JPWO2006098463A1 - ポリ核酸結合物質 - Google Patents
ポリ核酸結合物質 Download PDFInfo
- Publication number
- JPWO2006098463A1 JPWO2006098463A1 JP2007508240A JP2007508240A JPWO2006098463A1 JP WO2006098463 A1 JPWO2006098463 A1 JP WO2006098463A1 JP 2007508240 A JP2007508240 A JP 2007508240A JP 2007508240 A JP2007508240 A JP 2007508240A JP WO2006098463 A1 JPWO2006098463 A1 JP WO2006098463A1
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- peptide
- amino acid
- polynucleic acid
- binding substance
- present
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/001—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof by chemical synthesis
- C07K14/003—Peptide-nucleic acids (PNAs)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
- A61K47/542—Carboxylic acids, e.g. a fatty acid or an amino acid
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
- A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
- A61K47/645—Polycationic or polyanionic oligopeptides, polypeptides or polyamino acids, e.g. polylysine, polyarginine, polyglutamic acid or peptide TAT
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
- A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Virology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- AIDS & HIV (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Oncology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
ポリ核酸に結合する物質であって、求電子基を有する第１部分と、ペプチド、化合物および核酸からなる群から選択される１種以上を有する第２部分とを含むことを特徴とするポリ核酸結合物質。
Description
本発明は、ポリ核酸結合物質に関する。詳しくは、本発明は、求電子基を有する第１部分と、ペプチド、化合物および核酸からなる群から選択される１種以上を有する第２部分とを含むことを特徴とするポリ核酸結合物質に関する。
ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）は、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の原因ウイルスである。このウイルスにはトランス活性化領域（ＴＡＲ）及びＲｅｖ応答性エレメント（ＲＲＥ）が存在し、これらの領域又はエレメントは、スプライスされていない、又は部分的にスプライスされたＨＩＶ ｍＲＮＡイントロンに見出される。
ＲＲＥ及びＴＡＲをコードするＲＮＡは、ＨＩＶが複製する間、特定のＨＩＶタンパク質と相互作用する。すなわち、ＨＩＶタンパク質ＲｅｖはＲＲＥを認識するとＲＲＥに結合し、Ｒｅｖ／ＲＲＥ複合体が形成される。Ｒｅｖ／ＲＲＥ複合体の形成は、ＨＩＶタンパク質Ｒｅｖが当該複合体を介してｍＲＮＡを刺激するプロセスに関与し、また、Ｒｅｖの往復（Ｓｈｕｔｔｌｉｎｇ）に必須である核外輸送シグナル伝達に関与する。
このように、Ｒｅｖ／ＲＲＥ複合体の相互作用はウイルスが増殖する場合に必須であるため、この過程の機能を抑制することは、後天性免疫不全症（ＡＩＤＳ）の進行の抑制に大きく寄与する。
Ｒｅｖを標的にした治療は、アンチセンスやリボザイムを用いて試みられていた。更にＲＲＥデコイＲＮＡを用いた遺伝子治療も行なわれている。
発明者らは、以前よりｃＤＮＡライブラリー又はペプチドライブラリーからＲＮＡ結合タンパク質をスクリーニングする方法を開発し、新規物質の同定を行ってきた（特表平１１−５１１６５３号公報、Ｈａｄａｓ Ｐｅｌｅｄ−Ｚｅｈａｖｉ，ｅｔ ａｌ．，ＲＮＡ ９，２５２−２６１，２００３）。そして、これらの方法において得られたポリペプチドは、標的のＲＮＡとの結合活性を有し、特にＨＩＶのＲＲＥに結合することによってＨＩＶの増殖を阻害する能力を有するものである（国際公開第２００５／００７６８６号パンフレット）。しかし、ＨＩＶの治療に得られたポリペプチドをより効果的に用いるために、そのＲＮＡ結合活性や薬理効果をさらに改良することが望まれている。
ＲＲＥ及びＴＡＲをコードするＲＮＡは、ＨＩＶが複製する間、特定のＨＩＶタンパク質と相互作用する。すなわち、ＨＩＶタンパク質ＲｅｖはＲＲＥを認識するとＲＲＥに結合し、Ｒｅｖ／ＲＲＥ複合体が形成される。Ｒｅｖ／ＲＲＥ複合体の形成は、ＨＩＶタンパク質Ｒｅｖが当該複合体を介してｍＲＮＡを刺激するプロセスに関与し、また、Ｒｅｖの往復（Ｓｈｕｔｔｌｉｎｇ）に必須である核外輸送シグナル伝達に関与する。
このように、Ｒｅｖ／ＲＲＥ複合体の相互作用はウイルスが増殖する場合に必須であるため、この過程の機能を抑制することは、後天性免疫不全症（ＡＩＤＳ）の進行の抑制に大きく寄与する。
Ｒｅｖを標的にした治療は、アンチセンスやリボザイムを用いて試みられていた。更にＲＲＥデコイＲＮＡを用いた遺伝子治療も行なわれている。
発明者らは、以前よりｃＤＮＡライブラリー又はペプチドライブラリーからＲＮＡ結合タンパク質をスクリーニングする方法を開発し、新規物質の同定を行ってきた（特表平１１−５１１６５３号公報、Ｈａｄａｓ Ｐｅｌｅｄ−Ｚｅｈａｖｉ，ｅｔ ａｌ．，ＲＮＡ ９，２５２−２６１，２００３）。そして、これらの方法において得られたポリペプチドは、標的のＲＮＡとの結合活性を有し、特にＨＩＶのＲＲＥに結合することによってＨＩＶの増殖を阻害する能力を有するものである（国際公開第２００５／００７６８６号パンフレット）。しかし、ＨＩＶの治療に得られたポリペプチドをより効果的に用いるために、そのＲＮＡ結合活性や薬理効果をさらに改良することが望まれている。
本発明は、求電子基を有する第１部分と、ペプチド、化合物および核酸からなる群から選択される１種以上を有する第２部分とを含むポリ核酸結合物質、好ましくは求電子基とペプチドとを含むＲＮＡ結合ペプチドを提供することを目的とする。さらに、本発明は、ポリ核酸（好ましくはＲＮＡ）結合活性を上昇させることにより、ＨＩＶの増殖を抑制することを目的とする。
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、求電子基をＲＮＡ結合ペプチドに付加すると、ペプチドの薬理作用が上昇することを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１）ポリ核酸に結合する物質であって、求電子基を有する第１部分と、ペプチド、化合物および核酸からなる群から選択される１種以上を有する第２部分とを含むことを特徴とするポリ核酸結合物質。
（２）ポリ核酸がＲＮＡである、（１）記載のポリ核酸結合物質。
（３）ＲＮＡがＲＲＥ配列部位を含むものである、（２）記載のポリ核酸結合物質。
（４）第２部分がペプチドを含む、（１）記載のポリ核酸結合物質。
（５）ペプチドが、次式Ｉ：
Ｒ−Ｑ−Ｒ−Ｘ （Ｉ）
（ＸはＲ以外のアミノ酸残基を表す。）
で示されるアミノ酸配列を含むペプチド、その誘導体又はこれらの塩である、（４）記載のポリ核酸結合物質。
（６）ペプチドが、以下の（ａ）又は（ｂ）のペプチド、その誘導体又はこれらの塩である、（４）記載のポリ核酸結合物質。
（ａ）次式Ｉ：
Ｒ−Ｑ−Ｒ−Ｘ （Ｉ）
（ＸはＲ以外のアミノ酸残基を表す。）
で示されるアミノ酸配列を含む１２〜２３残基の長さのアミノ酸配列を有するペプチド
（ｂ）次式Ｉ：
Ｒ−Ｑ−Ｒ−Ｘ （Ｉ）
（ＸはＲ以外のアミノ酸残基を表す。）
で示されるアミノ酸配列を含む１２〜２３残基の長さのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、ＲＮＡ結合活性を有するペプチド
（７）Ｒが少なくとも９〜１１残基含まれることを特徴とする、（５）又は（６）記載のポリ核酸結合物質。
（８）ペプチドが、以下の（ａ）又は（ｂ）のペプチド、その誘導体又はこれらの塩である、（４）記載のポリ核酸結合物質。
（ａ）配列番号１〜２７で表されるアミノ酸配列からなるペプチド
（ｂ）配列番号１〜２７で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＲＮＡ結合活性を有するペプチド
（９）求電子基が下記式で表される基である、（１）記載のポリ核酸結合物質。
（式中、Ｚはハロゲン原子を表す。）
（１０）第１部分と第２部分との間に、スペーサーを有することを特徴とする、（１）記載のポリ核酸結合物質。
（１１）（１）〜（１０）のいずれかに記載のポリ核酸結合物質を含有してなる医薬組成物。
（１２）ＨＩＶの増殖抑制剤である、（１１）記載の医薬組成物。
（１３）ＨＩＶの感染予防剤である、（１１）記載の医薬組成物。
（１４）ＡＩＤＳの予防剤又は治療剤である、（１１）記載の医薬組成物。
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、求電子基をＲＮＡ結合ペプチドに付加すると、ペプチドの薬理作用が上昇することを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１）ポリ核酸に結合する物質であって、求電子基を有する第１部分と、ペプチド、化合物および核酸からなる群から選択される１種以上を有する第２部分とを含むことを特徴とするポリ核酸結合物質。
（２）ポリ核酸がＲＮＡである、（１）記載のポリ核酸結合物質。
（３）ＲＮＡがＲＲＥ配列部位を含むものである、（２）記載のポリ核酸結合物質。
（４）第２部分がペプチドを含む、（１）記載のポリ核酸結合物質。
（５）ペプチドが、次式Ｉ：
Ｒ−Ｑ−Ｒ−Ｘ （Ｉ）
（ＸはＲ以外のアミノ酸残基を表す。）
で示されるアミノ酸配列を含むペプチド、その誘導体又はこれらの塩である、（４）記載のポリ核酸結合物質。
（６）ペプチドが、以下の（ａ）又は（ｂ）のペプチド、その誘導体又はこれらの塩である、（４）記載のポリ核酸結合物質。
（ａ）次式Ｉ：
Ｒ−Ｑ−Ｒ−Ｘ （Ｉ）
（ＸはＲ以外のアミノ酸残基を表す。）
で示されるアミノ酸配列を含む１２〜２３残基の長さのアミノ酸配列を有するペプチド
（ｂ）次式Ｉ：
Ｒ−Ｑ−Ｒ−Ｘ （Ｉ）
（ＸはＲ以外のアミノ酸残基を表す。）
で示されるアミノ酸配列を含む１２〜２３残基の長さのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、ＲＮＡ結合活性を有するペプチド
（７）Ｒが少なくとも９〜１１残基含まれることを特徴とする、（５）又は（６）記載のポリ核酸結合物質。
（８）ペプチドが、以下の（ａ）又は（ｂ）のペプチド、その誘導体又はこれらの塩である、（４）記載のポリ核酸結合物質。
（ａ）配列番号１〜２７で表されるアミノ酸配列からなるペプチド
（ｂ）配列番号１〜２７で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＲＮＡ結合活性を有するペプチド
（９）求電子基が下記式で表される基である、（１）記載のポリ核酸結合物質。
（１０）第１部分と第２部分との間に、スペーサーを有することを特徴とする、（１）記載のポリ核酸結合物質。
（１１）（１）〜（１０）のいずれかに記載のポリ核酸結合物質を含有してなる医薬組成物。
（１２）ＨＩＶの増殖抑制剤である、（１１）記載の医薬組成物。
（１３）ＨＩＶの感染予防剤である、（１１）記載の医薬組成物。
（１４）ＡＩＤＳの予防剤又は治療剤である、（１１）記載の医薬組成物。
以下、本発明を詳細に説明する。
なお、本明細書において引用した文献、および公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込むものとする。
１．本発明の概要
本発明は、求電子基を有する第１部分と、ペプチド、化合物および核酸からなる群から選択される１種以上を有する第２部分とを含むことを特徴とする、ポリ核酸結合物質に関するものである。
本明細書において、「ポリ核酸結合物質」とは、ポリ核酸に結合することのできる物質を意味する。本発明のポリ核酸結合物質は、ポリ核酸に結合する活性を有すればよく、ポリ核酸への結合の強さによって限定されるものではない。
本明細書において、「ポリ核酸」とは、鎖状に複数個つながった核酸を意味する。
本明細書において、「核酸」は、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ウイルスＲＮＡ、デコイＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、ｓｉＲＮＡなどの天然および人工ＲＮＡ（ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）、ｃＤＮＡ、ｇｅｎｏｍｅ ＤＮＡ、ｓｓＤＮＡ（ｓｉｎｇｌｅ ｓｔｒａｎｄ ＤＮＡ）、ｄｓＤＮＡ（ｄｏｕｂｌｅ ｓｔｒａｎｄ ＤＮＡ）などのＤＮＡ（ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）、およびＰＮＡ（ｐｅｐｔｉｄｅ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）が含まれるが、好ましくはＲＮＡである。
上記のウイルスには、Ｒｅｖ応答性エレメント（ＲＲＥ）配列部位またはその類似構造を有するレトロウイルスであるＨＩＶ、ＦＩＶ、ＳＩＶ、ＢＩＶ、ＨＴＬＶなどのウイルスを挙げることができる。
本発明において第２部分は、好ましくはペプチドを含む。
２．第１部分
（１）求電子基
本発明において、第１部分は求電子基を有する。
本明細書において、「求電子基」とは、電子が不足している反応種（例えば、陽イオン、酸、酸化剤）を意味する。求電子基は、相手から電子をとって酸化するか、相手から電子をとって配位結合をつくるかの２通りの反応をする性質を有する。
本発明の第１部分に含まれる求電子基は、求電子基として機能する限り、どのような基であってもよい。本発明の第１部分に含まれる求電子基は、例えば、下記式、
（式中、Ｚはハロゲン原子を意味する。）
（本発明において、以下、「ＺＡｃ−」ともいう。）で表される基を挙げることができる。
本明細書において、「ハロゲン原子」は、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子であることが好ましく、より好ましくは塩素原子である。
（２）スペーサー
本発明において、第１部分と第２部分との間に、スペーサーを含有させることもできる。スペーサーを含有させることによって、ポリ核酸と第２部分との結合を維持したまま、適切な距離関係に存在する求核原子団を反応ターゲットとすることができる。
本発明において、スペーサーは、例えばＧＡＢＡ（γ−アミノ酪酸）、ε−アミノカプロン酸、または５−アミノ−３−オキソペンタン酸等のエーテル系アミノアルカン酸を挙げることができる。また、分岐して複数のアミノ基を有するカルボン酸も使用できる。これらスペーサーは、スペーサー中のアミノ基の位置で第１部分と結合することができ、また、スペーサー中のカルボキシル基の位置で第２部分と結合することができる。
この場合、以下のようにＧＡＢＡのＮ末端側を求電子基（下記の例ではＣｌＡｃ−）に結合させ、Ｃ末端側を第２部分（図示せず）に結合させることが好ましい。
ＧＡＢＡをスペーサーに用いる場合、第１部分は、ＧＡＢＡのアミノ基とクロロ酢酸のカルボキシル基とを結合させることにより、導入することができる。
（３）第２部分との結合
本発明において、第１部分と第２部分とは、共有結合であるアミド結合で結合しており、これらは公知の方法で反応させることができる。
また、本発明において、１つの第２部分に複数の第１部分および／またはスペーサーが結合していてもよい。
第２部分がペプチドの場合は、第１部分またはスペーサーはペプチドのＮ末端側および／またはＣ末端側に結合することができる。
第１部分にカルボニル基が含まれる場合は、当該カルボニル基とペプチドまたはスペーサーのＮ末端とは、アミド結合により結合する。例えばＺが塩素原子である場合（ＣｌＡｃ−）、第１部分が付加されたペプチドまたはスペーサーは、側鎖官能基を保護したペプチドまたはスペーサーと、クロロ酢酸とを直接縮合剤とともに反応させるか、一旦縮合剤でクロロ酢酸をクロロ酢酸無水物に変換後反応させるか、クロロ酢酸パラニトロフェニルエステル等の活性エステルを用いて反応させるか、またはクロロ酢酸クロリドを塩基とともに反応させることにより得ることができる。また例えば、第１部分またはスペーサーがカルボニル基を有する場合は、第１部分またはスペーサーのカルボニル基に続いて、ペプチドを順次合成していくこともできる。
あるいは、第１部分にアミノ基が含まれる場合は、当該アミノ基とペプチドまたはスペーサーのＣ末端とが結合する場合も、アミド結合により結合する。アミド結合は、当業者であれば公知の方法により行うことができる。
また、第２部分が化合物の場合は、第１部分が付加された化合物またはスペーサーは、例えばＺが塩素原子である場合、付加前の化合物または化合物に含まれるスペーサーと、縮合剤でクロロ酢酸無水物に変換後反応させるか、クロロ酢酸パラニトロフェニルエステル等の活性エステルを用いて反応させるか、またはクロロ酢酸クロリドを塩基とともに反応させることにより得ることができる。
さらに、第２部分が核酸の場合は、求電子基またはスペーサーと核酸とは、エステル化反応で結合することができる。
第２部分のポリ核酸への結合活性は、例えば、ＲＮＡ結合ペプチドの場合は、ＨＩＶ感染細胞の生存細胞数を測定することで評価することができる（実施例１）。また、例えば、上記のＲＮＡ結合ペプチドとＲＮＡとの結合活性は、下記のＫＡＮシステムにおけるレポーター遺伝子の発現量を基に、既知のペプチドとの相対的定量化によって評価することができる。
本発明のポリ核酸結合物質の好ましい態様は、例えば、
ＣｌＡｃ−ＧＡＢＡ−ＲＲＤＲＲＲＬＲＱＲＡＲＲＲＡＡＡＡ（配列番号２９）
である。
３．第２部分
本発明において、第２部分は、ペプチド、化合物、および核酸からなる群から選択される異種以上を有する。本発明において、第２部分は好ましくはペプチドを含む。
（１）ペプチド
本発明において第２部分に含まれるペプチド（ポリペプチドを含む）は、標的とするポリ核酸に結合することのできるペプチドであればどのようなペプチドであってもよい。本発明の第２部分に含まれるペプチドは、好ましくはＲＮＡに結合する活性を有するペプチド、すなわちＲＮＡ結合ペプチドである。
（ｉ）ＲＮＡ結合ペプチド
本発明において、ＲＮＡ結合ペプチドは、例えば、アルギニンに富む１５個のアミノ酸配列を骨格としつつ２３個のアミノ酸配列を含み、かつＨＩＶのＲｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）に結合する活性を有するペプチドであり、当該ペプチドをＨＩＶに接触させることによってＨＩＶの増殖を抑制させることができる。
本発明の第２部分に含まれるペプチドは、少なくとも次式Ｉ：
Ｒ−Ｑ−Ｒ−Ｘ （Ｉ）
（ＸはＲ以外のアミノ酸残基を表す。）
で示されるアミノ酸配列を含むペプチド、その誘導体又はこれらの塩である。
上記式において、Ｒ及びＱはアミノ酸の１文字表記をしたものであり、それぞれアルギニン（Ａｒｇ）、グルタミン（Ｇｌｎ）を表す（他のアミノ酸についても同様）。Ｘは、アルギニンを除く他のアミノ酸残基を表す。
本発明の第２部分に含まれるペプチドは、上記式のアミノ酸配列を含み、好ましくは１２〜２３個のアミノ酸配列を有する。そして、その中のいくつかのアミノ酸はアルギニンに富むドメイン（「アルギニンリッチドメイン」という）を形成する。例えば、２３アミノ酸残基を有するペプチドは、その中の５番目から１９番目がアルギニンリッチドメインを形成する。本発明の第２部分に含まれるペプチドは、アルギニンを好ましくは９〜１１残基含むものである。いくつかのＲＮＡ結合タンパク質のアルギニンリッチドメインは、それらの類似のＲＮＡと高親和性及び特異性をもって結合することが示されている。そして、配列がシンプルであること、及び構造が多様であることから、アルギニンリッチドメインは新規ＲＮＡ結合ペプチドを同定するために有効なツールとして利用することができる。本発明の第２部分に含まれるペプチドは、極めて多数の組合せをもつペプチドライブラリーから、カナマイシン・アンチターミネーション・システム（「ＫＡＮシステム」という）と呼ばれるスクリーニング手法により得ることができる。
ＫＡＮシステムとは、細胞内でカナマイシン耐性遺伝子の機能を用いて、ＲＮＡとペプチドの相互作用を検出するアッセイを意味する（Ｈａｄａｓ Ｐｅｌｅｄ−Ｚｅｈａｖｉ，ｅｔ ａｌ．，ＲＮＡ ９，２５２−２６１，２００３）。
具体的には、標的ＲＮＡに対応するオリゴＤＮＡ（ここで、「対応するオリゴＤＮＡ」とは、標的配列と同一の配列を有するように設計されたオリゴＤＮＡを意味する）と、レポーター遺伝子としてカナマイシン耐性遺伝子とを組み込んだＮレポータープラスミド、及びペプチドをコードするオリゴヌクレオチドを組み込んだＮ発現プラスミドを細胞に導入する。細胞内でＲＮＡとペプチドが相互作用するとカナマイシン耐性遺伝子が転写翻訳され、標的ＲＮＡとペプチドとが接触したシグナルとして、細胞はカナマイシン耐性を獲得する。細胞には、酵母や大腸菌などを用いることができる。大腸菌を用いた場合、カナマイシンを含んだ培地で生存した大腸菌には、ＲＮＡと相互作用するペプチドが発現していることになる。
また、上記ＫＡＮシステムにより得られた本発明の第２部分に含まれるペプチドのアミノ酸配列を以下の配列番号１〜２７に例示するが、本発明の第２部分に含まれるペプチドがＲＮＡ結合活性（ＨＩＶのＲＲＥに結合する活性）を有する限り、当該アミノ酸配列の１個又は数個のアミノ酸に欠失、置換、付加等の変異が生じてもよい（これらを本発明において「変異体」という）。例えば、配列番号１〜２７で表わされるアミノ酸配列の１個又は数個、好ましくは１〜９個、さらに好ましくは１〜５個のアミノ酸が欠失してもよく、配列番号１〜２７で表わされるアミノ酸配列に１個又は数個、好ましくは１〜９個、さらに好ましくは１〜５個のアミノ酸が付加してもよく、あるいは、配列番号１〜２７で表わされるアミノ酸配列の１個又は数個、好ましくは１〜９個、さらに好ましくは１〜５個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換してもよい。
１７：ＭＡＳＡＲＲＲＲＲＲＲＲＲＱＲＡＲＲＲＡＡＡＡ（配列番号１）
３９：ＭＡＳＲＤＲＴＲＲＲＲＴＲＱＲＳＲＲＲＡＡＡＡ（配列番号２）
４２：ＭＡＮＤＲＲＲＲＲＲＴＲＱＲＤＲＲＲＮＡＡＡＡ（配列番号３）
１１：ＭＡＳＬＲＲＮＲＲＲＳＲＱＲＡＲＲＲＥＡＡＡＡ（配列番号４）
２６：ＭＡＬＬＰＲＲＥＲＲＲＲＲＱＲＥＲＲＲＡＡＡＡ（配列番号５）
８ ：ＭＡＶＡＴＲＲＥＲＲＲＲＲＱＲＴＲＲＲＡＡＡＡ（配列番号６）
２−２８：ＭＡＳＤＰＲＲＱＲＲＲＲＲＱＲＡＲＲＲＡＡＡＡ（配列番号７）
２−０７：ＭＡＮＰＡＲＲＡＲＲＲＣＲＱＲＥＲＲＲＡＡＡＡ（配列番号８）
２−０６：ＭＡＩＬＡＲＲＱＲＲＲＧＲＱＲＥＲＲＲＡＡＡＡ（配列番号９）
２−０４：ＭＡＱＲＥＲＲＥＲＲＲＥＲＱＲＮＲＲＫＡＡＡＡ（配列番号１０）
３−０７：ＭＧＡＮＡＲＲＲＲＲＲＡＲＱＲＡＲＲＲＧＧＧ（配列番号１１）
３−１４：ＭＧＬＳＰＲＲＤＫＲＲＲＱＲＡＲＲＲＧＧＧ（配列番号１２）
３−０１：ＭＧＰＨＲＲＱＲＲＲＤＲＱＲＲＲＲＲＡＡＡ（配列番号１３）
３−１２：ＭＧＬＬＲＲＤＲＲＲＱＲＱＲＱＲＲＲＧＧＧ（配列番号１４）
ＤＲＲＲＬＲＱＲＡＲＲＲ（配列番号１５）
ＤＲＲＲＡＲＱＲＡＲＲＲ（配列番号１６）
ＥＲＲＲＮＲＱＲＡＲＲＲ（配列番号１７）
ＤＲＲＲＳＲＱＲＡＲＲＲ（配列番号１８）
ＨＲＲＲＬＲＱＲＡＲＲＲ（配列番号１９）
ＩＲＲＲＮＲＱＲＡＲＲＲ（配列番号２０）
ＬＲＲＲＡＲＱＲＭＲＲＲ（配列番号２１）
ＤＲＲＲＬＲＱＲＬＲＲＲ（配列番号２２）
ＩＲＲＲＬＲＱＲＡＲＲＲ（配列番号２３）
ＥＲＲＲＩＲＱＲＡＲＲＲ（配列番号２４）
ＴＲＲＲＬＲＱＲＡＲＲＲ（配列番号２５）
ＨＲＲＲＬＲＱＲＬＲＲＲ（配列番号２６）
ＤＲＲＲＲＲＱＲＩＲＲＲ（配列番号２７）
本発明の第２部分に含まれるペプチドとＲＮＡとの結合活性は、ＫＡＮシステムにおけるレポーター遺伝子の発現量を基に、既知のペプチドとの相対的定量化を行い評価することにより測定することができる。このときの解離定数は１００ｐＭ〜１０ｐＭである。
本発明は、上記ペプチドのほかにその誘導体も使用することができる。「誘導体」とは、本発明の第２部分に含まれるペプチドを起源とし、３以上のアミノ酸にまでアミノ酸の数を減らす、あるいは一部のアミノ酸を非天然の物を含んだ他のアミノ酸に置換したものをいう。また、上記誘導体は、天然物の一部を修飾したものであっても、化学合成により合成された修飾残基を含むペプチドであってもよい。
本発明の第２部分に含まれるペプチドは、アミノ酸配列の一部に化学修飾が施されたものも含む。「化学修飾」とは、化学試薬をタンパク質に反応させ、主にアミノ酸残基側鎖の化学構造を変えることをいう。例えば、本発明の第２部分に含まれるペプチドの活性部位又は活性部位近傍に存在すると予想されるアミノ酸を特異的に修飾する試薬（例えばポリエチレングリコール）を反応させる方法などが採用される。アフィニティラベルを行ってもよい。また、化学修飾にはアミノ酸のα炭素をメチル化したものも含む。化学修飾法は、当分野において周知である（大野素徳・金岡祐一・崎山文夫・前田浩 著、生物化学実験法 １２、蛋白質の化学修飾（上）、学会出版センター）。
なお、化学修飾されたアミノ酸配列を含むペプチドの修飾部分は、ペプチド本来の活性には影響せず、他の効果として作用する（Ｙａｍａｇｕｃｈｉ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６７（１０），２２６９−２２７２，２００３）。
置換、欠失等の変異が導入されているかどうかは、アミノ酸配列の配列決定、分子進化的工学やＸ線やＮＭＲなどによる構造解析を用いて確認することができる。
また、本発明の第２部分に含まれるペプチドの誘導体には、そのレトロエナンチオマーも含む。「レトロエナンチオマー」とは、上記ペプチドのアミノ酸配列の向きが左右逆になること（鏡像体を形成すること）を意味する。すなわち、ペプチドのＮ末端がＣ末端となり、Ｃ末端がＮ末端となり、かつ各アミノ酸がＤアミノ酸によって構成されている配列となることを意味する。このようなレトロエナンチオマーも、ＲＮＡ結合活性を有する限り本発明に含まれる。例えば、配列番号１５に示すアミノ酸配列のレトロエナンチオマーは、ＲＲＲＡＲＱＲＬＲＲＲＤ（配列番号２８）となる。他のペプチドのアミノ酸配列についても同様である。
さらに、本発明は、上記ペプチド（配列番号１〜２７）、その変異体、又はその誘導体を構成するアミノ酸配列の６５％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上を含むペプチド、その誘導体又はこれらの塩を使用することもできる。上記６５％の領域としては、例えば配列番号１〜２７に示す配列のうち、５番目〜１９番目（アルギニンリッチドメイン）の領域などが挙げられる。また、配列番号１〜２７に示すアミノ酸配列のうち、７０％以上、８０％以上、９０％以上の領域としてそれぞれ３番目〜１９番目、１番目〜１９番目、３番目〜２３番目の領域を例示することができ、９５％以上の領域として連続する２２個のアミノ酸の領域を例示することができる。
さらに、配列番号１〜２７に示すアミノ酸配列のほか、これらのアミノ酸配列のＮ末端側に２個のアルギニン（Ｒ）が付加されたアミノ酸配列（１４個のアミノ酸残基を有するアミノ酸配列）も、本発明の第２部分に含まれるペプチドに含有される。
上記のとおり本発明の第２部分に含まれるペプチドのアミノ酸配列が決定されると、その後は、当該アミノ酸配列をコードするＤＮＡを構築し、これを発現させることにより、あるいは上記ペプチドを化学合成することにより、得ることができる。
本発明の第２部分に含まれるペプチドの塩としては、生理学的に許容される酸付加塩又は塩基性塩が好ましい。酸付加塩としては、例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸などの無機酸との塩、あるいは酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸などの有機酸との塩が挙げられる。塩基性塩としては、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化マグネシウムなどの無機塩基との塩、あるいはカフェイン、ピペリジン、トリメチルアミン、ピリジンなどの有機塩基との塩が挙げられる。
塩は、塩酸などの適切な酸、あるいは水酸化ナトリウムなどの適切な塩基を用いて調製することができる。例えば、水中、又はメタノール、エタノール若しくはジオキサンなどの不活性な水混和性有機溶媒を含む液体中で、標準的なプロトコルを用いて処理することにより調製し得る。
（ｉｉ）ペプチドの化学合成
本発明の第２部分に含まれるペプチドの化学合成を行う場合は、ペプチドの合成の周知方法によって合成できる。例えば、アジド法、酸クロライド法、酸無水物法、混合酸無水物法、ＤＣＣ法、活性エステル法、カルボイミダゾール法、酸化還元法等が挙げられる。また、その合成は、固相合成法及び液相合成法のいずれをも適用することができる。市販のペプチド合成装置（島津製作所製ＰＳＳＭ−８など）を使用してもよい。
反応後は、溶媒抽出、蒸留、カラムクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、再結晶などの通常の精製法を組み合わせて本発明の第２部分に含まれるペプチドを精製することができる。
（ｉｉｉ）ペプチドをコードするポリヌクレオチド
本発明の第２部分に含まれるペプチドをコードするポリヌクレオチドは、本発明に使用するペプチドを遺伝子工学的に設計し、得ることができる。例えば、本発明の第２部分に含まれるペプチドのアミノ酸配列をもとに塩基配列を設計し、合成すればよい。ポリヌクレオチドとしてはＤＮＡ、ＲＮＡなどが挙げられるが、ＤＮＡであることが好ましい。
変異体のペプチドを遺伝子工学的に得るには、配列番号１〜２７のアミノ酸配列をコードするポリペプチドを、当分野において周知の部位特異的突然変異誘発法によって変異体を作製することができる。市販の部位特異的突然変異誘発用キットを用いてもよい（例えばＴａＫａＲａ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｕｔａｎ−Ｋ、Ｍｕｔａｎ−Ｓｕｐｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｋｍ等：タカラバイオ社製））。
（ｉｖ）組換えベクター、形質転換体及びペプチド
タンパク質発現用組換えベクターは、上記ポリヌクレオチドを適当なベクターに連結することにより得ることができ、形質転換体は、上記組換えベクターを、目的遺伝子が発現し得るように宿主中に導入することにより得ることができる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌ Ｄ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ，２００１）。
ベクターには、宿主微生物で自律的に増殖し得るファージ又はプラスミドが使用される。プラスミドＤＮＡとしては、大腸菌、枯草菌又は酵母由来のプラスミドなどが挙げられ、ファージＤＮＡとしてはλファージが挙げられる。さらに、動物ウイルス、昆虫ウイルスベクターを用いることもできる。
組換えベクターの作製は、精製されたＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、適当なベクターＤＮＡの制限酵素部位等に挿入してベクターに連結すればよい。
形質転換に使用する宿主としては、目的の遺伝子を発現できるものであれば特に限定されるものではない。例えば、細菌（大腸菌、枯草菌等）、酵母、動物細胞（ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞等）、昆虫細胞が挙げられる。
宿主への組換えベクターの導入方法は公知であり、任意の方法（例えばカルシウムイオンを用いる方法、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等）が挙げられる。
本発明の第２部分に含まれるペプチドは、前記形質転換体を培養し、その培養物から採取することにより得ることもできる。「培養物」とは、（ａ）培養上清、（ｂ）培養細胞若しくは培養菌体又はその破砕物のいずれをも意味するものである。
培養法は、当分野において周知である（前記Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇを参照）。
培養後、目的ペプチドが菌体内又は細胞内に生産される場合には、菌体又は細胞を破砕することによりタンパク質を抽出する。また、目的タンパク質が菌体外又は細胞外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離等により菌体又は細胞を除去する。その後、タンパク質の単離精製に用いられる一般的な生化学的方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独で又は適宜組み合わせて用いることにより、目的のペプチドを単離精製することができる。
本発明においては、ｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳によるペプチド合成を採用することができる。この場合は、ＲＮＡを鋳型にする方法とＤＮＡを鋳型にする方法（転写／翻訳）の２通りの方法を用いることができる。鋳型ＲＮＡとしては、前記（ｉｉｉ）に記載のポリヌクレオチドが挙げられ、鋳型ＤＮＡとしては、翻訳開始点の上流にプロモーターとリボゾーム結合部位を有している上記ポリヌクレオチド、あるいは翻訳開始点の上流に転写に必要なプロモーター等が組み込まれたポリヌクレオチドが挙げられる。ｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳システムは、市販のシステム、例えばＥｘｐｒｅｓｓｗａｙＴＭシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ＰＵＲＥＳＹＳＴＥＭ（登録商標；ポストゲノム研究所）、ＴＮＴシステム（登録商標；Ｐｒｏｍｅｇａ社）などを用いることができる。ｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳システムによるペプチド合成後は、上記の一般的な生化学的方法を単独又は組み合わせることにより、目的のペプチドを単離精製することができる。
（２）化合物
本発明の第２部分に含まれる化合物は、標的とするポリ核酸に結合することのできる化合物であれば、どのような化合物であってもよい。例えば、天然または合成低分子化合物ライブラリー、植物または動物由来抽出物に含まれる１〜複数個の化合物を挙げることができる。これらの化合物は、新規な化合物であっても、公知の化合物であってもよい。
標的ポリ核酸に結合する化合物は、例えば標的ポリ核酸と化合物との結合アッセイにより得ることができる。この場合は、例えば標的ポリ核酸が固相化された担体に化合物ライブラリーなどを接触させて、ポリ核酸に結合した化合物を選択することができる。また、前記のＫＡＮシステムを一部分使用して標的ポリ核酸に結合する化合物を選択することもできる。この場合、前述のＮレポータープラスミドを導入した細胞に化合物を接触させたときにカナマイシン耐性を獲得した細胞に接触させた化合物を、標的ポリ核酸に結合する化合物として選択することができる。
本発明の第２部分に含まれる化合物は、標的とするポリ核酸に結合する作用を有する限り、塩を形成していてもよく、それらの水和物であってもよい。または、ＣＡＤＤ（Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｉｄｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ）で同定される化合物も、標的ポリ核酸に結合する作用を有する限り、本発明の第２部分に含まれる化合物に含まれる。
本発明の第２部分に含まれる化合物の好ましい例としては、例えば、アミノグリコシド、複素環アミン、もしくはその塩、またはそれらの水和物が挙げられる。
（３）核酸
本発明の第２部分に含まれる核酸は、標的とするポリ核酸に結合する作用を有する限り、どのような核酸であってもよく、特に限定されるわけではないが、好ましくはアンチセンスオリゴヌクレオチド、またはｓｉＲＮＡである。本発明の第２部分に含まれる核酸は、例えば、結合相手（標的）のポリ核酸に相補的な塩基配列を有する核酸、結合相手のポリ核酸にストリンジェントな条件下で結合する塩基配列を有する核酸等を挙げることができる。ここで、「ストリンジェントな条件」とは、例えば、ハイブリダイゼーション後の洗浄時の条件であって、例えば塩濃度が３００〜２０００ｍＭ、温度が４０〜７５℃、好ましくは塩濃度が６００〜９００ｍＭ、温度が６５℃の条件を意味する。本発明の第２部分に含まれる核酸には、このようなストリンジェントな条件下において、特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドとしては、結合相手のポリ核酸の有する塩基配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の相同性を有する核酸が挙げられる。
本発明の第２部分に含まれる核酸は、新規な配列を有する核酸であってもよいし、公知の配列を有する核酸であってもよい。
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的とするｍＲＮＡに相補的な配列を有する核酸であり、アンチセンス法に用いられる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、当業者であれば標的ｍＲＮＡに応じて適宜設計し、合成することができる。
ｓｉＲＮＡは、細胞内でＤｉｃｅｒによってプロセッシングを受けて産生される短鎖ＲＮＡであり、ＲＮＡｉのエフェクターとして用いられる。
ｓｉＲＮＡの設計基準は以下の通りであり、当業者であればｓｉＲＮＡを適宜設計し、合成することができる。
（ａ）結合相手のポリ核酸を含有する遺伝子の開始コドンの下流の領域を選択する。開始コドンより下流の配列であれば特に限定されるものではなく、任意の領域を全て候補にすることが可能である。
（ｂ）選択した領域から、ａａで始まる連続する１５〜３０塩基、好ましくは１８〜２５塩基の配列を選択し、その配列のＧＣ含量が、例えば２０〜８０％となるものを選択する。
本発明の第２部分に含まれる核酸は、自動核酸合成機で合成することができる。あるいは、当業者であれば、本発明の第２部分に含まれる核酸をプラスミドなどのベクターに導入して、大腸菌などの宿主−ベクター系を用いて本発明の第２部分に含まれる核酸を産生することができる。
３．ポリ核酸結合物質を含む医薬組成物
本発明のポリ核酸結合物質は、医薬組成物として使用することができる。
本発明のポリ核酸結合物質に含まれる第２部分が、標的ポリ核酸の遺伝子発現を抑制または亢進する作用を有する場合には、本発明の医薬組成物は、当該遺伝子の発現の増減に起因する疾患の治療剤または予防剤として用いることができる。本発明において、疾患は単独であっても、併発したものであっても、上記以外の他の疾病を併発したものであってもよく、いずれも本発明のペプチドを使用する対象とすることができる。
また、本発明のポリ核酸結合物質含まれる第２部分が、例えば、ＨＩＶのＲＲＥに結合する活性を有する場合には、本発明の医薬組成物はＨＩＶの増殖抑制剤又は感染予防剤として用いることができる。
本発明の医薬組成物をＨＩＶの増殖抑制剤又は感染予防剤として使用する場合は、ＡＩＤＳ（後天性免疫不全症候群）患者、ＨＩＶウイルス陽性の健常者に対して治療又は予防を特異目的として用いることができる。また、健常者に対して、感染予防の目的で使用することができる。
本発明の医薬組成物は、経口又は非経口的に全身又は局所投与することができる。本発明の医薬組成物を経口投与する場合は、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、丸剤、トローチ剤、内用水剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤等のいずれのものであってもよく、使用する際に再溶解させる乾燥生成物にしてもよい。また、本発明の医薬組成物を非経口投与する場合は、静脈内注射（点滴を含む）、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射、坐剤などの製剤形態を選択することができ、注射用製剤の場合は単位投与量アンプル又は多投与量容器の状態で提供される。
これらの各種製剤は、製剤上通常用いられる賦形剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、潤滑剤、界面活性剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、溶解補助剤、防腐剤、矯味矯臭剤、無痛化剤、安定化剤、等張化剤等などを適宜選択し、常法により製造することができる。
上記各種製剤は、医薬的に許容される担体又は添加物を共に含むものであってもよい。このような担体及び添加物の例として、水、医薬的に許容される有機溶剤、コラーゲン、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、ゼラチン、寒天、グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン、マンニトール、ソルビトール、ラクトースなどが挙げられる。使用される添加物は、本発明の剤型に応じて上記の中から適宜又は組み合わせて選択される。
本発明の医薬組成物の投与量は、投与対象の年齢、投与経路、投与回数により異なり、広範囲に変えることができる。本発明のポリ核酸結合物質の有効量と適切な希釈剤及び薬理学的に使用し得る担体との組合せとして投与される有効量は、一回につき体重１ｋｇあたり１０〜１０００ｍｇ／ｂｏｄｙ、好ましくは５０〜５００ｍｇ／ｂｏｄｙの範囲の投与量を選ぶことができ、１日１回から数回に分けて１日以上投与される。
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
抗ＨＩＶ活性試験
（１）方法
本実施例は、Ｐａｕｗｅｌｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０；３０９−３２１，１９８８、Ｎａｋａｓｈｉｍａ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．，３６；１２４９−１２５５，１９９２、Ｎａｋａｓｈｉｍａ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔ．Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．，６；２７１−２８０，１９９５に記載の方法に従って行った。
具体的には、９６穴マイクロタイタープレートに、種々の濃度の試験物質とともにＨＩＶ感染ＭＴ−４細胞（２．５×１０４ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌ、ＭＯＩ：０．０１）を感染直後に加えた。
試験物質のＭＴ−４細胞に対する細胞毒性を知るために、ウイルス非感染細胞を同様に宿野濃度で試験物質とともに培養した。血清を添加して培養を行った。
ＣＯ２インキュベータで３７℃で５日間培養した後、ＭＴＴ法で生存細胞数を測定した。抗ウイルス活性は、ＨＩＶ感染による細胞傷害を５０％ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎする濃度（ＥＣ５０；５０％ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）、細胞毒性は試験物質による５０％細胞傷害濃度（ＣＣ５０；５０％ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）でそれぞれ表現した。また、有効係数（Ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ Ｉｎｄｅｘ；ＳＩ）はＣＣ５０／ＥＣ５０として計算した。
用いた試験物質は、
コントロールペプチド１：ｓｕｃ−ＲＲＤＲＲＲＬＲＱＲＡＲＲＲＡＡＡＡ−ＯＨ（配列番号３０）
試験ペプチド５：ＣｌＡｃ−ＧＡＢＡ−ＲＲＤＲＲＲＬＲＱＲＡＲＲＲＡＡＡＡ−ＯＨ（配列番号３１）
である。「ｓｕｃ」は、保護基であるスクシニルを意味する。
（２）結果
結果を表１に示す。
表１の結果より、求電子基およびスペーサーが付加された試験ペプチド５は、求電子基およびスペーサーを結合したことで薬理活性が向上することが示された。
なお、本明細書において引用した文献、および公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込むものとする。
１．本発明の概要
本発明は、求電子基を有する第１部分と、ペプチド、化合物および核酸からなる群から選択される１種以上を有する第２部分とを含むことを特徴とする、ポリ核酸結合物質に関するものである。
本明細書において、「ポリ核酸結合物質」とは、ポリ核酸に結合することのできる物質を意味する。本発明のポリ核酸結合物質は、ポリ核酸に結合する活性を有すればよく、ポリ核酸への結合の強さによって限定されるものではない。
本明細書において、「ポリ核酸」とは、鎖状に複数個つながった核酸を意味する。
本明細書において、「核酸」は、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ウイルスＲＮＡ、デコイＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、ｓｉＲＮＡなどの天然および人工ＲＮＡ（ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）、ｃＤＮＡ、ｇｅｎｏｍｅ ＤＮＡ、ｓｓＤＮＡ（ｓｉｎｇｌｅ ｓｔｒａｎｄ ＤＮＡ）、ｄｓＤＮＡ（ｄｏｕｂｌｅ ｓｔｒａｎｄ ＤＮＡ）などのＤＮＡ（ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）、およびＰＮＡ（ｐｅｐｔｉｄｅ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）が含まれるが、好ましくはＲＮＡである。
上記のウイルスには、Ｒｅｖ応答性エレメント（ＲＲＥ）配列部位またはその類似構造を有するレトロウイルスであるＨＩＶ、ＦＩＶ、ＳＩＶ、ＢＩＶ、ＨＴＬＶなどのウイルスを挙げることができる。
本発明において第２部分は、好ましくはペプチドを含む。
２．第１部分
（１）求電子基
本発明において、第１部分は求電子基を有する。
本明細書において、「求電子基」とは、電子が不足している反応種（例えば、陽イオン、酸、酸化剤）を意味する。求電子基は、相手から電子をとって酸化するか、相手から電子をとって配位結合をつくるかの２通りの反応をする性質を有する。
本発明の第１部分に含まれる求電子基は、求電子基として機能する限り、どのような基であってもよい。本発明の第１部分に含まれる求電子基は、例えば、下記式、
（本発明において、以下、「ＺＡｃ−」ともいう。）で表される基を挙げることができる。
本明細書において、「ハロゲン原子」は、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子であることが好ましく、より好ましくは塩素原子である。
（２）スペーサー
本発明において、第１部分と第２部分との間に、スペーサーを含有させることもできる。スペーサーを含有させることによって、ポリ核酸と第２部分との結合を維持したまま、適切な距離関係に存在する求核原子団を反応ターゲットとすることができる。
本発明において、スペーサーは、例えばＧＡＢＡ（γ−アミノ酪酸）、ε−アミノカプロン酸、または５−アミノ−３−オキソペンタン酸等のエーテル系アミノアルカン酸を挙げることができる。また、分岐して複数のアミノ基を有するカルボン酸も使用できる。これらスペーサーは、スペーサー中のアミノ基の位置で第１部分と結合することができ、また、スペーサー中のカルボキシル基の位置で第２部分と結合することができる。
この場合、以下のようにＧＡＢＡのＮ末端側を求電子基（下記の例ではＣｌＡｃ−）に結合させ、Ｃ末端側を第２部分（図示せず）に結合させることが好ましい。
（３）第２部分との結合
本発明において、第１部分と第２部分とは、共有結合であるアミド結合で結合しており、これらは公知の方法で反応させることができる。
また、本発明において、１つの第２部分に複数の第１部分および／またはスペーサーが結合していてもよい。
第２部分がペプチドの場合は、第１部分またはスペーサーはペプチドのＮ末端側および／またはＣ末端側に結合することができる。
第１部分にカルボニル基が含まれる場合は、当該カルボニル基とペプチドまたはスペーサーのＮ末端とは、アミド結合により結合する。例えばＺが塩素原子である場合（ＣｌＡｃ−）、第１部分が付加されたペプチドまたはスペーサーは、側鎖官能基を保護したペプチドまたはスペーサーと、クロロ酢酸とを直接縮合剤とともに反応させるか、一旦縮合剤でクロロ酢酸をクロロ酢酸無水物に変換後反応させるか、クロロ酢酸パラニトロフェニルエステル等の活性エステルを用いて反応させるか、またはクロロ酢酸クロリドを塩基とともに反応させることにより得ることができる。また例えば、第１部分またはスペーサーがカルボニル基を有する場合は、第１部分またはスペーサーのカルボニル基に続いて、ペプチドを順次合成していくこともできる。
あるいは、第１部分にアミノ基が含まれる場合は、当該アミノ基とペプチドまたはスペーサーのＣ末端とが結合する場合も、アミド結合により結合する。アミド結合は、当業者であれば公知の方法により行うことができる。
また、第２部分が化合物の場合は、第１部分が付加された化合物またはスペーサーは、例えばＺが塩素原子である場合、付加前の化合物または化合物に含まれるスペーサーと、縮合剤でクロロ酢酸無水物に変換後反応させるか、クロロ酢酸パラニトロフェニルエステル等の活性エステルを用いて反応させるか、またはクロロ酢酸クロリドを塩基とともに反応させることにより得ることができる。
さらに、第２部分が核酸の場合は、求電子基またはスペーサーと核酸とは、エステル化反応で結合することができる。
第２部分のポリ核酸への結合活性は、例えば、ＲＮＡ結合ペプチドの場合は、ＨＩＶ感染細胞の生存細胞数を測定することで評価することができる（実施例１）。また、例えば、上記のＲＮＡ結合ペプチドとＲＮＡとの結合活性は、下記のＫＡＮシステムにおけるレポーター遺伝子の発現量を基に、既知のペプチドとの相対的定量化によって評価することができる。
本発明のポリ核酸結合物質の好ましい態様は、例えば、
ＣｌＡｃ−ＧＡＢＡ−ＲＲＤＲＲＲＬＲＱＲＡＲＲＲＡＡＡＡ（配列番号２９）
である。
３．第２部分
本発明において、第２部分は、ペプチド、化合物、および核酸からなる群から選択される異種以上を有する。本発明において、第２部分は好ましくはペプチドを含む。
（１）ペプチド
本発明において第２部分に含まれるペプチド（ポリペプチドを含む）は、標的とするポリ核酸に結合することのできるペプチドであればどのようなペプチドであってもよい。本発明の第２部分に含まれるペプチドは、好ましくはＲＮＡに結合する活性を有するペプチド、すなわちＲＮＡ結合ペプチドである。
（ｉ）ＲＮＡ結合ペプチド
本発明において、ＲＮＡ結合ペプチドは、例えば、アルギニンに富む１５個のアミノ酸配列を骨格としつつ２３個のアミノ酸配列を含み、かつＨＩＶのＲｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）に結合する活性を有するペプチドであり、当該ペプチドをＨＩＶに接触させることによってＨＩＶの増殖を抑制させることができる。
本発明の第２部分に含まれるペプチドは、少なくとも次式Ｉ：
Ｒ−Ｑ−Ｒ−Ｘ （Ｉ）
（ＸはＲ以外のアミノ酸残基を表す。）
で示されるアミノ酸配列を含むペプチド、その誘導体又はこれらの塩である。
上記式において、Ｒ及びＱはアミノ酸の１文字表記をしたものであり、それぞれアルギニン（Ａｒｇ）、グルタミン（Ｇｌｎ）を表す（他のアミノ酸についても同様）。Ｘは、アルギニンを除く他のアミノ酸残基を表す。
本発明の第２部分に含まれるペプチドは、上記式のアミノ酸配列を含み、好ましくは１２〜２３個のアミノ酸配列を有する。そして、その中のいくつかのアミノ酸はアルギニンに富むドメイン（「アルギニンリッチドメイン」という）を形成する。例えば、２３アミノ酸残基を有するペプチドは、その中の５番目から１９番目がアルギニンリッチドメインを形成する。本発明の第２部分に含まれるペプチドは、アルギニンを好ましくは９〜１１残基含むものである。いくつかのＲＮＡ結合タンパク質のアルギニンリッチドメインは、それらの類似のＲＮＡと高親和性及び特異性をもって結合することが示されている。そして、配列がシンプルであること、及び構造が多様であることから、アルギニンリッチドメインは新規ＲＮＡ結合ペプチドを同定するために有効なツールとして利用することができる。本発明の第２部分に含まれるペプチドは、極めて多数の組合せをもつペプチドライブラリーから、カナマイシン・アンチターミネーション・システム（「ＫＡＮシステム」という）と呼ばれるスクリーニング手法により得ることができる。
ＫＡＮシステムとは、細胞内でカナマイシン耐性遺伝子の機能を用いて、ＲＮＡとペプチドの相互作用を検出するアッセイを意味する（Ｈａｄａｓ Ｐｅｌｅｄ−Ｚｅｈａｖｉ，ｅｔ ａｌ．，ＲＮＡ ９，２５２−２６１，２００３）。
具体的には、標的ＲＮＡに対応するオリゴＤＮＡ（ここで、「対応するオリゴＤＮＡ」とは、標的配列と同一の配列を有するように設計されたオリゴＤＮＡを意味する）と、レポーター遺伝子としてカナマイシン耐性遺伝子とを組み込んだＮレポータープラスミド、及びペプチドをコードするオリゴヌクレオチドを組み込んだＮ発現プラスミドを細胞に導入する。細胞内でＲＮＡとペプチドが相互作用するとカナマイシン耐性遺伝子が転写翻訳され、標的ＲＮＡとペプチドとが接触したシグナルとして、細胞はカナマイシン耐性を獲得する。細胞には、酵母や大腸菌などを用いることができる。大腸菌を用いた場合、カナマイシンを含んだ培地で生存した大腸菌には、ＲＮＡと相互作用するペプチドが発現していることになる。
また、上記ＫＡＮシステムにより得られた本発明の第２部分に含まれるペプチドのアミノ酸配列を以下の配列番号１〜２７に例示するが、本発明の第２部分に含まれるペプチドがＲＮＡ結合活性（ＨＩＶのＲＲＥに結合する活性）を有する限り、当該アミノ酸配列の１個又は数個のアミノ酸に欠失、置換、付加等の変異が生じてもよい（これらを本発明において「変異体」という）。例えば、配列番号１〜２７で表わされるアミノ酸配列の１個又は数個、好ましくは１〜９個、さらに好ましくは１〜５個のアミノ酸が欠失してもよく、配列番号１〜２７で表わされるアミノ酸配列に１個又は数個、好ましくは１〜９個、さらに好ましくは１〜５個のアミノ酸が付加してもよく、あるいは、配列番号１〜２７で表わされるアミノ酸配列の１個又は数個、好ましくは１〜９個、さらに好ましくは１〜５個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換してもよい。
１７：ＭＡＳＡＲＲＲＲＲＲＲＲＲＱＲＡＲＲＲＡＡＡＡ（配列番号１）
３９：ＭＡＳＲＤＲＴＲＲＲＲＴＲＱＲＳＲＲＲＡＡＡＡ（配列番号２）
４２：ＭＡＮＤＲＲＲＲＲＲＴＲＱＲＤＲＲＲＮＡＡＡＡ（配列番号３）
１１：ＭＡＳＬＲＲＮＲＲＲＳＲＱＲＡＲＲＲＥＡＡＡＡ（配列番号４）
２６：ＭＡＬＬＰＲＲＥＲＲＲＲＲＱＲＥＲＲＲＡＡＡＡ（配列番号５）
８ ：ＭＡＶＡＴＲＲＥＲＲＲＲＲＱＲＴＲＲＲＡＡＡＡ（配列番号６）
２−２８：ＭＡＳＤＰＲＲＱＲＲＲＲＲＱＲＡＲＲＲＡＡＡＡ（配列番号７）
２−０７：ＭＡＮＰＡＲＲＡＲＲＲＣＲＱＲＥＲＲＲＡＡＡＡ（配列番号８）
２−０６：ＭＡＩＬＡＲＲＱＲＲＲＧＲＱＲＥＲＲＲＡＡＡＡ（配列番号９）
２−０４：ＭＡＱＲＥＲＲＥＲＲＲＥＲＱＲＮＲＲＫＡＡＡＡ（配列番号１０）
３−０７：ＭＧＡＮＡＲＲＲＲＲＲＡＲＱＲＡＲＲＲＧＧＧ（配列番号１１）
３−１４：ＭＧＬＳＰＲＲＤＫＲＲＲＱＲＡＲＲＲＧＧＧ（配列番号１２）
３−０１：ＭＧＰＨＲＲＱＲＲＲＤＲＱＲＲＲＲＲＡＡＡ（配列番号１３）
３−１２：ＭＧＬＬＲＲＤＲＲＲＱＲＱＲＱＲＲＲＧＧＧ（配列番号１４）
ＤＲＲＲＬＲＱＲＡＲＲＲ（配列番号１５）
ＤＲＲＲＡＲＱＲＡＲＲＲ（配列番号１６）
ＥＲＲＲＮＲＱＲＡＲＲＲ（配列番号１７）
ＤＲＲＲＳＲＱＲＡＲＲＲ（配列番号１８）
ＨＲＲＲＬＲＱＲＡＲＲＲ（配列番号１９）
ＩＲＲＲＮＲＱＲＡＲＲＲ（配列番号２０）
ＬＲＲＲＡＲＱＲＭＲＲＲ（配列番号２１）
ＤＲＲＲＬＲＱＲＬＲＲＲ（配列番号２２）
ＩＲＲＲＬＲＱＲＡＲＲＲ（配列番号２３）
ＥＲＲＲＩＲＱＲＡＲＲＲ（配列番号２４）
ＴＲＲＲＬＲＱＲＡＲＲＲ（配列番号２５）
ＨＲＲＲＬＲＱＲＬＲＲＲ（配列番号２６）
ＤＲＲＲＲＲＱＲＩＲＲＲ（配列番号２７）
本発明の第２部分に含まれるペプチドとＲＮＡとの結合活性は、ＫＡＮシステムにおけるレポーター遺伝子の発現量を基に、既知のペプチドとの相対的定量化を行い評価することにより測定することができる。このときの解離定数は１００ｐＭ〜１０ｐＭである。
本発明は、上記ペプチドのほかにその誘導体も使用することができる。「誘導体」とは、本発明の第２部分に含まれるペプチドを起源とし、３以上のアミノ酸にまでアミノ酸の数を減らす、あるいは一部のアミノ酸を非天然の物を含んだ他のアミノ酸に置換したものをいう。また、上記誘導体は、天然物の一部を修飾したものであっても、化学合成により合成された修飾残基を含むペプチドであってもよい。
本発明の第２部分に含まれるペプチドは、アミノ酸配列の一部に化学修飾が施されたものも含む。「化学修飾」とは、化学試薬をタンパク質に反応させ、主にアミノ酸残基側鎖の化学構造を変えることをいう。例えば、本発明の第２部分に含まれるペプチドの活性部位又は活性部位近傍に存在すると予想されるアミノ酸を特異的に修飾する試薬（例えばポリエチレングリコール）を反応させる方法などが採用される。アフィニティラベルを行ってもよい。また、化学修飾にはアミノ酸のα炭素をメチル化したものも含む。化学修飾法は、当分野において周知である（大野素徳・金岡祐一・崎山文夫・前田浩 著、生物化学実験法 １２、蛋白質の化学修飾（上）、学会出版センター）。
なお、化学修飾されたアミノ酸配列を含むペプチドの修飾部分は、ペプチド本来の活性には影響せず、他の効果として作用する（Ｙａｍａｇｕｃｈｉ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６７（１０），２２６９−２２７２，２００３）。
置換、欠失等の変異が導入されているかどうかは、アミノ酸配列の配列決定、分子進化的工学やＸ線やＮＭＲなどによる構造解析を用いて確認することができる。
また、本発明の第２部分に含まれるペプチドの誘導体には、そのレトロエナンチオマーも含む。「レトロエナンチオマー」とは、上記ペプチドのアミノ酸配列の向きが左右逆になること（鏡像体を形成すること）を意味する。すなわち、ペプチドのＮ末端がＣ末端となり、Ｃ末端がＮ末端となり、かつ各アミノ酸がＤアミノ酸によって構成されている配列となることを意味する。このようなレトロエナンチオマーも、ＲＮＡ結合活性を有する限り本発明に含まれる。例えば、配列番号１５に示すアミノ酸配列のレトロエナンチオマーは、ＲＲＲＡＲＱＲＬＲＲＲＤ（配列番号２８）となる。他のペプチドのアミノ酸配列についても同様である。
さらに、本発明は、上記ペプチド（配列番号１〜２７）、その変異体、又はその誘導体を構成するアミノ酸配列の６５％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上を含むペプチド、その誘導体又はこれらの塩を使用することもできる。上記６５％の領域としては、例えば配列番号１〜２７に示す配列のうち、５番目〜１９番目（アルギニンリッチドメイン）の領域などが挙げられる。また、配列番号１〜２７に示すアミノ酸配列のうち、７０％以上、８０％以上、９０％以上の領域としてそれぞれ３番目〜１９番目、１番目〜１９番目、３番目〜２３番目の領域を例示することができ、９５％以上の領域として連続する２２個のアミノ酸の領域を例示することができる。
さらに、配列番号１〜２７に示すアミノ酸配列のほか、これらのアミノ酸配列のＮ末端側に２個のアルギニン（Ｒ）が付加されたアミノ酸配列（１４個のアミノ酸残基を有するアミノ酸配列）も、本発明の第２部分に含まれるペプチドに含有される。
上記のとおり本発明の第２部分に含まれるペプチドのアミノ酸配列が決定されると、その後は、当該アミノ酸配列をコードするＤＮＡを構築し、これを発現させることにより、あるいは上記ペプチドを化学合成することにより、得ることができる。
本発明の第２部分に含まれるペプチドの塩としては、生理学的に許容される酸付加塩又は塩基性塩が好ましい。酸付加塩としては、例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸などの無機酸との塩、あるいは酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸などの有機酸との塩が挙げられる。塩基性塩としては、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化マグネシウムなどの無機塩基との塩、あるいはカフェイン、ピペリジン、トリメチルアミン、ピリジンなどの有機塩基との塩が挙げられる。
塩は、塩酸などの適切な酸、あるいは水酸化ナトリウムなどの適切な塩基を用いて調製することができる。例えば、水中、又はメタノール、エタノール若しくはジオキサンなどの不活性な水混和性有機溶媒を含む液体中で、標準的なプロトコルを用いて処理することにより調製し得る。
（ｉｉ）ペプチドの化学合成
本発明の第２部分に含まれるペプチドの化学合成を行う場合は、ペプチドの合成の周知方法によって合成できる。例えば、アジド法、酸クロライド法、酸無水物法、混合酸無水物法、ＤＣＣ法、活性エステル法、カルボイミダゾール法、酸化還元法等が挙げられる。また、その合成は、固相合成法及び液相合成法のいずれをも適用することができる。市販のペプチド合成装置（島津製作所製ＰＳＳＭ−８など）を使用してもよい。
反応後は、溶媒抽出、蒸留、カラムクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、再結晶などの通常の精製法を組み合わせて本発明の第２部分に含まれるペプチドを精製することができる。
（ｉｉｉ）ペプチドをコードするポリヌクレオチド
本発明の第２部分に含まれるペプチドをコードするポリヌクレオチドは、本発明に使用するペプチドを遺伝子工学的に設計し、得ることができる。例えば、本発明の第２部分に含まれるペプチドのアミノ酸配列をもとに塩基配列を設計し、合成すればよい。ポリヌクレオチドとしてはＤＮＡ、ＲＮＡなどが挙げられるが、ＤＮＡであることが好ましい。
変異体のペプチドを遺伝子工学的に得るには、配列番号１〜２７のアミノ酸配列をコードするポリペプチドを、当分野において周知の部位特異的突然変異誘発法によって変異体を作製することができる。市販の部位特異的突然変異誘発用キットを用いてもよい（例えばＴａＫａＲａ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｕｔａｎ−Ｋ、Ｍｕｔａｎ−Ｓｕｐｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｋｍ等：タカラバイオ社製））。
（ｉｖ）組換えベクター、形質転換体及びペプチド
タンパク質発現用組換えベクターは、上記ポリヌクレオチドを適当なベクターに連結することにより得ることができ、形質転換体は、上記組換えベクターを、目的遺伝子が発現し得るように宿主中に導入することにより得ることができる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌ Ｄ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ，２００１）。
ベクターには、宿主微生物で自律的に増殖し得るファージ又はプラスミドが使用される。プラスミドＤＮＡとしては、大腸菌、枯草菌又は酵母由来のプラスミドなどが挙げられ、ファージＤＮＡとしてはλファージが挙げられる。さらに、動物ウイルス、昆虫ウイルスベクターを用いることもできる。
組換えベクターの作製は、精製されたＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、適当なベクターＤＮＡの制限酵素部位等に挿入してベクターに連結すればよい。
形質転換に使用する宿主としては、目的の遺伝子を発現できるものであれば特に限定されるものではない。例えば、細菌（大腸菌、枯草菌等）、酵母、動物細胞（ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞等）、昆虫細胞が挙げられる。
宿主への組換えベクターの導入方法は公知であり、任意の方法（例えばカルシウムイオンを用いる方法、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等）が挙げられる。
本発明の第２部分に含まれるペプチドは、前記形質転換体を培養し、その培養物から採取することにより得ることもできる。「培養物」とは、（ａ）培養上清、（ｂ）培養細胞若しくは培養菌体又はその破砕物のいずれをも意味するものである。
培養法は、当分野において周知である（前記Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇを参照）。
培養後、目的ペプチドが菌体内又は細胞内に生産される場合には、菌体又は細胞を破砕することによりタンパク質を抽出する。また、目的タンパク質が菌体外又は細胞外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離等により菌体又は細胞を除去する。その後、タンパク質の単離精製に用いられる一般的な生化学的方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独で又は適宜組み合わせて用いることにより、目的のペプチドを単離精製することができる。
本発明においては、ｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳によるペプチド合成を採用することができる。この場合は、ＲＮＡを鋳型にする方法とＤＮＡを鋳型にする方法（転写／翻訳）の２通りの方法を用いることができる。鋳型ＲＮＡとしては、前記（ｉｉｉ）に記載のポリヌクレオチドが挙げられ、鋳型ＤＮＡとしては、翻訳開始点の上流にプロモーターとリボゾーム結合部位を有している上記ポリヌクレオチド、あるいは翻訳開始点の上流に転写に必要なプロモーター等が組み込まれたポリヌクレオチドが挙げられる。ｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳システムは、市販のシステム、例えばＥｘｐｒｅｓｓｗａｙＴＭシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ＰＵＲＥＳＹＳＴＥＭ（登録商標；ポストゲノム研究所）、ＴＮＴシステム（登録商標；Ｐｒｏｍｅｇａ社）などを用いることができる。ｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳システムによるペプチド合成後は、上記の一般的な生化学的方法を単独又は組み合わせることにより、目的のペプチドを単離精製することができる。
（２）化合物
本発明の第２部分に含まれる化合物は、標的とするポリ核酸に結合することのできる化合物であれば、どのような化合物であってもよい。例えば、天然または合成低分子化合物ライブラリー、植物または動物由来抽出物に含まれる１〜複数個の化合物を挙げることができる。これらの化合物は、新規な化合物であっても、公知の化合物であってもよい。
標的ポリ核酸に結合する化合物は、例えば標的ポリ核酸と化合物との結合アッセイにより得ることができる。この場合は、例えば標的ポリ核酸が固相化された担体に化合物ライブラリーなどを接触させて、ポリ核酸に結合した化合物を選択することができる。また、前記のＫＡＮシステムを一部分使用して標的ポリ核酸に結合する化合物を選択することもできる。この場合、前述のＮレポータープラスミドを導入した細胞に化合物を接触させたときにカナマイシン耐性を獲得した細胞に接触させた化合物を、標的ポリ核酸に結合する化合物として選択することができる。
本発明の第２部分に含まれる化合物は、標的とするポリ核酸に結合する作用を有する限り、塩を形成していてもよく、それらの水和物であってもよい。または、ＣＡＤＤ（Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｉｄｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ）で同定される化合物も、標的ポリ核酸に結合する作用を有する限り、本発明の第２部分に含まれる化合物に含まれる。
本発明の第２部分に含まれる化合物の好ましい例としては、例えば、アミノグリコシド、複素環アミン、もしくはその塩、またはそれらの水和物が挙げられる。
（３）核酸
本発明の第２部分に含まれる核酸は、標的とするポリ核酸に結合する作用を有する限り、どのような核酸であってもよく、特に限定されるわけではないが、好ましくはアンチセンスオリゴヌクレオチド、またはｓｉＲＮＡである。本発明の第２部分に含まれる核酸は、例えば、結合相手（標的）のポリ核酸に相補的な塩基配列を有する核酸、結合相手のポリ核酸にストリンジェントな条件下で結合する塩基配列を有する核酸等を挙げることができる。ここで、「ストリンジェントな条件」とは、例えば、ハイブリダイゼーション後の洗浄時の条件であって、例えば塩濃度が３００〜２０００ｍＭ、温度が４０〜７５℃、好ましくは塩濃度が６００〜９００ｍＭ、温度が６５℃の条件を意味する。本発明の第２部分に含まれる核酸には、このようなストリンジェントな条件下において、特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドとしては、結合相手のポリ核酸の有する塩基配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の相同性を有する核酸が挙げられる。
本発明の第２部分に含まれる核酸は、新規な配列を有する核酸であってもよいし、公知の配列を有する核酸であってもよい。
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的とするｍＲＮＡに相補的な配列を有する核酸であり、アンチセンス法に用いられる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、当業者であれば標的ｍＲＮＡに応じて適宜設計し、合成することができる。
ｓｉＲＮＡは、細胞内でＤｉｃｅｒによってプロセッシングを受けて産生される短鎖ＲＮＡであり、ＲＮＡｉのエフェクターとして用いられる。
ｓｉＲＮＡの設計基準は以下の通りであり、当業者であればｓｉＲＮＡを適宜設計し、合成することができる。
（ａ）結合相手のポリ核酸を含有する遺伝子の開始コドンの下流の領域を選択する。開始コドンより下流の配列であれば特に限定されるものではなく、任意の領域を全て候補にすることが可能である。
（ｂ）選択した領域から、ａａで始まる連続する１５〜３０塩基、好ましくは１８〜２５塩基の配列を選択し、その配列のＧＣ含量が、例えば２０〜８０％となるものを選択する。
本発明の第２部分に含まれる核酸は、自動核酸合成機で合成することができる。あるいは、当業者であれば、本発明の第２部分に含まれる核酸をプラスミドなどのベクターに導入して、大腸菌などの宿主−ベクター系を用いて本発明の第２部分に含まれる核酸を産生することができる。
３．ポリ核酸結合物質を含む医薬組成物
本発明のポリ核酸結合物質は、医薬組成物として使用することができる。
本発明のポリ核酸結合物質に含まれる第２部分が、標的ポリ核酸の遺伝子発現を抑制または亢進する作用を有する場合には、本発明の医薬組成物は、当該遺伝子の発現の増減に起因する疾患の治療剤または予防剤として用いることができる。本発明において、疾患は単独であっても、併発したものであっても、上記以外の他の疾病を併発したものであってもよく、いずれも本発明のペプチドを使用する対象とすることができる。
また、本発明のポリ核酸結合物質含まれる第２部分が、例えば、ＨＩＶのＲＲＥに結合する活性を有する場合には、本発明の医薬組成物はＨＩＶの増殖抑制剤又は感染予防剤として用いることができる。
本発明の医薬組成物をＨＩＶの増殖抑制剤又は感染予防剤として使用する場合は、ＡＩＤＳ（後天性免疫不全症候群）患者、ＨＩＶウイルス陽性の健常者に対して治療又は予防を特異目的として用いることができる。また、健常者に対して、感染予防の目的で使用することができる。
本発明の医薬組成物は、経口又は非経口的に全身又は局所投与することができる。本発明の医薬組成物を経口投与する場合は、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、丸剤、トローチ剤、内用水剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤等のいずれのものであってもよく、使用する際に再溶解させる乾燥生成物にしてもよい。また、本発明の医薬組成物を非経口投与する場合は、静脈内注射（点滴を含む）、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射、坐剤などの製剤形態を選択することができ、注射用製剤の場合は単位投与量アンプル又は多投与量容器の状態で提供される。
これらの各種製剤は、製剤上通常用いられる賦形剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、潤滑剤、界面活性剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、溶解補助剤、防腐剤、矯味矯臭剤、無痛化剤、安定化剤、等張化剤等などを適宜選択し、常法により製造することができる。
上記各種製剤は、医薬的に許容される担体又は添加物を共に含むものであってもよい。このような担体及び添加物の例として、水、医薬的に許容される有機溶剤、コラーゲン、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、ゼラチン、寒天、グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン、マンニトール、ソルビトール、ラクトースなどが挙げられる。使用される添加物は、本発明の剤型に応じて上記の中から適宜又は組み合わせて選択される。
本発明の医薬組成物の投与量は、投与対象の年齢、投与経路、投与回数により異なり、広範囲に変えることができる。本発明のポリ核酸結合物質の有効量と適切な希釈剤及び薬理学的に使用し得る担体との組合せとして投与される有効量は、一回につき体重１ｋｇあたり１０〜１０００ｍｇ／ｂｏｄｙ、好ましくは５０〜５００ｍｇ／ｂｏｄｙの範囲の投与量を選ぶことができ、１日１回から数回に分けて１日以上投与される。
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
抗ＨＩＶ活性試験
（１）方法
本実施例は、Ｐａｕｗｅｌｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０；３０９−３２１，１９８８、Ｎａｋａｓｈｉｍａ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．，３６；１２４９−１２５５，１９９２、Ｎａｋａｓｈｉｍａ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔ．Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．，６；２７１−２８０，１９９５に記載の方法に従って行った。
具体的には、９６穴マイクロタイタープレートに、種々の濃度の試験物質とともにＨＩＶ感染ＭＴ−４細胞（２．５×１０４ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌ、ＭＯＩ：０．０１）を感染直後に加えた。
試験物質のＭＴ−４細胞に対する細胞毒性を知るために、ウイルス非感染細胞を同様に宿野濃度で試験物質とともに培養した。血清を添加して培養を行った。
ＣＯ２インキュベータで３７℃で５日間培養した後、ＭＴＴ法で生存細胞数を測定した。抗ウイルス活性は、ＨＩＶ感染による細胞傷害を５０％ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎする濃度（ＥＣ５０；５０％ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）、細胞毒性は試験物質による５０％細胞傷害濃度（ＣＣ５０；５０％ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）でそれぞれ表現した。また、有効係数（Ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ Ｉｎｄｅｘ；ＳＩ）はＣＣ５０／ＥＣ５０として計算した。
用いた試験物質は、
コントロールペプチド１：ｓｕｃ−ＲＲＤＲＲＲＬＲＱＲＡＲＲＲＡＡＡＡ−ＯＨ（配列番号３０）
試験ペプチド５：ＣｌＡｃ−ＧＡＢＡ−ＲＲＤＲＲＲＬＲＱＲＡＲＲＲＡＡＡＡ−ＯＨ（配列番号３１）
である。「ｓｕｃ」は、保護基であるスクシニルを意味する。
（２）結果
結果を表１に示す。
本発明により、求電子基と、ペプチド、化合物および核酸からなる群から選ばれる１種以上とを含むことを特徴とするポリ核酸結合物質が提供される。本発明のポリ核酸結合物質は、求電子基を含むために、ポリ核酸に対する高い結合活性を有する。したがって、本発明のポリ核酸結合物質は医薬組成物として有用であるといえる。特に、本発明のポリ核酸結合物質に含まれるペプチドが、ＲＮＡ結合ペプチドである場合は、ＲＮＡウイルス性疾患の治療や予防に用いることができる。
配列番号１〜３９：合成ペプチド
配列番号２９：１番目のアミノ酸に求電子基−スペーサーが結合している。
配列番号３０：１番目のアミノ酸にスクシニルが結合している。
配列番号３１：１番目のアミノ酸に求電子基−スペーサーが結合している。
［配列表］
配列番号２９：１番目のアミノ酸に求電子基−スペーサーが結合している。
配列番号３０：１番目のアミノ酸にスクシニルが結合している。
配列番号３１：１番目のアミノ酸に求電子基−スペーサーが結合している。
［配列表］
Claims (14)
- ポリ核酸に結合する物質であって、求電子基を有する第１部分と、ペプチド、化合物および核酸からなる群から選択される１種以上を有する第２部分とを含むことを特徴とするポリ核酸結合物質。
- ポリ核酸がＲＮＡである、請求項１記載のポリ核酸結合物質。
- ＲＮＡがＲＲＥ配列部位を含むものである、請求項２記載のポリ核酸結合物質。
- 第２部分がペプチドを含む、請求項１記載のポリ核酸結合物質。
- ペプチドが、次式Ｉ：
Ｒ−Ｑ−Ｒ−Ｘ （Ｉ）
（ＸはＲ以外のアミノ酸残基を表す。）
で示されるアミノ酸配列を含むペプチド、その誘導体又はこれらの塩である、請求項４記載のポリ核酸結合物質。 - ペプチドが、以下の（ａ）又は（ｂ）のペプチド、その誘導体又はこれらの塩である、請求項４記載のポリ核酸結合物質。
（ａ）次式Ｉ：
Ｒ−Ｑ−Ｒ−Ｘ （Ｉ）
（ＸはＲ以外のアミノ酸残基を表す。）
で示されるアミノ酸配列を含む１２〜２３残基の長さのアミノ酸配列を有するペプチド
（ｂ）次式Ｉ：
Ｒ−Ｑ−Ｒ−Ｘ （Ｉ）
（ＸはＲ以外のアミノ酸残基を表す。）
で示されるアミノ酸配列を含む１２〜２３残基の長さのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、ＲＮＡ結合活性を有するペプチド - Ｒが少なくとも９〜１１残基含まれることを特徴とする、請求項５又は６記載のポリ核酸結合物質。
- ペプチドが、以下の（ａ）又は（ｂ）のペプチド、その誘導体又はこれらの塩である、請求項４記載のポリ核酸結合物質。
（ａ）配列番号１〜２７で表されるアミノ酸配列からなるペプチド
（ｂ）配列番号１〜２７で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＲＮＡ結合活性を有するペプチド - 求電子基が下記式で表される基である、請求項１記載のポリ核酸結合物質。
（式中、Ｚはハロゲン原子を表す。） - 第１部分と第２部分との間に、スペーサーを有することを特徴とする、請求項１記載のポリ核酸結合物質。
- 請求項１〜１０のいずれかに記載のポリ核酸結合物質を含有してなる医薬組成物。
- ＨＩＶの増殖抑制剤である、請求項１１記載の医薬組成物。
- ＨＩＶの感染予防剤である、請求項１１記載の医薬組成物。
- ＡＩＤＳの予防剤又は治療剤である、請求項１１記載の医薬組成物。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2005071813 | 2005-03-14 | ||
| JP2005071813 | 2005-03-14 | ||
| PCT/JP2006/305478 WO2006098463A1 (ja) | 2005-03-14 | 2006-03-14 | ポリ核酸結合物質 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPWO2006098463A1 true JPWO2006098463A1 (ja) | 2008-08-28 |
Family
ID=36991807
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2007508240A Pending JPWO2006098463A1 (ja) | 2005-03-14 | 2006-03-14 | ポリ核酸結合物質 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPWO2006098463A1 (ja) |
| WO (1) | WO2006098463A1 (ja) |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH08259596A (ja) * | 1995-03-23 | 1996-10-08 | Hitachi Chem Co Ltd | リジン及びセリンからなる、規則的配列をもつペプチドもしくはポリペプチド |
| US6051429A (en) * | 1995-06-07 | 2000-04-18 | Life Technologies, Inc. | Peptide-enhanced cationic lipid transfections |
| US7060498B1 (en) * | 2001-11-28 | 2006-06-13 | Genta Salus Llc | Polycationic water soluble copolymer and method for transferring polyanionic macromolecules across biological barriers |
| US20030215395A1 (en) * | 2002-05-14 | 2003-11-20 | Lei Yu | Controllably degradable polymeric biomolecule or drug carrier and method of synthesizing said carrier |
| JPWO2005007686A1 (ja) * | 2003-07-16 | 2007-10-11 | 児玉 耕太 | Ｒｎａ結合ペプチド |
-
2006
- 2006-03-14 JP JP2007508240A patent/JPWO2006098463A1/ja active Pending
- 2006-03-14 WO PCT/JP2006/305478 patent/WO2006098463A1/ja active Application Filing
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2006098463A1 (ja) | 2006-09-21 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20210300974A1 (en) | Artificial transcription factors comprising a sliding domain and uses thereof | |
| JP3330595B2 (ja) | ウィルス（ｈｉｖ）増殖抑制 | |
| Lu et al. | Structural determinants and mechanism of HIV-1 genome packaging | |
| US20210254042A1 (en) | Methods and compositions for synthetic rna endonucleases | |
| JPH11502416A (ja) | 診断、予防および治療のための多発性硬化症に関与するウイルス性物質およびヌクレオチドフラグメント | |
| KR102242874B1 (ko) | Ｉｌ―６에 결합하는 압타머 및 ｉｌ―６ 매개된 질환을 치료하거나 진단하는 데에서 이의 용도 | |
| WO2014206336A1 (en) | A hiv-1 fusion inhibitor with long half-life | |
| JPH02264796A (ja) | リボヌクレオチドリダクターゼインヒビター | |
| Lapidot et al. | Insight into the mechanisms of aminoglycoside derivatives interaction with HIV‐1 entry steps and viral gene transcription | |
| JPH10509327A (ja) | 真核開始因子５Ａ（ｅＩＦ−５Ａ）変異体 | |
| JPWO2006098463A1 (ja) | ポリ核酸結合物質 | |
| JPWO2005007686A1 (ja) | Ｒｎａ結合ペプチド | |
| WO2006059638A1 (ja) | 抗ｈｉｖ薬、これを構成するポリペプチド、ポリペプチドをコードする遺伝子、抗ｈｉｖ薬の製造方法 | |
| Druillennec et al. | Nucleomimetic strategy for the inhibition of HIV-1 nucleocapsid protein NCp7 activities | |
| Abelson et al. | Characterization of the caprine arthritis encephalitis virus (CAEV) rev N-terminal elements required for efficient interaction with the RRE | |
| CN105968211B (zh) | 一种重组抗病毒蛋白及其制备方法和应用 | |
| Tang et al. | Synthesis, biophysical characterization, and anti-HIV-1 fusion activity of DNA helix-based inhibitors with a p-benzyloxyphenyl substituent at the 5′-nucleobase site | |
| WO2007043715A1 (ja) | Rna結合ペプチド | |
| WO2007004341A1 (ja) | Ｒｎａ結合ペプチド | |
| JP5422832B2 (ja) | 不活化遺伝子再活性化ペプチド | |
| KR100434451B1 (ko) | 인체 면역결핍 바이러스 1형 (ｈｉｖ-1)의 감염 억제능이높은 펩타이드 및 그 용도 | |
| WO2014022947A1 (zh) | 抑制hiv的短小多肽及药物用途 | |
| WO2008069290A1 (ja) | アクチノヒビン多量体を含む融合タンパク質からなる抗ｈｉｖ薬、これを構成するポリペプチド、ポリペプチドをコードする遺伝子および抗ｈｉｖ薬の製造法 | |
| US20030096760A1 (en) | Method of antagonizing the human SRC SH2 domain | |
| Dunn | Isolation and characterisation of monoclonal antibodies raised against the Pk peptide tag |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20090316 |
|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20090316 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20090818 |
|
| A711 | Notification of change in applicant |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A711 Effective date: 20090818 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20090818 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20111018 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20120228 |