KR102200261B1

KR102200261B1 - 여드름 균에 특이적으로 결합하는 어피바디 및 그의 용도

Info

Publication number: KR102200261B1
Application number: KR1020180156037A
Authority: KR
Inventors: 김성현; 박희선
Original assignee: 한국세라믹기술원
Priority date: 2018-12-06
Filing date: 2018-12-06
Publication date: 2021-01-08
Also published as: KR20200068995A

Abstract

본 발명은 여드름 균(Propionibacterium acnes)에 특이적으로 결합하는 어피바디, 상기 어피바디를 포함하는 재조합 벡터, 상기 어피바디를 유효성분으로 포함하는 여드름의 예방 또는 개선용 화장료 조성물, 및 상기 어피바디를 유효성분으로 포함하는 여드름의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다.

Description

여드름 균에 특이적으로 결합하는 어피바디 및 그의 용도{AFFIBODY SPECIFIC TO PROPIONIBACTERIUM ACNES ITS USE}

여드름은 아직 발생 원인이 명확하게 밝혀지지 않았으나, 얼굴, 목, 가슴, 등, 어깨 등에서 피지 분비 증가, 모낭 내 이상 각화, 여드름 유발균인 프로피오니 박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes : P. acnes)의 군락 형성 등, 복합적 원인에 의한 염증 반응에 의해 형성되는 국한성 만성 염증성 피부 질환이다. 여드름은 10대의 경우 85%, 성인의 경우 11%의 피부에서 관찰될 정도로 흔히 발병하는 피부 질환으로 일반적으로 10대 초반에 발생하고 성인이 되면 감소하지만, 성인이 된 후 발생하거나 오히려 그 증상이 심해지는 경우도 있다. 청소년기의 여드름은 남성에게서 더 빈번하게 발생하지만, 성인 여드름의 경우 여성에게서 더 빈번하게 발생하며, 이는 여성 호르몬의 변화 때문으로 여성은 월경 전 착상과 관련 있는 프로게스테론 분비량이 많아지면서 남성호르몬의 분비를 자극하게 되고, 이로 인해 성인 여드름의 증상이 악화되는 경우가 많이 있다. 여드름 유발균 P. acnes는 내기성 혐기성 세균으로서, 대부분의 건강한 성인의 피부에서 발견되었으며, P. acnes는 정상인에게서는 질환을 야기하지 않는 기회감염성 병원균으로, 여드름을 비롯하여 보철 관절 전염, 심내막염, 유육종증, 내안구염, 균혈증 등 다양한 염증 질환과 관련이 있다. P. acnes는 모공 내 혐기적 조건에서 각 종 효소를 분비하여 모낭 속 피지의 지방산(Fatty acid)과 트리글리세리드(Triglyceride)를 짧은 사슬 지방산(Short chain fatty acid)과 프로피온산(Propionic acid)으로 분해하여 양분을 얻으며, P. acnes가 모공 속에서 군락을 형성하면서 주변 세포에 손상을 가하고 피지를 분해하면서 발생되는 각종 부산물들이 모공을 막게 됨으로써 인간의 면역체계에 의해 염증 반응이 야기되면 여드름이 발생하게 된다.

따라서, 여드름을 치료하기 위해 항생제 및 호르몬의 국소 도포(클린다마이신, 에리쓰로마이신 등) 및 경구 투여(레티노이드 계열 등), 외과적 절개, 자외선 치료 등 다양한 방법이 시도되고 있으나, 아직까지 성공적인 치료법은 없으며, 항생제나 호르몬을 장기적으로 사용하면 내성 발생 및 간 독성 유발, 소화성 궤양, 기형아 유발 등의 심각한 부작용을 발생시키기도 하고, 국소 도포제의 경우 피부 자극 및 홍조 발생, 피부염 발생 등의 부작용이 있으며 환부로의 침투가 원활하지 않은 문제점이 있다. 또한, 외과적 절개는 피부 절개에 의한 손상 및 흉터가 남을 수 있다는 문제점이 있고, 자외선 치료의 경우 자외선에 의한 피부 손상 유발 및 특수 장비가 필요하다는 한계점이 있다.

한편, 어피바디(affibody)는 인공 단백질의 일종으로 인공항체의 일종이기도 하다. 황색포도구균(Staphylococcus aureus)의 단백질 A(SPA) 중 IgG 결합 영역인 58 아미노산 잔기를 사용한다. IgG와 결합 면을 형성하는 13 아미노산 잔기 부분을 무작위적인 배열과 치환한 라이브러리(library)를 구축하고, 그중에서 표적물질과 특이적으로 결합하는 것을 선별하는 것으로서 표적물질에 대한 어피바디(affibody)를 취득하게 된다. 어피바디(affibody)는 약 150kDa인 항체와 비교하면 약 6kDa 정도로 분자 크기가 작기 때문에 조직을 깊게 투과하기 쉬운 성질을 갖추고, 또한 열 또는 알칼리 등에 대한 내성도 갖는 등인 이점도 있다. 또한 어피바디는 박테리아를 이용해서 대량 생산하기 때문에 동물세포에서 생산하는 항체에 비해 저렴하게 제작할 수 있다. 그리고, 어피바디는 분자 조영제로서 이용 또는 친화력(affinity) 분리 등에도 이용되고 있다.

[선행문헌]

대한민국 공개특허 1. KR 10-2015-0117647 A

본 발명은 여드름 균(Propionibacterium acnes)에 특이적으로 결합하는 어피바디, 상기 어피바디를 포함하는 재조합 벡터, 상기 어피바디를 유효성분으로 포함하는 여드름의 예방 또는 개선용 화장료 조성물, 및 상기 어피바디를 유효성분으로 포함하는 여드름의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "특이적으로 결합(specifically binding)"은 상기 어피바디가 여드름 균(Propionibacterium acnes) 이외의 단백질에 실질적으로 결합하지 않거나 친화도에서 큰 차이를 보여 여드름 균(Propionibacterium acnes)과 다른 단백질의 구별을 가능하게 하는 것을 의미한다.

제1구현예에 따르면,

본 발명은 하기의 화학식 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 여드름 균(Propionibacterium acnes)에 특이적으로 결합하는 어피바디를 제공하고자 한다.

[화학식 1]

VDNKFNKEX¹X²X³AX⁴X⁵X⁶IX⁷X⁸LPNLNX⁹X¹⁰QX¹¹X¹²AFIX¹³SLX¹⁴DDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPKAA

(상기 화학식 1에서,

X1은 프롤린(P), 글라이신(G) 또는 류신(L)이고,

X2는 류신(L), 페닐알라닌(F), 글루타민(Q) 또는 글라이신(G)이고,

X3은 트레오닌(T), 프롤린(P), 세린(S) 또는 트립토판(W)이고,

X4는 세린(S), 라이신(K), 글라이신(G) 또는 알라닌(A)이고,

X5는 세린(S), 트립토판(W), 아이소류신(I), 류신(L) 또는 발린(V)이고,

X6은 글루탐산(E) 또는 아르기닌(R)이고,

X7은 글루타민(Q), 아이소류신(I), 페닐알라닌(F), 류신(L) 또는 트립토판(W)이고,

X8은 류신(L) 또는 아르기닌(R)이고,

X9는 라이신(K) 메티오닌(M) 또는 글루타민(Q)이고,

X10는 발린(V), 트립토판(W) 도는 아스파르트산(D)이고,

X11은 아르기닌(R), 글루타민(Q), 아스파라긴(N) 또는 라이신(K)이고,

X12는 아스파라긴(N), 히스티딘(H) 또는 글라이신(G)이고,

X13은 라이신(K), 아스파르트산(D) 또는 글라이신(G)이고,

X14는 라이신(K), 아르기닌(R), 아스파라긴(N) 또는 글라이신(G)이다)

본 명세서에서 사용된 용어 “아미노산”은 자연적으로 펩티드로 통합되는 22개의 표준 아미노산들뿐만 아니라 D-아이소머 및 변형된 아미노산들을 포함한다. 또한, 상기 펩티드는 번역 후 변형(post-translational modification)된 비표준 아미노산을 포함할 수 있다. 변역 후 변형은 인산화(phosphorylation), 당화(glycosylation), 아실화(acylation) (예를 들면, 아세틸화(acetylation), 미리스토일화(myristoylation) 및 팔미토일화(palmitoylation)), 알킬화(alkylation), 카르복실화(carboxylation), 히드록실화(hydroxylation), 당화반응(glycation), 비오티닐화(biotinylation), 유비퀴티닐화(ubiquitinylation), 화학적 성질의 변화(예를 들면, 베타-제거 탈이미드화, 탈아미드화) 및 구조적 변화(예를 들면, 이황화물 브릿지의 형성)를 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 펩티드는 자연 그대로의 공급원으로부터 동정 및 분리된 야생형 펩티드일 수 있다. 한편, 상기 펩티드는 하나 이상의 아미노산이 치환, 결실 및/또는 삽입된 아미노산 서열을 포함하는, 인공 변이체일 수도 있다. 인공 변이체뿐만 아니라 야생형 폴리펩티드에서의 아미노산 변화는 단백질의 폴딩(folding) 및/또는 활성에 유의한 영향을 미치지 않는 보존성 아미노산 치환을 포함한다. 예를 들면, 상기 보존성 치환은 염기성 아미노산(아르기닌, 리신 및 히스티딘), 산성 아미노산(글루탐산 및 아스파르트산), 극성 아미노산(글루타민 및 아스파라긴), 소수성 아미노산(루신, 이소로이신, 발린 및 메티오닌), 방향족 아미노산(페닐알라닌, 트립토판 및 티로신) 및 작은 아미노산(글리신, 알라닌, 세린 및 트레오닌)을 포함할 수 있다. 일반적으로 특이적 활성을 변경시키지 않는 아미노산 치환이 본 기술분야에 공지되어 있다. 가장 흔하게 발생하는 교환은 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu 및 Asp/Gly을 포함할 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 "폴리뉴클레오티드"는 뉴클레오티드의 중합체로, 용어 “핵산”과 동등한 의미로 사용될 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드(DNA), 리보뉴클레오티드(RNA), 뉴클레오티드 유사체, 및/또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid: PNA) 분자를 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 어피바디에 있어서, 상기 어피바디는 서열번호 1 내지 5 중 어느 하나로 표시되는 아미노산을 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 어피바디에 있어서, 상기 어피바디는 서열번호 1 내지 5 중 어느 하나로 표시되는 아미노산으로 이루어진 것을 특징으로 한다.

제2구현예에 따르면,

본 발명은 하기의 화학식 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 여드름 균(Propionibacterium acnes)에 특이적으로 결합하는 어피바디를 포함하는 재조합 벡터를 제공하고자 한다.

[화학식 1]

(상기 화학식 1에서,

X1은 프롤린(P), 글라이신(G) 또는 류신(L)이고,

X3은 트레오닌(T), 프롤린(P), 세린(S) 또는 트립토판(W)이고,

X4는 세린(S), 라이신(K), 글라이신(G) 또는 알라닌(A)이고,

X6은 글루탐산(E) 또는 아르기닌(R)이고,

X8은 류신(L) 또는 아르기닌(R)이고,

X9는 라이신(K) 메티오닌(M) 또는 글루타민(Q)이고,

X10는 발린(V), 트립토판(W) 도는 아스파르트산(D)이고,

X12는 아스파라긴(N), 히스티딘(H) 또는 글라이신(G)이고,

X13은 라이신(K), 아스파르트산(D) 또는 글라이신(G)이고,

본 명세서에서 사용된 용어 "벡터"는 적당한 숙주 세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있는 발현 벡터로서, 핵산 삽입물이 발현되도록 작동 가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 핵산 작제물을 의미한다. 상기 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드 (예를 들면: pSC101, ColE1, pBR322, pUC8/9, pHC79, pGEX 시리즈, pET 시리즈, pACYC184 및 pUC19 등), 파지 (예를 들면: λgt4·λB, λ-Charon, λΔz1 및 M13 등) 또는 바이러스 (예를 들면: SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 명세서에서 사용된 용어 "형질전환(transformation)"은 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체의 인자로서 또는 염색체 통합 완성에 의해 복제 가능하게 되는 것으로 외부의 DNA를 세포 내로 도입하여 인위적으로 유전적인 변화를 일으키는 현상을 의미한다. 상기 형질전환 방법은 CaCl2 침전법, CaCl2 방법에 DMSO(dimethyl sulfoxide)라는 환원물질을 사용함으로써 효율을 높인 Hanahan 방법, 전기천공법(electroporation), 인산칼슘 침전법, 원형질융합법, 실리콘 카바이드 섬유를 이용한 교반법, 아그로박테리아-매개 형질전환법, PEG를 이용한 형질전환법, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민 및 건조/억제 매개된 형질전환 방법 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 명세서에서 사용된 용어 "숙주세포"는 다른 미생물 또는 유전자를 기생시켜 영양을 공급하는 세포로, 벡터가 숙주세포에 형질전환됨으로써 숙주세포 내에서 다양한 유전적 또는 분자적 영향을 미치게 되는 세포를 의미한다. 상기 숙주세포는 대장균(E. coli)과 같은 에스케리키아(Escherichia)속 세균; 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 같은 바실러스(Bacillus)속 세균; 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida) 같은 슈도모나스(Pseudomonas)속 세균; 락토바실러스와 엔테로코커스 등 유산균; 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe) 같은 효모; 동물세포 및 곤충 세포를 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 재조합 벡터에 있어서, 상기 어피바디는 서열번호 1 내지 5 중 어느 하나로 표시되는 아미노산을 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 재조합 벡터에 있어서, 상기 어피바디는 서열번호 1 내지 5 중 어느 하나로 표시되는 아미노산으로 이루어진 것을 특징으로 한다.

제3구현예에 따르면,

본 발명은 하기의 화학식 1로 표시되는 여드름 균(Propionibacterium acnes)에 특이적으로 결합하는 어피바디를 유효성분으로 포함하는 여드름 예방 또는 개선용 화장료 조성물을 제공하고자 한다.

[화학식 1]

(상기 화학식 1에서,

X1은 프롤린(P), 글라이신(G) 또는 류신(L)이고,

X3은 트레오닌(T), 프롤린(P), 세린(S) 또는 트립토판(W)이고,

X4는 세린(S), 라이신(K), 글라이신(G) 또는 알라닌(A)이고,

X6은 글루탐산(E) 또는 아르기닌(R)이고,

X8은 류신(L) 또는 아르기닌(R)이고,

X9는 라이신(K) 메티오닌(M) 또는 글루타민(Q)이고,

X10는 발린(V), 트립토판(W) 도는 아스파르트산(D)이고,

X12는 아스파라긴(N), 히스티딘(H) 또는 글라이신(G)이고,

X13은 라이신(K), 아스파르트산(D) 또는 글라이신(G)이고,

본 발명에 따른 화장료 조성물에 있어서, 상기 어피바디는 서열번호 1 내지 5 중 어느 하나로 표시되는 아미노산을 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 화장료 조성물에 있어서, 상기 어피바디는 서열번호 1 내지 5 중 어느 하나로 표시되는 아미노산으로 이루어진 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 화장료 조성물은 상기 어피바디 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들이 포함되며, 예를 들면 황산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함한다.

본 발명에 따른 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들면, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수(스킨), 영양 화장수(밀크로션), 영양 크림, 맛사지 크림, 에센스, 아이크림, 클렌징 크림, 클렌징 포옴, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.

제4구현예에 따르면,

본 발명은 하기의 화학식 1로 표시되는 여드름 균(Propionibacterium acnes)에 특이적으로 결합하는 어피바디를 유효성분으로 포함하는 여드름의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하고자 한다.

[화학식 1]

(상기 화학식 1에서,

X1은 프롤린(P), 글라이신(G) 또는 류신(L)이고,

X3은 트레오닌(T), 프롤린(P), 세린(S) 또는 트립토판(W)이고,

X4는 세린(S), 라이신(K), 글라이신(G) 또는 알라닌(A)이고,

X6은 글루탐산(E) 또는 아르기닌(R)이고,

X8은 류신(L) 또는 아르기닌(R)이고,

X9는 라이신(K) 메티오닌(M) 또는 글루타민(Q)이고,

X10는 발린(V), 트립토판(W) 도는 아스파르트산(D)이고,

X12는 아스파라긴(N), 히스티딘(H) 또는 글라이신(G)이고,

X13은 라이신(K), 아스파르트산(D) 또는 글라이신(G)이고,

본 명세서에서 사용된 용어 “진단”은 특정 질병 또는 질환에 대한 객체의 감수성 (susceptibility)을 판정하는 것, 한 객체가 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는지 여부를 판정하는 것 (예를 들면, 뎅기열 바이러스의 동정), 특정 질병 또는 질환에 걸린 한 객체의 예후 (prognosis)를 판정하는 것, 또는 테라메트릭스 (therametrics) (예를 들면, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 객체의 상태를 모니터링 하는 것)을 포함한다.

본 발명에 따른 약제학적 조성물에 있어서, 상기 어피바디는 서열번호 1 내지 5 중 어느 하나로 표시되는 아미노산을 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 약제학적 조성물에 있어서, 상기 어피바디는 서열번호 1 내지 5 중 어느 하나로 표시되는 아미노산으로 이루어진 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 약제학적 조성물은 임상투여시 비경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다. 비경구적인 투여방법으로는 이에 제한되는 것은 아니나, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장내 투여일 수 있다.

본 발명에 따른 약제학적 조성물은 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 또는 생물학적 반응조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 약제학적 조성물은 또한 본 발명에 따른 어피바디를 유효성분으로 포함하는 외용제의 제형으로 제공될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물을 피부외용제로 사용하는 경우, 추가로 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제 및 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 유화제, 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉쇄제, 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 활성제, 친유성 활성제 또는 지질 소낭 등 피부 외용제에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 피부 과학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다. 또한 상기 성분들은 피부 과학 분야에서 일반적으로 사용되는 양으로 도입될 수 있다. 본 발명에 따른 약제학적 조성물이 피부 외용제로 제공될 경우, 연고, 패취, 겔, 크림 또는 분무제 등의 제형일 수 있다.

본 발명에 따른 어피바디는 여드름 균을 특이적으로 인지하고 결합할 수 있으므로, 이를 원료로 사용하여 장기적으로 사용하여도 내성 및 부작용이 없는 여드름 개선용 화장료 조성물 및 약학적 조성물을 제공할 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은 여드름 균 P.acne 바이오패닝 과정 중 Affibody 라이브러리의 바이오패닝의 4차 단계에서 회수한 60개의 재조합 파아지의 P.acne 및 BSA에 대한 ELISA 결과이다
도 2는 P.acne에 대해 특이성 검사를 하기 위해 P.acne 결합 Affibody 4의 재조합 파아지를 여러 단백질에 대해 ELISA를 수행하여 흡광도를 측정한 결과이다.
도 3은 P.acne에 대해 특이성 검사를 하기 위해 P.acne 결합 Affibody 13의 재조합 파아지를 여러 단백질에 대해 ELISA를 수행하여 흡광도를 측정한 결과이다.
도 4는 P.acne에 대해 특이성 검사를 하기 위해 P.acne 결합 Affibody 17의 재조합 파아지를 여러 단백질에 대해 ELISA를 수행하여 흡광도를 측정한 결과이다.
도 5는 박테리아를 이용해서 발현 후 정제한 Affibody 4이다. SDS-PAGE 상을 보면 크기가 약 7kDa이며 순도가 95% 이상으로 정제되었다.
도 6은 박테리아를 이용해서 발현 후 정제한 Affibody 13이다. SDS-PAGE 상을 보면 크기가 약 7kDa이며 순도가 95% 이상으로 정제되었다.
도 7은 박테리아를 이용해서 발현 후 정제한 Affibody 17이다. SDS-PAGE 상을 보면 크기가 약 7kDa이며 순도가 95% 이상으로 정제되었다.
도 8은 박테리아를 이용해서 발현 후 정제한 Affibody 24이다. SDS-PAGE 상을 보면 크기가 약 7kDa이며 순도가 95% 이상으로 정제되었다.

이하에서는 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 본 발명이 이하의 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 >

실시예 1 : Affibody 라이브러리에서 재조합 파아지 생산

-80℃에 저장된 Affibody 라이브러리에서 재조합 파아지를 생산하였다. 30ml SB 액체배지에 -80℃에 보관된 라이브러리 1ml을 추가하여 20분 동안 37℃에서 200rpm의 속도로 혼합하여 배양하였다. 여기에 Helper phage(9.7x10⁹pfu) 과 암피실린(최종 농도 50μg/ml)을 넣고 다시 한 시간 동안 같은 조건으로 배양하였다. 그리고 암피실린(50μg/ml) 및 카나마이신(10μg/ml)이 포함된 SB 액체배지 30ml에 옮겨 같은 조건으로 16시간 이상 배양하여 재조합 파아지를 생산하였다. 배양액을 4℃에서 5,000rpm의 속도로 10분 동안 원심 분리하여 얻은 상층액에 PEG/NaCl을 5:1 비율로 혼합하고 얼음에 1시간 동안 방치시킨 후, 4℃에서 20분 동안 13,000rpm의 속도로 원심 분리하여 상층액은 조심스럽게 제거하고 1ml의 PBS로 펠렛을 재현탁시켰다.

실시예 2. Affibody -P.acne의 바이오패닝 방법

여드름균 (P.acne)을 혐기적 상태로 하룻밤동안 37℃에서 배양한 후, 흡광도 OD₆₀₀=0.5값을 배지를 섞어 맞추었다. 1분 원심분리 후 상층액은 버리고 PBS 1ml을 넣고 펠렛을 풀어주고 다시 1분 원심분리하여 상층액은 버리고 같은 과정을 1회 더 반복하였다. 상층액은 완전히 다 뽑아서 버리고 2% BSA(1ml)를 넣고 펠렛과 풀어준 후 상온에서 2시간 동안 블록킹하였고, Affibody 재조합 파아지 포함용액 400ul 및 2% BSA 400ul을 혼합하여 2시간 방치하였다. 여드름균과 2% BSA 혼합액은 1분 원심분리로 상층액을 모두 제거하고 0.05% PBST(tween-20)로 (1ml) 풀어준 후, 원심분리로 상층액을 제거하였다. Affibody 재조합 파아지 포함용액과 여드름 균 펠렛과 섞고 30℃에서 1시간 배양히였다. 원심분리로 상층액을 분리하여 버리고 0.05% PBST(tween-20)로 3회 세척한 뒤 0.2M 글리신(pH 2.2)을 800ul씩 넣어 10분간 파아지를 용리시키고 1분 원심분리 후 E-tube에 모아 여기에 1M Tris(pH 9.0) 200ul를 넣어 중화시켰다. 각 바이오패닝마다 인풋 파아지 및 아웃풋 파아지의 수를 측정하기 위해 OD=0.7인 E. coli 세포에 섞어 주어 암피실린이 포함된 아가 배지에 도말하였다. 패닝을 반복하기 위해 P.acne 아웃풋 파아지 500ul를 5ml의 E. coli 세포와 섞어 37℃에서 200rpm의 속도로 30분 동안 혼합하며 배양한 후, 암피실린(50μg/ml) 및 헬퍼 파아지(9.7x10pfu) 첨가하여 같은 방법으로 30분 동안 배양하였다. 그 다음 암피실린(50μg/ml)과 카나마이신(10μg/ml)이 포함된 50ml SB 배지에 옮겨 같은 방법으로 하루 동안 배양하였다. 배양액을 4℃에서 5,000rpm의 속도로 10분동안 원심 분리하여 상층액에 PEG/NaCl [20% PEG(w/v) 및 15% NaCl(w/v)]을 5:1 비율로 첨가한 후 얼음에 1시간 동안 정치시켰다. 4℃에서 13,000rpm의 속도로 20분 동안 원심분리 후 상층액을 완전히 제거하고 1ml의 PBS 용액으로 파아지 펠렛을 현탁한 다음 2차 바이패닝에 사용하였다. 각 패닝 단계마다 상기와 동일한 방법을 사용했으며, 세척과정만 단계별로 각각 5회, 7회 및 9회(0.05% PBST) 증가시켰다. Affibody 라이브러리를 여드름 균 P.acne 단백질에 대해 4차에 걸쳐 바이오 패닝을 실시하고 각패닝 단계에서 회수한 파아지 펩타이드들의 아웃풋 파이지/인풋 파아지의 비율을 결정한 결과를 하기의 표 1에 나타내었다.

	패닝 단계 (조건)	인풋 파아지	아웃풋 파아지	output/input
1	Binding 상온 1hr Washing 3회 (0.05% PBST)	9.2X10⁹	1.11X10⁷	12X10^-4
2	Binding 상온 1hr Washing 5회 (0.05% PBST)	12.8X10¹⁰	3.77X10⁷	2.9X10^-4
3	Binding 상온 1hr Washing 7회 (0.05% PBST)	16.4X10¹⁰	4.33X10⁷	2.6X10^-4
4	Binding 상온 1hr Washing 9회 (0.05% PBST)	14.8X10¹⁰	2.3X10⁷	1.5X10^-4

실시예 3: P.acne 에 특이적인 파아지 검색(colony ELISA)

상기 표 1에서 아웃풋 파아지/인풋 파아지 비율이 가장 높은 바이오패닝 단계에서 회수한 파아지를 E. coli 세포에 감염시킨 후 플라크가 플레이트당 100-200개 정도가 되도록 도말하였다. 멸균된 팁을 이용하여 플라크 50개를 1ml의 SB-암피실린(50 μg/ml) 배양액에 접종한 후 37℃에서 5시간 동안 진탕 배양하여 헬퍼 파아지를 30ul씩 첨가하여 37℃에서 200rpm의 속도로 하루 동안 배양하였다. 배양액을 12,000rpm의 속도로 2분 동안 원심 분리하여 상층액을 회수한 후 2% BSA를 넣고 이를 파아지 검색에 사용하였다. 96웰 ELISA 플레이트에 5μg/ml의 P.acne, BSA(Bovine Serum Albumin)을 각 웰당 50ul씩 60개의 웰에 넣고 4℃에서 하루 동안 방치하였다. 다음날 모든 웰의 단백질을 제거하고 2% BSA를 사용하여 상온에서 2시간 동안 블록킹한 뒤, 용액을 모두 버리고 0.1% PBST로 3회 세척하였다. 각 클론별로 증폭된 파아지 용액 100ul씩을 모든 웰에 분주하고 30℃에서 1시간 동안 정치하였다. 0.1% PBST 용액으로 3회 세척한 다음 HRP-컨쥬게이트 항-M13항체(GE Healthcare)를 1:1,000으로 희석하여 100ul씩 분주하고 30℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 0.1% PBST로 3회 세척한 후 TMB용액 100ul를 분주하여 발색반응을 유도한 다음 100ul의 1M HSO를 첨가하여 반응을 중지시켰다. 450nm에서 흡광도를 측정하여 BSA에 비해 2.5배 이상 흡광도가 높은 클론들을 선택하였다. 이들의 플라스미드를 정제하여 시퀀싱을 의뢰하였다(Bioneer, Daejeon, Korea). 시퀀싱 프라이머는 GATTACGCCAAGCTTTGGAGC를 사용하였다.

실시예 4: 스크리닝해서 찾은 Affibody의 특이성 test

96웰 ELISA 플레이트에 10μg/ml의 P.acne, BSA, Streptavidin, Gelatin, 콜라겐을 각 웰당 50ul씩 well에 넣고 4℃에서 하루 동안 방치하였다. 다음날 모든 웰의 단백질을 제거하고 2% BSA를 사용하여 상온에서 2시간 동안 블록킹한 뒤, 용액을 모두 버리고 0.1% PBST로 3회 세척하였다. 각 클론별로 증폭된 파아지 용액 Affibody1, 2, 4, 5, 6, 11, 12, 13, 14, 16, 17, 21, 24, 26 파아지를 각각 100ul씩을 모든 웰에 분주하고 30℃에서 1시간 동안 정치하였다. 0.1% PBST 용액으로 3회 세척한 다음 HRP-컨쥬게이트 항-M13항체(GE Healthcare)를 1:2,000으로 희석하여 100ul씩 분주하고 30℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 0.1% PBST로 3회 세척한 후 TMB용액 100ul를 분주하여 발색반응을 유도한 다음 100ul의 1M HSO를 첨가하여 반응을 중지시켰다. 450nm에서 흡광도를 측정하여 P. ance에 대한 특이성을 확인하였다 (도 1 내지 4). 시퀀싱을 통해 P. ance 특이적 결합능을 가지는 Affibody 4, 40, 13, 17 및 24의 아미노산 서열을 하기의 표 2에 나타내었다.

P.acne@Affibody4	VDNKFNKEPLTASSEIQLLPNLNKVQRNAFIKSLKDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPKAA
P.acne@Affibody40	VDNKFNKEGFPASWEIIRLPNLNMWQQNAFIKSLRDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPKAA
P.acne@Affibody13	VDNKFNKEGQSAKIRIFLLPNLNQDQNNAFIDSLNDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPKAA
P.acne@Affibody17	VDNKFNKELGSAGLEILLLPNLNKDQKHAFIGSLGDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPKAA
P.acne@Affibody24	VDNKFNKELQWAAVEIWLLPNLNKDQNGAFIGSLNDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPKAA

실시예 5: Affibody의 발현 및 정제

상기 표 2의 P.acne-Affibody 4, 40, 13, 17 및 24의 유전자를 바이오니아에서 합성하여 expression vector pBT7-N-His에 클로닝하였다. 이를 BL21 세포에 형질 전환한 후 암피실린이 포함된 아가 배지에 도말하였다. 한천 평판 배지에서 자란 군락을 암피실린(50μg/ml)이 포함된 5ml의 LB 배지에 접종한 뒤 37℃에서 220rpm의 속도로 혼합하면서 하루 동안 배양한 후, 글리세롤과 1:1 비율로 혼합하여 stock 1ml을 만들어 -80℃ deepfreezer에 보관하였다. 암피실린(50μg/ml)이 포함된 20ml의 LB 배지에 stock 100ul를 접종하여 37℃에서 220rpm의 속도로 혼합하면서 하루 동안 배양한 후, 암피실린(50μg/ml)이 포함된 400ml의 LB 배지에 옮겨 OD=0.7까지 배양하였다. 이후 1mM 이소프로필-β-D-키오갈락토피라노사이드(IPTG)를 넣어주어 37℃에서 220rpm의 속도로 하루 동안 배양하였다. 4℃에서 4000xg로 10분 동안 원심 분리하여 침전된 세포들을 제외한 상층액을 모두 제거하고, 라이시스 버퍼(50mM sodium phosphate(pH 8.0), 300mM NaCl 및 10mM imidazole)로 현탁시켰다. -80℃에 하루 동안 보관한 후 꺼내어 완전히 녹인 후, PMSF(Phenyl methane sulfonyl fluoride) 10mg을 Isopropanol 1ml에 녹인 후 용해된 E. coli에 1ml 넣었다. 소니케이터를 이용하여 E. coli를 용해시킨 후에 4℃에서 13,000rpm의 속도로 1시간 동안 원심 분리했다. 증류수와 라이시스 버퍼로 Ni-NTA 친화성 레진(Elposbio, Daejeon, Korea)을 세척한 후 상층액을 레진에 결합시켰다. Washing buffer(50mM sodium phosphate(pH 8.0), 300mM NaCl 및 20mM imidazole) 600ml로 washing 후 일루션 버퍼(50mM 소sodium phosphate(pH 8.0), 300mM NaCl 및 250mM imidazole)을 이용하여 N-말단 His-tag Affibody 단백질을 용출시켜 획득하였다. 이렇게 획득한 단백질을 Centrifugal Filter(Merck Milipore Ltd, lreland)에 넣고 4℃에서 4,000rpm의 속도로 10min 원심 분리하여 농축 후 PBS를 넣고 같은 방법으로 5회 Buffer change하여 순도 높은 P.acne-Affibody 4, 13, 17, 24 단백질을 얻었다 (도 5 내지 8).

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시태양일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> Korea Institute of Ceramic Engineering and Technology <120> AFFIBODY SPECIFIC TO PROPIONIBACTERIUM ACNES ITS USE <130> DP-2018-0326 <160> 5 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 60 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> P.acne@Affibody4 <400> 1 Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Pro Leu Thr Ala Ser Ser Glu Ile 1 5 10 15 Gln Leu Leu Pro Asn Leu Asn Lys Val Gln Arg Asn Ala Phe Ile Lys 20 25 30 Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Ala Ala 50 55 60 <210> 2 <211> 60 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> P.acne@Affibody40 <400> 2 Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gly Phe Pro Ala Ser Trp Glu Ile 1 5 10 15 Ile Arg Leu Pro Asn Leu Asn Met Trp Gln Gln Asn Ala Phe Ile Lys 20 25 30 Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Ala Ala 50 55 60 <210> 3 <211> 60 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> P.acne@Affibody13 <400> 3 Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gly Gln Ser Ala Lys Ile Arg Ile 1 5 10 15 Phe Leu Leu Pro Asn Leu Asn Gln Asp Gln Asn Asn Ala Phe Ile Asp 20 25 30 Ser Leu Asn Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Ala Ala 50 55 60 <210> 4 <211> 60 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> P.acne@Affibody17 <400> 4 Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Leu Gly Ser Ala Gly Leu Glu Ile 1 5 10 15 Leu Leu Leu Pro Asn Leu Asn Lys Asp Gln Lys His Ala Phe Ile Gly 20 25 30 Ser Leu Gly Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Ala Ala 50 55 60 <210> 5 <211> 60 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> P.acne@Affibody24 <400> 5 Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Leu Gly Ser Ala Gly Leu Glu Ile 1 5 10 15 Leu Leu Leu Pro Asn Leu Asn Lys Asp Gln Lys His Ala Phe Ile Gly 20 25 30 Ser Leu Gly Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Ala Ala 50 55 60

Claims

서열번호 1 내지 5 중 어느 하나로 표시되는 아미노산으로 이루어지는 여드름 균(Propionibacterium acnes)에 특이적으로 결합하는 어피바디.
삭제
삭제
서열번호 1 내지 5 중 어느 하나로 표시되는 아미노산을 코딩하는 폴리뉴클레오티드로 이루어지는 여드름 균(Propionibacterium acnes)에 특이적으로 결합하는 어피바디를 포함하는 재조합 벡터.
삭제
삭제
서열번호 1 내지 5 중 어느 하나로 표시되는 아미노산으로 이루어지는 여드름 균(Propionibacterium acnes)에 특이적으로 결합하는 어피바디를 유효성분으로 포함하는 여드름 예방 또는 개선용 화장료 조성물.
삭제
서열번호 1 내지 5 중 어느 하나로 표시되는 아미노산으로 이루어지는 여드름 균(Propionibacterium acnes)에 특이적으로 결합하는 어피바디를 유효성분으로 포함하는 여드름의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
삭제