BR122015032743B1 - Vírus atenuado de influenza de suínos geneticamente engenheirado, formulação imunogênica, formulação farmacêutica, seus usos e métodos para produzir uma vacina - Google Patents

Vírus atenuado de influenza de suínos geneticamente engenheirado, formulação imunogênica, formulação farmacêutica, seus usos e métodos para produzir uma vacina Download PDF

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Abstract

1/1 resumo “vírus atenuado de influenza de suínos, formulação imunogênica, formulação farmacêutica, métodos para imunizar ou induzir uma resposta imune em um porco, para tratar uma infecção por vírus de influenza de suínos em um porco, para tratar câncer em um porco, e para produzir uma formulação imunogênica, célula, linhagem de células de porco, e, ovo embrionado” a presente invenção refere-se, em geral, a vírus atenuados de influenza de suínos tendo uma capacidade afetada para antagonizar resposta a interferon celular (ifn), e ao uso destes vírus atenuados em vacinas e formulações farmacêuticas. em particular, a invenção refere-se a vírus atenuados de influenza de suínos tendo modificações para um gene ns1 de suínos que diminuem ou eliminam a capacidade do produto de gene ns1 de antagonizar a resposta ifn celular. estes vírus replicam in vivo, mas demonstram replicação diminuída, virulência e aumentada atenuação e, assim, são bem apropriados para uso em vacinas de vírus vivos, e formulações farmacêuticas.

Description

(54) Título: VÍRUS ATENUADO DE INFLUENZA DE SUÍNOS GENETICAMENTE ENGENHEIRADO, FORMULAÇÃO IMUNOGÊNICA, FORMULAÇÃO FARMACÊUTICA, SEUS USOS E MÉTODOS PARA PRODUZIR UMA VACINA (73) Titular: MOUNT SINAI SCHOOL OF MEDICINE OF NEW YORK UNIVERSITY. Endereço: ONE GUSTAVE L. LEVY PLACE, NEW YORK, NY 10029-6574, ESTADOS UNIDOS DA AMÉRICA(US); ST. JUDE CHILDREN'S RESEARCH HOSPITAL. Endereço: 332 NORTH LAUDERDALE STREET, MEMPHIS, TN 38105, ESTADOS UNIDOS DA AMÉRICA(US); THE UNITED STATES OF AMERICA AS REPRESENTED BY THE SECRETARY OF AGRICULTURE. Endereço: 1400 INDEPENCE AVENUE, WASHINGTON, DC 20250-0302, ESTADOS UNIDOS DA AMÉRICA(US) (72) Inventor: PETER PALESE; ADOLFO GARCIA-SASTRE; RICHARD J. WEBBY; JUERGEN A. RICHT; ROBERT WEBSTER; KELLY M. LAGER
Código de Controle: 2A7D28CFBE99100C 8A03362CD423FE77
Prazo de Validade: 10 (dez) anos contados a partir de 03/04/2018, observadas as condições legais
Expedida em: 03/04/2018
Assinado digitalmente por:
Júlio César Castelo Branco Reis Moreira
Diretor de Patente
1/132 “VÍRUS ATENUADO DE INFLUENZA DE SUÍNOS GENETICAMENTE ENGENHEIRADO, FORMULAÇÃO IMUNOGÊNICA, FORMULAÇÃO FARMACÊUTICA, SEUS USOS E MÉTODO PARA PRODUZIR UMA VACINA” [0001] Este pedido é um pedido dividido do pedido de patente de invenção PI 0511776-3 depositado em 01/06/2005.
[0002] Este pedido reivindica o benefício do pedido provisório US número 60/576.418, depositado em 1 de junho de 2004, que é incorporado aqui por referência em sua totabdade.
1. CAMPO DA INVENÇÃO [0003] A presente invenção se refere, em geral, a vírus atenuado de influenza de suínos tendo uma capacidade prejudicada de antagonizar a resposta de interferon celular (IFN), e o uso destes vírus atenuados em formulações farmacêuticas e vacinas. Em particular, a invenção se refere a vírus atenuado de influenza de suínos tendo modificações em um gene NS1 suíno que diminuem ou ebminam a capacidade de produto de gene NS1 de antagonizar a resposta IFN celular. Estes vírus repbcam in vivo, mas demonstram virulência diminuída e atenuação aumentada e, assim, são bem apropriados para uso em vacinas de vírus vivo, e formulações farmacêuticas.
2. FUNDAMENTOS
2.1 Vírus de influenza [0004] Famílias de vírus contendo RNA fita única envelopado do genoma sentido-negativo são classificados em grupos tendo genomas não segmentados (vírus de doenças paramixoviridae, rabdoviridae, filoviridae e boma) ou os tendo genomas segmentados (ortomixoviridae, buniaviridae e arenaviridae). A família ortomixoviridae, descrita em detalhes abaixo, e usada nos exemplos aqui, inclui os vírus de influenza, tipos de vírus A, B e C, assim como os vírus togoto e dori e vírus
Petição 870160027774, de 13/06/2016, pág. 20/67
2/132 infeccioso de anemia de salmão.
[0005] Os virions de influenza consistem de um núcleo de ribonucleoproteína interno (um nucleocapsídeo helicoidal) contendo o genoma de RNA fita única, e um envelope de lipoproteína externo forrado por dentro por uma proteína de matriz (M1). O genoma segmentado de vírus de influenza A consiste de oito moléculas (sete para influenza C) de RNAs fita única, polaridade negativa, lineares, que codificam onze polipeptídeos, incluindo: as proteínas de RNA polimerase dependentes de RNA (PB2, PB1 e PA) e nucleoproteína (NP) que formam o nucleocapsídeo; as proteínas de membrana de matriz (M1, M2); duas glicoproteínas de superfície que projetam do lipídeo contendo envelope: hemaglutinina (HA) e neuraminidase (NA); a proteína não estrutural (NS1), proteína de exportação nuclear (NEP); e o fator proapoptótico PB1-F2. Transcrição e replicação do genoma ocorrem no núcleo e a montagem ocorre via formação de brotos na membrana do plasma. Os vírus podem reagrupar genes durante infecções mistas.
[0006] O vírus de influenza adsorve via HA para sialiloligossacarídeo em glicoproteínas de membrana de célula e glicolipídeos. Seguindo endocitose do virion, uma mudança conformacional na molécula HA ocorre dentro do endossoma celular o que facilita a fusão da membrana, assim disparando o não revestimento. O nucleocapsídeo migra par o núcleo onde mRNA viral é transcrito. mRNA viral é transcrito por um mecanismo único em que endonuclease viral cliva o término 5’ terminado de mRNAs heterólogos celulares que então servem como iniciadores para transcrição de gabaritos de RNA viral pela transcriptase viral. Os transcritos terminam em sítios de 15 a 22 bases das extremidades de seus gabaritos, onde as oligo(U) seqüências atuam como sinais para a adição de tratos poly(A). Dentre as oito moléculas de RNA viral assim produzidas, seis são mensagens monocistrônicas que são traduzidas diretamente nas proteínas representando HA, NA, NP e as proteínas de polimerase viral, PB2, PB1 e PA. Os outros dois transcritos sofrem emendas, cada dando dois mRNAs que são traduzidos em diferentes matrizes de leitura para produzir M1, M2, NS1 e NEP. O segmento PB1 codifica uma segunda proteína, a proteína PB1-F2 não estrutural, por uso de um ATG alternativo. Em
3/132 outras palavras, os oito segmentos RNA viral codificam para onze proteínas: nove estruturais e duas não estruturais. Um sumário dos genes do vírus de influenza e seus produtos de proteína é mostrado na tabela 1 abaixo.
TABELA 1 - SEGMENTOS DE RNA DO GENOMA DE VÍRUS DE INFLUENZA E DESIGNAÇÕES DE CODIFICAÇÃO
TABELA I:
Segmento ComprimentOb (nucleotídeos) Polipeptídeoc codificado Comprimentod (aminoácidos) Moléculas por virion Comentários
componente
1 2341 PB2 759 30-60 transcriptase de RNA; componente transcriptase de RNA de ligação de terminação RNA de célula hospedeira:
2 2341 PB1 757 iniciação de transcrição
3 2233 PB1-F2 PA 87 716 30-60 fator proapoptótico componente transcriptase de RNA hemaglutinina; trímero; envelope
4 1778 HA 566 500 glicoproteína; fixação
5 1565 NP 498 1000 media células Nucleoproteína; associada com RNA; componente estrutural de transcriptase de RNA Neuraminidase; tetrâmero;
6 1413 NA 454 100 proteína de matriz de
7 1027 Μή 252 3000 glicoproteína envelope; linhagens dentro de envelope Proteína estrutural em
4/132
890 NSi 230 membrana de plasma;
mRNA emendado Proteína não estrutural; função não conhecida Proteína de exportação
NEP 121 ? nuclear; mRNA emendado a Adaptado de R. A. Lamb e P. W. Choppin (1983), Annual Review of Biochemistry, volume 52, 467 - 506. b Para cepa A/PR/8/34 c Determinado por abordagens bioquímicas e genéticas d Determinado por análise da seqüência de nucleotídeo e sequenciamento de proteína [0007] A patogenicidade de vírus de influenza é modulada por vírus múltiplos e fatores hospedeiros. Dentre os fatores hospedeiros que lutam contra infecções virais, o sistema de interferon tipo I (IFNoe/β) representa um mecanismo de defesa inato anti-viral poderoso que foi estabelecido relativamente prematuro na evolução de organismos eucarióticos (García-Sastre, 2002, Microbes Infect 4: 647 - 55). O sistema INFoe/β antiviral envolve três etapas principais: (i) detecção de infecção viral e secreção de IFNoe/β, (ii) ligação de IFNa/β para seus receptores e indução de transcrição de genes estimulados por INFa/β, e (iii) síntese de enzimas antiviral e proteínas. A maior parte dos vírus, no entanto, tem informação genética específica adquirida codificando as moléculas de antagonista INFoe/β, que eficazmente bloqueiam uma ou mais etapas do sistema IFNoe/β antiviral. Vírus de influenza A expressa uma proteína não estrutural em células infectadas, a proteína NS1 (descrita em detalhes, infra), que contra atua a resposta de INFa/β celular (GarcíaSastre etal., 1998, Virology 252: 324 - 30).
[0008] O genoma do vírus de influenza A contém oito segmentos de RNA fita única de polaridade negativa, codificando para duas proteínas não estruturais e nove estruturais. A proteína não estrutural NS1 é abundante em células infectadas de vírus de influenza, mas não foram detectadas em virions. NS1 é uma fosfoproteína encontrada no núcleo de modo prematuro durante a infecção e também no
5/132 citoplasma em momentos posteriores do ciclo viral (King et al., 1975, Virology 64: 378). Estudos com mutantes de influenza sensíveis a temperatura (ts) transportando lesões no gene NS sugerem que a proteína NS1 é um regulador transcripcional e pós transcripcional de mecanismos pelos quais o vírus é capaz de inibir a expressão de gene de célula hospedeira e estimular a síntese de proteína viral. Como muitas outras proteínas que regulam os processos pós-transcripcionais, a proteína NS1 interage com as seqüências de RNA específicas e estruturas. A proteína NS1 foi relatada para se ligar a diferentes espécies de RNA incluindo: vRNA, poli-A, U6 snRNA, região 5’ não traduzida como de mRNAs virais e ds RNA (Qiu et al., 1995, RNA 1: 304; Qiu et al., 1994, J. Virol. 68: 2425; Hatada Fukuda 1992, J Gen Virol. 73: 3325 - 9. Expressão da proteína NS1 de cDNA em células transfectadas foi associada com vários efeitos: inibição de transporte núcleo-citoplásmico de mRNA, inibição de emendas pré-mRNA, inibição de poliadenilação de mRNA hospedeiro e estimulação de tradução de mRNA viral (Fortes, et al., 1994, EMBO J. 13: 704; Enami etal., 1994, J. Virol. 68: 1432; de Ia Luna etal., 1995, J. Virol. 69: 2427; Lu et al., 1994, Genes Dev. 8: 1817; Park et al., 1995, J. Biol Chem. 270, 28433; Nemeroff et al., 1998, Mol. Cell. 1: 1991; Chen et al., 1994, EMBO J. 18: 2273 - 83). Em particular, a proteína NS1 tem três domínios que foram registrados como tendo um número de funções reguladoras durante a infecção por vírus de influenza. Os 73 aminoácidos amino-terminais são responsáveis pela ligação a RNAs (Qian et al., 1995, RNA 1: 948 - 956), particularmente RNAs fita dupla, conferindo ao vírus a capacidade de escapar da resposta de interferon α/β (Donelan et al., 2003, J. Virol. 77: 13257 - 66). A porção central da proteína interage com o fator de iniciação de tradução eucariótico 4GI facilitando a tradução preferencial de mRNAs viral sobre mRNAs hospedeiros (Aragon etal., 2000, Mol. Cell Biol. 20: 6259 - 6268). O término carbóxi ou o domínio efetuador foram mostrados como inibindo o processamento de mRNA hospedeiro, especificamente, inibição de poliadenilação de mRNA hospedeiro (Nemeroff etal., 1998, Mol. Cell 1: 991 - 1000), ligação a caudas poli(A) de mRNA inibindo a exportação nuclear (Qiu e Krug, 1994, J. Virol. 68: 2425 - 2432) e inibição de emenda pré-mRNA (Lu etal., 1994, Genes Dev. 8:1817 - 1828).
6/132 [0009] Estudos sobre o vírus de influenza recombinante humano faltando o gene NS1 (deINSI) mostraram que este vírus pode somente replicar em sistemas incompetentes para IFN, como células Vero ou camundongos STAT1-/-; assim a proteína NS1 é responsável pela atividade de antagonista IFN (García-Sastre et al., 1998, Virology 252: 324 - 330). Também, foi mostrado que os vírus de influenza humano com proteínas NS1 truncadas são atenuados em camundongos (Egorov et al., 1998, J. Virol. 72: 6437 - 6441) e fornecem proteção contra desafio tipo selvagem (Talon etal., 2000, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 97: 4309 - 4314).
2.2 Vírus de influenza de suíno [0010] Influenza de suíno (Sl) é uma doença respiratória aguda de porco causada por vírus de influenza tipo A. Sua severidade depende de muitos fatores, incluindo idade do hospedeiro, cepa do vírus, e infecções secundárias (Easterday, 1980, Philos Trans R Soc Lond B Biol Sei 288: 433 - 7). Vírus de influenza A são vírus de RNA fita negativa, segmentado, e podem ser isolados de várias outras espécies de hospedeiro animal, incluindo pássaros, humanos, cavalos, baleias, e vison. Apesar de vírus de influenza completos raramente cruzarem a barreira da espécie, os segmentos de genes podem cruzar esta barreira através do processo de reagrupamento genético, ou troca genética. Porque os porcos suportam a replicação de ambos os vírus de influenza A humano e aviário (Kida etal., 1994, J Gen Virol75: 2183 - 8), eles foram postulados como desempenhando um papel importante em transmissão inter-espécies por atuarem como um “ vaso de misturação” para o reagrupamento entre vírus específicos para diferentes espécies hospedeiras (Scholtissek, 1994, Eur J Epidemiol 10: 455 - 8). Isto pode levar à geração de novos vírus de influenza capazes de cruzar a barreira de espécies para humanos. Existem três subtipos de vírus Sl (SIV) atualmente circulando em porcos nos U.S.: H1N1, H3N2, e H1N2 (Olsen, 2002, Vírus Res 85: 199 - 210; Karasin et al., 2002, J Clin Microbiol40: 1073 - 9; Karasin etal., 2000, Vírus Res 68: 71 - 85; Olsen etal., 2000, Arch Virol 145: 1399 - 419; Webby et al., 2000, J Virol 74: 8243 - 51; Webby et al., 2001, Philos Trans R Soc Lond B Biol Sei 356: 1817 - 28; Zhou, 2000, Vet Microbiol 74: 47 - 58). Antes de 1998, foram isolados principalmente SIVs de H1N1 “clássicos”
7/132 de suínos nos Estados Unidos (Kida et al., 1994, J Gen Virol 75: 2183 - 8; Scholtissek, 1994, Eur J Epidemol 10: 455 - 8; Olsen et al., 2000, Arch Virol. 145: 1399 - 419). Em 1998, SIVs do subtipo H3N2 foram isolados em estados múltiplos nos Estados Unidos. Estes vírus foram gerados por reagrupamento entre vírus de suínos, humanos, aviários e clássicos, eles estavam sofrendo uma evolução rápida e geralmente causavam uma doença mais severa do que SIV H1N1 clássico.
[0011] Patogenicidade de vírus de influenza é modulada por vírus múltiplos e fatores de hospedeiros. Dentre os fatores de hospedeiros que lutam contra as infecções virais, o sistema de interferon tipo I (IFNa/β) representa um mecanismo de defesa inato antiviral poderoso que foi estabelecido relativamente prematuro na evolução de organismos eucarióticos (Garcia-Sastre, 2002, Microbes Infecta. 647 55). O sistema IFNa/β antiviral envolve três etapas principais: (i) detecção de infecção viral e secreção de IFNa/β, (ii) ligação de IFNoe/β para seus receptores e indução transcriptional de genes estimulados por IFNa/β, e (iii) síntese de enzimas e proteínas antivirais. Mais vírus, no entanto, tem informação genética específica adquirida codificando moléculas de antagonista IFNa/β, que eficazmente bloqueiam uma ou mais etapas do sistema antiviral IFNa/β. Vírus de influenza A expressam uma proteína não estrutural em células infectadas, a proteína NS1, que contra atua a resposta de IFNa/β celular (Garcia-Sastre etal., 1998, Virology 252·. 324 - 30). [0012] A infecção por influenza em porcos foi primeiro registrada em 1918 e os primeiros vírus de influenza de suínos foram isolados de porcos em 1930 (Shope, R. E., 1931, J. Exp. Med. 54: 373 - 385). Estes primeiros isolados foram os progenitores do que foi reconhecido como a linhagem H1N1 de vírus de influenza A de suínos. De 1930 até 1990, a influenza nos porcos da América do Norte era causada quase que exclusivamente por infecção com vírus de suínos H1N1. Uma mudança dramática no padrão de influenza de suínos começou por volta de 1997, quando um aumento inesperado e substancial em soropositividade para H3 (8%) foi detectada e os vírus H3N2 começaram a ser isolados de porcos tanto nos Estados Unidos como no Canadá (Olsen et al., 2000, Arch. Virol. 134: 1399 - 1419). Além disso, o reagrupamento entre vírus H3N2 e vírus de suínos H1N1 resultou na detecção de
8/132 vírus reagrupados H1N2 de segunda geração (Karasin etal., 2000, J. Clin. Microbiol. 38: 2453 - 2456; Karasin etal., 2002, J. Clin Microbiol. 40: 1073 - 1079). Além disso, os vírus H4N6 de aves de origem de patos foram isolados de poros no Canadá (Karasin et al., 2000, J. Virol. 74: 9322 - 9327). A geração destes novos vírus além das variantes flutuantes antigênicas descritas de vírus de influenza de suínos H1N1 introduziu implicações para a saúde pública veterinária e humana em potencial. [0013] Em 1998, uma nova cepa de vírus de influenza de suínos ao qual os porcos tinham uma pequena imunidade tornou doente cada suíno em uma operação incluindo 2400 animais. Apesar de se ter somente um subtipo de influenza que infectou os porcos na América do Norte deste 1930, nos últimos anos recentes uma rápida sucessão de novos vírus de gripe está assolando os 100 milhões de porcos da América do Norte. Após anos de estabilidade, o vírus de gripe de suínos da América do Norte pulou em uma trilha rápida evolucionária, criando variantes a cada ano. Isto teve não apenas um efeito indesejado na indústria de criação de animais como também um impacto econômico negativo, mas também está preocupando os especialistas de que a evolução da gripe dos suínos aumenta a possibilidade de que um novo vírus irá surgir que é transmissível entre humanos. Felizmente, as novas cepas de porcos que tem aparecido na América do Norte até agora não pareceu infectar prontamente os humanos.
2.3. Vírus atenuados [0014] As vacinas de vírus atenuado são preparadas por “morte” do patógeno viral, por exemplo, por tratamento com calor ou formalina, de modo que ele não é capaz de replicação. As vacinas inativas tem uma utilidade limitada porque não provêem uma imunidade de longo prazo e, assim, fornecem uma proteção limitada. Uma abordagem alternativa para produzir vacinas de vírus envolve o uso de vacinas de vírus atenuado vivo. Os vírus atenuados são capazes de replicação mas não são patogênicos e, assim, provêem uma imunidade de duração mais longa e fornecem uma maior proteção. No entanto, os métodos convencionais para produzir vírus atenuados envolve a oportunidade de isolar mutantes na faixa de hospedeiro, muitos dos quais são sensíveis a temperatura, por exemplo, o vírus é passado através de
9/132 hospedeiros não naturais, e os vírus de progênie, que são imunogênicos, ainda não patogênicos, são selecionados.
[0015] Um substrato convencional para isolar e cultivar vírus de influenza para fins de vacina são os ovos de galinha embrionados. Os vírus de influenza são tipicamente cultivados durante 2-4 dias a 37 °C em ovos com 10-12 dias de idade. Apesar da maior parte dos isolados primários humanos de vírus de influenza A e B crescerem melhor no saco amniótico dos embriões, após 2 a 3 passagens o vírus se torna adaptado para crescer nas células da cavidade alantóica, que é acessível do exterior do ovo (Murphy, B. R., e R. G. Webster, 1996. Orthomyxovíruses pp. 1397 1445. In Fields Virology, Lippincott-Raven P.A.).
[0016] A tecnologia de DNA recombinante e técnicas de engenharia genética, em teoria, devem fornecer uma abordagem superior à produção de vírus atenuado porque mutações específicas podem ser engenheiradas de modo deliberado no genoma viral. No entanto, as alterações genéticas requeridas para atenuação de vírus não são conhecidas ou previsíveis. Geralmente, as tentativas para usar tecnologia de DNA recombinante para engenheirar vacinas virais tem sido principalmente dirigidas para a produção de vacinas de subunidades que contém somente as subunidades de proteína do patógeno envolvido na resposta imune, expressada em vetores virais recombinantes como vírus de vacínia ou baculovírus. Mais recentemente, técnicas de DNA recombinantes foram utilizadas em uma tentativa para produzir mutantes de deleção de herpesvírus ou poliovírus que imitam vírus atenuados encontrados na natureza ou mutantes da faixa hospedeiro conhecidos. Até 1990, os vírus RNA fita negativa não foram conduzidos à manipulação específica para o sítio de todo e, assim, não puderam ser geneticamente engenheirados.
[0017] Apesar de estes vírus serem benéficos porque eles são imunogênicos e não patogênicos, eles são difíceis de propagar em substratos convencionais com o fim de fabricar vacinas. Além disso, os vírus atenuados podem possuir características de virulência que são tão suaves de modo a não permitir ao hospedeiro montar uma resposta imune suficiente para atender aos desafios
10/132 subseqüentes.
[0018] Os vírus de influenza humanos não replicam de modo efetivo em pássaros, e vice-versa, devido às diferenças em receptores que ligam os vírus. Em contraste, os porcos são singularmente susceptíveis à infecção com vírus humanos e aviários porque eles possuem tipos de receptor presentes tanto em vírus de influenza aviários como em humanos. Como resultado, formulou-se a hipótese de que os porcos são os hospedeiros de “vasos de misturação” para o reagrupamento de vírus humano-aviário e se tem um suporte para esta teoria a partir de vários estudos. Ver, por exemplo, Shu et al., 1994, Virology 202: 825 - 33; Scholtissek, 1990, Med. Principies Pract. 2: 65-71; Zhou et al., 1999 J Virol. 73: 8851 - 6. Esta misturação facilita a geração de cepas de vírus de influenza humanos novos e a iniciação de uma pandemia de influenza.
[0019] As preparações de vírus de influenza inativados ou “mortos” são as únicas vacinas para influenza atualmente licenciadas nos Estados Unidos. Uma abordagem alternativa para produzir as vacinas de vírus para as vacinas de vírus inativado em que o patógeno viral é “morto”, envolve o uso de vacinas de vírus vivo atenuado que são capazes de replicação mas não são patogênicas. As vacinas vivas que são administradas intranasalmente podem ter vantagens sobre suas contra-partes inativadas. Primeiro, as vacinas vivas induzem, como se pensa, uma melhorada citotoxicidade mediada por célula reativa-cruzada, assim como uma resposta de anticorpo humoral, provendo uma melhor proteção do que as vacinas inativadas.(Gorse e Belshe, 1990, J. Clin. Microbiol. 28: 2539 - 2550; e Gorse et al., 1995, J. Infect. Dis. 172: 1 - 10). Em segundo lugar, as vacinas vivas também tem a vantagem de administração intranasal que evita o intumescimento e dor muscular ocasionalmente associados com a administração intramuscular de vacinas com adjuvantes inativadas. Estas vacinas vivas foram registradas como induzindo não somente respostas humorais contra o vírus de influenza homotípico mas também citotoxicidade mediada por células reativas cruzadas. Outras vantagens das vacinas vivas incluem o caso de administração intranasal, indução de imunidade mucosal, imunidade de duração mais longa, e sua eficácia de custo. Estas são todas as
11/132 considerações importantes com relação a vacinas para influenza de suínos em potencial.
[0020] Assim, são necessárias vacinas e formulações imunogênicas novas e mais eficazes para prevenir as infecções provocadas pelo vírus de influenza de suínos geradas por tal tecnologia.
3. SUMÁRIO DA INVENÇÃO [0021] A presente invenção proporciona vírus atenuado de influenza de suínos tendo uma capacidade prejudicada para antagonizar a resposta de interferon celular (IFN), métodos para produzir estes vírus atenuados de influenza de suínos, e o uso destes vírus em vacinas e formulações farmacêuticas. Estes vírus são capazes de gerar uma resposta imune e criar imunidade mas não causar doença ou causar febre e/ou sintomas menos severos, isto é, os vírus tem uma virulência diminuída. Assim, eles são candidatos ideais para vacinas de vírus vivos. Além disso, os vírus atenuados podem induzir uma resposta a IFN robusta, que tem outras conseqüências biológicas in vivo, dando proteção contra subseqüentes doenças infecciosas e/ou induzindo respostas anti-tumorais. Assim, os vírus atenuados podem ser usados farmaceuticamente, para a prevenção ou tratamento de outras doenças infecciosas e/ou doenças tratáveis por IFN.
[0022] A invenção é baseada em parte, na verificação dos requerentes de que os vírus de influenza de suínos engenheirados para conter ou contendo uma deleção (s) no gene NS1 tem uma replicação prejudicada com relação aos vírus de influenza de suínos de tipo selvagem como demonstrado por menos lesões no pulmão quando da infecção de porcos, reduzidos títulos virais em fluido de lavagem broncoalveolar (BALF) e reduzida detecção de vírus em esfregaços nasais. Surpreendentemente, e contrário aos resultados vistos com vírus de influenza humano em modelos de camundongos, o comprimento da proteína NS1 não está correlacionado com o nível de atenuação do vírus de influenza de suínos. Os requerentes verificaram que com a influenza de suínos, um vírus mutante com a proteína NS1 mais curta é o menos atenuado. Em outras palavras, os vírus de influenza de suínos contendo deleções mais curtas no gene NS1 demonstram uma maior atenuação in vivo do que os vírus
12/132 de influenza de suínos contendo deleções mais longas em seu gene NS1, ou vírus de influenza de suínos de tipo selvagem. Os requerentes ainda verificaram que os vírus de influenza de suínos recombinantes são prejudicados em sua capacidade de inibir a produção de IFN in vivo, e eles não replicam tão eficientemente como a cepa recombinante parental em ovos de galinha embrionados de 10 dias de idade, em células MDCK, em células PK-15 ou em um modelo de porco in vivo. Apesar de não se desejar limitar por qualquer teoria ou explicação para o mecanismo de ação dos mutantes de deleção de NS1 de vírus de influenza de suínos in vivo, os aspectos atenuados destes vírus são provavelmente devido a seus níveis de expressão de proteína NS1, sua capacidade de induzir uma resposta de IFN celular robusta, e sua capacidade prejudicada para antagonizar esta resposta. No entanto, os aspectos benéficos destes vírus podem não ser apenas atribuíveis a seu efeito sobre a resposta de interferon celular. De fato, alterações em outras atividades associadas com NS1, como alteração de emenda pré-mRNA, inibição de poliadenilação de mRNA celular, transporte nucleocitoplásmico de mRNA contendo poli(A), e estímulo de síntese de proteína viral, podem contribuir para o fenótipo atenuado desejado obtido pela introdução de mutações no gene NS1 de vírus de influenza de suínos. [0023] Um vírus de influenza de suínos atenuado da presente invenção compreende uma mutação no gene NS1 de influenza de suínos, que diminui a capacidade de produto de gene NS1 de antagonizar a resposta de interferon celular. Em uma forma de realização, um vírus de influenza de suínos atenuado da invenção compreende um genoma compreendendo uma mutação em gene NS1 de vírus de influenza de suínos que diminui a capacidade do produto de gene NS1 de antagonizar uma resposta de interferon celular, e permite ao vírus atenuado, em uma multiplicidade de infecção (MOI) de entre 0,0005 e 0,001, 0,001 e 0,01, 0,01 e 0,1, ou 0,1 e 1, ou um MOI de 0,0005, 0,0007, 0,001,0,005, 0,01,0,05, 0,1,0,5, 1,0,
1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, ou 6,0, crescer a títulos entre aproximadamente 1 a aproximadamente 100 vezes, aproximadamente 5 a aproximadamente 80 vezes, aproximadamente 20 a aproximadamente 80 vezes, ou aproximadamente 40 a aproximadamente 80 vezes, aproximadamente 1 a
13/132 aproximadamente 10 vezes, aproximadamente 1 a aproximadamente 5 vezes, aproximadamente 1 a aproximadamente 4 vezes, aproximadamente 1 a aproximadamente 3 vezes, aproximadamente 1 a aproximadamente 2 vezes, aproximadamente 3 a aproximadamente 15 vezes, ou aproximadamente 1,2, 3, 4, 5,
6, 7, 8, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 ou 100 vezes menores do que o vírus de influenza de suínos de tipo selvagem em células (por exemplo células de um humano (por exemplo, PerC6, uma linhagem de células produtoras derivadas de retinoblastos embriônicos humanos transformados com a região E1 de adenovírus 5), camundongo, galinha, (por exemplo, fibroblastos de embrião de galinha), rato, pássaros, ou porco (por exemplo, células PK(D1), células PK(15), células PK13, células NSK, células LLC-PK1, células LLC-PK1A, células ESK-4, células ST, células PT-K75, células PK-2a/CL 13 ou SJPL)), como determinado em aproximadamente 2 a 10 dias, 3 a 7 dias, 3 a 5 dias, ou 2, 3, 4, 5, 6,
7, 8,9, 10 dias após a infecção quando propagados sob as mesmas condições. Os títulos de vírus de influenza de suínos atenuado e de tipo selvagem podem ser determinados usando qualquer técnica bem conhecida na técnica ou descrita aqui (por exemplo testes de hemaglutinação, testes de placas, dose infecciosa de cultura de tecido 50 (TCID50), dose infecciosa de ovo 50 (EID50), etc.) e os vírus podem ser propagados sob condições descritas aqui ou bem conhecidas na técnica (por exemplo, em células de porco, células MDCK (por exemplo, em MEM, 10% p/p de soro de bezerro fetal (FCS), 1% de penicilina/estreptomicina a 37 °C em um incubador umidificado de CO2 a 5%), ou ovos de galinha embrionados (por exemplo, em um incubador estacionário a 37 °C com 55% de umidade relativa). Alternativamente, os vírus podem ser propagados em células (por exemplo, em células de porco, células MDCK, etc.) que são cultivadas em meio isento de soro ou reduzido em soro (por exemplo, tripsina TPCK).
[0024] Em uma forma de realização específica, um vírus atenuado de influenza de suínos da invenção compreende um genoma compreendendo uma mutação no gene NS1 de vírus de influenza de suínos que diminui a capacidade do produto de gene NS1 de antagonizar uma resposta de interferon celular, e permite ao vírus
14/132 atenuado, em uma multiplicidade de infecção (MOI) de entre 0,0005 e 0,001,0,001 e 0,01,0,01 e 0,1, ou 0,1 e 1, ou um MOI de 0,0005, 0,0007, 0,001,0,005, 0,01,0,05, 0,1, 0,5, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, ou 6,0, crescer a títulos entre aproximadamente 1 a aproximadamente 100 vezes, aproximadamente 5 a aproximadamente 80 vezes, aproximadamente 20 a aproximadamente 80 vezes, ou aproximadamente 40 a aproximadamente 80 vezes, aproximadamente 1 a aproximadamente 10 vezes, aproximadamente 1 a aproximadamente 5 vezes, aproximadamente 1 a aproximadamente 4 vezes, aproximadamente 1 a aproximadamente 3 vezes, aproximadamente 1 a aproximadamente 2 vezes, aproximadamente 3 a aproximadamente 15 vezes, ou aproximadamente 1,2, 3, 4, 5,
6, 7, 8, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 ou 100 vezes menores do que o vírus de influenza de suínos de tipo selvagem em células (por exemplo, células de um humano (por exemplo, PerC6, uma linhagem de células produtoras derivadas de retinoblastos embriônicos humanos transformados com a região E1 de adenovírus 5), camundongo, galinhas (por exemplo, fibroblastos de embrião de galinha), rato, pássaros, ou porco (por exemplo, células PK(D1), células PK(15), células PK13, células NSK, células LLC-PK1, células LLC-PK1A, células ESK-4, células ST, células PT-K75, células PK-2a/CL 13 ou SJPL)), como determinado a aproximadamente 2 a 10 dias, 3 a 7 dias, 3 a 5 dias, ou 2, 3, 4, 5, 6,
7, 8,9, 10 dias após a infecção quando propagado sob as mesmas condições. Os títulos de vírus de influenza de suínos atenuado e tipo selvagem podem ser determinados usando qualquer técnica bem conhecida na técnica ou aqui descrito (por exemplo, testes de hemaglutinação, testes de placas), etc e os vírus podem ser propagados sob condições descritas aqui ou bem conhecidas na técnica (por exemplo, em células de porco, células MDCK (por exemplo, em MEM, 10% p/p de soro bezerro fetal (FCS), 1% de penicilina/ estreptomicina a 37 °C em um incubador umedecido CO2 a 5%), ou ovos de galinha embrionados (por exemplo, em um incubador estacionário a 37 °C com 55% de umidade relativa).
[0025] Os vírus de influenza de suínos usados de acordo com a invenção podem ser selecionados dentre cepas de ocorrência natural, variantes ou mutantes; vírus
15/132 mutagenizados (por exemplo vírus gerados por exposição à mutagenes, passagens repetidas e/ou passagem em hospedeiros não permissivos), vírus reagrupantes e/ou vírus geneticamente engenheirados (por exemplo, usando “genética reversa” e técnicas de base em plasmídeo isento de auxiliar), tendo o fenótipo desejado - isto é, uma capacidade prejudicada para antagonizar a resposta de IFN celular. As cepas de vírus de ocorrência natural, variantes ou mutantes, reagrupantes e/ou geneticamente engenheirados com o desejado fenótipo de antagonista de interferon podem ser selecionadas com base em crescimento diferencial em células (por exemplo, células de um humano (por exemplo, PerC6, uma linhagem de células produtoras derivadas de retinoblastos embriônicos humanos transformados com a região E1 de adenovírus 5), camundongo, galinha (por exemplo, fibroblastos de embrião de galinha), rato, pássaros, ou porco (por exemplo, células PK(D1), células PK(15), células PK13, células NSK, células LLC-PK1, células LLC-PK1A, células ESK-4, células ST, células PT-K75, células PK-2a/CL 13 ou SJPL)), em outros testes descritos abaixo. Em algumas formas de realização, o vírus de influenza de suínos da invenção são vírus geneticamente engenheirados. Em outras formas de realização, o vírus de influenza de suínos da invenção não são cepas de ocorrência natural, variantes ou mutantes, reagrupantes.
[0026] Em uma forma de realização específica, um vírus atenuado de influenza de suínos da invenção compreende um genoma compreendendo uma mutação em um gene NS1 de vírus de influenza de suínos que diminui a capacidade do produto de gene NS1 de antagonizar uma resposta de interferon celular, e permite ao vírus atenuado, em uma multiplicidade de infecção (MOI) de entre 0,0005 e 0,001,0,001 e 0,01,0,01 e 0,1, ou 0,1 e 1, ou um MOI de 0,0005, 0,0007, 0,001,0,005, 0,01,0,05, 0,1, 0,5, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, ou 6,0, crescer a títulos entre aproximadamente 1 a aproximadamente 100 vezes, aproximadamente 5 a aproximadamente 80 vezes, aproximadamente 20 a aproximadamente 80 vezes, ou aproximadamente 40 a aproximadamente 80 vezes, aproximadamente 1 a aproximadamente 10 vezes, aproximadamente 1 a aproximadamente 5 vezes, aproximadamente 1 a aproximadamente 4 vezes, aproximadamente 1 a
16/132 aproximadamente 3 vezes, aproximadamente 1 a aproximadamente 2 vezes, aproximadamente 3 a aproximadamente 15 vezes, ou aproximadamente 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 ou 100 vezes menores do que o vírus de influenza de suínos de tipo selvagem em células (por exemplo células de um humano (por exemplo, PerC6, uma linhagem de células produtoras derivadas de retinoblastos embriônicos humanos transformados com a região E1 de adenovírus 5), camundongo, galinha, (por exemplo, fibroblastos de embrião de galinha), rato, pássaros, ou porco (por exemplo, células PK(D1), células PK(15), células PK13, células NSK, células LLC-PK1, células LLC-PK1A, células ESK-4, células ST, células PT-K75, células PK-2a/CL 13 ou SJPL)) como determinado por um teste de hemaglutinação de BALF de porcos ou sobrenadantes de células de porco aproximadamente 2 a 10 dias, 3 a 7 dias, 3 a 5 dias, ou 2, 3, 5, 6, 7, 8,9, 10 dias após a infecção ou quando os vírus são colocados em placas em células de rim canino Madin-Darby (MDCK). Em uma forma de realização, o crescimento de um vírus atenuado de influenza de suínos da invenção é comparado a um padrão ou referência particular, por exemplo, vírus de influenza de suínos de tipo selvagem A/Swine/Texas/4199-2/98. De acordo com estas formas de realização, o vírus atenuado pode ser geneticamente engenheirado para conter ou expressar seqüências de ácido nucleico de vírus de influenza não suíno como, por exemplo, um epítopo de um patógeno estranho ou um antígeno de tumor. Preferivelmente, as seqüências de vírus de influenza não suíno não incluem uma seqüência de ácido nucleico que altera o fenótipo atenuado do vírus. Assim, as seqüências de ácido nucleico codificando proteínas, polipeptídeos ou peptídeos com atividade antagonizante de interferon não são preferivelmente engenheirados em um vírus de influenza de suínos.
[0027] A invenção proporciona vírus atenuados de influenza de suínos compreendendo um genoma compreendendo pelo menos duas, pelo menos três, pelo menos quatro ou mais mutações em dois, três, quatro ou mais genes de vírus de influenza de suínos, em que pelo menos uma das mutações ocorre no gene NS1 e contribui ou é responsável (diretamente ou indiretamente) para a atenuação do
17/132 vírus e/ou a capacidade diminuída do vírus de antagonizar uma resposta de interferon celular. Em uma forma de realização, um vírus atenuado de influenza de suínos da invenção compreende um genoma compreendendo pelo menos duas, pelo menos três, pelo menos quatro ou mais mutações em dois, três, quatro ou mais genes de vírus de influenza de suínos, em que pelo menos uma das mutações ocorre no gene NS1 e é responsável para a capacidade diminuída do produto de gene NS1 de antagonizar uma resposta de interferon celular, e permite ao vírus atenuado, em um MOI de entre 0,0005 e 0,001,0,001 e 0,01,0,01 e 0,1, ou 0,1 e 1, ou um MOI de 0,0005, 0,0007, 0,001, 0,005, 0,01, 0,05, 0,1, 0,5, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, ou 6,0, crescer a títulos entre aproximadamente 1 a aproximadamente 100 vezes, aproximadamente 5 a aproximadamente 80 vezes, aproximadamente 20 a aproximadamente 80 vezes, ou aproximadamente 40 a aproximadamente 80 vezes, aproximadamente 1 a aproximadamente 10 vezes, aproximadamente 1 a aproximadamente 5 vezes, aproximadamente 1 a aproximadamente 4 vezes, aproximadamente 1 a aproximadamente 3 vezes, aproximadamente 1 a aproximadamente 2 vezes, aproximadamente 3 a aproximadamente 15 vezes ou aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 ou 100 vezes menores do que o vírus de influenza de suínos de tipo selvagem em células (por exemplo células de um humano (por exemplo, PerC6, uma linhagem de células produtoras derivadas de retinoblastos embriônicos humanos transformados com a região E1 de adenovírus 5), camundongo, galinha, (por exemplo, fibroblastos de embrião de galinha), rato, pássaros, ou porco (por exemplo, células PK(D1), células PK(15), células PK13, células NSK, células LLC-PK1, células LLC-PK1A, células ESK-4, células ST, células PT-K75, células PK-2a/CL 13 ou SJPL)), como determinado por, por exemplo, testes de hemaglutinação, aproximadamente de 2 a 10 dias, 3 a 7 dias, 3 a 5 dias, ou 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9, 10 dias após a infecção ou quando os vírus são propagados sob as mesmas condições.
[0028] Em uma forma de realização específica, um vírus atenuado de influenza de suínos da invenção compreende um genoma compreendendo pelo menos duas,
18/132 pelo menos três, pelo menos quatro ou mais mutações em dois, três, quatro ou mais genes de vírus de influenza de suínos, em que pelo menos uma das mutações ocorre no gene NS1 e é responsável para a capacidade diminuída do produto de gene NS1 de antagonizar uma resposta de interferon celular, e permite ao vírus atenuado, em um MOI de entre 0,0005 e 0,001,0,001 e 0,01,0,01 e 0,1, ou 0,1 e 1, ou um MOI de 0,0005, 0,0007, 0,001, 0,005, 0,01, 0,05, 0,1, 0,5, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, ou 6,0, crescer a títulos entre aproximadamente 1 a aproximadamente 100 vezes, aproximadamente 5 a aproximadamente 80 vezes, aproximadamente 20 a aproximadamente 80 vezes, ou aproximadamente 40 a aproximadamente 80 vezes, aproximadamente 1 a aproximadamente 10 vezes, aproximadamente 1 a aproximadamente 5 vezes, aproximadamente 1 a aproximadamente 4 vezes, aproximadamente 1 a aproximadamente 3 vezes, aproximadamente 1 a aproximadamente 2 vezes, aproximadamente 3 a aproximadamente 15 vezes ou aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 ou 100 vezes menores do que o vírus de influenza de suínos de tipo selvagem em células de porco, como determinado por, por exemplo, testes de hemaglutinação, aproximadamente 2 a 10 dias, 3 a 7 dias, 3 a 5 dias, ou 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9, 10 dias após a infecção ou quando os vírus são propagados sob as mesmas condições (por exemplo, em células MDCK). Em outra forma de realização, um vírus atenuado de influenza de suínos da invenção compreende um genoma compreendendo pelo menos duas, três, quatro ou mais mutações em dois, três, quatro ou mais genes de vírus de influenza de suínos, em que pelo menos uma das mutações ocorre no gene NS1 e é responsável pela atenuação do vírus, e permite ao vírus atenuado, em um MOI de entre 0,0005 e 0,001, 0,001 e 0,01, 0,01 e 0,1, ou 0,1 e 1, ou um MOI de 0,0005, 0,0007, 0,001,
0,005, 0,01, 0,05, 0,1, 0,5, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, ou 6,0, crescer a títulos de entre aproximadamente 1 a aproximadamente 100 vezes, aproximadamente 5 a aproximadamente 80 vezes, aproximadamente 20 a aproximadamente 80 vezes, ou aproximadamente 40 a aproximadamente 80 vezes, aproximadamente 1 a aproximadamente 10 vezes, aproximadamente 1 a
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Aproximadamente 5 vezes, aproximadamente 1 a aproximadamente 4 vezes, aproximadamente 1 a aproximadamente 3 vezes, aproximadamente 1 a aproximadamente 2 vezes, aproximadamente 3 a aproximadamente 15 vezes ou aproximadamente 1,2,3,4,5,6,7,8,9, 10,15,20,25,30,35,40,45,50,55,60,65,70,75,80,85,90,95 ou 100 vezes menores do que o vírus de influenza de sumos de tipo selvagem em células de pxroo, como determinado por, per exemplo, testes de hemaglutinaçãD, aproximadamente 2 a 10 dias, 3 a 7 dias, 3 a 5 dias, ou 2,3, 5,6,7,8,9,10 dias após a infecção quando os vírus são propagados sob as mesmas condições (por exemplo, em células MDCK). De acordo com estas formas de realização, o vírus atenuado tem um fenótipo de antagonista de interferon prejudicado e pode ser geneticamente engenheirado para conter ou exprossar sequências de ácido nucleico de vírus de influenza não suíno, como, per exemplo, um epítopo de um patógeno estranho (por exemplo, epítopos de vírus de smdrome respiratória e reprodutiva de porcinos, dtomegalo vírus porcino, vírus corona respiratório porcino, vírus enceíàlomiocardite porcina, diarréia epidêmica pxroina, e incluindo, mas não limitados da Brucella suis, e pjarasitas, incluindo, mas não limitados a ascaris (Ascaris suurri), nemtaóides (Trichuris suis), ou um antígeno de tumor como antígeno carcinoemhriônico (CEA), antígeno de câncar de mama como EGFR (receptor de fator de crescimento epidérmico), antígeno HER2 (pl85HIK2), epítopo HER2 neu, antígeno-50 de câncer (CA-50), antígeno de câncer 15-3 (CA15-3) associado com câncer de mama, antígeno associado a carcinoma (CAA), antígeno de melanoma, e antígenos associados a melanoma 100,25 e 150). Preferivelmente, as sequências de vírus de influenza não sumo (sequências heterólogas) não incluem uma sequência de ácido nucleico que altera o fenótipo atenuado do vírus. Assim, as sequências de ácido nucleico codificando proteínas, polipeptídeos ou peptídeos com atividade antagonizante de interferon preferivelmente não são engenheirados no vírus de influenza de suínos.
As mutações no gene NS1 de vírus de influenza de sumos compreendem (altemativamente, consistem de) qualquer mutação que resulta no fenótipo desejado (isto é, uma capacidade prejudicada piara antagonizar uma resposta de interferon celular). Exemplos do tipo de mutações que podam ser incluídos em ou introduzidos em um gene NS1 de vírus de
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20/132 influenza de sumos incluem, mas não são limitados a deleções, substituições, inserções e combinações dos mesmos. Uma ou mais mutações podem estar localizadas em qualquer lugar através do gene NS1, isto é, nas regiões regulatórias, não codificando e/ou codificando (por exemplo, o término amino e/ou o término carbóxi ou em algum ponto entre os mesmos). Em uma forma de realização específica, um vírus atenuado de influenza de suínos da invenção compreende um genoma compreendendo um gene NS1 de vírus de influenza de suínos com uma mutação (por exemplo, uma deleção ou substituição) no término amino. Em uma forma de realização preferida, um vírus atenuado de influenza de suínos da invenção compreende um genoma compreendendo um gene NS 1 de vírus de influenza de suínos com uma mutação (por exemplo, uma deleção ou substituição, preferivelmente uma deleção) no término carbóxi. Em outra forma de realização, um vírus atenuado de influenza de suínos da invenção compreende um genoma compreendendo uma mutação em um gene NS1 de vírus de influenza de suínos resultando em uma deleção consistindo de 5, preferivelmente 10,15,20,25,30,35,40,45,50, 55,60,65,70,75,80,85,90,91,92,93,94,95,100,105,110,115,119,120,121,125,130,135, 140,145,146,147,148,150,155,160,165,170 ou 175 resíduos de arrrinoáddos de término carbóxi de NS1, ou uma deleção entre 5-170,25-170,50-170,100-170,90-160,100-160 ou 105-160,90-150,5-75,5-50 ou 5-25 resíduos de aminoácidos de término carbóxi. Em outra forma de realização, um vírus atenuado de influenza de suínos da invenção compreende um genoma compreendendo uma mutação em um gene NS1 de vírus de influenza de suínos resultando em uma deleção de todos resíduos de arrrinoáddos do produto de gene NS1 exceto os resíduos de arrrinoáddos 1-126, resíduos de arrrinoáddos 1-120, resíduos de arrrinoáddos 1115, resíduos de arrrinoáddos 1-110, resíduos de arrrinoáddos 1-100, resíduos de arrrinoáddos
1-99, resíduos de arrrinoáddos 1-95, resíduos de arrrinoáddos 1-85, resíduos de arrrinoáddos 180, resíduos de arrrinoáddos 1-75, resíduos de arrrinoáddos 1-73, resíduos de arrrinoáddos 1-70, resíduos de arrrinoáddos 1-65 ou resíduos de arrrinoáddo 1-60, em que o arrrinoáddo terminal é o número 1. De acordo com estas formas de realização, o vírus atenuado de influenza de suínos é preferivelmente geneticamente engenhdiado. Em modalidades específicas, fomeddas aqui, é um vírus de influenza de sumos geneticamente engenhdiado A/Swme/Texas/4199-2/98 tendo
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21/132 um fenótipo antagonista de interferon alterado, em que o vírus compreende um gene NSI do vírus de influenza de sumos A/Swme/Texas/4199-2/98 com uma mutação resultando em uma proteína NSI de SEQ ID NO: 20, em que o gene NSI confere um fenótipo antagonista de interferon alterado. Em uma forma de realização preferida, um vírus atenuado de influenza de suínos da invenção é ΤΧ/98/del 126, ΤΧ/98/del 99 ou ΤΧ/98/del 73.
[00029] O vírus atenuado de influenza de suínos da presente invenção pode ser um vírus quimérico que expressa uma sequência heteróloga. Preferivelmente, a sequência heteróloga não é uma sequência de áddo nucldco que altera, o fenótipo atenuado do vírus. Consequentemente, preferivelmente, sequências de áddo nucleico codificando proteínas, polipeptídeos ou peptídeos com atividade antagonizante de interferon não são engenheirados no vírus de influenza de suínos. Em algumas formas de realização, o vírus quimérico expressa um antígeno de tumor. Em outras formas de realização, o vírus quimérico expressa um epítopo de um patógeno estranho.
[00030] Um vírus atenuado de influenza de suínos tendo o fenótipo desejado pode ser usado, ele mesmo, como o ingrediente ativo em formulações de vacina, farmacêuticas ou imunogênicas. Altemativamente, o vírus atenuado de influenza de sumos pode ser usado como o vetor ou “estrutura dorsal” de vacinas produzidas recombinantemente ou formulações imunogênicas. Para esta finalidade, as técnicas de “genética reversa” ou abordagem de plasmídeo isento de auxiliar podem ser usadas para engenheirar mutações ou introduzir epítopos estranhos no vírus atenuado de influenza de suínos, que deve servir como a cepa “parental”. Deste modo, as vacinas podem ser projetadas para imunização centra, variantes de cepas ou na alternativa, contra agentes infecciosos completamente diferentes ou antígenos de doença (por exemplo antígenos de tumor). Por exemplo, o vírus atenuado de influenza de suínos pode ser engenheirado para expressar epítopos neutralizantes de outras cepas pré-selecionadas. Altemativamente, epítopos de outros vírus podem ser construídos no vírus atenuado de influenza de sumos. Altemativamente, epítopos de patógenos infecciosos não virais (por exemplo, parasitas, bactéria, fungos) podem ser engenheirados no vírus de influenza de sumos.
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22/132 [0032] Em uma forma de realização particular, técnicas de reagrupamento podem ser usadas para transferir o fenótipo atenuado de uma cepa de vírus de influenza de suínos parental (um mutante natural, um vírus mutagenizado, ou um vírus geneticamente engenheirado) para uma cepa de vírus diferente (um vírus de tipo selvagem, um mutante natural, um vírus mutagenizado, ou um vírus geneticamente engenheirado). De acordo com esta forma de realização, a “técnica de genética reversa” e abordagem de plasmídeo isento de auxiliar podem ser usadas para engenheirar mutações ou introduzir epítopos estranhos no vírus atenuado de influenza de suínos, que iria servir como a “cepa parental”.
[0033] A presente invenção proporciona métodos para a vacinação de indivíduos compreendendo a administração de uma formulação de vacina compreendendo um vírus atenuado de influenza de suínos compreendendo uma mutação em um gene NS1 de vírus de influenza de suínos que diminui a capacidade do produto de gene NS1 de antagonizar a resposta de interferon celular, e um excipiente fisiologicamente efetivo. Em uma forma de realização, a presente invenção proporciona um método compreendendo a administração de uma quantidade eficaz de uma formulação de vacina da invenção. Em algumas formas de realização, a dose da formulação de vacina administrada está entre cerca de 102 a cerca de 108, cerca de 103 a cerca de 107, ou cerca de 104 a cerca de 5 x 106 pfu. Em outras formas de realização, a dose da formulação de vacina administrada é de 102, 5 x 102, 103, 5 x 103, 104, 5 x 104, 105, 5 x 105, 106, 5 x 106, 107, 5 x 107 ou 108 pfu. Nas formas de realização específicas, o indivíduo é um asno, zebra, camelo, cão, aves (por exemplo, um pato). Em uma forma de realização preferida, o indivíduo é um porco.
[0034] A presente invenção proporciona formulações imunogênicas compreendendo um vírus atenuado de influenza de suínos da invenção e métodos para induzir uma resposta imune para o tratamento, controle ou prevenção de uma infecção por vírus de influenza de suínos ou uma condição ou sintoma associado com a mesma, uma infecção diferente de uma infecção por vírus de influenza de suínos, ou uma condição ou sintoma associado com a mesma, ou uma condição em
23/132 que o vírus atenuado de influenza de suínos pode ser usado como um uma resposta imune a um antígeno particular associado com a condição, compreendendo administrar a um indivíduo uma formulação imunogênica da invenção. Em uma forma de realização, a presente invenção proporciona um método para induzir uma resposta imune para o tratamento, controle ou prevenção de uma infecção por vírus de influenza de suínos ou uma condição ou sintoma associado com a mesma, uma infecção diferente de uma infecção por vírus de influenza de suínos, ou uma condição ou sintoma associado com a mesma, ou uma condição em que o vírus atenuado de influenza de suínos pode ser usado como um uma resposta imune a um antígeno particular associado com a condição, compreendendo administrar a um indivíduo uma quantidade eficaz de uma formulação imunogênica da invenção. Em algumas formas de realização, a dose de uma formulação imunogênica da invenção administrada em um indivíduo está entre cerca de 102 a cerca de 108, cerca de 103 a cerca de 107, ou cerca de 104 a cerca de 5 x 106 pfu ou cerca de 104 a cerca de 107 pfu. Nas formas de realização específicas, a formulação imunogênica administrada em um indivíduo tem uma concentração de vírus atenuado de influenza de suínos de cerca de 104 a cerca de 107 pfu/ml. Em outras formas de realização, a dose de uma formulação imunogênica da invenção administrada em um indivíduo é 102, 5 x 102, 103, 5 x 103, 104, 5 x 104, 105, 5 x 105, 106, 5 x 106, 107, 5 x 107 ou 108 pfu. Nas formas de realização específicas, o indivíduo é um asno, zebra, camelo, cão, aves (por exemplo, um pato). Em uma forma de realização preferida, o indivíduo é um porco.
[0035] Os vírus atenuados de influenza de suínos, que induzem respostas de IFN robustas em indivíduos, também podem ser usados em formulações farmacêuticas para profilaxia ou tratamento de infecções e doenças tratáveis com IFN, como câncer. Neste aspecto, o tropismo do vírus atenuado de influenza de suínos pode ser alterado para marcar o vírus em um órgão de marcação desejado, tecido ou células in vivo ou ex vivo. Usando esta abordagem, a resposta de IFN pode ser induzida localmente, em um sítio de marcação, assim evitando ou minimizando os efeitos laterais de terapia sistêmica de IFN. Para esta finalidade, o
24/132 vírus atenuado de influenza de suínos pode ser engenheirado para expressar um ligando específico para um receptor do órgão, tecido ou células de marcação.
[0036] A presente invenção proporciona métodos para prevenir, controlar ou tratar uma infecção, ou uma doença tratável por IFN, em um indivíduo (por exemplo um porco), diferente de uma infecção viral de influenza de suínos, ou uma doença tratável por IFN causada por vírus de influenza de suínos, compreendendo a administração de uma formulação farmacêutica da invenção. Em uma forma de realização, a presente invenção proporciona um método para prevenir, controlar ou tratar uma infecção ou doença tratável por IFN em um indivíduo, diferente de uma infecção viral por influenza de suínos ou doença tratável por IFN causada por vírus de influenza de suínos, compreendendo administrar a um indivíduo uma quantidade eficaz de uma formulação farmacêutica da invenção. Em algumas formas de realização, a dose da formulação farmacêutica administrada no indivíduo está entre cerca de 102 a cerca de 1012, cerca de 102 a cerca de 1010, cerca de 102 a cerca de 108, cerca de 103 a cerca de 109, cerca de 103 a cerca de 107, cerca de 104 a cerca de 108, cerca de 104 a cerca de 5 x 106, cerca de 104 a cerca de 107, ou cerca de 104 a cerca de 1012 pfu. Nas formas de realização específicas, a formulação farmacêutica administrada ao indivíduo tem uma concentração de vírus atenuado de influenza de cerca de 104 a cerca de 1012 pfu/ml. Em outras formas de realização, a dose da formulação farmacêutica administrada é de 102, 5 x 102, 103, 5 x 103, 104, 5 x 104, 105, 5x 105, 10®, 5x 106, 107, 5x 107, 10®, 5x 10®, 1 x 109, 5x 109, 1 x 101°, 5 x 101°, 1 x 1011, 5 x 1011 ou 1012 pfu. Nas formas de realização específicas, o indivíduo é um asno, zebra, camelo, cão, aves (por exemplo, um pato). Em uma forma de realização preferida, o indivíduo é um porco.
[0037] A presente invenção proporciona métodos para prevenir, controlar ou tratar câncer em um indivíduo compreendendo administrar uma formulação farmacêutica da invenção. Em uma forma de realização, a presente invenção proporciona um método para prevenir, controlar ou tratar câncer em um indivíduo compreendendo administrar a um indivíduo uma quantidade eficaz de uma formulação farmacêutica da invenção. Em algumas formas de realização, a
25/132 formulação farmacêutica compreende um vírus de influenza de suínos compreendendo um antígeno de tumor. Em algumas formas de realização, a dose da formulação farmacêutica administrada ao indivíduo está entre cerca de 102 a cerca de 1012, cerca de 102 a cerca de 1010, cerca de 102 a cerca de 10®, cerca de 103 a cerca de 109, cerca de 103 a cerca de 107, cerca de 104 a cerca de 108, cerca de 104 a cerca de 5 x 106 pfu ou cerca de 104 a cerca de 1012 pfu. Nas outras formas de realização, a dose da formulação farmacêutica administrada é de 102, 5 x 102, 103, 5x 103, 104, 5x 104, 105, 5x 105, 106, 5x 106, 107, 5x 107, 10®, 5x 108, 1 x 109, 5 x 109, 1 x 1010, 5 x 1010, 1 x 1011, 5 x 1011 ou 1012 pfu. Nas formas de realização específicas, o indivíduo é um asno, zebra, camelo, cão, aves (por exemplo, um pato). Em uma forma de realização preferida, o indivíduo é um porco.
[0038] Os requerentes têm demonstrado que os vírus atenuados de influenza de suínos com atividade de antagonista de interferon prejudicada replicam in vivo gerando títulos que são menores do que os detectados com vírus de influenza de suínos de tipo selvagem, mas que são suficientes para induzir respostas imunológicas e de citocinas. Assim, mutações que diminuem, mas não abolem a atividade de antagonista de IFN do vírus de influenza de suínos são preferidas para formulações de vacina, farmacêuticas e imunológicas. Estes vírus podem ser selecionados para crescimento em substratos tanto convencionais como não convencionais, e para virulência intermediária.
[0039] A presente invenção proporciona células contendo (alternativamente, compreendendo) vírus de influenza de suínos da presente invenção. Em uma forma de realização específica, uma célula contém/compreende um vírus de influenza de suínos que é geneticamente engenheirado. Em algumas formas de realização, o vírus atenuado de influenza de suínos contido na célula é engenheirado para codificar um epítopo derivado de outro patógeno (por exemplo, outro vírus) ou um antígeno de tumor. De acordo com esta forma de realização, o genoma do vírus atenuado de influenza de suínos pode compreender pelo menos um segmento derivado de um vírus diferente. Qualquer célula pode ser infectada com, conter ou compreender um vírus atenuado de influenza de suínos da invenção incluindo, mas
26/132 não limitado a células MDCK, células PK, células Vero, células endoteliais de veia umbilical humana primária, (HUVEC), linhagem de célula epitelial humana H292, células HeLa, e células do rim embriônicas de suínos RES. Em uma forma de realização preferida, a célula é uma célula de porco ou de uma linhagem de células de porco. Em algumas formas de realização, a célula (por exemplo, uma célula de porco ou linhagem de células de porco) é deficiente em interferon.
[0040] Em algumas outras formas de realização, os vírus de influenza de suínos da invenção estão contidos em ovos de galinha embrionados com 10 dias de idade, 6 a 9 dias de idade, 6 a 8 dias de idade, ou 6 a 7 dias de idade. Em uma forma de realização específica, os vírus estão contidos na cavidade alantóica de tais ovos. Em outra forma de realização específica, os vírus estão contidos na cavidade amniótica de tais ovos.
[0041] A invenção engloba o uso de substratos como células, linhagens de células e ovos embrionados, para propagar os vírus atenuados de influenza de suínos da invenção. Em uma forma de realização, a invenção proporciona métodos para produção de vacinas e produção de fármacos compreendendo propagar, em um substrato, um vírus atenuado de influenza de suínos da presente invenção e coletar a progênie do vírus, em que o substrato é uma célula, linhagem de células ou ovo embrionado. Em algumas formas de realização, o substrato é um sistema deficiente em IFN. Sistemas deficientes em IFN exemplares incluem, mas não são limitados a ovos embrionados jovens (por exemplo, ovos embrionados com 6 a 10 dias de idade, 6 a 9 dias de idade, 6 a 8 dias de idade ou 6 a 7 dias de idade), e linhagens de células deficientes em IFN (como células VERO ou linhagens de células geneticamente engenheiradas como inativações STAT1). Ovos embrionados ou linhagens de células pré-tratados com compostos que inibem o sistema IFN (incluindo drogas, anticorpos, anti-sentido, ribozimas, etc.) também podem ser usados como um sistema deficiente em IFN. Além disso, ovos deficientes no sistema de IFN, por exemplo, ovos produzidos por pássaros negativos STAT1, especialmente aves domésticas, incluindo mas não limitadas a galinhas transgênicas, patos ou perus, podem ser usados como um sistema deficiente em
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IFN.
3.1 Terminologia [0042] Como usado aqui, o termo “cerca de” ou “aproximadamente” quando usado junto com um número refere-se a qualquer número na faixa de 1, 5 ou 10% do número referenciado.
[0043] Como usado aqui, a expressão “ término amino” de NS1 refere-se aos aminoácidos do resíduo de aminoácido amino terminal (resíduo de aminoácido 1) até de aminoácido 115, resíduos aminoácido 1 até 100, resíduos de aminoácido 1 até 75, resíduos de aminoácido 1 até 50, resíduos aminoácido 1 até 25, ou resíduos aminoácido 1 até 10 de proteína NS1 de vírus de influenza de suínos.
[0044] Como usado aqui, a expressão “termino carbóxi” de NS1 refere-se a resíduos de aminoácido 116 até o resíduo de aminoácido carbóxi terminal, resíduos de aminoácido 101 até o resíduo de aminoácido carbóxi terminal, resíduos de aminoácido 76 até o resíduo de aminoácido carbóxi terminal, resíduos de aminoácido 51 até o resíduo de aminoácido carbóxi terminal, ou resíduos de aminoácido 26 até o resíduo de aminoácido carbóxi terminal da proteína NS1 de vírus de influenza de suínos, quando o término amino NS1 inclui resíduos de aminoácido 1 até resíduo de aminoácido 115, resíduos aminoácido 1 até 100, resíduos de aminoácido 1 até 75, resíduos de aminoácido 1 até 50, ou resíduos de aminoácido 1 até 25, respectivamente, da proteína NS1 de vírus de influenza de suínos. As deleções do término carbóxi podem incluir deleções consistindo de 5, preferivelmente 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 73, 75, 80, 85, 90, 95, 99, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 126, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170 ou 175 resíduos de aminoácido de término carbóxi de NS1.
[0045] Como usado aqui, o termo “modulador de receptor de citocina” refere-se a um agente que modula a fosforilação de um receptor de citocina, a ativação de uma via de transdução de sinal associada com um receptor citocina, e/ou a expressão de uma proteína particular como citocina. Este tal agente pode modular diretamente ou indiretamente a fosforilação de um receptor de citocina, a ativação de uma via de transdução de sinal, associada com um receptor de citocina, e/ou a expressão de
28/132 uma proteína particular como uma citocina. Assim, exemplos de moduladores de receptor de citocinas incluem, mas não são limitados a citocinas, fragmentos de citocinas, proteínas de fusão, e antibióticos que ligam imunoespecificamente em um receptor de citocina ou um fragmento da mesma. Além disso, exemplos de moduladores de receptor de citocina incluem, mas não são limitados a peptídeos, polipeptídeos (por exemplo, receptores de citocina solúveis), proteínas de fusão e anticorpos que ligam imunoespecificamente em uma citocina ou um fragmento da mesma.
[0046] Como usado aqui, o termo “quantidade eficaz” refere-se à quantidade de uma terapia (por exemplo, um agente profilático ou terapêutico) que é suficiente para reduzir e/ou melhorar a severidade e/ou duração de uma condição (por exemplo, uma infecção por vírus de influenza de suínos ou uma condição ou sintoma associado com a mesma, outra infecção (por exemplo, outra infecção viral), uma doença tratável por IFN ou uma condição em que os vírus atenuados de influenza de suínos podem ser usados como um uma resposta imune a um antígeno particular associado com a condição), prevenir o avanço de uma condição (por exemplo, uma infecção por vírus de influenza de suínos ou uma condição ou sintoma associado com a mesma, outra infecção (por exemplo, outra infecção viral), uma doença tratável por IFN ou uma condição em que os vírus atenuados de influenza de suínos podem ser usados como um uma resposta imune a um antígeno particular associado com a condição), causar regressão de uma condição (por exemplo, uma infecção por vírus de influenza de suínos ou uma condição ou sintoma associado com a mesma, outra infecção (por exemplo, outra infecção viral) ou uma doença tratável por IFN), prevenir a recaída, desenvolvimento, ou início de um ou mais sintomas associados com uma condição (por exemplo, uma infecção por vírus de influenza de suínos ou uma condição ou sintoma associado com a mesma, outra infecção (por exemplo, outra infecção viral) ou uma doença tratável por IFN), reduz o título de vírus de influenza de suínos ou melhora ou aperfeiçoa o(s) efeito(s) profilático(s) terapêutico(s) de outra terapia (por exemplo, agente profilático ou terapêutico).
29/132 [0047] Como usado aqui, o termo “epítopos” refere-se aos sítios ou fragmentos de um polipeptídeo ou proteína tendo atividade antigênica ou imunogênica em um animal, preferivelmente em um mamífero, e mais preferivelmente em um porco. Um epítopo tendo atividade imunogênica é um sítio ou fragmento de um polipeptídeo ou proteína que elicita uma resposta de anticorpo em um animal. Um epítopo tendo atividade antigênica é um sítio ou fragmento de um polipeptídeo ou proteína ao qual se liga imunoespecificamente anticorpo como determinado por qualquer método bem conhecido do versado na técnica, por exemplo, por imunotestes.
[0048] Como usado aqui, o termo “fragmento” no contexto de um agente proteináceo refere-se a um peptídeo ou polipeptídeo compreendendo uma seqüência de aminoácidos de pelo menos 2 resíduos de aminoácidos contíguos, pelo menos 5 resíduos de aminoácidos contíguos, pelo menos 10 resíduos de aminoácidos contíguos, pelo menos 15 resíduos de aminoácidos contíguos, pelo menos 20 resíduos de aminoácidos contíguos, pelo menos 25 resíduos de aminoácidos contíguos, pelo menos 40 resíduos de aminoácidos contíguos, pelo menos 50 resíduos de aminoácidos contíguos, pelo menos 60 resíduos de aminoácidos contíguos, pelo menos 70 resíduos de aminoácidos contíguos, pelo menos 80 resíduos de aminoácidos contíguos, pelo menos 90 resíduos de aminoácidos contíguos, pelo menos 100 resíduos de aminoácidos contíguos, pelo menos 125 resíduos de aminoácidos contíguos, pelo menos 150 resíduos de aminoácidos contíguos, pelo menos 175 resíduos de aminoácidos contíguos, pelo menos 200 resíduos de aminoácidos contíguos, ou pelo menos 250 resíduos de aminoácidos contíguos da seqüência de aminoácido de um peptídeo, polipeptídeo ou proteína. Em uma forma de realização, um fragmento de uma proteína de comprimento completo retém atividade da proteína de comprimento completo, por exemplo, atividade de antagonista de IFN. Em outra forma de realização, o fragmento da proteína de comprimento completo não retém a atividade de proteína de comprimento completo, por exemplo, atividade de antagonista de IFN.
[0049] Como usado aqui, o termo “fragmento” no contexto de um ácido nucleico refere-se a um ácido nucleico compreendendo uma seqüência de ácido nucleico de
30/132 pelo menos 2 nucleotídeos contíguos, pelo menos 5 nucleotídeos contíguos, pelo menos 10 nucleotídeos contíguos, pelo menos 15 nucleotídeos contíguos, pelo menos 20 nucleotídeos contíguos, pelo menos 25 nucleotídeos contíguos, pelo menos 30 nucleotídeos contíguos, pelo menos 35 nucleotídeos contíguos, pelo menos 40 nucleotídeos contíguos, pelo menos 50 nucleotídeos contíguos, pelo menos 60 nucleotídeos contíguos, pelo menos 70 nucleotídeos contíguos, pelo menos 80 nucleotídeos contíguos, pelo menos 90 nucleotídeos contíguos, pelo menos 100 nucleotídeos contíguos, pelo menos 125 nucleotídeos contíguos, pelo menos 150 nucleotídeos contíguos, pelo menos 175 nucleotídeos contíguos, pelo menos 200 nucleotídeos contíguos, pelo menos 250 nucleotídeos contíguos, pelo menos 300 nucleotídeos contíguos, pelo menos 350 nucleotídeos contíguos, ou pelo menos 380 nucleotídeos contíguos da seqüência de ácido nucleico codificando um peptídeo, polipeptídeo ou proteína. Em uma forma de realização preferida, um fragmento de um ácido nucleico codifica um peptídeo ou polipeptídeo que retém atividade da proteína de comprimento completo, por exemplo, atividade de antagonista de IFN. Em outra forma de realização, o fragmento da proteína de comprimento completo não retém a atividade de proteína de comprimento completo, por exemplo, atividade de antagonista de IFN.
[0050] Como usado aqui, a expressão “seqüência heteróloga” refere-se a qualquer seqüência de ácido nucleico ou proteína, polipeptídeo ou seqüência peptídeo que não é normalmente encontrada na natureza ou associada na natureza com um ácido nucleico ou proteína, polipeptídeo ou seqüência peptídeo de interesse. Por exemplo, uma “seqüência heteróloga” pode fazer referência a uma seqüência derivada de uma espécie diferente.
[0051] Como usado aqui, o termo “em combinação” refere-se ao uso de mais do que uma terapia (por exemplo, mais do que um agente profilático e/ou terapêutico). O uso do termo “em combinação” não limita a ordem em que as terapias (por exemplo, agentes profiláticos e/ou terapêuticos) são administrados a um indivíduo com a condição (por exemplo, uma infecção por vírus de influenza de suínos ou uma condição ou sintoma associado com a mesma, outra infecção (por exemplo, outra
31/132 infecção viral) ou uma doença tratável por IFN). Uma primeira terapia (por exemplo, um primeiro agente profilático ou terapêutico) pode ser administrado antes de (por exemplo, 5 minutos, 15 minutos, 30 minutos, 45 minutos, 1 hora, 2 horas, 4 horas, 6 horas, 12 horas, 24 horas, 48 horas, 72 horas, 96 horas, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 8 semanas, ou 12 semanas antes), concomitantemente com, ou subseqüente a (por exemplo, 5 minutos, 15 minutos, 30 minutos, 45 minutos, 1 hora, 2 horas, 4 horas, 6 horas, 12 horas, 24 horas, 48 horas, 72 horas, 96 horas, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 8 semanas, ou 12 semanas depois) administração de uma segunda terapia (por exemplo, um segundo agente profilático ou terapêutico) a um indivíduo com uma condição (por exemplo, uma infecção por vírus de influenza de suínos ou uma condição ou sintoma associado com a mesma, outra infecção (por exemplo, outra infecção viral) ou uma doença tratável por IFN).
[0052] Como usado aqui, a expressão “atividade de antagonista de interferon” refere-se a uma proteína ou polipeptídeo, ou fragmento, derivado, ou análogo do mesmo que reduz ou inibe a resposta imune ai interferon celular. Em particular, uma proteína ou polipeptídeo, ou fragmento, derivado, ou análogo do mesmo (por exemplo, vírus de influenza de suínos NS1) que tem atividade antagonista interferon reduz ou inibe a expressão e/ou a atividade de interferon. Em uma forma de realização específica, a expressão “atividade de antagonista de interferon” refere-se a uma proteína de vírus de influenza de suínos ou polipeptídeo, ou fragmento, derivado, ou análogo do mesmo que reduz ou inibe a resposta imune de interferon celular. Uma proteína viral de influenza de suínos ou polipeptídeo com atividade de antagonista de interferon pode preferencialmente afetar a expressão e/ou a atividade de um ou dois tipos de interferon (IFN). Em uma forma de realização, a expressão e/ou a atividade de IFN-α é afetada. Em outra forma de realização, a expressão e/ou atividade de IFN-β é afetado. Em uma forma de realização, a expressão e/ou a atividade de IFN-yé afetada. Em algumas formas de realização, a expressão e/ou a atividade de IFN-β e/ou IFN-yé reduzida 5-10%, 10-20%, 20-30%, 30-40%, 40-50%, 50-60%, 60-70%, 70-80%, 80-90% ou mais por proteína, polipeptídeo, etc. com uma
32/132 atividade de antagonista de interferon quando comparada a um controle (por exemplo, PBS ou uma proteína sem atividade de antagonista de interferon) nos sistemas competentes IFN, por exemplo, uma célula do tipo selvagem ou animal sob as mesmas condições. Em algumas formas de realização, a expressão e/ou a atividade de IFN-β e/ou IFN-γ é reduzida aproximadamente 1 a aproximadamente 100 vezes, aproximadamente 5 a aproximadamente 80 vezes, aproximadamente 20 a aproximadamente 80 vezes, aproximadamente 1 a aproximadamente 10 vezes, ou aproximadamente 1 a aproximadamente 5 vezes, ou aproximadamente 40 a aproximadamente 80 vezes, ou 1,2, 3, 4, 5, 7, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 ou 100 vezes por proteína, polipeptídeo, etc. com uma atividade de antagonista de interferon quando comparada a um controle (por exemplo, PBS ou uma proteína sem atividade de antagonista de interferon) nos sistemas competentes de IFN sob as mesmas condições.
[0053] Como usado aqui, as expressões “sistemas deficientes em IFN” ou “substratos deficientes em IFN” referem-se aos sistemas, por exemplo, células, linhagens de célula e animais, como porcos, camundongos, galinhas, perus, coelhos, ratos, etc., que não produzem IFN ou produzem níveis baixos de IFN (isto é, uma redução em expressão de IFN de 5-10%, 10-20%, 20-30%, 30-40%, 40-50%, 50-60%, 60-70%, 70-80%, 80-90% ou mais quando comparado aos sistemas competentes em IFN sob as mesmas condições), não respondem ou respondem menos eficientemente a IFN, e/ou são deficientes na atividade de um ou mais genes antivirais induzidos por IFN.
[0054] Como usado aqui, a expressão “fenótipo induzindo IFN” refere-se a um fenótipo pelo qual um vírus demonstra uma resposta a interferon celular aumentada comparada a um vírus de tipo selvagem, que tipicamente inibe ou reduz as respostas medidas por interferon celular.
[0055] Como usado aqui, as expressões “distúrbios tratáveis por IFN”, “doenças tratáveis por IFN” e as expressões análogas referem-se a condições que são preveníveis, tratáveis, controladas ou melhoradas pela administração de IFN, ou IFN-α, β, γ ou qualquer combinação dos mesmos. Os distúrbios tratáveis por IFN
33/132 não precisam ser limitados a suínos, se o vírus de influenza de suínos infectar outras espécies. Os exemplos de distúrbios tratáveis por IFN em porcos incluem, mas não são limitados a febre aftosa, pneumonia Haemophilus de suíno (PHP, e outros distúrbios causados por infecção com, por exemplo, por A. pleuropneumoniae, P. haemolytica, P. multocida, H. somnus e A. suis.
[0056] Como usado aqui, a expressão fenótipo “intermediário” com relação a atividade de antagonista de IFN refere-se a um fenótipo que pode estimular uma resposta imune robusta, enquanto sendo atenuado devido aos vírus com um fenótipo intermediário não podem superar a resposta do IFN hospedeiro. Em particular, um fenótipo intermediário pode estimular uma resposta imune e inibe/reduz IFN somente na extensão em que permite menos ciclos de replicação viral ou números menores de partículas de vírus sendo produzidas em comparação com vírus de tipo selvagem, como determinado por técnicas bem conhecidas na técnica (por exemplo, como medido por testes de títulos de placa menores ou testes de hemaglutinação).
[0057] Como usado aqui, o termo “isolado”, no contexto de vírus, refere-se a um vírus que é derivado de um vírus parental único. Um vírus pode ser isolado usando métodos de rotina bem conhecidos do versado na técnica incluindo, mas não limitado aos baseados na purificação de placa e limitando a diluição.
[0058] Como usado aqui, os termos “controlar”, “controlando” e “controle” referem-se aos efeitos benéficos que um indivíduo deriva de uma terapia (por exemplo, um agente profilático ou terapêutico), que não resulta em uma cura da doença. Em algumas formas de realização, um indivíduo é administrado uma ou mais terapias (por exemplo, um ou mais agentes profiláticos ou terapêuticos) para “controlar” uma doença de modo a prevenir a progressão ou piora da doença.
[0059] Como usado aqui, a expressão “multiplicidade de infecção” ou “MOI” é o número médio de vírus por célula infectada. O MOI é determinado por divisão do número de vírus adicionado (ml adicionado x PFU) pelo número de células adicionadas (ml adicionado x células/ml).
[0060] Como usado aqui, a expressão “vírus de influenza não suíno” no contexto
34/132 de vírus de influenza de suínos contendo ou compreendendo seqüências de vírus de influenza não suíno refere-se a qualquer cepa de vírus de influenza ou isolado compreendendo uma seqüência (por exemplo, uma seqüência de ácido nucleico ou de aminoácido) heteróloga para o vírus de influenza de suínos, isto é, a seqüência não é encontrada naturalmente em associação com o vírus de influenza de suínos. [0061] Como usado aqui, a expressão “gene NS1 ” refere-se ao gene que codifica a proteína não estrutural (NS1) em influenza. NS1 é uma das oito moléculas codificadas pelo genoma segmentado de influenza A e outros vírus. Um “gene NS1 de vírus de influenza de suínos” é um gene NS1 isolado de um vírus de influenza de suínos. Os genes NS1 suínos representativos podem ser encontrados em bases de dados de seqüência como Genbank e incluem, mas não são limitados a Genbank número de acesso AJ293939 (A/Swine/ltaly/13962/95(H3N2)) e Genbank número de acesso AJ344041 (A/Swine/Cotes d’Armor/1121/00(H1N1)). Um “produto de gene NS1” refere-se a um produto de gene (por exemplo, um RNA ou proteína) codificado por um gene NS1. No caso de uma proteína, o produto de gene NS1 é de comprimento completo e tem atividade NS1 de tipo selvagem (por exemplo, de influenza A/Swine/Texas/4199-2/98. Um “produto de gene NS1 de vírus de influenza de suínos” refere-se a um produto de gene (por exemplo, um RNA ou proteína) codificado por um gene NS1 de vírus de influenza de suínos. No caso de uma proteína, o produto de gene NS1 de vírus de influenza de suínos é de comprimento completo e tem uma atividade NS1 de vírus de influenza de suínos de tipo selvagem, por exemplo, de influenza A/Swine/Texas/4199-2/98.
[0062] Como usado aqui, os termos “prevenir”, “prevenindo” e “prevenção” referem-se à inibição do desenvolvimento ou início de uma condição (por exemplo, uma infecção por vírus de influenza de suínos ou uma condição associada com a mesma, uma infecção diferente de uma infecção por vírus de influenza de suínos ou uma condição associada com a mesma, uma doença tratável por IFN ou uma condição em que os vírus atenuados de influenza de suínos podem ser usados como um uma resposta imune a um antígeno particular associado com a condição), ou a prevenção da recorrência, início ou desenvolvimento de um ou mais sintomas
35/132 de uma condição (por exemplo, uma infecção por vírus de influenza de suínos ou uma condição associada com a mesma, uma infecção diferente de uma infecção por vírus de influenza de suínos ou uma condição associada com a mesma, ou uma doença tratável por IFN), em um indivíduo resultando da administração de uma terapia (por exemplo, um agente profilático ou terapêutico), ou a administração de uma combinação de terapias (por exemplo, uma combinação de agentes profiláticos ou terapêuticos).
[0063] Como usado aqui, os termos “agente profilático” e “agentes profiláticos” referem-se a qualquer agente (s) que pode ser usado na prevenção de uma condição ou um sintoma da mesma (por exemplo, uma infecção por vírus de influenza de suínos ou uma condição ou sintoma associado com a mesma, uma infecção diferente de uma infecção por vírus de influenza de suínos ou uma condição ou sintoma associado com a mesma, uma doença tratável por IFN ou uma condição em que os vírus atenuados de influenza de suínos podem ser usados como um uma resposta imune para um antígeno particular associado com a condição). Preferivelmente, um agente profilático é um agente que é conhecido como sendo utilizável para ou que foi ou está sendo atualmente usado para prevenir ou impedir o início, desenvolvimento, progressão e/ou severidade de uma infecção por vírus de influenza de suínos ou uma condição ou sintoma associado com a mesma, uma infecção diferente de uma infecção por vírus de influenza de suínos ou uma condição ou sintoma associado com a mesma, uma doença tratável por IFN ou uma condição em que os vírus atenuados de influenza de suínos podem ser usados como um uma resposta imune a um antígeno particular associado com a condição. [0064] Como usado aqui, o termo “quantidade profilaticamente eficaz” refere-se a quantidade de uma terapia (por exemplo, agente profilático) que é suficiente para resultar na prevenção do desenvolvimento, recorrência, ou início de uma condição ou um sintoma da mesma (por exemplo, uma infecção por vírus de influenza de suínos ou uma condição ou sintoma associado com a mesma, uma infecção diferente de uma infecção por vírus de influenza de suínos ou uma condição ou sintoma associado com a mesma, uma doença tratável por IFN ou uma condição em
36/132 que os vírus atenuados de influenza de suínos podem ser usados como um uma reposta imune em um antígeno particular associado com a condição) ou para melhorar ou aperfeiçoar o(s) efeito (s) profilático (s) de outra terapia (por exemplo, um agente profilático).
[0065] Como usado aqui, a expressão “purificado” no contexto de vírus refere-se a um vírus que é substancialmente livre de material celular e meio de cultura da fonte de célula ou de tecido da qual o vírus é derivado. A frase “substancialmente livre de material celular” inclui as preparações de vírus em que o vírus é separado dos componentes celulares das células das quais ele é isolado ou recombinantemente produzido. Assim, o vírus que é substancialmente livre de material celular inclui preparações de proteína tendo menos que cerca de 30%, 20%, 10%, ou 5% (por peso seco) de proteína celular (também referido aqui como uma “proteína contaminante”). O vírus também é substancialmente livre de meio de cultura, isto é o meio de cultura, representa menos que cerca de 20%, 10%, ou 5% do volume da preparação do vírus. Um vírus pode ser purificado usando métodos de rotina conhecidos dos versados na técnica incluindo, mas não limitados a cromatografia e centrifugação.
[0066] Como usado aqui, os termos “indivíduo” ou “paciente” são usados de modo interpermutável. Como usado aqui, os termos “indivíduo” e “indivíduos” referem-se a um animal (por exemplo, pássaros, répteis, e mamíferos), preferivelmente um mamífero incluindo um não primata (por exemplo, um camelo, asno, zebra, vaca, porco, cavalo, gato, cão, rato, e camundongo) e um primata (por exemplo, um macaco, chimpanzé, e um humano). Em algumas formas de realização, o indivíduo ou paciente tem uma infecção por vírus de influenza de suínos. Em algumas formas de realização, o mamífero tem de 0 a 6 meses de idade, 6 a 12 meses de idade, 1 a 5 anos de idade, 5 a 10 anos de idade, 10 a 15 anos de idade, 15 a 20 anos de idade, 20 a 25 anos de idade, 25 a 30 anos de idade, 30 a 35 anos de idade, 35 a 40 anos de idade, 40 a 45 anos de idade, 45 a 50 anos de idade, 50 a 55 anos de idade, 55 a 60 anos de idade, 60 a 65 anos de idade, 65 a 70 anos de idade, 70 a 75 anos de idade, 75 a 80 anos de idade, 80 a 85 anos de
37/132 idade, 85 a 90 anos de idade, 90 a 95 anos de idade ou 95 a 100. Em uma forma de realização preferida, o indivíduo ou paciente é um porco. Em algumas formas de realização, o porco tem de 0 a 6 meses de idade, 6 a 12 meses de idade, 1 a 5 anos de idade, 5 a 10 anos de idade ou 10 a 15 anos de idade. A extensão de vida natural de um porco é de 10-15 anos.
[0067] Como usado aqui, “vírus de influenza de suínos” refere-se a um vírus de influenza do tipo A ou tipo C da família orthomyxovirus que causa influenza de suínos. Apesar de orthomyxovirus ter três grupos: tipo A, tipo B e tipo C, somente tipo A e tipo C de vírus de influenza infectam os porcos. Subtipos de vírus de influenza de suínos incluem H1N1, H1N2, H3N2, e H3N1. H9N2 e H5N1 também podem ser encontrados em porcos. Em algumas formas de realização, um vírus de influenza de suínos é um vírus de influenza que foi isolado de suínos. Em uma forma de realização preferida, um vírus de influenza de suínos contém um gene NS1 suíno. Os genes NS1 suínos representativos podem ser encontrados em bases de dados de seqüências públicas, como Genbank, e incluem, mas não são limitados a Genbank número de acesso AJ293939 (A/Swine/ltaly/ 13962/95(H3N2)) e Genbank número de acesso AJ344041 (A/Swine/Cotes d’Armor/1121/00(H1N1)). Exemplos de variantes de vírus de influenza de suínos incluem, mas não são limitados a A/Swine/Colorado/1/77, A/Swine/Colorado/23619/99, A/Swine/Cote d’Armor/3633/84, A/Swine/Cote d’Armor/3633/84, A/Swine/England/195852/92, A/Swine/Finistere/2899/82, A/Swine/Hong Kong/10/98, A/Swine/Hong Kong/9/98, A/Swine/Hong Kong/81/78, A/Swine/lllinois/100084/01, A/Swine/lllinois/100085A/01, A/Swine/lllinois/21587/99, A/Swine/lndiana/1726/88, A/Swine/lndiana/9K035/99, A/Swine/lndiana/P12439/00, A/Swine/lowa/30,
A/Swine/lowa/533/99, A/Swine/lowa/569/99,
A/Swine/lowa/930/01,
A/Swine/ltaly/1523/98,
A/Swine/Minnesota/55551/00, A/Swine/Minnesota/593/99, A/Swine/Minnesota/90882/98, A/Swine/Nebraska/1/92, A/Swine/Nebraska/209/98,
A/Swine/Netherlands/12/85, A/Swine/North Carolina/16497/99, A/Swine/North
A/Swine/lowa/15/30, A/Swine/lowa/3421 /90, A/Swine/lowa/17672/88, A/Swine/Korea/CY02/02,
A/Swine/lowa/8548-1 /98, A/Swine/ltaly/1513-1/98,
38/132
Carolina/35922/98, A/Swine/North Carolina/93523/01, A/Swine/North Carolina/98225/01, A/Swine/Oedenrode/7C/96, A/Swine/Ohio/891/O1,
A/Swine/Oklahoma/18717/99, A/Swine/Oklahoma/18089/99, A/Swine/Ontario/O19111/99, A/Swine/Ontario/01911-2/99, A/Swine/Ontario/41848/97, A/Swine/Ontario/97, A/Swine/Quebec/192/81, A/Swine/Quebec/192/91, A/Swine/Quebec/5393/91, A/Swine/Taiwan/7310/70, A/Swine/Tennessee/24/77, A/Swine/Texas/4199-2/98, A/Swine/Wisconsin/125/97, A/Swine/Wisconsin/136/97, A/Swine/Wisconsin/163/97, A/Swine/Wisconsin/164/97, A/Swine/Wisconsin/166/97, A/Swine/Wisconsin/168/97, A/Swine/Wisconsin/235/97, A/Swine/Wisconsin/238/97, A/Swine/Wisconsin/457/98, A/Swine/Wisconsin/458/98, A/Swine/Wisconsin/464/98 e
A/Swine/Wisconsin/14094/99.
[0068] Como usado aqui, o termo “sinergístico” refere-se a uma combinação de terapias (por exemplo agentes profiláticos ou terapêuticos) que é mais eficaz do que os efeitos aditivos de qualquer duas ou mais terapias únicas (por exemplo um ou mais agentes profiláticos ou terapêuticos). Um efeito sinergístico de uma combinação de terapias (por exemplo uma combinação de agentes profiláticos ou terapêuticos) permite o uso de menores doses do que uma ou mais terapias (por exemplo, um ou mais agentes profiláticos ou terapêuticos) e/ou uma administração menos freqüente de referidas terapias a um indivíduo com uma condição (por exemplo infecção por vírus de influenza de suínos ou uma condição ou sintoma associada com a mesma, uma infecção diferente de uma infecção por vírus de influenza de suínos ou uma condição ou sintoma associado com a mesma, uma doença tratável por IFN ou uma condição em que os vírus atenuados de influenza de suínos podem ser usados como um uma resposta imune a um antígeno particular associado com a condição). A capacidade de usar dosagens menores de terapias (por exemplo agentes profiláticos ou terapêuticos) e/ou administrar referidas terapias menos freqüentemente reduz a toxicidade associada com a administração de referidas terapias a um indivíduo sem reduzir a eficácia de referidas terapias na prevenção ou tratamento de uma condição (por exemplo infecção por vírus de influenza de suínos ou uma condição ou sintoma associada com a mesma, uma
39/132 infecção diferente de uma infecção por vírus de influenza de suínos ou uma condição ou sintoma associado com a mesma, uma doença tratável por IFN ou uma condição em que os vírus atenuados de influenza de suínos podem ser usados como um uma resposta imune a um antígeno particular associado com a condição). Além disso, um efeito sinergístico pode resultar em eficácia melhorada de terapias (por exemplo agentes profiláticos ou terapêuticos) na prevenção ou tratamento de uma condição (por exemplo infecção por vírus de influenza de suínos ou uma condição ou sintoma associada com a mesma, uma infecção diferente de uma infecção por vírus de influenza de suínos ou uma condição ou sintoma associado com a mesma, uma doença tratável por IFN ou uma condição em que os vírus atenuados de influenza de suínos podem ser usados como um uma resposta imune a um antígeno particular associado com a condição). Finalmente, efeito sinergístico de uma combinação de terapias (por exemplo, agentes profiláticos ou terapêuticos pode prevenir ou reduzir efeitos laterais adversos ou indesejados associados com o uso de qualquer terapia única.
[0069] Como usado aqui, o termo “modulador de receptor de células T” refere-se a um agente que modula a fosforilação de um receptor de células T, a ativação de uma via de transdução de sinal associada com um receptor de células T e/ou a expressão de uma proteína particular, como uma citocina. Este agente pode modular direta ou indiretamente a fosforilação de um receptor de células T, a ativação de uma via de transdução de sinal associada com um receptor de células T, e/ou a expressão de uma proteína particular como uma citocina. Os exemplos de moduladores de receptor de células T incluem, mas não são limitados a peptídeos, polipeptídeos, proteínas, proteínas de fusão e anticorpos que ligam imunoespecificamente a um receptor de células T ou um fragmento do mesmo. Além disso, outros exemplos de moduladores de receptor de células T incluem, mas não limitados a proteínas, peptídeos, polipeptídeos (por exemplo receptores de células T solúveis), proteínas de fusão e anticorpos que ligam imunoespecificamente a um ligando para um receptor de células T ou um fragmento do mesmo.
[0070] Como usado aqui, o termo “quantidade terapeuticamente eficaz” refere-se
40/132 à quantidade de uma terapia, que é suficiente para reduzir a severidade de uma condição (por exemplo uma infecção por vírus de influenza de suínos ou uma condição associada com a mesma), (por exemplo abortos, depressão, inapetência, anorexia, dispnéia, mialgia, ou aumentados linfonodos submandibulares induzidos por influenza), uma infecção diferente de uma infecção por vírus de influenza de suínos ou uma condição ou sintoma associado com a mesma, uma doença tratável por IFN ou uma condição em que os vírus atenuados de influenza de suínos podem ser usados como um uma resposta imune a um antígeno particular associado com a condição), reduzir a duração de uma condição (por exemplo infecção por vírus de influenza de suínos ou uma condição ou sintoma associada com a mesma, uma infecção diferente de uma infecção por vírus de influenza de suínos ou uma condição ou sintoma associado com a mesma, uma doença tratável por IFN ou uma condição em que os vírus atenuados de influenza de suínos podem ser usados como um uma resposta imune a um antígeno particular associado com a condição), reduzir o título de vírus de influenza de suínos ou outros vírus, reduzir o número de outros patógenos, melhorar um ou mais sintomas de uma condição (por exemplo infecção por vírus de influenza de suínos ou uma condição ou sintoma associada com a mesma, uma infecção diferente de uma infecção por vírus de influenza de suínos ou uma condição ou sintoma associado com a mesma, uma doença tratável por IFN ou uma condição em que os vírus atenuados de influenza de suínos podem ser usados como um uma resposta imune a um antígeno particular associado com a condição)., prevenir o avanço de uma condição (por exemplo infecção por vírus de influenza de suínos ou uma condição ou sintoma associada com a mesma, uma infecção diferente de uma infecção por vírus de influenza de suínos ou uma condição ou sintoma associado com a mesma, uma doença tratável por IFN ou uma condição em que os vírus atenuados de influenza de suínos podem ser usados como um uma resposta imune a um antígeno particular associado com a condição), causar regressão de uma condição (por exemplo infecção por vírus de influenza de suínos ou uma condição ou sintoma associada com a mesma, uma infecção diferente de uma infecção por vírus de influenza de suínos ou uma condição ou
41/132 sintoma associado com a mesma, uma doença tratável por IFN ou uma condição em que os vírus atenuados de influenza de suínos podem ser usados como um uma resposta imune a um antígeno particular associado com a condição), ou melhorar ou aperfeiçoar o(s) efeito (s) terapêutico (s) de outra terapia.
[0071] Como usado aqui, os termos “terapias” e “terapia” pode fazer referência a qualquer protocolo(s), método(s), composições, formulações e/ou agente(s) que podem ser usados na prevenção, tratamento, controle ou melhora de uma condição (por exemplo infecção por vírus de influenza de suínos ou uma condição ou sintoma associada com a mesma, uma infecção diferente de uma infecção por vírus de influenza de suínos ou uma condição ou sintoma associado com a mesma, uma doença tratável por IFN ou uma condição em que os vírus atenuados de influenza de suínos podem ser usados como um uma resposta imune a um antígeno particular associado com a condição). Em algumas formas de realização, os termos “terapias” e “terapia” se referem à terapia biológica, terapia de suporte, e/ou outras terapias utilizáveis no tratamento, controle, prevenção ou melhora de uma infecção por vírus de influenza de suínos ou condição ou sintoma associado com a mesma, uma infecção diferente de uma infecção por vírus de influenza de suínos ou uma condição ou sintoma associado com a mesma, uma doença tratável por IFN ou uma condição em que os vírus atenuados de influenza de suínos podem ser usados como um uma resposta imune a um antígeno particular associado com a condição, bem conhecidos do versado na técnica.
[0072] Como usado aqui, os termos “agente terapêutico” e agentes terapêuticos” que podem ser usados na prevenção, tratamento, controle ou melhora de uma condição ou sintoma da mesma (por exemplo infecção por vírus de influenza de suínos ou uma condição ou sintoma associada com a mesma, uma infecção diferente de uma infecção por vírus de influenza de suínos ou uma condição ou sintoma associado com a mesma, uma doença tratável por IFN ou uma condição em que os vírus atenuados de influenza de suínos podem ser usados como um uma resposta imune a um antígeno particular associado com a condição). Preferivelmente, um agente terapêutico é um agente que é utilizável, como se sabe,
42/132 para, ou que foi ou está sendo atualmente usado para a prevenção, tratamento, controle, ou melhora de uma infecção por vírus de influenza de suínos ou condição ou sintoma associado com a mesma, uma infecção diferente de uma infecção por vírus de influenza de suínos ou uma condição ou sintoma associado com a mesma, uma doença tratável por IFN ou uma condição em que os vírus atenuados de influenza de suínos podem ser usados como um uma resposta imune a um antígeno particular associado com a condição.
[0073] Como usado aqui, os termos “tratar”, “tratamento” e “tratando” referem-se a erradicação ou controle de replicação de vírus de influenza de suínos ou a replicação de um patógeno (por exemplo um vírus) diferente de um vírus de influenza de suínos, a redução no título de vírus de influenza de suínos ou vírus diferente de vírus de influenza de suínos, a redução nos números de um patógeno, a redução ou melhora de progressão, severidade e/ou duração de uma condição (por exemplo infecção por vírus de influenza de suínos ou uma condição ou sintoma associada com a mesma, uma infecção diferente de uma infecção por vírus de influenza de suínos ou uma condição ou sintoma associado com a mesma, uma doença tratável por IFN ou uma condição em que os vírus atenuados de influenza de suínos podem ser usados como um uma resposta imune a um antígeno particular associado com a condição), ou a melhora de um ou mais sintomas resultantes da administração de uma ou mais terapias (incluindo, mas limitados a administração de um ou mais agentes profiláticos ou terapêuticos).
[0074] O termo “antígeno de tumor” como usado aqui refere-se a uma moléculas ou uma célula de tumor que pode ser especificamente reconhecida por células T imunes ou anticorpos. Um antígeno de tumor inclui os presentes somente em células de tumor (antígenos específicos para tumor) assim como os presentes em células normais mas expressados preferivelmente ou de modo aberrante em células de tumor (antígenos associados a tumor). Os exemplos de antígenos de tumor incluem, mas não são limitados a antígenos de sarcóides, câncer de próstata, fibrosarcoma, antígenos de auto-diferenciação, como oncofetal, ou diferenciação, antígenos que são expressados por células malignas, incluindo mas não limitadas a antígenos
43/132 oncofetais, como antígenos carcinoembriônicos (CEA) do cólon, alfa-feto-proteína, a contraparte antigênica humana ou equivalente funcional de antígeno de murinos de 175 kDa, de carcinomas de bexiga de célula transicional, o antígeno p97 associado com melanoma ou GD3, e antígenos de diferenciação de carcinomas de pulmão humano como L6 e L20.
[0075] Como usado aqui, a expressão “vírus de influenza de suínos de tipo selvagem” refere-se aos tipos de vírus de suínos que são prevalentes, circulando naturalmente e produzindo surtos típicos de doença. Os exemplos de vírus de influenza de suínos de tipo selvagem incluem, mas não são limitados a A/Swine/Colorado/1/77, A/Swine/Colorado/23619/99, A/Swine/Cote d’Armor/3633/84, A/Swine/Cote d’Armor/3633/84, A/Swine/England/195852/92, A/Swine/Finistere/2899/82, A/Swine/Hong Kong/10/98, A/Swine/Hong Kong/9/98, A/Swine/Hong Kong/81/78, A/Swine/lllinois/100084/01, A/Swine/lllinois/100085A/01, A/Swine/lllinois/21587/99, A/Swine/lndiana/1726/88, A/Swine/lndiana/9K035/99, A/Swine/lndiana/P12439/00, A/Swine/lowa/30,
A/Swine/lowa/533/99, A/Swine/lowa/569/99,
A/Swine/lowa/930/01,
A/Swine/ltaly/1523/98,
A/Swine/Minnesota/55551/00, A/Swine/Minnesota/593/99, A/Swine/Minnesota/90882/98, A/Swine/Nebraska/1/92, A/Swine/Nebraska/209/98,
A/Swine/Netherlands/12/85, A/Swine/North Carolina/16497/99, A/Swine/North Carolina/35922/98, A/Swine/North Carolina/93523/01, A/Swine/North Carolina/98225/01, A/Swine/Oedenrode/7C/96, A/Swine/Ohio/891/O1,
A/Swine/Oklahoma/18717/99, A/Swine/Oklahoma/18089/99, A/Swine/Ontario/019111/99, A/Swine/Ontario/01911-2/99, A/Swine/Ontario/41848/97, A/Swine/Ontario/97, A/Swine/Quebec/192/81, A/Swine/Quebec/192/91, A/Swine/Quebec/5393/91, A/Swine/Taiwan/7310/70, A/Swine/Tennessee/24/77, A/Swine/Texas/4199-2/98, A/Swine/Wisconsin/125/97, A/Swine/Wisconsin/136/97, A/Swine/Wisconsin/163/97, A/Swine/Wisconsin/164/97, A/Swine/Wisconsin/166/97, A/Swine/Wisconsin/168/97, A/Swine/Wisconsin/235/97, A/Swine/Wisconsin/238/97, A/Swine/Wisconsin/457/98,
A/Swine/lowa/15/30, A/Swine/lowa/3421 /90, A/Swine/lowa/17672/88, A/Swine/Korea/CY02/02,
A/Swine/lowa/8548-1 /98, A/Swine/ltaly/1513-1/98,
44/132
A/Swine/Wisconsin/458/98, A/Swine/Wisconsin/464/98 e
A/Swine/Wisconsin/14094/99.
4. DESCRIÇÃO DAS FIGURAS [0076] Figuras 1A-1B - Geração de vírus de influenza Sw/Tx/98 derivado de plasmídeo com proteínas mudadas NS1. A figura 1A mostra um diagrama esquemático dos segmentos de gene de influenza NS de tipo selvagem e mudado. O segmento de gene NS foi modificado para criar genes NS1 mudados codificando 73, 99 e 126 aa, respectivamente. As mutações de NS1 não afetam a seqüência da proteína NEP. As seqüências sublinhadas foram introduzidas para gerar códons de parada (em negrito). A figura 1B mostra análise RT-PCR de vírus mutantes de deleção rWT e NS1. Os segmentos RNA viral de influenza foram amplificados usando iniciadores específicos para regiões de não codificação de todos os 8 segmentos virais de influenza. As setas indicam o tamanho decrescente do segmento NS. Os pontos indicam um produto correspondendo à extremidade 31 do segmento do gene HA devido à ligação interna do iniciador dianteiro.
[0077] Figuras 2A-2D. Caracterização de vírus Sw/TX/98 mutantes NS1 e de tipo selvagem derivados de plasmídeos em cultura de tecido. A figura 2A mostra curvas de crescimento de múltiplos ciclos de mutantes de deleção NS1 e tipo selvagem em células PK-15. A figura 2B mostra curvas de crescimento de ciclo único de mutantes de deleção NS1 e tipo selvagem em células PK-15. A figura 2C mostra tamanho de placa em células MDCK em 3 dias após a infecção. A figura 2D mostra um curso no tempo de expressão de proteína viral. As células PK-15 infectadas com vírus mutante NS1 e rWT (MOI = 2) e rotuladas com [35S]Met-Cys nos tempos indicados p.i. Os extratos celulares foram submetidos a SDS-PAGE e analisados por autoradiografia.
[0078] Figuras 3A-3C. Indução de IFN tipo I em células PK-15 infectadas com vírus Sw/TX/98 mutantes NS1 e de tipo selvagem derivados de plasmídeos. A figura 3A mostra uma representação esquemática dos níveis de bioteste IFN de IFN secretado por células infectadas com vírus em um teste fluorescente. A figura 3B mostra um curso no tempo de síntese de IFN de tipo I. As células PK-15 novas
45/132 foram tratadas durante 24 h com sobrenadantes inativados por UV (coletados em diferentes tempos p.i.) de células PK-15 que foram infectadas com os vírus indicados, seguido por infecção por VSV-GFP. Dezesseis horas após a infecção, as células expressando GFP foram visualizadas por microscopia fluorescente. Indução de IFN e TNF-α. Figura 3C mostra uma análise RT-PCR de mRNAs específicos para actina, e TNF-a, IFN-β-, em células PK-15 infectadas com vírus.
[0079] Figuras 4A-4C. Infecção de porcos com 4 semanas de idade com vírus Sw/TX/98 mutantes NS1 e tipo selvagem derivados de plasmídeos. A figura 4A mostra um gráfico de barras mostrando os escores histopatológicos de pulmões de porcos infectados com vírus de deleção TX/98 derivados de plasmídeos. A porcentagem média (±SEM) de superfície de pulmão com lesões macroscópicas no dia 5 p.i. A figura 4B mostra lesões microscópicas nos bronquíolos médios no dia 5 p.i. A figura 4C mostra títulos virais em fluido de lavagem broncoalveolar no dia 5 p.i. [0080] Figuras 5A-5D. Exame histopatológico de pulmões de porcos infectados com vírus Sw/TX/98 mutantes NS1 e tipo selvagem derivados de plasmídeos, ampliação 200 x. A figura 5A mostra bronquíolos de tamanho médio do pulmão de um porco de controle não infectado. O forro epitelial está intacto, e os alveólos circundantes são normais. A figura 5B mostra bronquiolite necrotizante aguda severa e pneumonia intersticial característica de lesão difundida induzida por infecção com vírus rWT TX/98. A figura 5C mostra um bronquíolo normal e um bronquíolo afetado em recuperação prematura da infecção com vírus 1-99 mutante com deleção, representativo de dano menos extensivo induzido por infecção com este vírus. A figura 5D mostra bronquíolo normal e alvéolos circundantes do pulmão de um porco inoculado com vírus 1-126. Não foram induzidas lesões por este vírus.
[0081] Figuras 6A-D. Exame histopatológico de pulmões de porcos infectados com vírus Sw/TX/98 mutantes NS1 e tipo selvagem derivados de plasmídeos, ampliação 200 x. A figura 6A mostra o forro epitelial de bronquíolo maior de pulmão de um porco de controle não infectado. As células epiteliais são colunares altas com núcleos basais pseudo- estratificados e cílios de superfície proeminentes. A figura 6B mostra o forro epitelial de um bronquíolo maior do pulmão de um porco infectado
46/132 com vírus TX/98 rWT. O forro epitelial está em total desarranjo devido a necrose e proliferação regenerativa das células epiteliais. A figura 6C mostra um bronquíolo grande e uma via aérea de ramificação menor do pulmão de um porco infectado com vírus 1 -99 mutante de deleção, representativo de um dano menos extensivo induzido por este vírus. A figura 6D mostra um forro epitelial normal do pulmão de um porco inoculado com vírus 1-126. Não resultou dano bronquiolar.
[0082] Figura 7 - Histopatologia de porcos vacinados com ΤΧ/98/del 126. A figura 7 mostra um gráfico de barras mostrando os escores histopatológicos de pulmões de porcos vacinados com TX/98/del126. Simulado = porcos não vacinados, inoculados por imitação; H3N2 = porcos não vacinados inoculados com 2x105 PFU por porco com A/Swine/Texas/4199-2/98; H1N1 = porcos não vacinados inoculados com 2x105 PFU por porco com A/Swine/MN/37866/99; MLV + simulado = porcos vacinados com ΤΧ/98/del 126, inoculados por imitação; MLV + H3N2 = porcos vacinados com ΤΧ/98/del 126 inoculados com 2x105 PFU por porco com A/Swine/Texas/4199-2/98; MLV+H1N1 = porcos vacinados com ΤΧ/98/del 126 inoculados com 2x105 PFU por porco com A/Swine/MN/37866/99.
[0083] Figura 8: Imuno-histoquímica para antígeno SIV em porcos vacinados com ΤΧ/98/del 126. A figura 8 mostra um gráfico de barras mostrando os escores histopatológicos para porcos vacinados com TX/98/del126. Simulado = porcos inoculados por imitação, não vacinados; H3N2 = porcos não vacinados inoculados com 2x105 PFU por porco com A/Swine/Texas/4199-2/98; H1N1 = porcos não vacinados inoculados com 2x105 PFU por porco com A/Swine/MN/37866/99; MLV + simulado = porcos vacinados com ΤΧ/98/del 126 inoculados por imitação, porcos vacinados com MLV + H3N2 = ΤΧ/98/del 126 inoculados com 2x105 PFU por porco com A/Swine/Texas/4199-2/98; MLV + H1N1 = porcos vacinados com ΤΧ/98/del 126 inoculados com 2x105 PFU por porco com A/Swine/MN/37866/99.
[0084] Figura 9: Títulos virais em lavagem de pulmão de porcos imunizados com ΤΧ/98/del 126 desafiados com SIVs H3N2 e H1N1. Figura 9 mostra um gráfico de barras mostrando os títulos virais em lavagem de pulmão de porcos vacinados com ΤΧ/98/del 126. Simulado = porcos não vacinados, inoculados por imitação, H3N2 =
47/132 porcos não vacinados inoculados com 2x105 PFU por porco com A/Swine/Texas/4199-2/98; H1N1 = porcos não vacinados inoculados com 2x105 PFU por porco com A/Swine/MN/37866/99; MLV + simulado = porcos vacinados com ΤΧ/98/del 126, inoculados por imitação; MLV + H3N2 = porcos vacinados com ΤΧ/98/del 126 inoculados com 2x105 PFU por porco com A/Swine/Texas/4199-2/98; MLV + H1N1 = porcos vacinados com ΤΧ/98/del 126 inoculados com 2x105 PFU por porco com A/Swine/MN/37866/99. O limite de detecção de vírus foi de 101,5 TCIDso/ml.
5. DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO [0085] A presente invenção proporciona vírus atenuados de influenza de suínos tendo uma capacidade prejudicada para antagonizar a resposta de interferon celular (IFN), métodos para produzir estes vírus atenuados de influenza de suínos, e o uso destes vírus em vacinas e formulações farmacêuticas. Estes vírus são capazes de gerar uma resposta imune e criar imunidade mas não causar doença ou causar febre e/ou sintomas menos severos, isto é, os vírus tem uma virulência diminuída. Assim, eles são candidatos ideais para vacinas de vírus vivos. Além disso, os vírus atenuados podem induzir uma resposta a IFN robusta, que tem outras conseqüências biológicas in vivo, dando proteção contra subseqüentes doenças infecciosas e/ou induzindo respostas anti-tumorais. Assim, os vírus atenuados de influenza de suínos podem ser usados farmaceuticamente, para a prevenção ou tratamento de outras doenças infecciosas e/ou doenças tratáveis por IFN.
[0086] A invenção é baseada em parte, na verificação dos requerentes de que os vírus de influenza de suínos engenheirados para conter ou contendo uma deleção (s) no gene NS1 tem uma replicação prejudicada com relação aos vírus de influenza de suínos de tipo selvagem como demonstrado por menos lesões no pulmão quando da infecção de porcos, reduzidos títulos virais em fluido de lavagem broncoalveolar (BALF) e reduzida detecção de vírus em esfregaços nasais. Surpreendentemente, e contrário aos resultados vistos com vírus de influenza humano em modelos de camundongos, o comprimento da proteína NS1 não está correlacionado com o nível de atenuação do vírus de influenza de suínos. Os requerentes verificaram que com a
48/132 influenza de suínos, um vírus mutante com a proteína NS1 mais curta é o menos atenuado. Em outras palavras, os vírus de influenza de suínos contendo deleções mais curtas no gene NS1 demonstram uma maior atenuação in vivo do que os vírus de influenza de suínos contendo deleções mais longas em seu gene NS1, ou vírus de influenza de suínos de tipo selvagem. Os requerentes ainda verificaram que os vírus de influenza de suínos recombinantes são prejudicados em sua capacidade de inibir a produção de IFN in vivo, e eles não replicam tão eficientemente como a cepa recombinante parental em ovos de galinha embrionados de 10 dias de idade, em células MDCK, em células PK-15 ou em um modelo de porco in vivo. Apesar de não se desejar limitar por qualquer teoria ou explicação para o mecanismo de ação dos mutantes de deleção de NS1 de vírus de influenza de suínos in vivo, os aspectos atenuados destes vírus são provavelmente devido a seus níveis de expressão de proteína NS1, sua capacidade de induzir uma resposta de IFN celular robusta, e sua capacidade prejudicada de antagonizar esta resposta. No entanto, os aspectos benéficos destes vírus podem não ser apenas atribuíveis a seu efeito sobre a resposta de interferon celular. De fato, alterações em outras atividades associadas com NS1, como alteração de emenda pré-mRNA, inibição de poliadenilação de mRNA celular, transporte nucleocitoplásmico de mRNA contendo poli(A), e estímulo de síntese de proteína viral, podem contribuir para o fenótipo atenuado desejado obtido pela introdução de mutações no gene NS1 de vírus de influenza de suínos. [0087] Uma influenza atenuada de suínos da presente invenção compreende uma mutação no gene NS1 de influenza de suínos, que diminui a capacidade de produto de gene NS1 de antagonizar a resposta de interferon celular. Em uma forma de realização, um vírus de influenza de suínos atenuado da invenção compreende um genoma compreendendo uma mutação em gene NS1 de vírus de influenza de suínos que diminui a capacidade do produto de gene NS1 de antagonizar uma resposta de interferon celular, e permite ao vírus atenuado, em uma multiplicidade de infecção (MOI) de entre 0,0005 e 0,001, 0,001 e 0,01, 0,01 e 0,1, ou 0,1 e 1, ou um MOI de 0,0005, 0,0007, 0,001, 0,005, 0,01, 0,05, 0,1, 0,5, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0,
3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, ou 6,0, crescer a títulos entre aproximadamente 1 a
49/132 aproximadamente 100 vezes, aproximadamente 5 a aproximadamente 80 vezes, aproximadamente 20 a aproximadamente 80 vezes, ou aproximadamente 40 a aproximadamente 80 vezes, aproximadamente 1 a aproximadamente 10 vezes, aproximadamente 1 a aproximadamente 5 vezes, aproximadamente 1 a aproximadamente 4 vezes, aproximadamente 1 a aproximadamente 3 vezes, aproximadamente 1 a aproximadamente 2 vezes, ou aproximadamente 1,2,3, 4, 5,
6, 7, 8, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 ou 100 vezes menores do que o vírus de influenza de suínos de tipo selvagem em células (por exemplo células de um humano (por exemplo, PerC6, uma linhagem de células produtoras derivadas de retinoblastos embriônicos humanos transformados com a região E1 de adenovírus 5), camundongo, galinha, (por exemplo, fibroblastos de embrião de galinha), rato, pássaros, ou porco (por exemplo, células PK(D1), células PK(15), células PK13, células NSK, células LLC-PK1, células LLC-PK1A, células ESK-4, células ST, células PT-K75, células PK-2a/CL 13 ou SJPL)), como determinado em aproximadamente 2 a 10 dias, 3 a 7 dias, 3 a 5 dias, ou 2, 3, 4, 5, 6,
7, 8,9, 10 dias após a infecção quando propagados sob as mesmas condições. Os títulos de vírus de influenza de suínos atenuado e de tipo selvagem podem ser determinados usando qualquer técnica bem conhecida na técnica ou descrita aqui (por exemplo testes de hemaglutinação, testes de placas, dose infecciosa de ovo (EID50), dose infecciosa de cultura de tecido (TCID50),, etc.) e os vírus podem ser propagados sob condições descritas aqui ou bem conhecidas na técnica (por exemplo, em células de porco, células MDCK (por exemplo, em MEM, 10% p/p de soro de bezerro fetal (FCS), 1% de penicilina/estreptomicina a 37 °C em um incubador umidificado de CO2 a 5%), ou ovos de galinha embrionados (por exemplo, em um incubador estacionário a 37 °C com 55% de umidade relativa). Alternativamente, os vírus podem ser propagados em células (por exemplo, em células de porco, células MDCK, etc.) que são cultivadas em meio isento de soro ou reduzido em soro (por exemplo, tripsina TPCK). Em outra forma de realização, 0 crescimento de um vírus atenuado de influenza de suínos da invenção é comparado com um padrão ou referência particular, por exemplo vírus de influenza de suínos de
50/132 tipo selvagem A/Swine/Texas/4199-2/98.
[0088] Em uma forma de realização específica, um vírus atenuado de influenza de suínos compreende um genoma compreendendo uma mutação no gene NS1 de influenza de suínos, que diminui a capacidade de produto de gene NS1 de antagonizar a resposta de interferon celular e permite ao vírus atenuado, em uma multiplicidade de infecção (MOI) de entre 0,0005 e 0,001, 0,001 e 0,01, 0,01 e 0,1, ou 0,1 e 1, ou um MOI de 0,0005, 0,0007, 0,001,0,005, 0,01, 0,05, 0,1, 0,5, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, ou 6,0, crescer a títulos entre aproximadamente 1 a aproximadamente 100 vezes, aproximadamente 5 a aproximadamente 80 vezes, aproximadamente 20 a aproximadamente 80 vezes, ou aproximadamente 40 a aproximadamente 80 vezes, aproximadamente 1 a aproximadamente 10 vezes, aproximadamente 1 a aproximadamente 5 vezes, aproximadamente 1 a aproximadamente 4 vezes, aproximadamente 1 a aproximadamente 3 vezes, aproximadamente 1 a aproximadamente 2 vezes, ou aproximadamente 1,2,3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 ou 100 vezes menores do que o vírus de influenza de suínos de tipo selvagem em células de suínos, como determinado em aproximadamente 2 a 10 dias, 3 a 7 dias, 3 a 5 dias, ou 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 dias após a infecção quando propagados sob as mesmas condições. Os títulos de vírus de influenza de suínos atenuado e de tipo selvagem podem ser determinados usando qualquer técnica bem conhecida na técnica ou descrita aqui (por exemplo testes de hemaglutinação, testes de placas, doses infecciosas de ovo (EID50), doses infecciosas de cultura de tecido (TCID50),, etc.) e os vírus podem ser propagados sob condições descritas aqui ou bem conhecidas na técnica (por exemplo, em células de porco, células MDCK (por exemplo, em MEM, 10% p/p de soro de bezerro fetal (FCS), 1% de penicilina/estreptomicina a 37 °C em um incubador umidificado de CO2 a 5%), ou ovos de galinha embrionados (por exemplo, em um incubador estacionário a 37 °C com 55% de umidade relativa). Alternativamente, os vírus podem ser propagados em células (por exemplo, em células de porco, células MDCK, etc.) que são cultivadas em meio isento de soro ou reduzido em soro (por exemplo, tripsina
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TPCK).
[0089] Um vírus atenuado de influenza de suínos tendo o fenótipo desejado pode ser usado, ele mesmo, como o ingrediente ativo em formulações de vacina, farmacêuticas ou imunogênicas. Alternativamente, o vírus atenuado de influenza de suínos pode ser usado como o vetor ou “estrutura dorsal” de vacinas produzidas recombinantemente ou formulações imunogênicas. Para esta finalidade, a técnica de “genética reversa” pode ser usada para engenheirar mutações ou introduzir epítopos estranhos no vírus atenuado de influenza de suínos, que deve servir como a cepa “parental”. Deste modo, as vacinas podem ser projetadas para imunização contra variantes de cepas ou na alternativa, contra agentes infecciosos completamente diferentes ou antígenos de doença (por exemplo antígenos de tumor). Por exemplo, o vírus atenuado pode ser engenheirado para expressar epítopos neutralizantes de outras cepas pré-selecionadas. Alternativamente, epítopos de outros vírus podem ser construídos no vírus atenuado de influenza de suínos. Alternativamente, epítopos de patógenos infecciosos não virais (por exemplo, parasitas, bactéria, fungos) podem ser engenheirados no vírus de influenza de suínos.
[0090] A presente invenção proporciona métodos para a vacinação de um indivíduo compreendendo a administração das formulações de vacina da invenção. Em uma forma de realização, a presente invenção proporciona um método compreendendo a administração a um indivíduo de uma quantidade eficaz de uma formulação de vacina da invenção. Em algumas formas de realização, a dose da formulação de vacina administrada ao indivíduo está entre cerca de 102 a cerca de 10®, cerca de 10® a cerca de 107, ou cerca de 104 a cerca de 5 x 10® pfu. Em outras formas de realização, a dose da formulação de vacina administrada é de 102, 5 x 102, 10®, 5 x 10®, 104, 5 x 104, 105, 5 x 105, 10®, 5 x 10®, 107, 5 x 107 ou 10® pfu. Em outras formas de realização, a dose de uma formulação imunogênica da invenção administrada a um indivíduo é de 102 a cerca de 10®, cerca de 10® a cerca de 107, ou cerca de 104 a cerca de 5 x 10® pfu. Em ainda outras formas de realização, a dose de uma formulação imunogênica da invenção administrada a um indivíduo é de 102, 5 x 102, 10®, 5 x 10®, 104, 5 x 104, 105, 5 x 105, 10®, 5 x 10®, 107, 5 x 107 ou 10® pfu.
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Em formas de realização específicas, o indivíduo é um asno, zebra, camelo, cão, aves (por exemplo, um pato). Em uma forma de realização preferida, o indivíduo é um porco.
[0091] A presente invenção proporciona formulações imunogênicas compreendendo um vírus atenuado de influenza de suínos da invenção e métodos para induzir uma resposta imune para o tratamento, controle ou prevenção de uma infecção por vírus de influenza de suínos ou uma condição ou sintoma associado com a mesma, uma infecção diferente de uma infecção por vírus de influenza de suínos, ou uma condição ou sintoma associado com a mesma, ou uma condição em que o vírus atenuado de influenza de suínos pode ser usado como um uma resposta imune a um antígeno particular associado com a condição, compreendendo administrar a um indivíduo uma formulação imunogênica da invenção. Em uma forma de realização, a presente invenção proporciona um método para induzir uma resposta imune para o tratamento, controle ou prevenção de uma infecção por vírus de influenza de suínos ou uma condição ou sintoma associado com a mesma, uma infecção diferente de uma infecção por vírus de influenza de suínos, ou uma condição ou sintoma associado com a mesma, ou uma condição em que o vírus atenuado de influenza de suínos pode ser usado como um uma resposta imune a um antígeno particular associado com a condição, compreendendo administrar a um indivíduo uma quantidade eficaz de uma formulação imunogênica da invenção. Em algumas formas de realização, a dose de uma formulação imunogênica da invenção administrada em um indivíduo está entre cerca de 102 a cerca de 108, cerca de 103 a cerca de 107, ou cerca de 104 a cerca de 5 x 106 pfu ou cerca de 104 a cerca de 107 pfu. Em outras formas de realização, a dose de uma formulação imunogênica da invenção administrada em um indivíduo é 102, 5 x 102, 103, 5 x 103, 104, 5 x 104, 105, 5 x 105, 106, 5 x 106, 107, 5 x 107 ou 108 pfu. Nas formas de realização específicas, o indivíduo é um asno, zebra, camelo, cão, aves (por exemplo, um pato). Em uma forma de realização preferida, o indivíduo é um porco.
[0092] Os vírus atenuados de influenza de suínos, que induzem respostas de IFN robustas em indivíduos, também podem ser usados em formulações
53/132 farmacêuticas para profilaxia ou tratamento de outras infecções ou doenças tratáveis com IFN, como câncer. Neste aspecto, o tropismo do vírus atenuado de influenza de suínos pode ser alterado para marcar o vírus em um órgão de marcação desejado, tecido ou células in vivo ou ex vivo. Usando esta abordagem, a resposta de IFN pode ser induzida localmente, em um sítio de marcação, assim evitando ou minimizando os efeitos laterais de terapia sistêmica de IFN. Para esta finalidade, o vírus atenuado de influenza de suínos pode ser engenheirado para expressar um ligando específico para um receptor do órgão, tecido ou células alvos.
[0093] A presente invenção proporciona métodos para prevenir, controlar ou tratar uma infecção, ou uma doença tratável por IFN, em um indivíduo, diferente de uma infecção viral de influenza de suínos, ou uma doença tratável por IFN causada por vírus de influenza de suínos, compreendendo a administração de uma formulação farmacêutica da invenção. Em uma forma de realização, a presente invenção proporciona um método para prevenir, controlar ou tratar uma infecção ou doença tratável por IFN em um indivíduo, diferente de uma infecção viral por influenza de suínos ou doença tratável por IFN causada por vírus de influenza de suínos, compreendendo administrar uma quantidade eficaz de uma formulação farmacêutica da invenção. Em algumas formas de realização, a dose da formulação farmacêutica administrada no indivíduo está entre cerca de 102 a cerca de 108, cerca de 103 a cerca de 107, cerca de 104 a cerca de 5 x 106 pfu, ou cerca de 104 a cerca de 1012 pfu. Nas formas de realização específicas, a formulação farmacêutica administrada ao indivíduo tem uma concentração de vírus atenuado de influenza de cerca de 104 a cerca de 1012 pfu/ml. Em outras formas de realização, a dose da formulação farmacêutica administrada ao indivíduo é de 102, 5 x 102, 103, 5 x 103, 104, 5x 104, 105, 5x 105, 106, 5x 106, 107, 5x 107, 10®, 5x 10®, 1 x 109, 5 x 109, 1 x 1010, 5 x 1010, 1 x 1011, 5 x 1011 ou 1012 pfu. Nas formas de realização específicas, o indivíduo é um asno, zebra, camelo, cão, aves (por exemplo, um pato). Em uma forma de realização preferida, o indivíduo é um porco.
[0094] A presente invenção proporciona métodos para prevenir, controlar ou tratar câncer em um indivíduo compreendendo administrar uma formulação
54/132 farmacêutica da invenção. Em uma forma de realização, a presente invenção proporciona um método para prevenir, controlar ou tratar câncer em um indivíduo compreendendo administrar uma quantidade eficaz de uma formulação farmacêutica da invenção. Em algumas formas de realização, a dose da formulação farmacêutica administrada ao indivíduo está entre cerca de 102 a cerca de 10®, cerca de 103 a cerca de 107, cerca de 104 a cerca de 5 x 106 pfu, ou cerca de 104 a cerca de 1012 pfu. Em outras formas de realização, a dose da formulação farmacêutica administrada ao indivíduo é de 102, 5 x 102, 103, 5 x 103, 104, 5 x 104, 105, 5 x 105, 10®, 5x 106, 107, 5x 107, 10®, 5x 108, 1 x 109, 5x 109, 1 x 101°, 5 x 101°, 1 x1011,5x 1011 ou 1012pfu.
[0095] Os requerentes demonstraram que os vírus atenuados de influenza de suínos com atividade de antagonista de interferon prejudicada foram mostrados como replicando in vivo gerando títulos que são menores do que os detectados com vírus de influenza de suínos de tipo selvagem, mas que são suficientes para induzir respostas imunológicas e de citocinas. Assim, mutações que diminuem, mas não abolem a atividade de antagonista de IFN do vírus de influenza de suínos são preferidas para formulações de vacina. Estes vírus podem ser selecionados para crescimento em substratos tanto convencionais como não convencionais, e para virulência intermediária.
[0096] A presente invenção proporciona células contendo (alternativamente, compreendendo) vírus de influenza de suínos da presente invenção. Em uma forma de realização específica, uma célula contém/compreende um vírus de influenza de suínos que é geneticamente engenheirado. Em algumas formas de realização, o vírus atenuado de influenza de suínos contido na célula é engenheirado para codificar um epítopo derivado de outro vírus ou um antígeno de tumor. De acordo com esta forma de realização, o genoma do vírus atenuado de influenza de suínos pode compreender pelo menos um segmento derivado de um vírus diferente. Qualquer célula pode ser infectada com, conter ou compreender um vírus atenuado de influenza de suínos da invenção incluindo, mas não limitado a células MDCK, células PK, células Vero, células endoteliais de veia umbilical humana primária,
55/132 (HUVEC), linhagem de célula epitelial humana H292, células HeLa, e células do rim embriônicas de suínos RES. Em uma forma de realização preferida, a célula é uma célula de porco ou de uma linhagem de células de porco. Em algumas formas de realização, a célula (por exemplo, uma célula de porco ou linhagem de células de porco) é deficiente em interferon.
[0097] A invenção engloba o uso de substratos como células, linhagens de células e ovos embrionados, para propagar os vírus atenuados de influenza de suínos da invenção. Em uma forma de realização, a invenção proporciona métodos para produção de vacinas, produção de formulações imunogênicas e produção de fármacos, compreendendo propagar, em um substrato, um vírus atenuado de influenza de suínos da presente invenção e coletar a progênie do vírus, em que o substrato é uma célula, linhagem de células ou ovo embrionado. Em algumas formas de realização, o substrato é um sistema deficiente em IFN. Sistemas deficientes em IFN exemplares incluem, mas não são limitados a ovos embrionados jovens (por exemplo, ovos embrionados com 6 a 10 dias de idade, 6 a 9 dias de idade, 6 a 8 dias de idade ou 6 a 7 dias de idade), e linhagens de células deficientes em IFN (como células VERO ou linhagens de células geneticamente engenheiradas como inativações STAT1). Ovos embrionados ou linhagens de células pré-tratados com compostos que inibem o sistema IFN (incluindo drogas, anticorpos, anti-sentido, ribozimas, etc.) também podem ser usados como um sistema deficiente em IFN. Além disso, ovos deficientes no sistema de IFN, por exemplo, ovos produzidos por pássaros negativos STAT1, especialmente aves domésticas, incluindo mas não limitadas a galinhas transgênicas, patos ou perus, podem ser usados como um sistema deficiente em IFN.
5.1. Geração de mutantes com atividade de antagonista de IFN alterada [0098] Qualquer vírus mutante de influenza de suínos ou cepa que tem uma atividade de antagonista de IFN diminuída pode ser selecionado e uso de acordo com a invenção. Em uma forma de realização, os mutantes ou variantes de ocorrência natural, ou mutantes de influenza de suínos espontâneos, podem ser selecionados, os quais tem uma capacidade prejudicada de antagonizar a resposta
56/132 a IFN celular. Em outra forma de realização, os vírus de influenza de suínos mutantes podem ser gerados por exposição do vírus a mutagenes, como irradiação ultra-violeta, ou mutagenes químicos, ou por passagens múltiplas e/ou passagem em hospedeiros não permissivos. A triagem em um sistema de crescimento diferencial pode ser usada para selecionar pelos mutantes tendo função de antagonista de IFN prejudicada. Porque o vírus de influenza de suínos A tem um genoma segmentado, o fenótipo atenuado pode ser transferido para outra cepa tendo um antígeno desejado por reagrupamento (isto é, por exemplo co-infecção do vírus atenuado e a cepa desejada, e seleção para reagrupantes mostrando ambos os fenótipos). Em uma forma de realização específica, os vírus de influenza de suínos da invenção não são vírus de ocorrência natural. Em outra forma de realização específica, os vírus de influenza de suínos da invenção são vírus geneticamente engenheirados. Em ainda outra forma de realização, um vírus de influenza de suínos com mutações de ocorrência natural no gene NS1 não são englobados pela invenção. Em ainda outra forma de realização específica, ambos os vírus de influenza de suínos com mutações no gene NS1 não são englobados pela invenção. Em formas de realização específicas, os vírus de influenza de suínos da invenção contém todo ou uma porção do gene NS1 derivado de vírus de influenza humano.
[0099] As mutações podem ser engenheiradas em vírus de influenza de suínos usando abordagens de “genética reversa”. Deste modo, as mutações naturais ou outras que conferem o fenótipo atenuado podem ser engenheiradas em cepas de vacinas. Por exemplo, deleções, inserções ou substituições da região de codificação do gene de vírus de influenza de suínos para a atividade de antagonista de IFN (isto é, o NS1 do vírus de influenza de suínos) podem ser engenheiradas. As deleções, inserções ou substituições na região de não codificação do gene de vírus de influenza de suínos responsável por atividade de antagonista de IFN também são contempladas. Para isto, as mutações nos sinais responsáveis pela transcrição, replicação, poliadenilação e/ou embalagem do gene responsável pela atividade do antagonista de IFN podem ser engenheiradas. Estas mutações, por exemplo, no
57/132 promotor, podem regular descendentemente a expressão do gene de vírus de influenza de suínos responsável pela atividade de antagonista de IFN. As mutações no promotor podem ser feitas, por exemplo, por embaralhamento do promotor (por exemplo do promotor do vírus de influenza B) ou em regiões de não codificação de gene NS1. As mutações em genes de vírus de influenza de suínos que podem regular a expressão do gene de vírus de influenza de suínos responsável pela atividade de antagonista de IFN (isto é, o gene NS1 do vírus de influenza de suínos) também estão no escopo de vírus que podem ser usados de acordo com a invenção.
[0100] A presente invenção também proporciona vírus de influenza de suínos compreendendo genomas compreendendo mutações para o segmento do gene NS1 que podem não resultar em uma atividade de antagonista de IFN alterada ou um fenótipo indutor de IFN, mas ao contrário resultar em funções virais alteradas e um fenótipo atenuado, por exemplo inibição alterada de exportação nuclear de mRNA contendo poli(A), inibição alterada de emenda pré-mRNA, inibição alterada de ativação de PKR por seqüestro de dsRNA, efeito alterado sobre a tradução de RNA viral e inibição alterada de poliadenilação de mRNA hospedeiro (por exemplo, ver Krug em Textbook of Influenza, Nicholson et al. ed. 1998, 82 - 92, e referências citadas no mesmo).
[0101] A técnica de genética reversa envolve a preparação de RNAs virais recombinantes sintéticos que contém as regiões de não codificação do RNA do vírus de influenza de suínos que são essenciais para o reconhecimento por polimerases virais e para os sinais de embalagem necessários para gerar um virion maduro. Os RNAs recombinantes são sintetizados de um gabarito de DNA recombinante e reconstituídos in vitro com complexo de polimerase viral purificado para formar ribonucleoproteínas recombinantes (RNPs) que podem ser usadas para transfectar células. Uma transfecção mais eficiente é obtida se as proteínas de polimerase viral estiverem presentes durante a transcrição dos RNAs sintéticas ou in vitro ou in vivo. Os RNPs recombinantes sintéticos podem ser resgatados em partículas de vírus infecciosas. As técnicas acima são descritas nas patente U.S. número 5.166.057
58/132 expedida em 24 de novembro de 1992; em patente U.S. número 5.854.037 expedida em 29 de dezembro de 1998; na publicação de patente européia EP 0702085A1, publicada em 20 de fevereiro de 1996; no pedido de patente U.S. série número 09/152.845; nas publicações de patente internacional PCT WO 97/12032 publicada em 3 de abril de 1997; WO 96/34625 publicado em 7 de novembro de 1996; na publicação de patente européia EP-A780475; WO 99/02657 publicada em 21 de janeiro de 1999; WO 98/53078 publicado em 26 de novembro de 1998; WO 98/02530 publicado em 22 de janeiro de 1998; WO 99/15672 publicado em 1 de abril de 1999; WO 98/13501 publicado em 2 de abril de 1998; WO 97/06270 publicado em 20 de fevereiro de 1997; e EPO 780 475A1 publicado em 25 de junho de 1997, cada sendo incorporado aqui por referência em sua totalidade.
[0102] A tecnologia de plasmídeo isento de auxiliar também pode ser usada para engenheirar um vírus atenuado de influenza de suínos. Para uma descrição de uma tecnologia de plasmídeo isento de auxiliar ver, por exemplo, publicação internacional número WO 01/04333; patente U.S. número 6.649.372; Fodor et al., 1999, J. Virol. 73: 9679 - 9682; Hoffmann et al., 2000, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 97: 6108 - 6113; e Neumann et al., 1999, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 96: 9345 - 9350, que são incorporados aqui por referência em suas totalidades.
[0103] Os vírus atenuados gerados pela abordagem de genética reversa ou tecnologia de plasmídeo isento de auxiliar podem ser usados nas formulações de vacina, imunogênicas e farmacêuticas descritas aqui. As técnicas de genética reversa ou tecnologia de plasmídeo isento de auxiliar também podem ser usadas para engenheirar mutações adicionais para outros genes virais importantes para produção de formulações de vacina, imunogênicas e farmacêuticas - isto é, os epítopos de variantes de cepas de vacinas utilizáveis podem ser engenheirados no vírus atenuado de influenza de suínos. Alternativamente, epítopos completamente estranhos, incluindo antígenos derivados de outros patógenos virais ou não virais podem ser engenheirados na cepa atenuada. Por exemplo, antígenos de vírus não relacionados, antígenos parasitas, antígenos bacterianos ou fúngicos, ou antígenos de tumor podem ser engenheirados na cepa atenuada (por exemplo epítopos de
59/132 vírus de síndrome respiratória e reprodutiva de porcinos, citomegalo vírus porcino, vírus corona respiratório porcino, vírus encefalomiocardite porcina, diarréia epidêmica porcina, e determinantes antigênicos de patógenos de suínos não virais como bactérias, incluindo, mas não limitados a Brucella suis, e parasitas, incluindo, mas não limitados a áscaris (Ascaris suum), nematóides (Trichuris suis), ou um antígeno de tumor como antígeno carcinoembriônico (CEA), antígeno de câncer de mama como EGFR (receptor de fator de crescimento epidérmico), antígeno HER2 (p185HER2), epítopo HER2 neu, antígeno-50 de câncer (CA-50), antígeno de câncer 15-3 (CA15-3) associado com câncer de mama, antígeno associado a carcinoma (CAA), antígeno de melanoma, e antígenos associados a melanoma 100, 25, e 150). Alternativamente, epítopos que alteram o tropismo do vírus in vivo podem ser engenheirados nos vírus atenuados quiméricos da invenção.
[0104] Em uma forma de realização específica, uma combinação de técnicas de genética reversa ou tecnologia isenta de auxiliar e técnicas de reagrupamento podem ser usadas para engenheirar vírus atenuados tendo os epítopos desejados em vírus de influenza de suínos. Por exemplo, um vírus atenuado de influenza de suínos (gerado. Por exemplo, por técnicas de genética reversa ou tecnologia de plasmídeo isento de auxiliar, ou uma combinação das mesmas), de uma cepa transportando o epítopo de vacina desejado (gerado, por exemplo, por seleção natural, mutagenese, técnicas de genética reversa, tecnologia de plasmídeo isento de auxiliar, ou uma combinação das mesmas) pode ser co-infectado em hospedeiros que permitem o reagrupamento dos genomas segmentados. Os reagrupantes que demonstram tanto o fenótipo atenuado como o epítopo desejado podem ser então selecionados. Em uma forma de realização particular, as técnicas de reagrupamento podem ser usadas para transferir o fenótipo atenuado de uma cepa parental de vírus de influenza de suínos (um mutante natural, um vírus mutagenizado, ou um vírus geneticamente engenheirado) para uma cepa de vírus diferente (um vírus de tipo selvagem, um mutante natural, um vírus mutagenizado, ou um vírus geneticamente engenheirado).
[0105] Em uma forma de realização específica, a presente invenção provê um
60/132 vírus atenuado de influenza de suínos compreendendo um genoma compreendendo uma mutação no gene NS1 de vírus de influenza de suínos que diminui a capacidade do produto de gene NS1 de antagonizar uma resposta de interferon celular. De acordo com esta forma de realização, o vírus atenuado de influenza de suínos é preferivelmente geneticamente engenheirado.
[0106] Os vírus atenuado de influenza de suínos da invenção podem ter uma ou mais de uma combinação de qualquer uma das seguintes características: a capacidade de induzir a atividade de interferon em um nível menor do que (por exemplo, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% menor do que) o do vírus de influenza de suínos de tipo selvagem, por exemplo A/Swine/Texas/4199-2/98, como medido por testes de interferon padrões; um título viral de 1 a 50, 2 a 25, 2 a 10 ou 3 a 7 vezes menor do que o do vírus de influenza de suínos de tipo selvagem, por exemplo, A/Swine/Texas/4199-2/98, quando cultivado sob as mesmas condições (por exemplo, inoculado a um MOI de 0,0001, 0,0005, 0,001, 0,005, 0,01, 0,05, 0,1, 0,5,
1,5 ou 10 e cultivado em células PK, células PK(D1), células PK(15), células PK13, células NSK, células LLC-PK1, células LLC-PK1A, células ESK-4, células ST, células PT-K75, células PK-2a/CL 13 ou células SJPL e testado em células MDCK); um título viral de 1 a 10 vezes, 1 a 5 vezes, 5-10 vezes, 10 a 500, 20 a 250, 20 a 100 ou 40 a 80 vezes menor do que o do vírus de influenza de suínos de tipo selvagem, por exemplo, A/Swine/Texas/4199-2/98, quando isolado de BALF de porcos infectados como testado em um teste de placa realizado em células MDCK; ou uma capacidade reduzida de causar lesões no pulmão em porcos infectados.
[0107] Em uma forma de realização específica, um vírus atenuado de influenza de suínos da invenção compreendendo uma mutação em um gene NS1 de vírus de influenza de suínos que diminui a capacidade do produto de gene NS1 de antagonizar uma resposta de interferon celular, e permitir ao vírus atenuado, em uma multiplicidade de infecção (MOI) de entre 0,0005 e 0,001, 0,001 e 0,01, 0,01 e 0,1, 0,1 e 1, ou 0,1 e 1, ou um MOI de 0,0005, 0,0007, 0,001, 0,005, 0,01,0,05, 0,1, 0,5, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, ou 6,0, crescer a títulos entre
61/132 aproximadamente 1 a aproximadamente 100 vezes, aproximadamente 5 a aproximadamente 80 vezes, aproximadamente 20 a aproximadamente 80 vezes, ou aproximadamente 40 a aproximadamente 80 vezes, aproximadamente 1 a aproximadamente 10 vezes, aproximadamente 1 a aproximadamente 5 vezes, aproximadamente 1 a aproximadamente 4 vezes, aproximadamente 1 a aproximadamente 3 vezes, aproximadamente 1 a aproximadamente 2 vezes, ou aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, ou aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 7, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 ou 100 vezes menos do que o vírus de influenza de suínos de tipo selvagem em células (por exemplo, células de um humano (por exemplo, PerC6, uma linhagem de células produtoras derivadas de retinoblastos embriônicos humanos transformados com a região E1 de adenovírus 5), camundongo, galinha, (por exemplo, fibroblastos de embrião de galinha), rato, pássaros, ou porco (por exemplo, células PK(D1), células PK(15), células PK13, células NSK, células LLC-PK1, células LLC-PK1A, células ESK-4, células ST, células PT-K75, células PK-2a/CL 13 ou SJPL)), como determinado por um teste de hemaglutinação de BALF obtido de porcos ou sobrenadantes de células de porco a aproximadamente 2 a 10 dias, 3 a 7 dias, 3 a 5 dias, ou 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9, 10 dias após a infecção ou quando os vírus são colocados em placas em células MDCK. Em uma forma de realização, o crescimento de um vírus atenuado de influenza de suínos da invenção é comparado a um padrão ou referência particular, por exemplo vírus de influenza de suínos de tipo selvagem A/Swine/Texas/41992/98. De acordo com estas formas de realização, o vírus atenuado pode ser geneticamente engenheirado para conter ou expressar seqüências de ácido nucleico de vírus de influenza não suíno como, por exemplo, um epítopo de um patógeno estranho ou antígeno de tumor. Preferivelmente, as seqüências de vírus de influenza não suínos não incluem uma seqüência de ácido nucleico que altera o fenótipo atenuado do vírus. Conseqüentemente, as seqüências de ácido nucleico codificando proteínas, polipeptídeos ou peptídeos com atividade antagonizante de interferon não são preferivelmente engenheiradas em vírus de influenza de suínos.
[0108] A invenção proporciona vírus atenuado de influenza de suínos
62/132 compreendendo um genoma compreendendo pelo menos duas, pelo menos três, pelo menos quatro ou mais mutações em dois, três, quatro ou mais genes de vírus de influenza de suínos, em que pelo menos uma das mutações ocorre no gene NS1 e contribui para ou é responsável (diretamente ou indiretamente) para a atenuação do vírus e/ou a capacidade diminuída do vírus de antagonizar uma resposta de interferon celular. Em uma forma de realização específica, um vírus atenuado de influenza de suínos da invenção compreende um genoma compreendendo pelo menos duas, pelo menos três, pelo menos quatro ou mais mutações em dois, três, quatro ou mais genes de vírus de influenza de suínos, em que pelo menos uma das mutações ocorre no gene NS1 e é responsável pela capacidade diminuída do produto de gene NS1 de antagonizar uma resposta de interferon celular, e permite ao vírus atenuado, em um MOI de entre 0,0005 e 0,001,0,001 e 0,01,0,01 e 0,1, ou 0,1 e 1, ou MOI de 0,0005, 0,0007, 0,001, 0,005, 0,01, 0,05, 0,1, 0,5, 1,0, 1,5, 2,0,
2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, ou 6,0, crescer a títulos entre aproximadamente 1 a aproximadamente 100 vezes, aproximadamente 5 a aproximadamente 80 vezes, aproximadamente 20 a aproximadamente 80 vezes, ou aproximadamente 40 a aproximadamente 80 vezes, aproximadamente 1 a aproximadamente 10 vezes, aproximadamente 1 a aproximadamente 5 vezes, aproximadamente 1 a aproximadamente 4 vezes, aproximadamente 1 a aproximadamente 3 vezes, aproximadamente 1 a aproximadamente 2 vezes, ou aproximadamente 1,2,3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 ou 100 vezes menores do que o vírus de influenza de suínos de tipo selvagem, por exemplo A/Swine/Texas/4199-2/98, em células de porco, como determinado por, por exemplo, testes de hemaglutinação, aproximadamente 2 a 10 dias, 3 a 7 dias, ou 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9, 10 dias após a infecção quando os vírus são propagados sob as mesmas condições. Em outra forma de realização, um vírus atenuado de influenza de suínos da invenção compreende um genoma compreendendo pelo menos duas, três, quatro ou mais mutações em dois, três, quatro ou mais genes de vírus de influenza de suínos, em que pelo menos uma das mutações ocorre no gene NS1 e é responsável pela atenuação do vírus, e permite ao vírus atenuado, em um MOI de
63/132 entre 0,0005 e 0,001, 0,001 e 0,01, 0,01 e 0,1, ou 0,1 e 1, ou um MOI de 0,0005, 0,0007, 0,001, 0,005, 0,01, 0,05, 0,1, 0,5, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0,
5,5, ou 6,0, crescer a títulos entre aproximadamente 1 a aproximadamente 100 vezes, aproximadamente 5 a aproximadamente 80 vezes, aproximadamente 20 a aproximadamente 80 vezes, ou aproximadamente 40 a aproximadamente 80 vezes, aproximadamente 1 a aproximadamente 10 vezes, aproximadamente 1 a aproximadamente 5 vezes, aproximadamente 1 a aproximadamente 4 vezes, aproximadamente 1 a aproximadamente 3 vezes, aproximadamente 1 a aproximadamente 2 vezes, ou aproximadamente 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 ou 100 vezes menores do que o vírus de influenza de suínos de tipo selvagem, por exemplo, A/Swine/Texas/41992/98, em células de porco, como determinado por, por exemplo, testes de hemaglutinação, aproximadamente 2 a 10 dias, 3 a 7 dias, 3 a 5 dias, ou 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9, 10 dias após a infecção quando os vírus são propagados sob as mesmas condições (por exemplo, em células MDCK). De acordo com estas formas de realização, o vírus atenuado tem um fenótipo de antagonista de interferon prejudicado e os vírus podem ser geneticamente engenheirados para conter ou expressar seqüências de ácido nucleico de vírus de influenza não suíno, como por exemplo, um epítopo de um patógeno estranho (por exemplo, epítopos de vírus de síndrome respiratória e reprodutiva de porcinos, citomegalo vírus porcino, vírus corona respiratório porcino, vírus encefalomiocardite porcina, diarréia epidêmica porcina, e determinantes antigênicos de patógenos não virais como bactérias e parasitas, para mencionar apenas alguns), ou um antígeno de tumor. Preferivelmente, as seqüências de vírus de influenza não suínos (seqüências heterólogas) não incluem uma seqüência de ácido nucleico que altera o fenótipo atenuado do vírus. Assim, as seqüências de ácido nucleico codificando proteínas, polipeptídeos ou peptídeos com atividade antagonizante de interferon não são preferivelmente engenheiradas no vírus de influenza de suínos.
[0109] Qualquer mutação que resulte no fenótipo desejado (preferivelmente, uma capacidade prejudicada de antagonizar uma resposta de interferon celular) pode ser
64/132 introduzida no gene NS1 do vírus de influenza de suínos. Os exemplos de tipos de mutações que podem ser incluídos em ou introduzidos no gene NS1 de vírus de influenza de suínos incluem, mas não são limitados a deleções, substituições, inserções e combinações dos mesmos. Uma ou mais mutações podem estar localizadas em qualquer ponto em todo o gene NSI (por exemplo o término amino, o término carbóxi, ou em algum ponte entre os mesmos), e/ou o elemento regulatório do gene NS1. Em uma forma de realização específica, um vírus atenuado de influenza de suínos da invenção compreende um genoma compreendendo um gene NS1 de vírus de influenza de suínos com um mutação (por exemplo, uma deleção ou substituição) no término amino. Em uma forma de realização preferida, um vírus atenuado de influenza de suínos da invenção compreende um genoma compreendendo um vírus de influenza de suínos com uma mutação (por exemplo, uma deleção ou substituição, preferivelmente uma deleção) no término carbóxi. Em outra forma de realização, um vírus atenuado de influenza de suínos da invenção compreende um genoma compreendendo uma mutação em um gene NS1 de vírus de influenza de suínos resultando em uma deleção consistindo de 5, preferivelmente 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 73, 75, 80, 85, 90, 95, 99, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 126, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170 ou 175 resíduos de aminoácidos do término carbóxi de NS1, ou uma deleção entre 5-170, 25-170, 50-170, 100-170, 100-160 ou 105-160 resíduos de aminoácidos de término carbóxi. Em outra forma de realização, um vírus atenuado de influenza de suínos da invenção compreende um genoma compreendendo uma mutação em um gene NS1 de vírus de influenza de suínos resultando em uma deleção de todos resíduos de aminoácidos exceto resíduos de aminoácidos 1-126, resíduos de aminoácidos 1120, resíduos de aminoácidos 1-115, resíduos de aminoácidos 1-110, resíduos de aminoácidos 1-100, resíduos de aminoácidos 1-99, resíduos de aminoácidos 1-95, resíduos de aminoácidos 1-85, resíduos de aminoácidos 1-80, resíduos de aminoácidos 1-75, resíduos de aminoácidos 1-73, resíduos de aminoácidos 1-70, resíduos de aminoácidos 1-65 ou resíduos de aminoácidos 1-60, em que o aminoácido amino terminal é número 1. De acordo com estas formas de realização,
65/132 o vírus atenuado de influenza de suínos é preferivelmente geneticamente engenheirado. Em uma forma de realização preferida, um vírus atenuado de influenza de suínos da invenção é ΤΧ/98/del 126, ΤΧ/98/del 99 ou ΤΧ/98/del 73. Em uma forma de realização mais preferida, o vírus atenuado de influenza de suínos é ΤΧ/98/del 126. Em uma forma de realização ainda mais preferida, o vírus atenuado de influenza de suínos é ΤΧ/98/del 99.
[0110] O vírus atenuado de influenza de suínos da presente invenção pode ser um vírus quimérico que expressa uma seqüência heteróloga por exemplo, antígenos de outras cepas de vacinas (por exemplo usando genética reversa, reagrupamento ou tecnologia de plasmídeo isento de auxiliar). Alternativamente, os vírus atenuados de influenza podem ser engenheirados, usando genética reversa, reagrupamento ou tecnologia de plasmídeo isento de auxiliar, com vírus geneticamente engenheirados, para expressar epítopos completamente estranhos, por exemplo, antígenos de outros patógenos infecciosos, antígenos de tumor ou antígenos de marcação. Em algumas formas de realização, os vírus atenuados de influenza de suínos expressam uma seqüência heteróloga derivada de outros agentes infecciosos de suínos, agentes infecções não de suínos, antígenos de tumor de suínos ou de outros tipos, (por exemplo, antígeno carcinoembriônico (CEA), antígeno de câncer de mama como EGFR (receptor de fator de crescimento epidérmico), antígeno de HER2 (p185HER2), HER2 neu epítopo, antígeno-50 de câncer (CA-50), antígeno de câncer 15-3 (CA15-3) associado com câncer de mama, antígeno associado a carcinoma (CAA), antígeno de melanoma, e antígenos associados a melanoma 100, 25, e 150). Em outras formas de realização, o vírus atenuado de influenza de suínos da presente invenção pode conter um segmento derivado de outro vírus. Porque o segmento NS RNA é o mais curto dentre os oito RNAs virais, é possível que o NS RNA vá tolerar inserções mais longas de seqüências heterólogas do que outros genes virais. Além disso, o segmento NS RNA dirige a síntese de altos níveis de proteínas em células infectadas, sugerindo que seria um segmento ideal para inserções de antígenos estranhos. As seqüências exemplares incluem epítopos de vírus de síndrome respiratória e reprodutiva de porcinos, citomegalo vírus porcino,
66/132 vírus corona respiratório porcino, vírus encefalomiocardite porcina, diarréia epidêmica porcina, e determinantes antigênicos de patógenos de suínos não virais como bactérias, incluindo, mas não limitados a Brucella suis, e parasitas, incluindo, mas não limitados a áscaris (Ascaris suum), nematóides (Trichuris suis).
[0111] Preferivelmente, a seqüência heteróloga não é uma seqüência de ácido nucleico que altera o fenótipo atenuado do vírus. Conseqüentemente, preferivelmente, as seqüências de ácido nucleico codificando proteínas, polipeptídeos ou peptídeos com atividade antagonizante de interferon não são engenheiradas no vírus de influenza de suínos. Em certas formas de realização, o vírus quimérico expressa um antígeno de tumor. Em outras formas de realização, o vírus quimérico expressa um epítopo de um patógeno estranho.
5.2 Seleção de vírus atenuado de influenza de suínos [0112] A invenção engloba métodos de seleção de vírus de influenza de suínos que tenham o fenótipo desejado, isto é, vírus atenuados de influenza de suínos ou vírus de influenza de suínos que tem atividade IFN baixa (isto é, uma redução de 510%, 10-20%, 20-30%, 30-40%, 40-50%, 50-60%, 60-70%, 70-80%, 80-90% ou mais quando comparado com os vírus de influenza de suínos de tipo selvagem, por exemplo, A/Swine/Texas/4199-2/98, sob as mesmas condições) ou sem atividade antagonista de IFN, sejam eles obtidos de variantes naturais, variantes espontâneos (isto é, variantes que evolvem durante a propagação dos vírus), variantes naturais mutagenizados, vírus reagrupantes e/ou geneticamente engenheirados (ver, por exemplo, patente U.S. número 6.635.416). Tais vírus podem ser melhor triados em testes de crescimento diferencial que comparam o crescimento em sistemas hospedeiros deficientes em IFN e competentes em IFN. Os vírus que demonstram melhor crescimento nos sistemas deficientes em IFN versus sistemas competentes em IFN são selecionados; preferivelmente, os vírus que crescem a títulos de pelo menos um log, pelo menos dois logs, três logs ou 1 a 50, 1 a 25, 1 a 20, 1 a 10 ou 1 a 5 logs maiores do que os sistemas deficientes em IFN como comparados com os sistemas competentes em IFN são selecionados. Os sistemas deficientes em IFN exemplares incluem, mas não são limitados a ovos embrionados jovens (por
67/132 exemplo, ovos embrionados de 6 a 10 dias de idade, 6 a 9 dias de idade, 6 a 8 dias de idade ou 6 a 7 dias de idade), linhagens de células deficientes em IFN (como células VERO ou linhagens de célula geneticamente engenheiradas como inativações STAT1, e inativações PKR, etc). Os ovos embrionados ou linhagens de células pré-tratadas com compostos que inibem o sistema IFN (incluindo drogas, anticorpos, anti-sentido, ribozimas, etc) também podem ser usados como um sistema deficiente em IFN. Além disso, ovos deficientes no sistema IFN, por exemplo, ovos produzidos por pássaros negativos para STAT1, especialmente aves domésticas, incluindo mas não limitados a galinhas patos, ou perus transgênicos, também podem ser usados como um sistema deficiente em IFN. Os vírus atenuados de influenza de suínos mostrando títulos menores em pelo menos de 1 a 50, 1 a 25, 1 a 20, 1 a 10 ou 1 a 5 logs em ovos de 10 dias de idade versus ovos de 6-7, 6-8, ou 6-9 dias de idade serão considerados prejudicados em sua capacidade de inibir a resposta a IFN.
[0113] Para fins de triagem, os sistemas deficientes em IFN transientes podem ser usados in lieu de sistemas geneticamente manipulados. Por exemplo, o sistema hospedeiro pode ser tratado com compostos que inibem a produção de IFN e/ou componentes de resposta de IFN (por exemplo, drogas, anticorpos contra IFN, anticorpos contra receptor IFN, inibidores de PKR, moléculas anti-sentido, e ribozimas, etc). O crescimento de vírus atenuados de influenza de suínos pode ser comparado a controles não tratados competentes para IFN versus sistemas tratados deficientes em IFN.
[0114] O crescimento de vírus de influenza de suínos (como medido por títulos) pode ser, por exemplo, comparado em várias células, linhagens de células, ou sistemas de modelos animais que expressam IFN e os componentes da resposta a IFN, versus células, linhas de células ou sistemas de modelos de animais deficientes para IFN ou componentes da resposta de IFN. As técnicas que são bem conhecidas na técnica para a propagação de vírus em linhagens de células podem ser usadas (ver, por exemplo, os exemplos de trabalho infra). O crescimento de vírus de influenza de suínos em uma linhagem de células competente para IFN versus uma
68/132 linhagem de células geneticamente engenheirada deficiente em IFN pode ser comparado.
[0115] Os vírus de influenza de suínos podem ser triados usando sistemas de teste de IFN, por exemplo, sistemas de teste com base em transcrição, em que a expressão do gene repórter é controlada por um promotor respondente a IFN. A expressão do gene repórter em células infectadas versus não infectadas pode ser medida para identificar vírus que induzem, de modo efetivo, uma resposta de IFN, mas que são incapazes de antagonizar a resposta de IFN. Por exemplo, as células de teste podem ser engenheiradas para expressar de modo transiente ou constitutivo os genes repórter como gene repórter luciferase ou gene repórter cloranfenicol transferase (CAT) sob o controle de um elemento de resposta estimulada por interferon, como o promotor estimulado por IFN do gene ISG-54K (Bluyssen et al., 1994, Eur. J. Biochem. 220: 395 - 402). Células são infectadas com o vírus de influenza de suínos de teste e o nível de expressão do gene repórter comparado com o de células não infectadas ou células infectadas com o vírus de influenza de suínos de tipo selvagem. Um aumento no nível de expressão do gene repórter após infecção com o vírus de influenza de suínos atenuado de teste iria indicar que o vírus de influenza de suínos de teste está induzindo uma resposta de IFN. Alternativamente, a indução de respostas de IFN pode ser determinada por medida da ativação transcripcional dependente de IFN seguindo infecção com o vírus atenuado de influenza de suínos de teste. A expressão de genes conhecidos como sendo induzida por IFN, por exemplo, Mx, PKR, 2-5-oligoadenilatesintetase, classe I de complexo de histocompatibilidade principal (MHC), etc., pode ser analisada pelas técnicas bem conhecidas do versado na técnica (por exemplo, northern blots, western blots, PCR, etc). A indução de respostas de IFN também pode ser determinada por medida do estado fosforilado de componentes da via IFN após infecção com um vírus de influenza de suínos de teste, por exemplo, IRF-3, que é fosforilado em resposta a um RNA fita dupla. Em resposta a IFN tipo I, Jak 1 quinase e TyK2 quinase, as subunidades de receptor de IFN, STAT1, e STAT2 são rapidamente fosforiladas por tirosina. Assim, a fim de determinar se o vírus de
69/132 influenza de suínos induz respostas de IFN, as células, como células 293, são infectadas com o vírus mutante de teste e após infecção, as células são lisadas. Os componentes da via de IFN, como Jak 1 quinase e TyK2 quinase, são imunoprecipitadas dos lisados de células infectadas, usando soro policlonal específico ou anticorpos, e o estado fosforilado por tirosina da quinase é determinado por testes de imunoblot com um anticorpo anti-fosfotirosina (por exemplo, ver Krishnan et al. 1997, Eur. J. Biochem. 247: 298 - 305). Um estado fosforilado melhorado de qualquer um dos componentes da via IFN após infecção com o vírus de influenza de suínos deve indicar indução de respostas de IFN pelo vírus de influenza de suínos.
[0116] Além disso, a indução de respostas de IFN após infecção com um vírus de influenza de suínos de teste pode ser determinada por medida da capacidade de ligar seqüências de DNA específicas ou a translocação de fatores de transcrição induzidos em resposta a infecção viral, por exemplo, IRF3, STAT1, STAT2, etc. Em particular, STAT1 e STAT2 são fosforilados e translocados do citoplasma para o núcleo em resposta a IFN tipo 1. A capacidade de ligar seqüências de DNA específicas ou a translocação de fatores de transcrição pode ser medida por técnicas bem conhecidas do versado na técnica, por exemplo, testes de troca de gel por eletromobilidade, coloração de células, etc. Outros testes que podem ser usados são descritos no pedido de patente U.S. número 09/829.711, que se incorpora por referência em sua totalidade. Em uma forma de realização preferida, no entanto, os testes de crescimento diferencial são usados para selecionar vírus tendo o fenótipo desejado, porque o sistema hospedeiro usado (competente em IFN versus deficiente em IFN) aplica a pressão de seleção apropriada.
[0117] Os vírus atenuados de influenza de suínos da presente invenção são triados de modo ótimo em células de porcos, incluindo células de porcos primárias, secundárias, e linhagens de células de porcos. Qualquer célula de porco que é capaz de cultivar vírus de influenza de suínos pode ser usada. As células de porcos preferidas incluem linhagens de células de rim porcino, linhagens de células de testículo porcino, e pulmão porcino. As células de poros representativas incluem,
70/132 mas não são limitados às células PK(D1), células PK(15), células PK13, células NSK, células LLC-PK1, células LLC-PK1A, células ESK-4, células ST, células PTK75, células PK-2a/CL 13 ou células SJPL.
[0118] Os vírus de influenza de suínos da invenção podem ser triados em células de porcos por comparação com os vírus de influenza de suínos de tipo selvagem, por exemplo, A/Swine/Texas/4199-2/98, sob as mesmas condições de crescimento. Os vírus atenuados de influenza de suínos são selecionados com base nas características como taxas de crescimento mais lentas, menores lesões no pulmão quando da infecção dos porcos, títulos virais reduzidos em fluido de lavagem broncoalveolar (BALF), e reduzida detecção de vírus em esfregaços nasais quando comparados com o vírus de influenza de suínos de tipo selvagem. Estes vírus atenuados de influenza de suínos tem uma virulência diminuída porque eles tem uma capacidade reduzida de replicar em sistemas competentes de interferon comparado com os vírus de influenza de suínos de tipo selvagem mas podem gerar uma resposta imune.
[0119] As células de porcos podem ser infectadas com os vírus de influenza de suínos de tipo selvagem, por exemplo, A/Swine/Texas/4199-2/98, e mutantes NS1 em um MOI específico e títulos virais no sobrenadante podem ser determinados em tempos específicos pós infecção. A infecção de células de porco a MOIs de entre 0,0005 e 0,001, 0,001 e 0,01, 0,01 e 0,1, 0,1 e 1, ou 1 e 10, ou um MOI de 0,0005, 0,001, 0,005, 0,01, 0,05, 0,1, 0,5, 1, 5 ou 10 pode ser usada. Em uma forma de realização, um MOI de 0,001 é usado. Títulos virais podem ser determinados de aproximadamente 2 a 10 dias, 3 a 7 dias, 3 a 5 dias ou 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 dias após a infecção. Em uma forma de realização específica, os títulos virais são determinados 5 dias após a infecção. Após cultivar os vírus em células de porcos, os títulos virais podem ser avaliados no sobrenadante. Qualquer sistema para medida de títulos de vírus de influenza pode ser usado. Os sistemas representativos são descritos na seção 5.7. Em uma forma de realização particular, os títulos virais no sobrenadante são determinados por colocação em placas em vários pontos no tempo em células MDCK.
71/132 [0120] Os sistemas de seleção da invenção englobam medir a indução de IFN por determinação de se um extrato da célula ou ovo infectado com o vírus atenuado de influenza de suínos de teste é capaz de conferir atividade protetora contra infecção viral. Mais especificamente, grupos de ovos de galinha embrionados de 10 dias de idade são infectados com o vírus de influenza de suínos mutante de teste ou o vírus de influenza de suínos de tipo selvagem. Aproximadamente 15 a 20 h após infecção, o fluido alantóico é coletado e testado para atividade de IFN por determinação da maior diluição com atividade protetora contra a infecção por vírus de influenza de suínos em células de cultura de tecido.
[0121] A patogênese de vírus de influenza de suínos mutantes da invenção também pode ser avaliada em porcos in vivo. Os testes utilizáveis incluem avaliação das lesões do pulmão em lóbulos pulmonares, esfregaços nasais e determinação de títulos virais em fluido de lavagem broncoalveolar (BALF) em qualquer método bem conhecido na técnica.
5.3. Propagação de vírus atenuados de influenza de suínos [0122] A presente invenção proporciona métodos para propagar vírus atenuado de influenza de suínos em células (por exemplo, células de porco), ovos embrionados, e animais. Os vírus atenuados de influenza de suínos da presente invenção podem ser propagados em qualquer substrato que permite que o vírus cresça em títulos que permitem um uso dos vírus atenuados de influenza de suínos descrito aqui. Em uma forma de realização específica, os vírus atenuados de influenza de suínos da presente invenção são propagados em qualquer substrato que permita ao vírus crescer em títulos comparáveis aos determinados para cepas de vírus de influenza de suínos de tipo selvagem em substratos competentes para IFN. Em outra forma de realização, os vírus atenuados de influenza de suínos são propagados em substratos deficientes em IFN. Os substratos que são utilizáveis para a seleção dos vírus atenuados de influenza de suínos da invenção não precisam ser usados para a propagação e vice-versa.
[0123] De acordo com os métodos da presente invenção, os vírus atenuados de influenza de suínos que podem ser cultivados em células (por exemplo, células de
72/132 porco), ovos embrionados, e animais são selecionados de cepas de ocorrência natural, variantes ou mutantes, vírus mutagenizados, reagrupantes e/ou vírus geneticamente engenheirados. Os métodos da presente invenção englobam cultivar os vírus atenuados de influenza de suínos, preferivelmente usando condições de crescimento apropriadas (ver, por exemplo, condições de crescimento especificadas na seção 6 abaixo), e coletando o vírus de progênie.
[0124] Em uma forma de realização específica, os vírus atenuados de influenza de suínos da invenção são propagados em células de porco. De acordo com esta forma de realização, as células de porco podem ou não podem ser deficientes em IFN ou produzir níveis menores de IFN. As células de porcos preferidas incluem linhagens de células de rim porcino, linhagens de células de testículo porcino, e linhagens de células de pulmão porcino. As células de porco representativas incluem, mas não são limitadas às células PK(D1), células PK(15), células PK13, células SJPL, células NSK, células LLC-PK1, células LLC-PK1A, células ESK-4, células ST, células PT-K75, e células PK-2a/CL 13. Em outra forma de realização específica, os vírus atenuados de influenza de suínos são propagados nas células de galinha, por exemplo, fibroblastos de embrião de galinha derivados de ovos embrionados com 6 dias de idade.
[0125] Em algumas formas de realização, a invenção proporciona métodos de propagar os vírus atenuados de influenza de suínos da invenção em ovos embrionados, por exemplo, de 6 a 14 dias de idade. Em outras formas de realização, ovos embrionados jovens ou imaturos podem ser usados para propagar os vírus atenuados de influenza de suínos da invenção. De acordo com a presente invenção, os ovos embrionados imaturos englobam ovos que tem menos de dez dias de idade, preferivelmente ovos com seis a nove dias de idade, seis a oito dias de idade, seis a sete dias de idade, ou ovos de seis dias de idade. Os ovos embrionados imaturos da presente invenção também englobam ovos que imitam artificialmente os ovos de até, mas menos que dez dias de idade, como um resultado de alterações das condições de crescimento, por exemplo mudanças nas temperaturas de incubação, tratamento com drogas, ou quaisquer outras alterações que resultam em um ovo
73/132 com um desenvolvimento retardado, como que o sistema IFN não é completamente desenvolvido como comparado com ovos de dez a doze dias de idade. Os vírus de influenza de suínos podem ser propagados em diferentes locais do ovo embrionado, por exemplo, a cavidade alantóica. Em algumas formas de realização, os ovos embrionados são ovos de galinha.
[0126] A invenção também engloba métodos e substratos deficientes em IFN para o crescimento e isolamento de vírus atenuados de influenza de suínos da presente invenção. Ver, por exemplo, patente U.S. número 6.573.079, que é expressamente incorporada por referência em sua totalidade. Os substratos deficientes em IFN que podem ser usados para sustentar o crescimento dos vírus atenuados de influenza de suínos incluem, mas não são limitados a células de ocorrência natural, linhagens de células, ovos embrionados, e sistemas deficientes em IFN, por exemplo células Vero, ovos embrionados jovens, células recombinantes ou linhagens de células que são engenheiradas para serem deficientes em IFN, por exemplo linhagens de células deficientes em IFN derivadas de inativações STAT1, inativações IRF3, inativações IRF7, inativações PKR, etc, os ovos embrionados obtidos de pássaros deficientes em IRN, especialmente aves domésticas (por exemplo galinhas, patos, perus), incluindo bandos que são criados para serem pássaros deficientes em IFN ou transgênicos (por exemplo inativações STAT1). Em algumas formas de realização, o substrato deficiente em IFN não é de células VERO e/ou não é uma linhagem de células deficiente em STATE [0127] O sistema hospedeiro, células, linhagens de células, ovos ou animais podem ser geneticamente engenheirados para expressar transgenes codificando inibidores do sistema de IFN, por exemplo, mutantes negativos dominantes, como STAT1 faltando o domínio de ligação de DNA, RNA anti-sentido, ribozimas, inibidores de produção IFN, inibidores de sinalização de IFN, e/ou inibidores de genes antivirais induzidos por IFN. Deve-se reconhecer que os animais que são criados ou geneticamente engenheirados para serem deficientes em IFN serão um pouco imunocomprometidos, e devem ser mantidos em um meio controlado, isento de doenças. Assim, as medidas apropriadas (incluindo o uso de antibióticos na
74/132 dieta) devem ser tomadas para limitar o risco de exposição a agentes infecciosos de animais deficientes em IFN transgênicos, como camundongos, bandos de galinhas de criação, patos, perus, etc. Alternativamente, o sistema hospedeiro, por exemplo, células, linhagens de células, ovos ou animais podem ser tratados com um composto que inibe a produção de IFN e/ou a via de IFN, por exemplo, drogas, anticorpos, moléculas anti-sentido, moléculas de ribozimas marcando o gene STAT1, e/ou genes antivirais induzidos por IFN.
[0128] A presente invenção engloba métodos de cultivar e isolar vírus de influenza de suínos tendo atividade de antagonista de IFN alterada em células e linhagens de células que naturalmente não tem uma via IFN ou tem uma via IFN deficiente, ou tem uma deficiência no sistema IFN, por exemplo baixos níveis de expressão de IFN em comparação com células de tipo selvagem. Em uma forma de realização particular, a presente invenção engloba métodos para cultivar os vírus atenuados de influenza de suínos da invenção em fibroblastos de embrião de galinha derivados de ovos embrionados de 6 dias de idade, ou células Vero, ou ovos embrionados comprometidos em IFN (por exemplo, ovos embrionados imaturos, como ovos embrionados de 6, 7 ou 8 dias de idade). Em outra forma de realização, a presente invenção engloba métodos de cultivar os vírus atenuados de influenza de suínos da invenção em células onde as células não são células VERO.
[0129] A presente invenção proporciona métodos de cultivar e isolar vírus de influenza de suínos da invenção a partir de um substrato deficiente em IFN geneticamente engenheirado. A presente invenção engloba porcos transgênicos e aves em que um gene essencial para o sistema IFN é mudado, por exemplo, STAT1, que iriam colocar ovos que são deficientes em IFN. A presente invenção ainda engloba transgênicos aviários que expressam fatores de transcrição dominantes negativos, por exemplo, STAT1 faltando o domínio de ligação de DNA, ribozimas, RNA anti-sentido, inibidores de produção de IFN, inibidores de sinalização de IFN, e inibidores de genes antivirais induzidos em resposta a IFN. [0130] A invenção proporciona linhagens de células recombinantes ou animais, particularmente porcos e aves, em que um ou mais dos genes essenciais para a
75/132 síntese de IFN, a via IFN, e/ou gene antiviral induzido por IFN, por exemplo, receptor de interferon STAT1, PKR, IRF3, IRF7, etc. foi mudado (isto é, rompido, isto é, uma inativação). O animal recombinante pode ser qualquer animal (por exemplo, um camundongo, um porco, uma ave, por exemplo, galinha, peru, franco, pato, etc) (ver, por exemplo, Sang, 1994, Trends Biotechnol. 12: 415; Perry, etal., 1993, Transgenic Res. 2: 125; Stern, C.D., 1996, Curr Top Microbiol Immunol 212: 195 - 206; e Shuman, 1991, Experientia 47: 897 para estudos com relação à produção de transgênicos aviários cada sendo aqui incorporado por referência em sua totalidade). Em uma forma de realização específica, o animal recombinante é um porco. Esta linhagem de célula ou animal pode ser gerada por qualquer método conhecido na técnica para a ruptura de um gene no cromossomo da célula ou animal. Estas técnicas incluem, mas não são limitadas a microinjeção pró-nuclear (Hoppe & Wagner, 1989, patente U.S. número 4.873.191); transferência de genes mediada por retrovírus em linhagens germinais (Van der Putten et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sei., USA 82: 6148 - 6152); marcação de genes em células -tronco embriônicas (Thompson et al., 1989, Cell 56: 313); eletroporação de embriões (Lo, 1983, Mol Cell. Biol. 3: 1803); e transferência de genes mediada por esperma (Lavitrano et al., 1989, Cell 57: 717); etc. Para um estudo destas técnicas ver Gordon, 1989, Transgenic Animais, Intl. Rev. Cytol. 115:171, que é incorporado aqui por referência em sua totalidade.
[0131] Em particular, um animal inativado em STAT1 pode ser produzido por promoção de recombinação homóloga entre um gene STAT1 em seu cromossomo e um gene STAT1 exógeno que foi tornado biologicamente inativo (preferivelmente por inserção de uma seqüência heteróloga, por exemplo um gene de resistência a antibiótico). Os métodos de recombinação homóloga para romper genes no genoma do camundongo são descritos, por exemplo, em Capecchi (1989, Science 244: 1288) e Mansour etal. (1988, Nature 336: 348 - 352).
[0132] Brevemente, toda ou uma porção de um clone genômico STAT1 é isolada de DNA genômico da mesma espécie como a célula ou animal inativado. O clone genômico STAT1 pode ser isolado por qualquer método bem conhecido na técnica
76/132 para o isolamento de clones genômicos (por exemplo por sondagem de uma biblioteca genômica com uma sonda derivada de uma seqüência STAT1 como STAT1 de porco (Genbank números de acesso AB116564 e NM_213769) e as seqüências apresentadas, ver Meraz et al. 1996, Cell 84: 431 - 442; Durbin et al. 1996, Cell 84: 443 - 450, e referências citadas no mesmo). Uma vez que o clone genômico é isolado, toda ou uma porção do clone é introduzida no vetor recombinante. Preferivelmente, a porção do clone introduzido no vetor contém, pelo menos, uma porção de um exon do gene STAT1, isto e, contém uma seqüência de codificação de proteína STAT1. Uma seqüência não homóloga à seqüência STAT1, preferivelmente um marcador selecionável positivo, como um gene codificando um gene de resistência a antibiótico, é então introduzido no exon do gene STAT1. O marcador selecionável é preferivelmente ligado operativamente a um promotor, mais preferivelmente um promotor constitutivo. A seqüência não homóloga é introduzida em qualquer ponto na seqüência de codificação de STAT1, que irá romper a atividade STAT1, por exemplo, em uma posição onde as mutações por pontos ou outras foram demonstradas como inativando a função da proteína STAT1. Por exemplo, mas não a título de limitação, a seqüência não homóloga pode ser inserida na seqüência de codificação para a porção da proteína STAT1 contando toda ou uma porção do domínio quinase (por exemplo, a seqüência de nucleotídeos codificando para pelo menos 50, 100, 150, 200 ou 250 aminoácidos do domínio quinase).
[0133] O marcador selecionável positivo é preferivelmente um gene de resistência a neomicina (gene neo) ou um gene de resistência higromicina (gene hygro). O promotor pode ser qualquer promotor conhecido na técnica; a título de exemplo, o promotor pode ser o promotor de fosfoglicerato quinase (PGK) (Adra et al., 1987, Gene 60: 65 - 74), o promotor Polll (Soriano et al., 1991, Cell 64: 693 701), ou o promotor MC1, que é um promotor sintético projetado para expressão em células -tronco derivadas de embrião (Thomas & Capecchi, 1987, Cell 51: 503 512). O uso de um marcador selecionável, como um gene de resistência a antibiótico, permite a seleção de células que incorporaram o vetor de marcação (por
77/132 exemplo, a expressão do produto de gene neo confere resistência a G418, e expressão do produto de gene hygro confere resistência a higromicina).
[0134] Em uma forma de realização preferida, um marcador selecionável negativo para uma etapa de contra-seleção para recombinação homóloga, em oposição a não homóloga, do vetor é inserido fora do inserto de clone genômico STAT1. Por exemplo, este marcador selecionável é o gene HSV timidina quinase (HSV-fA), cuja expressão torna a célula sensível a ganciclovir. O marcador selecionável negativo está preferivelmente sob o controle de um promotor como, mas não limitado ao promotor PGK, o promotor Ρο1 II, ou o promotor MC1.
[0135] Quando ocorre a recombinação homóloga, as porções do vetor que são homólogas ao gene STAT1, assim como o inserto não homólogo dentro das seqüências de gene STAT1, são incorporados no gene STAT1 no cromossomo, e o restante do vetor é perdido. Assim, porque o marcador selecionável negativo está fora da região de homologia com o gene STAT1, as células em que a recombinação homóloga ocorreu (ou sua progênie), não irão conter o marcador selecionável negativo. Por exemplo, se o marcador selecionável negativo for o gene HSV-fk, as células em que a recombinação homóloga tinha ocorrido não irão expressar a timidina quinase e irão sobreviver à exposição a ganciclovir. Este procedimento permite a seleção de células em que recombinação homóloga tinha ocorrido, como comparado com a recombinação não homóloga, em que é provável que o marcador selecionável negativo também seja incorporado no genoma junto com as seqüências STAT1 e o marcador selecionável positivo. Assim, células em que a recombinação não homóloga tinha ocorrido, irão mais provavelmente expressar timidina quinase e serão sensíveis a ganciclovir.
[0136] Uma vez preparado o vetor de marcação, ele é linearizado com uma enzima de restrição pra a qual se tem um sítio único no vetor de marcação, e o vetor linearizado é introduzido em células tronco derivadas de embrião (ES) (Gossler et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 83: 9065 - 9069) por qualquer método conhecido na técnica, por exemplo por eletroporação. Se o vetor e marcação incluir um marcador selecionável positivo e um marcador contra-selecionável negativo, as
78/132 células ES em que a recombinação homólogo tinha ocorrido podem ser selecionados por incubação em meio seletivo. Por exemplo, se os marcadores selecionáveis são o gene de resistência neo e o gene HSV-fk, as células são expostas a G418 (por exemplo, aproximadamente 300 gg/ml) e ganciclovir (por exemplo, aproximadamente 2 μΜ).
[0137] Qualquer técnica conhecida na técnica para genotipagem, por exemplo, mas não limitada a análise Southern blot ou a reação de cadeia polimerase, pode ser usada para confirmar que as seqüências STAT1 rompidas recombinaram de modo homólogo no gene STAT1 no genoma de células ES. Porque o mapa de restrição do clone genômico STAT1 é conhecido e a seqüência de seqüência de codificação de STAT1 é conhecida (ver Meraz etal. 1996, Cell 84: 431, Durbin etal. 1996, Cell 84: 443 - 450, todas referências citadas no mesmo), o tamanho de um fragmento de restrição particular ou um produto de amplificação PCR gerado a partir de DNA de ambos os alelos rompido e não rompido pode ser determinado. Assim, ao testar um fragmento de restrição ou produto PCR, cujo tamanho diferente entre o gene STAT1 rompido e não rompido, pode-se determinar se a recombinação homóloga ocorreu para romper o gene STATE [0138] As células ES com o locus STAT1 rompido podem ser introduzidas nos blastocistos por micro-injeção e então os blastocistos podem ser implantados no útero de camundongas psedográvidas usando técnicas de rotina. Os animais que desenvolvem dos blastocistos implantados são quiméricos para o alelo rompido. Os machos quiméricos podem ser cruzados com fêmeas, e este cruzamento pode ser projetado de modo que a transmissão da linhagem germinal do alelo é ligada à transmissão de uma certa cor do revestimento. A transmissão da linhagem germinal do alelo pode ser confirmada por Southern blotting ou análise PCR, como acima mencionado, de DNA genômico isolado de amostras de tecido.
[0139] Qualquer gene cujo produto é importante para a regulação de interferon pode ser usado. Outras mutações na via de interferon que podem ser usadas de acordo com a presente invenção incluem versões deficientes em quinase, de Jak1, TyK2 ou fatores de transcrição faltando os domínios de ligação de DNA STAT1, e
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STAT2 (ver, por exemplo, Krishnan etal., 1997, Eur. J. Biochem. 247: 298 - 305). [0140] Para purificação do vírus, o vírus atenuado de influenza de suínos é removido da cultura de células e separado dos componentes celulares, tipicamente por procedimentos de clarificação bem conhecidos, como centrifugação de gradiente e cromatografia em coluna, e podem ser ainda isolados como desejado usando procedimentos bem conhecidos do versado na técnica, por exemplo, testes em placas.
5.4 Uso de vírus atenuados [0141] Os vírus atenuados de influenza de suínos da invenção podem ser usados como vetores virais para produção de proteínas heterólogas como descrito na patente U.S. número 5.820.871, que é incorporada aqui por referência em sua totalidade.
[0142] Os vírus atenuados de influenza de suínos da invenção podem ser usados em testes de triagem para identificar proteínas virais com função antagonizante de interferon, para identificar proteínas virais que tem a capacidade de complementar a replicação de um vírus atenuado com capacidade prejudicada de antagonizar as respostas a interferon celular e testes de triagem para identificar agentes anti-virais que inibem a atividade de antagonista de interferon e inibem a replicação viral como descrito na patente U.S. número 6.635.416, que é incorporada aqui por referência em sua totalidade.
[0143] Os vírus atenuados de influenza de suínos da invenção podem ser usados para produzir anticorpos que podem ser usados em imunotestes diagnósticos, imunoterapia passiva, e geração de anticorpos antiidiotípicos. Por exemplo, um vírus atenuado de influenza de suínos compreendendo uma genoma compreendendo uma mutação no gene NS1 e uma seqüência heteróloga (por exemplo, um antígeno de tumor) pode ser administrado em um indivíduo (por exemplo, um porco) para gerar anticorpos que podem então ser isolados e usados em testes diagnósticos, imunoterapia passiva e geração de anticorpos antiidiotípicos. Os anticorpos gerados podem ser isolados por técnicas padrões conhecidas na técnica (por exemplo, cromatografia de imunoafinidade,
80/132 centrifugação, precipitação, etc.) e usados em imunotestes diagnósticos, imunoterapia passiva e geração de anticorpos antiidiotípicos. Os anticorpos isolados antes de serem usados na imunoterapia passiva podem ser modificados, por exemplo, os anticorpos podem ser quimerizados ou humanizados. Ver, por exemplo, patente U.S. números 4.444.887 e 4.716.111; e publicação internacional números WO 98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, WO 98/16654, WO 96/34096, WO 96/33735, e WO 91/10741; cada sendo incorporado aqui por referência em sua totalidade, para estudos sobre a geração de anticorpos quiméricos e humanizados. [0144] Os anticorpos isolados de indivíduos administrados com um vírus atenuado de influenza de suínos da invenção também podem ser usados para monitorar o tratamento e/ou progressão da doença. Um sistema de imunotestes bem conhecido na técnica pode ser usado para este fim, incluindo mas não limitado a sistemas de teste competitivo e não competitivo usando técnicas como radioimunotestes, ELISA (testes imunossorventes ligados a enzima), imunotestes “sanduíche”, reações de precipitina, reações de precipitina com difusão de gel, testes de imunodifusão, testes de aglutinação, testes de fixação de complemento, testes imunorradiométricos, imunotestes fluorescentes, imunotestes de proteína A e testes de imunoeletroforese, para citar apenas alguns.
[0145] Os anticorpos gerados pelos vírus atenuados de influenza de suínos da invenção também podem ser usados na produção de anticorpo antiidiotípico. O anticorpo antiidiotípico pode ser então usado, por sua vez, para imunização, a fim de produzir uma sub-população de anticorpos que ligam o antígeno inicial do microorganismo patogênico (Jerne, 1974, Ann. Immunol. (Paris) 125c: 373; Jerne et al., 1982, EMBOJ. 1:234).
[0146] Nos procedimentos de imunização, a quantidade de imunogene a ser usada e o esquema de imunização serão determinados por um médico versado na técnica e será administrada por referência a resposta imune e títulos de anticorpos do indivíduo.
5.5. Formulações de vacina / formulações imunogênicas [0147] A invenção engloba formulações de vacina e formulações imunogênicas
81/132 compreendendo um vírus atenuado de influenza de suínos tendo uma capacidade prejudicada para antagonizar a resposta de IFN celular (isto é, vírus de influenza de suínos com mutações no gene NS1 que prejudicam a capacidade do vírus de induzir uma resposta de IFN celular) e um excipiente apropriado. O vírus atenuado de influenza de suínos usado na formulação de vacina ou formulação imunogênica pode ser selecionado dentre mutantes ou variantes de ocorrência natural, vírus mutagenizados, ou vírus geneticamente engenheirados. Em uma forma de realização preferida, o vírus atenuado de influenza de suínos é geneticamente engenheirado. Em outra forma de realização preferida, o vírus atenuado de influenza de suínos é isolado ou purificado. As cepas atenuadas de vírus de influenza de suínos também podem ser geradas vias técnicas de reagrupamento, tecnologia de plasmídeo isento de auxiliar ou usando uma combinação de abordagem de genética reversa ou técnicas de reagrupamento e tecnologia de plasmídeo isento de auxiliar. As variantes de ocorrência natural incluem vírus isolados da natureza assim como variantes de ocorrência espontânea gerados durante a propagação do vírus, tendo uma capacidade prejudicada para antagonizar a resposta de IFN celular. Um vírus atenuado de influenza de suínos pode ser usado, ele mesmo, como o ingrediente ativo em formulações de vacina, ou imunogênicas. Alternativamente, o vírus atenuado de influenza de suínos pode ser usado como o vetor ou “estrutura dorsal” de vacinas produzidas recombinantemente ou formulações imunogênicas. Para esta finalidade, as técnicas recombinantes como de genética reversa (ou para vírus segmentados, combinações de genética reversa e técnicas de reagrupamento) podem ser usadas para engenheirar mutações ou introduzir antígenos estranhos no vírus atenuado de influenza de suínos usado na formulação de vacina ou formulação imunogênica. Deste modo, as vacinas podem ser projetadas para imunização contra variantes de cepas ou na alternativa, contra agentes infecciosos completamente diferentes ou antígenos de doença.
[0148] Virtualmente qualquer seqüência de gene heterólogo pode ser construída nos vírus atenuados de influenza de suínos da invenção para uso em formulações imunogênicas ou vacinas. Preferivelmente, epítopos que induzem uma resposta
82/132 imune protetora a qualquer um dentre vários patógenos, ou antígenos que ligam anticorpos neutralizantes podem ser expressados por ou como parte dos vírus. Por exemplo, seqüências de genes heterólogos que podem ser construídas nos vírus da invenção para uso em formulações imunogênicas ou vacinas incluem, mas não são limitadas a determinantes antigênicos de patógenos não virais como bactérias e parasitas. Em outra forma de realização, todo ou porções dos genes de imunoglobulina podem ser expressados. Por exemplo, regiões variáveis de imunoglobulinas anti-idiotípicas que imitam estes epítopos podem ser construídos nos vírus da invenção. Em ainda outra forma de realização, os antígenos associados com tumor podem ser expressados. Os exemplos de antígenos de tumor incluem, mas não são limitados a KS % antígeno pan-carcinona, antígeno de carcinoma ovariano (CA125), fosfato de ácido prostático, antígeno específico de próstata, antígeno associado a melanoma p97, antígeno de melanoma gp75, antígeno de melanoma de peso molecular elevado (HMW-MAA), antígeno de membrana específico de próstata, antígeno de carcinoembriônico (CEA), antígeno de mucina epitelial polimórfico, antígeno do glóbulo de gordura do leite, antígenos associados com tumor colo-retal (como: CEA, TAG-72, CO17-1A; GICA 19-9, CTA-1 e LEA), antígeno de linfoma de Burkitt - 38.12, CD19, antígeno CD20 de linfoma B, CD33, antígenos específicos para melanoma (como gangliosídeo GD2, gangliosídeo GD3, gangliosídeo GM2, gangliosídeo GM3), tipo de transplante específico para tumor de antígeno de superfície celular (TSTA) (como antígenos de tumor induzido viralmente incluindo vírus de tumor de DNA de antígeno T e antígenos de envelope de vírus de tumor RNA), feto-proteína alfa- antígeno oncofetal, como CEA de códon, antígeno oncofetal de tumor de bexiga, antígeno de diferenciação (como antígeno de carcinoma de pulmão humano L6 e L20), antígenos de fibrosarcoma, antígeno de célula T de leucemia Gp37, neoglicoproteína, esfingolipídeos, antígenos de câncer de mama (como EGFR (receptor de fator de crescimento epidérmico), antígeno HER2 (p185HER2) e HER2 neu epítopo), mucina epitelial polimórfica (PEM), antígeno de linfócitos humano maligno APO-1, antígeno de diferenciação (como antígeno I encontrado em eritrócitos fetais, endoderma primário, antígeno I encontrado em
83/132 eritrócitos adultos, pré-implante de embriões, l(Ma) encontrado em adenocarcinomas gástricos, M18, M39 encontrado em epitélio de mama, SSEA-1 encontrado em células de mielóide, VEP8, VEP9, Myl, VIM-D5, Di56-22 encontrado em câncer coloretal, TRA-1-85 (grupo sanguíneo H), C14 encontrado em adenocarcinoma colônico, F3 encontrado em adenocarcinoma de pulmão, AH6 encontrado em câncer gástrico, hapteno Y, Ley encontrado em células de carcinoma embrional, TL5 (grupo sangüíneo A), receptor EGF encontrado em células A431, série Ei (grupo sangüíneo B) encontrado em câncer pancreático, FC10.2 encontrado em células de carcinoma embrional, antígeno de adenocarcinoma gástrico, CO-514 (grupo sanguíneo Le a) encontrado em adenocarcinoma, NS-10 encontrado em adenocarcinomas, CO-43 (grupo sanguíneo Leb), G49 encontrado no receptor EGF de células A431, MH2 (grupo sanguíneo ALeb/Ley) encontrado em adenocarcinoma colônico, 19,9 encontrado em câncer de cólon, mucinas de câncer gástrico, T5A7 encontrado em células de mielóide, R24 encontrado em melanoma, 4,2, Gd3, D1,1, OFA-1, Gm2, OFA-2, Gd2, e M1:22:25:8 encontrado em células de carcinoma embrional, e SSEA-3 e SSEA-4 encontrado em embriões no estágio de 4 a 8 células), receptor de células T derivado de peptídeo de um linfoma de células T cutâneo, proteína reativa C (CRP), antígeno de câncer-50 (CA-50), antígeno de câncer 15-3 (CA15-3) associado com câncer de mama, antígeno de câncer 19 (CA-19) e antígeno de câncer 242 associado com cânceres gastrointestinal, antígeno associado a carcinoma (CAA), cromogranina A, antígeno de mucina epitelial (MC5), antígeno específico epitélio humano (HEA), antígeno de Lewis (a), antígeno de melanoma, antígenos associados a melanoma 100, 25, e 150, antígeno associado a carcinoma semelhante a mucina, proteína relacionada com resistência a múltiplas drogas (MRPm6), proteína relacionada com resistência a múltiplas drogas (MRP41), proteína oncogene Neu (C-erbB-2), enolase específica de neurônios (NSE), Pglicoproteína (produto de gene mdr1, antígeno relacionado com resistência a múltiplas drogas, p170, antígeno relacionado com resistência a múltiplas drogas, antígeno específico de próstata (PSA), CD56, e NCAM.
[0149] Pode-se formular ou uma vacina para vírus de influenza de suínos
84/132 recombinante viva ou uma formulação imunogênica ou uma vacina para vírus de influenza de suínos recombinante inativada ou formulação imunogênica. Um vírus de influenza de suínos pode ser inativado por métodos bem conhecidas do versado na técnica. Os métodos comuns usam formalina e calor para inativação. Ver, por exemplo, patente U.S. número 6.635.246, que é incorporada aqui por referência em sua totalidade. Outros métodos incluem os descritos nas patentes U.S. números 5.891.705; 5.106.619 e 4.693.981, que são incorporadas aqui por referência em suas totalidades.
[0150] Uma formulação imunogênica ou vacina viva pode ser preferida devido à multiplicação no hospedeiro leva a um estímulo prolongado de tipo similar e grandeza ao ocorrendo em infecções naturais e, assim, confere uma imunidade substancial de longo prazo. A produção destas formulações de vacina viva para vírus de influenza de suínos recombinantes e formulações imunogênicas pode ser obtida usando métodos convencionais envolvendo a propagação do vírus de influenza de suínos em cultura celular ou nos alantóis do embrião de pinto seguido por purificação. Além disso, os vírus atenuados de influenza de suínos podem induzir uma resposta a IFN robusta, que tem conseqüências biológicas in vivo, dando proteção contra doenças infecciosas subseqüentes e/ou induzindo respostas anti-tumorais.
[0151] As formulações de vacina e formulações imunogênicas podem incluir vírus atenuados de influenza de suínos geneticamente engenheirados que tem mutações no gene NS1 incluindo mas não são limitadas aos mutantes de influenza NS1 truncados descritos nos exemplos de trabalho, infra. Elas também podem ser formuladas usando variantes naturais. Quando formuladas como vacina de vírus viva, uma faixa de cerca de 102 a 108 pode ser usada, preferivelmente de cerca de
103 a 107, mais preferivelmente 104 pfu a cerca de 5x106, e mais preferivelmente de
104 a 107 pfu por dose deve ser usada.
[0152] Em algumas formas de realização, o vírus de influenza de suínos contém mutações para o segmento de gene NS1 que pode não resultar em uma atividade de antagonista de IFN ou um fenótipo indutor de IFN, mas ao contrário resultar em
85/132 funções virais alteradas e um fenótipo atenuado por exemplo, inibição alterada de exportação nuclear de mRNA contendo poli(A), inibição alterada de emenda prémRNA, inibição alterada de ativação de PKR por seqüestro de dsRNA, efeito alterado sobre a tradução de RNA viral e inibição alterada de poliadenilação de mRNA hospedeiro (por exemplo, ver Krug in Textbook of Influenza, Nicholson et al. ed. 1998, 82 - 92, e referências citadas no mesmo.
[0153] Muitos métodos podem ser usados para introduzir as formulações de vacina e formulações imunogênicas descritas acima, estas incluem, mas não são limitadas a vias intranasal, intratraqueal, oral, intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, e subcutânea. Pode ser preferível introduzir a formulação de vacina de vírus de influenza de suínos ou formulação imunogênica através da via natural de infecção do patógeno para o qual a vacina é projetada, ou através da via natural de infecção do vírus tipo selvagem. Onde uma preparação de vacina viva de vírus atenuado de influenza de suínos ou formulação imunogênica é usada, pode ser preferível introduzir a formulação através da via natural de infecção para vírus de influenza. A capacidade do vírus de influenza de induzir uma resposta imune secretória e celular vigorosa pode ser usada com vantagem. Por exemplo, a infecção do trato respiratório por vírus atenuados de influenza de suínos pode induzir uma resposta imune secretória forte, por exemplo, no sistema urogenital, com proteção concomitante contra um agente causador de doença particular.
[0154] Em uma forma de realização específica, pode ser desejável administrar as composições da invenção localmente à área em necessidade de tratamento, isto pode ser obtido, por exemplo, e não a título de limitação, infusão local durante a cirurgia, por injeção, por meio de um cateter, por meio de um implante, referido implante sendo de um material poroso, não poroso ou gelatinoso, incluindo membranas, como membranas sialásticas ou fibras. Em uma forma de realização, a administração pode ser por injeção direta no sitio (ou sítio anterior) ou infecção. [0155] Uma vacina ou formulação imunogênica da presente invenção, compreendendo 102 a 108 pfu pode ser usada, preferivelmente de cerca de 103 a 107, mais preferivelmente 104 pfu a cerca de 5x106 pfu de vírus atenuado de
86/132 influenza de suínos com atividade de antagonista de IFN alterada, pode ser administrado uma vez a um indivíduo. Alternativamente, uma vacina ou formulação imunogênica da presente invenção, compreendendo 102 a 108 pode ser usada, preferivelmente de cerca de 103 a 107, mais preferivelmente 104 a cerca de 5x106 pfu de vírus mutante com atividade de antagonista de IFN alterada, pode ser administrado duas, três vezes, quatro vezes, cinco vezes, seis vezes, sete vezes, oito vezes, nove vezes, ou dez vezes a um indivíduo com um intervalo de 2 a 6 meses, 2 a 8 meses, 2 a 10 meses, ou 2 a 12 meses entre as doses. Alternativamente, uma vacina ou formulação imunogênica da presente invenção, compreendendo 102 a 108 pode ser usada, preferivelmente de cerca de 103 a 107, mais preferivelmente 104 pfu a cerca de 5x106 pfu de vírus mutante com atividade de antagonista de IFN alterada, pode ser administrado na freqüência necessária a um indivíduo. Em uma forma de realização específica, o indivíduo é um porco.
[0156] Em algumas formas de realização, uma formulação de vacina ou uma formulação imunogênica da invenção não resulta em uma proteção completa de uma infecção (por exemplo, uma infecção viral), mas resulta em um título menor ou um número reduzido do patógeno (por exemplo, um vírus) comparado a um indivíduo não tratado. Os benefícios incluem, mas não são limitados a uma menor severidade dos sintomas da infecção e uma redução na extensão da doença ou condição associada com a infecção.
[0157] Em algumas formas de realização, a formulação de vacina ou formulação imunogênica da invenção é usada para proteger contra infecções por vírus de influenza de suínos. Em outras formas de realização, uma formulação de vacina da invenção é usada para proteger contra infecção por outro vírus de suíno, incluindo, mas não limitado a vírus de síndrome respiratória e reprodutiva de porcinos, citomegalo vírus porcino, vírus corona respiratório porcino, vírus de encefalomiocardite porcina, diarréia epidêmica porcina. Em ainda outras formas de realização, a formulação de vacina ou formulação imunogênica da invenção é usada para proteger contra infecções por patógenos diferentes de um vírus de suínos. [0158] Em algumas formas de realização, uma formulação imunogênica da
87/132 invenção é usada para prevenir, tratar, controlar ou melhorar condições em que a indução de uma resposta imune a um antígeno particular é benéfica.
5.6 Formulações farmacêuticas [0159] A presente invenção engloba as formulações farmacêuticas compreendendo os vírus de influenza de suínos com atividade de antagonista de IFN alterada a serem usadas como agentes anti-virais ou agentes anti-tumorais ou como agentes contra doenças tratáveis com IFN. Em uma forma de realização, as formulações farmacêuticas tem utilidade como um profilático anti-viral e podem ser administradas a um porco em risco de se tornar infectado ou que se espera seja exposto a um vírus, por exemplo vírus de influenza de suínos. Em outra forma de realização, as formulações farmacêuticas tem utilidade como uma medida terapêutica ou profilática para uma doença tratável por IFN e, assim, podem ser usadas para tratar, prevenir, controlar ou melhorar distúrbios tratáveis por IFN. Em uma forma de realização preferida, as formulações farmacêuticas tem utilidade como uma medida terapêutica ou profilática para uma doença tratável por IFN e, assim, podem ser usadas para tratar, prevenir, controlar ou melhorar distúrbios tratáveis por IFN. Em formas de realização específicas, as formulações farmacêuticas da invenção tem utilidade como uma medida terapêutica ou profilática para uma doença tratável por IFN e, assim, podem ser usadas para tratar, prevenir, controlar ou melhorar distúrbios tratáveis por IFN em asnos, zebras, camelos, cães, aves (por exemplo, patos). Em uma forma de realização preferida, as formulações farmacêuticas da invenção tem utilidade como uma medida terapêutica ou profilática para uma doença tratável por IFN e, assim, podem ser usadas para tratar, prevenir, controlar ou melhorar distúrbios tratáveis por IFN em porcos.
[0160] Em algumas formas de realização, uma formulação farmacêutica da invenção compreende um vírus atenuado de influenza de suínos quimérico compreendendo uma seqüência heteróloga. A seqüência heteróloga pode codificar um epítopo de um antígeno estranho ou de tumor. Um antígeno estranho pode ser selecionado dentre outro vírus, uma bactéria ou um parasita. Em uma forma de realização, as formulações farmacêuticas podem ser usadas para tratar tumores ou
88/132 prevenir formação de tumor, por exemplo, em porcos, que tem câncer ou em que estão em alto risco de desenvolver neoplasmas ou câncer, por exemplo, um indivíduo (por exemplo um porco, asno, ou outro animal que pode ser infectado com o vírus de influenza de suínos ou em que o vírus de influenza de suínos pode replicar) com câncer pode ser tratado para prevenir outra tumorigenese. Alternativamente, os porcos que estão ou que se espera sejam expostos a carcinogenes podem ser tratados. Alternativamente, os porcos que estão para ser expostos à radiação podem ser tratados antes de exposição e depois. Os cânceres específicos que podem ser tratados com os métodos e composições da presente invenção incluem, mas não são limitados a cânceres do útero, glândula mamária, pâncreas, pele, glândula linfática, vulva e testículos.
[0161] As propriedades antitumorais da invenção podem estar pelo menos parcialmente relacionadas com sua capacidade de induzir IFN e respostas de IFN. Alternativamente, as propriedades antitumorais dos vírus atenuados de influenza de suínos da invenção podem estar relacionadas com sua capacidade de especificamente crescer e matar as células tumorais, muitas das quais são bem conhecidas como tendo deficiências no sistema IFN. Apesar do (s) mecanismo(s) molecular(es) responsável(veis) pelas propriedades antitumorais, os vírus atenuados de influenza de suínos da invenção podem ser usados para tratar tumores ou para prevenir a formação de tumores.
[0162] A presente invenção ainda engloba os vírus de influenza de suínos com um fenótipo de antagonista de IFN alterado que são marcados para órgãos, tecidos e/ou células específicos no corpo a fim de induzir efeitos terapêuticos e profiláticos localmente. Uma vantagem desta abordagem é que os vírus de influenza de suínos indutores de IFN da invenção são marcados para sítios específicos, por exemplo, o local de um tumor, para induzir IFN em um modo específico para o sítio para um efeito terapêutico em vez de induzir IFN sistemicamente o que pode ter efeitos tóxicos.
[0163] Os vírus de influenza de suínos indutores de IFN da invenção podem ser engenheirados usando métodos aqui descritos para expressar proteínas ou
89/132 peptídeos que iriam marcar os vírus em um sítio particular. Em uma forma de realização específica, os vírus de influenza de suínos indutores de IFN devem ser marcados em sítios de tumores. Em tal forma de realização, os vírus de influenza de suínos podem ser engenheirados para expressar o sítio de combinação de antígeno de um anticorpo que reconhece um antígeno específico para tumor, assim marcando o vírus de influenza de suínos indutor de IFN para o tumor. Em outra forma de realização, quando o tumor a ser marcado expressa um receptor de hormônio, como tumores de mama ou ovariano, que expressam receptores de estrogênios, o vírus de influenza de suínos indutor de IFN pode ser engenheirado para expressar o hormônio apropriado. Em ainda outra forma de realização, onde o tumor a ser marcado expressa um receptor para um fator de crescimento, por exemplo, VEGF, EGF, ou PDGF, o vírus indutor de IFN pode ser engenheirado para expressar o fator de crescimento apropriado ou fragmento do mesmo. Assim, de acordo com a invenção, os vírus de influenza de suínos indutores de IFN podem ser engenheirados para expressar qualquer produto de gene de marcação, incluindo peptídeos, proteínas, como enzimas, hormônios, fatores de crescimento, antígenos ou anticorpos, que irão funcionar para marcar o vírus de influenza de suínos em um sítio em necessidade de tratamento (por exemplo, terapia anti-viral, anti-bacteriana, anti-microbiana, ou anti-câncer).
[0164] Os métodos de introdução incluem, mas não são limitados a vias intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutânea, intranasal, epidural e oral. As formulações farmacêuticas da presente invenção podem ser administradas por qualquer via conveniente, por exemplo por infusão ou injeção de bolo, por absorção através de forros epiteliais ou mucocutâneos, (por exemplo mucosa oral, retal, e mucosa intestinal, etc), e podem ser administradas juntas com outros agentes biologicamente ativos. A administração pode ser sistêmica ou local. Além disso, em uma forma de realização preferida, pode ser desejável introduzir as formulações farmacêuticas da invenção nos pulmões por qualquer via apropriada. A administração pulmonar pode ser empregada, por exemplo, por uso de um inalador ou nebulizador, e formulação com um agente aerossolizante.
90/132 [0165] Em uma forma de realização específica, pode ser desejável administrar as formulações farmacêuticas da invenção localmente à área em necessidade de tratamento, isto pode ser obtido, por exemplo, e não a título de limitação, infusão local durante cirurgia, aplicação tópica, por exemplo, em conjunto com um curativo para feridas após cirurgia, por injeção, por meio de um cateter, por meio de um supositório, ou por meio de um implante, referido implante sendo de um material poroso, não poroso ou gelatinoso, incluindo membranas, como membranas sialásticas, ou fibras. Em uma forma de realização, a administração pode ser por injeção direta no sítio (ou sítio anterior) de um tumor maligno ou tecido neoplásico ou pré-neoplásico.
[0166] Em outra forma de realização, a formulação farmacêutica pode ser entregue em uma matriz biológica. Um exemplo de uma matriz biológica é descrita na patente U.S. número 5.962.427, e publicação do pedido de patente U.S. número 2002/0193338, incorporadas aqui por referência em suas totalidades.
[0167] Em ainda outra forma de realização, a formulação farmacêutica pode ser distribuída em um sistema de liberação controlada. Em uma forma de realização, uma bomba pode ser usada (ver Langer, supra·, Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14: 201; Buchwald et al., 1980, Surgery 88: 507; Saudek et al., 1989, N. Engl. J. Med. 321: 574). Em outra forma de realização, materiais poliméricos podem ser usados (ver Medicai Applications of Controlled Release, Langer e Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Flórida (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen e Bali (eds.), Wiley, New York (1984); Ranger & Peppas, 1983, J. Macromol. Sei. Rev. Macromol. Chem. 23: 61; ver também Levy et al., 1985, Science 228: 190; During et al., 1989, Ann. Neurol. 25: 351 (1989); Howard et al., 1989, J. Neurosurg. 71: 105). Em ainda outra forma de realização, um sistema de liberação controlada pode ser colocado na proximidade do alvo da composição, isto é, o pulmão, assim requerendo somente uma fração da dose sistêmica (ver, por exemplo, Goodson, 1984, in Medicai Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, pp. 115 - 138). Outros sistemas de liberação controlado são discutidos na review por Langer (1990, Science 249:1527 - 1533).
91/132 [0168] Em uma forma de realização preferida, as formulações farmacêuticas da presente invenção compreendem uma quantidade eficaz de um vírus atenuado de influenza de suínos da invenção, e um veículo farmaceuticamente aceitável. O termo “farmaceuticamente aceitável” significa aprovado por uma agência reguladora do governo federal ou estadual ou listada na Farmacopéia Americana ou outras farmacopéias geralmente reconhecidas para uso em animais, e mais particularmente em humanos. O termo “veículo” refere-se a um diluente, adjuvante, excipiente, ou veículo com que a formulação farmacêutica é administrada. Soluções aquosas salina e de dextrose e soluções de glicerol também podem ser empregadas como veículos líquidos, particularmente para soluções injetáveis. Os excipientes farmacêuticos apropriados incluem amido, glucose, lactose, sacarose, gelatina, malte, arroz, farinha, giz, sílica gel, estearato de sódio, monoestearato de glicerol, talco, cloreto de sódio, leite desnatado, glicerol, propileno, glicol, água, etanol e outros. Estas composições podem tomar a forma de soluções, suspensões, emulsões, comprimidos, pílulas, cápsulas, pós, formulações de liberação prolongada, e outras. A composição pode ser formulada como um supositório. Formulação oral pode incluir veículos padrões, como tipos farmacêuticos de manitol, lactose, amido, estearato de magnésio, sacarina sódica, celulose, carbonato de magnésio, etc. Exemplos de veículos farmacêuticos apropriados são descritos em “Remingtoris Pharmaceutical Sciences” por E. W. Martin. Tais composições irão conter uma quantidade eficaz da terapia, preferivelmente na forma purificada, junto com uma quantidade apropriada de veículo, de modo a prover a forma para a administração apropriada ao paciente. A formulação deve se adequar ao modo de administração. A formulação particular também irá depender de se o vírus de influenza de suínos está vivo ou inativado.
[0169] A quantidade de formulação farmacêutica da invenção, que será eficaz no tratamento, prevenção ou controle, ou melhora de um distúrbio ou condição particular irá depender da natureza do distúrbio ou condição, e pode ser determinada por técnicas clínicas padrões. Além disso, testes in vitro podem ser opcionalmente empregados para ajudar a identificar as faixas de dosagem ótimas. A
92/132 dose precisa a ser empregada na formulação também irá depender da via de administração, e a seriedade da doença ou distúrbio, e deve ser decidida de acordo com o julgamento do médico encarregado e de circunstâncias de cada paciente. No entanto, faixas de dosagem apropriadas para administração são geralmente de cerca de 102, 5 x 102, 103, 5 x 103, 104, 5 x 104, 105, 5 x 105, 106, 5 x 106, 107, 5 x 107, 10®, 5x 10®, 1 x 109, 5 x 109, 1 x 1O10, 5x 1O10, 1 x 1011, 5x 1011 ou 1012 pfu, e mais preferivelmente cerca de 104 e cerca de 1012 pfu, e pode ser administrada a um indivíduo uma vez, duas vezes, três ou mais vezes com intervalos na freqüência como necessárias. As formulações farmacêuticas da presente invenção compreendendo 102, 5 x 102, 103, 5 x 103, 104, 5 x 104, 105, 5 x 105, 106, 5 x 106, 107, 5x 107, 10®, 5x 10®, 1 x 109, 5 x 109, 1 x 1O10, 5x 1O10, 1 x 1011, 5x 1011 ou 1012 pfu, e mais preferivelmente cerca de 104 e cerca de 1012 pfu de um vírus atenuado de influenza de suínos com atividade de antagonista de IFN alterada, podem ser administradas a um indivíduo intranasalmente, intratraquealmente, intramuscularmente ou subcutaneamente. As doses eficazes podem ser extrapoladas de curvas de resposta a doses derivadas de sistemas de testes de modelos animais ou in vitro.
[0170] Em algumas formas de realização, a formulação farmacêutica da invenção é usada para prevenir, controlar, tratar ou melhorar infecções por vírus, bactérias ou parasitas. Em outras formas de realização, a formulação farmacêutica da invenção é usada para prevenir, controlar, tratar ou melhorar câncer em um porco. Em outras formas de realização, a formulação farmacêutica da invenção é usada para prevenir, controlar, tratar ou melhorar outras doenças tratáveis por IFN.
5.7 Terapias utilizáveis em combinação com vírus de influenza de suínos [0171] A presente invenção também provê métodos para prevenir, controlar, tratar e/ou melhorar doenças e distúrbios incluindo, mas não são limitados a infecções de vírus de influenza de suínos, condições associadas com infecção por vírus de influenza de suínos, infecções diferentes das infecções por vírus de influenza de suínos, condições associadas com infecções diferentes de infecções por vírus de influenza de suínos, distúrbios tratáveis por IFN (por exemplo câncer) e
93/132 condições em que um vírus atenuado de influenza de suínos da invenção é usado como um vetor para induzir uma resposta imune a uma antígeno associado com a condição compreendendo a administração a um indivíduo em necessidade do mesmo de uma quantidade eficaz de um ou mais vírus atenuados de influenza de suínos da presente invenção e uma quantidade eficaz de uma ou mais terapias (por exemplo, agentes profiláticos ou terapêuticos) diferentes de vírus atenuados de influenza de suínos. Terapias incluem, mas não são limitadas a moléculas pequenas, drogas sintéticas, peptídeos, polipeptídeos, proteínas, ácidos nucleicos (por exemplo, nucleotídeos de DNA e RNA incluindo, mas não limitados a seqüências de nucleotídeo anti-sentido, hélices triplas, RNAi, e seqüências de nucleotídeos codificando proteínas biologicamente ativas, polipeptídeos ou peptídeos) anticorpos, moléculas inorgânicas sintéticas ou naturais, agentes miméticos, e moléculas orgânicas sintéticas ou naturais.
[0172] Qualquer terapia (por exemplo, agentes profiláticos ou terapêuticos) que se conhece como utilizável ou que foi usada ou está sendo atualmente usada para prevenção, controle, tratamento ou melhora de uma infecção por vírus de influenza de suínos, infecções diferentes das infecções por vírus de influenza de suínos, condições associadas com infecções diferentes de infecções por vírus de influenza de suínos, distúrbios tratáveis por IFN, condições em que um vírus atenuado de influenza de suínos da invenção é usado como um vetor para induzir uma resposta imune a uma antígeno associado com a condição, ou qualquer outra doença de porcos, pode ser usada em combinação com um vírus atenuado de influenza de suínos de acordo com a invenção descrita aqui. Ver, por exemplo, Taylor, Pig Diseases, sexta edição, Diamond Farm Book Pubns, 1995; Straw etal., Diseases of Swine, oitava edição, lowa State University Press, 1999, para informação com relação a terapias, particularmente agentes profiláticos ou terapêuticos, que foram ou estão sendo atualmente usados para prevenir, tratar, controlar e/ou melhorar as doenças dos porcos. Exemplos de agentes profiláticos ou terapêuticos incluem, mas não são limitados aos agentes anti-câncer; agentes anti-virais, agentes antiinflamatórios (por exemplo, adrenocorticóides, corticoesteróides (por exemplo,
94/132 beclometassona, budesonídeo, flunisolídeo, fluticasona, triamcinolona, metilprednisolona, prednisolona, prednisona, hidrocortisona)) e antibióticos (por exemplo, dactinomicina (anteriormente actinomicina), bleomicina, eritomicina, penicilina, mitramicina, e antramicina (AMC)).
5.7.1 Terapias anti-câncer [0173] Qualquer terapia (por exemplo, agente profilático ou terapêutico) que é utilizável, como se sabe, ou está sendo atualmente usada para a prevenção, tratamento, controle ou melhora de câncer ou um ou mais dos sintomas do mesmo, pode ser usada nas composições e método da invenção. Terapias (por exemplo, agentes terapêuticos ou profiláticos) incluem, mas não são limitadas a peptídeos, polipeptídeos, proteínas de fusão, moléculas de ácido nucleico, moléculas pequenas, agentes miméticos, drogas sintéticas, moléculas inorgânicas, e moléculas orgânicas. Exemplos não limitativos de terapias de câncer incluem quimioterapias, terapias de radiação, terapias hormonais, e/ou terapias/imunoterapias biológicas. [0174] Nas formas de realização particulares, o agente anti-câncer pode ser, mas não é limitado a um agente quimioterapêutico (por exemplo, acivicina, aclarubicina, cloridrato de acodazol, acronina, adozelesina, aldesleucina, altretamina, ambomicina, acetato de ametantrona, aminoglutetimida, ansacrina, anastrozol, antramicina, asparaginase, azacitidina, azetepa, batimastat, bleomicina, benzodepa, bicalutamida, cloridrato de bisantreno, dimesilato de bisnafídeo, bizelesina, sulfato de bleomicina, brequinar de sódio, bropirimina, busulfan, cactinomicina, calusterona, campatecina, caracemida, carbetímero, carboplatina, carmustina, cloridrato de carubicina, carzelesina, cedefingol, clorambucila, cirolemicina, cisplatina, cladribina, mesilato de crisnatol, ciclofosfamida, citarabina, ciclosporina A, combretastatina A4, análogo de combretastatina, fator citolítico, citostatina, dacliximab, docetaxel, dacarbazina, dactinomicina, cloridrato de daunorubicina, docetaxel, doxorubicina, droloxifeno, propionato de dromostanolona, duazomicina, edatrexato, cloridrato de eflornitina, elsamitrucina, enloplatina, enpromato, epipropidina, cloridrato de epirubicina, erbulozol, cloridrato de esorubicina, estramustina, etanidazol, etoposídeo, fazarabina, fenretinida,
95/132 floxuridina, fluorouracil, flurocitabina, fosquidona, gencitabina, hidroxiuréia, idarubicina, cloridrato de idarubicina, ifosfamida, ilmofosina, iproplatina, ifosfamida, cloridrato de irinotecano, acetato de lanreotídeo, letrozol, acetato de leuprolídeo, cloridrato de liarozol, lometrexol de sódio, lomustina, cloridrato de losoxantrona, masoprocol, mercaptopurina, metotrexato, metoprina, meturedepa, mitindomida, mitocarcina, mitocromina, mitomicina, mitoxantrona, ácido micofenólico, nitrossouréias, nocodazol, nogalamicina, ormaplatina, oxisuran, paclitaxel, plicamicina, complexo de platina, compostos de platina, complexo de platinatriamina, procarbizina, puromicina, taxol, tioguanina, talisomicina, tecogalan de sódio, tegafur, cloridrato de teloxantrona, vapreotídeo, verteporfina, sulfato de vinblastina, sulfato de vincristina, vindesina, sulfato de vindesina, sulfato de vinepidina, sulfato de vinglicinato, sulfato de vinleurosina, tartrato de vinorelbina, sulfato de vinrosidina, sulfato de vinzolidina, vorozol, zeniplatina, e zinostatina), inibidores de metaloproteinase de matriz, inibidores de tirosina quinase, tirfostinas, antagonistas de receptor uroquinase, inibidor de gene de resistência a drogas múltiplas, terapia com base em 1 supressor de tumor múltiplo, inibidor de ativador de plasminogênio, bisfosfonatos (por exemplo, pamidronato (Aredria), clondronato de sódio (Bonefos), ácido zoledrônico (Zometa), alendronato (Fosamax), etidronato, ibandornato, cimadronato, risedromato, e tiludromato), uma citocina (por exemplo, IL-2, IFN-a, IFN-β, IFN-γ, fator inibidor de leucemia, alfa-interferon de leucócitos, gonadotrofina coriônica humana, e trombopoietina), um hormônio (por exemplo, hormônio estimulante de tiróide), um anticorpo (por exemplo, um anticorpo anti-CD2, um anticorpo anti-CD20, e um anticorpo imunoespecífico para um ou mais receptores de galanina), vitamina D (por exemplo, 20-epi-1,25 dihidroxivitamina D3), um inibidor de angiogênese, um oligonucleotídeo anti-sentido, um modulador de gene de apoptose, um regulador de apoptose, um antagonista de BCR/ABL, um inibidor derivado de cartilagem, um agonista de estrógeno, um antagonista de estrógeno, um inibidor de gelatinase, um inibidor de glutationa, um inibidor de reductase HMG CoA (por exemplo, atorvastatina, cerivastatina, fluvastatina, lescol, lupitor, lovastatina, rosuvastatina, e simvastatina), um peptídeo imunoestimulante,
96/132 um inibidor de receptor de fator-1 de crescimento como insulina, um agonista de interferon, leuprolídeo+estrógeno+progesterona, leuprorelina, um RNA fita-dupla desalinhado, um inibidor de proteasoma, um modulador imune com base em proteína A, um inibidor de quinase C de proteína, um inibidor de tirosina fosfatase de proteína, um antagonista de raf, um inibidor de transferase de proteína ras farnesil, uma ribozima, RNAi, um modulador de transdução de sinal, um inibidor de célulastronco, um inibidor de divisão de células -tronco, um inibidor de telomerase, um agonista de receptor de timopoietina, e um inibidor de tradução.
[0175] Em formas de realização específicas, terapia de radiação compreendendo ou uso de raios x, raios gama e outras fontes de radiação para destruir as células de câncer é usada em combinação com os vírus atenuados de influenza de suínos da invenção. Nas formas de realização preferidas, o tratamento de radiação é administrado como radiação de feixes externa ou teleterapia, em que a radiação é dirigida de uma fonte remota. Em outras formas de realização preferidas, o tratamento de radiação é administrado como terapia interna ou braquiterapia em que uma fonte radioativa é colocada dentro do corpo próxima das células de câncer ou uma massa de tumor.
[0176] As terapias para câncer e suas dosagens, vias de administração e uso recomendado são bem conhecidas na técnica e foram descritas na literatura, como em Physicians’ Desk Reference (58a. edição, 2004) e Merck Veterinary Manual (oitava edição, 1998).
5.7.2 Terapias anti-anqioqênese [0177] Qualquer agente anti-angiogênico bem conhecido do versado na técnica pode ser usado nas composições e métodos da invenção. Exemplos não limitativos de agentes anti-angiogênicos incluem proteínas, polipeptídeos, peptídeos, proteínas de fusão, anticorpos (por exemplo, quimérico, monoclonal, policlonal, Fvs, ScFvs, fragmentos Fab, fragmentos F(ab)2, e fragmentos de ligação a antígenos dos mesmos) como anticorpos que ligam imuno-especificamente a TNFa, moléculas de ácido nucleico (por exemplo, moléculas anti-sentido ou hélices triplas), moléculas orgânicas, moléculas inorgânicas, e moléculas pequenas que reduzem ou inibem ou
97/132 neutralizam a angiogênese. Em particular, exemplos de agentes anti-angiogênicos, incluem, mas não são limitados a endostatina, angiostatina, apomigren, antitrombina anti-angiogênica III, os fragmentos proteolíticos N- terminais de 29 kDa e C-terminais de 40 kDa de fibronectina, um antagonista de receptor uPA, o fragmento proteolítico de 16 kDa de prolactina, o fragmento proteolítico de 7,8 kDa de um fator 4 de plaquetas, o fragmento de aminoácido 24 anti-angiogênico de fator 4 de plaquetas, o fator anti-angiogênico designado 13.40, o fragmento de peptídeo de aminoácido 22 anti-angiogênico de trombospondina I, o fragmento de peptídeo de aminoácido 20 anti-angiogênico de peptídeos contendo SPARC, RGD e NGR, os peptídeos antiangiogênicos pequenos de laminina, fibronectina, procolágeno e EGF, antagonistas de integrina ανβ3 (por exemplo, anticorpos de anti-integrina ανβ3), antagonistas de fator de crescimento de fibroblastos de ácido (aFGF), antagonistas de fator de crescimento de fibroblastos básicos (bFGF), antagonistas de fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) (por exemplo, anticorpos anti-VEGF), e antagonistas (VEGFR) de receptor VEGF (por exemplo, anticorpos anti-VEGFR).
5.7.3 Terapias anti-virais [0178] Qualquer agente anti-viral bem conhecido do versado na técnica pode ser usado nas composições e os métodos da invenção. Exemplos não limitativos de agentes anti-virais incluem proteínas, polipeptídeos, peptídeos, anticorpos de proteínas de fusão, moléculas de ácido nucleico, moléculas orgânicas, moléculas inorgânicas, e moléculas pequenas que inibem e/ou reduzem a fixação de um vírus em seu receptor, a internalização de um vírus em uma célula, a replicação de um vírus, ou liberação de vírus em uma célula. Em particular, os agentes anti-virais incluem, mas não são limitados a análogos de nucleosídeos (por exemplo, zidovudina, aciclovir, gangciclovir, vidarabina, idoxuridina, trifluridina, e ribavirina), foscarnet, amantadina, rimantadina, saquinavir, indinavir, ritonavir, alfa-interferons e outros interferons, e AZT.
[0179] Em formas de realização específicas, o agente anti-viral é um agente imunomodulatório que é imunoespecífico para um antígeno viral. Como usado aqui, o termo “antígeno viral” inclui, mas não é limitado a qualquer peptídeo viral,
98/132 polipeptídeo e proteína (por exemplo, 3AB, 3ABC de vírus de febre aftosa, GP5 de vírus de síndrome reprodutiva e respiratória de porcinos, vírus gE de pseudo-raiva, nucleoproteína de vírus de gastroenterite transmissível por suínos, neuraminidase de vírus de influenza, hemaglutinina de vírus de influenza, glicoproteína de vírus de herpes simplex (por exemplo, gB, gC, gD, e gE) e antígeno de superfície de hepatite B) que é capaz de elicitar uma resposta imune. Anticorpos utilizáveis desta invenção para tratamento de uma doença infecciosa viral incluem, mas não são limitados aos antígenos contra anticorpos de vírus patogênicos, incluindo como exemplos e não por limitação: adenovirdiae (por exemplo, mastadenovírus e aviadenovírus), herpesviridae (por exemplo, vírus de herpes simplex 1, vírus de herpes simplex 2, vírus de herpes simplex 5, e vírus de herpes simplex 6), leviviridae (por exemplo, levivírus, fase enterobactéria MS2, alolevírus), poxviridae (por exemplo, cordopoxvirinae, parapoxvírus, avipoxvírus, capripoxvírus, leporiipoxvírus, suipoxvírus, moluscipoxvírus, e entomopoxvirinae), papovaviridae (por exemplo, poliomavírus e papilomavírus), paramixoviridae (por exemplo, paramixovírus, vírus de parainfluenza 1, mobilivírus (por exemplo, vírus de sarampo, rubulavírus (por exemplo, vírus de caxumba), pneumonovirinae (por exemplo, pneumovírus, vírus sincicial respiratório humano), e metapneumovírus (por exemplo, pneumovírus aviário e metapneumovírus humano)), picornaviridae (por exemplo, enterovírus, rinovírus, hepatovírus (por exemplo, vírus de hepatite A humana), cardiovírus, e aptovírus), reoviridae (por exemplo, ortoreovírus, orbivírus, rotavírus, cipovírus, fijivírus, fitoreovírus, e orizavírus), retroviridae (por exemplo, retrovírus de tipo B de mamíferos, retrovírus tipo C de mamíferos, retrovírus tipo C de aves, grupo retrovírus do tipo D, retrovírus de BLV-HTLV, lentivírus (por exemplo, vírus de imunodeficiência humana 1 e vírus de imunodeficiência humana 2), espumavírus), flaviviridae (por exemplo, vírus de hepatite C), hepadnaviridae (por exemplo, vírus de hepatite B), togaviridae (por exemplo, alfavírus (por exemplo, vírus sindbis) e rubivírus (por exemplo, vírus de rubéola)), rhabdoviridae (por exemplo, vesiculovírus, lissavírus, efemerovírus, citorhabdovírus, e necleorhabdovírus), arenaviridae (por exemplo, arenavírus, vírus de coriomeningite linfocítica, vírus Ippy, e vírus lassa), e
99/132 coronaviridae (por exemplo, coronavírus e torovírus).
[0180] Exemplos específicos de anticorpos disponíveis utilizáveis para o tratamento de uma doença infecciosa viral incluem, mas não são limitados a PRO542 (Progenics) que é um anticorpo de fusão CD4 utilizável para o tratamento de infecção por HIV; Ostavir (Protein Design Labs, Inc., CA) que é um anticorpo humano utilizável para o tratamento de vírus de hepatite B; e protovir (Protein Design Labs, Inc., CA) que é um anticorpo lgG1 humanizado utilizável para o tratamento de citomegalovírus (CMV).
[0181] Terapias anti-virais e suas dosagens, vias de administração e uso recomendado são conhecidos na técnica e foram descritos na literatura como o Physicians’ Desk Reference (58a. edição, 2004) e Merck Veterinary Manual (oitava edição, 1998). Informação adicional sobre infecções virais se encontra disponível em Cecil Textbook of Medicine (décima oitava edição, 1988).
5.7.4 Terapias antibióticas [0182] Qualquer agente antibiótico bem conhecido do versado na técnica pode ser usado nas composições e os métodos da invenção. Agentes antibacterianos ou antibióticos que podem ser usados em combinação com os complexos da invenção incluem, mas não são limitados aos antibióticos aminoglicosídeos (por exemplo, apramicina, arbecacina, bambermicinas, butirosina, dibecacina, neomicina, neomicina, undecilenato, netilmicina, paromomicina, ribostamicina, sisomicina, e espectinomicina), antibióticos anfenicol (por exemplo, azidanfenicol, cloranfenicol, florfenicol, e tianfenicol), antibióticos ansamicina (por exemplo, rifamida e rifanpina), carbacefens (por exemplo, loracarbef), carbapenemos (por exemplo, biapenem e imipenem), cefaloesporinas (por exemplo, cefaclor, cefadroxil, cefamandol, cefatrizina, cefazedona, cefozopran, cefpimizol, cefpiramida, e cefpiroma), cefamicinas (por exemplo, cefbuperazona, cefmetazol, e cefminox), monobactamos (por exemplo, aztreonam, carumonam, e tigemonam), oxacefens (por exemplo, flomoxef, e moxalactamo), penicilinas (por exemplo, andinocilina, pivoxil de andinocilina, amoxicilina, bacampicilina, ácido benzilpenicilínico, benzilpenicilínico de sódio, epicilina, fenbenicilina, floxacilina, penancilina, hidriodeto de penetamato, o100/132 benetamina de penicilina, penicilina 0, penicilina V, benzatina de penicilina V, hidrabamina de penicilina V, penimepiciclina, e fencihicilina de potássio), lincosamidas (por exemplo, clindamicina, e lincomicina), macrolídeos (por exemplo, azitromicina, carbomicina, claritomicina, diritromicina, eritromicina, e acistrato de eritromicina), anfomicina, bacitracina, capreomicina, colistina, enduracidina, enviomicina, tetraciclinas (por exemplo, apiciclina, clortetraciclina, clomociclina, e demeclociclina), 2,4-diaminopirimidinas (por exemplo, brodimoprim), nitrofuranos (por exemplo, furaltadona, e cloreto de furazólio), quinolonas e análogos dos mesmos (por exemplo, cinoxacina, ciprofloxacina, clinafloxacina, flurnequina, e grepagloxacina), sulfonamidas (por exemplo, sulfametoxipirazina de acetila, benzilsulfamida, noprilsulfamida, ftalilsulfacetamida, sulfacrisoidina, e sulfacitina), sultanas (por exemplo, diatimossulfona, glucossulfona de sódio, e solassulfona), cicloserina, mupirocina e tuberina.
[0183] Exemplos adicionais de agentes antibacterianos incluem, mas não são limitados a acedapsona; acetossulfona de sódio; alamecina; alexidina; amdinocilina; andinocilina pivoxila; amiciclina; amifloxacina; mesilato de amifloxacina; amicacina; sulfato de amicacina; ácido aminossalicílico; aminossalicilato de sódio; amoxicilina; anfomicina; ampicilina; ampicilina de sódio; apalcilina de sódio; apramicina; aspartocina; sulfato de astromicina; avilamicina; avoparcina; azitromicina; azlocilina; azlocilina de sódio; cloridrato de bacampicilina; bacitracina; dissalicilato de metileno de bacitracina; bacitracina de zinco; bambermicinas; benzoilpas de cálcio; beritromicina; sulfato de betamicina; biapenem; biniramicina; cloridrato de bifenamina; bispiritiona magsulfex; buticacina; sulfato de butirosina; sulfato de capreomicina; carbadox; carbenicilina de dissódio; carbenicilina indanil de sódio; carbenicilina fenil de sódio; carbenicilina de potássio; carumonam de sódio; cefaclor; cefadroxila; cefamandol; nafato de cefamandol; cefamandol de sódio; cefaparol; cefatrizina; cefazaflur de sódio; cefazolina; cefazolina de sódio; cefbuperazona; cefdinir; cefepima; cloridrato de cefepima; cefetecol; cefixima; cloridrato de cefmnenóxima; cefinetazol; cefmetazol de sódio; cefonicid de monossódio; cefonicid de sódio; cefoperazona de sódio; ceforanídeo; cefotaxima de sódio; cefotetan;
101/132 cefotetan de dissódio; cloridrato de cefotiam; cefoxitina; cefoxitina de sódio; cefpimizol; cefpimizol de sódio; cefpiramida; cefpiramida de sódio; sulfato de cefpiroma; cefpodóxima proxetila; cefprozila; cefroxadina; cefsulodin de sódio; ceftazidima; ceftibuteno; ceftizóxima de sódio; ceftriaxona de sódio; cefuróxima; cefuróxima axetila; cefuróxima pivoxetila; cefuróxima de sódio; cefacetril de sódio; cefalexina; cloridrato de cefalexina; cefaloglicina; cefaloridina; cefalotin de sódio; cefapirin de sódio; cefradina; cloridrato de cetociclina; cetofenicol; cloranfenicol; palmitato de cloranfenicol; complexo de pantotenato de cloranfenicol; sucinato de cloranfenicol de sódio; fosfanilato de clorhexidina; cloroxilenol; bissulfato de clortetraciclina; cloridrato de clortetraciclina; cinoxacina; ciprofloxacina; cloridrato de ciprofloxacina; cirolemicina; claritromicina; cloridrato de clinafloxacina; clindamicina; cloridrato de clindamicina; cloridrato de palmitato de clindamicina; fosfato de clindamicina; clofazimina; benzatina de cloxacilina; cloxacilina de sódio, cloxiquina; colistimetato de sódio; sulfato de colistina; coumermicina; coumermicina de sódio; ciclacilina; cicloserina; dalfopristina; dapsona; daptomicina; demeclociclina; cloridrato de demeclociclina; demeciclina; denofungina; diaveridina; dicloxacilina; dicloxacilina de sódio; sulfato de dihidroestreptomicina; dipiritiona; diritromicina; doxiciclina; doxiciclina de cálcio; doxiciclina fosfatex; hiclato de doxiciclina; droxacina de sódio; enoxacina; epicilina; cloridrato de epitetraciclina; eritromicina; acistrato de eritromicina; estolato de eritromicina; etilsucinato de eritromicina; gluceptato de eritromicina; lactobionato de eritromicina; propionato de eritromicina; estearato de eritromicina; cloridrato de etambutol; etionamida; fleroxacina; floxacilina; fludalanina; flumequina; fosfomicina; fosfomicina de trometamina; fumoxicilina; cloreto de furazólio; tartrato de furazólio; fussidato de sódio; ácido fusídico; sulfato de gentamicina; gloximonam; gramicidina; haloprogina; hetacilina; hetacilina de potássio; hexedina; ibafloxacina; imipenem; isoconazol; isepamicina; isoniazid; josamicina; sulfato de canamicina; citasamicina; levofuraltadona; levopropilcilina de potássio; lexitromicina; lincomicina; cloridrato de lincomicina; lomefloxacina; cloridrato de lomefloxacina; mesilato de lomefloxacina; loracarbef; mafenídeo; meclociclina; sulfossalicilato de meclociclina; fosfato de potássio de megalomicina;
102/132 mequidox; meropenem; metaciclina; cloridrato de metaciclina; metenamina; hipurato de metenamina; mandelato de metenamina; meticilina de sódio; metioprim; cloridrato de metronidazol; fosfato de metronidazol; mezlocilina; mezlocilina de sódio; minociclina; cloridrato de minociclina; cloridrato de mirincamicina; monensina; monensina de sódio; nafcilina de sódio; nalidixato de sódio; ácido nalidíxico; natamicina; nebramicina; palmitato de neomicina; sulfato de neomicina; undecilenato de neomicina; sulfato de netilmicina; neutramicina; nifuradeno; nifuraldezona; nifuratel; nifuratrona; nifurdazila; nifurimida; nifurpirinol; nifurquinazol; nifurtiazol; nitrociclina; nitrofurantoína; nitromida; norfloxacina; novobiocina de sódio; ofloxacina; ormetoprima; oxacilina de sódio; oximonam; oximonam de sódio; ácido oxolínico; oxitetraciclina; oxitetraciclina de cálcio; cloridrato de oxitetraciclina; paldimicina; paraclorofenol; paulomicina; pefloxacina; messilato de pefloxacina; penamecilina; penicilina G benzatina; penicilina G de potássio; penicilina G procaína; penicilina G de sódio; penicilina V; penicilina V benzatina; penicilina V hidrabamina; penicilina V de potássio; pentizidona de sódio; aminossalicilato de fenila; piperacilina de sódio; pirbenicilina de sódio, piridicilina de sódio; cloridrato de pirlimicina; cloridrato de pivampicilina; pamoato de pivampicilina; probenato de pivampicilina; sulfato de polimixina B; porfiromicina; propicacina; pirazinamida; piritiona de zinco; acetato de quindecamina; quinupristina; racefenicol; ramoplanina; ranimicina; relomicina; repromicina; rifabutina; rifametano; rifamexila; rifamida; rifampina; rifapentina; rifaximina; rolitetraciclina; nitrato de rolitetraciclina; rosaramicina; butirato de rosaramicina; propionato de rosaramicina; fosfato de rosaramicina de sódio; estearato de rosaramicina; rosoxacina; roxarsona; roxitromicina; sanciclina; sanfetrinem de sódio; sarmoxicilina; sarpicilina; escopafingina; sisomicina; sulfato de sisomicina; esparfloxacina; cloridrato de espectinomicina; espiramicina; cloridrato de estalimicina; estefimicina; sulfato de estreptomicina; estreptonicozid; sulfabenz; sulfabenzamida; sulfacetamida; sulfacetamida de sódio; sulfacitina; sulfadiazina; sulfadiazina de sódio; sulfadoxina; sulfaleno; sulfamerazina; sulfameter; sulfametazina; sulfametizol; sulfametoxazol; sulfamonometoxina; sulfamoxol; sulfanilato de zinco; sulfanitrano; sulfasalazina; sulfasomizol; sulfatiazol; sulfazamet;
103/132 sulfisoxazol; sulfisoxazol acetila; sulfisoxazol diolamina; sulfomixina; sulopenem; sultamicilina; suncilina de sódio; cloridrato de talampicilina; teicoplanina; cloridrato de temafloxacina; temocilina; tetraciclina; cloridrato de tetraciclina; complexo fosfato de tetraciclina; tetroxoprim; tianfenicol; tifencilina de potássio; ticarcilina cresil de sódio; ticarcilina de dissódio; ticarcilina de monossódio; ticlatona; cloreto de tiodônio; tobramicina; sulfato de tobramicina; tossufloxacina; trimetoprim; sulfato de trimetoprim; trissulfapirimidinas; troleandomicina; sulfato de trospectomicina; tirotricina; vancomicina; cloridrato de vancomicina; virginiamicina; zorbamicina.
[0184] Terapias antibióticas e suas dosagens, vias de administração e uso recomendado são conhecidos na técnica e foram descritos na literatura como o Physicians’ Desk Reference (58a. edição, 2004) e Merck Veterinary Manual (oitava edição, 1998).
5.7.5 Terapias imunomoduladoras [0185] Qualquer agente imunomodulador bem conhecido do versado na técnica pode ser usado nos métodos e composições da invenção. Os agentes imunomoduladores podem afetar um ou mais ou todos os aspectos da resposta imune em um indivíduo. Aspectos de resposta imune incluem, mas não são limitados a uma resposta inflamatória, a cascata de complementos, diferenciação de leucócitos e linfócitos, proliferação e/ou função de efetuador, contagens de monócitos e/ou basófilos, e a comunicação celular dentre as células do sistema imune. Em algumas formas de realização da invenção, um agente imunomodulador modula um aspecto da presente invenção. Em outras formas de realização, um agente imunomodulador modula mais de um aspecto da resposta imune. Em uma forma de realização preferida da invenção, a administração de um agente imunomodulador a um indivíduo inibe ou reduz um ou mais aspectos das capacidades de resposta imune do indivíduo. Em algumas formas de realização, um agente imunomodulador não é um agente anti-inflamatório. Em algumas formas de realização, um agente imunomodulador é um agente quimioterapêutico. Em algumas formas de realização, um agente imunomodulador não é um agente quimioterapêutico.
104/132 [0186] Exemplos de agentes imunomoduladores incluem, mas não são limitados aos agentes proteináceos, como citocinas, peptídeos miméticos, e antibióticos (por exemplo, humano, humanizado, quimérico, monoclonal, policlonal, Fvs, ScFvs, fragmentos de Fab ou F(ab)2 ou fragmentos de ligação de epítopos), moléculas de ácido nucleico (por exemplo, moléculas de ácido nucleico anti-sentido e hélices triplas), moléculas pequenas, compostos orgânicos, e composto inorgânicos. Em particular, os agentes imunomoduladores incluem, mas não são limitados a metotrexato, leflunomida, ciclofosfamida, citoxan, imuran, ciclosporina A, minociclina, azatioprina, antibióticos (por exemplo, FK506 (tacrolimus)), metilprednisolona (MP), corticoesteróides, esteróides, micofenolato de mofetila, rapamicina (sirolimus), mizoribina, deoxiespergualina, brequinar, malononitriloamindas (por exemplo, leflunamida), moduladores de receptores de célula T, e moduladores de receptor de citocina.
[0187] Exemplos de moduladores de receptor de células T incluem, mas não são limitados aos anticorpos de receptor de célula anti-T (por exemplo, anticorpos antiCD4 (por exemplo, CM-T412 (Boeringer), IDEC-CE9.1® (IDEC e SKB), mAB 4162W94, ortoclone e OKTcdr4a (Janssen-Cilag)), anticorpos anti-CD2, anticorpos anti-CD3 (por exemplo, nuvion (Product Design Labs), OKT3 (Johnson & Johnson), ou rituxan (IDEC)), anticorpos anti-CD5 (por exemplo, um imunoconjugado ligado a ricina anti-CD5), anticorpos anti-CD7 (por exemplo, CHH-380 (Novartis)), anticorpos anti-CD8, anticorpos monoclonais de ligando anti-CD40 (por exemplo, IDEC-131 (IDEC)), anticorpos anti-CD52 (por exemplo, CAMPATH 1H (llex)), anticorpos antiCD2, anticorpos anti-CD11a (por exemplo, xanelim (Genentech)), e anticorpos antiB7 (por exemplo, IDEC-114) (IDEC)), CTLA4-imunoglobulina, e LFA-3TIP (Biogen, publicação internacional número WO 93/08656 e patente U.S. número 6.162.432). [0188] Exemplos de moduladores de receptor de citocinas incluem, mas não são limitados aos receptores de citocina solúveis (por exemplo, o domínio extracelular de um receptor TNF-α ou um fragmento do mesmo, o domínio extracelular de um receptor 11-1 β ou fragmento do mesmo, e o domínio extracelular de um receptor IL-6 ou um fragmento do mesmo), citocinas ou fragmentos dos mesmos (por exemplo,
105/132 interleucina IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-15, IL-23, TNF-a, TNF-β, interferon (IFN)-a, IFN-β, IFN-γ, e GM-CSF), anticorpos de receptor anti-citocina (por exemplo, anticorpos de receptor anti-IFN, anticorpos de receptor anti-IL-2 (por exemplo, zenapax (Protein Design Labs)), anticorpos de receptor anti-IL-3, anticorpos de receptor anti-IL-4, anticorpos de receptor anti-IL-6, anticorpos de receptor anti-IL-9, anticorpos de receptor anti-IL-10, anticorpos de receptor anti-IL-12, anticorpos de receptor anti-IL-13, anticorpos de receptor anti-IL15, e anticorpos de receptor anti-IL-23), anticorpos anti-citocina (por exemplo, anticorpos anti-IFN, anticorpos anti-TNF-α, anticorpos anti-IL-1 β, anticorpos anti-IL3, anticorpos anti-IL-6, anticorpos anti-IL-8 (por exemplo, ABX-IL-8 (Abgenix)), anticorpos anti-IL-9, anticorpos anti-IL-12, anticorpos anti-IL-13, anticorpos anti-IL15, e anticorpos anti-IL-23).
[0189] Em uma forma de realização específica, um modulador de receptor de citocinas é IL-3, IL-4, IL-10, ou um fragmento do mesmo. Em outra forma de realização, um modulador de receptor de citocinas é um anticorpo anti-IL-1 β, anticorpo anti-IL-6, anticorpo de receptor anti-IL-12, ou anticorpo anti-TNF-α. Em outra forma de realização, um modulador de receptor de citocinas é o domínio extracelular de um receptor TNF-α ou um fragmento do mesmo.
[0190] Em algumas formas de realização, um agente imunomodulador é um modulador de receptor de células B. Exemplos de moduladores de receptor de células B incluem, mas não são limitados a CD19. Os receptores de células B alvo proporciona um meio para modular as células B.
[0191] Em uma forma de realização preferida, proteínas, polipeptídeos ou peptídeos (incluindo anticorpos) que são utilizados como agentes imunomoduladores são derivados da mesma espécie como o recipiente das proteínas, polipeptídeos ou peptídeos de modo a reduzir a possibilidade de uma resposta imune a estas proteínas, polipeptídeos ou peptídeos. Em outra forma de realização preferida, quando o indivíduo é um porco, as proteínas, polipeptídeos, ou peptídeos que são utilizados como agentes imunomoduladores são derivados de porco.
106/132 [0192] De acordo com a invenção, um ou mais agentes imunomoduladores são administrados a um indivíduo antes, subseqüente, ou concomitantemente com um vírus atenuado de influenza de suínos. Qualquer técnica bem conhecida do versado na técnica pode ser usada para medir um ou mais aspectos da resposta imune em um indivíduo particular, e assim determinar quando é necessário administrar um agente imunomodulador ao referido indivíduo. Em uma forma de realização preferida, uma contagem de linfócitos absoluta média de aproximadamente 500 células/mm3, preferivelmente 600 células/mm3, 650 células/mm3, 700 células/mm3, 750 células/mm3, 800 células/mm3, 900 células/mm3, 1000 células/mm3, 1100 células/mm3, ou 1200 células/mm3 é mantida em um indivíduo.
[0193] Preferivelmente, agentes que são comercialmente disponíveis e conhecidos como funcionando como agentes imunomoduladores são usados de acordo com os métodos da invenção. A atividade imunomoduladora de um agente pode ser determinada in vitro e/ou in vivo por qualquer técnica bem conhecida na técnica, incluindo, por exemplo, testes CTL, testes de proliferação e imunotestes (por exemplo ELISAs) para a expressão de proteínas particulares, como moléculas co-estimulatórias e citocinas.
5.8 Dosagem e freqüência de administração [0194] A quantidade de agente profilático ou terapêutico ou uma composição da invenção que será eficaz na prevenção, tratamento, controle e/ou melhora de infecção por vírus de influenza de suínos ou uma condição associada com a mesma, uma infecção diferente de uma infecção por vírus de influenza de suínos ou uma condição associada com a mesma, uma doença tratável por IFN ou uma condição em que um vírus atenuado de influenza de suínos da invenção é usado como um vetor para induzir uma resposta imune a um antígeno associado com a condição, ou a prevenção da recorrência, início, ou desenvolvimento de um ou mais sintomas de uma infecção por vírus de influenza de suínos ou uma condição ou sintoma associado com a mesma, uma infecção diferente de uma infecção por vírus de influenza de suínos ou uma condição ou sintoma associado com a mesma, uma doença tratável por IFN ou uma condição em que os vírus atenuados de influenza de
107/132 suínos da invenção é usado como um vetor para induzir uma resposta imune a um antígeno associado com a condição, pode ser determinada por métodos clínicos padrões. A freqüência e dosagem irão também variar de acordo com fatores específicos para cada paciente dependendo das terapias específicas ( por exemplo, agente ou agentes terapêuticos ou profiláticos específicos) administrados, a severidade do distúrbio, doença ou condição, a via de administração, assim como a idade, corpo, peso, resposta e o histórico médico passado do paciente. Por exemplo, a dosagem do agente profilático ou terapêutico ou uma composição da invenção que será eficaz no tratamento, prevenção, controle e/ou melhora de uma infecção por vírus de influenza de suínos ou uma condição associada com a mesma, uma infecção viral diferente de uma infecção por vírus de influenza de suínos ou uma condição associada com a mesma, ou uma doença tratável por IFN, ou a prevenção da recorrência, início, ou desenvolvimento de um ou mais sintomas de uma infecção por vírus de influenza de suínos ou uma condição associada com a mesma, uma infecção viral diferente de uma infecção por vírus de influenza de suínos ou uma condição ou sintoma associado com a mesma, ou uma doença tratável por IFN, podem ser determinados por modelos de animais como os bem conhecidos do versado na técnica. Além disso, testes in vitro podem ser opcionalmente empregados para ajudar a identificar faixas de dosagem ótimas. Os regimes apropriados podem ser selecionados pelos versados na técnica por consideração de fatores e seguindo, por exemplo, dosagens como registrado na literatura e recomendado no Physician’s Desk Reference (58a. edição, 2004) e Merck Veterinary Manual (oitava edição, 1998), ou Straw et al., Diseases of the Swine, lowa State University Press (1999).
[0195] Doses exemplares de uma vacina ou formulação imunogênica incluem 102 a cerca de 108, cerca de 103 a cerca de 107, cerca de 104 a cerca de 5 x 106 pfu ou 104 a cerca de 107 pfu. Em outras formas de realização, a dose de uma vacina ou formulação imunogênica da invenção administrada a um indivíduo é de 102, 5 x 102, 103, 5 x 103, 104, 5 x 104, 105, 5 x 105, 106, 5 x 106, 107, 5 x 107 ou 108 pfu. Doses exemplares de uma formulação farmacêutica incluem 102, 5 x 102, 103, 5 x 103, 104,
108/132
5χ 104, 105, 5 χ 105, 106, 5 χ 106, 107, 5 χ 107, 10®, 5χ 10®, 1 χ 109, 5 χ 109, 1 χ 1Ο10, 5 χ 1010, 1 χ 1011, 5 χ 1011 ou 1012 pfu. Em certas formas de realização, a dose da formulação farmacêutica administrada ao indivíduo está entre cerca de 102 a cerca de 1012, cerca de 102 a cerca de 1010, cerca de 102 a cerca de 10®, cerca de 10® a cerca de 109, cerca de 103 a cerca de 107, cerca de 104 a cerca de 10®, cerca de 104 a cerca de 5 x 10® pfu ou cerca de 104 a cerca de 1012 pfu.
[0196] As doses exemplares de uma molécula pequena incluem quantidades em miligrama ou micrograma da molécula pequena por quilograma de peso do indivíduo ou amostra (por exemplo, cerca de 1 micrograma por quilograma e cerca de 500 miligramas por quilograma, cerca de 100 microgramas por quilograma e cerca de 5 miligramas por quilograma, ou cerca de 1 micrograma por quilograma a cerca de 50 microgramas por quilograma).
[0197] Para anticorpos, proteínas, polipeptídeos, peptídeos e proteínas de fusão englobados pela invenção, a dosagem administrada a um paciente é tipicamente de 0,0001 mg/kg a 100 mg/kg do peso corporal do paciente. Preferivelmente, a dosagem administrada a um paciente está entre 0,0001 mg/kg e 20 mg/kg, 0,0001 mg/kg e 10 mg/kg, 0,0001 mg/kg e 5 mg/kg, 0,0001 e 2 mg/kg, 0,0001 e 1 mg/kg, 0,0001 mg/kg e 0,75 mg/kg, 0,0001 mg/kg e 0,5 mg/kg, 0,0001 mg/kg a 0,25 mg/kg, 0,0001 a 0,15 mg/kg, 0,0001 a 0,10 mg/kg, 0,001 a 0,5 mg/kg, 0,01 a 0,25 mg/kg ou 0,01 a 0,10 mg/kg do peso corporal do paciente. Geralmente, anticorpos de porco tem uma meia-vida mais longa dentro do porco do que os anticorpos de outras espécies devido à resposta imune aos polipeptídeos estranhos. Assim, dosagens menores de anticorpos de porcos e administração menos freqüente aos porcos é com freqüência possível. Além disso, a dosagem e freqüência de administração de anticorpos ou fragmentos dos mesmos podem ser reduzidas por melhora da absorção e penetração no tecido dos anticorpos por modificações como, por exemplo, lipidação.
[0198] Preferivelmente, as dosagens de agentes profiláticos ou terapêuticos usados em terapias de combinação da invenção são menores do que os que foram ou estão sendo atualmente usados na prevenção, tratamento, controle e/ou melhora
109/132 de infecção por vírus de influenza de suínos ou uma condição ou sintomas associados com a mesma, uma infecção diferente de uma infecção por vírus de influenza de suínos ou uma condição associada com a mesma, uma doença tratável por IFN ou uma condição em que um vírus atenuado de influenza de suínos da invenção é usado como um vetor para induzir uma resposta imune a um antígeno associado com a condição. As dosagens recomendadas de agentes atualmente usados na prevenção, tratamento, controle e/ou melhora de infecção por vírus de influenza de suínos ou uma condição ou sintomas associados com a mesma, uma infecção diferente de uma infecção por vírus de influenza de suínos ou uma condição associada com a mesma, uma doença tratável por IFN ou uma condição em que um vírus atenuado de influenza de suínos da invenção é usado como um vetor para induzir uma resposta imune a um antígeno associado com a condição, podem ser obtidas de qualquer referência na técnica incluindo, mas não limitada a Hardman et al., eds., 2001, Goodman & Gilmaris The Pharmacological Basis Of Basis Of Therapeutics, décima edição., Mc-Graw-Hill, New York; Physicians’ Desk Reference (PDR) 58a edição, 2004, Medicai Economics Co., Inc., Montvale, NJ, e Merck Veterinary Manual (oitava edição, 1998); Taylor, Pig Diseases, sexta edição, Diamond Farm Book Pubns, 1995; e Straw et al., Diseases of Swine, oitava edição, lowa State University Press, 1999, que são incorporados aqui por referência em suas totalidades.
[0199] Em várias formas de realização, as terapias (por exemplo, agentes profiláticos ou terapêuticos) são administrados com um intervalo menor do que 5 minutos, com um intervalo menor do que 30 minutos, com um intervalo menor do que 1 hora, em um intervalo de cerca de 1 hora, com um intervalo de cerca de 1 a cerca de 2 horas, com um intervalo de cerca de 2 horas a cerca de 3 horas, com um intervalo de cerca de 3 horas a cerca de 4 horas, com um intervalo de cerca de 4 horas a cerca de 5 horas, com um intervalo de cerca de 5 horas a cerca de 6 horas, com um intervalo de cerca de 6 horas a cerca de 7 horas, com um intervalo de cerca de 7 horas a cerca de 8 horas, com um intervalo de cerca de 8 horas a cerca de 9 horas, com um intervalo de cerca de 9 horas a cerca de 10 horas, com um intervalo
110/132 de cerca de 10 horas a cerca de 11 horas, com um intervalo de cerca de 11 horas a cerca de 12 horas, com um intervalo de cerca de 12 horas a 18 horas, com um intervalo de 18 horas a 24 horas, com um intervalo de 24 horas a 36 horas, com um intervalo de 36 horas a 48 horas, com um intervalo de 48 horas a 52 horas, com um intervalo de 52 horas a 60 horas, com um intervalo de 60 horas a 72 horas, com um intervalo de 72 horas a 84 horas, com um intervalo de 84 horas a 96 horas, ou com um intervalo de 96 horas a 120 horas. Nas formas de realização preferidas, duas ou mais terapias são administradas na mesma visita do paciente.
[0200] Em algumas formas de realização, uma ou mais composições da invenção e uma ou mais terapias (por exemplo, agentes profiláticos ou terapêuticos) são ciclicamente administradas. A terapia cíclica envolve a administração de uma primeira terapia (por exemplo, agente profilático ou terapêutico) durante um período de tempo, seguido pela administração de uma segunda terapia (por exemplo, um segundo agente profilático ou terapêutico) durante um período de tempo, opcionalmente seguida pela administração de uma terceira terapia (por exemplo, agente profilático ou terapêutico) durante um período de tempo e assim em diante, e repetindo esta administração seqüencial, isto é, o ciclo a fim de reduzir o desenvolvimento de resistência a uma das terapias, de modo a evitar ou reduzir os efeitos laterais de uma das terapias e/ou melhoras a eficácia das terapias.
[0201] Em algumas outras formas de realização, uma composição de vacina ou imunogênica da invenção é administrada a um indivíduo em uma dose única, seguido por uma segunda dose de 3 a 6 semanas depois. De acordo com estas formas de realização, vacinações de reforço são administradas a um indivíduo com 6 a 12 meses de intervalo seguindo a segunda vacinação. Em uma forma de realização preferida, o indivíduo é um mamífero. Em uma forma de realização mais preferida, o indivíduo é um suíno com a infecção influenza A de suínos.
[0202] Em algumas formas de realização, a administração das mesmas composições da invenção pode ser repetida e a administração pode ser separada em pelo menos 1 dia, 2 dias, 3 dias, 5 dias, 10 dias, 15 dias, 30 dias, 45 dias, 2 meses, 75 dias, 3 meses, ou pelo menos 6 meses. Em outras formas de realização,
111/132 a administração da mesma terapia (por exemplo, agente profilático ou terapêutico) diferente de uma composição da invenção pode ser repetida e a administração pode ser repetida e a administração pode ser separada por pelo menos 1 dia, 2 dias, 3 dias, 5 dias, 10 dias, 15 dias, 30 dias, 45 dias, 2 meses, 75 dias, 3 meses, ou pelo menos 6 meses.
5.9 Testes biológicos
5.9.1 Testes in vitro [0203] Crescimento dos vírus atenuados de influenza de suínos da presente invenção pode ser avaliado em células de porco, por exemplo, células PK, outras células de porco como descrito aqui, e outras células competentes para IFN e deficientes em IFN. Em uma forma de realização específica, as células PK são infectadas em um MOI de 0,0005 e 0,001, 0,001 e 0,01, 0,01 e 0,1, 0,1 e 1, ou 1 e 10, ou um MOI de 0,0005, 0,001, 0,005, 0,01, 0,05, 0,1, 0,5, 1,5 ou 10 e incubadas com meio isento de soro suplementado com 5% de fluido alantóico. (F. Cook, University of Kentucky, Lexington, KY). Títulos virais são determinados no sobrenadante por HA em placas em células MDCK como descrito abaixo. Outras células em que os títulos virais podem ser avaliados incluem, mas não são limitadas a células PK, células Vero, células endoteliais de veia umbilical humana primária (HUVEC), linhagem de célula epitelial humana H292, células HeLa, e células de rim embriônico de suínos RES.
[0204] Os testes virais incluem os que medem a replicação viral alterada (como determinado, por exemplo por formação de placas) ou a produção de proteínas virais (como determinado, por exemplo por análise de western blot) ou RNAs virais (como determinado, por exemplo, por RT-PCR ou análise Northern blot) em células cultivadas in vitro usando métodos que são bem conhecidos na técnica.
[0205] A indução de respostas a IFN pode ser determinada por medida do estado fosforilado de componentes da via IFN seguindo infecção com o vírus mutante de tese, por exemplo IRF-3, que é fosforilado em resposta a RNA fita dupla. Em resposta ao IFN tipo 1, Jak1 quinase e TyK2 quinase, as subunidades do receptor de IFN, STAT1, e STAT2 são rapidamente fosforilados com tirosina. Assim,
112/132 a fim de determinar se o vírus atenuado de influenza de suínos induz respostas de IFN, as células, como células 293, são infectadas com o vírus mutante de teste e após infecção, as células são lisadas. Os componentes da via de IFN, como Jak1 quinase ou Tyk2 quinase, são imunoprecipitados dos lisados de células infectados, usando soro policlonal específico ou anticorpos, e o estado fosforilado de tirosina da quinase é determinado por testes imunoblot com um anticorpo anti-fosfotirosina (por exemplo, ver Krishnan et al. 1997, Eur. J. Biochem. 247: 298 - 305). Um estado fosforilado melhorado de qualquer um dos componentes de via IFN seguindo infecção com o vírus atenuado de influenza de suínos deve indicar a indução de respostas de IFN pelo vírus atenuado de influenza de suínos.
[0206] A indução de respostas de IFN pode ser determinada por medida de ativação transcripcional dependente de IFN seguindo infecção com o vírus atenuado de influenza de suínos de teste. Nesta forma de realização, a expressão de genes conhecidos como sendo induzidos por IFN, por exemplo, Mx, PKR, 2-5oligoadenilatesintetase, complexo de histocompatibilidade principal (MHC) classe I, etc, podem ser analisados por técnicas bem conhecidas dos versados na técnica (por exemplo northern blots, western blots, PCR, etc). Alternativamente, as células de teste como células de rim embriônico ou células de sarcoma osteogênico, são engenheiradas para expressar de modo transiente ou constitutivo os genes repórter, como gene repórter luciferase ou gene repórter cloranfenicol transferase (CAT) sob o controle de um elemento de resposta estimulado por interferon, como o promotor estimulado por IFN do gene ISG-54K (Bluyssen et al., 1994, Eur. J. Biochem. 220: 395 - 402). As células são infectadas com o vírus atenuado de influenza de suínos de teste e o nível de expressão do gene repórter comparado com o em células não infectadas ou células infectadas com o vírus de tipo selvagem. Um aumento no nível de expressão do gene repórter após infecção com o vírus de teste deve indicar que o vírus atenuado de influenza de suínos de teste está induzindo uma resposta de IFN.
[0207] A medida da indução de IFN pode ser também avaliada por determinação de se um extrato da célula ou ovo infectados com o vírus atenuado de influenza de
113/132 suínos de teste é capaz de conferir uma atividade protetora contra a infecção viral. Mais especificamente, os grupos de ovos embrionados de galinha com 10-12 dias de idade, ou ovos embrionados de galinha com 10 dias, são infectados com o vírus atenuado de influenza de suínos de teste ou o vírus de tipo selvagem. Aproximadamente 15 a 20 h após a infecção, o fluido alantóico é coletado e testado para atividade de IFN por determinação da maior diluição com atividade de proteção contra a infecção por vírus de influenza de suínos em células de cultura de tecido, como células MDCK.
5.9.2 Testes in vivo [0208] A virulência diminuída dos vírus atenuados de influenza de suínos da presente invenção pode ser avaliada em um indivíduo, particularmente porcos. Em um exemplo, a capacidade de induzir lesões no pulmão e causar infecção em suínos é comparada com o vírus de influenza de suínos de tipo selvagem e vírus simulado. As lesões no pulmão podem ser avaliadas como uma porcentagem de lóbulos pulmonares que estão saudáveis por inspeção visual. Os animais são submetidos a eutanásia 5 dias p.i. por administração intravenosa de pentobarbital, e seus pulmões são removidos in toto. A porcentagem da superfície de cada lóbulo pulmonar que é afetada por lesões macroscópicas é estimada visualmente. As porcentagens são obtidas em média para obter um valor médio para os 7 lóbulos pulmonares de cada animal.
[0209] Em outros testes, os esfregaços nasais e BALF podem ser testados para determinar a carga ou título viral. Os esfregaços nasais podem ser tomados durante a necropsia para determinar a carga viral após infecção. As amostras também podem ser tomadas com cuidado de porcos vivos para determinar a carga viral após a infecção. BALF pode ser obtido após os pulmões serem removidos da cavidade torácica por enxágüe dos pulmões (via traquéia) com cerca de 30 ml de meio McCoy sem soro.
[0210] Para quantificação de vírus em amostras de tecido, as amostras de tecido são homogeneizadas em solução salina tamponada com fosfato (PbS) e diluições de homogenados purificados adsorvido durante 1 h a 37 °C sobre monocamadas de
114/132 células MDCK. As monocamadas infectadas são então depositadas com uma solução de meio essencial mínimo contendo 0,1% de albumina de soro bovino (BSA), 0,01% de DEAE-dextrano, 0,1% de NaHCO3, e 1% de agar. Placas são incubadas 2 a 3 dias até poderem ser visualizadas. Os testes de dose infecciosa de cultura de tecido(TCID) para titular vírus de amostras infectadas com PR8 são realizados como a seguir. As monocamadas confluentes de células MDCK em placas de 96 cavidades são incubadas com diluições log de homogenados de tecido purificados em meio. Dois a três dias após a inoculação, alíquotas de 0,05 ml de cada cavidade são avaliadas para crescimento viral por teste de hemaglutinação (teste HA).
[0211] Em ainda outros testes, as avaliações histopatológicas são realizadas após infecção. Os turbinados nasais e traquéia são examinados por mudanças epiteliais e inflamação subepitelial. Os pulmões são examinados para mudanças epiteliais bronquiolares e inflamação peribronquiolar em bronquíolos grandes, médios, e pequenos ou terminais. Os alvéolos são também avaliados para mudanças inflamatórias. Os bronquíolos médios são classificados em uma escala de 0 a 3 +, como a seguir: 0 (normal: forrado por células epiteliais colunares médias a altas com bordas apicais ciliadas e núcleos pseudoestratificados basais; inflamação mínima); 1+ (camada epitelial colunar e mesmo contornada com apenas uma proliferação aumentada leve; cílios ainda visíveis em muitas células ); 2+ mudanças proeminentes na camada epitelial na faixa de atenuação a proliferação marcada; células desorganizadas e contorno da camada irregular na borda luminal); 3+ (camada epitelial marcadamente rompida e desorganizada com células necróticas visíveis no lúmen; alguns bronquíolos atenuados e outros em proliferação reativa marcada).
[0212] A traquéia é classificada em uma escala de 0 a 2,5+, como a seguir: 0 (normal: forrado por células epiteliais colunares médias a altas com bordas apicais ciliadas, núcleos basais e pseudoestratificados. O citoplasma evidente entre a borda apical e núcleo. Foco pequeno ocasional com células escamosas; 1+ (metaplasia escamosa focal da camada epitelial); 2+ (metaplasia escamosa difusa desta camada
115/132 epitelial, cílios podem ser evidentes focalmente); 2,5+ metaplasia escamosa difusa com muitos poucos cílios evidentes).
[0213] A imuno-histoquímica de vírus de influenza de suínos é realizada usando um anticorpo monoclonal específico para NP. A coloração é classificada 0 a 3 + como a seguir: 0 (sem células infectadas), 0,5+ poucas células infectadas); 1 + (poucas células infectadas, como células individuais amplamente separadas); 1,5+ (poucas células infectadas, como sozinhas amplamente separadas e em agrupamentos pequenos); 2+ (números moderados de células infectadas, geralmente afetando os agrupamentos de células adjacentes em porções do bronquíolos de forro de camada epitelial, ou em focos sublobulares pequenos em alvéolos); 3+ (numerosas células infectadas, afetando a maior parte da camada epitelial em bronquíolos, ou difundida em focos sublobulares grandes em alveólos).
5.9.3. Determinação do título viral [0214] O título viral é determinado por inoculação de várias diluições de vírus de influenza de suínos em culturas de células (por exemplo culturas de porcos), embriões de pinto, ou animais vivos (por exemplo porcos). Após incubação do vírus durante um tempo específico, o vírus é isolado usando métodos padrões.
[0215] A quantificação física do título viral pode ser realizada usando PCR aplicado a sobrenadantes virais (Quinn & Trevor, 1997; Morgan et al., 1990), testes de hemaglutinação, doses infecciosas de cultura de tecido (TCID50) ou doses infecciosas de ovos (EID50).
[0216] O teste HA é realizado em placas de 96 cavidades de fundo em V. Diluições em série de duas vezes de cada amostra em PBS são incubadas durante 1 h em gelo com um volume igual de uma suspensão a 0,5% de eritrócitos de galinha em PBS. As cavidades positivas continham uma camada aderente, homogênea, de eritrócitos; as células negativas continham uma pelota não aderente.
5.9.4. Determinação de títulos de anticorpo inibidores de hemaglutinação [0217] Em um método, o teste de inibição de HA, os níveis de anticorpos inibidores (Hl)de hemaglutinação (HA) em amostras são determinados como previamente descrito (Palmer et al., 1975, Advanced laboratory techniques for
116/132 influenza diagnosis. U.S. Department of Health, Education and Welfare Immunology Series. U.S. Department of Health, Education and Welfare, Washington, D.C.). Brevemente, as amostras são incubadas durante a noite a 37 °C com 4 volumes de enzima destruidora de receptor (Denka Seiken Co., Tokyo, Japan) preparadas de Vibrío cholerae. Após inativação da enzima destruidora de receptor por incubação das amostras a 56 °C durante 60 minutos, diluições em série de duas vezes de soros são misturadas com 4 unidades HA de vírus de influenza de suínos. Os testes são desenvolvidos por adição de 0,5% (vol/vol) de glóbulos vermelhos de galinha, e os títulos de anticorpo Hl são definidos como a recíproca para a maior diluição causando uma inibição completa de aglutinação.
5.9.5. Estudos de toxicidade [0218] A toxidade e/ou eficácia das composições da presente invenção podem ser determinadas por procedimentos farmacêuticos padrões em culturas de células ou animais experimentais, por exemplo para determinação de LD50 (a dose letal para 50% da população) e o ED50 (a dose terapeuticamente eficaz em 50% da população). A relação de dose entre efeitos tóxicos e terapêuticos é o índice terapêutico e pode ser expressada como a relação LD50/ED50. As terapias que demonstram grandes índices terapêuticos são preferidas. Apesar de terapias que demonstram efeitos laterais tóxicos poderem ser usadas, cuidado deve ser tomado para projetar um sistema de distribuição que vise tais agentes no sítio alvo de tecido afetado a fim de minimizar o dano potencial a células não infectadas e, assim, reduzir os efeitos laterais.
[0219] Os dados obtidos dos testes de cultura de células e estudos com animais podem ser usados na formulação de uma faixa de dosagem das terapias para uso em indivíduos (por exemplo porcos). A dosagem destes agentes está preferivelmente na faixa de concentrações circulantes que incluem o ED50 com pouca ou nenhuma toxicidade. A dosagem por variar nesta faixa dependendo da forma de dosagem empregada e a via de administração usada. Para qualquer terapia usada no método da invenção, a dose terapeuticamente eficaz pode ser estimada inicialmente dos testes de cultura de células. Uma dose pode ser
117/132 formulada em modelos de animais para obter uma faixa de concentração no plasma circulante que inclui o IC50 (isto é, a concentração do composto de teste que obtém uma inibição meio-máxima de sintomas) como determinado em cultura de células. Esta informação pode ser usada para determinar mais precisamente as doses utilizáveis em indivíduos (por exemplo porcos). Os níveis no plasma podem ser medidas, por exemplo, por cromatografia de líquido de elevado desempenho.
[0220] Além disso, quaisquer testes bem conhecidos na técnica podem ser usados para avaliar a utilidade profilática e/ou terapêutica de uma composição, terapia de combinação aqui descrita para infecção por vírus de influenza de suínos ou uma condição ou sintomas associados com os mesmos, uma infecção diferente de uma infecção por vírus de influenza de suínos ou uma condição ou sintoma associado com a mesma, uma doença tratável por IFN ou uma condição em que um vírus atenuado de influenza de suínos da invenção é usado como um vetor para induzir uma resposta imune a um antígeno associado com a condição.
[0221] Os seguintes exemplos são dados para ainda ilustrar a presente invenção mas não devem ser considerado em qualquer modo como limitando o escopo da presente invenção.
6. EXEMPLOS
6.1. Exemplo 1 - Geração de vírus Sw/Tx98 derivado de plasmídeo codificando NS1 truncado [0222] A mutagenese dirigida ao sítio foi usada para gerar deleções diferentes no segmento NS do vírus de influenza de suínos em tal modo que o NEP foi expressado sem qualquer alteração enquanto o NS1 foi parcialmente deletado. Isto foi obtido por inserção de um códon de parada no ORF de NS1 seguido por uma dei em ORF de NS1 englobando nucleotídeos não envolvidos na expressão de NEP. [0223] Células e vírus. Células de rim de porco 15 (PK-15), testículo de suíno (ST) e de tipo II de rim canino Darby foram cultivadas em meio essencial mínimo (MEM) suplementado com 10% de soro bovino fetal (FBS). As células de rim de hamster bebê (BHK), e 293T e A549 foram cultivadas em DMEM com 10% de FBS. Todas as células foram mantidas a 37 °C e 5% de CO2. O vírus de influenza
118/132
A/Swine/Texas/4199-2/98 (TX/98, subtipo H3N2) foi obtido do repositório no St. Jude Children’s Research Hospital, Memphis, TN. Os vírus de influenza foram cultivados em cavidades alantóicas de ovos embrionados de galinha ou em células MDCK. O vírus de estomatite vesicular recombinante GFP (VSV-GFP) (Stojdl, 2003, Câncer Cell 4: 263 - 75) foi cultivado e titulado em células BHK para uso em biotestes de IFN.
[0224] Construção de plasmídeos: As células MDCK foram infectadas com vírus TX/98 e RNA total foi extraído usando reagente de Trizol de acordo com as instruções do fabricante (Invitrogen). Os oito plasmídeos de genética reversa pHWSw-PB2, pHW-Sw-PB1, pHW-Sw-PA, pHW-Sw-HA, pHW-Sw-NP, pHW-Sw-NA, pHW-Sw-M e pHW-Sw-NS (correspondendo a oito segmentos de influenza viral listados na tabela 1) foram construídos por amplificação RT-PCR de segmentos de RNA viral único e clonagem dos cDNAs resultantes no vetor pHW2000 (Hoffmann et ai., 2000, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 97: 6108 - 6113). As seqüências de insertos para pHW-Sw-PB2, pHW-Sw-PB1, pHW-Sw-PA, pHW-Sw-HA, pHW-Sw-NP, pHWSw-NA, pHW-Sw-M e pHW-Sw-NS são providas nas SEQ ID NOS: 1-8, respectivamente. Neste sistema, cDNA de influenza viral é inserido entre as seqüências de terminador e promotor de polimerase I de RNA (po11). Esta unidade de transcrição de ρο11 de RNA é flanqueada por um promotor de polimerase II de RNA e um sítio de poliadenilação. A orientação dos dois promotores permite a síntese de RNA viral sentido negativo e mRNA sentido positivo de um gabarito de cDNA viral. pHW-Sw-NS-73, pHW-Sw-NS-99 e pHW-Sw-NS-126 são derivados de pHW-Sw-NS. Estes plasmídeos mutantes de NS1 foram construídos por ligação trimolecular: Dois produtos PCR foram ligados em pHW2000-Sw-NS digerido por Sall/NgolV.
[0225] O primeiro produto PCR era comum a todos os três plasmídeos mutantes de NS1, e foi obtido usando oligo pHW-3’ (reverso, anelando na estrutura dorsal do plasmídeo pHW2000) GGGTCAAGGAAGGCACGGGGGAGGGGC (SEQ ID NO: 9) e oligo 5’NS-Pacl (dianteiro, anelando no gene NS1) GCGCTTAATTAAGAGGGAGCAATCGTTGGAG (SEQ ID NO: 10) e pHW2000-Sw119/132
NS como gabarito. Este produto PCR foi digerido com NgolV e Pacl.
[0226] O segundo produto PCR foi específico para cada plasmídeo mutante de NSI, e foi obtido usando: um iniciador dianteiro comum, CMV5’ (anelando no promotor CMV de plasmídeo pHW2000)
GCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTG (SEQ ID NO: 11), e um iniciador reverso específico (anelando no gene NS1): NS73- Bglll-Pacl-3’
GCGCTTAATTAATCAAGATCTAGGATTCCTCTTTCAAAATCC (SEQ ID NO: 12), NS99-Bglll-Pacl-3’ GCTTAATTAATCAAGATCTATG ACATTTCCTCGAGGGTCATG (SEQ ID NO: 13) ou NS126-Bglll-Pacl-3’
GCGCTTAATTAATCAAGATCTACTTTTCCATGATCGCCTGGTCC (SEQ ID NO: 14). Os três produtos PCR correspondentes foram digeridos com Sall e Pacl, e usados na ligação trimolecular junto com o primeiro produto digerido com PCR Pacl/NgolV e pHW2000-Sw-NS digerido com Sall/NgolV, para gerar: pHW-Sw-Tx73, pHW-Sw-Tx-99 e pHW-Sw-Tx-126. Estes construções contém uma deleção na seqüência NS1, mais a inserção de 4 códons de parada nas 3 armações após esta deleção. Ver figura 1A. Apesar da proteína de exportação nuclear (NEP) não ser alterada nestas construções, o ORF de NS1 codifica somente os primeiros 73, 99 e 126 aminoácidos da proteína NS1 de tipo selvagem (comprimento total de NS1 de tipo selvagem é de 219 aminoácidos), respectivamente.
[0227] As cepas virais são descritas abaixo:
[0228] Sw/TX/98 wt: contém gene NS1 de tipo selvagem e representa um vírus de influenza de suínos H3N2 reagrupante triplo.
[0229] Sw/TX/98/del126: expressa os 126 aminoácidos N-terminais da proteína
NS1 de tipo selvagem.
[0230] Sw/TX/98/de199: expressa os 99 aminoácidos N-terminais da proteína
NS1 de tipo selvagem.
[0231] Sw/TX/98/de173: expressa os 72 aminoácidos N-terminais da proteína
NS1 de tipo selvagem.
[0232] Recuperação mediada por transfeccão de SIV recombinante: O resgate de vírus de influenza de DNA plasmídeo foi realizado como descrito em Fodor et al.
120/132 (1999, J Virol 73: 9679 - 82) e Neumann et al. (1999, Proc Natl Acad Sei USA 96: 9345 - 50) usando um sistema de oito plasmídeos (Hoffmann etal., 2000, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 97: 6108 - 6113). Para gerar o vírus (rWT) TX/98 de tipo selvagem recombinante, 0,5 pg de cada um dos 8 plasmídeos pHW foram transfectados em células 106 293T em suspensão usando o reagente lipofectamina 2000 (Invitrogen). Os vírus mutantes truncados NS1 foram gerados do mesmo modo mas substituindo o plasmídeo pHW-Sw-NS pelo mutante correspondente para recuperar os mutantes de vírus de173, de199 ou del126. Os vírus resultantes foram passados e clonados por purificação de placa em células MDCK. As cargas virais foram cultivadas em ovos embrionados de galinha com 7 dias. A identidade dos vírus recombinantes SIV foi verificada por análises eletroforéticas de gel de produtos RT-PCR derivados de RNA viral usando oligonucleotídeos específicos para as regiões de não codificação comuns. O gene NS de tipo selvagem ou as versões deletadas foram ainda confirmadas por sequenciamento.
[0233] Resultados - Para gerar SIV usando genética reversa, os oito RNAs virais de vírus Tx/98 foram clonados em plasmídeos de expressão anti-sentido para resgate viral (Hoffmann et al., 2000, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 97: 6108 - 6113). Quando de transfecção destes plasmídeos em células 293T, vírus infecciosos foram recuperados. Os SIVs parental (WT) e o tipo selvagem derivado de plasmídeo (rWT) cultivados em títulos similares em células MDCK e ovos embrionados. Quando inoculado em porcos, o vírus rWT produziu lesões similares como o vírus WT parental. Três mutantes SIV truncados com NS1 foram gerados codificando proteínas de NS1 de 73, 99, e 126 aminoácidos, como comparado com as proteínas longas de 219 aminoácidos, de comprimento completo, (figura 1A). As análises de RT-PCR e sequenciamento confirmaram a presença de genes NS1 truncados nas preparações de vírus resgatados (figura 1B).
6.2 Exemplo 2 - Caracterização de mutantes de dei de NS1 de vírus de influenza de suínos e A/Swine/Texas/4199-2/98 de tipo selvagem [0234] Para caracterizar o impacto da deleção de gene NS1 nas propriedades replicativas de vírus de influenza de suínos, o crescimento de mutantes de deleção
121/132 diferentes e de tipo selvagem descritos na seção 6.1 foi comparado. Também, o efeito destes mutantes em produção de IFN foi comparado.
[0235] Curvas de crescimento de vírus. Para analisar a replicação viral, as células PK-15 confluentes foram infectadas na multiplicidade de infecção indicada (MOI) e incubadas durante períodos de tempo diferentes a 37 °C em MEM contendo 0,3% de albumina bovino (MEM/BA) e 5% de fluido alantóico. Os títulos virais foram determinados por teste de placa em células MDCK em MEM/BA suplementado com 1 pg/ml de tripsina TPCK. Títulos foram expressados como unidades formadoras de placas (PFU) por ml.
[0236] A fim de investigar as propriedades de crescimento de múltiplos ciclos dos vírus NS1 mutantes, células epiteliais confluentes de porcos (PK-15) foram infectadas em um baixo MOI (MOI = 0,001). Sobrenadantes de células infectadas foram titulados em diferentes pontos de tempo após infecção por teste de placa em células MDCK. A cinética de crescimento de mutantes de deleção NS1 em células PK-15 era claramente diferente quando comparada com o vírus de tipo selvagem. Como interessante, o vírus mutante 1-126 era o mais comprometido no crescimento, seguido por mutantes 1-99 e 1-73 (figura 2A). Os tamanhos de placas em células MDCK estão correlacionados com as diferenças no crescimento em células PK-15 (figura 2C). Estes resultados indicam as deleções na proteína NS1 de vírus Sw/TX/98 resultam em atenuação de crescimento viral, tanto em células PK-15 como em células MDCK. Em contraste, quando os vírus mutantes de NS1 foram cultivados em um MOI elevado (MOI = 2) em células PK-15, diferenças principais em cinética de crescimento não foram detectadas (figura 2B). Isto indica mais provavelmente que a replicação viral dos vírus mutantes de NS1 não é limitada durante o primeiro ciclo de replicação, sugerindo que as células infectadas secretam citocinas antivirais, como IFN, que inibem os ciclos subseqüentes de replicação. [0237] Rotulacão metabólica - As células PK-15 confluentes semeadas em discos de 22 mm foram ou infectadas de modo simulado ou infectadas com vírus rWT, 1-73, 1-99 ou 1-126 em um MOI de 2. As células foram incubadas em MEM/BA a 37 °C durante vários pontos de tempo, e subseqüentemente rotuladas durante 2
122/132 horas com 10 gCi [35S]Met-Cys em MEM faltando Met-Cys. As células foram lavadas com solução salina tamponada com fosfato resfriada com gelo (PBS), lisadas e os extratos totais de células foram separados por eletroforese de dodecil sulfato de sódio - gel poliacrilamida (SDS-PAGE). As proteínas foram visualizadas por autoradiografia.
[0238] A rotulação metabólica de células PK infectadas com vírus (MOI = 2) com [35S]-Met-Cys, não revelaram diferenças na cinética de síntese de proteína NP dentre os vírus mutantes rWt e 1-73, 1-99 e 1-126 (figura 2D). As proteínas mutantes de NS1 podem não ser detectadas por rotulação.
[0239] Bioteste para medir a produção de IFN- Os níveis de IFN secretado por células infectadas com vírus foram determinados como previamente descrito (Park et al., 2003, J. Virol. 70: 9522 - 9532; Donelan, 2003, J Virol 77: 13257 - 66), com algumas variações. As células PK-15 confluentes semeadas em discos de 22 mm foram ou tratadas de modo simulado ou infectadas com vírus rWT, deli 73, del99 ou del126 em um MOI de 2. Após infecção, as células foram incubadas com MEM/BA contendo 5% de fluido alantóico, em pontos de tempo diferentes após a infecção, os sobrenadantes foram coletados. Os vírus presentes no sobrenadante foram inativados por UV por colocação de amostras em gelo 15,2 cm abaixo de uma lâmpada UV de 8 W (Fisher) durante 15 min com agitação constante. Novas células PK-15 foram semeadas em placas de 96 cavidades no dia antes e incubadas com os sobrenadantes inativados por UV durante 24 horas. As células PK-15 préincubadas foram então infectadas com VSV-GFP (MOI = 0,1). As células expressando GFP foram visualizadas por microscopia fluorescente 16 horas após a infecção.
[0240] A fim de ver se a atenuação observada de crescimento in vitro dos vírus truncados em NS1 estava diretamente correlacionada com a capacidade destes vírus de inibir o sistema IFN-α/β, a indução de IFN em células infectadas com os vírus Sw/Tx/98 recombinantes foi investigada. Os sobrenadantes de células PK-15 infectadas foram usados para determinar os níveis de IFN-α/β secretado usando um bioteste baseado em inibição de replicação de VSV-GFP (figura 3A). Para este fim,
123/132 as células PK-15 foram infectadas (MOI = 2) com SIVs mutantes de rWT e NS1 e sobrenadantes foram coletados para determinações de IFN a cada duas horas durante 10 h. Os resultados são mostrados na figura 3B. Os sobrenadantes de células infectadas de modo simulado não causaram inibição de expressão de GFP por VSV-GFP em células PK-15. Em contraste, a replicação de VSV-GFP foi completamente abolida em células pré-tratadas com o sobrenadante de células infectadas com del126 a 10 h após a infecção. Não foi detectado IFN-α/β por este teste em sobrenadantes de células infectadas com vírus rWT. Todos os vírus truncados com NS1 induziram níveis detectáveis de IFN-α/β em 6 h após a infecção, com vírus 1-126sendo o indutor de IFN-α/β mais forte, seguido por vírus del99 e del73. As experiências similares foram realizadas usando outras linhagens de células de suínos (ST) e humanas (A549) infectadas com vírus com resultados basicamente idênticos.
[0241] Análise de IFN-β e TNF-g mRNA por RT-PCR. As células PK-15 foram infectadas em um MOI de 2, e a 24 horas pós infecção, RNA total foi extraído usando kit Absolutely RNA RT-PCR Miniprep Kit (Stratagene). RT foi realizado por uso de oligodT como iniciador. PCR foi feito usando pares específicos de iniciadores para IFN-β de suínos (5-SWIFNB+GGCCATGGCTAACAAGTGCATCC (SEQ ID NO: 15), 3-SWIFNB-CCGGTCAGTTCCGGAGGTAATC (SEQ ID NO: 16)) e TNF-a (5’SW-TNFA ATGAGCACTGAGAGCATG (SEQ ID NO: 17), 3’SW-TNFA TCACAGGGCAATGATCCC (SEQ ID NO: 18)) mRNAs (Genbank números de acesso M86762 e X57321). Como um controle, os iniciadores específicos para βactina (Donelan, 2003 J Virol 77:13257 - 66) foram usados para amplificar um grupo fragmento de 550-bp de β-actina suíno. Os produtos foram seqüenciados e confirmados como sendo derivados dos mRNAs esperados.
[0242] Análise RT-PCR de transcritos de IFN-β- e TNF-α revelou a indução de expressão de mRNA destas citocinas em células PK-15 infectadas com vírus mutantes NS1, especialmente nas células infectadas com vírus 1-126 (figura 3C). Estes dados indicam que a potência de inibição de produção IFN pelos vírus Sw/Tx/98 recombinantes é como a seguir: rWT>del73>del99>del126.
124/132
6.3 Exemplo 3 - Patoqênese de vírus mutante/delecão TX/98 derivados de plasmídeos [0243] A patogênese de vírus de influenza de suínos específicos descritos em seção 6.1 foi avaliada em porcos. A capacidade de Sw/Tx/98/del126, Sw/Tx/98/del99, e Sw/Tx/98/del73 de induzir lesões no pulmão e causar infecções em suínos foi determinada e comparada com os resultados obtidos para um vírus simulado e o vírus de tipo selvagem Sw/Tx/98 wt. As lesões no pulmão foram avaliadas como a porcentagem de pulmão saudável em que as lesões ocorreram com uma média de sete lóbulos do pulmão sendo usados para esta determinação. Os vírus ou o vírus simulado foram administrados como descrito em detalhes abaixo e ou esfregaços nasais ou BALF foram obtidos durante a necropsia para determinar a carga viral cinco dias após a infecção. A avaliação histopatológica foi realizada. Os turbinados nasais e traquéia são examinados por mudanças epiteliais e inflamação subepitelial. O alvéolos também foram avaliados para mudanças inflamatórias.
[0244] Este exemplo demonstra as deleções C-terminais do gene NS1 resultam em um fenótipo atenuado.
6.3.1 Métodos [0245] Infecção de porcos. Os porcos isentos de patógenos específicos exogâmicos foram obtidos de uma fazenda comercial em lowa (USA). Os soros destes porcos foram confirmados como sendo negativos pela presença de anticorpos de inibição de hemaglutinação (Palmer, 1975, (U.S. Department of Health, Education, and Welfare, Washington, D.C.), pp. 51 - 52) contra H3N2 (Sw/TX/98 e Sw/CO/99) e H1N1 (Sw/IA/30) SIV. Grupos de quatro a cinco porcos foram alojados em salas de isolamento separadas. Na idade de 4 semanas, os porcos foram anestesiados por injeção intramuscular com uma mistura de cetamina, xilazina, zolazepam e tiletamina (Mengeling, 1996, Am J Vet Res 57: 834 - 839) antes de serem inoculados intratraquealmente (via laringoscópio e tubo traqueal) com 1 ml de solução de vírus contendo 1x105 PFU. Durante 5 dias, porcos foram monitorados para sinais clínicos, incluindo letargia, anorexia, tosse, hiperpnéia/ dispnéia, descarga nasal e ocular e sua temperatura corporal foi registrada
125/132 diariamente. No dia 5, os animais foram submetidos a eutanásia por administração intravenosa de pentobarbital (Fort Dodge Animal Health, Fort Dodge, USA), e seus pulmões foram removidos in toto. A porcentagem da superfície de cada lóbulo pulmonar que foi afetada por lesões macroscópicas foi estimada visualmente. As porcentagens foram tiradas em média para obter um valor médio para os 7 lóbulos pulmonares de cada animal. Os turbinados nasais, traquéia, e lóbulo cardíaco direito foram removidos e fixados com formalina para outra avaliação histopatológica. Sangue, fluido broncoalveolar (BALF) e esfregaços nasais também foram coletados durante a necropsia. BALF foi obtido após os pulmões serem removidos da cavidade torácica por enxágüe dos pulmões (via traquéia) com cerca de 30 ml de meio de McCoy sem soro. Todas as experiências com animais foram de acordo com o Comitê de Uso e Cuidado Animal Institucional do National Animal Disease Center. [0246] Observações clínicas e amostragem: Durante 5 dias, os porcos foram monitorados para sinais clínicos incluindo letargia, anorexia, tosse, hiperpnéia/ dispnéia, descarga nasal e ocular e sua temperatura corporal foi registrada diariamente. Sangue, BALF e esfregaços nasais também foram coletados durante a necropsia. BALF foi obtido após os pulmões serem removidos da cavidade torácica por enxágüe dos pulmões (via traquéia) com cerca de 30 ml de meio de McCoy sem soro. Os esfregaços nasais e BALF foram testados para determinar a carga viral. [0247] Titulações de vírus de esfregaços nasais e BALF. Os esfregaços nasais e BALF foram testados para determinar a carga viral. Diluições em série de dez vezes foram preparadas em meio de McCoy sem soro, suplementado com 5 pg/ml de tripsina. As células MDCK foram inoculadas com as diluições e incubadas com meio mais tripsina em placas de microtitulação a 37 °C durante 72 horas. As placas foram examinadas para efeitos citopáticos após 72 horas. Os títulos virais foram calculados pelo método de Reed e Muench (Reed, 1938, Am J Hyg 27: 493 - 497).
[0248] Avaliação histopatológica - Os turbinados nasais e traquéia foram coloridos com hematoxilina e eosina e examinados sob o microscópio para mudanças epiteliais e inflamação subepitelial. Os pulmões foram examinados para mudanças epiteliais bronquiolares e inflamação peribronquiolar em bronquíolos
126/132 grandes, médios, e pequenos ou terminais. Os alvéolos também foram avaliados para mudanças inflamatórias. Porque as lesões foram encontradas mais consistentemente em vias áreas de tamanho médio, os dados obtidos dos bronquíolos médios foram usados para comparações. Os bronquíolos médios são classificados em uma escala de 0 a 3 +, como a seguir: 0 (normal: forrado por células epiteliais colunares médias a altas com bordas apicais ciliadas e núcleos pseudoestratificados basais; inflamação mínima); 1+ (camada epitelial colunar e mesmo contornada com apenas uma proliferação aumentada leve; cílios ainda visíveis em muitas células ); 2+ mudanças proeminentes na camada epitelial na faixa de atenuação a proliferação marcada; células desorganizadas e contorno da camada irregular na borda luminal); 3+ (camada epitelial marcadamente rompida e desorganizada com células necróticas visíveis no lúmen; alguns bronquíolos atenuados e outros em proliferação reativa marcada).
[0249] A traquéia foi classificada em uma escala de 0 a 2,5+, como a seguir: 0 (normal: forrado por células epiteliais colunares médias a altas com bordas apicais ciliadas, núcleos basais e pseudoestratificados. O citoplasma evidente entre a borda apical e núcleo. Foco pequeno ocasional com células escamosas; 1+ (metaplasia escamosa focal da camada epitelial); 2+ (metaplasia escamosa difusa da maior parte da camada epitelial, cílios podem ser evidentes focalmente); 2,5+ metaplasia escamosa difusa com muitos poucos cílios evidentes).
[0250] A imuno-histoquímica de SIV foi realizada usando anticorpo monoclonal específico para NP de camundongo HB65 (American Type Culture Collecion, Manassas, Virgínia). O anticorpo foi produzido como fluido ascitos de camundongo. Uma diluição de 1/1000 de HB65 foi usada para imuno-histoquímica. O teste foi realizada usando um sistema Dako Envision IHC. A coloração foi classificada de 0 a 3+ como a seguir: 0 (sem células infectadas), 0,5+ poucas células infectadas); 1 + (poucas células infectadas, como células individuais amplamente separadas); 1,5+ (poucas células infectadas, como sozinhas amplamente separadas e em agrupamentos pequenos); 2+ (números moderados de células infectadas, geralmente afetando os agrupamentos de células adjacentes em porções do
127/132 bronquíolos de forro de camada epitelial, ou em focos sublobulares pequenos em alvéolos); 3+ (numerosas células infectadas, afetando a maior parte da camada epitelial em bronquíolos, ou difundida em focos sublobulares grandes em alveólos). [0251] Análise estatística - As temperaturas de corpo médias, extensão de mudanças grosseiras e histopatológicas, e replicação viral em grupos infectados e de controle foram comparadas por uso do teste t de Student de dois lados. Valores de probabilidade (P) < 0,05 foram considerados para indicar uma diferença estatisticamente significante entre os grupos.
6.3.2 Resultados [0252] Quarenta e sete porcos exogâmicos de 4 semanas de idade foram adquiridos de uma fazenda comercial em lowa (USA). Os grupos de 10 porcos foram infectados intratraquealmente com 105 pfu de vírus Sw/TX/98 mutantes NS1 e rWT. Sete animais foram infectados de modo simulado com meio apenas. A temperatura retal média de cada grupo infectado aumentou a >40 °C de 1 a 3 dias p.i. no rWT, 173 e 1-99 nos grupos de coortes infectados com vírus. Nem todos os animais infectados com mutante de deleção de NS1 1-126 demonstraram uma temperatura aumentada. Os sinais clínicos, que compreendiam falta de ar, secreção nasal, conjuntivite, e tosse, começam nos dias 2 a 4 p.i. no grupo infectado com vírus rWT. A prevalência de sinais clínicos diferiu entre os vírus respectivos. A maior parte dos sinais clínicos foi consistentemente observada nos grupos infectados com o vírus rWT enquanto alguns sinais foram observados nos coortes infectados com vírus 1 99 e 1 -73. Somente temperatura elevadas, mas não foram observados outros sinais clínicos nos porcos infectados com vírus 1-126.
[0253] Durante a necropsia no dia 5 p.i., a porcentagem de cada superfície de pulmão com lesões macroscópicas foi estimada. Como mostrado na figura 4A, animais de controle infectados de modo simulado não tinham lesões macroscópicas no pulmão. Os porcos infectados com o vírus rWT Sw/Tx/98 mostraram uma porcentagem significativamente maior de lesões macroscópicas no pulmão do que os porcos infectados com os vírus mutantes de deleção NS1 1 -99 (p = 0,006) ou 1-126 (p = 0,004). Porcos infectados com o vírus mutante de
128/132 deleção NS1 1-73 mostraram lesões menos severas, no entanto, isto não foi estatisticamente significativo (p > 0,05). Em geral, as lesões grosseiras que os requerentes observaram foram áreas consolidadas, marcadas, de cor de ameixa, em lóbulos individuais. Os lóbulos diafragmáticos estavam menos envolvidos do que os outros lóbulos. Os linfonodos mediastinais eram geralmente hiperêmicos e aumentados.
[0254] Os bronquíolos médios foram examinados microscopicamente em seções de tecido no lóbulo pulmonar cardíaco direito de porcos infectados com 4 semanas de idade e classificados histopatologicamente (figura 4B). Os animais infectados de modo simulado assim como porcos infectados com vírus 1-126 não mostraram ou mostraram apenas lesões mínimas, enquanto as lesões moderadas a severas foram detectadas em animais infectados com os vírus rWT e os vírus 1-99 e 1-73 Sw/TX/98 (figs. 5A-D e 6A-D). Todos os animais infectados com um tipo selvagem parental e alguns infectados com os vírus 1-73 ou 1-99 tinham escores elevados refletindo ruptura da camada de célula epitelial bronquial (caracterizado por necrose epitelial aguda ou subseqüente atenuação ou proliferação reativa). A maior parte dos animais infectados com vírus 1-73 ou 1-99 tinham um escore moderado refletindo uma proliferação levemente aumentada da camada epitelial bronquial. Os pulmões dos animais infectados com os vírus 1-126 mutantes de deleção NS1 estavam quase isentos de lesões. Como nas lesões de pulmão macroscópicas, os porcos infectados com 1-126 e 1-99 mostraram um dano significativamente menor do que os porcos infectados com rWT (1-126: p<0,0001; 1-99: p = 0,0002). De modo interessante, as lesões microscópicas em bronquíolos de porcos infectados com os vírus mutantes 1 -73 também foram significativamente menores quando comparadas com o vírus rWT parental (p = 0,02).
[0255] Os títulos de vírus em BALF foram também analisadas no dia 5 p.i. Como mostrado na figura 4C, todos os vírus replicaram no trato respiratório de porcos. Os títulos de vírus BALF foram significativamente maiores em animais infectados com vírus rWT parental quando comparados com os mutantes de deleção NS1. Esta verificação está correlacionada uma doença microscópica e grosseira menos
129/132 extensiva de modo significante observada em porcos infectados com mutantes de deleção NS1 versus vírus Sw/Tx/98 de tipo selvagem.
6.4 Exemplo 4: Uso de ΤΧ/98/del 126 como uma vacina [0256] A eficácia do mutante de deleção ΤΧ/98/del 126 atenuado foi testada em um estudo de vacinação de porcos. As experiências foram realizadas como descrito no exemplo 3, exceto que a vacinação com ΤΧ/98/del 126 foi realizada duas vezes nos dias 0 e dia 21 com 1x105 PFU por porco por inoculação intratraqueal. A vacinação e o desafio foram feitos por inoculação intratraqueal (usando 1 ml de solução de vírus/ ou meio como um controle). Os animais foram desafiados 9 dias ou 10 dias depois com as seguintes preparações:
• 2x105 PFU por porco com vírus H3N2 de tipo selvagem (A/Swine/Texas/4199-2/98- desafio homólogo) • 2x105 PFU por porco com vírus H1N1 de tipo selvagem (A/Swine/MN/37866/99 H1N1 clássico - desafio heterólogo) • desafio simulado com 1 ml meio [0257] Para avaliação histopatológica, o lóbulo cardíaco direito de cada pulmão foi colorido com hematoxilina e eosina e examinado para mudanças epiteliais bronquiolares e inflamação peribronquiolar em bronquíolos grande, médio, e pequeno ou terminal. Porque as lesões foram verificadas de modo mais consistente em vias áreas de tamanho médio, os dados obtidos de bronquíolos médios foram usados para comparações. A severidade da lesão foi classificada pela distribuição ou extensão de lesões dentro das seções examinadas como a seguir: 0 - não foram afetadas as vias aéreas. 1- somente algumas vias aéreas afetadas, 3 agrupamento localizado de vias aéreas afetadas, com freqüência dentro de um ou dois lóbulos, 3 - número baixo de vias aéreas afetadas mas na maior parte da seção. 4 - muitas vias aéreas afetadas, com freqüência severamente, de todos os tamanhos.
[0258] Um examinador treinado foi usado para avaliação das seções de tecido. O examinador não sabia de qual grupo de animais os tecidos eram derivados.
[0259] A imuno-histoquímica foi feita usando um anticorpo monoclonal específico
130/132 para nucleoproteína de influenza. O escore de antígeno foi como a seguir:
= sem células positivas para antígeno = somente algumas células com coloração positiva em uma via aérea ocasional
- somente algumas células com coloração positiva em vias aéreas dispersas que podem ser localizadas.
= números moderados de células com coloração positiva em uma via aérea ocasional = números moderados de células com coloração positiva em vias aéreas dispersas e alveólos.
[0260] A lavagem do pulmão foi testada para determinar a carga viral. As diluições em série de dez vezes foram preparadas em meio de McCoy sem soro, suplementada com 5 pg/ ml de tripsina. As células MDCK foram inoculadas com as diluições e incubadas com meio mais tripsina em placas de microtitulação a 37 °C durante 72 h. As placas foram examinadas para efeitos citopáticos após 72 h. Os títulos virais foram calculados pelo método de Reed e Muench.
[0261] Resultados - Os seguintes resultados foram obtidos 5 dias após o desafio.
[0262] Porcos não vacinados, não desafiados, que não tem quaisquer mudanças histopatológicas e não coletam antígeno de vírus de influenza em seus tecidos de pulmão (figuras 7 e 8). Vírus infeccioso não estava presente ou abaixo dos limites de detecção (figura 9).
[0263] Porcos não vacinados, desafiados com vírus H3N2 TX/98 de tipo selvagem, mostraram dano histopatológico significante e antígeno de vírus de influenza em seus tecidos de pulmão (figuras 7 e 8). Os títulos virais em lavagem de pulmão foram de > 106'25 TCID50/ml.
[0264] Porcos não vacinados, desafiados com vírus H1N1 MN/99 de tipo selvagem, mostraram dano histopatológico significante e antígeno de vírus de influenza em seus tecidos de pulmão (figuras 7 e 8). Os títulos virais em lavagem de pulmão foram de > 106,° TCID50/ml.
[0265] Porcos vacinados desafiados de modo simulado que não tem quaisquer
131/132 mudanças histopatológicas e não abrigam o antígeno de vírus de influenza em seus tecidos do pulmão (figuras 7 e 8). Os vírus infecciosos não estavam presentes ou estavam abaixo dos limites de detecção (figura 9).
[0266] Porcos vacinados desafiados com H3N2 que não tem quaisquer mudanças histopatológicos e não abrigam o antígeno de vírus de influenza em seus tecidos do pulmão (figuras 7 e 8). Os vírus infecciosos não estavam presentes ou estavam abaixo dos limites de detecção (figura 9).
[0267] Porcos vacinados desafiados com H1N1 que tem mudanças histopatológicos significativamente menores em seus tecidos do pulmão em comparação com poros não vacinados, desafiados com H1N1 (p < 0,001). Estes porcos não abrigam o antígeno de vírus de influenza em seus tecidos de pulmão (figuras 7 e 8). Nota-se a presença significativamente menor de vírus infecciosos (p<0,001) em lavagem de pulmão quando comparados com animais não vacinados desafiados com H1N1 (figura 9).
[0268] Em resumo, a vacinação de porcos com o mutante ΤΧ/98/del 126 resultou em uma imunidade protetora contra desafio com o isolado de vírus homólogo (desafio com vírus H3N2 A/Swine/Texas/4199-2/98). Quando os porcos vacinados foram desafiados com um vírus pertencendo a um sub-tipo de influenza diferente (desafio de vírus H1N1 A/Swine/MN/ 37866/99), este desafio de vírus heterólogo resultou em um número significante menor de lesões em tecidos de pulmão e carga viral em lavagem de pulmão em comparação com os controles não vacinados em dia 5 após a inoculação.
[0269] Estes dados indicam que o mutante ΤΧ/98/del 126 atenuado tem utilidade como uma vacina de vírus vivo modificado mostrando imunidade protetora contra desafio homólogo/ homotípico e uma considerável proteção contra desafio heterólogo/ heterotípico.
Equivalentes [0270] A presente invenção não deve ser limitada no escopo pelas formas de realização específicas descritas que se destinam como ilustrações únicas de aspectos individuais da invenção, e métodos funcionalmente equivalentes e
132/132 componentes dentro do escopo da invenção. De fato, várias modificações da invenção, além das mostradas aqui serão evidentes para os versados na técnica da seguinte descrição e desenhos anexos. Estas modificações se destinam a estar no escopo das reivindicações anexas.
[0271] Várias referências são citadas aqui, cuja descrição é incorporada por referência em sua totalidade.
1/3

Claims (20)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Vírus atenuado de influenza de suínos geneticamente engenheirado A/Swine/Texas/4199-2/98 tendo um fenótipo antagonista de interferon alterado caracterizado pelo fato de que o vírus compreende um gene NS1 do vírus de influenza de suínos A/Swine/Texas/4199-2/98 com uma mutação resultando em uma proteína NS1 de SEQ ID NO: 20, em que o gene NS1 confere um fenótipo antagonista de interferon alterado.
  2. 2. Formulação imunogênica caracterizada pelo fato de compreender o vírus atenuado de influenza de suínos geneticamente engenheirado conforme a reivindicação 1 e um excipiente fisiologicamente aceitável.
  3. 3. Formulação imunogênica, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que a concentração de vírus atenuado de influenza de suínos geneticamente engenheirado é de 104 a 107 pfu/ml.
  4. 4. Formulação farmacêutica caracterizada pelo fato de compreender o vírus atenuado de influenza de suínos geneticamente engenheirado conforme a reivindicação 1 e um veículo farmaceuticamente aceitável.
  5. 5. Formulação farmacêutica, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que a concentração de vírus atenuado de influenza de suínos geneticamente engenheirado é de 104 a 1012 pfu/ml.
  6. 6. Uso da formulação imunogênica conforme qualquer uma das reivindicações 2 ou 3 caracterizado pelo fato de ser na preparação de um medicamento para uso na imunização ou induzimento de resposta imune em um porco.
  7. 7. Uso do vírus atenuado de influenza de suínos geneticamente engenheirado conforme a reivindicação 1 caracterizado pelo fato de ser na preparação de um medicamento para uso na imunização ou induzimento de
    Petição 870160027774, de 13/06/2016, pág. 24/67
    2/3 resposta imune em um porco.
  8. 8. Uso, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a concentração de vírus atenuado de influenza de suínos geneticamente engenheirado na formulação imunogênica é de 104 a 107 pfu/ml.
  9. 9. Uso da formulação farmacêutica conforme qualquer uma das reivindicações 4 ou 5 caracterizado pelo fato de ser na preparação de um medicamento para uso na prevenção de uma condição ou um sintoma associado com infecção de vírus de influenza de suínos em um porco.
  10. 10. Uso da formulação farmacêutica conforme qualquer uma das reivindicações 4 ou 5 caracterizado pelo fato de ser para uso no tratamento de uma infecção de vírus de influenza de suínos em um porco.
  11. 11. Uso do vírus atenuado de influenza de suínos geneticamente engenheirado conforme a reivindicação 1 caracterizado pelo fato de ser na preparação de um medicamento para uso na prevenção de uma condição ou um sintoma associado com infecção de vírus de influenza de suínos em um porco.
  12. 12. Uso do vírus atenuado de influenza de suínos geneticamente engenheirado conforme a reivindicação 1 caracterizado pelo fato de ser na preparação de um medicamento para uso no tratamento de uma infecção de vírus de influenza de suínos em um porco.
  13. 13. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 ou 12, caracterizado pelo fato de que a concentração de vírus atenuado de influenza de suínos geneticamente engenheirado é de 104 a 1012 pfu/ml.
  14. 14. Método para produzir uma vacina, uma formulação imunogênica ou uma formulação farmacêutica caracterizado pelo fato de compreender:
    (a) propagar em um substrato o vírus atenuado de influenza de
    Petição 870160027774, de 13/06/2016, pág. 25/67
    3/3 suínos geneticamente engenheirado, tal como definido na reivindicação 1; e (b) coletar o vírus da progenia, em que o substrato é uma célula, bnhagem de células ou ovo embrionado.
  15. 15. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o substrato é uma célula de porco ou bnhagem de células de porco.
  16. 16. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o substrato é um ovo embrionado.
  17. 17. Método, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o ovo embrionado é um ovo de gabnha embrionado.
  18. 18. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 14, 16 ou 17, caracterizado pelo fato de que o ovo embrionado tem 6, 7 ou 8 dias de idade.
  19. 19. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 14, 15, 16, 17 ou 18, caracterizado pelo fato de que o substrato é deficiente em interferon.
  20. 20. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 ou 15, caracterizado pelo fato de que a bnhagem de células de porco é células PK(D1), células PK(15), células PK13, células SJPL, células NSK, células LLC-PK1, células LLC-PK1A, células ESK-4, células ST, células PTK75 ou células PK-2a/CL 13.
    Petição 870160027774, de 13/06/2016, pág. 26/67
    1/9
    FIGURA 1
    2/9
    Curva de crescimento em células PK-15 (mot 0,001 baixo) C3 Curva de crescimento em células PK-15 (moi 2 elevado)
    FIGURA 2
    3/9
    PK-15
    IFN
    Estado antlviral
    PK-15
    Oh PI
    2h PI
    4 h PI
    6hPI
    8 h PI
    10 h PI
    TNF-a
    IFN-β β-actlna
    FIGURA 3
    4/9
    Título Viral (log 10) Escore Bronquíolos Médios % Lesões do Pulmão
    Simulado rWT 1-126
    1-99 1-73
    FIGURA 4
    5/9
    6/9
    FIGURA 6
    7/9
    CO
    CM
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    FIGURA 8
    8/9
    CO
    CM
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    9/9
    FIGURA 9
    MLV = TX/98/del 126 Simulado H3N2 cH1N1
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