CN103221544A - 编码单克隆抗-ctla-4抗体的溶瘤腺病毒载体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生命科学和医学领域。具体地，本发明涉及癌症疗法。更具体地，本发明涉及溶瘤腺病毒载体以及包含所述载体的细胞和药物组合物。本发明还涉及用于治疗受试者的癌症的所述载体以及用于治疗受试者的癌症的方法。此外，本发明涉及在细胞中产生单克隆抗-CTLA4抗体以及增强受试者的肿瘤特异性免疫应答和细胞凋亡的方法，以及溶瘤腺病毒载体用于在细胞中产生单克隆抗-CTLA4抗体和在受试者中增强肿瘤特异性免疫应答和细胞凋亡的用途。

Description

编码单克隆抗-CTLA-4抗体的溶瘤腺病毒载体
发明领域
本发明涉及生命科学和医学领域。具体地，本发明涉及癌症疗法。更具体地，本发明涉及溶瘤腺病毒载体以及包含所述载体的细胞和药物组合物。本发明还涉及用于治疗受试者的癌症的所述载体以及用于治疗受试者的癌症的方法。此外，本发明涉及在细胞中产生单克隆抗-CTLA4抗体以及增强受试者的肿瘤特异性免疫应答和细胞凋亡的方法，以及溶瘤腺病毒载体用于在细胞中产生单克隆抗-CTLA4抗体和增强受试者的肿瘤特异性免疫应答和细胞凋亡的用途。
发明背景
癌症可利用手术、激素疗法、化学疗法、放射疗法和/或其它疗法来治疗，但在许多情况下，通常特征在于晚期的癌症不能用现有疗法来治愈。因此，需要新型癌细胞靶向方法，例如基因疗法。
在过去20年中，基因转移技术一直处于严密的审查中。癌症基因疗法的目的是，向肿瘤细胞引入治疗性基因。引入靶细胞的此类治疗性基因可以例如修正突变的基因，抑制活性癌基因或对细胞产生额外的性质。适当的外源性治疗基因包括但不限于，免疫治疗性、抗血管生成性、化学保护性(chemoprotective)和“自杀”基因，并且可通过利用修饰的病毒载体或非病毒法(包括电穿孔、基因枪和脂质或聚合物包衣)将其引入细胞。
最佳病毒载体的要求包括，发现特定靶细胞和在靶细胞中表达病毒基因组的高效能力。此外，最佳载体必须在靶组织或细胞中保持活性。在过去10年中，已开发了具有此类性质的病毒载体，例如，逆转录病毒、腺病毒和腺伴随病毒(adeno-associated viral)载体已在生物医学中得到广泛研究。
为了进一步改善对肿瘤的穿透性和抗肿瘤作用的局部放大，已构建了选择性溶瘤剂，例如条件复制腺病毒。溶瘤腺病毒是用于治疗癌症的很有前景的工具，并且在临床试验中已显示良好的安全性和一定的功效。肿瘤细胞因病毒在肿瘤细胞中的复制而被溶瘤腺病毒杀死，复制的晚期导致数以千计的病毒体(virion)释放入周围肿瘤组织，有效地进行肿瘤穿透和血管再感染。由于病毒基因组的工程改变(该改变阻止在非肿瘤细胞中的复制)，因此肿瘤细胞允许病毒复制，然而正常细胞则避免了病毒复制。
可通过在腺病毒E1区域中产生部分缺失或通过使用组织或肿瘤特异性启动子(TSP)来将复制局限于肿瘤组织。此类启动子的插入可增强载体在靶细胞中的作用，并且外源组织或肿瘤特异性启动子的使用在重组腺病毒载体中是非常常见的。
大多数临床试验一直以来利用基于腺病毒5(Ad5)的早期腺病毒来进行。溶瘤腺病毒的抗肿瘤作用依赖于它们的基因递送能力。不幸的是，大多数肿瘤低表达主要的Ad5受体，因此已向Ad5衣壳(capsid)中引入修饰。例如，使用血清型3型的结(knob)的衣壳修饰已在卵巢癌中显示提高的感染性和良好效力(Kanerva A,等人,Clin CancerRes2002;8:275-80;Kanerva A,等人,Mol Ther2002;5:695-704;Kanerva A,等人,Mol Ther2003;8:449-58)。此外，由于Ad载体的纤突(fiber)和五邻体(penton)底座是细胞进入机制的至关重要的介体，因此可通过此类衣壳蛋白的遗传修饰来实现重组Ad载体的靶向(Dmitriev I.,等人1998,Journal of Virology,72,9706-9713)。目前，在临床中使用的大部分溶瘤病毒由于关键病毒基因的若干缺失而在复制方面被高度减弱。此类病毒已显示优良的安全记录，但抗肿瘤功效仍然是有限的。
临床和临床前结果显示，利用未被武装的(unarmed)溶瘤病毒的治疗的免疫刺激不足以导致持续的抗肿瘤治疗性免疫应答。在这一点上，溶瘤病毒已被武装(be armed)以更具免疫刺激性。此外，肿瘤内的病毒复制和免疫刺激蛋白的表达通过诱导细胞因子的产生和肿瘤抗原的释放而增强免疫系统(Ries SJ,等人,Nat Med2000;6:1128-33)。
武装溶瘤病毒组合了常规基因递送的有利方面与能复制的试剂的效力。武装病毒的一个目的是，诱导针对允许病毒复制的细胞的免疫应答。如上文中所提及的，单独的病毒复制，尽管具有免疫原性，但通常不足以诱导有效的抗肿瘤免疫。为了增强治疗性免疫的诱导，已用刺激蛋白例如细胞因子武装病毒，以促进肿瘤抗原至抗原呈递细胞例如树突细胞的引入以及它们的刺激和/或成熟。免疫治疗性基因至肿瘤细胞的引入以及此外其蛋白质的翻译，导致免疫应答的激活和更高效的肿瘤细胞破坏。在这一点上，最相关的免疫细胞是天然杀伤细胞(NK)和细胞毒性CD8+T细胞。
已认识到癌症免疫疗法中的关键启示是，由于肿瘤免疫逃逸机制，抗-肿瘤免疫应答的诱导不足以根除疾病。相反地，由于晚期肿瘤的免疫抑制性质，抑制性T细胞的下调也是需要的(Dranoff G.,Nat RevCancer2004;4:11-22;de Visser KE等人,Nat Rev Cancer2006;6:24-37)。此类关键调控途径之一涉及细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4,CD152)，其针对B7/CD28介导的刺激起作用。拮抗CTLA-4的抗体的临床前抗肿瘤效力先前已显示于几个肿瘤模型中(Leach DR等人,Science1996;271:1734-6;Kwon ED等人,Proc Natl Acad SciUSA1999;96:15074-9)。
目前，两个抗CTLA-4的完全人单克隆抗体(mAb)正处于临床开发中：IgG1伊匹木单抗(以前称为MDX-010)和IgG2曲美木单抗(先前称为CP-675,206)。几个已公布的研究证明了，伊匹木单抗和曲美木单抗在患有黑色素瘤和其它癌症的患者中的生物学活性和临床活性(Kirkwood JM等人,Clin Cancer Res2010;16:1042-8;Hodi FS等人,N Engl J Med.2010;363;8:711-23;Ribas A等人,Oncologist2007;12:873-83)。尽管已在许多试验中看到了抗-肿瘤活性，但也已报导了严重的、甚至致命的副作用。副作用与因全身性施用而导致的正常组织暴露相关，而效力通过肿瘤处免疫抑制的减小来测定。因此局部产生CTLA-4mAb的可能性是迫切需要的。
CTLA-4是激活诱导的Ig超家族的I型跨膜蛋白，其由T淋巴细胞表达为共价同二聚体，用作共刺激分子B7.1(CD80)和B7.2(CD86)的抑制性受体(Ribas A等人,Oncologist2007;12:873-83)。mAb对CTLA-4的阻断导致淋巴细胞产生增加的白细胞介素-2(IL-2)和干扰素-γ(IFN-γ)；和增加的主要组织相容性复合物(MHC)I类分子的表达(Lee KM等人,Science1998;282:2263-6;Paradis TJ等人,Cancer Immunol Immunother2001;50:125-33)。
肿瘤用于逃避抗-肿瘤免疫的主要机制之一是，通过调节性T细胞(T-Reg)。在几个迄今被用于下调T-Reg的方法中，抗-CTLA4mAb是唯一一个其安全性和效力已在大型随机化研究中得到证明的方法(Hodi FS等人,N Engl J Med.2010;363;8:711-23)。虽然该试验代表了肿瘤免疫疗法的突破，但在此之前报道了利用另一种抗-CTLA4mAb的阴性3期研究(Ribas A等人J Clin Oncol ASCO suppl.2008;287)。此外，在所有抗-CTLA4mAb试验中，严重的免疫相关不利事件(irAE)已造成死亡，这导致了对所述方法的安全性的忧虑。因此，需要其它方法(例如基因疗法平台的应用)，因为其可增加局部浓度以获得增强的效力，同时减小与全身性暴露相关的副作用。
已报导，局限于肿瘤的抗-CTLA4scFv的表达与全身性T-Reg耗尽法的组合具有协同作用(Tuve S,等人Cancer Res2007;67:5929-39)。此外，当抗-CTLA-4scFv抗体被肿瘤持续表达以及腹膜内(i.p.)施用抗-CD25抗体时，作者在鼠模型中未观察到自身免疫反应(Tuve S,等人Cancer Res2007;67:5929-39)。相反地，当将抗-CTLA4mAb与T-Reg耗尽一起全身性施用时，观察到自身免疫反应(SutmullerRP等人,J Exp Med2001;194:823-32;Takahashi T等人J Exp Med2000;192:303-10)。协同作用的一个可能原因是，T-Reg的耗尽减少了调节性细胞的数目，同时抗-CTLA-4减少了抑制细胞的活性。此外，抗-CTLA4还可减小对抗原呈递细胞的抑制。
腺病毒是中等大小的(90-100nm)无包膜二十面体病毒，其在蛋白质衣壳中具有约36000个碱基对的双链线性DNA。病毒衣壳具有纤突结构，其参与病毒至靶细胞的附着。首先，纤突蛋白质的结(knob)结构域结合靶细胞的受体(例如，柯萨奇病毒腺病毒受体，CAR)，第二，病毒与整联蛋白分子相互作用，第三，病毒被内吞入靶细胞。接着，病毒基因组被从内体(endosome)转移进入细胞核，且靶细胞的复制机制也被用于病毒目的(Russell W.C.,J General Virol2000;81:2573-2604)。
腺病毒基因组具有按相继顺序转录的早期(E1-E4)、中期(IX和IVa2)和晚期基因(L1-L5)。早期基因产物影响宿主细胞的防御机制、细胞周期和细胞代谢。中期和晚期基因编码用于产生新病毒体的结构病毒蛋白质(Wu和Nemerow,Trends Microbiol2004;12:162-168;Russell W.C.,J General Virol2000;81;2573-2604;Volpers C.和Kochanek S.J Gene Med2004;6,suppl1:S164-71;KootstraN.A.和Verma I.M.Annu Rev PharmacolToxicol2003;43:413-439)。
已在人中发现超过50种不同血清型的腺病毒。血清型被分类成6个亚组A-F，并且已知不同的血清型与不同的病况(即，呼吸性疾病、结膜炎和胃肠炎)相关。已知腺病毒血清型5型(Ad5)引起呼吸疾病，其是基因治疗领域中最常研究的血清型。在第一种Ad5载体中，E1和/或E3区域被缺失，从而使得能够将外源DNA插入载体(Danthinne X,Imperiale MJ.,Gene Therapy.2000;7:1707-1714)。此外，其它区域的缺失以及另外的突变已给病毒载体提供了额外的性质。事实上，已提出腺病毒的各种修饰来实现有效抗肿瘤作用。
基因疗法的更高效和精确的基因转移以及增加的特异性和充足的肿瘤杀伤能力仍然是有必要的。治疗性载体的安全记录必须也是优异的。本发明通过利用腺病毒的溶瘤和免疫治疗性性质，以创新方式提供了具有上述性质的癌症治疗工具。
发明概述
本发明的目的是，提供用于实现腺病毒的上述性质的新型方法和工具，从而解决常规癌症疗法的问题。更具体地，本发明提供了用于基因疗法的新型方法和工具。
本申请描述了重组病毒载体的构建、与载体相关的方法以及其在肿瘤细胞系、动物模型以及癌症患者和正常供体的血细胞中的用途。
本发明涉及溶瘤腺病毒载体，所述载体包含：
1)腺病毒血清型5型(Ad5)核酸主链，其包含衣壳修饰，优选具有腺病毒血清型3型(Ad3)的结的衣壳修饰(Ad5/3衣壳嵌合体)，
2)在E1的Rb结合恒定区2中的24bp缺失(D24)；和
3)替代E3区域中的缺失的腺病毒基因gp19k/6.7K的编码特异于CTLA-4的完全人单克隆抗体的核酸序列。
本发明还涉及包含本发明的腺病毒载体的细胞。
本发明还涉及包含本发明的腺病毒载体的药物组合物。
本发明还涉及用于治疗受试者的癌症的本发明的腺病毒载体。
本发明还涉及治疗受试者的癌症的方法，其中所述方法包括给患有癌症(特别地常规化学疗法和/或放射疗法难以治疗的癌症)的受试者施用本发明的载体或药物组合物。
此外，本发明涉及在细胞中产生特异于CTLA-4的完全人单克隆抗体的方法，其中所述方法包括：
将包含本发明的溶瘤腺病毒载体的媒介物运送至细胞，和
在细胞中表达载体的特异于CTLA-4的完全人单克隆抗体。
此外，本发明涉及增强受试者的肿瘤特异性免疫应答的方法，其中所述方法包括：
将包含本发明的溶瘤腺病毒载体的媒介物运送至靶细胞或组织,
在细胞中表达载体的特异于CTLA-4的完全人单克隆抗体(抗-CTLA4mAb),
通过病毒基因组的肿瘤特异性复制而增加抗-CTLA4mAb在肿瘤(但非正常组织)中产生的量。
本发明还涉及本发明的溶瘤腺病毒载体用于在细胞中产生特异于CTLA-4的完全人单克隆抗体的用途。
本发明还涉及用于在细胞中产生特异于CTLA-4的完全人单克隆抗体的本发明的溶瘤腺病毒载体。
本发明还涉及本发明的溶瘤腺病毒载体用于增强受试者的肿瘤特异性免疫应答的用途。
本发明还涉及用于增强受试者的特异性免疫应答的本发明的溶瘤腺病毒载体。
本发明提供了用于治疗癌症(其为现有治疗方法难以治疗或不能治愈的癌症)的工具。此外，相较于许多其它治疗，对于适合于本发明的治疗的肿瘤类型的限制也很少。事实上，可利用提出的发明治疗所有实体瘤。与先前的技术相比较，本发明可帮助破坏更大的肿瘤(按质量计)和更复杂的肿瘤。可通过瘤内、腔内、静脉内途径以及与此类途径的组合提供治疗。本发明方法可提供全身性效力，尽管进行局部注射。本发明方法还可根除被提及为肿瘤起始(“癌症干细胞(cancerstem cell)”)的细胞(Eriksson M等人Mol Ther2007;15(12):2088-93)。
除了使得能够将载体转运至目的位置外，本发明的载体还确保了转基因的表达和保持。本发明解决了与常规疗法的治疗抗性相关的问题。此外，本发明提供了用于选择性治疗的、对健康组织具有较低的毒性或损害的工具和方法。本发明的有利方面还包括，相较于其它疗法，不同的和减小的副作用。重要地，本发明方法与许多其它形式的疗法(包括化学疗法、小分子抑制剂和放射疗法)具有协同作用，从而可以以组合方案使用。
未武装的腺病毒的针对允许复制的细胞的免疫反应的诱导通常未能强至足以导致治疗性肿瘤免疫的发生。为了克服该弱点，本发明提供了具有特异于CTLA-4的完全人单克隆抗体的武装的腺病毒，所述病毒通过活化T细胞毒性细胞和抗原呈递细胞，以及通过下调调节性T细胞和其它抑制性细胞而增强抗肿瘤免疫。抗-CTLA-4mAb还可直接诱导通常表达CTLA-4的肿瘤细胞的细胞凋亡。通过本发明的腺病毒，实现了几种由CTLA-4阻断性抗体(如上文中描述的)介导的抗肿瘤机制：
(A):抗-CTLA-4mAb可阻断衍生自活化的T细胞表面上的CTLA-4分子的免疫抑制信号转导(Chambers CA等人,Annu Rev Immunol2001;19:565-94)。
(B):重要的抑制性T细胞亚组(调节性T细胞，T-Reg)组成型表达CTLA-4并且可结合树突细胞上的B7分子，所述树突细胞为至关重要的抗原呈递细胞(Paust S等人,Proc Natl Acad Sci USA2004;101:10398-403)。吲哚胺2,3-双加氧酶和其它抑制回路的随后上调导致T细胞在微环境中的耐受，而非细胞毒性作用(Munn DH等人,J ClinInvest2004;114:280-90.
(C):表达CTLA-4的T细胞(包括T-Reg)也可直接结合活化的T细胞，因为B7共刺激分子在活化的人T细胞表面上表达。CTLA-4阻断性mAb干扰该抑制性信号转导，导致肿瘤抗原特异性T细胞的局部扩增(Paust S等人,Proc Natl Acad Sci USA2004;101:10398-403)。
(D):CTLA-4在许多肿瘤细胞表面上表达(Contardi E等人,Int JCancer2005;117:538-50)，这推定地反映对细胞毒性T细胞和DC的B7的直接免疫抑制作用。有趣地，CTLA-4阻断性mAb可通过触发细胞凋亡而诱导对肿瘤细胞的直接杀伤(Ribas A等人,Oncologist2007;12:873-83;Contardi E等人,Int J Cancer2005;117:538-50)，并且在体内这可通过抗体依赖性细胞毒作用得到进一步增强(Jinushi M等人Proc Natl Acad Sci U S A2006;103:9190-5)。
(E):肿瘤表达的CTLA-4可在肿瘤浸润性DC中触发增加的吲哚胺2,3-双加氧酶，并且CTLA-4特异性单克隆Ab也可阻断该作用(Ribas A等人,Oncologist2007;12:873-83)。
因此，5种不同的机制使得包含单克隆抗-CTLA-4的本发明的腺病毒成为高效的抗肿瘤方法，而无已导致安全问题的与全身性暴露相关的副作用(Hodi FS等人,N Engl J Med.2010;363;8:711-23;Sanderson K等人,J Clin Oncol2005;23:741-50。除了这5个转基因介导的机制外，病毒的溶瘤复制还将增添抗肿瘤效力。鉴于腺病毒本身介导高效的免疫刺激活性(Tuve S,等人Vaccine.2009;27(31):4225-39)，因此，溶瘤作用增添了所述方法的总体免疫效用。在下面的实施例9(图1、11、12)中，我们描述了这一方面的其它改善：将CpG部分添加进入腺病毒基因组使得病毒甚至更具免疫刺激性。
与现有技术的腺病毒工具相比较，本发明提供了更简单、更有效、廉价的、无毒性和/或更安全的癌症治疗工具。此外，无需辅助病毒或重组分子的共施用。
本发明提供了新一代的感染性增强的、高度有效的腺病毒，所述腺病毒保留了更早代的病毒的良好安全性，且导致更高的功效水平。重要地，本发明描述了这样的溶瘤腺病毒，其提供了对于溶瘤病毒的功效是至关重要的免疫因子。
本发明的新型产物使得能够进一步改善癌症疗法。
附图概述
图1显示了单和双靶向的和抗-CTLA4武装的溶瘤腺病毒的构建。溶瘤腺病毒Ad5/3-Δ24aCTLA4(单靶向的；其它的为双靶向的)、Ad5/3-hTERT-Δ24aCTLA4、Ad5/3-hTERT-Δ24aCTLA4-CpG、Ad5/3-E2F-Δ24aCTLA4和Ad5/3E2F-Δ24aCTLA4-CpG、复制缺陷型Ad5/3-aCTLA4以及未武装的溶瘤Ad5/3-Δ24(阳性对照)和复制缺陷型Ad5/3-Luc1(阴性对照)的示意性说明。
图2A-2F显示病毒产生的抗-CTLA4单克隆抗体的表达和功能的评价。
图2A：在非变性(上行)或变性条件(下行)下，通过Western印迹分析病毒感染的A549(从左至右泳道1和2)或PC3-MM2(泳道3和4)细胞的无血清上清液，以特异性检测人Ig(重链和轻链)。泳道1和3：用Ad5/3-Δ24aCTLA4感染的细胞；泳道2和4：用Ad5/3-aCTLA4感染的细胞。
图2B：证明病毒产生的抗-CTLA4单克隆抗体的活性的功能测定。用离子霉素、佛波醇12-十四酸酯13-乙酸酯(PMA)和重组人B7温育Jurkat细胞，导致与被抗原呈递细胞刺激但被抑制细胞抑制的T细胞相似的CD28和CTLA-4阳性细胞(晚期肿瘤中常见的情形)。来自经Ad5/3-Δ24aCTLA4或Ad5/3-aCTLA4感染的细胞的上清液导致B7/CTLA-4介导的抑制作用的抑制。这可从增加的IL-2产量(T细胞活化的标志)观察到。将重组抗-CTLA4单克隆抗体用作阳性对照。
图2C：显示重组CTLA-4(rCTLA-4)对病毒产生的抗-CTLA4单克隆抗体的亲和力的功能丧失测定(loss of function assay)。如先前一样(但现在还添加rCTLA-4以结合B7，阻止CTLA-4激活)活化Jurkat细胞。当添加含有aCTLA4的上清液时，rCTLA-4被封闭，并且B7能够结合CTLA-4以减少IL-2产量。条柱，3个单独的实验的平均值；条棒，SE，*,P<0.05；***,P<0.001。
图2D：A549、SKOV3-ip1、PC3-MM2肿瘤细胞系和UT-SCC8低代次肿瘤外植体的CTLA4表达水平。在荧光辅助细胞分选中，所有肿瘤细胞系对于CTLA4都是阳性的。
图2E和2F：显示抗-CTLA4表达盒的大尺寸或抗-CTLA4蛋白的产生不影响Ad5/3-Δ24aCTLA4的复制能力(replicativity)的腺病毒qPCR。简而言之，用PBS、Ad5/3-Δ24和Ad5/3-Δ24aCTLA4感染A549细胞，然后在不同的时间点通过qPCR测量来自上清液和来自细胞的病毒颗粒的数目。在病毒组之间未发现显著差异。
图3显示抗-CTLA4武装的腺病毒和对照载体的细胞杀伤效率。感染肿瘤细胞系(A)PC3-MM2、(B)SKOV3-ip1、(C)A549和(D)低代次肿瘤外植体UT-SCC8。在所有细胞系中，Ad5/3-Δ24aCTLA4具有与阳性对照病毒Ad5/3-Δ24相似的溶瘤效力。此外，复制缺陷型Ad5/3-aCTLA4也具有抗肿瘤活性，因为肿瘤细胞表达CTLA4。条柱，一式三份测定的平均值；条棒，SE。**,P<0.01；***,P<0.001。
图4显示，用表达抗-CTLA-4单克隆抗体的溶瘤腺病毒处理的、具有人前列腺癌异种移植物(PC3-MM2肿瘤)和人肺癌异种移植物(A549肿瘤)的免疫缺陷型小鼠的肿瘤生长抑制和细胞凋亡。在裸小鼠中建立PC3-MM2肿瘤(n=8/组)，其中人抗-CTLA-4不具有免疫学活性。因此，该模型仅测量抗-CTLA-4的溶瘤作用和促细胞凋亡作用。7天后，在第0、2和4天(箭头)用1×108个病毒颗粒瘤内处理肿瘤(直径5-8mm)。模拟小鼠仅用生长培养基进行注射。
图4A：Ad5/3-Δ24aCTLA4在该高度侵袭性模型中具有最佳抗肿瘤活性。相对于平均初始尺寸来表示肿瘤尺寸。点，平均值；条棒，SE；**,P<0.01(第7天的学生氏t检验)。
图4B：在第5天，通过免疫组织化学(褐色)对肿瘤冰冻切片的抗-CTLA4的表达(人IgG，上行)或细胞凋亡(活性胱天蛋白酶-3，下行)进行染色。在×40放大倍数下拍摄的图像。
图4C：在第7天，测量用Ad5/3-Δ24aCTLA4或Ad5/3-aCTLA4处理的小鼠的肿瘤和血浆的人IgG水平。在Ad5/3-Δ24aCTLA4处理的肿瘤中，相较于Ad5/3-aCTLA4处理的肿瘤，发现81倍的抗-CTLA4mAb(p<0.05)。此外，在用Ad5/3-Δ24aCTLA4处理的肿瘤中，与相同动物的血浆相比，发现了43.3倍的抗-CTLA4mAb(p<0.05)。平均血浆浓度为392.6μg/g(SE312.0)，其低于报导的分别用伊匹木单抗(561μg/mL)和曲美木单抗(450μg/mL)处理的人中耐受的浓度(REFS)(1mL的血浆重约1g)。在Ad5/3-Δ24aCTLA4肿瘤中，mAb的浓度为16977μg/g，因此远高于血浆中的浓度。条柱，一式三份测定的平均值；条棒，SE。
图4D.在肺癌模型中相较于模拟物的Ad5/3-Δ24aCTLA4引起的显著的抗肿瘤活性(P<0.01)。未看见Ad5/3-Δ24aCTLA4与Ad5/3-Δ24之间的显著差异。显示组，直至按照动物管理条例必须杀死来自所述组的第一只小鼠。点，平均值；条棒，SE。
图5显示，由Ad5/3-Δ24aCTLA4介导的、癌症患者的经刺激的外周血单核细胞(PBMC)中的增加的IL-2和IFN-γ产量。癌症患者(患者I244、患者C261、患者M158或患者X258)的PBMC用离子霉素、PMA和重组人B7进行刺激(以模拟肿瘤诱导的免疫抑制)以及用来自病毒感染的PC3-MM2细胞的过滤的上清液进行处理。IL-2(A)和IFN-γ(B)是T细胞活化的标志，且通过FACS阵列进行测定。将重组抗-CTLA-4单克隆抗体用作阳性对照。条柱，三个单独实验的平均值；条棒，SE。*,P<0.05；**,P<0.01；***,P<0.001。
图6显示，用Ad5/3-Δ24aCTLA4处理的健康供体的外周血单核细胞(PBMC)的IL-2和IFN-γ的产量。来自2个健康供体的PBMC用离子霉素、PMA和重组人B7进行刺激，以及用来自病毒感染的PC3-MM2细胞的过滤的上清液进行处理。利用FACS阵列测量生长培养基中的IL-2(A)或IFN-γ(B)水平。条柱，3个单独实验的平均值；条棒，SE。*,P<0.05；***,P<0.001。
图7显示，针对图2、5和6中显示的实例进行的抗-CTLA-4功能性测定的示意图。在体内，树突细胞通过主要组织相容性复合物(MHC)将抗原呈递给T细胞表面上的T细胞受体(TCR)。对于免疫应答(而非耐受性)，还需要共刺激。这通过B7.1或B7.2(DC上的)对T细胞上的CD28的结合来介导。T细胞活化可通过IL-2和IFN-γ的产量来定量。
图7A：在完整免疫系统不存在的情况下，可通过用佛波醇12-十四酸酯13-乙酸酯(PMA)和离子霉素温育PBMC来体外刺激T细胞活化，从而导致不依赖于TCR和CD28信号转导的活化。
图7B：在T细胞活化后，作为负反馈控制机制，CTLA-4的表达也被上调。
图7C：CTLA-4对B7的亲和力为CD28对B7的100倍，从而导致T细胞阻滞(T cell arrest)。
图7D：抗-CTLA-4抗体对CTLA-4信号转导的阻断阻断了抑制作用，从而导致T细胞的活化。
图7E：当添加可溶性重组人CTLA-4时，抗-CTLA-4mAb被隔离，从而使得B7自由地结合CTLA-4，并进行T细胞阻滞。
图7F：如果在抗-CTLA4mAb不存在的情况下将重组CTLA-4添加至生长培养基，那么其将隔离B7，从而使T细胞处于活化状态。
图8显示癌症患者的经刺激的外周血单核细胞(PBMC)中，由Ad5/3-Δ24aCTLA4产生的特异性抗-CTLA4mAb活性。癌症患者(患者I244、患者C261、患者M158或患者X258)的PBMC用离子霉素、PMA、重组人B7和重组人CTLA-4进行刺激；以及用来自病毒感染的PC3-MM2细胞的过滤的上清液进行处理。通过FACS测定测量生长培养基的IL-2(A)或IFN-γ(B)水平。条柱，3个单独实验的平均值；条棒，SE。*,P<0.05。
图9显示健康供体的经刺激的外周血单核细胞(PBMC)中，由Ad5/3-Δ24aCTLA4产生的特异性抗-CTLA4mAb活性。PBMC用离子霉素、PMA、重组人B7和重组人CTLA-4进行温育以及用来自病毒感染的PC3-MM2细胞的过滤的上清液进行处理。通过FACS测定测量生长培养基的IL-2(A)或IFN-γ(B)水平。条柱，3个单独实验的平均值。
图10显示，相较于复制缺陷型病毒，能复制的平台在增加抗-CTLA4mAb表达方面的效用。将PC3-MM2细胞以20000个细胞/孔接种，然后用各病毒以10VP/细胞感染所述细胞。感染后24h、48h和72h，收集上清液，用ELISA分析人IgG的量。相较于复制缺陷型Ad5/3-aCTLA4，对于溶瘤病毒Ad5/3-Δ24aCTLA4观察到3倍的增加。条柱，一式五份测定的平均值；条棒，SE。***,P<0.001。
图11显示包含toll样受体9(TLR-9)刺激性CpG分子的溶瘤腺病毒在肺癌的异种移植物小鼠模型中的作用。将A549细胞植入裸小鼠(5只小鼠/组，每小鼠2个肿瘤)，然后如下处理小鼠：盐水(黑色三角形)、富含CpG的溶瘤腺病毒(Ad5-Δ24CpG，白色圆圈)、溶瘤腺病毒(Ad5-Δ24，黑色正方形)、溶瘤腺病毒+重组CpG寡核苷酸(白色正方形)。富含CpG的病毒在介导抗肿瘤免疫中最有效，其甚至比与重组CpG分子组合提供的溶瘤腺病毒更有效。
图12A显示，对在72小时从处理的小鼠(与图11中的小鼠相同的小鼠)收获的脾细胞进行的MTS细胞杀伤测定的结果。报告在指定的时间点仍然活着的A549的百分比。图12B显示，鼠抗-CTLA4不影响抗病毒免疫。
图12B显示，干扰素γELISPOT测定的结果，其表明鼠抗-CTLA4不影响抗病毒免疫。用PBS、Ad5/3-Δ24、Ad5/3-Δ24和小鼠aCTLA4抗体或用单独的小鼠aCTLA4抗体处理具有免疫能力的C57Bl/6小鼠(n=5)。2周后，收集脾，在用UV-灭活的Ad5/3-Δ24或用功能性病毒刺激后，通过干扰素γELISPOT分析PBMC。SPU=斑点产生单位。
发明详述
腺病毒载体
在Ad5中以及在其它腺病毒中，二十面体衣壳由三种主要蛋白质：六邻体(II)、五邻体基座(penton base)(III)和多节纤突(knobbedfiber)(IV)以及次要蛋白质：VI、VIII、IX、IIIa和IVa2组成(RussellW.C.,J General Virol2000;81:2573-2604)。蛋白质VII、小肽mu和末端蛋白质(TP)与DNA缔合。蛋白质V通过蛋白质VI提供至衣壳的结构连接。病毒编码的蛋白酶是加工一些结构蛋白质所需要的。
本发明的溶瘤腺病毒载体基于腺病毒血清型5型(Ad5)核酸主链，该核酸主链包含衣壳修饰例如腺病毒血清型3型(Ad3)的结(Ad5/3衣壳嵌合体)、E1的Rb结合恒定区2中的24bp缺失(D24)和替代E3区域中缺失的gp19k/6.7K的编码特异于CTLA-4的完全人单克隆抗体(抗-CTLA4mAb或aCTLA4)的核酸序列。
在本发明的优选实施方案中，腺病毒载体基于人腺病毒。
Ad5基因组包含侧翼连接有左和右末端反向重复(分别地LITR和RITR)的早期(E1-4)、中期(IX和IVa2)和晚期(L1-5)基因，其包含DNA复制所需的序列。基因组还包含包装信号(ψ)和主要晚期启动子(MLP)。
早期基因E1A的转录启动复制周期，随后表达E1B、E2A、E2B、E3和E4。E1蛋白以使细胞对病毒复制更易感的方式调节细胞代谢。例如，它们干扰NF-κB、p53和pRb-蛋白。E1A和E1B一起用于抑制细胞凋亡。E2(E2A和E2B)和E4基因产物介导DNA复制，E4产物也影响病毒RNA代谢并且阻止宿主蛋白质的合成。E3基因产物负责抵抗宿主免疫系统的防御，增强细胞裂解，并且释放病毒后代(Russell W.C.,J General Virol2000;81:2573-2604)。
中期基因IX和IVa2编码病毒衣壳的次要蛋白。晚期基因L1-5(其导致病毒结构组分的产生、病毒颗粒在细胞核中的衣壳化和成熟)的表达受MLP影响(Russell W.C.,J General Virol2000;81:2573-2604)。
与野生型腺病毒基因组相比较，本发明的腺病毒载体在E1区中，特别地在E1A区域中缺乏来自CR2的24个碱基对，以及在E3区域中缺乏gp19k和6.7K，并且在病毒的纤突中包含衣壳修饰。在一些实施方案中，与野生型腺病毒基因组相比较，本发明的腺病毒载体额外地在E1区域中，特别地在E1A区域的上游包含hTERT启动子或E2F启动子，并且在E3区域中缺乏gp19k和6.7K。在一些实施方案中，本发明还包括富含TLR-9结合CpG岛的腺病毒主链，其已被置于E3区域中(图1)。
在本发明的优选实施方案中，除了修正的/部分区域E1和E3外，本发明的溶瘤腺病毒载体还包含选自E2、E4和晚期区域的一个或多个区域。在本发明的优选实施方案中，溶瘤腺病毒载体包含下列区域：左ITR、部分E1、pIX、pIVa2、E2、VA1、VA2、L1、L2、L3、L4、部分E3、L5、E4和右ITR。所述区域可以以任何顺序存在于载体中，但在本发明的优选实施方案中，所述区域按5'至3'的方向依次排列。开放阅读框架(ORF)可以在相同的DNA链或或在不同的DNA链中。在本发明的优选实施方案中，E1区域包含病毒包装信号。
如本文中所用，表述“腺病毒血清型5型(Ad5)核酸主链”是指Ad5的基因组或部分基因组，其包含选自Ad5来源的部分E1、pIX、pIVa2、E2、VA1、VA2、L1、L2、L3、L4、部分E3、L5和E4的一个或几个区域。在优选实施方案中，本发明的载体包含具有Ad3的一部分(例如，衣壳结构的一部分)的Ad5核酸主链。
如本文中所用，表述“部分”区域是指，与相应野生型区域相比，缺乏任何部分的区域。例如，“部分E3”可以指缺乏gp19k/6.7K的E3区域。
如本文中所用，表述“VA1”和“VA2”是指病毒相关RNA1和2，其由腺病毒转录但不被翻译。VA1和VA2在抵抗细胞防御机制中具有作用。
如本文中所用，表述“病毒包装信号”是指病毒DNA的一部分，其由一系列富含AT的序列组成并且控制衣壳化过程。
E1的24个碱基对的缺失(D24)影响CR2结构域，其负责结合Rb肿瘤抑制蛋白/细胞周期调节蛋白，从而允许诱导合成(S)期，即DNA合成或复制期。pRb和E1A的相互作用需要E1A蛋白保守区的8个氨基酸121至127(Heise C.等人2000,Nature Med6,1134-1139)，所述氨基酸在本发明中缺失。本发明的载体包含对应于根据Heise C.等人(2000,Nature Med6,1134-1139)的载体的氨基酸122-129的核苷酸的缺失。已知具有D24的病毒具有降低的克服G1-S检查点的能力，并且仅在其中该相互作用不是必需的细胞中，例如在Rb-p16途径具有缺陷的肿瘤细胞中有效复制(Heise C.等人2000,Nature Med6,1134-1139;Fueyo J等人2000,Oncogene19,2-12)。
E3区域不是病毒体外复制所必需的，但E3区域在宿主免疫应答的调控，即在抑制先天和特异性免疫应答中具有重要作用。E3中的gp19k/6.7K缺失是指，来自腺病毒E3A区域的965个碱基对的缺失。在所得的腺病毒构建体中，gp19k和6.7K基因都已缺失(Kanerva A等人2005,Gene Therapy12，87-94)。已知gp19k基因产物结合主要组织相容性复合物I(MHC1)分子并且将其隔离(sequester)在内质网中，且防止细胞毒性T淋巴细胞识别感染的细胞。由于许多肿瘤缺乏MHC1，所以gp19k的缺失增强了病毒的肿瘤选择性(病毒比野生型病毒更快地从正常细胞清除但在肿瘤细胞中无差异)。6.7K的蛋白质在细胞表面上表达，它们参与下调诱导TNF相关细胞凋亡的配体(TRAIL)的受体2。
在本发明中，将编码CTLA4mAb转基因的cDNA置于缺失gp19k/6.7k的E3区域中，处于E3启动子之下。这将转基因表达限制于允许病毒复制，且随后激活E3启动子的肿瘤细胞。E3启动子可以是本领域已知的任何外源或内源性启动子，优选内源性启动子。在本发明的优选实施方案中，编码抗CTLA4mAb的核酸序列处于病毒E3启动子的控制之下。
gp19k缺失在抗CTLA4mAb表达的背景中特别有用，因为其可增强保持该能力的此类肿瘤中的肿瘤表位的MHC1呈递。在该背景中，抗CTLA4mAb对T细胞毒性细胞的刺激可产生最佳益处。
抗-CTLA4mAb经由各种机制(包括活化T细胞毒性细胞、下调调节性T细胞(T-Reg)和抑制表达CTLA-4的肿瘤细胞对细胞毒性T细胞和抗原呈递细胞(例如树突细胞)的直接免疫抑制)起作用，从而增强免疫应答。除了上文中详细解释的这5个转基因介导的机制外，病毒的溶瘤复制将增添抗-肿瘤功效。
编码CTLA4mAb的核苷酸序列可来自任何动物例如人、猿、大鼠、小鼠、仓鼠、狗或猫，但优选在人的治疗的背景中CTLA4mAb由完全人的序列编码。编码CTLA4mAb的核苷酸序列可进行修饰以增强其作用，或不进行修饰，即野生型序列。在本发明的优选实施方案中，编码CTLA4mAb的核酸序列是未经修饰的。
外源性元件的插入可增强载体在靶细胞中的作用。外源组织或肿瘤特异性启动子的使用在重组腺病毒载体中是常见的，它们也可用于本发明。在一些实施方案中，本发明的腺病毒包含hTERT或hTERT的变体或E2F以控制E1A区域，优选置于E1A的上游。hTERT将载体导向表达端粒酶的细胞，而E2F将载体导向具有Rb/p16途径缺陷的细胞。此类缺陷导致游离E2F的高表达水平和E2F启动子的高活性。然而，可利用任何其它适当的启动子将病毒复制限制于靶细胞，所述启动子包括但不限于CEA、SLP、Cox-2、Midkine、CXCR4、SCCA2和TTS。它们通常被添加来控制E1A区域，但除此之外或备选地，也可调节其它基因例如E1B或E4。还可将外源绝缘子(insulator)即针对非特异性增强子的阻断元件、左ITR、天然E1A启动子或染色质蛋白质包含在重组腺病毒载体中。可任选地使用任何额外的组分或修饰，但其在本发明的载体中不是必须的。
在本发明的其它实施方案中，本发明的腺病毒载体的特征在于，腺病毒主链中的结合TLR-9的富含CpG的DNA区域(图1、11、12)。
本发明的溶瘤腺病毒载体包含衣壳修饰。大多数成人已被暴露于最广泛使用的腺病毒血清型Ad5，因此免疫系统可快速产生针对它们的中和抗体(NAb)。事实上，抗-Ad5NAb的流行可达到50%。已显示，可针对腺病毒衣壳的多个免疫原性蛋白质中的大多数诱导NAb，以及在另一方面，已显示Ad5纤突的结的甚至小的变化可允许逃脱衣壳特异性NAb(
Figure BDA00003144165700181
M,等人Gene Ther.2008;15(12):921-9)。因此，结的修饰在接触腺病毒的情况下对于在人中保持或增加基因递送是非常重要的。
此外，已知Ad5通过纤突的结部分结合称为CAR的受体，并且该结部分或纤突的修饰可促进至靶细胞的进入，并且在许多或大多数癌症中引起增强的溶瘤作用(Ranki T.等人,Int J Cancer2007;121:165-174)。事实上，衣壳修饰的腺病毒是用于改善基因至癌细胞的递送的有利工具。
如本文中所用，“衣壳”是指病毒的蛋白质外壳，其包括六邻体、纤突和五邻体基座蛋白。本领域已知的任何衣壳修饰，即六邻体、纤突和/或五邻体基座蛋白的修饰(所述修饰促进病毒至肿瘤细胞的递送)可用于本发明。修饰可以是遗传和/或物理修饰，包括但不限于，用于整合配体(其识别特定细胞受体和/或阻断天然受体结合)的修饰，用其它腺病毒的结替代腺病毒载体的纤突或结结构域(嵌合体)的修饰，以及向腺病毒添加特定分子(例如，成纤维细胞生长因子2，FGF2)的修饰。因此，衣壳修饰包括但不限于，小肽基序、肽、嵌合体或突变至纤突(例如，至结、尾或轴部分内)、六邻体和/或五邻体基座内的掺入。在本发明的优选实施方案中，衣壳修饰是Ad5/3嵌合体，整联蛋白结合(RGD)区域和/或硫酸肝素结合多聚赖氨酸修饰至纤突的插入。在本发明的具体实施方案中，衣壳修饰为Ad5/3嵌合体。
如本文中所用，衣壳的“Ad5/3嵌合体”是指，其中纤突的结部分来自Ad血清型3型并且纤突的其余部分来自Ad血清型5型的嵌合体。
本发明的载体还可包含其它修饰，例如E1B区域的修饰。
如本文中所用，“RGD”是指精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)基序，其在五邻体基座上暴露并且与支持腺病毒内吞的细胞α-v-β-整联蛋白相互作用。在本发明的优选实施方案中，衣壳修饰为RGD-4C修饰。“RGD-4C修饰”是指，异源整联蛋白结合RGD-4C基序在纤突结结构域的HI环中的插入。4C是指4个半胱氨酸，其形成RGD-4C中的硫桥。编码具有RGD-4C肽的纤突的重组Ad5纤突基因的构建详细地描述于例如DmitrievI.等人的论文(Journal of Virology1998;72:9706-9713)中。
如本文中所用，“硫酸乙酰肝素结合多聚赖氨酸修饰”是指7个赖氨酸的区段至纤突结c-末端的添加。
可通过使用载体，将表达盒用于在靶例如细胞中表达转基因。如本文中所用，表述“表达盒”是指DNA载体或其部分，包含编码cDNA或基因的核苷酸序列以及控制和/或调控所述cDNA或基因的表达的核苷酸序列。可将相似或不同的表达盒插入一个载体或插入几个不同的载体。本发明的Ad5载体可包含几个或一个表达盒。然而，仅一个表达盒也是足够的。在本发明的优选实施方案中，溶瘤腺病毒载体包含至少一个表达盒。在本发明的优选实施方案中，溶瘤腺病毒载体仅包含一个表达盒。
包含本发明的腺病毒载体的细胞可以是任何细胞，例如真核细胞、细菌细胞、动物细胞、人细胞、小鼠细胞等。细胞可以是体外、离体或体内细胞。例如，细胞可用于体外、离体或体内产生腺病毒载体，或细胞可以是靶，例如肿瘤细胞，其已被腺病毒载体感染。
在于细胞中产生CTLA4mAb的方法中，包含本发明的载体的媒介物被运送至细胞内，CTLA4mAb基因进行表达，蛋白质被翻译并且以旁分泌的方式进行分泌。“媒介物”可以是任何病毒载体、质粒或其它工具，例如颗粒，其能够将本发明的载体递送至靶细胞。本领域已知的任何常规方法可用于将载体递送至细胞。
可通过本发明增加受试者的肿瘤特异性免疫应答。T细胞毒性细胞的活化、调节性T细胞(T-Reg)的下调和表达CTLA-4的肿瘤细胞对细胞毒性T细胞和树突细胞的直接免疫抑制的抑制，因CTLA4mAb的表达而发生。
为了跟踪或研究本发明的效果，可测定免疫应答的各种参数。最常见的标志包括但不限于，血液或肿瘤中肿瘤或腺病毒特异性细胞毒性T细胞的改变。可在肿瘤处或淋巴组织中研究抗原呈递细胞的招募和活化。此外，可研究调节性细胞亚组(例如调节性T细胞)的数目或活性。血清细胞因子特征谱可阐明Th1/Th2环境(其对于免疫对耐受性也是非常重要的)。可按照本领域已知的任何常规方法研究此类标志的水平，包括但不限于，利用抗体、探针、引物等的那些方法，例如ELISPOT测定、四聚体分析、五聚体分析、细胞内细胞因子染色、血液中的抗体的分析以及血液或肿瘤中的不同细胞类型的分析。
癌症
已构建了在细胞中具有复制能力的本发明的重组Ad5/3载体，所述细胞在Rb途径，特别地Rb-p16途径中具有缺陷。此类缺陷细胞包括动物和人的所有肿瘤细胞(Sherr C.J.1996,Science274,1672-1677)。在本发明的优选实施方案中，载体能够在Rb途径具有缺陷的细胞中选择性复制。如本文中所用，“Rb途径中的缺陷”是指，所述途径的任何基因或蛋白质的突变和/或表观遗传改变。由于存在这些缺陷，肿瘤细胞过表达E2F，从而E1A CR2对Rb的结合(这通常是释放E2F以进行有效复制所必须的)不是必要的。
本发明的一些溶瘤腺病毒载体另外地经构建在表达人端粒酶逆转录酶(hTERT)的细胞中具有复制能力，该酶是人端粒酶的催化亚结构域。这些包括超过85%的人肿瘤，其被发现上调hTERT基因及其启动子的表达，然而大多数正常成人体细胞缺乏端粒酶或瞬时表达极低水平的该酶(Shay和Bacchetti1997,Eur J Cancer33:787-791)。这样的Rb-p16途径缺陷/hTERT启动子组合可靶向任何癌症或肿瘤，包括恶性和良性肿瘤，以及原发性肿瘤和转移灶可以是基因疗法的靶。E2F转录因子调节多组参与与生长控制相关的关键细胞事件的基因的表达(Johnson和Schneider-Broussard1998,Role of E2F in cellcycle control and cancer,Front Biosci.1998Apr27;3:d447-8;Muller和Helin2000,The E2F transcription factors:keyregulators of cell proliferation,Biochim Biophys Acta.2000Feb14;1470(1):M1-12)。
在非循环正常细胞中，E2F被隔离在pRb/E2F复合物中，从而E2F几乎是不可自由获得的。pRb途径在几乎所有人癌症中被破坏，导致游离的E2F存在于大多数癌症中，这证明了其在生理性生长控制中的关联性。可通过突变几种不同分子中的任一种来破坏该途径。然而，共同特征是，E2F启动子随后被激活以增加E2F水平。E2F结合许多靶基因的启动子，但对其功能重要的还是自体活化。因此，p16/Rb功能失调的细胞的特征在于高E2F水平，这通过E2F对其启动子的结合被进一步放大(Hanahan和Weinberg2000,Cell7;100(1):57-70;Johnson等人2002,Cancer Cell1(4):325-37)。
然而，如果腺病毒E1A受E2F启动子控制(如在例如US2008118470A1中)，那么除非同时使用消除E1A/Rb的D24缺失，否则存在自我扩增的恶性循环的风险。具体地，甚至存在于正常细胞中的低水平E2F可结合E2F启动子，从而导致E1A的表达，导致更多E2F从pRb/E2F复合物释放，导致更多E2F启动子激活和更多E1A。因此，在消除E1A对pRb的结合的D24缺失不存在的情况下，E2F启动子导致也可在正常细胞中复制的溶瘤腺病毒，这可能具有安全影响。
未甲基化的双链DNA可刺激TLR9(桥联接先天性和适应性免疫应答的内体受体)。富含CpG的区域在腺病毒主链中的插入增强了腺病毒刺激抗原呈递细胞中的TLR9的能力，从而增加了T细胞刺激和成熟以及NK活化(Nayak S,Herzog RW.Gene Ther.2010Mar;17(3):295-304)。
在本发明的具体实施方案中，癌症是任何实体瘤。在本发明的优选实施方案中，癌症选自：鼻咽癌、滑膜癌(synovial cancer)、肝细胞癌、肾癌、结缔组织的癌症、黑素瘤、肺癌、肠癌、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、脑癌、喉癌、口癌、肝癌、骨癌、胰腺癌、绒毛膜癌、胃泌素瘤、嗜铬细胞瘤、催乳素瘤、T细胞白血病/淋巴瘤、神经瘤、VHL病(von Hippel-Lindau disease)、卓-艾综合征(Zollinger-Ellison syndrome)、肾上腺癌、肛门癌、胆管癌、膀胱癌、输尿管癌、少突胶质细胞瘤、神经母细胞瘤、脑膜瘤、脊髓瘤、骨软骨瘤、软骨肉瘤、尤文氏肉瘤(Ewing's sarcoma)、原发部位不明癌症(cancer ofunknown primary site)、类癌(carcinoid)、胃肠道类癌、纤维肉瘤、乳腺癌、派杰氏病(Paget's disease)、宫颈癌、食道癌、胆囊癌、头部癌症(head cancer)、眼癌、颈癌、肾癌、肾母细胞瘤(Wilms'tumor)、卡波西肉瘤(Kaposi's sarcoma)、前列腺癌、睾丸癌、霍奇金氏病、非霍奇金淋巴瘤、皮肤癌、间皮瘤、多发性骨髓瘤、卵巢癌、内分泌胰腺癌、胰高血糖素瘤(glucagonoma)、胰腺癌、甲状旁腺癌、阴茎癌、垂体癌(pituitary cancer)、软组织肉瘤、视网膜母细胞瘤、小肠癌、胃癌、胸腺癌、甲状腺癌、滋养层癌症、葡萄胎、子宫癌、子宫内膜癌、阴道癌、外阴癌、听神经瘤、蕈样肉芽肿病(mycosis fungoides)、胰岛素瘤、类癌综合征、生长抑素瘤(somatostatinoma)、牙龈癌(gumcancer)、心脏癌症(heart cancer)、唇癌、脑膜癌(meninges cancer)、口腔癌、神经癌、腭癌(palate cancer)、腮腺癌、腹膜癌、咽癌、胸膜癌、涎腺癌、舌癌和扁桃体癌。
药物组合物
本发明的药物组合物包含至少一种类型的本发明的载体。此外，组合物可包含至少两种、三种或四种不同的本发明的载体。除了本发明的载体以外，药物组合物还可包含任何其它载体，例如其它腺病毒载体，例如US2010166799A1中描述的那些载体、其它治疗有效试剂、任何其它试剂例如药学上可接受的载体、缓冲剂、赋形剂、佐剂、抗菌药(antiseptics)、填充剂、稳定剂或增稠剂和/或通常在相应产物中发现的任何组分。
药物组合物可以为适合于施用的任何形式，例如固体、半固体或液体形式。制剂可选自但不限于，溶液、乳剂、悬浮液、片剂、丸剂和胶囊。
在本发明的优选实施方案中，溶瘤腺病毒载体或药物组合物用作原位癌症疫苗。如本文中所用，“原位癌症疫苗”是指杀死肿瘤细胞并且还增加抗肿瘤细胞的免疫应答的癌症疫苗。病毒复制对于可用于TH1型细胞毒性T细胞应答的免疫系统是强危险信号，从而用作APC成熟和活化以及NK细胞的招募的强有力共刺激因子。
肿瘤免疫学领域的至关重要的发现是，抗-肿瘤免疫应答的诱导不足以产生疗效。相反，减小肿瘤介导的免疫抑制也是至关重要的。肿瘤细胞裂解还帮助呈递肿瘤片段和表位至APC，且其它共刺激由炎症产生。因此，不依赖于表位(即，非HLA限制性)的应答在各肿瘤的背景中产生，且原位发生。肿瘤特异性免疫应答在靶细胞中被激活，随后允许抗肿瘤活性在整个受试者水平上例如在远端转移中发生。
载体的有效剂量取决于许多因素，包括需要治疗的受试者、肿瘤类型、肿瘤的位置和肿瘤的分期。剂量可例如从约108个病毒粒子(VP)变化至约1014个VP，优选从约5x109个VP变化至约1013个VP，更优选从约8x109个VP变化至约1012个VP。在本发明的一个具体实施方案中，人剂量在约5x1010-5x1011VP的范围内。
药物组合物可通过本领域已知的任何常规方法，例如通过利用下列方法之任一种来产生：分批、分批补料和灌注培养模式、柱层析纯化、CsCl梯度纯化和利用低剪切力细胞保留装置的灌注模式。
施用
可将本发明的载体或药物组合物施用给选自植物、动物和人类的任何真核生物受试者。在本发明的优选实施方案中，受试者是人或动物。动物可选自宠物、家养动物和生产性动物(production animal)。
任何常规方法可用于将载体或组合物给受试者施用。施用途径取决于组合物的制剂或形式、疾病、肿瘤位置、患者、共病和其它因素。在本发明的优选实施方案中，通过瘤内、肌内、动脉内、静脉内、胸膜内、血管内、腔内或腹膜内注射或口服施用来进行施用。
本发明的溶瘤腺病毒载体的仅一次施用可具有疗效。然而，在本发明的优选实施方案中，在治疗期间，数次施用溶瘤腺病毒载体或药物组合物。可在前2周、4周、每月或在治疗过程中施用溶瘤腺病毒载体或药物组合物例如1至10次。在本发明的一个实施方案中，在前2周，随后在第4周，随后每月，施用3至7次。在本发明的具体实施方案中，在前2周，随后在第4周，随后每月，施用4次。治疗期的长度可发生变化，例如可持续2至12个月或更长时间。
此外，可优选将本发明的溶瘤腺病毒载体的施用与其它溶瘤腺病毒载体例如US2010166799A1中描述的载体的施用组合。施用可以是同时的或相继的。
为了避免受试者中的中和抗体，可在治疗之间改变本发明的载体。在本发明的优选实施方案中，与早期治疗的载体相比较，将具有不同的衣壳纤突结的溶瘤腺病毒载体给受试者施用。如本文中所用，“衣壳的纤突结”是指纤突蛋白的结部分(图1a)。或者，可将病毒的完整衣壳转变成不同血清型的衣壳。
本发明的基因疗法单独是有效的，但腺病毒基因疗法与任何其它疗法例如常规疗法的组合可比单独的任一种疗法更有效。例如，组合疗法的每一种试剂可在肿瘤组织中独立地工作，腺病毒载体可使细胞对化学疗法或放射疗法敏感和/或化学治疗剂可升高病毒复制的水平或影响靶细胞的受体状态。或者，组合可以以对于治疗的效力是有益的方式调节受试者的免疫系统。例如，化学疗法可用于下调抑制细胞例如调节性T细胞。或者，可在溶瘤病毒疗法之后使用化学疗法，以增强免疫应答(通过杀死肿瘤细胞和随后释放表位和/或病毒)。化学疗法还可使肿瘤细胞对溶瘤病毒敏感，并且反之亦然。可同时或相继地施用联合治疗的试剂。在本发明的优选实施方案中，患者同时接受环磷酰胺以增强治疗的免疫效应。
在本发明的优选实施方案中，所述方法或用途还包括给受试者施用同步放射疗法(concurrent radiotherapy)。在本发明的另一个优选实施方案中，所述方法或用途还包括给受试者施用同步化学疗法。在本发明的另一个优选实施方案中，所述方法或用途还包括给受试者施用其它溶瘤腺病毒或疫苗病毒。载体的施用可是同时的或相继的。
如本文中所用，“同步”是指在本发明基因疗法之前、之后或同时施用的疗法。同步疗法的时间段可从数分钟变化至数周。优选，同步疗法持续数小时。在一个实施方案中，以节律方式将环磷酰胺通过静脉团注和口服进行施用。
适用于联合治疗的试剂包括但不限于，所有反式视黄酸、阿扎胞苷、硫唑嘌呤、博来霉素、卡铂、卡培他滨、顺铂、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、阿糖胞苷、柔红霉素、多西他赛、去氧氟尿苷、多柔比星(Doxorubicin)、表柔比星(Epirubicin)、爱波喜龙、依托泊苷、氟尿嘧啶、吉西他滨、羟基脲、伊达比星、伊马替尼、氮芥、巯嘌呤、甲氨蝶呤、米托蒽醌、奥沙利铂、紫杉醇、培美曲塞、替莫唑胺、替尼泊苷、硫鸟嘌呤、戊柔比星、长春碱、长春新碱、长春地辛和长春瑞滨。
在本发明的优选实施方案中，所述方法或用途还包括给受试者施用维拉帕米或另一种钙通道阻断剂。“钙通道阻断剂”是指一种药物和天然物质，其破坏钙通道的传导，其可选自维拉帕米、二氢吡啶、戈洛帕米、地尔硫卓、咪拉地尔、苄普地尔、氟司必林和芬地林。
在本发明的优选实施方案中，所述方法或用途还包括给受试者施用自噬诱导剂。自噬是指牵涉通过溶酶体机制降解细胞自己的组分的催化过程。“自噬诱导剂”是指能够诱导自噬的试剂，其可选自但不限于，mTOR抑制剂、PI3K抑制剂、锂、他莫昔芬、氯喹、巴弗洛霉素、坦西莫司、西罗莫司和替莫唑胺。在本发明的具体实施方案中，所述方法还包括给受试者施用替莫唑胺。替莫唑胺可以是口服或静脉内替莫唑胺。可将自噬诱导剂与免疫调节剂组合。在一个实施方案中，将编码抗-CTLA4mAb的溶瘤腺病毒与替莫唑胺和环磷酰胺组合。
在本发明的一个实施方案中，所述方法或用途还包括施用化学疗法或抗-CD20疗法或用于阻断中和抗体的其它方法。“抗-CD20疗法”是指能够杀死CD20阳性细胞的试剂，其可选自利妥昔单抗和其它抗-CD20单克隆抗体。“用于阻断中和抗体的方法”是指能够抑制通常因感染而产生的抗-病毒抗体产生的试剂，其可选自不同的化学治疗剂、免疫调节物质、皮质激素和其它药物。此类物质可选自但不限于，环磷酰胺、环孢素、硫唑嘌呤、甲泼尼龙、依托泊苷、CD40L、FK506(他克莫司)、IL-12、IFN-γ、白细胞介素10、抗-CD8、抗-CD4抗体、骨髓脱离(myeloablation)和口服腺病毒蛋白质。
还可将本申请中描述的方法与能够克服中和抗体的分子组合。此类试剂包括脂质体、脂质复合物和聚乙二醇，可将所述试剂与病毒混合。或者，可利用由腺病毒衣壳蛋白组成的免疫血浆取出法柱(immunopheresis column)除去中和抗体。
本发明的溶瘤腺病毒载体诱导病毒体介导的肿瘤细胞的溶瘤作用并且激活抗肿瘤细胞的人免疫应答。在本发明的优选实施方案中，所述方法或用途还包括，施用能够进一步下调受试者的调节性T细胞的物质。“能够下调调节性T细胞的物质”是指减少鉴定为T抑制细胞或调节性T细胞的细胞的量。此类细胞已被鉴定为特征在于下列免疫表型标志的一个或多个：CD4+、CD25+、FoxP3+、CD127-和GITR+。减少T抑制细胞或调节性T细胞的此类试剂可选自抗-CD25抗体或化学治疗剂。此类物质可用于减少调节性T细胞的数目，aCTLA4主要地有效地抑制它们的活性。
在本发明的优选实施方案中，所述方法或用途还包括给受试者施用环磷酰胺。环磷酰胺是常见化学治疗剂，其也已被用于一些自身免疫性障碍。在本发明中，环磷酰胺可用于增强病毒复制以及aCTLA4诱导的NK或细胞毒性T细胞的刺激(以增强抗肿瘤免疫应答)。其可以以静脉内团注剂量(bolus dose)或口服低剂量节律施用或它们的组合的方式使用。
在本发明中，为了确保CTLA-4阻断性mAb不杀死活化的细胞毒性T细胞(其对于治疗是有用的)，选择人IgG2亚型。IgG2诱导最小的补体激活和Ab依赖性细胞介导的细胞毒性(Bruggemann M.等人J ExpMed1987;166:1351-1361)并且还在人使用的背景中降低细胞因子释放综合征的可能性(Ribas A等人,Oncologist2007;12:873-83)。
本发明的任何方法或用途可以是体内、离体或体外方法或用途。
在本发明中，用特异于CTLA-4的完全人单克隆抗体武装溶瘤腺病毒。在该方法中，肿瘤细胞因病毒复制和因抗-CTLA4mAb抗-肿瘤免疫激活和直接的促细胞凋亡肿瘤细胞杀伤而被杀死。额外的益处可由归因于病毒复制的肿瘤抗原释放产生，其可通过潜在地允许更加特异性的抗肿瘤靶的免疫应答来提高抗-CTLA-4mAb疗法的效力(Hodi FS等人,N Engl J Med2010;363;8:711-23;Mokyr MB等人,CancerRes1998;58:5301-4;Wolchok JD and Saenger Y.,Oncologist2008;13Suppl4:2-9)。此外，治疗的副作用是非重叠的，这可能有利于增加效率而不增加毒性。已显示，溶瘤腺病毒可在癌细胞系中高效地表达作为转基因的功能性抗-CTLA4mAb(图2)。此外，已发现，可以将溶瘤腺病毒复制与抗-CTLA4mAb组合并且获得增强的细胞杀伤(图3-4)。这一直以来都被关注，因为mAb对CTLA-4的阻断导致增加的IFN-γ和主要组织相容性复合物(MHC)I类分子的产量，这潜在地可抑制病毒复制(McCart JA等人,Gene Ther2000;7:1217-23;Nakamura H等人,Cancer Res2001;61:5447-52)。病毒溶瘤作用与抗-CTLA4mAb表达一起导致比任一单独的治疗更高的体内抗肿瘤活性(图4)。已报导，用表达粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF)的溶瘤病毒与低剂量的节律性环磷酰胺(以减少T-Reg)的组合治疗癌症患者(Cerullo V等人,Cancer Res;2010;70:4297-309;Koski A等人,Mol Ther.2010Jul27.[Epub ahead of print].PMID:20664527)。此外，来自分泌GM-CSF的肿瘤细胞免疫疗法的小鼠抗-CTLA-4的细胞介导的递送激活有效的抗-肿瘤应答并且延长总体存活，并且减少全身性自身免疫的表现(Simmons AD等人,CancerImmunol Immunother2008;57:1263-70)。因此，可在多模式方法(multimodal approach)中，利用癌症常规疗法例如放射化疗法、疫苗例如GM-CSF和/或利用例如环磷酰胺进行的T-Reg的减少进一步提高本方法的效力。
本申请首次显示，可从溶瘤腺病毒产生全长mAb。此外，这也是由具有复制能力的肿瘤靶向性平台表达的第一个完全人抗-CTLA4mAb。在已进行的小鼠实验中未看见副作用。来自癌症患者PBMC的数据提供了Ad5/3-Δ24aCTLA4作为溶瘤病毒载体用于治疗晚期癌症患者的临床应用的根据。由于p16-Rb途径在许多(如果不是全部的话)实体瘤中具有缺陷(Sherr CJ.,Science1996;274:1672-724)，因此，本发明的Ad5/3-Δ24aCTLA4和其它Δ24缺陷型病毒适合用于治疗大多数类型的可用疗法难以治疗的癌症。除了Δ24外还包含hTERT或E2F启动子的本发明的此类实施方案实际上将本发明的效用扩大至所有癌症。此外，添加所述启动子可允许更大的治疗剂量，减少的副作用和增强的全身性效用。重要地，将CpG部分添加进入病毒基因组可增强抗肿瘤免疫应答。
本发明通过下列实施例来举例说明，所述实施例无意以任何方式进行限定。
实施例
动物
所有动物实验方案都通过赫尔辛基大学的实验动物委员会和南芬兰的省政府评审和批准。4至5周龄的NMRI裸小鼠获自Taconic(Ejby,Denmark)，并且在研究之前隔离检疫至少1周。小鼠的健康状态被频繁监测，只要疼痛或痛苦的任何征兆明显，就将它们杀死。
细胞培养
将人头颈鳞状细胞癌(HNSCC)低代次肿瘤细胞培养物UT-SCC8(声门上喉)(27)培养在补充有10%FCS(PromoCell GmbH,Heidelberg,德国)、1%非必需氨基酸(Gibco,Invitrogen,Carlsbad,California)、2mmol/L谷氨酰胺、100单位/mL青霉素和100单位/mL链霉素(全部来自Sigma,St.Louis,MO)的达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM)中。使用低代次的，通常第15-30代的UT-SCC细胞。
人转化胚肾细胞系293、人肺癌细胞系A549、人卵巢癌细胞系SKOV3-ip1和人前列腺癌细胞系PC-3MM2；以及Jurkat(克隆E6-1)人白血病T细胞淋巴母细胞获自美国典型培养物保藏中心(ATCC,Manassas,VA,USA)。在推荐的条件下维持所有细胞系。
人样品
在知情况同意的情况下，获得健康个体和患有常规疗法难以治疗的晚期转移肿瘤的患者的外周血单核细胞(PBMC)。
统计分析
使用双尾学生t检验(two tailed Student's t-test)，且小于0.05的p值被认为是显著的。
实施例1.腺病毒的构建
产生具有编码IgG2型抗-CTLA4mAb的cDNA序列的嵌合腺病毒(图1)。将抗-CTLA4mAb的编码序列引入腺病毒E3A的6.7K/gp19K缺失处，以产生具有复制能力的腺病毒Ad5/3-Δ24aCTLA4(SEQ ID.NO:1)、Ad5/3-hTERT-Δ24aCTLA4(SEQ ID.NO:2)、Ad5/3-hTERT-Δ24aCTLA4-CpG(SEQ ID.NO:3)、Ad5/3-E2F-Δ24aCTLA4(SEQ ID.NO:4)和Ad5/3-E2F-Δ24aCTLA4-CpG(SEQ ID.NO:5)，或引入由CMV启动子驱动的缺失的E1处，以产生复制缺陷型腺病毒Ad5/3-aCTLA4(SEQ ID.NO:6)。
使用标准腺病毒制备技术(Kanerva A,等人,Mol Ther2002;5:695-704；Bauerschmitz GJ等人,Mol Ther2006;14:164-74；KanervaA和Hemminki A.,Int J Cancer2004;110:475-80；Volk AL,等人,Cancer Biol Ther2003;2:511-5)产生和扩增溶瘤腺病毒。简而言之，首先构建具有转基因和其它部分(启动子、CpG、poly-A)的E1或E3穿梭载体，然后将其与拯救质粒(rescue plasmid)在特征在于人重组酶的细菌细胞中进行重组。图1中描述了病毒的主要特征，包括对照病毒Ad5Luc1(Kanerva A等人,Clin Cancer Res2002;8:275-80)和Ad5/3-Δ24(Kanerva A等人,Mol Ther2003;8:449-58)的特征。
为了产生Ad5/3-Δ24aCTLA4，产生质粒pTHSN-aCTLA4。pTHSN-aCTLA4在腺病毒基因组的缺失了6.7K/gp19K的E3区域中包含IgG2型抗-CTLA4mAb的重链和轻链。利用链之间的内部核糖体进入位点(IRES)实现重链和轻链的等摩尔性(equimolarity)。通过在大肠杆菌(Escherichia coli)BJ5183细胞(Qbiogene Inc.,Irvine,CA,USA)中进行FspI-线性化的pTHSN-aCTLA4与SrfI-线性化的pAdEasy-1.5/3-Δ24(Kanerva A等人,Clin Cancer Res2002;8:275-80)(在E1A中包含血清型3型的结和24bp缺失的拯救质粒)之间的同源重组来产生pAdEasy-1.5/3-Δ24-aCTLA4。通过PacI降解释放Ad5/3-Δ24aCTLA4的基因组，随后将其转染至A549细胞。将病毒在A549细胞上繁殖，在氯化铯梯度上纯化。在260nm测定病毒颗粒浓度，并在293细胞上进行标准TCID50(平均组织培养感染剂量)分析以测定感染性颗粒滴度。
为了产生Ad5/3-hTERT-Δ24aCTLA4、Ad5/3-hTERT-Δ24aCTLA4-CpG、Ad5/3-E2F-Δ24aCTLA4和Ad5/3-E2F-Δ24aCTLA4-CpG，首先将抗-CTLA扩增产物亚克隆入pTHSN或pTHSN-CpG，随后将其与pAd5/3-hTERT-E1A或pAd5/3-E2F-E1A重组(Bauerschmitz GJ,等人,Cancer Res2008;68:5533-9；Hakkarainen T,等人Clin Cancer Res.2009;15(17):5396-403)。用PacI线性化所得的质粒，将其转染进入A549细胞以进行扩增和拯救。将病毒在A549细胞上繁殖，在氯化铯梯度上进行纯化。在260nm测定病毒颗粒浓度，并在293细胞上进行标准TCID50(平均组织培养感染剂量)分析以测定感染性颗粒的滴度。
利用PCR和多个限制性消化来确认所有阶段的克隆。对穿梭质粒pTHSN-aCTLA4进行测序。利用PCR确认野生型E1的不存在。通过测序和PCR在最终的病毒中检查E1区域、转基因和纤突。在A549细胞上进行病毒产生的所有阶段(包括转染)以避免野生型重组的风险，如先前所描述的(Kanerva A等人2003,MolTher8,449-58;Bauerschmitz GJ等2006,MolTher14,164-74)。aCTLA4处于E3启动子之下(具体地处于内源病毒E3A基因表达控制元件之下)，这导致与复制相关的转基因表达，这始于感染后约8小时。除6.7K/gp19K的缺失外，E3是完整的。
为了构建非复制型E1缺失的对照病毒Ad5/3-aCTLA4，将抗-CTLA4mAb cDNA的两条链连接进入pShuttle-CMV。在pAdEasy-1.5/3质粒(Krasnykh VN,等人,J Virol1996;70:6839-46)(其具有完整的腺病毒基因组)与PmeI-线性化的pShuttle-CMV-aCTLA4之间进行同源重组，以构建pAdEasy-1.5/3-aCTLA4。利用PacI释放Ad5/3-aCTLA4的基因组，将其转染进入293细胞。将病毒在293细胞上繁殖，在氯化铯梯度上进行纯化。在260nm测定病毒颗粒浓度，在293细胞上进行标准噬斑测定，以测定感染性颗粒。
实施例2.所构建的腺病毒的体外表达和功能性
将Western印迹分析用于确认，所构建的腺病毒表达抗-CTLA4mAb。以10病毒颗粒(VP)/细胞，用构建的Ad5/3-Δ24aCTLA4或Ad5/3-aCTLA4感染A549或PC3-MM2肿瘤细胞。48小时后，用0.02μm过滤器(Anotop,Whatman,England)过滤病毒感染的细胞的上清液，在还原或非变性条件下，将15μL用于7.5%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，随后转移至硝酸纤维素膜上。用山羊抗-人IgG(重链和轻链)(AbD serotec,MorphoSys,Germany)温育膜，洗涤膜，随后用偶联至辣根过氧化物酶的二抗(Dako,Denmark)进行温育。利用增强型化学发光(GE Healthcare,Amersham,UK)进行信号检测。
在Western印迹中，在感染后48小时的上清液中，Ad5/3-Δ24aCTLA4和Ad5/3-aCTLA4表达预期的约150kDa的抗-CTLA4mAb(在非变性条件下)以及约50kDa的重链和约25kDa的轻链(在变性条件下)(图2A)。
为了比较溶瘤病毒Ad5/3-Δ24aCTLA4或复制缺陷型Ad5/3-aCTLA4的抗-CTLA4mAb表达，将PC3-MM2细胞以20000个细胞/孔接种，并用各自病毒以10VP/细胞进行感染。感染后24小时、48小时和72小时，收集上清液，通过ELISA分析其中的人IgG的量(图10)。
为了确认Ad5/3-Δ24aCTLA4和Ad5/3-aCTLA4表达功能性抗-CTLA4mAb，如先前所述(Lee KM等人,Science1998;282:2263-68)，检查经刺激的Jurkat细胞的增加的IL-2产量。
Jurkat细胞(克隆6.1)用0.3μg/ml的离子霉素(Sigma-AldrichCo.)、0.03μg/ml的佛波醇豆蔻酸酯乙酸酯(PMA)(Sigma-Aldrich Co.)和1μg/ml的重组人B7Fc嵌合体(R&D systems)进行刺激，以及用0.02μm过滤的(Anotop,Whatman,England)病毒感染的PC3-MM2细胞的上清液进行处理。刺激Jurkat细胞48小时后，按照制造商的说明书，利用BD Cytometric Bead Array Human Soluble Protein FlexSet(Becton Dickinson分析生长培养基中的白细胞介素-2(IL-2)水平。使用10个病毒颗粒(VP)/细胞，且48小时后，收集上清液。小鼠抗-人CTLA-4(=CD152)mAb(BD PharmingenTM,Europe)用作阳性对照。将FCAP Array v.1.0.2(Soft Flow)软件用于分析。图7显示功能性测定的示意图。
抗-CTLA4mAb结合细胞表面CTLA-4，从而阻断与重组B7(rB7)的免疫抑制相互作用。该分析显示，与各自的同基因对照Ad5/3-Δ24或Ad5/3Luc1-感染的细胞相比，在用Ad5/3-Δ24aCTLA4和Ad5/3-aCTLA4感染的细胞的上清液中发现抗-CTLA4mAb活性(图2B)。重组抗-CTLA4mAb用作阳性对照，其比从Jurkat细胞收集的上清液效力更强。
为了进一步确认病毒表达的抗-CTLA4mAb阻断经由CTLA-4的信号转导的能力，进行功能丧失测定。在功能丧失测定中，如上所述活化Jurkat细胞，但将0.1μg/ml的重组人CTLA-4/Fc嵌合体(R&D Systems)(rCTLA-4)添加至离子霉素、PMA和重组B7。rCTLA-4在生长培养基中结合抗-CTLA4mAb，从而释放细胞表面上的CTLA-4，以与rB7相互作用并抑制T细胞活化(这可观察为IL-2产量的减少)。与各自的同基因未武装的对照Ad5/3-Δ24或Ad5/3Luc1相比，对于用Ad5/3-Δ24aCTLA4和Ad5/3-aCTLA4感染的细胞的上清液观察到抗-CTLA4mAb的功能的丧失(图2C)。此外，对于Ad5/3-Δ24aCTLA4感染的肿瘤细胞的上清液，观察到最高的功能丧失，甚至高于阳性对照。综上所述，该数据表明，Ad5/3-Δ24aCTLA4对癌细胞的感染导致抗人CTLA-4的功能性完全人mAb的高表达，这导致T细胞活性的减少，如通过IL-2测量的。
当考虑腺病毒E1和E3区域中的缺失(即，分别地，E1的Rb结合恒定区2中的24bp缺失(D24)和E3中的6.7K/gp19K缺失)时，抗-CTLA4表达盒的插入等同于正好在提出的与腺病毒包装和功能性相容的105%阈值之下的基因组大小的获得(Kennedy&Parks,Mol Ther2009;17:1664-6)。为了研究基因组大小的增加或抗-CTLA4的表达是否影响病毒复制，用Ad5/3-Δ24aCTLA4、Ad5/3-Δ24或PBS感染A549细胞，在不同的时间点通过qPCR测量上清液中和细胞中的病毒基因组(正向引物，5'-TCCGGTTTCTATGCCAAACCT-3'，SEQ ID NO:7；反向引物，5'-TCCTCCGGTGATAATGACAAGA-3'，SEQ ID NO:8；和探针5'FAM-TGATCGATCCACCCAGTGA-3'MGBNFQ,SEQ ID NO:9,SEQ ID NO:10,SEQ ID NO：11)(Cerullo等人,2010；Cancer Res;70:4297-309)。在病毒组之间未看到显著差异，这表明完全的复制能力。
实施例3.肿瘤细胞系和低代次肿瘤外植体的CTLA-4表达
由于已报导，几乎90%的肿瘤细胞系表达CTLA-4且抗-CTLA-4mAb可能具有直接的抗肿瘤活性(13)，因此，研究在肿瘤细胞系，包括使用的HNSCC低代次肿瘤外植体中，情况是否也如此。
在低代次肿瘤细胞培养物UT-SCC8或肿瘤细胞系A549、SKOV3-ip1和PC3-MM2中进行间接免疫荧光术，以分析表面CTLA-4。简而言之，在4℃下用小鼠抗人CTLA-4mAb(BD PharmingenTM,Europe)作为一抗温育细胞沉淀30分钟，然后在4℃下用Alexa 
Figure BDA00003144165700331
488驴抗-小鼠IgG(Invitrogen)作为二抗再温育30分钟。在LSR流式细胞仪(BDPharmingenTM,Europe)上测量荧光强度。计数至少40000个细胞/样品。使用Clontech Discovery Labware immunocytometry系统(BDPharmingenTM,Europe)和FlowJo7.6.1软件进行分析。
A549、SKOV3-ip1和PC3-MM2肿瘤细胞系分别呈现99.5%、96.6%和96.6%的CTLA-4表达，而UT-SCC8低代次肿瘤外植体呈现90.3%的CTLA-4表达(图2D)。
实施例4.构建的腺病毒的体外和体内溶瘤效力的评价
评价Ad5/3-Δ24aCTLA4对不同肿瘤细胞系和对HNSCC低代次肿瘤细胞培养物的溶瘤效力(或细胞杀伤)。
以1.5×104或1.0×104个细胞/孔将HNSCC低代次肿瘤细胞培养物或肿瘤细胞系PC3-MM2、SKOV3-ip1或A549接种在96孔板上。第二天，将病毒以不同的浓度(1、10、100、1000VP/细胞)稀释在具有2%FCS的DMEM中，在37℃下感染细胞1小时，洗涤细胞，在DMEM中的5%FCS中进行温育。按照制造商的方案(Cell Titer96Aqueous One SolutionCell Proliferation Assay Promega)测定细胞活力(cellviability)。结果示于图3中。
在所有细胞系中，Ad5/3-Δ24aCTLA4具有与阳性对照病毒Ad5/3-Δ24相似的溶瘤效力。此外，复制缺陷型Ad5/3-aCTLA4也具有抗肿瘤活性，因为肿瘤细胞表达CTLA4。
Ad5/3-Δ24aCTLA4的溶瘤作用对PC3-MM2、SKOV3-ip1、A549和UT-SCC8分别导致97.6%、78.2%、69.1%和57.3%的细胞杀伤(图3)。Ad5/3-Δ24aCTLA4及其在E3中不具有转基因的对应物(Ad5/3-Δ24)在任何分析的肿瘤细胞系中在细胞毒性上未显示显著的差异。
对于非复制的Ad5/3-aCTLA4，对于低病毒剂量未观察到细胞毒性(图3)。然而，在最高Ad5/3-aCTLA4剂量上观察到细胞毒性，对于PC3-MM2、SKOV3-ip1、A549和UT-SCC8的最大细胞杀伤率分别为96.2%、74.3%、49.1%和56.15%(图3)。该结果与先前证实的抗-CTLA-4与癌细胞表面上表达的CTLA的直接结合诱导细胞死亡一致(Contardi E等人,Int J Cancer2005;117:538-50)。
实施例5.Ad5/3-Δ24aCTLA4的抗肿瘤活性的评价
通过用表达抗-CTLA-4单克隆抗体的溶瘤腺病毒处理小鼠，在具有人前列腺癌异种移植物的免疫缺陷型裸小鼠中评价腺病毒的肿瘤生长抑制作用和细胞凋亡。
通过将5x106个PC3-MM2细胞注射入5-6周龄雌性NMRI/裸小鼠(Taconic,Ejby,Denmark)的胁腹来建立人前列腺外植体异种移植物。7天后，使用50μL体积，用1x108VP注射肿瘤(n=8/组，直径5-8mm)三次(第0、2和4天)，每隔一日一次，对照肿瘤仅用DMEM进行注射。公式(长度x宽度2x0.5)用于计算肿瘤体积。
第5天，通过免疫组织化学分析对肿瘤冰冻切片的抗-CTLA4(人IgG)的表达或细胞凋亡(活性胱天蛋白酶-3)进行染色。制备包埋在Tissue Tek OCT(Sakura,Torrance,CA,USA)中的冷冻肿瘤的4-5μm冰冻切片，将其在-20℃下在丙酮中固定10分钟。使用以1:200稀释的山羊抗-人IgG(重链和轻链)(AbD serotec,MorphoSys)和抗活性胱天蛋白酶-3的兔单克隆抗体作为一抗，在室温下进行1小时(BDPharmingen Tm,AB559565)。此外，按照制造商的说明书，使用LSAB2System-HRP试剂盒(K0673,DakoCytomation,Carpinteria,CA,USA)温育切片。使用3,3'-二氨基联苯胺(DAB,Sigma,St Louis,MO,USA)显现结合的抗体。最后，利用苏木精对切片进行复染，然后在乙醇中脱水，于二甲苯中透明化，用加拿大树胶封片。使用配备有OlympusDP50彩色照相机的Leica DM LB显微镜在40x放大倍数下捕捉代表性图像。
第7天，测量用Ad5/3-Δ24aCTLA4或Ad5/3-aCTLA4处理的小鼠的肿瘤和血浆中的人IgG水平(图4C)。在Ad5/3-Δ24aCTLA4处理的肿瘤中，与Ad5/3-aCTLA4处理的肿瘤相比，发现81倍的抗-CTLA4mAb(p<0.05)。此外，与相同动物的血浆相比，在用Ad5/3-Δ24aCTLA4处理的肿瘤中发现了43.3倍的抗-CTLA4mAb(p<0.05)。平均血浆浓度为392.6μg/g(SE312.0)，其低于报导的分别用伊匹木单抗(561μg/mL)和曲美木单抗(450μg/mL)处理的人中耐受的浓度(Weber JS,等人JClin Oncol2008;26:5950-6；Ribas A,等人J Clin Oncol2005;23:8968-77；Tarhini AA,Iqbal F,Oncol Targets Ther2010;3:15-25)(1mL的血浆重约1g)。在Ad5/3-Δ24aCTLA4肿瘤中，mAb的浓度为16977μg/g，因此，远高于血浆中的浓度。
人抗-CTLA-4mAb不结合小鼠CTLA-4，并且异种移植物实验需要T细胞缺陷型裸小鼠。因此，该模型仅测定溶瘤和促细胞凋亡作用。然而，在该侵袭性皮下前列腺癌异种移植物模型中，Ad5/3-Δ24aCTLA4相较于模拟物显示显著的抗肿瘤作用(p<0.01；图4A)。与模拟物相比较，其它处理的组未显示显著的作用。在Ad5/3-Δ24aCTLA4与Ad5/3-Δ24之间未观察到统计学差异(p=0.43)，从而确认了抗-CTLA4mAb表达不降低病毒的抗肿瘤效力的体外数据。
鉴于CTLA-4阻断性Ab可通过触发细胞凋亡来诱导肿瘤细胞的直接杀伤，因此，评价抗肿瘤效力是否与人抗-CTLA4mAb产生以及随后增加的细胞凋亡相关。在Ad5/3-Δ24aCTLA4和Ad5/3-aCTLA4处理的肿瘤中观察到人mAb染色，但对于Ad5/3-Δ24或Ad5/3-Luc1未观察到所述染色(图4B)。人mAb的表达似乎与增加的细胞凋亡相关(图4B)。因此，Ad5/3-Δ24aCTLA4处理的肿瘤表达抗-CTLA-4mAb，从而导致增强的细胞凋亡。
为了进一步评价Ad5/3-Δ24aCTLA4的溶瘤和促细胞凋亡作用，使用人肺癌异种移植物模型。该模型不考虑转基因的免疫调节功能。通过将5x106个A549细胞注射进入5-6周龄雌性NMRI裸小鼠的胁腹来建立人肺癌肿瘤。用Ad5/3-Δ24aCTLA4、重组抗-CTLA4蛋白、非复制对照病毒Ad5/3lucI或溶瘤Ad5/3-Δ24处理肿瘤，如上文中针对PC3-MM2肿瘤所描述的，测量所述肿瘤。当肿瘤达到15mm的平均直径时，杀死小鼠。在Ad5/3-Δ24aCTLA4与Ad5/3-Δ24之间未观察到统计学差异，这表明本发明的病毒的复制依赖性溶瘤效力与亲代病毒相似(图4D)。
实施例6.表达抗-CTLA4mAb的溶瘤腺病毒对癌症患者的T细胞的免疫调节
为了将临床前发现扩展至人，研究患有化学疗法难以治疗的晚期实体瘤的患者的PBMC。用0.3μg/ml的离子霉素(Sigma-Aldrich Co.)、0.03μg/ml的佛波醇豆蔻酸酯乙酸酯(PMA)(Sigma-Aldrich Co.)和1μg/ml的重组人B7Fc嵌合体(R&D systems)刺激癌症患者(chondroideal黑色素瘤患者I244、结肠癌患者C261、间皮瘤患者M158或宫颈癌患者X258)的PBMC，以模拟肿瘤诱导的免疫抑制。在刺激后，用0.02μm过滤的(Anotop,Whatman,England)经Ad5/3-Δ24aCTLA4、Ad5/3-Δ24、Ad5/3-aCTLA4或Ad5/3-Luc1感染的PC3-MM2细胞的上清液处理PBMC。
在功能丧失测定中，将0.1μg/ml的重组人CTLA-4/Fc嵌合体(R&DSystems)添加至离子霉素、PMA和重组B7。PBMC刺激后24小时，按照制造商的说明书，利用BD Cytometric Bead Array Human SolubleProtein Flex Set(Becton Dickinson)分析生长培养基中的白细胞介素-2(IL-2)或干扰素-γ(IFN-γ)水平。使用10个病毒颗粒(VP)/细胞，48小时后，收集上清液。小鼠抗-人CTLA-4(=CD152)mAb(BDPharmingenTM,Europe)用作阳性对照。将FCAP Array v.1.0.2(SoftFlow)软件用于分析。
在所有4个患者的样品中，来自表达抗-CTLA4mAb的溶瘤腺病毒的上清液能够增强T细胞活性，如通过IL-2和干扰素γ测量的(图5)。实验原理示于图7中。有趣地，虽然对于Jurkat细胞(其为永生化T细胞系)，重组mAb更有效，但对于患者样品，病毒上清液通常效力更强。在功能丧失测定(原理示于图7E-F中)中获得类似的数据(图8)。
实施例7.抗-CTLA4mAb对来自健康个体的PBMC的作用
还使用健康个体的PBMC进行实施例6中描述的实验。与癌症患者相反，来自Ad5/3-Δ24aCTLA4感染的细胞的上清液不增加IL-2或干扰素γ的产量。在功能丧失测定中也未看到显著的变化。然而，由于阳性对照重组mAb在两种情况中都是有效的(图6中增加的IL-2和干扰素γ以及图8中减少的IL-2和干扰素γ；在图6的供体1和供体2中，分别地，增加的IL-2，p<0.05和p=0.206，增加的INF-γ，p<0.05和p=0.120；在图8的供体1和供体2中，分别地，减少的IL-2，p<0.001和p<0.05；以及减少的INF-γ，p<0.001和p<0.05；与仅用rB7、rCTLA4、离子霉素和PMA处理的细胞相比较)，因此，推定这是剂量作用。这得到下述的支持：在功能丧失测定中对于Ad5/3-Δ24aCTLA4看到非显著趋势(图8)，和来自Ad5/3-aCTLA4感染的细胞的上清液产生具有显著作用的几种情况(图6和8)。然而，抗-CTLA-4mAb的作用在癌症患者中更明显，这可能是因为它们具有更高程度的正在进行的免疫抑制过程(归因于存在的晚期肿瘤)。
实施例8：能够复制的平台在增加抗-CTLA4mAb表达中的效用
分析能够复制的平台与复制缺陷型病毒相比，在增加抗-CTLA4mAb表达中的效用。将PC3-MM2细胞以20000个细胞/孔接种，且分别用Ad5/3-Δ24aCTLA4和Ad5/3-aCTLA4以10VP/细胞进行感染。感染后24小时、48小时和72小时，收集上清液，通过ELISA分析其中的人IgG的量。相较于复制缺陷型Ad5/3-aCTLA4，对于溶瘤病毒Ad5/3-Δ24aCTLA4观察到3倍的增加。Ad5/3-aCTLA4(图10)。
溶瘤平台的一个效用是，获得高水平的转基因表达。在早期基因表达后，病毒基因组扩增并且产生高达10000拷贝的病毒DNA。这导致多得多的可产生转基因的拷贝(图10)。
实施例9：具有增加的免疫应答的溶瘤腺病毒载体
为了进一步增强免疫应答，使用肺癌的异种移植物小鼠模型研究特征在于在病毒主链中存在toll样受体9(TLR-9)刺激性CpG分子的溶瘤腺病毒(图1)。将A549细胞植入NMRI裸小鼠(5只小鼠/组，每小鼠两个肿瘤)，然后用1x108VP的富含CpG的溶瘤腺病毒Ad5-Δ24CpG、包含Δ24缺失的溶瘤腺病毒、溶瘤腺病毒+含CpG重组寡核苷酸(ODN2395,InvivoGen,USA)进行处理。如早前所述，以2天的间隔测量肿瘤生长，进行12天。富含CpG的病毒Ad5-Δ24CpG在介导抗肿瘤免疫中最有效(图11)。
用经UV灭活的病毒刺激从相同小鼠收获的脾细胞，将所述细胞以1:1和10:1的比率与A549细胞共培养。在第72小时进行MTS细胞杀伤测定。给出了在指定的时间点上仍然活着的A549细胞的百分比。图12A显示的数据证明，CpG修饰的病毒能够刺激抗原呈递细胞，这导致增强的抗肿瘤免疫应答。该应答是如此之强，以至于甚至在缺乏T细胞的裸小鼠中也可看见。因此，在具有免疫能力的动物和人中可预期甚至更好的数据。在用aCTLA-4同时下调抑制信号的情况下，TLR-9刺激(其诱导抗肿瘤免疫)的效用可能是最显著的。
由病毒产生的抗-CTLA4的表达可增强抗病毒免疫，从而抵消病毒疗法。为此，评价小鼠抗-CTLA4与腺病毒一起对具有免疫能力的小鼠脾细胞的作用。用PBS、单独的Ad5/3-Δ24、组合的Ad5/3-Δ24与小鼠aCTLA4抗体或用单独的小鼠aCTLA4抗体处理具有免疫能力的C57Bl/6小鼠(n=5)3次(图12B)。两周后，收集脾，通过干扰素γELISPOT(ELISPOTPRO，用于人IFN-γ，3420-2APT-10,MABTECH AB,Sweden)分析脾细胞。利用UV灭活的Ad5/3嵌合病毒或Ad5肽混合物进行刺激。在组之间未观察到显著的差异，这表明小鼠抗-CTLA4抗体不影响由病毒引起的免疫。
实施例10.特征在于单克隆抗CTLA-4抗体的溶瘤腺病毒载体在人癌症患者中的安全性和效力
I.患者
在Finnish Medicines Association(FIMEA)批准的AdvancedTherapy Access Program(ATAP)中招募了患有晚期和难治性实体瘤的患者。
在患有标准疗法难以治疗的晚期实体瘤的患者中选择患者。选择标准是常规疗法难以治疗的实体瘤、WHO表现评分为3或更低，以及无主要器官功能缺陷。淘汰标准是器官移植、HIV、严重心血管病、代谢病或肺病或阻碍溶瘤病毒治疗的其它症状、发现或疾病。获得书面知情同意，并遵循Good Clinical Practice和Declaration of Helsinki，施用治疗。适当时，瘤内、静脉内或腹膜内提供治疗。
II.利用编码aCTLA-4MAb的腺病毒载体的治疗
溶瘤腺病毒根据临床等级而产生，并开始患者的治疗。
通过瘤内注射提供治疗。治疗的总数是每3周3次。基于本发明人的关于其它溶瘤病毒的先前数据选择病毒剂量。然而，可根据情况使用不同的施用方案。例如，对于系列治疗的第一轮，患者瘤内或腹膜内接受剂量的一部分，例如剂量的4/5或2/5，且静脉内施用剩余剂量。
在适当的条件下在施用时将病毒稀释在无菌盐水溶液中。在病毒施用后，在医院监测所有患者过夜，随后在接下来的4周作为门诊病人进行监测。在每一次就诊时进行体格评价和医疗史记录，跟踪临床相关实验室值。
按照Common Terminology for Adverse Events v3.0(CTCAE)记录治疗的副作用，并且对其进行评分。由于许多癌症患者具有因疾病而产生的症状，因此，如果它们不恶化，则不对预先存在的症状进行评分。然而，如果症状变得更严重，例如治疗前的等级1在治疗后变成等级2，则将其评分为等级2。
利用造影剂增强的计算机断层摄影术(CT)扫描评价肿瘤尺寸。获得最大肿瘤直径。将实体瘤的应答评价标准(RECIST1.1)用于总体疾病，包括注射的和非注射的损伤。这些标准是：部分应答PR(肿瘤直径之和的大于30%的减小)、稳定的疾病SD(无减小/增加)、进行性疾病PD(大于20%的增加)。未满足PR的明显的肿瘤减小被评分为最小应答(minor responses，MR)。当在基线上升高时，还评价血清肿瘤标志，并且使用相同的百分比。
分析患者血清样品的免疫学和病毒学参数，包括随时间过去血液中的病毒拷贝数、抗病毒中和抗体的诱导、抗病毒和抗肿瘤T细胞的变化、其它免疫细胞类型和抗肿瘤抗体的变化。另外，按照CommonTerminology for Adverse Events v3.0(CTCAE)对不良事件评级，测量中和抗体滴度，并按照计算机断层摄影术(CT)的RECIST标准(Therasse P等人2000,J Natl Cancer Inst92,205-16)或正电子发射断层成像计算机断层摄影术(PET-CT)的PERCIST标准(Wahl等人2009J Nucl Med50Suppl1:122S-50S)评价效力。所有患者在治疗前已具有进行性肿瘤，并且处于疾病的不同分期。
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Claims (35)

1.一种溶瘤腺病毒载体，其包含
1)包含衣壳修饰的腺病毒血清型5型(Ad5)核酸主链，
2)E1的Rb结合恒定区2中的24bp缺失(D24)；和
3)替代E3区域中的缺失的腺病毒基因gp19k/6.7K的、编码特异于CTLA-4的完全人单克隆抗体(aCTLA MAb)的核酸序列。
2.权利要求1的溶瘤腺病毒载体，其还包含选自E2、E4和晚期区域的一个或多个区域。
3.权利要求1或2的溶瘤腺病毒载体，其包含下列区域：左ITR、部分E1、pIX、pIVa2、E2、VA1、VA2、L1、L2、L3、L4、部分E3、L5、E4和右ITR。
4.权利要求3的溶瘤腺病毒载体，其中所述区域按5'至3'的方向依次排列。
5.前述权利要求的任一项的溶瘤腺病毒载体，其中野生型区域位于E1区域的上游。
6.前述权利要求的任一项的溶瘤腺病毒载体，其中所述E1区域包含病毒包装信号。
7.前述权利要求的任一项的溶瘤腺病毒载体，其中编码aCTLAMAb的核酸序列处于病毒E3启动子的控制之下。
8.前述权利要求的任一项的溶瘤腺病毒载体，其在E1区域上游还包含编码肿瘤特异性人端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子或E2F启动子的核酸序列。
9.前述权利要求的任一项的溶瘤腺病毒载体，其在病毒主链中还包含CpG位点。
10.权利要求的溶瘤腺病毒载体，其中所述CpG位点在E3区域中。
11.前述权利要求的任一项的溶瘤腺病毒载体，其中E4区域是野生型的。
12.前述权利要求的任一项的溶瘤腺病毒载体，其中所述衣壳修饰是Ad5/3嵌合体、整联蛋白结合(RGD)区域和/或硫酸肝素结合多聚赖氨酸修饰至纤突的插入。
13.权利要求12的溶瘤腺病毒载体，其中所述衣壳修饰是Ad5/3嵌合体。
14.权利要求12的溶瘤腺病毒载体，其中所述衣壳修饰是RGD-4C修饰。
15.前述权利要求的任一项的溶瘤腺病毒载体，其包含至少一个表达盒。
16.前述权利要求的任一项的溶瘤腺病毒载体，其仅包含一个表达盒。
17.前述权利要求的任一项的溶瘤腺病毒载体，其中所述载体能够在Rb/p16-途径具有缺陷的细胞中选择性复制。
18.前述权利要求的任一项的溶瘤腺病毒载体，其中所述载体能够在表达端粒酶的细胞中选择性复制。
19.一种细胞，其包含权利要求1-18的任一项的腺病毒载体。
20.一种药物组合物，其包含权利要求1-18任一项的腺病毒载体。
21.前述权利要求的任一项的溶瘤腺病毒载体或药物组合物，其用作原位癌症疫苗。
22.权利要求1-18的任一项的腺病毒载体，其用于治疗受试者的癌症。
23.一种治疗受试者的癌症的方法，其中所述方法包括，给受试者施用权利要求1-18或20的任一项的载体或药物组合物。
24.权利要求21-23的腺病毒载体或方法，其中所述癌症选自：鼻咽癌、滑膜癌、肝细胞癌、肾癌、结缔组织的癌症、黑素瘤、肺癌、肠癌、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、喉癌、口癌、肝癌、骨癌、胰腺癌、绒毛膜癌、胃泌素瘤、嗜铬细胞瘤、催乳素瘤、T细胞白血病/淋巴瘤、神经瘤、VHL病、卓-艾综合征、肾上腺癌、肛门癌、胆管癌、膀胱癌、输尿管癌、少突胶质细胞瘤、神经母细胞瘤、脑膜瘤、脊髓瘤、骨软骨瘤、软骨肉瘤、尤文氏肉瘤、原发部位不明癌症、类癌、胃肠道类癌、纤维肉瘤、乳腺癌、派杰氏病、宫颈癌、食道癌、胆囊癌、头部癌症、眼癌、颈癌、肾癌、肾母细胞瘤、卡波西肉瘤、前列腺癌、睾丸癌、霍奇金氏病、非霍奇金淋巴瘤、皮肤癌、间皮瘤、多发性骨髓瘤、卵巢癌、内分泌胰腺癌、胰高血糖素瘤、胰腺癌、甲状旁腺癌、阴茎癌、垂体癌、软组织肉瘤、视网膜母细胞瘤、小肠癌、胃癌、胸腺癌、甲状腺癌、滋养层癌症、葡萄胎、子宫癌、子宫内膜癌、阴道癌、外阴癌、听神经瘤、蕈样肉芽肿病、胰岛素瘤、类癌综合征、生长抑素瘤、牙龈癌、心脏癌症、唇癌、脑膜癌、口腔癌、神经癌、腭癌、腮腺癌、腹膜癌、咽癌、胸膜癌、涎腺癌、舌癌、扁桃体癌。
25.权利要求21-24的腺病毒载体或方法，其中所述受试者是人或动物。
26.权利要求21-25的任一项的腺病毒载体或方法，其中通过瘤内、肌内、动脉内、静脉内、胸膜内、血管内、腔内或腹膜注射或口服施用来进行施用。
27.权利要求21-26的任一项的腺病毒载体或方法，其中在治疗期间施用所述溶瘤腺病毒载体或药物组合物数次。
28.权利要求21-27的任一项的腺病毒载体或方法，其中将与早期治疗的载体相比，具有不同的衣壳纤维结的溶瘤腺病毒载体施用给受试者。
29.权利要求21-28的任一项的腺病毒载体或方法，其中所述方法还包括，给受试者施用同步放射疗法或同步化学疗法或其它同步癌症疗法。
30.权利要求21-29的任一项的腺病毒载体或方法，其中所述方法还包括，在受试者中给受试者施用辅助剂，其选自维拉帕米或另一种钙通道阻断剂；自噬诱导剂；替莫唑胺；能够下调调节性T细胞的物质；环磷酰胺及其任何组合。
31.权利要求21-29的任一项的腺病毒载体或方法，其中所述方法还包括，施用化学疗法或抗-CD20疗法或用于阻断中和抗体的其它方法。
32.一种在细胞中产生特异于CTLA-4的完全人单克隆抗体的方法，其中所述方法包括：
a)将包含权利要求1-18任一项的溶瘤腺病毒载体的媒介物运送至细胞，和
b)在细胞中表达所述载体的特异于CTLA-4的完全人单克隆抗体。
33.一种增强受试者的肿瘤特异性免疫应答的方法，其中所述方法包括：
a)将包含权利要求1-15任一项的溶瘤腺病毒载体的媒介物运送至靶细胞或组织，
b)在细胞中表达所述载体的特异于CTLA-4的完全人单克隆抗体，和
c)通过使用溶瘤平台，增加表达的抗-CTLA4mAb的量，
d)通过使用溶瘤平台，增加抗-CTLA4mAb的肿瘤对血浆比。
34.权利要求1-18任一项的溶瘤腺病毒载体的用途，其用于在细胞中产生抗-CTLA4mAb。
35.权利要求1-18的任一项的溶瘤腺病毒载体，其用于产生抗CTLA4的完全人单克隆抗体。
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