JPS6156196A - モノクロ−ナル抗体 - Google Patents

モノクロ−ナル抗体

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JPS6156196A
JPS6156196A JP14735584A JP14735584A JPS6156196A JP S6156196 A JPS6156196 A JP S6156196A JP 14735584 A JP14735584 A JP 14735584A JP 14735584 A JP14735584 A JP 14735584A JP S6156196 A JPS6156196 A JP S6156196A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
antibody
hepatitis
cell
chimpanzee
cloned
Prior art date
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Pending
Application number
JP14735584A
Other languages
English (en)
Inventor
Isao Ono
小野 魁
Toshio Shikata
志方 俊夫
Yoko Shimizu
洋子 清水
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Fujirebio Inc
Mitsubishi Kasei Corp
Original Assignee
Fujirebio Inc
Mitsubishi Kasei Corp
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Filing date
Publication date
Application filed by Fujirebio Inc, Mitsubishi Kasei Corp filed Critical Fujirebio Inc
Priority to JP14735584A priority Critical patent/JPS6156196A/ja
Publication of JPS6156196A publication Critical patent/JPS6156196A/ja
Pending legal-status Critical Current

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Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K16/00Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans

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  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ム (産業上の利用分野) 本発明は、非A非B型肝炎抗原に特異的なモノクローナ
ル抗体に関する。
(従来の技術) ウィルス性肝炎のうち、A型およびB型肝炎については
、そのウィルスの実体が見出され、免疫学的方法による
診断も可能となっている。
しかしながら、A型でもなくB型で本なく、非A非B型
といわれる肝炎は輸血後肝炎のy。
−以上を占めるとされているが、その原因ウィルスが同
定されておらず、ヒトの非A非B型肝炎がチンパンジー
へ感染可能であることが確認されているにすぎない。
一方、非A非B型肝炎に関連した抗原抗体系の検索も、
多くの研究者によって患者の血清を中心にされているが
、未だ明確な系は見出されてはおらず、さらに、たとえ
ばモノクローナル抗体については、期待されているヒト
及びチンパンジー型のものは得られていない(たとえば
、医学のあゆみ第1/r巻第2号、第Fry〜ゲタV頁
、昭和!を年)。
(発明の目的) そこで、本発明者らは、上記非A非B型肝炎に関連した
モノクローナル抗体を見出すべく、非A非B型肝炎回復
期のチンパンジーおよびヒト末梢血リンパ球のトランス
フォーメーションを中心に種々検討を重ねた結果、本発
明に到達した。
すなわち、本発明の要旨は、非A非B型肝炎発症の肝細
胞内に出現する抗原に特異的に反応するヒト及びチンパ
ンジー型モノクローナル抗体にある。
(問題点を解決するための手段) 以下、本発明の詳細な説明する。
壕ず、本発明に係る抗体を産生ずる細胞株は、次のよう
な方法により得られる。
オームすることによシ、非A非B型肝炎関連抗体陽性の
培養細胞を得、ついでこれをクローン化して目的とする
抗体を産生ずる細胞株を得ることができる。
る。
一方、yvfウィルスを産生放出している細胞(たとえ
ば、Bりt−、r)を培地中で培養し、その培養上清を
分離し、ウィルス源(EBウィルス液)を得る。
ついで、このEBウィルス液と上記リンパ球を接触させ
た後、種々の培養密度で、組織培養用マイクロタイター
プレートに接種して培養する。
このトランスフォーメーション法は、適宜常法を選ぶこ
とができるが、少ない細胞密度で接種するオリゴクロー
ン法が好適に使用される。
細胞の増殖がみられる時期K、培養上清を集め、抗体活
性のスクリーニングを行ない、抗体活性陽性のものにつ
いて、クローニングを行なう。
クローニングに際しては、軟寒天(θoft agar
)法、限界希釈(1imiting dilution
)法又はシングルセルマニピユレーション(θingl
e (!al1manipulat1on)法の常法を
用いることができるが、主として軟寒天法および限界希
釈法が用いられる。
軟寒天法の場合、たとえば細胞をある密度で支持寒天層
上の接種寒天層に植え込み、増殖してきたコロニーを分
離し、再び浮遊培養に移し、抗体陽性のクローン株を取
得する。
また、限界希釈法の場合、たとえばxIIil照射した
腫瘍化B細胞をフィダー細胞として、細胞をある密度で
組織培養用マイクロタイタープレートに植込み、抗体陽
性のクローン株を取得する。
このクローン化された細胞株が産生ずる抗体は常法によ
シ取得でき、この抗体は非A非B型肝炎発症時の肝細胞
内に出現する抗原に特異的に反応する。
得られる抗体は、常法により、たとえばセファクリル ” 5ephacryl ”  S−700等によるゲ
ル濾過クロマトグラフィー等によシ精製することができ
、次のような性質を有する。
/) 蔗糖密度勾配遠心法及びゲルf過法による分子量
が約りθo、oooであシ、 λ)  SD日−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法に
よる分子量約t3,000の■鎖と分子量約、23,0
00のL鎖からなるチンパンジー又はヒトの工gM抗体
である。
(発明の効果) −番 − 水弁HAK係るモノクローナル抗体は、非A非B型肝炎
抗原に特異的でちシ、非A非B型肝炎の診断、輸血用血
清のスクリーニング、原因ウィルスの精製等に有用であ
る。さらに1本杭体はチンパンジー及びヒト型である特
徴を有するので非A非B型肝炎の治療にも有効であると
期待される。
(実施例) 以下、実施例によシ本発明をさらに詳細に説明する。
実施例1 / 非A非B型肝炎回復期のチンノくンジー末梢血すン
ハ球のトランスフォーメーションl )  培   地 RPM工/lグO培地に、リラシリンio。
μg/xi 、ストレプトマイシン100μg 1tx
l。
グルタミン、2mM1炭酸水素ナトリウム/、tg/l
を加えた後、二酸化炭素を吹きこみpH7,0〜7.弘
とし、牛胎児血清(IFetal Ca1f 8aru
m : Foe)  をλOチとKBウィルスを産生ず
るBlt−♂細 胞(Proceedings of National
 Academyof 5cience、7(7(1)
、/り0−/りp(lり73))をJ X / 05/
耐の細胞密度でRPM工/lグ0−4−#74F/S培
地を用いて7日間培養し、0.176μmのミリポアフ
ィルタ−でr過した培養上清をウィルス液として用いる
ウィルスの力価判定には、晴帯血のトランスフォーメー
ションt” 利用シタTDso/dを用いる。ウィルス
は、その力価が / Ol T Dso/d以上のものを用いる。
3) リンパ球の分離 ヘパリン加採血した非A非B型肝炎回 復期のチンパンジーの静脈血から、 フィコ)シコンレイ Ficol aonray  比重遠心法(IFico
l −ンパ球が分離される。
/−以上)を加え、37℃で1時間放置する。
その後、遠心によりウィルス液を除き RPM工/lグQ+λ0チPOEI培地を加え細胞密度
を調整し、平底マイクロタイタープレートに0./−ず
つ細胞を植えこむ。
μ8後に培地を0./ d加え以後≠〜7日に1度培地
の半量交換を行う。植えこむ細胞数によって異なるが、
平底マイクロタイタープレートのウェル当1)lo6個
では、7〜lO日で細胞が細胞集塊を形成底マイクロタ
イタープレートのウェル当p108〜ios個の細胞密
度で植えこむ。
り 培養上清中の非A非B型肝炎関連抗体−フ − の検出。
細胞が増殖してきたら、培養上清を集 め抗体価を測定する。その時期は、植えこむ細胞数によ
って異なるが、3週目からグ週目にかけて抗体活性陽性
のウェルが認められる。抗体陽性のウェルは、 λ弘穴マルチウェルプレー)、3jmnのシャーレ、t
O■のシャーレと培養量全拡大し、トランスフオームを
週目位からクローニングを行う。
キットリンパ腫細胞をマイクロタイタープレー)Kウェ
ル当1) 、2j、ooo個植えこむ。次にRPM工/
A4to+jO%?Jt8 培地テ10、!、λ、!、
1個/ 0./ atとなるように細胞を希釈し、これ
をマイクロタイタープレー) 1c 0.1atずつ植
えこみ培養する。7日後に培地を0、/ ml加え以後
グ〜7日K1度培地の半量交換を行う。培養開始後10
−.217日で肉眼で認められるコロニーが形成される
。その結果クローン株を得る。
3 抗体の取得および精製 上記クローン株をθ、t %牛血清アルブミン(FBE
I)台無血清培地(RITCjj−P培地)中で増殖さ
せ、培養上清を集め抗体を取得する。この上清を限外r
過(分子量30万以下の分子を排除する)後、“Sθp
ha c ryl”8−300t/Cよるゲルf過クロ
マトグラフィー (0,λMホウ酸緩衝液pH2,0)
で精製し抗体を得た。このチンパンジー型の精製抗体は
、オフタロニー法および免疫電気泳動法で、IgM 抗
体に対応する沈降線を示した。還元条件下の8DEl電
気泳動分析ではIgM のH鎖とL鎖に相当する2本の
バンドが認められた。
用いて、下記軟寒天法によシクローニングを行なった以
外は実施例1と同様にして、細胞株を得、ついでヒト型
の精製抗体を得た。
(軟寒天法) 支持層0.3%、接種層0.3 %のアガロースマリー
ン  コロイズ    6シー プラーク′。
(Marine Co11oide社製Sea Pla
que  アガロース)を含むRPMI/14tO+2
0チ FoS培地を用いる。細胞はプレート当り/θO
〜/θ、θθθ個植えこむ。培養開始後IO−コO日で
肉眼で認められるコロニーが形成される。この時点で、
パスツールピペットを用いてコロニーヲ吸い上げ、あら
かじめ0./1ttlのRPMI/4グO+20俤FC
EI培地を入れたマイクロタイタープレートに細胞を移
して培養し、クローン株を得る。
なお、上記の精製抗体も、オフタロニー法および免疫電
気泳動法で、IgM抗体に対応する沈降線を示した。ま
た還元条件下のSDS電気泳動分析では工gMのH鎖と
L鎖に相当する2本のバンドが認められた。
、     参考例/ (1)  非A非B型肝炎陽性肝組織との反応性実施例
1及びλで得られた抗体を用いて、非A非B型肝炎発症
時の肝組織を螢光抗体法によシ反応させ反応性の有無を
調べた。
すなわち、クリオスタットで薄切した肝組織切片をアセ
トンで室温で10分間処置する。
乾燥後、上記の非A非B型肝炎関連抗体(−次抗体)を
切片の上にのせ湿潤箱杷入れて37℃でto分間反応さ
せるやこのときに用いる抗体液は、あらかじめ濃度を適
当に希釈したものを用いるPBSで一次抗体を洗い流し
、振盪しながらPBEI中で洗浄する。次KPITCラ
ベルした抗ヒトエgM 抗体(2次抗体)を上記と同様
に37℃でto分間反応させる。PBSで標識抗体を洗
い流し、振盪しながらPBE中で洗浄する。風乾後、封
入剤〔グリセリy : OJM Na2003− Na
HOO1緩衝液(り;l)〕を滴下し、カバーグラスで
封入する。水銀ランプを光源とした螢光顕微鏡を用いて
観察する。
その結果、本抗体は、非A非B型肝炎の発症時に出現し
た抗原に対して反応する抗体であることが判明した。
(2)非A非B型肝炎陰性肝組織との反応性上記(1)
におけると同様の方法で、実施例1及びコで得られた抗
体を用いて、非A非B型肝炎陰性肝組織を螢光抗体法に
より反応させ反応性の有無を調べた。
その結果、本抗体は、A型肝炎もしくはB型肝炎の肝組
織切片と反応せず、非ウィルス性肝炎の肝組織切片とも
反応せず、また、正常肝組織切片とも反応しないことが
判明した。
特許出願人   小 野   魁 ほか3名 代理人 弁理士  長谷用   − ほか7名

Claims (1)

    【特許請求の範囲】
  1. (1)非A非B型肝炎発症時の肝細胞内に出現する抗原
    に特異的に反応するヒト及びチンパンジー型モノクロー
    ナル抗体。
JP14735584A 1984-07-16 1984-07-16 モノクロ−ナル抗体 Pending JPS6156196A (ja)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP14735584A JPS6156196A (ja) 1984-07-16 1984-07-16 モノクロ−ナル抗体

Applications Claiming Priority (1)

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JP14735584A JPS6156196A (ja) 1984-07-16 1984-07-16 モノクロ−ナル抗体

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JPS6156196A true JPS6156196A (ja) 1986-03-20

Family

ID=15428316

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Application Number Title Priority Date Filing Date
JP14735584A Pending JPS6156196A (ja) 1984-07-16 1984-07-16 モノクロ−ナル抗体

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JP (1) JPS6156196A (ja)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS62249999A (ja) * 1986-04-16 1987-10-30 インステイテイ パスツ−ル 非a非b型ウイルス性肝炎検出用試薬および免疫酵素法による前記肝炎の診断法
US5191064A (en) * 1988-09-30 1993-03-02 The Research Foundation For Microbial Diseases (Osaka University) Non-a, non-b hepatitis virus antigen peptide
US5218099A (en) * 1986-04-01 1993-06-08 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Post-transfusion, non-A, non-B hepatitis virus polynucleotides
US5350671A (en) * 1987-11-18 1994-09-27 Chiron Corporation HCV immunoassays employing C domain antigens

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