KR20150002343A - 생체구조물과 결합하는 신규한 분리된 펩타이드 및 그의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 서열번호 1 또는 2의 아미노산 서열을 포함하는 신규한 분리된 펩타이드, 상기 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터, 상기 발현벡터가 숙주세포에 도입된 형질전환체, 상기 형질전환체를 이용하여 상기 펩타이드를 제조하는 방법, 상기 펩타이드를 포함하는 가교제, 상기 가교제를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 본 발명에서 제공하는 펩타이드는 모발, 피부, 치아 등의 생체구조물에 범용적으로 결합할 수 있어, 다양한 약학조성물, 의약외품 조성물, 화장료 조성물의 유효성분을 위한 가교제로서 사용될 수 있으므로, 보다 기능성이 향상된 약학조성물, 의약외품 조성물 및 화장료 조성물의 제조에 활용될 수 있을 것이다.
Description
본 발명은 생체구조물과 결합하는 신규한 분리된 펩타이드 및 그의 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명은 서열번호 1 또는 2의 아미노산 서열을 포함하는 신규한 분리된 펩타이드, 상기 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터, 상기 발현벡터가 숙주세포에 도입된 형질전환체, 상기 형질전환체를 이용하여 상기 펩타이드를 제조하는 방법, 상기 펩타이드를 포함하는 가교제, 상기 가교제를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
통상적으로, 생체에서 발생하는 다양한 질환을 예방 또는 치료하기 위한 약학 조성물은 상기 질환의 증상, 환자의 상태, 질환이 유발된 조직의 상태 등을 고려하여 다양한 제형으로 제조된다. 현재까지 다양한 제형이 개발되어 유효성분을 효과적으로 질환이 유발된 조직에 투여하고 있음에도 불구하고, 실질적인 유효성분의 이용율은 낮은 수준에 불과하다는 문제점이 있는데, 이는 상기 유효성분이 질환이 유발된 조직에 효과적으로 전달되지 못하기 때문이다. 이러한 문제점을 해결하기 위한 방안으로서, 유효성분의 생체내 잔류율을 향상시키는 방안이 연구되고 있고, 그 결과 서방형 제제와 같은 생체내 잔류성을 향상시킨 제형이 개발되고 있다. 그러나, 이같은 서방형 제제는 생체내에 과량의 유효성분을 투여하고 서서히 방출시키는 방식으로 작용하기 때문에, 투여횟수를 감소시킨다는 편의성의 측면에서는 우수하지만, 방출된 유효성분이 질환이 유발된 조직으로 전달되어 이용율이 향상되는 것은 아니기 때문에, 유효성분의 생체내 잔류율을 향상시킨다는 점에서는 그다지 효과적이라고 할 수 없다.
상기 문제점을 근본적으로 해결하기 위한 방안중의 하나로서, 유효성분 자체를 질환이 유발된 생체구조물의 표면에 결합시켜서 생체내 잔류율을 증가시키는 방안이 모색되었고, 이를 위하여 생체구조물에 대한 결합활성을 나타내는 가교제를 개발하려는 연구가 활발히 진행되었다. 그 결과, 항체 등을 가교제로서 이용하여 유효성분을 질환이 유발된 조직에 결합시키는 연구가 진행되었고, 이에 따라 개발된 일부 제제는 상용화되었다. 그러나, 항체를 가교제로서 사용할 경우에는 특정 조직에 특이적으로 결합하기 때문에 생산비용이 증가하여, 필연적으로 치료제의 가격이 높아진다는 단점이 있었다.
항암제와 같이, 질환이 발병된 조직이 아닌 다른 조직에서 심각한 부작용을 유발시킬 우려가 있는 약학 조성물의 경우에는, 가격이 비싸더라도 질환이 발병된 조직에 특이적으로 결합할 수 있는 항체와 같은 가교제를 사용하여야만 한다. 그러나, 정상조직에서 심각한 부작용을 일으키지 않는 약학 조성물의 경우에는, 질환이 발병된 조직에 특이적으로 결합할 수 있는 항체와 같은 가교제보다는, 범용적으로 질환이 발병된 조직에 결합할 수 있는 가교제를 사용하는 것이 경제성의 측면에서 바람직하므로, 이처럼 범용적으로 사용할 수 있는 가교제를 개발하여야할 필요성이 제기되었으나, 아직까지는 별다른 연구성과가 보고되지 않고 있다.
이러한 배경하에서, 본 발명자들은 범용적으로 생체구조물 또는 질환이 발병된 조직에 결합할 수 있는 가교제를 개발하고자 예의 연구노력한 결과, 서열번호 1 또는 2의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드가 모발, 피부, 치아 등의 생체구조물에 범용적으로 결합할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 신규한 분리된 펩타이드를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 발현벡터가 도입된 형질전환체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 형질전환체를 이용하여 상기 펩타이드를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 펩타이드를 포함하는 가교제를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 가교제를 포함하는 조성물을 제공하는 것이다.
상술한 목적을 달성하기 위한 일 실시양태로서, 본 발명은 서열번호 1 또는 2의 아미노산 서열을 포함하고, 생체구조물 결합활성을 나타내는 신규한 분리된 펩타이드를 제공한다.
서열번호 1: KVWQLQLPQWIN
서열번호 2: KVWTLSNDYIEF
본 발명자들은 생체구조물에 유용성분을 장기간 동안 잔류시키는 방법을 개발하기 위하여 다양한 연구를 수행하던 중, 대부분의 중요 생체구조물은 단백질과 연관된다는 점에 착안하게 되었다. 즉, 생체구조물에 속하는 모발은 표면이 케라틴 단백질을 포함하는 큐티클 층으로 구성되고, 생체구조물에 속하는 피부는 표면이 케라틴 단백질과 지질로 구성되며, 생체구조물에 속하는 치아는 콜라겐과 무기물로 구성되므로, 상기 생체구조물에 포함되는 단백질 또는 기타 구성요소와 효과적으로 결합할 수 있는 단백질 또는 펩티드를 이용하면, 상기 생체구조물에 유용성분을 장기간 동안 잔류시킬 수 있을 것으로 예상하였다. 이처럼 상기 생체구조물과 유용성분의 가교역할을 수행할 수 있는 펩타이드를 개발하고자 파지 디스플레이 방법을 이용하여 모발, 피부, 치아 등의 다양한 생체구조물에 결합할 수 있는 능력을 나타내는 펩타이드를 선별하였다. 상기 선별된 펩타이드는 모발에 대한 결합성이 우수할 뿐만 아니라, 피부표면 및 치아표면에 대한 결합성이 우수함을 확인하였다.
따라서, 본 발명에서 제공하는 서열번호 1 또는 2의 아미노산 서열을 포함하는 신규한 펩타이드는 생체구조물에 작용하는 약학조성물, 의약외품 조성물, 화장료 조성물 등의 조성물에 포함되는 가교제로서 활용될 수 있음을 알 수 있었다.
본 발명에서 제공하는 펩타이드는 상기 서열번호 1 또는 2의 아미노산 서열을 포함하고, 생체구조물에 대하여 결합활성을 나타내는 한, 상기 서열번호 1 또는 2의 아미노산 서열의 N-말단 또는 C-말단에 다양한 아미노산 서열이 부가된 모든 펩타이드를 포함한다.
본 명세서에서 언급된 아미노산은 IUPAC-IUB 명명법에 따라 다음과 같이 약어로 기재하였다.
알라닌: A, 아르기닌: R, 아스파라긴: N,
아스파르트 산: D, 시스테인: C, 글루타민 산: E,
글루타민: Q, 글리신: G, 히스티딘: H,
이소루신: I, 루신: L, 리신: K,
메티오닌: M, 페닐알라닌: F, 프롤린: P,
세린: S, 트레오닌: T, 트립토판: W,
타이로신: Y, 발린: V
본 발명의 용어 "펩타이드(peptide)"란, 아미드 결합 (또는 펩타이드 결합)으로 연결된 아미노산으로 이루어진 폴리머를 의미한다. 상기 펩타이드의 제조방법은 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 유전자 재조합과 단백질 발현 시스템을 이용하여 제조하는 방법, 펩타이드 합성과 같은 화학적 합성을 통하여 시험관 내에서 합성하는 방법, 무세포 단백질 합성법, 자동 펩타이드 합성기를 이용한 방법 등과 같은, 당 분야에 널리 공지된 다양한 방법으로 제조할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 펩타이드는 생체구조물에 대하여 결합활성을 나타내어 상기 생체구조물과 유용성분간의 가교역할을 수행할 수 있는, 서열번호 1 또는 2의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드가 될 수 있다. 또한, 생체구조물에 대하여 결합활성을 나타낼 수 있다면, 상기 서열번호 1 또는 2의 아미노산 서열의 일부 아미노산이 부가, 치환, 결실 등의 방법으로 변이된 변이체도 본 발명에서 제공하는 펩타이드의 범주에 포함될 수 있다. 아울러, 본 발명의 펩타이드는 표적화 서열, 태그 (tag), 표지된 잔기, 반감기 또는 펩타이드의 안정성을 증가시키기 위한 특정 목적으로 고안된 아미노산 서열을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 용어 "생체구조물"이란, 생체를 구조적으로 구성하는 구성성분을 의미한다. 예를 들어, 모발, 피부, 치아 등이 될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 파지 디스플레이 방법을 사용하여 모발에 대한 결합성을 나타내는 펩타이드를 스크리닝하여 서열번호 1 또는 2의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 선별하고(실시예 1), 상기 선별된 펩타이드의 생체구조물에 대한 결합활성을 측정한 결과, 모발(표 1), 피부(표 2) 및 치아(표 3)에 대하여 강력한 결합활성을 나타내고, 서열번호 1의 펩타이드가 서열번호 2의 펩타이드보다도 상대적으로 우수한 결합활성을 나타냄을 확인하였다.
상술한 목적을 달성하기 위한 다른 실시양태로서, 본 발명은 상기 펩타이드를 코딩하는 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드를 구성하는 염기서열은 상기 서열번호 1 또는 2의 아미노산 서열을 코딩할 수 있는 염기서열 또는 상기 서열번호 1 또는 2의 아미노산 서열의 N-말단 또는 C-말단에 부가될 수 있는 다양한 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열이 상기 서열번호 1 또는 2의 아미노산 서열을 코딩할 수 있는 염기서열의 5'-말단 또는 3'-말단에 부가된 형태가 될 수 있고, 바람직하게는 상기 서열번호 1 또는 2의 아미노산 서열을 코딩할 수 있는 서열번호 3 또는 4의 염기서열 또는 상기 서열번호 1 또는 2의 아미노산 서열의 N-말단 또는 C-말단에 부가될 수 있는 다양한 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열이 상기 서열번호 3 또는 4의 염기서열의 5'-말단 또는 3'-말단에 부가된 형태가 될 수 있다.
서열번호 3: 5'-AAGGTTTGGCAGCTGCAGCTGCCGCAGTGGATTAAT-3'
서열번호 4: 5'-TAAGGTGTGGACGCTGTCGAATGATTATATTGAGTTT-3'
또한, 상기 생체구조물에 대하여 결합활성을 나타낼 수 있는 펩타이드를 코딩할 수 있는 한, 상기 염기서열과 상동성을 나타내는 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 역시 본 발명에서 제공하는 폴리뉴클레오티드의 범주에 포함될 수 있는데, 바람직하게는 80% 이상의 상동성을 나타내는 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 될 수 있고, 보다 바람직하게는 90% 이상의 상동성을 나타내는 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 될 수 있으며, 가장 바람직하게는 95% 이상의 상동성을 나타내는 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 될 수 있다.
상기 폴리뉴클레오티드는 라이브러리로부터 파지 디스플레이 기술을 이용하여 수득할 수 있다. 파지 디스플레이 기술은 랜덤 폴리뉴클레오티드를 파지(phage) 표면에 발현시키는 기술인데, 1) 파지의 외피 단백질(coat protein) pⅢ N-말단에 해당하는 유전자 부위에 무작위 서열의 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide) 또는 유전자 라이브러리를 삽입하는 단계; 2) 천연형의 외피 단백질 일부와 상기 무작위 서열의 올리고뉴클레오티드 또는 유전자 라이브러리에 의해 코딩되는 폴리펩티드의 융합 단백질을 발현시키는 단계; 3) 상기 올리고뉴클레오티드 또는 유전자 라이브러리에 의해 코딩된 폴리펩티드와 결합할 수 있는 수용체 물질을 처리하는 단계; 4) 수용체에 결합된 파아지 입자들을 낮은 pH나 결합 경쟁력 있는 분자를 이용하여 용출시키는 단계; 5) 패닝(panning)에 의하여 용출된 파아지를 숙주 세포 내에서 증폭시키는 단계; 6) 원하는 양을 얻기 위해 상기 방법을 반복하는 단계; 및 7) 패닝에 의해 선별된 파지 클론들의 DNA 서열로부터 활성이 있는 펩티드 또는 단백질의 아미노산 서열을 결정하는 단계로 구성될 수 있다.
또한, 공지된 폴리뉴클레오티드 합성방법을 이용하여, 본 발명의 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 수득할 수도 있다.
상술한 목적을 달성하기 위한 또 다른 실시양태로서, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 제공한다.
본 발명의 용어 "발현벡터"란, 적절한 숙주세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있도록 유전자 삽입물을 포함하고, 상기 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 발현벡터는 상기 폴레뉴클레오티드를 발현시켜서 상기 펩타이드를 생산할 수 있는 한 특별히 제한되지 않는데, 포유류 세포(예를 들어, 사람, 원숭이, 토끼, 래트, 햄스터, 마우스 세포 등), 식물 세포, 효모 세포, 곤충 세포 또는 박테리아 세포(예를 들어, 대장균 등)를 포함하는 진핵 또는 원핵세포에서 상기 폴리뉴클레오티드를 복제 및/또는 발현할 수 있는 벡터가 될 수 있고, 바람직하게는 숙주세포에서 상기 폴리뉴클레오티드가 발현될 수 있도록 적절한 프로모터에 작동가능하도록 연결되며, 적어도 하나의 선별마커를 포함하는 벡터가 될 수 있으며, 보다 바람직하게는 대장균 유래 플라스미드(pYG601BR322, pBR325, pUC118 및 pUC119), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)-유래 플라스미드(pUB110 및 pTP5), 효모-유래 플라스미드(YEp13, YEp24 및 YCp50), λ-파아지(Charon4A, Charon21A, EMBL3, EMBL4, λgt10, λgt11 및 λZAP), 레트로바이러스(retrovirus), 아데노바이러스(adenovirus), 백시니아 바이러스(vaccinia virus), 배큘로바이러스(baculovirus) 등이 될 수 있다.
상술한 목적을 달성하기 위한 또 다른 실시양태로서, 본 발명은 상기 발현벡터가 숙주세포에 도입된 형질전환체를 제공한다.
본 발명에서 제공하는 상기 발현벡터가 도입될 수 있는 숙주세포는 상기 폴레뉴클레오티드를 발현시켜서 상기 펩타이드를 생산할 수 있는 한 특별히 제한되지 않는데, 바람직하게는 대장균, 스트렙토미세스, 살모넬라 티피뮤리움 등의 박테리아 세포; 효모 세포; 피치아 파스토리스 등의 균류 세포; 드로조필라, 스포도프테라 Sf9 세포 등의 곤충 세포; CHO, COS, NSO, 293, 보우 멜라노마 세포 등의 동물 세포; 또는 식물 세포가 될 수 있고, 보다 바람직하게는 포유류 동물 세포가 될 수 있다.
상술한 목적을 달성하기 위한 또 다른 실시양태로서, 본 발명은 상기 형질전환체를 이용하여 상기 펩타이드를 제조하는 방법을 제공한다.
구체적으로, 본 발명의 펩타이드를 제조하는 방법은 (a) 서열번호 1 또는 2의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 수득하는 단계; (b) 상기 수득한 폴리뉴클레오티드를 클로닝하여 발현벡터를 수득하는 단계; (c) 상기 수득한 발현벡터를 숙주세포에 도입하여 형질전환체를 수득하는 단계; 및, (d) 상기 형질전환체를 배양하고, 이로부터 상기 서열번호 1 또는 2의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 회수하는 단계를 포함한다.
상술한 목적을 달성하기 위한 또 다른 실시양태로서, 본 발명은 상기 펩타이드를 포함하는 가교제를 제공한다.
본 발명에서 제공하는 펩타이드는 모발, 피부, 치아 등의 생체구조물에 대하여 강력한 결합활성을 나타낼 뿐만 아니라, 다양한 유용성분을 상기 생체구조물에 결합시키는 가교역할을 수행할 수 있으므로, 본 발명에서 제공하는 펩타이드는 약학 조성물, 의약외품 조성물, 화장료 조성물과 같은 다양한 조성물의 유효성분에 연결되어 생체구조물에 대한 결합을 제공함으로써 유효성분의 활용성을 향상시키는 가교제로서 사용될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, GFP 단백질의 N-말단에 상기 서열번호 1 또는 2의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 결합시킨, 각각의 GFP-융합펩타이드를 제조하고(실시예 3-1 내지 3-3), 이들 GFP-융합펩타이드의 생체구조물에 대한 결합활성을 측정한 결과, 모발(표 4), 피부(표 5) 및 치아(표 6)에 대하여 강력한 결합활성을 나타내고, 서열번호 1의 펩타이드를 포함하는 GFP-융합펩타이드가 서열번호 2의 펩타이드를 포함하는 GFP-융합펩타이드보다도 상대적으로 우수한 결합활성을 나타냄을 확인하였다.
따라서, 본 발명에서 제공하는 서열번호 1 또는 2의 펩타이드는 범용적으로 유용물질을 생체구조물에 결합시킬 수 있는 가교제로서의 활성을 나타냄을 알 수 있었다.
본 발명에서 제공하는 펩타이드는 피부, 치아 등의 생체구조물에 대한 결합성을 범용적으로 나타낼 뿐, 특정 생체구조물에 대한 특이적인 결합활성을 나타내지는 않으므로, 소화기 또는 순환기를 이용하여 표적에 전달되는 약학조성물 보다는 표적에 직접적으로 가하는 약학조성물의 유효성분을 위한 가교제로서 활용함이 바람직하다. 예를 들어, 액제, 연고제, 로션제, 스프레이제, 패취제, 크림제, 산제, 현탁제, 겔제, 에어로졸 등의 피부외용제 또는 피부주사제의 유효성분을 위한 가교제로서 본 발명의 펩타이드를 사용할 수 있다.
아울러, 본 발명의 펩타이드는 구강제제에 포함되는 가교제로서 사용될 수 있다. 구강질환을 치료하기 위하여 구강의 환부에 상기 질환을 치료하기 위한 구강제제를 도포할 경우에는, 구강에서 지속적으로 분비되는 타액으로 인하여 상기 도포된 구강제제가 희석되거나 제거될 수 있다. 본 발명에서 제공하는 펩타이드를 가교제로서 포함하는 구강제제는 그의 유효성분을 구강의 환부에 강력하게 결합시켜서 타액으로 인한 희석 또는 제거를 방지할 수 있다.
본 발명에서 제공하는 펩타이드는 모발, 피부, 치아 등의 생체구조물에 대하여 강력한 결합활성을 나타낼 뿐만 아니라, 다양한 유용성분을 상기 생체구조물에 결합시키는 가교역할을 수행할 수 있으므로, 본 발명에서 제공하는 펩타이드는 의약외품 조성물에 첨가되는 가교제로서 사용될 수 있다.
본 발명의 용어 "의약외품 조성물"이란, 의약외품이라고도 약칭하며, 약사법에서 규정하는 "사람이나 동물의 질병을 치료·경감·처치 또는 예방할 목적으로 사용되는 섬유·고무제품 또는 이와 유사한 것", "인체에 대한 작용이 약하거나 인체에 직접 작용하지 아니하며, 기구 또는 기계가 아닌 것과 이와 유사한 것", 또는 "감염병 예방을 위하여 살균·살충 및 이와 유사한 용도로 사용되는 제제"를 의미한다.
본 발명에 있어서, 본 발명의 펩타이드는 피부, 치아, 모발 등에 범용적으로 결합할 수 있으므로, 상기 펩타이드는 피부, 치아, 모발 등에 사용될 수 있는 의약외품 조성물의 유효성분을 위한 가교제로서 사용될 수 있다. 이때, 상기 피부, 치아, 모발 등에 사용될 수 있는 의약외품 조성물은 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 핸드워시, 가그린, 소독청결제, 샤워폼, 물티슈, 세제비누, 구중청량제, 치약제, 염모제, 제모제 등이 될 수 있다.
본 발명에서 제공하는 펩타이드는 화장료 조성물이 도포될 수 있는 피부 등의 부위에 범용적인 결합활성을 나타낼 뿐만 아니라, 다양한 성분을 피부에 결합시키는 가교역할을 수행할 수 있으므로, 본 발명에서 제공하는 펩타이드는 화장료 조성물의 유효성분을 위한 가교제로서 사용될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 펩타이드가 가교제로서 포함될 수 있는 화장료 조성물은 특별히 이에 제한되지 않으나, 크림, 에센스, 화장수, 팩, 영양크림, 마사지 크림, 클렌징 크림, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 클렌징 오일, 유액, 비누, 액체세정제, 입욕제, 선스크린 크림, 선 오일, 파운데이션, 메이크업 베이스, 립스틱, 아이새도, 아이라이너, 마스카라, 아이브로우 펜슬, 샴푸, 린스, 헤어 트리트먼트, 헤어 무쓰, 헤어 리퀴드, 포마드, 헤어 칼라제, 헤어 블릿치제, 칼라 린스, 헤어 토닉, 스칼프 트리트먼트 등이 될 수 있다.
상술한 목적을 달성하기 위한 또 다른 실시양태로서, 본 발명은 상기 펩타이드를 유효성분을 위한 가교제로서 포함하는 조성물을 제공한다. 이때, 상기 조성물은 약학 조성물, 의약외품 조성물 또는 화장료 조성물이 될 수 있다.
본 발명의 펩타이드는 그의 결합활성으로 인하여, 피부외용제, 피부주사제, 구강제제 등의 약학 조성물의 유효성분을 위한 가교제로서 사용할 수 있으므로, 상기 펩타이드를 가교제로서 포함하는 피부외용제제, 피부주사제제, 구강제제 등의 약학 조성물은 본 발명의 범주에 포함될 수 있다. 이때, 피부외용제제는 외용제 또는 좌제의 형태로 제형화 될 수 있고, 피부주사제제는 멸균 주사용액의 형태로 제형화 될 수 있으며, 구강제제는 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형의 형태로 제형화 될 수 있다. 또한, 상기 약학적 조성물은, 그의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 상기 담체, 부형제 또는 희석제로는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제, 윤활제, 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등을 사용할 수 있는데, 구체적으로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 칼슘카보네이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 광물유, 젤라틴, 리퀴드 파라핀, 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일, 에틸올레이트, 위텝솔, 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등을 사용할 수 있다.
본 발명의 펩타이드는 그의 결합활성으로 인하여, 피부, 치아, 모발 등에 사용될 수 있는 의약외품 조성물의 유효성분을 위한 가교제로서 사용될 수 있으므로, 상기 펩타이드를 가교제로서 포함하고 피부, 치아, 모발 등에 사용될 수 있는 의약외품 조성물 역시 본 발명의 범주에 포함될 수 있다.
본 발명의 펩타이드는 그의 결합활성으로 인하여, 피부에 사용될 수 있는 화장료 조성물의 유효성분을 위한 가교제로서 사용될 수 있으므로, 상기 펩타이드를 가교제로서 포함하는 화장료 조성물 역시 본 발명의 범주에 포함될 수 있다. 이때, 상기 화장료 조성물은 본 발명의 펩타이드 이외에 그 용도에 따라 통상적으로 사용되는 첨가제를 포함할 수 있는데, 상기 첨가제는 특별히 이에 제한되지 않으나, 향료, 색소, 살균제, 산화방지제, 방부제, 보습제, 점증제, 무기염류, 합성 고분자 물질, 유분, 물, 계면활성제, 알코올, 킬레이트제 등을 단독으로 또는 혼합하여 사용할 수 있다.
한편, 상기 약학 조성물, 의약외품 조성물 또는 화장료 조성물에 포함되는 본 발명의 펩타이드의 함량은 이들의 용도 및 제형에 따라 당업자가 용이하게 선택할 수 있다.
본 발명에서 제공하는 펩타이드는 모발, 피부, 치아 등의 생체구조물에 범용적으로 결합할 수 있어, 다양한 약학조성물, 의약외품 조성물, 화장료 조성물의 유효성분을 위한 가교제로서 사용될 수 있으므로, 보다 기능성이 향상된 약학조성물, 의약외품 조성물 및 화장료 조성물의 제조에 활용될 수 있을 것이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
1: 생체구조물에 결합하는
펩타이드의
선별
생체구조물에 결합하는 펩타이드를 선별하기 위하여 생체구조물의 일종인 모발을 대상으로 파지 디스플레이(Phage display) 방법을 수행하였다.
구체적으로, 건강한 성인의 모발 50mg을 잘게 잘라서 반응완충액(50mM Tris pH 7.5, 150mM NaCl, 1% BSA)에 침지하고, 랜덤 폴리뉴클레오티드 라이브러리가 도입되어 표면에 다양한 폴리펩타이드가 발현된 파지를 일정량 가하여 반응시켰다. 반응이 종료된 후, 상기 모발을 세척하고, 0.2N HCl 용액을 가하여 파지를 용출하였으며, 상기 용출된 파지를 증폭시켰다. 그런 다음, 상기 증폭된 파지를 모발에 가하고, 모발을 세척하였으며, 모발에서 파지를 용출하는 과정을 2회 추가로 수행하였다.
이때, 랜덤 폴리뉴클레오티드 라이브러리는 Ph.D -12 phage library kit(New England Biolab)를 사용하고, 모발에는 109개의 파지를 가하였다. 또한, 파지의 증폭은 상기 추출된 파지를 E.coli ER2738 (New England Biolab)에 접종하여 수행하였는데, 구체적인 방법은 다음과 같다: 25ml의 LB배지에 진탕 배양된 ER2738를 접종하고 O.D.(550nm) 0.5에서 결합한 파지를 elution한 용액을 모두 처리하고 4시간 배양하였다. 이후 8,000g로 원심 분리하여 대장균과 파지를 분리하였다. 파지가 있는 상층액에 6ml의 침전액(20% PEG6000, 2.5M NaCl)을 처리하여 파지를 침전시켰다. 8000G로 원심 분리후 침전된 파지에 TBS용액을 처리하여 파지를 분리 후 보관하였다.
최종적으로, 모발 결합성 파지가 가지는 펩타이드를 확인하기 위해서 파지를 단일 콜로니에서 증폭하였다. 파지를 가지는 대장균 ER2738은 LB/X-gal/IPTG plate에서 파란색을 띄는 성질을 이용하였다. ER2738 배양액에 300ul에 파지를 TBS 로 적정량 희석하고 2ul를 처리한 뒤, 이를 TOP agar 4ml에 섞은 후 LB/X-gal/IPTG plate 상단에 처리하고 16시간 추가 배양한 뒤 청색 콜로니를 선별하였다. 각각의 콜로니를 5ml 의 ER2738 배양액에 6시간 추가 배양한뒤 M13 phage spin kit (Qiagen)을 이용하여 DNA를 분리 후 염기서열을 분석하였다. 이를 통해 서열번호 1 또는 2의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 선별하였다.
서열번호 1: KVWQLQLPQWIN
서열번호 2: KVWTLSNDYIEF
실시예
2: 생체구조물에 대한
펩타이드의
결합활성
상기 실시예 1에서 선별된 각 펩타이드가 다양한 생체구조물에 대하여 결합활성을 나타낼 수 있는지를 확인하고자, 모발, 피부 및 치아에 대한 상기 펩타이드의 결합활성을 분석하였다.
실시예
2-1: 모발 결합활성
상기 실시예 1에서 선별된 각 펩타이드를 화학적으로 합성하고, 대조군으로는 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 사용하였다. 이때, 합성된 각 펩타이드의 C-말단에 Dansyl 기를 추가하였다.
서열번호 5: TDMNKTEIRFVR
한편, 건강한 성인의 모발 50mg을 잘게 잘라서 반응완충액에 침지하고, 상기 합성된 각각의 펩타이드를 가한 다음, 결합시켰다. 이어, 상기 모발을 3회 세척하고, 0.2N HCl 용액으로 모발에서 펩타이드를 용출한뒤 중화하였다. 모발에 결합한 펩타이드들의 양을 victor fluorescence meter(340/520)로 측정하여, 모발에 대한 펩타이드의 결합활성을 분석하였다(표 1).
| 시료 | 형광세기(340/520) |
| 대조군 서열번호 1 서열번호 2 |
140 8200 4000 |
상기 표 1에서 보듯이, 대조군의 펩타이드는 모발에 거의 결합되지 않았으나, 서열번호 1 또는 2의 펩타이드는 모발에 다량으로 결합하였고, 특히 서열번호 1의 펩타이드는 가장 많은 양으로 모발에 결합함을 알 수 있었다.
실시예
2-2: 피부 결합활성
모발 대신에 돼지피부를 사용하는 것을 제외하고는, 상기 실시예 2-1과 동일한 방법을 수행하여, 피부에 대한 펩타이드의 결합활성을 분석하였다(표 2).
| 시료 | 형광세기(340/520) |
| 대조군 서열번호 1 서열번호 2 |
1500 72000 54000 |
상기 표 2에서 보듯이, 대조군의 펩타이드는 피부에 거의 결합되지 않았으나, 서열번호 1 또는 2의 펩타이드는 피부에 다량으로 결합하였고, 특히 서열번호 1의 펩타이드는 가장 많은 양으로 피부에 결합함을 알 수 있었다.
실시예
2-3: 치아 결합활성
모발 대신에 치아구조의 핵심이 되는 Hydroxy apartite(HAP) 분말을 사용하는 것을 제외하고는, 상기 실시예 2-1과 동일한 방법을 수행하여, 치아에 대한 펩타이드의 결합활성을 분석하였다(표 3).
| 시료 | 형광세기(340/520) |
| 대조군 서열번호 1 서열번호 2 |
1500 82000 40000 |
상기 표 3에서 보듯이, 대조군의 펩타이드는 HAP에 거의 결합되지 않았으나, 서열번호 1 또는 2의 펩타이드는 HAP에 다량으로 결합하였고, 특히 서열번호 1의 펩타이드는 가장 많은 양으로 HAP에 결합함을 알 수 있었다.
상기 실시예 2-1 내지 2-3에서 보듯이, 대조군의 펩타이드는 모발, 피부 및 치아에 거의 결합되지 않았으나, 본 발명에서 제공하는 서열번호 1 또는 2의 펩타이드는 모발, 피부 및 치아에 다량으로 결합하였고, 특히 서열번호 1의 펩타이드는 가장 많은 양으로 모발, 피부 및 치아에 결합함을 알 수 있었다.
따라서, 본 발명에서 제공하는 서열번호 1 또는 2의 펩타이드는 범용적으로 생체구조물에 대한 결합활성을 나타냄을 알 수 있었다.
실시예
3: 생체구조물에 대한
펩타이드의
가교제로서의
활성
상기 실시예 1에서 선별된 각 펩타이드가 다양한 생체구조물에 유용성분을 결합시킬 수 있는 가교제로서의 활성을 나타낼 수 있는지를 확인하고자, 모발, 피부 및 치아에 대한 상기 펩타이드의 가교제로서의 활성을 분석하였다.
실시예
3-1: 모발에 대한
가교제로서의
활성
GFP 단백질의 N-말단에 상기 실시예 1에서 선별된 각 펩타이드와 대조군으로서 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드가 각각 결합되고, C-말단에는 histag가 결합된 각각의 GFP-융합펩타이드를 제조하였다.
한편, 건강한 성인의 모발 50mg을 잘게 잘라서 반응완충액에 침지하고, 상기 제조된 각각의 GFP-융합펩타이드를 가한 다음, 결합시켰다. 이어, 상기 모발을 3회 세척하고, anti-His antibody HRP(Horseradish peroxidase) conjugatge를 가하여 5분 동안 반응시킨 다음, 12000 RPM에서 1분간 10회 세척하고, 잔류하는 완충액을 제거하였다. 그런 다음, TMB(Tetramethyl benzidine) solution(Amersham)을 첨가하여 반응시키고, 0.2N 황산을 가하여 반응을 종료시킨 다음, 흡광도(450nm)를 측정하고, 각각의 측정된 흡광도에서 대조군의 흡광도를 뺀 값을 비교함으로써, GFP-융합펩타이드의 모발에 대한 결합활성을 분석하였다(표 4).
| 시료 | 형광세기(450) |
| 대조군 서열번호 1 서열번호 2 |
0.015 0.982 0.753 |
상기 표 4에서 보듯이, 대조군의 GFP-융합펩타이드는 모발에 거의 결합되지 않았으나, 서열번호 1 또는 2의 펩타이드를 포함하는 GFP-융합펩타이드는 모발에 다량으로 결합하였고, 특히 서열번호 1의 펩타이드를 포함하는 GFP-융합펩타이드는 가장 많은 양으로 모발에 결합함을 알 수 있었다.
실시예
3-2: 피부에 대한
가교제로서의
활성
모발 대신에 돼지피부를 사용하는 것을 제외하고는, 상기 실시예 3-1과 동일한 방법을 수행하여, 피부에 대한 GFP-융합펩타이드의 결합활성을 분석하였다(표 5).
| 시료 | 형광세기(450) |
| 대조군 서열번호 1 서열번호 2 |
0.012 1.082 0.853 |
상기 표 5에서 보듯이, 대조군의 GFP-융합펩타이드는 피부에 거의 결합되지 않았으나, 서열번호 1 또는 2의 펩타이드를 포함하는 GFP-융합펩타이드는 피부에 다량으로 결합하였고, 특히 서열번호 1의 펩타이드를 포함하는 GFP-융합펩타이드는 가장 많은 양으로 피부에 결합함을 알 수 있었다.
실시예
3-3: 치아에 대한
가교제로서의
활성
모발 대신에 치아구조의 핵심이 되는 HAP 분말을 사용하는 것을 제외하고는, 상기 실시예 3-1과 동일한 방법을 수행하여, 치아에 대한 GFP-융합펩타이드의 결합활성을 분석하였다(표 6).
| 시료 | 형광세기(450) |
| 대조군 서열번호 1 서열번호 2 |
0.011 1.282 0.743 |
상기 표 6에서 보듯이, 대조군의 GFP-융합펩타이드는 HAP에 거의 결합되지 않았으나, 서열번호 1 또는 2의 펩타이드를 포함하는 GFP-융합펩타이드는 HAP에 다량으로 결합하였고, 특히 서열번호 1의 펩타이드를 포함하는 GFP-융합펩타이드는 가장 많은 양으로 HAP에 결합함을 알 수 있었다.
상기 실시예 3-1 내지 3-3에서 보듯이, 대조군의 펩타이드를 포함하는 GFP-융합펩타이드는 모발, 피부 및 치아에 거의 결합되지 않았으나, 본 발명에서 제공하는 서열번호 1 또는 2의 펩타이드를 포함하는 GFP-융합펩타이드는 모발, 피부 및 치아에 다량으로 결합하였고, 특히 서열번호 1의 펩타이드를 포함하는 GFP-융합펩타이드는 가장 많은 양으로 모발, 피부 및 치아에 결합함을 알 수 있었다.
따라서, 본 발명에서 제공하는 서열번호 1 또는 2의 펩타이드는 범용적으로 유용물질을 생체구조물에 결합시킬 수 있는 가교제로서의 활성을 나타냄을 알 수 있었다.
<110> LG HOUSEHOLD & HEALTH CARE LTD.
<120> Novel isolated peptide for binding to somatic structure and uses
thereof
<130> PA130524/KR
<160> 5
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> peptide
<400> 1
Lys Val Trp Gln Leu Gln Leu Pro Gln Trp Ile Asn
1 5 10
<210> 2
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> peptide
<400> 2
Lys Val Trp Thr Leu Ser Asn Asp Tyr Ile Glu Phe
1 5 10
<210> 3
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> coding sequence
<400> 3
aaggtttggc agctgcagct gccgcagtgg attaat 36
<210> 4
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> coding sequence
<400> 4
taaggtgtgg acgctgtcga atgattatat tgagttt 37
<210> 5
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> peptide
<400> 5
Thr Asp Met Asn Lys Thr Glu Ile Arg Phe Val Arg
1 5 10
Claims (11)
- 서열번호 1 또는 2의 아미노산 서열을 포함하고, 생체구조물 결합활성을 나타내는 신규한 분리된 펩타이드.
- 제1항에 있어서,
상기 생체구조물은 모발, 피부 또는 치아인 것인 펩타이드.
- 제1항 또는 제2항의 펩타이드를 코딩하는 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
- 제3항에 있어서,
서열번호 3 또는 4의 염기서열을 포함하는 것인 폴리뉴클레오티드.
- 제3항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터.
- 제5항의 발현벡터가 숙주세포에 도입된 형질전환체.
- (a) 서열번호 1 또는 2의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 수득하는 단계;
(b) 상기 수득한 폴리뉴클레오티드를 클로닝하여 발현벡터를 수득하는 단계;
(c) 상기 수득한 발현벡터를 숙주세포에 도입하여 형질전환체를 수득하는 단계; 및,
(d) 상기 형질전환체를 배양하고, 이로부터 목적하는 펩타이드를 회수하는 단계를 포함하는, 서열번호 1 또는 2의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드의 제조방법.
- 제7항에 있어서,
상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 3 또는 4의 염기서열을 포함하는 것인 방법.
- 제1항 또는 제2항의 펩타이드를 포함하는 가교제.
- 제9항의 가교제를 포함하는 조성물.
- 제10항에 있어서,
약학 조성물, 의약외품 조성물 및 화장료 조성물로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
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| KR20130076056A KR101494534B1 (ko) | 2013-06-28 | 2013-06-28 | 생체구조물과 결합하는 신규한 분리된 펩타이드 및 그의 용도 |
Applications Claiming Priority (1)
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| KR20130076056A KR101494534B1 (ko) | 2013-06-28 | 2013-06-28 | 생체구조물과 결합하는 신규한 분리된 펩타이드 및 그의 용도 |
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Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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| KR20130076056A KR101494534B1 (ko) | 2013-06-28 | 2013-06-28 | 생체구조물과 결합하는 신규한 분리된 펩타이드 및 그의 용도 |
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|---|---|---|---|---|
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| KR102006862B1 (ko) * | 2019-01-07 | 2019-08-02 | 주식회사 하이센스바이오 | 신규한 펩타이드 |
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| US20060199206A1 (en) * | 2005-03-01 | 2006-09-07 | Hong Wang | Method for identifying skin care composition-resistant skin-binding peptides |
| US20070196305A1 (en) * | 2005-03-01 | 2007-08-23 | Hong Wang | Method for identifying hair conditioner-resistant hair-binding peptides and hair benefit agents therefrom |
| US8287845B2 (en) * | 2008-12-18 | 2012-10-16 | E I Du Pont De Nemours And Company | Hair-binding peptides |
-
2013
- 2013-06-28 KR KR20130076056A patent/KR101494534B1/ko active IP Right Grant
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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