CN102727880A - 遗传工程猪流感病毒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明一般性地涉及拮抗细胞干扰素(IFN)反应的能力受损的减毒猪流感病毒，以及这种减毒病毒在疫苗和药物制剂中的用途。本发明特别涉及猪NS1基因被修饰以减弱或消除NS1基因产物对细胞IFN反应的拮抗能力的减毒猪流感病毒。这些病毒在体内复制，但表现出降低的复制、毒力，和增强的减毒性，因此适合用于活病毒疫苗和药物制剂中。

Description

遗传工程猪流感病毒及其应用

本申请是申请日为2005年6月1日的中国申请号200580026048.9的分案申请。本发明要求于2004年6月1日提交的美国临时申请第60/576,418号的权益，本发明将其引入作为参考。

1.发明领域

本发明一般性地涉及拮抗细胞干扰素(IFN)反应的能力受损的减毒猪流感病毒，以及这种减毒病毒在疫苗和药物制剂中的用途。本发明特别涉及猪NS1基因被修饰以减弱或消除NS1基因产物对细胞IFN反应的拮抗能力的减毒猪流感病毒。这些病毒在体内复制，但表现出降低的毒力和增强的减毒性，因此适合用于活病毒疫苗和药物制剂。

2.背景技术

2.1流感病毒

含包被的反义基因组单链RNA的病毒家族可分为具有非分段基因组的组群(副粘病毒科、棒状病毒科、纤状病毒科(Filoviridae)和博尔纳病病毒(BornaDisease病毒))，或者具有分段基因组的其它组群(正粘病毒科、布尼亚病毒科(Bunyaviridae)和沙粒样病毒科(Arenaviridae))。以下详述并用在本发明实施例之中的正粘病毒科家族包括流感病毒A型、B型和C型，以及索戈托(Thogoto)病毒、多理病毒(Dhori)病毒和传染性鲑鱼贫血病毒。

流感病毒体由内部的含单链RNA基因组的核糖核蛋白核心(螺旋形核壳体)和外部的被基质蛋白(M1)内联的脂蛋白包膜组成。流感病毒A型的分段基因组由8种(C型流感为7种)线形、负极性、单链RNA分子组成，单链RNA编码7种多肽，包括：RNA依赖性RNA聚合酶蛋白(PB2、PB1和PA)和形成核壳体的核蛋白(NP)；基质膜蛋白(M1、M2)；从含脂质的包膜伸出的两种表面糖蛋白：血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)；非结构蛋白(NS1)、核输出蛋白(NEP)；以及促凋亡因子PB1-F2。基因组的转录和复制在核内进行，通过在质膜上出芽装配。在混合感染中这些病毒可以发生基因重排。

流感病毒通过HA吸附在细胞膜糖蛋白和糖脂的唾(液)酸寡糖上。病毒体内吞后，在细胞内涵体中发生HA分子的构象变化，该内涵体促进膜的融合，由此引发脱壳。核壳体移至核，在核中病毒mRNA被转录。病毒mRNA通过独特的机制来转录，其中病毒核酸内切酶从细胞异源mRNA中剪切5′帽状末端，该帽状末端随后作为引物通过病毒转录酶转录病毒RNA模板。转录产物在距离其模板末端15-22碱基处终止，在那里寡(U)序列作为添加多poly(A)结构的信号。在这样产生的8种病毒RNA分子中，6种为单顺反子信使，它们被直接翻译成代表HA、NA、NP和病毒聚合酶蛋白、PB2、PB1和PA的蛋白质。其它的两种转录子进行剪接，每种产生两种mRNA，这些mRNA在不同的阅读框内被翻译产生M1、M2、NS1和NEP。通过使用可供选择地ATG，该PB1片段编码第二种蛋白质：非结构性PB1-F2蛋白。换言之，所述8种病毒RNA片段编码11种蛋白：9种结构性蛋白和两种非结构性蛋白。流感病毒基因和其蛋白产物的总结如下表I所示。

表I：流感病毒基因组RNA片段及其编码分配^a

^a改写自R.A.Lamb and P.W.Choppin(1983)，Annual Review of Biochemistry，Volume 52，467-506.

^b对于A/PR/8/34株

^c由生物化学和遗传方法确定

^d由核酸序列分析和蛋白测序确定

流感病毒的病原性由多重病毒和宿主因素来调节。在对抗病毒感染的宿主因素中，I型干扰素(IFNα/β)系统是有力的抗病毒先天防御机制的代表，其在真核有机体的进化中相对较早地建立(Garcia-Sastre，2002，Microbes Infect 4：647-55)。该抗病毒IFNα/β系统涉及三个主要步骤：(i)检测病毒感染和分泌IFNα/β，(ii)IFNα/β与其受体结合并诱导转录IFNα/β刺激性基因，及(iii)合成抗病毒酶和蛋白。然而，大多数病毒已经获得编码IFNα/β拮抗分子的特异性遗传信息，其有效地阻断IFNα/β抗病毒系统的一个或多个步骤。A型流感病毒在感染的细胞中表达非结构性蛋白：NS1蛋白(如下文详述)，该蛋白对抗细胞的IFNα/β反应(Garcia-Sastre等，1998，Virology 252：324-30)。

A型流感病毒基因组含有8种负极性单链RNA片段，编码两种非结构性蛋白质和9种结构性蛋白质。非结构性蛋白NS1富含在被流感病毒感染的细胞中，但在病毒体中没有检测到。NS1是在感染早期出现在核中在病毒周期晚期出现在胞浆中的磷酸蛋白(King等，1975，Virology 64：378)。对携带损伤的NS基因的温度敏感性(ts)流感病毒突变株的研究表明，NS1蛋白为转录和转录后调节因子机制，通过该机制病毒可抑制宿主细胞的基因表达和刺激病毒蛋白合成。如同许多其它调节转录后过程的蛋白，NS1蛋白与特定的RNA序列和结构相互作用。已报道，NS1蛋白结合不同种类的RNA，包括vRNA、poly-A、U6snRNA、病毒mRNA的5′未翻译区域和ds RNA(Qiu等，1995，RNA 1：304；Qiu等，1994，J.Virol.68：2425；Hatada Fukuda 1992，J Gen Virol.73：3325-9)。在转染细胞中从cDNA表达NS1蛋白与几种作用相关：抑制mRNA的核-胞浆转运、抑制前mRNA剪接、抑制宿主mRNA聚腺苷酸化、和刺激病毒mRNA的翻译(Fortes，等，1994，EMBO J.13：704；Enami等，1994，J.Virol.68：1432；de Ia Luna等，1995，J.Virol.69：2427；Lu等，1994，Genes Dev.8：1817；Park等，1995，J.Biol Chem.270，28433；Nemeroff等，1998，Mol.Cell.1：1991；Chen等，1994，EMBO J.18：2273-83)。特别是，NS1蛋白具有三个结构域，已报道这些结构域在流感病毒感染中具有一些调节功能。氨基末端的73个氨基酸负责与RNA结合(Qian等，1995，RNA 1：948-956)，特别是与双链RNA结合，赋予病毒逃逸干扰素α/β反应的能力(Donelan等，2003，J.Virol.77：13257-66)。该蛋白的中央部分与真核细胞的翻译起始因子4GI互相作用，促进病毒mRNA相对于宿主mRNA优先翻译(

等，2000，Mol.CellBiol.20：6259-6268)。已经证明羧基末端或效应子结构域抑制宿主mRNA的加工，具体地抑制宿主mRNA聚腺苷酸化(Nemeroff等，1998，Mol.Cell 1：991-1000)、与mRNA的poly(A)尾结合抑制核输出(Qiu and Krug，1994，J.Virol.68：2425-2432)和抑制前mRNA的剪接(Lu等，1994，Genes Dev.8：1817-1828)。

对缺乏NS1基因的人重组流感病毒(delNS1)的研究表明该病毒只能在例如STAT1-/-小鼠或Vero细胞的IFN缺陷系统中复制；因此NS1蛋白负责拮抗IFN活性(Garcia-Sastre等，1998，Virology 252：324-330)。还表明，NS1蛋白敲除的人流感病毒对小鼠是减毒的(Egorov等，1998，J.Virol.72：6437-6441)，并且该病毒提供对抗野生型病毒的保护(Talon等，2000，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97：4309-4314)。

2.2猪流感病毒

猪流感(SI)是由A型流感病毒引起的猪急性呼吸疾病。其严重性依赖多种因素，包括宿主年龄、病毒株和二次感染(Easterday，1980，Philos Trans R Soc Lond BBiol Sci 288：433-7)。A型流感病毒是分段负链RNA病毒，并可以从许多其它种类宿主中分离，包括鸟、人、马、鲸鱼和貂。尽管完整的流感病毒很少能跨越种属障碍，但基因片段可以通过基因重组或基因漂移过程来跨越此障碍。由于猪支持人和鸟的A型流感病毒复制(Kida等，1994，JGen Virol 75：2183-8)，因而推定猪作为“混合容器”使得对不同宿主特异的病毒种类之间发生重组从而在种间传播中发挥重要作用(Scholtissek，1994，Eur J Epidemiol 10：455-8)。这可以导致产生能够跨越种属障碍传染人类的新流感病毒。目前有三种SI病毒(SIV)亚型在美国的猪中循环：H1N1、H3N2和H1N2(Olsen，2002，Virus Res 85：199-210；Karasin等，2002，J Clin Microbiol40：1073-9；Karasin等，2000，Virus Res 68：71-85；Olsen等，2000，Arch Virol 145：1399-419；Webby等，2000，J Virol 74：8243-51；Webby等，2001，Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci 356：1817-28；Zhou，2000，Vet Microbiol 74：47-58)。1998年之前，主要的“传统”H1N1SIV分离自美国的猪(Kida等，1994，J GenVirol 75：2183-8；Scholtissek，1994，Eur J Epidemiol 10：455-8；Olsen等，2000，ArchVirol.145：1399-419)。在1998年，SIV的H3N2亚型在美国的多个州被分离。这些病毒由人、鸟和传统的猪病毒之间重组产生，它们进化迅速并引起比传统H1N1SIV更严重的疾病。

流感病毒的病原性由多重病毒和宿主因素来调节。在对抗病毒感染的宿主因素中，I型干扰素(IFNα/β)系统是有力的抗病毒先天防御机制的代表，其在真核有机体的进化中相对较早地建立(Garcia-Sastre，2002，Microbes Infect 4：647-55)。抗病毒IFNα/β系统涉及三个主要步骤：(i)检测病毒感染的和分泌IFNα/β，(ii)IFNα/β与其受体的结合并诱导转录IFNα/β刺激性基因，及(iii)合成抗病毒酶和蛋白。然而，大多数病毒已经获得编码IFNα/β拮抗分子的特异性遗传信息，其有效地阻断IFNα/β抗病毒系统的一个或多个步骤。A型流感病毒在感染的细胞中表达非结构性蛋白：NS1蛋白，该蛋白对抗细胞的IFNα/β反应(Garcia-Sastre等，1998，Virology 252：324-30)。

1918年首次报道猪的流感感染并在1930年首次从猪中分离猪流感病毒(Shope，R.E.，1931，J Exp.Med.54：373-385)。这些首次分离物是猪A型流感病毒H1N1系的祖先。从1930年至二十世纪九十年代，北美猪的流感几乎无例外地由H1N1猪病毒的感染引起。猪流感模式的显著变化发生在1997年左右，当时检测到未预料到的和实质性增加的H3血清阳性(8％)，并在美国和加拿大从猪中开始分离到了H3N2病毒(Olsen等，2000，Arch.Virol.134：1399-1419)。此外，在H3N2病毒和H1N1猪病毒之间的重组导致第二代H1N2重组病毒的检出(Karasin等，2000，J Clin.Microbiol.38：2453-2456；Karasin等，2002，J.Clin Microbiol.40：1073-1079)。此外，从加拿大的猪中分离到了鸭来源的鸟H4N6病毒(Karasin等，2000，J.Virol.74：9322-9327)。除了所述H1N1猪流感病毒的抗原漂移变体，这些新病毒的产生可引起潜在的兽医和人类公共健康问题。

在1998年，猪对其几乎没有免疫性的新猪流感病毒株使得实验中的2400头动物致病。尽管自从1930年仅有一种流感亚型使北美的猪致病，但最近几年里，新流感病毒的快速演变感染了北美的1亿头猪。稳定数年后，北美的猪流感病毒进入进化的快速轨道，每年都产生变体。这不仅对畜牧业产生不好的影响和引起负面经济效应，而且专家们担心这种进化中的猪流感病毒增加了产生在人中传播的新病毒的可能性。幸运的是，这些在北美出现的新猪病毒株至今显示不容易感染人。

2.3减毒病毒

通过“杀灭”病毒病原性来制备失活的病毒疫苗，例如通过加热和福尔马林处理，从而使其不能复制。因失活的疫苗不能提供长期持久的免疫，其使用受到限制，因此仅提供有限的保护。制备病毒疫苗的另外可选择性途径涉及使用减毒的活病毒疫苗。减毒病毒能够复制但没有致病性，因而提供更长而持久的免疫并产生较强的保护。然而，制备减毒病毒的传统方法涉及宿主范围内突变株的机会性分离，这些突变株多数是温度敏感的；例如，通过非天然宿主对病毒进行传代，并且选择有免疫原性而不致病的子代病毒。

用于分离和培养以用作疫苗免疫为目的的流感病毒的常规培养基是鸡胚蛋。流感病毒通常于37℃在10-12天龄的胚中生长2-4天。尽管大多数A和B型流感病毒的人原始分离物在胚的羊膜囊生长更好，但2-3代后，病毒变得适应生长在尿囊腔中，该腔可以从鸡蛋外部进入(Murphy，B.R.，和R.G.Webster，1996.Orthomyxo Viruses pp.1397-1445.In Fields Virology.Lippincott-Raven P.A.)。

理论上，重组DNA技术和遗传工程技术应该能提供制备减毒病毒的更好方法，因为可有意将特定的突变工程化到病毒基因组中。然而，病毒减毒所需的基因改变是未知或不能够预测的。通常，多数利用重组DNA技术来工程化病毒疫苗来制备亚单位疫苗，这种亚单位疫苗仅含有在重组病毒载体(例如在牛痘病毒或杆状病毒(baculovirus))中表达的参与免疫应答的病原体蛋白质亚单位。最近，重组DNA技术已经用于尝试制备疱疹病毒缺失突变株或脊髓灰质炎病毒，其模拟天然发现的或已知宿主范围突变株的减毒病毒。直至1990年，负链RNA病毒还不能进行位点特异性操作，因而不能被遗传工程化。

尽管这些病毒只具有免疫原性而没有致病性从而是有益的，但它们难以在用于制备疫苗的传统培养基中繁殖。此外，减毒病毒可能具有过于缓和的毒力特性，以至于不能使宿主产生足以应对后续感染的免疫反应。

由于结合病毒的受体不同，人流感病毒不能在鸟中有效复制，反之亦然。相反，猪对人和鸟病毒的感染格外敏感，因为猪具有在人和鸟流感病毒中都存在的受体型。因而，推测猪是人鸟病毒重组体的“混合容器”宿主，并且有几个研究支持此理论。参见例如，Shu等，1994，Virology 202：825-33；Scholtissek，1990，Med.Principles Pract.2：65-71；Zhou等，1999J Virol.73：8851-6。这种混合有利于新的人流感病毒株的产生，引发流感全面流行。

失活或“杀灭”流感病毒制剂是目前在美国批准的仅有的流感疫苗。将病毒疫苗替代病毒病原体被“杀灭”的失活病毒疫苗的可选择的途径涉及利用能够复制但不致病的减毒活病毒疫苗。鼻内给药的活疫苗相对其失活的对应疫苗具有优越性。首先，现在认为活疫苗可改善交叉反应性细胞介导的细胞毒作用以及体液抗体反应，提供比失活疫苗更好的保护(Gorse and Belshe，1990，J.Clin.Microbiol.28：2539-2550；和Gorse等，1995，J.Infect.Dis.172：1-10)。其次，活疫苗具有鼻内给药的优越性，避免了肌肉内注射失活佐剂疫苗偶尔引起的肿胀和肌肉疼痛。这些活疫苗被报道不仅能够诱导抗同型流感病毒的体液反应而且能够诱导交叉反应性细胞介导的细胞毒作用。活疫苗的其它优越性包括易于鼻内给药、诱导粘膜免疫、更长的持久性免疫和成本效率。这些是潜在的猪流感疫苗的重要考虑因素。

因此，亟需由此技术产生用于预防猪流感病毒感染的新的更有效的疫苗和免疫原性制剂。

3.发明概述

本发明提供拮抗细胞干扰素(IFN)反应的能力受损的减毒猪流感病毒、制备这种减毒猪流感病毒的方法、以及这种病毒在疫苗和药物制剂中的应用。这种疫苗能够产生免疫反应并形成免疫性，但不致病或很少引起和/或较少引起严重症状，即该病毒具有降低的毒力。因此它们是活疫苗理想的候选。而且，该减毒病毒可诱导具有其它体内生物学后果的有力的IFN反应，提供对抗后续感染性疾病的保护和/或诱导抗肿瘤反应。因此，该减毒病毒可以在药物中使用来预防和治疗其它感染性疾病和/或IFN可治疗性疾病。

本发明部分基于申请人的发现，即经工程化在NS1基因中含有或包含缺失的猪流感病毒相对于野生型猪流感病毒具有减弱的复制性，如被感染的猪肺病灶较少、在支气管肺泡灌洗液(BALF)中病毒滴度降低、鼻擦拭签检测的病毒减少。惊奇的是，与小鼠模型中观察到的人流感病毒的结果相反，NS1蛋白的长度不与猪流感病毒的减毒性相关。申请人发现，对于猪流感病毒，具有最短NS1蛋白的突变株病毒减毒是最少的。换言之，与含有较长缺失的NS1基因的猪流感病毒或野生型猪流感病毒比较，含较短缺失的NS1基因的猪流感病毒表现较高的体内减毒。申请人进一步发现重组猪流感病毒体外抑制IFN产生的能力受损，并且它们在10天的含胚鸡蛋、MDCK细胞、PK-15细胞或猪体内模型中不象其亲代重组株一样有效地复制。不意欲受任何猪流感病毒NS1缺失突变株的体内作用机制的理论或结实的限制，推测是由NS1蛋白的表达水平、诱导有力的细胞IFN反应的能力和拮抗这种反应的能力受损引起这种病毒减毒特征。然而，这种病毒的有益特征并不能全归因于其对细胞干扰素反应的作用。事实上，其它与NS1相关的活性改变，例如，改变前mRNA剪接，对mRNA聚腺苷酸化、含poly(A)mRNA的核-胞浆转运、和刺激病毒蛋白合成的抑制，都可能有助于通过在猪流感病毒NS1基因中诱导突变来实现所需的减毒表型。

本发明的减毒猪流感病毒包括猪流感病毒NS1基因的突变，该突变减弱NS1基因产物拮抗细胞干扰素反应的能力。在一个实施方案中，本发明的减毒猪流感病毒包括含有猪流感病毒NS1基因突变的基因组，该突变减弱NS1基因产物拮抗细胞干扰素反应的能力，并且允许该减毒病毒以感染复数(MOI)为0.0005至0.001、0.001至0.01、0.01至0.1或0.1至1之间，或者MOI为0.0005、0.0007、0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5或6.0，在细胞(例如，人细胞(例如，PerC6，来自被腺病毒5的E1区转化的人胚胎视网膜母细胞的产病毒细胞株)、小鼠细胞、鸡细胞(例如，鸡胚胎成纤维细胞)、大鼠细胞、鸟细胞或猪细胞(例如，PK(D1)、PK(15)细胞、PK13细胞、NSK细胞、LLC-PK1细胞、LLC-PK1A细胞、ESK-4细胞、ST细胞、PT-K75细胞、PK-2a/CL 13或SJPL细胞))中生长到滴度比野生型猪流感病毒低约1至约100倍、约5至约80倍、约20至约80倍或约40至约80倍、约1至约10倍、约1至约5倍、约1至约4倍、约1至约3倍、约1至约2倍、约3至约15倍，或者约1、2、3、4、5、6、7、8、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100倍，这可以在相同增殖条件下，在感染后约2至10天、3至7天、3至5天、或者2、3、4、5、6、7、8、9、10天测定。减毒的和野生型猪流感病毒的滴度可利用本领域公知和本发明所述的任何技术来测定(例如，血细胞凝集试验、空斑试验、组织培养感染剂量50(TCID50)、蛋感染剂量50(EID50)等)，病毒可在本发明所述或本领域公知的条件下增殖(例如，在猪细胞、MDCK细胞(例如，在MEM、10％v/v胎牛血清(FCS)、1％青霉素/链霉素中，在37℃、5％CO₂的湿化培养箱中)或在含胚胎的鸡蛋中(例如，在静止培养箱中，在37℃、55％相对湿度下))。可供选择地，可在无血清或低血清含量(例如，TPCK胰蛋白酶)培养基生长的细胞(例如，猪细胞、MDCK细胞等)中增殖病毒。

在具体实施方案中，本发明的减毒猪流感病毒包括包含猪流感病毒NS1基因突变的基因组，该突变减弱了NS1基因产物拮抗细胞干扰素反应的能力，并且允许该减毒病毒以感染复数(MOI)为0.0005至0.001、0.001至0.01、0.01至0.1或0.1至1之间，或者MOI为0.0005、0.0007、0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5或6.0，在细胞(例如，人细胞(例如，PerC6，来自被腺病毒5的E1区转化的人胚胎视网膜母细胞的产病毒细胞株)、小鼠细胞、鸡细胞(例如，鸡胚胎成纤维细胞)、大鼠细胞、鸟细胞或猪细胞(例如，PK(D1)、PK(15)细胞、PK13细胞、NSK细胞、LLC-PK1细胞、LLC-PK1A细胞、ESK-4细胞、ST细胞、PT-K75细胞、PK-2a/CL 13或SJPL细胞))中生长到滴度比野生型猪流感病毒低约1至约100倍、约5至约80倍、约20至约80倍或约40至约80倍、约1至约10倍、约1至约5倍、约1至约4倍、约1至约3倍、约1至约2倍、约3至约15倍，或者约1、2、3、4、5、6、7、8、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100倍，这可以在相同增殖条件下，在感染后约2至10天、3至7天、3至5天，或者2、3、4、5、6、7、8、9、10天测定。减毒的和野生型猪流感病毒的滴度可利用本领域公知和本发明所述的任何技术来测定(例如，血细胞凝集试验、空斑试验等)，病毒可在本发明所述或本领域公知的条件下增殖(例如，在猪细胞、MDCK细胞(例如，在MEM、10％v/v胎牛血清(FCS)、1％青霉素/链霉素中，在37℃、5％CO₂的湿化培养箱中)或在含胚胎的鸡蛋中(例如，在静止培养箱中，在37℃、55％相对湿度下))。

用于本发明的猪流感病毒可选自具有所需表型(即拮抗细胞IFN反应的能力受损)的天然发生株、变体或突变株；诱导突变的病毒(例如，通过暴露在诱变剂下产生的病毒，反复传代和/或在非许可宿主中传代)；重组体；和/或遗传工程化病毒(例如，利用“反向遗传学”和基于质粒的无辅助(helper-free)技术)。具有所需干扰素拮抗表型的天然发生株、变体和突变株、重组体和/或遗传工程化的病毒可以根据在下文所述的其它试验的细胞(例如，人细胞(例如，PerC6，来自腺病毒5的E1区转化的人胚胎视网膜母细胞的产病毒细胞株)、小鼠细胞、鸡细胞(例如，鸡胚胎成纤维细胞)、大鼠细胞、鸟细胞或猪细胞(例如，PK(D1)、PK(15)细胞、PK13细胞、NSK细胞、LLC-PK1细胞、LLC-PK1A细胞、ESK-4细胞、ST细胞、PT-K75细胞、PK-2a/CL 13或SJPL细胞))中的差别生长来选择。在某些实施方案中，本发明的猪流感病毒为遗传工程化病毒。在其它的实施方案中，本发明的猪流感病毒是非天然发生株、变体和突变株和/或重组体。

在具体实施方案中，本发明的减毒猪流感病毒包括含猪流感NS1基因突变的基因组，该突变减弱NS1基因产物拮抗细胞干扰素反应的能力，并且允许该减毒病毒以感染复数(MOI)为0.0005至0.001、0.001至0.01、0.01至0.1或0.1至1之间，或者MOI为0.0005、0.0007、0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5或6.0，在细胞(例如，人细胞(例如，PerC6，来自被腺病毒5的E1区转化的人胚胎视网膜母细胞的产病毒细胞株)、小鼠细胞、鸡细胞(例如，鸡胚胎成纤维细胞)、大鼠细胞、鸟细胞或猪细胞(例如，PK(D1)、PK(15)细胞、PK13细胞、NSK细胞、LLC-PK1细胞、LLC-PK1A细胞、ESK-4细胞、ST细胞、PT-K75细胞、PK-2a/CL 13或SJPL细胞))中生长到滴度比野生型猪流感病毒低约1至约100倍、约5至约80倍、约20至约80倍或约40至约80倍、约1至约10倍、约1至约5倍、约1至约4倍、约1至约3倍、约1至约2倍、约3至约15倍，或者约1、2、3、4、5、6、7、8、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100倍，这可以在感染后约2至10天、3至7天、3至5天，或者2、3、5、6、7、8、9、10天，或者当病毒在Madin-Darby犬肾(MDCK)细胞产生蚀斑时，通过对猪BALF或猪细胞上清液进行血细胞凝集试验测定，。在一个实施方案中，将本发明减毒猪流感病毒的生长与具体标准或参照比较，例如与野生型猪流感病毒A/Swine/Texas/4199-2/98比较。根据这些实施方案，减毒病毒可以被遗传工程化来含有或表达非猪流感病毒核酸序列，例如，外源病原体或肿瘤抗原的抗原决定簇。优选地，该非猪流感病毒序列不包括改变病毒减毒表型的核酸序列。因此，不将编码具有干扰素拮抗活性的蛋白、多肽或肽的核酸序列工程化到猪流感病毒中。

本发明提供包括在2、3、4或更多个猪流感病毒基因中含有至少2、至少3或至少4种或更多突变的基因组的减毒猪流感病毒，其中这些突变中的至少1个位于NS 1基因，并有助于或导致(直接或间接)病毒的减毒和/或病毒拮抗细胞干扰素反应的能力受损。在一个实施方案中，本发明的减毒猪流感病毒包括在2、3、4或更多个猪流感病毒基因中含有至少2、至少3或至少4种或更多突变的基因组，其中这些突变中的至少1个位于NS 1基因并导致NS1基因产物拮抗细胞干扰素反应的能力减弱，并且使得该减毒病毒以MOI为0.0005至0.001、0.001至0.01、0.01至0.1或0.1至1之间，或者MOI为0.0005、0.0007、0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5或6.0，在细胞(例如，人细胞(例如，PerC6，来自被腺病毒5的E1区转化的人胚胎视网膜母细胞的产病毒细胞株)、小鼠细胞、鸡细胞(例如，鸡胚胎成纤维细胞)、大鼠细胞、鸟细胞或猪细胞(例如，PK(D1)、PK(15)细胞、PK13细胞、NSK细胞、LLC-PK1细胞、LLC-PK1A细胞、ESK-4细胞、ST细胞、PT-K75细胞、PK-2a/CL 13或SJPL细胞))中生长到滴度比野生型猪流感病毒低约1至约100倍、约5至约80倍、约20至约80倍或约40至约80倍、约1至约10倍、约1至约5倍、约1至约4倍、约1至约3倍、约1至约2倍、约3至约15倍，或者约1、2、3、4、5、6、7、8、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100倍，这可以在相同增殖条件下，感染后约2至10天、3至7天、3至5天，或者2、3、5、6、7、8、9、10天，通过血细胞凝集试验测定。

在具体的实施方案中，本发明的减毒猪流感病毒包括在2个、3个、4个或更多个猪流感病毒基因中含至少2、至少3、至少4种或更多突变的基因组，其中这些突变中的至少1个位于NS 1基因并导致NS1基因产物拮抗细胞干扰素反应的能力减弱，并且使得该减毒病毒以MOI为0.0005至0.001、0.001至0.01、0.01至0.1或0.1至1之间，或者MOI为0.0005、0.0007、0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5或6.0，在猪细胞中生长到滴度比野生型猪流感病毒低约1至约100倍、约5至约80倍、约20至约80倍或约40至约80倍、约1至约10倍、约1至约5倍、约1至约4倍、约1至约3倍、约1至约2倍、约3至约15倍，或者约1、2、3、4、5、6、7、8、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100倍，这可以在相同增殖条件下时(例如在MDCK细胞中)，在感染后约2至0天、3至7天、3至5天，或者2、3、5、6、7、8、9、10天，通过血细胞凝集试验测定。在另一实施方案中，本发明的减毒猪流感病毒包括在2个、3个、4个或更多个猪流感病毒基因中含至少2、至少3、至少4种或更多突变的基因组，其中这些突变中的至少1个位于NS 1基因并导致该病毒的减毒，并且使得该减毒病毒以MOI为0.0005至0.001、0.001至0.01、0.01至0.1或0.1至1之间，或者MOI为0.0005、0.0007、0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5或6.0，在猪细胞中生长到滴度比野生型猪流感病毒低约1至约100倍、约5至约80倍、约20至约80倍或约40至约80倍、约1至约10倍、约1至约5倍、约1至约4倍、约1至约3倍、约1至约2倍、约3至约15倍，或者约1、2、3、4、5、6、7、8、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100倍，这可以在相同增殖条件下(例如在MDCK细胞中)，感染后约2至10天、3至7天、3至5天，或者2、3、5、6、7、8、9、10天，通过血细胞凝集试验测定。根据这些实施方案，所述减毒病毒具有受损的干扰素拮抗表型并可以被遗传工程化来含有或表达非猪流感病毒核酸序列，例如，外源病原体的抗原决定簇(例如，猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪巨细胞病毒、猪呼吸道冠状病毒、猪脑心肌炎病毒、猪流行性腹泻病毒的抗原决定簇、以及非病毒性猪病原体的抗原决定簇，例如细菌包括但不限于布鲁氏菌(Brucella suis)，以及寄生虫包括但不限于蛔虫(Ascaris suum)、鞭虫(Trichuris suis)的抗原决定簇，或肿瘤抗原例如癌胚抗原(CEA)、乳腺癌抗原例如EGFR(上皮生长因子受体)、HER2抗原(p185^HER2)、HER2neu抗原决定簇、癌抗原-50(CA-50)、与乳腺癌相关的癌抗原15-3(CA15-3)、癌症相关抗原(CAA)、黑素瘤抗原以及黑素瘤相关抗原100、25和150)。优选地，所述非猪流感病毒序列(异源序列)不包括改变病毒减毒表型的核酸序列。因此，编码具有干扰素拮抗活性的蛋白、多肽和肽的核酸序列优选不被工程化到猪流感病毒中。

猪流感病毒NS1基因中的突变包括(或者，由以下组成)任何导致所需表型(即，拮抗细胞干扰素反应的能力受损)的突变。可包括在或引入猪流感病毒NS1基因中的突变类型的实例包括但不限于：缺失、替代、插入以及上述的组合。一种或多种突变可位于整个NS1基因的任意处，即，在调控区、非编码区和/或编码区(例如，氨基末端和/或羧基末端或之间的某些地方)。在具体实施方案中，本发明的减毒猪流感病毒包括在氨基末端含有突变(例如，缺失或取代)的猪流感病毒NS1基因的基因组。在优选的实施方案中，本发明的减毒猪流感病毒包括在羧基末端含有突变(例如，缺失或取代，优选缺失)的猪流感病毒NS1基因的基因组。在另一实施方案中，本发明的减毒猪流感病毒包括在猪流感病毒NS1基因中含有突变的的基因组，该突变导致自NS1羧基末端缺失5、优选10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、100、105、110、115、119、120、121、125、130、135、140、145、146、147、148、150、155、160、165、170或175个氨基酸残基，或者自NS1羧基末端缺失5-170、25-170、50-170、100-170、90-160、100-160或105-160、90-150、5-75、5-50或5-25氨基酸残基。在另一实施方案中，本发明的减毒猪流感病毒包括在猪流感病毒NS1基因中含突变的的基因组，该突变导致除了氨基酸残基1-126、氨基酸残基1-120、氨基酸残基1-115、氨基酸残基1-110、氨基酸残基1-100、氨基酸残基1-99、氨基酸残基1-95、氨基酸残基1-85、氨基酸残基1-80、氨基酸残基1-75、氨基酸残基1-73、氨基酸残基1-70、氨基酸残基1-65或氨基酸残基1-60外，其它所有NS1基因产物的氨基酸残基都缺失，其中氨基末端氨基酸为序号1。根据这些实施方案，减毒猪流感病毒优选是遗传工程化的。在优选的实施方案中，本发明的减毒猪流感病毒为TX/98/del 126、TX/98/del 99或TX/98/del 73。

本发明的减毒猪流感病毒可以是表达异源序列的嵌合病毒。优选地，该异源序列不是改变病毒减毒表型的核酸序列。因此，优选地，编码具有干扰素拮抗活性的蛋白、多肽或肽的核酸序列不被工程化到猪流感病毒中。在某些实施方案中，嵌合病毒表达肿瘤抗原。在其它的实施方案中，嵌合病毒表达外源病原体的抗原决定簇。

具有所需表型的减毒猪流感病毒本身可做为疫苗、药物制剂或免疫原性制剂的活性成分。可供选择地，该减毒猪流感病毒可用作重组制备的疫苗或免疫原性制剂的载体或“骨架”。为此，“反向遗传学”技术或无辅助(helper-free)质粒方法可用于在可作为“亲代”株的减毒猪流感病毒中进行工程化突变或引入外源抗原决定簇。以这种方式，疫苗可以被设计成针对株变体进行免疫，或者可选择地针对完全不同的感染因子或疾病抗原进行免疫(例如，肿瘤抗原)。例如，该减毒猪流感病毒可被工程化以表达其它预先选定株的中和性抗原表位。可选择地，其它病毒的抗原决定簇可被构建到该减毒猪流感病毒中。可选择地，非病毒感染病原体(例如，寄生虫，细菌，真菌)的抗原决定簇抗能够被构建到该猪流感病毒中。

在特定的实施方案中，重组技术可用于将来自亲代的猪流感病毒株减毒表型(天然突变、诱导突变病毒或遗传工程化病毒)转移到不同的病毒株(野生型病毒、天然突变株、诱导突变病毒或遗传工程化病毒)。根据此实施方案，“反向遗传学技术”或无辅助(helper-free)质粒方法可以被用来在可以用作“亲代株”的减毒猪流感病毒中工程化突变或引入外源抗原决定簇。

本发明提供免疫个体的方法，包括给予含有减毒猪流感病毒和生理学上有效的赋形剂的疫苗制剂，该减毒猪流感病毒在猪流感NS 1基因中含有减弱NS 1基因产物拮抗细胞干扰素反应的能力的突变。在一个实施方案中，本发明提供了包括给予有效量本发明疫苗制剂的方法。在某些实施方案中，所给予的疫苗制剂的剂量为约10²至约10⁸pfu、约10³至约10⁷pfu或约10⁴至约5×10⁶pfu。在其它实施方案中，所给予的疫苗制剂的剂量为10²、5×10²、10³、5×10³、10⁴、5×10⁴、10⁵、5×10⁵、10⁶、5×10⁶、10⁷、5×10⁷或10⁸pfu。在具体实施方案中，所述个体为驴、斑马、骆驼、狗、鸟(例如，鸭子)。在优选的实施方案中，所述个体为猪。

本发明提供了包括本发明减毒猪流感病毒的免疫原性制剂和包括给予个体本发明免疫原性制剂用于诱导免疫反应的方法，以治疗、控制或预防猪流感病毒感染或与其相关的不适或症状、猪流感病毒感染外的其它感染或与其相关的不适或症状，或者不适(其中该减毒猪流感病毒可用作载体来诱导针对与该不适相关的特定抗原的免疫反应)。在一个实施方案中，本发明提供包括给予个体有效量的本发明免疫原性制剂的诱导免疫反应的方法，以治疗、控制或预防猪流感病毒感染或与其相关的不适或症状、猪流感病毒感染外的其它感染或与其相关的不适或症状，或者不适(其中该减毒猪流感病毒可用作载体来诱导针对与该不适相关的特定抗原的免疫反应)。在某些实施方案中，给予个体的本发明免疫原性制剂的剂量为约10²至约10⁸pfu、约10³至约10⁷pfu或约10⁴至约5×10⁶pfu，或者约10⁴至约10⁷pfu。在具体实施方案中，给予个体的免疫原性制剂含有减毒猪流感病毒的浓度为约10⁴至约10⁷pfu/ml。在其它实施方案中，给予个体的本发明免疫原性制剂的剂量为10²、5×10²、10³、5×10³、10⁴、5×10⁴、10⁵、5×10⁵、10⁶、5×10⁶、10⁷、5×10⁷或10⁸pfu。在具体实施方案中，所述个体为驴、斑马、骆驼、狗、鸟(例如，鸭子)。在优选的实施方案中，所述个体为猪。

在个体中诱导有力的IFN反应的减毒猪流感病毒也可用于药物制剂中，以预防或治疗感染和IFN可治疗性疾病例如癌症。在这方面，可以改变该减毒猪流感病毒的趋向性，将病毒在体内施用(in vivo)或体外转移再回输(ex vivo)使之靶向所期望的靶器官、组织或细胞。利用此方法，可在靶点局部诱导IFN反应，从而避免系统性IFN治疗的副作用或使之最小化。为此目的，可将该减毒猪流感病毒工程化以表达对靶器官、组织或细胞受体特异的配体。

本发明提供包括给予个体本发明的药物制剂来预防、控制或治疗个体(例如，猪)的猪流感病毒感染外的其它感染或者不是由猪流感病毒引起的IFN-可治疗性疾病的方法。在一个实施方案中，本发明提供包括给予个体有效量的本发明药物制剂来预防、控制或治疗个体(例如，猪)猪流感病毒感染外的其它感染或者不是由猪流感病毒引起的IFN-可治疗性疾病的方法。在某些实施方案中，给予个体的药物制剂剂量为约10²至约10¹²、约10²至约10¹⁰、约10²至约10⁸、约10³至约10⁹、约10³至约10⁷、约10⁴至约10⁸、约10⁴至约5x 10⁶、约10⁴至约10⁷或约10⁴至约10¹²pfu。在具体实施方案中，给予个体的药物制剂含有减毒流感病毒的浓度为约10⁴至约10¹²pfu/ml。在其它实施方案中，药物制剂的给药剂量为10²、5×10²、10³、5×10³、10⁴、5×10⁴、10⁵、5×10⁵、10⁶、5×10⁶、10⁷、5×10⁷、10⁸、5×10⁸、1×10⁹、5×10⁹、1×10¹⁰、5×10¹⁰、1×10¹¹、5×10¹¹或10¹²pfu。在具体实施方案中，所述个体为驴、斑马、骆驼、狗、鸟(例如，鸭子)。在优选的实施方案中，所述个体为猪。

本发明提供包括给予个体本发明药物制剂来预防、控制或治疗个体癌症的方法。在一个实施方案中，本发明提供包括给予个体有效量的本发明药物制剂来预防、控制或治疗个体癌症的方法。在某些实施方案中，该药物制剂包括含有肿瘤抗原的猪流感病毒。在某些实施方案中，给予个体的药物制剂的剂量为约10²至约10¹²pfu、约10²至约10¹⁰pfu、约10²至约10⁸pfu、约10³至约10⁹pfu、约10³至约10⁷pfu、约10⁴至约10⁸pfu、约10⁴至约5×10⁶pfu或约10⁴至约10¹²pfu。在其它实施方案中，该药物制剂的给药剂量为10²、5×10²、10³、5×10³、10⁴、5×10⁴、10⁵、5×10⁵、10⁶、5×10⁶、10⁷、5×10⁷、10⁸、5×10⁸、1×10⁹、5×10⁹、1×10¹⁰、5×10¹⁰、1×10¹¹、5×10¹¹或10¹²pfu。在具体实施方案中，所述个体为驴、斑马、骆驼、狗、鸟(例如，鸭子)。在优选的实施方案中，所述个体为猪。

申请人已经证明，干扰素拮抗活性受损的减毒猪流感病毒体内复制产生的滴度低于用野生型猪流感病毒所测的滴度，但该滴度足以诱导免疫和细胞因子反应。因此，减弱但不消除所述猪流感病毒的IFN拮抗活性的突变对于疫苗、免疫学和药物制剂是优选的。可选择这样的病毒在常规和非常规培养基中生长，并具有中等毒力。

本发明提供含有(或者，包含)本发明猪流感病毒的细胞。在具体实施方案中，细胞含有/包含遗传工程化的猪流感病毒。在某些实施方案中，细胞中含有的减毒猪流感病毒被工程化以编码来自另一病原体(例如，另一种病毒)的抗原决定簇或肿瘤抗原。根据此实施方案，该减毒猪流感病毒的基因组可以包括至少一种来自不同病毒的片段。任何细胞都可以含有或包括本发明的减毒猪流感病毒，或被该病毒感染，这些细胞包括但不限于：MDCK细胞、PK细胞、Vero细胞、原代人脐带静脉内皮细胞(HUVEC)、H292人上皮细胞株、HeLa细胞和猪胚胎肾细胞RES。在优选的实施方案中，所述细胞为猪细胞或猪细胞株。在某些实施方案中，所述细胞(例如，猪细胞或猪细胞株)为干扰素缺陷的。

在某些其它实施方案中，本发明的猪流感病毒被包含在10天、6-9天、6-8天、6-7天龄的含胚鸡蛋中。在具体实施方案中，该病毒被包含在这样的蛋的尿囊腔中。在另一具体实施方案中，该病毒被包含在这样的蛋的羊膜腔中。

本发明包括用培养基例如细胞、细胞株和含胚蛋来增殖本发明的减毒猪流感病毒。在一个实施方案中，本发明提供制备疫苗产品和药物产品的方法，包括在培养基中增殖本发明的减毒猪流感病毒，并收集子代病毒，其中培养基为细胞、细胞株或含胚蛋。在某些实施方案中，培养基为IFN缺陷系统。示例的IFN缺陷系统包括但不限于：早期含胚蛋(例如，6-10天、6-9天、6-8天或6-7天龄的含胚蛋)和IFN缺失的细胞株(例如VERO细胞或例如STAT1敲除的遗传工程化细胞株)。含胚蛋或用抑制IFN系统的化合物(包括药物、抗体、反义核酸、核酶等)预处理的细胞株也可用作IFN缺陷系统。此外，IFN系统缺陷的蛋，例如，由STAT1阴性的鸟特别是家禽包括但不限于转基因鸡、鸭或火鸡生的蛋，可用作IFN缺陷系统。

3.1术语

这里所用术语“约”或“大约”当与数字联用时，指所用数字的1％、5％或10％内的任何数字。

这里所用短语NS1的“氨基末端”指猪流感病毒NS 1蛋白的从氨基末端氨基酸残基(氨基酸残基1至氨基酸残基115、氨基酸残基1至100、氨基酸残基1至75、氨基酸残基1至50、氨基酸残基1至25或氨基酸残基1至10。

当猪流感病毒NS 1蛋白的氨基末端是氨基酸残基1至氨基酸残基115、氨基酸残基1至100、氨基酸残基1至75、氨基酸残基1至50或氨基酸残基1至25时，这里所用短语NS1的“羧基末端”分别指猪流感病毒NS 1蛋白的氨基酸残基116至羧基末端氨基酸残基、氨基酸残基101至羧基末端氨基酸残基、氨基酸残基76至羧基末端氨基酸残基、氨基酸残基51至羧基末端氨基酸残基或氨基酸残基26至羧基末端氨基酸残基。从羧基末端的缺失可包括自NS1羧基末端的5、优选10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、73、75、80、85、90、95、99、100、105、110、115、120、125、126、130、135、140、145、150、155、160、165、170或175个氨基酸残基的缺失。

这里所用术语“细胞因子受体调节剂”指调节细胞因子受体磷酸化、与细胞因子受体相关的信号转导途径活化和/或特定蛋白例如细胞因子的表达的试剂。这种试剂可直接或间接调节细胞因子受体磷酸化、与细胞因子受体相关的信号转导途径活化和/或特定蛋白例如细胞因子的表达。因此，细胞因子受体调节剂的实例包括但不限于：细胞因子、细胞因子片段、融合蛋白和与细胞因子受体或其片段免疫特异性结合的抗体。此外，细胞因子受体调节剂的实例包括但不限于：肽、多肽(例如，可溶性细胞因子受体)、融合蛋白和与细胞因子受体或其片段免疫特异性结合的抗体。

这里所用术语“有效量”指治疗(例如，预防性试剂或治疗试剂)的量，该量足以减轻和/或改善不适(例如，猪流感病毒感染或与其相关的不适或症状、其它感染(例如，另一种病毒感染)、IFN可治疗性疾病或不适(其中该减毒猪流感病毒可用做载体来介导针对与所述不适相关的特定抗原的免疫反应))的严重程度和/或持续时间、预防不适(例如，猪流感病毒感染或与其相关的不适或症状、其它感染(例如，另一种病毒感染)、IFN可治疗性疾病或不适(其中该减毒猪流感病毒可用做载体来介导针对与所述不适相关的特定抗原的免疫反应))的进展、引起不适(例如，猪流感病毒感染或与其相关的不适或症状，其它感染(例如，另一种病毒感染)、或IFN可治疗性疾病)的康复、防止一种或多种与不适(例如，猪流感病毒感染或与其相关的不适或症状、其它感染(例如，另一种病毒感染)、或IFN可治疗性疾病)相关的症状复发、发展或发生，降低猪流感病毒的滴度，或增强或改善另一种治疗性试剂(例如，预防或治疗试剂)的预防或治疗作用。

这里所用术语“抗原决定簇”指在动物，优选哺乳动物，最优选猪中具有抗原或免疫原活性的多肽或蛋白的位点或片段。具有免疫原活性的抗原决定簇是引发动物抗体反应的多肽或蛋白的位点或片段。具有抗原活性的抗原决定簇是用本领域所属技术人员熟知的任何方法例如免疫分析所确定的、与抗体免疫特异性结合的多肽或蛋白的位点或片段。

这里在描述蛋白质性试剂的情况下所使用的术语“片段”指包含肽、多肽或蛋白质氨基酸序列的至少2个连续的氨基酸残基、至少5个连续的氨基酸残基、至少10个连续的氨基酸残基、至少15个连续的氨基酸残基、至少20个连续的氨基酸残基、至少25个连续的氨基酸残基、至少40个连续的氨基酸残基、至少50个连续的氨基酸残基、至少60个连续的氨基酸残基、至少70个连续的氨基酸残基、至少80个连续的氨基酸残基、至少90个连续的氨基酸残基、至少100个连续的氨基酸残基、至少125个连续的氨基酸残基、至少150个连续的氨基酸残基、至少175个连续的氨基酸残基、至少200个连续的氨基酸残基或至少250个连续的氨基酸残基的氨基酸序列。在一个实施方案中，全长蛋白质的片段保留了全长蛋白的活性，例如IFN拮抗活性。在另一实施方案中，全长蛋白质的片段不保留全长蛋白质的活性，例如IFN拮抗活性。

这里在描述核酸的情况下所使用的术语“片段”指包含编码肽、多肽或蛋白的核酸序列的至少2个连续的核苷酸、至少5个连续的核苷酸、至少10个连续的核苷酸、至少15个连续的核苷酸、至少20个连续的核苷酸、至少25个连续的核苷酸、至少30个连续的核苷酸、至少35个连续的核苷酸、至少40个连续的核苷酸、至少50个连续的核苷酸、至少60个连续的核苷酸、至少70个连续的核苷酸、至少80个连续的核苷酸、至少90个连续的核苷酸、至少100个连续的核苷酸、至少125个连续的核苷酸、至少150个连续的核苷酸、至少175个连续的核苷酸、至少200个连续的核苷酸、至少250个连续的核苷酸、至少300个连续的核苷酸、至少350个连续的核苷酸或至少380个连续的核苷酸的核酸。在优选的实施方案中，核酸片段编码的肽或多肽保留全长蛋白的活性，例如IFN拮抗活性。在另一实施方案中，全长蛋白质的片段不保留全长蛋白质的活性，例如IFN拮抗活性。

这里所用短语“异源序列”指任何通常不是天然存在或与所关注的核酸或蛋白质、多肽或肽序列不天然相关的核酸序列或蛋白质、多肽或肽序列。例如，“异源序列”可指来自不同种属的序列。

这里所用术语“联合”(或“组合”)指使用超过一种治疗(例如，多于一种预防试剂和/或治疗试剂)。术语“联合”的使用不限制给予有不适(例如，猪流感病毒感染或与其相关的不适或症状，另一种感染(例如，另一种病毒感染)或IFN可治疗性疾病)的个体治疗性试剂(例如，预防性试剂和/或治疗试剂)的顺序。可以在给予具有不适(例如，猪流感病毒感染或与其相关的不适或症状，另一种感染(例如，另一种病毒感染)或IFN可治疗性疾病)的个体第二治疗性试剂(例如，第二预防或治疗试剂)之前(例如，5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周或12周前)、同时或之后(例如，5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周或12周后)给予第一治疗(例如，第一预防性试剂或治疗试剂)。

这里所用短语“干扰素拮抗活性”指降低或抑制细胞干扰素免疫反应的蛋白质或多肽，或其片段、衍生物或类似物。特别是，具有干扰素拮抗活性的蛋白或多肽，或其片段、衍生物或类似物(例如，猪流感病毒NS1)降低或抑制干扰素表达和/或活性。在具体实施方案中，短语“干扰素拮抗活性”指降低或抑制细胞干扰素免疫反应的猪流感病毒蛋白或多肽，或其片段、衍生物或类似物。具有干扰素拮抗活性的猪流感病毒蛋白或多肽可优选地影响一种或两种类型干扰素(IFN)的表达和/或活性。在一个实施方案中IFN-α的表达和/或活性被影响。在另一实施方案中，IFN-β的表达和/或活性被影响。在一个实施方案中，IFN-γ的表达和/或活性被影响。在某些实施方案中，在有IFN活性的系统(IFN-competent systems)例如野生型细胞或动物中在相同条件下，与对照(例如，PBS或无干扰素拮抗活性的蛋白质)相比，具有干扰素拮抗活性的蛋白、多肽等使IFN-β和/或IFN-γ的表达和/或活性降低5-10％、10-20％、20-30％、30-40％、40-50％、50-60％、60-70％、70-80％、80-90％或更多。在某些实施方案中，在有IFN活性的系统中，在相同条件下，与对照(例如，PBS或无干扰素拮抗活性的蛋白质)相比，具有干扰素拮抗活性的蛋白、多肽等使IFN-β和/或IFN-γ的表达和/或活性降低约1至约100倍、约5至约80倍、约20至约80倍、约1至约10倍，或约1至约5倍，或约40至约80倍，或者1、2、3、4、5、7、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100倍。

这里所用短语“IFN缺陷系统”或“IFN缺失培养基”指不产生IFN或产生低水平IFN(即，在相同的条件下与有IFN活性的系统比较，IFN表达减少5-10％、10-20％、20-30％、30-40％、40-50％、50-60％、60-70％、70-80％、80-90％或更多)、对IFN没有反应或反应效率低、和/或由IFN诱导的一种或多种抗病毒基因的活性缺失的系统，例如细胞、细胞株和动物例如猪、小鼠、鸡、火鸡、兔子、大鼠等。

这里所用短语“IFN诱导性表型”指这样的表型，病毒相对于野生型病毒显示增加的细胞干扰素反应，该表型典型地抑制或减少细胞干扰素介导的反应。

这里所用短语“IFN可治疗性病症”、“IFN可治疗性疾病”以及类似短语指可通过给予IFN(IFN-α，β，γ或其任意组合)来预防、治疗、控制或改善的不适。如果猪流感病毒感染其它物种，则IFN可治疗的病症不限于猪。猪的IFN可治疗病症的实例包括但不限于口蹄疫、猪嗜血杆菌肺炎(PHP)、以及由例如胸膜肺炎放线杆菌(A.pleuropneumoniae)、溶血巴斯德氏菌(P.haemolytica)、多杀巴斯德氏菌(P.multocida)、睡眠嗜血杆菌(H.somnus)以及A.suis感染所引起其它病症。

这里就IFN拮抗活性所用的短语“中间”表型指这样的表型，其可激发较强的免疫反应，但同时是减毒的，因为具有中间表型的病毒不能克服宿主的IFN反应。特别地，与野生型病毒相比，中间表型能够刺激免疫反应并抑制/降低IFN仅至其允许较少的病毒复制轮次或病毒颗粒数量的程度，这可以用本领域熟知的技术来测定(例如，通过较低的空斑滴度或血细胞凝集试验来测定)。

这里在描述病毒的情况下所使用的术语“分离的”指来自单一亲代病毒的病毒。可利用本领域所属技术人员公知的常规技术来分离病毒，这些技术包括但不限于基于空斑纯化(plaque purification)和限制性稀释(limiting dilution)的技术。

这里所用术语“控制”指个体从治疗(例如，预防性试剂或治疗性试剂)中获得的有益效果，其不能治愈所述疾病。在某些实施方案中，给予个体一种或多种治疗(例如，一种或多种预防性试剂或治疗性试剂)来“控制”疾病从而防止所述疾病进展或恶化。

这里所用短语“感染复数”或“MOI”指每个被感染细胞的平均病毒数量。MOI由加入的病毒数量(加入的ml×PFU)除以加入的细胞数量(加入的ml×细胞/ml)测得。

这里在描述含有或包含非猪流感病毒序列的猪流感病毒的情况下所用短语“非猪流感病毒”指任何包含与猪流感病毒异源(即未发现与猪流感病毒天然相关)的序列(例如，核酸或氨基酸序列)的流感病毒株或分离株。

这里所用短语“NS1基因”指在流感病毒中编码非结构性蛋白(NS1)的基因。NS1是由分段的A型流感病毒基因组和其它病毒编码的8种分子之一。“猪流感病毒NS1基因”是从猪流感病毒分离的NS1基因。代表性的猪NS1基因可在公共序列数据库例如Genbank中找到，包括但不限于Genbank编号AJ293939(A/swine/Italy/13962/95(H3N2))和Genbank编号AJ344041(A/swine/Cotesd′Armor/1121/00(H1N1))。“NS1基因产物”指由NS1基因编码的基因产物(例如，RNA或蛋白)。如果是蛋白质，该NS1基因产物是全长的并具有野生型NS1的活性(例如，来自流感病毒A/swine/Texas/4199-2/98的基因产物)。“猪流感病毒NS 1基因产物”指由猪流感病毒NS1基因编码的基因产物(例如，RNA或蛋白)。如果是蛋白质，该猪流感病毒NS1基因产物是全长的并具有野生型猪流感病毒NS1的活性，例如，来自A/swine/Texas/4199-2/98。

这里所用术语“防止”和“预防”指通过给予个体治疗(例如，预防性试剂或治疗性试剂)或者给予联合治疗性试剂(例如，预防性试剂或治疗性试剂的组合)来抑制不适(例如，猪流感病毒感染或与其相关的不适、猪流感病毒感染外的其它感染和与其相关的不适，或者IFN可治疗性疾病或不适(其中所述减毒猪流感病毒可作为载体来诱导对与该不适相关的特定抗原的免疫反应))的发展和发生，或者预防不适(例如，猪流感病毒感染或与其相关的不适、猪流感病毒感染外的其它感染和与其相关的不适，或者IFN可治疗的不适)的一种或多种症状的复发、发生或发展。

这里所用术语“预防性试剂”指任何可用于预防不适或其症状(例如，猪流感病毒感染或与其相关的不适或症状、猪流感病毒感染外的其它感染或与其相关的不适或症状、IFN可治疗性疾病或不适(其中所述减毒猪流感病毒可作为载体来诱导针对与该不适相关的特定抗原的免疫反应))的试剂。优选地，预防性试剂是已知可以用于或已经用于或正在用于预防或阻止猪流感病毒感染或与其相关的不适或症状、猪流感病毒感染外的其它感染或与其相关的不适或症状、IFN可治疗性疾病或不适(其中所述减毒猪流感病毒可作为载体来诱导针对与该不适相关的特定抗原的免疫反应)的发生、发展、进展和/或严重程度的试剂。

这里所用术语“预防有效量”指治疗(例如，预防性试剂)的量，该量足以预防不适或其症状(例如，猪流感病毒感染或与其相关的不适或症状、猪流感病毒感染外的其它感染和与其相关的不适、IFN可治疗性疾病或不适(其中所述减毒猪流感病毒可作为载体来诱导针对与该不适相关的特定抗原的免疫反应))的发展、复发或发生，或者增强或改善另一种疗法(例如，预防性试剂)的预防效果。

这里在描述病毒时所用的短语“纯化的”指基本上不含细胞材料和培养基(病毒从这些细胞或培养基中分离)的病毒。“基本上不含细胞材料”的描述包括病毒与细胞(该病毒从其中分离或重组产生)的细胞组分分离的病毒制剂。因此，基本上不含细胞材料的病毒包括含有的细胞蛋白质(这里也称为“杂质蛋白质”)低于约30％、20％、10％或5％(干重)的蛋白制剂。该病毒也基本上不含培养基，即培养基占病毒制剂的体积低于约20％、10％或5％。可利用本领域所属技术人员公知的常规方法来纯化病毒，包括但不限于层析或离心。

这里所用术语“个体”或“患者”可以相互替代使用。这里所用术语“个体”指动物(例如，鸟、爬行动物和哺乳动物)，优选哺乳动物包括非灵长类(例如，骆驼、驴、斑马、牛、猪、马、猫、狗、大鼠和小鼠)和灵长类(例如，猴子、黑猩猩和人)。在某些实施方案中，个体或患者被猪流感病毒感染。在某些实施方案中，哺乳动物为0至6月、6至12月、1至5岁、5至10岁、10至15岁、15至20岁、20至25岁、25至30岁、30至35岁、35至40岁、40至45岁、45至50岁、50至55岁、55至60岁、60至65岁、65至70岁、70至75岁、75至80岁、80至85岁、85至90岁、90至95岁或95至100岁。在优选的实施方案中，个体或患者为猪。在某些实施方案中，猪为0至6月、6至12月、1至5岁、5至10岁或10至15岁。猪的自然寿命为10-15年。

这里所用的“猪流感病毒”指引起猪流感的来自正粘病毒家族的A型或C型流感病毒。正粘病毒有三类：A型、B型和C型，仅A型和C型流感病毒感染猪。猪流感病毒的亚型包括H1N1、H1N2、H3N2和H3N1。H9N2和H5N1可以在猪中发现。在某些实施方案中，猪流感病毒为分离自猪的流感病毒。在优选的实施方案中，猪流感病毒含有猪NS1基因。可在例如Genbank的公共数据库中找到代表性的猪NS1基因，其包括但不限于Genbank编号AJ293939(A/swine/Italy/13962/95(H3N2))和Genbank编号AJ344041(A/swine/Cotesd′Armor/1121/00(H1N1))。猪流感病毒变体的实例包括但不限于A/Swine/Colorado/1/77、A/Swine/Colorado/23619/99、A/Swine/Cote d′Armor/3633/84、A/Swine/Cote d′Armor/3633/84、A/Swine/England/195852/92、A/Swine/Finistere/2899/82、A/Swine/Hong Kong/10/98、A/Swine/Hong Kong/9/98、A/Swine/Hong Kong/81/78、A/Swine/Illinois/100084/01、A/Swine/Illinois/100085A/01、A/Swine/Illinois/21587/99、A/Swine/Indiana/1726/88、A/Swine/Indiana/9K035/99、A/Swine/Indiana/P12439/00、A/Swine/Iowa/30、A/Swine/Iowa/15/30、A/Swine/Iowa/533/99、A/Swine/Iowa/569/99、A/Swine/Iowa/3421/90、A/Swine/Iowa/8548-1/98、A/Swine/Iowa/930/01、A/Swine/Iowa/17672/88、A/Swine/Italy/1513-1/98、A/Swine/Italy/1523/98、A/Swine/Korea/CY02/02、A/Swine/Minnesota/55551/00、A/Swine/Minnesota/593/99、A/Swine/Minnesota/9088-2/98、A/Swine/Nebraska/1/92、A/Swine/Nebraska/209/98、A/Swine/Netherlands/12/85、A/Swine/North Carolina/16497/99、A/Swine/North Carolina/35922/98、A/Swine/North Car-olina/93523/01、A/Swine/North Carolina/98225/01、A/Swine/Oedenrode/7C/96、A/Swine/Ohio/891/01、A/Swine/Oklahoma/18717/99、A/Swine/O klahoma/18089/99、A/Swine/Ontario/01911-1/99、A/Swine/Ontario/01911-2/99、A/Swine/Ontario/41848/97、A/Swine/Ontario/97、A/Swine/Quebec/192/81、A/Swine/Quebec/192/91、A/Swine/Quebec/5393/91、A/Swine/Taiwan/7310/70、A/Swine/Tennessee/24/77、A/Swine/Texas/4199-2/98、A/Swine/Wisconsin/125/97、A/Swine/Wisconsin/136/97、A/Swine/Wisconsin/163/97、A/Swine/Wisconsin/164/97、A/Swine/Wiscon-sin/166/97、A/Swine/Wisconsin/168/97、A/Swine/Wisconsin/235/97、A/Swine/Wisconsin/238/97、A/Swine/Wisconsin/457/98、A/Swine/Wisconsin/458/98、A/Swine/Wisconsin/464/98和A/Swine/Wisconsin/14094/99。

这里所用术语“协同的”指比任何两种或更多种单独治疗(例如，一种或多种预防性试剂或治疗性试剂)的相加作用更有效的治疗(例如，预防或剂治疗性试剂)组合。治疗性试剂组合(例如，预防性试剂或治疗性试剂的组合)的协同作用使得可以给予不适的个体(例如，猪流感病毒感染或与其相关的不适、猪流感病毒感染外的其它感染和与其相关的不适、或者IFN可治疗性疾病或不适(其中所述减毒猪流感病毒可作为载体来诱导针对与该不适相关的特定抗原的免疫反应))更少量的一种或多种治疗性试剂(例如，一种或多种预防性试剂或治疗性试剂)和/或更低频率地给予所述治疗性试剂。使用较低剂量的治疗(例如，预防性试剂或治疗性试剂)和/或施用治疗性试剂的频率减少能够降低与给予个体所述治疗性试剂相关的毒性，但不降低所述治疗性试剂预防或治疗不适(例如，猪流感病毒感染或其相关的不适、猪流感病毒感染外的其它感染和与其相关的不适、或者IFN可治疗性疾病或不适(其中所述减毒猪流感病毒可作为载体来诱导针对与该不适相关的特定抗原的免疫反应))的效力。此外，协同作用可提高治疗(例如，预防性试剂或治疗性试剂)预防或治疗不适(例如，猪流感病毒感染或与其相关的不适、猪流感病毒感染外的其它感染和与其相关的不适、或者IFN可治疗性疾病或不适(其中所述减毒猪流感病毒可作为载体来诱导针对与该不适相关的特定抗原的免疫反应))的效力。最后，治疗(例如，预防性试剂或治疗性试剂)组合的协同作用可避免或减少与使用任何单一治疗性试剂相关的不良反应或不期望的副作用。

这里所用术语“T细胞受体调节剂”指调节T细胞受体磷酸化、与T细胞受体相关的信号转导途径的活化和/或特定蛋白质例如细胞因子的表达的试剂。这种试剂可直接或间接地调节T细胞受体的磷酸化、与T细胞受体相关的信号转导途径的活化和/或特定蛋白质例如细胞因子的表达。T细胞受体调节剂的实例包括但不限于与T细胞受体免疫特异性结合的肽、多肽、蛋白质、融合蛋白和抗体或其片段。此外，T细胞受体调节剂的实例包括但不限于与T细胞受体的配体免疫特异性结合的蛋白质、肽、多肽(例如，可溶性T细胞受体)，融合蛋白和抗体或其片段。

这里所用术语“治疗有效量的”指治疗的量，该量足以减少不适(例如，猪流感病毒感染或与其相关的不适(例如，流感导致的流产、抑郁、食欲不振、厌食、呼吸困难、肌痛、下颌下淋巴结肿大)、猪流感病毒感染外的其它感染或其相关的不适或症状、IFN可治疗性疾病或不适(其中所述减毒猪流感病毒可作为载体来诱导针对与该不适相关的特定抗原的免疫反应))的严重程度，缩短不适(例如，猪流感病毒感染或与其相关的不适、猪流感病毒感染外的其它感染或与其相关的不适或症状、或者IFN可治疗性疾病或不适(其中所述减毒猪流感病毒可作为载体来诱导针对与该不适相关的特定抗原的免疫反应))的持续时间，降低猪流感病毒或其它病毒的滴度，减少其它病原体的数量，改善不适(例如，猪流感病毒感染或与其相关的不适、猪流感病毒感染外的其它感染或与其相关的不适或症状、或者IFN可治疗性疾病或不适(其中所述减毒猪流感病毒可作为载体来诱导针对与该不适相关的特定抗原的免疫反应))的一种或多种症状，防止不适(例如，猪流感病毒感染或与其相关的不适，猪流感病毒感染外的其它感染或与其相关的不适或症状，或者IFN可治疗性疾病或不适(其中所述减毒猪流感病毒可作为载体来诱导针对与该不适相关的特定抗原的免疫反应))的发展，使不适(例如，猪流感病毒感染或与其相关的不适、猪流感病毒感染外的其它感染或与其相关的不适或症状、或者IFN可治疗性疾病或不适(其中所述减毒猪流感病毒可作为载体来诱导针对与该不适相关的特定抗原的免疫反应))康复，或者增强或改善另一种治疗性试剂的治疗效果。

这里所用术语“治疗”可以是任何能够用于预防、治疗、控制或改善不适(例如，猪流感病毒感染或与其相关的不适、猪流感病毒感染外的其它感染或与其相关的不适或症状、或者IFN可治疗性疾病或不适(其中所述减毒猪流感病毒可作为载体来诱导针对与该不适相关的具体抗原的免疫反应))的方案、方法、组合物、剂型和/或试剂。在某些实施方案中，所用术语“治疗”指所属本领域技术人员公知用于预防、治疗、控制或改善猪流感病毒感染或与其相关的不适或症状、猪流感病毒感染外的其它感染或与其相关的不适或症状、IFN可治疗性疾病或不适(其中该减毒猪流感病毒可作为载体来诱导针对与该不适相关的特定抗原的免疫反应)的生物治疗、支持治疗和/或其它治疗。

这里所用术语“治疗”指任何用于预防、治疗、控制或改善不适或其症状(例如，猪流感病毒感染或与其相关的不适或症状、猪流感病毒感染外的其它感染和与其相关的不适或症状、IFN可治疗性疾病或不适(其中所述减毒猪流感病毒可作为载体来诱导针对与该不适相关的特定抗原的免疫反应)的试剂。优选地，治疗性试剂是已知可以用于、或已被用于或正在用于预防、治疗、控制或改善猪流感病毒感染或与其相关的不适或症状、猪流感病毒感染外的其它感染或与其相关的不适或症状、IFN可治疗性疾病或不适(其中该减毒猪流感病毒可作为载体来诱导针对与该不适相关的特定抗原的免疫反应)的试剂。

这里所用术语“处理”指通过给予一种或多种治疗(包括但不限于，给予一种或多种预防性试剂或治疗性试剂)根除或控制猪流感病毒的复制或非猪流感病毒病原体(例如，病毒)的复制、降低猪流感病毒或猪流感病毒外其它病毒的复制、降低病原体的数量、降低或改善不适(猪流感病毒感染或与其相关的不适、猪流感病毒感染外的其它感染和与其相关的不适或症状、IFN可治疗性疾病或不适(其中所述减毒猪流感病毒可作为载体来诱导针对与该不适相关的特定抗原的免疫反应))的进展、严重程度和/或持续时间，或者改善一种或多种症状。

这里所用术语“肿瘤抗原”指可被免疫T细胞或抗体识别的肿瘤细胞上的分子。肿瘤抗原包括那些仅在肿瘤细胞上表达的抗原(肿瘤特异性抗原)以及在正常细胞上存在但在肿瘤细胞上优势或异常表达的的分子(肿瘤相关抗原)。肿瘤抗原的实例包括但不限于肉瘤抗原、前列腺癌抗原、纤维肉瘤抗原、自主分化抗原例如癌胚抗原、或由恶性细胞表达的分化抗原包括但不限于癌胚抗原例如结肠癌胚抗原(CEA)、甲胎蛋白、移行细胞膀胱癌175kDa小鼠抗原的人抗原性对应物或功能等同物、黑素瘤相关抗原p97或GD3，以及人肺癌分化抗原例如L6和L20。

这里所用短语“野生型猪流感病毒”指流行的、天然循环的并引起典型疾病爆发的猪病毒类型。野生型猪流感病毒的实例包括但不限于A/Swine/Colorado/1/77、A/Swine/Colorado/23619/99、A/Swine/Coted′Armor/3633/84、A/Swine/Cote d′Armor/3633/84、A/Swine/England/195852/92、A/Swine/Finistere/2899/82、A/Swine/Hong Kong/10/98、A/Swine/Hong Kong/9/98、A/Swine/Hong Kong/81/78、A/Swine/Illinois/100084/01、A/Swine/Illinois/100085A/01、A/Swine/Illinois/21587/99、A/Swine/Indiaha/1726/88、A/Swine/Indiana/9K035/99、A/Swine/Indiaha/P12439/00、A/Swine/Iowa/30、A/Swine/Iowa/15/30、A/Swine/Iowa/533/99、A/Swine/Iowa/569/99、A/Swine/Iowa/3421/90、A/Swine/Iowa/8548-1/98、A/Swine/Iowa/930/01、A/Swine/Iowa/17672/88、A/Swine/Italy/1513-1/98、A/Swine/Italy/1523/98、A/Swine/Korea/CY02/02、A/Swine/Minnesota/55551/00、A/Swine/Minnesota/593/99、A/Swine/Minnesota/9088-2/98、A/Swine/Nebraska/1/92、A/Swine/Nebraska/209/98、A/Swine/Nethe rlands/12/85、A/Swine/North Carolina/16497/99、A/Swine/North Carolina/35922/98、A/Swine/NorthCarolina/93523/01、A/Swine/North Carolina/98225/01、A/Swine/Oedenrode/7C/96、A/Swine/Ohio/891/01、A/Swine/Oklahoma/18717/99、A/Swine/Oklahoma/18089/99、A/Swine/Ontario/01911-1/99、A/Swine/Ontario/01911-2/99、A/Swine/Onta-rio/41848/97、A/Swine/Ontario/97、A/Swine/Quebec/192/81、A/Swine/Quebec/192/91、A/Swine/Quebec/5393/91、A/Swine/Taiwan/7310/70、A/Swine/Tenne-ssee/24/77、A/Swine/Texas/4199-2/98、A/Swine/Wisconsin/125/97、A/Swine/Wisc-onsin/136/97、A/Swine/Wisconsin/163/97、A/Swine/Wisconsin/164/97、A/Swine/Wisconsin/166/97、A/Swine/Wisconsin/168/97、A/Swine/Wisconsin/235/97、A/Swine/Wisconsin/238/97、A/Swine/Wisconsin/457/98、A/Swine/Wisconsin/458/98、A/Swine/Wisconsin/464/98及A/Swine/Wisconsin/14094/99。

4.附图说明

图1A-1B，含NS1突变蛋白的质粒衍生的Sw/Tx/98流感病毒的生成。图1A为野生型和突变的NS流感病毒基因片段的示意图。NS基因片段被修饰从而产生分别编码73、99和126aa的突变NS1基因。NS1突变不影响NEP蛋白的序列。下划线序列被引入形成终止密码子(粗体)。图1B为rWT和NS1缺失突变病毒的RT-PCR分析。利用对所有8个流感病毒片段非编码区特异的引物来扩增流感病毒RNA片段。箭头所指显示NS片段变短。点显示由于内部结合正向引物生成的对应于HA基因片段3′末端的产物。

图2A-2D，组织培养物中质粒衍生的野生型和NS1突变的Sw/TX/98病毒的表征。图2A显示在PK-15细胞中野生型和NS1缺失突变株的多周期生长曲线。图2B显示在PK-15细胞中野生型和NS1缺失突变株的单周期生长曲线。图2C显示感染后3天MDCK细胞中的空斑大小。图2D显示病毒蛋白表达的时间过程。在所指示的感染后时间，用rWT和NS1突变的病毒感染(MOI＝2)PK-15细胞并用[³⁵S]Met-Cys标记。将细胞提取物进行SDS-PAGE并通过放射自显影来分析。

图3A-3C，在质粒衍生的野生型和NS1突变的Sw/TX/98病毒感染的PK-15细胞中诱导I型IFN。图3A显示在荧光分析中感染了病毒的细胞分泌IFN的IFN生物分析水平示意图。图3B显示I型IFN合成的时间过程。新鲜的PK-15细胞用UV-灭活的上清液(在感染后不同时间收集)处理24小时，该上清液来自被病毒感染随后用VSV-GFP感染的PK-15细胞。感染后16小时，用荧光显微镜观察表达GFP的细胞，IFN和TNF-α的诱导。图3C显示病毒感染的PK-15细胞中TNF-α、IFN-β-和β-actin-特异性mRNA的RT-PCR分析。

图4A-4C，质粒衍生的野生型和NS1突变的Sw/TX/98病毒感染4周龄猪。图4A显示被质粒衍生的TX/98缺失病毒感染的猪肺组织病理学评分的条形图。在感染后第5天，具有肉眼可见损伤的肺表面的平均百分比(±SEM)。图4B显示在感染后第5天，中细支气管的显微损伤。图4C显示在感染后第5天，支气管肺泡灌洗液的病毒滴度。

图5A-5D，质粒衍生的野生型和NS1突变的Sw/TX/98病毒感染的猪的肺组织病理学检验，200x放大。图5A显示非感染对照猪肺的中等大小细支气管。上皮层完整，周围的肺泡正常。图5B显示由rWT TX/98病毒感染导致的严重急性坏死性细支气管炎和以广泛病灶为特征的间质性肺炎。图5C显示缺失突变株1-99病毒感染早期恢复中的一个正常细支气管和一个损伤细支气管，代表由该病毒感染导致的损伤程度较低。图5D显示1-126病毒接种的猪的肺正常细支气管和周围肺泡。该病毒不导致病灶。

图6A-D，质粒衍生的野生型和NS1突变的Sw/TX/98病毒感染的猪的肺组织病理学检验，200x放大。图6A显示未感染的对照猪肺的较大细支气管上皮层。上皮细胞为高柱状，具有假复层基底核和突出的表面纤毛。图6B显示TX/98rWT病毒感染猪肺的较大细支气管上皮层。由于上皮细胞坏死和再生性增生导致上皮层完全混乱。图6C显示缺失突变株1-99病毒感染的猪的肺大细支气管和较小支气管气道，表示由该病毒导致的损伤程度较低。图6D显示1-126病毒接种的猪的肺正常上皮层。不产生细支气管损伤。

图7，TX/98/del 126预防免疫的猪的组织病理学。图7显示预防免疫了TX/98/del 126的猪的肺组织病理学评分。对照＝未预防免疫、模拟注射的猪；H3N2＝给每只未预防免疫的猪接种2x10⁵ PFU A/Swine/Texas/4199-2/98；H1N1＝给每只未预防免疫的猪接种2x10⁵PFU A/Swine/MN/37866/99；MLV+对照＝用TX/98/del126预防免疫的，模拟接种的猪；MLV+H3N2＝给每只TX/98/del 126预防免疫的猪接种2x10⁵ PFU A/Swine/Texas/4199-2/98；MLV+H1N1＝给每只TX/98/del  126预防免疫的猪接种2x10⁵PFUA/Swine/MN/37866/99。

图8：TX/98/del 126-预防免疫的猪的SIV-抗原免疫组织化学。图8显示描述TX/98/del126预防免疫的猪的免疫组织化学评分条形图。对照＝未预防免疫的、模拟接种的猪；H3N2＝给未预防免疫的每只猪接种2x10⁵PFUA/Swine/Texas/4199-2/98；H1N1＝给未预防免疫的每只猪接种2x10⁵PFUA/Swine/MN/37866/99；MLV+对照＝用TX/98/del126预防免疫的、模拟接种的猪；MLV+H3N2＝给TX/98/del126预防免疫的每只猪接种2x10⁵PFU的A/Swine/Texas/4199-2/98；MLV+H1N1＝给TX/98/del126预防免疫的每只猪接种2x10⁵PFU的A/Swine/MN/37866/99。

图9：用H3N2和H1N1SIV感染TX/98/del 126免疫了的猪的肺灌洗液中病毒滴度。图9显示描述TX/98/del 126免疫了的猪的肺灌洗液中病毒滴度的条形图。对照＝未预防免疫的、假接种的猪；H3N2＝给未预防免疫的每只猪接种2x10⁵PFU的A/Swine/Texas/4199-2/98；H1N1＝给未预防免疫的每只猪接种2x10⁵PFU的A/Swine/MN/37866/99；MLV+对照＝用TX/98/del126预防免疫的、模拟接种的猪；MLV+H3N2＝给TX/98/del126预防免疫的每只猪接种2x10⁵PFU的A/Swine/Texas/4199-2/98；MLV+H1N1＝给TX/98/del126预防免疫的每只猪接种2x10⁵PFU的A/Swine/MN/37866/99。病毒的检测限度为10^1.5TCID₅₀/ml。

5.发明详述

本发明提供拮抗细胞干扰素(IFN)反应的能力受损的减毒猪流感病毒、制备这种减毒猪流感病毒的方法，以及这种病毒在疫苗和药物制剂中的用途。这种疫苗能够产生免疫反应并产生免疫性，但不引起疾病或引起较少和/或不太严重的症状，即该病毒的毒力降低。因此它们是活病毒疫苗理想的候选者。此外，该减毒猪流感病毒可诱导有力的IFN反应，这种反应具有其它体内生物学后果，提供对抗后续感染性疾病的保护和/或诱导抗肿瘤反应。因此，该减毒猪流感病毒可以在药学上使用来预防和治疗其它感染性疾病和/或IFN可治疗性疾病。

本发明部分基于申请人的以下发现：工程化使NS1基因含有缺失的猪流感病毒相对于野生型猪流感病毒其复制受损，例如被感染的猪有较少肺损伤、在支气管肺泡灌洗液(BALF)中病毒滴度降低、鼻擦拭签检测到的病毒减少。惊奇的是，与观察到的小鼠模型中人流感病毒的结果相反，NS1蛋白的长度不与猪流感病毒的减毒水平相关。申请人发现，对于猪流感病毒，具有最短NS 1蛋白的突变病毒减毒最小。换言之，与NS1基因含有较长缺失的猪流感病毒或野生型猪流感病毒相比，NS 1基因含较短缺失的猪流感病毒表现较高的体内减毒。申请人进一步发现重组猪流感病毒体外抑制IFN产生的能力受损，并且它们在10天含胚鸡蛋、MDCK细胞、PK-15细胞或体内猪模型中不象其亲代重组株一样有效复制。不意欲受任何猪流感病毒NS1缺失突变株的体内作用机制的理论或解释的限制，推测这种病毒的减毒特征是由其NS1蛋白的表达水平、诱导有力的细胞IFN反应的能力、以及拮抗这种反应的能力受损所引起。然而，这种病毒的有益特征并不能单一地归因于其对细胞干扰素反应的作用。事实上，其它与NS1相关的活动(例如改变前mRNA剪接、抑制细胞mRNA聚腺苷酸化、抑制含poly(A)mRNA的核-胞浆转运、刺激病毒蛋白合成)的改变，可有助于通过在猪流感病毒NS1基因中引入突变来实现所需的减毒表型。

本发明减毒猪流感病毒包括猪流感NS1基因的突变，该突变减弱NS1基因产物拮抗细胞干扰素反应的能力。在一个实施方案中，本发明的减毒猪流感病毒包括含有猪流感病毒NS1基因突变的基因组，该突变减弱NS1基因产物拮抗细胞干扰素反应的能力，并且允许该减毒病毒以感染复数(MOI)为0.0005至0.001、0.001至0.01、0.01至0.1或0.1至1之间，或者MOI为0.0005、0.0007、0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5或6.0，在细胞(例如，人细胞(例如，PerC6，来自被腺病毒5的E1区转化的人胚胎视网膜母细胞的产病毒细胞株)、小鼠细胞、鸡细胞(例如，鸡胚胎成纤维细胞)、大鼠细胞、鸟细胞或猪细胞(例如，PK(D1)、PK(15)细胞、PK13细胞、NSK细胞、LLC-PK1细胞、LLC-PK1A细胞、ESK-4细胞、ST细胞、PT-K75细胞、PK-2a/CL 13或SJPL细胞))中生长到滴度比野生型猪流感病毒低约1至约100倍、约5至约80倍、约20至约80倍或约40至约80倍、约1至约10倍、约1至约5倍、约1至约4倍、约1至约3倍、约1至约2倍、或者约1、2、3、4、5、6、7、8、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100倍，这可以在相同增殖条件下，在感染后约2至10天、3至7天、3至5天，或者2、3、4、5、6、7、8、9、10天测定。减毒的和野生型猪流感病毒的滴度可利用本领域公知和本发明所述的任何技术来测定(例如，血细胞凝集试验、空斑试验、蛋感染剂量(EID50)、组织培养感染剂量(TCID50)等)，病毒可在本发明所述或本领域公知的条件下增殖(例如，在猪细胞、MDCK细胞(例如，在MEM、10％v/v胎牛血清(FCS)、1％青霉素/链霉素中，在37℃、5％CO₂的湿化培养箱中)或在含胚胎的鸡蛋中(例如，在静止培养箱中，在37℃、55％相对湿度下))。可选择地，可在无血清或低血清含量(例如，TPCK胰蛋白酶)培养基生长的细胞(例如，猪细胞、MDCK细胞等)中增殖病毒。在一个实施方案中，将本发明的减毒猪流感病毒的生长与具体的标准或参考比较，例如，与野生型猪流感病毒A/Swine/Texas/4199-2/98比较。

在具体实施方案中，本发明的减毒猪流感病毒包括含猪流感NS1基因突变的基因组，该突变减弱NS1基因产物拮抗细胞干扰素反应的能力，并且允许该减毒病毒以感染复数(MOI)为0.0005至0.001、0.001至0.01、0.01至0.1或0.1至1之间，或者MOI为0.0005、0.0007、0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5或6.0，在猪细胞中生长到滴度比野生型猪流感病毒低约1至约100倍、约5至约80倍、约20至约80倍或约40至约80倍、约1至约10倍、约1至约5倍、约1至约4倍、约1至约3倍、约1至约2倍、或者约1、2、3、4、5、6、7、8、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100倍，这可以在相同增殖条件下，在感染后约2至10天、3至7天、3至5天，或者2、3、4、5、6、7、8、9、10天测定。减毒的和野生型猪流感病毒的滴度可利用本领域公知和本发明所述的任何技术来测定(例如，血细胞凝集试验、空斑试验、蛋感染剂量(EID50)、组织培养感染剂量(TCID50)等)，病毒可在本发明所述或本领域公知的条件下增殖(例如，在猪细胞、MDCK细胞(例如，在MEM、10％v/v胎牛血清(FCS)、1％青霉素/链霉素中，在37℃、5％CO₂的湿化培养箱中)或在含胚胎的鸡蛋中(例如，在静止培养箱中，在37℃、55％相对湿度下))。可选择地，可在无血清或低血清含量(例如，TPCK胰蛋白酶)培养基生长的细胞(例如，猪细胞、MDCK细胞等)中增殖病毒。

具有所需表型的减毒猪流感病毒本身可做为疫苗、药物制剂或免疫原性制剂的活性成分。可选择地，该减毒猪流感病毒可用作重组制备疫苗或免疫原性制剂的载体或“骨架”。为此，“反向遗传学”可用来在作为“亲代”株的减毒猪流感病毒中进行工程化突变或引入外源抗原决定簇。以这种方式，疫苗可以被设计成针对病毒株变体进行免疫，或者可供选择地针对完全不同的感染因子或疾病抗原(例如，肿瘤抗原)进行免疫。例如，该减毒猪流感病毒可被工程化以表达其它预先选定的病毒株的中和性抗原表位。可选择地，其它病毒的抗原决定簇可被构建到该减毒猪流感病毒中。可选择地，非病毒感染病原体(例如，寄生虫、细菌、真菌)的抗原决定簇抗能够被构建到该猪流感病毒中。

本发明提供包括给予本发明疫苗制剂以预防免疫个体的方法。在一个实施方案中，本发明提供了包括给予个体有效量的本发明疫苗制剂的方法。在某些实施方案中，给予个体的疫苗制剂剂量为约10²至约10⁸pfu、约10³至约10⁷pfu或约10⁴至约5x 10⁶pfu。在其它实施方案中，所给予的疫苗制剂剂量为10²、5×10²、10³、5×10³、10⁴、5×10⁴、10⁵、5×10⁵、10⁶、5×10⁶、10⁷、5×10⁷或10⁸pfu。在其它实施方案中，给予个体的本发明免疫原性制剂的剂量为约10²至约10⁸pfu、约10³至约10⁷pfu或约10⁴至约5x 10⁶pfu。在另外一些实施方案中，给予个体的本发明免疫原性制剂的剂量为10²、5×10²、10³、5×10³、10⁴、5×10⁴、10⁵、5x 10⁵、10⁶、5×10⁶、10⁷、5×10⁷或10⁸pfu。在具体实施方案中，所述个体为驴、斑马、骆驼、狗、鸟(例如，鸭子)。在优选的实施方案中，所述个体为猪。

本发明提供了包含本发明的减毒猪流感病毒的免疫原性制剂和包括给予个体本发明免疫原性制剂来诱导免疫反应，以治疗、控制或预防猪流感病毒感染或与其相关的不适或症状、猪流感病毒感染以外的其它感染或与其相关的不适或症状、或者下述不适(该减毒猪流感病毒可用作载体来诱导针对与该不适相关的特定抗原的免疫反应)的方法。在一个实施方案中，本发明提供包括给予个体有效量的本发明免疫原性制剂来诱导免疫反应，以治疗、控制或预防猪流感病毒感染或与其相关的不适或症状、猪流感病毒感染以外的其它感染或与其相关的不适或症状、或者下述不适(该减毒猪流感病毒可用作载体来诱导针对与该不适相关的特定抗原的免疫反应)的方法。在某些实施方案中，给予个体的本发明免疫原性制剂的剂量为约10²至约10⁸pfu、约10³至约10⁷pfu或约10⁴至约5x 10⁶pfu，或者约10⁴至约10⁷pfu。在其它实施方案中，给予个体的本发明免疫原性制剂的剂量为10²、5×10²、10³、5×10³、10⁴、5×10⁴、10⁵、5×10⁵、10⁶、5×10⁶、10⁷、5×10⁷或10⁸pfu。在具体实施方案中，所述个体为驴、斑马、骆驼、狗、鸟(例如，鸭子)。在优选的实施方案中，所述个体为猪。

在个体中诱导有力的IFN反应的减毒猪流感病毒也可用于药物制剂中，以预防或治疗其它感染或IFN可治疗性疾病例如癌症。在这方面，可以改变该减毒猪流感病毒的趋向性，将病毒在体内施用(in vivo)或体外转移再回输(ex vivo)使之靶向所期望的靶器官、组织或细胞。利用此方法，可在靶点局部诱导IFN反应，从而避免系统性IFN治疗的副作用或使之最小化。为此目的，可将该减毒猪流感病毒工程化以表达对靶器官、组织或细胞受体特异的配体。

本发明提供包括给予本发明药物制剂来预防、控制或治疗个体的猪流感病毒感染以外的其它感染、或者不是由猪流感病毒引起的IFN-可治疗性疾病、或者由猪流感病毒引起的IFN-可治疗性疾病的方法。在一个实施方案中，本发明提供包括给予有效量的本发明药物制剂来预防、控制或治疗个体的猪流感病毒感染以外的其它感染、或者不是由猪流感病毒引起的IFN-可治疗性疾病、或者由猪流感病毒引起的IFN-可治疗性疾病的方法。在某些实施方案中，给予个体的药物制剂剂量为约10²至约10⁸pfu、约10³至约10⁷pfu、约10⁴至约5x 10⁶pfu、或约10⁴至约10¹²pfu。在其它实施方案中，给予个体药物制剂的剂量为10²、5×10²、10³、5×10³、10⁴、5×10⁴、10⁵、5×10⁵、10⁶、5×10⁶、10⁷、5×10⁷、10⁸、5×10⁸、1×10⁹、5×10⁹、1×10¹⁰、5×10¹⁰、1×10¹¹、5×10¹¹或10¹²pfu。在具体实施方案中，所述个体为驴、斑马、骆驼、狗、鸟(例如，鸭子)。在优选的实施方案中，所述个体为猪。

本发明提供包括给予本发明药物制剂以预防、控制或治疗个体癌症的方法。在一个实施方案中，本发明提供包括给予有效量的本发明药物制剂以预防、控制或治疗个体癌症的方法。在某些实施方案中，给予个体药物制剂的剂量为约10²至约10⁸pfu、约10³至约10⁷pfu、约10⁴至约5x 10⁶pfu或约10⁴至约10¹²pfu。在其它实施方案中，给予个体药物制剂的剂量为10²、5×10²、10³、5×10³、10⁴、5×10⁴、10⁵、5×10⁵、10⁶、5×10⁶、10⁷、5×10⁷、10⁸、5×10⁸、1×10⁹、5×10⁹、1×10¹⁰、5×10¹⁰、1×10¹¹、5×10¹¹或10¹²pfu。

申请人已经证明，干扰素拮抗活性受损的减毒猪流感病毒在体内复制产生的滴度低于用野生型猪流感病毒所测得的滴度，但该滴度足以诱导免疫的和细胞因子反应。因此，减弱但不消除该猪流感病毒的IFN拮抗活性的突变对于疫苗制剂是优选的。可选择这样的病毒在常规和非常规培养基中生长，并具有中等毒力。

本发明提供含有(或者，包含)本发明猪流感病毒的细胞。在具体实施方案中，细胞含有/包含遗传工程化的猪流感病毒。在某些实施方案中，细胞中含有的减毒猪流感病毒被工程化以编码来自另一病毒的抗原决定簇或肿瘤抗原。根据此实施方案，该减毒猪流感病毒的基因组可以包括至少一个来自不同病毒的片段。任何细胞都可以含有或包含本发明减毒猪流感病毒，或被该病毒感染，这些细胞包括但不限于：MDCK细胞、PK细胞、Vero细胞、原代人脐带静脉内皮细胞(HUVEC)、H292人上皮细胞株、HeLa细胞和猪胚胎肾细胞RES。在优选的实施方案中，所述细胞为猪细胞或猪细胞株。在某些实施方案中，所述细胞(例如，猪细胞或猪细胞株)为干扰素缺陷的。

本发明包括用培养基例如细胞、细胞株和含胚蛋来增殖本发明的减毒猪流感病毒。在一个实施方案中，本发明提供制备疫苗、免疫原性制剂和药物制剂的方法，包括在培养基中增殖本发明的减毒猪流感病毒，并收集子代病毒，其中培养基为细胞、细胞株或含胚蛋。在某些实施方案中，培养基为IFN缺陷系统。示例性的IFN缺陷系统包括但不限于早期含胚蛋(例如，6-10天、6-9天、6-8天或6-7天龄的含胚蛋)、IFN缺失的细胞株(例如VERO细胞或遗传工程化细胞株例如STAT1敲除的细胞)。含胚蛋或用抑制IFN系统的化合物(包括药物、抗体、反义核酸、核酶等)预处理的细胞株也可用作IFN缺陷系统。此外，IFN系统缺陷的蛋，例如由STAT1阴性的鸟特别是家禽包括但不限于转基因鸡、鸭或火鸡生的蛋，可用作IFN缺陷系统。

5.1IFN拮抗活性改变的突变株的产生

根据本发明，可选择并使用任何IFN拮抗活性降低的突变猪流感病毒或病毒株。在一个实施方案中，可选择拮抗细胞IFN反应的能力受损的天然存在的突变株或变体、或自然发生的猪流感病毒突变株。在另一实施方案中，可以通过将病毒暴露于诱变剂例如紫外线辐射或化学诱变剂、或者通过多次传代和/或在非许可宿主中传代产生突变的猪流感病毒。可在差异生长系统中筛选来选择IFN拮抗剂功能受损的那些突变株。因为A型猪流感病毒具有分段基因组，通过重组可将该减毒表型转移至具有所需抗原的另一株中(即，通过减毒病毒和所需株的共感染，并选择表现两种表型的重组体)。在具体实施方案中，本发明的猪流感病毒并非天然存在的病毒。在另一具体实施方案中，本发明的猪流感病毒为遗传工程化病毒。在另一具体实施方案中，本发明不包括在NS1基因中具有天然发生的突变的猪流感病毒。在另一实施方案中，本发明不包括在NS1基因中有突变的已知猪流感病毒。在具体实施方案中，本发明的猪流感病毒包含来自人流感病毒的全部和部分NS1基因。

利用“反向遗传学”方法可将突变工程化到猪流感病毒中。以此方式，赋予减毒表型的天然的或其它突变可被工程化到疫苗株中。例如，可以通过工程化实现猪流感病毒IFN拮抗活性的基因编码区(即，猪流感病毒的NS1)的缺失、插入和取代。也可考虑猪流感病毒IFN拮抗活性的基因非编码区的缺失、插入和取代。为此，可工程化使那些负责转录、复制、多聚腺苷酸化和/或包装IFN拮抗活性基因的信号发生突变。这种突变(例如启动子的突变)可下调猪流感病毒IF拮抗活性基因的表达。可使启动子发生突变，例如通过启动子穿梭(promotershuffling)(例如，B型流感病毒启动子))突变，或在NS1基因的非编码区发生突变。可调节猪流感病毒IFN拮抗活性基因的表达(即，猪流感病毒NS1基因)的猪流感病毒基因突变也在可用于本发明的病毒范围内。

本发明还提供包括包含NS 1基因片段突变的基因组的猪流感病毒，该突变可以不导致IFN拮抗活性改变或IFN诱导表型，但引起病毒功能改变和减毒表型，例如，改变对含poly(A)的mRNA核输出的抑制、改变对前mRNA剪接的抑制、通过dsRNA螯合(sequestering)改变对PKR活化的抑制、对病毒RNA翻译作用的改变、和改变对宿主mRNA多聚腺苷酸化的抑制(例如，参见Krug inTextbook of Influenza，Nicholson等编.1998，82-92，以及其中引用的文献)。

反向遗传学技术涉及制备合成的重组病毒RNA，该重组RNA包含猪流感病毒RNA的非编码区，该非编码区对病毒聚合酶的识别和产生成熟病毒体所需的包装信号是必需的。从重组DNA模板合成重组RNA并与纯化的病毒聚合酶复合体在体外重建来形成重组核蛋白(RNP)，该核蛋白可用于转染细胞。如果在转录体外或者体内合成的RNA时存在病毒聚合酶蛋白，会实现更有效的转染。合成的重组RNP可被恢复至感染性病毒颗粒中。上述技术公开在1992年11月24日批准的美国专利第5,166,057号；1998年12月29日批准的美国专利第5,854,037号；1996年2月20日公开的欧洲专利公开EP 0702085A1；美国专利申请系列号09/152,845；1997年4月3日公开的PCT国际专利公开WO97/12032；1996年11月7日公开的WO96/34625；欧洲专利公开EP-A780475；1999年1月21日公开的WO 99/02657；1998年11月26日公开的WO 98/53078；1998年1月22日公开的WO 98/02530；1999年4月1日公开的WO 99/15672；1998年4月2日公开的WO 98/13501；1997年2月20日公开的WO 97/06270；以及1997年6月25日公开的EPO 780475A1中，本发明将上述每一篇全部引入作为参考。

也可采用无辅助质粒技术来工程化减毒猪流感病毒。对于无辅助质粒技术的描述参见，例如国际专利公开WO 01/04333；美国专利第6,649,372号；Fodor等，1999，J.Virol.73：9679-9682；Hoffmann等，2000，Proc.Natl.Acad.Sci.USA97：6108-6113；及Neumann等，1999，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96：9345-9350，本发明将这些文献全部引入作为参考。

反向遗传学方法或无辅助质粒技术产生的减毒病毒可用于本发明所述的疫苗、免疫原性制剂和药物制剂。反向遗传学技术或无辅助质粒技术也可用于将其它突变工程化到对疫苗制剂、免疫原性制剂和药物制剂重要的其它病毒基因中，即，有用的疫苗株变体的抗原决定簇可被工程化到减毒猪流感病毒中。可选择地，完全外源的抗原决定簇，包括来自其它病毒或非病毒病原体的抗原可被工程化到减毒株中。例如，非相关病毒的抗原、寄生虫抗原、细菌或真菌抗原或肿瘤抗原可被工程化到减毒株中，例如猪增殖和呼吸综合征病毒、猪巨细胞病毒、猪呼吸道冠状病毒、猪脑心肌炎病毒、猪流行性腹泻病毒的抗原决定簇；以及非病毒病原体的抗原显性基因，例如细菌包括但不限于布鲁氏菌(Brucella suis)和寄生虫包括但不限于蛔虫(Ascaris suum)、鞭虫(Trichuris suis)的抗原决定簇；或肿瘤抗原例如癌胚抗原(CEA)、乳腺癌抗原例如EGFR(上皮生长因子受体)、HER2抗原(p185^HER2)、HER2neu抗原决定簇、癌抗原-50(CA-50)、与乳腺癌相关的癌抗原15-3(CA15-3)、癌症相关抗原(CAA)、黑素瘤抗原以及黑素瘤相关抗原100、25和150)。可供选择地，体内改变病毒趋向性(tropism)的抗原决定簇可被工程化到本发明的嵌合减毒病毒中。

在具体实施方案中，可以联合使用反向遗传学技术或无辅助质粒技术和重组技术对具有猪流感病毒所需抗原决定簇的减毒病毒进行工程化。例如，减毒猪流感病毒(通过例如反向遗传学技术、无辅助质粒技术或其组合生成的)和携带所需疫苗抗原决定簇的株(通过例如自然选择、诱导突变、通过反向遗传学技术、无辅助质粒技术或其组合生成的)可被共转染至允许分段基因组重组的宿主。可以随后选择既表现减毒表型又表现所需抗原决定簇的重组体。在具体实施方案中，可使用重组技术从亲代猪流感病毒株(天然突变株、诱导突变的病毒或遗传工程化病毒)中将减毒表型转移至不同病毒株(野生型病毒、天然突变株、诱导突变的病毒或遗传工程化病毒)。

在具体实施方案中，本发明提供包含猪流感病毒NS1基因含有突变的基因组的减毒猪流感病毒，该突变降低NS1基因产物拮抗细胞干扰素反应的能力。根据此实施方案，该减毒猪流感病毒优选被遗传工程化。

本发明的减毒猪流感病毒可具有以下特征中的一种或多种或以下特征的任意组合：通过标准的干扰素分析测定，诱导干扰素活性的能力水平比野生型猪流感病毒(例如A/Swine/Texas/4199-2/98)低例如，5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或98％；当在相同的条件下生长时(例如，以MOI为0.0001、0.0005、0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1、5或10接种，在PK细胞、PK(D1)细胞、PK(15)细胞、PK13细胞、NSK细胞、LLC-PK1细胞、LLC-PK1A细胞、ESK-4细胞、ST细胞、PT-K75细胞、PK-2a/CL 13细胞或SJPL细胞中生长，并在MDCK细胞中分析)，病毒滴度比野生型猪流感病毒(例如A/Swine/Texas/4199-2/98)低1至50、2至25、2至10或者3至7倍；当从感染的猪BALF中分离、用MDCK细胞进行空斑试验时，病毒滴度比野生型猪流感病毒(例如，A/Swine/Texas/4199-2/98)低1至10倍、1至5倍、5-10倍、10至500倍、20至250、20至100或40至80倍；或者引起感染的猪肺损伤的能力降低。

在具体实施方案中，本发明的减毒猪流感病毒包含含有猪流感NS1基因的突变的基因组，该突变减弱NS1基因产物拮抗细胞干扰素反应的能力，并且允许该减毒病毒以感染复数(MOI)为0.0005至0.001、0.001至0.01、0.01至0.1或0.1至1之间，或者MOI为0.0005、0.0007、0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5或6.0，在细胞(例如，人细胞(例如，PerC6，来自被腺病毒5的E1区转化的人胚胎视网膜母细胞的产病毒细胞株)、小鼠细胞、鸡细胞(例如，鸡胚胎成纤维细胞)、大鼠细胞、鸟细胞或猪细胞(例如，PK(D1)细胞、PK(15)细胞、PK13细胞、NSK细胞、LLC-PK1细胞、LLC-PK1A细胞、ESK-4细胞、ST细胞、PT-K75细胞、PK-2a/CL 13或SJPL细胞))中生长到滴度比野生型猪流感病毒低约1至约100倍、约5至约80倍、约20至约80倍或约40至约80倍、约1至约10倍、约1至约5倍、约1至约4倍、约1至约3倍、约1至约2倍、或者约1、2、3、4、5、6、7、8、或约1、2、3、4、5、7、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100倍，这可以在感染后约2至10天、3至7天、3至5天，或者2、3、5、6、7、8、9、10天，通过对猪BALF或猪细胞上清液进行血细胞凝集试验测定，或者病毒在MDCK细胞产生蚀斑测定。在一个实施方案中，将本发明减毒猪流感病毒的生长与具体标准或参照比较，例如与野生型猪流感病毒A/Swine/Texas/4199-2/98比较。根据这些实施方案，减毒病毒可以被遗传工程化来含有或表达非猪流感病毒核酸序列，例如外源病原体或肿瘤抗原的抗原决定簇。优选地，该非猪流感病毒序列不包括改变病毒减毒表型的核酸序列。因此，不将编码具有干扰素拮抗活性的蛋白、多肽或肽的核酸序列工程化到猪流感病毒中。

本发明提供了包含在2、3、4或更多个猪流感病毒基因中含有至少2、至少3至少4种或更多突变的基因组的减毒猪流感病毒，其中这些突变中的至少1个位于NS 1基因，并有助于或导致(直接或间接)病毒减毒和/或病毒拮抗细胞干扰素反应的能力减弱。在具体实施方案中，本发明的减毒猪流感病毒包含在2、3、4或更多个猪流感病毒基因中含有至少2、至少3、至少4种或更多突变的基因组，其中这些突变中的至少1个位于NS 1基因中，并导致NS1基因产物拮抗细胞干扰素反应的能力减弱，并且使得该减毒病毒以MOI为0.0005至0.001、0.001至0.01、0.01至0.1或0.1至1之间，或者MOI为0.0005、0.0007、0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5或6.0时，在猪细胞中生长到滴度比野生型猪流感病毒(A/Swine/Texas/4199-2/98)低约1至约100倍、约5至约80倍、约20至约80倍或约40至约80倍、约1至约10倍、约1至约5倍、约1至约4倍、约1至约3倍、约1至约2倍、或者约1、2、3、4、5、6、7、8、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100倍，这可以在感染后约2至10天、3至7天、3至5天、或者2、3、5、6、7、8、9、10天，在相同增殖条件下，通过血细胞凝集试验测定。在另一实施方案中，本发明的减毒猪流感病毒包含在2个、3个、4个或更多个猪流感病毒基因中含有至少2、3、4种或更多突变的基因组，其中这些突变中的至少1个位于NS 1基因并导致该病毒的减毒，并且使得该减毒病毒以MOI为0.0005至0.001、0.001至0.01、0.01至0.1或0.1至1之间，或者MOI为0.0005、0.0007、0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5或6.0，在猪细胞中生长到滴度比野生型猪流感病毒(A/Swine/Texas/4199-2/98)低约1至约100倍、约5至约80倍、约20至约80倍或约40至约80倍、约1至约10倍、约1至约5倍、约1至约4倍、约1至约3倍、约1至约2倍、或者约1、2、3、4、5、6、7、8、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100倍，这可以在感染后约2至10天、3至7天、3至5天，或者2、3、5、6、7、8、9、10天，在相同增殖条件下(例如在MDCK细胞中)，通过血细胞凝集试验测定。根据这些实施方案，该减毒病毒具有受损的干扰素拮抗表型并且该病毒可以被遗传工程化来含有或表达非猪流感病毒核酸序列，例如外源病原体的抗原决定簇(例如，猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪巨细胞病毒、猪呼吸道冠状病毒、猪脑心肌炎病毒、猪流行性腹泻病毒的抗原决定簇，以及非病毒猪病原体的抗原决定簇，例如细菌和寄生虫)，或肿瘤抗原。优选地，所述非猪流感病毒序列(异源序列)不包括改变病毒减毒表型的核酸序列。因此，编码具有干扰素拮抗活性的蛋白、多肽和肽的核酸序列优选不被工程化到猪流感病毒中。

任何导致所需表型的突变(优选地，拮抗细胞干扰素反应的能力受损)都可以被引入猪流感病毒NS1基因中。可包括在或引入猪流感病毒NS1基因的突变类型的实例包括但不限于：缺失、替代、插入以及上述的组合。一种或多种突变可位于整个NS1基因的任意处(例如，氨基末端、羧基末端或之间的某些地方)和/或NS1基因的调控因子。在具体实施方案中，本发明的减毒猪流感病毒包含在氨基末端含有突变(例如，缺失或取代)的猪流感病毒NS1基因的基因组。在优选的实施方案中，本发明的减毒猪流感病毒包含在羧基末端含有突变(例如，缺失或取代，优选缺失)的猪流感病毒NS1基因的基因组。在另一实施方案中，本发明的减毒猪流感病毒包含在猪流感病毒NS1基因中含有突变的基因组，该突变导致自NS1羧基末端缺失5、优选10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、73、75、80、85、90、95、99、100、105、110、115、119、120、125、126、130、135、140、145、150、155、160、165、170或175个氨基酸残基，或者自NS1羧基末端缺失5-170、25-170、50-170、100-170、100-160或105-160氨基酸残基。在另一实施方案中，本发明的减毒猪流感病毒包含在猪流感病毒NS1基因中含突变的基因组，该突变导致除了氨基酸残基1-126、氨基酸残基1-120、氨基酸残基1-115、氨基酸残基1-110、氨基酸残基1-100、氨基酸残基1-99、氨基酸残基1-95、氨基酸残基1-85、氨基酸残基1-80、氨基酸残基1-75、氨基酸残基1-73、氨基酸残基1-70、氨基酸残基1-65或氨基酸残基1-60外(其中氨基末端氨基酸为序号1)，其它所有氨基酸残基都缺失。根据这些实施方案，减毒猪流感病毒优选是遗传工程化的。在优选的实施方案中，本发明的减毒猪流感病毒为TX/98/del 126、TX/98/del 99或TX/98/del 73。在更优选的实施方案中，该减毒的猪流感病毒是TX/98/del 126。在更加优选的实施方案中，该减毒的猪流感病毒是TX/98/del 99。

本发明的减毒猪流感病毒可以是表达异源序列例如其它疫苗株的抗原的嵌合病毒(例如，利用反向遗传学、重组或无辅助质粒技术)。可选择地，可以利用反向遗传学、重组或无辅助物质粒技术对该减毒流感病毒进行遗传工程化，来表达全外源的抗原决定簇，例如其它感染性病原体的抗原、肿瘤抗原或靶向抗原。在某些实施方案中，该减毒猪流感病毒表达来自其它猪感性因子、非猪感染性因子、猪或其它类型的肿瘤抗原(例如，癌胚抗原(CEA)、乳腺癌抗原例如EGFR(上皮生长因子受体)、HER2抗原(p185HER2)、HER2neu抗原决定簇、癌抗原-50(CA-50)、癌抗原15-3(CA15-3)、乳腺癌相关抗原、癌症相关抗原(CAA)、黑素瘤抗原，以及黑素瘤相关抗原100、25和150)。在其它实施方案中，本发明的减毒猪流感病毒可包含来自另一种病毒的片段。因为NS RNA片段在所述8种病毒RNA中是最短的，与其它病毒基因相比，NS RNA可能会包容更长异源序列的插入。再者，所述NS RNA片段指导被感染细胞中高水平蛋白的表达，表明其可以是外源抗原插入的理想片段。示例性序列包括猪增殖和呼吸综合征病毒、猪巨细胞病毒、猪呼吸道冠状病毒、猪脑心肌炎病毒、猪流行性腹泻病毒的抗原决定簇以及非病毒猪病原体(例如细菌包括但不限于布鲁氏菌，以及寄生虫包括但不限于蛔虫(Ascaris suum)、鞭虫(Trichuris suis)的抗原决定基。

优选地，该异源序列不是改变所述病毒减毒表型的核酸序列。因此，优选地，编码具有干扰素拮抗活性的蛋白、多肽、肽的核酸序列不被工程化到该猪流感病毒中。在某些实施方案中，该嵌合病毒表达肿瘤抗原。在其它实施方案中，该嵌合病毒表达外源病原体的抗原决定簇。

5.2减毒猪流感病毒的选择

本发明包括选择具有所需表型的猪流感病毒的方法，该病毒即减毒猪流感病毒或具有低IFN活性的(即，在相同的条件下与野生型猪流感病毒例如A/Swine/Texas/4199-2/98相比，降低5-10％、10-20％、20-30％、30-40％、40-50％、50-60％、60-70％、70-80％、80-90％或更多)或没有IFN拮抗活性的猪流感病毒，无论该猪流感病毒是否获自天然变体、自发变体(即，在病毒增殖中进化的变体)、诱导突变的天然变体、重组体和/或遗传工程化的病毒(参见例如，美国专利第6,635,416号)。在差异生长试验中可以最好地筛选这种病毒，该试验比较病毒在IFN缺失和有IFN活性的宿主系统中的生长。选择在IFN缺失宿主系统中比有IFN活性的宿主系统中生长更好的病毒；优选地，选择与有IFN活性系统相比，在IFN缺陷系统中生长滴度高出至少1个对数、至少2个对数、至少3个对数、或1至50、1至25、1至20、1至10或1至5对数的病毒。IFN缺陷系统的实例包括但不限于，初期含胚卵(例如，6至10天、6至9天、6至8天或6至7天龄含胚卵)、IFN缺失细胞株(例如VERO细胞或遗传工程化的细胞株例如STAT1敲除、PKR敲除等)。用抑制IFN系统的化合物(包括药物、抗体、反义核酸、核酶等)预处理的含胚蛋或细胞株，也可用作IFN缺失的系统。此外，IFN系统缺陷的蛋，例如STAT1阴性的鸟特别是家禽(包括但不限于转基因鸡、鸭或火鸡)产的蛋可用作IFN缺陷系统。与6-7、6-8或6-9天龄的蛋相比，对在10天龄蛋中显示至少1至50、1至25、1至20、1至10或1至5指数滴度降低的减毒猪流感病毒可以认为其抑制IFN反应的能力减弱。

为了筛选的目的，可以用IFN短暂缺失的系统代替遗传操作系统。例如，可用抑制IFN生成和/或IFN反应组分的化合物(例如，药物、抗IFN抗体、抗IFN受体抗体、PKR抑制剂、反义分子和核酶等)来处理宿主系统。可在有IFN活性的未处理的对照与IFN缺失处理的系统中比较减毒猪流感病毒的生长。

可以在例如表达IFN和IFN反应组分的多种细胞、细胞株或动物模型系统与IFN或IFN反应组分缺陷的细胞、细胞株或动物模型系统中比较猪流感病毒的生长(通过滴度测定)。可利用本领域公知的用于在细胞株中增殖病毒的技术(参见例如，下述工作实施例)。可以在有IFN活性的细胞株与IFN缺失的遗传工程化细胞株中比较猪流感病毒的生长。

可以利用IFN试验体系(例如，其中由IFN反应性启动子控制报告基因表达的基于转录的分析系统)筛选猪流感病毒。可检测感染细胞和未感染细胞中报告基因的表达来识别有效诱导IFN反应但不拮抗IFN反应的病毒。例如，在干扰素刺激性反应元件(例如，ISG-54K基因的IFN刺激性启动子)的控制下，可工程化测试细胞以瞬时或组成性地表达报告基因例如荧光素酶报告基因或氯霉素转移酶(CAT)报告基因(Bluyssen等，1994，Eur.J.Biochem.220：395-402)。用待检测的猪流感病毒感染细胞，并将报告基因的表达水平与未感染细胞或用野生型猪流感病毒感染的细胞比较。报告基因表达水平在待检测猪流感病毒感染后增加说明该猪流感病毒诱导IFN反应。可选择地，可以在待检测的减毒猪流感病毒感染后通过检测IFN依赖性转录的活化来确定对IFN反应的诱导。可以通过本领域公知的技术(例如，Northern印迹、Western印迹、PCR等)分析已知由IFN诱导的基因的表达(例如Mx、PKR、2-5-寡腺苷酸化合成酶、I类主要组织相容性复合体(MHC)等)。IFN反应的诱导也可通过检测用待检测猪流感病毒感染后IFN途径组分的磷酸化状态来确定(例如，IRF-3，其响应双链RNA而被磷酸化)。在对I型IFN响应中，Jak1激酶和TyK2激酶、IFN受体的亚单位、STAT1和STAT2被快速酪氨酸磷酸化。因此，为确定该猪流感病毒是否诱导IFN反应，用待检测的突变病毒感染细胞例如293细胞的细胞，感染后裂解该细胞。从该细胞裂解物的中利用特异性多克隆血清或抗体来免疫沉淀IFN途径组分，例如Jak1激酶或TyK2激酶，而且激酶的酪氨酸磷酸化状态可通过抗磷酸酪氨酸抗体的免疫印迹分析来确定(例如，参见Krishnan等.1997，Eur.J.Biochem.247：298-305)。猪流感病毒感染后，任何IFN途径组分磷酸化状态的增强都表明该猪流感病毒诱导IFN反应。

此外，待检测猪流感病毒感染后对IFN反应的诱导可通过检测结合特定DNA序列的能力来确定，或检测病毒感染所诱导的转录因子移位，例如，IRF3、STAT1、STAT2等。特别是，响应I型IFN、STAT1和STAT2被磷酸化并从细胞浆中移至细胞核。通过本领域公知的技术例如凝胶电泳迁移率实验、细胞染色等可检测结合特定DNA序列的能力或转录因子的移位。其它可以使用的试验参见美国专利申请第09/829,711号，本发明将其全部引入作为参考。然而，在优选的实施方案中，采用差异生长试验来选择具有所需表型的病毒，因所用的宿主系统(有IFN活性比较IFN缺失)施加了适当的选择压力。

本发明的减毒猪流感病毒任选地在猪细胞(包括原始、次级猪细胞和猪细胞株)中筛选。可采用任何猪流感病毒能够生长的猪细胞。优选的猪细胞包括猪肾脏细胞株、猪睾丸细胞株和猪肺。代表性猪细胞包括但不限于PK(D1)细胞、PK(15)细胞、PK13细胞、NSK细胞、LLC-PK1细胞、LLC-PK1A细胞、ESK-4细胞、ST细胞、PT-K75细胞、PK-2a/CL 13细胞或SJPL细胞。

在相同生长条件下，通过与例如A/Swine/Texas/4199-2/98的野生型猪流感病毒比较，可在猪细胞中筛选本发明的猪流感病毒。与野生型猪流感病毒比较，根据以下特点来挑选减毒猪流感病毒：例如较低的生长率、猪感染后较少的肺损伤、支气管肺泡灌洗液(BALF)中降低的病毒滴度、以及鼻擦拭签减少的检出。这种减毒猪流感病毒具有降低的毒力，因为与野生型猪流感病毒相比它们在有干扰素活性的系统中复制能力降低，但可产生免疫反应。

可用野生型猪流感病毒例如A/Swine/Texas/4199-2/98和NS1突变株以特定MOI来感染猪细胞，并且在感染后的特定时间测定上清液中的病毒滴度。可以用0.0005和0.001、0.001和0.01、0.01和0.1、0.1和1或1和10的MOI，或者0.0005、0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1、5或10的MOI感染猪细胞。在一个实施方案中，采用0.001的MOI。感染后约2至10天、3至7天、3至5天或2、3、4、5、6、7、8、9或10天可测定病毒的滴度。在具体实施方案中，可在感染后5天测定病毒滴度。在猪细胞中培养病毒后，可测定上清液中的病毒滴度。可采用任何检测流感病毒滴度的系统。代表性系统如5.7节所述。在具体实施方案中，上清液中的病毒滴度可通过在不同时间点MDCK细胞中的空斑来确定。

本发明的选择系统包括通过确定待测试减毒猪流感病毒感染细胞或蛋的提取物是否能够提供对抗病毒感染的保护活性来检测IFN诱导。更具体地，用待检测的突变猪流感病毒或野生型猪流感病毒感染10天龄含胚鸡蛋组。感染后大约15至20小时，收集尿囊液，并通过测定在组织培养细胞中针对猪流感病毒感染的保护活性的最高稀释来检测IFN活性。

也可以在猪体内评价本发明突变猪流感病毒的致病性。可以使用的试验包括利用本领域公知的方法评估肺叶的肺损伤、鼻擦拭签和测定支气管肺泡灌洗液(BALF)中病毒滴度。

5.3减毒猪流感病毒的增殖

本发明提供了在细胞(例如，猪细胞)、含胚蛋和动物中增殖减毒猪流感病毒的方法。本发明的减毒猪流感病毒可以用允许该病毒生长至一定滴度从而可以根据本发明使用的任何培养基来增殖。在具体实施方案中，本发明的减毒猪流感病毒可在任何下述培养基中增殖：该培养基允许该病毒生长至与野生型猪流感病毒株在有IFN活性培养基中测定的滴度相匹配的滴度。在另一实施方案中，本发明的减毒猪流感病毒在IFN缺失的培养基中增殖。用于选择本发明减毒猪流感病毒的培养基不一定用于增殖，反之亦然。

根据本发明的方法，可在细胞(例如，猪细胞)、含胚蛋和动物中生长的减毒猪流感病毒可选自天然存在的株、变体或突变株、诱导突变的病毒、重组体和/或遗传工程化的病毒。本发明的方法包括培养该减毒猪流感病毒，优选利用适合的生长条件(参见例如，下述第6节描述的生长条件)，收集子代病毒。

在具体实施方案中，本发明的减毒猪流感病毒在猪细胞中增殖。根据此实施方案，猪细胞可以是或可以不是IFN缺失或产生较低水平的IFN。优选的猪细胞包括猪肾脏细胞株、猪睾丸细胞株和肺细胞株。代表性的猪细胞包括但不限于PK(D1)细胞、PK(15)细胞、PK13细胞、SJPL细胞、NSK细胞、LLC-PKl细胞、LLC-PKlA细胞、ESK-4细胞、ST细胞、PT-K75细胞和PK-2a/CL 13细胞。在另一具体实施方案中，该减毒猪流感病毒在鸡细胞例如来自6天龄含胚蛋的鸡胚纤维母细胞中增殖。

在某些实施方案中，本发明提供在含胚蛋(例如6至14天龄)中增殖本发明减毒猪流感病毒的方法。在其它实施方案中，初期或未成熟的含胚蛋可用来增殖本发明的减毒猪流感病毒。根据本发明，未成熟的含胚蛋包括小于10天龄的蛋，优选6至9天龄的蛋、6至8天龄、6至7天龄或6天龄的蛋。本发明未成熟的含胚蛋还包括人工模拟未成熟的最多或少于10天龄的蛋，这是由生长条件改变导致的，例如改变孵育温度；用药物处理；或导致蛋发育阻滞的任何其它改变，从而与10至12天龄的蛋比较IFN系统没有充分发育。猪流感病毒可在含胚蛋的不同区域增殖，例如，尿囊腔。在某些实施方案中，含胚蛋为鸡蛋。

本发明还包括培养和分离本发明减毒猪流感病毒的方法和IFN缺失培养基。参见例如，美国专利第6,573,079号，其被全部引入作为参考。可用于支持减毒猪流感病毒生长的IFN缺失培养基包括但不限于天然存在的细胞、细胞株、含胚蛋、和IFN缺陷系统例如Vero细胞、初期含胚蛋；工程化为IFN缺失的重组细胞或细胞株，例如来自STAT1敲除、IRF3敲除、IRF7敲除、PKR敲除等的IFN缺失细胞株；来自IFN缺失的鸟特别是家禽(例如鸡、鸭和火鸡)的含胚蛋，这样的家禽包括喂养成为IFN缺失的鸟或转基因鸟(例如，STAT1敲除)。在某些实施方案中，IFN缺失培养基不是Vero细胞和/或不是STAT1缺失细胞株。

宿主系统、细胞、细胞株、蛋或动物可被遗传工程化来表达编码IFN系统抑制剂的转基因，例如，显性-阴性的突变株例如STAT1缺失DNA结合区、反义RNA、核酶、IFN产成抑制剂、IFN信号产生抑制剂和/或由IFN诱导的抗病毒基因的抑制剂。应认识到，喂养或遗传工程化的IFN缺失的动物会有些免疫损伤，应置于受控制的无疾病环境中。因此，应使用适合的手段(包括使用膳食抗生素)限制转基因IFN缺失的动物暴露于感染因子的风险，例如小鼠、喂养的母鸡、鸭、火鸡等禽群。可供选择地，宿主系统例如细胞、细胞株、蛋或动物可用抑制IFN产生和/或IFN途径的化合物来处理，例如，靶向STAT1基因和/或由IFN诱导的抗病毒基因的药物、抗体、反义分子、核酶分子。

本发明包括在IFN拮抗活性改变的细胞和细胞株(天然不具有IFN途径、或具有缺陷的IFN途径、或IFN系统系统有缺陷，例如与野生型细胞比较，IFN表达水平低)中培养和分离猪流感病毒的方法。在具体的实施方案中，本发明包括在来自6天龄含胚蛋的鸡胚纤维母细胞、或Vero细胞、或IFN受损的含胚蛋(例如，6、7或8天龄的含胚蛋的未成熟含胚蛋)中培养本发明减毒猪流感病毒的方法。在另一实施方案中，本发明包括在非Vero细胞中培养本发明的减毒猪流感病毒。

本发明提供在遗传工程化的IFN缺失培养基中培养和分离本发明猪流感病毒的方法。本发明包括IFN系统所必需的基因(例如STAT1)突变的转基因猪和鸟类，其可下出IFN缺失的蛋。本发明还包括表达显性基因阴性的转录因子(dominant-negative transcription factors)(例如STAT1缺乏DNA结合区、核酶、反义RNA、IFN生成抑制剂、IFN信号发生抑制剂和IFN诱导的抗病毒基因的抑制剂)的转基因鸟类。

本发明提供重组细胞株和动物特别是猪和鸟类，其中对于IFN合成、IFN途径所必需的一种和多种基因和/或由IFN诱导的抗病毒基因，例如，干扰素受体、STAT1、PKR、IRF3、IRF7等已经被突变(例如，阻断，即“敲除”)。重组动物可以是任何动物(例如小鼠、猪或鸟，例如，鸡、火鸡、母鸡、鸭子等(参见例如，关于转基因鸟类制备的综述：Sang，1994，Trends Biotechnol.12：415；Perry等，1993，Transgenic Res.2：125；Stern，CD.，1996，Curr Top Microbiol Immunol212：195-206；和Shuman，1991，Experientia 47：897，本发明将每一篇文献全部引入作为参考))。在具体实施方案中，重组动物为猪。这种细胞株和动物可由本领域公知的用于阻断细胞或动物染色体基因的任何方法来制备。这样的技术包括但不限于原核显微注射(Hoppe&Wagner，1989，U.S.专利号4,873,191)；逆转录病毒介导的生殖种系基因转移(Van der Putten等，1985，Proc.Natl.Acad.ScL，USA82：6148-6152)；胚胎干细胞基因打靶(Thompson等，1989，Cell 56：313)；胚胎电穿孔(Lo，1983，Mol Cell.Biol.3：1803)；和精子介导的基因转移(Lavitrano等，1989，Cell57：717)；等。这类技术的综述参见Gordon，1989，Transgenic Animals，Intl.Rev.Cytol.115：171，本发明将其全部引入作为参考。

特别是，STAT1敲除动物可通过促进染色体中的STAT1基因和已被生物失活的外源性STAT1基因(优选通过插入异源序列，例如，抗生物素抗性基因)之间的同源重组来制备。在小鼠基因组中用来阻断基因的同源重组方法例如Capecchi(1989，Science 244：1288)和Mansour等(1988，Nature 336：348-352)所述。

简言之，从作为基因敲除细胞或动物的同一物种的基因组DNA中分离全部或部分STAT1基因组克隆。可以利用本领域公知的任何用于分离基因组克隆的方法来分离STAT1基因组克隆(例如，用来自STAT1序列例如猪的STAT1(Genbank编号AB 116564和NM_213769)和Meraz等1996，Cell 84：431-442；Durbin等1996，Cell 84：443-450所提供序列的探针来探测基因组文库，本发明将其引入作为参考)。一旦分离基因组克隆后，将该克隆的全部或部分引入重组载体中。优选地，被引入部分克隆的载体含有部分STAT1基因外显子，即含有STAT1蛋白编码序列。不与STAT1序列同源的序列，优选正选择性标记例如编码抗生素抗性基因，被随后引入STAT1基因外显子。选择性标志物优选可操作地连接至启动子，更优选组成型启动子。非同源性序列被引入STAT1编码序列的任何将会阻断STAT1活性的位置，例如，已经证明该位置的点突变或其它突变使STAT1蛋白功能失活的位置。例如但不限于，非同源性序列可插入至含全部或部分激酶结构域的STAT1蛋白部分的编码序列(例如，编码该激酶结构域的至少50、100、150、200或250氨基酸的核苷酸序列)。

正选择性标记优选为新霉素抗性基因(neo基因)或潮霉素抗性基因(hygro基因)。启动子可以是本领域公知的任何启动子；例如启动子可以是磷酸甘油激酶(PGK)启动子(Adr等，1987，Gene 60：65-74)，Pol II启动子(Soriano等，1991，Cell64：693-701)，或MC1启动子，其为设计用于在胚胎衍生干细胞中表达的合成启动子(Thomas&Capecchi，1987，Cell 51：503-512)。使用选择性标记例如抗生素抗性基因使得能够选择已经整合了打靶载体的细胞(例如，neo基因产物的表达赋予对G418的抗性，而hygro基因产物的表达赋予对潮霉素的抗性)。

在优选的实施方案中，用于与载体同源(与非同源相反)重组的负选择性标记被插入STAT1基因组克隆插入的外面。例如，这种负选择性标记为HSV胸腺嘧啶激酶基因(HSV-tk)，该基因的表达使细胞对ganciclovir(更昔洛韦)敏感。负选择性标记优选在启动子(例如但不限于PGK启动子、Pol II启动子或MCl启动子)的控制下。

当同源重组发生时，与STAT1基因同源的载体部分以及STAT1基因序列中的非同源插入被整合入染色体的STAT1基因中，并丢失该载体的剩余部分。因此，由于负选择性标记在STAT1基因同源区域的外部，发生同源重组的细胞(或其后代)将不含有该负选择性标记。例如，如果负选择性标记为HSV-tk基因，那么已发生同源重组的细胞不会表达胸腺嘧啶激酶并在ganciclovir暴露后存活。与非同源重组(很可能该负选择性标记也与STAT1序列和正选择性标记一起被整合入基因组)相比，此过程使得能够选择已经发生同源重组的细胞。因此，已经发生非同源重组的细胞很可能表达胸腺嘧啶激酶并对ganciclovir敏感。

制备打靶载体后，用在该打靶载体中有唯一位点的限制性内切酶将其线形化，通过本领域公知的任何方法例如电穿孔将该线形化载体引入胚胎干(ES)细胞(Gossler等，1986，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83：9065-9069)。如果该打靶载体包括正选择性标记和负选择性标记，在选择性培养基中培养来筛选已经发生同源重组的ES细胞。例如，如果选择性标记为neo抗性基因和HSV-tk基因，将细胞暴露于G418(例如，大约300μg/ml)和ganciclovir(例如，大约2μM)。

用于检测基因型的本领域公知的任何技术(例如但不限于Southern印迹分析或聚合酶链式反应)可用于证明阻断的STAT1序列已被同源重组到ES细胞基因组的STAT1基因中。因为STAT1基因组克隆的限制性图谱是公知的，而且STAT1编码序列也是公知的(参见Meraz等1996，Cell 84：431，Durbin等.1996，Cell84：443-450，本发明将其引入作为参考)，可以确定阻断的和非阻断的等位基因DNA的具体限制性内切片段或PCR扩增产物的大小。因此，通过分析限制性内切片段或PCR产物(它们的大小在阻断的和阻断的STAT1基因中不同)，可确定是否发阻断STAT1基因的同源重组。

具有阻断的STAT1位点的ES细胞可随后通过显微注射被导入胚泡中，然后利用常规技术将该胚泡植入小鼠子宫中。由植入的胚泡发育而来的动物嵌合了阻断的等位基因。嵌合的雄性可与雌性杂交，而且这种杂交可设计成等位基因的生殖系传递与某种皮毛的颜色传递相联系。可通过如上所述的Southern印迹或PCR分析来证实从组织样品中分离的基因组DNA的等位基因生殖系传递。

可使用其产物对干扰素调节重要的任何基因。根据本发明可以使用的其它干扰素途径突变包括Jak1、TyK2激酶缺陷形式或缺乏DNA结合区域的转录因子STAT1和STAT2(参见例如，Krishnan等，1997，Eur.J.Biochem.247：298-305).

为了纯化病毒，通过公知的净化方法例如梯度离心和柱层析，从细胞培养物中去处并从细胞组分中分离减毒猪流感病毒，并可利用本领域所属技术人员公知的方法进行进一步分离，例如空斑试验。

5.4减毒病毒的用途

本发明所述减毒猪流感病毒可用作病毒载体制备异源蛋白产物，如美国专利第5,820,871号所述的，本发明将其全部引入作为参考。

本发明的减毒猪流感病毒可以在筛选试验中用于鉴定具有干扰素拮抗功能的病毒蛋白，以鉴定能够对拮抗细胞干扰素反应的能力受损的减毒病毒的复制进行补充的病毒蛋白，本发明的减毒猪流感病毒还可以在筛选试验中用于鉴定抑制干扰素拮抗活性和抑制病毒复制的抗病毒试剂，如美国专利第6,635,416号所述，其本发明将其全部引入作为参考。

本发明的减毒猪流感病毒可用于制备用于诊断性免疫试验、被动免疫治疗和抗独特型的抗体。例如，可将包含含有NS 1基因突变和异源序列(例如，肿瘤抗原)的基因组的减毒猪流感病毒施用于个体(例如，猪)以产生抗体，随后分离该抗体用于诊断性免疫试验、被动免疫治疗和抗独特型抗体的制备。所制备的抗体可以通过本领域公知的标准技术来分离(例如，免疫亲和层析、离心、沉淀等)，并用于诊断性免疫试验、被动免疫治疗和抗独特型抗体的制备。被分离的抗体在用于被动免疫之前可对其进行修饰，例如，可以嵌合或人源化该抗体。对于嵌合和人源化抗体的综述参见例如，美国专利第4,444,887号和第4,716,111号；以及国际公开号WO 98/46645、WO 98/50433、WO 98/24893、WO98/16654、WO 96/34096，WO 96/33735和WO 91/10741；本发明将其全部引入作为参考。

分离自给予了本发明减毒猪流感病毒的个体的抗体还可用于监测治疗和/或疾病的进程。任何本领域公知的免疫分析系统都可用于此目的，包括但不限于竞争和非竞争性分析系统(其采用例如放射性免疫试验、ELISA(酶联免疫吸附试验)、“夹心”免疫试验、沉淀反应、凝胶扩散沉淀反应、免疫扩散试验、凝聚集试验、补体固定试验、免疫放射定量试验、荧光免疫试验、蛋白A免疫试验和免疫电泳试验等。

本发明减毒猪流感病毒产生的抗体可用于制备抗独特型抗体。随后可将该抗独特型抗体用于免疫，产生与病原微生物初始抗原结合的抗体亚群(Jerne，1974，Ann.Immunol.(Paris)125c：373；Jerne等，1982，EMBO J.1：234)。

在免疫化过程中，可由本领域的熟练医师来确定所用免疫原的剂量和免疫计划，并参照个体的免疫反应和抗体滴度来进行给药。

5.5疫苗制剂/免疫原性制剂

本发明包括疫苗制剂和免疫原性制剂，这些制剂包含拮抗细胞IFN反应的能力受损的减毒猪流感病毒(即，猪流感病毒具有NS1基因突变，该突变损伤病毒诱导细胞IFN反应的能力)，及适合的赋形剂。用于疫苗制剂或免疫原性制剂的减毒猪流感病毒可选自天然发生的突变株或变体、诱导突变的病毒或遗传工程化病毒。在优选的实施方案中，减毒猪流感病毒为遗传工程化的。在另一优选的实施方案中，分离或纯化减毒猪流感病毒。猪流感病毒的减毒株也可以通过重组技术、无辅助质粒技术、或反向遗传学途径或无辅助质粒技术与重组技术的组合来制备。拮抗细胞IFN反应的能力受损的天然发生变体包括从天然分离的以及在病毒增殖时自发产生的变体病毒。该减毒猪流感病毒本身可作为疫苗制剂或免疫原性制剂的活性成分。可供选择地，该减毒猪流感病毒可用做重组制备的疫苗或免疫原性制剂的载体或“骨架”。为此，重组技术例如反向遗传学技术(或对于分段病毒，反向遗传学技术和重组技术的组合)可用于工程化突变或引入外源抗原至疫苗制剂或免疫原性制剂中使用的减毒猪流感病毒。以此种方式，可将疫苗设计成针对株变体进行免疫，或者针对完全不同的感染因子或疾病抗原进行免疫。

事实上，任何异源性基因序列都可被构建到用于疫苗或免疫原性制剂的本发明减毒猪流感病毒中。优选地，诱导针对多种病原体的保护性免疫反应的抗原决定簇或结合中和性抗体的抗原可以通过该病毒表达，或作为该病毒的一部分表达。例如，可以被构建到用于疫苗或免疫原性制剂的本发明病毒中的异源性基因序列包括但不限于非病毒病原体的抗原决定簇，例如细菌和寄生虫。在另一实施方案中，可表达全部或部分免疫球蛋白基因。例如，模拟这类抗原决定簇的抗独特型免疫球蛋白的可变区可被构建到本发明的病毒中。在另一实施方案中，可表达肿瘤相关抗原。肿瘤抗原的实例包括但不限于KS 1/4泛癌抗原、卵巢癌抗原(CA 125)、前列腺酸性磷酸酶、前列腺特异性抗原、黑色素瘤-相关抗原p97、黑色素瘤抗原gp75、高分子量黑色素瘤抗原(HMW-MAA)、前列腺特异性膜抗原、癌胚抗原(CEA)、多态性上皮粘蛋白抗原、乳脂球抗原、结肠直肠肿瘤相关抗原(例如：CEA、TAG-72、CO17-1A；GICA 19-9、CTA-I和LEA)，伯基特淋巴瘤(Burkitt′s lymphoma)抗原-38.13、CD19、B细胞淋巴瘤抗原CD20、CD33、黑色素瘤特异性抗原(例如神经节苷脂GD2、神经节苷脂GD3、神经节苷脂GM2、神经节苷脂GM3)、细胞表面抗原的肿瘤特异移植抗原(TSTA)(例如，例如病毒诱导的肿瘤抗原包括DNA肿瘤病毒的T-抗原和RNA肿瘤病毒的包膜抗原)、癌胚抗原-α-胎蛋白例如结肠的CEA、膀胱肿瘤癌胚抗原、分化抗原(例如人肺癌抗原L6和L20)、纤维肉瘤抗原、白血病T细胞抗原-Gp37、拟糖蛋白(neoglycoprotein)、鞘脂类、乳腺癌抗原(例如EGFR(表皮生长因子受体)、HER2抗原(p185HER2)和HER2neu抗原决定簇)、多态性上皮粘蛋白(PEM)、恶性人淋巴细胞抗原-APO-1、分化抗原(例如，胚胎红细胞的I型抗原、原始内胚层、成人红细胞的I抗原、植入前胚胎、胃腺癌的I(Ma)、乳腺上皮的M18、M39、髓细胞的SSEA-I、结直肠癌的VEP8、VEP9、Myl、VIM-D5、D156-22、TRA-1-85(血型H)、结肠腺癌的C14、肺腺癌的F3、胃癌的AH6、Y半抗原、胚胎癌细胞的Le^y、TL5(血型A)、A431细胞的EGF受体、前列腺癌的E₁系列(血型B)、胚胎癌细胞的FC 10.2、胃腺癌抗原、腺癌的CO-514(血型Le^a)、腺癌的NS-10、CO-43(血型Le^b)、A431细胞EGF受体的G49、结肠腺癌的MH2(血型Ale^b/Le^y)、结肠癌的19.9、胃癌粘蛋白、髓细胞的T5A7、黑色素瘤的R24、胚胎癌细胞的4.2、G_D3、D1.1、OFA-1、G_M2、OFA-2、G_D2和M1：22:25:8，以及4至8细胞阶段胚胎的SSEA-3和SSEA-4)、来自皮肤T细胞淋巴瘤的T细胞受体衍生肽、C反应蛋白(CRP)、乳腺癌相关的癌抗原-50(CA-50)、癌抗原15-3(CA15-3)、胃肠癌相关的癌抗原-19(CA-19)和癌抗原-242、癌相关抗原(CAA)、嗜铬粒蛋白A、上皮粘蛋白抗原(MC5)、人上皮特异性抗原(HEA)、Lewis(a)抗原、黑色素瘤抗原、黑色素瘤相关抗原100、25和150，粘蛋白样癌相关抗原、多药物抗性相关蛋白(MRPm6)、多药物抗性相关蛋白(MRP41)、Neu致癌基因蛋白(C-erbB-2)、神经元特异性烯醇酶(NSE)、P-糖蛋白(mdr1基因产物)、多药物抗性相关抗原、p170、多药物抗性相关抗原、前列腺特异抗原(PSA)、CD56和NCAM。

可配制活的重组猪流感病毒疫苗或免疫原性制剂，或者失活的重组猪流感病毒疫苗或免疫原性制剂。可利用本领域所属技术人员公知的方法来失活猪流感病毒。常用方法例如福尔马林和加热失活，参见例如美国专利第6,635,246号，本发明将其全部引入作为参考。其它的方法包括美国专利第5,891,705号；第5,106,619号和第4,693,981号所公开的，本发明将其全部引入作为参考。

优选活疫苗或免疫原性制剂，因为其在宿主体内的增殖可以延长相似的刺激，并且数量达到天然感染发生的水平，从而赋予实质的和长期持续的免疫。这种活重组猪流感病毒疫苗制剂和免疫原性制剂的制备可通过常规方法来实现，常规方法涉及在细胞培养物中或在鸡胚尿囊增殖猪流感病毒然后纯化。此外，该减毒猪流感病毒可诱导有力的IFN反应，该反应具有其它体内生物学后果，提供对后续感染疾病的保护和/或诱导抗肿瘤反应。

疫苗制剂和免疫原性制剂可包括在NS1基因有突变的遗传工程化猪流感病毒，包括但不限于如下面工作实施例所述截短的NS1流感突变株。这些制剂可利用天然的变体来配制。当配制活病毒疫苗时，可以每剂使用约10²至10⁸pfu、优选约10³至10⁷pfu、更优选10⁴至约5x10⁶、最优选10⁴至10⁷pfu。

在某些实施方案中，猪流感病毒含有NS1基因片段的突变，该突变可不导致改变的IFN拮抗活性或IFN诱导性表型，但导致病毒功能改变和减毒表型，例如改变对含poly(A)mRNA核输出的抑制、改变对前mRNA剪接的抑制、通过dsRNA螯合(sequestering)改变对PKR活化的抑制、改变病毒RNA翻译作用、和改变对宿主多聚腺苷酸化的抑制(例如，参见Krug in Textbook of Influenza，Nicholson等.Ed.1998，82-92，以及其中引用的文献)。

可利用多种方法引入上述疫苗制剂和免疫原性制剂，这些方法包括但不限于鼻内、气管内、口服、皮内、肌肉内、腹腔内、静脉内和皮下途径。可优选通过病原体(疫苗是针对该病原体而设计的)感染的天然途径或通过野生型病毒感染的天然途径来引入猪流感病毒疫苗制剂或免疫原性制剂。当使用活减毒猪流感病毒疫苗制剂或免疫原性制剂时，其可优选通过流感病毒感染的天然途径来引入该制剂。可利用流感病毒诱导强体液和细胞免疫反应的能力。例如，减毒猪流感病毒引起的呼吸道感染可在例如泌尿生殖器系统诱导强烈的体液免疫反应，提供对特定致病因子的伴随保护。

在具体实施方案中，优选在需要治疗的区域局部施用本发明组合物；这种施用可通过例如但不限于手术时的局部灌输、注射、导管途径、植入物途径来实现，所述植入物可以是多孔、非多孔或凝胶材料，包括膜例如sialastic膜，或纤维。在一个实施方案中，可以在位点(或前位点)或感染处直接注射来给药。

包含10²至10⁸pfu、优选约10³至10⁷pfu、更优选10⁴至约5x 10⁶pfu的IFN拮抗活性改变的减毒猪流感病毒的本发明疫苗或免疫原性制剂，可一次性施用于个体。可供选择地，包含10²至10⁸pfu、优选约10³至10⁷pfu、更优选10⁴至约5x 10⁶pfu的IFN拮抗活性改变的突变病毒的本发明疫苗或免疫原性制剂，可两次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次或10次施用于个体，各次之间的间隔为2至6月、2至8月、2至10月或2至12月。可供选择地，包含10²至10⁸pfu、优选约10³至10⁷pfu、更优选10⁴至约5x 10⁶pfu的IFN拮抗活性改变的突变病毒的本发明疫苗或免疫原性制剂，可根据需要对个体多次施用。在具体的实施方案中，所述个体为猪。

在某些实施方案中，本发明疫苗制剂或免疫原性制剂不产生对抗感染(例如，病毒感染)的完全保护，但与未治疗的个体比较，导致病原体(例如，病毒)的滴度较低或数量较少。益处包括但不限于，感染症状严重程度降低、感染相关疾病或不适的持续时间缩短。

在某些实施方案中，本发明的疫苗制剂或免疫原性制剂被用来提供对抗猪流感病毒感染的保护。在其它的实施方案中，本发明的疫苗制剂被用来提供对抗另一种猪病毒感染的保护，包括但不限于猪增殖和呼吸综合征病毒、猪巨细胞病毒、猪呼吸道冠状病毒、猪脑心肌炎病毒、猪流行性腹泻病毒。在其它一些实施方案中，本发明的疫苗制剂或免疫原性制剂被用来提供对抗非猪病毒的病原体感染的保护。

在某些实施方案中，可利用本发明的免疫原性制剂来预防、治疗、控制或改善不适(诱导针对特定抗原的免疫反应是有益的)。

5.6药物制剂

本发明包括药物制剂，该药物制剂包含IFN拮抗活性改变的猪流感病毒，可作为抗病毒剂或抗肿瘤剂或对抗IFN可治疗性疾病的试剂使用。在一个实施方案中，该药物制剂具有作为抗病毒预防性试剂的用途，并且可以施用于处在被病毒例如猪流感病毒感染的风险下或者可能会暴露在病毒例如猪流感病毒中的猪。在另一实施方案中，该药物制剂具有作为IFN可治疗性疾病的治疗性试剂或预防性试剂的用途，因此可用于治疗、预防、控制或改善IFN可治疗性病症。在优选的实施方案中，该药物制剂具有作为猪IFN可治疗性疾病的治疗性试剂或预防性试剂的用途，因此可用于治疗、预防、控制或改善猪IFN可治疗性病症。在具体的实施方案中，该药物制剂具有作为IFN可治疗性疾病的治疗性试剂或预防性试剂的用途，因此可用于治疗、预防、控制或改善驴、斑马、骆驼、狗、鸟类(例如，鸭子)的IFN可治疗性病症。在优选的实施方案中，本发明的药物制剂具有作为IFN可治疗性疾病的治疗性试剂或预防性试剂的用途，因此可用于治疗、预防、控制或改善猪的IFN可治疗性病症。

在某些实施方案中，本发明的药物制剂包含含有异源序列的嵌合减毒猪流感病毒。该异源序列可编码外源性抗原或肿瘤抗原的抗原决定簇。外源性抗原可选自另一种病毒、细菌或寄生虫。在一个实施方案中，该药物制剂可用于治疗肿瘤或预防肿瘤形成，例如，患有癌症的猪或有发展成肿瘤或癌症风险的那些个体。例如，患有癌症的个体(例如，能够被猪流感病毒感染或猪流感病毒可以在其体内复制的猪、驴或其它动物)可以被治疗以预防进一步的肿瘤发生。可供选择地，可治疗暴露或有可能暴露在致癌物质下的猪。可供选择地，可治疗将要暴露或已经暴露在放射线下的猪。可利用本发明的方法和组合物治疗的具体癌症包括但不限于子宫癌、乳腺癌、前列腺癌、皮肤癌、淋巴腺癌、阴道癌和睾丸癌。

本发明的抗肿瘤特性至少部分与其诱导IFN和IFN反应的能力有关。可供选择地，本发明的减毒猪流感病毒的抗肿瘤特性与其特异地在肿瘤细胞内生长和杀伤肿瘤细胞的能力有关，已知许多这样的肿瘤细胞IFN系统有缺陷。无论所述抗肿瘤特性的分子机制如何，本发明的减毒猪流感病毒可用于治疗肿瘤或预防肿瘤形成。

本发明还包括IFN拮抗表型改变的并靶向机体特定器官、组织和/或细胞以局部诱导治疗或预防效果的猪流感病毒。这种方式的优点之一是本发明诱导IFN的猪流感病毒可被靶向特定的位点，例如肿瘤区域，以位点特异性方式来诱导IFN而不是系统性地诱导IFN从而引起毒性作用。

可利用本发明所述方法工程化本发明诱导IFN的猪流感病毒，使之表达可将病毒靶向特定位点的蛋白或肽。在具体的实施方案中，诱导IFN的猪流感病毒可靶向肿瘤位点。在这样的实施方案中，猪流感病毒可被工程化来表达识别肿瘤特异抗原的抗体的抗原结合位点，从而将诱导IFN的猪流感病毒靶向该肿瘤。在另一实施方案中，当欲靶向的肿瘤表达激素受体时(例如乳腺或卵巢肿瘤表达雌激素受体)，可以工程化诱导IFN的猪流感病毒来表达适合的激素。在另一实施方案中，当欲靶向的肿瘤表达生长因子(例如VEGF、EGF或PDGF)受体时，可工程化诱导IFN的猪流感病毒来表达适合的生长因子或其片段。因此，根据本发明，诱导IFN的猪流感病毒可被工程化来表达任何打靶基因产物，包括肽、蛋白质，例如酶、生长因子、抗原或抗体，它们具有将该猪流感病毒靶向需要治疗(例如，抗病毒、抗细菌、抗微生物或抗癌症治疗)的位点的功能。

引入的方法包括但不限于皮内、肌肉内、腹腔内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外和口服途径。本发明的药物制剂可通过任何方便的途径来给药，例如通过灌输和弹丸注射(bolus injection)、上皮层或粘膜皮肤层吸收(例如，口腔粘膜、直肠和肠粘膜等)，并可与其它生物活性制剂一同给药。给药可以是系统的或局部的。此外，在优选的实施方案中，需要将本发明药物制剂通过任何适合的途径引入肺中。例如可以通过使用吸入器或喷雾器、以及含有雾化剂的制剂进行肺部给药。

在具体的实施方案中，需要在需要治疗的区域局部施用本发明药物制剂；这种施用可通过例如但不限于手术中的局部灌输、局部应用，例如手术后与伤口敷料一同使用、注射、导管方式、栓剂方式或植入物方式，该植入物为有孔、无孔或凝胶状材料，包括膜例如sialastic膜或纤维。在一个实施方案中，可通过在恶性肿瘤、瘤或瘤前病变组织的位置(或从前的位置)直接注射给药。

在另一实施方案中，可以在生物基质中传输药物制剂。生物基质的实例如美国专利第5,962,427号和美国专利申请公开2002/0193338所述，本发明将其全部引入作为参考。

在另一实施方案中，药物制剂可以在控释系统中传输。在一个实施方案中，可利用泵(参见上述Langer；Sefton，1987，CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14：201；Buchwald等，1980，Surgery 88：507；Saudek等，1989，N.Engl.J.Med.321：574)。在另一实施方案中，可使用聚合材料(参见Medical Applications of Controlled Release，Langer和Wise(编)，CRC Pres.，Boca Raton，Florida(1974)；Controlled DrugBioavailability，Drug Product Design and Performance，Smolen和Ball(编)，Wiley，NewYork(1984)；Ranger & Peppas，1983，J.Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.23：61；还参见Levy等，1985，Science 228：190；During等，1989，Ann.Neurol.25：351(1989)；Howard等，1989，J.Neurosurg.71：105)。在另一实施方案中，可将控释系统放置在组合物靶点的附近，即肺，从而仅需要系统剂量的一部分(参见例如，Goodson，1984，in Medical Applications of Controlled Release，supra，vol.2，pp.115-138)。其它的控释系统如Langer(1990，Science 249：1527-1533)的综述所述。

在优选的实施方案中，本发明的药物制剂包含有效量的本发明减毒猪流感病毒，以及药学上可接受的载体。术语“药学上可接受的”指被联邦或州政府管理部门批准的或列入美国药典或其它通常公认的药典、用于动物特别是用于人的。术语“载体”指稀释剂、佐剂、赋形剂，或用来施用药物制剂的媒介。盐溶液和水性右旋糖和甘油溶液也可作为液体载体来使用，特别是用于注射溶液。适合的制药赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、凝胶、麦芽、稻米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、甘油硬脂酸酯、滑石、氯化钠、干脱脂奶、甘油、丙稀、乙二醇、水、乙醇等。这些组合物可采用溶液、悬浮液、乳液、片剂、丸剂、胶囊、粉剂、缓释制剂等。该组合物也可被配制成栓剂。口服制剂可包括标准的载体，例如药物级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。适合的药物载体的实例在E.W.Martin所著的“Remington′sPharmaceutical Sciences”中有描述。这种组合物可包含有效量优选为纯化形式的治疗性试剂，与适量的载体一同提供适合患者给药的形式。制剂应适合给药的方式。具体制剂也可取决于猪流感病毒是否为活的或失活的。

本发明的药物制剂有效治疗、预防、控制或改善具体病症或不适的剂量取决于病症或不适的特性，并可通过标准的临床技术来确定。此外，可任选地用体外试验来帮助确定理想的剂量范围。在制剂中使用的准确剂量还可根据给药途径、疾病或病症的严重程度来决定，并应该根据操作者的判断和每一患者的情况来决定。然而，给药的适合剂量范围通常为约10²、5×10²、10³、5×10³、10⁴、5×10⁴、10⁵、5×10⁵、10⁶、5×10⁶、10⁷、5×10⁷、10⁸、5×10⁸、1×10⁹、5×10⁹、1×10¹⁰、5×10¹⁰、1×10¹¹、5×10¹¹或10¹²pfu，并最优选约10⁴至约10¹²pfu，可有间隔地对个体给药1次、2次、3次或根据需要多次给药。本发明的药物制剂包含10²、5×10²、10³、5×10³、10⁴、5×10⁴、10⁵、5×10⁵、10⁶、5×10⁶、10⁷、5×10⁷、10⁸、5×10⁸、1×10⁹、5×10⁹、1×10¹⁰、5×10¹⁰、1×10¹¹、5×10¹¹或10¹²pfu，最优选约10⁴至约10¹²pfu的IFN拮抗活性改变的减毒猪流感病毒，可鼻内、气管内、肌肉内或皮下给药。可从体外或动物模型试验系统的剂量效应曲线来推断有效量。

在某些实施方案中，本发明的药物制剂可用于预防、控制、治疗或改善由病毒、细菌或寄生虫引起的感染。在其它的实施方案中，本发明的药物制剂可用于预防、控制、治疗或改善猪的癌症。在其它的实施方案中，本发明的药物制剂用于预防、控制、治疗或改善其它IFN可治疗性疾病。

5.7 与猪流感病毒联合使用的治疗性试剂

本发明还提供预防、控制、治疗和/或改善疾病和病症的方法，所述疾病和病症包括但不限于猪流感病毒感染、与猪流感病毒感染相关的不适、猪流感病毒感染外的其它感染、或与猪流感病毒感染外的其它感染相关的不适或症状，IFN可治疗性疾病(例如癌症)和不适(本发明的减毒猪流感病毒可用做载体来诱导针对与该不适相关的特定抗原的免疫反应)，该方法包括给予需要治疗的个体有效量的一种和多种本发明的减毒猪流感病毒和有效量的减毒猪流感病毒以外的一种和多种治疗性试剂(例如，预防性试剂和治疗性试剂)。治疗性试剂包括但不限于小分子、合成药物、肽、多肽、蛋白质、核酸(例如，DNA和RNA核苷酸包括但不限于反义核苷酸序列、三螺旋、RNAi和编码生物活性蛋白、多肽或肽的核苷酸序列)、抗体、合成的或天然的无机分子、模拟试剂(mimetic agent)、和合成或天然有机分子。

任何如下所述的治疗(例如，预防性试剂或治疗性试剂)都可与本发明的减毒猪流感病毒联合使用，该治疗是公知可以使用或已经使用或目前正在用于预防、控制、治疗或改善猪流感病毒感染、猪流感病毒感染以外的其它感染、与猪流感病毒感染以外的其它感染相关的不适、IFN可治疗性病症、不适(本发明的减毒猪流感病毒可用做载体来诱导针对与该不适相关的特定抗原的免疫反应)或任何其它猪疾病。相关治疗的信息可参见例如，Taylor，Pig Diseases，第6版，DiamondFarm Book Pubns，1995；Straw等，Diseases of Swine，第8版，Iowa State UniversityPress，1999，特别是已经或正在用于预防、控制、治疗和/或改善猪疾病的预防性试剂或治疗性试剂。预防和治疗性试剂的实例包括但不限于抗癌剂、抗病毒剂、抗炎剂(例如，肾上腺皮质激素、皮质类固醇(例如，倍氯米松(beclomethasone)、布地缩松(budesonide)、氟尼缩松(flunisolide)、氟替卡松(fluticasone)、曲安西龙(triamcinolone)、甲基强的松龙(methlyprednisolone)、泼尼松龙(prednisolone)、强的松(prednisone)、氢化可的松(hydrocortisone))以及抗生素(例如，放线菌素D(dactinomycin)(以往称为actinomycin)、争光霉素(bleomycin)、红霉素、青霉素，光神霉素(mithramycin)以及氨茴霉素(anthramycin，AMC)).

5.7.1抗癌治疗

已知可以用来或已经使用或目前正在用于预防、控制、治疗或改善癌症或其一种或多种症状的任何治疗(例如，治疗性试剂或预防性试剂)均可用于本发明的组合物和方法中。治疗(例如，治疗性试剂或预防性试剂)包括但不限于肽、多肽、融合蛋白、核酸分子、小分子、模拟试剂、合成药物、无机分子和有机分子。癌症治疗性试剂的非限制性实例包括化疗、放疗、激素治疗和/或生物治疗/免疫治疗。

在具体的实施方案中，抗癌剂可以是但不限于：化疗剂(例如，阿西维辛(acivicin)、阿柔比星(aclarubicin)、盐酸阿考达唑(acodazole hydrochloride)，阿克罗宁(acronine)、阿多来新(adozelesin)、阿地白介素(aldesleukin)、六甲蜜胺(altretamine)、安波霉素(ambomycin)、醋酸双氢胺蒽醌(ametantrone acetate)、氨鲁米特(aminoglutethimide)、安沙可林(amsacrine)、阿纳托(司)唑(anastrozole)、安曲霉素(anthramycin)、天冬酰胺酶(asparaginase)、阿扎胞苷(azacitidine)、阿扎替派(azetepa)、巴马司他(batimastat)、博来霉素(bleomycin)、苄替派(benzodepa)、比卡鲁胺(bicalutamide)、盐酸比生群(bisantrene hydrochloride)、二甲磺酸双奈法德(bisnafidedimesylate)、比折来新(bizelesin)、硫酸博来霉素(bleomycin sulfate)、布喹那钠(brequinar sodium)、溴匹立明(bropirimine)、白消安(busulfan)、放线菌素(cactinomycin)、7β，17α-二甲睾酮(calusterone)、喜树碱(campathecin)、卡醋胺(caracemide)、卡贝替姆(carbetimer)，卡铂(carboplatin)、卡氮芥(carmustine)、盐酸卡柔比星(carubicin hydrochloride)、卡折来新(carzelesin)、西地芬戈(cedefingol)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、西罗里霉素(cirolemycin)、顺铂(cisplatin)、克拉屈滨(cladribine)、甲磺酸克立那托(crisnatol mesylate)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、阿糖胞苷(cytarabine)、环孢霉素A(cyclosporin A)、考布他汀(combretastatin A4)、考布他汀类似物(combretastatin analogue)、溶细胞因子(cytolytic factor)、cytostatin、达昔单抗(dacliximab)、多西紫杉醇(docetaxel)、氮烯咪胺(dacarbazine)、更生霉素(dactinomycin)、盐酸柔红霉素(daunorubicin hydrochloride)、多西紫杉醇(docetaxel)、阿霉素(doxorubicin)、屈洛昔芬(droloxifene)、丙酸甲雄烷酮(dromostanolonepropionate)、偶氮霉素(duazomycin)、依达曲沙(edatrexate)、盐酸依氟鸟氨酸(eflornithine hydrochloride)、依沙芦星(elsamitrucin)、恩洛铂(enloplatin)、苯环丙炔酯(enpromate)、双环氧哌啶(epipropidine)、盐酸表柔比星(epirubicin hydrochloride)、厄布洛唑(erbulozole)、盐酸依索比星(esorubicin hydrochloride)、雌莫司汀(estramustine)、依他硝唑(etanidazole)、依托泊苷(etoposide)、法扎拉滨(fazarabine)、芬维A胺(fenretinide)、氟脲嘧啶脱氧核苷(floxuridine)、氟尿嘧啶(fluorouracil)、氟环胞苷(flurocitabine)、磷喹酮(fosquidone)、吉西他滨(gemcitabine)、羟(基)脲(hydroxyurea)、去甲氧正定霉素(idarubicin)、盐酸去甲氧正定霉素(idarubicinhydrochloride)、异磷酰胺(ifosfamide)、依莫佛新(ilmofosine)、异丙铂(iproplatin)、异磷酰胺(ifosfamide)、盐酸依立替康(irinotecan hydrochloride)、醋酸兰瑞肽(lanreotide acetate)、来曲唑(letrozole)、醋酸亮丙瑞林(leuprolide acetate)、盐酸利阿唑(liarozole hydrochloride)、洛美曲索钠(lometrexol sodium)、洛莫司汀(lomustine)、盐酸洛索蒽醌(losoxantrone hydrochloride)、马丙考(masoprocol)、巯嘌呤(mercaptopurine)、甲氨喋呤(methotrexate)、metoprine、美妥替哌(meturedepa)、米丁度胺(mitindomide)、mitocarcin、丝裂红素(mitocromin)、丝裂霉素(mitomycin)、米托蒽醌(mitoxantrone)、霉酚酸(mycophenolic acid)、亚硝(基)脲(nitrosoureas)、噻氨酯哒唑(nocodazole)、诺加霉素(nogalamycin)、奥马铂(ormaplatin)、亚磺酰吡啶(oxisuran)、紫杉醇(paclitaxel)、光辉霉素(plicamycin)、铂复合物(platinum complex)、铂化合物(platinum compounds)、铂-三胺复合物(platinum-triamine complex、procarbizine、嘌罗霉素(puromycin)、紫杉醇(taxol)、硫鸟嘌呤(thioguanine)、他利霉索(talisomycin)、替可加兰钠(tecogalan sodium)、喃氟啶(tegafur)、盐酸替洛蒽醌(teloxantrone hydrochloride)、伐普肽(vapreotide)、维替泊芬(verteporfin)、长春花碱(vinblastine sulfate)、硫酸长春新碱(vincristine sulfate)，长春地辛(vndesine)、硫酸长春地(vindesine sulfate)、硫酸长春匹定(vinepidine sulfate)、硫酸长春甘酯(vingyycinatesulfate)、硫酸环氧长春碱(vinleurosine sulfate)、酒石酸长春瑞滨(vinorelbine tartrate)、硫酸异长春碱(vinrosidine sulfate)、硫酸长春利定(vinzolidine sulfate)、伏氯唑(vorozole)、折尼拉汀(zeniplatin)和净司他丁(zinostatin))、基质金属蛋白酶抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂、酪氨酸磷酸化抑制剂(tyrphostins)、尿激酶受体拮抗剂、多重抗药基因抑制剂、基于多肿瘤抑制基因1(multiple tumor suppressor 1)的治疗性试剂、纤溶酶原激活物抑制剂(plasminogen activator inhibitor)、二膦酸盐(例如，帕米膦酸二钠(pamidronate，Aredria)、sodium clondronate(Bonefos)、唑来膦酸(zoledronic acid，Zometa)、阿伦膦酸盐(alendronate，Fosamax)、依替膦酸盐(etidronate)、伊班膦酸盐(ibandornate)、cimadronate、利塞膦酸盐(risedromate)以及tiludromate)、细胞因子(例如，IL-2、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、白血病抑制因子、白细胞α干扰素、人绒毛膜促性腺激素和血小板生成素(thrombopoietin)、激素(例如，甲状腺刺激激素(thyroid stimulating hormone))、抗体(例如，抗-CD2抗体、抗-CD20甘丙肽(galanin)受体免疫特异性的抗体)、维生素D(例如，20-epi-1，25二羟基维生素D3)、血管生成抑制剂、反义寡核苷酸、凋亡基因调节剂、凋亡调节剂、BCR/ABL拮抗剂、软骨衍生抑制剂、雌激素激动剂、雌激素拮抗剂、明胶酶抑制剂、谷胱甘肽抑制剂、HMG CoA还原酶抑制剂(例如，阿托伐他汀(atorvastatin)、西立伐他汀(cerivastatin)、氟伐他汀(fluvastatin)、来适可(lescol)、lupitor、洛伐他汀(lovastatin)、瑞舒伐他汀(rosuvastatin)和辛伐他汀(simvastatin))、免疫刺激肽、胰岛素样生长因子-1受体抑制剂、干扰素激动剂、亮丙瑞林(leuprolide)+雌激素+黄体酮、亮丙瑞林(leuprorelin)、错配的双链RNA、蛋白酶体抑制剂、基于蛋白A的免疫调节剂、蛋白激酶C抑制剂、蛋白酪氨酸磷酸酶抑制剂、raf拮抗剂、ras法尼基蛋白转移酶抑制剂、核酶、RNAi、信号转导调节剂、干细胞抑制剂、干细胞分化抑制剂、端粒酶抑制剂、促胸腺生成素受体激动剂以及翻译抑制剂。

在具体的实施方案中，包括破坏癌细胞的x-射线、伽马射线和其它放射源的放射性治疗与本发明的减毒猪流感病毒联合使用。在优选的实施方案中，所述放射性治疗以外部射束放射或远距离放射疗法(其中所述放射线从远距离源射出)施用。在其它优选实施方案中，放射线治疗作为内部或近距离放射治疗来施用，其中放射源被放置在机体内部接近癌细胞或肿瘤块。

癌症治疗性试剂和其剂量、给药途径和推荐的用法是本领域公知的并已经在例如Physicians’Desk Reference(58th ed.，2004)和Merck Veterinary Manual(第8版，1998)的文献描述。

5.7.2抗血管生成治疗

本领域所属技术人员公知的任何抗血管生成剂可用于本发明的组合物和方法中。抗血管生成剂的非限制性实例包括降低或抑制或中和血管生成的蛋白质、多肽、肽、融合蛋白、抗体(例如，嵌合、单克隆、多克隆、Fvs、ScFvs、Fab片段、F(ab)₂片段及其抗原结合片段)例如免疫特异性结合TNFα的抗体、核酸分子(例如，反义分子或三螺旋)、有机分子、无机分子以及小分子。特别是，抗血管生成剂的实例包括但不限于血管内皮抑制素(endostatin)、血管抑素(angiostatin)、apomigren、抗血管生成抗凝血酶(anti-angiogenic antithrombin)III、纤维连接蛋白的29kDa N末端和40kDa C末端蛋白水解片段、uPA受体拮抗剂、催乳素的16kDa蛋白水解片段、血小板因子-4的7.8kDa蛋白水解片段、血小板因子-4的抗-血管生成24氨基酸片段(被称为13.40的抗血管生成因子)、血小板凝血酶敏感蛋白I(thrombospondin I)的抗血管生成22氨基酸肽片段、SPARC抗血管生成20氨基酸肽片段、含RGD和NGR的肽、层粘连蛋白的抗血管生成小肽、纤维连接蛋白、前胶原(procollagen)和EGF、整合素αvβ₃拮抗剂(例如，抗整合素αvβ₃抗体)、酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)拮抗剂、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)拮抗剂、血管内皮生长因子(VEGF)拮抗剂(例如，抗-VEGF抗体)，和VEGF受体(VEGFR)拮抗剂(例如，抗-VEGFR抗体)。

5.7.3抗病毒治疗

本领域所属技术人员公知的任何抗病毒治疗性试剂可用于本发明的组合物和方法中。抗病毒治疗性试剂的非限制性实例包括抑制和/或降低病毒与其受体粘附、病毒进入细胞的内在化、病毒的复制、病毒从细胞中释放的蛋白质、多肽、肽、融合蛋白、抗体、核酸分子、有机分子、无机分子以及小分子。特别是，抗病毒剂包括但不限于核苷类似物(例如，齐多夫定(zidovudine)、阿昔洛韦(acyclovir)、gangcyclovir、阿糖腺苷(vidarabine)、碘苷(idoxuridine)、三氟尿苷(trifluridine)以及利巴韦林(ribavirin))、膦甲酸盐(foscarnet)、金刚烷胺(amantadine)、金刚乙胺(rimantadine)、沙奎那韦(saquinavir)、印地那韦(indinavir)、利托那韦(ritonavir)、α-干扰素和其它干扰素以及AZT。

在具体的实施方案中，抗病毒剂为对病毒抗原免疫特异性的免疫调节剂。这里所用术语“病毒抗原”包括但不限于能够激发免疫反应任何病毒肽、多肽和蛋白(例如，口蹄疫病毒的3AB、3ABC、猪增殖与呼吸综合征病毒GP5、伪狂犬病病毒gE、猪传染性胃肠炎病毒核蛋白质、流感病毒神经氨(糖)酸苷酶(neuraminidase)、流感病毒血凝素(hemagglutinin)、单纯疱疹病毒糖蛋白(例如，gB、gC、gD和gE)以及乙肝表面抗原)。用于本发明治疗病毒感染性疾病的抗体包括但不限于抗病原病毒抗原的抗体，病原病毒包括例如但不限于：腺病毒科(adenovirdae)(例如，哺乳动物腺病毒属(mastadenovirus)和禽腺病毒属(aviadenovirus))、疱疹病毒科(herpesviridae)(例如，单纯疱疹病毒病毒1、单纯疱疹病毒病毒2、单纯疱疹病毒病毒5和单纯疱疹病毒病毒6)、光滑噬菌体病毒科(leviviridae)(例如，轻小病毒(levivirus)、肠细菌MS2期(enterobacteria phase MS2)、allolevirus)、痘病毒科(poxviridae)(例如，脊椎动物痘病毒亚科(chordopoxvirinae)、副痘病毒属(parapoxvirus)、禽痘病毒属(avipoxvirus)、骆驼痘病毒属(capripoxvirus)、兔痘病毒属(leporipoxvirus)、猪痘病毒属(suipoxvirus)、软疣痘病毒属(molluscipoxvirus)和昆虫痘病毒亚科(entomopoxvirinae))、乳头多瘤空泡病毒科(papovaviridae)(例如，多瘤病毒属(polyomavirus)和乳头瘤病毒属(papillomavirus))、副粘病毒科(paramyxoviridae)(例如，副粘液病毒(paramyxovirus)、副流感病毒1、mobillivirus(例如，麻疹病毒(measlesvirus))、腮腺炎病毒属(rubulavirus)(例如，腮腺炎病毒(mumpsvirus))、肺病毒亚科(pneumonovirinae)(例如，肺病毒属(pneumovirus)、人呼吸道合胞病毒(human respiratory synctial virus)，以及间质肺病毒(metapneumovirus)(例如，禽肺病毒(avian pneumovirus)和人间质肺病毒))、小RNA病毒科(picornaviridae)(例如肠道病毒属(enterovirus)，鼻病毒属(rhinovirus)、肝病毒属(例如，人甲型肝炎病毒)、心病毒属(cardiovirus)及口蹄疫病毒(apthovirus))、呼肠孤病毒科(reoviridae)(例如，正呼肠孤病毒属(orthoreovirus)、环状病毒属(orbivirus)、轮状病毒(rotavirus)、质型多角体病毒(cypovirus)、斐济病毒属(fijivirus)、植物呼肠病毒属(phytoreovirus)，和水稻病毒属(oryzavirus))、逆转录病毒科(retroviridae)(例如，哺乳动物B型逆转录病毒、哺乳动物C型逆转录病毒、家禽C型逆转录病毒、D型逆转录病毒组、BLV-HTLV逆转录病毒、慢病毒属(lentivirus)(例如，人类免疫缺陷病毒1和人类免疫缺陷病毒2)、泡沫病毒属(spumavirus))、黄病毒科(flaviviridae)(例如，丙型肝炎病毒)、嗜肝DNA病毒科(hepadnaviridae)(例如，乙型肝炎病毒)、披膜病毒科(togaviridae)(例如，甲病毒(例如，辛德比斯病毒(sindbis virus))和风疹病毒属(rubivirus)(例如，风疹病毒(rubellavirus)、弹状病毒科(rhabdoviridae)(例如，水泡性病毒属(vesiculovirus)、狂犬病毒属(lyssavirus)、短暂热病毒属(ephemerovirus)、质型弹状病毒属(cytorhabdovirus)和necleorhabdovirus)、沙粒病毒科(arenaviridae)(例如，沙粒病毒(arenavirus)、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(lymphocytic choriomeningitis virus)、伊派病毒(Ippy virus)以及拉沙病毒(lassa virus))，及日冕形病毒科(coronaviridae)(例如，冠形病毒(coronavirus)和环曲病毒属(torovirus))。

用于治疗病毒感染疾病的有用抗体的具体实例包括但不限于用于治疗HIV感染的CD4融合抗体的PRO542(Progenies)；用于治疗乙型肝炎病毒感染的人抗体的Ostavir(Protein Design Labs，Inc.，CA)；以及用于治疗巨细胞病毒(CMV)的人源化IgG1抗体：Protovir(Protein Design Labs，Inc.，CA)。

抗病毒治疗性试剂、其剂量、给药途径以及推荐的用法是本领域公知的并在例如Physicians’Desk Reference(58th ed.，2004)和Merck Veterinary Manual(8thed.，1998)中描述。病毒感染的其它信息参见Cecil Textbook of Medicine(18th ed.，1988)。

5.7.4抗生素治疗

本领域所属技术人员公知的任何抗生素治疗性试剂都可用于本发明的组合物和方法中。可与本发明复合物联合使用的抗细菌试剂或抗生素包括但不限于：氨基糖甙类抗生素(例如，阿布拉霉素(apramycin)、阿贝卡星(arbekacin)、班贝霉素(bambermycins)、布替罗星(butirosin)、地贝卡星(dibekacin)、新霉素(neomycin)、十一烯酸酯(undecylenate)、奈替霉素(netilmicin)、巴龙霉素(paromomycin)、核糖霉素(ribostamycin)、西苏霉素(sisomicin)、和大观霉素(spectinomycin))、amphenicol抗生素(例如，叠氮氯霉素(azidamfenicol)、氯霉素(chloramphenicol)、氟苯尼考(florfenicol)和甲砜氯霉素(thiamphenicol))、安沙霉素抗生素(ansamycinantibiotics)(例如，利福酰胺(rifamide)和利福平(rifampin))、碳头孢烯类(carbacephems)(例如，洛拉卡比(loracarbef))、碳青霉烯类(carbapenems)(例如，比阿培南(biapenem)和亚胺培南(imipenem))、头孢菌素类(cephalosporins)(例如，头孢克洛(cefaclor)、头孢羟氨苄(cefadroxil)、头孢羟唑(cefamandole)、头孢曲秦(cefatrizine)、头孢吡酮(cefazedone)、头孢唑兰(cefozopran)、头孢咪唑(cefpimizole)、头孢匹胺(cefpiramide)和头孢匹罗(cefpirome))、头霉素类(cephamycins)(例如，头孢拉宗(cefbuperazone)、头孢美唑(cefmetazole)和头孢米诺钠(cefminox))、单酰胺菌素类(monobactams)(例如，氨曲南(aztreonam)、卡芦莫南(carumonam)和替吉莫南(tigemonam))、氧头孢烯类(oxacephems)(例如，夫洛莫西(flomoxef)和拉氧头孢(moxalactam))、青霉素类(例如，氮卓西林(amdinocillin)、氮卓脒青霉素匹酯(amdinocillin pivoxil)、阿莫西林(amoxicillin)、巴氨西林(bacampicillin)、苄青霉素酸(benzylpenicillinic acid)、苄青霉素钠(benzylpenicillin sodium)、依比青霉素(epicillin)、苯苄青霉素(fenbenicillin)、氟氯青霉素(floxacillin)、青霉素G双酯(penamccillin)、氢碘酸喷沙西林(penethamate hydriodide)、o-苯乙苄胺青霉素(penicillino-benethamine)、青霉素O(penicillin O)，青霉素V(penicillin V)、苄星青霉素V(penicillin V benzathine)、哈胺青霉素V(penicillin V hydrabamine)、青哌四环素(penimepicycline)以及(phencihicillin potassium))、林可酰胺类抗生素(lincosamides)(例如，克林霉素(clindamycin)、和林可霉素(lincomycin))、大环内酯类(macrolides)(例如，阿齐红霉素(azithromycin)、卡波霉素(carbomycin)、克拉仙霉素(clarithomycin)、地红霉素(dirithromycin)、乙琥红霉素(erythromycin)和红霉素阿西曲酯(erythromycin acistrate))、安福霉素(amphomycin)、杆菌肽(bacitracin)、卷曲霉素(capreomycin)、粘菌素(colistin)、持久杀菌素(enduracidin)、结核放线菌素N(enviomycin)、四环素类(tetracyclines)(例如，阿匹四环素(apicycline)、金霉素(chlortetracycline)、氯莫环素(clomocycline)和脱甲氯四环素(demeclocycline))、2，4-氨基密啶(2，4-diaminopyrimidines)(例如，溴莫普林(brodimoprim))、呋喃类药物(nitrofurans)(例如，呋喃唑酮(furaltadone)和氯化呋噻咪唑(furazolium chloride))、喹诺酮类及其类似物(例如，西诺沙星(cinoxacin)、环丙沙星(ciprofloxacin)、克林沙星(clinafloxacin)、氟甲喹(flumequine)和grepagloxacin)、磺胺类(sulfonamides)(例如，乙酰磺胺甲氧吡嗪(acetyl sulfamethoxypyrazine)、苄磺胺(benzylsulfamide)、苯丙磺胺二磺酸钠(hoprylsulfamide)、酞磺醋胺(phthalylsulfacetamide)、偶氮磺胺(sulfachrysoidine)、和磺胺乙胞嘧啶(sulfacytine))、砜类(sulfones)(例如，麝酚砜(diathymosulfone)、二葡糖氨苯砜钠(glucosulfone sodium)和苯丙砜(solasulfone))、环丝氨酸(cycloserine)、莫匹罗星(mupirocin)和N-反(对甲氧苯乙烯基)甲酰胺(tuberin)。

抗菌剂的其它实例包括但不限于，醋氨苯砜(Acedapsone)；醋胺磺氨苯砜钠(Acetosulfone Sodium)；阿来霉素(Alamecin)；阿来西定(Alexidine)；氮卓西林(Amdinocillin)；氮卓脒青霉素匹酯(Amdinocillin Pivoxil)；阿密环素(Amicycline)；氨氟沙星(Amifloxacin)；甲磺酸氨氟沙星(Amifloxacin Mesylate)；阿米卡星(Amikacin)；硫酸阿米卡星(Amikacin Sulfate)；氨基水杨酸(Aminosalicylic acid)；对氨水杨酸钠(Aminosalicylate sodium)；阿莫西林(Amoxicillin)；安福霉素(Amphomycin)；氨苄西林(Ampicillin)；氨苄青霉素钠(Ampicillin Sodium)；阿帕西林钠(Apalcillin Sodium)；阿布拉霉素(Apramycin)；门冬托星(Aspartocin)；硫酸阿司米星(Astromicin Sulfate)；阿维霉素(Avilamycin)；阿伏霉素(Avoparcin)；阿齐红霉素(Azithromycin)；阿洛西林(Azlocillin)；阿洛西林钠(Azlocillin Sodium)；盐酸卡巴西林(Bacampicillin Hydrochloride)；杆菌肽(Bacitracin)；亚甲基双水杨酸杆菌肽(Bacitracin Methylene Disalicylate)；杆菌肽锌(Bacitracin Zinc)；班贝霉素(Bambermycins)；苯酰胺水杨酸钙(Benzoylpas Calcium)；去氧红霉素(Berythromycin)；硫酸倍他霉素(Betamicin Sulfate)；比阿培南(Biapenem)；比尼霉素(Biniramycin)；盐酸苯柳胺酯(Biphenamine Hydrochloride)；硫酸镁双巯氧吡啶(BispyrithioneMagsulfex)；氨羟丁卡钠霉素(Butikacin)；硫酸丁酰苷菌素(Butirosin Sulfate)；硫酸卷曲霉素(Capreomycin Sulfate)；卡巴氧(Carbadox)；羧苄基青霉素双钠盐(Carbenicillin Disodium)；卡茚西林钠(Carbenicillin Indanyl Sodium)；羧苄苯青霉素钠(Carbenicillin Phenyl Sodium)；羧苄青霉素钾(Carbenicillin Potassium)；卡鲁莫南钠(Carumonam Sodium)；头孢克洛(Cefaclor)；头孢羟氨苄(Cefadroxil)；头孢羟唑(Cefamandole)；头孢孟多酯钠(Cefamandole Nafate)；头孢孟多酯钠(CefamandoleSodium)；头孢哌罗(Cefaparole)；头孢曲秦(Cefatrizine)；头孢氟唑钠(CefazafiurSodium)；头孢唑啉(Cefazolin)；头孢唑啉钠(Cefazolin Sodium)；头孢拉宗(Cefbuperazone)；头孢地尼(Cefdinir)；头孢平(Cefepime)；盐酸头孢平(CefepimeHydrochloride)；头孢替考(Cefetecol)；头孢克肟(Cefixime)；盐酸头孢甲肟(Cefmnenoxime Hydrochloride)；头孢美唑(Cefmetazole)；头孢美唑钠(CefmetazoleSodium)；头孢尼西单钠(Cefonicid Monosodium)；头孢尼西钠(Cefonicid Sodium)；头孢哌酮钠(Cefoperazone Sodium)；头孢胺四唑(Ceforanide)；头孢噻肟钠(Cefotaxime Sodium)；头孢替坦(Cefotetan)；头孢替坦二钠(Cefotetan Disodium)；盐酸头孢替安(Cefotiam Hydrochloride)；头孢西丁(Cefoxitin)；头孢西丁钠(CefoxitinSodium)；头孢咪唑(Cefpimizole)；头孢咪唑钠(Cefpimizole Sodium)；头孢匹胺(Cefpiramide)；头孢匹胺钠(Cefpiramide Sodium)；硫酸头孢匹罗(Cefpirome Sulfate)；头孢泊肟(Cefpodoxime Proxetil)；头孢罗齐(Cefprozil)；，头孢沙定(Cefroxadine)；头孢磺啶钠(Cefsulodin Sodium)；头孢他定(Ceftazidime)；头孢布坦(Ceftibuten)；头孢唑肟钠(Ceftizoxime Sodium)；头孢曲松钠(Ceftriaxone Sodium)；头孢呋新(Cefuroxime)；头孢呋新酯(Cefuroxime Axetil)；头孢呋辛匹赛酯(CefuroximePivoxetil)；头孢呋新钠(Cefuroxime Sodium)；头孢赛曲钠(Cephacetrile Sodium)；先锋霉素IV(Cephalexin)；头孢氨苄盐酸盐(Cephalexin Hydrochloride)；先锋霉素III(Cephaloglycin)；Cephaloridine；头孢噻吩钠(Cephalothin Sodium)；头孢匹林钠(Cephapirin Sodium)；泛捷复(Cephradine)；盐酸西托环素(CetocyclineHydrochloride)；乙酰霉素(Cetophenicol)；氯霉素(Chloramphenicol)；无味氯霉素(Chloramphenicol Palmitate)；氯霉素泛酸酯复合物(Chloramphenicol PantothenateComplex)；丁二酸钠氯霉素(Chloramphenicol Sodium Succinate)；氨基苯磷酸氯己定(Chlorhexidine Phosphanilate)；对氯间二甲酚(Chloroxylenol)；金霉素硫酸氢盐(Chlortetracycline Bisulfate)；盐酸金霉素(Chlortetracycline Hydrochloride)；西诺沙星(Cinoxacin)；环丙沙星(Ciprofloxacin)；盐酸环丙沙星(Ciprofloxacin Hydrochloride)；西罗里霉素(Cirolemycin)；克拉仙霉素(Clarithromycin)；盐酸克林沙星(ClinafloxacinHydrochloride)；克林霉素(Clindamycin)；盐酸克林霉素(Clindamycin Hydrochloride)；盐酸氯林可霉素棕榈酸酯(Clindamycin Palmitate Hydrochloride)；氯林可霉素磷酸酯(Clindamycin Phosphate)；氯苯吩嗪(Clofazimine)；苄星邻氯青霉素(CloxacillinBenzathine)；苄星邻氯青霉素(Cloxacillin Sodium)；氯羟喹(Cloxyquin)；粘菌素甲磺钠(Colistimethate Sodium)；硫酸多粘菌素E(Colistin Sulfate)；库马霉素(Coumermycin)；库马霉素钠(Coumermycin Sodium)；氨环已青霉素(Cyclacillin)；环丝氨酸(Cycloserine)；达福普汀(Dalfopristin)；氨苯砜(Dapsone)；达托霉素(Daptomycin)；脱甲金霉素(Demeclocycline)；盐酸去甲金霉素(DemeclocyclineHydrochloride)；去甲四环素(Demecycline)；Denofungn；二氨黎芦嘧啶(Diaveridine)；双氯青霉素(Dicloxacillin)；双氯西林钠(Dicloxacillin Sodium)；硫酸双氢链霉素(Dihydrostreptomycin Sulfate)；双硫氧吡啶(Dipyrithione)；地红霉素(Dirithromycin)；脱氧土霉素(Doxycycline)；强力霉素钙(Doxycycline Calcium)；多西环素磷酸复合物(Doxycycline Fosfatex)；盐酸多西环素(Doxycycline Hyclate)；屈克沙星钠(Droxacin Sodium)；依诺沙星(Enoxacin)；环烯氨甲青霉素(Epicillin)；盐酸表四环素(Epitetracycline Hydrochloride)；乙琥红霉素(Erythromycin)；红霉素阿西曲酯(Erythromycin Acistrate)；无味红霉素(Erythromycin Estolate)；琥乙红霉素(Erythromycin Ethylsuccinate)；葡庚糖酸红霉素(Erythromycin Gluceptate)；乳糖红霉素(Erythromycin Lactobionate)；红霉素丙酸酯(Erythromycin Propionate)；红霉素硬脂酸盐(Erythromycin Stearate)；盐酸乙胺丁醇(Ethambutol Hydrochloride)；乙硫异烟胺(Ethionamide)；Fleroxacin；氟罗沙星(Floxacillin)；氟氘丙氨酸(Fludalanine)；氟甲喹(Flumequine)；磷霉素(Fosfomycin)；磷霉素氨丁三醇(FosfomycinTromethamine)；呋莫西林(Fumoxicillin)；氯化呋噻咪唑(Furazolium Chloride)；酒石酸呋噻咪唑(Furazolium Tartrate)；夫西地酸钠(Fusidate Sodium)；夫西地酸(Fusidic Acid)；硫酸双生霉素(Gentamicin Sulfate)；格洛莫南(Gloximonam)；短杆菌肽(Gramicidin)；卤苯炔醚(Haloprogin)；海他西林(Hetacillin)；海他西林钾(Hetacillin Potassium)；海可西定(Hexedine)；依巴沙星(Ibafloxacin)；亚胺培南(Imipenem)；双二氯苯唑(Isoconazole)；异帕米星(Isepamicin)；异烟肼(Isoniazid)；角沙霉素(Josamycin)；硫酸卡那霉素(Kanamycin Sulfate)；，白霉素(Kitasamycin)；左旋呋吗唑酮(Levofuraltadone)；苯氧丙基青霉素钾(Levopropylcillin Potassium)；来西索霉素(Lexithromycin)；林可霉素(Lincomycin)；盐酸林可霉素(LincomycinHydrochloride)；罗美沙星(Lomefloxacin)；盐酸罗美沙星(LomefloxacinHydrochloride)；甲磺酸罗美沙星(Lomefloxacin Mesylate)；洛拉卡比(Loracarbef)；磺胺米隆(Mafenide)；氯甲烯土霉素(Meclocycline)；磺基水杨酸氯甲烯土霉素(Meclocycline Sulfosalicylate)；巨霉素磷酸二氢钾(Megalomicin PotassiumPhosphate)；美喹多司(Mequidox)；倍能(Meropenem)；甲烯土霉素(Methacycline)；盐酸甲烯土霉素(Methacycline Hydrochloride)；乌洛托品(Methenamine)；马尿酸乌洛托品(Methenamine Hippurate)；孟德立酸乌洛托品(Methenamine(Mandelate)；甲氧苯青霉素钠(Methicillin Sodium)；甲硫苄嘧啶(Metioprim)；甲硝唑盐酸盐(Metronidazole Hydrochloride)；甲硝唑磷酸盐(Metronidazole Phosphate)；美洛西林(Mezlocillin)；美洛西林钠(Mezlocillin Sodium)；米诺环素(Minocycline)；盐酸米诺环素(Minocycline Hydrochloride)；米林可霉素盐酸盐(Mirincaniycin Hydrochloride)；莫能星(Monensin)；莫能星钠(Monensin Sodium)；萘夫西林钠(Nafcillin Sodium)；萘啶酮酸钠(Nalidixate Sodium)；萘啶酸(Nalidixic Acid)；纳他霉素(Natamycin)；妥布霉素(Nebramycin)；棕榈酸新霉素(Neomycin Palmitate)；硫酸新霉素(NeomycinSulfate)；十一烯酸新霉素(Neomycin Undecylenate)；硫酸萘替米星(NetilmicinSulfate)；中性霉素(Neutramycin)；硝呋拉定(Nifuradene)；硝呋地腙(Nifuraldezone)；硝呋噁酮(Nifuratei)；硝呋隆(Nifuratrone)；硝呋达齐(Nifurdazil)；硝呋米特(Nifurimide)；硝呋吡醇(Nifurpirinol)；硝呋奎唑(Nifurquinazol)；硝呋噻唑(Nifurthiazole)；硝基四环素(Nitrocycline)；呋喃妥因(Nitrofurantoin)；二硝苯甲酰胺(Nitromide)；氟哌酸(Norfloxacin)；新生霉素钠(Novobiocin Sodium)；氧氟沙星(Ofloxacin)；奥美普林(Ormetoprim)；苯唑西林钠(Oxacillin Sodium)；肟莫南(Oximonam)；肟莫南钠(Oximonam Sodium)；奥索利酸(Oxolinic Acid)；土霉素(Oxytetracycline)；土霉素钙(Oxytetracycline Calcium)；盐酸土霉素(OxytetracyclineHydrochloride)；帕地霉素(Paldimycin)；对氯酚(Parachlorophenol)；保洛霉素(Paulomycin)；培氟沙星(Pefloxacin)；甲磺酸培氟沙星(Pefloxacin Mesylate)；青霉素G双酯(Penamecillin)；苄星青霉素G(Penicillin G Benzathine)；青霉素G钾(Penicillin G(Potassium)；普鲁卡因青霉素G(Penicillin G Procaine)；青霉素G钠(Penicillin G Sodium)；青霉素V(Penicillin V)；苄星青霉素V(Penicillin VBenzathine)；哈胺青霉素V(Penicillin V Hydrabamine)；青霉素V钾(Penicillin V(Potassium)；戊胺唑酮钠(Pentizidone Sodium)；对氨水杨酸苯酯(PhenylAminosalicylate)；哌拉西林钠(Piperacillin Sodium)；吡苄西林钠(PirbenicillinSodium)；吡地西林钠(Piridicillin Sodium)；盐酸吡利霉素(Pirlimycin Hydrochloride)；盐酸匹氨青霉素(Pivampicillin Hydrochloride)；双羟萘酸匹氨西林(PivampicillinPamoate)；丙苯酸匹氨青霉素(Pivampicillin Probenate)；硫酸多粘菌素B(PolymyxinB Sulfate)；泊非霉素(Porfiromycin)；Propikacin；吡嗪酰胺(Pyrazinamide)；巯氧吡啶锌(Pyrithione Zinc)；醋酸喹癸胺(Quindecamine Acetate)；奎奴普丁(Quinupristin)；消旋甲砜霉素(Racephenicol)；雷冒拉宁(Ramoplanin)；雷尼霉素(Ranimycin)；雷洛霉素(Relomycin)；里泼罗霉素(Repromicin)；利福布丁(Rifabutin)；利福美坦(Rifametane)；利福克昔(Rifamexil)；利福酰胺(Rifamide)；利福平(Rifampin)；利福喷丁(Rifapentine)；利福昔明(Rifaximin)；吡咯烷甲基四环素(Rolitetracycline)；硝酸罗列环素(Rolitetracycline Nitrate)；罗沙米星(Rosaramicin)；罗沙米星丁酸盐(Rosaramicin Butyrate)；罗沙米星丙酸盐(Rosaramicin Propionate)；磷酸罗沙米星钠(Rosaramicin Sodium Phosphate)；罗沙米星硬脂酸盐(Rosaramicin Stearate)；罗索沙星(Rosoxacin)；硝酚胂酸(Roxarsone)；罗红霉素(Roxithromycin)；去甲去氧四环素(Sancycline)；山费培南钠(Sanfetrinem Sodium)；酚咪青霉素(Sarmoxicillin)；沙匹西林(Sarpicillin)；司可芬净(Scopafingin)；西苏霉素(Sisomicin)；硫酸西索霉素(SisomicinSulfate)；施怕沙星(Sparfioxacin)；盐酸壮观霉素(Spectinomycin Hydrochloride)；乙酰螺旋霉素(Spiramycin)；盐酸偏端菌素(Stallimycin Hydrochloride)；司替霉素(Steffimycin)；硫酸链霉素(Streptomycin Sulfate)；链霉素异烟肼(Streptonicozid)；磺胺苯(Sulfabenz)；苯甲酰磺胺(Sulfabenzamide)；磺胺醋酰(Sulfacetamide)；磺胺醋酰钠(Sulfacetamide Sodium)；磺胺西汀(Sulfacytine)；磺胺嘧啶(Sulfadiazine)；磺胺嘧啶钠(Sulfadiazine Sodium)；碘胺多辛(Sulfadoxine)；磺胺林(Sulfalene)；磺胺乙胞嘧啶(Sulfamerazine)；磺胺(5)对甲氧嘧啶(Sulfameter)；磺胺二甲基嘧啶(Sulfamethazine)；磺胺甲噻二唑(Sulfamethizole)；磺胺甲基异噁唑(Sulfamethoxazole)；磺胺间甲氧嘧啶(Sulfamonomethoxine)；磺胺二甲噁唑(Sulfamoxole)；磺胺酸锌(Sulfanilate Zinc)；磺胺硝苯(Sulfanitran)；柳氮磺吡啶(Sulfasalazine)；磺胺甲异噻唑(Sulfasomizole)；磺胺塞唑(Sulfathiazole)；磺胺甲苯吡唑(Sulfazamet)；磺胺异恶唑(Sulfisoxazole)；磺胺乙酰异噁唑(SulfisoxazoleAcetyl)；磺胺异噁唑二乙醇胺盐(Sulfisoxazole Diolamine)；磺粘菌素(Sulfomyxin)；硫培南(Sulopenem)；青霉烷砜(Sultamicillin)；磺氨苄青霉素钠(Suncillin Sodium)；氨苄青霉素酞酯盐酸盐(Talampicillin Hydrochloride)；替考拉宁(Teicoplanin)；替马氟沙星盐酸盐(Temafloxacin Hydrochloride)；替莫西林(Temocillin)；四环素(Tetracycline)；盐酸四环素(Tetracycline Hydrochloride)；四环素磷酸复盐(Tetracycline Phosphate Complex)；四氧普林(Tetroxoprim)；甲砜氯霉素(Thiamphenicol)；Thiphencillin Potassium；羧噻酚青霉素甲苯酯钠(Ticarcillin CresylSodium)；替卡西林二钠(Ticarcillin Disodium)；替卡西林钠(Ticarcillin Monosodium)；氯苯异噻酮(Ticlatone)；氯化氯苯噻碘(Tiodonium Chloride)；妥布霉素(Tobramycin)；硫酸妥布霉素(Tobramycin Sulfate)；托氟沙星(Tosufloxacin)；甲氧苄氨嘧啶(Trimethoprim)；硫酸甲氧苄啶(Trimethoprim Sulfate)；三磺嘧啶(Trisulfapyrimidines)；醋竹桃霉素(Troleandomycin)；硫酸丙大观霉素(Trospectomycin Sulfate)；短杆菌素(Tyrothricin)；万古霉素(Vancomycin)；万古霉素盐酸盐(Vancomycin Hydrochloride)；维吉霉素(Virginiamycin)；拉来霉素(Zorbamycin)。

抗生素治疗、其剂量、给药途径以及推荐的用法是本领域公知的并已在例如Physicians’Desk Reference(58th ed.，2004)和Merck Veterinary Manual(8th ed.，1998)中描述。

5.7.5免疫调节治疗

本领域所属技术人员公知的任何免疫调节剂都可用于本发明的组合物和方法中。免疫调节剂可影响个体免疫反应的一个或多个或所有方面。所述免疫反应的方面包括但不限于炎性反应、补体级联反应、白细胞和淋巴细胞分化、增殖、和/或效应子功能、单核细胞和/或嗜碱性粒细胞计数，以及免疫系统细胞中的细胞间联系。在本发明的某些实施方案中，免疫调节剂调节免疫反应的一个方面。在其它实施方案中，免疫调节剂不止调节免疫反应的一个方面。在本发明优选的实施方案中，给予个体免疫调节剂以抑制或降低该个体免疫反应能力的一个或多个方面。在某些实施方案中，免疫调节剂不是抗炎剂。在某些实施方案中，免疫调节剂不是抗血管生成剂。在某些实施方案中，免疫调节剂为化疗剂。在某些实施方案中，免疫调节剂不是化疗剂。

免疫调节剂的实例包括但不限于蛋白类试剂(例如细胞因子、肽模拟物和抗体(例如，人抗体、人源化抗体、单克隆抗体、多克隆抗体，抗体的Fvs、ScFvs、Fab或F(ab)₂片段、或抗原决定簇结合片段))、核酸分子(例如，反义核酸分子或三螺旋)、小分子、有机化合物和无机化合物。特别是，免疫调节剂包括但不限于甲氨喋呤(methotrexate)、来氟米特(leflunomide)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、环磷酰胺(Cytoxan)、硫唑嘌呤(Immuran)、环胞素A(cyclosporine A)、米诺环素(minocycline)、硫唑嘌呤(azathioprine)、抗生素(例如，FK506(他克莫司(tacrolimus))、甲基氢化泼尼松(methylprednisolone)(MP)、皮质类固醇、类固醇、考酚酸莫酯(mycophenolate mofetil)、雷怕霉素(rapamycin)(西罗莫司，sirolimus)、咪唑立宾(mizoribine)、脱氧精胍菌素(deoxyspergualin)、布喹特林(brequinar)、malononitriloamindes(例如，来氟米特(leflunamide))、T细胞受体调节剂以及细胞因子受体调节剂。

T细胞受体调节剂的实例包括但不限于抗T细胞受体抗体(例如，抗-CD4抗体(例如，cM-T412(Boeringer)、IDEC-CE9.1

(IDEC和SKB)、mAB 4162W94、Orthoclone和OKTcdr4a(Janssen-Cilag))、抗-CD2抗体、抗-CD3抗体(例如，Nuvion(Product Design Labs)、OKT3(Johnson&Johnson)或者Rituxan(IDEC))、抗-CD5抗体(例如，抗-CD5蓖麻蛋白(ricin)-连接的免疫交联物)、抗-CD7抗体(例如，CHH-380(Novartis))、抗-CD8抗体、抗-CD40配体单克隆抗体(例如，IDEC-131(IDEC))、抗-CD52抗体(例如，CAMPATH IH(Ilex))、抗-CD2抗体、抗-CD11a抗体(例如，Xanelim(Genentech))和抗-B7抗体(例如，IDEC-114)(IDEC)))、CTLA4-免疫球蛋白，以及LFA-3TIP(Biogen，国际公开号WO 93/08656和美国专利第6,162,432号)。

细胞因子受体调节剂的实例包括但不限于可溶性细胞因子受体(例如，TNF-α受体的胞外域或其片段、IL-1β受体的胞外域或其片段，以及IL-6受体的胞外域或其片段)、细胞因子或其片段(例如，白介素IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-15、IL-23、TNF-α、TNF-β、干扰素(IFN)-α、IFN-β、IFN-γ以及GM-CSF)、抗细胞因子受体抗体(例如，抗IFN受体抗体、抗IL-2受体抗体(例如Zenapax(Protein Design Labs))、抗IL-3受体抗体、抗IL-4受体抗体、抗IL-6受体抗体、抗IL-9受体抗体、抗IL-10受体抗体、抗IL-12受体抗体、抗IL-13受体抗体、抗IL-15受体抗体以及抗IL-23受体抗体)、抗细胞因子抗体(例如，抗IFN抗体、抗TNF-α抗体、抗-IL-1β抗体、抗IL-3抗体、抗IL-6抗体、抗IL-8抗体(例如，ABX-IL-8(Abgenix))、抗IL-9抗体、抗IL-12抗体、抗IL-13抗体、抗IL-15抗体以及抗IL-23抗体)。

在具体的实施方案中，细胞因子受体调节剂为IL-3、IL-4、IL-10或其片段。在另一实施方案中，细胞因子受体调节剂为抗IL-1β抗体、抗IL-6抗体、抗IL-12受体抗体或抗TNF_-α抗体。在另一实施方案中，细胞因子受体调节剂为TNF_-α受体的胞外域或其片段。

在某些实施方案中，免疫调节剂为B细胞受体调节剂。B细胞受体调节剂的实例包括但不限于CD19。靶向B细胞受体提供了调节B细胞的一种手段。

在优选的实施方案中，用作免疫调节剂的蛋白、多肽或肽(包括抗体)来自与施用该蛋白、多肽或肽的受者相同的物种，从而减少对这些蛋白、多肽或肽的免疫反应的可能性。在另一优选的实施方案中，当所述个体为猪时，用作免疫调节剂的蛋白、多肽或肽来自猪。

根据本发明，在给予个体减毒猪流感病毒之前、之后或同时，给予一种或多种免疫调节剂。可以用本领域所属技术人员公知的任何技术检测具体个体的免疫反应的一个或多个方面，并由此确定何时需要给予该个体免疫调节剂。在优选的实施方案中，在个体中维持大约500细胞/mm³、优选600细胞/mm³、650细胞/mm³、700细胞/mm³、750细胞/mm³、800细胞/mm³、900细胞/mm³、1000细胞/mm³、1100细胞/mm³或者1200细胞/mm³的平均绝对淋巴细胞计数。

优选地，可商业获得的和已知具有免疫调节剂功能的试剂可根据本发明方法来使用。可通过本领域所属技术人员公知的任何技术在体外和/或体内确定试剂的免疫调节活性，这样的技术包括例如，对于特定蛋白质例如共刺激分子和细胞因子的表达，可以使用CTL分析、增殖分析和免疫分析(例如，ELISA)。

5.8给药的剂量与频率

可以通过标准的临床方法确定本发明预防性试剂或治疗性试剂或组合物在以下应用中的剂量：有效地预防、治疗、控制和/或改善猪流感病毒感染或与其相关的不适、猪流感病毒感染外的其它感染或与其相关的不适、IFN可治疗性疾病或不适(其中本发明的减毒猪流感病毒被用作载体来诱导针对与该不适相关的抗原的免疫反应)，或者预防与下述情况相关的一种或多种症状的复发、发作或发展：猪流感病毒感染或与其相关的不适、猪流感病毒感染外的其它感染或与其相关的不适、IFN可治疗性疾病、或不适(其中本发明的减毒猪流感病毒被用作载体来诱导针对与该不适相关的抗原的免疫反应)。频率和剂量也可根据每一患者的具体因素(取决于施用的具体治疗性试剂(例如，一种或多种具体治疗性试剂或预防性试剂)，病症、疾病或不适的严重程度，给药途径，以及年龄、体重、反应以及患者的既往医疗史)不同而不同。例如，可根据例如本领域技术人员所知的动物模型来确定本发明的预防或治疗性试剂或组合物在以下应用中的剂量：本发明预防性试剂或治疗性试剂或组合物在以下应用中的剂量：有效地预防、治疗、控制和/或改善猪流感病毒感染或与其相关的不适、猪流感病毒感染外的其它感染或与其相关的不适、IFN可治疗性疾病，或者预防与下述情况相关的一种或多种症状的复发、发作或发展：猪流感病毒感染或与其相关的不适、猪流感病毒感染外的其它感染或与其相关的不适、IFN可治疗性疾病。此外，可以任选地利用体外试验来帮助鉴定最佳的剂量范围。本领域所属技术人员能够通过考虑这些因素、并且参考文献报导的以及Physician′s Desk Reference(第58版，2004)，Merck Veterinary Manual(第8版，1998)，或Straw等，Diseases of theSwine，Iowa State University Press(1999)所建议的剂量来选择适合的方案。

疫苗或免疫原性制剂的示例性剂量包括10²至约10⁸pfu、约10³至约10⁷pfu、约10⁴至约5x 10⁶pfu或10⁴至约10⁷pfu。在其它实施方案中，给予个体的本发明疫苗或免疫原性制剂的剂量为10²、5×10²，10³、5×10³、10⁴、5×10⁴、10⁵、5×10⁵、10⁶、5×10⁶、10⁷、5×10⁷或10⁸pfu。药物制剂的示例性剂量包括10²、5×10²、10³、5×10³、10⁴、5×10⁴、10⁵、5×10⁵、10⁶、5×10⁶、10⁷、5×10⁷、10⁸、5×10⁸、1×10⁹、5×10⁹、1×10¹⁰、5×10¹⁰、1×10¹¹、5×10¹¹或10¹²pfu。在某些实施方案中，给予个体药物制剂的剂量为约10²至约10¹²pfu、约10²至约10¹⁰pfu、约10²至约10⁸pfu、约10³至约10⁹pfu、约10³至约10⁷pfu、约10⁴至约10⁸pfu、约10⁴至约5x 10⁶pfu或约10⁴至约10¹²pfu。

小分子的示例性剂量包括每千克个体或样品的小分子毫克或微克量(例如，约1微克每千克至约500毫克每千克、约100微克每千克至约5毫克每千克或者约1微克每千克至约50微克每千克)。

对于本发明包括的抗体、蛋白质、多肽、肽和融合蛋白，给予患者的剂量通常为0.0001mg/kg至100mg/kg患者体重。优选地，给予患者的剂量为0.0001mg/kg至20mg/kg、0.0001mg/kg至10mg/kg、0.0001mg/kg至5mg/kg、0.0001至2mg/kg、0.0001至1mg/kg、0.0001mg/kg至0.75mg/kg、0.0001mg/kg至0.5mg/kg、0.0001mg/kg至0.25mg/kg、0.0001至0.15mg/kg、0.0001至0.10mg/kg、0.001至0.5mg/kg、0.01至0.25mg/kg或者0.01至0.10mg/kg患者体重。通常，由于对外源多肽的免疫反应，猪抗体比来自其它物种的抗体在猪中具有更长的半衰期。因此，常常可以施用较低剂量的猪抗体以及较低频率对猪给药。此外，可通过修饰例如脂化来增强抗体的摄取和组织穿透来降低抗体或其片段的施用剂量和频率。

优选地，用于本发明联合治疗中的预防性试剂或治疗性试剂的剂量低于那些在以下应用中已经使用或正在使用的预防性试剂或治疗性试剂的量：预防、治疗、控制和/或改善猪流感病毒感染或不适或与其相关的症状、猪流感病毒感染外的其它感染或不适或与其相关的症状、IFN可治疗疾病，或不适(其中本发明的减毒猪流感病毒被用作载体来诱导针对与该不适相关的抗原的免疫反应)。目前用于预防、治疗、控制和/或改善猪流感病毒感染或不适或与其相关的症状、猪流感病毒感染外的其它感染或不适或与其相关的症状、IFN可治疗疾病或不适(其中本发明的减毒猪流感病毒被用作载体来诱导针对与该不适相关的抗原的免疫反应)的试剂的推荐剂量可从本领域任何文献中获得，包括但不限于Hardman等遍，2001，Goodman&Gilman′s The Pharmacological Basis Of Basis OfTherapeutics，第10版，Mc-Graw-Hill，New York；Physicians′Desk Reference(PDR)第58版，2004，Medical Economics Co.，Inc.，Montvale，NJ，and Merck VeterinaryManual(第8版，1998)；Taylor，Pig Diseases，第6版，Diamond Farm Book Pubns，1995；和Straw等，Diseases of Swine，第8版，Iowa State University Press，1999，本发明将其全部引入作为参考。

在不同的实施方案中，治疗(例如，预防性试剂或治疗试剂)施用的间隔少于5分钟、少于30分钟、1小时、约1小时、约1至约2小时、约2小时至约3小时、约3小时至约4小时、约4小时至约5小时、约5小时至约6小时、约6小时至约7小时、约7小时至约8小时、约8小时至约9小时、约9小时至约10小时、约10小时至约11小时、约11小时至约12小时、约12小时至18小时、18小时至24小时、24小时至36小时、36小时至48小时、48小时至52小时、52小时至60小时、60小时至72小时、72小时至84小时、84小时至96小时或96小时至120小时。在优选的实施方案中，两种或更多种的治疗在同一次患者就诊中给予。

在某些实施方案中，本发明的一种或多种组合物和一种和多种其它治疗(例如，预防性试剂或治疗试剂)被循环施用。循环治疗涉及施用第一治疗(例如，第一预防性试剂或治疗试剂)一段时间，随后施用第二治疗(例如，第二预防性试剂或治疗试剂)一段时间，任选地，随后施用第三治疗(例如，预防性试剂或治疗试剂)一段时间，并重复这一顺序性施用(即循环)，以减少对某一治疗性试剂形成耐药性，以避免或减少某一治疗性试剂的副作用和/或提高治疗性试剂的疗效。

在某些其它的实施方案中，本发明的疫苗或免疫原组合物以单一剂量施用于个体，然后在3至6后施用第二剂量。根据这些实施方案，在第二疫苗免疫后6-12个月的间隔，对该个体给予加强疫苗免疫。在优选的实施方案中，该个体为哺乳动物。在更优选的实施方案中，该个体为A型猪流感病毒感染的猪。

在某些实施方案中，可重复施用本发明的相同组合物，施用的间隔可以为至少1天、2天、3天、5天、10天、15天、30天、45天、2个月、75天、3个月或至少6个月。在其它实施方案中，除了本发明组合物外，可重复施用相同的治疗(例如，预防性试剂或治疗试剂)，施用间隔可以为至少1天、2天、3天、5天、10天、15天、30天、45天、2个月、75天、3个月或至少6个月。

5.9生物学分析试验

5.9.1体外分析试验

本发明减毒猪流感病毒的生长可在猪细胞例如PK细胞、本发明所述的其它猪细胞以及有IFN活性的和IFN缺失的细胞中进行分析。在具体实施方案中，以0.0005至0.001、0.001至0.01、0.01至0.1、0.1至1或1至10的MOI，或者以0.0005、0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1、5或10的MOI感染PK细胞，并用含5％尿囊液的无血清培养基培养(F.Cook，University of Kentucky，Lexington，KY)。通过下述在MDCK细胞中形成的HA空斑来测定上清液中的病毒滴度。可测定其中病毒滴度的其它细胞包括但不限于PK细胞、Vero细胞、原代人脐静脉内皮细胞细胞(HUVEC)、H292人上皮细胞株、HeLa细胞以及猪胎肾细胞RES。

病毒分析试验包括用本领域公知的方法在体外检测培养细胞中病毒复制(例如，通过空斑形成所测定)或病毒蛋白生成(例如，通过western印迹分析所测定)或病毒RNA生成(例如，通过RT-PCR或northern印迹分析测定)的改变的那些试验。

IFN反应的诱导可通过测定待检测的突变病毒感染后IFN途径组分的磷酸化状态来确定，例如，IRF-3，其在对双链RNA的反应中被磷酸化的。在对I型IFN的反应中，Jak1激酶和TyK2激酶、IFN受体亚基、STAT1和STAT2被快速酪氨酸磷酸化。因此，为确定减毒猪流感病毒是否诱导IFN反应，用待检测的突变病毒感染细胞例如293细胞，并在感染后裂解该细胞。利用特异性多克隆血清或抗体将IFN途径组分例如Jak1激酶或TyK2激酶从被感染的细胞裂解物中免疫沉淀出来，利用抗磷酸酪氨酸抗体的免疫印迹试验来确定激酶的酪氨酸磷酸化状态(例如参见Krishnan等，1997，Eur.J.Biochem.247：298-305)。减毒猪流感病毒感染后，IFN途径任何组分增强的磷酸化状态提示该减毒猪流感病毒诱导IFN反应。

IFN反应的诱导可通过测定待检测突变病毒感染后IFN依赖的转录活性来确定。在此实施方案中，已知由IFN诱导的基因的表达，例如Mx、PKR、2-5-寡聚腺苷酸合成酶、I类主要组织相容性复合物(MHC)等，可通过本领域技术人员公知的技术(例如，northern印迹、western印迹、PCR等)来分析。可供选择地，待检测的细胞例如胎肾细胞或成骨肉瘤细胞被工程化来瞬时或组成性地表达干扰素刺激反应元件(例如ISG-54K基因的IFN刺激启动子)控制的报告基因例如荧光素酶报告基因或氯霉素转移酶(CAT)(Bluyssen等，1994，Eur.J.Biochem.220：395-402)。用待检测的减毒猪流感病毒感染细胞，并将报告基因的表达水平与未感染的细胞或野生型病毒感染的细胞比较。待检测的病毒感染后，报告基因表达水平的增加提示该待检测的减毒猪流感病毒诱导IFN反应。

对IFN诱导的测量也可以通过测定来自待检测减毒猪流感病毒感染细胞或蛋的提取物是否赋予针对病毒感染的保护作用。更具体的，用待检测的减毒猪流感病毒或野生型病毒感染10-12天龄的含胚鸡蛋或10天龄组。感染后大约15至20小时，收集尿囊液，并通过测定对组织培养细胞例如MDCK细胞中猪流感病毒感染的保护活性的最高稀释度来检测IFN活性。

5.9.2体内分析试验

本发明的减毒猪流感病毒毒力的降低可在个体特别是猪中进行评价。在一个实例中，将诱导猪肺损伤和引起猪感染的能力与野生型猪流感病毒和假病毒比较。通过视觉观察，以病毒感染后健康肺叶的百分比来评价肺损伤。感染后(p.i.)5天，通过静脉内给予戊巴比妥使动物安乐死，并取出全部肺。视觉评价每一肺叶表面的肉眼可见损伤的百分比。将所有百分比平均从而获得每个动物7叶肺的平均值。

在其它分析试验中，可检测鼻擦拭签和BALF来确定病毒负载或滴度。在尸检中取鼻擦拭签来确定感染后的病毒负载。也可从活猪小心采集样品来确定感染后的病毒负载。肺从胸腔取出后，用约30ml无血清的McCoy′s培养液灌洗肺(通过气管)可获得BALF。

为了定量组织样品中的病毒，在磷酸盐缓冲液(PBS)中研磨组织样品，并将澄清了的匀浆稀释液在37℃下被单层MDCK细胞上吸附1小时。随后用含0.1％牛血清白蛋白(BSA)、0.01％DEAE-右旋糖苷、0.1％NaHCO₃和1％琼脂的最低必需培养液覆盖被感染的细胞。孵育培养板2至3天直到可观察到空斑。组织培养感染剂量(TCID)分析试验根据如下所述进行，来滴定PR8-感染样品的病毒。将96孔培养板中MDCK细胞的融合单层与培养液中指数稀释的澄清化组织匀浆液一起孵育。孵育2-3天后，通过血细胞凝集试验(HA分析)来评估每一孔0.05ml份的病毒生长。

在其它的分析试验中，在感染后进行组织病理学的评价。检测鼻甲骨和气管的上皮改变和上皮下炎症。在大、中、小或终末细支气管中，检测肺的细支气管上皮改变和细支气管周围的炎症。还评价了肺泡的炎症改变。中等细支气管按如下0至3+进行分级：0(正常：被覆顶端有纤毛和具有基底假复层核的中等至高柱状上皮细胞；最小限度的炎症)；1+(柱状上皮层，轮廓平坦，并仅有轻微的增生；在许多细胞上仍可见纤毛)；2+(从变薄至显著增生的明显上皮改变；在腔的边界处细胞紊乱并且层的轮廓不规则)；3+(上皮层显著破坏并紊乱，腔中可见坏死的细胞；一些细支气管变薄而其它的显著反应性增生)。

气管按如下0至2.5+度进行分级：0(正常：被覆顶端有纤毛、具有基底和假复层核的中等至高柱状上皮细胞。顶端与核之间细胞浆明显。偶有鳞状细胞的少量聚集)；1+(上皮层的灶状鳞状化生)；2+(大量上皮层的弥漫性鳞状化生，纤毛呈灶状明显)；2.5+(弥漫性鳞状化生，纤毛很少)。

用NP特异性多克隆抗体进行猪流感病毒免疫组织化学。染色按以下0至3+分级：0(无感染细胞)；0.5+(较少感染细胞)；1+(很少的感染细胞，呈广泛分散的单个细胞)；1.5+(很少的感染细胞，呈广泛的分散并有小的细胞聚集)；2+(中等数量的感染细胞，通常影响部分覆盖细支气管的上皮层的邻近细胞丛，或肺泡中小叶的细胞丛)；3+(大量感染细胞，影响大部分细支气管上皮层，或在广泛分布于肺泡中大的小叶)。

5.9.3测定病毒滴度

通过将连续稀释的猪流感病毒与细胞培养物(例如，猪培养物)、鸡胚或活动物(例如，猪)孵育来测定病毒滴度。在将所述病毒孵育特定时间后，用标准方法来分离所述病毒。

可利用病毒上清液的PCR反应(Quinn & Trevor，1997；Morgan等，1990)、血细胞凝集试验、组织培养感染剂量(TCID50)或蛋感染剂量(EID50)来对病毒滴度的进行物理定量。

HA试验在V型底96孔培养板进行。每一样品的连续2倍的PBS稀释在冰上与等体积的PBS中的0.5％鸡红细胞悬浮液共孵育1小时。阳性孔含有粘附的均一层的红细胞；阴性孔含有非粘附的颗粒。

5.9.4测定血细胞凝集抑制性抗体滴度

在一个方法中，HA抑制试验，如前所述(Palmer等，1975，Advanced laboratorytechniques for influenza diagnosis.U.S.Department of Health，Education and WelfareImmunology Series.U.S.Department of Health，Education and Welfare，Washington，D.C)测定样品中血细胞凝集(HA)抑制性(HI)抗体的水平。简言之，将样品在37℃与4倍体积的从Vibrio cholerae制备的受体破坏酶(Denka Seiken Co.，Tokyo，Japan)孵育过夜。将该样品在56℃孵育60分钟使受体破坏酶失活，将血清的两倍系列稀释液与4HA单位的猪流感病毒孵育。加入0.5％(体积/体积)鸡红细胞开始试验，HI抗体滴度定义为导致聚集完全抑制的最高稀释的倒数。

5.9.5毒性研究

本发明组合物的毒性和/或效力可通过在细胞培养或试验动物上进行的标准药学上的操作来测定，例如，测定LD50(50％群体致死剂量)和ED50(50％群体治疗有效量)。毒性和治疗效果的剂量比值为治疗指数，可表示为比值LD50/ED50。优选治疗指数高的治疗性试剂。当使用具有毒性副作用的治疗性试剂时，为了将对未感染的细胞的潜在损伤最小化，应注意设计将这些制剂靶向至被影响组织位点的输送系统，并由此降低副作用。

从细胞培养试验和动物研究中获得的数据可用来配制用于个体(例如，猪)的治疗性试剂的剂量范围。这种试剂的剂量优选在包括ED50的毒性很少或不具有毒性的循环浓度范围内。根据使用的剂型和给药途径，剂量可在该范围内变化。对于本发明方法使用的任何治疗性试剂，可从细胞培养试验中初步估计治疗有效量。可在动物模型中配方剂量，来达到包括细胞培养中测定的IC50(即，达到症状半数最大抑制的待检测化合物的浓度)在内的循环血浆浓度范围。可利用这种信息更准确地确定用于个体(例如，猪)的剂量。通过例如高效液相色谱可检测血浆中的水平。

此外，本领域所属技术人员公知的任何试验都可用于评价本发明公开的组合物、联合治疗性试剂预防和/或治疗用途，猪流感病毒感染或不适或与其相关的症状、猪流感病毒感染外的其它感染或不适或与其相关的症状、IFN可治疗性疾病或不适(其中本发明的减毒猪流感病毒可以用作载体来诱导针对与该不适相关的抗原的免疫反应)的用途。

提供以下实施例以进一步阐述本发明，但不是以任何方式限制本发明。

6.实施例

6.1实施例1：编码截短的NS1的质粒衍生Sw/Tx98病毒的生成

利用定点突变使猪流感病毒NS片段产生不同的缺失，突变的方式是NEP的表达没有任何改变而NS 1部分缺失。这样的突变是如下实现的：在NS1ORF中插入终止密码，其后跟随NS1ORF的缺失，且该缺失包含的核苷酸不参与NEP的表达。

细胞和病毒将猪肾-15(PK-15)、猪睾丸(ST)和Madin-Darby犬肾(MDCK)II型细胞在补充了10％胎牛血清(FBS)的最低必需培养基(MEM)中培养。将乳仓鼠肾(BHK)、293T和A549细胞在含10％FBS的DMEM中培养。所有细胞保持在37℃和5％CO₂。流感病毒A/Swine/Texas/4199-2/98(TX/98，H3N2亚型)获自St.Jude Children′s Research Hospital，Memphis，TN的保藏中心。将流感病毒在含胚鸡蛋的尿囊腔或MDCK细胞中培养。在BHK细胞中培养并滴定表达GFP的重组水泡性口膜炎病毒(VSV-GFP)(Stojdl，2003，Cancer Cell 4：263-75)，以用于IFN生物试验。

质粒的构建用TX/98病毒感染MDCK细胞，并根据制造商说明书利用Trizol试剂(Invitrogen)提取总RNA。通过RT-PCR扩增单病毒RNA片段并将所得cDNA克隆至载体pHW2000中来构建八种反向基因质粒pHW-Sw-PB2、pHW-Sw-PB 1、pHW-Sw-PA、pHW-Sw-HA、pHW-Sw-NP、pHW-Sw-NA，pHW-Sw-M和pHW-Sw-NS(对应表1所列的八种流感病毒片段)(Hoffmann等，2000，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97：6108-6113)。pHW-Sw-PB2、pHW-Sw-PB 1、pHW-Sw-PA、pHW-Sw-HA、pHW-Sw-NP、pHW-Sw-NA、pHW-Sw-M和pHW-Sw-NS中的插入序列分别为SEQ ID NO：1-8。此系统中，流感病毒cDNA被插入RNA多聚酶I(polII)启动子和终止子序列之间。整个RNA poII转录单位与RNA聚合酶II(polII)启动子和多聚腺苷酸位点侧翼连接。这两个启动子的方向使得从一种病毒cDNA模板中合成反义病毒RNA和正义mRNA。pHW-Sw-NS-73、pHW-Sw-NS-99和pHW-Sw-NS-126为pHW-Sw-NS的衍生物。这些NS 1突变的质粒通过三分子联接来构建：将两个PCR产物连接在SalI/NgoIV消化的pHW2000-Sw-NS。

如下获得的第一PCR产物在所有三种NS 1突变的质粒中都有：以寡pHW-3′(反向，在质粒pHW2000骨架中退火)GGGTCAAGGAAGGCACGGGGGAGGGGC(SEQ ID NO：9)和寡5′NS-PacI(正向，在NS1基因中退火)GCGCTTAATTAAGAGGGAGCAATCGTTGGAG(SEQ ID NO：10)和pHW2000-Sw-NS作为模板。用NgoIV和Pad来消化此PCR产物。

如下获得的第二PCR产物对每一NS 1突变的质粒是特异的：使用共同的正向引物CMV5′(在pHW2000质粒的CMV启动子中退火)GCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTG(SEQ ID NO：11)和特定的反向引物(在NS1基因中退火)：NS73-Bgl II-PacI-3′GCGCTTAATTAATCAAGATCTAGGATTCCTCTTTCAAAATCC(SEQ ID NO：12)、NS99-Bgl II-PacI-3′GCTTAATTAATCAAGATCTATGACATTTCCTCGAGGGTCATG(SEQ ID NO：13)或NS126-Bgl II-PacI-3！GCGCITAATTAATCAAGATCTACTTTTCCATGATCGCCTGGTCC(SEQ ID NO：14)。用SalI和PacI消化这三种相应的PCR产物，并与PacI/NgoIV消化的第一PCR产物和SalI/NgoIV消化的pHW2000-Sw-N一同用于三分子连接以生成：pHW-Sw-Tx-73、pHW-Sw-Tx-99和pHW-Sw-Tx-126。这些构建体在NS1序列中含有缺失，并且在此缺失后的在3个框架中插入4个终止密码子。参见图1A。核输出蛋白(NEP)ORF在这些构建体中没有改变，NS1ORF仅分别编码野生型NS1蛋白的头73、99和126氨基酸(野生型NS1全长为219氨基酸)。

病毒株如下所述：

Sw/TX/98wt：含野生型NS1基因，代表三重排的H3N2猪流感病毒。

Sw/TX/98/del126：表达野生型NS1蛋白N-末端的126个氨基酸。

Sw/TX/98/del99：表达野生型NS1蛋白N-末端的99个氨基酸。

Sw/TX/98/del73：表达野生型NS1蛋白N-末端的72个氨基酸。

转染介导重组SIV的恢复。如Fodor等(1999，J Virol 73：9679-82)与Neumann等(1999，Proc Natl Acad Sci USA 96：9345-50)所述利用八质粒系统(Hoffmann等，2000，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97：6108-6113)将流感病毒从质粒DNA中恢复。为产成生重组野生型(rWT)TX/98病毒，利用Lipofectamine 2000试剂(Invitrogen)将0.5μg所述8种pHW质粒中的每一种转染到悬浮液中的10⁶个293T细胞中。以相同的方式来生成NS1截短的突变病毒，只是由相应的突变的质粒取代pHW-Sw-NS质粒以回收del73、del99或del126病毒突变株。传代所生成的病毒并利用空斑纯化将其克隆到MDCK细胞中。将病毒储存(virus stock)在7天龄的含胚鸡蛋中培养。利用对共有非编码区特异性的寡核苷酸对重组病毒SIV的RNA进行RT-PCR，对RT-PCR的产物进行凝胶电泳分析来鉴定重组病毒SIV。通过测序来进一步确定野生型NS基因或缺失的NS基因。

结果。为利用反向遗传学生成SIV，将来自Tx/98病毒的八种病毒RNA克隆至双义表达质粒中以恢复病毒(Hoffmann等，2000，Proc.Natl.Acad.Sci.USA97：6108-6113)。将这些质粒在293T细胞中转染后，回收感染的病毒。亲代野生型(WT)和质粒衍生的野生型(rWT)SIV在MDCK细胞和含胚蛋中生长滴度相似。当接种猪时，rWT病毒产生与亲代WT病毒类似的损伤。三种编码NS1蛋白的73、99和126个氨基酸的NS1截短的SIV突变株，与全长219个氨基酸的NS1蛋白(图1A)比对。RT-PCR与测序分析证实截短的NS1基因促在于恢复的病毒制备物中(图1B)。

6.2实施例2：猪流感病毒NS1缺失突变株和野生型A/Swine/Texas/4199-2/98 的表征

为表征NS1基因缺失对猪流感病毒复制特性的影响，比较了6.1节所述的野生型与不同的缺失突变株。还比较了这些突变株对IFN生成的作用。

病毒生长曲线为了分析病毒复制，以指示的感染复数(MOI)感染融合的PK-15细胞并在37℃、在含0.3％牛白蛋白的MEM(MEM/BA)和5％尿囊液中孵育不同的时间。通过在含1μg/ml TPCK胰蛋白酶的MEM/BA中的MDCK细胞上进行空斑试验来测定病毒滴度。滴度以每ml的空斑形成单位(PFU)来表示。

为研究突变NS1病毒的多周期生长特征，以低MOI(MOI＝O.001)感染融合的猪上皮细胞(PK-15)。通过MDCK细胞进行的空斑试验来滴定感染后不同时间点的感染细胞的上清液。当与野生型病毒比较时，NS 1缺失突变株在PK-15细胞中的生长动力学明显不同。有意思的是，1-126突变病毒的生长受到损害最大、其次是1-99和1-73突变株(图2A)。MDCK细胞中的空斑大小与在PK-15细胞中的生长差异相关(图2C)。这些结果表明，Sw/TX/98病毒NS1蛋白的缺失导致在PK-15和MDCK细胞中病毒生长的减弱。相反，当NS1突变病毒以高MOI(MOI＝2)在PK-15细胞中培养时，未观察到生长动力学的显著差异(图2B)。这很可能表明，NS1突变病毒的病毒复制在复制的第一循环不受限制，说明感染的细胞分泌抗病毒细胞因子例如IFN，其抑制复制的后续循环。

接种在22mm平皿的融合PK-15细胞被模拟感染或以MOI为2的rWT、1-73、1-99或1-126病毒感染。细胞在MEM/BA中37℃下孵育不同的时间点，随后用缺乏Met-Cys的MEM中的10μCi[³⁵S]Met-Cys标记2小时。用冰冷的磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤细胞，裂解细胞并通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离全部的细胞提取物。用放射性自显影来观察蛋白。

用[³⁵S]-Met-Cys代谢性标记病毒感染的PK细胞(MOI＝2)，表明rWT以及1-73、1-99和1-126突变病毒NP蛋白合成的动力学没有差异(图2D)。NS1突变体蛋白不能用标记检测。

检测IFN生成的生物分析试验如前所述(Park等，2003，J.Viro1.70：9522-9532；Donelan，2003，J Virol 77：13257-66)略有修改，测定病毒感染细胞分泌的IFN。接种在22mm平皿的融合PK-15细胞被假感染或以MOI为2的rWT、del73、del99或del126病毒感染。感染后，将细胞在含5％尿囊液的MEM/BA中孵育，并在不同的时间点收集上清液。将样品置于冰上放在8-W UV灯(Fisher)下6英寸照射15分钟同时连续搅拌，用UV失活上清液中的病毒。一天前将新的PK-15细胞接种在96孔板中，与UV失活的上清液孵育24小时。随后用VSV-GFP(MOI＝0.1)感染预孵育的PK-15细胞。感染后16小时用荧光显微镜观察表达GFP的细胞。

为了了解所观察到的NS1截短病毒体外生长的降低是否与这些病毒抑制IFN-α/β系统的能力直接相关，研究了重组Sw/Tx/98病毒感染细胞中的IFN诱导。感染的PK-15细胞的上清液被用于测定分泌的IFN-α/β水平，所用生物分析试验是基于VSV-GFP复制的抑制(图3A)。为此，用rWT和NS1突变的SIV(MOI＝2)感染PK-15细胞并每2小时收集上清液共10小时用于IFN测定。结果如图3B所示。假感染细胞的上清液在PK-15中没有VSV-GFP的GFP表达抑制。相反，用感染后10小时del 126病毒感染的细胞上清液预处理的细胞中VSV-GFP复制完全消失。在rWT病毒感染细胞的上清液中，此试验未检测到IFN-α/β。感染后6小时所有NS1截短的病毒都诱导出可检测水平的IFN-α/β，1-126病毒为较强的IFN-α/β诱导剂，其次是del99和del73病毒。在其它病毒感染的猪(ST)和人(A549)细胞株上进行的类似试验得到了基本相同的结果。

利用RT-PCR分析IFN-β和TNF-αmRNA以MOI为2感染PK-15细胞，并在感染后24小时利用Absolutely RNA RT-PCR Miniprep试剂盒(Stratagene)提取总RNA。利用寡T作为引物来实施RT。利用猪IFN-βmRNA的特异引物对(5-SWIFNB+GGCCATGGCTAACAAGTGCATCC(SEQ ID NO：15)，3-SWIFNB-CCGGTCAGTTCCGGAGGTAATC(SEQ ID NO：16))和TNF-αmRNA的特异引物对(5′SW-TNFA-ATGAGCACTGAGAGCATG(SEQ ID NO：17)，3′SW-TNFA-TCACAGGGCAATGATCCC(SEQ ID NO：18))(Genbank编号为M86762和X57321)进行PCR。作为对照，利用β-actin的特异引物(Donelan，2003J Virol 77：13257-66)来扩增猪β-actin的550-bp片段。产物测序并证实是来自所期望的mRNA。

IFN-β和TNF-α转录物的RT-PCR分析显示NS1突变病毒感染的PK-15细胞中存在这些细胞因子的mRNA表达诱导，特别是1-126病毒感染的细胞中(图3C)。这些数据表明重组Sw/Tx/98病毒对IFN生成诱导的抑制能力如下：rWT＞del73＞del99＞del 126。

6.3实施例3：质粒衍生的TX/98突变/缺失病毒的致病机理

在猪中评估6.1节所述的具体猪流感病毒的致病机理。测定了Sw/Tx/98/dell26、Sw/Tx/98/del99和Sw/Tx/98/del73诱导肺损伤的能力以及在猪中引起的感染，并与假病毒和野生型病毒Sw/Tx/98wt的结果进行了比较。以发生损伤的七叶肺的平均健康肺百分比来评价肺损伤。病毒或假病毒的给予如下详述，在尸检中获得鼻擦拭签或BALF来确定感染后5天的病毒负载。进行组织学评价。检查鼻甲骨和气管的上皮改变和上皮下炎症。同时也评价肺泡的炎症改变。

此实施例证明，NS1基因的C-末端缺失导致减毒的表型。

6.3.1方法

猪的感染无病原体感染的杂种(Out-bred)猪来自Iowa(USA)的商业猪农场。这些猪的血清证明抗H3N2(Sw/TX/98and Sw/CO/99)和抗H1N1(Sw/IA/30)SIV的血细胞凝集抑制抗体为阴性(Palmer，1975，(U.S.Department of Health，Education，and Welfare，Washington，D.C)，第51-52页)。4-5头猪组成一组，各组被分别圈养在单独的房间。4周大时，肌肉内注射克他命(ketamine)、甲苯噻嗪(xylazine)、唑氟氮草(zolazepam)和替来他明(tiletamine)麻醉猪(Mengeling，1996，Am J Vet Res57：834-839)，然后在气管内(通过喉镜和气管导管)接种1ml含IxIO⁵PFU的病毒溶液。监视猪的临床指征5天，包括嗜睡、厌食、咳嗽、呼吸过度/呼吸困难、鼻和眼排除物以及每天记录它们的体温。在第5天时，通过静脉内给予戊巴比妥来将动物安乐死(Fort Dodge Animal Health，Fort Dodge，USA)，并整体取出肺。每一肺叶表面肉眼可见损伤的百分比通过视觉观察来评价。平均百分比来获得每一动物7个肺叶的平均值。取出鼻甲骨、气管和右心叶，并用福尔马林固定用于进一步的组织病理学评价。在尸检中，还收集血液、支气管肺泡液(BALF)和鼻擦拭签。从胸腔中取出肺后利用30ml的无血清McCoy′s培养液(通过导管)冲洗肺来获得BALF。所有动物试验符合国立动物疾病中心的公共动物健康与应用委员会(Institutional Animal Care and Use Committee of the National AnimalDisease Center)的规定。

临床观察与取样监测动物的临床指征5天，这些指征包括嗜睡、厌食、咳嗽、呼吸过度/呼吸困难、鼻和眼排出物，并每日记录体温。在尸检中，还收集血液、支气管肺泡液(BALF)和鼻擦拭签。从胸腔中取出肺后利用30ml的无血清McCoy′s培养液(通过导管)冲洗肺来获得BALF。检测鼻擦拭签和BALF来确定病毒负载。

鼻擦拭签和BALF的病毒滴度检测鼻擦拭签和BALF来确定病毒负载。用不含血清含5μg/ml胰蛋白酶的McCoy′s培养基制备10倍的连续稀释液。用该稀释液接种MDCK细胞并用含胰蛋白酶的培养液在微滴定板中37℃孵育72小时。72小时后检测培养板中的细胞病理效果。利用Reed和Muench方法计算病毒滴度(Reed，1938，Am J Hyg 27：493-497)。

组织病理学评估：用苏木精伊红染色鼻甲骨和气管并在显微镜下检查上皮改变和上皮下炎症。检查肺的大、中和小或终末细支气管中的细支气管上皮和细支气管周围炎症。还评估了肺泡的炎症改变。因为损伤最常见于中型气道，因此将来自中间细支气管的数据进行比较。中等细支气管按如下0至3+进行分级：0(正常：被覆顶端有纤毛和具有基底假复层核的中等至高柱状上皮细胞；最少的炎症)；1+(柱状上皮层，轮廓平坦，并仅有轻微的增生；在许多细胞上仍可见纤毛)；2+(从变薄至显著增生的明显上皮改变；在腔的边界处细胞紊乱并且细胞层的轮廓不规则)；3+(上皮层显著破坏并紊乱，腔中可见坏死的细胞；一些细支气管变薄而其它的显著反应性增生)。

气管按如下0至2.5+度进行分级：0(正常：被覆顶端有纤毛、具有基底和假复层核的中等至高柱状上皮细胞。顶端与核之间细胞浆明显。偶有鳞状细胞的少量聚集)；1+(上皮层的灶状鳞状化生)；2+(大量上皮层的弥漫性鳞状化生，纤毛呈灶状明显)；2.5+(弥漫性鳞状化生，纤毛很少)。

用NP特异性多克隆抗体HB65(American Type Culture Collection，Manassas，Virginia)进行SIV免疫组织化学。以小鼠腹水制备该抗体。1/1000的HB65稀释液用于免疫组织化学。利用Dako Envision IHC系统进行该分析。染色按以下0至3+分级：0(无感染细胞)；0.5+(较少感染细胞)；1+(很少的感染细胞，呈广泛分散的单个细胞)；1.5+(很少的感染细胞，呈广泛分散并有小的细胞聚集)；2+(中等数量的感染细胞，通常影响部分覆盖细支气管的上皮层的邻近细胞丛，或肺泡中小叶的细胞丛)；3+(大量感染细胞，影响大部分细支气管上皮层，或在广泛分布于肺泡中大的小叶)。

统计学分析通过双侧Student′s t检验来比较感染和对照组的平均体温、肉眼和组织病理学改变的程度和病毒复制。概率(P)值＜0.05即认为组间具有统计学显著差异。

6.3.2结果

47只4周大的杂种(outbred)猪购自Iowa的商业猪农场。用10⁵pfu的rWT和NS 1突变的Sw/TX/98病毒气管内感染每组10只猪。7只动物仅用培养液来假感染。在rWT、1-73和1-99病毒感染组中感染后(p.i.)1至3天每一感染组的平均直肠温度增加至≥40℃(数据未示出)。并非NS1缺失突变株1-126感染的所有动物都表现温度增加。临床指征包括呼吸困难、鼻分泌、结膜炎和咳嗽在rWT-病毒感染组中感染后2至4开始。在不同的病毒中临床指征的发生也不同。在rWT病毒感染组中大多数临床表现是一致的，而在1-99和1-73病毒感染组中仅观察到某些临床指征。在1-126病毒感染猪中仅观察到升高的体温而无其它临床指征。

在感染后5天的尸检中，评估了具有肉眼可见损伤的每一肺表面的百分比。如图4A所示，假感染对照动物无肉眼可见的肺损伤。与NS1缺失的突变病毒1-99(p＝0.006)或1-126(p＝0.004)感染的猪比较，用rWT Sw/Tx/98病毒感染的猪表现显著较高的肉眼可见肺损伤。NS1缺失的突变病毒1-73感染的猪表现出较少的严重损伤，但没有统计学意义(p＞0.05)。通常，在单独肺叶上观察到的肉眼损伤是显著的、杨李色(plum)的实体区域。与其它肺叶相比，隔膜叶很少受到影响。纵隔淋巴结通常是充血和肿大。

显微镜检查4周大感染猪的右心肺叶组织切片中的中间细支气管，并进行组织病理学计分(图4B)。假感染动物以及1-126病毒感染的猪显示没有或最小的损伤，而rWT以及1-99和1-73Sw/TX/98病毒感染的动物中检测到中度至重度的损伤(图5A-D和6A-D)。亲代野生型感染的所有动物以及一些1-73和1-99病毒感染的动物具有反映支气管上皮细胞层破坏的较高计分(以急性上皮坏死或随后的变薄或反应性增殖为特征)。1-73或1-99病毒感染的大多数动物具有反映气管上皮层轻度增生的的中等记分。NS1缺失突变的1-126病毒感染的动物的肺几乎没有损伤。在肉眼可见的肺损伤中，1-126和1-99感染的猪比rWT感染的猪显示显著的较轻损伤(1-126：p＜0.000l；1-99：p＝0.0002)。有趣的是，在1-73突变体病毒感染的猪细支气管的显微损伤也比亲代rWT病毒显著减少(p＝0.02)。

在感染后5天也分析了BALF中的病毒滴度。如图4C所示，所有病毒在猪呼吸道中复制。与NS1缺失的突变株比较，亲代rWT病毒感染动物的BALF病毒滴度显著升高。这种发现与NS1缺失突变株与野生型Sw/Tx/98病毒感染的猪相比明显不那么广泛的肉眼和显微病变相关。

6.4实施例4：TX/98/del 126作为疫苗的用途

在猪的疫苗免疫研究中，检测了减毒的TX/98/del 126缺失突变株的效力。除用TX/98/del 126以1x10⁵PFU在第0天和第21天通过气管内接种进行两次疫苗免疫外，如实施例3所述实施试验。通过气管内接种来进行疫苗免疫和刺激(利用1ml的病毒溶液/或培养液作为对照)。用以下制剂刺激动物9天或10天：

·每只猪用2x10⁵PFU的野生型H3N2病毒(A/Swine/Texas/4199-2/98-同源性刺激)

·每只猪用2x10⁵PFU野生型H1N1病毒(A/Swine/MN/37866/99经典H1N1-异源性刺激)

·用1ml培养液假刺激

对于组织学评价，用苏木精伊红染色每个肺的右侧心叶并检查大、中和小或终末细支气管中细支气管上皮和细支气管周围炎症。因损伤最常见于中型气道，因此将来自中间细支气管的数据用于比较。通过所检查切片中的损伤分布或程度将损伤的严重程度记分如下：0-无气道受影响。1-仅有少数孤立的气道受到影响；2-受影响的气道的局部簇集，常位于一个或两个小叶中。3-受影响的气道数量低但分布在切片的大部分。4-许多气道受影响，常严重，所有大小的气道。

通过一个训练有素的检查人员来评估织切片。该检查人员对所述组织来源于何组动物不知情。

用对流感病毒核蛋白特异的单克隆抗体进行免疫组织化学分析。抗原记分如下：

0＝无抗原阳性细胞。

1＝气道中偶见少数阳性标记细胞。

2＝少数阳性标记的细胞出现在散在分布的气道中，阳性细胞可局部聚集。

3＝偶见气道(occasional airway)中有中等数量阳性标记细胞。

4＝散在的气道和肺泡中有中等数量的阳性标记细胞。

检测肺灌洗液确定病毒负载。用不含血清含5μg/ml胰蛋白酶的McCoy′s培养基制备10倍连续稀释液。用该稀释液接种MDCK细胞并用含胰蛋白酶的培养液在微滴定板中37℃孵育72小时。72小时后检测培养板中的细胞病理现象。利用Reed和Muench方法计算病毒滴度。

结果在刺激后5天获得以下结果：

1.未进行疫苗免疫、未刺激的猪在其肺组织中没有任何组织病理学改变且不具有流感病毒抗原(图7和8)。感染病毒不存在或低于检测限度(图9)。

2.野生型H3N2TX/98病毒刺激的未疫苗免疫的猪在肺组织表现显著的组织病理学损伤和流感病毒抗原(图7和8)。肺灌洗液的病毒滴度≥10^6.25TCID₅₀/ml。

3.野生型H1N1MN/99病毒刺激的未疫苗免疫的猪在其肺组织中表现显著的组织病理学损伤和流感病毒抗原(图7和8)。肺灌洗液的病毒滴度为≥10^6.0TCID₅₀/ml。

4.疫苗免疫的、假刺激的猪在其肺组织中没有任何组织病理学改变且不具有流感病毒抗原(图7和8)。感染病毒不存在或低于检测限度(图9)。

5.疫苗免疫的、H3N2刺激的猪在其肺组织中没有任何组织病理学改变且不具有流感病毒抗原(图7和8)。感染病毒不存在或低于检测限度(图9)。

6.疫苗免疫的、H1N1刺激的猪与未疫苗免疫的、H1N1刺激的猪相比，肺组织具有显著降低的组织病理学改变(p＜0.001)。这些猪在其肺组织中不具有流感病毒抗原(图7和8)。与未进行疫苗免疫、H1N1刺激的动物相比，肺灌洗液中的感染病毒显著降低(p＜0.001)(图9)。

综上，用减毒的TX/98/del 126突变株免疫的猪产生针对同源病毒分离物刺激(H3N2A/Swine/Texas/4199-2/98病毒刺激)的保护性免疫。当用属于不同流感病毒亚型的病毒刺激(H1N1A/Swine/MN/37866/99病毒刺激)免疫了的猪时，在接种5天后，与未疫苗免疫的对照相比，该异源病毒刺激导致肺组织中显著降低的损伤和肺灌洗液中显著降低的病毒负载。

这些数据显示减毒的TX/98/del 126突变株作为修饰的活病毒疫苗的用途，该疫苗显示了针对同源/同型刺激的保护性免疫和针对异源/异型刺激的显著保护。

6.5等同的

本发明的范围不受所述具体实施方案的限制，这些实施方案仅作为本发明各方面的示例，功能上等同的方法和组分均属于本发明的范围。当然，除了这里所显示和描述的，根据上面的描述和附图，本发明的各种变化对本领域所属技术人员是显而易见的。这种变化应落入所附权利要求的范围内。

这里引用的各参考文献，其内容被全部引入作为参考。

Claims (10)

1.免疫原性制剂，其含有干扰素拮抗表型受损的遗传工程化减毒猪流感病毒和生理学可接受的赋形剂，其中所述病毒包含具有突变的猪流感病毒NS1基因，所述突变导致除氨基酸残基1-126之外的所有NS1氨基酸残基的缺失，且其中氨基末端氨基酸为1位。

2.如权利要求1所述的免疫原性制剂，其中所述猪流感病毒NS1基因中的突变位于猪流感病毒A/Swine/Texas/4199-2/98NS1基因。

3.如权利要求1所述的免疫原性制剂，其中所述猪流感病毒NS 1基因中的突变位于以下猪流感病毒的NS1基因中：A/Swine/Colorado/1/77、A/Swine/Colorado/23619/99、A/Swine/Co te d′Armor/3633/84、A/Swine/Coted′Armor/3633/84、A/Swine/England/195852/92、A/Swine/Finistere/2899/82、A/Swine/HongKong/10/98、A/Swine/HongKong/9/98、A/Swine/HongKong/81/78、A/Swine/Illinois/100084/01、A/Swine/Illinois/100085A/01、A/Swine/Illinois/21587/99、A/Swine/Indiana/1726/88、A/Swine/Indiana/9K035/99、A/Swine/Indiana/P12439/00、A/Swine/Iowa/30、A/Swine/Iowa/15/30、A/Swine/Iowa/533/99、A/Swine/Iowa/569/99、A/Swine/Iowa/3421/90、A/Swine/Iowa/8548-1/98、A/Swine/Iowa/930/01、A/Swine/Iowa/17672/88、A/Swine/Italy/1513-1/98、A/Swine/Italy/1523/98、A/Swine/Korea/CY02/02、A/Swine/Minnesota/55551/00、A/Swine/Minnesota/593/99、A/Swine/Minnesota/9088-2/98、A/Swine/Nebraska/1/92、A/Swine/Nebraska/209/98、A/Swine/Netherlands/12/85、A/Swine/NorthCarolina/16497/99、A/Swine/North Carolina/35922/98、A/Swine/North Carolina/93523/01、A/Swine/North Carolina/98225/01、A/Swine/Oedenrode/7C/96、A/Swine/Ohio/891/01、A/Swine/O klahoma/18717/99、A/Swine/Oklahoma/18089/99、A/Swine/Ontario/01911-1/99、A/Swine/Ontario/01911-2/99、A/Swine/Ontario/41848/97、A/Swine/Ontario/97、A/Swine/Quebec/192/81、 A/Swine/Quebec/192/91、A/Swine/Quebec/5393/91、A/Swine/Taiwan/7310/70、A/Swine/Tennessee/24/77、A/Swine/Texas/4199-2/98、A/Swine/Wisconsin/125/97、A/Swine/Wisconsin/136/97、A/Swine/Wisconsin/163/97、A/Swine/Wisconsin/164/97、A/Swine/Wisconsin/166/97、A/Swine/Wisconsin/168/97、A/Swine/Wisconsin/235/97、A/Swine/Wisconsin/238/97、A/Swine/Wisconsin/457/98、A/Swine/Wisconsin/458/98、A/Swine/Wisconsin/464/98或A/Swine/Wisconsin/14094/99。

4.如权利要求1-3中任意一项所述的免疫原性制剂，其中所述减毒猪流感病毒为表达异源序列的嵌合病毒。

5.如权利要求4所述的免疫原性制剂，其中所述异源序列包含来源于另一种病毒的抗原决定簇或至少一个片段。

6.如权利要求1-3中任意一项所述的免疫原性制剂，其中所述减毒猪流感病毒为表达肿瘤抗原的嵌合病毒。

7.如权利要求1-3中任意一项所述的免疫原性制剂，其中所述减毒猪流感病毒为表达外源病原体的抗原决定簇的嵌合病毒。

8.如权利要求1所述的免疫原性制剂，其中所述减毒猪流感病毒为TX/98/del 126。

9.有效量的如权利要求1-8中任一项所述的免疫原性制剂在制备用于在猪中免疫或诱导免疫应答，和治疗猪流感病毒感染，或用于在猪中预防与猪流感病毒感染相关的不适的药物中的用途。

10.制备如权利要求1-8中任一项所述的免疫原性制剂的方法，所述方法包括：

(a)在培养基中增殖如权利要求1-8中任一项所述的遗传工程化减毒猪流感病毒；和

(b)收集子代病毒，

其中所述培养基为细胞、细胞系或含胚蛋。

Images