WO2005095612A1

WO2005095612A1 - グアニンヌクレオチド交換因子をコードする遺伝子およびその遺伝子産物

Info

Publication number: WO2005095612A1
Application number: PCT/JP2005/005918
Authority: WO
Inventors: Osamu Ohara; Takahiro Nagase; Michio Oishi; Hiroshi Yokota; Osamu Kamida
Original assignee: Daiichi Pharmaceutical Co., Ltd.; Kazusa Dna Research Institute Foundation
Priority date: 2004-03-31
Filing date: 2005-03-29
Publication date: 2005-10-13
Also published as: US20070196377A1; EP2112222A1; US7667013B2; US20100125131A1; US8173778B2; JPWO2005095612A1; EP2112222A4; JP4746537B2

Abstract

　低分子量ＧＴＰ結合蛋白質の１グループであるＲｈｏファミリー蛋白質に対してグアニンヌクレオチド交換因子（ＧＥＦ）として作用する新規な蛋白質をコードする遺伝子、すなわち配列番号１、３または５に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドまたはその相補鎖、該ポリヌクレオチドの相同物、前記ポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質、前記ポリヌクレオチドを含むベクター、前記ベクターを含む形質転換体、前記ポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質に対する抗体、前記ポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質の機能および／または発現を阻害する化合物の同定方法、疾患の判定方法、医薬組成物および試薬キットを提供した。

Description

明細書

グァニンヌクレオチド交換因子をコードする遺伝子およびその遺伝子産物技術分野

[0001] 本発明は、低分子量 GTP結合蛋白質の 1グループである Rhoファミリー蛋白質に対してグァニンヌクレオチド交換因子として作用する蛋白質および該蛋白質をコードするポリヌクレオチドに関する。より詳しくは、 Rhoファミリー低分子量 GTP結合蛋白質である Cdc42と結合する蛋白質、該蛋白質をコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含有する組換えベクター、該組換えベクターにより形質転換されてなる形質転換体に関する。また、前記蛋白質の製造方法、前記蛋白質に対する抗体に関する。さらに、前記蛋白質の機能および Zまたは前記ポリヌクレオチドの発現を阻害する化合物の同定方法に関する。また、前記ポリヌクレオチドの発現量を測定することを特徴とする胃腫瘍の診断方法に関する。さらに、前記蛋白質の機能阻害剤および Zまたは前記ポリヌクレオチドの発現阻害剤を有効成分として含んでなる胃腫瘍の防止剤および Zまたは治療剤、前記蛋白質の機能阻害剤および Zまたは前記ポリヌクレオチドの発現阻害剤を用いることを特徴とする、胃腫瘍の防止方法および Z または治療方法に関する。また、前記蛋白質、前記ポリヌクレオチド、前記組換えべクタ一、前記形質転換体および前記抗体のうち、少なくともいずれか 1つを含んでなる試薬キットに関する。背景技術

[0002] Rhoファミリー低分子量 GTP結合蛋白質 (以下、単に Rhoファミリー蛋白質と称することがある）は低分子量 GTP結合蛋白質 (以下、単に低分子量 G蛋白質と称する)の 1グループに属する蛋白質である。低分子量 G蛋白質は、細胞膜受容体と細胞内情報伝達経路に関与する効果器 (エフェクター）との間で、シグナルの増幅因子として作用する。また、低分子量 G蛋白質は、グアノシン^ 三リン酸 (GTP)またはグアノシン^ 二リン酸 (GDP)と特異的に結合し、結合した GTPを GDPに加水分解する酵素活性をもつ。細胞膜受容体に細胞外情報物質が結合すると、そのシグナルが低分子量 G蛋白質に伝達され、低分子量 G蛋白質に結合している GDPと細胞内に存在する GTPとの交換反応（以下、 GDPZGTP交換反応と略称する）が起きる。その結果、活性型 (GTP結合型)低分子量 G蛋白質が生じる。活性型低分子量 G蛋白質は、エフェクターに作用してシグナルを増幅する。その後、活性型低分子量 G蛋白質は、その酵素活性により、結合している GTPを GDPに加水分解し、それにより不活性ィ匕する。このように、低分子量 G蛋白質は、グァニンヌクレオチドの交換により、細胞内情報伝達経路において分子スィッチとして働く。

[0003] Rhoファミリー蛋白質として、 Cdc42、 Raclおよび RhoA等が知られている。 Cdc4 2は線維芽細胞でフイロポディアの形成を制御している。 Raclは、白血球やマクロファージではスーパーォキシドの産生を、線維芽細胞では細胞膜のラッフリングゃラメリポディアの形成を制御している。また、 Cdc42と Raclは c— Jun N末端キナーゼシグナル伝達経路を活性化し得る。このように、 Rhoファミリー蛋白質は、細胞内情報伝達の制御を介して様々な細胞機能に関与している。 Rhoファミリー蛋白質が関与する細胞機能として、例えば細胞骨格の再構成、細胞接着、遺伝子発現等が知られている。 Rhoファミリー蛋白質を介するこのような作用は、発生時の形態形成、白血球等の遊走、神経突起退縮、および癌細胞の転移や浸潤に働くと考えられる。

[0004] Rhoファミリー蛋白質の分子スィッチとしての作用に関与している分子の 1つが Rho グァニンヌクレオチド交換因子 (Rho Guanine nucleotide Exchange Factor 、以下 Rho— GEFと略称する）である。 Rho— GEFは、 Rhoファミリー蛋白質の GDP ZGTP交換反応を促進して Rhoファミリー蛋白質の活性化を促進する機能を有する。この機能により、 Rho— GEFは、 Rhoファミリー蛋白質が関与する細胞内情報伝達の制御に重要な役割を担う。以下、 GDPZGTP交換反応を促進する機能を GEF活性と称することがある。

[0005] Rho— GEFには、特徴的ドメイン構造、例えば Dbl相同ドメイン（Dbl Homology

Domain,以下 DHドメインと略称する）およびプレックストリン相同ドメイン（Pleckst rin Homology Domain,以下 PHドメインと略称する）が存在する。 DHZPHのタンデム構造は、 Rho— GEFに典型的なドメイン構造である。以下、 DHドメインおよび PHドメインのタンデム構造を、 DH/PHドメインと呼称する。

[0006] DHZPHドメインは、 Rho— GEFによる Rhoファミリー蛋白質の活性ィ匕に寄与する重要なドメインであり、 Rho— GEFの活性ドメインであると考えられている。例えば、 R ho— GEFのプロトタィプでぁるproto— Dblのァミノ酸配列のぅち、 DHZPHドメインを含む C末端側領域力もなる蛋白質が、 Rhoファミリー蛋白質を活性ィ匕することが報告されている（非特許文献 1)。この報告において、 proto— Dblの全長 925アミノ酸残基からなるアミノ酸配列のうち N末端側第 1番目から第 497番目のアミノ酸残基の欠失により生じた C末端側領域力もなる蛋白質は、 Rhoファミリー蛋白質を活性ィ匕し、その結果、細胞形質転換に関与した。このことから、 proto— Dblの活性ィ匕は腫瘍原性活性化（oncogenic activation)と考えられて、る。以下、 proto— Dblの C末端側領域からなるこのような蛋白質を oncogenic— Dblと呼称する。 oncogenic— Dbl 力 RhoA、 Cdc42および Raclと結合すること、並びに Cdc42および RhoAに対して GEF活性を有する一方、 Raclには GEF活性を示さないことが報告されている（非特許文献 2)。

[0007] proto— Dblのファミリー蛋白質をコードする遺伝子として、例えば vav (非特許文献 3および 4)、 ost (非特許文献 5)、 lbc (非特許文献 6)等が知られている。これら遺伝子は癌に関与する遺伝子である。その他、 Rho— GEFとして作用する蛋白質をコードする遺伝子として、 Trio (非特許文献 7)や kalirin (非特許文献 8)等が報告されている。 Trioは、そのノックアウトマウスにおいて胎仔発生時の骨格筋の異常および脳の構成異常を引き起こす。 kalirinは、神経細胞における神経突起形成に関与する。このように、 Rho GEFとして作用する蛋白質が関与する細胞機能は各蛋白質ごとに固有であり、また、該蛋白質が活性ィ匕する Rhoファミリー蛋白質もそれぞれ異なる。

[0008] 以下に本明細書において引用した文献を列記する。

非特許文献 1 :ビ（Bi, F. )ら、「モレキュラーアンドセルラーバイオロジー（Mole cular and Cellular Biology)」、 2001年、第 21卷、 p. 1463— 1474。

非特許文献 2 :ハート（Hart, M. J. )ら、「ジャーナルォブバイオロジカルケミストリー（Journal of Biological Chemistry)」、 1994年、第 269卷、 p. 62— 65。非特許文献 3 :カツアブ（Katzav, S. )ら、「ェンボジャーナル（EMBO Journal) J 、 1989年、第 8卷、 p. 2283— 2290。

非特許文献 4 :コステロ（Costello, P. S. )ら、「プロシーディングスォブザナショナルアカデミーォブサイェンシズォブザユナイテッドステーッォブァメリカ (Proceedings of Tne National Academy of sciences of The Uni ted States of America)」、 1999年、第 96卷、 p. 3035— 3040。

非特許文献 5 :ホリイ（Horii, Y. )ら「ェンボジャーナル（EMBO Journal)」、 199 4年、第 13卷、 p. 4776—4786。

非特許文献 6 :トクソズ (Toksoz, D. )ら、「オンコジーン（Oncogene)」、 1994年、第 9卷、 p. 621— 628。

非特許文献 7 :ォブリエン（O ' Brien, S. P. )ら、「プロシーディングスォブザナショナルアカデミーォブサイェンシズォブザユナイテッドステーッォブ

/'メリ力 (Proceedings of The National Academy of sciences of Tne

United States of America)」、 2000年、第 97卷、 p. 12074—12078。

非特許文献 8 :ペンゼス（Penzes, P. )ら、「ジャーナルォブニューロサイエンス (J ounal of Neuroscience)」、 2001年、第 21卷、 p. 8426— 8434。

非特許文献 9 :サムブルック（Sambrook)ら編、「モレキュラークローユング，ァラボラトリーマ-ユアル第 2版」、 1989年、コールドスプリングハーバーラボラトリー。非特許文献 10 :村松正實編、「ラボマ-ユアル遺伝子工学」、 1988年、丸善株式会社。

非特許文献 11 :マディン（Madin, K. )ら、「プロシーディングスォブザナショナルアカデミーォブサイェンシズォブザユナイテッドステーッォブアメリカ (Proceedings oi The National Academy of sciences of fhe United

States of America)」、 2000年、第 97卷、 p. 559— 564。

非特許文献 12 :ウルマー（Ulmer, K. M. )、「サイエンス（Science)」、 1983年、第 219卷、 p. 666— 671。

非特許文献 13 :エールリツヒ（Ehrlich, H. A. )編、「PCRテクノロジー， DNA増幅の原理と応用」、 1989年、ストックトンプレス。

非特許文献 14 :サイキ（Saiki, R. K. )ら、「サイエンス（Science)」、 1985年、第 23 0卷、 p. 1350—1354。

非特許文献 15 :「実験医学」、 1994年、第 12卷、第 6号、 p. 35—。非特許文献 16 :フローマン（Frohman, M. A. )ら、「プロシーディングスォブザナショナルアカデミーォブサイェンシズォブザユナイテッドステーッォブ 7メリ力 (Proceedings of The National Academy of Sciences oi The United States of America)」、 1988年、第 85卷、第 23号、 p. 8998— 9002 非特許文献 17 :サンガー（Sanger, F. )ら、「プロシーディンダスォブザナショナルアカデミーォブサイェンシズォブザユナイテッドステーッォブァメリカ (Proceedings of The National Academy of sciences of Tne Uni ted States of America)」、 1977年、第 74卷、 p. 5463— 5467。

非特許文献 18 :マキサム（Maxam A. M. )ら、「メソッズインェンザィモロジ一（

Methods in Enzymology)」、 1980年、第 65卷、 p. 499— 560。

非特許文献 19 :オハラ（Ohara, O. )ら、「ディーェヌエーリサーチ（DNA Resear ch)」、 1997年、第 4卷、 p. 53— 59。

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0009] 本発明の課題は、新規な Rho— GEFおよび該 Rho— GEFをコードする遺伝子を提供することである。また本発明の課題には、該遺伝子を含有する組換えベクター、該組換えベクターにより形質転換されてなる形質転換体を提供することも含まれる。さらに本発明の課題には、該 Rho— GEFの製造方法および該 Rho— GEFを認識する抗体を提供することも含まれる。また本発明の課題には、該 Rho— GEFの機能および Zまたは該遺伝子の発現を阻害する化合物の同定方法を提供することも含まれる。さらに本発明の課題には、該 Rho— GEFの機能の異常および Zまたは該遺伝子の発現の異常に基づく疾患の防止方法および Zまたは治療方法、並びに該疾患の診断方法、試薬キットを提供することも含まれる。

課題を解決するための手段

[0010] 本発明者らは上記課題解決のために鋭意努力し、新規 Rho— GEFをコードする遺伝子を見出し、該遺伝子を用いて新規 Rho— GEFを取得することに成功した。そして、該 Rho— GEFの DH/PHドメインを含む部分蛋白質力 Rhoファミリー蛋白質である RhoA、 Cdc42および Rac 1とそれぞれ結合することを実験的に明らカにした。また、該蛋白質が Cdc42の活性ィ匕を促進することを実証した。さらに該 Rho— GEF 遺伝子の組織発現が、ある胃腺癌様腫瘍 (Adenocarcinoid tumor)例にお!/、て正常な胃組織の約 5倍、 4. 5倍以上であることを見出した。本発明はこれらの知見に基づいて達成した。

[0011] すなわち、本発明は、配列表の配列番号 1に記載の塩基配列若しくはその相補的塩基配列で表わされるポリヌクレオチド、または配列表の配列番号 2に記載のァミノ酸配列で表わされる蛋白質をコードするポリヌクレオチド若しくは該ポリヌクレオチドの相補的塩基配列で表わされるポリヌクレオチドに関する。

[0012] また本発明は、配列表の配列番号 3若しくは 5に記載の塩基配列またはその相補的塩基配列で表わされるポリヌクレオチド、または配列表の配列番号 4若しくは 6に記載のアミノ酸配列で表わされる蛋白質をコードするポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレォチドの相補的塩基配列で表わされるポリヌクレオチドに関する。

[0013] さらに本発明は、配列表の配列番号 3に記載の塩基配列若しくはその相補的塩基配列で表わされるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、または配列表の配列番号 4に記載のアミノ酸配列で表わされる蛋白質をコードするポリヌクレオチド若しくは該ポリヌクレオチドの相補的塩基配列で表わされるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドであって、 Cdc42の活性ィ匕を促進する蛋白質をコードするポリヌクレオチドに関する。

[0014] さらにまた本発明は、前記ポリヌクレオチドの塩基配列と少なくとも約 70%の相同性を有する塩基配列で表わされるポリヌクレオチドであって、 Cdc42の活性ィ匕を促進する蛋白質をコードするポリヌクレオチドに関する。

[0015] また本発明は、前記ポリヌクレオチドの塩基配列において、 1乃至数個のヌクレオチドの欠失、置換、付加などの変異あるいは誘発変異を有するポリヌクレオチドであつて、 Cdc42の活性ィ匕を促進する蛋白質をコードするポリヌクレオチドに関する。

[0016] さらに本発明は、前記ポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダィゼーシヨンするポリヌクレオチドであって、 Cdc42の活性ィ匕を促進する蛋白質をコードするポリヌクレオチドに関する。 [0017] さらにまた本発明は、前記いずれかのポリヌクレオチドを含有する組換えベクターに関する。

[0018] また本発明は、前記組換えベクターにより形質転換されてなる形質転換体に関する

[0019] さらに本発明は、前記糸且換えベクターおよび Cdc42をコードするポリヌクレオチドを含有する組換えベクターにより形質転換されてなる形質転換体に関する。

[0020] さらにまた本発明は、配列表の配列番号 2に記載のアミノ酸配列で表わされる蛋白質に関する。

[0021] また本発明は、配列表の配列番号 4または 6に記載のアミノ酸配列で表わされる蛋白質に関する。

[0022] さらに本発明は、前記いずれかのポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質に関する。

[0023] さらにまた本発明は、前記形質転換体を培養する工程を含む、前記いずれかの蛋白質の製造方法に関する。

[0024] また本発明は、前記いずれかの蛋白質を認識する抗体に関する。

[0025] さらに本発明は、前記いずれかの蛋白質の機能および Zまたは前記いずれかのポリヌクレオチドの発現を阻害する化合物の同定方法であって、ある化合物と該蛋白質および Zまたは該ポリヌクレオチドとの相互作用を可能にする条件下で、該機能および Zまたは該発現の存在、不存在または変化を検出することにより、該化合物が該蛋白質の機能および Zまたは該ポリヌクレオチドの発現を阻害するか否かを判定することを特徴とする同定方法に関する。

[0026] さらにまた本発明は、蛋白質の機能力 Cdc42と結合する機能および Zまたは Cd c42の活性ィ匕を促進する機能である前記同定方法に関する。

[0027] また本発明は、前記いずれかの蛋白質の機能および Zまたは前記いずれかのポリヌクレオチドの発現を阻害する化合物の同定方法であって、前記いずれかの蛋白質、前記いずれかのポリヌクレオチド、前記組換えベクター、前記形質転換体および前記抗体のうち少なくともいずれか 1つを用いることを特徴とする同定方法に関する。

[0028] さらに本発明は、蛋白質の機能力 Cdc42と結合する機能および Zまたは Cdc42 の活性ィヒを促進する機能である前記同定方法に関する。

[0029] さらにまた本発明は、ヒト胃組織由来の被検組織が、ヒト胃腫瘍由来組織であるか否かを判定する方法であって、該被検組織における前記、ずれかのポリヌクレオチドの発現量を測定することを特徴とする判定方法に関する。

[0030] また本発明は、被検組織における前記いずれかのポリヌクレオチドの発現量力対照であるヒト正常胃由来組織における該ポリヌクレオチドの発現量の 4. 5倍以上である場合に、被検組織がヒト胃腫瘍由来組織であると判定することを特徴とする、前記判定方法に関する。

[0031] さらに本発明は、前記いずれかの蛋白質の機能を阻害する化合物および Zまたは前記いずれかのポリヌクレオチドの発現を阻害する化合物を有効成分として含んでなる胃腫瘍の防止剤および Zまたは治療剤に関する。

[0032] さらにまた本発明は、前記いずれかの蛋白質の機能を阻害する化合物および Zまたは前記、ずれかのポリヌクレオチドの発現を阻害する化合物を用いることを特徴とする胃腫瘍の防止方法および Zまたは治療方法に関する。

[0033] また本発明は、前記いずれかの蛋白質、前記いずれかのポリヌクレオチド、前記組換えベクター、前記形質転換体および前記抗体のうち少なくとも、ずれか 1つを含んでなる試薬キットに関する。

発明の効果

[0034] 本発明においては、 Rhoファミリー蛋白質に結合する機能を有し、 GDPZGTP交換反応を促進して Rhoファミリー蛋白質を活性化し得る新規蛋白質および該蛋白質をコードするポリヌクレオチドを提供できる。本蛋白質は、 Rhoファミリー蛋白質である RhoA、 Cdc42および Raclとそれぞれ結合する。さらに本蛋白質は、 Cdc42の活性化を促進する。本蛋白質およびポリヌクレオチドにより、 Rhoファミリー蛋白質が関与する情報伝達経路および細胞機能の解明とその調節が実施できる。さらに、本蛋白質の機能の異常および Zまたは本ポリヌクレオチド発現の異常に基づく疾患、例えば胃腫瘍の診断、防止および Zまたは治療が実施できる。

図面の簡単な説明

[0035] [図 l]cDNAクローン hj03796または該 cDNAの部分配列からなる DNAであって D H/PHドメインコード領域を含む DNAを用いて構築したベクターを導入した細胞の細胞溶解液において、 hj03796がコードする蛋白質または該蛋白質の DHZPHドメインを含む蛋白質断片 (hj03796DH/PH)を示すバンド力ウェスタンブロッテイング法により検出されたこと (それぞれレーン 1および 4)を説明する図である。 proto- Dbl DHZPHは陽性コントロールとして用いた（レーン 2および 5)。ベクターを導入しなかったコントロール細胞から同様の処理により得た蛋白質溶液では、かかるバンドは検出されな力つた（レーン 3および 6)。（実施例 2)

[0036] [図 2]cDNAクローン hj03796の部分配列からなる DNAであって DHZPHドメインコード領域を含む DNAと、 Racl遺伝子（レーン 1)、 RhoA遺伝子（レーン 2)または Cd c42遺伝子（レーン 3)とを共発現させた細胞の細胞溶解液において、該 DNAがコードする蛋白質（hj03796DHZPH)と Racl (レーン 1)、 RhoA (レーン 2)および Cdc 42 (レーン 3)との結合を示すバンドが検出されたことを説明する図である（上図)。結合の測定はプルダウン法により行った。陰性コントロールとして Rhoファミリー蛋白質の代わりに GST— tag融合 j8—ダルク口-ダーゼを用いたとき、あるいは Rhoファミリ一蛋白質遺伝子を発現させな力つたときには力かるバンドは認められな力つた (それぞれレーン 4および 5)。 proto— Dbl DHZPHは陽性コントロールとして用いた。各細胞溶解液において、 hj03796DHZPHまたは proto— Dbl DHZPHの発現量はほぼ同等であった (下図)。（実施例 3)

[0037] [図 3-A]hj03796DHZPHと Rhoファミリー蛋白質を共発現させた細胞、および hjO 3796DHZPHまたは Rhoファミリー蛋白質を発現させた細胞のいずれにおいても、 hj03796DHまたは Rhoファミリー蛋白質の発現がほぼ同等であったことを示す図である。図中 GEFとは hj03796DHZPHを意味し、 Rhoとは Rhoファミリー蛋白質を意味する。また、黒矢頭は hj03796DHZPHを、白矢頭は Rhoファミリー蛋白質を示す。（実施例 4)

[0038] [図 3-B]hj03796DHZPHと Cdc42を共発現させた細胞で、 Cdc42のみを発現させた細胞と比較して、 PAR— 1に結合する活性型 Cdc42が増加したことを示す図である（レーン 4)。図中 GEFとは hj03796DHZPHを意味し、 Rhoとは Rhoファミリー蛋白質を意味する。また、白矢頭は Rhoファミリー蛋白質を示す。（実施例 4) 発明を実施するための最良の形態

[0039] 以下、本発明について発明の実施の態様をさらに詳しく説明する。

本明細書にぉ、ては、単離された完全長 DNAおよび Zまたは RNA;合成完全長 DNAおよび Zまたは RNA；単離された DNAオリゴヌクレオチド類および Zまたは R NAオリゴヌクレオチド類；ある、は合成 DNAオリゴヌクレオチド類および Zまたは R NAオリゴヌクレオチド類を意味する総称的用語として「ポリヌクレオチド」 t 、う用語を使用し、ここでそのような DNAおよび Zまたは RNAは最小サイズが 2ヌクレオチドである。

[0040] 本明細書においては、単離された若しくは合成の完全長蛋白質;単離された若しくは合成の完全長ポリペプチド；または単離された若しくは合成の完全長オリゴぺプチドを意味する総称的用語として「蛋白質」という用語を使用し、ここで蛋白質、ポリぺプチド若しくはオリゴペプチドは最小サイズが 2アミノ酸である。以降、アミノ酸を表記する場合、 1文字または 3文字にて表記することがある。

[0041] (ポリヌクレオチド）

本発明の一態様は新規ポリヌクレオチドに関する。本ポリヌクレオチドは、ヒト脳由来長鎖 cDNAライブラリーから、 Rho— GEFに特徴的なドメインである DH/PHドメインをコードする領域を有する遺伝子として同定した。ヒト脳由来長鎖 cDNAライブラリ一は、市販のヒト脳、胎児脳および脳海馬由来の polyA+RNAを出発原料として常法により構築した cDNAライブラリーについて dbEST(database of Expressed Sequence Tags)分析により cDNA断片を単離して全塩基配列を決定した cDNA クローンからなる cDNAライブラリーである。

[0042] 本発明に係るポリヌクレオチドの具体的態様は、配列表の配列番号 1に記載の塩基配列またはその相補的塩基配列で表わされるポリヌクレオチドであり得る。配列番号 1に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドは、 4977bpのポリヌクレオチドであり、 1340アミノ酸残基 (配列番号 2)をコードするオープンリーディングフレーム（ ORF)を含む。配列番号 1に記載の塩基配列にぉ、て第 602番目から第 1126番目までのヌクレオチドからなる領域は、配列番号 2に記載のアミノ酸配列の第 97番目のノリン (Val)力も第 271番目のァスパラギン酸 (Asp)までの 175アミノ酸残基力もなる DHドメインをコードする。配列番号 1に記載の塩基配列において第 1202番目から第 1495番目までのヌクレオチドからなる領域は、配列番号 2に記載のアミノ酸配列の第 297番目のロイシン（Leu)から第 394番目のロイシン（Leu)までの 98アミノ酸残基力なる PHドメインをコードする。配列番号 1に記載の塩基配列において第 602番目力も第 1495番目までのヌクレオチド力もなる領域は、配列番号 2に記載のアミノ酸配列の第 97番目のパリン (Val)から第 394番目のロイシン（Leu)までの 298アミノ酸残基力もなる DHZPHドメインをコードする。本発明の範囲には、配列番号 2に記載のアミノ酸配列で表わされる蛋白質をコードするポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドの相補的塩基配列で表わされるポリヌクレオチドも包含される。

[0043] 本発明に係るポリヌクレオチドとしてまた、配列番号 3若しくは 5に記載の塩基配列またはその相補的塩基配列で表わされるポリヌクレオチドが例示できる。配列番号 3 に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドは、配列番号 1に記載の塩基配列の第 581番目力も第 1675番目までの塩基配列で表わされるポリヌクレオチドである。また、配列番号 5に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドは、配列番号 3に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドの^末端にコザックコンセンサス配列（以下、コザックシークェンスと略称する）とメチォニンに対応するコドンとからなるオリゴヌクレオチド (配列番号 19)が付加されたポリヌクレオチドである。配列番号 3または 5に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドは、 Rho— GEFの活性ドメインである DHZPHドメインをコードする領域を含む。

[0044] 本発明に係るポリヌクレオチドは、好ましくは、 Rhoファミリー蛋白質の活性ィ匕を促進する機能を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドの相補的塩基配列で表わされるポリヌクレオチドである。かかるポリヌクレオチドとして、配列番号 5に記載の塩基配列またはその相補的塩基配列で表わされるポリヌクレオチドを好ましく例示できる。配列番号 5に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドと Rhoファミリー蛋白質をコードする遺伝子とを共に発現させた動物細胞において、 Rhoファミリー蛋白質の活性ィ匕が促進された (実施例 4参照)。すなわち、配列番号 5 に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質は、 Rhoフアミリー蛋白質の活性ィ匕を促進すると考える。配列番号 5に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドは、配列番号 1に記載の塩基配列の第 581番目力も第 1675番目までの塩基配列で表わされるポリヌクレオチド (配列番号 3)の^末端にコザックシークエンスとメチォニンに対応するコドンとからなるオリゴヌクレオチド (配列番号 19) が付加されたポリヌクレオチド (配列番号 5)である。配列番号 5に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質は、配列番号 3に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質の N末端にメチォニンがぺプチド結合により付加された蛋白質である。コザックシークェンスとメチォニンに対応するコドンとからなるオリゴヌクレオチド (配列番号 19)は、配列番号 3に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドの発現を目的として付加したオリゴヌクレオチドであり、発現された蛋白質の機能に大きな影響を与えない。したがって、配列番号 3に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドは、コザックシークェンスとメチォニンに対応するコドンとからなるオリゴヌクレオチド (配列番号 19)が付加されていないが、 Rhoファミリー蛋白質の活性ィ匕を促進する蛋白質をコードすると考える。

[0045] 配列番号 3に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドがコードする蛋白質および配列番号 5に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質はいずれも、上記のように、 Rhoファミリー蛋白質の活性ィ匕を促進する。配列番号 3に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質として配列番号 4に記載のアミノ酸配列で表わされる蛋白質が挙げられる。配列番号 5に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質として配列番号 6に記載のアミノ酸配列で表わされる蛋白質が挙げられる。配列番号 4若しくは 6に記載のアミノ酸配列で表わされる蛋白質をコードするポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレォチドの相補的塩基配列で表わされるポリヌクレオチドも本発明の範囲に包含される

[0046] 配列番号 3に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドが Rhoファミリー蛋白質の活性ィ匕を促進する蛋白質をコードすると考えられることから、配列番号 3に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドも、 Rhoファミリー蛋白質の活性化を促進する蛋白質をコードすると考える。また、配列番号 4に記載のアミノ酸配列で表わされる蛋白質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドも、 Rhoファミリー蛋白質の活性ィ匕を促進する蛋白質をコードすると考える。配列番号 3に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドとして例えば、配列番号 1に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドが挙げられる。配列番号 1に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドも、 Rhoファミリー蛋白質の活性化を促進する蛋白質をコードすると考える。

[0047] 本発明の範囲には、配列番号 3に記載の塩基配列若しくはその相補的塩基配列で表わされるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドまたは配列番号 4に記載のアミノ酸配列で表わされる蛋白質をコードするポリヌクレオチド若しくは該ポリヌクレオチドの相補的塩基配列で表わされるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドも包含される。好ましくは、このようなポリヌクレオチドであって、 Rhoファミリー蛋白質の活性ィ匕を促進する蛋白質をコードするポリヌクレオチドである。さらに好ましくは、該ポリヌクレォチドであって、 DHZPHドメインコード領域を有するポリヌクレオチドである。

[0048] 本発明に係るポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質によって活性ィ匕が促進される Rhoファミリー蛋白質として、例えば Cdc42、 RhoAおよび Racl等、より好ましくは Cdc42が例示できる。 Rhoファミリー蛋白質はこれらに限定されず、本ポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質によって活性ィ匕が促進される限りにお、て、ずれの Rho ファミリー蛋白質であってもよい。本ポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質の、 Rh oファミリー蛋白質の活性ィ匕に対する促進機能は、例えばエフェクタープルダウン法を使用して測定できる（実施例 4参照)。

[0049] Cdc42、 RhoAおよび Raclは、それぞれ配列表の配列番号 21、 23および 25に記載のアミノ酸配列で表わされる蛋白質である。 Cdc42遺伝子、 RhoA遺伝子および R acl遺伝子は、それぞれ配列表の配列番号 20、 22および 24に記載の塩基配列で表わされる遺伝子である。 Cdc42、 RhoAおよび Racl並びにこれらの遺伝子は、上記各配列で表わされるものに限らず、一般的に知られている Cdc42、 RhoAおよび R aclの機能を有する限りにおいて、上記各配列において 1乃至数個の変異を有する蛋白質および遺伝子であることができる。また、これらの機能を促進するあるいは欠失させるといった所望の目的のために上記各配列に 1乃至数個の変異を導入した変異体を用いることもできる。 Cdc42、 RhoAおよび Raclの製造は、例えばその遺伝子を含有する組換えベクターを自体公知の遺伝子工学的方法により導入してなる形質転換体を培養すること等により実施できる。

[0050] 本発明に係るポリヌクレオチドの取得は、本発明により開示されたその具体例、例えば配列表の配列番号 1に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドにつ、ての配列情報に基づいて、公知の遺伝子工学的手法 (非特許文献 9および 10等を参照）により容易に実施できる。

[0051] 具体的には、本発明に係るポリヌクレオチドの発現が確認されている適当な起源から、常法に従って cDNAライブラリーを調製し、該 cDNAライブラリ一力も所望のクローンを選択することにより本ポリヌクレオチドを取得できる。 cDNAの起源として、本ポリヌクレオチドの発現が確認されている各種の細胞や組織、またはこれらに由来する培養細胞、例えばヒトの脳由来の細胞等が例示できる。これら起源からの全 RNAの分離、 mRNAの分離や精製、 cDNAの取得とそのクローニング等はいずれも常法に従って実施できる。また、ヒトの脳、胎児脳および脳海馬由来の市販されている poly A+RNAから cDNAライブラリーを構築して用いることもできる。 cDNAライブラリーから所望のクローンを選択する方法も特に制限されず、慣用の方法を利用できる。例えば、本ポリヌクレオチドに選択的にハイブリダィゼーシヨンするプローブやプライマー等を用いて所望のクローンを選択できる。具体的には、本ポリヌクレオチドに選択的にハイブリダィゼーシヨンするプローブを用いたプラークハイブリダィゼーシヨン法、コ口-一ハイブリダィゼーシヨン法等やこれらを組合せた方法等を例示できる。ここで用

V、るプローブとして、本ポリヌクレオチドの配列情報に基づ、て化学合成したポリヌクレオチド等が一般的に使用できる。また、既に取得された本ポリヌクレオチドやその部分塩基配列で表わされるポリヌクレオチドも好ましく使用できる。さらに、本ポリヌクレォチドの配列情報に基づき設計したセンスプライマー、アンチセンスプライマーをか力るプローブとして用いることもできる。

[0052] cDNAライブラリーからの所望のクローンの選択は、例えば公知の蛋白質発現系を利用して各クローンにつ、て発現蛋白質の確認を行!、、さらに該蛋白質の機能を指標にして実施できる。本ポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質の機能として、例えば、 RhoA、 Cdc42および Racl等の Rhoファミリー蛋白質と結合する機能および Rh oファミリー蛋白質の活性化を促進する機能が挙げられる。蛋白質発現系として、自体公知の発現系がいずれも利用できるが、無細胞蛋白質発現系の利用が簡便である (非特許文献 11)。

[0053] ここで、「Rhoファミリー蛋白質の活性化」とは、 Rhoファミリー蛋白質に結合したグァノシン^ 二リン酸 (GDP)をグアノシン三リン酸 (GTP)に交換する反応を意味する。本反応は、 Rhoファミリー蛋白質からの GDPの解離反応と、その結果生成したヌクレオチドに結合していない Rhoファミリー蛋白質への GTPの結合反応力もなる。「 Rhoファミリー蛋白質の活性ィ匕の促進」とは、本反応の律速段階である Rhoファミリー蛋白質からの GDPの解離反応を促進することを意味する。

[0054] 本発明に係るポリヌクレオチドの取得にはその他、ポリメラーゼ連鎖反応（以下、 PC Rと略称する、非特許文献 12— 14)による DNAZRNA増幅法が好適に利用できる。 cDNAライブラリ一力も全長の cDNAが得られ難いような場合には、 RACE法 (非特許文献 15)、特に^ RACE法 (非特許文献 16)等の採用が好適である。 PCR に使用するプライマーは、ポリヌクレオチドの塩基配列情報に基づ、て適宜設計でき、常法に従って合成により取得できる。増幅させた DNAZRNA断片の単離精製は、常法、例えばゲル電気泳動法等により実施できる。

[0055] 力べして得られるポリヌクレオチドの塩基配列の決定は、常法、例えばジデォキシ法

(非特許文献 17)やマキサムギルバート法 (非特許文献 18)等により、また簡便には市販のシーケンスキット等を用いて実施できる。

[0056] 本発明に係るポリヌクレオチドは上記ポリヌクレオチドに限定されず、上記ポリヌクレォチドと配列相同性を有し、かつ Rhoファミリー蛋白質の活性ィ匕を促進する蛋白質をコードするポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドの相補的塩基配列で表わされるポリヌクレオチドを包含する。配列相同性は、通常、塩基配列の全体で約 50%以上、好ましくは約 70%以上、より好ましくは約 80%以上、さらに好ましくは約 90%以上であることが適当である。さらにより好ましくは、 DHZPHドメインコード領域を有するポリヌクレオチドが望ましい。 DHZPHドメインコード領域における配列相同性は約 70 %以上、好ましくは約 80%以上、より好ましくは約 90%以上であることが適当である。また DHZPHドメインがその機能、例えば Rhoファミリー蛋白質の活性ィ匕を促進する機能を保持して、ることがさらに好ま、。

[0057] 本発明に係るポリヌクレオチドには、上記ポリヌクレオチドの塩基配列において 1個以上、例えば 1〜： LOO個、好ましくは 1〜30個、より好ましくは 1〜20個、さらに好ましくは 1〜： LO個、特に好ましくは 1個乃至数個のヌクレオチドの欠失、置換、付加または挿入といった変異が存する塩基配列またはその相補的塩基配列で表わされるポリヌクレオチドが包含される。変異の程度およびそれらの位置等は、該変異を有するポリヌクレオチドが Rhoファミリー蛋白質の活性ィ匕を促進する機能を有する蛋白質、より好ましくは DHZPHドメインを有する蛋白質をコードするポリヌクレオチドである限り特に制限されない。変異を有するポリヌクレオチドは、天然に存在するポリヌクレオチドであってよぐ誘発変異を有するポリヌクレオチドであってよい。また、天然由来の遺伝子に基づ、て変異を導入して得たポリヌクレオチドであってもよ!/、。変異を導入する方法は自体公知であり、例えば、部位特異的変異導入法、遺伝子相同組換え法、プライマー伸長法または PCR等を、単独でまたは適宜組合せて用いることができる。例えば成書に記載の方法 (非特許文献 9よび 10)に準じて、あるいはそれらの方法を改変して実施することができ、ウルマーの技術 (非特許文献 12)を利用することもできる。

[0058] 本発明に係るポリヌクレオチドとしてはまた、上記ポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダィゼーシヨンするポリヌクレオチドを例示できる。ハイブリダィゼーシヨンの条件は、例えば成書に記載の方法 (非特許文献 9)等に従うことができる。具体的には、「ストリンジェントな条件下」とは、例えば、 6 X SSC、 0. 5% SDSおよび 50% ホノレムアミドの溶液中で 42。Cにてカロ温した後、 0. 1 X SSC、 0. 5% SDS の溶液中で 68°Cにて洗浄する条件をいう。これらポリヌクレオチドは本ポリヌクレオチドにハイブリダィゼーシヨンするポリヌクレオチドであれば相補的配列を有するポリヌクレオチドでなくてもよい。好ましくは、コードする蛋白質が Rhoファミリー蛋白質の活性化を促進する機能を有する蛋白質であり、より好ましくは DHZPHドメインを有する蛋白質であることが望ましい。

[0059] 本発明に係るポリヌクレオチドには、上記ポリヌクレオチドの指定された領域に存在する部分塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチドが包含される。このようなオリゴヌクレオチドは、その最小単位として好ましくは該領域において連続する 5個以上のヌクレオチド、より好ましくは 10個以上、より好ましくは 20個以上のヌクレオチド力もなる。これらオリゴヌクレオチドは、本発明に係るポリヌクレオチドの塩基配列情報に従って、所望の配列を設計し、自体公知の化学合成法により製造できる。簡便には、 DNA /RNA自動合成装置を用いてオリゴヌクレオチドを製造できる。これらオリゴヌクレオチドは、本遺伝子または本遺伝子断片を増幅するためのプライマー、本遺伝子またはその転写産物を検出するためのプローブ等として用いることができる。

[0060] 本発明に係るポリヌクレオチドの指定された領域に存在する部分塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチドとして、配列表の配列番号 7、 8、 9または 10に記載の塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチドを好ましく例示できる。

[0061] 本発明に係るポリヌクレオチドはヒト由来のポリヌクレオチドである力本ポリヌクレオチドと配列相同性を有し、 Rhoファミリー蛋白質の活性ィ匕を促進する蛋白質をコードするポリヌクレオチド、好ましくは DHZPHドメインコード領域を有するポリヌクレオチドである限りにおいて、哺乳動物由来のポリヌクレオチド、例えばマウス、ゥマ、ヒッジ、ゥシ、ィヌ、サル、ネコ、クマ、ラットまたはゥサギ等由来のポリヌクレオチドも本発明に包含される。

[0062] 本発明に係るポリヌクレオチドは、その発現あるいはそれがコードする蛋白質の機能、例えば Rhoファミリー蛋白質の活性ィ匕を促進する機能が阻害されない限りにおいて、 5,末端側や ^末端側に所望の遺伝子が付加されたポリヌクレオチドであってよい。本ポリヌクレオチドに付加することのできる遺伝子は、具体的には例えばグルタチオン S トランスフェラーゼ（GST)、 β ガラクトシダーゼ（ 13 Gal)、ホースラデイツシュパーォキシダーゼ（HRP)またはアルカリホスファターゼ (ALP)等の酵素類、あるいは His— tag、 Myc— tag、 HA -tag, FLAG— tagまたは Xpress— tag等のタグペプチド類等の遺伝子を例示できる。これら遺伝子から選択した 1種類または複数種類の遺伝子を組合せて本ポリヌクレオチドに付加できる。これら遺伝子の付加は、慣用の遺伝子工学的手法により行うことができ、遺伝子や mRNAの検出を容易にするために有用である。

[0063] (ベクター）本発明の一態様は、本発明に係るポリヌクレオチドを含有する組換えベクターに関する。本組換えベクターは、本ポリヌクレオチドを適当なベクター DNAに挿入することにより取得できる。

[0064] ベクター DNAは宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、宿主の種類および使用目的により適宜選択される。ベクター DNAは、天然に存在する DNAを抽出して得られたベクター DNAの他、複製に必要な部分以外の DNAの部分が一部欠落しているベクター DNAでもよい。代表的なベクター DNAとして例えば、プラスミド、バタテリオファージおよびウィルス由来のベクター DNAを挙げられる。プラスミド DNAとして、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミド、酵母由来のプラスミド等を例示できる。バタテリオファージ DNAとして、 λファージ等が挙げられる。ウイルス由来のベクター DNAとして例えば、レトロウイルス、ワクシニアウィルス、アデノウィルス、パポバウィルス、 SV40、鶏痘ウィルス、および仮性狂犬病ウィルス等の動物ウイノレス由来のベクター、あるいはバキュロウイノレス等の昆虫ウイノレス由来のベクターが挙げられる。その他、トランスポゾン由来、挿入エレメント由来、酵母染色体エレメント由来のベクター DNA等を例示できる。あるいは、これらを組合せて作成したベクタ一 DNA、例えばプラスミドおよびバタテリオファージの遺伝学的エレメントを組合せて作成したベクター DNA (コスミドゃファージミド等）を例示できる。

[0065] ベクター DNAは、発現ベクターやクローユングベクター等、目的に応じていずれも用いることができる。本発明に係るポリヌクレオチドを含有する組換え発現ベクターは、本ポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質の製造に有用である。

[0066] ベクター DNAには、本発明に係るポリヌクレオチドの機能が発揮されるように該ポリヌクレオチドを組込むことが必要であり、少なくとも本ポリヌクレオチドとプロモーターとをその構成要素とする。これら要素に加えて、所望によりさらに、複製そして制御に関する情報を担持した遺伝子配列を組合せて自体公知の方法によりベクター DNAに組込むことができる。力かる遺伝子配列として、リボソーム結合配列、ターミネータ一、シグナル配列、ェンハンサ一等のシスエレメント、スプライシングシグナル、および選択マーカー（ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等)等を例示できる。これらから選択した 1種類または複数種類の遺伝子配列をベクター DNAに組込むことができる。

[0067] ベクター DNAに本発明に係るポリヌクレオチドを組込む方法は、自体公知の方法を適用できる。例えば、本ポリヌクレオチドを含む遺伝子を適当な制限酵素により処理して特定部位で切断し、次いで同様に処理したベクター DNAと混合し、リガーゼにより再結合する方法が利用できる。あるいは、本ポリヌクレオチドに適当なリンカ一をライゲーシヨンし、これを目的に適したベクターのマルチクローユングサイトへ挿入することによつても、所望の組換えベクターが取得できる。

[0068] (形質転換体）

本発明の一態様は、本発明に係る組換えベクターにより、宿主を形質転換して得られる形質転換体に関する。本発明に係るポリヌクレオチドを含有する組換え発現べクターを導入した形質転換体は、本ポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質の製造に有用である。本形質転換体には、本ポリヌクレオチド以外の所望の遺伝子を含有するベクター DNAの 1種類または複数種類をさらに導入できる。本ポリヌクレオチド以外の所望の遺伝子を含有するベクター DNAとして、例えば、 RhoA、 Raclまたは Cdc 42等の Rhoファミリー蛋白質をコードする遺伝子を含有するベクター DNAが挙げられる。本ポリヌクレオチドを含有する発現ベクターと Rhoファミリー蛋白質をコードする遺伝子を含有する発現ベクターとにより形質転換して得られる形質転換体は、本ポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質による Rhoファミリー蛋白質の活性ィ匕促進を阻害する化合物の同定方法に使用できる。このような形質転換として好ましくは、本発明に係る組換えベクターと Cdc42をコードするポリヌクレオチドを含有する組換えべクターとにより形質転換して得られる形質転換体が挙げられる。

[0069] 宿主として、原核生物および真核生物の!/、ずれも用いることができる。原核生物として、例えば大腸菌（ェシエリヒアコリ（Escherichia coli) )等のェシエリヒア属、枯草菌等のバシラス属、シユードモナスプチダ（Pseudomonas putida)等のシユードモナス属、リゾビゥムメリロティ（Rhizobium meliloti)等のリゾビゥム属に属する細菌が挙げられる。真核生物として、酵母、昆虫細胞および哺乳動物細胞等の動物細胞を例示できる。酵母は、サッカロミセス ·セレビシェ (Saccharomyces cerevisiae)、シゾサッカロミセスボンべ（Schizosaccharomyces pombe)等が挙げられる。昆虫細胞は、 Sf 9細胞や Sf 21細胞等を例示できる。哺乳動物細胞は、サル腎由来細胞（ COS細胞、 Vero細胞等）、チャイニーズノ、ムスター卵巣細胞（CHO細胞）、マウス L 細胞、ラット GH3細胞、ヒト FL細胞や 293EBNA細胞等が例示できる。好ましくは哺乳動物細胞を用いる。最も好ましくは、 293EBNA細胞を用いる。

[0070] ベクター DNAの宿主細胞への導入は、自体公知の手段が応用され、例えば成書に記載されている標準的な方法 (非特許文献 9)により実施できる。より好ましい方法として、遺伝子の安定性を考慮するならば染色体内へのインテグレート法が挙げられるが、簡便には核外遺伝子を利用した自律複製系を使用できる。具体的には、リン酸カルシウムトランスフエクシヨン、 DEAE—デキストラン媒介トランスフエクシヨン、マイク口インジェクション、陽イオン脂質媒介トランスフエクシヨン、エレクト口ポレーシヨン、形質導入、スクレープ負荷（scrape loading)、バリスティック導入（ballistic introdu ction)および感染等が挙げられる。

[0071] 原核生物を宿主とする場合、組換えベクターが該原核生物中で自律複製可能であると同時に、プロモーター、リボゾーム結合配列、本発明に係るポリヌクレオチド、転写終結配列により構成されていることが好ましい。また、プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。細菌を宿主とする場合、プロモーターは大腸菌等の細菌中で発現できるプロモーターであればいずれも利用可能である。例えば、 trpプロモ一ター、 lacプロモーター、 PLプロモーター、 PRプロモーター等の、大月昜菌ゃファージに由来するプロモーターが用いられる。 tacプロモーター等の人為的に設計改変されたプロモーターを用いてもよい。細菌への糸且換えベクターの導入方法は、細菌に D NAを導入する方法であれば特に限定されず、いずれも利用可能である。好ましくは例えば、カルシウムイオンを用いる方法、エレクト口ポレーシヨン法等を利用できる。

[0072] 哺乳動物細胞を宿主とする場合、組換えベクターが該細胞中で自律複製可能であると同時に、プロモーター、プライス部位、本発明に係るポリヌクレオチド、ポリアデニル化部位、転写終結配列により構成されていることが好ましい。また、所望により複製起点が含まれていてもよい。プロモーターは、 SR aプロモーター、 SV40プロモーター、 LTRプロモーター、 CMVプロモーター等が用いられ、また、サイトメガロウィルスの初期遺伝子プロモーター等を用いてもよヽ。哺乳動物細胞への組換えべクターの導入方法は、好ましくは例えば、エレクト口ポレーシヨン法、リン酸カルシウム法、リポフエクシヨン法等が利用できる。最も好ましくは、リポフエクシヨン法が用いられる

[0073] 酵母を宿主とする場合、プロモーターは、酵母中で発現できるプロモーターであれば特に限定されず、例えば、 gallプロモーター、 gallOプロモーター、ヒートショック蛋白質プロモーター、 MF a 1プロモーター、 PH05プロモーター、 PGKプロモータ一、 GAPプロモーター、 ADHプロモーター、 AOX1プロモーター等が挙げられる。酵母への組換えベクターの導入方法は、酵母に DNAを導入する方法であれば特に限定されず、好ましくは例えば、エレクト口ポレーシヨン法、スフエロプラスト法、酢酸リチウム法等が利用できる。

[0074] 昆虫細胞を宿主とする場合、組換えベクターの導入方法は、好ましくは例えば、リン酸カルシウム法、リポフエクシヨン法、エレクト口ポレーシヨン法等が利用できる。

[0075] (蛋白質）

本発明の一態様は、本発明に係るポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質に関する。

[0076] 本発明に係る蛋白質の具体的態様として、例えば配列番号 1に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質が挙げられる。より具体的には、力かる蛋白質として配列番号 2に記載のアミノ酸配列で表わされる蛋白質を例示できる。本蛋白質において、その第 97番目ノリン (Val)力も第 271番目ァスパラギン酸（ Asp)までのアミノ酸配列に DHドメイン力第 297番目ロイシン（Leu)力第 394番目ロイシン (Leu)までのアミノ酸配列に PHドメインが存在する。第 97番目ノリン (Val )力も第 394番目ロイシン (Leu)までのアミノ酸配列に DHZPHドメインが存在する。

[0077] 本発明に係る蛋白質としてまた、配列番号 3または 5に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質が挙げられる。より具体的には、配列番号 3に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質として配列番号 4に記載のアミノ酸配列で表わされる蛋白質を例示できる。また、配列番号 5 に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質として配列番号 6に記載のアミノ酸配列で表わされる蛋白質を例示できる。配列番号 4に記載のアミノ酸配列は、配列番号 2に記載のアミノ酸配列の第 90番目のリジン (Lys)力第 454番目のロイシン (Leu)までのアミノ酸配列に相当する。また、配列番号 6に記載のアミノ酸配列は、配列番号 4に記載のアミノ酸配列の N末端にメチォニンがぺプチド結合により付加されたアミノ酸配列である。すなわち、これら各アミノ酸配列で表わされる蛋白質は、 DH/PHドメインを含んでいる。

[0078] 本発明に係る蛋白質は、好ましくは Rhoファミリー蛋白質の活性ィ匕を促進する機能を有する蛋白質である。かかる蛋白質として、配列番号 5に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質を好ましく例示できる。配列番号 5に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドと、 RhoA、 Cdc42および Raclといった各 Rhoファミリー蛋白質をコードする遺伝子とを共に発現させた動物細胞において、該ポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質は各 Rhoファミリー蛋白質と結合することがプルダウン法により判明した (実施例 3参照)。また、当該動物細胞において、 Cdc 42の活性化が促進された (実施例 4参照)。これらから、配列番号 5に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質は、 Rhoファミリー蛋白質と結合してその活性化を促進すると考える。配列番号 5に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質は、配列番号 3に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質の N末端にメチォニンがペプチド結合により付加された蛋白質である。配列番号 5に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質は、配列番号 3に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドの発現を目的として該ポリヌクレオチドの^末端にコザックシークェンスとメチォニンに対応するコドンとからなるオリゴヌクレオチド (配列番号 19)を付加した結果、得られた蛋白質である。付加されたメチォニンは、発現された蛋白質の機能に大きな影響を与えない。したがって、配列番号 3に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質は、 N末端のメチォニンが付加されていない力 Rhoファミリー蛋白質と結合してその活性ィ匕を促進すると考える。

[0079] 配列番号 3に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質は、上記のように、配列番号 5に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質と同様、 Rhoファミリー蛋白質と結合してその活性ィ匕を促進すると考えられる。また、これら蛋白質に含まれる DHZPHドメインは、 Rhoファミリー蛋白質の活性ィ匕に寄与する重要なドメインであることが知られている。

[0080] これらから、配列番号 3に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質を含有する蛋白質も Rhoファミリー蛋白質と結合してその活性ィ匕を促進すると考える。かかる蛋白質として、配列番号 3に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質が挙げられる。また、配列番号 3に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドが配列番号 4に記載のァミノ酸配列で表わされる蛋白質をコードすることから、配列番号 4に記載のアミノ酸配列で表わされる蛋白質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質が同様に力かる蛋白質として例示できる。具体的には、配列番号 3に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質として、配列番号 1に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質が例示できる。配列番号 1に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質として、配列番号 2に記載のアミノ酸配列で表わされる蛋白質が挙げられる。これら例示した蛋白質はいずれも、 Rhoファミリー蛋白質と結合してその活性ィ匕を促進すると考える。

[0081] 本発明の範囲には、配列番号 3に記載の塩基配列若しくはその相補的塩基配列で表わされるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドまたは配列番号 4に記載のアミノ酸配列で表わされる蛋白質をコードするポリヌクレオチド若しくは該ポリヌクレオチドの相補的塩基配列で表わされるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドであって、 Rhoファミリー蛋白質の活性ィ匕を促進する蛋白質をコードするポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質も包含される。

[0082] 本発明に係る蛋白質は上記蛋白質に限定されず、本発明に係るポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質であればいずれも本発明の範囲に包含される。好ましくは、本発明に係るポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質であって、 Rhoファミリー蛋白質の活性ィ匕を促進する機能を有する蛋白質が望ましい。かかる蛋白質として、例えば、配列番号 1に記載の塩基配列またはその相補的塩基配列で表わされるポリヌクレオチド、配列番号 2に記載のアミノ酸配列で表わされる蛋白質をコードするポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドの相補的塩基配列で表わされるポリヌクレオチド、配列番号 3若しくは 5に記載の塩基配列またはその相補的塩基配列で表わされるポリヌクレオチド、および配列番号 4若しくは 6に記載のアミノ酸配列で表わされる蛋白質をコードするポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドの相補的塩基配列で表わされるポリヌクレオチド力なる群より選ばれるいずれか 1のポリヌクレオチドの塩基配列と少なくとも 70%の相同性を有する塩基配列で表わされるポリヌクレオチドであって、 Rhoフアミリー蛋白質の活性ィ匕を促進する蛋白質をコードするポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質が挙げられる。また、例えば、上記ポリヌクレオチド群より選ばれるいずれ力 1のポリヌクレオチドの塩基配列において 1乃至数個のヌクレオチドの欠失、置換、付加等の変異あるいは誘発変異を有する塩基配列で表わされるポリヌクレオチドであって、 Rhoファミリー蛋白質の活性ィ匕を促進する蛋白質をコードするポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質が挙げられる。さらに、上記ポリヌクレオチド群より選ばれるいずれ力 1のポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダィゼーシヨンするポリヌクレオチドであって、 Rhoファミリー蛋白質の活性ィ匕を促進する蛋白質をコードするポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質であってもよい。

本発明に係るこのような蛋白質として、より具体的には、配列番号 2、 4または 6に記載のアミノ酸配列で表わされる蛋白質と配列相同性を有し、かつ Rhoファミリー蛋白質の活性化を促進する機能を有する蛋白質が例示できる。配列相同性は、通常、ァミノ酸配列の全体で約 50%以上、好ましくは約 70%以上、より好ましくは約 80%以上、さらに好ましくは約 90%以上であることが適当である。さらにより好ましくは、 DH ZPHドメインを有する蛋白質が望ましい。 DHZPHドメインにおける配列相同性は約 70%以上、好ましくは約 80%以上、より好ましくは約 90%以上であることが適当である。また DHZPHドメインがその機能、例えば Rhoファミリー蛋白質の活性ィ匕を促進する機能を保持していることがさらに好ましい。また、本蛋白質として、配列番号 2、 4または 6に記載のアミノ酸配列において 1個以上、例えば 1〜： L00個、好ましくは 1 〜30個、より好ましくは 1〜20個、さらに好ましくは 1〜： L0個、特に好ましくは 1個乃至数個のアミノ酸の欠失、置換、付加または挿入といった変異を有するアミノ酸配列で表わされ、かつ Rhoファミリー蛋白質の活性化を促進する機能を有する蛋白質が例示できる。アミノ酸の変異の程度およびそれらの位置等は、該変異を有する蛋白質が、 Rhoファミリー蛋白質の活性ィ匕を促進する機能を有する蛋白質、より好ましくは DHZPHドメインを有する蛋白質である限り特に制限されない。かかる変異を有する蛋白質は、天然において例えば突然変異や翻訳後の修飾等により生じたものであつてよぐまた天然由来の遺伝子に基づいて変異を導入して得たものであってもよい。変異を導入する方法は自体公知であり、例えば、公知の遺伝子工学的技術を利用して実施できる。変異の導入において、当該蛋白質の基本的な性質 (物性、機能、生理活性または免疫学的活性等)を変化させないという観点からは、例えば、同族アミノ酸 (極性アミノ酸、非極性アミノ酸、疎水性アミノ酸、親水性アミノ酸、陽性荷電アミノ酸、陰性荷電アミノ酸および芳香族アミノ酸等）の間での相互の置換は容易に想定される。

[0084] 本発明に係る蛋白質にはさらに、上記蛋白質の部分配列で表わされる蛋白質が包含される。例えば、配列番号 2、 4または 6に記載のアミノ酸配列で表わされる蛋白質の部分配列で表わされる蛋白質も本発明の範囲に包含される。かかる蛋白質は、その最小単位として好ましくは 5個以上、より好ましくは 8個以上、さらに好ましくは 12個以上、特に好ましくは 15個以上の連続するアミノ酸で表わされる。

[0085] 本発明に係る蛋白質はヒト由来の蛋白質であるが、本蛋白質と配列相同性を有し、かつ Rhoファミリー蛋白質の活性ィ匕を促進する機能を有する蛋白質、好ましくは DH ZPHドメインを有する蛋白質である限りにおいて、哺乳動物由来の蛋白質、例えばマウス、ゥマ、ヒッジ、ゥシ、ィヌ、サル、ネコ、クマ、ラットまたはゥサギ等由来の蛋白質も本発明に包含される。

[0086] 本発明に係る蛋白質は、本蛋白質をコードする遺伝子を遺伝子工学的手法で発現させた細胞や生体試料から調製したもの、無細胞系合成産物または化学合成産物であってよぐあるいはこれらからさらに精製されたものであってもよい。また、本蛋白質は、本蛋白質をコードする遺伝子を含む細胞において発現しているものであり得る。該細胞は、本蛋白質をコードする遺伝子を含むベクターをトランスフエクシヨンして得られた形質転換体であり得る。

[0087] 本発明に係る蛋白質はさらに、その構成アミノ基またはカルボキシル基等を、例えばアミド化修飾する等、機能の著し、変更を伴わない限りにお、て改変が可能である。また、 N末端側や C末端側に別の蛋白質等を、直接的に、またはリンカ一べプチド等を介して間接的に、遺伝子工学的手法等を用いて付加することにより標識ィ匕したものであってよい。好ましくは、本蛋白質の基本的な性質が阻害されないような標識化が望ましい。さらに好ましくは、本蛋白質の Rhoファミリー蛋白質の活性ィ匕促進機能が阻害されないような標識ィ匕が好ましい。標識ィ匕に用いる物質 (標識物質)は、 GS Τ、 β— Gal、 HRPまたは ALP等の酵素類、 His— tag、 Myc— tag、 HA— tag、 FL AG— tagまたは Xpress— tag等のタグペプチド類、フルォレセインイソチオシァネート (fluorescein isothiocyanate)またはフィコエリスリン (phycoerythrin)等の: ¾：光物質類、マルトース結合蛋白質、免疫グロブリンの Fc断片あるいはピオチン等が例示できるが、これらに限定されない。また、放射性同位元素による標識化も可能である。標識物質は、 1種類または複数種類を組合せて本蛋白質に付加できる。これら標識物質自体またはその機能の測定により、本蛋白質を容易に検出または精製可能であり、また、例えば本蛋白質と他の蛋白質との結合の検出や本蛋白質の機能の測定が可能である。

[0088] (蛋白質の製造方法）

本発明の一態様は、本発明に係る蛋白質の製造方法に関する。本蛋白質は、例えば本蛋白質をコードする遺伝子の塩基配列情報に基づいて一般的遺伝子工学的手法 (非特許文献 9、 10、 12および 13等を参照）により取得可能である。例えば、本発明に係るポリヌクレオチドの発現が確認されて、る各種の細胞や組織、またはこれらに由来する培養細胞力常法に従って cDNAライブラリーをまず調製する。次いで、本蛋白質をコードする遺伝子に選択的にハイブリダィゼーシヨンするプライマーを用いて、該 cDNAライブラリ一力も本ポリヌクレオチドを増幅する。得られたポリヌクレオチドの発現誘導を公知の遺伝子工学的手法を利用して行うことにより、本蛋白質を取得できる。

[0089] 具体的には例えば、本発明に係る形質転換体を培養し、次いで得られた培養物から本蛋白質を回収することにより、本蛋白質を製造できる。本形質転換体の培養は、各々の宿主に最適な自体公知の培養条件および培養方法で行うことができる。培養は、形質転換体により発現される本蛋白質自体または本蛋白質の機能、例えば Rho ファミリー蛋白質の活性ィ匕を促進する機能を指標にして実施できる。あるいは、宿主中または宿主外に産生された本蛋白質自体またはその蛋白質量を指標にして培養してもよぐ培地中の形質転換体量を指標にして継代培養またはバッチ培養を行ってちょい。

[0090] 本発明に係る蛋白質が形質転換体の細胞内あるいは細胞膜上に発現する場合には、形質転換体を破砕して本蛋白質を抽出する。また、本蛋白質が形質転換体外に分泌される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離処理等により形質転換体を除去した培養液を用いる。

[0091] 本発明に係る蛋白質は、所望により、形質転換体を培養した培養液または形質転換体から、その物理的性質、化学的性質等を利用した各種分離操作方法により分離および Zまたは精製できる。分離および Zまたは精製は、本蛋白質の機能、例えば

Rhoファミリー蛋白質の活性ィ匕を促進する機能を指標にして実施できる。分離操作方法として、例えば硫酸アンモニゥム沈殿、限外ろ過、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ァフィ-ティークロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、透析法等を単独でまたは適宜組合せて用いることができる。好ましくは、本蛋白質のアミノ酸配列情報に基づき、これらに対する特異的抗体を作製し、該抗体を用いて特異的に吸着する方法、例えば該抗体を結合させたカラムを利用するァフィ二テイク口マトグラフィーを用いることが推奨される。

[0092] 本発明に係る蛋白質はまた、一般的な化学合成法により製造できる。蛋白質の化学合成方法として、例えば、固相合成方法、液相合成方法等が知られているがいずれも利用可能である。力かる蛋白質合成法は、より詳しくは、アミノ酸配列情報に基づ V、て、各アミノ酸を 1個ずつ逐次結合させて鎖を延長させて、く、わゆるステップワイズェロンゲーシヨン法と、アミノ酸数個力もなるフラグメントを予め合成し、次いで各フラグメントをカップリング反応させるフラグメントコンデンセーシヨン法とを包含する。本蛋白質の合成は、そのいずれによっても行うことができる。上記蛋白質合成法において利用される縮合法も常法に従うことができる。縮合法として、例えば、アジド法、混合酸無水物法、 DCC法、活性エステル法、酸化還元法、 DPPA (ジフヱニルホスホリルアジド）法、 DCC +添カ卩物（1—ヒドロキシベンゾトリァゾール、 N—ヒドロキシサクシンアミド、 N—ヒドロキシ一 5—ノルボルネン一 2, 3—ジカルボキシイミド等）法、ウッドワード法等が例示できる。化学合成により得られる本蛋白質はさらに、上記のような慣用の各種精製方法により適宜精製を行うことができる。

[0093] 本発明に係る蛋白質の部分配列で表わされる蛋白質は、本蛋白質を適当なぺプチダーゼにより切断することによつても得ることができる。

[0094] (抗体）

本発明の一態様は、本発明に係る蛋白質を認識する抗体に関する。本抗体は、本蛋白質を抗原として用いて作製できる。抗原として、本蛋白質およびその断片のいずれを用いることもできる。断片を用いるときは、該断片は少なくとも 8個、好ましくは少なくとも 10個、より好ましくは少なくとも 12個、さらに好ましくは 15個以上のアミノ酸で構成される。本蛋白質に特異的な抗体を作成するためには、本蛋白質に固有なアミノ酸配列からなる領域を抗原として用いることが好まし、。この領域のアミノ酸配列は、必ずしも該蛋白質またはその断片のアミノ酸配列と同一である必要はなぐその立体構造上の外部への露出部位が好ま、。露出部位のアミノ酸配列が一次構造上で不連続であっても、該露出部位について連続的なアミノ酸配列であればよい。本抗体は本蛋白質を特異的に認識する抗体であればいずれであってもよぐ特に限定されない。本蛋白質を特異的に認識するとは、本蛋白質を認識する、例えば本蛋白質に結合するが、本蛋白質以外の蛋白質は認識しないか、弱く認識することを意味する。認識の有無は、公知の抗原抗体結合反応により決定できる。

[0095] 抗体の産生には、自体公知の抗体作製法を利用できる。例えば、抗原をアジュバントの存在下または非存在下で、単独でまたは担体に結合して動物に投与し、体液性応答および Zまたは細胞性応答等の免疫誘導を行うことにより抗体が得られる。担体は、それ自体が宿主に対して有害作用を示さずかつ抗原性を増強せしめる限りにおいて、公知の担体をいずれも使用できる。具体的には、セルロース、重合アミノ酸、アルブミンおよびキーホールリンペットへモシァニン等を例示できる。アジュバントは、フロイント完全アジュバント（FCA)、フロイント不完全アジュバント（FIA)、 Ribi (MPL )、 Ribi (TDM)、 Ribi (MPL + TDM)、百日咳ワクチン（Bordetella pertussis v accine)、ムラミルジペプチド（MDP)、アルミニウムアジュバント（ALUM)、およびこれらの組み合わせを例示できる。免疫される動物は、マウス、ラット、ゥサギ、ャギ、ゥマ等が好適に用いられる。

[0096] ポリクローナル抗体は、免疫手段を施された動物の血清から自体公知の抗体回収法により取得できる。好ましい抗体回収手段として免疫ァフィ二ティクロマトグラフィー法が挙げられる。

[0097] モノクローナル抗体は、免疫手段が施された動物から抗体産生細胞 (例えば、脾臓またはリンパ節由来のリンパ球)を回収し、自体公知の永久増殖性細胞 (例えば、 P3 —X63—Ag8株等のミエローマ株)への形質転換手段を導入することにより生産できる。例えば、抗体産生細胞と永久増殖性細胞とを自体公知の方法で融合させてハイブリドーマを作成してこれをクローン化する。クローン化した種々のハイブリドーマから、本発明に係る蛋白質を特異的に認識する抗体を産生するハイブリドーマを選別し、該ハイブリドーマの培養液力抗体を回収する。

[0098] 本発明に係る蛋白質を認識または結合し得るポリクローナル抗体またはモノクロ一ナル抗体は、該蛋白質の精製用抗体、試薬または標識マーカー等として利用できる。特に本蛋白質の機能を阻害する抗体は、本蛋白質の機能調節に使用でき、本蛋白質の機能異常や量的異常に起因する各種疾患の解明、防止、改善および Zまたは治療のために有用である。

[0099] (化合物の同定方法）

本発明の一態様は、本発明に係る蛋白質の機能を阻害する化合物、あるいは本発明に係るポリヌクレオチドの発現を阻害する化合物の同定方法に関する。本同定方法は、本発明に係る蛋白質、ポリヌクレオチド、組換えベクター、形質転換体または抗体のうち少なくともいずれか 1種類を用いて、自体公知の医薬品スクリーニングシステムを利用して実施できる。本同定方法は、インビトロまたはインビボで実施されるいずれの方法も包含する。本同定方法により、本蛋白質の立体構造に基づくドラッグデザインによる拮抗剤の選別、蛋白質合成系を利用した遺伝子レベルでの発現の阻害剤の選別、または抗体を利用した抗体認識物質の選別等が実施できる。

[0100] 本発明に係る蛋白質の機能を阻害する化合物の同定方法は、本蛋白質の機能を測定し得る実験系において、本蛋白質と調べようとする化合物 (被検化合物)の相互作用を可能にする条件下で、本蛋白質と被検化合物とを共存させてその機能を測定し、次いで、被検化合物の存在下における本蛋白質の機能と、被検化合物の非存在下における本蛋白質の機能とを比較し、本蛋白質の機能の存在、不存在または変化、例えば低減、増カロ、消失、出現を検出することにより実施可能である。被検化合物の非存在下における本蛋白質の機能と比較して、被検化合物の存在下における本蛋白質の機能が低減または消失する場合、該被検化合物は本蛋白質の機能を阻害すると判定できる。機能の測定は、該機能の直接的な検出により、または例えば機能の指標となるシグナルを実験系に導入して該シグナルを検出することにより実施できる。シグナルは、 GST等の酵素類、 His— tag、 Myc— tag、 HA— tag、 FLAG— ta gまたは Xpress— tag等のタグペプチド類、または蛍光蛋白質等が例示できる力一般的に化合物の同定方法に用いられて、る標識物質であれば、ずれも利用できる。

[0101] 本発明に係る蛋白質の機能として、例えば Rhoファミリー蛋白質の活性ィ匕を促進する機能および Rhoファミリー蛋白質と結合する機能が挙げられる。

[0102] 本発明に係る蛋白質の Rhoファミリー蛋白質との結合機能を指標にした同定方法は、例えば、本蛋白質を遺伝子工学的手法により発現させて取得し、被検化合物の存在下または非存在下における Rhoファミリー蛋白質との結合の検出を行うことにより実施できる。具体的には、例えば Rhoファミリー蛋白質を遺伝子工学的手法により GST— tag融合蛋白質として発現させ、その後ダルタチオンセファロースに結合させ、被検化合物の存在下または非存在下で、本蛋白質と反応させる。ダルタチオンセファロースに結合させた Rhoファミリー蛋白質に結合する本蛋白質を定量することにより、本蛋白質の Rhoファミリー蛋白質との結合機能を阻害する化合物の同定が可能である。被検化合物の非存在下における両蛋白質の結合と比較して、被検化合物の存在下における両蛋白質の結合が低減または消失する場合、該被検化合物は本蛋白質の Rhoファミリー蛋白質との結合機能を阻害すると判定できる。本蛋白質の定量は、例えば、本発明に係る抗体を用いて実施できる。抗体は、 HRPや ALP等の酵素、放射性同位元素、蛍光物質またはピオチン等の標識物質で標識した抗体を用いることができる。あるいは、標識した二次抗体を用いてもよい。本蛋白質として、タグべプチドを融合した蛋白質を用いれば、抗タグ抗体を用いて定量を実施できる。または、本蛋白質を上記酵素、放射性同位元素、蛍光物質、ピオチン等の標識物質で直接標識して用いてもよい。このような場合、標識物質を測定することにより、本蛋白質の定量を実施できる。

[0103] より具体的には、本発明に係る蛋白質をコードするポリヌクレオチドと Rhoファミリー蛋白質をコードするポリヌクレオチドとを共発現させた適当な細胞を用い、両蛋白質の結合をプルダウン法により検出する実験系（実施例 3参照）を用いて、該結合を阻害する化合物を同定できる。

[0104] 本発明に係る同定方法に、公知のツーハイブリッド (two— hybrid)法を用いることもできる。例えば、本発明に係る蛋白質と DNA結合蛋白質を融合蛋白質として発現するプラスミド、 Rhoファミリー蛋白質と転写活性化蛋白質を融合蛋白として発現するプラスミド、および適切なプロモーター遺伝子に接続したレポーター遺伝子を含有するプラスミドを、酵母または真核細胞等に導入する。次いで、被検化合物の存在下におけるレポーター遺伝子の発現量と、被検化合物の非存在下におけるレポーター遺伝子の発現量との比較により、本蛋白質と Rhoファミリー蛋白質との結合を阻害する化合物の同定を達成できる。被検化合物の非存在下におけるレポーター遺伝子の発現量と比較して、被検化合物の存在下におけるレポーター遺伝子の発現量が減少または消失する場合、該被検化合物は本蛋白質の Rhoファミリー蛋白質との結合機能を阻害すると判定できる。レポーター遺伝子は、レポーターアツセィで一般的に用いられている遺伝子をいずれも用いることができる力ルシフェラーゼ、 13—Galまたはクロラムフエ-コールァセチルトランスフェラーゼ等の酵素活性を有する遺伝子を例示できる。レポーター遺伝子の発現の検出は、その遺伝子産物の活性、例えば、上記例示したレポーター遺伝子の場合は酵素活性を検出することにより実施できる

[0105] 本発明に係る蛋白質と Rhoファミリー蛋白質との結合を阻害する化合物の同定方法はまた、ビアコアシステム（BIACORE system)等の表面プラズモン共鳴センサ一を用いて実施できる。あるいは、シンチレーシヨンプロキシミティアツセィ法（Scintil lation proximity assay ^ SPA)や光共鳴ェ不ルキー移 (Fluorescence re sonance energy transfer、 FRET)を応用した方法を用いて、本同定方法を実施できる。

[0106] 本発明に係る蛋白質が有する Rhoファミリー蛋白質の活性化促進機能を指標にした同定方法は、例えば、本蛋白質と該蛋白質により活性ィ匕が促進される Rhoファミリ一蛋白質とを共存させ、活性化された Rhoファミリー蛋白質の量を、被検化合物の存在下または非存在下において測定することにより実施できる。被検化合物の非存在下における活性ィ匕された Rhoファミリー蛋白質の量と比較し、被検化合物の存在下における該蛋白質の量が減少する場合、該化合物は、本蛋白質が有する Rhoフアミリー蛋白質の活性ィ匕促進機能を阻害すると判定できる。活性化された Rhoファミリー蛋白質は、該蛋白質に対する抗体等を用いて定量され得る。例えば、活性化された Rhoファミリー蛋白質は、活性ィ匕された Rhoファミリー蛋白質には結合するが、活性化されて!/、な、Rhoファミリー蛋白質には結合しな、か弱く結合するエフェクター分子を用いて定量され得る。具体的には、実施例 4に示すように、エフェクター分子の活性ィ匕された Rhoファミリー蛋白質との結合部位を含む蛋白質に GST— tagを付カロした蛋白質と、活性ィ匕された Rhoファミリー蛋白質との結合をプルダウン法により検出し、さらに活性ィ匕された Rhoファミリー蛋白質の量を電気泳動法およびウェスタンプロット法により測定する。 Rhoファミリー蛋白質によって、活性化された該蛋白質と結合するエフェクター分子は異なる。したがって、用いる Rhoファミリー蛋白質の種類により適当なエフェクター分子を選択して用いる。例えば、活性ィ匕された Cdc42および活性化された Raclは、そのエフェクター分子である PAK— 1に結合することが知られている。また、活性化された RhoAは、そのエフェクター分子である Rhotekinに結合する。

[0107] 本発明に係る蛋白質が有する Rhoファミリー蛋白質の活性化促進機能を指標にした同定方法はまた、本蛋白質、該蛋白質により活性ィ匕が促進される Rhoファミリー蛋白質であって放射性同位元素で標識した GDPと結合している Rhoファミリー蛋白質および GTPを共存させ、活性ィ匕された Rhoファミリー蛋白質の量を被検化合物の存在下または非存在下において測定することにより実施できる。活性ィ匕された Rhoファミリ一蛋白質は、放射性同位元素で標識した GDPと結合している Rhoファミリー蛋白質の量の減少により定量され得る。

[0108] 「Rhoファミリー蛋白質の活性ィ匕促進機能を阻害する」とは、本発明に係る蛋白質により促進される、 Rhoファミリー蛋白質の活性ィ匕において、該促進を阻害することを意味する。

[0109] 本発明に係る同定方法において用いる Rhoファミリー蛋白質は、本発明に係る蛋白質との結合および本蛋白質による活性ィ匕の促進に影響がない限りにおいて、一部を欠損した蛋白質であってよぐあるいは上記のような標識物質が付加された蛋白質であってよい。

[0110] 本発明に係るポリヌクレオチドの発現を阻害する化合物の同定方法は、本ポリヌクレオチドの発現を測定し得る実験系にお、て、本ポリヌクレオチドと被検化合物の相互作用を可能にする条件下で、本ポリヌクレオチドと被検化合物とを共存させてその発現を測定し、次いで、被検化合物の存在下における本ポリヌクレオチドの発現と、被検化合物の非存在下における本ポリヌクレオチドの発現とを比較し、本ポリヌクレオチドの発現の存在、不存在または変化、例えば低減、増加、消失、出現を検出することにより実施できる。被検化合物の非存在下における本ポリヌクレオチドの発現と比較して、被検化合物の存在下における本ポリヌクレオチドの発現が減少または消失する場合、該被検化合物は本ポリヌクレオチドの発現を阻害すると判定できる。具体的には例えば、本同定方法は、本発明に係る形質転換体を用いて本ポリヌクレオチドを発現させる実験系にお!/ヽて、該形質転換体と被検化合物とを接触させた後に、本ポリヌクレオチドの発現を測定することにより実施できる。発現の測定は、簡便には発現される蛋白質の量、あるいは該蛋白質の機能、例えば Rhoファミリー蛋白質の活性ィ匕を促進する機能を指標にして実施できる。また、例えば発現の指標となるシグナルを実験系に導入して該シグナルを検出することにより、発現の測定を実施できる。シグナルは、 GST等の酵素類、 His— tag、 Myc— tag、 HA -tag, FLAG— tagまたは Xpress— tag等のタグペプチド類、または蛍光物質等が例示できる。これらシグナルの検出方法は当業者には周知である。

[0111] 本発明に係るポリヌクレオチドの発現を阻害する化合物の同定方法はまた、例えば本ポリヌクレオチドを含む遺伝子のプロモーター領域の下流に、該ポリヌクレオチドの代わりにレポーター遺伝子を連結したベクターを作成し、該ベクターを導入した細胞、例えば真核細胞等と被検化合物とを接触させ、レポーター遺伝子の発現の存在、不存在または変化を測定することにより実施できる。レポーター遺伝子は、レポータ一アツセィで一般的に用いられて、る遺伝子を!、ずれも用いることができる力ルシフェラーゼ、 β—Galまたはクロラムフエ-コールァセチルトランスフェラーゼ等の酵素活性を有する遺伝子を例示できる。レポーター遺伝子の発現の検出は、その遺伝子産物の活性、例えば、上記に例示したレポーター遺伝子の場合は酵素活性を検出すること〖こより実施できる。

[0112] (化合物）

本発明に係る同定方法により得られた化合物は、本発明に係る蛋白質の機能、例えば Rhoファミリー蛋白質の活性化を促進する機能の阻害剤や拮抗剤等の候補ィ匕合物として利用できる。また、本発明に係るポリヌクレオチドの発現阻害剤の候補ィ匕合物として利用できる。これら候補化合物は、その有用性と毒性のバランスを考慮して選別することにより医薬として調製でき、ゆえに本蛋白質の機能の異常および Zまたは本ポリヌクレオチドの発現の異常に起因する各種病的症状の防止効果および Z または治療効果を期待できる。また、本発明に係る化合物は、本同定方法以外の方法により得られたィ匕合物であって、本蛋白質の機能を阻害するおよび Zまたは本ポリヌクレオチドの発現を阻害する化合物も含まれる。

[0113] (医薬組成物）

本発明の一態様は、本発明に係る蛋白質、ポリペプチド、組換えベクター、形質転換体、抗体、または化合物を有効成分として含み、本蛋白質の機能および Zまたは本ポリペプチドの発現を阻害するまたは拮抗することに基づく医薬または医薬組成物に関する。

[0114] 本発明に係る医薬は、本発明に係る蛋白質、ポリヌクレオチド、組換えベクター、形質転換体、抗体、または化合物のうち少なくともいずれ力 1つを有効成分としてその有効量含む医薬となしてもよい。通常は、 1種類または 2種類以上の医薬用に許容される担体 (医薬用担体)を用いて医薬組成物を製造することが好まヽ。

[0115] 本発明に係る医薬組成物中に含まれる有効成分の量は、広範囲から適宜選択される。通常約 0. 00001〜70重量％、好ましくは 0. 0001〜5重量％程度の範囲とするのが適当である。

[0116] 医薬用担体は、医薬組成物の使用形態に応じて通常使用される、充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、崩壊剤、滑沢剤等の希釈剤や賦形剤等が例示できる。これらは得られる医薬組成物の使用形態に応じて適宜選択して使用される。

[0117] 例えば水、医薬的に許容される有機溶剤、コラーゲン、ポリビュルアルコール、ポリビュルピロリドン、カルボキシビュルポリマー、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ぺクチン、キサンタンガム、アラビアゴム、力ゼイン、ゼラチン、寒天、グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ヮセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン、マン-トール、ソルビトール、ラタトース等が挙げられる。これらは、本発明に係る医薬組成物の使用形態に応じて適宜 1種類または 2種類以上を組合せて使用される。

[0118] 所望により、通常の蛋白質製剤に使用され得る各種の成分、例えば安定化剤、殺菌剤、緩衝剤、等張化剤、キレート剤、 pH調整剤、界面活性剤等を適宜使用して医薬組成物を調製することもできる。

[0119] 安定化剤は、ヒト血清アルブミンや通常の L アミノ酸、糖類、セルロース誘導体等が例示でき、これらは単独でまたは界面活性剤等と組合せて使用できる。特にこの組合せによれば、有効成分の安定性をより向上させ得る場合がある。上記 L—アミノ酸は、特に限定はなぐ例えばグリシン、システィン、グルタミン酸等のいずれでもよい。糖類も特に限定はなぐ例えばグルコース、マンノース、ガラクトース、果糖等の単糖類、マン-トール、イノシトール、キシリトール等の糖アルコール、ショ糖、マルトース、乳糖等の二糖類、デキストラン、ヒドロキシプロピルスターチ、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸等の多糖類等およびそれらの誘導体等の、ずれでもよ、。セルロース誘導体も特に限定はなぐメチルセルロース、ェチルセルロース、ヒドロキシェチルセル口ース、ヒドロキシプロピノレセノレロース、ヒドロキシプロピノレメチノレセノレロース、カノレボキシメチルセルロースナトリウム等の!/、ずれでもよ!/、。

[0120] 界面活性剤も特に限定はなぐイオン性および非イオン性界面活性剤のいずれも使用できる。これには、例えばポリオキシエチレングリコールソルビタンアルキルエステル系、ポリオキシエチレンアルキルエーテル系、ソルビタンモノァシルエステル系、脂肪酸グリセリド系等が包含される。

[0121] 緩衝剤は、ホウ酸、リン酸、酢酸、クェン酸、 ε アミノカプロン酸、グルタミン酸および Ζまたはそれらに対応する塩 (例えばそれらのナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ金属塩やアルカリ土類金属塩)等が例示できる。

[0122] 等張化剤は、塩ィ匕ナトリウム、塩ィ匕カリウム、糖類、グリセリン等が例示できる。

[0123] キレート剤は、ェデト酸ナトリウム、クェン酸等が例示できる。

[0124] 本発明に係る医薬および医薬組成物は、溶液製剤として使用できる。その他、これを凍結乾燥化し保存し得る状態にした後、用時、水や生埋的食塩水等を含む緩衝液等で溶解して適当な濃度に調製した後に使用することもできる。

[0125] 本発明に係る医薬および医薬組成物は、本発明に係る蛋白質の機能の異常および Ζまたは本ポリヌクレオチドの発現の異常に基づく疾患の防止剤および Ζまたは治療剤として使用できる。また、当該疾患の防止方法および Ζまたは治療方法に使用できる。

[0126] 本発明に係る蛋白質の機能および Ζまたは本発明に係るポリヌクレオチドの発現の過剰に関連する異常な症状に対しては、例えば本蛋白質の機能および Ζまたは本ポリヌクレオチドの発現を阻害する有効量の阻害剤を医薬用担体とともに対象に投与することにより、異常な症状を防止、改善または治療するといつた効果を得ることができる。あるいは、内在性の本ポリヌクレオチドの発現を発現ブロック法を用いて阻害することにより同様の効果が得られる。本ポリヌクレオチドの発現の阻害は、例えば本ポリヌクレオチドの部分配列からなるオリゴヌクレオチドをアンチセンスオリゴヌタレォチドとして用いることにより実施できる。アンチセンスオリゴヌクレオチォドとして用、るオリゴヌクレオチォドは、本ポリヌクレオチドの翻訳領域のみでなぐ非翻訳領域に対応するものであっても有用である。本ポリヌクレオチドの発現を特異的に阻害するためには、該ポリヌクレオチドに固有な領域の塩基配列を用いることが好ましい。

[0127] 本発明に係るポリヌクレオチドの一態様である配列表の配列番号 1に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドの組織発現は、胃腫瘍の 1つである胃腺癌様腫瘍 (stomach adenocarcinoid tumor)で正常胃組織と比較して約 5倍、 4. 5倍以上高!、ことが判明した。配列番号 1に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質には Rho— GEFの活性ドメインである DHZPHドメインが存在する。一方、配列番号 1に記載の塩基配列の第 581番目力も第 1675番目までの塩基配列で表わされるポリヌクレオチド (配列番号 3)の^末端にコザックシークェンスとメチォニンに対応するコドンとからなるオリゴヌクレオチド (配列番号 19)が付加されたポリヌクレオチド（配列番号 5)は、 DHZPHドメインコード領域を有し、 Rhoファミリー蛋白質をコードする遺伝子と共発現させた動物細胞において、 Rhoファミリー蛋白質と結合しその活性ィ匕を促進した。このことから、配列番号 5に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質は、 Rho— GEFとして作用すると考えられる。配列番号 3に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドの^末端に付加されたコザックシークェンスとメチォニンに対応するコドンとからなるオリゴヌクレオチド (配列番号 19)は、発現された蛋白質の機能に大きな影響を与えない。したがつて、配列番号 3に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質も、 Rho— GEFとして作用すると考える。また、配列番号 1に記載の塩基配列は配列番号 3に記載の塩基配列を含むため、配列番号 1に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質も、 Rhoファミリー蛋白質と結合して Rh o— GEFとして作用すると考えられる。 Rho— GEFとして単離された遺伝子には、 va V (非特許文献 3および 4)、 ost (非特許文献 5)、 ibc (非特許文献 6)等の癌に関与する遺伝子が知られている。これらから、本ポリヌクレオチドの高発現は胃腫瘍に関連すると考える。したがって、本発明に係る医薬および医薬組成物は、胃腫瘍の防止剤および Zまたは治療剤として有用である。さらに、胃腫瘍の防止方法および Zまたは治療方法に使用できる。

本発明に係る医薬および医薬組成物の用量範囲は特に限定されず、含有される成分の有効性、投与形態、投与経路、疾患の種類、対象の性質 (体重、年齢、病状および他の医薬の使用の有無等）、および担当医師の判断等に応じて適宜選択される。一般的には適当な用量は、例えば対象の体重 lkgあたり約 0. Ol ^ g-lOOmg 程度、好ましくは約 0.： g〜lmg程度の範囲であることが好ましい。し力しながら、当該分野においてよく知られた最適化のための一般的な常套的実験を用いてこれらの用量の変更を行うことができる。上記投与量は 1日 1〜数回に分けて投与することができ、数日または数週間に 1回の割合で間欠的に投与してもよい。

[0129] 本発明に係る医薬または医薬組成物を投与するときは、該医薬または医薬組成物を単独で使用してよぐあるいは治療に必要な他の化合物または医薬と共に使用してもよい。

[0130] 投与経路は、全身投与または局所投与の!/ヽずれも選択できる。この場合、疾患、症状等に応じた適当な投与経路を選択する。例えば、非経口経路として、通常の静脈内投与、動脈内投与のほか、皮下、皮内、筋肉内等への投与が挙げられる。あるいは経口経路で投与できる。さらに、経粘膜投与または経皮投与も実施できる。癌疾患に用いる場合は、腫瘍に注射等により直接投与することが好まし、。

[0131] 投与形態は、各種の形態が治療目的に応じて選択でき、その代表的な例として、錠剤、丸剤、散剤、粉末剤、細粒剤、顆粒剤、カプセル剤等の固体投与形態や、水溶液製剤、エタノール溶液製剤、懸濁剤、脂肪乳剤、リボソーム製剤、シクロデキストリン等の包接体、シロップ、エリキシル等の液剤投与形態が含まれる。これらは更に投与経路に応じて経口剤、非経口剤（点滴剤、注射剤）、経鼻剤、吸入剤、経膣剤、坐剤、舌下剤、点眼剤、点耳剤、軟膏剤、クリーム剤、経皮吸収剤、経粘膜吸収剤等に分類され、それぞれ通常の方法に従い、調合、成形、調製することができる。

[0132] (診断方法）

本発明に係る蛋白質、ポリヌクレオチド、組換えベクター、形質転換体、抗体または化合物は、それ自体を、診断マーカーや診断試薬等の疾患診断手段として使用できる。

[0133] 本発明によれば、例えば本発明に係るポリヌクレオチドの一部または全部のポリヌクレオチドを利用することにより、個体または各種糸且織における該ポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドを含む遺伝子の異常の有無あるいは発現の有無を特異的に検出できる。本発明に係るポリヌクレオチドの検出により、該ポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドを含む遺伝子の量的異常および zまたは機能異常等に基づく疾患の易罹患性、発症、および Zまたは予後の診断が実施できる。

[0134] 疾患の診断は、例えば調べようとする試料 (被検試料）について、本発明に係るポリヌクレオチドの存在を検出すること、その存在量を決定すること、および Zまたはその変異を同定することにより実施できる。正常な対照試料との比較において、本ポリヌクレオチドの存在の変化、その量的変化を検出できる。あるいは、正常遺伝子型との比較において本ポリヌクレオチドを公知の手法により増幅した増幅生成物について、例えばサイズ変化を測定することにより、欠失や挿入といった変異を検出できる。また、被検試料力も増幅したポリヌクレオチドを、例えば標識した本ポリヌクレオチドとハイブリダィゼーシヨンさせることにより点突然変異を同定できる。力かる変化および変異の検出により、上記診断を実施できる。

[0135] 本発明は、被検試料中の本発明に係るポリヌクレオチドの定性的または定量的な測定方法、または該ポリヌクレオチドの特定領域における変異の定性的または定量的な測定方法をも提供できる。

[0136] 配列番号 1に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドの組織発現は、胃腫瘍の 1つである胃腺癌様腫瘍で正常胃組織と比較して約 5倍、 4. 5倍以上高いことが判明した。また、上述したように、該ポリヌクレオチドの高発現は胃腫瘍に関連すると考えられる。したがって、被検試料中の該ポリヌクレオチドの発現量の増加を検出することにより、該被検試料が胃腫瘍由来の被検試料であるカゝ否かを判定する方法を実施できる。このような判定方法も本発明の範囲に包含される。本判定方法において該ポリヌクレオチドの発現量の増加は、被検試料と正常な対照試料とを比較することにより検出できる。被検試料として、好ましくはヒト胃組織由来の被検組織が挙げられる。対照試料として、好ましくはヒト正常胃由来組織が挙げられる。該ポリヌクレオチドの発現量が対照試料と比較して増加している場合、好ましくは約 4. 5倍以上、より好ましくは約 5倍以上に増加している場合、被検試料がヒト胃腫瘍由来試料であると判定できる。本判定方法はまた、配列番号 1に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレォチドの代わりに、該ポリヌクレオチドを除く本発明に係るポリヌクレオチドを用いて実施できる。力かるポリヌクレオチドとして例えば、配列番号 3に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドが挙げられる。本発明に係るポリヌクレオチドの発現量とは、該ポリヌクレオチドの転写産物の量を意味する。

[0137] 被検試料は、本発明に係るポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含む遺伝子またはその変異遺伝子の核酸を含む限りにおいて特に制限されず、例えば、細胞、血液、尿、唾液、髄液、組織生検または剖検材料等の生体生物由来の試料を例示できる。あるいは所望により試料カゝら核酸を抽出して核酸試料を調製して用いることもできる。核酸は、ゲノム DNAを検出に直接使用してもよぐあるいは分析前に PCRまたはその他の増幅法を用いることにより酵素的に増幅してもよい。 RNAまたは cDNAを同様に用いてもよい。核酸試料は、また、標的配列の検出を容易にする種々の方法、例えば変性、制限消化、電気泳動またはドットブロッテイング等により調製してもよい。本発明に係るポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドを含む遺伝子の検出には、自体公知の遺伝子検出法がいずれも使用できる。具体的には、プラークハイブリダィゼーシヨン、コロニーハイブリダィゼーシヨン、サザンブロット法、ノザンブロット法、 NA SBA法、または逆転写ポリメラーゼ連鎖反応 (RT—PCR)等が例示できる。また、 in situ RT— PCRや in situ ハイブリダィゼーシヨン等を利用した細胞レベルでの測定により検出できる。このような遺伝子検出法において、本発明に係るポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含む遺伝子またはその変異遺伝子の同定および Zまたはその増幅の実施に、本ポリヌクレオチドの部分配列力なるオリゴヌクレオチドであつてプローブとしての性質を有するものまたはプライマーとしての性質を有するものが有用である。プローブとしての性質を有するオリゴヌクレオチドとは、本ポリヌクレオチドのみに特異的にハイブリダィゼーシヨンできる該ポリヌクレオチド特有の配列力なるものを意味する。プライマーとしての性質を有するものとは本ポリヌクレオチドのみを特異的に増幅できる該ポリヌクレオチド特有の配列力もなるものを意味する。また、増幅できる変異遺伝子を検出する場合には、遺伝子内の変異を有する箇所を含む所定の長さの配列を持つプライマーある、はプローブを作成して用いる。プローブまたはプライマーとして、塩基配列長が一般的に 5乃至 50ヌクレオチド程度であるものが好ましぐ 10乃至 35ヌクレオチド程度であるものがより好ましぐ 15乃至 30ヌクレオチド程度であるものがさらに好ましい。本発明に係るポリヌクレオチドまたはその断片を増幅するためのプライマー、あるいは本ポリヌクレオチドを検出するためのプローブとして、具体的には、配列番号 7、 8、 9または 10に記載の塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチドを好ましく例示できる。プローブは、通常は標識したプローブを用いるが、非標識であってもよい。また、直接的または間接的に標識したリガンドとの特異的結合により検出してもよい。プローブおよびリガンドを標識する方法は、種々の方法が知られており、例えばニックトランスレーション、ランダムプライミングまたはキナーゼ処理を利用する方法等を例示できる。適当な標識物質として、放射性同位体、ピオチン、蛍光物質、化学発光物質、酵素、抗体等が挙げられる。

[0139] 遺伝子検出法は、 PCRが感度の点力も好ましい。 PCRは、本発明に係るポリヌクレォチド、該ポリヌクレオチドを含む遺伝子またはその変異遺伝子を特異的に増幅できるプライマーを用いる方法である限り、従来公知の方法のいずれも使用できる。例えば RT— PCRが挙げられる力その他、当該分野で用いられる種々の PCRの変法を適応できる。

[0140] PCRにより、遺伝子の検出の他に、本発明に係るポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含む遺伝子またはその変異遺伝子の DNAの定量も実施できる。かかる分析方法として、 MSSA法等の競合的定量法、または一本鎖 DNAの高次構造の変化に伴う移動度の変化を利用した突然変異検出法として知られる PCR— SSCP法を例示できる。

[0141] 本発明によればまた、例えば本発明に係る蛋白質を利用することにより、個体若しくは各種組織における該蛋白質およびその機能の異常の有無を特異的に検出できる。本発明に係る蛋白質およびその機能の異常の検出により、該蛋白質の量的異常および Zまたは機能の異常に基づく疾患の易罹患性、発症、および Zまたは予後の診断を実施できる。

[0142] 蛋白質の検出による疾患の診断は、例えば被検試料について、該蛋白質の存在を検出すること、その存在量を決定すること、および Zまたはその変異を検出することにより実施できる。すなわち、本発明に係る蛋白質および Zまたはその変異体を定量的あるいは定性的に測定する。正常な対照試料との比較において、本蛋白質の存在の変化、その量的変化を検出できる。正常蛋白質との比較において、例えばァミノ酸配列を決定することによりその変異を検出できる。かかる変化および変異の検出により、上記診断を実施できる。被検試料は、本蛋白質および Zまたはその変異体を含むものである限り特に制限されず、血液、血清、尿、生検組織等の生体生物由来の生物学的試料が例示できる。

[0143] 本発明に係る蛋白質および変異を有する該蛋白質の測定は、本発明に係る蛋白質、例えば配列表の配列番号 2、 4または 6に記載のアミノ酸配列で表わされる蛋白質、または該蛋白質のアミノ酸配列において 1若しくは数個乃至複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入または付加されたアミノ酸配列で表わされる蛋白質、これらの断片、または該蛋白質やその断片に対する抗体を用いて実施できる。

[0144] 蛋白質の定量的あるいは定性的な測定は、この分野における慣用技術による蛋白質検出法あるいは定量法を用いて実施できる。例えば、本蛋白質のアミノ酸配列分析により変異蛋白質を検出できる。さらに好ましくは、抗体 (ポリクローナルまたはモノクローナル抗体)を用いて、蛋白質の配列の相違、または蛋白質の有無を検出する。

[0145] 本発明は、被検試料中の本蛋白質の定性的または定量的な測定方法、または該蛋白質の特定領域の変異の定性的または定量的な測定方法を提供できる。

[0146] 具体的には、被検試料について、本蛋白質に対する特異抗体を用いて免疫沈降を行い、ウェスタンブロット法またはィムノブロット法で本蛋白質の解析を行うことにより、上記検出を実施できる。また、本蛋白質に対する特異抗体を用いて免疫組織化学的技術によりパラフィンまたは凍結組織切片中の本蛋白質を検出できる。

[0147] 本蛋白質またはその変異体を検出する方法の好ましい具体例として、モノクローナル抗体および Zまたはポリクローナル抗体を用いるサンドイッチ法を含む、酵素免疫測定法 (ELISA)、放射線免疫検定法 (RIA)、免疫放射線検定法 (IRMA)、および免疫酵素法 (IEMA)等が挙げられる。その他、ラジオィムノアツセィゃ競争結合アツセィ等を利用することもできる。

[0148] 本発明に係る蛋白質、ポリヌクレオチド、組換えベクター、形質転換体、および抗体はいずれも、それ自体を単独であるいは組合わせて、試薬等として使用できる。試薬は、本発明に係る蛋白質、ポリヌクレオチド、組換えベクター、形質転換体、および抗体のうちの少なくとも 1種類の他に、緩衝液、塩、安定化剤、および,または防腐剤等の物質を含むことができる。なお、製剤化にあたっては、各性質に応じた自体公知の製剤化手段を導入すればよい。該試薬は、例えば、本発明に係る判定方法、化合物の同定方法、あるいは本蛋白質または本ポリヌクレオチドの測定方法に使用できる。該試薬はその他、本発明に係る蛋白質またはポリヌクレオチドが関与する細胞内情報伝達経路の解明、および該蛋白質またはポリヌクレオチドの異常に基づく疾患等に関する基礎的研究等に有用である。

[0149] 本発明はまた、本発明に係る蛋白質、ポリヌクレオチド、組換えベクター、形質転換体、および抗体のうちの少なくとも、ずれか 1つを含んでなる試薬キットを提供する。試薬キットにはその他、本発明に係る蛋白質やポリヌクレオチドを検出するための標識物質、標識の検出剤、反応希釈液、標準抗体、緩衝液、洗浄剤および反応停止液等、測定の実施に必要とされる物質を含むことができる。標識物質として、上述の蛋白質や放射性同位元素等が挙げられる。標識物質は、予め本発明に係る蛋白質あるいはポリヌクレオチドに付加されていてもよい。本試薬キットは、本発明に係る判定方法、化合物の同定方法、あるいは本蛋白質または本ポリヌクレオチドの測定方法に使用できる。さらに、本試薬キットは、前記測定方法を用いる検査方法に、検査剤並びに検査用キットとして使用できる。また、前記測定方法を用いる診断方法にも、診断剤並びに診断用キットとして使用できる。

[0150] 以下、本発明を実施例に基づき具体的に説明する。

実施例 1

[0151] (ヒト脳由来 cDNAライブラリーの構築と遺伝子の分取）

ヒトの脳、胎児脳および脳海馬由来の polyA+RNA (Clontech社製：カタログ No. 6516— 1、 6525— 1および 6578— 1)を出発原料として常法により cDNAライブラリ一を構築し、 dbEST分析により cDNA断片を単離して cDNAクローンの塩基配列を決定した。具体的には、小原らの方法 (非特許文献 19)に従って調製した上記ヒト脳由来の cDNAライブラリーから、約 50, 000個の組換え体をランダムに選択し、このうち約 30, 000個のクローンの cDNAについて、その 5' 末端および 3' 末端の塩基配列を決定した。さらに約 1, 100個のクローンを主にインビトロの転写翻訳実験により選択し、それら cDNAの塩基配列を小原らの方法に従って決定した。

[0152] 全塩基配列の決定を行った cDNAクローンについて、コンピュータプログラムを用いた汎用解析方法により ORFを予想した。次いで、 ORF領域についてモチーフドメイン検索を行い、 Rho— GEFの活性ドメインである DHZPHドメインをコードする領域を含む cDNAを同定した。

[0153] 同定した cDNAクローン hj03796は、全長 4977bpの新規な塩基配列を有する D NA (配列番号 1)であり、 1340アミノ酸（配列番号 2)をコードする ORFを含む。 DH ドメインは配列番号 2に記載のアミノ酸配列の第 97番目のノリン (Val)力も第 271番目のァスパラギン酸 (Asp)までの 175アミノ酸残基力もなる。 PHドメインは配列番号 2に記載のアミノ酸配列の第 297番目のロイシン (Leu)から第 394番目のロイシン (L eu)までの 98アミノ酸残基力もなる。 DHドメインおよび PHドメインをコードする領域はそれぞれ、配列番号 1に記載の塩基配列の第 602番目力も第 1126番目のヌクレォチドおよび第 1202番目力も第 1495番目のヌクレオチドに相当する。

実施例 2

[0154] (DNAの発現と精製）

実施例 1で同定したクローン hj03796を用いて、該クローンがコードする蛋白質を F LAG— tag融合蛋白質として 293EBNA細胞（Invitrogen社製）で発現させた。また、クローン hj03796がコードする蛋白質の部分配列力なり DH/PHドメインを含む蛋白質を 293EBNA細胞を用いて発現させた。発現の確認はウェスタンブロット法により行った。

[0155] まず、 hj03796遺伝子を含む発現ベクターを構築した。テンプレートとして pBlues cript II— hj03796 (hj03796は pBluescript II SK+の Sail— Notlサイトに挿入されてヽる：かずさ DNA研究所製）、プライマーとして K0599s3 (配列番号 7)および asBaml (配列番号 8)を用いて pfu turbo (Stratagene社製）にて遺伝子を増幅した。増幅した遺伝子を HincIlZBamHIで切断して得た遺伝子断片、 pBluescriptll —hj03796を SallZHincIIで切断した遺伝子断片、および pDsRed2—Nl (Clont ech社製）を Sall/BamHIで切断した遺伝子断片をライゲーシヨンし、コンビテントセルに導入した。次いで、形質転換した大腸菌から精製キットを用いて DNAを精製した。精製 DNAを Sall/BamHIで切断して得られた hj03796フラグメントを、ベクタ一 DNAである pFLAG— CMV5b (SIGMA社製）の SallZBamHIサイトに挿入し、 hj03796発現ベクターを得た。制限酵素処理を行った塩基配列が正しく挿入されていることは、シーケンスを行なって確認した。シーケンス反応は DNA Sequencing Kit (ABI社製）を、泳動および解析は ABI PRISM 377を用いて行なった。

[0156] 次に、 hj03796クローンがコードする全長蛋白質の部分配列力もなる蛋白質であつて DHZPHドメインを含む蛋白質（以下、 hj03796DHZPHと称する）を発現させるためのベクターを、ゲートウェイ ^TMクロー-ングテクノロジー（Invitrogen社製）を用いて構築した。 pBluescriptll— hj03796をテンプレートとし、 pfu turboを用いて、 pr oto— Dblの DHZPHドメインコード領域と相同性のある領域（配列番号 1の第 581 番目力も第 1675番目のヌクレオチドに相当）の^末端にコザックシークェンスとメチォニンに対応するコドンとからなるオリゴヌクレオチド (配列番号 19)が付加されたポリヌクレオチドを増幅した。その後、増幅産物を TOPOクローユングシステムを用いた反応にて pENTRZSDZD— TOPOに挿入し、エントリーベクターを作製した。増幅反応にはプライマーとして、 03796DZP— F1 (配列番号 9)および 03796DZP— R3 (配列番号 10)を使用した。次いで、上記エントリーベクターと C末端 FLAG— tag (3 X )融合蛋白質発現ベクターを用いて、 LRクロナーゼによる組換え反応により、 hj 03796DHZPHを FLAG— tag (3 X )融合蛋白質として発現させるための発現べクターを作製した。 hj03796の DHZPHドメインコード領域の塩基配列が正しく挿入されていることは、シーケンスを行って確認した。シーケンス反応は DYEnamic ET Terminator Cycle Sequencing Kit (.Amersham Biosciences社製)を、泳動および解析は ABI PRISM 377を用いて行なった。

[0157] hj03796DHZPHの比較対照として、既知 Rho— GEFである proto— Dblの DH ZPHドメイン（以下、 proto— Dbl DHZPHと称する）を用いるためにその発現べクターを構築した。マルチプルティシュー cDNAパネルズ（Multiple Tissue cDNA Panels、 Clontech社製）のブレインファーストストランド DNA(brain first stran d DNA)をテンプレートとし、 pfu turboを用いて proto— Dblの DH/PHドメインコード領域 (proto— Dblの塩基配列中の開始 ATGコドンより第 1485番目から第 24 29番目）を増幅した。その後、増幅産物をライゲーシヨン反応にて pFLAG— CMV5 a (SIGMA社製）の Bglll - Sailサイトに挿入し、 proto - Dbl DHZPHを FLAG - tag融合蛋白質として発現させるための発現ベクターを作製した。増幅反応にはブライマ一として、 DZP— si (Bglll) (配列番号 11)および DZP— asl (Sail) (配列番号 12)を使用した。 proto— Dblの DHZPHドメインコード領域の塩基配列が正しく挿入されていることをシーケンスにより確認したところ、 1塩基が公開配列と異なることが明らかになった。しかし、この 1塩基の差異によるアミノ酸置換は認められな力つた。具体的には、発現ベクターに挿入された proto— Dblの DH/PHドメインコード領域の塩基配列は、 proto— Dblの公開配列（ァクセッション番号: X12556)と比較し、その公開配列の開始 ATGコドンより第 1962番目の塩基である T (チミン）が A (アデニン）となった塩基配列である。発現ベクターに挿入された proto— Dblの DHZPH ドメインコード領域の塩基配列は、 proto— Dblの公開配列の開始 ATGコドンより第 1480番目力も第 2433番目までの塩基配列の^末端に ATGGCAが付加されている塩基配列である。したがって、発現ベクターに挿入された proto— Dblの DHZPH コード領域において、その開始 ATGコドンより第 489番目の塩基が公開配列の対応する塩基と異なっている。公開配列の開始 ATGコドンより第 1960番目力も第 1962 番目までの塩基は GGTであり、グリシンをコードしている。一方、発現ベクターに揷入された proto— Dblの DHZPHコード領域の塩基配列の開始 ATGコドンより第 48 7番目力も第 489番目までの塩基は GGAであり、同様にグリシンをコードしている。すなわち、 1塩基の差異によるアミノ酸置換は認められな力つた。 proto— Dblの公開塩基配列および該公開塩基配列にコードされるアミノ酸配列をそれぞれ配列番号 26 および 27に示す。配列番号 26に示した proto— Dblの塩基配列は、 2005年 2月 24 日に NCBI (National Center for Biotechnology Information)公開ァータベースを閲覧したときに公開されていた塩基配列である。

各発現ベクターは、 293EBNA細胞にリポフエクシヨン法によりトランスフエクシヨンした。すなわち、各発現ベクターを添カ卩した無血清の DMEMとリボフヱクトァミン 2000 (LipofectAMINE2000、 Invitrogen社製）を添カ卩した DMEMとを混合し、室温で 20分間インキュベーションした。得られた混合液を、前日播種して 37°Cにて 5%CO

2 存在下で培養した 293EBNA細胞に添加した。遺伝子導入処理した細胞は 37°Cにて 5%CO存在下で 2日間インキュベーションした。培養終了後、エチレンジァミン四

2

酢酸を含むリン酸緩衝生理食塩水（PBS—EDTA)にて細胞を洗浄し、プロテア一ゼインヒビターカクテル（protease inhibitor cocktail、 1/100濃度、 SIGMA社製） 1%を含む溶解バッファー (Lysis buffer)にて細胞を溶解して細胞溶解液を調製した。溶解バッファ一は、次の組成からなる： 25mM Tris— HC1、 pH7. 5 ; 150 mM NaCl; lmM CaCl；および 1% Triton X— 100。

2

[0159] 各細胞溶解液は、等量の SDS— PAGEサンプルバッファーと混合し、加熱処理（1 00°Cで 5分間）して電気泳動用サンプルを調製した。 SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、泳動ゲルをブロッテイングバッファーに 5分間以上浸して平衡ィ匕した後、 PVDF膜上に蛋白質をトランスファーした。ブロッテイング終了後の PVDF膜は、 TBS— Tにブロックエース (大日本製薬株式会社製)を 3： 1の割合で混合した溶液 ( TBS-T+BA)に 4°Cでー晚浸してブロッキングした。ブロッキング終了後に、 PVD F膜を TBS— Tにて 10分以上振とうしながら 1回洗浄した。上記で用ヽた SDS— PA GEサンプルバッファ一は、次の組成からなる： 1. 7% Tris ;0. 13M HC1; 22% グリセロール； 4. 6% SDS ;および 0. 22gZmL ブロモフエノールブルー。ブロッティングバッファ一は、次の組成からなる： 25mM Tris ;40mM ε —アミノー n—力プロン酸； 20%メタノール；および 0. 05% SDS。 TBS—Tは、次の組成からなる： 1 50mM NaCl; 10mM Tris— HC1、 pH7. 5 ;および 0. 05% Tween— 20。

[0160] 抗 FLAG M2モノクローナル抗体（SIGMA社製）を TBS— T+BAで 1000倍希釈して PVDF膜に添カ卩し、 37°Cで 1時間以上保温した。その後、 PVDF膜を TBS— Tにて 3回洗浄し（1回の洗浄に付き 10分以上の振とう）、 TBS— T+BAで 1000倍に希釈した HRP標識抗マウス IgG抗体（Cell Signaling Technology社製）を添カロして、 37°Cで 1時間以上保温した。最終的に、 PVDF膜を TBS— Tにて 3回洗浄した後（1回の洗浄に付き 10分以上の振とう）、 ECLプラスウェスタンブロッテイングディテクシヨンシステム（Amer sham Biosciences社製）〖こより、抗 FLAG抗体に反応する発現蛋白質を検出した。化学発光シグナルは検出装置 (Lumino Imaging A nalyzer,東洋紡績株式会社製）にて可視化した。

[0161] 結果を図 1に示す。 FLAG— tag融合蛋白質として発現させた hj03796は、 220K Da力ら 97. 4KDaの間に単一バンドとして検出された（図 1内レーン 1)。 hj03796D HZPHは、抗 FLAG抗体により約 50KDaに単一バンドとして検出された（図 1内レーン 4)。 hj03796がコードする蛋白質 (以下、 hj03796蛋白質と称する）および hjO 3796DHZPHの予想分子量はそれぞれ約 150KDaおよび約 43KDaである。このこと力ら、上記単一バンドは、それぞれ hj03796および hj03796DHZPHであることが明らかになった。また、 proto— Dbl DHZPHは、抗 FLAG抗体により約 40KDa に単一バンドとして検出された（図 1内レーン 2およびレーン 5)。ベクターを導入しな力つたコントロール細胞から同様の処理により得た蛋白質溶液では、かかるバンドは V、ずれも検出されなかった（レーン 3および 6)。

[0162] 力くして、 hj03796蛋白質、 hj03796DHZPH、および proto— Dbl DHZPHを得ることができた。

実施例 3

[0163] (Rhoファミリー蛋白質との結合の検出）

実施例 2で構築した hj03796DHZPH (C末端 FLAG— tag融合蛋白質)発現べクタ一を用いて、 hj03796DHZPHと Rhoファミリー蛋白質との結合について、プルダウン法により検討した。

[0164] Rhoファミリー蛋白質として、 Cdc42、 Rho Aおよび Raclを用いた。これら蛋白質を

N末端 GST— tag融合蛋白質として発現させるための発現ベクターは後述するように構築した。

[0165] 陽性コントロールとして proto— Dbl DHZPHを用いた。 proto— Dbl DH/PH

(C末端 FLAG— tag融合蛋白質)発現ベクターは実施例 2で構築した発現ベクターを用いた。 proto— Dblは Rho— GEFのプロトタイプであり、 proto— Dblの活性化は oncogenic activationと考えられている。 proto— Dblの活性化は、そのアミノ酸配列の N末端側 (第 1番目力第 497番目のアミノ酸)の欠失により起こる。すなわち、 p roto Dblの C末端側の DH/PHドメインを含む領域（oncogenic— Dbl)が Rhoフアミリー蛋白質を活性ィ匕することが報告されている (非特許文献 1)。本実施例において用、た proto - Dbl DH/PHは proto - Dblの第 494番目から第 811番目までのアミノ酸を有する欠失変異体であり、 oncogenic— DbUり短い配列である。 oncog enic— Dblは、 Cdc42、 RhoAおよび Raclと結合するが、 Cdc42および RhoAに対して GEF活性を有する一方、 Raclには GEF活性を持たないことが報告されている（非特許文献 2)。 [0166] hj03796DHZPHまたは proto— Dbl DHZPHに結合する Rhoファミリー蛋白質の特異性を確認するため、 N末端側に GST— tagを付加した |8—ダルク口ニダ一ゼ（Glucuronidase) (以下、 GST— GUSと略称する）を陰性コントロールとして用いた。

[0167] hj03796DHZPH発現ベクターまたは proto— Dbl DHZPH発現ベクターと Rh oファミリー蛋白質発現ベクターとを添カ卩した無血清の DMEMと Lipofectamine20 00を添カ卩した DMEMを混合し、室温で 20分間インキュベーションした。得られた混合液を 293EBNA細胞に添カ卩した。 293EBNA細胞は、遺伝子導入の前日に細胞数 6. 0 X 10⁴Zwellを 24ゥエルプレートへ播種し、 37°Cにて 5%CO存在下でー晚

2

培養した後に本実施例で用いた。遺伝子導入処理した細胞は 37°Cにて 5%CO存

2 在下で 2日間インキュベーションした。培養終了後、 PBS— EDTAにて細胞を洗浄し、プロテアーゼインヒビターカクテル（protease inhibitor cocktail、 SIGMA社製 ) 1%を含む溶解バッファー (組成は実施例 2を参照）にて細胞を溶解して細胞溶解液を調製した。

[0168] 各細胞溶解液について、 hj03796DHZPHまたは proto— Dbl DHZPHと Rho ファミリー蛋白質との結合をプルダウン法により検出した。各細胞溶解液 300 L、溶解バッファーにけん濁した 20 μ Lのグルタチオンセファロース 4Β (Glutathione se pharose 4B)および溶解バッファー 100 μ Lを混合した。各サンプルは、 MgClお

2 よびジチオスレィトール (DTT)がそれぞれ最終濃度 ImMとなるように調製した。回転盤にて回転させながら 4°Cで 1時間反応させた後に、 lmLの冷却した溶解バッファ一（MgClの最終濃度は ImM)を用いて遠心処理（1, OOOrpmで 4°Cにて 15秒間）

2

により 3回洗浄した。洗浄後、上清を除去した Glutathione sepharose 4Bに、溶解バッファーと等量の SDS— PAGEサンプルバッファー（組成は実施例 2を参照）とを混合した溶液を 40 L添加してミキサーにて撹拌後、加熱処理（100°Cにて 5分間 )して電気泳動用サンプルを調製した。 SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、ブロッテイングバッファー (組成は実施例 2を参照）に 5分間以上浸して平衡ィ匕した泳動ゲルから、 PVDF膜上に蛋白質をトランスファーした。ブロッテイング終了後の PV DF膜は、 TBS—T+BA (組成は実施例 2を参照）に 4°Cでー晚浸してブロッキングした。ブロッキング終了後に、 PVDF膜を TBS— T (組成は実施例 2を参照）にて洗浄した（10分以上の振とうを 1回)。

[0169] 抗 FLAG M2モノクローナル抗体（SIGMA社製）を TBS— T+BAで 1000倍希釈して PVDF膜に添カ卩し、 37°Cで 1時間以上保温した。その後、 PVDF膜を TBS— Tにて 3回洗浄し（1回の洗浄に付き 10分以上の振とう）、 TBS— T+BAで 1000倍に希釈した HRP標識抗マウス IgG抗体（Cell Signaling Technology社製）を添カロして、 37°Cで 1時間以上保温した。最終的に、 PVDF膜を TBS— Tにて 3回洗浄した後（1回の洗浄に付き 10分以上の振とう）、 ECLプラスウェスタンブロッテイングディテクシヨンシステム（Amer sham Biosciences社製）〖こより、抗 FLAG抗体に反応する発現蛋白質を検出した。化学発光シグナルは検出装置にて可視化した。

[0170] 抗 FLAG抗体にて予想分子量にバンドが検出された場合、 hj03796DHZPHまたは proto— Dbl DHZPHは Rhoファミリー蛋白質と結合すると判定した。図 2に示したように、 hj03796DHZPHと Rhoファミリー蛋白質 (Racl、 RhoAまたは Cdc42) とを共発現させた細胞カゝら調製した試料ではそれぞれ約 50KDaに hj03796DHZ PHに相当するバンドが検出された（図 2の上図、 hj03796DHZPHのレーン 1、 2および 3)。一方、 proto— Dbl DHZPHと RhoAまたは Cdc42とを共発現させた細胞力調製した試料では、 proto— Dbl DHZPHに相当する約 40KDa付近にバンドが検出された（図 2の上図、 proto— Dbl DHZPHのレーン 2および 3)力 proto - Dbl DHZPHと Raclとを共発現させた細胞力調製した試料では力かるバンドは検出されなかった（図 2の上図、 proto -Dbl DHZPHのレーン 1)。 hj03796DH ZPHおよび proto— Dbl 01¾7?1¾と03丁ー &8融合|8—グルクロ-ダーゼとを共発現させた細胞力も調製した試料では、かかるバンドは検出されな力つた（図 2の上図、レーン 4)。すなわち、 hj03796DH/PH*5j t^proto-Dbl DH/PHは、 GS T—GUSとは結合しな力つた、また、 Rhoファミリー蛋白質遺伝子を発現させなかつたときには力かるバンドは認められなかった（レーン 5)。各細胞における hj03796D HZPHおよび proto— Dbl DHZPHの発現量を細胞溶解液を用いて比較したところ、ほぼ同量であった（図 2の下図）。

[0171] これらから、 hj03796DHZPH力Cdc42、 RhoAまたは Raclと結合することが判明した。したがって、 hj03796DHZPHを含む hj03796全長蛋白質は、これら Rho ファミリー蛋白質と結合すると考えられ、さらに Rho— GEFとしての機能を有する可能 '性がある。

[0172] 本実施例で用いた Cdc42、 Rho Aまたは Raclを N末端 GST— tag融合蛋白質として発現させるための各発現ベクターは以下のように構築した。

Cdc42、RhoAまたは Raclの発現ベクターはゲートウェイ ^TMクローユングテクノロジ一（Invitrogen社製）を用いて作製した。まず、 Multiple Tissue cDNA Panels (Clontech社製）のスプリーンファーストストランド DNA (spleen first strand DN A)をテンプレートとして、 pfu turboを用いて各 Rhoファミリー蛋白質（Cdc42、 Rho Aおよび Racl)をコードする遺伝子を増幅した。増幅産物を、 TOPO cloning sys temを用、た反応にて pENTRZDに挿入してエントリ一ベクターを作製した。増幅反応にはプライマーとして、 Cdc42遺伝子に対しては Cdc42— sl (配列番号 13)および Cdc42— asl (配列番号 14)、 RhoA遺伝子に対しては RhoA— si (配列番号 1 5)および RhoA— as 1 (配列番号 16)、 Racl遺伝子に対しては Racl— si (配列番号 17)および Racl— asl (配列番号 18)を使用した。次に、構築したエントリーベクタ一について、 N末端 GST— tag融合蛋白質発現ベクターである pDEST27を用いて LRクロナーゼによる組換え反応より GST融合 Rhoファミリー蛋白質発現プラスミドを作製した。各遺伝子のコード領域の塩基配列が正しく挿入されてヽることをシーケンスを行って確認した。シーケンス反応は DYEnamic ET Terminator Cycle Se quencing Kit (Amersham Biosciences社製）を、泳動および解析は ABI PRI SM 377を用いて行なった。

実施例 4

[0173] (hj03796DHZPHによる Cdc42の活性化促進）

hj03796DHZPHの Rhoファミリー蛋白質に対する GEF活性を、実施例 2で構築した hj03796DHZPH (C末端 FLAG— tag融合蛋白質)発現ベクターを用いて、エフェクタープルダウン法により検討した。 Rhoファミリー蛋白質として、 Cdc42、 Rho Aおよび Raclを用いた。これら Rhoファミリー蛋白質はいずれも N末端 3 X FLAG— tag融合蛋白質として発現させた。 [0174] 0379601¾7?11 (じ末端？1^^ー &₈融合蛋白質)発現べクターと上記ぃずれかの Rhoファミリー蛋白質を発現させるための発現ベクターとを、 24ゥエルプレートに播種した 293EBNA細胞に導入した。ベクターの細胞への導入は、 Lipofectamine 2000を用いて行った。陰性コントロールとして、細胞に各ベクターを導入せずに、 Li pofectamine2000のみを添カ卩したものを用いた。遺伝子導入 1日後、プロテアーゼインヒビターカクテル（1Z100濃度： SIGMA社製)を含む溶解バッファーで細胞を溶解して細胞溶解液を調製した。次いで、細胞溶解液をエフェクターベッド (UPST ATE社製）と 4°Cで 1時間反応させた。エフェクターベッドとして、 PAK—1または Rh otekinの、活性型 Rhoファミリー蛋白質に結合するドメインに GST— tagを付カ卩した蛋白質が結合しているダルタチオンァガロースを用いた。反応させたエフェクターべッドは、溶解バッファーで洗浄し、溶出液（トリス ' SDS ' j8メルカプトエタノール処理液：株式会社第一化学社製)で溶出操作を行った。得られた溶出液は、 SDS - PAGE によりウェスタンブロッテイングに付し、その後、抗 FLAG抗体を用いて FLAG— tag 付加蛋白質の検出を実施した。溶解バッファ一は次の組成力もなる： 25mM HEP ES、 pH7. 5 ; 150mM NaCl ; 10mM MgCl ; lmM EDTA ; 2% グリセローノレ

2

; 1 % Triton X— 100。

[0175] hj03796DHZPHが Rhoファミリー蛋白質に対して GEF活性を有するならば、 hjO 3796DHZPHにより Rhoファミリー蛋白質は不活性型 (GDP結合型)から活性型 ( GTP結合型）に移行する。エフェクターベッドとして使用した PAR— 1は活性型 Cdc 42および活性型 Rac lと結合することが知られている。また、 Rhotekinは活性型 Rh oAと結合する。したがって、 hj03796DHZPHが Rhoファミリー蛋白質に対して GE F活性を有するならば、エフェクターベッドに結合する Rhoファミリー蛋白質量が増加する。抗 FLAG抗体により、 hj03796DHZPHおよび Rhoファミリー蛋白質を共発現させた細胞力も得た試料力 Rhoファミリー蛋白質のみを発現させた細胞力も得た試料よりも Rhoファミリー蛋白質のバンドが濃く検出される場合、 hj03796DH/PH は GEF活性を有すると判定した。

[0176] 結果を図 3—Aおよび図 3— Bに示す。図 3—Aは、各細胞溶解液に含まれる Rho ファミリー蛋白質および/または hj03796DH/PHの発現を抗 FLAG抗体により検出した結果を示す。各 Rhoファミリー蛋白質（図中では Rhoと示す)の発現は、 hj037 96DHZPHと共発現させた細胞および Rhoファミリー蛋白質のみを発現させた細胞のいずれにおいても、ほぼ同等であった（図 3— Aのレーン 2、 4、 6、 8、 10および 12 にお!/、て白矢頭で示す)。 RhoAにつ!/、ては複数のバンドが確認された（図 3— Aのレーン 6および 8)。これは、蛋白質分解酵素による影響であると考えた。また、 hj037 96DHZPH (図中では GEFと示す）の発現は、 hj03796DHZPHのみを発現させた細胞および各 Rhoファミリー蛋白質と共発現させた細胞のいずれにおいても、ほぼ同等であった（図 3— Aのレーン 3、 4、 7、 8、 11および 12において黒矢頭で示す）。

[0177] 図 3— Bは、上記各細胞溶解液を用いてエフェクタープルダウン法を実施した結果を示す。 Cdc42と hj03796DHZPH (図中では GEFと示す）を共発現させた細胞から得た試料（図 3— Bのレーン 4)において、 Cdc42のみを発現させた細胞から得た試料（図 3— Bのレーン 2)と比較して、バンドが濃く検出された。すなわち、 Cdc42と hjO 3796DHZPHを共発現させた細胞では、 PAR— 1に結合する活性型 Cdc42が増カロした。このことから、 hj03796DHZPHは、 Cdc42に対して GEF活性を有することが明らかになった。よって、 hj03796DHZPHを含む hj03796全長蛋白質も Cdc4 2に対して GEF活性を有すると考える。このように、 hj03796は、 Cdc42の活性化を促進する機能を有することが判明した。

産業上の利用可能性

[0178] 本発明に係るポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質は Rhoファミリー蛋白質と結合し、さらに Rhoファミリー蛋白質の活性ィ匕を促進した。本蛋白質およびポリヌクレオチドの利用により、 Rhoファミリー蛋白質が関与する情報伝達経路および細胞機能の解明とその調節、並びに本蛋白質またはポリヌクレオチドの異常に基づく疾患、例えば胃腫瘍の診断、防止および Zまたは治療が可能になる。したがって、本発明は基礎科学分野力医薬開発分野まで広く寄与する有用な発明である。

配列表フリーテキスト

[0179] 配列番号 1 :グァニンヌクレオチド交換因子としての機能を有する蛋白質 (配列番号 2 )をコードするポリヌクレオチド。

配列番号 1 : (602)： (1126) Dbl相同ドメインをコードする領域。配列番号 1 : (1202)： (1495)プレックストリン相同ドメインをコードする領域。

配列番号 3：配列番号 1の第 581番目力も第 1675番目までのヌクレオチドからなる部分配列であって、 Dbl相同ドメインおよびプレックストリン相同ドメインをコードする領域を含むポリヌクレオチドであり、ここで該ポリヌクレオチドは配列番号 4に記載のアミノ酸配列をコードする。

配列番号 5： 5'末端にコザックコンセンサス配列とメチォニンに対応するコドンとを有し、それに続いて、配列番号 1の第 581番目力も第 1675番目までのヌクレオチドからなる部分配列であって Dbl相同ドメインおよびプレックストリン相同ドメインをコードする領域を含む配列を有するポリヌクレオチドであり、ここで該ポリヌクレオチドは配列番号 6に記載のアミノ酸配列をコードする。

配列番号 5 : (1)： (4)コザックコンセンサス配列。

配列番号 5 : (5)： (7)メチォニンに対応するコドン。

配列番号 7：プライマー用に配列番号 1の配列に基づ!/、て設計されたポリヌクレオチド。

配列番号 8：プライマー用に配列番号 1の配列に基づ!/、て設計されたポリヌクレオチド。

配列番号 9：プライマー用に配列番号 1の配列に基づ!/、て設計されたポリヌクレオチド。

配列番号 10：プライマー用に配列番号 1の配列に基づ!/、て設計されたポリヌクレオチド。

配列番号 11：プライマー用に proto— Dblの配列に基づ、て設計されたポリヌクレオチド。

配列番号 12：プライマー用に proto— Dblの配列に基づ、て設計されたポリヌクレオチド。

配列番号 13：プライマー用に Cdc42の配列に基づ、て設計されたポリヌクレオチド。配列番号 14：プライマー用に Cdc42の配列に基づ、て設計されたポリヌクレオチド。配列番号 15：プライマー用に RhoAの配列に基づ、て設計されたポリヌクレオチド。配列番号 16：プライマー用に Rho Aの配列に基づ、て設計されたポリヌクレオチド。配列番号 17：プライマー用に Raclの配列に基づ、て設計されたポリヌクレオチド。配列番号 18：プライマー用に Raclの配列に基づ、て設計されたポリヌクレオチド。配列番号 19 :コザックコンセンサス配列とそれに続くメチォニンに対応するコドンを含む設計されたオリゴヌクレオチド。

配列番号 20： Cdc42遺伝子。

配列番号 21 : Cdc42

配列番号 22： RhoA遺伝子

配列番号 23 :RhoA

配列番号 24： Rac 1遺伝子

配列番号 25 :Racl

配列番号 26 : proto— Dbl (配列番号 27)をコードする遺伝子。

Claims

請求の範囲

[1] 配列表の配列番号 1に記載の塩基配列若しくはその相補的塩基配列で表わされるポリヌクレオチド、または配列表の配列番号 2に記載のアミノ酸配列で表わされる蛋白質をコードするポリヌクレオチド若しくは該ポリヌクレオチドの相補的塩基配列で表わされるポリヌクレオチド。

[2] 配列表の配列番号 3若しくは 5に記載の塩基配列またはその相補的塩基配列で表わされるポリヌクレオチド、または配列表の配列番号 4若しくは 6に記載のアミノ酸配列で表わされる蛋白質をコードするポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドの相補的塩基配列で表わされるポリヌクレオチド。

[3] 配列表の配列番号 3に記載の塩基配列若しくはその相補的塩基配列で表わされるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、または配列表の配列番号 4に記載のァミノ酸配列で表わされる蛋白質をコードするポリヌクレオチド若しくは該ポリヌクレオチドの相補的塩基配列で表わされるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドであつて、 Cdc42の活性ィ匕を促進する蛋白質をコードするポリヌクレオチド。

[4] 請求項 1または 2に記載のポリヌクレオチドの塩基配列と少なくとも約 70%の相同性を有する塩基配列で表わされるポリヌクレオチドであって、 Cdc42の活性ィ匕を促進する蛋白質をコードするポリヌクレオチド。

[5] 請求項 1または 2に記載のポリヌクレオチドの塩基配列において、 1乃至数個のヌクレォチドの欠失、置換、付加などの変異あるいは誘発変異を有するポリヌクレオチドであって、 Cdc42の活性ィ匕を促進する蛋白質をコードするポリヌクレオチド。

[6] 請求項 1または 2に記載のポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でノ、イブリダィゼーシヨンするポリヌクレオチドであって、 Cdc42の活性化を促進する蛋白質をコードするポリヌクレオチド。

[7] 請求項 1から 6のいずれか 1項に記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター。

[8] 請求項 7に記載の組換えベクターにより形質転換されてなる形質転換体。

[9] 請求項 7に記載の組換えベクターおよび Cdc42をコードするポリヌクレオチドを含有する組換えベクターにより形質転換されてなる形質転換体。

[10] 配列表の配列番号 2に記載のアミノ酸配列で表わされる蛋白質。

[11] 配列表の配列番号 4または 6に記載のアミノ酸配列で表わされる蛋白質。

[12] 請求項 3から 6のいずれか 1項に記載のポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質。

[13] 請求項 8または 9に記載の形質転換体を培養する工程を含む、請求項 10から 12のいずれか 1項に記載の蛋白質の製造方法。

[14] 請求項 10から 12のいずれ力 1項に記載の蛋白質を認識する抗体。

[15] 請求項 10から 12のいずれ力 1項に記載の蛋白質の機能および Zまたは請求項 1から 6のいずれか 1項に記載のポリヌクレオチドの発現を阻害する化合物の同定方法であって、ある化合物と該蛋白質および Zまたは該ポリヌクレオチドとの相互作用を可能にする条件下で、該機能および Zまたは該発現の存在、不存在または変化を検出することにより、該化合物が該蛋白質の機能および Zまたは該ポリヌクレオチドの発現を阻害する力否かを判定することを特徴とする同定方法。

[16] 蛋白質の機能が、 Cdc42と結合する機能および Zまたは Cdc42の活性ィ匕を促進する機能である請求項 15に記載の同定方法。

[17] 請求項 10から 12のいずれ力 1項に記載の蛋白質の機能および Zまたは請求項 1から 6のいずれか 1項に記載のポリヌクレオチドの発現を阻害する化合物の同定方法であって、請求項 10から 12のいずれ力 1項に記載の蛋白質、請求項 1から 6のいずれ力 1項に記載のポリヌクレオチド、請求項 7に記載の組換えベクター、請求項 8または 9に記載の形質転換体および請求項 14に記載の抗体のうち少なくともいずれか 1つを用いることを特徴とする同定方法。

[18] 蛋白質の機能が、 Cdc42と結合する機能および Zまたは Cdc42の活性ィ匕を促進する機能である請求項 17に記載の同定方法。

[19] ヒト胃組織由来の被検組織がヒト胃腫瘍由来組織であるカゝ否かを判定する方法であつて、該被検組織における請求項 1から 6のいずれか 1項に記載のポリヌクレオチドの発現量を測定することを特徴とする判定方法。

[20] 被検組織における請求項 1から 6のいずれか 1項に記載のポリヌクレオチドの発現量力対照であるヒト正常胃由来組織における該ポリヌクレオチドの発現量の 4. 5倍以上である場合に、被検組織がヒト胃腫瘍由来組織であると判定することを特徴とする、請求項 19に記載の判定方法。

[21] 請求項 10から 12のいずれ力 1項に記載の蛋白質の機能を阻害する化合物および Z または請求項 1から 6のいずれか 1項に記載のポリヌクレオチドの発現を阻害するィ匕合物を有効成分として含んでなる胃腫瘍の防止剤および Zまたは治療剤。

[22] 請求項 10から 12のいずれ力 1項に記載の蛋白質の機能を阻害する化合物および Z または請求項 1から 6のいずれか 1項に記載のポリヌクレオチドの発現を阻害するィ匕合物を用いることを特徴とする胃腫瘍の防止方法および Zまたは治療方法。

[23] 請求項 10から 12のいずれ力 1項に記載の蛋白質、請求項 1から 6のいずれ力 1項に記載のポリヌクレオチド、請求項 7に記載の組換えベクター、請求項 8または 9に記載の形質転換体および請求項 14に記載の抗体のうち少なくともいずれか 1つを含んでなる試薬キット。