b, 인터페론 감마-1b, 인슐린, 라로니다제, 이브리투모맙 티욱세탄, 인슐린, 인플릭시맙, 인터페론 베타-1b, 오프렐베킨, 이두르술파제, 파니투무맙, 면역 글로불린 인간, 세툭시맙, 아달리무맙, 페가스파르가제, 다클리주맙, 아스파라기나제, 인터페론 알파콘-1, 인터페론 알파-n3, 루트로핀 알파, 레피루딘, 락타제, 무로모납, 메카세르민, 나탈리주맙, 노페투모맙, 네시리티드, 옥트레오티드, ospA 지단백질, 테넥테플라제, 프람린티드, 파파인, 우로키나제, 아니스트레플라제, 드로트레코긴 알파, 레테플라제, 베카플레르민, 팔리비주맙, 알테플라제, 라니비주맙, 재조합 인간 골 형태발생 단백질 7 (rhBMP7), 재조합 정제된 단백질 유도체 (DPPD), 스트렙토키나제, 칼시토닌, 세르모렐린, 세크레틴, 알파-1-프로테이나제 억제제, 사투모맙 펜데티드, 테크네튬 파놀레소맙, 테리파라티드, 트립신, 에타네르셉트, 및 그의 기능적 도메인 또는 단편 변이체, 또는 그의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
히알루로난 (HA)은 ECM의 중요한 구조 요소이고, 반복 디사카라이드 단위로 이루어진 고분자량 선형 글리코사미노글리칸이다. 이는 결합, 상피 및 신경 조직 전체에 걸쳐 광범위하게 분포될 수 있고, 그의 발현 수준은 많은 유형의 종양에서 유의하게 상승될 수 있다. 히알루로니다제는 HA의 분해를 촉매하는 효소의 패밀리이다. 인간에서 다음 적어도 5종의 기능적 히알루로니다제가 지금까지 확인되었다: HYAL1, HYAL2, HYAL3, HYAL4 및 HYAL5 (또한 PH-20 또는 SPAM1로 공지됨), 이 중에서 PH-20은 비교적 중성인 pH에서 기능적인 것으로 지금까지 알려진 유일한 것이다. 본 개시내용의 일부 실시양태에서, 히알루로니다제를 다른 종양-표적화 치료제 (예컨대 트랜스진, 또한 본원에서 외인성 핵산으로 지칭됨)와 조합하는 것은 적어도 ECM을 감소시키고 종양 내부 및 종양 간 치료제의 수송을 증진시킴으로써 변형된 종양용해 바이러스의 치료 효과를 촉진할 수 있다.
본원의 일부 실시양태는 히알루로난을 분해할 수 있는 막 연관 단백질, 예컨대 히알루로니다제를 코딩하는 외인성 핵산을 포함할 수 있는 변형된 종양용해 바이러스를 개시한다. 본원에 사용된 용어 "히알루로니다제"는 종양에서 HA의 분해를 촉매하는 임의의 효소 또는 그의 단편, 예컨대 비제한적으로, PH-20 및 다른 종으로부터의 그의 상동체, 뿐만 아니라 유사한 효소 기능을 갖는 다른 조작된/설계 단백질을 지칭할 수 있다는 것을 주목해야 한다. 본원에 사용된 히알루로니다제는 히알루로난 분해 효소의 부류를 지칭할 수 있다.
일부 실시양태에서, 변형된 종양용해 바이러스는 키메라 단백질인 케모카인 수용체를 코딩할 수 있는 외인성 핵산을 포함한다. 그의 세포외 도메인의 적어도 일부는 바이러스의 종양-표적화 전달을 촉진하는 케모카인 수용체로부터의 것일 수 있고, 그의 세포내 도메인의 적어도 일부는 종양-특이적 복제를 촉진하거나, 면역억제 활성을 억제하거나 또는 일부 다른 유익한 효과를 전달하는 케모카인 수용체로부터의 것일 수 있거나, 또는 그 반대의 경우일 수 있다. 예를 들어, 변형된 종양용해 바이러스는 CCR5의 세포내 GTPase 도메인 및 CXCR4 또는 CCR2의 세포외 케모카인-결합 도메인을 갖는 단백질을 코딩하는 핵산을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 상이한 기능성을 갖는 도메인들을 조합함으로써 변형된 종양용해 바이러스의 치료 성능의 추가의 개선을 달성할 수 있다. 본 개시내용의 한 실시양태는 변형된 종양용해 바이러스가 적어도 1종의 케모카인 수용체를 코딩할 수 있는 외인성 핵산을 포함할 수 있다는 것이다. 일부 경우에, 변형된 종양용해 바이러스는 2종 이상의 상이한 케모카인 수용체를 코딩할 수 있는 외인성 핵산을 포함할 수 있고, 이는 바이러스에 의해 동시에 발현될 수 있다. 본원에 기재된 변형된 종양용해 바이러스로부터 동시에 발현될 수 있는 예시적인 케모카인 수용체는 CXCR4 및 CCR2를 포함할 수 있다. 1종 초과의 케모카인 수용체를 발현하는 변형된 종양용해 바이러스에서, 종양용해 바이러스의 치료적 적용에 관하여 종양 세포에 대한 조합 또는 상승작용적 효과가 달성될 수 있다.
특정 실시양태에서, 변형된 종양용해 바이러스는 외인성 CXCR4-발현 핵산을 포함한다. 특정 실시양태에서, 변형된 종양용해 바이러스는 외인성 CCR2-발현 핵산을 포함한다. 특정 실시양태는 CXCR4 및 CCR2 둘 다를 코딩하는 외인성 핵산을 포함하는 변형된 종양용해 바이러스를 개시하고, 두 케모카인은 동일한 바이러스로부터 발현된다. 특정 상황 하에서, 전형적으로 종양 미세환경에서 발현되는 CXCL12 및/또는 CCL2는 CXCR4 및/또는 CCR2-발현 림프구 또는 변형된 종양용해 바이러스에 의해 감염된 다른 이동 세포를 유인하여, 변형된 종양용해 바이러스의 종양-표적화 전달을 증진시킬 수 있다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 변형된 바이러스는 STAT3의 활성을 조정할 수 있고, 그 결과 STAT3에 의해 조절되는 유전자의 활성화를 또한 조정할 수 있는 작용제를 코딩하는 mRNA를 생성할 수 있는 하나 이상의 외인성 핵산 서열 (대안적으로 트랜스진으로 지칭됨)을 포함할 수 있다. 따라서, 본원에 제공된 특정 예는 STAT-3 매개 유전자-활성화를 조정할 수 있는 작용제를 코딩할 수 있는 외인성 핵산 서열을 함유하는 종양용해 백시니아 바이러스를 제공한다. 본원에 사용된 어구 "STAT3-매개 유전자 활성화를 조정한다"는 STAT3 활성이 조정되고, 그 결과 STAT3에 의해 조절되는 1종 이상의 유전자의 활성화가 또한 조정되는 과정을 지칭할 수 있다.
특정 실시양태에서, STAT3-매개 유전자 활성화를 조정할 수 있는 작용제는 단백질 또는 그의 단편일 수 있다. 특정 실시양태에서, 단백질 또는 그의 단편은 STAT3 활성 및 STAT3-매개 유전자 활성화를 억제, 감소 또는 최소화할 수 있다. STAT3 활성 및 STAT3-매개 유전자 활성화를 억제, 감소 및/또는 최소화하는 단백질 또는 그의 단편은, 예를 들어 STAT3 반응성 유전자의 프로모터 영역 내의 DNA 결합 서열에 대한 STAT3의 결합을 차단할 수 있다. 추가의 예에서, STAT3 활성 및 STAT3-매개 유전자 활성화를 억제, 감소 또는 최소화하는 단백질 또는 그의 단편은, 예를 들어 SH2 도메인에서 STAT3 단백질에 직접 결합할 수 있다. 특정 실시양태에서, STAT3 활성을 억제, 감소 및/또는 최소화하는 단백질은 STAT3의 인산화를 차단, 방지, 감소 및/또는 최소화하고/거나 STAT3을 탈인산화시킨다. 특정한 비제한적 실시양태에서, STAT3 활성을 조정하는 단백질은 포스포티로신 포스파타제 (PTP), 활성화된 STAT의 단백질 억제제 (PIAS, 예를 들어 PIAS3) 및 시토카인 신호전달의 억제제 (SOCS) 단백질 (예를 들어, SOC3)을 포함할 수 있다.
암 표적
본 개시내용의 한 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 변형된 종양용해 폭스바이러스의 전달에 의한 과다증식성 질환, 예컨대 암 또는 종양의 치료 방법이 제공된다. 본원에 기재된 바와 같은 변형된 종양용해 폭스바이러스에 의해 치료될 수 있는 암은 흑색종, 간세포성 암종, 유방암, 폐암, 복막암, 전립선암, 방광암, 난소암, 백혈병, 림프종, 신암종, 췌장암, 상피 암종, 위암, 결장 암종, 십이지장암, 췌장 선암종, 중피종, 다형성 교모세포종, 성상세포종, 다발성 골수종, 전립선 암종, 간세포성 암종, 담관암종, 췌장 선암종, 두경부 편평 세포 암종, 결장직장암, 장-유형 위 선암종, 자궁경부 편평-세포 암종, 골육종, 상피 난소 암종, 급성 림프모구성 림프종, 골수증식성 신생물 및 육종을 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.
본 개시내용의 방법에 의해 치료될 수 있는 암 세포는 방광, 혈액, 골, 골수, 뇌, 유방, 결장, 식도, 위장, 치은, 두부, 신장, 간, 폐, 비인두, 경부, 난소, 전립선, 피부, 위, 고환, 혀 또는 자궁으로부터의 세포를 포함할 수 있다. 추가로, 암은 구체적으로 하기의 조직학적 유형의 것일 수 있지만 이에 제한되지는 않는다: 악성 신생물; 암종; 미분화 암종; 거대 및 방추 세포 암종; 소세포 암종; 유두상 암종; 편평 세포 암종; 림프상피 암종; 기저 세포 암종; 모발기질 암종; 이행 세포 암종; 유두상 이행 세포 암종; 선암종; 악성 가스트린종; 담관암종; 간세포성 암종; 복합 간세포성 암종 및 담관암종; 섬유주 선암종; 선양 낭성 암종; 선종성 폴립 내의 선암종; 가족성 결장 폴립증 선암종; 고형 암종; 악성 카르시노이드 종양; 세기관지-폐포 선암종; 유두상 선암종; 혐색소성 암종; 호산성 암종; 호산세포성 선암종; 호염기구 암종; 투명 세포 선암종; 과립 세포 암종; 여포성 선암종; 유두상 및 여포성 선암종; 비-피막성 경화성 암종; 부신 피질 암종; 자궁내막양 암종; 피부 부속기 암종; 아포크린 선암종; 피지 선암종; 귀지 선암종; 점액표피양 암종; 낭선암종; 유두상 낭선암종; 유두상 장액성 낭선암종; 점액성 낭선암종; 점액성 선암종; 인환 세포 암종; 침윤성 관 암종; 수질성 암종; 소엽성 암종; 염증성 암종; 유방의 파제트병; 선방 세포 암종; 선편평상피 암종; 편평세포 화생을 동반한 선암종; 악성 흉선종; 악성 난소 기질 종양; 악성 난포막종; 악성 과립막 세포 종양; 악성 남성모세포종; 세르톨리 세포 암종; 악성 라이디히 세포 종양; 악성 지질 세포 종양; 악성 부신경절종; 악성 유방외 부신경절종; 크롬친화세포종; 사구맥관육종; 악성 흑색종; 무멜라닌 흑색종; 표재 확산성 흑색종; 거대 색소 모반 내의 악성 흑색종; 상피양 세포 흑색종; 악성 청색 모반; 육종; 섬유육종; 악성 섬유성 조직구종; 점액육종; 지방육종; 평활근육종; 횡문근육종; 배아성 횡문근육종; 폐포 횡문근육종; 기질 육종; 악성 혼합 종양; 뮐러 혼합 종양; 신모세포종; 간모세포종; 암육종; 악성 중간엽종; 악성 브레너 종양; 악성 엽상 종양; 활막 육종; 악성 중피종; 미분화배세포종; 배아성 암종; 악성 기형종; 악성 난소 갑상선종; 융모막암종; 악성 중신종; 혈관육종; 악성 혈관내피종; 카포시 육종; 악성 혈관주위세포종; 림프관육종; 골육종; 피질근접 골육종; 연골육종; 악성 연골모세포종; 중간엽 연골육종; 골의 거대 세포 종양; 유잉 육종; 악성 치원성 종양; 사기질모세포 치아육종; 악성 사기질모세포종; 사기질모세포 섬유육종; 악성 송과체종; 척삭종; 악성 신경교종; 상의세포종; 성상세포종; 원형질성 성상세포종; 원섬유성 성상세포종; 성상모세포종; 교모세포종; 핍지교종; 핍지모세포종; 원시 신경외배엽; 소뇌 육종; 신경절신경모세포종; 신경모세포종; 망막모세포종; 후각 신경원성 종양; 악성 수막종; 신경섬유육종; 악성 신경초종; 악성 과립 세포 종양; 악성 림프종; 호지킨병; 호지킨 부육아종; 악성 소림프구성 림프종; 악성 대세포 미만성 림프종; 악성 여포성 림프종; 균상 식육종; 다른 명시된 비-호지킨 림프종; 악성 조직구증; 다발성 골수종; 비만 세포 육종; 면역증식성 소장 질환; 백혈병; 림프성 백혈병; 형질 세포 백혈병; 적백혈병; 림프육종 세포 백혈병; 골수성 백혈병; 호염기구성 백혈병; 호산구성 백혈병; 단핵구성 백혈병; 비만 세포 백혈병; 거핵모구성 백혈병; 골수성 육종; 및 모발상 세포 백혈병. 일부 경우에, 전이성인 고형 암은 본 개시내용의 변형된 종양용해 바이러스, 예컨대 전신 전달에 유리한 변형된 종양용해 폭스바이러스를 사용하여 치료될 수 있다. 일부 경우에, 치료제의 종양내 전달의 목적을 위한 것과 같이 접근불가능하거나 접근하기 어려운 고형 암은 전신 전달에 유리한 본 개시내용의 변형된 종양용해 폭스바이러스를 사용하여 치료될 수 있다. 유리 지방산의 증가된 발현과 연관된 암은, 일부 예에서, 전신 전달에 유리하고 증가된 양의 EEV를 형성하는 본 개시내용의 변형된 종양용해 폭스바이러스를 사용하여 치료될 수 있다.
본 개시내용은 또한 임의의 유형의 원발성 암의 국부 침습 또는 전이 또는 둘 다를 억제 또는 예방하는 방법을 고려한다. 예를 들어, 원발성 암은 흑색종, 비소세포 폐암, 소세포 폐암, 폐암, 간암종, 망막모세포종, 성상세포종, 교모세포종, 치은암, 설암, 백혈병, 신경모세포종, 두부암, 경부암, 유방암, 췌장암, 전립선암, 신장암, 골암, 고환암, 난소암, 중피종, 자궁경부암, 위장암, 림프종, 뇌암, 결장암 또는 방광암일 수 있다. 특정 실시양태에서, 원발성 암은 폐암일 수 있다. 예를 들어, 폐암은 비소세포 폐 암종일 수 있다. 더욱이, 본 개시내용은 암을 예방하거나 또는 전암 또는 전암성 세포, 예컨대 화생, 이형성증 및 증식증을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 이는 또한 바람직하지 않지만 양성인 세포, 예컨대 편평 화생, 이형성증, 양성 전립선 비대증 세포, 과형성 병변 등을 억제하기 위해 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 암 또는 보다 중증인 형태의 암으로의 진행은 본원에서 논의된 바와 같은 변형된 종양용해 폭스바이러스를 수반하는 본 개시내용의 방법에 의해 중지, 파괴 또는 지연될 수 있다.
추가로, 본원에 개시된 바와 같은 변형된 종양용해 폭스바이러스는 종양 미세환경에서 유리 지방산의 높은 생체이용률을 갖는 종양의 치료를 위해 투여될 수 있다. 일부 경우에, 비만 환자에서 종양 내 지방세포에 의해 방출되는 유리 지방산이 종양 내의 변형된 종양용해 폭스바이러스의 복제 및 EEV 형태의 바이러스의 형성에 공급되어 그를 증진시킬 수 있다. 비만이 아닌 환자, 특히 복막암을 갖는 환자에서 이점이 또한 실현될 수 있다. 예를 들어, 여러 복막암이 본 개시내용의 변형된 종양용해 바이러스를 사용하는 요법에 대한 표적일 수 있는데, 이는 이들이 망 벽에서 성장하는 경향이 있고 지방세포에 공급될 수 있으며, 상기 언급된 바와 같이 종양 내 지방세포에 의해 방출된 유리 지방산이 종양 내의 변형된 바이러스에 공급될 수 있고 그의 복제를 증진시킬 수 있기 때문이다. 본원에 개시된 바와 같은 변형된 종양용해 폭스바이러스는 유리 지방산의 높은 생체이용률을 갖는 종양에서 세포외 외피보유 바이러스 (EEV)의 증가된 역가를 형성할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 바와 같은 변형된 폭스바이러스로 감염된 세포를 투여함으로써 종양을 치료하는 방법이 제공된다. 감염된 세포는 대상체에게, 예를 들어 종양내로 투여될 수 있고, 이에 의해 변형된 폭스바이러스는 높은 백분율의 EEV 입자 (예를 들어, 적어도 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 또는 그 초과)를 함유하는 바이러스 입자의 집단을 계내 (예컨대, 종양 또는 종양 미세환경 내) 생산한다. 이어서, EEV 입자를 대상체로부터, 예컨대 대상체로부터 단리된 생물학적 샘플로부터 수거하고, 대상체로의 후속 전신 전달 (예를 들어, 정맥내 전달)에 사용할 수 있다. 일부 경우에, 이는 대상체 내의 변형된 종양용해 바이러스의 전신 파종을 증진시키고 치료 결과를 개선시킬 수 있다.
치료 방법 및 효능 및 약동학 검정
본 개시내용은 일부 실시양태에서 본원에 개시된 바와 같은 변형된 종양용해 폭스바이러스의 투여에 의해 대상체를 치료하는 방법을 제공한다.
치료 유효량의 상기 기재된 바와 같은 변형된 종양용해 폭스바이러스, 또는 그를 함유하는 제약 조성물을 암 세포에 투여하는 것을 포함하는, 암 세포에서 독성 효과를 일으키는 방법이 제공된다. 본 개시내용은 제1 암 세포에 상기 기재된 바와 같은 변형된 종양용해 폭스바이러스를 투여하여 제1 암 세포가 상기 바이러스로 감염되도록 하는 것을 포함하는, 제2 암 세포의 성장 및 증식 중 적어도 하나를 억제하는 방법을 추가로 제공한다. 따라서, 본원에 개시된 방법의 일부 실시양태에서, 치료 유효량의 본원에 기재된 바와 같은 변형된 종양용해 폭스바이러스, 또는 그를 함유하는 제약 조성물을 투여했을 때 모든 암 또는 종양 세포가 감염되지는 않고, 감염되지 않은 세포의 성장이 직접적인 감염 없이 억제될 수 있는 것으로 고려된다.
일부 예에서, 종양용해를 유도하고, 세포를 사멸시키고, 성장을 억제하고, 전이를 억제하고, 종양 크기를 감소시키고, 달리 종양 세포의 악성 표현형을 역전시키거나 감소시키기 위해, 본 개시내용의 방법 및 조성물을 사용하여, 암 세포 또는 종양을 치료 유효 용량의 본원에 기재된 바와 같은 예시적인 변형된 종양용해 폭스바이러스 또는 그를 함유하는 제약 조성물과 접촉시킬 수 있다. 특정 실시양태에서, 유효량의 본 개시내용의 변형된 종양용해 폭스바이러스 또는 그의 제약 조성물은 종양용해, 암 세포의 파괴 또는 용해, 또는 암 세포의 성장 또는 크기의 억제 또는 감소를 유도하는데 충분한 양을 포함할 수 있다. 암 세포의 성장을 감소시키는 것은, 예를 들어, 세포 사멸 또는 더 느린 복제 속도 또는 세포를 포함하는 종양의 성장 속도 감소 또는 암 세포를 함유하는 대상체의 생존 연장에 의해 명시될 수 있다.
일부 실시양태에서, 대상체에게 유효량의 상기 기재된 바와 같은 변형된 바이러스를 투여하는 것을 포함하는, 암 또는 종양이 있는 대상체를 치료하는 방법이 제공된다. 이러한 방법에서 유효량은 암의 성장 속도 또는 암의 확산을 감소시키거나 또는 대상체에서 생존을 연장시키는 양을 포함할 수 있다. 본 개시내용은 유효량의 상기 기재된 바와 같은 변형된 종양용해 폭스바이러스를 종양에 투여하는 것을 포함할 수 있는, 종양의 성장을 감소시키는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 유효량의 변형된 종양용해 폭스바이러스, 또는 그의 제약 조성물은 종양의 성장을 느리게 하거나, 종양의 성장 또는 크기를 억제 또는 감소시키는 것을 유도하는데 충분한 양을 포함할 수 있고, 종양의 근절을 포함할 수 있다. 종양의 성장을 감소시키는 것은, 예를 들어, 성장 속도 감소 또는 종양을 함유하는 대상체의 생존 연장에 의해 명시될 수 있다.
본 개시내용은 또한, (i) 대상체에게 루시페라제 리포터 유전자를 추가로 발현하는 치료 유효량의 본 개시내용에 따른 변형된 종양용해 폭스바이러스 또는 제약 조성물을 단독으로 또는 추가의 요법과 조합하여 투여하는 단계; (ii) 바이러스를 투여한 직후에 대상체로부터 제1 생물학적 샘플을 수집하고, 제1 생물학적 샘플 내의 루시페라제 리포터의 수준을 결정하는 단계, (iii) 단계 (ii)에서의 투여 후에 대상체로부터 제2 생물학적 샘플을 수집하는 단계, (iii) 제2 생물학적 샘플 내의 루시페라제 리포터의 수준을 검출하는 단계를 포함할 수 있는, 본원에 기재된 바와 같은 변형된 종양용해 폭스바이러스의 감염성 또는 항종양 활성, 또는 그의 종양 특이적 바이러스 복제의 양을 결정하는 방법을 제공하며, 여기서 루시페라제의 수준이 단계 (ii)에서보다 단계 (iii)에서 더 높으면 변형된 종양용해 폭스바이러스는 감염성이고, 항종양 활성을 입증하며, 종양 특이적 바이러스 복제를 나타내는 것으로 결정된다. 제2 생물학적 샘플은 단계 (i)에서 투여하고 나서 약 30분, 약 1시간, 약 2시간, 약 3시간, 약 4시간, 약 5시간, 약 6시간, 약 7시간, 약 8시간, 약 9시간, 약 10시간, 약 12시간, 약 15시간, 약 24시간, 약 36시간, 약 48시간, 약 72시간, 약 4일, 약 5일, 약 6일, 약 7일, 약 8일, 약 9일, 약 10일, 약 11일, 약 12일, 약 13일, 약 14일, 약 15일, 약 1개월, 내지 약 2개월 후에 수집된다. 일부 실시양태에서, 상기 언급된 방법은 대상체에게 치료 유효량의 본 개시내용의 변형된 종양용해 폭스바이러스, 예컨대 본원에 기재된 바와 같은 변형된 종양용해 폭스바이러스 또는 그를 포함하는 제약 조성물을 투여한 후에 상기 대상체로부터 수집한 혈장 샘플 내의 1종 이상의 검정 시토카인 수준, 예를 들어, IL-2, IL-7, IL-8, IL-10, IFN-γ, GM-CSF, TNF-α, IL-6, IL-4, IL-5, 및 IL-13의 수준을 단계 (i) 및 (iii)에서 검출하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 본 개시내용의 일부 실시양태에서, 상기 언급된 단계 (ii) 및 (iv) 사이에서의 루시페라제 생물발광의 증가는, 변형된 종양용해 폭스바이러스에서 변형을 포함하지 않으면서 그 외에는 동일한 바이러스에서의 것과 비교하여, 본원에 기재된 바와 같은 변형된 종양용해 폭스바이러스의 경우에 더 높다. 변형된 종양용해 폭스바이러스 투여 후에 바이러스 로드를 검출 및 모니터링하기 위한 다른 예시적인 기술은 실시간 정량적 PCR을 포함한다.
본원에 기재된 바와 같이, 치료 유효량의 본 개시내용에 따른 변형된 종양용해 폭스바이러스 또는 폭스바이러스를 함유하는 제약 조성물의 투여 후에 약동학을 모니터링하는 방법이 추가로 제공된다. 약동학을 모니터링하기 위한 예시적인 방법은 하기 단계를 포함할 수 있다: (i) 대상체에게 치료 유효량의 변형된 종양용해 폭스바이러스 또는 그를 포함하는 제약 조성물을 단독으로 또는 추가의 요법과 조합하여 투여하는 단계; (ii) 단계 (i)에서 투여하고 나서 약 15분, 약 30분, 약 45분, 약 60분, 약 75분, 약 90분, 약 120분, 약 180분, 및 약 240분, 약 5시간, 약 6시간, 약 7시간, 약 8시간, 약 9시간, 약 10시간, 약 12시간, 약 15시간, 약 24시간, 약 36시간, 약 48시간, 약 72시간, 약 4일, 약 5일, 약 6일, 약 7일, 약 8일, 약 9일, 약 10일, 약 11일, 약 12일, 약 13일, 약 14일, 약 15일, 약 1개월, 내지 약 2개월 후로부터 선택된 하나 이상의 시점에 대상체로부터 생물학적 샘플을 수집하는 단계, 및 (iii) 상기 언급된 시점에 수집된 생물학적 샘플 내의 바이러스 게놈 (또는 바이러스 게놈 내에 삽입된 리포터 유전자, 예컨대 루시페라제)의 양을 검출하는 단계. 일부 경우에, 바이러스 게놈 카피/mL가 15분 시점에 수집된 샘플에서 가장 높을 수 있고, 추가로 240분 시점에 수집된 샘플은 검출가능한 양의 바이러스 게놈을 함유하지 않을 수 있다. 따라서, 일부 경우에, 바이러스 피크가 투여하고 나서 약 15분 후에 관찰될 수 있고, 대부분의 바이러스가 약 240분 (또는 4시간) 후에 대상체의 시스템으로부터 소거될 수 있다. 일부 경우에, 제1 바이러스 피크가 투여하고 나서 약 15분 후에 관찰될 수 있고, 제2 바이러스 피크가 후속 시점, 예를 들어, 약 30분, 약 45분, 약 60분, 또는 약 90분에 수집된 생물학적 샘플에서 관찰될 수 있다. 예시적인 실시양태에서, 생물학적 샘플은 혈액일 수 있고, 바이러스 게놈/mL의 양은 정량적 PCR 또는 다른 적절한 기술에 의해 결정될 수 있다. 일부 예에서, 제1 바이러스 피크가 본 개시내용의 변형된 종양용해 바이러스, 예컨대 본원에 기재된 바와 같은 종양용해 폭스바이러스를 투여하고 나서 약 15분 후에 관찰될 수 있고, 제2 바이러스 피크가 그를 투여하고 나서 약 30분, 약 1시간, 약 2시간, 약 3시간, 약 4시간, 약 5시간, 약 6시간, 약 7시간, 약 8시간, 약 9시간, 약 10시간, 약 12시간, 약 15시간, 약 24시간, 약 36시간, 약 48시간, 약 72시간, 약 4일, 약 5일, 약 6일, 약 7일, 약 8일, 약 9일, 약 10일, 약 11일, 약 12일, 약 13일, 약 14일, 약 15일, 약 1개월, 내지 약 2개월 후에 관찰될 수 있다.
일부 경우에, 변형된 종양용해 폭스바이러스의 종양-선택적 복제를 리포터 유전자, 예컨대 루시페라제 유전자를 사용하는 것을 통해 측정할 수 있다. 일부 실시양태에서, 루시페라제 유전자는 바이러스의 게놈 내로 삽입될 수 있고, 종양 세포는 바이러스로 감염될 수 있다. 감염된 종양 세포에서의 생물발광을 측정하여 종양-선택적 복제를 모니터링할 수 있다. 일부 예는, 변형된 종양용해 폭스바이러스에서 변형을 함유하지 않으면서 그 외에는 동일한 종양용해 폭스바이러스에서의 것과 비교하여, 본 개시내용의 변형된 종양용해 바이러스에서의 루시페라제 리포터 생물발광의 증가를 보여준다.
변형된 종양용해 바이러스의 전달
일부 실시양태에서, 대상체에게 투여되는 본 개시내용의 변형된 종양용해 폭스바이러스의 양은 약 103 내지 1012개의 감염성 바이러스 입자 또는 플라크 형성 단위 (PFU), 또는 약 105 내지 1010 PFU, 또는 약 105 내지 108 PFU, 또는 약 108 내지 1010 PFU일 수 있다. 일부 실시양태에서, 대상체에게 투여되는 본 개시내용의 변형된 종양용해 폭스바이러스의 양은 약 103 내지 1012개의 바이러스 입자 또는 플라크 형성 단위 (PFU), 또는 약 105 내지 1010 PFU, 또는 약 105 내지 108 PFU, 또는 약 108 내지 1010 PFU일 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 변형된 종양용해 폭스바이러스는 약 103 PFU/용량 내지 약 104 PFU/용량, 약 104 PFU/용량 내지 약 105 PFU/용량, 약 105 PFU/용량 내지 약 106 PFU/용량, 약 107 PFU/용량 내지 약 108 PFU/용량, 약 109 PFU/용량 내지 약 1010 PFU/용량, 약 1010 PFU/용량 내지 약 1011 PFU/용량, 약 1011 PFU/용량 내지 약 1012 PFU/용량, 약 1012 PFU/용량 내지 약 1013 PFU/용량, 약 1013 PFU/용량 내지 약 1014 PFU/용량, 또는 약 1014 PFU/용량 내지 약 1015 PFU/용량을 포함할 수 있는 용량으로 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 변형된 종양용해 폭스바이러스는 약 2 x 103 PFU/용량, 3 x 103 PFU/용량, 4 x 103 PFU/용량, 5 x 103 PFU/용량, 6 x 103 PFU/용량, 7 x 103 PFU/용량, 8 x 103 PFU/용량, 9 x 103 PFU/용량, 약 104 PFU/용량, 약 2 x 104 PFU/용량, 약 3 x104 PFU/용량, 약 4 x 104 PFU/용량, 약 5 x 104 PFU/용량, 약 6 x 104 PFU/용량, 약 7 x 104 PFU/용량, 약 8 x 104 PFU/용량, 약 9 x 104 PFU/용량, 약 105 PFU/용량, 2 x 105 PFU/용량, 3 x 105 PFU/용량, 4 x 105 PFU/용량, 5 x 105 PFU/용량, 6 x 105 PFU/용량, 7 x 105 PFU/용량, 8 x 105 PFU/용량, 9 x 105 PFU/용량, 약 106 PFU/용량, 약 2 x 106 PFU/용량, 약 3 x 106 PFU/용량, 약 4 x 106 PFU/용량, 약 5 x 106 PFU/용량, 약 6 x 106 PFU/용량, 약 7 x 106 PFU/용량, 약 8 x 106 PFU/용량, 약 9 x 106 PFU/용량, 약 107 PFU/용량, 약 2 x 107 PFU/용량, 약 3 x 107 PFU/용량, 약 4 x 107 PFU/용량, 약 5 x 107 PFU/용량, 약 6 x 107 PFU/용량, 약 7 x 107 PFU/용량, 약 8 x 107 PFU/용량, 약 9 x 107 PFU/용량, 약 108 PFU/용량, 약 2 x 108 PFU/용량, 약 3 x 108 PFU/용량, 약 4 x 108 PFU/용량, 약 5 x 108 PFU/용량, 약 6 x 108 PFU/용량, 약 7 x 108 PFU/용량, 약 8 x 108 PFU/용량, 약 9 x 108 PFU/용량, 약 109 PFU/용량, 약 2 x 109 PFU/용량, 약 3 x 109 PFU/용량, 약 4 x 109 PFU/용량, 약 5 x 109 PFU/용량, 약 6 x 109 PFU/용량, 약 7 x 109 PFU/용량, 약 8 x 109 PFU/용량, 약 9 x 109 PFU/용량, 약 1010 PFU/용량, 약 2 x 1010 PFU/용량, 약 3 x 1010 PFU/용량, 약 4 x 1010 PFU/용량, 약 5 x1010 PFU/용량, 약 6 x 1010 PFU/용량, 약 7 x 1010 PFU/용량, 약 8 x 1010 PFU/용량, 약 9 x 1010 PFU/용량, 약 1010 PFU/용량, 약 2 x 1010 PFU/용량, 약 3 x 1010 PFU/용량, 약 4 x 1010 PFU/용량, 약 5 x 1010 PFU/용량, 약 6 x 1010 PFU/용량, 약 7 x 1010 PFU/용량, 약 8 x 1010 PFU/용량, 약 9 x 1010 PFU/용량, 약 1011 PFU/용량, 약 2 x 1011 PFU/용량, 약 3 x 1011 PFU/용량, 약 4 x 1011 PFU/용량, 약 5 x 1011 PFU/용량, 약 6 x 1011 PFU/용량, 약 7 x 1011 PFU/용량, 약 8 x 1011 PFU/용량, 약 9 x 1011 PFU/용량, 또는 약 1012 PFU/용량, 약 1012 PFU/용량 내지 약 1013 PFU/용량, 약 1013 PFU/용량 내지 약 1014 PFU/용량, 또는 약 1014 PFU/용량 내지 약 1015 PFU/용량을 포함할 수 있는 용량으로 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 변형된 종양용해 폭스바이러스는 5 x 109 PFU/용량을 포함할 수 있는 용량으로 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 변형된 종양용해 폭스바이러스는 최대 5 x 109 PFU/용량을 포함할 수 있는 용량으로 투여될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 변형된 종양용해 폭스바이러스는 약 103개의 바이러스 입자/용량 내지 약 104개의 바이러스 입자/용량, 약 104개의 바이러스 입자/용량 내지 약 105개의 바이러스 입자/용량, 약 105개의 바이러스 입자/용량 내지 약 106개의 바이러스 입자/용량, 약 107개의 바이러스 입자/용량 내지 약 108개의 바이러스 입자/용량, 약 109개의 바이러스 입자/용량 내지 약 1010개의 바이러스 입자/용량, 약 1010개의 바이러스 입자/용량 내지 약 1011개의 바이러스 입자/용량, 약 1011개의 바이러스 입자/용량 내지 약 1012개의 바이러스 입자/용량, 약 1012개의 바이러스 입자/용량 내지 약 1013개의 바이러스 입자/용량, 약 1013개의 바이러스 입자/용량 내지 약 1014개의 바이러스 입자/용량, 또는 약 1014개의 바이러스 입자/용량 내지 약 1015개의 바이러스 입자/용량을 포함할 수 있는 용량으로 투여될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 변형된 종양용해 폭스바이러스는 약 103 PFU/kg 내지 약 104 PFU/kg, 약 104 PFU/kg 내지 약 105 PFU/kg, 약 105 PFU/kg 내지 약 106 PFU/kg, 약 107 PFU/kg 내지 약 108 PFU/kg, 약 109 PFU/kg 내지 약 1010 PFU/kg, 약 1010 PFU/kg 내지 약 1011 PFU/kg, 약 1011 PFU/kg 내지 약 1012 PFU/kg, 약 1012 PFU/kg 내지 약 1013 PFU/kg, 약 1013 PFU/kg 내지 약 1014 PFU/kg, 또는 약 1014 PFU/kg 내지 약 1015 PFU/kg을 포함할 수 있는 용량으로 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 변형된 종양용해 폭스바이러스는 약 2 x 103 PFU/kg, 3 x 103 PFU/kg, 4 x 103 PFU/kg, 5 x 103 PFU/kg, 6 x 103 PFU/kg, 7 x 103 PFU/kg, 8 x 103 PFU/kg, 9 x 103 PFU/kg, 약 104 PFU/kg, 약 2 x 104 PFU/kg, 약 3 x104 PFU/kg, 약 4 x 104 PFU/kg, 약 5 x 104 PFU/kg, 약 6 x 104 PFU/kg, 약 7 x 104 PFU/kg, 약 8 x 104 PFU/kg, 약 9 x 104 PFU/kg, 약 105 PFU/kg, 2 x 105 PFU/kg, 3 x 105 PFU/kg, 4 x 105 PFU/kg, 5 x 105 PFU/kg, 6 x 105 PFU/kg, 7 x 105 PFU/kg, 8 x 105 PFU/kg, 9 x 105 PFU/kg, 약 106 PFU/kg, 약 2 x 106 PFU/kg, 약 3 x 106 PFU/kg, 약 4 x 106 PFU/kg, 약 5 x 106 PFU/kg, 약 6 x 106 PFU/kg, 약 7 x 106 PFU/kg, 약 8 x 106 PFU/kg, 약 9 x 106 PFU/kg, 약 107 PFU/kg, 약 2 x 107 PFU/kg, 약 3 x 107 PFU/kg, 약 4 x 107 PFU/kg, 약 5 x 107 PFU/kg, 약 6 x 107 PFU/kg, 약 7 x 107 PFU/kg, 약 8 x 107 PFU/kg, 약 9 x 107 PFU/kg, 약 108 PFU/kg, 약 2 x 108 PFU/kg, 약 3 x 108 PFU/kg, 약 4 x 108 PFU/kg, 약 5 x 108 PFU/kg, 약 6 x 108 PFU/kg, 약 7 x 108 PFU/kg, 약 8 x 108 PFU/kg, 약 9 x 108 PFU/kg, 약 109 PFU/kg, 약 2 x 109 PFU/kg, 약 3 x 109 PFU/kg, 약 4 x 109 PFU/kg, 약 5 x 109 PFU/kg, 약 6 x 109 PFU/kg, 약 7 x 109 PFU/kg, 약 8 x 109 PFU/kg, 약 9 x 109 PFU/kg, 약 1010 PFU/kg, 약 2 x 1010 PFU/kg, 약 3 x 1010 PFU/kg, 약 4 x 1010 PFU/kg, 약 5 x1010 PFU/kg, 약 6 x 1010 PFU/kg, 약 7 x 1010 PFU/kg, 약 8 x 1010 PFU/kg, 약 9 x 1010 PFU/kg, 약 1010 PFU/kg, 약 2 x 1010 PFU/kg, 약 3 x 1010 PFU/kg, 약 4 x 1010 PFU/kg, 약 5 x 1010 PFU/kg, 약 6 x 1010 PFU/kg, 약 7 x 1010 PFU/kg, 약 8 x 1010 PFU/kg, 약 9 x 1010 PFU/kg, 약 1011 PFU/kg, 약 2 x 1011 PFU/kg, 약 3 x 1011 PFU/kg, 약 4 x 1011 PFU/kg, 약 5 x 1011 PFU/kg, 약 6 x 1011 PFU/kg, 약 7 x 1011 PFU/kg, 약 8 x 1011 PFU/kg, 약 9 x 1011 PFU/kg, 또는 약 1012 PFU/kg, 약 1012 PFU/kg 내지 약 1013 PFU/kg, 약 1013 PFU/kg 내지 약 1014 PFU/kg, 또는 약 1014 PFU/kg 내지 약 1015 PFU/kg을 포함할 수 있는 용량으로 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 변형된 종양용해 폭스바이러스는 5 x 109 PFU/kg을 포함할 수 있는 용량으로 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 변형된 종양용해 폭스바이러스는 최대 5 x 109 PFU/kg을 포함할 수 있는 용량으로 투여될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 변형된 종양용해 폭스바이러스는 약 103개의 바이러스 입자/kg 내지 약 104개의 바이러스 입자/kg, 약 104개의 바이러스 입자/kg 내지 약 105개의 바이러스 입자/kg, 약 105개의 바이러스 입자/kg 내지 약 106개의 바이러스 입자/kg, 약 107개의 바이러스 입자/kg 내지 약 108개의 바이러스 입자/kg, 약 109개의 바이러스 입자/kg 내지 약 1010개의 바이러스 입자/kg, 약 1010개의 바이러스 입자/kg 내지 약 1011개의 바이러스 입자/kg, 약 1011개의 바이러스 입자/kg 내지 약 1012개의 바이러스 입자/kg, 약 1012개의 바이러스 입자/kg 내지 약 1013개의 바이러스 입자/kg, 약 1013개의 바이러스 입자/kg 내지 약 1014개의 바이러스 입자/kg, 또는 약 1014개의 바이러스 입자/kg 내지 약 1015개의 바이러스 입자/kg을 포함할 수 있는 용량으로 투여될 수 있다.
본원에 기재된 바와 같은 변형된 종양용해 폭스바이러스의 액체 투여 형태는, 특정 실시양태에서, 약 103 PFU/mL 내지 약 104 PFU/mL, 약 104 PFU/mL 내지 약 105 PFU/mL, 약 105 PFU/mL 내지 약 106 PFU/mL, 약 107 PFU/mL 내지 약 108 PFU/mL, 약 109 PFU/mL 내지 약 1010 PFU/mL, 약 1010 PFU/mL 내지 약 1011 PFU/mL, 약 1011 PFU/mL 내지 약 1012 PFU/mL, 약 1012 PFU/mL 내지 약 1013 PFU/mL, 약 1013 PFU/mL 내지 약 1014 PFU/mL, 또는 약 1014 PFU/mL 내지 약 1015 PFU/mL의 바이러스 용량을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 변형된 종양용해 폭스바이러스는 약 2 x 103 PFU/mL, 3 x 103 PFU/mL, 4 x 103 PFU/mL, 5 x 103 PFU/mL, 6 x 103 PFU/mL, 7 x 103 PFU/mL, 8 x 103 PFU/mL, 9 x 103 PFU/mL, 약 104 PFU/mL, 약 2 x 104 PFU/mL, 약 3 x104 PFU/mL, 약 4 x 104 PFU/mL, 약 5 x 104 PFU/mL, 약 6 x 104 PFU/mL, 약 7 x 104 PFU/mL, 약 8 x 104 PFU/mL, 약 9 x 104 PFU/mL, 약 105 PFU/mL, 2 x 105 PFU/mL, 3 x 105 PFU/mL, 4 x 105 PFU/mL, 5 x 105 PFU/mL, 6 x 105 PFU/mL, 7 x 105 PFU/mL, 8 x 105 PFU/mL, 9 x 105 PFU/mL, 약 106 PFU/mL, 약 2 x 106 PFU/mL, 약 3 x 106 PFU/mL, 약 4 x 106 PFU/mL, 약 5 x 106 PFU/mL, 약 6 x 106 PFU/mL, 약 7 x 106 PFU/mL, 약 8 x 106 PFU/mL, 약 9 x 106 PFU/mL, 약 107 PFU/mL, 약 2 x 107 PFU/mL, 약 3 x 107 PFU/mL, 약 4 x 107 PFU/mL, 약 5 x 107 PFU/mL, 약 6 x 107 PFU/mL, 약 7 x 107 PFU/mL, 약 8 x 107 PFU/mL, 약 9 x 107 PFU/mL, 약 108 PFU/mL, 약 2 x 108 PFU/mL, 약 3 x 108 PFU/mL, 약 4 x 108 PFU/mL, 약 5 x 108 PFU/mL, 약 6 x 108 PFU/mL, 약 7 x 108 PFU/mL, 약 8 x 108 PFU/mL, 약 9 x 108 PFU/mL, 약 109 PFU/mL, 약 2 x 109 PFU/mL, 약 3 x 109 PFU/mL, 약 4 x 109 PFU/mL, 약 5 x 109 PFU/mL, 약 6 x 109 PFU/mL, 약 7 x 109 PFU/mL, 약 8 x 109 PFU/mL, 약 9 x 109 PFU/mL, 약 1010 PFU/mL, 약 2 x 1010 PFU/mL, 약 3 x 1010 PFU/mL, 약 4 x 1010 PFU/mL, 약 5 x1010 PFU/mL, 약 6 x 1010 PFU/mL, 약 7 x 1010 PFU/mL, 약 8 x 1010 PFU/mL, 약 9 x 1010 PFU/mL, 약 1010 PFU/mL, 약 2 x 1010 PFU/mL, 약 3 x 1010 PFU/mL, 약 4 x 1010 PFU/mL, 약 5 x 1010 PFU/mL, 약 6 x 1010 PFU/mL, 약 7 x 1010 PFU/mL, 약 8 x 1010 PFU/mL, 약 9 x 1010 PFU/mL, 약 1011 PFU/mL, 약 2 x 1011 PFU/mL, 약 3 x 1011 PFU/mL, 약 4 x 1011 PFU/mL, 약 5 x 1011 PFU/mL, 약 6 x 1011 PFU/mL, 약 7 x 1011 PFU/mL, 약 8 x 1011 PFU/mL, 약 9 x 1011 PFU/mL, 또는 약 1012 PFU/mL, 약 1012 PFU/mL 내지 약 1013 PFU/mL, 약 1013 PFU/mL 내지 약 1014 PFU/mL, 또는 약 1014 PFU/mL 내지 약 1015 PFU/mL를 포함할 수 있는 용량으로 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 변형된 종양용해 폭스바이러스는 5 x 109 PFU/mL를 포함할 수 있는 용량으로 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 변형된 종양용해 폭스바이러스는 최대 5 x 109 PFU/mL를 포함할 수 있는 용량으로 투여될 수 있다.
변형된 종양용해 폭스바이러스가 주사에 의해 투여될 수 있는 일부 경우에, 투여량은 약 주사당 103개의 바이러스 입자, 주사당 104개의 바이러스 입자, 주사당 105개의 바이러스 입자, 주사당 106개의 바이러스 입자, 주사당 107개의 바이러스 입자, 주사당 108개의 바이러스 입자, 주사당 109개의 바이러스 입자, 주사당 1010개의 바이러스 입자, 주사당 1011개의 바이러스 입자, 주사당 1012개의 바이러스 입자, 주사당 2 x 1012개의 바이러스 입자, 주사당 1013개의 바이러스 입자, 주사당 1014개의 바이러스 입자, 또는 주사당 1015개의 바이러스 입자를 포함할 수 있다. 변형된 종양용해 폭스바이러스가 주사에 의해 투여되는 추가의 경우에, 투여량은 약 주사당 103개의 감염성 바이러스 입자, 주사당 104개의 감염성 바이러스 입자, 주사당 105개의 감염성 바이러스 입자, 주사당 106개의 감염성 바이러스 입자, 주사당 107개의 감염성 바이러스 입자, 주사당 108개의 감염성 바이러스 입자, 주사당 109개의 감염성 바이러스 입자, 주사당 1010개의 감염성 바이러스 입자, 주사당 1011개의 감염성 바이러스 입자, 주사당 1012개의 감염성 바이러스 입자, 주사당 2 x 1012개의 감염성 바이러스 입자, 주사당 1013개의 감염성 바이러스 입자, 주사당 1014개의 감염성 바이러스 입자, 또는 주사당 1015개의 감염성 바이러스 입자를 포함할 수 있다. 추가의 실시양태에서, 본 개시내용의 변형된 종양용해 폭스바이러스는 약 103 조직 배양 억제 용량 50% (TCID50)/kg, 104 TCID50/kg, 104 TCID50/kg, 104 TCID50/kg, 104 TCID50/kg, 104 TCID50/kg, 104 TCID50/kg, 104 TCID50/kg, 104 TCID50/kg, 104 TCID50/kg, 104 TCID50/kg, 104 TCID50/kg, 104 TCID50/kg, 3x108 TCID50/kg, 4x108 TCID50/kg, 5x108 TCID50/kg, 3x109 TCID50/kg, 4x109 TCID50/kg, 5x109 TCID50/kg, 3x1010 TCID50/kg, 4x1010 TCID50/kg, 또는 4x1010 TCID50/kg일 수 있는 용량으로 투여될 수 있다. 본원에서 10x는 대안적으로 1 eX로 표현됨에 주목한다. 특정 실시양태에서, 변형된 종양용해 폭스바이러스는 1회 이상의 용량으로 투여될 수 있다. 특정 실시양태에서, 바이러스는 종양 내의 세포의 적어도 약 20%, 종양 내의 세포의 적어도 약 30%, 종양 내의 세포의 적어도 약 40%, 종양 내의 세포의 적어도 약 50%, 종양 내의 세포의 적어도 약 60%, 종양 내의 세포의 적어도 약 70%, 종양 내의 세포의 적어도 약 80%, 또는 종양 내의 세포의 적어도 약 90%에서 종양용해를 유도하는데 충분한 양으로 투여될 수 있다. 특정 실시양태에서, 바이러스의 단일 용량은 1, 2, 5, 10, 15, 20 또는 24시간의 기간에 걸쳐 대상체 또는 종양에 투여되는 양을 지칭할 수 있다. 특정 실시양태에서, 용량은 시간에 걸쳐 또는 분리된 주사에 의해 확산될 수 있다. 특정 실시양태에서, 다중 용량 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6회 또는 그 초과의 용량)의 폭스바이러스가 대상체에게 투여될 수 있고, 예를 들어, 제2 치료가 제1 치료로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7일 또는 수주 내에 이루어질 수 있다. 특정 실시양태에서, 다중 용량의 변형된 종양용해 바이러스는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7일 또는 그 초과 또는 수주의 기간에 걸쳐 대상체에게 투여될 수 있다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 종양용해 폭스바이러스 또는 제약 조성물은 약 1주 내지 약 2주, 약 2주 내지 약 3주, 약 3주 내지 약 4주, 약 4주 내지 약 5주, 약 6주 내지 약 7주, 약 7주 내지 약 8주, 약 8주 내지 약 9주, 약 9주 내지 약 10주, 약 10주 내지 약 11주, 약 11주 내지 약 12주, 약 12주 내지 약 24주, 약 24주 내지 약 48주, 약 48주 또는 약 52주, 또는 그 초과의 기간에 걸쳐 투여될 수 있다. 특정 경우에, 본원에 기재된 바와 같은 종양용해 폭스바이러스 또는 제약 조성물의 투여 빈도는 1일 1회, 1일 2회, 매주 1회, 3주마다 1회, 4주마다 1회 (또는 1개월에 1회), 8주마다 1회 (또는 2개월마다 1회), 12주마다 1회 (또는 3개월마다 1회), 또는 24주마다 1회 (또는 6개월마다 1회)일 수 있다. 본원에 개시된 방법의 일부 실시양태에서, 종양용해 폭스바이러스 또는 제약 조성물은, 독립적으로, 제1 기간 동안 초기 용량, 제2 기간 동안 중간 용량, 및 제3 기간 동안 고용량으로 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 초기 용량은 중간 용량보다 더 낮을 수 있고, 중간 용량은 고용량보다 더 낮을 수 있다. 일부 실시양태에서, 제1, 제2 및 제3 기간은 독립적으로 약 1주 내지 약 2주, 약 2주 내지 약 3주, 약 3주 내지 약 4주, 약 4주 내지 약 5주, 약 6주 내지 약 7주, 약 7주 내지 약 8주, 약 8주 내지 약 9주, 약 9주 내지 약 10주, 약 10주 내지 약 11주, 약 11주 내지 약 12주, 약 12주 내지 약 24주, 약 24주 내지 약 48주, 약 48주 또는 약 52주, 또는 그 초과일 수 있다.
일부 예에서, 대상체는 본원에 기재된 치료 방법 중 임의의 것에 따라 본원에 기재된 바와 같은 변형된 종양용해 폭스바이러스 또는 그를 포함하는 제약 조성물을 투여하기 전에, 그의 투여와 공동으로, 및 그의 투여 후에 탄수화물 감소 식이, 예를 들어, 케톤생성 식이 중일 수 있다. 특정 실시양태에서, 대상체는 1일에 500 그램 미만의 탄수화물, 1일에 450 그램 미만의 탄수화물, 1일에 450 그램 미만의 탄수화물, 1일에 400 그램 미만의 탄수화물, 1일에 350 그램 미만의 탄수화물, 1일에 300 그램 미만의 탄수화물, 1일에 250 그램 미만의 탄수화물, 1일에 200 그램 미만의 탄수화물, 1일에 150 그램 미만의 탄수화물, 1일에 100 그램 미만의 탄수화물, 1일에 90 그램 미만의 탄수화물, 1일에 80 그램 미만의 탄수화물, 1일에 70 그램 미만의 탄수화물, 1일에 60 그램 미만의 탄수화물, 1일에 50 그램 미만의 탄수화물, 1일에 40 그램 미만의 탄수화물, 1일에 30 그램 미만의 탄수화물, 1일에 20 그램 미만의 탄수화물, 1일에 10 그램 미만의 탄수화물을 소비하는 것을 포함할 수 있는 식이 중일 수 있다.
본 개시내용의 변형된 종양용해 폭스바이러스 또는 그를 포함하는 제약 조성물을 암 또는 종양 세포에 전달하기 위한 예시적인 방법은 종양내 주사를 통하는 것일 수 있다. 그러나, 대안적인 투여 방법, 예를 들어, 정맥내, 주입을 통하는 것, 비경구, 정맥내, 피내, 근육내, 경피, 직장, 요도내, 질내, 비강내, 척수강내, 또는 복강내 투여를 또한 사용할 수 있다. 투여 경로는 종양의 위치 및 성질에 따라 변할 수 있다. 특정 실시양태에서, 투여 경로는 치아내, 경피, 비경구, 정맥내, 근육내, 비강내, 피하, 국부 (예를 들어, 종양 주변, 특히 종양의 혈관계 또는 인접 혈관계), 경피, 척수강내, 기관내, 복강내, 동맥내, 방광내, 종양내, 흡입, 관류, 세척에 의해 또는 경구일 수 있다. 주사가능한 용량의 변형된 종양용해 폭스바이러스는 볼루스 주사로서 또는 저속 주입으로서 투여될 수 있다. 특정 실시양태에서, 변형된 종양용해 폭스바이러스는 환자 내에 이식된 공급원으로부터 환자에게 투여될 수 있다. 특정 실시양태에서, 변형된 종양용해 폭스바이러스의 투여는 선택된 기간에 걸친 연속 주입에 의해 이루어질 수 있다. 일부 경우에, 본원에 기재된 바와 같은 종양용해 폭스바이러스, 또는 그를 함유하는 제약 조성물은 약 15분, 약 30분, 약 45분, 약 50분, 약 55분, 약 60분, 약 75분, 약 90분, 약 100분, 또는 약 120분 또는 그 초과의 기간에 걸친 주입에 의해 치료 유효 용량으로 투여될 수 있다. 본 개시내용의 변형된 종양용해 폭스바이러스 또는 제약 조성물은 액체 투여량으로서 투여될 수 있고, 여기서 총 투여 부피는 약 1 mL 내지 약 5 mL, 약 5 mL 내지 10 mL, 약 15 mL 내지 약 20 mL, 약 25 mL 내지 약 30 mL, 약 30 mL 내지 약 50 mL, 약 50 mL 내지 약 100 mL, 약 100 mL 내지 150 mL, 약 150 mL 내지 약 200 mL, 약 200 mL 내지 약 250 mL, 약 250 mL 내지 약 300 mL, 약 300 mL 내지 약 350 mL, 약 350 mL 내지 약 400 mL, 약 400 mL 내지 약 450 mL, 약 450 mL 내지 500 mL, 약 500 mL 내지 750 mL, 또는 약 750 mL 내지 1000 mL이다.
제약 조성물
본원에 기재된 바와 같은 변형된 종양용해 폭스바이러스를 함유하는 제약 조성물은 용액, 글리세롤, 액체 폴리에틸렌 글리콜 중의 분산액, 및 오일 중의 그의 임의의 조합물로서, 고체 투여 형태로, 흡입성 투여 형태로서, 비강내 투여 형태로서, 리포솜 제제로서, 나노입자를 포함하는 투여 형태, 마이크로입자를 포함하는 투여 형태, 중합체성 투여 형태, 또는 그의 임의의 조합으로서 제조될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 제약 조성물은 안정화제 및 완충제를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 제약 조성물은 가용화제, 예컨대 멸균수, 트리스-완충제를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 제약 조성물은 부형제를 포함할 수 있다. 부형제는 문헌 [Handbook of Pharmaceutical Excipients, American Pharmaceutical Association (1986)]에 기재된 부형제일 수 있다. 적합한 부형제의 비제한적 예는 완충제, 보존제, 안정화제, 결합제, 압착제, 윤활제, 킬레이트화제, 분산 증진제, 붕해제, 향미제, 감미제, 착색제를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서 부형제는 완충제일 수 있다. 적합한 완충제의 비제한적 예는 시트르산나트륨, 탄산마그네슘, 중탄산마그네슘, 탄산칼슘 및 중탄산칼슘을 포함할 수 있다. 완충제로서, 중탄산나트륨, 중탄산칼륨, 수산화마그네슘, 락트산마그네슘, 글루콘산마그네슘, 수산화알루미늄, 시트르산나트륨, 타르타르산나트륨, 아세트산나트륨, 탄산나트륨, 폴리인산나트륨, 폴리인산칼륨, 피로인산나트륨, 피로인산칼륨, 인산수소이나트륨, 인산수소이칼륨, 인산삼나트륨, 인산삼칼륨, 메타인산칼륨, 산화마그네슘, 수산화마그네슘, 탄산마그네슘, 규산마그네슘, 아세트산칼슘, 글리세로인산칼슘, 염화칼슘, 수산화칼슘 및 다른 칼슘 염, 또는 그의 조합이 제약 제제에 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서 부형제는 보존제를 포함할 수 있다. 적합한 보존제의 비제한적 예는 항산화제, 예컨대 알파-토코페롤 및 아스코르베이트, 및 항미생물제, 예컨대 파라벤, 클로로부탄올, 및 페놀을 포함할 수 있다. 항산화제는 추가로 EDTA, 시트르산, 아스코르브산, 부틸화 히드록시톨루엔 (BHT), 부틸화 히드록시 아니솔 (BHA), 아황산나트륨, p-아미노 벤조산, 글루타티온, 프로필 갈레이트, 시스테인, 메티오닌, 에탄올 및 N-아세틸 시스테인을 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 일부 경우에 보존제는 발리다마이신 A, TL-3, 소듐 오르토 바나데이트, 플루오린화나트륨, N-a-토실-Phe-클로로메틸케톤, N-a-토실-Lys-클로로메틸케톤, 아프로티닌, 페닐메틸술포닐 플루오라이드, 디이소프로필플루오로포스페이트, 키나제 억제제, 포스파타제 억제제, 카스파제 억제제, 그랜자임 억제제, 세포 부착 억제제, 세포 분열 억제제, 세포 주기 억제제, 지질 신호전달 억제제, 프로테아제 억제제, 환원제, 알킬화제, 항미생물제, 옥시다제 억제제 또는 다른 억제제를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서 본원에 기재된 바와 같은 제약 조성물은 부형제로서 결합제를 포함할 수 있다. 적합한 결합제의 비제한적 예는 전분, 예비젤라틴화 전분, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 메틸셀룰로스, 소듐 카르복시메틸셀룰로스, 에틸셀룰로스, 폴리아크릴아미드, 폴리비닐옥소아졸리돈, 폴리비닐알콜, C12-C18 지방산 알콜, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리올, 사카라이드, 올리고사카라이드, 및 그의 조합을 포함할 수 있다. 제약 제제에 사용될 수 있는 결합제는 전분 예컨대 감자 전분, 옥수수 전분, 밀 전분; 당 예컨대 수크로스, 글루코스, 덱스트로스, 락토스, 말토덱스트린; 천연 및 합성 검; 젤라틴; 셀룰로스 유도체 예컨대 미세결정질 셀룰로스, 히드록시프로필 셀룰로스, 히드록시에틸 셀룰로스, 히드록시프로필 메틸 셀룰로스, 카르복시메틸 셀룰로스, 메틸 셀룰로스, 에틸 셀룰로스; 폴리비닐피롤리돈 (포비돈); 폴리에틸렌 글리콜 (PEG); 왁스; 탄산칼슘; 인산칼슘; 알콜 예컨대 소르비톨, 크실리톨, 만니톨 및 물, 또는 그의 조합으로부터 선택될 수 있다.
일부 실시양태에서 본원에 기재된 바와 같은 제약 조성물은 부형제로서 윤활제를 포함할 수 있다. 적합한 윤활제의 비제한적 예는 스테아르산마그네슘, 스테아르산칼슘, 스테아르산아연, 수소화 식물성 오일, 스테로텍스, 폴리옥시에틸렌 모노스테아레이트, 활석, 폴리에틸렌글리콜, 벤조산나트륨, 소듐 라우릴 술페이트, 마그네슘 라우릴 술페이트, 및 경질 미네랄 오일을 포함할 수 있다. 제약 제제에 사용될 수 있는 윤활제는 금속성 스테아레이트 (예컨대 스테아르산마그네슘, 스테아르산칼슘, 스테아르산알루미늄), 지방산 에스테르 (예컨대 소듐 스테아릴 푸마레이트), 지방산 (예컨대 스테아르산), 지방 알콜, 글리세릴 베헤네이트, 미네랄 오일, 파라핀, 수소화 식물성 오일, 류신, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 금속성 라우릴 술페이트 (예컨대 소듐 라우릴 술페이트, 마그네슘 라우릴 술페이트), 염화나트륨, 벤조산나트륨, 아세트산나트륨 및 활석, 또는 그의 조합으로부터 선택될 수 있다.
일부 실시양태에서 제약 제제는 부형제로서 분산 증진제를 포함할 수 있다. 적합한 분산제의 비제한적 예는 전분, 알긴산, 폴리비닐피롤리돈, 구아 검, 카올린, 벤토나이트, 정제된 목재 셀룰로스, 소듐 스타치 글리콜레이트, 동형비결정질(isoamorphous) 실리케이트, 및 높은 HLB 유화제 계면활성제로서 미세결정질 셀룰로스를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 제약 조성물은 부형제로서 붕해제를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 붕해제는 비-발포성 붕해제일 수 있다. 적합한 비-발포성 붕해제의 비제한적 예는 전분 예컨대 옥수수 전분, 감자 전분, 그의 예비젤라틴화 및 변형 전분, 감미제, 점토, 예컨대 벤토나이트, 미세결정질 셀룰로스, 알기네이트, 소듐 스타치 글리콜레이트, 검 예컨대 한천, 구아, 로커스트 빈, 카라야, 펙틴, 및 트라가칸트를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서 붕해제는 발포성 붕해제일 수 있다. 적합한 발포성 붕해제의 비제한적 예는 시트르산과 조합된 중탄산나트륨 및 타르타르산과 조합된 중탄산나트륨을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 부형제는 향미제를 포함할 수 있다. 외부 층 내로 혼입되는 향미제는 합성 향미 오일 및 향미 방향족; 천연 오일; 식물, 잎, 꽃 및 과일로부터의 추출물; 및 그의 조합으로부터 선택될 수 있다. 일부 실시양태에서, 향미제는 시나몬 오일; 윈터그린 오일; 페퍼민트 오일; 클로버 오일; 건초 오일; 아니스 오일; 유칼립투스; 바닐라; 시트러스 오일 예컨대 레몬 오일, 오렌지 오일, 포도 및 자몽 오일; 및 사과, 복숭아, 배, 딸기, 라즈베리, 체리, 자두, 파인애플 및 살구를 포함하는 과일 에센스로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
일부 실시양태에서 부형제는 감미제를 포함할 수 있다. 적합한 감미제의 비제한적 예는 글루코스 (옥수수 시럽), 덱스트로스, 전화당, 프룩토스, 및 그의 혼합물 (담체로서 사용되지 않는 경우); 사카린 및 그의 다양한 염 예컨대 나트륨 염; 디펩티드 감미제 예컨대 아스파르탐; 디히드로칼콘 화합물, 글리시리진; 스테비아 레바우디아나 (스테비오시드); 수크로스의 클로로 유도체 예컨대 수크랄로스; 및 당 알콜 예컨대 소르비톨, 만니톨, 실리톨 등을 포함할 수 있다.
일부 경우에, 본원에 기재된 바와 같은 제약 조성물은 착색제를 포함할 수 있다. 적합한 착색제의 비제한적 예는 식품, 약물 및 화장품 색소 (FD&C), 약물 및 화장품 색소 (D&C), 및 외용 약물 및 화장품 색소 (Ext. D&C)를 포함할 수 있다. 착색제는 염료 또는 그의 상응하는 레이크로서 사용될 수 있다.
일부 경우에, 본원에 기재된 바와 같은 제약 조성물은 킬레이트화제를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 킬레이트화제는 살진균 킬레이트화제일 수 있다. 예는 에틸렌디아민-N,N,N',N'-테트라아세트산 (EDTA); EDTA의 이나트륨, 삼나트륨, 사나트륨, 이칼륨, 삼칼륨, 이리튬 및 이암모늄 염; EDTA의 바륨, 칼슘, 코발트, 구리, 디스프로슘, 유로퓸, 철, 인듐, 란타넘, 마그네슘, 망가니즈, 니켈, 사마륨, 스트론튬 또는 아연 킬레이트; 트랜스-1,2-디아미노시클로헥산-N,N,N',N'-테트라아세트산 1수화물; N,N-비스(2-히드록시에틸)글리신; 1,3-디아미노-2-히드록시프로판-N,N,N',N'-테트라아세트산; 1,3-디아미노프로판-N,N,N',N'-테트라아세트산; 에틸렌디아민-N,N'-디아세트산; 에틸렌디아민-N,N'-디프로피온산 디히드로클로라이드; 에틸렌디아민-N,N'-비스(메틸렌포스폰산) 반수화물; N-(2-히드록시에틸)에틸렌디아민-N,N',N'-트리아세트산; 에틸렌디아민-N,N,N',N'-테트라키스(메틸렌포스폰산); O,O'-비스(2-아미노에틸)에틸렌글리콜-N,N,N',N'-테트라아세트산; N,N-비스(2-히드록시벤질)에틸렌디아민-N,N-디아세트산; 1,6-헥사메틸렌디아민-N,N,N',N'-테트라아세트산; N-(2-히드록시에틸)이미노디아세트산; 이미노디아세트산; 1,2-디아미노프로판-N,N,N',N'-테트라아세트산; 니트릴로트리아세트산; 니트릴로트리프로피온산; 니트릴로트리스(메틸렌인산)의 삼나트륨 염; 7,19,30-트리옥사-1,4,10,13,16,22,27,33-옥타아자비시클로[11,11,11] 펜타트리아콘탄 헥사히드로브로마이드; 또는 트리에틸렌테트라민-N,N,N',N",N'",N'"-헥사아세트산을 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.
또한, 본원에 개시된 1종 이상의 변형된 종양용해 바이러스 및 1종 이상의 다른 항미생물제 또는 항진균제, 예를 들어, 폴리엔 예컨대 암포테리신 B, 암포테리신 B 지질 복합체 (ABCD), 리포솜 암포테리신 B (L-AMB), 및 리포솜 니스타틴, 아졸 및 트리아졸 예컨대 보리코나졸, 플루코나졸, 케토코나졸, 이트라코나졸, 포사코나졸 등; 글루칸 신타제 억제제 예컨대 카스포펀진, 미카펀진 (FK463), 및 V-에키노칸딘 (LY303366); 그리세오풀빈; 알릴아민 예컨대 테르비나핀; 플루시토신 또는 본원에 기재된 것을 포함한 다른 항진균제를 포함하는 조합 제품이 고려된다. 추가로, 펩티드는 국소 항진균제 예컨대 시클로피록스 올라민, 할로프로진, 톨나프테이트, 운데실레네이트, 국소 니스타틴, 아모롤핀, 부테나핀, 나프티핀, 테르비나핀, 및 다른 국소 작용제와 조합될 수 있는 것으로 고려된다. 일부 경우에, 제약 조성물은 추가의 작용제를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 추가의 작용제는 제약 조성물에서 치료 유효량으로 존재할 수 있다.
통상적인 저장 및 사용 조건 하에, 본원에 기재된 바와 같은 제약 조성물은 미생물 성장을 방지하기 위해 보존제를 포함할 수 있다. 특정 예에서, 본원에 기재된 바와 같은 제약 조성물은 보존제를 포함하지 않을 수 있다. 주사가능한 사용에 적합한 제약 형태는 멸균 수용액 또는 분산액 및 멸균 주사가능한 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 분말을 포함할 수 있다. 제약 조성물은 예를 들어 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 및/또는 식물성 오일, 또는 그의 임의의 조합을 함유하는 용매 또는 분산 매질인 담체를 포함할 수 있다. 적절한 유동성은, 예를 들어 레시틴과 같은 코팅의 사용, 분산액의 경우 필요한 입자 크기의 유지 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 미생물 작용의 방지는 다양한 항박테리아제 및 항진균제, 예를 들어 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티메로살 등에 의해 이루어질 수 있다. 다수의 경우에, 등장화제, 예를 들어 당 또는 염화나트륨을 포함하는 것이 바람직할 것이다. 주사가능한 조성물의 지속 흡수는, 흡수를 지연시키는 작용제, 예를 들어 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 조성물에 사용함으로써 이루어질 수 있다.
수용액으로의 비경구 투여를 위해, 예를 들어, 액체 투여 형태가 필요하다면 적합하게 완충될 수 있고, 액체 희석제가 충분한 염수 또는 글루코스로 등장성이게 될 수 있다. 액체 투여 형태는 정맥내, 근육내, 피하, 종양내 및 복강내 투여에 특히 적합하다. 이와 관련하여, 사용될 수 있는 멸균 수성 매질이 본 개시내용을 고려하여 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지될 것이다. 예를 들어, 하나의 투여량이 1mL 내지 20 mL의 등장성 NaCl 용액에 용해될 수 있고, 100 mL 내지 1000 mL의 유체, 예를 들어, 중탄산나트륨 완충 염수에 첨가되거나, 또는 제안된 주입 부위에서 주사될 수 있다.
특정 실시양태에서, 멸균 주사가능한 용액은, 본원에 기재된 바와 같은 변형된 종양용해 폭스바이러스 또는 그를 함유하는 제약 조성물을, 필요하다면 상기 열거된 다양한 다른 성분과 함께, 필요한 양으로 적절한 용매에 혼입시킨 후, 여과 멸균함으로써 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 다양한 멸균된 활성 성분을, 염기성 분산 매질 및 상기 열거된 것으로부터의 필요한 다른 성분을 함유하는 멸균 비히클 내에 혼입시킴으로써 제조된다. 본원에 개시된 조성물은 중성 또는 염 형태로 제제화될 수 있다. 제약상 허용되는 염은 무기 산, 예컨대 염산 또는 인산, 또는 유기 산, 예컨대 아세트산, 옥살산, 타르타르산, 만델산 등을 사용하여 형성된 산 부가염 (단백질의 유리 아미노기를 사용하여 형성됨)을 포함한다. 유리 카르복실기에 의해 형성된 염은 또한, 무기 염기, 예컨대, 예를 들어 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘 또는 제2철 히드록시드, 및 유기 염기, 예컨대 이소프로필아민, 트리메틸아민, 히스티딘, 프로카인 등으로부터 유래될 수 있다. 제제화 시, 제약 조성물은 투여 제제와 상용성인 방식으로, 및 치료상 유효한 양으로 투여될 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용의 제약 조성물은 제약상 허용되는 담체와 조합된 유효량의 본원에 개시된 변형된 종양용해 폭스바이러스를 포함할 수 있다. 본원에 사용된 "제약상 허용되는"은 활성 성분의 생물학적 활성의 유효성을 방해하지 않고/거나 그것이 투여되는 환자에게 독성이지 않은 임의의 담체를 포함한다. 적합한 제약 담체의 비제한적 예는 포스페이트 완충 염수 용액, 물, 에멀젼, 예컨대 오일/물 에멀젼, 다양한 유형의 습윤제 및 멸균 용액을 포함할 수 있다. 제약상 상용성인 담체의 추가의 비제한적 예는 겔, 생체흡수성 매트릭스 물질, 변형된 종양용해 바이러스를 함유하는 이식 요소, 또는 임의의 다른 적합한 비히클, 전달 또는 분배 수단 또는 물질을 포함할 수 있다. 이러한 담체는 통상적인 방법에 의해 제제화될 수 있고, 유효량으로 대상체에게 투여될 수 있다.
생산 방법
본 개시내용의 변형된 종양용해 폭스바이러스는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 방법에 의해 생산될 수 있다. 특정 실시양태에서, 변형된 종양용해 바이러스는 적합한 숙주 세포, 예를 들어, HeLa 세포, 293 세포, 또는 Vero 세포에서 증식되고, 숙주 세포로부터 단리되고, 시간의 경과에 따른 감염성의 상실을 최소화하도록 바이러스의 안정성 및 완전성을 촉진하는 조건에서 저장될 수 있다. 일부 경우에, 높은 백분율의 EEV 입자를 생산하는 변형된 종양용해 바이러스는 종양용해 바이러스의 제조 방법에서 개선된 접종물로서 작용할 수 있다. 특정의 예시적인 방법에서, 변형된 종양용해 폭스바이러스는 세포 스택, 롤러 병, 또는 관류 생물반응기를 사용하여 숙주 세포에서 증식된다. 일부 예에서, 변형된 종양용해 바이러스의 정제를 위한 하류 방법은 여과 (예를 들어, 심층 여과, 접선 흐름 여과, 또는 그의 조합), 초원심분리, 또는 크로마토그래피 포획을 포함할 수 있다. 예를 들어, 동결 또는 건조에 의해, 예컨대 동결건조에 의해 변형된 종양용해 바이러스가 저장될 수 있다. 특정 실시양태에서, 투여 전에, 저장된 변형된 종양용해 폭스바이러스를 투여를 위해 재구성하고 (저장을 위해 건조된 경우), 제약상 허용되는 담체에 희석할 수 있다.
일부 실시양태는 본원에 기재된 바와 같은 변형된 종양용해 폭스바이러스가, 변형된 종양용해 바이러스에서 변형을 포함하지 않으면서 그 외에는 동일한 바이러스와 비교하여, HeLa 세포 및 293 세포에서 보다 높은 역가를 나타낸다는 것을 제공한다. 특정 경우에, HeLa 세포 및 293 세포에서의 보다 높은 역가는 변형된 종양용해 폭스바이러스에서 관찰된다.
조합 요법
특정 실시양태에서, 본 개시내용의 방법은 1종 이상의 추가의 요법이 후속되거나, 이것이 선행되거나 또는 이와 조합하여, 본원에 개시된 바와 같은 변형된 종양용해 폭스바이러스 또는 그를 함유하는 제약 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 추가의 요법의 예는 화학요법, 방사선, 추가의 바이러스에 의한 종양용해 바이러스 요법, 면역조정 단백질에 의한 치료, 항암제, 또는 그의 임의의 조합을 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 추가의 요법은 변형된 폭스바이러스, 예컨대 종양용해 백시니아 바이러스의 투여와 관련하여 공동으로 또는 순차적으로 투여될 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 방법은 1종 이상의 항암제 또는 암 요법이 후속되거나, 이것이 선행되거나 또는 이와 조합하여, 본원에 개시된 바와 같은 변형된 종양용해 바이러스를 투여하는 것을 포함할 수 있다. 항암제는 화학요법제, 방사선요법제, 시토카인, 면역 체크포인트 억제제, 항혈관신생제, 아폽토시스-유도제, 항암 항체 및/또는 항-시클린-의존성 키나제 작용제를 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 특정 실시양태에서, 암 요법은 화학요법, 생물학적 요법, 방사선요법, 면역요법, 호르몬 요법, 항-혈관 요법, 동결요법, 독소 요법 및/또는 수술, 또는 그의 조합을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 방법은 본 개시내용의 변형된 종양용해 바이러스가 후속되거나, 이것이 선행되거나 또는 이와 조합하여, 본원에 개시된 변형된 바이러스를 투여하는 것을 포함할 수 있다. 변형된 종양용해 폭스바이러스, 예컨대 변형된 백시니아 바이러스와 화학요법의 조합은 변형된 종양용해 바이러스에서 변형을 포함하지 않는 변형된 종양용해 바이러스에서는 관찰되지 않는 상승작용적 효과를 달성한다. 상기 조합의 상승작용적 효과는 화학요법, 예컨대 탁솔(Taxol)®의 용량을 낮추기 위해 유리하게 사용될 수 있다. 따라서, 변형된 바이러스를 사용한 본원에 개시된 치료 방법은 화학요법과 연관된 독성, 예를 들어, 화학요법에 반응하지만 치료 용량에서 부작용을 겪는 환자를 감소시킬 수 있다. 특정 경우에, 상승작용적 효과는 화학요법 단독 또는 종양용해 백시니아 바이러스 단독과 비교하여 종양 성장의 감소를 발생시킬 수 있다. 예시적인 종양 성장 감소는 약 2% 내지 약 50%, 예컨대 약 5%, 약 10%, 약 20%, 약 25%, 약 35%, 약 45% 또는 약 50%일 수 있다.
특정 실시양태에서, 변형된 종양용해 폭스바이러스, 예컨대 백시니아 바이러스를 사용하는 치료는 단독으로 또는 1종 이상의 면역조정제와 조합되어 사용될 수 있다. 면역조정제는 종양 또는 암과 연관된 항바이러스 면역을 억제할 수 있는 임의의 화합물, 분자 또는 물질을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 면역조정제는 변형된 바이러스에 대한 선천성 면역 또는 적응 면역을 억제할 수 있다. 면역조정제의 비제한적 예는 항-CD33 항체 또는 그의 가변 영역 (또한 본원에서 그의 항원 결합 단편으로도 지칭됨), 항-CD11b 항체 또는 그의 가변 영역 (또한 본원에서 그의 항원 결합 단편으로도 지칭됨), COX2 억제제, 예를 들어, 셀레콕시브, 시토카인, 예컨대 IL-12, GM-CSF, IL-2, IFN3 및 1FNγ, 및 케모카인, 예컨대 MIP-1, MCP-1 및 IL-8을 포함한다. 특정 실시양태에서, 면역조정제는 항-CTLA4, 항-PD-1, 및 항-PD-L1 및 TLR 효능제 (예를 들어, 폴리 I:C)와 같은, 그러나 이에 제한되지는 않는 면역 체크포인트 억제제를 포함할 수 있다. 일부 예에서, 면역조정제는 면역 체크포인트 억제제, 예컨대 PD-1의 길항제 (예를 들어, PD-1에 결합하는 길항제 항체), PD-L1의 길항제 (예를 들어, PD-L1에 결합하는 길항제 항체), CTLA-4의 길항제 (예를 들어, CTLA-4에 결합하는 길항제 항체), A2AR의 길항제 (예를 들어, A2AR에 결합하는 길항제 항체), B7-H3의 길항제 (예를 들어, B7-H3에 결합하는 길항제 항체), B7-H4의 길항제 (예를 들어, B7-H4에 결합하는 길항제 항체), BTLA의 길항제 (예를 들어, BTLA에 결합하는 길항제 항체), IDO의 길항제 (예를 들어, IDO에 결합하는 길항제 항체), KIR의 길항제 (예를 들어, KIR에 결합하는 길항제 항체), LAG3의 길항제 (예를 들어, LAG3에 결합하는 길항제 항체), TIM-3의 길항제 (예를 들어, TIM3에 결합하는 길항제 항체)를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 추가의 요법은 면역 체크포인트 조절제를 투여하는 것을 포함할 수 있다. 한 예에서, 면역 체크포인트 조절제는 TGN1412일 수 있다. 한 예에서, 면역 체크포인트 조절제는 NKTR-214일 수 있다. 한 예에서, 면역 체크포인트 조절제는 MEDI0562일 수 있다. 한 예에서, 면역 체크포인트 조절제는 MEDI6469일 수 있다. 한 예에서, 면역 체크포인트 조절제는 MEDI6383일 수 있다. 한 예에서, 면역 체크포인트 조절제는 JTX-2011일 수 있다. 한 예에서, 면역 체크포인트 조절제는 키트루다(Keytruda) (펨브롤리주맙)일 수 있다. 한 예에서, 면역 체크포인트 조절제는 옵디보(Opdivo) (니볼루맙)일 수 있다. 한 예에서, 면역 체크포인트 조절제는 예르보이(Yervoy) (이필리무맙)일 수 있다. 한 예에서, 면역 체크포인트 조절제는 트레멜리무맙일 수 있다. 한 예에서, 면역 체크포인트 조절제는 테센트릭(Tecentriq) (아테졸리주맙)일 수 있다. 한 예에서, 면역 체크포인트 조절제는 MGA271일 수 있다. 한 예에서, 면역 체크포인트 조절제는 인독시모드일 수 있다. 한 예에서, 면역 체크포인트 조절제는 에파카도스타트일 수 있다. 한 예에서, 면역 체크포인트 조절제는 리릴루맙일 수 있다. 한 예에서, 면역 체크포인트 조절제는 BMS-986016일 수 있다. 한 예에서, 면역 체크포인트 조절제는 MPDL3280A일 수 있다. 한 예에서, 면역 체크포인트 조절제는 아벨루맙일 수 있다. 한 예에서, 면역 체크포인트 조절제는 두르발루맙일 수 있다. 한 예에서, 면역 체크포인트 조절제는 MEDI4736일 수 있다. 한 예에서, 면역 체크포인트 조절제는 MEDI4737일 수 있다. 한 예에서, 면역 체크포인트 조절제는 TRX518일 수 있다. 한 예에서, 면역 체크포인트 조절제는 MK-4166일 수 있다. 한 예에서, 면역 체크포인트 조절제는 우렐루맙 (BMS-663513)일 수 있다. 한 예에서, 면역 체크포인트 조절제는 PF-05082566 (PF-2566)일 수 있다.
추가의 요법이 방사선인 특정 예에서, 예시적인 선량은 5,000 Rad (50 Gy) 내지 100,000 Rad (1000 Gy), 또는 50,000 Rad (500 Gy), 또는 언급된 범위 내의 다른 적절한 선량일 수 있다. 대안적으로, 방사선 선량은 약 30 내지 60 Gy, 약 40 내지 약 50 Gy, 약 40 내지 48 Gy, 또는 약 44 Gy, 또는 언급된 범위 내의 다른 적절한 선량일 수 있고, 이러한 선량은, 예를 들어, 상기 기재된 바와 같은 선량측정 연구에 의해 결정된다. 본원에 사용된 "Gy"는 100 Rad와 동등한 방사선의 특정 흡수 선량에 대한 단위를 지칭할 수 있다. Gy는 "그레이"의 약어이다.
추가의 요법이 화학요법인 특정 예에서, 예시적인 화학요법제는 비제한적으로 알킬화제 (예를 들어, 질소 머스타드 유도체, 에틸렌이민, 알킬술포네이트, 히드라진 및 트리아진, 니트로스우레아, 및 금속 염), 식물 알칼로이드 (예를 들어, 빈카 알칼로이드, 탁산, 포도필로톡신, 및 캄프토테신 유사체), 항종양 항생제 (예를 들어, 안트라시클린, 크로모마이신 등), 항대사물 (예를 들어, 폴산 길항제, 피리미딘 길항제, 퓨린 길항제, 및 아데노신 데아미나제 억제제), 토포이소머라제 I 억제제, 토포이소머라제 II 억제제 및 기타 항신생물성 화학요법제 (예를 들어, 리보뉴클레오티드 리덕타제 억제제, 부신피질 스테로이드 억제제, 효소, 항미세관제, 및 레티노이드)를 포함할 수 있다. 예시적인 화학요법제는 비제한적으로 아나스트로졸 (아리미덱스(Arimidex)®), 비칼루타미드 (카소덱스(Casodex)®), 블레오마이신 술페이트 (블레녹산(Blenoxane)®), 부술판 (밀레란(Myleran)®), 부술판 주사 (부술펙스(Busulfex)®), 카페시타빈 (젤로다(Xeloda)®), N4-펜톡시카르보닐-5-데옥시-5-플루오로시티딘, 카르보플라틴 (파라플라틴(Paraplatin)®), 카르무스틴 (BiCNU®), 클로람부실 (류케란(Leukeran)®), 시스플라틴 (플라티놀(Platinol)®), 클라드리빈 (류스타틴(Leustatin)®), 시클로포스파미드 (시톡산(Cytoxan)® 또는 네오사르(Neosar)®), 시타라빈, 시토신 아라비노시드 (시토사르-U(Cytosar-U)®), 시타라빈 리포솜 주사 (데포사이트(DepoCyt)®), 다카르바진 (DTIC-돔®), 닥티노마이신 (악티노마이신 D, 코스메간), 다우노루비신 히드로클로라이드 (세루비딘(Cerubidine)®), 다우노루비신 시트레이트 리포솜 주사 (다우녹솜(DaunoXome)®), 덱사메타손, 도세탁셀 (탁소테레(Taxotere)®), 독소루비신 히드로클로라이드 (아드리아마이신(Adriamycin)®, 루벡스(Rubex)®), 에토포시드 (베페시드(Vepesid)®), 플루다라빈 포스페이트 (플루다라(Fludara)®), 5-플루오로우라실 (아드루실(Adrucil)®, 에푸덱스(Efudex)®), 플루타미드 (유렉신(Eulexin)®), 테자시티빈, 겜시타빈 (디플루오로데옥시시티딘), 히드록시우레아 (히드레아(Hydrea)®), 이다루비신 (이다마이신(Idamycin)®), 이포스파미드 (이펙스(IFEX)®), 이리노테칸 (캄프토사르(Camptosar)®), L-아스파라기나제 (엘스파르(ELSPAR)®), 류코보린 칼슘, 멜팔란 (알케란(Alkeran)®), 6-메르캅토퓨린 (퓨린톨(Purinethol)®), 메토트렉세이트 (폴렉스(Folex)®), 미톡산트론 (노반트론(Novantrone)®), 밀로타르그, 파클리탁셀 (탁솔(Taxol)®), 포에닉스 (이트륨(Yttrium)90/MX-DTPA), 펜토스타틴, 폴리페프로산 20 및 카르무스틴 이식물 (글리아델(Gliadel)®), 타목시펜 시트레이트 (놀바덱스(Nolvadex)®), 테니포시드 (부몬(Vumon)®), 6-티오구아닌, 티오테파, 티라파자민 (티라존(Tirazone)®), 주사용 토포테칸 히드로클로라이드 (하이캄틴(Hycamptin)®), 빈블라스틴 (벨반(Velban)®), 빈크리스틴 (온코빈(Oncovin)®), 및 비노렐빈 (나벨빈(Navelbine)®), 이브루티닙, 이델라리십, 및 브렌툭시맙 베도틴을 포함할 수 있다.
예시적인 알킬화제는 비제한적으로 질소 머스타드, 에틸렌이민 유도체, 알킬 술포네이트, 니트로소우레아 및 트리아젠): 우라실 머스타드 (아미노우라실 머스타드(Aminouracil Mustard)®, 클로레타미나실(Chlorethaminacil)®, 데메틸도판(Demethyldopan)®, 데스메틸도판(Desmethyldopan)®, 해만타민(Haemanthamine)®, 노르도판(Nordopan)®, 우라실 질소 머스타드®, 우라실로스트(Uracillost)®, 우라실모스타자(Uracilmostaza)®, 우라무스틴(Uramustin)®, 우라무스틴(Uramustine)®), 클로르메틴 (머스타르겐(Mustargen)®), 시클로포스파미드 (시톡산®, 네오사르®, 클라펜(Clafen)®, 엔독산(Endoxan)®, 프로시톡스(Procytox)®, 레비뮨(Revimmune)™), 이포스파미드 (미톡사나(Mitoxana)®), 멜팔란 (알케란®), 클로람부실 (류케란(Leukeran)®), 피포브로만 (아메델(Amedel)®, 베르사이트(Vercyte)®), 트리에틸렌멜라민 (헤멜(Hemel)®, 헥살렌(Hexalen)®, 헥사스타트(Hexastat)®), 트리에틸렌티오포스포르아민, 테모졸로미드 (테모다르(Temodar)®), 티오테파 (티오플렉스(Thioplex)®), 부술판 (부실벡스(Busilvex)®, 밀레란(Myleran)®), 카르무스틴 (BiCNU®), 로무스틴 (세뉴(CeeNU)®), 스트렙토조신 (자노사르(Zanosar)®), 및 다카르바진 (DTIC-돔®)을 포함할 수 있다. 추가의 예시적인 알킬화제는 비제한적으로 옥살리플라틴 (엘록사틴(Eloxatin)®); 테모졸로미드 (테모다르(Temodar)® 및 테모달(Temodal)®); 닥티노마이신 (또한 악티노마이신-D, 코스메겐(Cosmegen)®으로도 공지됨); 멜팔란 (또한 L-PAM, L-사르코리신, 및 페닐알라닌 머스타드, 알케란®으로도 공지됨); 알트레타민 (또한 헥사메틸멜라민 (HMM), 헥살렌(Hexalen)®으로도 공지됨); 카르무스틴 (BiCNU®); 벤다무스틴 (트레안다(Treanda)®); 부술판 (부술펙스(Busulfex)® 및 밀레란(Myleran)®); 카르보플라틴 (파라플라틴(Paraplatin)®); 로무스틴 (또한 CCNU, 세뉴®로도 공지됨); 시스플라틴 (또한 CDDP, 플라티놀® 및 플라티놀®-AQ로도 공지됨); 클로람부실 (류케란®); 시클로포스파미드 (시톡산® 및 네오사르®); 다카르바진 (또한 DTIC, DIC 및 이미다졸 카르복스아미드, DTIC-돔®으로도 공지됨); 알트레타민 (또한 헥사메틸멜라민 (HMM), 헥살렌(Hexalen)®으로도 공지됨); 이포스파미드 (이펙스®); 프레드누무스틴; 프로카르바진 (마툴란(Matulane)®); 메클로레타민 (또한 질소 머스타드, 무스틴 및 메클로로에타민 히드로클로라이드, 머스타르겐®으로도 공지됨); 스트렙토조신 (자노사르(Zanosar)®); 티오테파 (또한 티오포스포아미드, TESPA 및 TSPA, 티오플렉스(Thioplex)®로도 공지됨); 시클로포스파미드 (엔독산®, 시톡산®, 네오사르®, 프로시톡스®, 레비뮨®); 및 벤다무스틴 HCl (트레안다(Treanda)®)을 포함한다.
예시적인 안트라시클린은 비제한적으로, 예를 들어, 독소루비신 (아드리아마이신® 및 루벡스®); 블레오마이신 (블레녹산®); 다우노루비신 (다우노루비신 히드로클로라이드, 다우노마이신, 및 루비도마이신 히드로클로라이드, 세루비딘®); 다우노루비신 리포솜 (다우노루비신 시트레이트 리포솜, 다우녹솜®); 미톡산트론 (DHAD, 노반트론®); 에피루비신 (엘렌스(Ellence)™); 이다루비신 (이다마이신®, 이다마이신 PFS®); 미토마이신 C (뮤타마이신®); 겔다나마이신; 헤르비마이신; 라비도마이신; 및 데스아세틸라비도마이신을 포함할 수 있다.
예시적인 빈카 알칼로이드는 비노렐빈 타르트레이트 (나벨빈®), 빈크리스틴 (온코빈®), 및 빈데신 (엘디신®)); 빈블라스틴 (또한 빈블라스틴 술페이트, 빈카류코블라스틴 및 VLB, 알카반-AQ(Alkaban-AQ)® 및 벨반®으로 공지됨); 및 비노렐빈 (나벨빈®)을 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.
예시적인 프로테아솜 억제제는 보르테조밉 (벨케이드®); 카르필조밉 (PX-171-007, (S)-4-메틸-N-((S)-1-(((S)-4-메틸-1-((R)-2-메틸옥시란-2-일)-1-옥소펜탄-2-일)아미노)-1-옥소-3-페닐프로판-2-일)-2-((S)-2-(2-모르폴리노아세트아미도)-4-페닐부탄아미도)-펜탄아미드); 마리조밉 (NPI-0052); 익사조밉 시트레이트 (MLN-9708); 델란조밉 (CEP-18770); 및 O-메틸-N-[(2-메틸-5-티아졸릴)카르보닐]-L-세릴-O-메틸-N-[(1S)-2-[(2R)-2-메틸-2-옥시라닐]-2-옥소-1-(페닐메틸)에틸]-L-세린아미드 (ONX-0912)를 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.
본원에 사용된 "와 조합된"은 변형된 폭스바이러스, 예컨대 본원에 기재된 바와 같은 종양용해 백시니아 바이러스 또는 그를 포함하는 제약 조성물, 및 추가의 요법, 예컨대 1종 이상의 작용제를 포함하는 추가의 요법이 치료 요법 또는 계획의 일부로서 대상체에게 투여된다는 것을 의미한다. 특정 실시양태에서, 조합되어 사용되는 것은 변형된 종양용해 바이러스 및 1종 이상의 작용제가 투여 전에 물리적으로 조합되는 것 또는 이들이 동일한 시간 프레임에 걸쳐 투여되는 것을 요구하지 않는다. 예를 들어, 및 비제한적으로, 변형된 종양용해 바이러스 및 1종 이상의 작용제는 치료될 대상체에게 공동으로 투여될 수 있거나, 또는 동시에 또는 순차적으로 임의의 순서로 또는 상이한 시점에 투여될 수 있다.
다양한 실시양태에서, 추가의 요법은 액체 투여 형태, 고체 투여 형태, 좌제, 흡입성 투여 형태, 비강내 투여 형태, 리포솜 제제, 나노입자를 포함하는 투여 형태, 마이크로입자를 포함하는 투여 형태, 중합체 투여 형태, 또는 그의 임의의 조합으로 투여될 수 있다. 특정 실시양태에서, 추가의 요법은 약 1주 내지 약 2주, 약 2주 내지 약 3주, 약 3주 내지 약 4주, 약 4주 내지 약 5주, 약 6주 내지 약 7주, 약 7주 내지 약 8주, 약 8주 내지 약 9주, 약 9주 내지 약 10주, 약 10주 내지 약 11주, 약 11주 내지 약 12주, 약 12주 내지 약 24주, 약 24주 내지 약 48주, 약 48주 또는 약 52주, 또는 그 초과의 기간에 걸쳐 투여된다. 특정 경우에, 추가의 요법의 투여 빈도는 1일 1회, 1일 2회, 매주 1회, 3주마다 1회, 4주마다 1회 (또는 1개월에 1회), 8주마다 1회 (또는 2개월마다 1회), 12주마다 1회 (또는 3개월마다 1회), 또는 24주마다 1회 (또는 6개월마다 1회)일 수 있다. 특정 실시양태에서, 암을 갖는 대상체를 치료하는 방법은, 대상체에게 유효량의 본 개시내용의 변형된 종양용해 폭스바이러스, 예컨대 변형된 종양용해 백시니아 바이러스를 투여하는 것을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 방법은 대상체에게 유효량의 1종 이상의 작용제를 투여하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 및 비제한적으로, 작용제는 상기 기재된 바와 같은 항암제, 면역조정제, 또는 그의 임의의 조합일 수 있다.
키트
실시양태에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 바와 같은 변형된 종양용해 폭스바이러스, 예컨대 변형된 종양용해 백시니아 바이러스를 투여하기 위한 키트를 제공한다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 키트는 상기 기재된 바와 같은 변형된 종양용해 폭스바이러스, 예컨대 변형된 종양용해 백시니아 바이러스, 또는 변형된 종양용해 백시니아 바이러스를 포함하는 제약 조성물을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 키트는 추가로 1종 이상의 성분, 예컨대 사용에 대한 지침서, 장치 및 추가의 시약, 및 상기 개시된 방법을 수행하기 위한 성분, 예컨대 튜브, 용기 및 시린지를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 키트는 추가로, 변형된 바이러스와 조합되어 투여될 수 있는 1종 이상의 작용제, 예를 들어, 항암제, 면역조정제, 또는 그의 임의의 조합 중 적어도 1종을 포함할 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용의 키트는 본원에 개시된 변형된 바이러스를 함유하는 1개 이상의 용기를 포함할 수 있다. 예를 들어, 및 비제한적으로, 본 개시내용의 키트는 본 개시내용의 변형된 종양용해 바이러스를 함유하는 1개 이상의 용기를 포함할 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용의 키트는 사용에 대한 지침서, 변형된 종양용해 바이러스를 대상체에게 투여하기 위한 장치, 또는 추가의 작용제 또는 화합물을 대상체에게 투여하기 위한 장치를 포함할 수 있다. 예를 들어, 및 비제한적으로, 지침서는 변형된 종양용해 바이러스, 및 임의로, 키트 내에 포함된 다른 성분, 및 대상체의 적절한 상태, 적절한 투여량 및 변형된 바이러스를 투여하기 위한 적절한 투여 방법을 결정하는 방법을 포함한 투여 방법의 설명을 포함할 수 있다. 지침서는 또한 치료 지속기간에 걸쳐 대상체를 모니터링하는 것에 대한 안내를 포함할 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용의 키트는 변형된 종양용해 바이러스를 대상체에게 투여하기 위한 장치를 포함할 수 있다. 의약 및 제약 조성물을 투여하기 위해 관련 기술분야에 공지된 다양한 장치 중 임의의 것이 본원에서 제공되는 키트에 포함될 수 있다. 예를 들어, 및 비제한적으로, 이러한 장치는 피하 바늘, 정맥내 바늘, 카테터, 무바늘 주사 장치, 흡입기 및 액체 분배기, 예컨대 점안기를 포함한다. 특정 실시양태에서, 예를 들어, 정맥내 주사, 종양내 주사, 복강내 주사에 의해 전신으로 전달될 변형된 종양용해 바이러스가 피하 바늘 및 시린지가 있는 키트 내에 포함될 수 있다.
<실시예>
하기 실시예는 본 개시내용의 범주를 제한하지 않으면서 기재된 실시양태를 추가로 예시한다.
실시예 1: WO34를 함유하는 변형된 종양용해 백시니아 바이러스의 제조 및 특징화
본 연구는 바이러스로부터의 EEV 입자의 방출을 증가시키는 백시니아 바이러스 (WR 균주)에서의 신규 돌연변이를 확인하고 특징화하였다. EEV 입자는 바이러스의 종양용해 잠재력을 증진시킬 수 있고 (예를 들어, 혈류를 통한 증가된 전달 및 확산을 통해), 백시니아의 다른 치료 용도를 위한 이익을 제공할 수 있다 (예를 들어, 백신으로서).
WR A34R 유전자의 무작위 돌연변이유발을 수행하고, 이에 따라 생성된 백시니아 바이러스 균주 (A34R 유전자에 다양한 돌연변이를 함유함)를 EEV 입자 생산에 대해 스크리닝하여, 높은 수준의 EEV의 생산/방출을 증진시킨 돌연변이를 함유하는 균주를 확인하였다. A34R 내의 추가의 점 돌연변이 (K119E)와 함께 K151E 돌연변이를 함유하는 균주를 확인하였다. A34R 내의 이중 돌연변이 (K119E 및 K151E) (WO34)를 함유하는 균주의 경우에 EEV 입자 생산 수준의 유의한 증가가 있는 것으로 관찰되었다. 수행된 추가의 연구는, WO34 (A34R 이중 돌연변이체 K119E 및 K151E)를 함유하는 종양용해 균주가 마우스 모델에서 암 치료의 맥락으로 평가 시 증진된 치료 효과를 나타내는 것으로 나타났다.
WO34를 확인하기 위한 스크리닝 방법
바이러스 유전자 VACWR157 (본원에서 A34R 단백질을 코딩하는 A34R 유전자로도 지칭됨)의 무작위 돌연변이유발을 PCR을 사용하여 수행하였다. A34R 오픈 리딩 프레임 (ORF)을 뉴클레오티드 유사체 8-옥소-dGTP 및 dPTP의 존재 하에 Taq 폴리머라제를 사용하여 증폭시켰다. VACWR157의 5' 및 3' 영역을 직접 또한 PCR에 의해 증폭시켰다. 후자를 또한 PCR에 의해 GFP 리포터 (5' 말단 상의 GFP)와 어셈블리하였다. 마지막으로, 5'-돌연변이유발된 VACWR157 및 GFP-3' 단편을 모두 PCR 프라이머에 의해 첨가된 단편 사이의 짧은 상보적 영역을 사용하여 PCR로 어셈블리하였다. 단순화된 어셈블리 개략도가 도 1에 도시되어 있다 (프로모터 및 프라이머 오버행은 나타내지 않음).
백시니아 바이러스 DNA의 5' 및 3' 영역에 의해 플랭킹된 돌연변이유발된 VACWR157 및 GFP를 함유하는 완전히 어셈블리된 단편을 정제하고, 143B 인간 골육종 세포를 형질감염시키기 위해 사용하였다. 이어서, 형질감염된 세포를 백시니아 바이러스로 감염시켜 돌연변이유발된 VACWR157 바이러스 라이브러리의 재조합-유도 생성을 허용하였다. EEV 생산-증진된 돌연변이체를 우선적으로 선택하기 위해, 바이러스 풀로 감염된 플라스크로부터의 배지를 비-감염된 플라스크에 첨가하였다. 클론 플라크를 여러 라운드의 연속 감염 후에 단리하고, EEV 생산-증진된 A34R에서의 돌연변이를 생어 서열분석에 의해 특징화하였다.
모든 단리된 클론은 2개의 미스센스 돌연변이: K119E 및 K151E, 및 F129에서의 1개의 침묵 돌연변이 (서열식별번호: 2)를 공유하는 것으로 관찰되었다. 돌연변이체 단백질을 WO34 (서열식별번호: 2)로 지정하고, 1개의 상응하는 클론에 UID WO0064R.002를 부여하였다. 클론의 상기 초기 코호트에서 GFP 리포터는 loxP 부위에 의해 플랭킹되지 않았고, 제거될 수 없었다. WO34를 코딩하는 코돈-스크램블링된 ORF를 합성하고, 이를 사용하여 loxP-플랭킹된 GFP를 함유한 전달 벡터 (pWR157-KE.R)를 클로닝하였다. WO34를 코딩하는 새로운 재조합 바이러스를 형광 플라크로부터 선택한 다음, 이를 사용하여 cre 재조합효소-발현 세포를 감염시켰다. 리포터-결여 클론을 cre 처리 후에 선택하였다.
표 1: A34R 유전자 및 단백질 서열
Figure pct00001
Figure pct00002
WO34를 함유하는 EEV-증진된 백시니아 바이러스에 의해 형성된 바이러스 플라크 코멧 테일
이전에 적정한 EEV-증진된 백시니아 바이러스를 희석하고, 6-웰 플레이트에서 전면생장 BS-C-40 세포 상에 두었다. 플레이트를 인큐베이션하고, 48시간 동안 방해받지 않게 둔 다음, 세포를 크리스탈 바이올렛으로 염색하여 이상 EEV 생산으로 인한 코멧 테일 형성에서의 차이를 관찰하였다. 결과를 도 2에 도시한다. 도 2에서 알 수 있는 바와 같이, WO34 함유 백시니아 바이러스 균주는 WI 균주 (WR 균주에서 A34R 단일 돌연변이) 및 WR 균주 (비-돌연변이된 A34R)과 비교하여 증진된 코멧-테일 형성을 나타냈다. WO34 함유 백시니아 바이러스 균주의 코멧-테일 형성은 가시적으로 증가하였다.
WO34를 함유하는 EEV-증진된 백시니아 바이러스의 중화
백시니아 바이러스의 다양한 균주 (WO34 함유 백시니아 바이러스, WI 균주, IHD-J 균주, 및 WR 균주)를 사용하는 2개의 개별 실험에서, HeLa 세포를 6-웰 플레이트에서 전면생장률로 성장시키고, 1 MOI (감염 다중도)의 백시니아 바이러스 균주로 감염시켰다. 24시간 후, 1 mL의 배양 배지를 제거하고, 800 g에서 원심분리하였다. 이어서, 약 500 μl의 상청액을 제거하고, 바이러스 플라크 검정에 사용하였다. 연속 희석 동안, 샘플을 항-L1 NR-45114 항체 또는 VIG로 처리한 다음, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 희석물을 플라크 검정을 위해 BS-C-40 세포의 전면생장 6 웰 플레이트에 첨가하였다. 1.5시간 후, 배지를 3% CMC를 함유한 CM10으로 대체하였다. 48시간 후, 세포를 크리스탈 바이올렛으로 염색하여 바이러스 플라크를 카운팅함으로써, 도 3a-3b에 도시된 바와 같은 HeLa 세포 상청액 중 바이러스의 역가 및 중화 항체의 차단 능력을 측정하였다 (도 3a는 항-L1 NR-45114 항체로의 처리 후 바이러스 플라크 역가를 도시하고, 도 3b는 항-L1R 항체 및 VIG 항체로의 처리 후 바이러스 플라크 역가를 도시함).
WO34를 함유하는 EEV-증진된 백시니아 바이러스로의 감염 후 세포 생존율
96-웰 플레이트에서, HCT116 또는 MC38 세포주를 시딩하고, 90% 전면생장률까지 성장시켰다. 이어서, 세포를 1 MOI의 다양한 백시니아 바이러스 균주 (WR 균주, IHD-J 균주, WI 균주, WO34 함유 균주)로 감염시켰다. 24시간 간격으로 매일 세포 생존율을 프로메가로부터의 셀타이터 96 수성 비-방사성 세포 증식 키트로 시험하였다. 모든 웰로부터 블랭크 값 평균을 제거하고, 비감염된 대조군의 평균 값을 계산한 다음, 각각의 감염된 웰의 상대 값 (A490/비감염된 웰의 평균)을 계산함으로써 상대 생존율을 계산하였다. 결과를 도 4에 도시한다 (상단 패널-MC38 세포; 하단 패널 HCT116 세포).
암 세포에서 WO34를 함유하는 EEV-증진된 백시니아 바이러스의 바이러스 복제 검정
개별 실험에서, HCT116 또는 MC38 세포를 12-웰 플레이트 상에서 90% 전면생장률로 성장시키고, 1개의 플레이트를 3일 복제 검정의 각각의 날에 사용하였다. 모든 플레이트를 동일한 날에 1 MOI의 다양한 백시니아 바이러스 균주 (WR 균주, IHD-J 균주, WI 균주, WO34 함유 균주)로 감염시켰다. 감염후 24시간마다, 1개의 플레이트를 -80℃ 동결기에서 동결시켰다. 플레이트를 2회 동결 및 해동시켜 세포를 파괴하고, 용해물을 BS-C-40 세포에 대한 바이러스 플라크 검정에 사용하였다. ml당 플라크 형성 단위를 도 5에 도시한다 (상단 패널 HCT116 세포; 하단 패널 MC38 세포).
SEQUENCE LISTING <110> KALIVIR IMMUNOTHERAPEUTICS LLC <120> MODIFIED EXTRACELLULAR ENVELOPED VIRUS <130> 59248-704.601 <140> PCT/US2020/056107 <141> 2020-10-16 <150> 62/916,035 <151> 2019-10-16 <160> 5 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 507 <212> DNA <213> Vaccinia virus <400> 1 atgaaatcgc ttaatagaca aactgtaagt aggtttaaga agttgtcggt gccggccgct 60 ataatgatga tactctcaac cattattagt ggcataggaa catttctgca ttacaaagaa 120 gaactgatgc ctagtgcttg cgccaatgga tggatacaat acgataaaca ttgttattta 180 gatactaaca ttaaaatgtc tacagataat gcggtttatc agtgtcgtaa attacgagcc 240 agattgccta gaccggatac tagacatctg agagtattgt ttagtatttt ttataaagat 300 tattgggtaa gtttaaaaaa gaccaatgat aaatggttag atattaataa tgataaagat 360 atagatatta gtaaattaac aaattttaaa caactaaaca gtacgacgga tgctgaagcg 420 tgttatatat acaagtctgg aaaactggtt aaaacagtat gtaaaagtac tcaatctgta 480 ctatgtgtta aaaaattcta caagtga 507 <210> 2 <211> 507 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 2 atgaaatcgc ttaatagaca aactgtaagt aggtttaaga agttgtcggt gccggccgct 60 ataatgatga tactctcaac cattattagt ggcataggaa catttctgca ttacaaagaa 120 gaactgatgc ctagtgcttg cgccaatgga tggatacaat acgataaaca ttgttattta 180 gatactaaca ttaaaatgtc tacagataat gcggtttatc agtgtcgtaa attacgagcc 240 agattgccta gaccggatac tagacatctg agagtattgt ttagtatttt ttataaagat 300 tattgggtaa gtttaaaaaa gaccaatgat aaatggttag atattaataa tgatgaggat 360 atagatatta gtaaattaac aaatttcaaa caactaaaca gtacgacgga tgctgaagcg 420 tgttatatat acaagtctgg aaaactggtt gaaacagtat gtaaaagtac tcaatctgta 480 ctatgtgtta aaaaattcta caagtga 507 <210> 3 <211> 507 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 3 atgaaatcgc ttaatagaca aactgtaagt aggtttaaga agttgtcggt gccggccgct 60 ataatgatga tactctcaac cattattagt ggcataggaa catttctgca ttacaaagaa 120 gaactgatgc ctagtgcttg cgccaatgga tggatacaat acgataaaca ttgttattta 180 gatactaaca ttaaaatgtc tacagataat gcggtttatc agtgtcgtaa attacgagcc 240 agattgccta gaccggatac tagacatctg agagtattgt ttagtatttt ttataaagat 300 tattgggtaa gtttaaaaaa gaccaatgat aaatggttag atattaataa tgatgaggat 360 atagatatta gtaaattaac aaatttcaaa caactaaaca gtacgacgga tgctgaagcg 420 tgttatatat acaagtctgg aaaactggtt gaaacagtat gtaaaagtac tcaatctgta 480 ctatgtgtta aaaaattcta caagtga 507 <210> 4 <211> 168 <212> PRT <213> Vaccinia virus <400> 4 Met Lys Ser Leu Asn Arg Gln Thr Val Ser Arg Phe Lys Lys Leu Ser 1 5 10 15 Val Pro Ala Ala Ile Met Met Ile Leu Ser Thr Ile Ile Ser Gly Ile 20 25 30 Gly Thr Phe Leu His Tyr Lys Glu Glu Leu Met Pro Ser Ala Cys Ala 35 40 45 Asn Gly Trp Ile Gln Tyr Asp Lys His Cys Tyr Leu Asp Thr Asn Ile 50 55 60 Lys Met Ser Thr Asp Asn Ala Val Tyr Gln Cys Arg Lys Leu Arg Ala 65 70 75 80 Arg Leu Pro Arg Pro Asp Thr Arg His Leu Arg Val Leu Phe Ser Ile 85 90 95 Phe Tyr Lys Asp Tyr Trp Val Ser Leu Lys Lys Thr Asn Asp Lys Trp 100 105 110 Leu Asp Ile Asn Asn Asp Lys Asp Ile Asp Ile Ser Lys Leu Thr Asn 115 120 125 Phe Lys Gln Leu Asn Ser Thr Thr Asp Ala Glu Ala Cys Tyr Ile Tyr 130 135 140 Lys Ser Gly Lys Leu Val Lys Thr Val Cys Lys Ser Thr Gln Ser Val 145 150 155 160 Leu Cys Val Lys Lys Phe Tyr Lys 165 <210> 5 <211> 168 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 5 Met Lys Ser Leu Asn Arg Gln Thr Val Ser Arg Phe Lys Lys Leu Ser 1 5 10 15 Val Pro Ala Ala Ile Met Met Ile Leu Ser Thr Ile Ile Ser Gly Ile 20 25 30 Gly Thr Phe Leu His Tyr Lys Glu Glu Leu Met Pro Ser Ala Cys Ala 35 40 45 Asn Gly Trp Ile Gln Tyr Asp Lys His Cys Tyr Leu Asp Thr Asn Ile 50 55 60 Lys Met Ser Thr Asp Asn Ala Val Tyr Gln Cys Arg Lys Leu Arg Ala 65 70 75 80 Arg Leu Pro Arg Pro Asp Thr Arg His Leu Arg Val Leu Phe Ser Ile 85 90 95 Phe Tyr Lys Asp Tyr Trp Val Ser Leu Lys Lys Thr Asn Asp Lys Trp 100 105 110 Leu Asp Ile Asn Asn Asp Glu Asp Ile Asp Ile Ser Lys Leu Thr Asn 115 120 125 Phe Lys Gln Leu Asn Ser Thr Thr Asp Ala Glu Ala Cys Tyr Ile Tyr 130 135 140 Lys Ser Gly Lys Leu Val Glu Thr Val Cys Lys Ser Thr Gln Ser Val 145 150 155 160 Leu Cys Val Lys Lys Phe Tyr Lys 165

Claims (71)

  1. 적어도 2개의 돌연변이를 포함하는 A34R 단백질 또는 그의 단편을 코딩하는 핵산을 포함하며, 여기서 적어도 2개의 돌연변이는 야생형 백시니아 바이러스 A43R 단백질 (서열식별번호: 4)의 위치 Lys119 및 Lys151에 상응하는 위치에 존재하는 것인 변형된 종양용해 폭스바이러스.
  2. 제1항에 있어서, 위치 Lys119에 상응하는 위치에서의 돌연변이가 Lys119Glu인 변형된 종양용해 폭스바이러스.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 위치 Lys151에 상응하는 위치에서의 돌연변이가 Lys151Glu인 변형된 종양용해 바이러스.
  4. 제1항에 있어서, 야생형 백시니아 바이러스 A43R 단백질 (서열식별번호: 4)의 위치 Lys119 및 Lys151에 상응하는 위치에서의 적어도 2개의 돌연변이가 각각 Lys119Glu 및 Lys151Glu인 변형된 종양용해 바이러스.
  5. 야생형 A34R 단백질 (서열식별번호: 4) 내의 pH 5에서 양으로 하전된 아미노산 잔기에 존재하는 적어도 2개의 비-자연 발생 돌연변이를 포함하는 A34R 단백질 또는 그의 단편을 코딩하는 핵산을 포함하는 변형된 종양용해 폭스바이러스.
  6. 야생형 A34R 단백질 (서열식별번호: 4)의 위치 110에 존재하지 않는 적어도 2개의 비-자연 발생 돌연변이를 포함하는 A34R 단백질 또는 그의 단편을 코딩하는 핵산을 포함하는 변형된 종양용해 폭스바이러스.
  7. 야생형 A34R 단백질 (서열식별번호: 4) 내의 아스파르트산 잔기에 존재하지 않는 적어도 2개의 비-자연 발생 돌연변이를 포함하는 A34R 단백질 또는 그의 단편을 코딩하는 핵산을 포함하는 변형된 종양용해 폭스바이러스.
  8. 야생형 A34R 단백질 (서열식별번호: 4) 내의 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 시스테인, 글루타민, 글루탐산, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 류신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신 또는 발린 잔기에 독립적으로 존재하는 적어도 2개의 비-자연 발생 돌연변이를 포함하는 A34R 단백질 또는 그의 단편을 코딩하는 핵산을 포함하는 변형된 종양용해 폭스바이러스.
  9. 야생형 A34R 단백질 (서열식별번호: 4)의 위치 Lys151 이외의 위치에 존재하는 리신 잔기에서 비-자연 발생 돌연변이를 포함하는 A34R 단백질 또는 그의 단편을 코딩하는 핵산을 포함하는 변형된 종양용해 폭스바이러스.
  10. 야생형 A34R 단백질 (서열식별번호: 4)의 위치 Lys119에서 비-자연 발생 돌연변이를 포함하는 A34R 단백질 또는 그의 단편을 코딩하는 핵산을 포함하는 변형된 종양용해 폭스바이러스.
  11. 야생형 A34R 단백질 (서열식별번호: 4) 내의 pH 5에서 양으로 하전된 아미노산 잔기에 존재하는 적어도 2개의 비-자연 발생 돌연변이를 포함하는 A34R 단백질 또는 그의 단편을 코딩하는 핵산을 포함하며, 적어도 2개의 비-자연 발생 돌연변이를 포함하지 않으면서 그 외에는 동일한 종양용해 바이러스와 비교하여 바이러스 플라크 형성 검정에서 증가된 수의 코멧 테일 유형 플라크를 생성하는 변형된 종양용해 폭스바이러스.
  12. 적어도 2개의 비-자연 발생 돌연변이를 포함하는 A34R 단백질 또는 그의 단편을 코딩하는 핵산을 포함하며, 여기서 비-자연 발생 돌연변이 중 어느 하나가 야생형 A34R 단백질 (서열식별번호: 4) 내의 위치 110에 존재하는 경우, 코딩된 아미노산은 아스파라긴 잔기가 아닌 것인 변형된 종양용해 폭스바이러스.
  13. 종양용해 폭스바이러스의 야생형 균주와 비교하여 중화 항체에 대한 증가된 저항성을 나타내는 변형된 종양용해 폭스바이러스이며, 여기서 증가된 저항성은 항-L1 NR-45114 항체 또는 항-VIG 항체로의 처리 후 바이러스 플라크 검정에서 변형된 종양용해 폭스바이러스 또는 야생형 균주에 의해 생산된 플라크의 수에 의해 측정되고, 변형된 종양용해 폭스바이러스는 적어도 약 55,000 플라크 형성 단위/mL를 생산하는 것인 변형된 종양용해 폭스바이러스.
  14. 중화 항체로의 처리 후 바이러스 플라크 검정에서 적어도 약 55,000 플라크 형성 단위/mL를 생산하는 변형된 종양용해 폭스바이러스.
  15. 제10항에 있어서, 중화 항체가 항-L1 NR-45114 항체 또는 항-VIG 항체인 변형된 종양용해 폭스바이러스.
  16. 제9항 또는 제10항에 있어서, A34R 단백질 또는 그의 단편이 야생형 A34R 단백질 (서열식별번호: 4)의 위치 Lys151에서 돌연변이를 추가로 포함하는 것인 변형된 종양용해 폭스바이러스.
  17. 제1항에 있어서, pH 5에서 양으로 하전된 아미노산 잔기가 리신 잔기인 변형된 종양용해 폭스바이러스.
  18. 제5항 내지 제12항 및 제16항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산이 바이러스 유전자 VACWR157 내의 코딩 서열 또는 그의 단편에 대해 적어도 약 80% 상동성인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 변형된 종양용해 폭스바이러스.
  19. 제5항 내지 제12항 및 제16항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산이 서열식별번호: 3으로 제시된 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 약 80% 상동성인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 변형된 종양용해 폭스바이러스.
  20. 제5항 내지 제8항, 제11항 내지 제12항 및 제17항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 2개의 비-자연 발생 돌연변이 중 적어도 하나가 야생형 A34R 단백질 (서열식별번호: 4)의 위치 Lys119에 존재하는 것인 변형된 종양용해 폭스바이러스.
  21. 제9항 및 제18항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 비-자연 발생 돌연변이가 야생형 A34R 단백질 (서열식별번호: 4)의 위치 Lys119에 존재하는 것인 변형된 종양용해 폭스바이러스.
  22. 제10항 또는 제21항에 있어서, 야생형 A34R 단백질 (서열식별번호: 4)의 위치 Lys119에서의 돌연변이가 Lys119Glu인 변형된 종양용해 폭스바이러스.
  23. 제5항 내지 제8항, 제11항 내지 제12항, 제17항 내지 제19항 및 제20항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 2개의 비-자연 발생 돌연변이 중 적어도 하나가 야생형 A34R 단백질 (서열식별번호: 4)의 위치 Lys151에 존재하는 것인 변형된 종양용해 폭스바이러스.
  24. 제23항에 있어서, 야생형 A34R 단백질 (서열식별번호: 4)의 위치 Lys151에서의 돌연변이가 Lys151Glu인 변형된 종양용해 폭스바이러스.
  25. 돌연변이 Lys119Glu 및 Lys151Glu를 포함하는 A34R 단백질을 발현하는 변형된 종양용해 폭스바이러스.
  26. 제19항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 서열식별번호: 3의 위치 305-307이 뉴클레오티드 GAA 또는 GAG를 포함하는 것인 변형된 종양용해 폭스바이러스.
  27. 제19항 내지 제23항 및 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 서열식별번호: 3의 위치 451-453이 뉴클레오티드 GAA 또는 GAG를 포함하는 것인 변형된 종양용해 폭스바이러스.
  28. 제5항 내지 제8항, 제11항 내지 제12항 및 제17항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 2개의 비-자연 발생 돌연변이를 포함하지 않으면서 그 외에는 동일한 종양용해 바이러스와 비교하여 세포내 성숙 바이러스 형태보다 더 많은 양의 세포외 외피보유 바이러스 형태를 생산하는 변형된 종양용해 폭스바이러스.
  29. 제9항 내지 제10항, 제16항 및 제21항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 비-자연 발생 돌연변이를 포함하지 않으면서 그 외에는 동일한 종양용해 바이러스와 비교하여 세포내 성숙 바이러스 형태보다 더 많은 양의 세포외 외피보유 바이러스 형태를 생산하는 변형된 종양용해 바이러스.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 치료 단백질 또는 진단 단백질 중 적어도 하나를 코딩하는 외인성 핵산을 추가로 포함하는 변형된 종양용해 폭스바이러스.
  31. 제30항에 있어서, 외인성 핵산이 케모카인 수용체, 막 연관 단백질, 히알루로난을 분해할 수 있는 미생물 단백질, 미생물 단백질, SOCS3, PH-20, HMGB1, PIAS3, IL15, IL15-Rα, LIGHT, ITAC, 프랙탈카인, CCL5, N1L, 면역 체크포인트 조정제, 대사 조정 단백질 중 적어도 하나, 또는 그의 임의의 조합을 코딩할 수 있는 것인 변형된 종양용해 폭스바이러스.
  32. 제31항에 있어서, 케모카인 수용체를 코딩하는 외인성 핵산을 포함하며, 여기서 케모카인 수용체는 CXCR4 및 CCR2 중 적어도 하나를 포함하는 것인 변형된 종양용해 폭스바이러스.
  33. 제31항 또는 제32항에 있어서, 막 연관 단백질을 코딩하는 외인성 핵산을 포함하는 변형된 종양용해 폭스바이러스.
  34. 제33항에 있어서, 막 연관 단백질이 막 연관 히알루로니다제를 포함하는 것인 변형된 종양용해 폭스바이러스.
  35. 제34항에 있어서, 막 연관 히알루로니다제가 PH-20을 포함하는 것인 변형된 종양용해 폭스바이러스.
  36. 제35항에 있어서, PH-20이 GPI-앵커링된 것인 변형된 종양용해 폭스바이러스.
  37. 제31항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 히알루로난을 분해할 수 있는 미생물 단백질을 코딩하는 외인성 핵산을 포함하며, 여기서 미생물 단백질은 분비된 히알루로니다제를 포함하는 것인 변형된 종양용해 바이러스.
  38. 제37항에 있어서, 분비된 히알루로니다제가 HysA, lin, sko 및 rv 중 적어도 하나, 또는 그의 임의의 조합을 포함하는 것인 변형된 종양용해 폭스바이러스.
  39. 제31항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 미생물 단백질을 코딩하는 외인성 핵산을 포함하는 변형된 종양용해 폭스바이러스.
  40. 제43항에 있어서, 미생물 단백질이 HysA를 포함하는 것인 변형된 종양용해 폭스바이러스.
  41. 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 바이러스의 게놈에서의 변형을 추가로 포함하며, 여기서 변형은 B5R 유전자의 돌연변이 또는 결실을 포함하는 것인 변형된 종양용해 폭스바이러스.
  42. 제41항에 있어서, 바이러스의 게놈에서의 변형을 포함하며, 여기서 변형은 B5R 유전자의 SCR 영역에서 돌연변이 또는 결실을 포함하고, 상기 SCR 영역은 SCR1, SCR3, SCR4 또는 그의 임의의 조합을 포함하고, SCR 영역은 SCR2를 포함하지 않는 것인 변형된 종양용해 폭스바이러스.
  43. 제1항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 티미딘 키나제 (TK), B8R, B18R, B15R, K7R, C6L, K4L, F8L, F9L, F10L, F17R, E1L, E4L, E6R, E8R, E10R, E11L, O2L, I1L, I2L, I3L, I5L, I7L, I8R, G1L, G3L, G4L, G5.5R, G7L, G9R, L1R, L3L, L4R, L5R, J1R, J4R, J6R, H1L, H2R, H3L, H4L, H5R, H6R, D1R, D2L, D3R, D6R, D7R, D8L, D11L, D12L, D13L, A2.5L, A3L, A4L, A5R, A6L, A7L, A9L, A10L, A13L, A14L, A15L, A16L, A17L, A18R, A21L, A24R, A25L, A26L, A27L, A28L, A29L, A30L, A31R, A34R, A42R, A45R, A46R, A52R, 및 그의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 바이러스 유전자의 돌연변이 또는 결실을 추가로 포함하는 변형된 종양용해 폭스바이러스.
  44. 제43항에 있어서, 바이러스 유전자 A52R의 돌연변이 또는 결실을 포함하는 변형된 종양용해 폭스바이러스.
  45. 제31항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, (i) CXCR4 및 CCR2 중 적어도 하나를 포함하는 케모카인 수용체를 코딩하는 외인성 핵산; (ii) PIAS3을 코딩하는 외인성 핵산; (iii) 티미딘 키나제 유전자의 돌연변이 또는 결실; (iv) A52R 유전자의 돌연변이 또는 결실을 포함하는 변형된 종양용해 폭스바이러스.
  46. 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 전신 전달에 적합한 변형된 종양용해 폭스바이러스.
  47. 제1항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 면역 회피가 가능한 변형된 종양용해 폭스바이러스.
  48. 제46항 또는 제47항에 있어서, 전신 전달이 경구 투여, 비경구 투여, 비강내 투여, 설하 투여, 직장 투여, 경피 투여 또는 그의 임의의 조합을 포함하는 것인 변형된 종양용해 폭스바이러스.
  49. 제48항에 있어서, 비경구 투여가 정맥내 주사를 포함하는 것인 변형된 종양용해 폭스바이러스.
  50. 제1항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 종양내 전달에 적합한 변형된 종양용해 폭스바이러스.
  51. 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 백시니아 바이러스인 변형된 종양용해 폭스바이러스.
  52. (i) 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 변형을 포함하는 종양용해 폭스바이러스 DNA 백본 벡터를 수득하는 단계; (ii) 종양용해 바이러스 DNA 벡터를 추가로 변형시켜 조작된 DNA 벡터를 생산하는 단계; (iii) 조작된 DNA 벡터로 포유동물 세포를 형질감염시키는 단계; (iv) 포유동물 세포를 바이러스 복제에 적합한 조건 하에 배양하는 단계; 및 (v) 바이러스 입자를 수거하는 단계를 포함하는, 종양용해 폭스바이러스를 조작하는 방법.
  53. 제52항에 있어서, 포유동물 세포가 HeLa 세포, 293 세포, A549 세포 또는 Vero 세포를 포함하는 것인 방법.
  54. 제1항 내지 제53항 중 어느 한 항에 따른 종양용해 폭스바이러스, 용기; 및 병리학적 혈관신생과 연관된 장애를 치료하기 위해 대상체에게 상기 종양용해 바이러스를 투여하는 것에 대한 지침서를 포함하는 키트.
  55. 대상체에게 치료 유효량의 제1항 내지 제54항 중 어느 한 항에 따른 종양용해 폭스바이러스를 투여하는 것을 포함하는, 종양을 치료하는 방법.
  56. 대상체에게 야생형 A34 단백질 (서열식별번호: 4)의 위치 119 및 151에 돌연변이를 포함하는 A34R 단백질을 발현하는 변형된 종양용해 폭스바이러스로 감염된 환자-유래 백혈구 세포를 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함하며, 여기서 변형된 종양용해 폭스바이러스는 종양 미세환경에서 바이러스 입자의 집단을 생산하는 것인, 종양을 치료하는 방법.
  57. 제56항에 있어서, 환자-유래 백혈구 세포가 대식세포를 포함하는 것인 방법.
  58. 제56항에 있어서, 환자-유래 백혈구 세포가 종양-표적화 T 세포를 포함하는 것인 방법.
  59. 제56항에 있어서, 바이러스 플라크 검정에서 측정 시 바이러스 입자의 집단의 적어도 약 10% 내지 적어도 약 90%가 EEV 입자인 방법.
  60. 제56항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 종양 미세환경으로부터 EEV 입자를 수거하고, EEV 입자를 대상체에게 정맥내 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  61. 제56항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 종양용해 폭스바이러스가 변형된 종양용해 백시니아 바이러스인 방법.
  62. 숙주 세포의 배양물을 적어도 약 10% 내지 적어도 약 90% EEV 입자를 포함하는 변형된 종양용해 폭스바이러스의 집단으로 감염시키는 것을 포함하며, 여기서 변형된 종양용해 폭스바이러스는 야생형 A34 단백질 (서열식별번호: 4)의 위치 119 및 151에서 돌연변이를 포함하는 A34R 단백질을 발현하는 것인 방법.
  63. 제62항에 있어서, 변형된 종양용해 폭스바이러스가 변형된 종양용해 백시니아 바이러스인 방법.
  64. 환자에게 적어도 2개의 돌연변이를 포함하는 A34R 단백질 또는 그의 단편을 코딩하는 핵산을 포함하는 변형된 종양용해 바이러스를 투여하는 것을 포함하며, 여기서 적어도 2개의 돌연변이는 야생형 백시니아 바이러스 A43R 단백질 (서열식별번호: 4)의 위치 Lys119 및 Lys151에 상응하는 위치에 존재하는 것인, 암을 치료하는 방법.
  65. 제64항에 있어서, 야생형 백시니아 바이러스 A43R 단백질 (서열식별번호: 4)의 위치 Lys119 및 Lys151에 상응하는 적어도 2개의 돌연변이 n 위치가 각각 Lys119Glu 및 Lys151Glu인 방법.
  66. 환자에게 적어도 2개의 돌연변이를 포함하는 A34R 단백질 또는 그의 단편을 코딩하는 핵산을 포함하는 변형된 종양용해 바이러스를 투여하는 것을 포함하며, 여기서 적어도 2개의 돌연변이는 야생형 백시니아 바이러스 A43R 단백질 (서열식별번호: 4)의 위치 Lys119 및 Lys151에 상응하는 위치에 존재하는 것인, 종양을 치료하는 방법.
  67. 제66항에 있어서, 야생형 백시니아 바이러스 A43R 단백질 (서열식별번호: 4)의 위치 Lys119 및 Lys151에 상응하는 적어도 2개의 돌연변이 n 위치가 각각 Lys119Glu 및 Lys151Glu인 방법.
  68. 제64항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 투여가 종양내 주사, 정맥내 주사 또는 그의 조합을 통한 것인 방법.
  69. 제55항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 투여가 종양내 주사, 정맥내 주사 또는 그의 조합을 통한 것인 방법.
  70. 제68항 또는 제69항에 있어서, 추가의 요법을 종양용해 폭스바이러스와 조합하여 투여하는 것을 추가로 포함하며, 여기서 추가의 요법은 화학요법, 방사선 요법, 추가의 바이러스를 사용한 종양용해 바이러스 요법, 면역조정 단백질을 사용한 치료, CAR T 세포 요법, 항암제, 면역조정제 중 적어도 하나, 또는 그의 임의의 조합을 포함하는 것인 방법.
  71. 제70항에 있어서, 추가의 요법이 항-CD33 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 항-CD11b 항체 또는 그의 항원 결합 단편, COX2 억제제, 시토카인, 케모카인, 항-CTLA4 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 항-PD-1 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 항-PD-L1 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 및 TLR 효능제로 이루어진 군으로부터 선택되는 면역조정제를 포함하는 것인 방법.
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