ES2550007T3

ES2550007T3 - Sistema multi-plásmido para la producción de virus de la gripe

Info

Publication number: ES2550007T3
Application number: ES05750661.0T
Authority: ES
Inventors: Erich Hoffmann; Hong Jin; Bin Lu; Gregory Duke; George Kemble; Zhongying Chen
Original assignee: MedImmune LLC
Current assignee: MedImmune LLC
Priority date: 2004-05-24
Filing date: 2005-05-20
Publication date: 2015-11-03
Anticipated expiration: 2025-05-20
Also published as: EP1748790A2; WO2005115448A8; DK1748790T3; EP2644696B1; EP1748790B1; WO2005115448A3; EP1748790A4; EP2995678A1; HUE025727T2; EP2644696A1; WO2005115448A2

Abstract

Un método para aumentar la replicación de un virus de la gripe reorganizante, comprendiendo el método las etapas de: i) comparar la secuencia de aminoácidos del virus de la gripe reorganizante con la secuencia de aminoácidos de un virus de la gripe diferente, creciendo dicho virus de la gripe diferente en huevos embrionados; ii) alterar uno o más aminoácidos en un polipéptido de HA de H3N2 del virus reorganizante para que coincida con la secuencia del virus de la gripe diferente que comprende sustituir según sea necesario los restos de aminoácidos de H3 de HA siempre que la posición 183 sea una leucina y la posición 226 sea una alanina, produciendo de este modo un virus reorganizante alterado; y iii) crecer el virus reorganizante alterado en huevos, mediante lo que la replicación del virus reorganizante alterado aumenta en al menos un 10% en comparación con la replicación de virus reorganizante no alterado.

Description

Sistema multi-plásmido para la producción de virus de la gripe,

Antecedentes de la invención

Los virus de la gripe están foonados por un núcleo interno de ribonucleoproteina que contiene un genoma de ARN monocatenario segmentado y una envuelta externa de lipoproteína revestida de una proteína de matriz, Los virus de la gripe A Y B contiene cada uno ocho segmentos de ARN monocatenario con polaridad negativa, El genoma de gripe A codifica al menos once polipéptidos. Los segmentos 1-3 codifican los tres polipéptidos, formando el ARN viral dependiente de ARN polimerasa. El segmento 1 codifica la proteína de complejo de polimerasa PB2. Las demás proteínas polimerasas, PB1 y PA, están codificadas por el segmento 2 y el segmento 3, respectivamente Además, el segmento 1 de algunas cepas de gripe A codifica una proteína pequeña, PB 1-F2, producida a partir de una fase de lectura alternativa en la región codificante de PB 1. El segmento 4 codifica la glucoproteína de superficie hemaglutinina (HA) implicada en la unión y entrada a la célula durante la infección. El segmento 5 codifica el polipéptido de la nucleoproteína de la nucleocápsida (NP), el componente estructural principal asociado con el ARN viral. El segmento 6 codifica una glucoproteína de envuelta, neuraminidasa (NA). El segmento 7 codifica dos proteínas de matriz, denominadas M1 y M2, que se traducen a partir de ARNm cortados y empalmados de manera diferencial. El segmento 8 codifica a NS1 y NS2 (NEP), dos proteínas no estructurales, que se traducen a partir de variantes de ARNm de corte y empalme alternativo

Los ocho segmentos del genoma de la gripe B codifican 11 proteínas. Los tres genes más grandes codifican componentes de la ARN polimerasa, PB1, PB2 Y PA. El segmento 4 codifica la proteína HA. El segmento 5 codifica a NP. El segmento 6 codifica la proteína NA y la proteína NB. Ambas proteínas, NB y NA, se traducen a partir de fases de lectura solapantes de un ARNm bicistrónico. El segmento 7 de la gripe B también codifica dos proteinas· M1 y BM2. El segmento más pequeño codifica dos productos: NS1 se traduce a partir del ARN de longitud completa, mientras que NS2 se traduce a partir de una variante de ARNm de corte y empalme.

Se han producido vacunas capaces de producir una respuesta inmunitaria protectora específica para los virus de la gripe durante más de 50 años. Las vacunas pueden caracterizarse como vacunas de virus completo, vacunas de virus fraccionados, vacunas de antígenos de superficie y vacunas de virus vivo atenuado. Mientras que las formulaciones adecuadas de cua lqu iera de estos tipos de vacuna son capaces de producir una respuesta sistémica inmune, las vacunas de virus vivo atenuado también son capaces de estimular la inmunidad mucosal local en el tracto respiratorio

FluMist™ es una vacuna viva atenuada que protege a niños y adultos frente a la enfermedad de la gripe (Belshe et al., (1998) The efficacy of live attenuated, cold-adapted, trivalent, intranasallnfluenza virus vaccine in children N Engl J Med 338:1405-12; Nichol et al. (1999) Effecliveness of live, atlenuated intranasal influenza virus vaccine in heallhy, working adults: a randomized controlled trial JAMA 282:137-44). Las cepas de la vacuna FluMist™ contienen segmentos génicos de HA y NA procedentes de las cepas de tipo silvestre actualmente en circulación junto con seis segmentos génicos, PB1, PB2, PA, NP, M Y NS, de un virus donante maestro (VDM). El VDM para las cepas de gripe A de FluMist (VDM-A) se creó pasando en serie la cepa de wt (tipo silvestre) AlA/m Arbor/6/60 (AlAA/6/60) en cultivo tisular de riñón primario de pollo a temperaturas sucesivamente más bajas (Maassab (1967) Adaptation and growth characteristics of influenza virus at 25 degrees e Nature 213:612-4). VDM-A se replica de manera eficaz a 25QC (ca, adaptado al frío), pero su crecimiento está restringido a 38 y 39 QC (ts, sensible a la temperatura). Además, el virus no se replica en los pulmones de hurones infectados (att, atenuación). Se cree que el fenotipo Is contribuye a la atenuación de la vacuna en seres humanos restringiendo su replicación en todas salvo las partes más frías del tracto respiratorio. La estabilidad de esta propiedad se ha demostrado en modelos animales y estudios clínicos. A diferencia del fenotipo ts de cepas de gripe creadas mediante mutagérlesis quimica, la propiedad ts de VDM-A no se revirtió después de su pase por hámsteres infectados o en aislados obtenidos de niños (para una revisión reciente, véase Murphy y Coelingh (2002) Principies underlying the development and use of live attenuated cold-adapted inftuenza A and B virus vaccines Viral Immunol 15:295-323). Mochalova et al. (2003), Virology, 313(2):473-480 divulgan que la propagación del virus H1N1 humano en huevos embrionados da como resultado una selección de variantes con sustituciones de aminoácidos próximas al sitio de unión al receptor de HA, es decir, G226R o D225G Medeiros et al. (2001), Virology, 289(1):74-85 describen que el cambio sucesivo de Gln226 a Leu a lIe a Val observado en aislados naturales da como resultado una pérdida progresiva de la capacidad de la HA para unirse a los eritrocitos de pollo. Ha et al. (2001), Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 98(20):11181-11186 confionan que Gln226 es un resto específico de aves, mientras que Leu226 es específico de seres humanos. Rogers et al. (1983), Nature, 304(5921 ):76-78 también identificaron el resto 226 como importante para la unión de HA a ácido siálico en células diana. Este documento sugiere además que también pueden intervenir otros restos en la especificidad, incluyendo His183. Jin-Hua et al. (2004), Virus Genes, 29(3):329334 desvela que el resto 226, y también los restos 183 y 190 de H9N2 son importantes para la especificidad de unión de HA

Estudios clínicos en más de 20.000 y niños que implican 12 cepas reorganizantes 6:2 han demostrado que estas vacunas están atenuadas, son seguras y eficaces (Belshe et al. (1998) The efficacy of live atlenuated, cold-adapted, trivalent, intranasal Influenza virus vaccine in children N Engl J Med 338:1405-12; Boyce et al. (2000) Safety and immullOgenicity of adjuvanted and unadjuvanted subunit influenza vaccines administered intranasally to healthy adults Vaccine 19:217-26; Edwards et al. (1994) A randomized controlled trial of cold adapted and inactivated vaccines for the prevention of influenza A disease J Infect Dis 169:68-76; Nichol et al. (1999) Effectiveness of live, altenuated intranasal influenza virus vaccine in healthy, working adults: a randomized controlled trial JAMA 282:13744). Los reorganizantes que portan los seis genes intemos de VDM-A y los dos segmentos génicos de HA y NA del virus wt (reorganizante 6:2) mantienen los fenotipos ca, ts y alt de manera consistente (Maassab et al. (1982) Evaluation of a cold -recombinant influenza virus vaccine in ferrets J Infecl Dis 146:780-900)

Hasta la fecha , todas las vacunas comercia les para la gripe en los Estados Unidos se han propagado en huevos de gallina embrionados. Aunque el virus de la gripe crece bien en los huevos de ga llina, la producción de vacuna depende la disponibilidad de huevos. Deben organizarse los suministros de huevos, y seleccionarse las cepas para vacunación meses antes de la siguiente temporada de gripe, limitando la flexibilidad de esta estrategia, y dando a menudo como resultado retrasos y escasez en la producción y distribución. Desafortunadamente, algunas cepas de vacuna de gripe, tales como el prototipo de cepa NFujianf411/02 que circuló durante la temporada 2003-04, no se replica bien en huevos de gallina embrionados, y tiene que aislarse mediante cultivo celular en un procedimiento costoso y laborioso. También se describe en el presente documento una nueva tecnología para aumentar la capacidad de replicación de las cepas de vacuna en huevos de gallina embrionados. Además, la presente divulgación permite una producción más eficaz y económica de vacunas de la gripe

Los sistemas para producir virus de la gripe en cultivo celular también se han desarrollado en los últimos años (véase, por ejemplo, Furminger. Vaccine Production, en Nicholson et al. (eds) Textbook of Influenza págs. 324 -332; Merten el al. (1996) Production of influenza virus in cell cultures for vaccine preparation, en eohen y Shafferman (eds) Novel Strategies in Design and Production of Vaccines págs. 141-151 ). Típicamente, estos métodos implican la infección de células hospedadoras inmortalizadas adecuadas con una cepa seleccionada del virus. Aunque se eliminan muchas de las dificultades relacionadas con la producción de vacunas en huevos de gallina, no todas las cepas patogénicas de gripe crecen bien y pueden producirse de acuerdo con los métodos de cultivo tisular establecidos. Además, muchas cepas con características deseables, por ejemplo, atenuación, sensibilidad a la temperatura y adaptación fría, adecuadas para la producción de vacunas atenuadas vivas, no han crecido satisfactoriamente en cultivo tisular usando métodos establecidos.

La producción de virus de la gripe a partir de ADN recombinante podría aumentar significativamente la flexibilidad y utilidad de los metodos de cultivo tisular para la producción de vacunas de la gripe. Recientemente, se han comunicado sistemas para producir virus de la gripe A partir de plásmidos recombinantes que incorporan ADNc que codifican el genoma viral. (Véase, por ejemplo, Neumann et al. (1999) Generation of influenza A virus entirely from cloned cDNAs. Proc Natl Acad Sci USA 96:9345-9350; Fodor et al. (1999) Rescue of influenza A virus from recombinant DNA. J. Viral 73:9679-9682; Hoffmann et al. (2000) A DNA transfeclion system for generation of influenza A virus from eight plasmids Proc Natl Acad Sei USA 97:6108-6113; documento WO 01/83794). Estos sistemas ofrecen el potencial de producir virus recombinantes, y virus reorganizantes que expresan las proteínas HA y NA inmunogénicas de cualquier cepa seleccionada. Sin embargo, a diferencia del virus de la gripe A, no se han publicado informes que describan sistemas solo de plásmido para el virus de la gripe B.

Además, ninguno de los sistemas solo de plásmido actualmente disponibles es adecuado para generar cepas atenuadas, sensibles a la temperatura, adaptadas al frío para la producción de vacunas vivas atenuadas. También se describen en el presente documento un sistema de ocho plásmidos para la generación de virus de la gripe B totalmente a partir de ADNc clonado, y métodos para la producción de virus de la gripe A y B vivos atenuados adecuados para formulaciones de vacuna, tales como formulaciones de vacuna de virus vivo útiles para administración intranasal, así como otros numerosos beneficios que serán evidente tras una revisión de la memoria descriptiva

Sumario de la invención

La presente invención está definida por las reivindicaciones. La presente invención se refiere a un método para aumentar la replicación de un virus de gripe reorganizante, comprendiendo el mélodo las etapas de: i) comparar la secuencia de aminoácidos del virus de la gripe reorganizante con la secuencia de aminoácidos de un virus de gripe diferente, creciendo dicho virus de la gripe diferente en huevos embrionados; ii) alterar uno o más aminoácidos en un polipéplido de HA de H3N2 del virus reorganizante para que coincida con la secuencia del virus de la gripe diferente que comprende sustituir según sea necesario los restos de aminoácidos de H3 de HA siempre que la posición 183 sea una leucina y la posición 226 sea una alanina, produciendo de este modo un virus reorganizante alterado; y iii) crecer el virus reorganizante alterado en huevos, mediante lo que la replicación del virus reorganizante alterado aumenta en al menos un 10% en comparación con la replicación de virus reorganizante no alterado. La presente invención se refiere además a un virus de gripe reorganizante de replicación potenciada que comprende una proteína HA de H3N2 que comprende una leucina en la posición 183 y una alanina en la posición 226 así como a una composición inmunogénica que comprende el virus de la gripe reorganizante de replicación potenciada de la invención. También se describe en el presente documento un sistema multi-vector para la producción de virus de la gripe en cultivo celular, ya métodos para producir virus de la gripe recombinantes y reorganizantes, incluyendo, pOI" ejemplo, virus de la gripe atenuados (alt), adaptados al frío (ca) yfo sensibles a la temperatura (ts), adecuados como vacunas, incluyendo vacunas de la gripe vivas atenuadas, tales como aquellas adecuadas para su administración en una formulación de vacuna intranasal

También se describen en el presente documento vectores y métodos para producir virus de la gripe B recombinantes en cultivo celular, por ejemplo, en ausencia de virus auxiliar (es decir, un sistema de cultivo celular sin virus auxiliar). Los métodos descritos en el presente documento implican introducir una diversidad de vectores, cada uno de los cuales incorpora una porción de un virus de la gripe B en una población de células hospedadoras capaces de soportar replicación viral. Las células hospedadoras se cultivan en condiciones permisivas para el crecimiento viral, y se recuperan los virus de la gripe. Los virus de la gripe B pueden ser virus atenuados, virus adaptados al frío ylo virus sensibles a la temperatura. Por ejemplo, los virus de la gripe B recombinantes procedentes de vectores son virus atenuados, adaptados al frío, sensibles a la temperatura, de tal forma que son adecuados para su administración como una vacuna atenuada viva, por ejemplo, en una formulación de vacuna intranasal. En un ejemplo, los virus se producen introduciendo una diversidad de vectores que incorporan la tota lidad o parte de un genoma de virus de la gripe B/Ann ArborI1/66, por ejemplo, un genoma de virus ca B/Ann ArborI1166.

Por ejemplo, los virus de la gripe B son virus de la gripe diseñados por ingeniería genética de manera artificial que incorporan una o más sustituciones de aminoácidos que influencian las propiedades biológicas características de la cepa ca de gripe B/Ann Arbor/1/66. Dichos virus de la gripe inclu~en modificaciones que dan como resultado

PB2265 34

sustituciones de aminoácidos en una o más de las posiciones PB1 39 , PB1 561 , PB1 66\ Y Np, tales como:

PB1 391 (K391E), PB1 561 (E581G), PB1 661 (A661T), PB2~5 (N265S) y Np34 (D34G). Cualquier mutación (en una o más de estas posiciones) que de manera individual o en combinación de como resultado un aumento en la sensibilidad a la temperatura, la adaptación al fria o la atenuación en relación a virus de tipo silvestre es una mutación adecuada en el contexto descrito en el presente documento.

Puede introducirse en una población de células hospedadoras una diversidad de vectores que incorporan al menos los 6 segmentos genómicos intemos de una cepa de gripe B junto con uno o más segmentos génicos que codifican antígenos de superficie inmunogénicos de la gripe de una cepa de gripe diferente. Por ejemplo, Se introducen al menos los 6 segmentos genómicos intemos de una cepa de gripe B atenuada, adaptada al frío ylo sensible a la temperatura, por ejemplo, una cepa ca , all, ts de B/Ann ArborI1/66 o una cepa de gripe B diseñada por ingeniería genética de manera artificial que incluye una sustitución de aminoácidos en una o más de las posiciones especificadas anteriormente, en una población de células hospedadoras junto con uno o más segmentos que codifican antígenos inmunogénicos procedentes de otra cepa de virus. Típicamente, los antígenos de superficie inmunogénicos incluyen uno o ambos de los antigenos de hemaglutinina (HA) y/o neuraminidasa (NA). En los casos donde se introduce un solo segmento que codifica un antigeno de superficie inmunogénico, también se introducen los 7 segmentos complementarios del virus seleccionado en las células hospedadoras.

Pueden introducirse una variedad de vectores plasmídicos que incorporan segmentos del genoma del virus de la gripe B en una población de células hospedadoras. Por ejemplo, se utilizan 8 plásmidos, cada uno de los cuales incorpora un segmento de genoma diferente, para introducir un genoma de gripe B completo en las células hospedadoras. Como alternativa, puede emplearse un número mayor de plásmidos, que incorporan subsecuencias genómicas más pequeñas.

Típicamente, los vectores plasmídicos descritos en el presente documento son vectores de expresión bidireccionales. Un vector de expresión bidireccional descrito en el presente documento incluye típicamente un primer promotor y un segundo promotor, en el que el primer y el segundo promotor están unidos operativamente a hebras altemas del mismo ADNc bicatenario que codifica el ácido nucleico viral, incluyendo un segmento del genoma viral de la gripe. Opcionalmente, el vector de expresiÓfl bidireccional incluye una señal de poliadenilación y/o una secuencia de terminación. Por ejemplo, la señal de poliadenilación ylo la secuencia de terminación pueden estar localizadas flanqueando a un segmento del genoma del virus de la gripe interno a los dos promotores. Una señal de poliadenilación favorable en el contexto descrito en el presente documento es la señal de poliadenilación de SV40. Un vector plasmídico ejemplar descrito en el presente documento es el plásmido pAD3000, ilustrado en la Figura 1

Los vectores se introducen en células hospedadoras capaces de soportar la replicación del virus de la gripe a partir de los promotores del vector. Los ejemplos favorables de células hospedadoras incluyen células Vero, células Per.C6, células BHK, células PCK, células MDCK, células MDBK, células 293 (por ejemplo, células 293T), y células COSo En combinación con los vectores plasmídicos pAD3000 descritos en el presente documento las células Vera, células 293, y células COS son particularmente adecuadas. Los co-cultivos de una mezcla de al menos dos de estas líneas celulares, por ejemplo, una combinación de células COS y MDCK o una combinación de células 293T y MDCK, puede constituir la población de células hospedadoras

Entonces se crecen las células hospedadoras que incluyen los vectores de gripe B en cultivo en condiciones permisivas para la replicación y ensamblaje de virus. Típicamente, las células hospedadoras que incorporan los plásmidos de gripe B descritos en el presente documento se cultivan a una temperatura por debajo de 37 QC, preferentemente a una temperatura igual a, o menor de, 35 QC. Tipicamente, las células se cultivan a una temperatura de entre 32 QC y 35 QC. Las células pueden cultivarse a una temperatura entre aproximadamente 32 QC y 34 QC, por ejemplo, a aproximadamente 33 QC. Después del cultivo durante un periodo de tiempo adecuado para permitir la replicación del virus hasta un titulo elevado, se recuperan los virus recombinantes y/o reorganizantes Opcionalmente, pueden inactivarse los virus recuperados

También se describen en el presente documento métodos ampliamente aplicables para producir virus de gripe recombinantes en cultivo celular mediante la introducción de una diversidad de vectores que incorporan un genoma de virus dela gripe en una población de células hospedadoras capaces de soportar la replicación de virus de la gripe, el cultivo de las células a una temperatura menor o igual a 35 oC, y la recuperación de los virus de la gripe

Puede introducirse una variedad de vectores plasmídicos que incorporan segmentos del genoma del virus de la gripe en una población de células hospedadoras. Pueden utilizarse 8 plásmidos, incorporando cada uno un segmento genómico diferente para introducir un genoma de gripe completo en las células hospedadoras Tipicamente, los vectores plasmidicos descritos en el presente documento son vectores de expresión bidireccionales. Un vector plasmídico ejemplar descrito en el presente documento es el plásmido pAD3000, ilustrado en la Figura 1.

Los virus de la gripe pueden corresponder a un virus de la gripe B. Los virus de la gripe también pueden corresponder a un virus de la gripe A. Los métodos pueden incluir recuperar virus de la gripe recombinantes y/o reagrupados capaces de provocar una respuesta inmune tras su administración, por ejemplo, administración intranasal, a un sujeto. Los virus pueden inactivarse antes de su administración, o pueden administrarse virus vivos atenuados. También se describen en el presente documento virus de la gripe A y de la gripe B recombinantes y reorganizantes producidos de acuerdo con los métodos descritos en el presente documento

Los virus pueden incluir un virus de la gripe atenuado, un virus de la gripe adaptado al frío, un virus de la gripe sensible a la temperatura, o un virus con cualquier combinación de estas características deseables. El virus de la gripe puede incorporar un virus de la cepa B/Ann Albor/1I66, por ejemplo, una cepa BlAnn Arbor/1/66 adaptada al frío, sensible a la temperatura y atenuada. El virus de la gripe puede incorporar un virus de la cepa /VAnn Arbor/6f60, por ejemplo, una cepa AJAnn Arbor/6/60 adaptada al frío, sensible a la temperatura y atenuada. Los virus pueden ser virus de la gripe diseñados por ingenieria genética de manera artificial que incorporan uno o más aminoácidos sustituidos que influencian las propiedades biológicas características de por ejemplo, ca AJAnn Albor/6f60 o ca B/Ann Arbor/1f66. Dichos aminoácidos sustituidos corresponden de manera favorable a aminoácidos

391 581

únicos de ca AJAnn Arborf6/60 o ca BlAnn Arborf1/66, por ejemplo, en un virus de cepa A: PB1 (K391E), PB1

(E581G), PB1 661 (A661T), PB2265 IN265S) y Np34 (D34G); y, en un virus de cepa B: PB26lO (S630R); PA(V431 M); PA497 (Y497H); Npss (T55A); NP1'i4 (V114A); Np4'0 (p410H); NpS09 (A509T); M1'59 (H159Q) YM1 '83 (M183V). De manera similar, están abarcadas otras sustituciones en cualquiera de estas posiciones que den como resultado sensibilidad a la temperatura, adaptación al frío yfo atenuación por los virus y métodos descritos en el presente documento. Se entenderá que algunos virus A o B pueden tener ya los restos citados en las posiciones indicadas. En este caso, las sustituciones se efectuarán de tal forma que el virus resultante tenga todas las sustituciones preferidas

Opcionalmente, se producen virus reorganizantes introduciendo vectores que incluyen los seis genes intemos de una cepa viral seleccionada respecto de sus propiedades favorables en relación a la producción de vacunas, en combinación con los segmentos genómicos que cod ifican los antígenos de superficie (HA y NA) de una cepa seleccionada, por ejemplo, patogénica. Por ejemplo, el segmento HA se selecciona favorablemente de una cepa H1, H3 o B patogénicamente relevante, tal como se efectúa rutinariamente para la producción de vacunas. De manera similar, el segmento HA puede seleccionarse de una cepa patogénica emergente, tal como una cepa H2 (por ejemplo, H2N2), una cepa H5 (por ejemplo, H5N1) o una cepa H7 (por ejemplo, H7N7). Como alternativa, se introducen los siete segmentos génicos complementarios de la primera cepa en combinación con el segmento que codifica a HA o a NA Los segmentos génicos internos pueden proceder de las cepas de gripe B/Ann Arbor/1f66 o AJAnn Arbor/6f60

También se describen en el presente documento métodos para producir nuevos virus de la gripe con propiedades deseables relevantes para la producción de vacunas, por ejemplo, virus de la gripe sensibles a la temperatura, atenuados yfo adaptados al frío, así como vacunas para la gripe que incluyen dichos nuevos virus de la gripe. Los nuevos virus de gripe de cepa A pueden producirse introduciendo mutaciones que den como resultado sustituciones de aminoácidos en una o más posiciones especificadas que se demuestra en el ~resente documento que son

PB1 661

importantes para el fenotipo sensible a la temperatura, por ejemplo, PB1 301 , PB1 58 PB2265 ! Np34 . Por

, PB1 1766, PB1 2OÓS

ejemplo, se introducen mutaciones en las posiciones de nucleótido PBS'195 , PB282 y NP'46 , u otras posiciones de nucleótidos, dando como resultado una sustitución de aminoácidos en la posición de aminoácido especificada. Cualquier mutación (en una o más de estas posiciones) que de manera individual o en combinación de como resultado un aumento en la sensibilidad a la temperatura, la adaptación al frío o la atenuación en relación a virus de tipo silvestre es una mutación adecuada en el contexto descrito en el presente documento. Por ejemplo, las mutaciones seleccionadas entre PB1 391 (K391E), PB1 581 (E581G), PB1 661 (A661T), PB2265 (N265S) YNp34 (D34G) se introducen favorablemente en el genoma de una cepa de gripe A de tipo silvestre, por ejemplo, PR8, para producir una variante sensible a la temperatura adecuada para su administración como vacuna viva atenuada. Para aumentar la estabilidad del fenotipo deseado, se introduce típicamente una diversidad de mutaciones. Después de la introducción de las mutaciones seleccionadas en el genoma de la gripe, el genoma de la gripe mutado se replica en condiciones en las que se produce el virus. Por ejemplo, el genoma del virus de la gripe mutado puede replicarse en huevos de gallina. Como alternativa, el genoma del virus de la gripe puede replicarse en cultivo celular. En el último caso, el virus se amplifica además opcionalmente en huevos de gallina para aumentar el título. También se describen en el presente documento virus sensibles a la temperatura y opcionalmente atenuados ylo adaptados al frío producidos de acuerdo con los métodos descritos en el presente documento, así como vacunas que incluyen dichos virus. De manera similar, también se describen en el presente documento nuevos ácidos nucleicos virales recombinantes que incorporan una o más mutaciones en las posiciones PB1 391 , PB1 5e1 , PB1 661 , PB2265 Y Np34, por ejemplo, las mutaciones seleccionadas entre PB1 391 (K391E), PB1 S81 (E581G), PB1 661 (A661T), PB2265 (N265S) y Np34 (D34G), Ypolipéptidos con dichas sustituciones de aminoácidos.

Del mismo modo, los métodos presentados en el presente documento están adaptados para producir nuevas cepas de gripe B con fenotipos sensibles a la temperatura, y opcionalmente atenuados y/o adaptados al frío mediante la introducción de una o más mutaciones especificadas en un genoma de gripe B. Por ejemplo, se introducen una o más mutaciones Que dan como resultado una sustitución de aminoácidos en una posición seleccionada entre PB2630, PA431 ; PA4~7; Np5S; NPl14; Np410; Np509; M11S9 y M1183 en el genoma de una cepa de gripe B para producir un virus de la ~pe B sensible a la temperatura. Las sustituciones de aminoácidos ejemplares incluyen las

431 497 l14 410

siguientes: PB26 (S630R); PA(V431M); PA(Y497H); Np55 (T55A); Np(V114A); Np(P410H); Np509

159 183

(A509T); M1 (H159Q) Y M1 (M183V). Tal como se indica anteriormente, también se describen en el presente documento todas las vacunas que incorporan dichos virus asi como los ácidos nucJeicos y polipéptidos que incorporan estas mutaciones y sustituciones de aminoácidos. Los métodos presentados en el presente documento pueden adaptarse para producir nuevas cepas de gripe B con fenotipos sensibles a la temperatura y atenuados que

comwenden o como altemativa consisten en introducir las siguientes sustituciones de aminoácidos: PA(V431M); Np1 4 (V114A); Np410 (P410H); M1 1S9 (H159Q) y M1 183 (M183V). Se contempla especificamente que se encuentren dentro del ámbito descrito en el presente documento sustituciones de aminoácidos conservativas y no conservativas en estas posiciones. Los métodos presentados en el presente documento pueden adaptarse para producir nuevas cepas de gripe B con fenotipos sensibles a la temperatura y atenuados que comprenden o como altemativa consisten en introducir una mutación en las siguientes posiciones de aminoácidos: PA431; NPl14; NP410; M1 159 Y

M1 . Los métodos presentados en el presente documento pueden adaptarse para producir nuevas cepas de gripe B con fenotipos sensibles a la temperatura y atenuados que comprenden o como alternativa consisten en introducir una mutación en las siguientes posiciones de aminoácidos: PA43 ; NPl14; NP410; Y M1183. Los métodos presentados en el presente documento pueden adaptarse para producir nuevas cepas de gripe B con fenotipos sensibles a la temperatura y atenuados que com~renden o como alternativa consisten en introducir una mutación en las siguientes posiciones de aminoácidos: PA43 ; NP114; Np410; y M1 159. Los métodos presentados en el presente documento pueden adaptarse para producir nuevas cepas de gripe B con fenotipos sensibles a la temperatura y atenuados que

comwenden o como alternativa consisten en introducir las siguientes sustituciones de aminoácidos: PA(V431M); Np1 4 (V114A); Np410 (P410H); M1 159 (H159Q), M1 183 (M183V); y PA497 (Y497H). Los métodos presentados en el presente documento pueden adaptarse para producir nuevas cepas de gripe B con fenotipos sensibles a la temperatura y atenuados que comwenden o como alternativa consisten en introducir las siguientes sustituciones de

aminoácidos: PA431 (V431M); Np14 (V114A); Np410 (P410H); (M1159 (H159Q) y/o M1183 (M183V)); y PA(Y497H) Se contempla especificamente que se encuentren dentro del ámbito descrito en el presente documento sustituciones de aminoácidos conservativas y no conservativas en estas posiciones. Se entenderá que algunos virus B pueden tener ya los restos citados en las posiciones indicadas. En este caso, las sustituciones se efectuarán de tal forma que el virus resultante tenga todas las sustituciones preferidas. Los métodos presentados en el presente documento también pueden adaptarse para producir nuevas cepas de gripe B con fenotipos sensibles a la temperatura y atenuados que comprenden o como alternativa consisten en introducir una mutación en las siguientes posiciones de aminoácidos: PA431; NPl14; Np410; M1159; M1183; Y PA497.

Por consiguiente, también se describen en el presente documento virus de la gripe que incorporan las mutaciones descritas en el presente documento independientemente del método mediante el cual se produzcan. Es decir, también se describen en el presente documento cepas de gripe que incluyen las mutaciones descritas en el presente documento, por ejemplo, cualquier virus de gripe A con una sustitución de aminoácidos en relación al tipo silvestre

391 5866265 y Np34

en una o más posiciones seleccionadas entre: PB1 , PB1 \ PB1 \ PB2o cualquier virus de gripe B con una sustitución de aminoácidos en relación al tipo silvestre en una o más posiciones seleccionadas entre: PB2630;

PA431; PA497; Np509; M1 159 Y M1183

; Np55; NPl14; Np410, con la salvedad de no considerar como descritas en el presente documento las cepas ca AfAnn Arbor/6/60 y B/Ann Arbor/1I66. Los virus de gripe A pueden incluir una

391 581 661

diversidad de mutaciones seleccionadas entre PB1 (K391 E), PB1 (E581G), PB1 (A661T), PB2265 (N265St¡; Np34 (D34G)· v los virus de (¡ripe B pueden incluir una diversidad de mutaciones seleccionadas entre PB2

Npl14 Np509 M1 159

(S630R); PAb l (V431M); PA4"97 (Y497H); Np55 (T55A); (V114A); Np410 (P410H); (A509T);

(H159Q) Y M1 (M183V), respectivamente. Se entenderá que algunos virus A pueden tener ya los restos citados en las posiciones indicadas. En este caso, las sustituciones se efectuarán de tal forma que el virus resultante tenga todas las sustituciones preferidas. Las nuevas cepas B con fenotipo sensible a la temperatura y atenuado pueden comRrender o como alternativa consistir en sustituciones/mutaciones de aminoácidos en las siguientes posidones: PA4 1 (V431M); Npl14 (V114A); Np410 (P410H); M1159 (H159Q) Y M1183 (M183V). Se entenderá que algunos virus B pueden tener ya los restos citados en las posiciones indicadas. En este caso, las sustituciones se efectuarán de tal forma que el virus resultante tenga todas las sustituciones preferidas. Las nuevas cepas B con fenotipo sensible a la temperatura y atenuado también pueden comprender o como alternativa consistir en sustituciones/mutaciones de aminoácidos en las siguientes posiciones: PA431 (V431 M); Npl14 (V114A); Np410 (P410H); Y M1 159 (H159Q). Las nuevas cepas B con fenotipo sensible a la temperatura y atenuado igualmente pueden comprender o como

431 l14

alternativa consistir en sustitucionesfmutaciones de aminoácidos en las siguientes posiciones: PA(V431M); Np(V114A); Np410 (P410H); y M1183 (M183V). Se entenderá que algunos virus B pueden tener ya los restos citados en las posiciones indicadas, En este caso, las sustituciones se efectuarán de tal forma que el virus resultante tenga todas las sustituciones preferidas. Se contempla específicamente que estén también descritas en el presente documento sustituciones de aminoácidos conservativas y no conservativas en estas posiciones. Las nuevas cepas B con fenotipo sensible a la temperatura y atenuado pueden comprender o como alternativa consistir en

M1159 Y M1183

sustituciones/mutaciones de aminoácidos en las siguientes posiciones: PA431; NPl14; Np410; Las nuevas cepas B con fenotipo sensible a la temperatura y atenuado pueden comprender o como alternativa consistir en sustilucionesfmutaciones de aminoácidos en las siguientes posiciones: PA43 ; NP114; Np410; Y M1159. Las nuevas cepas B con fenotipo sensible a la temperatura y atenuado pueden comprender o como alternativa consistir en sustituciones/mutaciones de aminoácidos en las siguientes posiciones: PA431; NPl14; NP410; Y M1 183 Las nuevas cepas B con fenotipo sensible a la temperatura y atenuado pueden comprender o como alternativa consistir en

Np114

sustituciones/mutaciones de aminoácidos en las siguientes posiciones: PA431 (V431M); (V11 4A); NP410

1S9 183 497

(P410H); M1 (H159Q), M1 (M183V); Y PA(Y497H). Se entenderá que algunos virus B pueden tener ya los restos citados en las posiciones indicadas. En este caso, las sustituciones se efectuarán de tal forma que el virus resultante tenga todas las sustituciones preferidas. Las nuevas cepas B con fenotipo sensible a la temperatura y atenuado pueden comprender o como alternativa consistir en sustituciones/mutaciones de aminoácidos en las siguientes posiciones: PA431; NPl14; NP410; M1 159; M1 183; Y PA491 Se entenderá que algunos virus B pueden tener ya los restos citados en las posiciones indicadas. En este caso, las sustituciones se efectuarán de tal forma que el virus resu ltante tenga todas las sustituciones preferidas

Puede introducirse una diversidad de vectores plasmídicos que incorporan el genoma del virus de la gripe en las células hospedadoras. Por ejemplo, pueden incorporarse los segmentos de un genoma de virus de la gripe en al menos 8 vectores plasmídicos. Los segmentos de un genoma de virus de la gripe pueden incorpOfarse en 8 plásmidos. Por ejemplo, cada uno de los 8 plásmidos puede incorporar favorablemente un segmento diferente del genoma del virus de la gripe.

Los vectores descritos en el presente documento pueden ser vectores de expresión bidireccionales Un vector de expresión bidireccional descrito en el presente documento incluye típicamente un primer promotor y un segundo promotor, en el que el primer y el segundo promotor están unidos operativamente a hebras altemas del mismo ácido nucleico viral bicatenario que incluye un segmento del genoma viral de la gripe. Opcionalmente, el vector de expresión bidireccional incluye una señal de poliadenilacíón y/o una secuencia de terminación. Por ejemplo, la señal de poliadenilaciÓfl yfo la secuencia de terminación pueden estar localizadas flanqueando a un segmento del genoma del virus de la gripe intemo a los dos promotores. Una señal de poliadenilación favorable en el contexto descrito en el presente documento es la señal de poliadenilación de SV40. Un vector plasmídico ejemplar descrito en el presente documento es el plásmido pAD3000, ilustrado en la Figura 1.

Cualquier célula hospedadora capaz de soportar la replicación del virus de la gripe a partir de los promotores del vector es adecuada en el contexto descrito en el presente documento. Los ejemplos favorables de células hospedadoras incluyen células Vero, células Per.C6, células BHK, células PCK, células MOCK, células MOBK, células 293 (por ejemplo, células 293T), y células COSo En combinaciÓfl con los vectores plasmidicos pA03000 descritos en el presente documento las células Vero, células 293, y células COS son particularmente adecuadas Los co-cultivos de una mezcla de al menos dos de estas líneas celulares, por ejemplo, una combinación de células COS y MOCK o una combinación de células 293T y MOCK, puede constituir la población de células hospedadoras.

También se describe en el presente documento el cultivo de células hospedadoras que incorporan los plásmidos descritos en el presente documento a una temperatura por debajo de 37 QC, preferentemente a una temperatura igual a, o menor de, 35 OC Típicamente, las células se cultivan a una temperatura de entre 32 OC Y 35 OC. Las células pueden cultivarse a una temperatura entre aproximadamente 32 OC Y 34 oC, por ejemplo, a aproximadamente 33 QC.

En el presente documento también se describen nuevos métodos para rectar virus de la gripe A o de la gripe B recombinantes o reorganizantes (es decir, cepas de tipo silvestre y variantes de la gripe A y/o virus de la gripe) a partir de células Vero en cultivo. Se electropora una diversidad de vectores que incorporan un genoma de virus de la gripe en una población de células Vero. Las células se crecen en condiciones permisivas para la replicación viral, por ejemplo, en el caso de cepas del virus adaptadas al frío, atenuadas y sensibles a la temperatura, se hacen crecer las células Vero a una temperatura por debajo de 37 oC, preferentemente a una temperatura igual a, o menOf de, 35 oC. Típicamente, las células se cultivan a una temperatura de entre 32 oC y 35 oC. Las células pueden cultivarse a una temperatura entre aproximadamente 32 oC y 34 oC, por ejemplo, a aproximadamente 33 oC. Opcionalmente (por ejemplo, para la producción de vacunas), se hace crecer las células Vero en medio libre de suero sin productos de origen animal

En los métodos descritos anteriormente, los virus se recuperan después de cultivar las células hospedadoras que incorporan los plásmidos del genoma de la gripe. Los virus recuperados pueden ser virus recombinantes. Los virus pueden ser virus de la gripe reorganizantes que tienen contribuciones genéticas de más de una cepa de virus progenitora. Opcionalmente, los virus recombinantes o reagrupados recuperados se amplifican adicionalmente mediante paso por cultivos celulares o en huevos de gallina.

Opcionalmente, los virus recuperados están ¡nactivados. Los virus recuperados pueden comprender una vacuna para la gripe. Por ejemplo, la vacuna para la gripe recuperada puede ser un virus de la gripe reorganizante (por ejemplo, virus reorganizanles 6:2 o 7:1) que tienen un antígeno de HA y/o de NA procedente de una cepa seleccionada de gripe A o gripe B. Los virus de la gripe reorganizanles pueden tener un fenotipo atenuado. Opcionalmente, los virus de la gripe reorganizantes pueden estar adaptados al frio y/o ser sensibles a la temperatura, por ejemplo, un virus de la gripe b atenuado, adaptado al fria o sensible a la temperatura que tenga una o más sustituciooes de aminoácidos seleccionadas entre las sustituciones de la Tabla 17. Dichos virus de la gripe son útiles, por ejemplo, como vacunas vivas atenuadas para la producción profiláctica de una respuesta inmunitaria específica para una cepa de gripe seleccionada, por ejemplo, patógena. También se describen en el presente documento virus de la gripe, por ejemplo, virus de la gripe reorganizantes, producidos de acuerdo con los métodos descritos en el presente documento

También se describen en el presente documento métodos para producir una vacunas de virus de gripe recombinante que implica introducir una diversidad de vectores que incorporan un gellOma de virus de la gripe en una población de células hospedadoras capaces de soportar la replicación del virus de la gripe, cultivar las células hospedadoras a una temperatura menor o igual a 35 QC, y recuperar un virus de la gripe capaz de provocar una respuesta inmunitaria tras su administración al sujeto. Las vacunas descritas en el presente documento pueden ser virus de cepas de gripe A o gripe B. Los virus de la vacuna de la gripe pueden incluir un virus de la gripe atenuado, un virus de la gripe adaptado al frío, o un virus de la gripe sensible a la temperatura. Los virus pueden poseer una combinación de estas propiedades deseables _ El virus de la gripe puede contener un virus de la cepa AJAnn Arbor/6/60, El virus de la gripe puede incorporar un virus de la cepa B/Ann Arbor/1l66. Como altemativa, la vacuna induye virus de la gripe A o de la gripe B diseñados por ingeniería genética de manera artificial por ingeniería genética que incorporan al menos un aminoácido sustituido que influencia las propiedades biológicas características de ca AJAnn Arbor/6f60 o ca/B/Ann AIbor/1 f66, tal como un único aminoácido de estas cepas. Por ejemplo, las vacunas descritas en el presente documento incluyen virus de la gripe A recombinantes y reorganizantes que incluyen al menos una mutación que da

como resultado una sustitución de aminoácidos en una posición seleccionada entre PB1 39\ PB1 58\ PB1 , PB2265 Y Np3"4 Y virus de gripe B recombinantes y reorganizantes diseñados por ingeniería genética de manera artificial que incluyen al menos una mutaciórJ que dé como resultado una sustitución de aminoácidos en una posición

, Np410, Np509, M1'59 Y M1'83seleccionada entre PB2630, PA431, PA.t91, Np55, NP'14

El virus puede incluir un virus de la gripe reorganizante (por ejemplo, un reorganizante 6:2 o 7:1) que tiene segmentos de genoma viral procedentes de más de una cepa de virus de la gripe. Por ejemplo, una vacuna d virus de gripe reorganizante incluye favorablemente un antígeno de superficie de HA y/o NA procedente de una cepa seleccionada de gripe A o B, en combinación con los segmentos de genoma intemos de una cepa de virus seleccionada por sus propiedades deseables respecto de la producción de vacunas. A menudo, es deseable seleccionar la cepa de gripe de la que proceden los segmentos que codifican a HA y/o NA basándose en predicciones de prevalencia local o mundial de cepas patógenas (por ejemplo, tal como se describe anteriormente) En algunos casos, la cepa de virus que contribuye a los segmentos de genoma internos es una cepa de gripe atenuada, adaptada al frío y/o sensible a la temperatura, por ejemplo, de cepa AJAnn Arbor/6/60 , B/Ann Arbor11/66 ,

o una cepa de gripe diseñada por ingenieria genética de manera artificial que tenga una o más sustituciones de aminoácidos que den como resultado el fenotipo deseado, por ejemplo, virus de gripe A que induyen al menos una mutación que dé como resultado una sustitución de aminoácidos en una posición seleccionada entre PB1 3 .." PB1 58"

PB1 , PB221l5 YNp34 Y virus de gripe B que incluyen al menos una mutación 1Jsue dé como resultado una sustituciórJ de aminoácidos en una posición seleccionada entre PB2630, PA431, PA4"1, NP , NP'14, Np410, Np509, M1'59 Y M1'83. Por ejemplo, los virus reorganizantes favorables induyen virus de gripe A diseñados .p?,r ingeniería aenética de manera artificial con una o más sustituciones de aminoácidos seleccionadas entre PB1 39 (K391 E), PB1 1 (E581G),

PB1 661

(A661T), PB2265 (N265S) y Np34 (D34G); Y virus de gripe B aue incluyen una o más sustituciones de aminoácidos seleccionadas entre PB2630 (S630R); PA431 (V431 M); PA4 7 (Y497H); Np55 (T55A); Np114 (V114A);

Np(P410H); Np509 (A509T); M1 '59 (H159Q) Y M1 '83 (M183V).

Si se desea, los virus de la vacuna de la gripe se inactivan Iras su recuperación.

También se describen en el presente documento vacunas de virus de la g ripe, induyendo vacunas vivas atenuadas, producidas mediante los métodos descritos en el presente documento. Las vacunas de virus de la gripe pueden ser vacunas de virus reorganizantes.

También se describen en el presente documento plásmidos que son vectores de expresión bidireccionales. Los vectores de expresiórJ bidireccionales descritos en el presente documento incorporan un primer promotor insertado entre un segundo promotor y un sitio de poliadenilación, por ejemplo, un sitio de poliadenilación de SV40_ El primer promotor y el segundo promotor pueden situarse en orientaciones opuestas flanqueando a al menos un sitio de clonación. Un vector ejemplar descrito en el presente documento es el plásmido pAD3000, ilustrado en la Figura 1

Puede insertarse al menos un segmento de un genoma de virus de la gripe en el sitio de clonación, por ejemplo, en forma de un ácido nucleico bicatenario. Por ejemplo, un vector descrito en el presente documento incluye un plásmido que tiene un primer promotor insertado entre un segundo promotor y un sitio de poliadenilación de SV40, en el que el primer promotor y el segundo promotor están situados en orientaciones opuestas flanqueando al mellOS un segmento de un virus de la gripe

También se describen en el presente documento kits que incluyen uno o más vectores de expresión descritos en el presente documento. Típicamente, los kits también incluyen uno o más de: una línea celular capaz de soportar la replicación del virus de la gripe, un tampón, un medio de cultivo, un conjunto de instrucciones, un material de envase y un recipiente. El kit puede comprender una diversidad de vectores de expresión, pudiendo incluir cada uno de ellos al menos un segmento de un genoma de virus de la gripe. Por ejemplo, también se describen en el presente documento kits que incluyen una diversidad de vectores de expresión incluyendo cada uno los segmentos de gellOma interllOs de una cepa de virus seleccionada, por ejemplo, seleccionada por sus propiedades deseables respecto de la producción o administración de vacunas. Por ejemplo, la cepa de virus seleccionada puede ser una cepa atenuada, adaptada al frio y/o sensible a la temperatura, por ejemplo, AJAnn Arbor/6/60 o B/Ann Arbor/1I66, o una cepa altemativa con las propiedades deseadas, tal como una cepa diseñada artificialmente que tenga una o más sustituciones de aminoácidos tal como se describe en el presente documento, por ejemplo, en la Tabla 17. El kit puede incluir vectores de expresión que incorporan miembros de una biblioteca de ácidos nucleicos que codifican variantes de antígenos de HA y/o NA

También se describe en el presente documento el crecimiento productivo de cultivos celulares que incluyen al menos una célula que incorpora una diversidad de vectores que incluyen un genoma de virus de la gripe, a una temperatura menor o igual a 35 oC . La composición también puede incluir un medio de cultivo celular. La diversidad de vectores puede incluir vectores de expresión bidireccionales, por ejemplo, que comprenden un primer promotor insertado entre un segundo promotor y un sitio de poliadenilación de SV40. Por ejemplo, el primer promotor y el segundo promotor pueden situarse en orientaciones opuestas flanqueando a al menos un segmento de un virus de la gripe. Los cultivos celulares descritos en el presente documento se mantienen a una temperatura menor o igual a 35 oC , tal como entre aproximadamente 32 oC y 35 oC , típicamente entre aproximadamente 32 oC y aproximadamente 34 oC , por ejemplo, a aproximadamente 33 oC.

También se describe en el presente documento un sistema de cultivo celular que incluye un cultivo celular de crecimiento productivo de al menos una célula que incorpora una diversidad de vectores que comprenden un gellOma de virus de gripe, tal como se describe anteriormente, y un regulador para mantener el cultivo a una temperatura menor o igual a 35 oC. Por ejemplo, el regulador mantiene favorablemente al cultivo celular a una temperatura entre aproximadamente 32 oC y 35 oC, típicamente entre aproximadamente 32 oC y aproximadamente 34 oC , por ejemplo, a aproximadamente 33 oC

También se describen en el presente documento virus de la gripe recombinantes o reorganizantes diseñados por ingeniería genética de manera artificial que incluyen una o más sustituciones de aminoácidos que influencian la sensibilidad a la temperatura, la adaptación al frío y/o la atenuación. Por ejemplo, también se describen en el presente documento virus de la ~ripe A que tienen una o más sustituciones de aminoácidos en una posición seleccionada entre: PB139\ PB1ss , PB166\ PB2265 Y Np14 Y virus de gripe B diseñados por ingenieria genética de manera artificial Que tienen una o más sustituciones de aminoácidos en posiciones seleccionadas entre PB263O,

PA431 , PA497 , Np5S, Npl14, NP"10, NpS09, M1 159 Y M1 163. Los e!emplOS incluyen virus de gripe A con una cualquiera o

PB2265

más de las si~ientes sustituciones de aminoácidos: PB1 3 1 (K391E), PB1 581 (E581G), PB1 661 (A661T), (N265S) y NP ~D34G); Y virus de la gripe B con una cualquiera o más de las siguientes sustituciones de aminoácidos: PB2 30 (S630R); PA431 (V431 M); PA497 (Y497H ); Np55 (T55A); Npl14 (V114A); Np410 (P410H ); NpS09

159 163

(A509T); M1 (H159Q) Y M1 (M183V). Los virus pueden incluir una diversidad de mutaciones, tales como una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho o nueve sustituciones de aminoácidos en las posiciones identificadas anteriormente. Por consiguiente, también se describen en el presente documento virus de la gripe A ~ue tienen sustituciones de aminoácidos en todas las cinco posiciones indicadas anteriormente, por ejemplo, PB1 39 (K391 E), PB1581 (E581G), PB1661 (A661T), PB2265 (N265S) y Np34 (D34G) Y virus de gripe B diseñados por ingeniería genética de manera artificial que tienen sustituciones de aminoácidos en ocho o en todas las nueve ~siciones

630 431 491 55 1

indicadas anteriormente, por ejemplo, PB2(S630R); PA(V431M); PA(Y497H ); Np(T55A); Np4 (V114A);

M1 159

NP"10 (P410H); NpS09 (A509T); (H159Q) Y M1 183 (M183V). Además, los virus pueden incluir una o más sustituciones de aminoácidos adicionales llO enumeradas anteriormente. Además, se describen en el presente documento virus de gripe A o B que tienen sustituciones de aminoácidos en las siguientes cinco posiciones: PA431;

; M1 159

NPl14; Np410y M1 163. Además, los virus pueden incluir una o más sustituciones de aminoácidos adicionales no enumeradas anteriormente.

Los virus de la gripe diseñados por ingeniería genética de manera aruficial pueden ser virus de la gripe sensibles a la temperatura, virus de la gripe adaptados al frío y/o virus de la gripe atenuados. Por ejemplo, un virus de la gripe sensible a la temperatura muestra típicamente una reducción log 10 del crecimiento de aproximadamente 2,0 y 5,0 a 39 oC en comparación con un virus de la gripe de tipo silvestre. Por ejemplo, un virus sensible a la temperatura muestra favorablemente una reducción del crecimiento de al menos aproximadamente 2,0 10g lo, al menos aproximadamente 3,0 IOg10, al menos aproximadamente 4,0 log lO, o de al menos aproximadamente 4,5 loglO a 39 oC en relación a la de un virus de la gripe de tipo silvestre. Típicamente, pero no necesariamente, un virus de la gripe sensible a la temperatura mantiene características de crecimiento robusto a 33 oC. Un virus de la gripe atenuado descrito en el presente documento muestra tipicamente una reducción en el crecimiento entre 2,0 y 5,0 IOg 10 en un ensayo de atenuación en hurones en comparación con un virus de la gripe de lipo silvestre. Por ejemplo, un virus de la gripe atenuado descrito en el presente documento muestra una reducción en el crecimiento de al menos aproximadamente 2,0 log10, frecuentemente de aproximadamente 3,0 10g1O Y favorablemente de al menos aproximadamente 4,0 10910 en un ensayo de atenuación en hurones en relación a virus de la gripe de tipo silvestre,

También se describe en el presente documento un método para producir virus de la gripe en cultivo celular, comprendiendo el método: i) introducir una diversidad de vectores que comprenden un genoma de virus de la gripe en una población de células hospedadoras, siendo capaz dicha población de células hospedadoras de soportar la replicación de virus de la gripe; ii) cultivar la población de células hospedadoras a una temperatura menor o igual a 35 oC; y, iii) recuperar una diversidad de virus de la gripe.

Los métodos anteriores descritos en el presente documento comprenden introducir una diversidad de vectores que comprenden al menos un virus de gripe B/Ann Arbor/1l66 o un genoma de virus de gripe B diseñado por ingenieria genética de manera artificial que codifica al menos un aminoácido sustituido, influenciando dicho aminoácido sustituido las propiedades biológicas características de BIAnn Arbor/1f66.

Los métodos anteriormente descritos pueden comprender introducir una diversidad de vectores en una población de células hospedadoras que comprenden al menos un virus de gripe B/Ann Arbor/1/66 o un genoma de virus de gripe B diseñado por ingeniería ~nética de manera artificial que codifica al menos un aminoácido sustituido en las

Y Np509

siguientes posiciones: PB2 ; PA43'; NP114; NP410; . El genoma del virus de ce~a B de gripe puede

y M1 183

comprender además un aminoácido sustituido en una o más de las siguientes posiciones: M1 '

Los métodos anteriormente descritos pueden comprender introducir una diversidad de vectores en una población de células hospedadoras que comprenden al menos un virus de gripe BIAnn Arbor/1f66 o un genoma de virus de gripe B diseñado por ingeniería genética de manera artificial, en el que el genoma codifica una o más de las sustituciones

l14

de aminoácidos seleccionadas entre grupo que consiste en: PB2630 (S630R); PA431 (V431M); Np(V114A); Np410 (P410H); y Np51'9 (A509T). El genoma de virus de cepa de gripe B puede comprender al menos cinco sustituciones de aminoácidos.

Se proporciona un método producir un virus de la gripe adaptado al frío (ca), comprendiendo el método: (a) introducir

43 114 41O

al menos una mutación en las siguientes posiciones de aminoácidos: PB2630 , PA\ Np, Np, Y Np509 en un genoma de virus de gripe B; y (b) replicar el genoma de virus de la gripe mutado en condiciones en las que se produce virus.

También se describe en el presente documento un método para producir un virus de la g ripe adaf¡tado al frio (ca~4 comprendiendo el método: (a) introducir al menos las siguientes mutaciones: PB2630 (S630R), PA4 1 (V431M), Np1

410 509

(V114A), Np(P410H), Y Np(A509T) en un genoma de virus de gripe B; y (b) replicar el genoma de virus de la gripe mutado en condiciones en las que se produce virus.

También se describe en el presente documento un método para producir un virus de la gripe adaptado al frío (ca) que se replica eficazmente a 25"2w comrrendiendo el método: Wintroducir al menos una mutación en las siguientes

114 410

posIciones de aminoácidos: PB2 , PA 3\ Np, Np, y NP en un genoma de ViruS de gnpe B; y (b) replicar el genoma de virus de la gripe mutado en cond iciones en las que se produce virus

También se describe en el presente documento un método para producir un virus de la gripe adaptado al frío (ca) que se replica eficazmente a 25"C, comprendiendo el método: (a) introducir al menos las siguientes mutaciones: PB2630 (S630R), PA431 (V431 M), Npl14 (V114A), Np410 (P410H), y Np509 (A509T) en un genoma de virus de gripe B; y (b) replicar el genoma de virus de la gripe mutado en condiciones en las que se produce virus.

También se describe en el presente documento un virus de la gripe (y composiciones inmunogénicas que comprenden al mismo) producido mediante los métodos anteriores.

También se describe en el presente documento un virus adaptado al frío (y composiciones inmunogénicas que comprenden al mismo) producido mediante los métodos anteriores.

También se describe en el presente documento la identificación y manipulación de restos de aminoácidos en HA y NA que afectan a la replicación del virus de la gripe en células y en huevos de gallina embrionados. También se describe en el presente documento el uso de tecnología genética inversa para generar vacunas de virus de gripe con HA y NA variantes con replicación mejorada en huevos de gallina embrionados y/o células. También se describen en el presente documento métodos para modular la actividad de unión a receptor de HA y/o la actividad de NA. Además, en el presente documento se describen virus de la gripe con capacidad potenciada para replicarse en huevos de gallina embrionados y/o células

También se describen en el presente documento métodos para manipular restos de aminoácidos de HA ylo NA para aumentar la capacidad de un virus de la gripe para replicarse en huevos de gallina embrionados ylo células. El método implica la introducción de sustituciones de restos de aminoácidos en HA ylo NA y hace uso de métodos para producir virus de la gripe en cultivo celular mediante la introducción de una diversidad de vectores que incorporan un genoma de virus de gripe en una población de células hospedadoras capaces de soportar la replicación del virus de la gripe, cultivar las células y recuperar el virus de la gripe. Preferentemente, el virus de la gripe recuperado tiene una capacidad aumentada para replicarse en huevos de gallina embrionados y/o célu las. También se describen en el presente documento variantes de virus de la gripe con una capacidad aumentada para replicarse en huevos de gallina embriooados (citadas en el presente documento como "variantes de gripe de replicación potenciada") en comparaciórJ con cepas virales de gripe no modificadas.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1: Ilustración del plásmido pA03000 (SEC ID N°: 90).

Figura 2 Micrografías de células infectadas

Figura 3: Análisis de genotipado de rVoM-A y del virus reorganizante 6:2 H1 N1 a partir de transfección de plásm ido.

Figura 4: Ilustración del sistema de ocho plásmidos para la producción de virus de la gripe B

Figura 5: A y B. Caracterización del virus VOM-B recombinante mediante RT-PCR; C y O Caracterización de BIYamanashi/166/98 mediante RT-PCR.

Figura 6' Secuencia de pA03000 en formato de GeneBank

Figura 7: Alineamiento de secuencia con VoM-B y ocho plásmidos (SEC ID N°: 91-98).

Figura 8: Productos de RT -PCR procedentes de la amplificación simultánea de segmentos de HA y NA de cepas de gripe B.

Figura 9: Diagrama de barras que ilustra los títulos relativos de virus recombinantes y reorganizantes

Figura 10: Diagrama de barras que ilustra los titulos relativos de virus reorganizantes a temperaturas permisivas y restrictivas (sensibi lidad a la temperatura)

Figura 11 ' Representación gráfica de virus reorganizantes que incorporan mutaciones específicas (knock-in) que se correlacionan con la sensibilidad a la temperatura (panel izquierdo) y los títulos relativos a temperaturas permisivas y restrictivas (sensibilidad a la temperatura) (panel derecho).

Figura 12: Determinación de mutaciones de ts en un ensayo de minigenoma. A. Se transfectaron células HEP-2 con PB1 , PB2, PA, NP Y pFlu-CAT, se incubaron a 33 o 39 oc durante 18 horas y se analizaron los extractos celulares respecto de la expresión de gen indicador de CAT B. Expresión de ARNm de CAT mediante ensayo de extensión de cebadores.

Figura 13: Ilustración esquemática de recombinantes de genoma triple coo restos de tipo silvestre en las proteínas PA, NP, Y M1 .

Figura 14: Tabulación del crecimiento de virus recombinantes de un solo gen y de doble gen.

Figura 15: Tabulación de restos de aminoácidos de la nucleoproteína que corresponde a fenotipo no-ts.

Figura 16: Diagrama esquemático de mutantes de PR8 recombinantes. Las mutaciooes introducidas en los genes de PB 1 y/o PB2 se indican con los puntos gruesos.

Figura 17' Diagrama de barras que ilustra los títulos relativos a 33 OC Y 39 oc

Figura 18: Fotomicrografías que ilustran la morfología de la placa de mutantes de PR8 a varias temperaturas Se infectaron células MoCK tal como se indica y se incubaron a 33, 37 Y 39 "C durante tres días. Las placas de virus se visualizaroo mediante inmunotinci6n y se fotografiaroo.

Figura 19: Síntesis de proteínas a temperaturas permisivas y no permisivas. Se infectaron células MoCK con virus tal como se indica y se incubaron a 33 o 39 "C durante toda la noche. Se electroforetizaron polipéptidos radiomarcados en una SDS-PAGE y se autorradiografiaroo. Se indican las proteinas virales HA, NP, M1 Y NS

Figura 20: A. Diagramas de líneas que ilustran la replicación diferencial de VDM-A y VoM-B en células PeLC6 en relación a la replicación en células MoCK: B. Diagrama de líneas que ilustra la replicación diferencial de los reorganizanles de un solo gen de VDM-A en células PeLC6.

Figura 21: Diagrama de barras que ilustra la replicación diferencial de virus reorganizantes. Los recuadros en gris representan restos de aminoácidos de tipo silvestre. Las líneas de puntos representan la temperatura de apagamiento (ts) de 2,0 10910.

Figuras 22-23: Comparación antigénica de AlPanamaJ99 (H3N2) y similar a AlFujianl411102 (H3N2).

Figuras 24-28: Muestra la deriva antigénica desde AlPanama/99 a similar a AlFujianl02

Figuras 29-35: Detalle de las modificaciones en las cepas para producir virus de crecimiento aumentado en huevos embrionados

Figura 36: Afinidad de unión a receptor de HA de virus recombinantes Las variantes 6:2 AlFujian, AlSendai, A.lWyoming, y AlFujian con los cambios V186 y 1226 o L183 y A226 se adsorbieron a células MDCK a una mdi de 1,0 a 4Q C o 33°C durante 30 min, y las células infectadas se lavaron tres veces (+) o se dejaron sin tratar (-). Después de 6 horas de incubación a 33°C, las células se procesaron para linción de inmunofluorescencia El porcentaje de células infectadas (medias ± DE) indicado en cada imagen fue un promedio de seis imágenes

Figura 37: Cinética de crecimiento de virus recombinantes en células MDCK. Se infectaron células MDCK a una mdi de 1,0 bien a 33°C o a 4°C durante 30 minutos, se lavaron 3x con PBS. Las células infectadas se incubaron a 33°C y se recogieron los sobrenadantes de cultivo a los intervalos de tiempo indicados y se determinó la cantidad de virus mediante ensayo en placa

Figura 38: sitios de unión a receptor en HA y NA de subtipos de H3N2. Se indican los restos que mostraron aumentar la afinidad de uniórJ a receptor de HA y disminuir la actividad enzimática de NA en relación con los sitios de unión a ácido siálico (SIA)_ El monómero de HA se modeló usando 5HMG y el monómero de NA se modeló basándose en 2BAT usando WebLab VewerLite 3.10 (Accelrys , San Diego, CA).

Descripción detallada

Muchas cepas de virus de la gripe patógenas crecen solo de manera escasa en cultivo tisular, y no se han crecido satisfactoriamente cepas adecuadas para la producción de vacunas de virus vivo atenuado (por ejemplo, virus de la gripe sensibles a la temperatura, adaptados al frío y/o atenuados) en células cultivadas para producción comercial. La presente invención está definida por las reivindicaciones. También se describe en el presente documento un sistema de transfección multi-plásmido que permite el crecimiento y la recuperación de cepas de virus de la gripe que no están adaptadas para el crecimiento en condiciones de cultivo celular convencionales. Un desafío adicional en el desarrollo y producción de vacunas de la gripe es que una o más de las cepas de g ripe en circulación pueden no replicarse bien en huevos de gallina embrionados. La presente divulgación identifica varios restos de aminoácidos que influencian las actividades de las proteínas HA y NA Y ha identificado sustituciones de aminoácidos específicas que pueden modular estas actividades. En el presente documento se describe que la modulación de la actividad de unión del receptor de HA ylo la actividad de neuraminidasa NA puede potenciar la replicación de la gripe en huevos ylo células hospedadoras (por ejemplo, células Vera o MDCK). En el presente documento se describen específicamente combinaciones de sustituciones de aminoácidos en HA ylo NA que pueden potenciar la replicación viral en huevos y/o células y se demuestra que estas sustituciones de aminoácidos no tienen un impacto significativo en la antigenicidad de estos virus de la gripe recombinantes. Por lo tanto, en el presente documento se describe el uso de tecnología genética inversa para mejorar la fabricación de vacunas de virus de la gripe.

Los métodos descritos en el presente documento proporcionan vectores y métodos para producir virus de la gripe B recombinante en cultivo celular completamente a partir de ADN viral clonado. Los métodos descritos en el presente documento pueden basarse, en parte, en el desarrollo de condiciones de cultivo tisular que soportan el crecimiento de cepas de virus (virus de gripe tanto de cepa A como de cepa B) oon propiedades deseables en relación a la producción de vacunas (por ejemplo, patogenicidad o fenotipo atenuado, adaptación al frío, sensibilidad a la temperatura, etc.) in vitro en células cultivadas. Los virus de la gripe se producen introduciendo una diversidad de vectores que incorporan segmentos de genoma viral clonados en células hospedadoras, y cultivando las células a una temperatura que no supere los 35 oC. Cuando se transfectan los vectores que incluyen un genoma de virus de la gripe, pueden recuperarse virus recombinantes adecuados como vacunas mediante procedimientos de purificaci6n convencionales. Usando el sistema de vector y los métodos descritos en el presente documento, pueden producirse virus reorganizantes que incorporan los seis segmentos génicos internos de una cepa seleccionada por sus propiedades deseables respecto a la producción de vacunas, y los segmentos inmunogénicos HA y NA de una cepa seleccionada, por ejemplo, patogénica, de una manera rápida y eficaz en cultivo tisular. Por lo tanto, el sistema y los métodos descritos en el presente documento son útiles para la producción rápida en cultivo celular de virus de la gripe A y B recombinantes y reorganizantes, incluyendo virus adecuados para su uso como vacunas, incluyendo vacunas vivas atenuadas, tales como vacunas adecuadas para administración intranasal

Típicamente, se selecciona una sola cepa de virus donante maestro (VDM) para cada uno de los subtipos A y B. En el caso de una vacuna viva atenuada, la cepa de virus donante maestro se selecciona típicamente por sus propiedades favorables, por ejemplo, sensibilidad a la temperatura, adaptación al frío ylo atenuación, en relación a la producción de vacunas. Por ejemplo, las cepas donantes maestras ejemplares incluyen dichas cepas de AlAnn Arbor/6/60 y B/Ann Arbor/ll66 sensibles a la temperatura, atenuadas y adaptadas al frío, respectivamente. La presente divulgación aclara las mutaciones subyacentes que dan como resultado los fenotipos ca, ts y att de estas cepas virales, y proporciona métodos para producir nuevas cepas de gripe adecuadas para su uso como cepas donantes en el contexto de la producción de vacunas recombinantes y reorganizantes

Por ejemplo, se produce un virus donante maestro de tipo A (VDM-A), o un virus donante maestro de tipo B (VDMB), a partir de una diversidad de ADNc virales clonados que constituyen el genoma viral. Los virus recombinantes pueden producirse a partir de ocho ADNc virales clonados. Los ocho ADNc virales que representan las secuencias seleccionadas de VDM-A o VDM-B para PB2, PB1 , PA, NP, HA, NA, M Y NS se clonan en un vector de expresión bidireccional, tal como un plásmido (por ejemplo, pAD3000), de tal forma que el ARN genómico viral puede transcribirse a partir de un promotor de ARN polimerasa I (poi 1) de una hebra y los ARNm virales pueden sintetizarse a partir de un promotor de ARN polimerasa II (poi 11) de la otra hebra. Opcionalmente, puede modificarse cualquier segmento génico, incluyendo el segmento de HA (por ejemplo, para eliminar el sitio de escisión multibásico).

Entonces se recupera el virus MDV-A o MDV-B recombinante infeccioso después de la transfección de plásmidos que portan los ocho ADNc virales en células hospedadoras adecuadas, por ejemplo, células Yero, células MDCKl293T o MDCKlCOS7 cocultivadas. Usando los plásmidos y los métodos descritos en el presente documento, la divulgación es útil, por ejemplo, para generar vacunas de la gripe de reorganizados 6:2 mediante cotransfección de los 6 genes internos (PB1, PB2, PA, NP, M Y NS) del virus seleccionado (por ejemplo, VDM-A, VDM-B) junto con la HA y la NA derivadas de virus de la gripe diferentes de tipo correspondiente (A o B). Por ejemplo, el segmento HA se selecciona favorablemente de una cepa Hl , H3 o B patogénicamente relevante, tal como se efectúa rutinaria mente para la producción de vacunas. De manera similar, el segmento HA puede seleccionarse de una cepa con relevancia emergente como cepa patogénica, tal como una cepa H2 (por ejemplo, H2N2), una cepa H5 (por ejemplo, H5Nl) o una cepa H7 (por ejemplo, H7N7). También pueden producirse reorganizados que incorporan siete segmentos de genoma del MDV y bien el gen HA o NA de una cepa seleccionada (reorganizados 7:1 ). Además, este sistema es útil para determinar la base molecular de características fenotípicas, por ejemplo, los fenotipos atenuados (att), adaptados al frío (ca), y sensibles a la temperatura (ts), relevantes para la producción de vacunas.

También se describen en el presente documento métodos para manipular restos de aminoácidos de HA y/o NA para aumentar la capacidad de un virus de la gripe para replicarse en huevos de gallina embrionados y/o células. Por ejemplo, los métodos descritos en el presente documento pueden usarse para modular la actividad de unión al receptor de HA y/o la actividad de neuraminidasa NA para aumentar la capacidad de un virus de la gripe para replicarse en huevos ylo células. Además, en el presente documento se describen virus de la gripe con capacidad potenciada para replicarse en huevos de gallina embrionados ylo células.

DEFINICIONES

A menos que se defina de otro modo, se entiende que todos los términos científicos y técnicos tienen el mismo significado al usado de manera común en la técnica a la que pertenecen. Para el fin de la presente divulgación se definen a continuación los siguientes términos

Las expresiones "ácido nucleico", "polinucleótido", "secuencia polinucieotídica" y "secuencia de ácido nucleico" se refieren a polímeros de desoxirribonucleótido o ribonucleótido monocatenarios o bicatenarios, o a quimeras o análogos de los mismos. Tal como se usa en el presente documento, la expresión incluye opcionalmente polímeros de análogos de nucleótidos de origen natural que tienen la naturaleza esencial de nucleótidos naturales en tanto que hibridan con ácidos nucleicos monocalenarios de una manera similar a los nucleótidos de origen natural (por ejemplo, ácidos peptidonucleicos). A menos que se indique lo contrario, una secuencia de ácido nucleico particular descrita abarca secuencias complementarias, además de la secuencia indicada explícitamente.

El término "gen" se usa ampliamente para referirse a cualquier ácido nucleico asociado con una función biológica Por lo tanto, los genes incluyen secuencias codificantes ylo las secuencias reguladores necesarias para su expresión. El término "gen" se aplica a una secuencia genómica específica, así como a un ADNc o a un ARNm codificado por esa secuencia gen6mica.

Los genes también incluyen segmentos de ácido nucleico no expresados que, por ejemplo, forman secuencias de reconocimiento para otras proteínas. Las secuencias reguladoras no expresadas incluyen "promotores" y "potenciadores", a los que se unen proteínas reguladoras, tales como factores de transcripción, dando como resultado la traducción se secuencias adyacentes o próximas. Un promotor o potenciador "especifico de tejido" es uno que regula la transcripción en un tipo o tipos de tejido o célula específicos

El término "vector" se refiere a los medios mediante los cuales puede propagarse y/o transferirse un ácido nucleico entre organismos, células, o componentes celulares. Los vectores incluyen plásmidos, virus, bacteriófagos, provirus, fagémidos, transposones, y cromosomas artificiales, y similares, que se replican de manera autónoma o pueden integrarse en un cromosoma de una célula hospedadora. Un vector también puede ser un polinucleótido de ARN desnudo, un polinucleótido de ADN desnudo, un polinucie6tido compuesto tanto de ADN como de ARN en la misma hebra, un ADN o ARN conjugado a poli-lisina, un ADN o ARN conjugado a un péplido, un ADN conjugado a liposomas, o similares, que no se replican autánomamente Más comúnmente, los vectores descritos en el presente documento son plásmidos,

Un "vector de expresión~ es un vector, tal como un plásmido, que es capaz de promover la expresión, así como la replicación de un ácido nucleico incorporado en el mismo. Típicamente, el ácido nucleico que se va a expresar está "unido operativamente~ a un promotor y/o potenciador, y se somete a control regulador de la transcripción por el promotor y/o potenciador.

Un "vector de expresión bidireccional~ está caracterizado típicamente por dos promotores altemativos orientados en direcciones opuestas en relación a un ácido nucleico situado entre los dos promotores, de tal forma que pueda iniciarse la transcripción en ambas orientaciones, dando como resultado, por ejemplo, la transcripción de ARN tanto de hebra más (+) o sentido, como negativo (-) o antisentido. Como alternativa, el vector de expresión bidireccional puede ser un vector ambisentido, en el que el ARNm viral y el ARN genómico viral (en forma de ARNc) se expresan a partir de la misma hebra

En el contexto descrito en el presente documento, el término "aislado" se refiere a un material biológico, tal como un ácido nucleico o una proteína, que está sustancialmente libre de componentes que acompañan normalmente o interact úan con este en su ambiente de origen natural. El material aislado comprende opcionalmente material no encontrado con el material en su ambiente natural, por ejemplo, una célula. Por ejemplo, si el material está en su ambiente natural, tal como una célula, el material se ha puesto en una localización en la célula (por ejemplo, genoma

o elemento genético) no nativa para un material encontrado en ese ambiente. Por ejemplo, un ácido nucleico de origen natural (por ejemplo, una secuencia codificante, un promotor, un potenciador, etc.) se aísla si se introduce mediante medios no naturales en un locus del genoma (por ejemplo, un vector, tal como un plásmido o un vector viral, o amplic6n) no nativo para ese ácido nucleico Dichos ácidos nucleicos también se citan como ácidos nucleicos

"heterólogos~.

El término "recombinante" indica que el material (por ejemplo, un ácido nucleico o proteina) se ha alterado artificial o sintéticamente (de manera no natural) por la intervención humana. La alteración puede efectuarse en el material en,

o retirado de, su ambiente o estado natural. Específicamente, en referencia a un virus, por ejemplo, un virus de la gripe, el virus es recombinante cuando se produce mediante la expresión de un ácido nucleico recombinante

El término "reorganizado~, cuando se refiere a un virus, indica que el virus incluye componentes genéticos y/o polipeptídicos derivados de más de una cepa viral o fuente progenitora. Por ejemplo, un reorganizado 7:1 incluye 7 segmentos virales gen6micos (o segmentos génicos) derivados de un primer virus progenitor, y un solo segmento gellÓmico viral complementario, por ejemplo, que codifica hemaglutinina o neuraminidasa, a partir de un segundo virus progenitor. Un reorganizado 6:2 incluye 6 segmentos genómicos, más comúnmente los 6 genes internos de un primer virus progenitor, y dos segmentos complementarios, por ejemplo, hemaglutinina y neuraminidasa, procedentes de un virus progenitor diferente

La expresión "introducido" en referencia a un ácido nucleico heterólogo o aislado se refiere a la incorporación de un ácido nucleico en una célula eucariota o procariota donde puede incorporarse el ácido nucleico en el genoma de la célula (por ejemplo, cromosoma, plásmido, plástido o ADN mitocondria l), convertido en un replicón autónomo, o expresado de manera transitoria (por ejemplo, ARNm transfectado). El término incluye métodos tales como "infección~, "transfección~, "transformación" y "transducciórJ". En el contexto descrito en el presente documento, pueden emplearse una variedad de métodos para introducir ácidos nucleicos en células procariotas, incluyendo electroporación, precipitación con fosfato de calcio, transfección mediada por lípidos (Iipofección), etc.

La expresión "célula hospedadora" significa una célula que contiene un ácido nucleico heterólogo, tal como un vector, y soporta la replicación y/o la expresión del ácido nUcleico, y opcionalmente la producción de uno o más productos codificados, incluyendo un polipéptido y/o un virus. Las células hospedadoras pueden ser células procariotas, tales como E eoli, o células eucariotas, tales como células de levadura, de insecto, de anfibio, aviares o de mamífero, incluyendo células de ser humano. Las células hospedadoras ejemplares en el contexto descrito en el presente documento incluyen células Vero (riñón de mono verde africano), células PeLC6 (células reinales embrionarias humanas), células BHK (riñón de cría de hámster), células primarias de riñón de polio (PCK), células de riñón canino Madin-Darby (MOCK), células de riñón bovino Madin-Darby (MOBK), células 293 (por ejemplo, células 293T), y células COS (por ejemplo, células COS1 y COS7). La expresión célula hospedadora abarca combinaciones o mezclas de células, incluyendo, por ejemplo, cultivos mixtos de diferentes tipos celulares o líneas celulares (por ejemplo, células Vero y CEK). Se describe un co-cultivo de células Vero SF electroporadas, pOf ejemplo, en el documento PCT/US04f42669 registrado el 22 de diciembre de 2004

Las expresiones ~sensible a la temperatura~, ~adaptado al frío~ y "atenuado~ se conocen bien en la técn ica. POf ejemplo, la expresión ~sensible a la temperatura" ("ts-) indica que el virus muestra una reducción de 100 veces o mayOf en el titulo a 39 GC en relación a 33 GC para cepas de gripe A, y que el virus muestra una reducción de 100 veces o mayor en el título a 37 GC en relación a 33 GC para cepas de gripe B. Por ejemplo, la expresión -adaptado al frío" (-ca") indica que el virus muestra crecimiento a 25 GC dentro de 100 veces su crecimiento a 33 GC. Por ejemplo, la expresión "atenuado" Call") indica que el virus se replica en las vías aéreas superiores de hurones, pero no es detectable en los tejidos pulmonares, y no produce una enfermedad similar a gripe en el animal. Se entendera que los virus con fenotipos intermedios, es decir, los virus que muestran reducciones de títulos de mellOs de 100 veces a 39 QC (para virus de cepa A) o de 37 QC (para virus de cepa Bl, que muestran crecimiento a 25 QC que es más de 100 veces su crecimiento a 33 QC (por ejemplo, en 100 veces, 500 veces, 1000 veces, 10.000 veces menos), y/o muestran crecimiento reducido en los pulmones en relación al crecimiento en las vías aéreas superiores de hurones (es decir, parcialmente atenuados) y/o enfermedad similar a gripe reducida en el animal, que posee una o mas de las sustituciones de aminoácidos descritas en el presente documento también son virus útiles descritos en el presente documento. El crecimiento indica la cantidad viral indicada por el título, tamaño de placa o morfología, la densidad de partículas u otras medidas conocidas por los expertos en la materia.

La expresión "diseñado por ingeniería genética de manera artificial" se usa en el presente documento para indicar que el virus, el acido nucleico viral o el producto codificado de manera viral, por ejemplo, un polipéptido, una vacuna, comprenden al menos una mutación introducida mediante métodos recombinantes, por ejemplo, mutagénesis de sitio dirigido, mutagénesis por PCR, etc. La expresión "diseñado por ingeniería genética de manera artificial", cuando se refiere a un virus (o a un componente o producto viral) que comprende una o mas mutaciones de nucleótido y/o sustituciones de aminoácidos indica que el genoma viral o el segmento genómico que codifica el virus (o componente o producto viral) llO procede de fuentes naturales, tales como una cepa de origen natural o de laboratorio preexistente de virus producida mediante métodos no recombinantes (tales como paso progresivo a

Q

25C), por ejemplo, una cepa AJAnn Arbor/6/60 o B/Ann Arbor/l /66 de tipo silvestre o adaptada al frío.

Virus de la gripe

El geooma de los virus de la gripe está compuesto de ocho segmentos de ácido ribonucleico (ARN) de cadena lineal (-), que codifica las proteínas inmunogénicas hemaglutinina (HA) y neuraminidasa (NA), y seis polipéptidos intemos de núcleo: la nucleoproteína de la nucleocápsida (NP); proteínas de matriz (M); proteínas no estructurales (NS); y 3 proteínas ARN polimerasas (PA, PSI, PB2). Durante la replicación, se transcribe el ARN genómico viral en ARN mensajero de hebra (+) y ARNc genómico de hebra (-) en el núcleo de la célula hospedadora. Cada unode los ocho segmentos genómicos se empaqueta en los complejos de ribonucleoproteína que contienen, además del ARN, NP Y un complejo de polimerasa (PB1, PB2, Y PAlo

En el presente documento, el ARN gen6mico viral correspoodiente a cada uno de los ocho segmentos se inserta en un vector recombinante para la manipulación y producción de virus de la gripe. Una diversidad de vectores, incluyendo vectores virales, plásmidos, cósmidos, fagos, y cromosomas artificiales, pueden emplearse en el contexto descrito en el presente documento. Típicamente, por facilidad de manipulación, los segmentos genómicos virales se insertan en un vector plasmídico, proporcionando uno o más orígenes de replicación funcionales en células bacterianas y eucariotas, y, opcionalmente, un marcador conveniente para explorar o seleccionar células que incorporan la secuencia plasmídica. Un vector ejemplar, el plásmido pAD3000 se ilustra en la Figura 1.

Mas comúnmente, los vectores plasmídicos descritos en el presente documento son vectores de expresión bidireccionales capaces de iniciar la transcripciórJ del segmento genómico viral insertado en cualquier dirección, es decir, dando lugar a moléculas de ARN viral tanto de hebra (+) como de hebra (-). Para efectuar la transcripciórJ bidireccional, cada uno de los segmentos genómicos virales se inserta en un vector que tiene al menos dos promotores independientes, de tal forma que se transcriben las copias del ARN genómico viral mediante un primer promotor de ARN polimerasa (por ejemplo, Pol i), de una hebra, y se sintetizan ARNm virales a partir de un segundo promotor de ARN polimerasa (por ejemplo, Poi 11). Por consiguiente, se disponen los dos promotores en orientaciones opuestas flanqueando a cada sitio de clonación (es decir, una secuencia de reconocimiento por enzima de restricciórJ), preferentemente un sitio de clonación único, adecuados para la inserción de segmentos de ARN genómico viral. Como alternativa, puede emplearse un vector "ambisentido" en el que el ARNm de hebra (+) y el ARN viral de hebra (-) (como un ARNc) se transcriben a partir de la misma hebra del vector

Vectores de expresión

El segmento genómico del virus de la gripe que va a expresarse se une operativamente a una secuencia de control de la transcripción adecuada (promotor) para dirigir la síntesis de ARNm. Una variedad de promotores son adecuados para su uso en vectores de expresión para regular la transcripción de segmentos genómicos del virus de la gripe. Por ejemplo, en caso de que el vector sea el plásmido pAD3000, se utiliza el promotor de ARN polimerasa 11 (poi 11) dependiente de ADN de citomegalovirus (CMV). Si se desea, por ejemplo, para regular la expresiórJ condicional, pueden sustituirse otros promotores que inducen la transcripción de ARN en condiciones especificadas,

o en los tejidos o células especificadas. Hay disponibles numerosos promotores virales y de mamífero, por ejemplo, humanos, o pueden aislarse de acuerdo con la aplicación específica contemplada. Por ejemplo, los promotores alternativos obtenidos a partir de los genomas de virus de animales y seres humallOs incluyen promotores tales como los promotores de adenovirus (tales como AdellOvirus 2), virus del papiloma, virus de la hepatitis B, virus de polioma y virus de simio 40 (SV40), y varios promotores retrovirales. Los promotores de mamífero incluyen, entre otros muchos, el promotor de actina, promotores de inmunoglobulina, promotores de choque por calor, y similares. Ademas, pueden emplearse promotores de bacteriófagos en conjunción con la ARN polimerasa afín, por ejemplo, el promotor T7

La transcripción se aumenta opcionalmente incluyendo una secuencia potenciadora. Los potenciadores son elementos de ADN típicamente cortos, por ejemplo, de 10-500 pb, de acción en cis que actúan en concierto con un promotor para aumentar la transcripción, Se han aislado muchas secuencias potenciadoras a partir de genes de mamífero (hemoglobina, elastasa, albúmina, alfa-fetoproteína, e insulina), y virus de células eucariotas. El potenciador puede empalmarse en el vector a una posición 5' o 3' de la secuencia codificante heteróloga, pero se inserta típicamente en un sitio 5' del promotor. Típicamente, el promotor, y si se desea, las secuencias potenciadoras de la transcripción adicional se seleccionan para optimizar la expresión en el tipo de célula hospedadora en la que se va a introducir el ADN heterólogo (Scharf et al., (1994) Heat stress promoters and transcription factors Results Probl Gell Differ 20:125-62; Kriegler et al. (1990) Assembly of enhancers, promoters, and splice signals to control expression of transferred genes Methods in Enzymol 185: 512-27). Opcionalmente, el amplicón puede contener también un sitio de unión a ribosoma o un sitio intemo de entrada al ribosoma (IRES) para el inicio de la traducción

Los vectores descritos en el presente documento también incluyen de manera favorable las secuencias necesarias para la terminación de la transcripción y para estabilizar el ARNm, tales como un sitio de poliadenilación o una secuencia de terminación. Dichas secuencias están fácilmente disponibles a partir de las regiones 5' y en ocasiones 3' no traducidas de ADN o ADNc eucarióticos o virales. Por ejemplo, implicando al plásmido pAD3000, las secuencias de poliadenilación de SV40 proporcionan una señal de poliadenilaciórJ.

Además, tal como se describe anteriormente, los vectores de expresión incluyen opcionalmente uno o más genes marcadores de selección para proporcionar un rasgo fenotípico para la selección de células transformadas, además de los genes lisiados anteriormente, marcadores, tales como la dihidrofolato reductasa o la resistencia a neomicina son adecuados para la selección en cultivo de célula eucariotas

El vector que contiene la secuencia de ADN adecuada tal como se describe anteriormente, así como un promotor o secuencia de control adecuada, pueden emplearse para transformar una célula hospedadora, permitiendo la expresión de la proteína. Aunque los vectores descritos en el presente documento pueden replicarse en células bacterianas, será más frecuentemente deseable introducirlos en células de mamífero, por ejemplo, células Vero, células BHK, células MDCK, células 293, células COS, para el fin de la expresión

Elementos de expresión adicionales

Mas comúnmente, el segmento gen6mico que codifica la proteína del virus de la gripe incluye cualquier secuencia adicional necesaria para su expresión, incluyendo la traducción en una proteína viral funcional. En otras situaciones, puede emplearse un minigén, u otra construcción artificial que codifica las proteínas virales, por ejemplo, una proteína HA o NA. En este caso, a menudo es deseable incluir señales de iniciación específicas que ayudan a la traducción eficaz de la secuencia codificante heteróloga. Estas señales pueden incluir, por ejemplo, el codón de iniciación ATG y secuencias adyacentes. Para asegurar la traducciórJ de la inserción completa, se inserta el codón de iniciación en el marco de lectura correcto en relación a la proteína viral. Los elementos transcripcionales exógenos y los endones de iniciación pueden ser de varios orígenes, tanto naturales como sintéticos. La eficacia de la expresiórJ puede potenciarse mediante la inclusión de potenciadores adecuados para el sistema celular que se esté usando.

Si se desea, pueden incorporarse secuencias polinucleotídicas que codifican elementos expresados adicionales, tales como secuencias de señal, secuencias de secreción o localización, y similares en el vector, generalmente, en fase con la secuencia del polinucleótido de interés, por ejemplo, para dirigir la expresión del polipéptido a un compartimento celular, membrana, u orgánulo deseado, o en el medio de cultivo celular. Dichas secuencias se conocen por los expertos, e incluyen péptidos líderes de secreción, secuencias de dirección a orgánulos (por ejemplo, secuencias de localización nuclear, señales de retención en el RE, secuencias de tránsito mitocondrial), secuencias de localización/anclaje en membrana (por ejemplo, secuencias de detención de la transferencia, señales de ancla de GPl), y similares.

Vacunas de virus de la gripe

Históricamente, las vacunas de virus de la gripe se han producido en huevos de gallina embrionados usando cepas de virus seleccionadas basándose en predicciones empíricas de cepas relevantes. Más recientemente, se han producido virus reorganizantes que incorporan antígenos de hemaglutinina y neuraminidasa seleccionados en el contexto de una cepa maestra aprobada atenuada, sensible a la temperatura. Después del cultivo del virus a través de múltiples pases en huevos de gallina, se recuperan los virus de la gripe y, opcionalmente, se inactivan, por ejemplo, usando formaldehído y/o ¡3-propiolactona. Sin embargo, la producción de vacuna de la gripe de este modo tiene varios inconvenientes significativos. Los contaminantes que quedan de los huevos de gallina son elevada mente antigénicos, pirogénicos, y frecuentemente dan como resultado efectos secunda rios significativos tras su administración. De manera más importante, las cepas designadas para la producción tienen que seleccionarse y distribuirse, típicamente meses antes de la siguiente estación de gripe, para dar tiempo para la producción e inactivación de la vacuna de la gripe. Los intentos de producción de vacunas recombinantes y reorganizantes en cultivo celular se han visto impedidos por la incapacidad de ninguna de las cepas aprobadas para la producción de vacunas de crecer de manera eficaz en condiciones de cultivo celular convencionales

También se describe en el presente documento un sistema de vector, y métodos para producir virus recombinantes y reorganizantes en cultivo que hacen posible producir rápidamente vacunas que corresponden a una o varias cepas antigénicas de virus. En particular, se proporcionan condiciones y cepas que dan como resultado una producción eficaz de virus a partir de un sistema multi-plásmido en cultivo celular Opcionalmente, si se desea, los virus pueden amplificarse adicionalmente en huevos de gallina

Por ejemplo, no ha sido posible crecer la cepa maestra de gripe B, BfAnn Arbor/lI66, en condiciones de cultivo celular convencionales, por ejemplo, a 37 "C. En los métodos descritos en el presente documento, se introducen en células adecuadas múltiples plásmidos, incorporando cada uno un segmento de un genoma de virus de la gripe, y se mantienen en cultivo a una temperatura menor o igual a 35 "C. Típicamente, los cultivos se mantienen a entre aproximadamente 32 "C y 35"C, preferentemente entre aproximadamente 32 "C y aproximadamente 34 QC, por ejemplo, a aproximadamente 33 oC

Típicamente, los cultivos se mantienen en un sistema, tal como una incubadora de cultivos celulares, en condiciones de humedad y C02 controladas, a una temperatura constante usando un regulador de la temperatura, tal como un termostato para asegurar que la temperatura no supera los 35 QC.

Los virus de la gripe reorganizantes pueden obtenerse fácilmente introduciendo un subconjunto de vectores que corresponden a segmentos genómicos de un virus de gripe maestro, en combinación con segmentos complementarios procedentes de cepas de interés (por ejemplo, variantes antigénicas de interés). Tipicamente, las cepas maestras se seleccionan basándose en propiedades deseables relevantes para la administración de vacunas. Por ejemplo, para la producción de vacunas, por ejemplo, para la producción de una vacuna viva atenuada, la cepa de virus donante maestro puede seleccionarse respecto de un fenotipo atenuado, adaptación al frío y/o sensibilidad a la temperatura. En este contexto, la cepa ca de gripe A, NAnn Arbor/6/60; la cepa ca de gripe B, B/Ann Arbor/1/66; u otra cepa seleccionada respecto de sus propiedades fenotípicas, por ejemplo, una cepa atenuada, adaptada al frío y/o sensible a la temperatura, tal como una cepa de gripe A diseñada por ingeniería genética de manera artificial tal como se describe en el Ejemplo 4 o una cepa de gripe B diseñada por ingeniería genética de manera artificial que incorporan una o más de las sustituciones de aminoácidos especificadas en la Tabla 17 se seleccionan de manera favorable como cepas donantes maestras.

Los plásmidos que incorporan los seis genes intemos de la cepa de virus maestra de gripe (es decir, PB1 , PB2, PA, NP, NB, M1, BM2, NS1 Y NS2) pueden transfectarse en células hospedadoras adecuadas en combinación con segmentos de hemaglutinina y neuraminidasa de una cepa antigénicamente deseable, por ejemplo, una cepa en la que se predice que causa una infección de gripe local o global significativa. Después de la replicación del virus reorganizante en cultivo celular a temperaturas adecuadas para una recuperación eficaz, por ejemplo, menor o igual a 35 oC, tal como entre aproximadamente 32 oC y 35 QC, por ejemplo, entre aproximadamente 32 QC y aproximadamente 34 QC, o a aproximadamente 33 QC, se recuperan los virus reorganizantes. Opcionalmente, el virus recuperado puede inactivarse usando un agente desnaturalizante, tal como formaldehído o ¡3-propiolactona

Vacunas de virus de la grioe atenuados sensibles a la temperatura y adaptados al frío

En un aspecto, la presente divulgación se basa en la determinación de las mutaciones subyacentes al fenotipo ts en cepas donantes maestras preferidas del virus. Para determinar la importancia funcional de cambios de un solo nudeótido en el genoma de la cepa de VDM, se evaluaron virus reorganizantes procedentes de cepas altamente relacionadas del linaje NAA16/BO respecto de su sensibi lidad a la temperatura. La naturaleza isogénica de las dos cepas progenitoras permite la evaluación de cambios de un solo nucleótido en el fenotipo ts. Por consiguiente, la base genética para el fenotipo ts de VDM-A se mapea a nivel de nucleótidos para especificar restos de aminoácidos en PB1, PB2, Y NP.

Los intentos anteriores para mapear la base genética del fenotipo ts de ca NAA16/60 utilizaron técnicas clásicas de coinfección/reorgan izantes para crear reorganizantes de un solo gen y de múltiples genes entre NAA16/BO y una cepa wt no relacionada. Estos estudios sugirieron que tanto PB2 como PB1 contribuyeron al fenotipo ts {Kendal et al. (1978) Biochemical characteristics of recombinant viruses derived at sub-optimal temperatures: evidence that ts lesions are present in RNA segments 1 and 3, and that RNA 1 codes for the virion transcriptase enzyme, p. 734-743. En B. W. J. Mahy, y R_O. Barry (ed.) Negative Strand Viruses, Academic Press; Kendal et al. (1977) Comparative studies of wild-type and cold mutant (temperature sensilive) influenza viruses: genealogy of the matrix (M) and the non-structural (NS) proteins in recombinant cold-adapted H3N2 viruses J Gen ViroI 37:14S-1S9; Kendal et al. (1979) Comparative studies of wild-type and cold-mutant (temperature sensitive) influenza viruses: independent segregation of temperature-sensitivity of virus repl ication from temperature-sensitivity of virion transcriptase activity during recombination of mutant AJAnn Arborf6f60 with wild-type H3N2 strains J Gen Viral 44:443-4560; Snyder et al. (1988) Four viral genes independentJy contribute to atlenuation of live influenza AJA/m Arbor/6f60 (H2N2) cold -adapted reassortant virus vaccines J Virol 62:488-95). La interpretación de estos estudios, sin embargo, se confundió debido a efectos de constelación, que estuvieron causados por la mezcla de segmentos génicos de dos cepas de gripe A divergentes. Las interacciones debilitadas podrían haber sucedido a través de cambios entre los segmentos génicos de AJAPJ6f60 y de wt distintos de aquellos implicados específicamente en la expresión del fenotipo ts a partir del origen de AJAA16f60. También se demostró que los efectos de constelación confundieron la interpretación de la asociación del segmento génico M con el fenotipo atl (Subbarao et al. (1992) The atlenuation phenotype conferred by the M gene of the influenza AJAnn Arborl6f60 cold-adapted virus (H2N2) on the AJKorea/82 (H3N2) reassortant virus results from a gene constellation effect Virus Res 25:37-50)

Las mutaciones que dan como resultado sustituciones de aminoácidos en las posiciones PB1 391, PB1 581, PB1 66\

y Np34

PB2uS se identifican en el presente documento como funciona lmente importantes para conferir el fenotipo sensible a la temperatura al virus de cepa VDM-A. Como apreciarán los expertos en la materia, las mutaciones en

11 9S1766 821 146

nucleótidos en las posiciones PB1 , PB1 , PB1 200S, PB2y Npdesignan sustituciones de aminoácidos en

391 581 661 PB2265

PB1 , PB1 , PB1 , Y Np34, respectivamente. Por lo tanto, también se describen en el presente documento cualesquiera sustituciones de nucleótidos que den como resultado aminoácidos sustituidos en estas

391 581 661

posiciones. Las mutaciones ejemplares PB1 (K391 E), PB1 (E581G), PB1 (A661T), PB2265 (N265S) y Np34 (D34G), de manera individual, y más preferentemente en combinación, dan como resultado un fenotipo sensible a la temperatura. La reversión simultánea de estas mutaciones a tipo silvestre suprime el fenotipo ts, mientras que la introducción de estas mutaciones en un origen de tipo silvestre da como resultado virus con un fenotipo ts. De manera consistente con la estabilidad de estos fenotipos durante el pase del virus, ningún cambio individual puede revertir individualmente el perfil de sensibilidad a la temperatura del virus resultante al de tipo silvestre. En cambio, estos cambios parecen actuar en concierto entre sí para expresar completamente el fenotipo ts. Este descubrimiento permite el diseño por ingenieria genética de cepas adicionales de virus de gripe A sensible a la temperatura adecuadas para virus donantes maestros para la producción de vacunas de gripe vivas atenuadas

De manera similar, las sustituciones de aminoácidos individuales en una cepa de virus donante maestro B se correlacionan con el fenotipo ts, tal como se ilustra en la Tabla 17. Por lo tanto, los métodos presentados en el presente documento están adaptados para producir nuevas cepas de gripe B con fenotipos sensibles a la temperatura, y opcionalmente atenuados y/o adaptados al frío mediante la introducción de una o más mutaciones especificadas en un genoma de gripe B. Por ejemplo, se introducen una o más mutaciones que dan como resultado una sustitución de aminoácidos en una posición seleccionada entre PB2630, PA431; PA497; NPss; NPl14; NP410; Np509; M1 159 Y M1 183 en el genoma de una cepa de gripe B para producir un virus de la gripe B sensible a la temperatura

431 497

Las sustituciones de aminoácidos ejemplares incluyen las siguientes : PB2630 (S630R)~PA(V431 M); PA(Y497H); Np55 (T55A); Npl14 (V114A); NP 10 (P410H); Np51'9 (A509T); M1 159 (H159Q) Y M1 (M183V).

En el presente documento se describen virus de la gripe que incorporan las mutaciones independientemente del método mediante el que se producen. Es decir, también se describen en el presente documento cepas de gripe que incluyen las mutaciones descritas en el presente documento, por ejemplo, cualquier virus de gripe A con una sustitución de aminoácidos en relación al tipo silvestre en una o más posiciones seleccionadas entre: PB1 39\

581 661

PB1 , PB1 , PB2265 Y Np34 o cualquier virus de gripe B con una sustitución de aminoácidos en relación alllF'

silvestre en una o más posiciones seleccionadas entre: PB2630; PA; PA497; Np55; NPl14; NP410; Np509; M11 Y M1 183, con la salvedad de no considerar como descritas en el presente documento las cepas ca AJAnn Arborf6/60 y BfAnn Arbor/1f66. Los virus de gripe A pueden incluir una diversidad de mutaciones (por eje~lo, dos, o tres, o cuatro, o Cinco, o más mutaciones) selecCionadas entre PB1 391 (K391E), PB1 581 (E581G), PB1 1 (A66n), PB2265 (N265S) y Np34 (034G); Y los virus de gripe B incluyen una diversidad de mutaciones seleccionadas entre PB2630

431 497 Npm 10 Np500 150

(S630R); PA(V431 M); PA(Y497H); Np55 (T55A); (V114A); Np· (P410H); (A509T); M1 (H 1590) Y M1183 (M183V), respectivamente Por ejemplo, además de proporcionar virus con los fenotipos deseados relevantes para la producción de vacunas, son adecuados los virus con un subconjunto de mutaciones, por ejemplo, 1, o 2, o 3, o 4, o 5 mutaciones seleccionadas para dilucidar la contribución de las mutaciones adicionales al fenotipo del virus. Los virus de la gripe pueden incluir al menos un nucleátido adicional no de tipa silvestre (por ejemplo, dando posiblemente como resultado una sustitución adicional de aminoácidos), que refina opcionalmente el fenotipo deseado o confiere un atributo fenotípico deseable adicional Replicación viral potenciada

En el presente documento también se describe un método para la introducción de al menos una sustitución de resto de aminoácido en HA ylo NA para aumentar la capacidad de un virus de la gripe para replicarse en huevos de gallina embrionados ylo en células hospedadoras. También se describen en el presente documento variantes de virus de la gripe con capacidad aumentada para replicarse en huevos de ga llina embrionados ylo en células hospedadoras (citadas en el presente documento como "variantes re replicación potenciada~) cuando se comparan con virus de la gripe sin sustituciones en HA ylo NA. Se contempla específicamente que el método descrito en el presente documento pueda utilizarse para potenciar la replicaciórl de un virus de la gripe en una célula hospedadora y que las variantes de replicación potenciada puedan tener replicación potenciada en huevos de ga llina ylo célu las hospedadoras. Las células adecuadas para la replicación del virus de la gripe incluyen, por ejemplo, células Vero, células Per.C6, células SHK, células MDCK, células 293 y células cas, incluyendo células 293T y células CaS7

El método descrito en el presente documento puede introducir al menos una sustitución de aminoácidos en HA ylo NA que potenciará la capacidad de un virus de la gripe para replicarse en huevos ylo células hospedadoras en al menos un 10%, o en al menos un 20%, o en al menos un 30%, o en al menos un 40%, o en al menos un 50%, o en al menos un 60%, o en al menos un 70%, o en al menos un 80%, o en al menos un 90%, o en al menos un 100%, o en al menos un 200%, o en al menos un 300%, o en al menos un 400%, o en al menos un 500% en comparación con el virus de la gripe no modificado. Se contempla específicamente que puedan efectuarse las modificaciones de aminoácdos tanto en HA como en NA. Preferentemente, el método descrito en el presente documento no altera significativamente la antigenicidad del virus de la gripe sustituido cuando se compara con el virus de la gripe no sustituido. El método descrito en el presente documento reduce la antigenicidad del virus de la gripe sustituido en comparaciórl con el virus de la gripe no sustituido en menos de un 10%, o en menos de un 20%, o en menos de un 30%, o en menos de un 40%, o en menos de un 50%, o en menos de un 60%, o en menos de un 70%, o en menos de un 80%, o en menos de un 90%, o en menos de un 100%. Se conocen bien en la técnica métodos para determinar la antigenicidad viral (véase también el "Ejemplo 11", anteriormente citado).

El método descrito en el presente documento incorpora además un virus de la gripe atenuado, un virus de la gripe adaptado al frío, un virus de la gripe sensible a la temperatura, o un virus con cualquier combinación de estas características deseables. Preferentemente, los virus incorporados mediante el método descrito en el presente documento incluyen, pero sin limitación, el virus de la gripe de cepa SIAnn Arbor11/66 , el virus de la gripe de cepa AJAnn Arbor/B/BO. El método descrito en el presente documento puede introducir vectores que incluyen los seis genes intemos de una cepa viral seleccionada por sus propiedades favorables en relación a la producción de vacunas, en combinación con los segmentos genómicos que codifican los antígenos de superficie de HA y NA manipulados deseados para producir virus de gripe con capacidad potenciada para replicarse en huevos de ga llina embrionados y/o en células hospedadoras (véase más arriba y el "Ejemplo 11"). Los métodos descritos en el presente documento pueden incorporar además un virus de la gripe no atenuado.

El método descrito en el presente documento puede introducir al menos una sustituciórl de aminoácidos que modula la actividad de unión a receptor de HA. La actividad de unión a receptor de HA incluye, pero sin limitación, la unión de HA a restos de ácido siálico (por ejemplo, restos de sialilo-galactosilo unidos en 2,6 [Siaa(2,6)Gal] y restos de sialilo-galactosilo un idos en 2,3 [Siaa(2 ,3)Gal]) presentes en las glucoproteinas o glucolípidos de la superficie celu lar. En ~Ejemplo 11" (más adelante) se presenta un método para ensayar la unión de HA. Se conocen bien airas métodos en la técnica. Él método descrito en el presente documento puede introducir sustituciones de aminoácidos que modulan la especificidad de unión a receptor de HA para restos de [Siaa(2,B)Gal] ylo [Siaa(2,3)Gal]. Preferentemente, el método potenciará la unión de HA a restos de [Siaa(2,3)Gal]

El método descrito en el presente documento puede inlroducir al menos una sustitución de aminoácidos que potencia la actividad de unión a receptor de HA. Preferentemente, la actividad de unión a receptor aumenta en al menos un 10%, o en al menos un 20%, o en al menos un 30%, o en al menos un 40%, o en al menos un 50%, o en al menos un 60%, o en al menos un 70%, o en al menos un 80%, o en al menos un 90%, o en al menos un 100%, o en al menos un 200%

El método descrito en el presente documento puede introducir al menos una sustitución de aminoácidos que reduce la actividad de unión a receptor de HA. Preferentemente, la actividad de uniórl a receptor se reduce en al menos un 10%, o en al menos un 20%, o en al menos un 30%, o en al menos un 40%, o en al menos un 50%, o en al menos un 60% , o en al menos un 70%, o en al menos un 80%, o en al menos un 90%, o en al menos un 100%, o en al menos un 200%.

El método puede introducir al menos una sustitución de aminoácidos en las posiciones 183, 186 ylo 226 de HA De acuerdo con la presente invención, tal como se define en las reivindicaciones, se efectúan sustituciones de aminoácidos en las posiciones 183 y 226, de tal forma que la posición 183 es una leucina y la posición 226 es una alanina

El método descrito en el presente documento puede introducir al menos una sustitución de aminoácidos que modula la actividad de neuraminidasa de NA. La actividad de neuraminidasa de NA incluye, pero sin limitación, la hidrólisis de sustratos que contienen ácido N-acel ilneuramínico unido de manera alfa-cetosídica (Neu5Ac). Los métodos para determinar la actividad de neuraminidasa se conocen bien en la técnica (véase también el ~Ejemplo 11~ más adelante)

El método descrito en el presente documento puede introducir al menos una sustitución de aminoácidos que potencia la actividad de neuraminidasa de NA. Preferentemente, la actividad de unión a receptor aumenta en al menos un 10%, o en al menos un 20%, o en al mellOs un 30%, o en al menos un 40%, o en al menos un 50%, o en al menos un 60%, o en al mellOs un 70%, o en al menos un 80%, o en al menos un 90%, o en al menos un 100%, o en al menos un 200%.

El método descrito en el presente documento puede introducir al menos una sustitución de aminoácidos que reduce la actividad de neuraminidasa de NA. Preferentemente, la actividad de neuraminidasa se reduce en al menos un 10%, o en al menos un 20%, o en al menos un 30%, o en al menos un 40%, o en al menos un 50%, o en al mellOs un 60%, o en al menos un 70%, o en al menos un 80%, o en al menos un 90%, o en al menos un 100%, o en al menos un 200%.

El método descrito en el presente documento puede introducir al menos una sustitución de a minoácidos en las posiciones 119 y/o 136 de NA. Preferentemente, las sustituciones se efectúan de tal modo que la posición 119 es un glutamato y la posición 136 es una glutamina

Un experto en la materia apreciará que en algunos casos, la proteína HA ylo NA ya tendrá los restos de aminoácido preferidos en una o más de las posiciones anteriormente mencionadas. En esta situación, se introducirán sustituciones solo en las posiciones restantes no coincidentes

Se contempla específicamente que puedan efectuarse sustituciones conservativas de aminoácidos para dichas sustituciones de aminoácidos en las posiciones 183, 186 ylo 226 de HA y en las posiciones 119 ylo 136 de NA, descritas anteriormente.

Se sabe bien en la técnica que "sustitución conservativa de aminoácidos" se refiere a sustituciones de aminoácidos que sustituyen aminoácidos funcionalmente equivalentes. Los cambios conservativos de aminoácidos dan como resultado cambios silentes en la secuencia de aminoácidos del péptido resultante. Por ejemplo, uno o más aminoácidos de una pola ridad similar actúan como equivalentes funcionales y dan como resultado una alteración silente en la secuencia de aminoácidos del péptido. También pueden considerarse como Msustituciones conservativas" aquellas sustituciones que son de carga neutra y que sustituyen a un resto con un resto más pequeño, incluso si los restos se encuentran en grupos diferentes (pOf ejemplo, sustitución de fenilalanina con isoleucina, más pequeña). Se han definido en la técnica familias de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares. Las fam ilias de sustituciones conservativas de aminoácidos incluyen, pero sin limitación, no polares (por ejemplo, Trp, Phe, Met, Leu, lIe, Val, Ala, Pro), polares no cargadas (por ejemplo, Gly, Ser, Thr, Asn, Gln, Tyr, Cys), ácidaslcargadas negativamente (por ejemplo, Asp, Glu), básicas/cargadas positivamente (por ejemplo, Arg, Lys, His), beta-ramificadas (por ejemplo, Thr, Val, lIe), restos que influencian la orientación de cadena (por ejemplo, Gly, Pro) y aromáticas (por ejemplo, Trp, Tyr, Phe, His). La expresión "sustitución conservativa de aminoácidos también se refiere al uso de análogos o variantes de aminoácidos. Se proporciona una orientación referente a cómo preparar sustituciones de aminoácidos fenotípicamente silentes en Bowie et al., MDeciphering the Message in Protein Sequences: Tolerance to Amino Acid Substitutions," (1990, Science 247:1306-10).

También se describen en el presente documento virus de la gripe modificados, citados en el presente documento como variantes de gripe de "replicación potenciada", que incorporan al menos una sustitución de aminoácidos en HA y/o NA que potencia su replicación en huevos de gallina embrionados y/o en células hospedadoras cuando se comparan con los virus de la gripe no modificados. Preferentemente, la capacidad de replicación de una variante de gripe de replicación potenciada en huevos ylo células hospedadoras se ha potenciado en al menos un 10%, o en al menos un 20%, o en al menos un 30%, o en al menos un 40%, o en al menos un 50%, o en al menos un 60%, o en al menos un 70%, o en al menos un 80%, o en al menos un 90%, o en al menos un 100%, o en al menos un 200%,

o en al menos un 300%, o en al menos un 400%, o en al menos un 500% en comparación con el virus de la gripe no mod ificado.

Una variante de gripe de replicación potenciada puede incorporar además un virus de gripe atenuado, un virus de la gripe adaptado al frío, un virus de la gripe sensible a la temperatura, o un virus con cualquier combinación de estas características deseables. Preferentemente, el virus incorporado en una variante de gripe de replicación potenciada incluye, pero sin limitación, el virus de la gripe de cepa BIAnn Arborf1/66, el virus de la gripe de cepa AJAnn Arbor/6160. Se contempla específicamente que se produzca una variante de gripe de replicación potenciada introduciendo vectores que incluyen los seis genes internos de una cepa viral seleccionada por sus propiedades favorables referentes a la producción de vacunas, en combinación con los segmentos genómicos que codifican los antígenos de superficie de HA y NA sustituidos deseados (véase más arriba y el ~Ejemplo 11")

Una variante de gripe de replicación potenciada puede incOfporar al menos una sustitución de amillOácidos en HA que modula la actividad de unión a receptor de HA (véase más arriba) Preferentemente, el método potenciará la unión de HA a restos de [Siaa(2 ,3)Gal] Una variante de gripe de replicación potenciada puede incorporar al menos una sustitución de aminoácidos que potencia la actividad de unión a receptor de HA_ Preferentemente, la actividad de unión a receptor aumenta en al menos un 10%, o en al menos un 20%, o en al menos un 30%, o en al menos un 40%, o en al menos un 50%, o en al menos un 60%, o en al menos un 70%, o en al menos un 80%, o en al menos un 90%, o en al menos un 100%, o en al menos un 200%. Se contempla específicamente que una variante de gripe potenciada en huevo no tenga una antigenicidad viral significativamente alterada cuando se compara con el virus de la gripe no sustituido_ Una variante de gripe de replicación potenciada puede tener una antigenicidad que se reduce en menos de un 10%, o en menos de un 20%, o en menos de un 30%, o en menos de un 40%, o en menos de un 50%, o en menos de un 60%, o en menos de un 70%, o en menos de un 80%, o en menos de un 90%, o en menos de un 100% cuando se compara con el virus no sustituido_ Se conocen bien en la técnica métodos para determinar la antigenicidad viral (véase también el ~Ejemplo 11", anteriormente citado)

Una variante de gripe de replicación potenciada puede incorporar al menos una sustitución de aminoácidos que reduce la actividad de unión a receptor de HA. Preferentemente, la actividad de unión a receptor se reduce en al menos un 10%, o en al menos un 20%, o en al menos un 30%, o en al menos un 40%, o en al menos un 50%, o en al menos un 60%, o en al menos un 70%, o en al menos un 80%, o en al menos un 90%, o en al menos un 100%, o en al menos un 200%.

Una variante de gripe de replicación potenciada puede incOfporar al menos una sustitución de aminoácidos en HA en las posiciones 183, 186 y/o 226_ De acuerdo con la invención, tal como se define en las reivindicaciones, las sustituciones de aminoácidos están presentes en las posiciones 183 y 226, de tal forma que la posición 183 es una leucina y la posición 226 es una alanina

Una variante de gripe de replicación potenciada puede incorporar al menos una sustitución de aminoá.cidos que modula la actividad de neuraminidasa de NA (véase más arriba)

Una variante de gripe de replicación potenciada puede incorporar al menos una sustitución de aminoácidos que potencia la actividad de neuraminidasa de NA_Preferentemente, la actividad de unión a receptor aumenta en al menos un 10%, o en al menos un 20%, o en al menos un 30%, o en al menos un 40%, o en al menos un 50%, o en al menos un 60%, o en al menos un 70%, o en al menos un 80%, o en al menos un 90%, o en al menos un 100%, o en al menos un 200%

Una variante de gripe de replicación potenciada puede incorporar al menos una sustitución de aminoácidos que

reduce la actividad de neuraminidasa de NA_ Preferentemente, la actividad de neuraminidasa se reduce en al menos un 10%, o en al menos un 20%, o en al menos un 30%, o en al menos un 40%, o en al menos un 50%, o en al menos un 60%, o en al menos un 70%, o en al menos un 80%, o en al menos un 90%, o en al menos un 100%, o en al menos un 200%.

Una variante de gripe de replicación potenciada puede incOfporar al menos una sustitución de aminoácidos en NA en las posiciones 119 y/o 136. Preferentemente, las sustituciones se efectúan de tal modo que la posición 119 es un glutamato y la posición 136 es una glutamina.

Cultivo celular

Típicamente, la propagación del virus se logra en las composiciones de medio en las que se cultivan normalmente las células hospedadoras_ Las células adecuadas para la replicación del virus de la gripe incluyen, por ejemplo, células Vero, células Per.C6, células BHK, células MOCK, células 293 y células COS, incluyendo células 293T y células COS7_ Comúnmente, se emplean co-cultivos que incluyen dos de las lineas celulares anteriores, por ejemplo, células MDCK y células 293T o COS a una relación, por ejemplo, de 1:1, para mejorar la eficacia de la replicacíón. Típicamente, las células se cultivan en un medio de cultivo comercial estándar, tal como medio Eagle modificado de Dulbecco suplementado con suero (por ejemplo, suero fetal bovino al 10 %), o en medio sin suero, con humedad controlada y una concentración de C02 adecuada para mantener un pH tamponado neutro (por ejemplo, a un pH entre 7,0 y 7,2). Opcionalmente, el medio contiene antibióticos para prevenir el crecimiento bacteriano, por ejemplo, penicilina, estreptomicina, etc_, y/o nutrientes adicionales, tales como L-glutamina, piruvato de sodio, aminoácidos no esenciales, suplementos adicionales para promover características de crecimiento favorables, por ejemplo. tripsina, ¡3-mercaptoetanol, y similares.

Los procedimientos para mantener a las células de mamífero en cultivo se han comunicado de manera extensiva, y son conocidos para los expertos en la materia. Se proporcionan protocolos generales, por ejemplo, en Freshney (1983) Culture of Animal Celis: Manual of Basic Technique, Alan R. Liss, Nueva York.; Paul (1975) Cell and Tissue Culture, 5a ed_. Livingston, Edimburgo; Adams (1980) Laboratory Techniques in Biochemislry and Molecular BiologyCell Culture for Biochemisls, Work. y Burdon (eds_) Elsevier, Ámsterdam_Los detalles adicionales referentes a los procedimientos de cultivo tisular de interés particular en la producción de virus de la gripe in vivo incluyen, por ejemplo, Merten et al. (1996) Production of influenza virus in cell cultures for vaccine preparation. En Cohen y Shafferman (eds) Novel Strategies in Design and Production of Vaccines _ Además, se determinan fácilmente variaciones en dichos procedimientos adaptados para la presente divulgación mediante experimentación rutinaria Las células para la producción de virus de la gripe pueden cultivarse en medio con suero o sin suero. En algunos casos, por ejemplo, para la preparación de virus purificados, es deseable crecer las células hospedadoras en condiciones sin suero, Las células pueden cultivarse a pequeña escala, por ejemplo, en menos de 25 mi de medio, tubos o matraces de cultivo, o en grandes matraces con agitación, en botellas rotatorias, o en perlas microtransportadoras (por ejemplo, perlas microtransportadoras de OEAE-dextrano, tales como Dormacell, Pfeifer y Langen; Superbead, Flow Laboratories; perlas de copollmero de estireno-trimetilamina, tales como Hillex, SoloHill, Ann Arbor) en matraces, botes o cultivos en reactor. Las perlas microtransportadoras son pequeñas esferas (en el intervalo de 100-200 micras de diámetro) que proporcionan una gran área superficial para crecimiento celular adherente por volumen de cultivo celular. Por ejemplo, un solo litro de medio puede incluir más de 20 millones de perlas microtransportadoras que proporcionan más de 8000 centímetros cuadrados de superficie de crecimiento Para la producción comercial de virus, por ejemplo, para la producción de vacunas, a menudo es deseable cultivar las células en un biorreactor o en un fermentador. Los biorreactores están disponibles en volúmenes desde menos de 1 litro hasta más de 100 litros, por ejemplo, Biorreactor Cyt03 (Osmonics, Minnetonka, MN); biorreactores NBS (New Brunswick Scientific, Edison, N.J.); biorreactores a escala de laboratorio o comercial de B. Braun Biotech Intemational (B. Braun Biotech, Melsungen, Alemania)

Independientemente del volumen de cultivo, en el contexto descrito en el presente documento, es importante que se mantengan los cultivos a una temperatura menor o igual a 35 oC, para asegurar una recuperación eficaz de virus de la gripe recombinantes yfo reorganizantes usando el sistema multiplásmido descrito en el presente documento. Por ejemplo, las células se cultivan a una temperatura entre aproximadamente 32 oC y 35 oC, típicamente a una temperatura entre aproximadamente 32 oC y aproximadamente 34 oC, nonnalmente a aproximadamente 33 oC

Típicamente, se emplea un regulador, por ejemplo, un termostato u otro dispositivo para detectar y mantener la temperatura del sistema de cultivo celular para asegurar que la temperatura no supere los 35 oC durante el periodo de replicación del virus

Introducción de vectores en células hospedadoras

Los vectores que comprenden segmentos genómicos de la gripe se introducen (por ejemplo, transfectan) en células hospedadoras de acuerdo con métodos bien conocidos en la técnica para introducir ácidos nucleicos heterólogos en células eucariotas, incluyendo, por ejemplo, co-precipitación con fosfato de calcio, electroporación, microinyección, lipofección y transfección empleando reactivos de transfección de poliamina. Por ejemplo, pueden transfectarse vectores, por ejemplo, plásmidos en células hospedadoras, tales como células COS, células 293T o combinaciones de células COS o 293T y células MDCK, usando un reactivo de transfección de poliamina TranslT -L T1 (Mirus) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se introducen aproximadamente 1 !Jg de cada vector en la población de células hospedadoras con aproximadamente 2 ¡.JI de TranslT -LT1 diluido en 160 ¡.JI de medio, preferentemente medio sin suero, en un volumen total de 200 ~I. Las mezclas de AON :reactivo de transfección se incuban a temperatura ambiente durante 45 min seguido de la adición de 800 !JI de medio. La mezcla de transfecciÓll se añade a las células hospedadoras, y se cultivan las células como se ha descrito anteriormente. Por consiguiente, para la producción de virus recombinantes o reorganizados en cultivo celular, se mezclan vectores que incorporan cada uno de los 8 segmentos de genoma (PB2, PB1, PA, NP, M, NS, HA Y NA) con aproximadamente 20 ¡.JI de TranslT -L T1 Y se transfectan en las células hospedadoras. Opcionalmente, se reemplaza el medio que contiene suero antes de la transfección por medio sin suero, por ejemplo, Opti-MEM 1, Y se incuba durante 4-6 horas.

Como alternativa, puede emplearse electroporación para introducir vectores que incorporan segmentos genómicos de la gripe en células hospedadoras. Por ejemplo, se introducen de manera favorable vectores de plásmido que incorporan un virus de la gripe A o de la gripe B en células Vero usando electroporación de acuerdo con el siguiente procedimiento. En resumen, 5 x 106 células Vero, por ejemplo, crecidas en medio Eagle modificado (MEM) suplementado con suero fetal bovino (FBS) al 10 % se resuspenden en 0,4 mi de OptiMEM y se ponen en una cubeta de electroporación. Se añaden veinte microgramos de ADN en un volumen de hasta 25 !JI a las células en la cubeta, que a continuación se mezcla suavemente dando unos golpecitos suaves. La electroporacián se lleva a cabo de acuerdo con las instrucciones del fabricante (por ejemplo, un dispositivo Gene Pulser 11 de BioRad con un dispositivo Capacitance Extender Plus conectado) a 300 voltios, 950 microfaradios con una constante de tiempo de entre 28-33 milisegundos. Entonces se vuelven a mezclar las células dando golpecitos suaves y aproximadamente 1-2 minutos después de la electroporación se añaden 0,7 mi de MEM con FBS al 10% directamente a la cubeta. Las células se transfectan entonces a dos pocillos de una placa de cultivo tisular estándar de 6 pocillos que contiene 2 mi de MEM. FBS a, 10% u OPTI-MEM sin suero. La cubeta se lava para recuperar cualquier célula restante y la suspensión de lavado se divide entre dos poci llos. El volumen final es de aproximadamente 3,5 mI. Las células se incuban entonces en condiciones permisivas para el crecimiento viral, por ejemplo, a aproximadamente 33 "C para las cepas adaptadas al frío

Recuperación de virus

Los virus se recuperan típicamente del medio de cultivo, en el que han crecido las células infectadas (transfectadas). Tipicamente, se aclara el medio antes de la concentración de los virus de la gripe. Los métodos comunes incluyen filtración, ultrafiltración, adsorción en sulfato de bario y elución, y centrifugación. Por ejemplo, el medio en bruto de cultivos infectados puede aclararse primeramente mediante centrifugación a, por ejemplo, 1000-2000 x g durante un tiempo suficiente para eliminar los restos de células y otra materia en partículas grandes, por ejemplo, entre 10 y 30 minutos. Como altemativa, el medio se filtra a través de un filtro de acetato de celulosa de 0,8 ~m para eliminar a las células intactas y otra materia en partículas grandes, Opcionalmente. el sobrenadante del medio aclarado se centrifuga para precipitar los virus de la gripe, por ejemplo, a 15.000 )( g, durante aproximadamente 3 -5 horas Después de la resuspensión del precipitado de virus en un tampón adecuado, tal como STE (Tris-HCI 0,01 M; NaCI 0,15 M; EDTA 0,0001 M) o suero salino tamponado con fosfato (PBS) a pH 7.4, el virus se concentra mediante centrifugación de gradiente de densidad en sacarosa (60 %-12 %) o tartrato de potasio (50 %-10 %). Los gradientes continuos o escalonados, por ejemplo, un gradiente de sacarosa entre el 12 % Y el60 % en cuatro etapas de 12 %, son adecuados. Los gradientes se centrifugan a una velocidad y durante un tiempo suficiente para concentrar los virus en una banda visible para su recuperación. Como altemativa, y para la mayoria de aplicaciones comerciales a gran escala, el virus se elutria a partir de gradientes de densidad usando un rotor de centrifugación zonal que opera en modo continuo. Se proporcionan detalles adicionales suficientes para orientar a un experto a lo largo de la preparación de virus de la gripe a partir de cultivo tisular, por ejemplo, en Furminger. Vaccine Production, en Nicholson et al. (eds) Textbook of Influenza págs. 324-332; Merten et al. (1996) Production of influenza virus in cell cultures for vaccine preparation. En Cohen y Shafferman (eds) Novel Strategies in Oesign and Production of Vaccines págs. 141-151, y en la Patente de Estados Unidos nO 5.690.937. Si se desea, los virus recuperados pueden almacenarse a -80 QC en presencia de sacarosa-fosfato-glutamato (SPG) como estabilizante.

Métodos y composiciones para la administración profiláctica de vacunas

Los virus recombinantes y reorganizantes descritos en el presente documento pueden administrarse profilácticamente en un vehículo o excipiente adecuado para estimular una respuesta inmunitaria especifica para una o más cepas del virus de la gripe. Típicamente, el vehículo o excipiente es un vehículo o excipiente farmaceuticamente aceptable, tal como agua estéril, solución salina acuosa, soluciones salinas tamponadas acuosas, soluciones de dextrosa acuosas, soluciones de glicerol acuosas, etanol, fluido alantoico de huevos de gallina no infectados (es decir, fluido alantoico normal, "NAF") o combinaciones de los mismos. La preparación de dichas soluciones asegurando la esterilidad, el pH, la isotonicidad, y la estabilidad se efectúa de acuerdo con protocolos establecidos en la técnica. En general, se selecciona un vehículo o excipiente para minimizar los efectos alérgicos y otros no deseados, y para ajustarse a la ruta de administración particular, por ejemplo, subcutánea, intramuscular, intranasal, etc

En general, los virus de la gripe descritos se administran en una cantidad suficiente para estimular una respuesta inmune especifica para una o más cepas de virus de la gripe. Preferentemente, la administración de los virus de la gripe suscita una respuesta inmune protectora. Las dosificaciones y métodos para provocar una respuesta inmune protectora contra una o más cepas de gripe se conocen pos los expertos en la materia. Por ejemplo, los virus de la gripe inactivados se proporcionan en el intervalo de aproximadamente 1-1000 DIH50 (dosis infecciosa en humanos), es decir, a aproximadamente 105 _108 ufp (unidades formadoras de placa) por dosis administrada. Como altemativa, se administran aproximadamente 10-50 I-Ig, por ejemplo, aproximadamente 15 1-19 de HA sin adyuvante, administrándose dosis menores con un adyuvante. Típicamente, la dosis se ajustará dentro de este intervalo basándose en, por ejemplo, la edad, estado físico, peso corporal, sexo, dieta, tiempo de administración, y otros factores clínicos. La formulación de vacuna profiláctica se administra por vía sistémica, por ejemplo, mediante inyección subcutánea o intramuscular usando una aguja y una jeringuilla, o un dispositivo de inyección sin aguja Como altemativa, la formulación de vacuna se administra por vía intranasal, bien en gotas, aerosol de partículas grandes (mayores de aproximadamente 10 micrometros), o espray en el tracto respiratorio superior. Aunque cualquiera de las rutas de administración anteriores da como resultado una respuesta inmunitaria sistémica protectora, la administración intranasal confiere el beneficio añadido de provocar inmunidad mucosal en el sitio de entrada del virus de la gripe. Para administración intranasal, se prefieren a menudo vacunas de virus vivo atenuado, por ejemplo, un virus de la gripe atenuado, adaptado al frío y/o sensible a la temperatura recombinante o reorganizante. Aunque se prefiere la estimulación de una respuesta inmune protectora con una sola dosis, pueden administrarse dosis adicionales mediante la misma ruta o diferentes, para lograr el efecto profiláctico deseado.

Como altemativa, puede estimularse una respuesta inmune dirigiéndose ex vivo o in vivo a células dendríticas con virus de la gripe. Por ejemplo, se exponen células dendríticas en proliferación a virus en una cantidad suficiente y durante un periodo de tiempo suficiente como para permitir la captura de los antígenos de la gripe por las células dendriticas. Entonces se transfieren las células a un sujeto que va a vacunarse mediante métodos de trasplante intravenoso convencionales.

Opcionalmente, la formulación para la administración profiláctica de los virus de la gripe, o las subunidades de los mismos, también contiene uno o más adyuvantes para potenciar la respuesta inmune a los antígenos de la gripe. Los adyuvantes adecuados incluyen: saponina, geles minerales, tales como hidróxido de aluminio, sustancias tensioaclivas, tales como lisolecitina, polioles plurónicos, polianiones, péptidos, aceite o emulsiones de hidrocarburo, bacilo Calmetle-Guerin (BCG), Corynebacterium parvum, y los adyuvantes sistémicos OS-21 y MF59.

Si se desea, puede efectuarse la administración profiláctica de vacunas de virus de la g ripe conjuntamente con la administración de una o más moléculas inmunoestimuladoras. Las moléculas inmunoestimuladoras incluyen diversas citocinas, linfocinas y quimiocinas con actividades inmunoestimuladoras, inmunopotenciadoras y proinflamatorias, tales como interleucinas (por ejemplo, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-12, IL-13); factores de crecimiento (por ejemplo, factor estimulante de colonias (CSF) de granulocitos-macrófagos (GM»; y otras moléculas inmunoestimuladoras, tales como factor inflamatorio de macrófagos, ligando Flt3, 87.1; 87.2, etc. Las moléculas inmunoestimuladoras pueden administrarse en la mi~ma formulación que los virus de la gripe, o pueden administrarse por separado. Pueden administrarse la proteína o un vector de expresión que codifica la proteína para producir un efecto inmunoestimulador.

Los vectores descritos en el presente documento que incluyen genoma de gripe pueden emplearse para introducir ácidos nucleicos heterólogos en un organismo hospedador o célula hospedadora, tal como una célula de mamífero, por ejemplo, células procedentes de un sujeto humano, en combinación con un vehículo o excipiente farmacéutico adecuado, tal como se describe anteriormente. Típicamente, el ácido nucleico heterólogo se inserta en una región no esencial de un gen o segmento génico, por ejemplo, el gen M del segmento 7. La secuencia polinucleotídica heteróloga puede codificar un polipéptido o péptido, o un ARN, tal como un ARN antisentido o ribozima. Entonces se introduce el ácido nucleico heterólogo en un hospedador o célula hospedadora produciendo virus recombinantes que incorporan el ácido nucleico heterólogo, y los virus se administran tal como se describe anteriormente.

Como alternativa, puede introducirse y expresarse un vector descrito en el presente documento que incluye un ácido nucleico heterólogo en células hospedadoras cotransfectando el vector en una célula infectada con un virus de la gripe. Opcionalmente, las células se devuelven o administran al sujeto, típicamente al sitio del que se obtuvieron. En algunas aplicaciones, las células se injertan sobre un tejido, órgano, o sitio de sistema (tal como se ha descrito anteriormente) de interés, usando procedimientos de transferencia o injerto celular establecidos. Por ejemplo, pueden administrarse células madre de linaje hematopoyético, tales como células madre de médula ósea, de sangre de cordón umbilical, o hematopoyéticas derivadas de sangre periférica a un sujeto usando técnicas de administración o transfusión convencionales.

Como alternativa, los virus que comprenden un ácido nucleico heterólogo pueden administrarse a las células de un sujeto in vivo. Típicamente, dichos métodos implican la administración de partículas de vector a una población de células diana (por ejemplo, células sanguíneas, células cutáneas, células hepáticas, células neurales (incluyendo del cerebro), células renales, células uterinas, células musculares, células intestinales, células de cuello de útero, células vaginales, células prostáticas, etc., así como células tumorales procedentes de una diversidad de células, tejidos y/u órganos. La administración puede ser bien sistémica, por ejemplo, mediante administración intravenosa de partículas virales, o mediante administración de las partículas virales directamente a un sitio o sitios de interés mediante una diversidad de métodos, incluyendo inyección (por ejemplo, usando una aguja o jeringuilla), administración de vacuna sin aguja, administración tópica, o a presión en un tejido, órgano o sitio de la piel. Por ejemplo, las partículas de vector viral pueden administrarse por inhalación, por vía oral, intravenosa, subcutánea, subdérmica, intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intratecal, mediante administración vaginal o rectal, o colocando las partículas virales en una cavidad u otro sitio del organismo, por ejemplo, durante la cirugía.

Los métodos anteriormente descritos son útiles para tratar terapéutica o profiláctica mente una enfermedad o trastorno introduciendo un vector descrito en el presente documento que comprende un polinucleótido heterólogo que codifica un polipéptido (o péptido) o ARN terapéutica o profilácticamente eficaz (por ejemplo, un ARN antisentido

o ribozima) en una población de células diana in vitro, ex vivo o in vivo. Tipicamente, el polinucleótido que codifica al polipéptido (o péptido), o ARN de interés se une operativa mente a secuencias reguladoras adecuadas, tal como se describen anteriormente, en las secciones tituladas "Vectores de expresión" y "Elementos de expresión adicionales". Opcionalmente, se incorpora más de una secuencia coclificante heteróloga en un solo vector o virus. Por ejemplo, además de un polinucleótido que codifica un polipéptido o ARN terapéutica o profilácticamente activo, el vector también puede incluir polipéptidos terapéuticos o profilácticos adicionales, por ejemplo, antígenos, moléculas coestimuladoras, citocinas, anticuerpos, etc., ylo marcadores, y similares.

Los métodos y vectOfes descritos en el presente documento pueden usarse para tratar terapéutica o profilácticamente una amplia variedad de trastornos, incluyendo trastornos genéticos y adquiridos, por ejemplo, como vacunas para enfermedades infecciosas, causadas por virus, bacterias, y similares.

Para facilitar el uso de los vectores y sistemas de vectores descritos en el presente documento, cualquiera de los vectores, por ejemplo, plásmídos de virus de la gripe consenso, plásmidos de polipéptidos de la gripe variantes, plásmidos de bibliotecas de polipéptidos de gripe, etc., y componentes adicionales, tales como, tampones, células, medio de cultivo, útil para el empaquetamiento y la infección de virus de la gripe con fines experimentales o terapéuticos, pueden empaquetarse en forma de kit. Típicamente, el kit contiene, además de los componentes anteriores, materiales adicionales que pueden incluir, por ejemplo, instrucciones para efectuar los métodos descritos en el presente documento, material de envase y un recipiente

Manipulación de ácidos nucleicos y proteínas virales

En el contexto descrito en el presente documento, los ácidos nucleicos y/o proteínas de la gripe se manipulan de acuerdo con técnicas de biología molecular bien conocidas. Se describen protocolos detallados para varios de estos procedimientos, incluyendo amplificación, clonación, mutagénesis, transformación y similares, por ejemplo, en Ausubel et al. Current Protocols in Molecular Biology (complementado a partir del 2000) John Wiley & Sons, Nueva York rAusubel~); Sambrook et al. Molecular Cloning • A Laboratory Manual (2a Ed.), Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1989 rSambrook~), y Berger y Kimmel Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology volumen 152 Academic Press, Inc., San Diego, CA rBerger~)

Además de las referencias anteriores , los protocolos para las técnicas de ampl ificación in vitro, ta les como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), la reacción en cadena de la ligasa (LCR), la amplificación por Op replicasa, y otras técnicas mediadas por ARN polimerasa (por ejemplo, NASBA), útiles, por ejemplo, para amplificar sondas de AONc descritas en el presente documento, se encuentran en Mullis et al. (1987) Patente de Estados Unidos nO 4.683.202; PCR Protocols A Guide to Methods and Applications (Innis et al. eds) Academic Press Inc. San Diego, CA (1990) ("Innis"); Amheim y Levinson (1990) C&EN 36; The Journal Of NIH Research (1991) 3:81, Kwoh et al. (19S9) Proc Natl Acad Sci USA 86, 1173; Guatelli et al. (1990) Proc Natl Acad Sci USA 87:1874; Lomell et al (1989) J Clin Chem 35:1826; Landegren et al. (1988) Science 241:1077; Van Brunt (1990) Biotechnology 8:291; Wu y Wa llace (1989) Gene 4: 560; Barringer et al. (1990) Gene 89:117, y Sooknanan y Malek (1995) Biotechnology

13:563_ Los métodos adicionales, útiles para clonar ácidos nucleicos en el contexto descrito en el presente documento incluyen Wallace et al. Patente de Estados Unidos nO 5.426.039. Se resumen métodos mejorados para amplificar ácidos nucleioos grandes mediante PCR en Cheng et al. (1994) Nature 369:684 y las referencias citadas en el mismo

Determinados polinucleótidos descritos en el presente documento, por ejemplo, oligonucleátidos, pueden sintetizarse utilizando diversas estrategias de fase sólida, incluyendo química de acoplamiento de fosforamidita basada en mononucle6tidos y/o trinucleótidos. Por ejemplo, las secuencias de ácido nucleico pueden sintetizarse mediante la adición secuencial de monómeros y/o trímeros activados a una cadena de polinucle6tido en elongación. Véase, por ejemplo, Caruthers, M.H. el al. (1992) Melh Enzymol 211 :3.

En lugar de sintetizar las secuencias deseadas, puede solicitarse esencialmente cualquier ácido nucleico según especificaciones de cualquiera de una diversidad de fuentes comerciales, tales como The Midland Certified Reagent Company (mcrc@oligos.com), The Great American Gene Company (www.genco.com). ExpressGen, Inc (www.expressgen.com), Operon Technologies, Inc. (www.operon.com), y muchas otras.

Además, puede lograrse la sustitución de restos de aminoácidos seleccionados en los polipéptidos virales mediante, por ejemplo, mutagenesis de sitio di rigido. Por ejemplo, los polipeptidos virales con sustituciones de aminoácidos correlacionadas funcionalmente con una característica fenotípica deseable, por ejemplo, un fenotipo atenuado, adaptación al frio, sensibilidad a la temperatura, pueden producirse introduciendo mutaciones específicas en un segmento de ácido nudeico viral que codifica al polipéptido. Los métodos para la mutagénesis de sitio dirigido se conocen bien en la técnica y se describen, por ejemplo, en Ausubel, Sambrook, y Berger, anteriormente citados. Hay disponibles comercialmente numerosos kits para llevar a cabo la mutagénesis de sitio dirigido, por ejemplo, el kit de mutagénesis de sitio dirigido Chameleon (Stratagene, La Jolla), y pueden usarse de acuerdo con las instrucciones del fabricante para introducir, por ejemplo, una o más sustituciones de aminoácidos descritas en la Tabla 6 o en la Tabla 17, en un segmento genómico que codifica un polipéptido de gripe A o B, respectivamente.

Ejemplos

EJEMPLO 1: CONSTRUCCiÓN DE pAD3000

El plásmido pHW2000 (Hoffmann et al. (2000) A DNA transfection system for generation of influenza A virus from eight plasmids Proc Natl Acad Sci USA 97:6108-6113) se modificó para reemplazar las señales de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovino (BGH) con secuencias de señal de poliadenilación procedentes del virus de simio 40 (SV40)

Las secuencias procedentes de SV40 se amplificaron con Taq MasterMix (Oiagen) usando los siguientes

oligonucleátidos, denominados en la dirección 5' a 3'· polyA.1· AACAATIGAGATCTCGGTCACCTCAGACATGATAAGATACATIGATGAGT (SEC ID N°: 1) polyA.2: TATAACTGCAGACTAGTGATATCCTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTA (SEC ID N°· 2)

Se usó el plásmido pSV2His como molde. Se obtuvo un fragmento coherente con el produclo predicho de 175 pb Y se clonó en pcDNA3.1, usando un vector de clonación Topo TA (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se cortó el fragmento de 138 pb deseado que contenía las señales de poliadenilación de SV40 del plásmido resultante con EcoRV y BstEII, se aisló a partir de un gel de agarosa, y se ligó entre los sitios únicos Pvull y BstEII en pHW2000 usando técnicas convencionales (véase, por ejemplo, Ausubel, Berger, Sambrook). El plásmido resultante, pAD3000 (Figura 1), se secuenció y se halló que contenía el sitio de poliadenilación de SV40 en la orientación correcta. Los nucleátidos 295-423 en pAD3000 corresponden a los nucleótidos 2466-2594, respectivamente, en la cepa 777 de SV40 (AF332562)

EJEMPLO 2: SISTEMA DE OCHO PLÁSMIDOS PARA LA PRODUCCiÓN DE VDM A Se ha usado comúnmente una variante de la cepa de virus de la gripe A adaptada al frío AJAAJ6/60 como virus donante maestro para la producción de vacunas de gripe A administradas por vía nasal. Esta cepa es un virus donante maestro (VDM) ejemplar en el contexto descrito en el presente documento, Por razones de simplicidad, esta cepa NAAJ6f60 se denomina en el presente documento VDM-A_El ARN viral de VDM-A se extrajo usando el kit RNeasy mini (Qiagen) y se amplificaron los ocho fragmentos de ADNc correspondientes mediante RT-PCR usando los cebadores listados en la Tabla 1

Tabla1 . Secuencia de los cebadores usados cara clonar los ochos seamentos de VDM-A SEC ID N°

Cebador I Secuencia (5'-3') CEBADORES DIRECTOS DE VDM-A

3: Aar1 PB2 10ng CAC TTA T AT TCA CCT GCC TCA GGG AGC GAA AGC AGG TC

4: BsmBI-PBI T AT TCG TCT CAG GGA GCG AAA GCA GGC AAA

5: BsmBI PA T AT TCG TCT CAG GGA GCG AAA GCA GGT ACT

6: BsmBI NP T AT TCG TCT CAG GGA GCA AAA GCA GGG T AG A

7: Aa rl HA-long CAC TTA T AT TCA CCT GCC TCA GGG AGC AAA AGC AGG GG

8: BsmBI NA T AT TCG TCT CAG GGA GCA AAA GCA GGA GTG A

9: BsmBI -M T AT TCG TCT CAG GGA GCA AAA GCA GGT AGA T

10: BsmBI NS T AT TCG TCT CAG GGA GCA AAA GCA GGG TGA

CEBADORES INVERSOS DE VDM-A

11: Aarl PB2-long CCT AAC ATA TCA CCT GCC TCG T AT T AG T AG AAA CAA GGT CGT TI

12: BsmBI-PB1 ATA TCG TCT CGT ATT AGT AGA AAC AAG GCA TTI

13: BsmBI-PA ATA TCG TCT CGT A TI AGT AGA AAC AAG GT A cn

14: BsmBI-NP ATA TCG TCT CGT ATT AGT AGA AAC AAG GGT ATT

15: Aarl HA long CCT AAC ATA TCA CCT GCC TCG T AT T AG T AG AAA CAA GGG TGT T

16: BsmBI-NA ATA TCG TCT CGT ATT AGT AGA AAC AAG GAG TTT

17: BsmBI-M ATA TCG TCT CGT A TI AGT AGA AAC AAG GT A GTT

18: 8smBI NS ATA TCG TCT CGT A TI AGT AGA AAC AAG GGT GTT

10 Con la excepción de los segmentos genómicos de la gripe que codifican HA y PB2, que se amplificaron usando los cebadores que contenían el sitio de reconocimiento de la enzima de restricción Aar 1, los 6 genes restantes se amplificaron con cebadOfes que cootenían el sitio de reconocimiento de la enzima de restricción BsmB t. Los fragmentos de ADNc tanto de Aar I como de BsmB t se clonaron entre los dos sitios de BsmB I del vector pAD3000.

15 El análisis de secuenciación reveló que todos los fragmentos de ADNc clonados contenían mutaciones respecto de la secuencia consenso de VDM-A, que se introdujeron igualmente durante las etapas de clonación. Las mutaciones halladas en cada segmento génico se resumen en la Tabla 2.

Tabla 2_ Mutaciones introducidas en los clones de VDM A en oAD3000

Segmento: Posiciones de mutación (ni) Cambios de aminoácido

génico

PB2: A954(GfCIT) , G1066A, T1580C, T1821C Si lente, Gly a Ser, Val a A la, Silenle

PB': C1117T Arg a detención

PA: G742A, A1163G , A1615G , T1748C, Glya Ser, Asp a Gly, Arg a Gly, Mel a Th r, no

C2229del: codificante

HA: A902C , C1 493T Asn a His, Cys a Arg

NP: C113A, T100BC Thr a Asn, silente

NA: C1422T Pro a Leu

M: A191G Thr a Ala

NS: C38T Si lente

Todas las mutaciones se corrigieron hacia la secuencia consenso de VDM-A usando un kit de mutagénesis de sitio dirigido QuikChange (Stratagene) y cebadores oligonucleotídicos sintéticos, tal como se muestran en la Tabla 3.

Tabla 3_ Cebadores usados Dara correair las mutaciones en los clones de VOM·A HJ67

PB2A954G

5/P/gcaagctgtggaaalatgcaaggc(SEC ID N°: 19) HJ68

PB2A954G _as

gccttgcalatttccacagcttgc (SEC ID N°' 20) HJ69

PB2G1066A

S/P/gaagtgcttacgggcaatcttcaaac (SEC ID N°: 21) PB2

HJ70 PB2G1066A.as

gtttgaagattgcccgtaagcacttc (SEC ID N°: 22) HJ71

PB2T1580A

S/P/cctgaggaggtcagtgaaacac (SEC ID NO: 23) HJ72

PB2T1580A_as

gtgtttcaclgacctcctcagg (SEC ID N°: 24) HJ73

PB21821C

5/P/gtttgttaggactclatlccaac (SEC ID N°· 25) HJ74

PB21821C _as

gtlggaalagagtccaacaaac (SEC ID N°· 26) PB1

HJ75 PB1C1117T

gacagtaagclccgaacacaaalac (SEC ID N°: 27) HJ76

PB1C1117T.as

gtatttgtgttcggagcttcatgc (SEC ID N°: 28) HJ77

PA-G742A

5/P/cgaaccgaacggclacaltgaggg (SEC ID N°: 29) HJ78

PA-G742A.as

ccctcaatgtagccgtlccggtlcg (SEC ID NO: 30) HJ79

PA-A1163G

S/P/cagagaaggtagatllgacgactg (SEC ID N°: 31 ) HJ80

PA-A1163G.as

cagtcgtcaaagtclacctlctctg (SEC ID NO: 32) PA

PA-A1615G HJ81

5/P/cactgacccaagacllgagccac (SEC ID N°· 34) HJ82

PA-A1615G.as

gtggctcaagtcttgggtcagtg (SEC ID N°: 34) HJ83

PA-T1748C

S/P/caaagallaaaatgaaatggggaatg (SEC ID N°: 35) HJ84

PA-T1748C .as

cattccccatttcatlltaatclltg (SEC ID N°: 36) HJ85

PA-C2229

S/P/gtaccltglttclaclaataacccgg (SEC ID N°-37) HJ86

PA C2230_as

ccgggllallagtagaaacaaggtac (SEC 10 N°· 38) HJ87

HA A902C

5/P/ggaacacttgagaactgtgagacc (SEC ID N°: 39) HA

HA A902C_asHJ88

ggtctcacagllctcaaglgltcc (SEC ID N°: 40) HJ89

HA-C1493T

5/P/gaattttatcacaaatgtgatgatgaatg (SEC ID NO: 41 ) HJ90

HA-C1493T.as

cattcatcatcacalltgtgataaaallc (SEC ID N°: 42) HJ91

NP-C113A S/P/gccagaatgcaactgaaatcagagc (SEC ID N°: 43)

NP-C113A.as

NP HJ92 gctclgalllcagtttcallctggc (SEC ID N°: 44) HJ93

NP T1008C

5/P/ccgaatgagaatccagcacacaag (SEC ID N°· 45) HJ94

NP-T1008C _as

cttgtgtgclggattctcattcgg (SEC ID N°-46) HJ95

NA C1422T catcaatttcatgcctalataagctttc (SEC ID N°· 47)

NA-C1422T.as

NS HJ96 gaaagcttatataggcatgaaattgatg (SEC ID N°: 48) HJ97

NS-C38T

cataatggatcctaacactgtgtcaagc (SEC ID N°: 49) HJ98

NS-C38T.as

gcltgacacagtgttaggatccattatg (SEC ID N°: 50) PA

HJ99 PA6C375T

ggagaatagattcatcgagattggag (SEC ID NO: 51 ) HJ100

PA6C375T.as

ctccaatctcgatgaatctallctcc (SEC ID N°: 52)

EJEMPLO 3 GENERACiÓN DE VIRUS DE LA GRIPE VDM A RECOMBINANTE y REORGANIZADO INFECCIOSO

Se mantuvieron células de riñón canino Madin-oarby (MoCK) y células COS7 humanas en medio Eagle modificado (MEM) que contenia suero fetal bovino (FBS) al 10%_ Se mantuvieron células embrionarias de riñón humano (293T) en Opti-MEM I (Life Technologies) que contenía FBS al 5%_ Se cocultivaron células MDCK y COS7 o 293T en placas de 6 pocillos a una relación 1:1 y se usaroo las células para transfecciórJ a una confluencia de 10 aproximadamente el 80%. Las células 293T y COS7 tienen una elevada eficacia de la transfección, pero no son permisivas para la replicación del virus de la gripe_El cultivo conjunto con células MDCK asegura una replicación eficiente de los virus recombinantes_ Antes de la Iransfección. se reemplazaron los medios que contenian suero con medio sin suero (Opti-MEM 1) Y se incubaron durante 4--6 horas_La lransfección del ADN de plásmido se efectuó usando Trans1T-LT11 (Mirus) mezclando 1 jJg de cada uno de los 8 ADN plasmídicos (PB2, PB1 , PA, NP, M, NS,

15 HA Y NA) con 20 jJl de Trans1T-LT1 diluido en 160 jJl de Opti-MEM I en un volumen total de 200 jJl. Las mezclas de AON:reaclivo de Iransfección se incubaron a temperatura ambiente durante 45 min seguido de la adición de 800 jJl de Opti-MEM l. Entonces se añadió la mezcla de transfección a las células MoCK/293T o MoCK/COS7 cultivadas conjuntamente. Las células transfectadas se incubaron a 35 QC o 33 oC durante entre 6 horas y 24 horas, por ejemplo, durante loda la noche, y la mezcla de Iransfección se reemplazó con 1 mi de Opli-MEM I en cada pocillo

20 Después de la incubación a 35 oc o 33 oC durante 24 horas, se añad ió a cada pocillO 1 mi de Opti-MEM I que contenia TPCK-lripsina 1jJg/ml y se incubó durante 12 horas adicionales _El virus recuperado se amplificó entonces

en células MDCK confluentes o se amplificó directamente en huevos de gallina embrionados. Las células MDCK en placa de 12 pocillos se infectaron con 0,2 mi de la mezcla de transfección durante 1 hora a temperatura ambiente, se retiró la mezcla y se reemplazó con 2 mi de Opti-MEM I que contenía TPCK-tripsina 1IJg/ml. Las células se incubaroo a 35 QC o 33 QC durante 3-4 días. Los virus amplificados se almacenaroo a -80QC en presencia de estabilizante de SPG o se purificaron en placa y se amplificaron en células MOCK o en huevos de gallina embrionados

Expresión funcional de proteínas polimerasas de VOM-A

La actividad funcional de las cuatro proteínas polimerasas de VDM-A, PB2, PB1, PA Y NP, se analizó respecto de su capacidad para replicar un minigenoma de virus de la gripe que codificaba un gen indicador de EGFP. Un conjunto de 8 plásmidos de expresión (véase, por ejemplo, la Tabla 4) (Hoffmann et al. (2001) Eight plasmid rescue system for influenza A virus; Options for the control of influenza Intemational Congress Series 1219:1007-1013) que conten ía los AONc de la cepa AlPRJ8/34 (H1 N1 ) Y un min igenoma viral que contenía un gen ind icador que codificaba proteína verde fluOfescente (EGFP, pHW72-EGFP)

Se transfectaron PB1, PB2, PA Y NP o PB1, PA, NP (-PB2 como control negativo) de VDM-A en las células MDCK/293T cultivadas conjuntamente junto con un plásmido que representaba un minigenoma de EGFP de virus de la gripe A (pHW72-EGFP) (Hoffmann et al. (2000) ~AmbisenseH approach for the generation of Influenza A virus: vRNA and mRNA synthesis from one template Virology 15:267(2):310-7). Las células transfectadas se observaroo en un microscopio de contraste de fase o en un microscopio de fluorescencia a las 48 horas después de las transfección. Como altemativa, puede emplearse citometría de flujo para detectar la expresión de EGFP

Tal como se muestra en la Figura 2, la fluorescencia verde, que indica la expresión del minigenoma de EGFP se observó en las células transfectadas con PB2, PB1, PA Y NP de VOM-A, pero no en las células transfectadas con solo tres proteínas polimerasas. Esto indicó que las proteínas polimerasas de VDM-A en pA03000 eran funcionales.

En otros ensayos se usa un minigenoma que incluye el gen de cloranfenicol acetil transferasa (CAT), denominado pFlu-CAT para medir la actividad de polimerasa. En dicho ensayo, la expresión de CAT se mide a nivel de proteína (por ejemplo, mediante ELlSA) o de ARN, como indicador de la replicación del minigenoma

Análisis de los plásmidos de VOM-A mediante experimento reorganizante de un solo gen

Se demostró que cada uno de los 8 segmentos génicos de VDM -A clonados en pA03000 se expresaba funcionalmente en un experimento reorganizante cotransfectando un solo segmento génico de VOM-A junto con los siete segmentos complementa rios de la cepa de control AlPRlB/34 . Todos los plásmidos de segmento genómico individual en combinación con segmentos de control complementarios generaron virus reorganizantes infecciosos, que causaron efectos citopáticos en células MOCK infectadas, lo que indica que todos los ocho plásmidos codifican proteínas de VOM-A funcionales. Tabla 4

Tabla 4. Recuoeración de reoman izantes 7+1 mediante olásm idos

Segmento virus ,: génico de PB2 PMDV-A-PB2 PB' pHW191-PB2 PA pHW191-PB2 NP pHW191-PB2

2: PHW192-PB1 pMOV-A-PB1 pHW192-PB1 pHW192-PB1

3: PHW193 PA pHW193 PA pMOV A PA pHW193 PA

4: PHW195 NP pHW195 NP pHW195 NP pMOV A NP

5: PHW197 M pHW197 M pHW197 M pHW197 M

6: PHW198 NS pHW198 NS pHW198 NS pHW198 NS

7: PHW194 HA pHW194 HA pHW194 HA pHW194 HA

8: PHW-196-NA pHW-196-NA pHW-196-NA pHW-196-NA

CPE: (+) (+) (+) (+)

Segmento virus ,: génico de M PHW191-PB2 NS pHW191-PB2 HA pHW191-PB2 NA pHW191-PB2

2: PHW192-PB1 pHW192-PB1 pHW192-PB1 pHW192-PB1

3: PHW193-PA pHW193-PA pHW193-PA pHW193-PA

4: PHW195-NP pHW195-NP pHW195-NP pHW195-NP

5: PMDV-A-M pHW197-M pHW197-M pHW197-M

6: PHW19B-NS pMOV-A-NS pHW19B-NS pHW19B-NS

7: PHW 194-HA pHW194-HA pMOV-A-HA pHW194-HA

8: PHW-196-NA pHW-196-NA pHW-196-NA pMOV-A-NA

CPE: (+) (+) (+) (+)

Para determinar adicionalmente las restricciones de empaquetamiento del virus dela gripe A, se separó el segmento NS en dos segmentos génicos separados: uno que codificaba el segmento genómico NS1 y el otro codificando el segmento genómiCQ NS2, Los nueve plásmidos que incorporaban los segmentos genómicos de la g ripe A se transfectaron en células MDCKlCOS tal como se describe anteriormente, y los virus recombinantes se amplificaron en huevos de gallina embrionados antes de su titulación en células MDCK. Se observó un tamaño de placas reducido para el sistema de nueve plásmidos en comparación con el sistema de ocho plásmidos descrito anteriormente. El análisis mediante RT-PCR demostró que solo estaba presente el segmento NS2 en los viriones, y que no estaba empaquetado el segmento génico NS1 .

Recuperación de VDM-A y virus reorganizantes 6:2

Siguiendo los procedimientos descritos anteriormente, tres días después de la transfección bien con los 8 plásmidos de VDM-A (recombinantes), o con los plásmidos que incorporaban los 6 genes internos de VDM-A, y HA Y NA procedentes de AlPRl8/34 (reorganizante 6:2), se usaron los sobrenadantes de cultivo para infectar nuevas células MDCK, y las células infectadas se incubaron a 33"C durante tres días en presencia de 1IJg/ml de TPCK-tripsina. Se observó el efecto citoplásmico del virus recombinante en células MDCK usando un microscopio. La expresión de hemaglutinina viral se controló usando un ensayo de hemaglutinina (HA) convencional. Los ensayos de HA se efectuaron mezclando 50 ¡JI de sobrenadantes de cultivo diluidos en serie 2 veces con 50 ¡JI de glóbulos rojos sanguíneos de gallina a11% en placas de 96 pocillos. Se detectó un título de HA de aproximadamente 1:254-1:1024 para los virus amplificados procedentes bien de los 8 plásmidos de VDM-A transfeclados, o del virus reorganizante

6:2. La reacción de transfección que usa los 8 plásmidos de AlPRl8/34 obtenida del Dr. E. Hoffman se usó como control positivo. Se produjeron virus de la gripe infecciosos a partir de estas tres reacciones de transfección, según se indica en la Tabla 5.

,

,6,2 ' 90nloo de VDM-A

T'h!,5

, n,e. "

.,. .,

,62

1 vI,ü,

, • n"2 '-PB2 IAD73' )

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+

1ePE 1+

Se llevó a cabo RT-PCR para mapear los genotipos de los virus recuperados. Se aisló el ARN viral a partir del sobrenadante de cultivo celular infectado usando el kit RNeasy mini (Oiagen) y se amplificaron los ocho segmentos génicos del virus de la gripe mediante RT-PCR usando cebadores específicos para cada segmento génico de VDMA Y cebadores específicos de H1 y N1 Tal como se muestra en la Figura 3, rVDM-A contenía PB2, PB1, NP, PA, M Y NS que eran específicos para VDM-A y HA Y NA específicos para el subtipo H2 y N2. El reorganizante 6:2 conten ía los 6 genes intemos procedentes de VDM-A, y las HA y NA procedentes de AlPRl8f34 (H1N1 ). Esto confirmó que los virus generados a partir de los plásmidos transfectados tenían los genotipos correctos.

Los virus rescatados se titularon mediante ensayo en placa en células MDCK y se confirmó que las placas eran de virus de la gripe mediante inmunotinción usando suero de pollo provocado contra VDM-A. Se infectaron células MDCK a un 100% de confluencia en placas de 12 pocillOS con 100 ¡.JI de virus diluido en serie 10 veces a TA durante 1 hora con agitación suave. Se retiró el inóculo y se recubrieron las células con L 15 1X que contenía agarosa al 0,8 % Y TPCK-tripsina 1¡.J9/ml. Las placas se incubaron a 35°C o 33°C durante tres días, se fijaron con metanol al 100%, se bloquearon con leche al 5% en PBS, y se incubaron con antisuero anti-VDM-A de pollo diluido a 1 :2000 durante 1 hora seguido de incubación con IgG de conejo anti-pollo conjugada a HRP durante 1 h. Las placas se visua lizaron mediante la adición de la solución de sustrato de HRP (DAKO). Todos los virus recuperados mostraron una inmunotinción positiva

EJEMPLO 4: MAPEO DE LA BASE GENÉTICA DE LOS FENOTIPOS CA TS ATT DE VDM-A

La cepa de vacuna del virus de la gripe VDM-A tiene varios fenotipos relevantes para la producciÓfl de vacunas, por ejemplo, vacunas vivas atenuadas: adaptación al frío (ca), sensibilidad a la temperatura (ts) y atenuación (all). La comparación de secuencia de la cepa VDM-A con la cepa AlAA/6/60 wt virulenta no-ts reveló diferencias minimas de 17 nucleótidos entre estas dos cepas (Tabla 6). Varios de los cambios en la secuencia de VDM-A son únicos para esta cepa en comparación con todos los virus de la gripe de tipo A disponibles en la base de datos de GenBank, lo que sugiere que una o más de estas sustituciones de aminoácidos está relacionada funcionalmente con el fenotipo

(o los fenotipos) att, ca y ts, El cambio de un solo aminoácido en PB2fue la única posición de nucleótido que se había comunicado previamente como determinante en el fenotipo ts de VDM-A (Subbarao et al. (1995) Addition of

5 Temperature-Sensilive Missense Mulalions inlo the PB2 Gene of Influenza A Transfeclanl Viruses Can Effecl an Increase in Temperalure Sensitivily and Attenuation and Permits Ihe Ralional Design of a Genetically Engineered Live Influenza A Virus Vaccine J. ViroL 69:5969-5977)

Para determinar con precisión las sustituciones mínimas implicadas en los fenotipos de VDM-A, se cambiaron

10 individualmenle los nucleótidos en el don de VDM-A que diferian de AlAA16/60 de wt por aquellos de AlAA16/60 de wt (es decir, "se revirtieron"). Cada segmento génico revertido se introdujo entonces en células hospedadoras en combinación con segmentos complementarios de VDM-A para recuperar los reorganizantes de un solo gen Además, el segmenlo génico revertido y el segmento correspondiente de VDM-A también pueden transfectarse en combinación con segmentos procedentes de otras cepas de tipo silvestre, por ejemplo, la cepa AlPRl8/34, para

15 evaluar la contribución de cada segmento génico a los fenotipos del virus _ Usando el sistema de plásmido de VDM-A recombinante descrito anteriormente, se llevó a cabo mutagénesis de sitio dirigido para modificar adicionalmente los seis genes intemos para producir un reorganizante no-ts. Se introdujeron un lotal de 15 mulaciones de sustitución de nucleótidos en los seis plásmidos de VDM-A para representar el genoma de tipo silvestre de AlAAJ6/60 (rWt, Flu064) tal como se lisia en la Tabla 6. Se manluvieron y Iransfectaron células de riñón canino Madin-Darby (MDCK) y

20 células COS-7 tal como se describe anteriormente. El virus recuperado se pasó en células MDCK una vez, seguido de amplificación en las cavidades alantoicas de huevos de pollo embrionados. La lransfección y el crecimiento de virus en MDCK y huevos se llevaron a cabo a 33 oC, una temperatura permisiva para virus tanto ca como wt para minimizar cualquier presión selecliva de temperatura. El genolipo del virus se confinnó mediante análisis de secuencia de fragmentos de ADNc amplificados a partir de ARN viral.

25 Tabla 6 Comoaración de secuencias de AlAAJ6/60 "wt" v VDM A

-

Las características fenotípicas se determinaron mediante procedimientos conocidos en la técnica, por ejemplo, lal como se han descrito anteriormente en la Patente de Estados Unidos 6.322.967 de Parkin titulada "Recombinant tryptophan mutants of influenza," que se incorpora al presente documento en su totalidad. En resumen, la 30 sensibilidad a la temperatura de los virus reoombinantes se determinó mediante ensayo en placa en células MDCK a 33,38 Y 39 oC. Se infectaron las células MDCK en placas de 6 pocillos con 400 ~I de virus diluido en serie 10 veces y se adsorbieron a temperatura ambiente durante 60 mino Se retiraron los inóculos y se reemplazaron con L 15/MEM 1x que contenía agarosa al 1% y TPCK-tripsina 1 ~g/mL Las células infectadas se incubaron a 33 oC en una incubadora de C02 o en contenedores estancos al agua que contenian C02 al 5% sumergidos en baños de agua 35 mantenidos a 38 ± 0,1 "C o 39 ± 0,1 "C (Parkin el al. (1996) Temperature sensitive mutants of influenza A virus generated by reverse genetics and dustered charged lo alanine mutagenesis. Vir. Res. 46:31-44). Después de tres días de incubación, se inmunotiñeron las monocapas usando anticuerpos policlonales de pollo anti-VDM y se

numeraron las placas. Se compararon los recuentos de placas a cada una de las temperaturas para evaluar el fenotipo ts de cada virus y se llevó a cabo cada ensayo un mínimo de tres veces. La temperatura de extinción se definió como la temperatura más baja que tenía una reducción del título de 100 veces o mayor en comparación a 33

'C

El virus infeccioso obtenido a partir de las células COS-7/MDCK cultivadas conjuntamente con los ocho plásmidos (pMDV-PB2, pMDV-PB1 , pMDV-PA, pMDV-NP, pMDV-HA, pMDV-NA, pMDV.M, y pMDV-NS) se amplificó en huevos embrionados de gallina, y se demostró que mostraban el fenotipo ts característico de VDM-A no recombinante de procedencia biológica (Tabla 7). Ni VDM-A ni rVDM-A formaron placas distinguibles a 39 oC, aunque ambos formaron placas fácilmente visualizables a 33 oC

Tabla 7. Re: licación de reoroanizantes de VDMlWt a diversas temperaturas

Virus con genes: 33 "C 38 "C 33 °C/38 oC 39 "C 33 °C/39 "C

Wt

VDM: 8,91 6,10 2,82 <:4,0 >4,91

rVDM-A: 8,72 6,19 2,53 <:4,0 >4,72

Wt (E10SE2): 8,86 8,87 -0,01 8,87 -0,01

rWT (Flu064): 9,02 9,07 -0,05 8,96 0,06

Wt PB2: 8,46 7,87 0,59 5,80" 2,66

Wt-PB1: 8,92 8,74 0,18 7,86" 1,06

Wt-NP: 8,40 7,24 1,15 <:4,0 >4,40

Wt-PA: 8,57 6,10 2,48 <:4,0 >4,57

Wt-M: 8,80 6,68 2,12 <:4,0 >4,80

WtNS: 8,72 6,10 2,62 <:4 ,0 >4,72

Wt-PB1 /PB2: 8,94 8,89 0,05 8,10' 0,85

Wt: 8,52 8,38 0,14 8,41 0,1

PB1 fPB2/NP

"Indica reducción en el tamaño de la placa en comparación con rWt tEI subrayado indica que no se detectaron placas a una dilución en serie de 10'"

Para efectuar un análisis sistemático y detallado de la base genética del fenotipo ts de VDM-A, se utilizaron para la comparación las secuencias de varias cepas no-ts, no-att de wt de AJAA/6/60 con diferencias de 17-48 nudeótidos respecto de AJAA/6/60 de ca, induyendo el aislado altamente relacionado, AJAA/6f60 E10SE2 de wt. Existen un total de 19 diferencias de nucleótidos entre E10SE2 y VDM-A (Tabla 6). Se demostró que E10SE2 era no-ts (Tabla 7) y no-att en hurones. Para generar un virus recombinante no-ts, se alteraron los plásmidos de VDM-A mediante mutagénesis de sitio dirigido para incorporar 15 de las 19 diferencias que representaban 10 cambios de aminoácidos. Cuatro de las posiciones de nUcleótidos, PB2-1182, 1212, PB1-123, Y NP-1550, que diferían entre VDM-A y E10SE2 no se alteraron respecto de la secuencia de VDM-A, ya que estos nucleótidos se observaron en otros aislados no-ts de AJAA/6f60 y, por lo tanto, no se esperaba que tuviesen un papel en la expresión del fenotipo ts (Herlocher et al. (1996) Sequence comparisons of AJAA16/60 inftuenza viruses: mutations 'IIItlich may contribute to attenualion. Virus Research 42:11-25). El virus recombinante (rWI, Flu064), que codificaba los 15 cambios de nudeótidos, se obtuvo de las células COS-7/MDCK cultivadas conjuntamente transfecladas con un conjunto de 8 plásmidos, pWt-PB2, pWt-PB1 , pWt-PA, pWt-NP, pWt-M, pWt-NS, pMDV-HA, Y pMDV-NA. El análisis de secuenciación indicó que rWt contenía los cambios genéticos designados y era oo-ts a 39 oC, idéntico al AJAA/6f60 de wt de procedencia biológica. Estas observaciones demostraron que el fenotipo ts se mapeaba a un subconjunto de estos 15 cambios de nucleótidos

Contribución de los seis segmentos con sentido intemos al fenotipo ts del virus

Se evaluó el efecto de cada segmento génico de wt en el fenotipo ts de VDM-A creando reorganizantes de un solo gen recombinantes (Tabla 7). La introducción de PB2 de wt en rVDM-A dio como resultado un virus que solo era 00ts a 38 oC; sin embargo, siguió siendo ts a 39 oC. La reducción en el título de virus a 38°C y 39 oC (en relación a 33 oC) fue de 0,6 10910 Y 2,7 10910, respectivamente, medido mediante ensayo de placa en células MDCK. El reorganizante que contenía el segmento génico de PB1 de wt era no-ts, respecto de su capacidad para formar placas tanto a 38 como a 39"C. El tamaño de la placa de este recombinante, sin embargo, se vio influenciado por el aumento de la temperatura y se redujo significativamente a 39"C en comparación con rWt La introducción del segmento génico de NP de wt en rVDM-A dio como resultado un virus que también era no-ts a 38 oC, pero a diferencia del recombinante de PB2 de wI, el virus que contenia el segmento génico de NP de ts no formó placas a 39 oC. l a introducción de segmentos génicos de PA, M o NS de wt de manera independiente en rVDM-A no alteró el fenotipo ts, lo que indica que estos tres segmentos génicos tenían un papel mínimo en el mantenimiento de este fenotipo.

Debido a que ni PB1 de wt, PB2 de wt o NP de wt expresados individualmente en el origen de VDM-A pudieron crear una placa de manera eficiente y perfiles de tamaño de placa idénticos a rWT no-ts, estos segmentos génicos se introdujeron en VDM-A en varias combinaciones, La combinación de PB1 de wt y PB2 de wt dio como resultado un virus que era no-ts tanto a 38 como a 39 QC (Tabla 7). Aunque el tamaño de la placa era mayor que el de cualquiera de los reorganizantes de un solo gen, fue significativamente menor que el de rWt. La combinación triple de PB1 fPB2fNP de wt en rVDM-A dio como resultado un virus que era similar o idéntico a rWT en cuanto a su eficiencia y tamaño de placa a 39 "C. Por lo tanto, mientras que los segmentos génicos de PB2, PB1 Y NP DE wt solo revirtieron parcialmente el fenotipo ts cuando se introdujeron individualmente, la combinación de los tres segmentos génicos de wt fue capaz de revertir completamente el fenotipo ts a un comportamiento no-ts idéntico al de rWt.

Para determinar si estos 3 segmentos génicos eran capaces de impartir el fenotipo ts característico de VDM-A a rWt, se introdujeron los seis segmentos génicos internos procedentes de VDM-A en rWt de manera individual o en combinación. La introducción de los segmentos génicos PB1 , PB2, o NP individualmente en rWt dio como resultado una reducción del título de virus a 38 QC y una reducción mayor a 39 "c, sin embargo, ninguno de estos reorganizantes de un solo gen estaba tan restringido a alta temperatura como rVDM-A (Figura 10). Los segmentos génicos PA, M Y NS procedentes de VDM-A no influenciaron el fenotipo no-ts de rWt. De manera consistente con los reorganizantes anteriores, se demostró que la introducción de ambos genes PB1 y PB2 de VDM-A en la estructura de rWt aumentó en gran medida el fenotipo ts del virus a 38 "C; sin embargo, la reversión completa del fenotipo ts del virus requirió la adición del gen NP. Por lo tanto, los segmentos génicos de PB1, PB2 Y NP procedentes de VDMA fueron importantes para conferir el fenotipo ts completo

Maceo del locus genético que determinó el fenotipo ts de VDM A

Se abordaron sistemáticamente las diferencias específicas entre los segmentos génicos PB1 , PB2 Y NP de rWt y rVDM-A para identificar aquellos cambios que desempeñaron un papel significativo en el fenotipo ts. El gen NP de rVDM-A difirió de NP de rWt solo en el nucleótido 146 (G34D, Tabla 6). El gen de PB2 de rVDM-A difirió del de rWt en tres sitios, pero solo el nucleótido 821 dio como resultado un cambio de aminoácido (N265S, Tabla 6) y representó probablemente el locus de ts localizado en el segmento génico de PB2. El gen de PB1 de VDM -A difirió de PB1 de wt en 6 posiciones de nUcleótidos, de las cuales 4 fueron cambios codificantes (Tabla 6). Se sustituyó cada una de las sustituciones de resto de aminoácido de wt individualmente en el segmento génico de PB1 de rVDM-A para evaluar su papel en el fenotipo ts. 1395G (Glu-457) Y 2005G (Ala) no afectaron al fenotipo ts de VDM

A. 1195A (Lys-391 ) y 1766A (Glu-581 ) d ieron cada una como resultado una ligera reducción en el fenotipo ts a 38 "c , pero no tuvieron efecto a 39 "c (Tabla 8). Estos datos indicaron que 1195A y 1766A fueron probablemente los locus de ts en el segmento génico de PB1 Sin embargo, la combinación tanto de 1195A como de 1766A no produjo un fenotipo ts similar al de PB1 de wt (Tabla 6). La adición de 2005G pero no de 1395A a PB1-1195Af1766A disminuyó adicionalmente el fenotipo ts del virus a 39 "c, demostrando que 2005A tenía también un papel en la expresión del fenotipo ts especificada por el segmento PB1 de VDM-A.

Tabla 8· Mapeo de los restos en PB1 que determinan el fenotiPQ ts

Virus con secuencia wt: 33 QC 38 "c 33 "Cf 38 "C 39 QC 33 QC/39 "C

10910 UFPfml

rVDM -A: 8,67 6,00 2,67 <~T >4,67

.wt: 9,04 9,01 0,03 9,03 0,01

PB1-1195A: 8,06 6,68 1,38 <~ >4,06

PB1-1395G: 8,72 5,88 2,85 <~ >4,72

PB1 -1766A: 8,07 6,70 1,37 <±.Q >4,07

PB1-2005G: 8,76 6,31 2,45 <±.Q >4,76

PB1 -1 195A1766A: 8,65 7,60 1,05 5,98 2,68

PB1 -1 195A1395G1766A: 8,84 8,13 0,71 6,38 2,46

PB1-1195A1766A2005G: 8,79 8,12 0,66 7,14 1,64

PB1fPB2INP: 8,26 8,63 0,12 8,59 0,16

PB2INP: 8,81 8,21 0,59 7,56 1,25

PB1-1195AfPB2INP: 8,86 8,81 0,05 7,60 1,26

PB1 -1 766AfPB2INP: 9,33 8,84 0,50 8,71 0,62

PB1-1766A2005G/PB2INP: 8,30 8,22 0,08 8,11 0,18

PB1-1 766A 1395GfPB2INP: 8,88 8,85 0,03 8,39 0,49

PB1 -1 195A1766AfPB2fNP: 8,45 8,48 0,06 8,10 0,35

*Ind ica reducción en el tamaño de la placa e: n comparación c on rWt

tEI subrayado indica que no se detectaron placas a una dilución en serie de 10-4.

Se introdujeron entonces mutaciones individuales de PB1 junto con PB2 de wt y NP de wt en rVDM-A. Los reorganizantes de PB2INP de wt y rVDM-A fueron no-ts a 38 "c y tenían una reducción de titulo de 1,25 log10 a 39 QC pero su tamaño de placa estaba muy reducido en comparación con rWl. La adición de PB1 -1195A o 1766A no cambió significativamente el fenotipo del reorganizante de PB2INP de wt. Solo la combinación de PB 1-1195A Y 1766A, junto con un PB2 de wt y NP de wt, dio como resultado un virus que tenia el mismo fenotipo no-ts que PB1 fPB2fNP de wt y el reorganizante rVDM-A (Tabla 8). La adición de PB1-1395G o 2005G a PB1-1766fPB2fNP de 5

et no convirtió al virus a un fenotipo no-ts característico de rWt Estos datos, por lo tanto, demostraron que los cuatro aminoácidos distribuidos en los tres genes PB1 , PB2 Y NP podían revertir por completo el fenotipo ts de MDV-A

Restricción de células hospedadoras de VDM A v virus reoraanizantes

Además de los fenotipos de sensibilidad a la temperatura y atenuación mostrados por el virus VDM-A y virus reorganizantes con uno o más segmentos procedentes de VDM-A tal como se han descrito anteriormente, el virus VDM-A mostró restricción de célula hospedadora tal como se indicó por el crecimiento reducido en células PecC6 en relación al crecimiento en células MDCK. Los virus VDM-A y reorganizantes con segmentos PB1 y PB2 procedentes de VDM-A mostraron un crecimiento significativamente reducido en células PecC6 en relación a su crecimiento en células MDCK,tal como se muestra en la Figura 20A y B.

Diseño por ingeniería genética de una cepa de virus sensible a la temperatura y atenuada

Para determinar si los cinco aminoácidos identificados en los segmentos génicos PB1, PB2 Y NP de VDM-A podrían reproducir los fenotipos ts y att de VOM-A, se introdujeron PB1-391 E, 581 G, 661T, PB2-26SS y NP-34G en una cepa de virus de tipo silvestre divergente (AlPR/8/34; ~PR8~), Y el virus resultante mostró una reducción del títu lo de virus de 1,9 loglO a 38 oc y una reducción de 4,6 10glO a 39 oC, que fue muy similar a la de rVOM-A (Figura 11)

La comparación de secuencia entre los genes PB1 , PB2 YNP de AlAAJ6/60 ca (VOM-A) YAlPRf8/34 reveló ~ue los cuatro aminoácidos sustituidos identificados en los genes de PB1 y PB2 de VDM-A son únicos. NP está

Y PB1 661

conservado entre VOM-A y PR8. Por lo tanto, los tres sitios de ts, PB1 391 (K391E), PB1 S81 (ES81G) (A661T), identificados en el gen PB1 de VOM-A se introdujeron en PB1 de AlPRf8/34 y PB2265 (N26SS) se introdujo en PB2 de AlPRf8/34 mediante mutagénesis de sitio dirigido. Las mutaciones introducidas en los genes PB1 y PB2 se verificaron mediante análisis de secuenciación. Los pares de cebadores usados para la reacción de mutagénesis se listan en la Tabla 9. Estos virus se muestran esquemáticamente en la Figura 16

Tabla 9. Cebadores usados para introducir mutaciones de ts en los genes PB1 y PB2 de PR8

HJ240: PR8-PB1A119SG 5' GAAAGAAGATTGAAGAAATCCGACCGCTC (SEC ID N°· 79)

HJ241: PR8-PB1A1195G.as 5' GAGCGGTCGGATTTCTTCAATCTTCTTTC (SEC ID N°: 80)

HJ242: PR8-PB1A1766G 5' GAAATAAAGAAACTGTGGGGGCAAACCCGTICC (SEC ID N°· 81)

HJ243: PR8-PB1A1766G.as 5' GGAACGGGTTTGCCCCCACAGTTTCTTIATTIC (SEC ID N°· 82)

HJ244: PR8-PB1G2005A 5' GTATGATGCTGTTACAACAACACACTC C (SEC ID N°: 83)

HJ245: PR8-PB1G2005A.as 5' GGAGTGTGTIGTTGTAACAGCATCATAC (SEC ID N°: 84)

HJ246: PR8-PB2A821G 5' ATTGCTGCTAGGAGCATAGTGAGAAGAGC (SEC ID NO: 85)

HJ247: PR8-PB2A821G.as 5' GCTCTICTCACTATGCTCCTAGCAGCAAT (SEC ID N°· 86)

Para examinar si las mutaciones de ts introducidas en los genes PB1 y PB2 de PR8 conferían el fenotipo ts in vitro, se llevó a cabo un ensayo de minigenoma. El indicador de minigenoma de la gripe, denominado pFlu-CAT, contenia el gen CAT de sentido negativo clonado bajo el control del promotor de poi L La expresión de la proteína CAT dependía de la expresión de las proteínas de la gripe PB1, PB2, PA, YNP.

En resumen, se transfectaron células Hep-2 con 1 jJg de cada uno de PB1, PB2, PA, NP Y minigenoma de pFlu-CAT mediante lipofectamina 2000 (Invitrogen). Después de una incubación durante toda la noche (aproximadamente 18 horas) a 33 "C o 39 "C, se analizaron los extractos celulares respecto de la expresión de proteína CAT mediante el kit de ELlSA para CAT (Rache Bioscience). Se midió el nivel de ARNm de CAT mediante ensayo de extensión de cebadoL A las 48 horas después de la transfección, se extrajo el ARN celular total mediante reactivo TRlzol (Invitrogen) y se mezcló 1/3 del ARN oon un exceso de cebador de ADN (5'-ATGTTCTTTACGATGCGATTGGG (SEC ID N°: 89) marcado en su extremo 5' con [r_32P]_ATP y T4 polinucleótido cinasa en 6jJI de agua. Después de desnaturalizar a 95 "c durante 3 min, se llevó a cabo la extensión de cebador después de la adición de 50 U de transcriptasa inversa superscript (Invitrogen) en el tampón de reacción proporcionado con la enzima que contenía 0,5 mM de dNTP durante 1 hora a 42 oC. Los productos de transcripción se analizaron en geles de poliacrilamida al 6% que contenían urea 8 M en tampón TBE y se detectaron mediante autorradiografía.

Tal como se muestra en la Fig. 12A Y B, el gen PB1 que portaba las tres sustituciones de aminoácidos (PR8 -3s),

PB1 391

(K391 E), PB1 S81 (E581G) YPB1 661 (A661T), tenían actividad reducida a 33"C en comparación con el control de PRB. Se observó una reducción mayor en la expresión de proteína CAT (Fig. 12A) para este mutante a 39 "C, indicando que el gen PB1 con los tres sitios de VDM-A ts introducidos mostró una replicación sensible a la temperatura en este ensayo in vitro. La introducción de PB2265 (N265S) en PR8 tuvo un efecto muy pequeño en su actividad a temperaturas tanto permisivas (33 oC) como no permisivas (39 oC). La combinación tanto de PB1 -3s como de PB2-1s dio como resultado una reducción mayor en la actividad de proteína (PR8-4s), que pareció ser incluso más ts que VDM-A. Tal como se esperaba, se detectó una actividad de bajo nivel (15%) en células transfectadas con los genes PB1 , PB2, PA, NP procedentes de VOM-A a 39 oC en comparación con AlAAJ6/60 de wt (wt AlAA)

Los virus mutantes de PR8 se generaron y recuperaron tal como se describió anteriormente. En resumen, se transfectaron células COS-7 y MDCK cultivadas conjuntamente con ocho plásmidos que codificaban los genes HA, NA, PB1, PB2, PA, NP, M Y NS de PR8 procedentes de PR8, Para producir un virus que portaba cuatro locus de ts (PR8-4s), se usaron PB1·3s que contenía tres cambios en PB1 en las posiciooes de nucleótidos 1195 (K391E), 1766 (E581G) Y 2005 (A661T) Y PB1-1s que contenía un cambio en PB2 en la posición 821 (N265S). Además, También se recuperaron por separado los virus de PR8 que portaban bien tres mutaciones en PB1 (PR8-3s) o una mutación en PB2 (PR8-1s). Estos virus se muestran esquemáticamente en la Figura 16. Los cuatro virus PR8 mutantes recombinantes crecieron a títulos muy elevados en huevos embrionados, alcanzando un título de 9,0 10910 ufp/mlo mayor, tal como se muestra en la Tabla 10.

Para examinar la síntesis de proteínas virales en células infectadas, se infectaron células MDCK con un virus a una MOl de 5 y se marcaron las células con 35S_Trans a las 7 horas después de la infección durante 1 hora. Se sometió el lisado de células marcadas a electroforesis en gel de poliacrilamida al 1,5% que contenía SOS y se autorradi09rafió. La síntesis de proteínas también se estudió mediante transferencia de Westem. Las células infectadas por virus se recogieron a las 8 horas después de la infección y se sometieron a electroforesis en un gel de gradiente al 4-15%. Se sondó la transferencia con anticuerpo anti-M1 o anticuerpo policlonal de pollo anti-VDM-A, seguido de incubación con anticuerpo secundario conjugado a HRP. Las bandas de proteínas conjugadas a anticuerpo se detectaron mediante sistema de detección quimioluminiscentes (Invitrogen) seguido de exposición a película de rayos X.

Tal como se muestra en la Fig 19, todos tenían un nivel similar de síntesis de pfOtelnas a 33 "c , sin embargo, a 39 oC, el nivel de síntesis de proteínas se redujo ligeramente para PR8-1s, pero se redujo en gran medida en células infectadas con PR8-3s y PR8-4s. Los análisis de transferencia de Western también mostraron síntesis de proteinas reducida en el orden de PR8-4s>PR8-3s>PR8-1 s. Por lo tanto, la replicaciórJ reducida de los mutantes de ts era probablemente el resultado de su replicación reducida a temperaturas no permisivas

La sensibilidad a la temperatura de los virus mutantes de PR8 se determinó mediante ensayo en placa en células MDCK a 33 oC, 37 "c , 38 oC Y 39 "C. Los virus recuperados se amplificaron en huevos embrionados y se introdujeron en células, tal como se describe anteriormente. Después de la incubación de células infectadas por virus durante tres días a las temperaturas indicadas, se inmunotiñeron monocapas de células usando anticuerpos policlonales de pollo anti-VDM y se numeraron las placas. Los recuentos de placas obtenidos a cada una de las

temperaturas se compararon para evaluar el fenotipo ts de cada virus. La temperatura de extinción se definió como la temperatura más baja que tenía una reducción del título de 100 veces o mayor en comparación a 33 "c

Tal como se muestra en la Tabla 10 y en la Fig. 17, todos los mutantes se replicaron bien a 33 oC, aunque se observó una ligera reducción en el título de virus. A 38 oC, se observó una reducción significativa en el título de virus para todos los mutantes. A 39 "c, se observó una reducción del título de virus mayor de 4,0 10910 para los virus que portaban los tres locus de ts en el gen PB1 (PR8-3s y PR8-4s). PR8-1s también fue ts a 39 "C. El fenotipo ts de PR8-4s fue muy similar al de VDM-A, que tuvo una reducción de 4,6 10910 a 39 oC en comparación con 33 oC Aunque los tres mutantes de PR8 no tuvieron una reducción del título de virus mayor de 2,0 10g lO a 37 "c , su morfología de placa fue diferente de la de aquellos a 33 <oC. Tal como se muestra en la Fig. 18, el tamaño de la placa para cada mutante se redujo solo ligeramente a 33 "c en comparación con PR8. Se observó una reducción significativa en el tamaño de placa a 37 oC para PR8-3s y mayor para PR8-4s. PR8-1 s no tuvo una reducción del tamaño de placa significativa a 37 oC. A 39 "c, solo unas pocas placas de tamaño cuidadosamente seleccionado se observaron tanto para PR8-3s como para PR8-4s. Se observó un tamaño de placa de aproximadamente un 30% del de PRB de wt para PR8 -1s

Tabla 10 Sensibilidad a la temperatura de PR8 con ellocus de ts introducido Título viral (lag 10 ufp/ml)

Virus: 33 oC 37 "c 38 oC 39 oC

VDM-A: 8,6 7,0 6,4 4·

M~: 8 ) 8) ~ 8~

PR8: 9,6 9,5 9,5 9

PB8-1s: 9,4 8,9 7,7 7,4

PB8-3s: 9,2 8,8 7,8 5,2

PB8-4s: 9,5 7,8 7,1 4,4

Se asignó un título de 4,0 cuando no se detectó virus a 10.000 diluciones.

Se examinó la atenuación de los virus PR8 mutantes en hurones. En resumen, se usaron hurones macho de 9-10 semanas de edad para evaluar la replicación del virus en el tracto respiratorio de un hospedador animal. Se alojaron individualmente los hurones y se les inoculó 8,5 IOg10 ufp de virus por vía intranasaL Tres días después de la infección, se sedó a los hurones con ketamina-HCL, se recogieron los pulmones y los cornetes nasales (NT). Los homagenizados de tejido pulmonar se diluyeron en serie y se titularon en huevos de gallina embrionados de 10 días de edad. El título de virus (loglOEIDsoIml) en los pulmones se calculó mediante los métodos de Karber. La replicación del virus en NT se determinó mediante ensayo en placa y se expresó como IOg10 ufp/ml

Los niveles de replicación del virus en pulmones y cornetes nasales se midieron mediante EIDSO o ensayos de placa (Tabla 11). Tres días después de la infección, PR8 se replicó a un nivel de 5,9 IOg10 EIDSO/gramo de tejido pulmonar. Sin embargo, PR8-1s mostró una reducción en la replicación de 3,0 10glO de pulmones de hurón y se detectó una replicación muy baja para PR8-3s. No se detectó replicación para PR8-4s, que se estudió en dos grupos de virus infeclados con virus obtenidos independientemente. El límite de detección de virus en los pulmones de hurón mediante ensayo de EID50 es de 1,5 IOg10 y por lo tanto, se asignó un titulo de 1,5 log,o EIDSO para PR8-4s Como control, VDM-A no se replicó en pulmones de hurón y AfAA16f60 de wt se replicó hasta un título de 4,4 109'0 La replicación del virus en los cometes nasales (NT) se examinó mediante ensayo de placa en células MDCK. PR8 se replicó hasta un titulo de 6,6 10910 ufp/g en la nariz. Solo se observaron ligeras reducciones en el título viral para PR8-1s y PR8-3s. Se observó una reducción de 2,2 10910 para PR8-4s (A), mientras que se observó una reducción de 4,3 10910 para PR8-4s (8), que portaba un cambio en el gen PB1 (E390G). La replicación reducida en gran medida de PR8.4s (B) se correlaciona bien con su fenotipo ts a 37 oC. En este caso se usó una dosis infecciosa de 8,5 10g lO ufp en lugar de la de 7,0 log,o ufp que se usó normalmente para evaluar el fenotipo de atenuación de vacunas de la gripe procedentes de VDM-A. Este resultado indicó que PR8 que portaba los cuatro locus de ts procedentes de VDM-A estaba atenuado para replicación en el tracto respiratorio inferior de hurones

Tabla 11 . Reolicación de mulanles de PR8 en hurones

Virus: Hurones Dosis (109'0 ufp) Título de virus en pulmones (Iog" EID50/g + DTl . Título de virus en cornetes nasales (Iog,dg ,+ DT)

PR8 PR8-1s: 4 4 85 85 59+03 38+04 66+01 59+02

PRB-3s PR8-4s A: 4 4 8,5 8,5 1,7±0,1 1,5+0,0 5,8 ± 0 ,3 4,6 + 0 ,2

PR8-4s 8 VDM-A WtAJAA: 4 4 4 8,5 85 85 1,5+0,0 15+0 0 44+01 2,3 + 0 ,3 46+ 01 54+01

no se detectó virus y se asignó un titu lo de 1 ,5 10glO EID50fg El v irus contiene un cambio adicional en P81-1193-lE390G)

En los ensayos tanto de ts como de att, el mulante de PR8 moslró fenotipos tanlo Is como att que fueron muy similares a los de VDM-A. Estos datos indican que la introducción de las sustituciones de aminoácidos únicas del VDM-A en una cepa de virus de la gripe divergente da como resultado un virus que muestra los fenotipos sensibles a la temperatura y atenuados deseables para producir, por ejemplo, vacunas vivas atenuadas. Además, el virus PR8 Is, att creció a un tílulo elevado, lo que lo hizo adecuado para su uso como virus donante maestro para la producción de vacunas de gripe vivas atenuadas o inactivadas. Estos resultados indican que las cinco mutaciones de VDM-A: PBI-391E, PB1 -581G, PBI-661T, PB2-265S, Y NP-34G pueden conferir los fenotipos ts y att a cualquier cepa de gripe A. De manera similar, pueden producirse nuevas cepas B Is y att adecuadas para la producción de vacunas introduciendo las mutaciones de la cepa VDM-B en virus de la gripe de cepa B. Además de producir vacunas de virus vivas atenuadas, la inlroducción de estas mutaciones en cepas donantes dará lugar a la producción de vacunas inactivadas más seguras

EJEMPLO 5: SISTEMA DE OCHO PLAsMIDOS PARA LA PRODUCCiÓN DE VDM-B

Se extrajo el ARN viral de una variante adaptada al frio de gripe B/Ann Arbor/1f66 (calMaster Ann Arborf1l66 PI Aviron 1012197) , una cepa donante maeslra de gripe B (MDV-B) ejemplar, a partir de 100 IJI de fluido alantoico de huevos embrionados infectados usando el kit RNeasy (Qiagen, Valencia, CA), y se eluyó el ARN en 40 J.l1 de H20 Se efectuó la RT-PCR de los segmentos genómicos usando el kit de RT -PCR One Step (Qiagen, Valencia, CA) de acuerdo con el protocolo proporcionado, usando 1 IJI de ARN extraído para cada reacción. La reacción de RT se llevó a cabo durante 50 min a 50 oC, seguido de 15 min a 94 oC. La PCR se llevó a cabo durante 25 ciclos a 94 oC durante 1 min, 54 oC durante 1 min, y 72 oC durante 3 mino Los genes de P se amplificaron usando cebadores especificos de segmento con sitios de 85mBI que dieron como resultado la generación de dos fragmentos (Tabla 12).

Tabla. 12..CebadQr~$ d$ RT-PCR para la. arnplificar;ion d$IO$ aARJ'''¡v d~ grip$ 61Ann_ArbQ!1116e Ciil

Cebador directo Cebador inverso

PB ': Bm-PBlb-l: (SEC ID N": 53)

[lA]: TATTCGTCTG.II,GGGAGCAGAAGCGG AGCCTTIAAGATG

PB ': Bm-PBlb-I22G: (SEC ID N°' 55)

[lB]: TATTCGTCTCGGCATCTTIGTCGCCTGGGATGATGATG

PB2: Bm-PB2b-l: (SEC ID NO: 57)

[2A1: TATTCGTCTCAGGGAGCAGAAGCGGAGCGTTTTCAAGATG

PB2: Bm-PB2b-l '42: (SEC ID N": 59)

[2B]: TATTCGTCTCATGAGAATGGAAAAACTACTAATAAATTCAGC

PA: Bm-Pab-l: (SEC ID NO: 61)

[JAI: TATTCGTCTCAGGGAGCAGAAGCGGTGCGTTIGA

w m: PA Bm-Pab-1283: (SEC ID N°: 63)

[3B]: TATTCGTCTCTCCTGGATCTACCAGAAATAGGGCCAGAC

HA: VDM-B 5'BsmBI-HA (SEC ID N": 65)

TATTCGTCTCAGGGAGCAGAAGCAGAGCATTITCTAATATC

NP: Ba-NPb-1: (SEC ID NO: 67)

TATTGGTCTCAGGGAGCAGAAGCACAGCATTTTCTTGT

NA: VDM-B S'BsmBI-NA (SEC ID N": 69)

TATTCGTCTG.II,GGGAGCAGAAGCAGAGCATCTTCTCAAAAC

": VDM-B S'BsmBI-M: (SEC ID N~ 71)

TATTCGTCTCAGGGAGCAGAAGCACGCACTTTCTTAAAATG

NS: VDM-B 5'BsmBI-NS: (SEC ID N": 73)

TATTCGTCTCAGGGAGCAGAAGCAGAGGATTTGTTTAGTC

Bm· PBlb-1200R: (SEC ID N°: 54)

TATTCGTCTCGATGCCGTTCCTTCTTCATTGAAGAATGG

Bm-PBlb-2369R: (SEC ID N°' 56)

ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACACGAGCCTT

Bm-PB2b-1 '45R: (SEC ID N°: 58)

TATTCGTCTCTCTCATTTIGCTCTTTTTTAATATTCCCC

Bm-PB2b-2396R: (SEC ID N°: 60)

ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACACGAGCATT

Bm-PAb-1261R: (SEC ID NO. 62)

TATTCGTCTCCCAGGGCCCTTTTACTTGTCAGAGTGC

Bm-PAb-23G8R: (SEC ID N°: 64)

ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACACGTGCATT

VDM-B 3'BsmBI-HA: (SEC ID N": 66)

ATATCGTCTCGTATTAGTAGTAACAAGAGCAnnnTC

Ba-NPb-1842R: (SEC ID No: 68)

ATATGGTCTCGTATTAGTAGAAACAACAGCATTITT

VOM-B 3'BsmBI-NA: (SEC ID N": 70)

ATATCGTCTCGTATTAGTAGTAACAAGAGCAnnnTCAG

VOM-B 3'BsmBI-M: (SEC ID N": 72)

ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAACGCACTTTTTCCAG

VDM-B 3'BsmBI-NS: (SEC ID N": 74)

ATATCGTCTCGTATTAGTAGTAACAAGAGGATTTTTAT

Las secuencias complementarias con las secuercias de gripe se muestran en negrita. Los extremos 5' tienen secuencias de reconocimiento para las endonucleasas de restricción BsmBI {Sil}) o Bsal {Sal

Clonación de plasmidos

Se aislaron fragmentos de PRC, se digirieron con BsmBI (o Bsal para NP) y se insertaron en pAD3000 (un derivado de pHW2000 que permite la transcripción de ARNv de sentido negativo y de ARNm positivo) en el sitio de 8smBI tal como se ha descrito anteriormente. Se secuenciaron de dos a cuatro de cada plasmido resultante y se compararon con la secuencia consenso de VDM-B basandose en la secuenciación directa de los fragmentos de RT-PCR. Se "repararon" los plasmidos que tenían sustituciones de nucleótidos que daban como resultado cambios de aminoácidos diferentes de la secuencia consenso bien mediante clonación de plásmidos o mediante la utilización del kit Quikchange (Stratagene, La Jolla, CA). Los plásmidos de B/Ann Arbor/1/66 resultantes se denominaron pAB121PB1, pAB122-PB2, pAB123-PA, pAB124-HA, pAB125-NP, pAB126-NA, pAB127-M, Y pAB128-NS. Usando este sistema de transcripción bidireccional se producen inlracelularmente todos los ARN y proteínas virales, dando como resultado la producción de virus de la gripe B infecciosos (Figura 4)

Cabe destacar que pAB121-PB1 y pAB124-HA tenían 2 sustituciones silentes de nucleótidos y pAB128-NS tenía 1, en comparación con la secuencia consenso (Tabla 13). Estos cambios de nucleótidos no dan como resultado alteraciones de aminoácidos, y no se prevé que afecten al crecimiento y rescate de virus Se han mantenido estas sustituciones silentes para facilitar el genotipado de los virus recombinantes.

Tabla 13. Con junto de plásm idos que representa los ocho segmentos de B/Ann Arbor/1/66 (VOM-Bl

Seg: plásmidos nucleótidos proteína

PB1: PAB121-PB1 A924>G924 ; C1701>T1701 silente

PB2: PAB122-PB2 consenso

PA: PAB123-PA consenso

HA: PAB124-HA T150>C150; T153>C153 silente

NP: PAB125-NP consenso

NA: PAB126-NA consenso

M: PAB127-M consenso

NS: PAB128-NS A416>G416 NS1 : silente

Para la construcción de los plásmidos con sustitución de nucleótidos en los genes PA, NP Y M1 se usaron como moldes los plásmidos pAB123-PA, pAB125-NP Y pAB127-M. Los nucleótidos se cambiaron mediante el kit Quikchange (Stratagene, La Jolla, CA). Como altemativa, se amplificaron dos fragmentos mediante PCR usando cebadores que contenían las mutaciones deseadas, se digirieron con 8smBI y se insertaron en pA03000-BsmBI en una reacción de ligación de tres fragmentos. Los plásmidos generados se secuenciaron para asegurar que el AoNc no contenia mutaciones no deseadas.

La secuencia del AoN molde se determinó usando kits de reacción listos para secuenciación de terminadores de ciclo con colorante rodamina o d-rodamina con AON polimerasa FS AmpliTaq® (Perkin-Elmer, Applied Biosystems, Inc, Foster City, CA). Las muestras se separaron mediante electroforesis y se analizaron en secuenciadores de AON modelo 373, modelo 373 Stretch, o modelo 377 de PEJABI.

En un experimento separado, se amplificó el ARN viral de gripe BfYamanashif166/98 y se clonó en pA03000 tal como se describe anteriormente respecto de la cepa VDM-B, con la excepción de que la amplificación se llevó a cabo durante 25 ciclos a 94 QC durante 30 segundos, 54 QC durante 30 segundos y 72 QC durante 3 minutos. Se usaron cebadores idénticos para la amplificación de los segmentos de la cepa BfYamanashif166/98, con la sustitución de los siguientes cebadores para la amplificación de los segmentos de NP y NA: VoM-B 5'BsmBI-NP: TATTCGTCTCAGGGAGCAGAAGCACAGCATTTTCTTGTG (SEC ID N°· 75) Y VOM-B 3'BsmBI-NP:ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAACAGCAIIIIIIAC (SEC ID N°· 76) Y Bm-NAb-1· TATTCGTCTCAGGGAGCAGAAGCAGAGCA (SEC ID NO: 77) Y Bm-NAb-1557R:ATATCGTCTCGTATTAGTAGTAACAAGAGCA TTTT (SEC ID N°: 78), respectivamente. Los plásmidos de BNamanashif166/98 se denominaron pAB251-PB1 , pAB252-PB2, pAB253-PA, pAB254-HA, pAB255-NP, pAB256NA, pAB257-M, Y pAB258-NS. Se identificaron tres diferencias de nucleótidos silentes en PA, facilitando el genotipado de virus recombinante y reorganizante de BfYamanashi/166f98.

EJEMPLO 6: GENERACiÓN DE VIRUS DE LA GRIPE B RECOMBINANTE y DE VIRUS DE LA GRIPE REORGANIZADO INFECCIOSO

Para superar los obstáculos encontrados en el intento de crecer gripe B en un sistema de cultivo libre de virus auxiliar, la presente divulgación proporciona nuevos vectores y protocolos para la producción de virus de la gripe de cepa B recombinantes y reorganizantes. El sistema de vector usado para el rescate de virus de la gripe B se basa en el desarrollado para la generación del virus de la gripe A (Hoffmann et al. (2000) A oNA transfection system for generation of influenza A virus from eight plasmids Proc Nat! Acad Sci USA 97:6108-6113; Hoffmann y Webster (2000) Unidirectional RNA polymerase I-polymerase 11 transcription system for the generation of influenza A virus

from eight plasmids J Gen Viral 81:2843-7). Se cultivaron conjuntamente células 293T o COS-7 (células de primate con una alta eficacia de transfección y de actividad de poli) con células MDCK (permisivas para el virus de la gripe); las células 293T se mantuvieron en medio OptiMEM l-AS que contenía FBS al 5%, las células COS-7 se mantuvieron en medio DMEM I-AB que contenía FBS al 10%. Las células MDCK se mantuvieron en MEM 1x, FBS al 10 % con la adición de agentes antibióticos y antimicóticos. Antes de la transfección con los vectores de genoma viral, se lavaron las células con 5 mi de PBS o de medio sin FBS. Se añadieron diez mi de Iripsina -EDTA a las células confluentes en un matraz de 75 cm2 (las células MDCK se incubaron durante 20-45 min, las células 293T se incubaron durante 1 min). Las células se centrifugaron, y se resuspendieron en 10 mi de OptiMEM I-AB. Después se diluyó un mi de cada linea celular suspendida en 18 mi de OptiMEM I-AB, Y se mezcló. Después se separaron las células en alícuotas en una placa de 6 pocillos a 3 mi/poci llo. Después de 6-24 horas, se mezcló 1 1-19 de cada plásmido en un tubo Eppendorf de 1,5 mi con OptiMEM I-AB para los plásmidos (x ¡.JI de plásmidos + x ¡.JI de OptiMEM I-AB + x 1-11de Trans1T-LT1 = 200 1-11); 2 1-11de Trans1T-LT1 por 1-19 de ADN de plásmido. La mezcla se incubó a temperatura ambiente durante 45 mino Después se añadieron 800 ¡.JI de OptiMEM I-AB. Se retiró el medio de las células, y se añadió la mezcla de Iransfección a las células (t = O) a 33 oC duranle 6-15 horas. La mezcla de transfección se retiró lentamente de las células, y se añadió 1 mi de OptiMEM I·AB, Y las células se incubaron a 33 oC durante 24 horas. Cuarenta y ocho horas después de la transfección, se añadió 1 mi de OptiMEM I-AB que contenía 1 ¡.Jg/ml de TPCK-tripsina a las células. A las 96 horas después de la transfección, se añadió 1 mi de OptiMEM I-AB que contenía 1 I-Ig/ml de TPCK-tripsina a las células

Entre 4 dfas y 7 días después de la transfección se extrajo 1 mi del sobrenadante de cultivo celular y se controló mediante ensayo de HA o de placa. En resumen, se separó en alícuotas 1 mi de sobrenadante en un tubo Eppendorf y se centrifugó a 5000 rpm durante 5 mino Se transfirieron novecientos 1-11 de sobrenadante a un tubo nuevo, y se efectuaron diluciones en serie a 500 ¡.JI/pocillo a células MDCK (por ejemplo, en placas de 12 pocillos). El sobrenadante se incubó con las células durante 1 hora y después se retiró y se reemplazó con medio de infección (MEM 1x) que contenía 11-19fml de TPCK-Iripsina. Entonces se efectuaron los ensayos de HA o los ensayos de placa. Por ejemplo, ara los ensayos de placa, se titularon los sobrenadantes en células MDCK que se incubaron con un recubrimiento de agarosa al 0,8% durante tres días a 33 oc. Para la infección de huevos, se recogió el sobrenadante de células lransfectadas a los seis o siete días después de la transfección, se inyectaron 100 1-11 de las diluciones de virus en Opti-MEM I a huevos de gallina embrionados de 11 días de edad a 33 oC. Se determinó el título tres días después de la inoculación mediante ensayo de TCIDso en células MDCK

Para generar VDM-B, se transfeclaron células 293T-MDCK o COS-7-MOCK cultivadas conjuntamente con 1 I-Ig de cada plásmido. Cuando se examinaron a los 5 a 7 días después de la lransfección, las células MDCK cultivadas conjuntamente mostraron efectos citopáticos (CPE), indicando la generación de virus VDM-B infeccioso a partir del ADNc clonado. No se observaron CPE en las células transfectadas con siete plásmidos (Tabla 14). Para determinar la eficacia del sistema de transfección de ADN para la generación de virus, se titularon los sobrenadantes de células siete días después de la transfección en células MOCK y se determinó el título de virus mediante ensayo de placa. El lílulo de virus del sobrenadante de células 293T-MDCK cultivadas conjuntamente fue de 5,0 x 106 ufpfml u de 7,6 x 106 ufpfml en células COS7-MDCK

Tabla 14. Generación de virus de griee B infeccioso a eartir de ocho elásmidos segmento 1 2 3 4

PB1: pAB121-PB1 PAB121-PB1

PB2: pAB122-PB2 pAB122-PB2 PAB122-PB2 pAB122-PB2

PA: pAB123-PA pAB123-PA pAB123-PA pAB123-PA

HA: pAB124-HA pAB124-HA pAB124-HA pAB124-HA

NP: pAB125-NP pAB125-NP pAB125-NP pAB125-NP

NA: pAB126-NA pAB126-NA pAB126-NA pAB126-NA

M: pAB127-M pAB127-M pAB127-M pAB127-M

NS: pAB128-NS pAB128-NS pAB128-NS pAB128-NS

células 293T-MDCK cocu ltivadas células COS-7-MDCK cocu ltivadas

CPE + +

ufpfml 5,Ox106 O 7,6 X 106 O

Se transfectaron de manera transitoria células 293T-MOCK (1, 2) o COS7-MOCK (3, 4) cultivadas conjuntamente con siete u ocho plásm idos. Se controló el efecto citopático (CPE) siete días después de la transfección en las células MDCK cultivadas conjuntamente. Siete días después de la transfección se titularon los sobrenadantes de células Iransfectadas en células MOCK. Los datos de ufpfml representan la med ia de múltiples experimentos de transfección (por ejemplo, tres o cuatro).

Se obtuvieron resultados comparables en los experimentos de transfección que uti lizaban los vectores plasmídicos de BlYamanashi/166f98. Estos resultados demuestran que el sistema de transfección permite la generación reproducible desde cero del virus de la g ripe B a partir de ocho plásmidos. Genotipado de gripe B recombinante Después de un pase posterior en células MDCK, se usó RT-PCR del sobrenadante de células infectadas para confirmar la autenticidad del virus generado. La RT -PCR se efectuó con cebadores especificos de segmentos para los ocho segmentos (Tabla 12), Tal como se muestra en la Figura SA, se generaron productos de PCR para todos los segmentos. La secuenciación directa de los productos de PCR de los segmentos PB1, HA, Y NS reveló que los cuatro nucleótidos analizados fueron iguales a los encontrados en el plásmido pAB121-PB1 , pAB124-HA, Y pAB128NS. Estos resultados confirmaron que el virus generado se generó a partir de los plásmidos designados y excluyen (además de los controles negativos) cualquier contaminación de laboratorio posible con el virus progenitor (Figura 5B).

De manera similar, después de la transfección con los vectores plasmidicos de BNamanashif166f98, se recuperó el virus y se amplificó la región que abarcaba los nucleótidos 1280-1290 del segmento PA. La secuenciación confirmó que el virus recuperado correspondia a BNamanashif166f98 recombinante procedente de plásmidos (Figuras 5C y D).

Fenotipado de rVDM B

El virus VDM-B muestra dos fenotipos caracteristicos: sensibilidad a la temperatura (ts) y adaptación al frío (ca). Por

definición, una diferencia de 2 log (o mayor) en el título del virus a 37 oC en comparación con 33 oC define ts, ca se define por una diferencia menor de 2 log en el crecimiento del virus a 25"C en comparación con 33 "C. Se infectaron células primarias de riñón de pollo (PCK) con el virus progenitor VDM-B y con el virus transfectado procedente de plásmidos para determinar el crecimiento viral a tres temperaturas

Para el ensayo de placa, se usaron células MDCK confluentes (ECACC) en placas de seis pocillos. Se incubaron diluciones de virus durante 30-60 min a 33 oC. Las células se recubrieron con un revestimiento de agarosa al 0,8 %. Las células infectadas se incubaron a 33 oC o 37 oC. Tres días después de la infección, las células se tiñeron con solución de violeta cristal al 0,1 % Y se determinó el número de placas.

Se llevó a cabo el ensayo de fenotipo ca-ts mediante titulación de TCIOso de muestras de virus a 25, 33, Y 37"C Este formato de ensayo mide el título de TCIDso examinando el efecto citopático (CPE) del virus de la gripe en monocapas de células primarias de riñón de pollo en placas de cultivo de 96 pocillos a diferentes temperaturas (25 oC, 33 oC, 37 oC). Este ensayo no depende de la morfología de la placa, que varía con la temperatura y las cepas virales; en su lugar, depende únicamente de la capacidad del virus de la gripe para replicarse y causar CPE. Una suspensión de células primarias de riñón de pollo (PCK), preparada mediante tripsinización del tejido primario, se suspendió en medio MEM (de Earl) que contenía FCS al 5%. Las células PCK se suspendieron en placas de cultivo de 96 pocillos durante 48 horas para preparar una monocapa con >90% de confluencia. Tras 48 horas, la monocapa de células PCK se lavó durante una hora con medio MEM sin suero que contenía L-glutamina 5 mM, antibióticos, aminoácidos no esenciales, citado como medio de ensayo de fenotipo (PAM). Se prepararon diluciones en serie de diez veces del virus en bloques de 96 pocillos que contenían PAM. Entonces se emplacaron las muestras de virus diluido en la monocapa de PCK lavada en las placas de 96 pocillos. A cada dilución de la muestra de virus, se usaron replicados de seis pocillos para la infección con el virus diluido. Se incluyeron células no infectadas como control celular en forma de replicado de 6 pocillos para cada muestra. Cada muestra de virus se tituló en 2-4 replicados. Se incluyó virus de control de fenotipo con títulos predeterminados a 25 oC, 33 oC Y 37 oC en cada ensayo. Para determinar el fenotipo ts de las muestras de virus, se incubaron las placas durante 6 días a 33 oC y 37 oC en incubadores de cultivo celular de C02al 5%. Para la caracterización del fenotipo ca se incubaron las placas a 25 oC durante 10 días. El título de virus se calculó mediante el método de Karber y se comunicó como media de Log1o (n=4) de TCIDso títulofml ± desviación tipica. Las desviaciones tipicas de los titulas de virus presentados en las Fig. 1-3 se encontraban en el intervalo de 0,1 a 0,3. La diferencia en título de virus a 33 oC y 37°C se usaron para determinar el fenotipo ts y la diferencia en titulo de virus a 25 oC y 33 oC se usaron para determinar el fenotipo ca

El virus VDM-B recombinante procedente de plásmido (VDM-B rec) expresó los dos fenotipos característicos en cultivo celular, ca y ts, tal como se esperaba. El fenotipo ca, replicación eficaz a 25 "C, se mide funcionalmente como una diferencia en título entre 25 oC y 33 oC menor o igual a 2 loglO cuando se ensaya en células PCK. Tanto el VDMB progenitor como recVDM-B expresaron ca; la diferencia entre 25 oC y 33 oC fue de 0,3 y 0,4 log10, respectivamente (Tabla 15). El fenotipo ts también se mide observando los titulas a dos temperaturas diferentes en células PCK; para este fenotipo, sin embargo, el título a 37 oC debe ser menor que el título a 33 oC en 2 log10 o más. La diferencia entre 33 vC y 37 vC para el VDM-B progenitor y recVDM-B fue de 3,4 y 3,7 log,o, respectivamente (Tabla 15). Por lo tanto, el virus VDM-B procedente de plásmido recombinante expresó los fenotipos tanto ca como ts

El virus recombinante tenía un título de 7,0 log10 TCIDso/ml a 33 oC y de 3,3 TCIDso/ml a 37 oC y de 8,8 log10 TCID5(lI'ml a 25 "c (Tabla 15). Por lo tanto, el virus recombinante procedente de la transfecciÓfl con los ocho plásmidos de segmento gen6mico de VDM-B de la gripe tiene los fenotipos tanto ca como ts

Tabla 15 Ensayo de fenotipo para VDM-B y rVDM-B generados a partir de plasm idos Temperatura (OC)

25 33 37

Log,o TCID50/ml (Media ± DT)

ca BfAnn Arborf01f66 (VDM B) 8,8 ± 0,3 8,5 ± 0,05 5,1 ± 0,1 ca, ts RecVDM-B 7,4±O,3 7,O±O,13 3,3±O,12 ca, ts Rec53-VDM-B 5,9 ± 0,1 5,7 ± 0,0 5,3 ± 0,1 ca, oo-ts

Las células prima rias de riñón de POllO se infectaron con el virus VDM-B progenitor y el virus recombinante procedente de plasmidos (recVDM-B). El titulo de virus se determinó a tres temperaturas diferentes.

EJEMPLO 7: PRODUCCiÓN DE VIRUS BfYAMANASHlf166f98 REORGANIZANTE

Los segmentos HA y NA de varias cepas diferentes que representan los linajes principales de la gripe B se amplificaron y clonaron en pAD3000, esencialmente tal como se describe anteriormente. Los cebadores se optimizaron para amplificación simultanea por RT -PCR de los segmentos HA y NA. La comparación de las regiones terminales del ARNv que representa la región no codificante del segmento 4 (HA) Ydel segmento 6 (NH/NA) reveló que los 20 nucleótidos terminales en el extremo S' y 15 nucleótidos en el extremo 3' eran idénticos entre los genes HA YNA de los virus de la gripe B. Se sintetizó un par de cebadores para RT-PCR (las secuencias subrayadas son especificas de virus de la gripe B) Bm-NAb-1· TAT TCG TCT CAG GGA GCA GAA GCA GAG CA (SEC ID N°· 87); Bm-NAb·1557R: ATA TCG TCT CGT A TI AGT AGT AAC AAG AGC A TI TI (SEC ID N°· 88) Yse usaron para amplificar simultáneamente los genes HA y NA a partir de varias cepas de gripe B (Fig. 8). Se aislaron los fragmentos de PCR de HA y NA de BNictoriaf504/2000, B/Hawaii/l0f2001, y B/Hong Kongf330f2001 , se digirieron con BsmBI y se insertaron en pAD3000. Estos resultados demostraron la aplicabilidad de estos cebadores para la generación eficaz de plásmidos que contenían los genes HA y NA de gripe B de varios virus de tipo silvestre diferentes que representan los linajes principales de gripe B. Los productos de RT-PCR pueden usarse para secuenciación y/o clonación en los plásmidos de expresión.

Para demostrar la utilidad de BfYamanashif166f98 (un virus similar a BfYamagata/16f88) para expresar de manera eficaz antígenos de diversos linajes de gripe B, se generaron reorganizantes que contenían PB1 , PB2, PA, NP, M, NS de BfYamanashif166f98 y la HA y NA de cepas que representaban los linajes tanto Víctoria como Yamagata (reorganizantes 6+2). Se transfectaron de manera transitoria células COS7·MDCK cultivadas conjuntamente con seis plásmidos que representaban BfYamanashif166/98 y dos plásmidos que contenían el ADNc de los segmentos HA Y NA de dos cepas del linaje BNictoriaf2187, BlHong Kongf330f2001 y BfHawaiif10f2001 , y una cepa del linaje BfYamagata/16/aa, BNictoriaf504/2000, de acuerdo con los métodos descritos anteriormente. De seis a siete días después de la transfección se titularon los sobrenadantes en células MOCK nuevas. Los tres virus reorganizantes 6+2 tenian titulas entre 4-9 x 106 ufp/ml (Tabla 16). Estos datos demostraron que los seis genes intemos de BfYamanashif166/98 podían formar de manera eficiente virus infecciosos con segmentos génicos de HA y NA de ambos linajes de gripe B

Se titularon los sobrenadantes de células COS7·MDCK cultivadas conjuntamente seis o siete días después de la transfección y el títu lo viral se determinó mediante ensayos en placa en célu las MDCK,

Tabla 16: Conjunto de plásmidos usado para la generación de BfYamanashi/166J98 y de reorganizantes 6 + 2.

segmento

1 pAB251-PB1 pAB251-PB1 pAB251-PB1 pAB251-PB1

2 pAB252· pAB252·PB2 pAB252·PB2 pAB252·PB2 pAB252·PB2

PB2

3 pAB253-PA pAB253-PA pAB253-PA pAB253-PA pAB253-PA

4 pAB254-HA pAB254-HA pAB281-HA pAB285-HA pAB287-HA

5 pAB255·NP pAB255·NP pAB255·NP pAB255·NP pAB255·NP

6 pAB256-NA pAB256-NA pAB291 -NA pAB295-NA pAB297-NA

7 pAB257-M pAB257-M pAB257-M pAB257-M pAB257·M

8 ~AB258-NA 2AB258-NA 2AB258-NA 2AB258-NA 2AB258-NA

Virus recombinante 8 6 + 2 6 + 2 6 + 2 B/Hong

BfYamanashi/166f98 BNictoriaf504/2000 BfHawaii/10/2001 Kongf330/2001

u!pI ml3 O 4 x 105 9 X 105 6 X 105 7 X 105

Se obtienen títulos relativamente elevados mediante replicación de BfYamanashif166J9S de tipo silvestre en huevos. Se llevaron a cabo experimentos para determinar si esta propiedad era un fenotipo inherente de los seis genes "intemos" de este virus. Para evaluar esta propiedad, se comparó el rendimiento de BNictoriaf504/2000 de tipo silvestre, que se replica solo de manera moderada en huevos, con el rendimiento del reorganizante 6+2 que expresaba HA y NA de BNictoriaf504/2000. Se inocularon estos virus además de los de tipo silvestre y BfYamanashif166/98 recombinantes en 3 o 4 huevos de gallina embrionados, bien a 100 o 1000 ufp. Tres días después de la infección, se recogieron los fluidos alantoicos de los huevos y se determinaron los títulos de TCID5Q en

células MDCK. Los reorganizantes 6+2 produjeron cantidades similares de virus en el fluido alantoico de la cepa BNamanashif166f98 wt y recombinante (Fig. 9). La diferencia en título entre BNictoriaf504f2000 y el recombinante 6+2 fue de aproximadamente 1,6 109 10 TelDso (0,7-2,5 10910 TelDsdml, le del 95%). La diferencia entre BNictoria/504f2000 y el recombinante 6+2 se confirmó en tres experimentos separados (P < 0,001). Estos resultados demostraroo que las propiedades de crecimiento en huevo de BlYamanashi/166f98 pueden conferirse a antigenos de HA y NA que se expresan normalmente a partir de cepas que se replican mal en huevos

EJEMPLO 8: BASE MOLECULAR PARA LA ATENUACiÓN DE BfANN ARBOR/1 f66 CA

El virus VDM-B (BfAnn Arborf1f66 ca) está atenuado en seres humanos, muestra un fenotipo atenuado en hurones y muestra un fenotipo adaptado al frío y sensible a la temperatura en cultivo celular. Las secuencias de aminoácidos deducidas de los genes intemos de VDM-B se compararon con las secuencias en la base de datos de gripe de Los Álamos (en la world wide web en: flu.lanl.gov) usando el algoritmo de búsqueda BLAST. Se identificaron ocho aminoácidos únicos para VDM-B y no presentes en cualquier otra cepa (Tabla 17). Los segmentos genómicos que codifican PB1 , BM2, NS1 y NS2 no muestran restos sustituidos de manera única. Las proteinas PA y M1 pueden tener cada una dos, y la proteína NP tiene cuatro aminoácidos únicos sustituidos (Tabla 17). Un resto de aminoácido sustituido se encuentra en PB2 en la posición 630 (una cepa adicional, BfHarbinf7f94 (AD170572) también tiene un resto de arginina en la posición 630)

Estos resultados sugirieron que los segmentos génicos PB2, PA, NP Y M1 pueden estar implicados en el fenotipo atenuado de VDM-B. De un modo análogo a lo descrito anteriormente para VDM-A, el sistema de ocho plásmidos puede utilizarse para generar virus recombinante y reorganizante (sencillo yfo doble, es decir, reorganizantes 7:1; 6:2) de manera independiente de virus auxiliar simplemente mediante la transfección conjunta de los plásmidos relevantes en células cultivadas, tal como se describen anteriormente con respecto a VDM-A. Por ejemplo, pueden usarse los 6 genes internos de BfLeef40 en conjunción con segmentos de HA y NA procedentes de VDM-B para generar reorganizantes 6+2.

Tabla 17 Aminoácidos sustituidos de manera única de BfAnn Arbor/1 f66

N' PB1 PB2 PA NP: ~s. O 1 2 4 ca BfAnn Arbor/1f66 aminoácido codón 630 Arg630 431 Met431 497 His497 55 Ala55 114 Ala114 410 His410 509 Thr509 Secuencias alineadas (virus de tipo silvestre) aminoácido codón AG8 Ser630 8TG Val431 .QAT Tyr497 QCC Thr55 G~G Val114 C.8T Pr0410 G8C Ala509 Número alineadas AG.Q QTG lAT 8CC GlG C.QT, CCC G§C de secuencias 23 23 23 26

M1 BM2 NS1 NS2: 2 O O O 159 183 Gln159 Val183 CA/', QTG His159 M183 CAl 8TG 24 24 80 80

La secuencia de aminoácidos deducida de ocho proteínas de ca BfAnn AIbor se usó en una búsqueda BLAST. Se muestran las posiciones de aminoácidos que fueron diferentes entre VDM-B y las secuencias alineadas Los nucleótidos en los cadones gue están subra~ados re~resentan las ~osiciones sustituidas_

Para determinar si las 8 únicas diferencias de aminoácidos tuvieron cualquier impacto en los fenotipos característicos de VDM-B, se construyó un virus recombinante en el que todas las ocho posiciones de nucleótidos codificaron los aminoácidos que reflejaban el complemento genético de gripe de wt. Se construyó un conjunto de plásmidos en el que los ocho restos de los genes PA, NP, Y M1 estaban cambiados mediante mutagénesis de sitio dirigido para reflejar los aminoácidos de tipo silvestre (tal como se indica en la Tabla 17). Se generÓ un recombinante con los ocho cambios, denominado rec53-VDM-B, mediante cotransfección de los plásmidos construidos en células COS7-MDCK cultivadas conjuntamente. El cultivo conjunto de células MDCK y el crecimiento a 33 "c aseguró que el sobrenadante contuviese títulos virales elevados de seis a siete dias después de la transfecciÓfl. Los sobrenadantes de las células transfectadas se titularon y se determinó el titulo en células MDCK mediante un ensayo de placa y células PCK a 33 ~C y 37 ~C

Tal como se muestra en la Fig. 13, en dos experimentos diferentes independientes, recVDM-B expresó el fenotipo ts en células tanto MDCK como PCK. El virus triple reorganizante rec53 -VDM-B diseñado que portaba los ocho cambios de aminoácidos expresaron el fenotipo no-ts, la diferencia en el titulo entre 33 oC y 37 oc fue de solo 0,7 10g1O en células PCK. Este título fue menor de la diferencia de 2 IOg10 característica de la definición de ts y significativamente menor que la diferencia de -3 laglO observada con recVDM-B. Estos resultados demuestran que la alteración de los ocho aminoácidos en las proteínas PA, NP, Y M1 fue suficiente para generar un virus no-ts similar a tipo silvestre con glucoproteínas tanto homólogas como heterólogas

Entonces se determinó la contribución de cada segmento génico al fenotipo Is. Se generaron recombinantes procedentes de plásmidos que portaban segmentos génicos bien de PA, NP, o M con el complemento de aminoácidos de tipo silvestre mediante la técnica de cotransfección de ADN. Todos los recombinantes de un solo gen mostraron restricción de crecimiento a 37 oC en células MDCK y en células PCK (Fig. 14), indicando que los cambios en ninguno de los segmentos génicos eran capaces de revertir el fenotipo ts. Además, los virus recombinantes que portaban los segmentos génicos NP y M o PA y M juntos también mantuvieron el fenotipo ts. Por el contrario, los virus recombinantes que portaron los segmentos génicos tanto PA como NP tenían una diferencia en el título entre 37 oC y 33 oC de 2,0 log10 o menor, similar a rec53-VDM-B Estos resultados muestran que los genes NP y PA tienen una contribución principal al fenotipo Is

Para determinar si todos los cuatro aminoácidos en la proteína NP y dos en la proteína PA contribuyen a no-ts, se generaron recombinantes de triple gen y doble gen con genes NP y PA alterados (Fig. 15). La sustitución de dos aminoácidos en la proteína NP, A114 --,> V114 Y H410 --,> P410 dieron como resultado un fenotipo no-ts. Los virus con la sustitución H410 __ P410 individual en la nucleoproteína mostraron un fenotipo no-ts en MDCK y PCK. Por otra parte, la sustitución A55 __ T55 individual mostró un fenotipo ts, al igual que lo hizo la sustitución individual en la posición 509. Estos resultados indican que los restos de aminoácido V114 y P410 en NP están implicados en el crecimiento eficaz a 37 oC (Fig. 21A). Se empleó una estrategia similar para diseccionar la contribución de los dos aminoácidos en el gen de PA. Se construyó un conjunto de recombinantes, portando cada uno un segmento génico de NP con cuatro am inoácidos consenso de tipo si lvestre y un gen PA con solo uno de los dos aminoácidos consenso de tipo silvestre. La sustitución H497 __ Y497 siguió siendo ts (Fig. 21B), demostrando que este locus tiene poco impacto en la expresión del fenotipo. Por el contra rio, la sustitución de M431 con V431 dio como resultado una reversión del fenotipo Is. Estos resultados demuestran que los aminoácidos A114 y H410 en NP y M431 en PA son los determinantes principales para la sensibilidad a la temperatura de VD M-B.

Basándose en las pruebas anteriores, un fenotipo ts y un fenotipo atenuado están elevada mente correlacionados Está bien establecido que el virus ca BfAnn Arborf1f66 no es detectable en el tejido pulmonar de hurones infectados, mientras que los virus de la gripe B no atenuados son detectables en los pulmones después de la infección intranasal. Para determinar si una mutación idéntica subyace a los fenotipos Is y att, se llevaron a cabo los siguientes estudios.

Se pasaron virus recombinantes obtenidos después de la transfección en huevos de gallina embrionados para producir una reserva de virus. Se inoculó a hurones de nueve semanas de edad por vía intranasal con 0,5 mi por orificio nasal de virus con títulos de 5,5, 6,0 o 7,0 10g1O ufpfml. Tres días después de la infecciÓf'l se sacrificó a los hurones y se examinaron sus pulmones y cometes nasales, tal como se ha descrito anteriormente.

Se infectó a hurones (cuatro animales en cada grupo) por vía intranasal con recVDM-B o rec53-VDM-B Tres días después de la infección con el virus se extrajeron cometes nasales y tejido pulmonar y se ensayó la existencia de virus. No se detectó virus en los tejidos pulmonares de hurones infectados con 7,0 log1O Ufp de recVDM-B. De los cuatro animales infectados con virus rec53-VDM-B con 7,0 loglo ufp, se detectó virus en el tejido pulmonar de tres animales (en un animal de este grupo por razones desconocidas). En dos de los cuatro tejidos pulmonares de hurones infectados con rec53-VDM-B a una dosis menor (5,5 log ufpfml) pudo aislarse virus del tejido pulmonar. Por lo tanto, el cambio de los ocho aminoácidos únicos en la proteína PA, NP, Y M1 en restos de tipo silvestre fue suficiente para convertir un fenotipo att en un fenotipo no att

Ya que los datos en cultivo celular demostraron que PA y NP son conllibuyentes principales al fenotipo Is, en un segundo experimento, se infectó a los hurones con rec53-VDM-B (PA, NP, M), rec62-VDM-B (PA), NP rec71-VDM-B (NP) con 6 lag ufp. Dos de los cuatro animales infectados con rec53-VDM-B tenían virus en el pulmón. Ninguno de los tejidos pulmonares de los hurones infectados con virus reorganizantes sencillos y dobles tenía niveles detectables de virus. Por lo tanto, además de los aminoácidos en las proteínas PA y NP, la proteína M1 es importante para el fenotipo at!. El virus con PA y NP de wt no se replicó en pulmones de hurones, indicando que un subconjunto de las mutaciones implicadas en la atenuación está implicado en el fenotipo ts

Por lo lanto, los fenotipos ts y att de B/Ann Arbor/1f66 se determinan por al menos tres genes. La conversión de ocho aminoácidos en la proteína PA, NP, Y M1 en restos de tipo silvestre dio como resultado un virus recombinante que se replicaba eficazmente a 37 oC. De manera similar, un virus recombinante 6+2 que representaba los seis genes intemos de VDM-B con los segmentos HA y NA de BfHong Kong/330tol mostró un fenotipo ts y el triple recombinante fue no-Is

Los resultados de los presentes inventores usando la estructura de VDM-B indicaron que los seis aminoácidos fueron suficientes para convertir un fenotipo tsfatt en un fenotipo no-Is/no-att. Por lo tanto, los presentes inventores se interesaron en determinar si la introducción de estos seis restos de "atenuación" podrían transferir estas propiedades biológicas a un virus de la g ripe B heterólogo, no atenuado, tal como BNamanashif166f98. Se proclujeron virus BNamanashi/166f98 recombinante de tipo silvestre (recYam) (7) y un virus recombinante (rec6 -Yam): con seis cambios de aminoácidos PA (V431 __M431, H497 __Y497), NP (V114 __AI14, P410 __ H410), Y M1

(H159---+Q159, M183---+V183). RecYam mostró una reducción en el título de 0,17 laglO a 37 oC en comparación con

33 oC, mientras que rec6Yam fue claramente ts, la diferencia en el titulo viral entre 37 oC y 33 oC fue de 4,6 lag 10. Se recuperó virus de manera eficaz de hurones infectados con recYam, tal como se esperaba para un virus de la gripe B de tipo silvestre típico. Cuando se inocula rec6Yam en hurones, no se detectó virus en los tejidos pulmonares (Tabla 18). Por lo tanto, la transferencia de los locus de ts/att de VDM-B es suficiente para transferir los fenolipos Is y att a un virus divergente

Tabl a 18 E lucf d e a enuacl n en hUfanes

, '0'

Virus componentes Fenotipo ts

Hurones

Dosis Cornetes

Tejido recombinante

de wt3 {log10 nasalesb

pulmonar ufp]

[log10ufpJg]

[log10 EID50/gt rVDM-B

n; <15

Is

401"no

rec53-B no-Is

6,0

NP, PA, M

4,65

3,81 rec62-B

NP, PA no-ts

6,0

4,69

<1 ,5 rec71NP B

NP

Is

6,0

4,13

<1 ,5 rec71M B

<15

M

Is

no-IsRecYam

rec6Yam

Is

6,0

4,02

<1 ,5 Se usaron virus recombinantes con estructura de VDM-B que diferían en los aminoácidos de lipa

silvestre (para detalles, véase la Tabla 2) para hurones infectados por vía intfanasal. RecYam e, BNamanashif166f98 recombinante y Rec6Yam representa un virus que tiene seis ~cambios de aminoácidos de atenuaciÓf'l de VDM-B" en NP, PA, Y M1 con una estructura de BNamanashi. b¡"res dias después de la infección, se determinó el titulo de virus de los cornetes nasales y tejido pulmonar, se muestra el tílulo medio de cuatro hurones infeclados. " <1 ,5 indica que no se detectó virus.

Tal como se describe anteriormente con respecto a las cepas de gripe A, la sustituci6n de los restos indicados anteriormentesW~)Qr ejemplo, PB2630 (S630R); PA431 (V431M); PA497 (Y497H); Np55 (T55A); Np114 (V114A); Np410 (P410H); NP (A509T); M1 159 (H159Q) Y M1 163 (M183V), confiere los fenotipos ts y atto Por consiguiente, las variantes de cepa de gripe B diseñadas por ingeniería genética de manera artificial que tenían uno o más de estas sustituciones de aminoácidos muestran los fenotipos ts y att y son adecuadas para su uso, por ejemplo, como virus de cepa donante maestra, en la producción de vacunas de virus de la gripe vivas atenuadas

EJEMPLO 9· RESCATE DE VIRUS DE GRIPE A PARTIR DE OCHO PLÁSMIDOS MEDIANTE ELECTROPORACIÓN DE CéLULAS VERO

Se ha sugerido previamente que puede recuperarse virus de la gripe A recombinante de células Vera (Fodor et al. (1999) Rescue of influenza A virus from recombinant DNA J. Viral. 73:9679-82; Hoffmann el al. (2002) Eighl-plasmid system for rapid generation of influenza virus vaccine 20:3165-3170). El método comunicado requiere del uso de reactivos lipidicos y solo se ha documentado para una sola cepa de una cepa de virus de la gripe A de laboratorio elevadamente competente para replicación (AlWSN/33 y AlPRl8f34), haciendo que sea de aplicación limitada en la producción de virus vivo atenuado adecuado para la producción de vacunas. En el presente documento se describe un nuevo método para recuperar virus de la gripe recombinante de células Vero usando electroporación. Estos métodos son adecuados para la producción de virus de cepas tanto de gripe A como de gripe B, y permiten la recuperación de, por ejemplo, virus adaptados al fria, sensibles a la temperatura y atenuados a partir de células Vera crecidas en condiciones sin suero, facilitando la preparación de vacuna viva atenuada adecuada para su administración en, por ejemplo, formulaciones de vacuna intranasa!. Además de su amplia aplicabilidad entre cepas de virus, la electroporación no requiere de reaclivos adicionales distintos de medio de crecimiento para el sustrato celular y por lo tanto tiene un potencial menor para contaminantes no deseados. En particular, este método es eficaz para generar virus recombinantes y reorganizantes usando células Vera adaptadas a crecimiento en condiciones sin suero, tales como aislados de células Vera certificados como libres de patógenos para la producción de vacunas. Esta característica apoya la elección de la electroporación como método adecuado para la introducción comercial de ADN en sustratos celulares

Se comparó la electroporación con una diversidad de métodos para la introducción de ADN en células Vera, incluyendo transfección usando numerosos reactivos basados en lipidos, precipitación por fosfato de calcio y microinyección celular. Aunque se ha obtenido cierto éxito usando reactivos basados en virus para el rescate de gripe A, solo la electroporacián demostró rescatar gripe B asi como gripe A de células Vera

Un dia antes de la electroporación, se separaron las células Vera confluentes al 90 -100%, Y se sembraron a una densidad de 9 x 106 células por matraz T225 en MEM suplementado con penfestrep, L-glutamina, aminoácidos no esenciales y FBS a110% (MEM, FBS al 10%). Al día siguiente, se lripsinizaron las células y se resuspendieron en 50 mi de suera salino tampanado con fosfato (PBS) por matraz T225. Entonces se precipitan las células y se resuspenden en 0,5 mi de OptiMEM I por matraz T225. Opcionalmente, puede usarse medio OptiMEM a medida que no contiene componentes de procedencia humana o animal. Después de la determinación de la densidad celular,

por ejemplo, contando una disolución 1:40 en un hemocitómetro, se añadieron 5 x 106 células a una cubeta de electroporación de 0,4 cm en un volumen final de 400 ~I de OptiMEM 1. Se añadieron entonces veinte I-Ig de ADN que consistía en una mezcla equimolar de ocho plásmidos que incorporaban el genoma de VDM-A o VDM-B en un volumen de no más de 25 1-11 a las células en la cubeta. Las células se mezdaron mediante golpecitos suaves y se electroporaron a 300 voltios, 950 microfaradios en un Gene Pulser 11 de BioRad equipado con un dispositivo Capacitance Extender Plus (BioRad, Hercules, CA). La constante de tiempo debe encontrarse en el intervalo de 28 33 milisegundos

Los contenidos de la cubeta se mezclaron mediante golpecitos suaves y después de 1-2 min de la electroporación, se añadieron O,lml de MEM, FBS al 10% con una pipeta de 1 mI. Se mezclaron de nuevo las células pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo unas cuantas veces y se separaron entre dos pocillos de una placa de 6 pocillos que contenía 2 mi de MEM por pocillo, FBS al 10%. Después se lavó la cubeta con 1 mi de MEM, FBS al 10% y se separó entre los dos pocillos hasta un volumen final de aproximadamente 3,5 mi por pocillo.

En experimentos altemativos, se electroporaron células Vero adaptadas a condiciones de crecimiento sin suero, por ejemplo, en OptiPro (SFM) (Invitrogen, Carlsbad, CA) ta l como se describe anteriormente, salvo que después de la electroporación en OptiMEM 1, las células se diluyeron en OptiPro (SFM) en el que se cultivaron posteriormente para el rescate del virus

Las células electroporadas se crecieron entonces en condiciones adecuadas para la replicación y recuperación del virus introducido, es decir, a 33 OC para las cepas donantes maestras adaptadas al frío. Al día siguiente (por ejemplo, aproximadamente 19 horas después de la electroporación), se retiró el medio y las células se lavaron con 3 mi por pocillo de OptiMEM I u OptiPro (SFM). Se añadió a cada pocillo un mi de OptiMEM t u OptiPro (SFM) por pocillo que contenía penfestrep, y se recogieron a diario los sobrenadantes reemplazando el medio. Los sobrenadantes se almacenaron a -80 oC en SPG Se observó un pico de producción de virus típicamente entre 2 y 3 días después de la electroporación.

Tabla 19: Resultados del rescate de 8 plásmidos de cepas VDM en diferentes tipos celulares y mediante diferentes métodos de transfección Sustrato Método N°de ensayo Resultado (virus infeccioso

recu~rado~

VDM-B

COS-7fMDCK: Lipo 3 positivo

COS-7fMDCK: CaP04 2 positivo

MRC-5: Lipo 5 negativo

MRC-5: CaP04 3 negativo

MRC-5: Electroporación 2 negativo

WI-38: Lipo 2 negativo

WI-38: Electroporación 4 negativo

WI-38: Microinyección 1 negativo

LF1043: Lipo 1 negativo

LF1043: CaP04 2 negativo

Vero: Lipo 7 negativo

Vero: CaP04 2 negativo

VerofMDCK: Lipo 1 negativo

Vero (suero): Electroporación 5 positivo (5f5)

Vero (sin suero): Electroporación 4 positivo (4f4)

VDM-A

Vero (suero): Electroporación 3 positivo (3f3)

Vero (sin suero): Electrof'oración 3 ~siti vo (3f3)

EJEMPLO 10: SISTEMA DE VECTOR DE VIRUS DE LA GRIPE PARA ADMINISTRACiÓN GENICA

Los vectores descritos en el presente documento también pueden usarse como sistemas de administración génica y para terapia génica. Para dichas aplicaciones, es deseable generar virus de la gripe recombinante, por ejemplo, virus de la gripe A o B recombinante que expresa una proteína exógena. Por ejemplo, debido a que el segmento 7 del virus de la gripe B no se corta y empalma, proporciona un elemento genético conveniente para la inserción de secuencias de ácido nucleico heterólogas. El ARNm contiene dos cistrones con dos fases abiertas de lectura que codifican las proteínas Ml y BM2. La fase abierta de lectura de BM2 o Ml se sustituye por la secuencia heteróloga de interés, por ejemplo, un gen que codifica la proteína verde fluorescente potenciada (EGFP). Mediante el uso del sistema de vector basado en plásmido descrito en el presente documento, se clona el ADNc que codifica la fase abierta de lectura de M1 -EGFP y BM2 en dos plásmidos diferentes. La fase abierta de lectura está flanqueada por la región no codificante del segmento 7, que contiene las señales necesarias para la replicación y transcripción. Como alternativa, se construyen dos plásmidos: uno que contiene la ORF de M1 y el otro que contiene EGFP-BM2. La cotransfección de los nueve plásmidos resultantes da como resultado la generación de un virus de la gripe B recombinante que contiene la secuencia génica heteróloga De manera similar, puede expresarse EGFP a partir del segmento NS 1 de la gripe A

El virus de la gripe B ~verde~ ejemplar puede usarse para la estandarización en ensayos de virus, tales como ensayos de micro neutralización. La combinación de la tecnología basada en plásmidos y la detección sencilla de expresión de proteínas (la nUOfescencia procedente de EGFP puede controlarse mediante microscopía, tal como se ilustra en la Figura 2), permite la optimización de la expresión de proteínas

EJEMPLO 11 : ESTUDIOS GENÉTICOS DE CEPAS DE VACUNA DE LA GRIPE H3N2 RECIENTES

La cepa viva atenuada adaptada al frío de la gripe, NAPJ6160 , en ejemplos típicos preferidos, es el virus donante maestro (VDM-A) para las vacunas de la gripe A FluMist™ Los 6 genes intemos de VDM-A confieren los fenotipos de adaptación al frío (ca), sensibilidad a la temperatura (ts) y atenuación (alt) para cada una de las cepas de vacuna Usando genética inversa, se demuestra que múltiples aminoácidos segregados entre tres segmentos génicos: PB1K391E, E581G, A661T, PB2-N265S, Y NP-D34G que controlan la expresión de los fenotipos ts y aft de VDM-A. El rescate de plásmido de cepas de vacuna 6:2 permite una generación más eficaz de vacunas de la gripe que las técnicas reorganizantes clásicas.

Las vacunas de la gripe inactivadas para la temporada 2003-04 cootenían el antígeno de NPanamal99 (H3N2) y fueroo incapaces de provocar respuestas de anticuerpo robustas en niños seronegativos para las cepas H3N2 derivadas similares a NFujianl411102 que circularon durante esa temporada. Véanse las Figuras 22 y 23 Desafortunadamente, NFujianl411102 no se replicó bien en huevos embrionados y, por lo tanto, prohibió su uso para la fabricación de vacunas. Usando la tecnología de genética inversa, los presentes inventores demostraron que la pérdida en el equilibrio en las actividades de HA y NA fue responsable de la pobre replicación de la cepa prototipo NFujianl411102 en huevos. Véanse las Figuras 29 a 34. El virus N Fujian pudo obtener su eficiente replicación en huevos bien aumentando su actividad de HA o reduciendo su actividad de NA. Específicamente, los presentes inventores demostraron que mientras que varias sustituciones de aminoácidos individuales fueron capaces de potenciar ligeramente la replicación de la cepa NFujianl411102 en huevos, varias combinaciones proporcionaron una potenciación mucho más robusta. Véanse las Figuras 35 a 38. El presente estudio ha demostrado que es factible mejorar el crecimiento del virus de la gripe en huevos de gallina embrionados y/o células hospedadoras introduciendo cambios específicos en los genes de HA y NA sin afectar a la antigenicidad del virus

Para producir una cepa viable en huevos, se evaluó un conjunto de reorganizantes 6:2 de H3N2 del linaje NFujianl411102 respecto de su replicación en células MDCK, huevos embrionados y hurones Aunque NFujianl411/02 no creció en huevos, una adaptación a huevo de este virus dio como resultado dos sustituciones de aminoácidos en HA, H 183L Y V226A que permitió el crecimiento de virus en huevos embrionados. Además, se compararon en su secuencia una cepa adaptada a huevo ANJyoming/03/2003 que crecía bien en huevos y hurones y la vacuna de NSendai/H-F4962f02 que crecía bien en huevos, pero que no se replicó bien en hurones. Se determinó que G186V y V2261 en HA, ylo Q119E y K136Q en NA eran necesarios para una replicación eficaz de virus in vitro e in vivo. Sin embargo, estos cambios de aminoácidos no tuvieron efecto en la antigenicidad del virus Se contempla y espera la adopción de dichas técnicas para producir cepas capaces del crecimiento en huevos (para cepas que son difíciles/problemáticas para su crecimiento en huevos) o para producir cepas más capaces de crecimiento en huevos (para cepas que ya pueden crecer en huevos) para otros virus de la gripe.

Se estudió la base molecular para la deriva antigénica de cepas NPanamal99 a cepas similares a NFujian/02 cambiando grupos de restos de HA de NPanamaf99 a aquellos de ANJyomingl03. Véase la Figura 24. Se examinó la antigenicidad de los reorganizantes 6:2 modificados mediante ensayos de HAI y de microneutralización usando sueros de hurón de animales inmunizados coo NPanama/99 o ANJyomingl03. Véanse las Figuras 25 a 28. Se determinó que solo unos pocos cambios eran respoosables de la deriva antigénica mientras que otros tuvieron un impacto más dramático en la replicación del virus. Por lo tanto, tal como indican los datos, se usa opcionalmente genética inversa para modificar cepas de vacuna para modificar los rendimientos de vacuna sin afectar a la antigenicidad del virus

Materiales y métodos

Cepas virales células y anticuerpos~ Las cepas de tipo silvestre (wt) de la gripe A, AfFujianl411102 (N Fujian), NSendai H/F4962f02 (NSendai) y ANJyoming/03/03 (AlWyoming), se obtuvieron del Centro para el Control de Enfermedades (Center for Disease Control) (Atlanta, GA) y se amplificaron una vez en células MDCK o en huevos de pollo embrionados (huevos). La cepa Ankara del virus vaccinia modificado que expresaba T7 ARN polimerasa de bacteriófago (MVA-T7) se creció en células CEK. Se mantuvieron células HEp-2, COS-7 y MDCK (obtenidas a través de la Colección Americana de Cultivos Tipo (American Type Culture Collections), ATCC) en medio esencial mínimo (MEM) que contenía suero fetal bovino (FBS) al 5%. Se produjeron en pollos antisueros policlonales contra NArm Arbor/6160, NSendai-H/F4962/02 y AlWyoming/03l03. Se obtuvieron anticuerpos mooodonales contra la proteína NP de gripe A a través de BioDesign (Saco, MI). Generación de reoraanizantes 6~2 recombinantes~ Se generaron reorganizantes 6:2 recombinantes que contenían los segmentos de ARN de HA y NA de las cepas H3N2 reorganizados en VDM-A de acuerdo con los procedimientos descritos anteriormente. En resumen, se transfectó un conjunto de seis plásmidos que contenían los genes internos de VOM-A junto con los plásmidos de expresión de HA y NA en células COS·7/MOCK cultivadas conjuntamente usando reactivos TranslT L T1 (Mi rus, Madison, WI). El sobrenadante de cultivo celular transfectado se recogió a los 3 días después de la transfección y se usó para infectar células MDCK nuevas y huevos de gallina embrionados de 10 días de edad. Las células MOCK infectadas se incubaron a 33QC hasta que el 80-90% de las células mostraron efecto citopático. Los huevos de gallina embrionados se incubaron a 33QC durante tres días y se recogieron los fluidos alantoicos y se almacenaron a -80"C en presencia del estabilizante SPG (sacarosa 0,2 M, KHzP04 3,8 mM, K2HP04 7,2 mM, glutamato monosódico 5,4 mM). Se detenninó el título de virus mediante ensayo de placa en células MOCK incubadas bajo un revestimiento que consistía en L15/MEM 1x, agarosa a11% y TPCK-tripsina 1 ~g/ml a 33"C durante 3 días. Las placas se enumeraron mediante inmunotinción usando anticuerpos policlonales anti-VDM-A

Clonación de plásmidos de expresión de HA y NA: Para producir virus reorganizantes 6:2 recombinantes que contengan segmentos de HA y NA de subtipo H3N2 y los seis segmentos de ARN intemos de VOM-A, y los ADNc de HA y NA de NSendai-H/F4962/02 y A.lWyoming/03f03 de wt se amplificaron mediante RT-PCR usando transcriptasa inversa Superscriptlll (Invitrogen, Carlsbad, CA) y ufp AON polimerasa (Stratagene, La Jolla, CA), el ARNv extraído como molde y los cebadores específicos de H3 y N2. Se usaron los cebadores HA-Aar15 (5'cacttatattcacctgcctcagggagcaaaagcagggg3' SEC ID N°: 90) y HA-Aar13 (5'cctaacatatcacctgcctcgtattagtagaaacaagggtgtt3' SEC ID N°· 91) para amplificar el segmento de HA. Se usaron los cebadores N2-Aar15 (5'cacllatattcacctgcctcagggagcaaaagcaggagt3' SEC ID N°: 92) and N2-Aar13 (5'cctaacatatcacctgcctcgtattagtagaaacaaggagllt3' SEC ID N°· 93) para amplificar el segmento de NA. Los pares de cebadores de HA y NA contenían el sitio de restricción de Aar I que se había diseñado para que fuese comparable al sitio de BsmB I presente en el plásmido de expresión de poi tlpol 11 de pA03000. Se secuenciaron los clones de AONc de HA y NA Y se compararon con las secuencias consenso de HA y NA que se obtuvieron mediante secuenciación directa de los productos de AONc de HA y NA amplificados mediante RT-PCR. Cualquier mutaciórJ introducida en los clones de AONc durante el proceso de clonación se corrigió mediante el kit de mutagénesis de sitio dirigido QuickChange (Stratagene, La Jolla, CA).

Ensayo HAI (ensayo de inhibición de la hemaglutinacián para el virus de la gripe)· Reactivos: cRBC al 0,5% (lavado tres veces con PBS, puede usarse en 2-3 días); microplaca de 96 pocillos de fondo en U; PBS (sin Ca y Mg); Puntas; Virus de la gripe; Muestras de suero y suero de control positivo de preparaciones de título alto y bajo: Se determinó el título de HA mediante un ensayo de HA (se usó el título de virus a 1:8 para HA!. Si el título de HA de un virus dado era de 1 :256, se dividía entre 8. Por lo tanto, se necesitaba diluir el virus a 1 :32. Se prepararon 2,5 mi de virus para cada placa de 96 pocillos); El suero se trató opcionalmente con ROE (enzima destructora de receptor) para las muestras de hurones; Se preparó la ROE según las instrucciones del fabricante; Se combinaron ROE y muestras de suero a una dilución 1:4. Por ejemplo, se añaden 100 ¡.JI de suero a 300 ¡.JI de ROE. Se agitó vorticialmente la mezcla y se incubó durante toda la noche (18-20 h) en una incubadora a 37 "C. Se calentó la mezcla a 56 QC durante 45-50 mino Se exploró el suero respecto de aglutininas no específicas; Se mezclaron 25 ¡.JI de suero tratado con ROE con 25 ¡.JI de PBS pipeteando hacia arriba y hacia abajo 3 veces; Se añadieron 50 ¡.JI de cRBC al 0,5% a la mezcla y al pocillo de control solo con PBS; Se incubó a TA durante 30-45 min (+: indica la hemagtutinación no específica parcial o completa; -: indica que no hay hemaglutinación); Las aglutininas de cRBC no específicas pueden eliminarse mediante preincubación del suero con RBC empaquetada a una proporción de 20:1 a 4 "c durante 1 h, seguido de centrifugación a 2000 rpm durante 10 min a 4 "C. Los controles pueden incluir típicamente lo siguiente: control celular de cRBC; Retrolitulación de virus: dilución de 2 veces de 8 unidades/50 ¡.JI diluido desde 1:2 a 1 :32 para asegurar que el virus usado se encuentra a las concentraciones correctas; Control de suero positivo: se diluye en serie 2 veces suero de título conocido junto con las muestras de suero de ensayo. Un protocolo de HAI típico puede comprender: Dilución en serie de las muestras de suero dos veces; Se añaden 25 ¡JI de PBS a cada pocillo; Se añaden 25 ¡JI de virus al pocillo 1A (por ejemplo, 1 :2), se mezcla pipeteando hacia arriba y hacia abajo 3 x; Se transfieren 25 ¡.JI del pocillo A al pocitlo B (por ejemplo, 1 :4) y se mezcla 3x como anteriormente, se repite la dilución hasta el pocillo H (por ejemplo, 1 :256); Se añaden 25 ¡JI de virus (8 unidades/50 ¡JI) a muestras de suero diluidas, se mezcla hacia arriba y hacia abajo 3x y se incuba a TA durante 30-40 min; Se añaden 50 ¡.JI de cRBC al 0,5%, se mezcla bien pipeteando hacia arriba y hacia abajo 3x; Se incuba a TA durante 30-45 min; Se registra la hemaglutinación. El título de hAI se define como la dilución más alta del suero que inhibe completamente la hemaglutinación. Si no se observa inhibición, el título es <1:4. Si todos los pocillos muestran inhibición, el título es > 1:256

Medida de la actividad de neuraminidasa de la proteína NA expresada transitoriamente· Para medir la actividad de neuraminidasa de las proteínas NA, se expresaron NA de wt y sus derivados modificados a partir de las células transfectadas por plásmidos. Para obtener un alto nivel de expresión de las proteínas NA, se transcribió el ARN de NA a partir de los promotores de TI y CMV ya que el gen estaba insertado cadena abajo de estos promotores duales. Se infectaron células HEp-2 en placas de 10 cm con MVA-Tl a una moi de 5,0 durante 1 h seguido de transfección de 5 ¡Jg del plásmido de NA usando reactivo lipofectamina 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA). Las células transfectadas se incubaron a 35"C durante 48 h. Después de lavar con suero salino tamponado con fosfato (PBS), se rascaron las células a partir de las placas y se lisaron en 100 ¡.JI de NaOAc 0,125 M, pH 5,0. La actividad de neuraminidasa en las células transfectadas se determinó mediante un ensayo fluorimétrico. Después de un ciclo de congelación-descongelación, se diluyeron en serie 50 ¡.JI de lisados celulares 2 veces y se incubaron con 150 ¡JI de 1,2 mM de sustrato de ácido 2'-(4-metilumbeliferil)--a-0 -N-acetilneurámico (MU-NANA) (Sigma, San Luis, MO) a 37"C durante 1 h Y se detuvo con 75 ¡JI de glicina 1,0 M (pH 5,5). El nivel de fluorescencia del cromóforo 4

3S

melilumbeliferona liberado se determinó a 362 nm en un lector de placa SpectroMAX. El nivel de cada proteína NA expresado en las células transfectadas se controló mediante transferencia de Western usando anticuerpos de pollo anti-NWyoming, También se midieron las actividades de neuraminidasa de los virus NSendai y NWyoming de wt que contenían 6,0 log1 0 UFP en 1 00 ~I mediante el ensayo flurimétrico

Unión a receotor y reolicación de recombinantes 6:2 en células MOCK.-Se determinaron la unión a receptor de HA y la cinética de crecimiento de reorganizantes 6:2 recombinantes en células MDCK. Se infectaron células MDCK en placas de seis pocillos con NFujian, NSendai, AlWyoming 6:2 y dos virus recombinantes modificados a una moi de 1,0. Después de 30 min de adsorción bien a 33"C o 4"C, las células infectadas bien se lavaron tres veces con PBS,

o se recubrieron directamente con 3 mi de OptiMEM I que contenía 1 ¡Jglml de tripsina-TPCK y se incubaron a 33"C Se fijó un conjunto de las placas infectadas con paraformaldehído al 1% a las 6 h después de la infección durante 15min a temperatura ambiente, y se permeabilizaron con Trilon X-100 al 0,2% en PBS durante 15 min seguido de análisis de inmunofluorescencia usando anticuerpos monoclonales anti-NP. Las imágenes celulares capturadas con la cámara digital ORCA-100 mediante el programa informático de análisis de captura de imágenes y de intensidad dinámica Compix, Versión 5,3 (Crabberry Township, PA) para calcular el porcentaje de las células infectadas. Se incubó otro conjunto de placas a 33"C. En varios instantes de intervalos, se recogieron 250 ¡JI de sobrenadante de cultivo y se almacenaron a -80"C en presencia de SPG antes de la titulación del virus. Después de retirar cada alícuota, se añadió a las células una cantidad igual de medio reciente El título de virus en estas alícuotas se determinó mediante ensayo de placa en células MDCK a 33"C.

Para determinar si la diferencia de unión entre estos virus afectó a la cinética de crecimiento de virus en células MDCK, se incubaron las células MDCK infectadas a 33"C y se recogieron los sobrenadantes de cultivo en varios instantes para la titulación del virus. Cuando se adsorbió a 33"C, A/Fujian 6:2 tenía una cinética de crecimiento menor y un titulo más bajo (Fig. 2), A/Sendai, A/Fujian 6:2 con HA-V1861226 o HA-L183A226 se comportaron de manera similar a AlWyoming 6:2. Cuando se efectuó la adsorción a 4"C, A/Fujian 6:2 así como A/Sendai 6:2 tenían cinéticas de crecimiento más lentas. ANJyoming 6:2 y las dos variantes de A/Fujian crecieron de manera similar. Estos resultados fueron coherentes con el ensayo de unión de virus mientras que la etapa de lavado redujo la infección eficaz de A/Fujian a ambas temperaturas

Antigenicidad de virus recombinantes 6:2: Se analizó la antigenicidad de cada virus mediante ensayo de inhibición de hemaglutinina (HAI) usando sueros de hurón anti-A/Sendai y anti-AlWyoming. Se incubaron alícuotas de 25 ¡JI de antisueros de hurones diluidos en serie 2 veces con 2S ¡JI de virus que contenía 4 unidades de HA de virus reorganizantes 6:2 a 37"C durante 1 h seguido de incubación con 50 ~I de glóbulos rojos de pavo al 0,5% (RBC) a 25"C durante 45 min Se definió el tílu lo de HAI como la reciproca de la dilución mayor de suero que inhibió la hemaglutinación.

Generación de cepas de vacuna de A/Fujian A/Sendai y AlWyoming 6:2

Las cepas de virus de la gripe A de tipo silvestre (wI), A/Fujian/411 /02, AlSendai-H/F4962/02 y AlWyoming/03/03 se obtuvieron del Center for Disease Control (Atlanta, GA) y se amplificaron una vez en células MDCK o en huevos de pollo embrionados. Tal como se indica en la Tabla 20, se pasó A/Fujian solo tres veces en cultivo celular, mientras que AlSendai y ANJyoming se sometieron a 11 pases en huevos. Las secuencias de HA y NA de estas tres cepas se determinaron mediante secuenciación de los productos de RT-PCR usando ARNv extraído de estos virus. En la Tabla 1 se lista la diferencia en la secuencia de HA y NA de estas tres cepas de H3N2. A/Sendai fue idéntica a A/Fujian en su secuencia de aminoácidos de HA1 , pero difirió en la secuencia de NA en tres posiciones de aminoácidos, 119, 146 Y 347. AlWyoming tenía la secuencia de NA idéntica a la de A/Fujian, pero difirió de la de A/Fujian y A/Sendai en HA1 en cuatro aminoácidos. Además, tanto A/Sendai como AlWyoming tenían Glu-150 en lugar de Gly-150 en HA2. Después de un ciclo de amplificación en células MDCK, el resto 183 en HA1 de A/Fujian de wt mutó de His-183 a Leu-183 y fue difícil aislar al virus AlFujian de wI con His-183, indicando que el virus con His-183 tenía una ventaja de crecimiento in vitro.

Estos tres virus de wt crecieron de manera diferente en células MDCK, alcanzando títulos de 6,1, 8,1 Y 6,7 IOg 10 UFPfml para A/Fujian de wI, A/Sendai de wt y AlWyoming de wt, respectivamente. A/Fujian de wt se replicó mal en huevos, alcanzando un título de 4,1 10g lO UFPfml (Tabla 20). El virus aislado en huevos tenía el cambio H183L en HA. Por el contrario, A/Sendai de wt y ANJyoming de wt crecieron bien en huevos, teniendo títulos de 9,0 y 8,9 loglO UFPfml, respectivamente.

Para confirmar que los segmentos HA y NA de estas cepas de H3N2 controlaban la replicación del virus en huevos y células, se reorganizaron los segmentos génicos de HA y NA con los segmentos génicos intemos de la cepa adaptada al frío AtAnn Arborf6/60 , el virus donante maestro para las vacunas de la gripe vivas atenuadas FluMist (VD M-A) para generar tres virus reorganizantes 6:2. La replicación de estos tres virus se evaluó en células MDCK y en huevos de gallina embrionados. AlFujian 6:2 (6,2 10gloUFP/ml) mostró un tílulo más bajo que A/Sendai 6:2 (7,1 10glOUFP/ml) y ANJyoming (7,0 log10UFP/ml) en células MDCK. De manera similar a A/Fujian de wt, A/Fujian 6:2 se replicó mal en huevos de gallina embrionados con un título de 4,1 logloUFP/ml. Tanto A/Sendai 6:2 como ANJyoming se replicaron a títulos mayores de 8,7 y 8,1 log lOUFP/ml, respectivamente. Por lo tanto, la transferencia de los segmentos génicos de HA y NA de wI en VDM -A no cambió la capacidad de cada virus para replicarse en huevos.

Tabla 20 Comparación de cepas wt y 6:2 recombinantes similares a AlFujianf411f02 en secuencia de HA y NAy su

replicación en células MDCK y huevos,

Cepas virales: Posiciones de aminoácidos

HA1: HA2 NA

128: 186 219 226 150 119 136 347

AlFujianf411f02(1): T G S V G E O H

(C1IC2)

AlSendai-HfF4962/02: E O K Y

(CxE8fE3)

.tvWyomingf03f03: A V Y/F E

(ck2E2fE9)

Cepas virales: T ítu lo viral (log10UFPfml ± DTt)

(H istorial de pases): MDCK Huevos

AlFujianf411/0i1): wt 6,1 ± 0,3 6:2 6,2 ± 0, 3(~) wt 6:2 4,1 ± 0,6 4 ,2 ± 0,5

(C1fC2)

AlSendai-HfF4962/02: B,1 ± 0,2 7,1±0,1 9,0 ± 0,3 B,7 ± 0,2

(CxE8fE3)

.tvWyomingf03f03: 6,7 ± 0,5 7,0 ± 0,4 8,9 ± 0,3 8 ,1 ± 0,1

~Ck2E2fE9)

5 Efecto de cambios de aminoácidos en las actividades de neuraminidasa de NA y replicación de virus

AlFujian difirió de AlSendai en tres aminoácidos en NA, E1190, 0136K y H347Y (Tabla 20), se baraja la hipótesis de que uno o más de estos cambios permitió que AlSendai se replicase en huevos de gallina embrionados a un titulo mayor que AlFujian. Las sustituciones de E119 por restos de G, D, A o V se han comunicada para varias cepas 10 resistentes a fármacos anti-neuraminidasa que dieron como resultado actividad de neuraminidasa reducida. Para determinar si el cambio E119Q o cualquiera de los otros dos en NA tenían un efecto en la actividad de NA de AlFujian y en su capacidad para replicarse en huevos de gallina embrionados, se introdujeron mutaciones por sustitución individuales y dobles en plásmidos de expresión de NA de AlFujian y se midió la actividad de NA en las células HEp-2 transfectadas. Además, los virus recombinantes 6:2 que portaban mutaciones en el NA de NFujian se 15 recuperaron también y se comparó su crecimiento en células MDCK y huevos (Tabla 21). AfFujian (E1190136H147) tenía una actividad de NA mayor en aproximadamente un BO% en comparación con la de AfSendai (0119K136Y147). La mutaciórJ individual 0119 tenía un 66% de actividad de NA, el cambio Y347 tenía un efecto mínimo en la actividad de NA pero K136 tenia solo un 25% de actividad. Las mutaciones dobles, K136Y347, 0119Y347, Y 0119K136 tenían actividad de NA reducida a niveles del 29%, 52% Y 25% de la de AfFujian,

20 respectivamente. Estos datos indicaron que estos tres restos de NA afectaron a la actividad de NA en el orden de K136>0119>Y347.

Se examinó esta correlación de la actividad de NA de los mutantes de NA con replicación del virus en huevos de gallina embrionados (Tabla 21). Se demostró que los seis virus modificados se replicaban bien en células MDCK 25 alcanzando títulos en el intervalo de 6,2 a 6,9 log10UFPfml, pero se replicaron de manera significativamente diferente en huevos. FJ-0119 y FJ-347 que tenían una actividad de NA del 66% y 99% de AfFujian fueroo incapaces de crecer en huevos. FJ-K136, con una actividad de NA del 25%, fue capaz de crecer hasta un título de 4,8 loglOUFPfml en huevos, pero a 4,0 loglO menor que la de AfSendai (B ,8 loglOUFP/ml). Inesperadamente, aunque K136Y347 redujo de manera significativa la actividad de NA in vitre, el virus recombinante que portaba estas dos mutaciooes 30 (FJ-K136T347) no fue capaz de replicarse en huevos de gallina embrionados. 0119Y347, que tenía un 52% de actividad de NA, se replicó en huevos hasta un título de 4,5 logloufpfml. 0119K136, que tenía una actividad de NA ligeramente mayor que la de AfSendai se replicó hasta un título de 6,2 logloufplml pero seguía siendo 2,6 log10 menor que la de AlSendaL Estos resultados indicaron que cada uno de los tres restos de NA que difirieron entre AfFujian y AfSendai impactaron de manera diferente en la replicación del virus. Aunque varias mutaciones de NA

35 pudieron reducir la actividad de NA a un nivel próximo al de AfSendai, solamente los cambios 0136K y E119Q pudieron dar como resultado una mejora significativa en la replicación del virus en huevos de gallina embriooados. Ya que los dobles mutantes de 0119K136 no se replicaron de manera tan eficiente como el virus AfSendai en huevos, el resto Y347 también podría afectar a la replicación del virus en huevos

Tabla 21. Efectos de restos de NA en la replicación del virus en células MDCKX huevos embrionados.

NA: Restos de NA Actividad de NA(1) Titulo de VlruS( (Log\oUFP/ml)

119: 136 347 (Media ± DT) MDCK Huevos

NFujian: E a H 100 6 ,5 <1,5

FJ-Q119: Q 66±3 6 ,7 <1 ,5

FJ·Y347: Y 99 ± 1 6 ,6 <1,5

FJ·K136: K 25 ± 1 6 ,6 4,8

FJ·K136Y347: K Y 29±3 6 ,5 <1 ,5

FJ-Q119Y347: Q Y 52 ± 4 6 ,6 4,5

FJ-Ql19K136: Q K 25 ± 1 6 ,2 6,2

NSENDAI: Q K Y 21 + 1 6 ,9 8,8

(1): Las actividades de NA en células HEp 2 transfectadas con ADNc de NA se expresaron como el porcentaje del de N Fujian (media ± error estándar) a partir de cuatro experimentos independientes.

(2): Se generaron virus recombinantes 6:2 usando HA y NA de NFujian o NA de NFujian con las mutaciones indicadas

Efectos de restos de HA en la replicación del virus

Los cambios de los cuatro restos de HAlen AllNyoming/03/03 que diferian de NFujian se investigaron respecto de sus papeles en la replicación del virus. Las mutaciones por sustitución individuales y múltiples se introdujeron en ADNc de HA de NFujian y se introdujeron los plásmidos de HA en VDM-A junto con NA de NFujian. Todos los virus mutantes reorganizantes 6:2 se replicaron bien en células MDCK pero crecieron de manera diferente en huevos de gallina embrionados (Tabla 33). Los reorganizantes 6:2 con HA de N Fujian (T128G186S219V226) fueron incapaces de replicarse en huevos. Un cambio individual de T128A no mejoró el crecimiento de virus en huevos. Sin embargo, el cambio individual G186V o V2261 dio como resultado un aumento en la replicación del virus en huevos. Los cambios dobles de G186V y V2261 en HA se replicaron eficazmente en huevos. Las sustituciones adicionales en los restos 128 ylo 219 no aumentaron significativamente la replicación del virus. Por lo tanto, un mínimo de dos cambios G186V y V2261 permitieron que AlFujian 6:2 creciese eficazmente en huevos de gallina embrionados.

TABLA 22. EFECTOS DE RESTOS DE HA EN LA REPLICACiÓN DE VIRUS EN HUEVOS EMBRIONADOS

Virus(l): Reslos de HA Titulo de virus en

huevos

128: 186 219 226 (log lOUFPlml)

AlFujian: T G S V <1,5

HA-A128: A <1 ,5

HA-V186: V 4,9

HA-1226: 5,2

HA-V1861226: V 7,6

HA-V186Y21 91226: V Y 7,5

AIIN~omi n9: A V Y 7,3

(i) El virus recuperado de la, célu las transfectadas contenía NAyHAde NFujian con los cambios de aminoácidos indicados

Adaptación de NFujian/411 102 6:2

Para determinar si la cepa NFujian 6:2 podia adaptarse al crecimiento en huevos de gallina embrionados, se amplificó el virus en células MDCK seguido de su pase en huevos (Tabla 23). Cuando se inocularon 3,0 10g 1OUFP de virus en un huevo, se detectó menos de 2,0 10gloUFP/ml de virus en el Huido alantoico recogido. No pudieron recuperarse virus infecciosos después de los pases de este material. Durante el segundo experimento de pase, se aumentó la cantidad de virus inoculado en huevos de gallina embrionados hasta 5,9 log,o UFP. Se detectó un título de 3,9 loglOUFP/ml en el Huido alantoico recogido (FJ-EP1) y un pase adicional en huevos aumentó el titulo de virus hasta 6,2 log\oUFP/ml (FJ-EP2). Un pase adicional en huevos (FJ-EP3) aumentó el título de virus hasta 8,2 1091OUFPlml. El análisis de secuencia del virus FJ-EP2 reveló una mutación de A a U en el nucleótido 625 en el segmento de ARN de HA que dio como resultado un cambio de H183L en la proteína HA. El análisis adicional mostró que este cambio también sucedió durante la amplificación del virus en células MDCK. La mutación H183L también se encontró en HA de N Fujian de wt durante su replicación en MDCK y huevos, tal como se ha descrito anteriormente. Se encontró una mutación de U a C adicional en el nucleótido 754 de HA dando como resultado una sustitución V226A en el virus FJ-EP3 amplificado (Tabla 23). No se detectaron cambios en el segmento de NA

Para confirmar que las mutaciones H183L y V226A en HA eran de hecho responsables del aumento en la replicación de AlFujian 6:2 en huevos, se introdujeron H183L y V226A en HA de NFujian HA de manera individual o en combinación. Se obtuvieron tres virus recombinantes y crecieron hasta un título de 7,4 10g lOUFPlml para FJH183L, 7,9 10gloUFPlml para FJ-V226A y 8,4 10glOUFP/ml para FJ-H183LN226A (Tabla 23). Por lo tanlo, H183L y V226A contribuyeron independientemente a la replicación mejorada del virus AlFujian en huevos de gallina embrionados.

Tabla 23. Mutaciones en la HA de revirtientes adaptados a huevo de NFujian 6:2 y su replicación en huevos

embrionados Virus Mutaciones en nucleótido (aminoácido) Virus títulos (Log1oUFP/ml) Pasado en huevo

FJ-EPl NO ' 3,9

FJ-EP2 A625U (HI83L) 6,2

FJ-EP3 A625U (H183L), U745C (V226A) 8,2 Recombinantes

FJ-183L A625T (H 183L) 7,'

FJ-226A T745C (V226A) 7,9

FJ-183U226A A625U (HI83L), U745C (V226A) 8,4 No determinado Propiedades de unión a receptor y replicaciÓfl de virus recombinantes

A partir de los estudios anteriores, se demostró que los cambios de NA que redujeron la actividad de NA de AlFujian eran suficientes para que este virus creciese en huevos. Por otra parte, los cambios de HA (V186VyV2261 o H183L y V226A) podrian haber aumentado la afinidad de unión a receptor para compensar la mayor actividad de NA de AlFujian_ Para determinar si los cambios en la proteina HA de AlFujian aumentaron su capacidad de unión a receptor, se comparó la adosorción de AlFujian 6:2 que portaba el cambio HA-V1861226 y la de AlFujian 6:2 adaptada a huevo que contenia los cambios HA-L 183A226 con AlFujian 6:2, AlSendai, y AlWyoming. Se adsorbió cada virus en células MDCK a una moi de 1,0 durante 30 min a 4"C o 33"C, se retiró el inóculo y las células infectadas se lavaron tres veces o se omitió la etapa de lavado. Después de 6 horas de incubación a 33"C, se determinó el porcentaje de células infectadas mediante análisis de inmunofluorescencia usando anticuerpo anti-NP. Tal como se muestra en la Fig_36, AlFujian 6:2 y AlSendai infectaron al 26-27% de células cuando se llevó a cabo la adsorciÓfl a 4"C, pero la mayoría de los virus se eliminaron fácilmente mediante la etapa de lavado_A 33"C, el lavado redujo en gran medida la infección de virus AlFujian 6:2 (6,2% en comparación con el 37,8%) pero no tuvo un efecto significativo en la infección de AlSendai 6:2 (42,8% en comparación con el 51,7%). Por el contrario, AlWyoming 6:2, AlFujian a HA-V1861226 o HA-L 183A226 tuvieron una tasa de infección similar, independientemente de si las células se adsorbieron a 4"C o 33"C y con o sin una etapa de lavado_ Estos datos indicaron que HA de AlFujian y de AlSendai tenían tan baja afinidad de unión que los virus unidos a 4"C podían eliminarse por lavado de las células fácilmente. La uniÓfl y la cinética de entrada del virus fueron más rápidas a 33" C, por lo tanto, la etapa de lavado tuvo un impacto mínimo en la infección por virus AlSendai 6:2_ Sin embargo, la mayoría de AlFujian 6:2 se eliminó por lavado en condiciones similares debido a que su mayor actividad de NA evitó la unión eficaz del virus a 33"C (datos no mostrados).

Antigen icidad de virus recombinantes

Para examinar si los virus con los restos de HA y NA modificados afectaron a la antigenicidad del virus , se llevó a cabo un ensayo de inhibición de hemaglutinaciÓfl (HAI) usando sueros de hurón anti-AlWyoming y anti-AlSendai (Tabla 24). Los sueros de hurón anti-AlWyoming o anti-AlSendai tuvieron un título de HAI similar cuando se midió con virus AlFujian 6:2 o AlSendai. Un título de HAI ligeramente mayor se detectó con el virus AlWyoming 6:2, probablemente debido a la mayor unión de HA de AlWyoming al receptor de la célula en los glóbulos rojos sanguíneos_Los dos virus modificados (AlFujianHA-VI861226 y AlFujian HA-L 183A226) tuvieron un título de HAI similar a AlWyoming cuando se midió mediante cualquier suero. Queda indicado que la diferencia de aminoácidos entre NSendai y AlWyoming y los virus modificados en HA generados en el presente estudio no alteraron la antigenicidad del virus.

Tabla 24Antigenicidad de virus AlFujian 6:2 modificados

_

Virus(1): HA NA Antigenicidad (log2HAI)(l)

128: 183 186 219 226 119 136 347 anti-AlWY anti-AlSD

AlFujian: T H G S V E Q H 9 9

AlWyoming: A. V Y I 11 10

HA-V1861226: V I Y 11 11

HA-L183A226: L A. 11 11

(1): Se creció AlFujian en células MDCK y el resto de virus crecieron en huevos.

(2): Se midió la antigenicidad mediante ensayo HAI usando suero de hurón inmunizado contra AlWyoming (anti-AlWY) o AlSendai (anti-AlSD) con los antígenos del virus indicados

EJEMPLO 12: DETERMINACiÓN DE LOS LOCUS QUE CONTROLAN EL FENOTIPO DE ADAPTACiÓN AL FRío DEL VIRUS DE LA GRIPE BfANN ARBORl1f66

El virus adaptado al frío (ca) B/Ann Arbor/1f66 es el virus donante maestro (VDM-B) para las vacunas vivas atenuadas de gripe B Flumisl®. Las vacunas de virus de la gripe B 6:2 que portaban los seis genes internos procedentes de B/Ann Arborf1/66 ca y las glucoproteínas de superficie HA y NA a partir de las cepas de tipo silvestre se caracterizan por los fenotipos de adaptación al frío (ca), sensibilidad a la temperatura (Is) y atenuación (all). El análisis de secuencia reveló que VDM-B contiene nueve aminoácidos en las proteínas PB2, PA, NP YM1 que no se encuentran en las cepas de gripe B de tipo silvestre. Los presentes inventores han determinado que tres aminoácidos en PA(M431V) y NP(A114V, H410P) determinaron el fenotipo ts y, además de estos tres locus de ts, dos aminoácidos en M1 (Q159H, V183M) confirieron el fenotipo att

Para entender la base molecu lar del fenotipo ca, se usó el sistema genético inverso basado en plásmidos para evaluar la contribución de estos nueve aminoácidos especificos de VDM-B para el fenotipo ca. VDM-B recombinante se replicó eficazmente a 25"C y 33"C en las células de riñón de pollo embrionario (CEK). Por el contrario, BfAnn Arbor/1f66 recombinante y de tipo silvestre, que contenía los nueve aminoácidos de tipo silvestre, se replicaron de manera ineficaz a 25"C. Se determinó que un total de cinco aminoácidos de tipo silvestre, uno en PB2 (R630S), uno en PA(M431 V) Ytres en NP(A114V, H410P, T509A), fueron necesarios para revertir completamente el fenotipo ca de VDM-B. Además , el reemplazo de dos am inoácidos en la proteína M1 (Q159H, V183M) de VDM-B o cepas de vacuna 6:2 con los aminoácidos de tipo silvestre aumentaron significativamente la replicación del virus a 33"C pero no a 25"C en células CEK; el cambio V183M tuvo un impacto mayor en el cambio

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> Medlmmune Vaccines, Inc Hoffmann, Erich Jin, Hong Lu, Bin Duke, Gregory Kemble, George Chen, Zhongying

<120> SISTEMA MUL TIPLÁSMIDO PARA LA PRODUCCiÓN DE VIRUS DE LA GRIPE

<130> FL210PCT2

<150> US 60/574.117

<151>

<150> US 60/578.962

<1 51>

<150> US 60/631 .892

<151>

<150> US 60f643.278

<151>

<150> US 60f657.372 <151>

<160>102

<170> Patentln versión 3.1

<210> 1

<211> 50

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador oligonucleotidico polyA.1

<400> 1 aacaattgag atctcggtca cctcagacat gataagatac attgatgagt 50

<210> 2

<211> 50

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador oligonucleotídico polyA.2

<400> 2 tataactgca gactagtgat atccttgttt attgcagctt ataatggtta

<210> 3

<211> 38

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador oligonucieotídico para RT-PCR de VDM-A

<400> 3 cacttatatt cacctgcctc agggagcgaa agcaggtc 38

<210> 4

<211> 30

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador oligonucleotídico para RT-PCR de VDM-A

<400> 4 tatlcgtctc agggagcgaa agcaggcaaa 30

<210> 5

<211> 30

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador oligonucleotídico para RT-PCR de VDM-A

<400> 5 tattcgtctc agggagcgaa agcaggtact 30

<210> 6

<211> 31

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador oligonucieolídico para RT-PCR de VDM-A

<400> 6 latlcgtctc agggagcaaa agcagggtag a 31

<210>7

<211> 38

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador oligonucleotídico para RT-PCR de VDM-A

<400> 7 cactlalatl cacctgcclc agggagcaaa agcagggg 38

<210> 8 <211>31

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador oligonucleolídico para RT-PCR de VDM-A

<400> 8 lattcglclc agggagcaaa agcaggaglg a 31

<210>9 <211>31

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador oligonucleotídico para RT -PCR de VDM-A

<400> 9 lattcglctc agggagcaaa agcagglaga t 31

<210>10

<211> 30

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador oligonucleolídico para RT-PCR de VDM-A

<400> 10 tattcgtctc agggagcaaa agcagggtga 30

<210> 11

<211> 44

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador oligonucleotídico para RT-PCR de VDM-A

<400> 11 cclaacatal cacclgcctc gtattagtag aaacaagglc gttt

<210> 12

<211> 33

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador oligonucleotídico para RT-PCR de VDM-A

<400> 12 atatcglclc glattagtag aaacaaggca ttt 33 <210>13

<211> 33

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador oligonucleotídico para RT-PCR de VDM-A

<400> 13 atatcglctc g1attagtag aaacaaggla ctt 33

<210> 14

<211> 33

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador oligonucleotídico para RT-PCR de VDM-A

<400> 14 atatcglctc gtattaglag aaacaagggl att 33

<210>15

<211> 43

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador oligonucleolídico para RT-PCR de VDM-A

<400> 15 cclaacatal cacclgcctc glattaglag aaacaagggl gtt 43

<210>16

<211> 33

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador oligonucleotídico para RT-PCR de VDM-A

<400> 16 atatcglctc gtattagtag aaacaaggag lit 33

<210> 17

<211> 33

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador oligonucleolídico para RT-PCR de VDM-A

<400> 17 atatcglctc gtattagtag aaacaaggla gil 33

<210>18

<211> 33

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador oligonucleolídico para RT-PCR de VDM-A

<400> 18 atatcglctc gtattagtag aaacaagggt gtt 33

<210> 19

<211> 24

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador oligonucleolídico para la corrección de la mutación de VDM-A

<400> 19 gcaagctglg gaaatalgca aggc 24

<210> 20

<211> 24

<212> ADN

<213> Artificial <220>

<223> cebador oligonucleotídico para la corrección de la mutación de VDM-A

<400> 20 gccttgcata tttccacagc ttgc 24

<210> 21

<211> 26

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador oligonucleotídico para la corrección de la mutación de VDM-A

<400> 21 gaagtgctla cgggcaatct tcaaac 26

<210> 22

<211 > 26

<212> ADN

<21 3> Artificial

<220>

<223> cebador oligonucleotídico para la corrección de la mutación de VDM-A

<400> 22 gtttgaagat tgcccgtaag cacttc 26

<210> 23

<211> 22

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador oligonucleolídico para la corrección de la mutación de VDM-A

<400> 23 cctgaggagg tcagtgaaac ac 22

<210> 24

<211 > 22

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador oligonucleotídico para la corrección de la mutación de VDM-A

<400> 24 gtgtltcact gacctcctca gg 22

<210> 25

<211 > 23

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador oligonucleotídico para la corrección de la mutación de VDM-A

<400> 25 gtttgttagg actctattcc aac 23

<21 0> 26

<211> 23

<212> ADN

<213> Artificial <220>

<223> cebador oligonucleotídico para la corrección de la mutación de VDM-A

<400> 26 gttggaatag agtcctaaca aac 23

<210> 27

<211> 25

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador oligonucieotídico para la corrección de la mutación de VDM-A

<400> 27 gacagtaagc tccgaacaca aatac 25

<210> 28

<211> 24

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador oligonucieotídico para la corrección de la mutación de VDM-A

<400> 28 gtatttgtgt tcggagcttc atgc 24

<210> 29

<211> 24

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador oligonucieotídico para la corrección de la mutación de VDM-A

<400> 29 cgaaccgaac ggctacattg a99g 24

<210> 30

<211> 24

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador oligonucleotídico para la corrección de la mutación de VDM-A

<400> 30 ccctcaatgt agccgttcgg ttcg 24

<210> 31

<211> 24

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador oligonucleotídico para la corrección de la mutación de VDM-A

<400> 31 cagagaaggt agattlgacg actg 24

<210> 32

<211> 25

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador oligonucleotídico para la corrección de la mutación de VDM-A

<400> 32 cagtcglcaa aglctacctl ctctg 25

<210> 33

<211> 23

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador oligonucleotídico para la corrección de la mutación de VDM-A

<400> 33 cactgaccca agacttgagc cac 23

<210> 34

<211> 23

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador oligonucieotídico para la corrección de la mutación de VDM-A

<400> 34 gtggctcaag tcttggglca gtg 23

<210> 35

<211> 26

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador oligonucleotídico para la corrección de la mutación de VDM-A

<400> 35 caaagattaa aatgaaatgg ggaatg 26

<210> 36 <211>26

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador oligonucieotídico para la corrección de la mutación de VDM-A

<400> 36 catLccccat ttcattLtaa tctttg 26

<210> 37 <211>26

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador oligonucleotidico para la corrección de la mutación de VDM-A

<400> 37 gtaccttgtt tctactaata acccgg 26

<210> 38

<211> 26

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador oligonucieotídico para la corrección de la mutación de VDM-A

<400> 38 ccgggttatt agtagaaaca aggtac 26

<210>39

<211> 24

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador oligonucleotídico para la corrección de la mutación de VDM-A

<400> 39 ggaacacttg agaactgtga gacc 24

<210> 40

<211> 24

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador oligonucleotídico para la corrección de la mutación de VDM-A

<400> 40 ggtctcacag ttctcaagtg ttcc 24

<210>41

<211> 29

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador oligonucleotídico para la corrección de la mutación de VDM-A

<400> 41 gaattttatc acaaatgtga tgatgaatg 29

<210> 42

<211> 29

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador oligonucleotídico para la corrección de la mutación de VDM-A

<400> 42 cattcatcat cacatttgtg ataaaattc 29

<210> 43 <211>25

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador oligonucleotídico para la corrección de la mutación de VDM-A

<400> 43 gccagaatgc aactgaaatc agagc 25

<210> 44

<211> 25

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador oligonucleotídico para la corrección de la mutación de VDM-A <400> 44 gctctgattt cagtltcatl ctggc 25

<210> 45 <211>24

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador oligonucleolídico para la corrección de la mutación de VDM-A

<400> 45 ccgaatgaga atccagcaca caag 24

<210>46

<211> 24

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador oligonucleolídico para la corrección de la mutación de VDM-A

<400> 46 cttgtgtgct ggattctcat tcgg 24

<210> 47

<211> 28

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador oligonucleolídico para la correcci6n de la mutación de VDM-A

<400> 47 catcaattlc atgcctatat aagctltc 28

<210> 48

<211> 28

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador oligonucleotídico para la corrección de la mutación de VDM-A

<400> 48 gaaagctlat ataggcatga aatlgatg 28

<210> 49

<211> 28

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador oligonucleolídico para la corrección de la mutación de VDM-A

<400> 49 cataatggat cctaacactg tgtcaagc 28

<210> 50

<211> 28

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador oligonucleotidico para la corrección de la mutación de VDM-A

<400> 50

gcllgacaca glglla9gal ccallalg 28

<210> 51

<211> 26

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador oligonucleolídico para la corrección de la mulación de VDM-A

<400> 51 ggagaataga Itcatcgaga IIggag 26

<210> 52 <211>26

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador oligonucleolídico para la corrección de la mulación de VDM-A

<400> 52 ctccaalctc gatgaalcta Itclcc 26

<210> 53

<211> 38

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador oligonucleolídico para RT-PCR de B/Ann Arbor/1/66 ca

<400> 53 latlcgtctc agggagcaga agcggagccl lIaagatg 38

<210> 54

<211> 39

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador oligonucleolídico para RT-PCR de B/Ann Arbor/1l66 ca

<400> 54 taltcglctc galgccgltc cltcltcalt gaagaatgg 39

<210> 55

<211> 38

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador oligonucleolídico para RT-PCR de B/Ann Arborf1/66 ca

<400> 55 laltcgtctc ggcatctttg tcgcctggga tgatgatg 38

<210> 56

<211> 33

<212> AON

<213> Artificial

<220>

<223> cebador ol igonucleotíd ico para RT-PCR de B/Ann Arborf1/66 ca

<400> 56 atalcglctc gtaltagtag aaacacgagc ctt 33

<210> 57

<211> 40

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador oligonucleolídico para RT-PCR de B/Ann Arbor/1/66 ca

<400> 57 tattcglclc agggagcaga agcggagcgt tttcaagalg 40

<210> 58

<211> 39

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador oligonucleolídico para RT-PCR de B/Ann Arbor/1/66 ca

<400> 58 tattcgtctc Ictcattttg ctctttttta alattcccc 39

<210> 59

<211 > 42

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador oligonucleotídico para RT-PCR de B/Ann Arborf1l66 ca

<400> 59 tattcglctc algagaalgg aaaaactact aataaattca gc 42

<21 0> 60

<211 > 33

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador oligonucleolídico para RT-PCR de B/Ann Arborf1/66 ca

<400> 60 alatcglclc gtattaglag aaacacgagc att 33

<210> 61

<211> 34

<212> ADN

<21 3> Artificial

<220>

<223> cebador oligonucleotídico para RT-PCR de BfAnn Arborf1l66 ca

<400> 61 lattcgtclc agggagcaga agcgglgcgl ttga 34

<21 0> 62

<211> 37

<212> ADN

<21 3> Artificial

<220>

<223> cebador oligonucleotídico para RT-PCR de B/Ann Arborf1/66 ca

<400> 62 tattcgtctc ccagggccct tttacttgtc agagtgc 37

<210> 63

<211> 39

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador oligonucleotidico para RT-PCR de B/Ann Arbor/1l66 ca

<400> 63 tattcgtctc tcctggatct accagaaata gggccagac 39

<210> 64

<211> 33

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador oligonucleotídico para RT-PCR de B/Ann Arbor/1l66 ca

<400> 64 atatcgtctc gtattagtag aaacacgtgc att 33

<210> 65 <211>41

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador oligonucleolídico para RT-PCR de B/Ann Arborf1/66 ca

<400> 65 lattcgtctc agggagcaga agcagagcal ttlctaatal c 41

<210> 66 <211>37

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador oligonucleolídico para RT-PCR de B/Ann Arborf1/66 ca

<400> 66 atatcgtctc gtattagtag taacaagagc atttttc 37

<210> 67

<211> 38

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador oligonucleolídico para RT-PCR de B/Ann Arborf1/66 ca

<400> 67 tattggtctc agggagcaga agcacagcat tttcttgt 38

<210> 68

<211> 36

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador oligonucleotídico para RT-PCR de B/Ann Arborf1l66 ca

<400> 68 atatggtctc gtattagtag aaacaacagc attttt 36

<210> 69 <211>41

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador oligonucleotídico para RT-PCR de B/Ann Arbor/1l66 ca

<400> 69 tattcgtctc agggagcaga agcagagcat cttctcaaaa c 41

<210> 70

<211> 39

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador oligonucleotídico para RT-PCR de B/Ann Arborf1f66 ca

<400> 70 atatcgtctc gtattagtag taacaagagc atttttcag 39

<210> 71 <211>41

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador oligonucleotídico para RT-PCR de B/Ann Arborf1l66 ca

<400> 71 tattcgtctc agggagcaga agcacgcact ttcttaaaat 9 41

<210> 72

<211> 40

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador oligonucleotídico para RT-PCR de B/Ann Arborf1l66 ca

<400> 72 atatcglctc gtattagtag aaacaacgca ctttttccag 40

<210> 73

<211> 40

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador oligonucleolídico para RT-PCR de B/Ann Arborf1/66 ca

<400> 73 lattcgtctc agggagcaga agcagaggat ttgtttagtc 40

<210> 74

<211> 38

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador oligonucleotídico para RT-PCR de B/Ann Arborf1l66 ca

<400> 74 atatcgtctc gtattagtag laacaagagg atltttal 38

<210> 75

<211> 39

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador oligonucleolídico para la amplificación de NP de B/Yamanashi/166/98

<400> 75 lattcglclc agggagcaga agcacagcal ttlcttglg 39

<210>76

<211> 39

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador oligonucleotídico para la amplificación de NP de BlYamanashi/166/98

<400> 76 atatcglctc gtattagtag aaacaacagc atttttlac 39

<210> 77

<211 > 29

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador oligonucleolídico para la amplificación de NA de BfYamanashi/166/98

<400> 77 tattcgtctc agggagcaga agcagagca 29

<210> 78

<211 > 35

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador oligonucleotídico para la amplificación de NA de BfYamanashi/166/98

<400> 78 atatcglctc gtattagtag laacaagagc atttt 35

<210> 79

<211> 29

<212> ADN

<21 3> Artificial

<220>

<223> cebador oligonucleotídico para introducir mutaciones de ts en los genes PB1 y PB2 de PR8

<400> 79 gaaagaagat tgaagaaatc cgaccgctc 29

<210> 80 <211>29

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<400> 80 gagcggtcgg atttcttcaa tcttctttc 29

<210> 81

<211 > 33

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<400> 81

gaaataaaga aactgtgggg gcaaacccgt tcc 33

<210> 82 <211>33

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<400> 82 ggaacgggtt tgcccccaca gtttctttat !tc 33

<210> 83

<211> 28

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador oligonucleotídico para introducir mutaciones de 15 en los genes PB1 y PB2 de PR8

<400> 83

gtatgalgct gltacaacaa cacactcc 28

<210> 84

<211> 28

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador ol igonucleotídico para introducir mutaciones de ts en los genes PB1 y PB2 de PR8

<400> 84 ggagtgtglt gltglaacag calcatac 28

<210> 85

<211> 29

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<400> 85 attgctgcta ggagcatagt gagaagagc 29

<210> 86

<211> 29

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<400> 86

gctcttctca clatgclcct agcagcaat 29

<210> 87

<211> 29

<212> ADN

<213> Artificial <220>

<223> cebador oligonucleotídico para RT-PCR de HA y NA

<400> 87 lattcgtclc agggagcaga agcagagca 29

<210> 88

<211> 35

<212>ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador oligonucleolídico para RT-PCR de HA y NA

<400> 88 alatcglctc gtattagtag laacaagagc atttt 35

<210> 89

<211 > 23

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador oligonucleolídico para la extensión de cebadores

<400> 89 atgtlcttla cgatgcgalt ggg 23

<210> 90

<211> 38

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador oligonucleolídico para la amplificación de HA

<400> 90 cacttalatt cacctgcclc agggagcaaa agcagggg 38

<210> 91

<211 > 43

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador oligonucleolídico para la amplificación de HA

<400> 91 cclaacatal cacclgcctc gtattagtag aaacaagggt gtt 43

<210> 92

<211> 39

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador oligonucleotídico para la amplificación de NA

<400> 92 cacttalatt cacctgcclc agggagcaaa agcaggagl 39

<210> 93

<211> 43

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador oligonucleotídico para la amplificación de NA

<400> 93 5 cclaacalal cacclgcctc glattaglag aaacaaggag Itt 43

<210> 94

<211> 2836

<212> ADN 10 <213> Artificial

<220>

<223> pAD3000

15 <400> 94

ctll.qclI.gtta accggll.gtac tggtcqll.cct ccgaagttgg 99'999agll'ag acggtaccgt 60 ctccaataac ccggcggccc aaaatgccga ctcggagcga aagatatacc tcccccgggg >20 cc999l199tc .';¡cgtcaccga cCllcgccgcc 99cccaggc9 acgcgcgllca cggacllcctg '"O tccccaaaaa cgccaccatc gcagccacac acggagcgcc c999gccctc tggtcaaccc ,<O caqgacacac gcgggagcag c9cc99gccg gggacgccct ccc:ggcggtc acctcagaca 300 tgataagata cattgatgag tttggacaaa ccacaactag aatgcagtga aaaaaatgct 360 . '

ttatttgtga aatttgtgat gctattgctt tatttgtaac cattataagc tgcaataaac 420

aaggatctgc attaatgaat cggccaacgc 9c999ga9a'1 gC99tttgcg tattgggcgc <80

tcttccgctt cctcgctcac tgactcgctg cgetcggtcg ttcggctgcg gcgagcg9ta 5<0

tcagctcl'lct caaaggcggt aatacggtta tccacagaat caggggataa cgcaggaaag 600

aacatgtgag ca..aagqcca ocaaaaggcc Bqqaaccgta aaaaogccgc qtt<;¡ctqgcg 660

tttttccata ggctccgccc ccctqacgag catcacaaaa atcgacgctc aagtcagagg 720

tqqcqaaacc cgacaggact: ataaagatac cagqcgtttc cccctggaag ctccctcgtg 780

cgctctcctg ttccgaccct gccgcttacc ggatacctgt ccgcctttct cccttcqgga 840

agcgtggcgc tttctcaatg ctcacgctqt aqqtatctca qttcggtgta g'gtcgttcgc 900

tccaa..,ct99 gctgtc;tgca cgaacccccc gttcagccc<;¡ acc..,ctqcgc cttatccg9t 960

aactatcgtc ttqaqtccaa cccggtaaga cacgacttat cgccactqqc ao;¡caqccact 1020

ggtaAcagga ttagcagagc gaggtatgta ggcggtgcta cagagttctt gaagtggtgg lOBO

cctaactacg gctaca,ctag aaggacagta tttggtatct gcqctctgct gaagccagtt 1140

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<213> Virus de la gripe B

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5 <210> 101

<21 1> 1190

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<213> Virus de la gripe B

10 <400> 101

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<210> 102

<211 > 1098 5 <212> AQN

<213> Virus de la gripe B

<400> 102

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Claims

REIVINDICACIONES

1, Un método para aumentar la replicación de un virus de la gripe reorganizante, comprendiendo el método las etapas de

i) comparar la secuencia de aminoácidos del virus de la gripe reorganizante con la secuencia de aminoacidos de un virus de la gripe diferente, creciendo dicho virus de la gripe diferente en huevos embrionados; ii) alterar uno o más aminoácidos en un polipéptido de HA de H3N2 del virus reorganizante para que coincida con la secuencia del virus de la gripe diferente que comprende sustituir según sea necesario los restos de aminoácidos de H3 de HA siempre que la posición 183 sea una leucina y la posición 226 sea una alanina, produciendo de este modo un virus reorganizante alterado; y iii) crecer el virus reorganizante alterado en huevos, mediante lo que la replicación del virus reorganizante alterado aumenta en al menos un 10% en comparación con la replicación de virus reorganizante no alterado,

2 El método de la reivindicación 1, en el que el virus reorganizante alterado es un virus reorganizante 6:2

3, El método de la reivindicación 1, en el que el virus reorganizante alterado es un virus reorganizante 7:1,

4, El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el virus reorganizante alterado está atenuado, es sensible a la temperatura y/o esta adaptado al frio

S. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el virus de la gripe reorganizante comprende un polinucieótido de una cepa de virus AJAnn Arbor/6/60.
6.

El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el virus de la gripe reorganizante comprende un polinucleótido de una cepa de virus B/Ann Arbor/1/66.
7.

El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que la replicación del virus de la gripe reorganizante alterado aumenta en al menos un 20% en comparación con la replicación de virus reorganizante no alterado
8.

El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que la replicación del virus de la gripe reorganizante alterado aumenta en al menos un 40% en comparación con la replicación de virus reorganizante no alterado
9.

Un virus de la gripe reorganizante con replicación potenciada que comprende una proteína HA de H3N2 que comprende una leucina en la posición 183 y una alanina en la posición 226.
10.

El virus de la gripe reorganizante de replicación potenciada de la reivindicación 9, que es un virus reorganizante

6:2. 11 El virus de la gripe reorganizante de replicación potenciada de la reivindicación 9, que es un virus reorganizante

7:1.
12.

El virus de la gripe reorganizante de replicación potenciada de una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, que esta atenuado, es sensible a la temperatura y/o está adaptado al fria
13.

El virus de la gripe reorganizante de replicación potenciada de una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, que comprende un polinucleótido de un virus de una cepa AJAnn Arbor/6/60
14.

El virus de la gripe reorganizante de replicación potenciada de una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, que comprende un polinucleótido de un virus de una cepa B/Ann Arbor/1/66
15.

Una composición inmunogénica que comprende el virus de la gripe reorganizante de replicación potenciada de una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 14.