KR100191125B1

KR100191125B1 - 마우스에서 분리한 신규의 swi3계 유전자 및 그로부터 발현되는 단백질

Info

Publication number: KR100191125B1
Application number: KR1019960033288A
Authority: KR
Inventors: 성노현; 박상대; 전성호
Original assignee: 성노현
Priority date: 1996-08-10
Filing date: 1996-08-10
Publication date: 1999-06-15
Also published as: KR960034414A

Abstract

본 발명은 사카로마이시즈 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)의 SWI3 유전자와 유추 아미노산 서열에 있어 매우 높은 상동성을 나타내는 마우스 유래의 신규한 SRG3 (SWI3-related gene)유전자, 그로부터 유추되는 아미노산 서열을 가지는 SRG3 단백질 및 전기 유전자로부터 발현되어 마우스의 SWI2계 단백질과 복합체를 형성하는 신규의 SRG3 단백질에 관한 것이다. 본 발명의 SRG3 유전자는 1101개의 아미노산을 암호화하는 3303bp의 제방해독틀을 포함하고 있다. 아울러, SRG3 유전자로부터 유추되는 아미노산 서열을 분석한 결과, N-말단 부위는 아스파라긴산과 글루탐산이 풍부하여 산성을 띠고, 아르기닌과 라이신이 풍부한 염기성 부위는 C-말단의 로이산-지퍼 모티브와 인접한 곳에 위치하며, C-말단 부위는 프롤린가 글루타민이 풍부한 것으로 확인되었으며, 또한 N-글리코실화 부위 및 인산화 부위가 존재하는 것으로 확인되었다. 본 발명에서 분리한 마우스의 SRG3 유전자는 SRG3 단백질의 발현 및 분리 등에 이용될 수 있으며, 나아가 사람의 SWI3계 유전자 분리에 이용될 수도 있다. 또한, SRG3 단백질은 T 세포 분화의 주요 장소인 흉선에서 높게 발현되므로, 면역 조절인자의 탐색 및 개발에 이용될 수도 있다.

Description

마우스에서 분리한 신규의 SWI3계 유전자(SRG3) 및 그로부터 발현되는 단백질

본 발명은 마우스에서 분리한 신규의 SWI3계 유전자 및 그로부터 발현되는 단백질에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 사카로마이시즈 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)의 SWI3 유전자와 유추 아미노산 서열레 있어 유의한 상동성을 나타내는 마우스 흉선 유래의 신규한 SRG3(SWI3-related gene) 유전자, 그로부터 유추되는 아미노산 서열을 가지는 SRG3 단백질 및 전기 유전자로부터 발현되어 마우스의 SWI2계 단백질과 복합체를 형성하는 신규의 SRG3 단백질에 관한 것이다.

SWI/SNF 복합체의 다섯 가지 단위체(subunit)는 SWI1(ADR6), SWI2(SNF2), SWI3, SNF5 및 SNF6 유저자에 의해 암호화되는데, 사카로마이시즈 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)에서 교배형 전환과 관련된 HO 유전자 및 전화효소(intertase)를 암호화하며 포도당에 의해 발현이 저하되는 SUC2 유전자의 양성적인 조절자로서 처음 발견되었다(참조: Stern, M. et al., J. Mol. Biol., 178:853-868(1984); Sternberg, P. W. et al., Cell, 48:567-577(1987); Carlson, M. et al., Genetics, 98;25-40(1981); Laurent, B. C. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 88;2687-2691(1991); Neigeborn, L., and Carlson. M., Genetics, 108;845-858(1984)). 이후, 이들 SWI 유전자의 발현 단백질은 수많은 조절성 유전자들, 예를 들면, 효모의 GAL4, 초파리(Drosophila)의 ftz, 포유동물의 스테로이드(steroid)수용체 및 렉스 에이-비코이드(LexA-Bicoid) 융합 단백질 유전자의 전사를 활성시키는 것으로 밝혀졌다. 또한, SWI/SNF 단백질은 염색질(chromation)의 억제 작용을 증화시켜 전사활성을 촉진시키기도 하고, 전효소(holoenzyme) 형태의 효모 RNA 폴리머라제(polymerase) II 의 필수 구성요소로서 전기 전효소에 뉴클레오좀(nucleosome) DNA를 붕괴시키는 능력을 부여하는 것으로 보고되고 있다.

상기와 같은 SWI/SNF 단백질들의 활성은 서로 긴밀하게 연관되어 있으며, 유전자-특이적인 활성인자와 결합하는 복합체의 구성 요소로서 작용한다. SWI/SNF 유전자에 변이를 유도하면 다섯 가지 유전자의 변이가 모두 매우 유사한 표현형을 형성하게 되며, 다중 결손성 swi 또는 snf 변이체의 표현형은 단일성 swi 또는 snf 변이체의 표현형과 동일하다. 그 밖에도, 다섯 종류의 SWI/SNF 단백질 모두가 그들 자신 유전자의 전사에 필요하며, SWI1 및 SWI2 단백질이 없으면 SWI3 단백질의 안정성이 저하되는 것으로 밝혀졌다. 더욱이, SWI/SNF 단백질들은 상호 의존적으로 전사활성에 관여하여, 다석 상지의 SWI/SNF 폴리펩티드는 함께 정제되고 항체에 의해 함께 침전되며, 거대한 다단위체 복합체의 구성성분인 것으로 밝혀졌다.

상술한 SWI/SNF 복합체의 기능이 하기와 같은 보고로부터 고등 진핵생물에서 보존 되고 있을 것으로 추측된다. 즉, 래트(rat)의 글루코코르티코이드(glucocorticoid) 수용체(GR)는 사카로마이시즈 세레비지애(S. cerevisiae)에서의 전사를 촉진시키기 위해 SWI/SNF 단백질을 필요로 하며, GR-SWI3 복합체가 야생형(SWI3⁺)의 효모 추출물에서 항체에 의해 함께 침전되는 것으로 밝혀졌다. 뿐만 아니라, SWI3에 대한 항체가 초파리의 핵 추출물에서 래트 GR의 전사 촉진 기능을 저해 하는 것으로 밝혀졌다.

아울러, 이러한 보고들은 포유동물에도 사카로마이시즈 세레비지애 SWI/SNF 복합체의 동족 단백질이 존재함이 시사한다. 그러나, SWI/SNF 복합체는 크기가 크고 기능적 다양성이 예상되므로, 서열의 유사성만으로 포유동물의 동족 단백질을 찾아내기는 매우 어려운 실정이어서, 지금까지 brm(초파리의 유사성(homeotic)유전자의 활성인자), hbrm(또는 hSNF2α라고도 함) 및 BRG-1(또는 hSNFβ라고도 함)와 같은 SWI2 단백질의 동족 단백질만이 보고되고 있다. 최근에는 사람의 면역결핍증 바이러스-타잎 1(HIV-1) 조립효소(intergrase)와 상호작용하는 SNF5 에 대한사람의 동족 단백질을 발견하기도 하엿다 또한, 효모의 SWI/SNF와 유사한 시험관내(in vitro) 활성을 가진 복합체가 사람의 HeLa 세포에서 부분 정제되었다. 이러한 결과들로 미루어 보아, SWI 단백질은 고등 진핵생물에서 폭넓게 보존되어 있음을 알 수 있다.

그러나, SWI3에 대한 동족 단백질은 고등 진핵 생물에서 아직 발견되지 않았다.

이에, 본 발명자들은 사카로마이시즈 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)의 SWI3 유전자와 유추 아미노산 서열에 있어 유의한 상동성을 나타내는 SRG3 유전자를 고등 진핵생물인 마우스로부터 분리하고, 전기 유전자로부터 발현되는 신규한 SRG3 단백질이 마우스의 SWI2계 단백질과 복합체를 형성함을 규명하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

결국, 본 발명의 주된 목적은 마우스에서 분리한 신규의 SWI3계 유전자인 SRG3 유전자 및 그로부터 유추되는 아미노산 서열을 가지는 SRG3 단백질을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 전기 SRG3 유전자로부터 발현되어 마우스의 SWI2계 단백질과 복합체를 형성하는 신규한 SRG3 단백질을 제공하는 것이다.

제1도는 SRG3 유전자 및 3가지 클론의 제한효소 지도이다.

제2도는 SRG3 유전자의 염기서열 및 그로부터 유추되는 아미노산 서열을 나타낸다.

제3도는 SRG3 단백질과 사카로마이시즈 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) SWI3 단백질과의 아미노산 서열의 상동성을 나타내는 영역을 도시한 그림이다.

제4(a)도는 마우스의 여러가지 조직에서의 SRG3 유전자의 발현을 조사한 노던 블럿(Nothern blot) 분석 결과를 나타내는 사진이다.

제4(b)도는 T 세포 및 B 세포에서의 SRG3 유전자의발현을 조사한 노던 블럿(Nothern blot) 분석 결과를 나타내는 사진이다.

제5도는 SRG3 단백질의 면역학적 블럿(immunoblot) 및 면역학적 침전(immunoprecipitation)결과를 나타내는 사진이다.

이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 한다.

고등 진핵생물인 마우스에서 SWI3계 유전자를 분리하기 위해, 우선 마우스의 비장 및 흉선으로부터 각각 poly(A)⁺RNA를 수득한 다음, 비장에서는 발현되지 않고 흉선에서만 특이적으로 발현되는 유전자를 분리할 수 있는 공제성 탐침(subtractive probe)을 제조하였다. 그를 사용하여 마우스의 흉선 cDNA 라이브러리로부터 SWI3 유전자계인 신규한 SRG3 유전자를 클로닝하였다. 이렇게 얻은 SRG3 전체 유전자의 염기서열을 결정하여 분석한 결과, SRG3 유전자는 3303bp의 하나의 긴 개방해독들을 가지고 있으며 이 개방해독들은 분자량이 125kDa으로 추측되는 1101개의 아미노산을 암호화는 것으로 확인되었다.

또한, 상기 SRG3 유전자로부터 유추되는 아미노산 서열을 분석한 결과, MH₂-말단의 분비신호와 막 횡단 부위로 추측되는 서열은 없고, N-글리코실화 부위로 예상되는 위치가 세 개 있는 것으로 확인되었다. 아울러, N-말단 부위는 아스파라긴산과 글루탐산이 풍부하여 산성을 띠고, 아르기닝과 러이신이 풍부하고 다른 단백질 또는 DNA와 결합할 가능성이 높은 염기성 부위는 C-말단의 로이신-지퍼 모티브(leucin-zipper motif)와 인접한 곳에 위치하며, C-말단 부위는 프롤린과 글루타민이 풍부한 것으로 밝혀졌다. 따라서, 상기 SRG3 단백질은 다른 단백질과 상호작용하여 전사촉인자로 작용할 것으로 추측되며, DNA와 직접적으로 결합할 가능성도 있으리라 추측된다.

한편, 사카로마이시즈 세레비지애의 SWI3 단백질은 N-말단에 산성도가 높은 부위가 존재하고 C-말단에 인접해서 로이신-지퍼 모티브가 존재하는 99kDa의 핵단백질로 알려져 있다. 이에, SWI3 단백질과 SRG3 단백질의 유추 아미노산 서열을 비교한 결과, 여섯 부분에서 15 내지 40%의 동일성과 38 내지 77%의 유사성을 나타내어, SRG3 단백질은 SWI3와 매우 높은 아미노산 유사성을 가지고 있음을 알 수 있었고, 또한 두 단백질은 그들의 N-말단 부위가 매우 높은 산성을 나타내고, 로이신-지퍼 모티브에 해당하는 아미노산 서열이 거의 동일하다는 점에서 매우 유사하였다. 그러나, SRG3 단백질에는 염기성 부위가 로이신-지퍼 모티브 근처에 존재하는 반면에, SWI3 단백질에는 그 부위가 없으며, SRG3 단백질의 C-말단 부분에는 프롤린 및 글루타민 잔기가 풍부한 반면에, SWI3 단백질의 경우에는 그러하지 않다는 면에서 상이하였다. 따라서, 이 두가지 단백질은 유사한 단백질 구조와 생화학적 기능을 가질 것이라고 추측되기도 하지만, 구조와 기능 면에서 차이가 있을 것으로 추측된다.

마우스의 여러가지 다른 조직과 세포에서의 SRG3 단백질의 발현 정도를 알아보기 위하여, 각 조직과 세포로부터 추출한 총 RNA를 사용하여 노던 블럿을 실시한 결과, 상기 유전자는 흉선, 정소 및 뇌에서 높은 수준으로 발현되고 비장 및 다른 조직에서는 낮게 발현되는 것으로 확인되었다. 또한, 흉선에서 주로 분화하는 T 세포에서 SRG 3 유전자가 주로 발현될 가능성이 있는지 알아보기 위하여, T 세포와 B 세포를 분리하고 RNA를 추출하여 노던 블럿을 실시한 결과, T 세포와 B 세포 모두 SRG3 단백질을 발현하지만 흉선세포에서의 발현정도의 30% 이하인 것으로 관찰되었다.

아울러, SRG3 유전자로부터 발현된 단백질의 특이성을 규명하기 위하여, SRG3 융합 단백질에 대한 다클론 항체를 제조하고, 그를 사용하여 흉선의 세포파쇄액에 대한 면역학적 침전과 면역블럿 분석을 실시하였다. 그 결과, SRG3 단백질의 추정 분자량 125kDa보다 큰 170kDa 위치에서 특이적인 밴드가 확인되었는데, 이는 SRG3 단백질에 당이나 인산기가 덧붙여져 실제 분자량이 증가하였음을 의미한다. 또한, SRG3 단백질은 마우스의 SWI2계 단백질 또는 다른 SWI/SNF 단백질과 복합체를 형성함을 알 수 있었고, 효모의 swi3^-변이체를 보완하지 못함을 확인하였다.

상술한 본 발명의 SRG3 cONA는 SRG3 단백질의 반현 및 분리 등에 이용될 수 있으며, 나아가 사람의 SWI3계의 유전자 분리에 이용될 수 있다. 또한, SRG3 단백질은 T 세포 분화의 주유 장소인 흉선에서 높게 발현되므로, 면역 조절인자의 탐색 및 개발에 이용될 수도 있다.

한편, 본 발명의 아미노산 서열에 있어서, '기능적으로 동등한'이란 SRG3 단백질의 아미노산 서열 중에서 Gly, Ala; Val, Ile, Leu; Asp, Glu; Asn, Gln; Ser, Thr; Lys, Arg; 및, Phe, Tyr과 같은 조합으로 치환된 모든 단백질을 의미한다. 또한, 본 발명의 염기서열에 있어서, '기능적 등가물'이라 함은 SRG3 유전자의 염기서열 중에서 전기 조합의 아미노산을 제공할 수 있는 염기서열을 가지는 모든 유전자를 의미한다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명의 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것는 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

[실시예 1]

[Poly(A)⁺RAN의 분리 및 공제성 탐침이 제조]

고등 진핵생물인 마우스로부터 SWI3계 유전자를 분리하기 위하여, 우선 마우스에서 poly(A)⁺RNA를 제조하였다. 즉, 3 내지 5주된 마우스의 흉선과 비장에서 CsCl₂밴딩(banding) 방법으로 총 RNA를 추출한 후(참조; Chomczunski, P., and Sacchi, N., Anal, Biochem., 162 : 156-159(1987)), 올리고(dT)-셀롤로스 크로마토그래피에 이해 poly(A)⁺RNA를 분리하였다(참조; Avi, H., and Leader, P., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69: 1408-1412(1972)).

이어, 비장에서는 발현되지 않고 흉선에서만 특이적으로 발현되는 유전자를 분리하기 위하여, 공제성 탐침을 하기와 같이 제조하였다. 상기의 poly(A)⁺RAN 10ug을 65℃에서 2분간 가열시키고, 올리고(dT)를 포함하는 1mg의 자기구슬(Dynabeads oligo(dT)₂₅, Dynal Inc., Norway)에 상온에서 30분간 결합시켰다. 이렇게 결합한 poly(A)⁺RNA는 자기장에 의해 떨어지며, 첫번째 가닥의 cDNA의 합성에 주형(template)으로 사용된다.

한편, 흉선에서의 두번째 가닥의 cDNA를 헥사뉴클레오티드 및 200uCi의 [α-³²p]dCTP(3000Ci/mmol)를 사용하여 무작위적 프라이밍(random priming) 방법으로 합성하였다. 이렇게 합성한 방사능 표지된 탐침을 자기구슬에 결합된 첫번째 가닥의 비장 cDNA 100ug과 혼합하여 55℃에서 1시간 동안 처리하였다. 이때, 첫번째 가닥의 비장 cDNA와 결합하는 방사능 표지의 탐침 DNA는 자기장을 이용하여 제거함으로써, 공제성 탐침을 제조하였다.

[실시예 2]

[마우스의 SRG3 유전자의 클로닝 및 그의 염기서열 결정]

마우스에서 SWI3계의 유전자를 분리하기 위하여, 실시예 1에서 제조한 공제성 탐침을 사용하여 마우스의 흉선 cDNA 라이브러리(참조: Eschenfeldt et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 83:9403-9407(1986))로부터 #243 클론을 얻었다. 이 클론은 0.8kb의 cDNA 삽입체를 가지고 있으며, 흉선에서 높게 발현되는 것으로 나타났다. 따라서, 0.8kb cDNA 삽입체의 염기서열을 분석하기 위해 pBluescrip SK벡터(Stratagene, USA)에 서브클로닝한 후, 시쿼네이즈 2.0 키트(United States Biochemical Co., USA)를 사용하여 디데옥시법(참조; Sanger, F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 74:5463-5467(1977))으로 그의 염기서열을 결정하였다. 이렇게 결정된 염기서열을 Blast 프로그램(NCBI, USA)을 이용하여 GenBank 데이터베이스의 염기서열과 비교분석한 결과 신규한 유전자임이 밝혀졌다.

이에, 전체 유전자를 분리하기 위해, #243 클론의 0.8kb cDNA 단편을 탐침으로 사용하여 마우스의 흉선 cDNA 라이브러리를 재스크리닝하였다. 그 결과, 3.2kb의 삽입체를 가지는 cDNA 클론 #3를 얻었다. 이렇게 얻은 유전자의 염기서열을 상기와 같은 방법으로 결정하여 분석한 결과, #3 클론은 ATG의 시작 코돈은 있으나 종결 코돈이 없는 불완전한 개방해독틀(ORF)을 가지고 있는 것으로 확인되었다. 따라서, #3클론의 XbaI/XhoI 단편을 탐침으로 사용하여 마우스의 흉선 cDNA 라이브러리를 재스크리닝한 결과, 종결 코돈과 3'-미전사 부분을 포함하는 3kb의 삽입체를 가지고 있는 클론 #3-2를 분리할 수 있었다(참조; 제1도). 결국, SRG3 유전자는 #3과 #3-2 두 클론의 XbaI 단편을 연결시킴으로써, 전체 4.7kb의 cDNA로 제조되었다. 제1도에서, 검은 부분은 개방해독틀을 나타내고, H, Bg, S, P, X 및 K는 각각 제한효소 HinIII, BgIII, SalI, PstI, XbaI 및 KpnI의 절단부위를 나타낸다.

이렇게 클로닝된 SRG3 전체 유전자의 염기서열을 상기와 같은 방법으로 결정하여 분석한 결과, SRG3 유전자는 3303bp의 하나의 긴 개방해독틀을 포함하고 있으며 이 개방해독틀은 1101개의 아미노산을 암호화하여 그의 분자량이 125kDa으로 추측되었다(참조: 제2도). 제2도는 SRG3 유전자의 염기서열과 그로부터 유추되는 아미노산 서열을 나타낸다. 제2도에서, 대문자로 표시된 염기서열은 1101개의 아미노산을 암호화하는 개방해독틀을 나타내고, (*)는 로이신-지퍼 모티브로 예상되는 위치를 나타내며, 밑출친 부분은 효모의 SWI3 단백질과 아미노산 유사성을 보이는 부분을 나타냈다.

[실시예 3]

[SRG3 유전자의 분석]

SRG3 유전자의 염기서열로부터 유추되는 아미노산 서열을 Blast 프로그램(NCBI, USA)을 이용하여 SWISS-PROT 데이터베이스의 아미노산 서열과 비교분석한 결과, 사카로마이시즈 세레비지애의 SWI3 단백질과 유사성이 있는 것으로 밝혀졌다(참조: 제3도 및 표 1). 또한, 서열분석 결과 상기 유전자에는 NH₂-말단의 분비신호와 막 횡단 부위로 추측되는 서열은 없고, N-글리코실화 부위로 예상되는 위치가 세개 있는 것으로 확인되었다. 한편, 효모의 SWI3 단백질은 N-말단에 산성도가 높은 부위가 존재하는 C-말단에 인접해서 로이신-지퍼 모티브가 존재하는 99kDa의 핵단백질로 알려져 있다.

제3도에서, SRG3 단백질과 효모의 SWI3 단백질과의 아미노산 유사성을 나타내는 영역 I, II, III, V 및 VI은 각각 서로 다른 무늬에 네모로 표시하였다. 제3도에서 보듯이, 아미노산 서열로부터 유추되는 단백질의 N-말단 부위는 산성을 높게 띄고 있는데, 211번 위치의 아미노산에서부터 441전 위치의 아미노산에 해당되는 231개의 아미노산 중에서 23%가 아스파라긴산과 글루탐산이었다(참조: 제2도). 또한, 다른 단백질과 결합하여 DNA와 결합할 가능성이 있는 염기성 부위(참조: Landschulz, W. H., et al, Science, 240:1759-1764(1988))는 C-말단의 로이신-지퍼 모티브와 인접한 곳에 위치하고 있는데, 로이신-지퍼 모티브의 N-말단 방향으로 아미노산 위치 #767-#859에 해당되는 92개의 아미노산 중 42%가 아르기닌과 라이신이었다(참조: 제2도). 또한 상기 단백질의 C-말단에는 프롤린과 글루타민이 많이 분포되어 있는 부위가 있는 것으로 나타났다. 즉, 952번 위치의 아미노산에서부터 1101번 위치의 아미노산에 해당되는 150개의 아미노산 중에서 44%가 프롤린과 글루타민이었다(참조; 제2도). 그러므로, 상기 단백질은 다른 단백질과 상호작용하여 전사촉진 인자로 작용하는 것으로 추측되며, DNA와 직접적으로 결합할 가능성도 있으리라 추측된다.

상기 표 1에서 보듯이, SRG3 단백질과 효모의 SWI3 단백질은 I 내지 VI부분으로 표시된 여섯 부분의 아미노산 서열에서 15 내지 40%의 동일성 및 38 내지 77%의 유사성을 나타냄을 알 수 있다.

아울러, I 및 II부분을 포함하는 N-말단 부위는 두 단백질 모두 매우 높은 산성을 나타내고, SWI3 단백질의 두번째 로이신이 SRG3 단백질에서느 페닐알라닌으로 바뀐 것 외에는 두 단백질 모두 똑같이 VI부분에서 로이신-지퍼 모티브가 위치한다(참조: 제2도). 그러나, SWI3 단백질에는 DNA와 결합에 필요한 염기성 부위가 로이신-지퍼 모티브 근처에 없는 반면에, SRG3 단백질에는 아르기닌과 라이신이 풍부한 염기성 부위가 로이신-지퍼 모티브 근처에 존재한다. 뿐만 아니라, SRG3 단백질과 SRG3 단백질은 C-말단 부분에서도 차이가 있는데, 프롤린 및 글루타민이 풍부한 부위가 SWI3 단백질과 달리 SRG3 단백질의 C-말단에는 존재한다. 따라서, 전기 두가지 단백질은 유사한 단백질 구조와 생화학적 기능을 가질 것이라고 추측되기도 하지만, 구조와 기능 면에서 두 단백질 사이에 차이가 있을 것으로 추측된다.

[실시예 4]

[여러가지 조직과 세포에서의 SRG3 유전자의 발현 수준 분석]

마우스의 여러가지 다른 조직과 세포에서의 SRG3 단백질의 발현정도를 알아보기 위하여, 각 조직과 세포로부터 추출한 총 RNA 15ug을 개방해독을 주요부분을 포함하는 1.8kb의 HidIII 단편을 탐침으로 하여 노던 블럿을 실시한 결과, 3.5kb와 5kb 크기의 전사체가 확인되었다(참조: 제4(a)도). 제4(a)도에서, 제1, 2, 3, 4, 5, 6 및 7레인은 흉선, 비장, 림프절, 정소, 뇌, 심장 및 폐에서의 발현정도를 각각 나타낸다. 이때, 화살표는 각각 3.5kb와 5kb의 전사체를 표시한다. 제4(a)도에서 보듯이, SRG3 유전자는 흉선, 정소 및 뇌에서 높은 수준으로 발현되나, 비장 및 다른 조직에서는 낮게 발현됨을 알 수 있었다.

아울러, 흉선에서 주로 분화하는 T 세포에서 SRG3 유전자가 발현될 가능성이 있는지 알아보기 위하여, 우선 T 세포와 B 세포를 분리하였다. 즉, C57BL/6J 마우스의 비장과 림프절로부터 단일세포액을 수득하고 적혈구를 제거한 다음, PBS 용액(137mM NcCl, 2.7mM KCl, 4.3mM Ha₂HPO₄, 1.4mM KH₂PO₄, pH 7.3)에 현탁시켰다. 바이오틴(biotin)이 결합된 T 세포 수용체에 특이적인 H57-597 항체와 10⁷개의 세포 당 10ul의 스트렙타비딘(streptavidin)이 결합된 마이크로비드(microbead)로 T 세포를 염색하였다. B 세포는 마이크로비드에 결합된 염소의 항-마우스 IgM으로 염색하였다.

이렇게 염색한 세포들을 자기적 세포분리기(Miltenyi Biotec, GmbH, Bergisch Gladbach, FRG)을 이용하여 분리한 후, 분리된 세포들의 순수도를 FACS(fluorescence activated cell sorter) 분석으로 확인하였다. 분리된 세포들의 순수도를 T 세포에 대해 특이적인 유전자인 TCF-1 유전자를 탐침으로 사용하여 RNA 블럿으로 분석한 결과, 후술하는 제4(b)도에서 보듯이 매우 순수한 것으로 확인되었다.

이렇게 분리한 T 세포 및 B 세포로부터 RNA를 추출하고, 상술한 방법으로 노던 블럿으로 실시하였다(참조; 제4(b)도). 제4(b)도에서, 제1,2 및 3레인은 흉선, T 세포 및 B 세포에서의 발현정도를 각각 나타낸다. 이때, 검은 화살표는 TCF-1 유전자를 탕침으로 사용한 노던블럿으로 분석의 결과를 나타내고, 흰 화살표는 대조구로서 β-액틴의 유전자를 탐침으로 사용한 노던블럿 분석의 결과를 나타낸다. 제4(b)도에서 보듯이, T 세포와 B 세포 모두 SRG3 단백질을 발현하지만, 흉선세포에서의 발현정도의 30%인 것으로 확인되었다.

[실시예 5]

[SRG3 유전자의 발현 단백질에 대한 특성 규명]

SRG3 유전자의 발현으로 생성된 단백질의 특성을 규명하기 위하여, 우선 SRG3-GST 융합 단백질에 대한 디클론 항체를 하기와 같은 방법으로 제조하였다. 즉, SRG3 유전자의 C-말단 부분을 GST(glutathion-S-transferase) 유전자를 가지고 있는 pGEX4T-2 플라스미드(Pharmacia Biotech., Sweden)에 삽입하였다. 이어, 그를 E. coli DH5α 세포에 도입하고, 제조합 재장균을 밤새도록 배양한 다음, 200ml의 LB 배양액에 200 배로 희석하여 넣고, 2시간 동안 진탕배양하였다. 그런 다음, 용합 단백질의 발현을 유도하기 위해, 1mM IPTG를 처리하여 3시간 동안 더 배양하였다. 배양한 세포를 수득하여 파쇄하고, 다량 발현된 분자량 약 85kDa의 GST-3C 융합 단백질을 글루타치온-시파로즈 4B 친화성 크로마토그래피에 의해 정제하였다(참조: Smith, D. B., and Johnson, K.S., Gene, 67:31-40(1988)). 정제된 융합 단백질을 뉴질랜드 흰 토끼에 피하주사하고, 이어 두 번의 추가 항원자극으로 GST-3C 융합 단백질에 대한 다클론 혈청을 얻었다.

SRG3 유전자로부터 발현된 단백질의 특성을 알아보고자, 흉선의 세포파쇄액을 사용하여 다음과 같이 면역학적 침전과 면역블럿 분석을 실시하였다. 즉, 마우스의 흉선으로부터 단일세포 현탁액을 수득하고, 0.1mM의 초산칼륨, 2.25ug/ml의 펩스타틴(pepstatin), 10ug/ml의 류펩틴(leupeptin) 1ug/m의 소이빈 저해제(soybean inhibitor), 2mM PMSF 및 0.1mM DTT를 포함하는 IP 완충액(20mM HEPES, pH 7.6, 10% glycerol, 25mM MgCl₂, 0.1mM EDTA, 0.2% NP-40)을 처리하여 단일세포를 수득하였다. 이렇게 수득한 세포를 8분 동안 초음파 파쇄하고, 15,000× g에서 5분간 4℃에서 원심분리하여 상층액을 취하였다. 이어, 20ul의 33% 단백질 A-세파로즈 현탁액을 가하고, 90분 동안 반응시켜 상층액에 존재하는 항체를 제거한 다음, 상기에서 제조한 SRG3에 대한 혈청 3ul를 가하여 4℃에서 밤새도록 반응시켰다. 그런 다음, 20ul의 33% 단백질 A-세파로즈 현탄액으로 1시간 동안 반응시키고, 0.6M 초산칼륨을 포함하는 IP 완충액으로 세번 세척하여, HEPES가 없는 IP 완충액으로 한번 세척하였다. 이렇게 침전된 단백질을 10ul의 SDS-PAGE 시료용 완충액에 용해시키고, 2분간 끓인 다음, SDS-PAGE 전기영동하고 면역블럿 분석하였다(참조: 제5도). 이때, 1차 항체로는 상기에서 제조한 SRG3에 대한 혈청 또는 hSNF2에 대한 혈청(참조: Khavarl et al., Nature, 366 : 170-174(1993))을 사용하였고, 2차 항체로는 염기성 인산화효소(alkaline phosphatase)가 결합된 항-토끼 IgG 항체를 사용하였다.

제5도에서, 제1 레인은 흉선의 세포파쇄액을 직접 면역블럿 분석한 결과를 나타내고, 제2 레인은 흉선의 세포파쇄액을 SRG3에 대핸 혈청으로 침전시킨 후 면역 블럿 분석한 결과를 각각 나타낸다. 제5도의 제1 및 2레인으로 부터, 170kDa 위치에서 SRG3에 대한 특이적인 밴드가 확인됨을 알 수 있었는데, 이는 염기서열로부터 유추되는 분자량 125kDa과 상당한 차이를 나타낸다. 이와 마찬가지로, 효모 SWI3 단백질의 분자량도 염기서열로부터 유추되는 분자량은 99kDa이지만 실지 전기영동상에서는 130kDa의 밴드로 확인되었다(참조: Cairns, B.R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:1950-1954(1994); Peterson, C.L., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:2905-2908(1994)). 따라서, SWI3 단백질과 SRG3 단백질은 아마도 당이나 인산기가 덧붙여져 겔 상에서의 실제 분자량이 증가한 것으로 추측한다. 실지로, SRG3 단백질에는 세 개의 N-글리코실화 가능 위치 및 몇 개의 인산화 가능 위치가 존재한다.

한편, HeLa 세포의 핵추출물은 BRGI에 대한 항체를 사용하여 침전시켰을 때, 사람의 SNF2/SWI2계 단백질이 분자량 43, 45, 50, 60, 150, 및 170kDa 등의 여섯 개의 다른 단백질과 같이 침전되는 것으로 보고되어(참조: Kwon, H., et al, Nature, 370:477-481(1994)). 여섯 개 다른 단백질 중의 하나인 170kDa 단백질이 SRG3 단백질에 대한 사람의 동족체일 가능성이 제시되었다. 따라서, SRG3 단백질의 마우스의 SWI2계 단백질과 같은 다른 단백질과 결합되어 있는지 조사해 보인다.

제5도의 제3 레인에서 보듯이, 상기 흉선의 세포파쇄액을 hSNF2에 대한 혈청으로 면역블럿 분석을 했을 때, hSNF2와 비슷한 크기인 약 195kDa의 분자량을 가진 단백질이 확인되었다. 이 결과는 hSNF에 대한 혈청이 마우스의 동족 단백질도 인지함을 나타낸다.

상기와 같은 방법으로 흉선의 세포파쇄액을 SRG3에 대한 혈청으로 침전시키고, hSNF2에 대한 혈청으로 면역블럭 분석을 실시한 결과, 마우스의 SWI2계 단백질에 해당하는 특이적 밴드가 나타났다(참조: 제5도의 제4 레인). 반면에, 대조 혈청으로 면역학적 침전시킨 후 hSNF2에 대한 혈청으로 면역블럿 분석을 했을 때는 특이적인 밴드가 나타나지 않았다(참조: 제5도의 제5 레인). 이 결과로 부터, SRG3 단백질은 마우스의 SWI2계 단백질과 결합하고 있음을 알 수 있고, 아마도 마우스의 다른 SWI/SNF 단백질과도 결합하고 있으리라 추측되었다.

이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명은 사카로마이시즈 세레비지애의 SWI3 유전자와 유추 아미노산 서열에 있어 매우 높은 상등성을 나타내는 마우스 유래의 신규한 SRG3 유전자, 그로부터 유추되는 아미노산 서열을 가지는 SRG3 단백질 및 전기 유전자로부터 발현되어 마우스의 SWI2계 단백질과 복합체를 형성하는 신규의 SRG3 단백질을 제공한다. 본 발명의 SRG3 유전자는 1101개의 아미노산을 암호화하는 3303bp의 개방해독틀을 포함하고 있다. 아울러, SRG3 유전자로부터 유추되는 아미노산 서열을 분석한 결과, N-말단 부위는 프롤린과 글루타민이 풍부하여 산성을 띠고, 아르기닌과 라이신이 풍부한 염기성 부위는 C-말단측의 로이신-지퍼 모티브와 인접한 곳에 위치하며, C-말단 부위는 프롤린과 글루타민이 풍부한 것으로 확인되었으며, 또한 N-글리코실화 부위 및 인산화 부위가 존재하는 것으로 확인되었다. 본 발명에서 분리한 마우스의 SRG3 유전자는 SRG3 단백질의 발현 및 분리 등에 이용될 수 있으며, 나아가 사람의 SWI3계 유전자 분리에 이용될 수도 있다. 또한, SRG3 단백질은 T 세포 분화의 주요 장소인 흉선에서 높게 발현되므로, 면역 조절인자의 탐색 및 개발에 이용될 수도 있다.

Claims

마우스의 흉선에서 분리한 하기와 같은 염기서열을 가지는
제1항의 염기서열로부터 유추되는 하기와 같은 아미노산 서열을 가지는 SRG3 단백질:
제2항에 있어서, 아미노산 #860-#951의 로이신-지퍼 모티브(leucin-zipper motif)의 N-말단에 아르기닝 및 라이신의 풍부한 염기성 부위가 존재하는 것을 특징으로 하는 SRG3 단백질.
제2항에 있어서, C-말단에 프롤린 및 글루타민이 풍부한 것을 특징으로 하는 SRG3 단백질.
제2항에 있어서, N-글리코실화 위치 및 인산화 위치가 존재하는 것을 특징으로 하는 SRG3 단백질.
제1항의 유전자로부터 발현된 170kDa의 분자량을 가지며, 마우스의 SWI2계의 단백질 또는 다른 SWI/SNF 단백질과 복합체를 형성하는 것을 특징으로 하는 SRG3 단백질.