JPH06189751A - Ｈｉｖの精製単離されたレトロウィルス - Google Patents

Ｈｉｖの精製単離されたレトロウィルス

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JPH06189751A
JPH06189751A JP5049628A JP4962893A JPH06189751A JP H06189751 A JPH06189751 A JP H06189751A JP 5049628 A JP5049628 A JP 5049628A JP 4962893 A JP4962893 A JP 4962893A JP H06189751 A JPH06189751 A JP H06189751A
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Abstract

(57)【要約】 【目的】 ＡＩＤＳ疾患の原因となるＨＩＶレトロウィ
ルスを発見した。該ウィルスはＡＩＤＳ患者の血清中に
存在する抗体を検出するための抗原の原料として用いら
れる。 【構成】 以下の特徴を有するＴ−リンパ栄養的レトロ
ウィルスであるＨＩＶの精製単離されたレトロウィル
ス。 １）標的がヘルパーＴ−リンパ球である； ２）Ｍｇ2+イオンの存在を要求し、ポリ（アデニレー
ト）−オリゴ（デオキシチミジレート）12-18 に強い親
和性を示す逆転写酵素活性を有する； ３）ＨＴＬＶ−Ｉのｐ２４タンパク質と免疫学的に交差
反応しないｐ２５タンパク質を含む； ４）ＨＴＬＶ−Ｉのｐ１９タンパク質と免疫学的に交差
反応するタンパク質を含まない。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、後天性免疫不全症候群
の原因となるＨＩＶ、即ちヒト免疫不全ウィルスに関
し、このウィルスはこの疾患の患者の血清中に存在する
抗体を検出するための抗原の原料として用いられる。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】後天性
免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）は、最近数ケ国において認
められている。この疾患は主として複数の相手を有する
同性愛の男性において報告されており、疫学的研究は性
的経路並びに静脈内薬物投与及び輸血による水平伝播を
示唆している。ＡＩＤＳの患者に生ずる顕著な細胞性免
疫の抑制及び彼等のＴリンパ球の下部集団の量的変異
は、Ｔ細胞或いはＴ細胞の下部集団が仮想的感染剤に対
する好ましい標的ではないかということを示唆する。或
いは又、これらの変異はそれに引き続く感染の結果でも
あり得る。
【０００３】低下した細胞性免疫はＡＩＤＳ患者におい
て深刻な日和見感染を引き起こし、それらの多くはカポ
ジ肉腫を発現させる。しかしながら、ＡＩＤＳを発現し
た或いはしない同性愛男性及び幼児において、執拗な複
数のリンパ節疾患の状況も又記載されている。その様な
リンパ節の組織学的側面は、反応性増殖のそれである。
その様な症例は、この疾患の早期或いはより穏やかな形
態に対応するものかもしれない。
【０００４】
【課題を解決するための手段】ＡＩＤＳ及びしばしばＡ
ＩＤＳの前駆的徴候と考えられるリンパ節疾患症候群
（ＬＡＳ）の主たる病因学的作用因子の一つが、複数の
リンパ節疾患を有する同性愛患者のリンパ節から単離さ
れたＴ−リンパ栄養的レトロウィルスよりなることが見
出された。このウィルスは、ヒトＴ細胞白血病ウィルス
（ＨＴＬＶ）科［R. C. Gallo 及び M. S. Reitz、J. N
atl. Cancer Inst. 69（No.6) 、1209 (1982)]とは区別
されるように思われる。最後に述べたウィルスは、所謂
ＨＴＬＶ−Ｉサブグループに属していることが知られて
いる。
【０００５】この患者は、頸部リンパ節疾患及び無力症
について１９８２年１２月に医学相談を求めた３３才の
同性愛の男性であった（患者１）。検査結果は、腋窩及
び鼠径部のリンパ節疾患を示した。熱も最近の体重の減
少も見られなかった。この患者は幾つかの淋病の履歴を
有し、１９８２年９月に梅毒の治療を受けていた。イン
タビューに際して、彼は毎年５０人を越える性的交渉の
相手を有し、北アフリカ、ギリシャ、及びインドを含む
多くの国へ旅行していたことを明らかにした。彼のニュ
ーヨークへの最後の旅行は１９７９年であった。
【０００６】実験室の試験は、サイトメガロウィルス
（ＣＭＶ）及びエプスタイン−バ−（Ｅ．Ｂ．）ウィル
スについて血清学的陽性（免疫グロブリンＧ）を示し
た。ヒト及びサルの細胞上で培養された彼の咽喉からの
細胞には、単純ヘルペスウィルスが検出された。頸部リ
ンパ節の生検が行われた。一つの試料は組織学的検査に
当てられ、それはリンパ節の一般構造の変化のない胞状
増殖を出現させた。免疫組織学的研究は、副皮質領域に
おいて多くのＴリンパ球（ＯＫＴ３+ ）を示した。全細
胞懸濁液の類型化は、６２％の細胞がＴリンパ球（ＯＫ
Ｔ３+ ）、４４％がＴ−ヘルパ−細胞（ＯＫＴ４+ ）、
及び１６％がサプレッサ−細胞（ＯＫＴ８+）であるこ
とを示した。
【０００７】同一の生検されたリンパ節の細胞をフィト
ヘマグルチニン（ＰＨＡ）、Ｔ−細胞生育因子（ＴＣＧ
Ｆ）及びヒトα−インターフェロンに対する抗血清と共
に培養培地に入れた（「細胞は抗生物質、１０-5Ｍβ−
メルカプトエタノール、１０％ウシ胎児血清、０．１％
のヒトα−インターフェロンに対するヒツジ抗体（中和
力価、１０-5希釈率において７IU）及び１０％のＰＨＡ
のないＴＣＧＦを補給したＲＰＭＩ−１６４０培地中に
おいて生育した」）。ヒトα−インターフェロンに対す
る抗血清を使用した理由は、レトロウィルスを含むウィ
ルスに慢性的に感染した細胞により分泌される内因性イ
ンターフェロンを中和するためであった。マウス系にお
いては、以前にインターフェロンに対する抗血清が１０
〜５０の倍率によりレトロウィルス産生を増大し得るこ
とが示されている[ F. Barre-Sinoussi 等、Ann. Micro
biol.(Institut Pasteur) 、130B、349 (1979)] 。３日
後にＰＨＡを含有しない同一培地中において培養を継続
した。試料は、逆転写酵素分析及び電子顕微鏡における
検査のために規則的に取り出した。
【０００８】１５日間の培養後、ＨＴＬＶ−Ｉについて
説明されているイオン性条件[B. J.Poiesz 等、Proc. N
atl. Acad. Sci. U.S.A., 77, 7415 (1980)] を使用す
ることにより培養上澄液中に逆転写酵素活性が検出され
た。ウィルス産生は１５日間継続し、その後リンパ球増
殖の低下と平行して減少した。同一方法で培養された末
梢血液リンパ球は、６週間後にも逆転写酵素活性につい
て終始陰性であった。サイトメガロウィルスは、ＭＲＣ
５細胞との長期間の共培養時に元の生検組織中には検出
されたが、培養されたＴ−リンパ球中には培養の如何な
る時点においても検出されなかった。
【０００９】本発明は、ＬＡＳ及びＡＩＤＳの診断に有
用な新たに単離したウィルスに関するものである。以下
に、ＨＩＶ−１と命名される新たに単離されたウィルス
についての説明を行う。
【００１０】このウィルスは、健康な提供者から得られ
たＴリンパ球の培養液に伝播可能である。特に、ウィル
ス伝播は、パスツール研究所の輸血センターの健康な成
人提供者から確立されたＴリンパ球の培養液を用いて試
みられた。３日目に培養液の半分を混合細胞懸濁液の遠
心分離後の生検からのリンパ球と共培養した。逆転写酵
素活性は、共培養の１５日目の上澄液には検出すること
ができたが、５日目及び１０日目では検出することがで
きなかった。逆転写酵素は患者の細胞から放出されたも
のと同一の特性を有し、放出量は１５〜２０日間安定で
あった。提供者のリンパ球の未感染培養液の細胞は、培
養が中止された６週間迄の期間内に逆転写酵素活性を示
さなかった。
【００１１】この感染共培養液の細胞のない上澄液を用
いて、二つの臍帶ＬＣ１及びＬＣ５からのＴリンパ球の
３日間培養液をポリブレン（２μｇ／ml）の存在下にお
いて感染させた。７日間の遅滞期間後に、両方の臍帶リ
ンパ球培養液の上澄液中に比較的高力価の逆転写酵素活
性が検出された。感染しなかった同一の培養液は陰性に
留まった。これらの二つの逐次感染は、ウィルスが新生
児或いは成人からの正常なリンパ球上で増殖し得ること
を明確に示す。
【００１２】上記共培養においては、患者１の細胞その
まま（それらは衰え、最早生育しなかった）、或いは予
備Ｘ線照射されるか又はマイトマイシンＣ処理された細
胞が使用された。
【００１３】リンパ球の感染培養液から得ることのでき
るＨＩＶ−１ウィルス或いはＨＩＶ−１ウィルス懸濁液
は、それらを完全にその他のＨＴＬＶから区別する特性
を有する。これらの特性を以下に適宜図面に関連して言
及する。それは、それぞれ逆転写酵素活性及び〔3 Ｈ〕
ウリジン活性の、感染リンパ球培養液から得られた細胞
のない上澄液のウィルス内容物の超遠心分離後の蔗糖勾
配中のＨＩＶ−１ウィルスの連続画分に対する変化を表
わす曲線を示す。
【００１４】逆転写酵素活性によるＨＩＶ−１ウィルス
分析は、患者１からのウィルスに関連して図において用
いられた方法に従って行なうことができる。分析結果を
図に示す。患者１からのウィルスに感染した臍帶血液Ｔ
リンパ球を、１８時間〔3 Ｈ〕ウリジン（２８Ci／ミリ
モル，Amersham; ２０μCi／ml）で標識化した。細胞の
ない上澄液を５０，０００rpm において１時間超遠心分
離を行なった。ペレットを２００μｌのＮＴＥ緩衝液
（１０mMトリス，pH７．４、１００mM NaCl及び１mM
EDTA）中に再懸濁し、ＩＥＣ型ＳＢ４９８ローター内に
おいて、５５，０００rpm において９０分間、３ml線形
蔗糖勾配（１０〜６０％）を用いて遠心分離を行った。
画分（２００μｌ）を集め、各画分の３０μｌ試料につ
いて５mMＭｇ2+及びポリ（Ａ）−オリゴ−（ｄＴ）
12-18 を鋳型プライマーとして用いてＲＮＡ依存ＤＮＡ
ポリメラーゼ活性の測定を行った。各画分の２０μｌ部
分を１０％トリクロル酢酸を用いて沈澱させた後、０．
４５μm ミリポア（Millipore)フィルターで濾過した。
3 Ｈ−標識酸沈澱物質をパッカード（Packard)βカウン
ター中で測定した。
【００１５】この新規ウィルス単離体がレトロウィルス
であったということは、上記蔗糖勾配中におけるその密
度、即ち１．１６及びその〔3 Ｈ〕ウリジンを用いた標
識化により更に示された（図）。迅速に沈澱するＲＮＡ
はＨＩＶ−１ウィルスと会合しているように思われる。
【００１６】元の生検からのウィルス感染細胞並びに第
１及び第２ウィルス継代からの感染リンパ球を用いて、
逆転写酵素活性及び酵素の鋳型特異性に対する最適必要
条件を求めた。結果は全ての場合に同一であった。この
逆転写酵素活性は、ポリ（アデニレート）−オリゴ（デ
オキシチミジレート)12-18［ポリ（Ａ）−オリゴ（ｄ
Ｔ）12-18 ］に対して強い親和性を示し、最適濃度５mM
のＭｇ2+及び７．８の最適pHを必要とした。この反応
は、アクチノマイシンＤによって阻害されなかった。こ
の特性、並びにデオキシアデニレート−デオキシチミジ
レートよりもリボースアデニレート−デオキシチミジレ
ートに対する優先的な特異性は、ＤＮＡ依存ポリメラー
ゼ類からこのウィルス酵素を区別するものである。
【００１７】ウィルス産生細胞の超薄切片の電子顕微鏡
検査は、おそらくウィルスの未熟及び成熟形態に対応す
る２種類の粒子を示し、未熟粒子は細胞表面に出芽し、
濃い半月形が原形質膜に密着している。場合により、あ
る粒子は細胞表面から離れながら、この状態に留まる。
【００１８】成熟粒子は小さな密度の高い偏心コア（平
均直径４１nm）を有する全く異なった形態を有する。殆
どのウィルス粒子が球形（平均直径１３９nm）或いは卵
形であるが、しかし、ある写真において、特にウィルス
が単離された元の培養液にみられる粒子においては、尻
尾を有する形態も又観察される。後者の形態は又、培地
中に放出された細胞質の小胞にもみることができる。そ
の様な粒子は又、小胞膜から出芽することによっても形
成される。成熟粒子の形態は、その大きなコアが９２nm
の平均直径を有するＨＴＬＶから明確に区別される。
【００１９】ヘルパーＴ−リンパ球（Leu3細胞）がウィ
ルスの主たる標的を形成する。換言すれば、このＨＩＶ
−１ウィルスは、これらの細胞に対して特別の向性を有
する。Leu3細胞は、ORTHO により商標ＯＫＴ４として市
販されているモノクローナル抗体により認識可能であ
る。これに対して、主としてサプレッサー或いは細胞毒
細胞であり、ORTHO により商標ＯＫＴ８として市販され
ているモノクローナル抗体により認識されるLeu2細胞の
富化培養液は、同一条件において感染された場合にも、
ウィルス感染後６週間後にも何等の検知可能な逆転写酵
素活性を示さなかった。ＡＩＤＳの殆どの症例におい
て、正常では１を越えるＯＫＴ４+ 細胞のＯＫＴ８+ 細
胞に対する比は０．１以下程度の値に降下している。
【００２０】ＨＩＶ−１ウィルスは又、Ｔリンパ腫及び
Ｔ白血病を有する患者の培養されたＴリンパ球からの従
来知られているＨＴＬＶ−Ｉ単離物からも免疫学的に区
別される。使用された抗体はＨＴＬＶ−Ｉのｐ１９及び
ｐ２４コア蛋白質に特異的に反応するものであった。ｐ
１９に対するモノクローナル抗体［M.Robert-Guroff
等、J. Exp. Med.、 154、 1957 (1980)] 及びｐ２４に対
するポリクローナルヤギ抗体［V. S. Kalyanaraman等、
J. Virol.、 38、 906 (1981) ] を患者１の生検からの感
染細胞及び健康な供与者から得られ、同一ウィルスに感
染させたリンパ球に対する間接螢光アッセイにおいて用
いた。ＨＩＶ−１ウィルス産生細胞はいずれの型の抗体
とも反応しなかったのに対し、慢性的にＨＴＬＶ−Ｉに
感染し［M.Popovic, P. S. Sarim, M. Robert-Guroff,
V. S. Kalyanaraman, D. Mann, J.Minomada, R. C. Gal
lo著、Science、 219、 856 (1983)] 、かつ、対照例とし
て使用された臍帶リンパ球の二つの系統は、強い表面螢
光を示した。
【００２１】何れのウィルス抗原が患者の血清内に存在
する抗体により認識されるかを決定するために、数回の
免疫沈澱実験を行った。患者１からのウィルスに感染し
た臍帶リンパ球及び未感染対照例を、［35Ｓ］メチオニ
ンで２０時間標識化した。細胞を洗剤を用いて溶解し、
細胞質Ｓ１０抽出物を作成した。上澄液中に放出された
標識化ウィルスは蔗糖勾配中にバンド形成した。両物質
をＨＴＬＶ−Ｉｐ２４に対する抗血清、患者１からの血
清及び健康な供与者からの血清試料により免疫沈澱し
た。免疫複合体を変性条件下でポリアクリルアミドゲル
電気泳動により分析した。患者１からのウィルス感染細
胞及びこのウィルスに感染したＬＣ１細胞中に存在する
ｐ２５蛋白質は患者１からの血清により特異的に認識さ
れたが、同様な条件下で得られたＨＴＬＶ−Ｉｐ２４に
対する抗血清或いは正常な供与者の血清では認識されな
かった。反対に、対照例のＨＴＬＶ感染細胞抽出物中に
存在するｐ２４は、ＨＴＬＶに対する抗体により認識さ
れたが、患者１からの血清によっては認識されなかっ
た。
【００２２】35Ｓ−メチオニン−標識化ウィルスの精製
後に検出された主たる蛋白質（ｐ２５）は約２５，００
０（即ち２５Ｋ）の分子量を有する。他のレトロウィル
ス類との類推により、この主たる蛋白質はウィルスのコ
ア中に位置するものと考えられた。これは、患者の血清
がウィルスのコアを凝集させることができることを示す
免疫電子顕微鏡実験において確認することができる。反
対に、エーテル処理ウィルスに対してウサギ中で形成さ
れた抗血清はｐ２５蛋白質を沈澱させなかった。
【００２３】精製ウィルスのポリアクリルアミドゲル電
気泳動中に見られるその他の蛋白質のウィルス源は、推
定がより困難である。ｐ１５蛋白質が銀染色後に見られ
たが、35Ｓ−メチオニンで標識化後には、おそらくこの
蛋白質中のこのアミノ酸の不足により、はるかに弱いも
のであった。より高い分子量範囲において、ウィルス膜
の内部或いは外部のいずれにおいても、ウィルスの細胞
蛋白質による汚染が見られるようである。３６Ｋ及び４
２Ｋ蛋白質及び８０Ｋ蛋白質は、常に形成されて精製ウ
ィルスと会合し、主たる膜蛋白質を代表し得るものであ
る。ｐ１９（即ち約１９，０００の分子量を有するも
の）がＨＩＶ−１抽出物から単離された。
【００２４】本発明のＨＩＶは、より詳細にはＬＡＳ或
いはＡＩＤＳに罹患した患者の血清により免疫学的に認
識されることの可能な該ウィルスの抗原含有抽出物の調
製に用いられる。勿論、任意の種類の免疫学的分析法に
使用することが可能である。例えば、免疫蛍光分析法、
免疫酵素分析法或いは放射免疫沈殿法が特に適したもの
である。
【００２５】例外的状況の場合を除いて、罹患患者の血
清は元のままのＨＩＶ−１ウィルス或いは同様な表現型
又は免疫学的特性を有するウィルスを認識しない。ウィ
ルスの膜蛋白質については、患者の中には、患者の血清
で免疫学的に検出可能なものもある。しかしながら、コ
ア蛋白質が該血清に曝されると免疫学的検出が可能とな
る。従って、本発明のＨＩＶは、それから抽出される抗
原を製造するために用いられ、それが最も粗製のもの、
特に単なるウィルスのライゼート、或いはより精製され
たもの、特にｐ２５蛋白質に富んだ抽出物、或いは更に
精製ｐ２５蛋白質或いはそれに免疫学的に関連した蛋白
質に富んだ抽出物であると否とを問わず、ＨＩＶの全て
の抽出物は抗原として用いられる。抗原には、任意の精
製方法を使用することが可能である。例えば、R. C. Mo
ntelaro 等、J. Virology 、1982年 6月、 p.p.1029-103
8 に開示されるような精製方法を使用することが可能で
ある。
【００２６】ＨＩＶ型のウィルスの源は、ＬＡＳ及びＡ
ＩＤＳ患者からの或いは血友病患者から単離可能なＴ−
リンパ球培養物から得られる。次のものから正常なリン
パ球上で増殖する二つのレトロウィルスが得られた。 １）広範なカポジ肉腫病態及びその血液中に実際上全く
ＯＫＴ４+ リンパ球を有しない激しいリンパ球減少を有
する複数の相手を有する白人の同性愛者のリンパ節リン
パ球、 ２）ニューロトキソプラスモシス（neurotoxo-plasmosi
s)及び０．１のＯＫＴ４+ ／ＯＫＴ８+ 比を示す若いＢ
血友病患者の血液リンパ球。
【００２７】これらの二つのレトロウィルスは、ＩＤＡ
Ｖ１及びＩＤＡＶ２とそれぞれ命名された（免疫不全関
連ウィルスとして）。これまでに得られた部分的特性化
の結果は、ＩＤＡＶ１及びＩＤＡＶ２のＨＩＶ−１に対
する下記のような類似性（同一性ではなくとも）を示
す。即ち： −同一のイオン要求及び逆転写酵素の鋳型特異性、 −超薄切片における同一の形態、 −抗原的に関連したｐ２５蛋白質：ＨＩＶ−１患者の血
清はＩＤＡＶ１及びＩＤＡＶ２からのｐ２５を免疫沈澱
させ、反対にＩＤＡＶ２患者からの血清はＨＩＶ−１ｐ
２５を免疫沈澱させる。
【００２８】ＩＤＡＶ１患者の血清はより低い抗体価を
有するように思われ、ＨＩＶ−１及びＩＤＡＶ１ｐ２５
蛋白質に対して弱い沈澱帯を与えた。ＩＤＡＶ１及びＩ
ＤＡＶ２のｐ２５蛋白質は、ＨＴＬＶｐ２４抗血清によ
って認識されなかった。これらの類似性は、これらの三
つの単離物の全ては同一群のウィルスに属することを示
唆する。
【００２９】本発明のウィルスは、更に診断患者からの
血清或いはその他の生物学的媒体を上記の如きウィルス
抽出物と接触させ、その免疫学的反応を検出することを
特徴とする試験管内（in vitro) のＬＡＳ或いはＡＩＤ
Ｓの診断方法に用いられる。好ましい方法は、免疫酵素
分析法或いは免疫蛍光分析法、特にＥＬＩＳＡ技術によ
るものである。これらの分析法は、直接或いは間接の免
疫酵素分析法或いは免疫蛍光分析法のいずれであっても
よい。この様に、本発明は又標識の型が酵素、蛍光、放
射能等のいずれであってもよい標識化ウィルス抽出物に
用いられる。
【００３０】その様な分析法としては、例えば、次のよ
うな方法が含まれる。即ち： −本発明のウィルスからの所定量の抽出物を滴定マイク
ロプレートのウェル中に堆積し、 −該ウェル中に診断すべき血清の次第に増大する希釈液
を導入し、 −マイクロプレートをインキュベートし、 −マイクロプレートを充分に洗浄し、 −マイクロプレートのウェル中に血液免疫グロブリンに
向けられた標識化抗体を導入し（標識化は基質を加水分
解することのできる酵素から選ばれた酵素により行なわ
れ、これにより基質は次いで少なくとも所定の波長帯域
においてその放射線吸収が変化する）、及び −疾患の潜在リスク或いは有効存在の目安として基質加
水分解の量を、好ましくは対照例との比較方法において
検出することよりなる。
【００３１】上記診断用のキットは、上記型のウィルス
の抽出物或いはより精製された画分（該抽出物或いは画
分は、放射能、酵素或いは免疫酵素ラベルなどにより標
識化されている）、抗−ヒト免疫グロブリン或いはプロ
テインＡ（アガロースビーズなどの水不溶性支持体に固
定されているのが有利である）、健康なヒトから得られ
たリンパ球抽出物、緩衝液及び適当であるならば標識の
可視化のための基質、よりなることを特徴とするもので
ある。
【００３２】本発明のウィルスのその他の特徴は、関連
ウィルスの好ましい単離及び培養方法、診断手段として
適当な抽出物の好ましい抽出方法、好ましい診断技術及
び達成することのできる結果についての説明が進むにつ
れて更に明らかとなるであろう。
【００３３】
【実施例】
１．ウィルス増殖 臍帶或いは血液のいずれかからの培養されたＴ−リンパ
球、或いは又健康なウィルス陰性の成人の供与者からの
骨髄細胞が、ウィルス増殖に適したものである。しかし
ながら、リンパ球がウィルスを成育させる能力には、個
人間に幾分の差異がある。従って、ウィルスに対する抗
体を有さず、又そのリンパ球が逆転写酵素（ＲＴ）活性
により検出されるように繰り返し自発的にウィルスを放
出せず、又ウィルス蛋白質が検出されなかった健康的な
成人供与者を選択するのが好ましい。
【００３４】供与者のリンパ球を得、細胞泳動により分
離し、５０％の非働化（補体を不活性化した）ヒト血清
及び１０％ＤＭＳＯを加えたＲＰＭＩ１６４０培地中
で、使用時まで液体窒素中、−１８０℃において凍結保
存した。
【００３５】ウィルス感染のためには、リンパ球を培養
液（ＲＰＭＩ１６４０培地）中にフィトヘマグルチニン
（ＰＨＡ）と共に５×１０6 細胞/ml の濃度で３日間置
いた。
【００３６】次いで、培地を除去し、細胞をウィルス懸
濁液（ウィルス産生リンパ球の粗製上澄液、−８０℃で
保存）中に再懸濁した。細胞／ウィルス濃度の最適条件
は、５〜１０，０００cpm のＲＴ活性に対して２×１０
6 細胞であり、ＲＴ活性は前記の方法で求めた。２４時
間後に細胞を遠心分離にかけ未吸着ウィルスを除去し、
ＰＨＡのない培地に再懸濁し、ＰＨＡのないＴＣＧＦ
（インターロイキン２）：（０．５〜１ U/ml 、最終濃
度）、POLYBREN(Sigma):（２μg /ml ) 及び５６℃で３
０分間非働化した抗−インターフェロンαヒツジ血清
（７U のα白血球インターフェロンを１／１００，００
０の希釈率で中和することのできる０．１％の血清）を
補給した。ウィルス産生は、１ml試料についてＲＴ活性
測定により３日毎に試験した。
【００３７】抗−インターフェロン血清の存在はウィル
ス産生において重要である。即ち、リンパ球を抗−ヒト
−α−インターフェロン血清の不存在下において感染さ
せると、ＲＴ活性により測定したウィルスの産生は極め
て低いか或いは遅延する。使用されるヒツジ抗血清は、
部分的に精製されたα白血球インターフェロンに対して
形成され、Cantell の技術により作られたものであるの
で、インターフェロン以外の成分の役割は排除すること
ができない。
【００３８】ウィルスの産生は、通常感染後９〜１５日
目に開始し、１０〜１５日間継続する。如何なる場合に
も連続的永久系統の発現は観察されなかった。
【００３９】２．ウィルスの精製 ＥＬＩＳＡにおけるその使用のために、ウィルスを１０
％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ ６０００）沈澱に
より濃縮し、２０〜６０％の蔗糖勾配中で２回平衡にな
る迄バンド形成させた。１．１６の密度におけるウィル
スのバンドを次いで回収するが、これはそのままＥＬＩ
ＳＡ分析に使用可能である。放射免疫沈澱分析法（ＲＩ
ＰＡ）に使用するためには、メトリッツアミド（Metriz
amide)［Nyegaard (Oslo) によりNYCODENZの商標で販
売］の等張勾配における精製が好ましいことが判明し
た。そのような勾配におけるウィルス密度は極めて低か
った（１．１０〜１．１１）。
【００４０】ＲＩＰＡでは、細胞及びウィルスの35Ｓ−
メチオニンによる代謝標識化の後、ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動を次のＲＩＰＡに対する修正以外は上記と
同様にして行なった。即ち、NYCODENZ中で精製されたウ
ィルスを５００ U/ml のアプロチニンを含有する４容の
ＲＩＰＡ用緩衝液（０．５％ＳＤＳ）中で溶解した。５
μｌの試験血清とのインキュベーションは、３７℃で１
時間行い、次いで＋４℃で１８時間行った。更に免疫複
合体とプロティンＡセファロースビーズとのインキュベ
ーションは、＋４℃において３時間行った。
【００４１】３．ＥＬＩＳＡ用ウィルス抽出物の調製 上記の如き蔗糖勾配中において精製されたウィルスをＲ
ＩＰＡ用緩衝液（０．５％ＳＤＳ）中において溶解し、
マイクロテストプレート（Nunc）のウェル上に被覆し
た。
【００４２】ＥＬＩＳＡの好ましい条件を以下にまとめ
て示す。各試験血清の一連の希釈液をウェル２つずつに
添加後、特異的に固定したIgGをペルオキシダーゼと結
合したヤギ抗−ヒトIgG により発現させる。酵素反応は
オルト−フェニレンジアミンを基質として行い、自動分
光光度計を用いて４９２ｎｍにおいて読み取る。同一プ
レート上で各血清を対照抗原について試験する（ある血
清について高い可能性がある非特異性結合を除去するた
めに、同一供与者からの未感染Ｔ−リンパ球の粗製細胞
質ライゼートを使用する）。血清は、ウィルス抗原に対
する光学濃度（O.D.) と対照細胞抗原に対するO.D.の差
が少なくとも０．３０であった場合には陽性（ウィルス
に対する抗体）と考えられた。
【００４３】以下に上記疾患或いは疾患の可能性を検定
するための特別の試験を開示する。方法 このＥＬＩＳＡ試験は、血清抗−レトロウィルス型ＨＩ
Ｖ抗体の検出及び滴定のためのものである。それはレト
ロウィルス抗原（Ｔリンパ球上で培養）と、同一である
が非感染であるリンパ球のライゼートにより構成される
対照抗原との競争試験を行うことよりなる。２種の抗原
上への抗体の結合は、対応する基質の添加により発現す
る酵素で標識化された抗−ヒト免疫グロブリンを用いて
検出する。
【００４４】ウィルス抗原の調製 使用する細胞培養液はヒト起源のＴリンパ球であり、臍
帶血液、骨髄、健康な供与者の血液、由来のものであ
る。
【００４５】細胞のウィルスによる感染後、感染細胞培
養液の上澄液を使用する。それを、１０％PEG を用いて
沈澱させることにより濃縮し、次いで２０〜６０％の蔗
糖勾配上において超遠心分離により平衡になるまで精製
（２〜３回）する。
【００４６】ウィルスの画分を集め、５０，０００rpm
において６０分間遠心分離により濃縮する。沈降したウ
ィルスを、最少容量のＮＴＥ緩衝液（トリス０．０１
Ｍ、NaCl ０．１Ｍ、ＥＤＴＡ ０．００１Ｍ）中にpH
７．４において採取する。蛋白質濃度をローリー（Lowr
y)法により求める。ウィルスを、次いでＲＩＰＡ用緩衝
液（０．５％ＳＤＳ、最終濃度）により３７℃において
１５分間溶解する。
【００４７】対照抗原の調製 非感染リンパ球を前記条件により５〜１０日間培養す
る。それらを低速で遠心分離し５％のZYMOFREN（Speci
a)(５００ U/ml ）の商品名で市販されている製品の存
在下においてＲＩＰＡ用緩衝液中で溶解する。４℃にお
いて１５分間しばしば渦巻き撹拌しながら放置後、ライ
ゼートを１０，０００rpm で遠心分離する。この上澄液
が対照抗原を構成する。その蛋白質濃度をローリー法に
より測定する。
【００４８】試薬 １−プレート＝Nunc−特別にコントロールされたＥＬＩ
ＳＡ ２−ＰＢＳ緩衝液：pH７．５ ３−ツイーン（TWEEN ）２０ ４−炭酸緩衝液：pH＝９．６（Na2CO3＝０．２M ；NaHC
O3＝０．２M ） ５−非胎児ウシ血清：凍結状態で保存（BIOPRO） ６−ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）SIGMA （画分Ｖ） ７−ペルオキシダーゼ PASTEUR により標識化されたヒト抗IgG （Ｈ＋Ｌ）、１
μｌチューブ中に４℃で保存。 ８−洗浄緩衝液＝ＰＢＳ緩衝液、pH７．５＋０．０５％
TWEEN ２０ 複合体の希釈は示された希釈率においてＰＢＳ緩衝液＋
TWEEN ２０（０．０５％）＋ウシアルブミン０．５g ／
１００ml中において行う。 ９−血清の希釈緩衝液＝ＰＢＳ緩衝液＋０．０５％TWEE
N ２０＋０．５g ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）／１０
０ml １０−基質＝ＯＰＤ ・クエン酸緩衝液、pH＝５．６、クエン酸三ナトリウム
（C6H5Na3O 7，２H2O）、０．０５M ；クエン酸（C6H8O
7，１H2O ）、０．０５M 。 ・過酸化水素＝３０％（１１０容）−クエン酸緩衝液使
用時には０．０３％にて使用。 ・オルト−フェニレンジアミン＝SIGMA 緩衝液２５ml当たり７５mg、緩衝液中において即席で希
釈する。
【００４９】プレートの調製 使用されるプレートは９６個のＵ字型ウェルを有する
（Nunc、ＥＬＩＳＡ）。それらは各々８個のウェルを有
する１〜１２番の番号を付けられた１２列を含む。抗原
の分布は次の通りである。 −１００μｌのpH９．６の炭酸緩衝液中に希釈されたウ
ィルス抗原を、次の列のウェルの各々（＋のマークを付
される）中に沈積する １−２−５−６−９−１０ −１００μｌのpH９．６の炭酸緩衝液中に希釈された対
照抗原を、次の列のウェルの各々（−のマークを付され
る）中に沈積する ３−４−７−８−１１−１２。
【００５０】ウィルス抗原の希釈液を各ウィルス産生段
階において滴定する。ウィルス抗原の数個の希釈液を試
験し、陽性及び陰性の公知の対照例（数個の希釈率にお
いて）及びペルオキシダーゼで標識化した抗−ヒトIgG
と対比し、後者は又数個の希釈率で試験される。原則と
して、調製物の蛋白質濃度は５〜２．５μg /ml であ
る。対照抗原については、同一の蛋白質濃度を使用す
る。プレートをプラスチックの蓋で閉じて４℃で一晩イ
ンキュベートする。次いで、それらを一度蒸溜水中に入
れ、遠心分離を行う。ウェルに、次いで３００μｌのＰ
ＢＳ緩衝液中２０％の非ウシ胎児血清を満たす。インキ
ュベーションを３７℃において２時間継続する（被覆プ
レート）。
【００５１】プレートを０．０５％のTWEEN ２０含有Ｐ
ＢＳ緩衝液中において（ＰＢＳ−ｔｗ緩衝液）３回洗浄
する： ・第１回の洗浄 ３００μl ・第２回及び第３回の洗浄２００μl ／ウェル。 プレートを注意深く乾燥し、プラスチックの接着フィル
ムでシールする。それらは−８０℃で保存することがで
きる。
【００５２】ＥＬＩＳＡ反応：抗体価測定 解凍後、プレートを３回ＰＢＳ−ｔｗ中で洗浄する。そ
れらを注意深く乾燥する。陽性及び陰性対照血清並びに
試験血清を先ず試験管内において０．５％のウシアルブ
ミンを含有するＰＢＳ−ｔｗで希釈する。選ばれた希釈
率は１／４０である。
【００５３】−１００μl の各血清を、２ウェルずつの
ウィルス抗原上及び２ウェルずつの対照抗原上に沈積す
る。 −同一の操作を、陽性及び陰性希釈血清についても行
う。 −１００μl のＰＢＳ＋TWEEN ＋ウシ血清アルブミンを
２個の＋ウェル及び２個の−ウェルに導入し、複合対照
例を形成する。 −それらの蓋を付したプレートを３７℃で１時間３０分
インキュベートする。 −それらをＰＢＳ＋TWEEN ０．０５％中で４回洗浄す
る。 −１００μl の抗−ヒトIgG （ペルオキシダーゼ標識）
を選ばれた希釈率において各ウェル中に堆積し、３７℃
でインキュベートする。 −プレートを再び（ＰＢＳ＋TWEEN ）緩衝液で５回洗浄
する。それらを注意深く乾燥する。
【００５４】酵素反応の発現は、オルト−フェニレンジ
アミン基質（０．０３％のH2O2を含有するpH５．６のク
エン酸緩衝液中０．０５％）を用いて行う。 −１００μl の基質を各ウェル中に分配する。 −これらのプレートを暗室中に実験室温度において２０
分間放置する。 −読み取りは分光光度計（マイクロプレート用）上で４
９２ｎｍにおいて行う。ウィルスに対する抗体を含有す
るとみなされた血清は、０．３０以上のＯＤＤ（光学密
度差＝ウィルス抗原の光学密度−対照抗原の光学密度）
を与えたものである。
【００５５】この技術は定性的滴定並びに定量的滴定を
可能にするものである。この目的のために被測定血清の
数個の希釈液を用いることも、或いは血清の希釈液を同
一条件で試験されるある範囲の対照例と対比することも
可能である。
【００５６】下記に示す表は、上記に例示したＥＬＩＳ
Ａ測定法を用いて行ったＨＩＶ抗体の最初の血清学的検
討結果を与えるものである。
【００５７】
【表１】
【００５８】この表は、ＬＡＳを有する同性愛患者中に
おけるＨＩＶ抗体の高い罹患率、正常人における極めて
低い発病率及び現在健康な同性愛者におけるウィルス感
染の適度な広がりを明確に示している。後者の群におい
て、全ての陽性の個人は数多くの相手（毎年５０人を越
える）を有していた。ＨＴＬＶ抗体の発生率は３つの群
の全てにおいて極めて低かった［市販のＥＬＩＳＡ試験
試薬（Biotech ）を用いて測定］。ＡＩＤＳ患者の群
は、より理解することのできない結果を与えた。即ち、
ほぼ２０％がＨＩＶ抗体を有したが、血清の幾つかは疾
患の極めて遅い段階で採られたので、体液応答が否定さ
れた可能性がある。
【００５９】更に又、全てのＬＡＳ患者のリンパ球は必
ずしも検知可能のＨＩＶ型ウィルスを産生するものでは
ないと言うべきである。特に、さらに６人のＬＡＳ患者
からのリンパ節細胞を患者１について述べたと同様な培
養液に入れ、ウィルス産生を試験した。その結果、ＲＴ
活性により何等のウィルス放出も検出することができな
かった。しかしながら、第１の患者の血清によって認識
されたｐ２５蛋白質は、三つのその他の症例において、
35Ｓ−メチオニンで標識化されたＴ−細胞の細胞質抽出
物中には検出することができた。これは、その様な症例
における同様なウィルスの部分的発現を示唆する。更
に、これらの患者の全て（６／６）はＨＩＶｐ２５蛋白
質に対する抗体を有し、彼等が全て同様な或いは同一な
ウィルスに感染していたことを示した。
【００６０】興味深いことに、患者の１人（患者２）の
リンパ球においては、ＨＴＬＶ１に対して産生されたヤ
ギ抗血清を用いた場合に、弱いが、しかし特定の同一径
（ｐ２４〜ｐ２５）のバンドの免疫沈殿があった。同様
に、この患者の血清は、ＨＴＬＶ及びＨＩＶに対する抗
体を有し、いずれのウィルスにもよる二重感染を示唆す
る。その様な症例は、むしろめずらしいように思われ
る。
【００６１】本発明は、最後に又、特にｐ２５に対する
動物抗体又はモノクローナル抗体の産生のためのｐ２５
蛋白質を含有するＨＩＶ抽出物、或いは精製ｐ２５蛋白
質により形成することのできる生物学的試薬に用いられ
るものである。これらの抗体は、ＨＩＶウィルス或いは
ＨＩＶ関連ウィルスの抗原決定基を更に研究する際に有
用な手段となり得る。言語の容易性により、リンパ球の
ある下部集団或いは関連するモノクローナル抗体の命名
に関して用いられたＯＫＴ命名は、その所有者により登
録されていると否とを問わず、如何なる対応する商標の
有効性にも反するものではない。
【００６２】更に又、ウィルス抽出物、特にウィルスラ
イゼート或いは富化画分は又、菌株ＨＩＶ−１、ＩＤＡ
Ｖ１或いはＩＤＡＶ２から得ることのできるｐ２５蛋白
質を含有する抽出物或いは富化画分とのそれらの免疫学
的関連或いは類似性により定義することも可能である。
この様にＨＩＶ−１、ＩＤＡＶ１或いはＩＤＡＶ２の蛋
白質抽出物が同一血清と行うのと類似パターンの免疫学
的反応を与えることのできる任意の蛋白質画分の原料と
して用いられるウィルスは、それらのウィルスの等価物
と考えられなければならず、従って本発明の特許請求の
範囲に含まれるものである。同様な結論は、勿論その様
な等価の蛋白質抽出物を利用する診断手段（方法及びキ
ット）にも当てはまるものである。
【００６３】ＨＩＶ−１ウィルスは、“Collection Nat
ionale des Cultures de Micro-organismes ”（C.N.C.
M.) に番号Ｉ−２３２として１９８３年７月１５日に寄
託され、ＩＤＡＶ１及びＩＤＡＶ２は、C.N.C.M.に１９
８３年９月１５日にそれぞれ番号Ｉ−２４０及びＩ−２
４１として寄託された。本発明は、実質的に同一の免疫
学的特性を有する限り、上記寄託菌株の変異種（突然変
異種）或いは変種も含有するものである。
【図面の簡単な説明】
図１は、患者１からのウィルスについて行った分析の結
果を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 7/00 Ｃ１２Ｒ 1:92） (71)出願人 591057360 サントル・ナショナル・ド・ラ・ルシェル シュ・シアンティフィック ＣＥＮＴＲＥ ＮＡＴＩＯＮＡＬ ＤＥ ＬＡ ＲＥＣＨＥＲＣＨＥ ＳＣＩＥＮＴ ＩＦＩＱＵＥ フランス、75700 パリ、ケ・アナトー ル・フランス、15 (72)発明者 リユク・モンタニール フランス国、92350 ル・プレツシス− ロビンソン、リユー・ドウ・マラブリー 21 (72)発明者 ジヤン−クロード・シエルマン フランス国、78310 エランクール、クロ ー・ ドルガール ２ (72)発明者 フランソワ・バール−シヌツシ フランス国、92130 イツシ・レ・ムーリ ニユー、50 リユー・デルバン、ル・カー プリコーネ 104 (72)発明者 フランソワ・ベジネツト−ブラン フランス国、75005 パリ、ブールバー ル・ サン−ジエルマン 24 (72)発明者 クリステイン・ルージユ フランス国、75015 パリ、リユー・ド ウ・ ダンツイーク 21 (72)発明者 ビリー・ローゼンボーム フランス国、75011 パリ、パツサージ ユ・ ドウ・ラ・マン・ドール 11 (72)発明者 シヤルル・ドーゲー フランス国、75001 パリ、リユー・ジヤ ン− ジヤーク・ルソー 19 (72)発明者 ジヤークリーヌ・グリユスト フランス国、94240 ラエイ・レ・ローズ、 リユー・デユ・ゲ ６ (72)発明者 マリエ−テレーズ・ニユジエール フランス国、75015 パリ、リユー・ド ウ・ ラ・クロワ・ニベール 241 (72)発明者 フランソワ・レイ フランス国、75014 パリ、リユー・ドデ ツサ 10 (72)発明者 クローデイーヌ・アセラー−ブラン フランス国、75015 パリ、リユー・ルク ールベ 137 (72)発明者 ソランジユ・シヤマーレ フランス国、75015 パリ、リユー・ルク ールベ 324

Claims (3)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 以下の特徴を有するＴ−リンパ栄養的レ
    トロウイルスであるＨＩＶの精製単離されたレトロウイ
    ルス。 １）標的がヘルパーＴ−リンパ球である； ２）Ｍｇ2+イオンの存在を要求し、ポリ（アデニレー
    ト）−オリゴ（デオキシチミジレート）12-18 に強い親
    和性を示す逆転写酵素活性を有する； ３）ＨＴＬＶ−Ｉのｐ２４タンパク質と免疫学的に交差
    反応しないｐ２５タンパク質を含む； ４）ＨＴＬＶ−Ｉのｐ１９タンパク質と免疫学的に交差
    反応するタンパク質を含まない。
  2. 【請求項２】 平均直径４１nmのコアを有する請求項１
    のレトロウイルス。
  3. 【請求項３】 ショ糖勾配中で１．１６の密度を有する
    請求項１又は２のレトロウイルス。
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