ES2890427T3 - Mutantes de virus de la gripe A - Google Patents

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Abstract

Un virus de la gripe A recombinante que comprende un gen M mutante, en donde el gen M mutante comprende dos codones de terminación en una posición correspondiente a los nucleótidos 786-791 de la SEQ ID NO: 28 y una supresión de los nucleótidos correspondientes a los nucleótidos 792-842 de la SEQ ID NO: 28, en donde la secuencia de los dos codones de terminación en nucleótidos correspondientes a los nucleótidos 786-791 de la SEQ ID NO: 28 es TAATAG.

Description

DESCRIPCIÓN
Mutantes de virus de la gripe A
Antecedentes
La gripe es una de las causas principales de muerte entre los adultos estadounidenses. Cada año, aproximadamente 36 000 personas mueren a causa de la gripe y más de 200000 personas son hospitalizadas. La gripe es una enfermedad muy contagiosa que se transmite al toser, estornudar y por contacto físico directo con objetos, tales como pomos de puertas y teléfonos, que portan el virus. Los síntomas de la gripe incluyen fiebre, cansancio extremo, cefalea, escalofríos y dolores corporales; aproximadamente el 50 por ciento de las personas infectadas no presentan síntomas, pero siguen siendo contagiosas. La inmunización tiene una eficacia del 70 al 90 por ciento para prevenir la gripe en personas sanas menores de 65 años, siempre que las antigenicidades de la cepa del virus en circulación coincidan con las de la vacuna.
La vacunación es el método principal para prevenir la gripe y actualmente se encuentran disponibles vacunas de virus vivos atenuados e inactivados (muertos). Por ejemplo, Watanabe et al., 2009 (Journal of Virology, The American Society for Microbiology vol. 83 (11): 5947-5950) desvela que un virus de la gripe A que carece de la proteína M2 se puede usar como una vacuna viva atenuada. Las vacunas de virus vivos, administradas normalmente por vía intranasal, activan todas las fases del sistema inmunitario y pueden estimular una respuesta inmunitaria a múltiples antígenos víricos. Por tanto, el uso de virus vivos supera el problema de la destrucción de antígenos víricos que puede producirse durante la preparación de vacunas víricas inactivadas. Además, la inmunidad producida por vacunas de virus vivos es generalmente más duradera, más eficaz y con mayor reactividad cruzada que la inducida por las vacunas inactivadas, y las vacunas de virus vivos son menos costosas de producir que las vacunas de virus inactivados. Sin embargo, las mutaciones en virus atenuados con frecuencia están mal definidas y la reversión es una preocupación.
Sumario
En un aspecto de la invención, se proporciona un virus de la gripe A recombinante que comprende un gen M mutante, en donde el gen M mutante comprende dos codones de terminación en una posición correspondiente a los nucleótidos 786-791 de la SEQ ID NO: 28 y una supresión de los nucleótidos correspondientes a los nucleótidos 792-842 de la SEQ ID NO: 28, en donde la secuencia de los dos codones de terminación en nucleótidos correspondientes a los nucleótidos 786-791 de la SEQ ID NO: 28 es TAATAG. En un aspecto de la invención, se proporciona un virus de la gripe A recombinante que comprende un gen M mutante, en donde el gen M mutante comprende dos codones de terminación en una posición correspondiente a los nucleótidos 786-791 de la SEQ ID NO: 28 y una sustitución de G a C en una posición correspondiente al nucleótido 52 de la SEQ ID NO: 28, en donde la secuencia de los dos codones de terminación en nucleótidos correspondientes a los nucleótidos 786-791 de la SEQ ID NO: 28 es TAATAG. En un aspecto de la invención, se proporciona un virus de la gripe A recombinante que comprende un gen M mutante, en donde el gen M mutante comprende dos codones de terminación en una posición correspondiente a los nucleótidos 786-791 de la SEQ ID NO: 28 y una supresión de los nucleótidos correspondientes a los nucleótidos 792-842 de la SEQ ID NO: 28, y una sustitución de G a C en una posición correspondiente al nucleótido 52 de la SEQ ID NO: 28, en donde la secuencia de los dos codones de terminación en nucleótidos correspondientes a los nucleótidos 786-791 de la SEQ ID NO: 28 es TAATAG. En una realización, la mutación del gen M da lugar a que el virus no exprese la proteína M2, o causa que el virus exprese una proteína M2 truncada que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4. En otra realización, el gen M mutante no revierte a una secuencia de tipo silvestre o no silvestre que codifica una proteína M2 funcional durante al menos 10 pases en un sistema de célula hospedadora in vitro, en donde la célula hospedadora se modifica para producir una versión de tipo silvestre del gen mutante, proporcionando de este modo el producto génico al virus en trans. En una realización, el virus no es patógeno en un mamífero infectado con el virus. En otra realización, el sistema celular in vitro comprende células de ovario de hámster chino o células Vero. En otra realización, se proporciona una composición que comprende el virus de la gripe A recombinante de cualquier reivindicación anterior. En otra realización, la mutación del gen M da lugar a que el virus no exprese la proteína M2, o causa que el virus exprese una proteína M2 truncada que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4. En una realización, la composición no es patógena para un mamífero al que se le administra la composición. En una realización, la composición puede comprender además un adyuvante.
El virus de la gripe recombinante puede comprender la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3.
La composición puede comprender la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3. La composición puede inducir una respuesta inmunitaria detectable en un mamífero en un periodo de aproximadamente tres semanas después de la administración de la composición al mamífero.
Breve descripción de los dibujos
La FIGURA 1 es un gráfico que representa el papel del canal iónico M2 en el ciclo de vida de un virus de la gripe, en donde (1) el virus de la gripe se une a los receptores de ácido siálico en una superficie celular; (2) el virus se internaliza en la célula; (3) el canal iónico M2 se expresa en la superficie vírica; (4) el canal iónico M2 se abre para permitir la entrada de protones, lo que conduce a una liberación de ARN vírico que entra en el núcleo, se replica y da lugar a la síntesis de proteínas víricas; y (5) los componentes víricos se empaquetan en viriones y se liberan. La FIGURA 2 es un diagrama esquemático de genes M2 de tipo silvestre y mutantes. El gen M2 del segmento M de A/Puerto Rico/8/1934 (PR8) se suprimió mediante la inserción de dos codones de terminación cadena abajo del marco abierto de lectura de la proteína M1 seguido de la supresión de 51 nucleótidos en el dominio transmembrana para inhibir la expresión de la proteína M2 de longitud completa.
La FIGURA 3 muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 28) de M1 y M2 sin procesar.
La FIGURA 4 es un gráfico que muestra la cinética de crecimiento de los virus M2KO(ATM) (panel superior) y PR8 de tipo silvestre (panel inferior) en células MDCK normales y células MDCK que expresan de forma estable la proteína M2 (M2CK). Las células se infectaron con virus a una multiplicidad de infección de 10-5. Se determinaron los títulos de virus en los sobrenadantes celulares. El PR8 de tipo silvestre creció a títulos altos en ambos tipos celulares, mientras que M2KO(ATM) creció bien solo en las células M2CK y no creció en absoluto en las células MDCK.
La FIGURA 5 es una transferencia de Western que muestra que el virus M2KO(ATM) produce antígenos víricos, pero no M2, en células normales. Los lisados celulares se exploraron con sueros de ratón infectados con PR8 (panel A) o anticuerpo monoclonal anti-M2 (panel B). Carril 1, marcador de peso molecular; Carril 2, células MDCK infectadas con PR8; Carril 3, células MDc K infectadas con M2KO(ATM); Carril 4, células MDCK sin infectar. La FIGURA 6 es un gráfico que muestra el cambio en el peso corporal del ratón después de la inoculación con variantes de M2KO.
La FIGURA 7A es un gráfico que muestra la respuesta de anticuerpos en ratones inoculados con variantes de M2KO.
La FIGURA 7B es un gráfico que muestra el título de anticuerpos IgG anti-PR8 en el suero de ratones reforzados 6 semanas después de la infección.
La FIGURA 8 es un gráfico que muestra el cambio en el peso corporal del ratón después de la exposición a la gripe, tras la inoculación con variantes de M2KO.
La FIGURA 9 es un gráfico que muestra la supervivencia del ratón después de la exposición a la gripe, tras la inoculación con variantes de M2KO.
La FIGURA 10 es un gráfico que muestra el cambio en el peso corporal del ratón después de la inoculación con PR8 por vía intranasal (IN), por vía intradérmica (ID) o por vía intramuscular (IM).
La FIGURA 11A es un gráfico que muestra el título de anticuerpos en suero, recogido a las 2 semanas tras la inoculación con PR8, del ratón con concentración de 1,8X101 ufp (baja) o 1,8x104 ufp (alta) de virus. La FIGURA 11B es un gráfico que muestra el título de anticuerpos en suero, recogido a las 7 semanas tras la inoculación con PR8, del ratón con concentración de 1,8X101 ufp (baja) o 1,8x104 ufp (alta) de vacuna.
La FIGURA 12 es un gráfico que muestra la supervivencia del ratón después de la exposición a la gripe, tras la inoculación con PR8.
La FIGURA 13 es un gráfico que muestra el cambio en el peso corporal del ratón después de la exposición a la gripe, tras la inoculación con PR8.
La FIGURA 14 es un gráfico que muestra el título de anticuerpos en suero, recogido de un ratón inoculado con 1,8x104 ufp de PR8 por vía intradérmica a las 7 semanas después de la inoculación.
La FIGURA 15 es un gráfico que muestra el cambio en el peso corporal de los ratones inoculados con 1,8x104 ufp de PR8 por vía intradérmica.
La FIGURA 16 es un gráfico que muestra el % de supervivencia después de la exposición para ratones infectados con un virus heterosubtípico.
La FIGURA 17 es un gráfico que muestra los títulos de ELISA de ratones de diferentes grupos de vacunación. La FIGURA 18 es un gráfico que muestra el % de supervivencia de los ratones después de la infección por virus homosubtípicos.
La FIGURA 19 es un gráfico que muestra el % de supervivencia de los ratones después de la exposición a virus heterosubtípicos.
La FIGURA 20 es un gráfico que muestra cambios en el peso corporal de hurones inoculados. Los hurones se inocularon con 107 DICT50 del virus M2KO(ATM) (panel A) o con 107 DICT50 del virus de la gripe A A/Brisbane/10/2007 (H3N2) (panel B). Se supervisó el peso corporal durante 3 días después de la inoculación.
La FIGURA 21 es un gráfico que muestra cambios en la temperatura corporal de hurones inoculados. Los hurones se inocularon con 107 DICT50 del virus M2KO(ATM) (panel A) o con 107 DICT50 del virus de la gripe A A/Brisbane/10/2007 (H3N2) (panel B). Se supervisó la temperatura corporal durante 3 días después de la inoculación.
La FIGURA 22 es un gráfico que muestra cambios en el peso corporal de los hurones después de la vacunación. Los hurones se inocularon con 107 DICT50 del virus M2KO(ATM) [G1 y G3], con 107 DICT50 del virus FM#6 [G2 y G4] u OPTI-MEM™ [G5]. Los cambios en el peso corporal se supervisaron durante 14 días después de la vacunación de sensibilización (panel A) y después de recibir una vacuna de refuerzo (panel B).
La FIGURA 23 es un gráfico que muestra cambios en el peso corporal de los hurones después de la exposición. Los hurones fueron expuestos a 107 DICT50 del virus de la gripe A A/Brisbane/10/2007 (H3N2). Se supervisó el peso corporal durante 14 días después de la inoculación.
La FIGURA 24 es un gráfico que muestra cambios en la temperatura corporal de los hurones después de la vacunación. Los hurones se inocularon con 107 DICT50 del virus M2KO(ATM) [G1 y G3], con 107 DICT50 del virus FM#6 [G2 y G4] u OPTI-MEM™ [G5]. Los cambios en la temperatura corporal se supervisaron durante 14 días después de la vacunación de sensibilización (panel A) y después de recibir una vacuna de refuerzo (panel B).
La FIGURA 25 es un gráfico que muestra cambios en la temperatura corporal de los hurones después de la exposición. Los hurones fueron expuestos a 107 DICT50 del virus de la gripe A A/Brisbane/10/2007 (H3N2). Se supervisó la temperatura corporal durante 14 días después de la inoculación.
La FIGURA 26 es un gráfico que muestra cambios en el peso de los hurones después de la inoculación del virus. Los hurones donantes se inocularon el día 0 con 107 DICT50 del virus M2KO(ATM) (panel A) o con 107 DICT50 del virus A/Brisbane/10/2007 (H3N2) (panel B). 24 horas (día 1) después de la inoculación, los donantes se colocaron en una jaula con contactos directos (CD) adyacentes a una jaula que aloja un contacto de aerosol (CA). Se supervisaron los cambios en el peso corporal durante 14 días después de la inoculación del donante.
La FIGURA 27 es un gráfico que muestra cambios en la temperatura corporal de los hurones después de la inoculación del virus. Los hurones donantes se inocularon el día 0 con 107 DICT50 del virus M2KO(ATM) (panel A) o con 107 DICT50 del virus A/Brisbane/10/2007 (H3N2) (panel B). 24 horas (día 1) después de la inoculación, los donantes se colocaron en una jaula con contactos directos (CD) adyacentes a una jaula que aloja un contacto de aerosol (CA). Se supervisaron los cambios en la temperatura corporal durante 14 días después de la inoculación del donante.
La FIGURA 28 es un gráfico que muestra que la vacuna M2KO(ATM) induce respuestas humorales y mucosas. El panel A muestra títulos de IgG e IgA en suero después de la administración de PR8, M2KO(ATM), PR8 inactivado (IN, IM) o PBS. El panel B muestra los títulos de IgG e IgA de lavado pulmonar después de la administración de PR8, M2KO(ATM), PR8 inactivado (IN, IM) o PBS.
La FIGURA 29 es un gráfico que muestra que la vacuna M2KO(ATM) protege a los ratones de la exposición vírica homosubtípica y heterosubtípica letal. El panel A muestra el cambio de peso corporal del ratón después de la exposición homóloga a PR8 (H1N1). El panel B muestra la supervivencia del ratón después de la exposición heteróloga a Aichi (H3N2).
La FIGURA 30 es un gráfico que muestra que la vacuna M2KO(ATM) controla la replicación del virus de exposición en las vías respiratorias. El panel A muestra los títulos víricos después de la exposición a PR8 (H1N1). El panel B muestra los títulos víricos después de la exposición a Aichi (H3N2).
La FIGURA 31 es un gráfico que muestra la cinética de la respuesta de anticuerpos a la vacuna M2KO(ATM) en suero.
La FIGURA 32 es un gráfico que muestra la respuesta de anticuerpos de la mucosa a la vacuna M2KO(ATM) en suero y las vías respiratorias.
La FIGURA 33 es un gráfico que muestra la cinética de IgG anti-HA en ratones en respuesta a la vacuna M2KO(ATM).
La FIGURA 34 es un gráfico que muestra que la vacuna M2KO(ATM) induce respuestas inmunitarias similares a FluMist® e IVR-147. El panel A muestra los títulos víricos en suero en animales a los que se ha administrado FluMist® H3, M2KO(ATM) H3, IVR-147 y PBS. El panel B muestra los títulos víricos de lavado pulmonar en animales a los que se ha administrado FluMist® H3, M2KO(ATM) H3, IVR-147 y PBS. El panel C muestra los títulos víricos de los cornetes nasales en animales a los que se ha administrado FluMist® H3, M2KO(ATM) H3, IVR-147 y PBS.
La FIGURA 35 es un gráfico que muestra que la vacuna M2KO(ATM) protege contra la exposición a Aichi. El panel A muestra la pérdida de peso corporal después de la exposición a Aichi en animales a los que se ha administrado FluMist® H3, M2KO(AM) H3, Iv R-147 y PBS. El panel B muestra el porcentaje de supervivencia después de la exposición a Aichi de animales a los que se ha administrado FluMist® H3, M2KO(ATM) H3, IVR-147 y PBS. La FIGURA 36 es un gráfico que muestra que la vacuna H5N1 M2KO(AM) induce títulos de anticuerpos IgG contra HA.
La FIGURA 37 es un gráfico que muestra el peso corporal después de la administración de vacunas M2KO(AM) CA07, WT CA07 y FluMist® CA07.
La FIGURA 38 es un gráfico que muestra que el virus M2KO(AM) no se replica en las vías respiratorias de los ratones.
La FIGURA 39 es un gráfico que muestra que la vacuna M2KO(AM) presenta cinética de anticuerpos rápida. La FIGURA 40 es un gráfico que muestra que la vacuna M2KO(AM) protege contra la exposición heteróloga con el virus H3N2, A/Aichi/2/1968.
La FIGURA 41 es un gráfico que muestra que la vacuna M2KO(AM) sensibiliza para respuestas celulares que se recuperan tras la exposición.
La FIGURA 42 es un gráfico que muestra que el virus M2KO(AM) genera niveles de ARNm similares a los del virus de tipo silvestre para M2.
La FIGURA 43 es un gel de agarosa que muestra productos de digestiones de restricción del plásmido de expresión pCMV-PR8-M2. Carriles 1 y 5; Escalera de ADN de 1 Kb (Promega, Madison, WI, Estados Unidos), carriles 2-4; pCMLV-PR8-M2 digerido con Eco R1: 0,375 |jg (carril 2), 0,75 |jg (carril 3) y 1,5 |jg (carril 4).
La FIGURA 44 es un gráfico que muestra un alineamiento de secuencias de pCMV -PR8-M2 con el marco abierto de lectura del gen M2 de la gripe. La FIGURA 44 desvela las SEQ ID NO: 29-33, respectivamente, en orden de aparición.
La FIGURA 45 es un gráfico que muestra la replicación del virus M2KO(AM) y FluMist® en las vías respiratorias del hurón.
La FIGURA 46 es un gráfico que muestra los títulos víricos de M2KO(AM) y FluMist® en lavados nasales después de la exposición intranasal con el virus A/Brisbane/10/2007 (H3N2).
La FIGURA 47 es un gráfico que muestra los títulos de IgG en hurones después de la vacunación con M2KO(AM) y FluMist®, solo grupo de sensibilización.
La FIGURA 48 es un gráfico que muestra los títulos de IgG en hurones después de la vacunación con M2KO(AM) y FluMist®, grupos de sensibilización-refuerzo.
La FIGURA 49 es un gráfico que muestra un sumario de los títulos de IgG de ELISA en sueros de hurón de la vacunación con M2KO(AM) o FluMist® hasta después de la exposición.
La FIGURA 50 es un gráfico que muestra los títulos víricos en lavados nasales de hurones en un estudio de transmisión. El virus M2KO(ATM) no se transmitió (no se detectó ningún virus), mientras que el virus de control Brisb/10 sí se transmitió.
La FIGURA 51 es un gráfico que muestra los títulos de IgG en sujetos vacunados con virus A/California, A/Perth y B/Brisbane por vía intranasal (IN), por vía intramuscular (IM) y por vía intradérmica (ID FGN).
La FIGURA 52 es un gráfico que muestra los títulos de IgG en sujetos a los que se ha administrado una dosis de sensibilización o una dosis de sensibilización y refuerzo de la vacuna A/Perth (H3N2) por vía intramuscular (IM) o por vía intradérmica (ID FGN).
La FIGURA 53 es un gráfico que muestra los títulos víricos en cobayas inoculados con FluLaval: A/California/7/2009 NYMC X-181, A/Victoria/210/2009 NYMC X-187 (un virus similar a A/Perth/16/2009) y B/Brisbane/60/2008 por suministro intramuscular (IM) e intradérmico (ID) a los 0, 30 y 60 días después de la inoculación.
La FIGURA 54 es un gráfico que muestra el porcentaje de supervivencia de los sujetos vacunados con H5N1 M2KO(AM) expuestos 5 meses después de la inmunización con el virus Vietnam/1203/2004.
La FIGURA 55 es un gráfico que muestra el porcentaje de supervivencia de los sujetos vacunados con H5N1 M2KO(AM) expuestos 4 semanas después de la inmunización con el virus Vietnam/1203/2004.
Descripción detallada
I. Definiciones
En el presente documento se usan las siguientes expresiones, cuyas definiciones se proporcionan a modo de orientación.
Como se usan en el presente documento, las formas en singular "un", "uno/una", y "el/la" designan tanto el singular como el plural, a menos que se indique expresamente que designan solamente el singular.
El término "aproximadamente" y el uso de intervalos en general, independientemente de que estén modificados o no por el término "aproximadamente", significa que el número comprendido no está limitado al número exacto establecido en el presente documento y se entiende que hace referencia a intervalos sustancialmente dentro del intervalo citado sin alejarse del alcance de la invención. Como se usa en el presente documento, "aproximadamente" será entendido por personas expertas en la materia y variará en cierta medida en función del contexto en el que se use. Si hay usos del término que no son claros para los expertos en la materia dado el contexto en el que se usen, "aproximadamente" significará hasta más o menos un 10 % del término particular.
Como se usa en el presente documento, "sujeto" y "paciente" se usan indistintamente y se refieren a un animal, por ejemplo, un miembro de cualquier especie de vertebrado. Los métodos y composiciones de la materia objeto desvelada en la presente son particularmente útiles para vertebrados homeotermos, incluyendo mamíferos y aves. Los sujetos ilustrativos pueden incluir mamíferos tales como seres humanos, así como mamíferos y aves de importancia por estar en peligro de extinción, de importancia económica (animales criados en granjas para consumo humano) y/o de importancia social (animales mantenidos como mascotas o en zoológicos) para los seres humanos. El sujeto puede ser un ser humano. El sujeto puede no ser humano.
Como se usan en el presente documento, las expresiones "cantidad eficaz" o "cantidad terapéuticamente eficaz" o "cantidad farmacéuticamente eficaz" se refieren a una cantidad suficiente para lograr un efecto terapéutico y/o profiláctico deseado, p. ej., una cantidad que dé lugar a la prevención de, enfermedad, afección y/o síntoma o síntomas de las mismas. En el contexto de aplicaciones terapéuticas o profilácticas, la cantidad de una composición administrada al sujeto dependerá del tipo y la gravedad de la enfermedad y de las características del individuo, tales como la salud general, la edad, el sexo, el peso corporal y la tolerancia a los fármacos de composición. También dependerá del grado, la gravedad y el tipo de enfermedad o afección. El experto podrá determinar las dosis adecuadas dependiendo de estos y otros factores. Pueden administrarse múltiples dosis. Adicionalmente, o como alternativa, se pueden administrar múltiples composiciones o compuestos terapéuticos (p. ej., composiciones inmunogénicas tales como vacunas).
Como se usan en el presente documento, los términos "aislado" y/o "purificado" se refieren a preparación in vitro, aislamiento y/o purificación de un ácido nucleico (p. ej., un vector o plásmido), polipéptido, virus o célula de modo que no esté asociado con sustancias no deseadas in vivo o se purifique sustancialmente de sustancias no deseadas in vivo con las que se produce normalmente. Por ejemplo, puede obtenerse una preparación de virus aislado mediante cultivo in vitro y propagación, y está sustancialmente exento de otros agentes infecciosos. Como se usa en el presente documento, "sustancialmente exento" significa por debajo del nivel de detección de un compuesto en particular, tal como ácidos nucleicos, proteínas, células, virus, agentes infecciosos, etc. no deseados usando métodos de detección convencionales para ese compuesto o agente.
Como se usa en el presente documento, la expresión "virus recombinante" se refiere a un virus que se ha manipulado in vitro, p. ej., usando técnicas de ácidos nucleicos recombinantes, para introducir cambios en el genoma vírico y/o introducir cambios en las proteínas víricas. Por ejemplo, los virus recombinantes pueden incluir tanto secuencias de ácido nucleico endógenas, de tipo silvestre, como secuencias de ácido nucleico mutantes y/o exógenas. Adicionalmente, o como alternativa, los virus recombinantes pueden incluir componentes proteicos modificados, tales como matriz mutante o variante, hemaglutinina, neuraminidasa, nucleoproteína, proteínas no estructurales y/o polimerasas.
Como se usa en el presente documento, la expresión "célula recombinante" o "célula modificada" se refiere a una célula que se ha manipulado in vitro, p. ej., usando técnicas de ácidos nucleicos recombinantes, para introducir ácido nucleico en la célula y/o modificar ácidos nucleicos celulares. Los ejemplos de células recombinantes incluyen células procariotas o eucariotas que portan plásmidos exógenos, vectores de expresión y similares, y/o células que incluyen modificaciones en su ácido nucleico celular (p. ej., sustituciones, mutaciones, inserciones, supresiones, etc., en el genoma celular). Una célula recombinante ilustrativa es una que se ha manipulado in vitro para expresar una proteína exógena, tal como una proteína M2 vírica.
Como se usa en el presente documento, los términos "mutante", "mutación" y "variante" se usan indistintamente y se refieren a una secuencia de ácido nucleico o polipéptido que difiere de una secuencia de tipo silvestre. Las secuencias mutantes o variantes pueden ser de origen natural. La secuencia mutante o variante puede introducirse de forma recombinante y/o química. Las mutaciones de ácidos nucleicos pueden incluir modificaciones (p. ej., adiciones, supresiones, sustituciones) de secuencias de ARN y/o ADN. Las modificaciones pueden incluir modificación química (p. ej., metilación) y también pueden incluir la sustitución o adición de nucleótidos naturales y/o no naturales. Las mutaciones de ácidos nucleicos pueden ser mutaciones silenciosas (p. ej., Uno o más cambios de ácidos nucleicos que codifican el mismo aminoácido que la secuencia de tipo silvestre) o pueden dar lugar a un cambio en el aminoácido codificado, dar lugar a un codón de terminación o pueden introducir defectos de corte y empalme o alteraciones de corte y empalme. Las mutaciones de ácidos nucleicos en secuencias codificantes también pueden dar lugar a cambios de aminoácidos conservadores o no conservadores.
Como se usa en el presente documento, el término "ARNv" se refiere al ARN que comprende un genoma vírico, incluyendo genomas víricos segmentados o no segmentados, así como genomas víricos de hebra positiva y negativa. El ARNv puede ser completamente endógeno y de "tipo silvestre" y/o puede incluir secuencias recombinantes y/o mutantes.
Como se usa en el presente documento, la expresión "célula hospedadora" se refiere a una célula en la que un patógeno, tal como un virus, puede replicarse. Las células hospedadoras pueden ser células cultivadas in vitro (p. ej., células CHO, células Vero, células MDCK, etc.) Adicionalmente, o como alternativa, las células hospedadoras pueden ser in vivo (p. ej., células de un vertebrado infectado, tal como un ave o un mamífero). Las células hospedadoras pueden modificarse, p. ej., para mejorar la producción vírica, tal como mediante la mejora de la infección vírica de la célula hospedadora y/o la mejora de la velocidad de crecimiento vírico. A modo de ejemplo, pero no a modo de limitación, las modificaciones ilustrativas de la célula hospedadora incluyen la expresión recombinante de receptores de ácido siálico con enlaces 2-6 en la superficie celular de la célula hospedadora y/o la expresión recombinante de una proteína en las células hospedadoras que se ha vuelto ausente o ineficaz en el patógeno o virus.
Como se usa en el presente documento, el término "infectado" se refiere a albergar una enfermedad o patógeno, tal como un virus. Una infección puede ser intencionada, tal como por la administración de un virus o patógeno (p. ej., por vacunación), o no intencionada, tal como por transferencia natural del patógeno de un organismo a otro, o de una superficie contaminada al organismo.
Como se usa en el presente documento, el término "atenuado", como se usa junto con un virus, se refiere a un virus que tiene una virulencia o patogenicidad reducida en comparación con un homólogo no atenuado, pero aún es viable o está vivo. Normalmente, la atenuación hace a un agente infeccioso, tal como un virus, menos perjudicial o virulento para un sujeto infectado en comparación con un virus no atenuado. Esto contrasta con el virus destruido o completamente inactivado.
Como se usa en el presente documento, el término "tipo" y "cepa", como se usan junto con un virus, se usan indistintamente y se usan para hacer referencia en general a virus que tienen características diferentes. Por ejemplo, el virus de la gripe A es un tipo de virus diferente al virus de la gripe B. De manera análoga, la gripe A H1N1 es un tipo de virus diferente al de la gripe A H2N1, H2N2 y H3N2. Adicionalmente, o como alternativa, diferentes tipos de virus tales como los de la gripe A H2N1, H2N2 y H3N2 pueden denominarse "subtipos".
Como se usa en el presente documento, "M2KO" o "M2KO(ATM)" se refiere a la SEQ ID NO: 1, un virus que comprende la SEQ ID NO: 1 o una vacuna que comprende un virus que comprende la SEQ ID NO: 1, dependiendo del contexto en el que se use. Por ejemplo, al describir las mutaciones del gen M2 demostradas en el presente documento, "M2KO" o "M2KO(ATM)" se refiere a la SEQ ID NO: 1. Al describir el componente vírico de una vacuna, "M2KO" o "M2KO(ATM)" se refiere a un virus de la gripe recombinante que posee 6 genes internos de PR8 (nucleoproteína (NP), genes de la polimerasa (PA, PB1, p B2), no estructural (NS), matriz (M)), pero que no expresa la proteína M2 funcional. Al describir una vacuna, "M2KO" o "M2KO(ATM)" se refiere a una vacuna que comprende el virus recombinante M2KO(AM).
Como se usa en el presente documento, el "virus M2KO(ATM)" abarca un virus de la gripe recombinante que posee 6 genes internos de PR8 (nucleoproteína (NP), genes de la polimerasa (PA, PB1, PB2), no estructural (NS), matriz (M)), pero que no expresa la proteína M2 funcional, solos o en combinación con otros componentes víricos y/o genes que codifican otros componentes víricos. El virus M2KO(ATM) puede comprender genes de otros virus de la gripe. El virus puede comprender los genes HA y NA de gripe A/Uruguay/716/2007(H3N2) similar a A/Brisbane/10/2007. El virus M2KO(AM) puede comprender los genes HA y NA del virus A/Vietnam/1203/2004 (H5N1). El virus M2KO (AM) puede comprender los genes HA y NA del virus A/California/07/2009 (CA07) (H1N1pdm).
II. Virus de la gripe A
A. General
La gripe es una de las causas principales de muerte entre los adultos estadounidenses. El agente causante de la gripe son los virus de la familia Orthomyxoviridae, incluyendo el virus de la gripe A, virus de la gripe B y virus de la gripe C, siendo la gripe A la más habitual y virulenta en seres humanos.
El virus de la gripe A es un virus de ARN de hebra negativa. El genoma del virus de la gripe A está contenido en ocho cadenas de ARN individuales (no emparejadas) cuyos complementos codifican once proteínas (HA, NA, NP, M1, M2, NS1, NEP, PA, PB1, PB1-F2, PB2). El tamaño total del genoma es de aproximadamente 14000 bases. La naturaleza segmentada del genoma permite el intercambio de genes completos entre diferentes cepas víricas durante la cohabitación celular. Los ocho segmentos de ARN son los siguientes. 1) HA codifica hemaglutinina (se necesitan aproximadamente 500 moléculas de hemaglutinina para producir un virión); 2) NA codifica neuraminidasa (se necesitan aproximadamente 100 moléculas de neuraminidasa para producir un virión); 3) NP codifica nucleoproteína; 4) M codifica dos proteínas (la M1 y la M2) usando diferentes marcos de lectura del mismo segmento de ARN (se necesitan aproximadamente 3000 moléculas de M1 para producir un virión); 5) NS codifica dos proteínas (NS1 y NEP) usando diferentes marcos de lectura del mismo segmento de ARN; 6) PA codifica una ARN polimerasa; 7) PB1 codifica una ARN polimerasa y una proteína PB1-F2 (induce apoptosis) usando diferentes marcos de lectura del mismo segmento de ARN; 8) PB2 codifica una ARN polimerasa.
Hay varios subtipos de gripe A, nombradas según un número H (para el tipo de hemaglutinina) y un número N (para el tipo de neuraminidasa). En la actualidad, hay 16 antígenos H diferentes conocidos (H1 a H16) y nueve antígenos N diferentes conocidos (N1 a N9). Cada subtipo de virus ha mutado en diversas cepas con diferentes perfiles patógenos; algunos patógenos para una especie pero no para otras, algunos patógenos para múltiples especies. Los subtipos de virus de la gripe A ilustrativos que se han confirmado en seres humanos incluyen, pero sin limitación, H1N1 que causó la "gripe española" y el brote de gripe porcina de 2009; H2N2 que causó la "gripe asiática" a finales de la década de 1950; H3N2 que causó la gripe de Hong Kong a finales de la década de 1960; H5N1, considerada una amenaza de pandemia de gripe mundial debido a su propagación a mediados de la década de 2000; H7N7; H1N2 que actualmente es endémico en seres humanos y cerdos; y H9N2, H7N2, H7N3, H5N2, H10N7.
Algunas variantes de la gripe A se identifican y nombran según el aislado conocido al que son más similares y, por tanto, se supone que comparten el linaje (p. ej., tipo virus de la gripe de Fujian); según su hospedador habitual (ejemplo virus de la gripe humana); según su subtipo (ejemplo H3N2); y según su patogenia (ejemplo LP, baja patogenia). Por tanto, una gripe de un virus similar al aislado A/Fujian/411/2002(H3N2) se puede denominar gripe de Fujian, gripe humana y gripe H3N2.
Además, las variantes de la gripe se nombran en ocasiones según la especie (hospedador) para la que la cepa es endémica o está adaptada. Las principales variantes nombradas que usan esta convención son: gripe aviar, gripe humana, gripe porcina, gripe equina y gripe canina. También se han nombrado variantes según su patogenia en aves de corral, especialmente pollos, p. ej., gripe aviar de baja patogenia (LPAI) y gripe aviar de alta patogenia (HPAI).
B. Ciclo de vida y estructura
El ciclo de vida de los virus de la gripe implica en general la unión a receptores de la superficie celular, entrada en la célula y descubrimiento del ácido nucleico vírico, seguido de la replicación de los genes víricos dentro de la célula. Después de la síntesis de nuevas copias de proteínas y genes víricos, estos componentes se ensamblan en partículas de virus descendientes, que a continuación salen de la célula. Diferentes proteínas víricas desempeñan una función en cada una de estas etapas.
La partícula de gripe A está formada por una envoltura lipídica que encapsula el núcleo vírico. El lado interior de la envoltura está revestido por la proteína de la matriz (M1), mientras que la superficie exterior se caracteriza por dos tipos de espículas de glucoproteína: hemaglutinina (HA) y neuraminidasa (Na ). M2, una proteína de canal iónico transmembrana, también forma parte de la envoltura lipídica. Véase, p. ej., figura 1.
La proteína HA, una proteína de membrana trimérica de tipo I, es responsable de la unión a sialiloligosacáridos (oligosacáridos que contienen ácido siálico terminal unido a galactosa) en las glucoproteínas o glucolípidos de la superficie de la célula hospedadora. Esta proteína también es responsable de la fusión entre las membranas vírica y de la célula hospedadora, después de la internalización del virión por endocitosis.
La neuraminidasa (NA), una proteína de membrana tetramérica de tipo II, es una sialidasa que escinde restos de ácido siálico terminales de los glucoconjugados de las células hospedadoras y la HA y NA, y por tanto se reconoce como enzima destructora de receptores. Esta actividad sialidasa es necesaria para la liberación eficiente de viriones descendientes de la superficie de la célula hospedadora, así como la prevención de la agregación de la descendencia debido a la actividad de unión de las HA víricas con otras glucoproteínas. Por tanto, la actividad de unión al receptor de la HA y la actividad destructora de receptores de la NA probablemente actúen como contrapesos, permitiendo la replicación eficiente de la gripe.
Los segmentos del genoma están empaquetados en el núcleo de la partícula vírica. El RNP (ARN más nucleoproteína, NP) está en forma helicoidal con tres polipéptidos de polimerasa vírica asociados con cada segmento.
El ciclo de vida del virus de la gripe comienza con la unión de la HA a los receptores que contienen ácido siálico en la superficie de la célula hospedadora, seguido de endocitosis mediada por receptores. Figura 1. El pH bajo en los endosomas tardíos desencadena un cambio conformacional en la HA, exponiendo de este modo el extremo N de la subunidad HA2 (el denominado péptido de fusión). El péptido de fusión inicia la fusión de la membrana vírica y endosómica, y la proteína de la matriz (M1) y los complejos de RNP se liberan en el citoplasma. Los RNP consisten en la nucleoproteína (NP), que encapsida ARNv, y el complejo de polimerasa vírica, que está formado por las proteínas PA, PB1 y PB2. Los RNP se transportan al núcleo, donde tienen lugar la transcripción y la replicación. El complejo de ARN polimerasa cataliza tres reacciones diferentes: (1) síntesis de un ARNm con una caperuza 5' y una estructura poliA 3', (2) un ARN complementario (ARNc) de longitud completa y (3) ARNv genómico que usa el ADNc como molde. Los ARNv recién sintetizados, NP y proteínas de polimerasa se ensamblan a continuación en RNP, se exportan desde el núcleo y se transportan a la membrana plasmática, donde se produce la gemación de las partículas víricas descendientes. La proteína neuramimidasa (NA) desempeña una función tardía en la infección al eliminar el ácido siálico de los sialiloligosacáridos, liberando de este modo viriones recién ensamblados de la superficie celular y evitando la autoagregación de partículas víricas. Aunque el ensamblaje del virus implica interacciones proteínaproteína y proteína-ARNv, la naturaleza de estas interacciones sigue siendo en gran parte desconocida.
C. Función de la proteína M2
Como se ha descrito anteriormente, hay tres proteínas que atraviesan la membrana vírica: hemaglutinina (HA), neuramimidasa (NA) y M2. Los dominios extracelulares (ectodominios) de HA y NA son bastante variables, mientras que el dominio ectodominio de M2 es esencialmente invariante entre los virus de la gripe A. Sin desear quedar ligados a teoría alguna, en los virus de la gripe A, se cree que la proteína M2 que posee actividad de canal iónico actúa en un estado temprano en el ciclo de vida vírico entre la penetración de la célula hospedadora y la eliminación del ARN vírico. Una vez que los viriones han experimentado endocitosis, se cree que el canal iónico M2 asociado al virión, un haz helicoidal homotetramérico, permite que los protones fluyan desde el endosoma hacia el interior del virión para interrumpir las interacciones del complejo de proteína M1-ribonucleoproteína (RNP) lábil frente a ácidos, promoviendo de este modo la liberación de RNP en el citoplasma. Además, entre algunas cepas de gripe cuyas HA se escinden intracelularmente (p. ej., A/peste aviar/Rostock/34), se cree que el canal iónico M2 eleva el pH de la red trans-Golgi, previniendo cambios conformacionales en la HA debido a condiciones de pH bajo en este compartimento. También se ha mostrado que el dominio transmembrana M2 en sí mismo puede actuar como un canal iónico. Se cree que la actividad de canal iónico de la proteína M2 es esencial en el ciclo de vida de los virus de la gripe, debido a que se ha mostrado que el clorhidrato de amantadina, que bloquea la actividad del canal iónico M2, inhibe la replicación vírica. Sin embargo, no se ha demostrado directamente un requisito para esta actividad en la replicación de los virus de la gripe A. La estructura de la proteína M2 se muestra en la figura 2. La secuencia de ácido nucleico de la proteína M2, junto con la secuencia M1, se muestra en la figura 3.
Aunque los virus de la gripe B y C son estructural y funcionalmente similares al virus de la gripe A, hay algunas diferencias. Por ejemplo, el virus de la gripe B no tiene una proteína M2 con actividad de canal iónico. En cambio, la proteína NB, un producto del gen de NA, probablemente tiene actividad de canal iónico y, por tanto, una función similar a la proteína M2 del virus de la gripe A. De manera similar, el virus de la gripe C no tiene una proteína M2 con actividad de canal iónico. Sin embargo, es probable que la proteína CM1 del virus de la gripe C tenga esta actividad.
III. Mutantes víricos M2
La reivindicación 1 desvela un virus de la gripe A que alberga una secuencia de ARNv de M2 mutante. Normalmente, dichos mutantes no tienen actividad de canal iónico M2, presentan propiedades de crecimiento atenuadas in vivo, no pueden producir descendencia infecciosa y no son patógenos o muestran una patogenia reducida en sujetos infectados. Los virus mutantes son inmunogénicos y, cuando se usan como vacuna, proporcionan protección contra la infección con un virus homólogo de tipo silvestre y/u otro virus patógeno. Adicionalmente, los mutantes M2 desvelados en el presente documento son estables y no mutan para expresar un polipéptido M2 funcional, independientemente de la célula hospedadora usada. Adicionalmente, o como alternativa, la proteína M1 de estos mutantes puede producirse sin alteración detectable de su función. Los virus que albergan las secuencias de ácidos nucleicos de M2 mutantes pueden no replicarse en una célula hospedadora en la que podría propagarse un virus de tipo silvestre correspondiente. A modo de ejemplo, pero no a modo de limitación, el virus de tipo silvestre se puede cultivar, propagar y replicar en el cultivo de células MDCK, células CHO y/o células Vero, mientras que el virus correspondiente que alberga una secuencia M2 mutante no puede crecer, replicarse o propagarse en el mismo tipo de células.
Como se ha indicado anteriormente, el virus mutante M2 puede ser estable y no muta ni revierte a una secuencia de tipo silvestre o de tipo no silvestre que codifica una proteína M2 funcional en una célula hospedadora. Por ejemplo, el virus mutante M2 puede ser estable durante 2 pases, 3 pases, 5 pases, 10 pases, 12 pases, 15 pases, 20 pases, 25 pases o más de 25 pases en una célula hospedadora. La célula hospedadora puede ser una célula hospedadora sin modificar. La célula hospedadora puede ser una célula hospedadora modificada, tal como una célula MDCK que expresa la proteína M2.
Los mutantes M2 pueden incluir una o más sustituciones y/o supresiones de ácidos nucleicos. Las mutaciones pueden estar localizadas en ácidos nucleicos que codifican uno o más del dominio extracelular de la proteína M2, el dominio transmembrana de las proteínas M2 y/o la cola citoplasmática de la proteína M2. Adicionalmente, o como alternativa, una o más mutaciones de ácido nucleico pueden dar lugar a una variante de corte y empalme, uno o más codones de terminación y/o una o más supresiones de aminoácidos del péptido M2. Los virus que portan el ácido nucleico M2 mutante pueden producir un polipéptido M2 no funcional. Los virus que portan el ácido nucleico M2 mutante pueden no producir un polipéptido m 2. Los virus que portan el ácido nucleico M2 mutante pueden producir un polipéptido M2 truncado. El polipéptido M2 truncado puede tener la secuencia de aminoácidos MSLLTEVETPIRNEWGCRCNGSSD (SEQ ID NO: 4).
Se proporcionan a continuación tres mutantes víricos M2 no limitantes, ilustrativos (M2-1, M2-2 y M2-3) en las tablas 1-3. En las tablas, las letras minúsculas corresponden a la secuencia M2; las letras mayúsculas corresponden a la secuencia M1; la secuencia mutante (p. ej., codones de terminación, defecto de corte y empalme) está en negrita, subrayada. Las bases subrayadas (minúsculas) en el mutante M2-2 indican la región suprimida en los mutantes M2-1 y M2-3.
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La secuencia del polipéptido M2 producida a partir de este mutante es la siguiente: MSLLTEVETPIRNEWGCRCNGSSD. (SEQ ID NO: 4).
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No se produce ninguna secuencia de poMpéptido M2 a partir de este mutante.
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No se produce ninguna secuencia de polipéptido M2 a partir de este mutante.
Adicionalmente, o como alternativa, pueden introducirse mutaciones M2 en la cola citoplasmática. Figura 2. La cola citoplasmática de la proteína M2 es un mediador de la producción de virus infecciosos. Los truncamientos de la cola citoplasmática M2 pueden dar lugar a una disminución de los títulos de virus infecciosos, una reducción de la cantidad de ARN vírico empaquetado, una disminución de los acontecimientos de gemación y una reducción de la eficiencia de gemación. Se ha mostrado que la secuencia 5' es más importante que la secuencia 3' para el empaquetamiento del genoma y que una secuencia 5' más larga es mejor para el empaquetamiento del genoma. Además, los estudios han mostrado que la longitud de los nucleótidos es importante, pero la secuencia real lo es menos (las secuencias aleatorias son suficientes para generar virus). Ha sido difícil desarrollar mutantes estables de cola citoplasmática M2 y la bibliografía incluye numerosos ejemplos de reversión de mutantes.
Por ejemplo, Pekosz et al. JVI, 2005; 79 (6): 3595-3605, reemplazaron dos codones con codones de terminación en la posición de aminoácido 70, pero el virus pronto revirtió. Otra mutación ilustrativa de la cola citoplasmática de M2 se denomina M2sup11. En el mutante M2sup1 1, se suprimen 11 restos de aminoácidos del extremo carboxilo de la cola citoplasmática. Este truncamiento se debe a la introducción de dos codones de terminación y no se produce un polipéptido M2 de longitud completa. Aunque este mutante es estable cuando se pasa en células MDCK que expresan M2 (M2CK), revierte a M2 de longitud completa durante el pase en células MDCK normales (J Virol. 200882 (5): 2486­ 92). Sin desear quedar ligados a teoría alguna, es probable que la reversión se produzca con presión selectiva en las células MDCK.
Otro mutante de cola citoplasmática M2, M2terminación90ala78-81 no redujo el título del virus, pero ala70-77 sí (JVI 2006; 80 (16) págs. 8178-8189). Los experimentos de exploración de alanina indicaron además que los aminoácidos en las posiciones 74 a 79 de la cola M2 desempeñan una función en la morfogénesis del virión y afectan a la infecciosidad vírica. (J Virol. 200680(11): 5233-40)
En consecuencia, se presentan en el presente documento nuevos mutantes citoplasmáticos, con características diferentes a las descritas anteriormente. Por ejemplo, los mutantes citoplasmáticos pueden ser estables (no revierten para expresar un polipéptido M2 de longitud completa) en células MDCK. Los mutantes citoplasmáticos pueden ser estables durante 2 pases, 3 pases, 5 pases, 10 pases, 15 pases, 20 pases, 25 pases o más de 25 pases en una célula hospedadora.
El polipéptido M2 de tipo silvestre se muestra a continuación en la tabla 4. Para cada una de las secuencias, el texto en negrita indica el dominio transmembrana. El dominio extracelular es el primero (izquierda), seguido del dominio transmembrana (centro) y la secuencia de la cola citoplasmática (derecha).
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Se generó M2-4 (M2sup FG#1) pero no fue pasable en células MDCK normales, pero puede ser pasable en una célula hospedadora modificada (p. ej., una célula que expresa un polipéptido M2 de tipo silvestre). Se generaron M2-5 (M2sup FG#2) y M2-6 (FG#3) y se pasaron en células MDCK normales. La secuencia de nucleótidos del gen M de estos virus es estable al menos hasta el pase 10 en células MDCK. Estos mutantes también podrían propagarse y pasarse a otras células (p. ej., células que apoyan la replicación de la gripe). También se encontró que estos mutantes no están atenuados y son patógenos.
Como se describe en los ejemplos más adelante, los virus mutantes M2 descritos en el presente documento no se replican en las vías respiratorias ni se diseminan a otros órganos en el modelo de hurón y no se transmiten en el modelo de hurón. Las vacunas que comprenden el mutante M2 inducen respuestas inmunitarias robustas en mamíferos y protegen a los mamíferos contra la exposición al virus de la gripe. El virus M2KO induce respuestas inmunitarias humorales y mucosas en ratones y protege a los ratones de la exposición letal homosubtípica y heterosubtípica. Las vacunas que comprenden el virus mutante M2 como se describe en el presente documento proporcionan una protección eficaz contra la exposición a la gripe y tienen la ventaja de estar atenuadas en hospedadores mamíferos. Estos hallazgos demuestran que los virus mutantes M2 descritos en el presente documento son útiles para vacunas contra la gripe.
IV. Sistema de producción de virus basado en células
A. Producción de virus mutantes de "primera generación"
El virus mutante, tal como los que portan el ácido nucleico M2 mutante, puede ser generado por genética inversa basada en plásmidos como se describe en Neumann et al., Generation of influenza A viruses entirely from clone cDNAs, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 9345-9350 (1999). En resumen, las células hospedadoras eucariotas se transfectan con uno o más plásmidos que codifican los ocho ARN víricos. Cada secuencia de ARN vírico está flanqueada por un promotor de ARN polimerasa I y un terminador de ARN polimerasa I. Notablemente, el ARN vírico que codifica la proteína M2 incluye la secuencia de ácido nucleico M2 mutante. La célula hospedadora se transfecta adicionalmente con uno o más plásmidos de expresión que codifican las proteínas víricas (p. ej., polimerasas, nucleoproteínas y proteínas estructurales), incluyendo una proteína M2 de tipo silvestre. La transfección de la célula hospedadora con los plásmidos de ARN vírico da lugar a la síntesis de los ocho ARN víricos de la gripe, uno de los cuales alberga la secuencia M2 mutante. Las polimerasas y nucleoproteínas víricas cotransfectadas ensamblan los ARN víricos en RNPv funcionales que se replican y transcriben, formando en última instancia el virus de la gripe infecciosa que tiene una secuencia de ácido nucleico M2 mutante, teniendo aún un polipéptido M2 funcional incorporado en la envoltura lipídica vírica.
Los métodos alternativos para producir un virus mutante de "primera generación" incluyen un sistema de transfección de ribonucleoproteína (RNP) que permite el reemplazo de genes del virus de la gripe con moléculas de ARN recombinante generadas in vitro, como se describe en Enami y Palese, High-efficiencyformation of influenza virus transfectants, J. Virol. 65 (5): 2711-2713.
Se sintetiza el ARN vírico in vitro y los transcritos de ARN están recubiertos con nucleoproteína (NP) vírica y proteínas de polimerasa que actúan como RNP biológicamente activos en la célula transfectada como se demostró en Luytjes et al., Amplification, expression, and packaging of a foreign gene by influenza virus, Cell 59: 1107-1113.
El método de transfección de RNP se puede dividir en cuatro etapas: 1) Preparación de ARN: el ADN plasmídico que codifica un segmento del virus de la gripe se transcribe en ARN de sentido negativo en una reacción de transcripción in vitro; 2) Encapsidación del ARN: el ARN transcrito se mezcla después con NP purificada en gradiente y proteínas de polimerasa aisladas del virus de la gripe interrumpido para formar un complejo de RNP biológicamente activo; 3) Transfección y rescate del ARN encapsidado: la ribonucleocápsida artificial se transfecta a las células previamente infectadas con un virus auxiliar de la gripe que contiene un gen diferente del que se está rescatando; el virus auxiliar amplificará el ARN transfectado; 4) Selección del gen transfectado: debido a que tanto el virus auxiliar como el transfectante que contiene el gen rescatado están en el sobrenadante del cultivo, es necesario un sistema de selección adecuado que use anticuerpos para aislar el virus que porta el gen transfectado.
El sistema de selección permite la generación de nuevos virus de gripe transfectantes con características biológicas y moleculares específicas. La selección de anticuerpos contra una proteína de la superficie diana puede usarse a continuación para la selección positiva o negativa.
Por ejemplo, un virus transfectante o mutante que contiene un gen M2 que no expresa una proteína M2 puede cultivarse en una línea celular de mamífero adecuada que se ha modificado para expresar de manera estable la proteína M2 funcional de tipo silvestre. Para prevenir o inhibir la replicación del virus auxiliar que expresa el gen M2 de tipo silvestre y, por lo tanto, la proteína M2e en la superficie de la membrana, pueden usarse anticuerpos contra M2e. Dichos anticuerpos están disponibles en el mercado e inhibirían la replicación del virus auxiliar y permitirían que el virus transfectante/mutante que contiene el M2 mutante crezca y se enriquezca en el sobrenadante. La inhibición de la replicación del virus de la gripe por los anticuerpos de M2e se ha descrito previamente en la proteína M2 del virus de la gripe A: restricción de anticuerpos monoclonales del crecimiento del virus y detección de M2 en viriones, J Virol 62: 2762-2772 (1988) y Treanor et al, El anticuerpo monoclonal transferido de forma pasiva a la proteína M2 inhibe la replicación del virus de la gripe A en ratones, J. Virol. 64: 1375-1377 (1990).
Adicionalmente, o como alternativa, se pueden usar los mismos anticuerpos para "capturar" el virus auxiliar y permitir el enriquecimiento del transfectante. Por ejemplo, los anticuerpos se pueden usar para revestir el fondo de una placa de cultivo tisular o se pueden usar en una matriz de columna para permitir el enriquecimiento del transfectante en el sobrenadante o eluido.
El virus transfectante puede cultivarse en células que expresan M2 en placas de pocillos múltiples mediante dilución límite y a continuación identificarse y clonarse, por ejemplo, creando placas de réplica. Por ejemplo, la mitad de una alícuota de un pocillo dado de la placa de múltiples pocillos que contiene el virus cultivado se puede usar para infectar células MDCK y la otra mitad para infectar células MDCK que expresan la proteína M2. Tanto el virus transfectante como el virus auxiliar crecerán en células MDCK que expresan la proteína M2. Sin embargo, solo el virus auxiliar crecerá en células MDCK convencionales, lo que permitirá identificar el pocilio en la placa de múltiples pocilios que contiene el transfectante. El virus transfectante se puede purificar adicionalmente en placa en las células que expresan la proteína M2.
B. Propagación de mutantes víricos
Los mutantes víricos descritos en el presente documento pueden mantenerse y pasarse en células hospedadoras. A modo de ejemplo, pero no reivindico, las células hospedadoras ilustrativas adecuadas para el crecimiento de mutantes víricos de la gripe, tales como mutantes víricos de la gripe A incluyen cualquier cantidad de células eucariotas, incluyendo, pero sin limitación, células renales caninas Madin-Darby (células MDCK), células de simio tales como células de mono verde africano (p. ej., células Vero), células CV-1 y células renales de mono rhesus (p. ej., células LLcomk.2), células bovinas (p. ej., células MDBK), células de cerdo, células de hurón (p. ej., células pulmonares de visón) células BK-1, células de roedores (p. ej., células de ovario de hámster chino), células humanas, p. ej., células retinianas humanas embrionarias (p. ej., PER-C6®), células renales embrionarias humanas 293T y células aviares que incluyen fibroblastos embrionarios.
Adicionalmente, o como alternativa, la célula hospedadora eucariota puede modificarse para mejorar la producción vírica, p. ej., mejorando la infección vírica de la célula hospedadora y/o mejorando la tasa de crecimiento vírico. Por ejemplo, la célula hospedadora puede modificarse para expresar, o tener mayor expresión, de ácido siálico con enlaces 2,6 en la superficie celular, permitiendo una infección más eficiente y eficaz de estas células por virus de la gripe A mutantes o de tipo silvestre. Véase, p. ej., publicación de patente de los Estados Unidos n.° 2010-0021499 y patente de los Estados Unidos n.° 7176021. Por tanto, pueden usarse células de ovario de hámster chino (células CHO) y/o células Vero modificadas para expresar al menos una copia de un gen de 2,6-sialiltransferasa (ST6GAL 1). A modo de ejemplo, pero no a modo de limitación, la secuencia génica de beta-galatosamida alfa-2,6-sialiltransferasa ST6 de Homo sapiens indicada por el número de referencia BC040009.1, es un ejemplo de un gen de ST6Gal que puede integrarse y expresarse en una célula CHO. Una o más copias de un polinucleótido que codifica un producto génico de ST6Gal I funcional se pueden introducir por ingeniería genética en una célula. Es decir, se pueden usar células que se han transformado de manera estable para expresar 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 o más de 12 copias de un gen de ST6Gal I. Un solo casete de expresión puede incluir una o más copias del gen de ST6Gal I para expresar, que está ligado operativamente a elementos reguladores, tales como promotores, potenciadores y secuencias terminadoras y de señal de poliadenilación, para facilitar la expresión del gen de ST6Gal I o sus copias. Como alternativa, se puede diseñar por ingeniería genética un único casete de expresión para expresar una copia de un gen de ST6Gal I e integrarse múltiples casetes de expresión en el genoma de una célula hospedadora. En consecuencia, puede incorporarse al menos un gen de ST6Gal I en el genoma de una célula hospedadora, de manera que la célula exprese el gen de ST6Gal I y su producto proteico enzimático. Dependiendo del número de copias, una sola célula hospedadora puede expresar muchas proteínas del gen de ST6Gal I funcionales.
Se conocen bien en la técnica vectores adecuados para la clonación, transfección y producción de líneas celulares modificadas, estables. Un ejemplo no limitante incluye los vectores pcDNA3.1 (Invitrogen).
Adicionalmente, o como alternativa, la célula hospedadora eucariota puede modificarse para producir una versión de tipo silvestre de un gen vírico mutante, proporcionando de este modo el gen al virus en trans. Por ejemplo, una cepa vírica que alberga una proteína M2 mutante puede presentar una tasa de crecimiento mejorada (p. ej., mayor producción vírica) cuando se pasa a células hospedadoras que producen la proteína M2 de tipo silvestre. La cepa vírica a que alberga una proteína M2 mutante puede no crecer o replicarse en una célula que no expresa un gen M2 de tipo silvestre. Además, dichas células hospedadoras pueden ralentizar o prevenir la reversión vírica a una secuencia de M2 funcional, porque, por ejemplo, no existe una presión selectiva para la reversión en dicho hospedador.
Se conocen bien en la técnica métodos para producir tanto vectores de expresión como células hospedadoras modificadas. Por ejemplo, se puede preparar un vector de expresión de M2 situando la secuencia de ácido nucleico M2 (secuencia de ORF de M2; este es el codón de inicio de M2 "de tipo silvestre" para el codón de terminación (tabla 5)) a continuación en un vector de expresión eucariota.
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Las células hospedadoras (p. ej., células MDCK) se pueden transfectar después mediante métodos conocidos en la técnica, p. ej., usando reactivos y equipos disponibles en el mercado, tales como TransIT® LT1 (Mirus Bio, Madison, WI). A modo de ejemplo, pero no a modo de limitación, las células pueden seleccionarse y probarse para la expresión de M2 mediante cotransfección con un marcador detectable o un marcador seleccionable (p. ej., resistencia a higromicina) y/o mediante cribado, por ejemplo, con inmunotinción indirecta usando un anticuerpo de M2. La expresión de M2 se puede determinar mediante inmunotinción indirecta, citometría de flujo o ELISA.
A modo de ejemplo, pero no a modo de limitación, las células de riñón embrionario humano 293T y las células de riñón canino Madin-Darby (MDCK) se mantuvieron en medio de Eagle modificado por Dulbecco complementado con suero de ternero fetal al 10% y en medio esencial mínimo (MEM) que contenía suero de ternero neonato al 5%, respectivamente. Todas las células se mantuvieron a 37 °C en CO2 al 5 %. Se establecieron células MDCK resistentes a higromicina que expresan de manera estable la proteína M2 de A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) mediante cotransfección con el plásmido pRHyg, que contiene el gen de resistencia a higromicina y el plásmido pCAGGS/M2, expresando la proteína M2 de longitud completa, en una relación de 1:1. El clon de células MDCK estable (M2CK) que expresa M2 se seleccionó en medio que contenía 0,15 mg/ml de higromicina (Roche, Mannheim, Alemania) mediante el cribado con inmunotinción indirecta usando un anticuerpo monoclonal anti-M2 (14C2) (Iwatsuki et al., JVI, 2006, vol. 80, No.1, págs. 5233-5240). Las células M2CK se cultivaron en MEM complementado con suero de ternero fetal al 10 % y 0,15 mg/ml de higromicina. En las células M2CK, los niveles de expresión y localización de M2 fueron similares a los de las células infectadas por virus (datos no mostrados). Las células Vero que expresan M2 se pueden preparar de una manera similar.
Las células y los mutantes víricos se pueden cultivar y propagar mediante métodos bien conocidos en la técnica. A modo de ejemplo, pero no a modo de limitación, las células hospedadoras se pueden cultivar en presencia de MEM complementado con suero de ternero fetal al 10 %. Las células que expresan M2 se infectan a una MOI de 0,001 lavando con PBS seguido de adsorción del virus a 37 °C. Puede añadirse medio de crecimiento vírico que contenga tripsina/TPCK y las células se incuban durante 2-3 días hasta que se observe un efecto citopático.
A este respecto, se han desarrollado sistemas de biorreactores desechables para células de mamíferos, con o sin virus, cuyos beneficios incluyen una preparación más rápida de las instalaciones y un riesgo reducido de contaminación cruzada. Las células descritas en el presente documento, por ejemplo, se pueden cultivar en bolsas desechables tales como las de Stedim, bolsas Bioeaze de SAFC Biosciences, HybridBagTM de Cellexus Biosytems o biorreactores de un solo uso de HyClone o Celltainer de Lonza. Los biorreactores pueden tener formatos de tamaño de 1 l, 10 l, 50 l, 250 l, 1000 l. Las células pueden mantenerse en suspensión en medio optimizado sin suero, exento de productos animales. El sistema puede ser un sistema semicontinuo donde un cultivo se puede expandir en una sola bolsa de 1 l a 10 l, por ejemplo, o un sistema de perfusión que permite el aporte constante de nutrientes evitando al mismo tiempo la acumulación de subproductos potencialmente tóxicos en el medio de cultivo.
Para el almacenamiento a largo plazo, el virus mutante se puede almacenar como reservas congeladas.
V. Vacunas y método de administración
A. Composiciones/vacunas inmunogénicas
Hay diversos tipos diferentes de vacunas que se pueden preparar a partir del sistema de producción de virus basado en células desvelado en el presente documento. La presente divulgación incluye, pero no reivindica, la fabricación y producción de vacunas de virus vivos atenuados, vacunas de virus inactivados, vacunas de virus completos, vacunas de virus divididos, vacunas de virus virosómicos, vacunas de antígeno de superficie vírica y combinaciones de las mismas. Por tanto, existen numerosas vacunas capaces de producir una respuesta inmunitaria protectora específica para diferentes virus de la gripe donde las formulaciones adecuadas de cualquiera de estos tipos de vacunas son capaces de producir una respuesta inmunitaria, p. ej., una respuesta inmunitaria sistémica. Las vacunas de virus vivos atenuados tienen la ventaja de que también pueden estimular la inmunidad mucosa local en las vías respiratorias.
Los antígenos de vacuna usados en las composiciones descritas pero no reivindicadas en el presente documento pueden ser antígenos "directos", es decir, no se administran como ADN, sino que son los propios antígenos. Dichas vacunas pueden incluir un virus completo o solo parte del virus, tales como, pero sin limitación, polisacáridos víricos, ya sea que estén solos o conjugados con elementos transportadores, tales como proteínas transportadoras, microorganismos completos vivos atenuados, microorganismos inactivados, péptidos y proteínas recombinantes, glucoproteínas, glucolípidos, lipopéptidos, péptidos sintéticos o microorganismos rotos en el caso de las vacunas denominadas vacunas "divididas".
Las vacunas se desvelan en el presente documento pero no se reivindican. Puede proporcionarse una vacuna de virión completa. Una vacuna de virión completa puede concentrarse por ultrafiltración y después purificarse por centrifugación zonal o por cromatografía. Normalmente, el virión se inactiva antes o después de la purificación usando formalina o beta-propiolactona, por ejemplo.
Se puede proporcionar una vacuna subunitaria, que comprende glucoproteínas purificadas. Dicha vacuna se puede preparar de la siguiente manera: usando suspensiones víricas fragmentadas por tratamiento con detergente, se purifican los antígenos de superficie, por ejemplo, mediante ultracentrifugación. Por tanto, las vacunas subunitarias contienen principalmente proteína HA y también NA. El detergente usado puede ser un detergente catiónico, por ejemplo, tal como bromuro de hexadecil trimetil amonio, un detergente aniónico tal como desoxicolato de amonio; o un detergente no iónico tal como el comercializado con el nombre TRITON X100. La hemaglutinina también se puede aislar después del tratamiento de los viriones con una proteasa tal como bromelina, y después purificarse por métodos convencionales.
Se puede proporcionar una vacuna dividida, que comprende viriones que se han sometido a tratamiento con agentes que disuelven los lípidos. Se puede preparar una vacuna dividida de la siguiente manera: una suspensión acuosa del virus purificado obtenido como anteriormente, inactivado o no, se trata, con agitación, mediante disolventes lipídicos tales como éter etílico o cloroformo, asociados con detergentes. La disolución de los lípidos de la envoltura vírica da lugar a la fragmentación de las partículas víricas. Se recupera la fase acuosa que contiene la vacuna dividida, constituida principalmente por hemaglutinina y neuraminidasa con su entorno lipídico original eliminado, y el núcleo o sus productos de degradación. A continuación, las partículas infecciosas residuales se inactivan si aún no se ha hecho.
Se pueden proporcionar vacunas de virus de la gripe inactivados. Las vacunas inactivadas se pueden preparar mediante inactivación del virus usando métodos conocidos, tales como, pero sin limitación, tratamiento con formalina o p-propiolactona. Los tipos de vacunas inactivadas que se pueden usar pueden incluir vacunas de virus completo (WV) o vacunas subviriónicas (SV) (divididas). La vacuna WV contiene virus inactivado, intacto, mientras que la vacuna SV contiene virus purificado alterado con detergentes que solubilizan la envoltura vírica que contiene lípidos, seguido de inactivación química del virus residual.
Adicionalmente, o como alternativa, se pueden proporcionar vacunas de virus de la gripe vivos atenuados. Dichas vacunas pueden usarse para prevenir o tratar la infección por el virus de la gripe.
La atenuación se puede lograr en una sola etapa mediante la transferencia de genes atenuados de un virus donante atenuado a un virus aislado o reordenado según métodos conocidos (véase, p. ej., Murphy, Infect. Dis. Clin. Pract. 2, 174 (1993)). Un virus puede atenuarse mediante la mutación de una o más secuencias de ácido nucleico víricas, lo que da lugar a un virus mutante. Por ejemplo, la secuencia de ácido nucleico vírico mutante puede codificar un producto proteico defectuoso. El producto proteico puede tener una función disminuida o no tener función. No se puede producir ningún producto proteico a partir del ácido nucleico vírico mutante.
Por tanto, el virus puede atenuarse o inactivarse, formularse y administrarse, según métodos conocidos, como una composición inmunogénica (p. ej., como una vacuna) para inducir una respuesta inmunitaria en un animal, p. ej., un ave y/o un mamífero. Se conocen bien en la técnica métodos para determinar si dichas vacunas atenuadas o inactivadas han mantenido una antigenicidad similar a la del aislado clínico o una cepa de alto crecimiento procedente del mismo. Dichos métodos conocidos incluyen el uso de antisueros o anticuerpos para eliminar virus que expresan determinantes antigénicos del virus donante; selección química (p. ej., amantadina o rimantidina); actividad e inhibición de HA y NA; y cribado de ADN (tal como hibridación de sonda o PCR) para confirmar que los genes del donante que codifican los determinantes antigénicos (p. ej., genes HA o NA) u otras secuencias mutantes (p. ej., M2) no están presentes en los virus atenuados. Véase, p. ej., Robertson etal., Giornale di Igiene e Medicina Preventiva, 29, 4 (1988); Kilbourne, Bull. M2 World Health Org., 41, 643 (1969); y Robertson et al., Biologicals, 20, 213 (1992).
La vacuna puede incluir un virus de gripe atenuado que carece de expresión de una proteína M2 funcional. El virus mutante puede replicarse bien en células que expresan proteínas M2, pero en las células de tipo silvestre correspondientes, expresa proteínas víricas sin generar viriones descendientes infecciosos.
Las composiciones farmacéuticas, adecuadas para administración intradérmica, inoculación o para administración parenteral u oral, comprenden virus de la gripe atenuados o inactivados, y opcionalmente pueden comprender además soluciones, suspensiones o emulsiones acuosas o no acuosas estériles. Las composiciones pueden comprender además agentes auxiliares o excipientes, como se conoce en la técnica. Véase, p. ej., Berkow et al., The Merck Manual, 15a edición, Merck and Co., Rahway, N.J. (1987); Goodman et al., eds., Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, octava edición, Pergamon Press, Inc., Elmsford, N.Y. (1990); Avery's Drug Treatment: Principles and Practice of Clinical Pharmacology and Therapeutics, tercera edición, ADIS Press, LTD., Williams y Wilkins, Baltimore, Md. (1987); y Katzung, ed., Basic and Clinical Pharmacology, quinta edición, Appleton y Lange, Norwalk, Conn. (1992).
Las preparaciones para administración parenteral pueden incluir soluciones, suspensiones y/o emulsiones acuosas o no acuosas estériles, que pueden contener agentes auxiliares o excipientes conocidos en la técnica. Algunos ejemplos de disolventes no acuosos son propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales tales como aceite de oliva y ésteres orgánicos inyectables tales como oleato de etilo. Pueden usarse vehículos o vendajes oclusivos para aumentar la permeabilidad de la piel y mejorar la absorción de antígenos. Las formas de dosificación líquidas para administración oral pueden comprender en general una solución de liposomas que contienen la forma de dosificación líquida. Las formas adecuadas para suspender liposomas incluyen emulsiones, suspensiones, soluciones, jarabes y elixires que contienen diluyentes inertes usados habitualmente en la técnica, tales como agua purificada. Además de los diluyentes inertes, dichas composiciones también pueden incluir adyuvantes, agentes humectantes, agentes emulsionantes y de suspensión, o agentes edulcorantes, aromatizantes o perfumantes.
Cuando se usa una composición de la presente invención para la administración a un individuo, puede comprender además sales, tampones, adyuvantes u otras sustancias que sean deseables para mejorar la eficacia de la composición. Para vacunas, se pueden usar adyuvantes, sustancias que aumentan una respuesta inmunitaria específica. Normalmente, el adyuvante y la composición se mezclan antes de la presentación al sistema inmunitario, o se presentan por separado, pero en el mismo sitio del organismo que se inmuniza.
Las composiciones inmunogénicas (p. ej., vacunas) desveladas en el presente documento pueden incluir múltiples tipos diferentes de virus o antígenos víricos, al menos uno de los cuales incluye un gen M2 mutante (p. ej., un virus que comprende la mutación M2KO(AM) (SEQ ID NO: 1)) y/o una mutación correspondiente en el equivalente funcional M2 de ese virus (p. ej., la proteína NB de gripe B o la proteína CM1 de gripe C). Las composiciones inmunogénicas pueden incluir un solo tipo de virus o antígeno vírico que incluye un gen m 2 mutante (p. ej., un virus que comprende la mutación M2KO(AM) (SEQ ID NO: 1)) y/o una mutación correspondiente en el equivalente funcional M2 de ese virus (p. ej., la proteína NB de gripe B o la proteína CM1 de gripe C). Por ejemplo, el componente principal de una composición inmunogénica, tal como una composición de vacuna, puede incluir uno o más virus de la gripe de tipo A, B o C, o cualquier combinación de los mismos o cualquier combinación de antígenos de estos virus, en donde al menos un virus incluye un gen M2 mutante (p. ej., un virus que comprende la mutación M2KO(AM) (SEQ ID NO: 1)) y/o una mutación correspondiente en el equivalente funcional M2 de ese virus (p. ej., la proteína NB de gripe B o la proteína CM1 de gripe C). Por ejemplo, al menos dos de los tres tipos, al menos dos de diferentes subtipos, al menos dos del mismo tipo, se pueden proporcionar al menos dos del mismo subtipo o un aislado(s) o reagrupado(s) diferentes en una composición inmunogénica (p. ej., una vacuna). A modo de ejemplo, pero no a modo de limitación, el virus de la gripe humana de tipo A incluye los subtipos H1N1, H2N2 y H3N2. Las composiciones inmunogénicas (p. ej., vacunas) pueden incluir un virus que comprende un gen M2 mutante (p. ej., un virus que comprende la mutación M2KO(AM) (SEQ ID NO: 1)) y/o una mutación correspondiente en el equivalente funcional M2 de ese virus (p. ej., la proteína NB de gripe B o la proteína CM1 de gripe C) y de aproximadamente 0,1 a 200 |jg, p. ej., de 10 a 15 jg de hemaglutinina de cada una de las cepas que entran en la composición. Se puede proporcionar heterogeneidad en una vacuna mezclando virus de la gripe replicados para al menos dos cepas de virus de la gripe, tales como de 2 a 50 cepas, o cualquier intervalo o valor en el mismo. Se pueden usar cepas de virus de la gripe A o B que tengan una composición antigénica moderna. Además, se pueden proporcionar composiciones inmunogénicas (p. ej., vacunas) para variaciones en una sola cepa de un virus de la gripe, usando técnicas conocidas en la materia.
La vacuna puede comprender un virus que comprende la mutación M2KO(ATM) (SEQ ID NO: 1) junto con otros componentes víricos y/o genes que expresan otros componentes víricos. La vacuna (p. ej., un virus que comprende la mutación M2KO(AM) (SEQ ID NO: 1)) puede comprender genes de otras cepas víricas, incluyendo, pero sin limitación, por ejemplo, genes HA y NA de otras cepas víricas. La vacuna puede comprender genes HA y NA de los subtipos del virus de la gripe humana de tipo A H5N1, H1N1, H2N2 o H3N2. La vacuna puede comprender genes HA y NA de, por ejemplo, los virus PR8xBrisbane/10/2007, A/Vietnam/1203/2004 o A/California/07/2009 (CA07).
Una composición farmacéutica puede comprender además o adicionalmente al menos un compuesto quimioterapéutico, p. ej., para terapia génica, un inmunosupresor, un agente antiinflamatorio o un agente inmunoestimulante, o agentes antivíricos incluyendo, pero sin limitación, gammaglobulina, amantadina, guanidina, hidroxibencimidazol, interferón-a, interferón-p, interferón-y, factor de necrosis tumoral-a, tiosemicarbarzonas, metisazona, rifampicina, ribavirina, un análogo de pirimidina, un análogo de purina, foscarnet, ácido fosfonoacético, aciclovir, didesoxinucleósidos, un inhibidor de la proteasa o ganciclovir.
La composición también puede contener cantidades variables pero pequeñas de formaldehído sin endotoxinas y conservantes, que se ha descubierto que son seguros y no contribuyen a efectos indeseables en el organismo al que se administra la composición.
B. Administración
Una composición inmunogénica (p. ej., una vacuna) como se desvela en el presente documento puede administrarse mediante cualquiera de las vías usadas o recomendadas convencionalmente para las vacunas: vía parenteral, vía mucosa, y puede estar en diversas formas: líquido inyectable o pulverizable, formulación liofilizada o secada por atomización o secada al aire, etc. Las vacunas pueden administrarse mediante una jeringa o mediante un inyector sin aguja para inyección intramuscular, subcutánea o intradérmica. Las vacunas también se pueden administrar por medio de un nebulizador capaz de suministrar un polvo seco o un aerosol líquido a las membranas mucosas, ya sean nasales, pulmonares, vaginales o rectales.
Una vacuna como se desvela en el presente documento puede conferir resistencia a una o más cepas de la gripe mediante inmunización pasiva o inmunización activa. En inmunización activa, una composición de vacuna viva inactivada o atenuada se administra de forma profiláctica a un hospedador (p. ej., un mamífero) y la respuesta inmunitaria del hospedador a la administración protege contra infecciones y/o enfermedades. Para la inmunización pasiva, los antisueros inducidos pueden recuperarse y administrarse a un receptor sospechoso de tener una infección causada por al menos una cepa del virus de la gripe.
La presente divulgación incluye, pero no reivindica, métodos para prevenir o atenuar una enfermedad o un trastorno, p. ej., infección por al menos una cepa del virus de la gripe. Como se usa en el presente documento, se dice que una vacuna previene o atenúa una enfermedad si su administración da lugar a la atenuación total o parcial (es decir, supresión) de un síntoma o afección de la infección o la inmunidad total o parcial del individuo a la enfermedad.
Al menos un virus de la gripe inactivado o atenuado, o composición del mismo, de la presente invención se puede administrar por cualquier medio que logre los fines previstos, usando una composición farmacéutica como se ha descrito previamente. Por ejemplo, la administración de dicha composición puede ser mediante diversas vías parenterales tales como vías subcutánea, intravenosa, intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intranasal, oral o transdérmica. La administración parenteral puede ser mediante inyección en embolada o mediante perfusión gradual a lo largo del tiempo. Una composición inmunogénica como se desvela en el presente documento puede ser por aplicación intramuscular o subcutánea.
Un régimen para prevenir, suprimir o tratar una patología relacionada con el virus de la gripe puede comprender la administración de una cantidad eficaz de una composición de vacuna como se describe en el presente documento, administrada como un único tratamiento o repetida como dosificaciones de mejora o refuerzo, durante un periodo de hasta e incluyendo entre una semana y aproximadamente 24 meses, o cualquier intervalo o valor en el mismo. Una vacuna contra la gripe como se desvela en el presente documento se puede administrar anualmente.
Una "cantidad eficaz" de una composición de vacuna es una que es suficiente para lograr un efecto biológico deseado. Se entiende que la dosis eficaz puede depender de la edad, el sexo, la salud y el peso del receptor, el tipo de tratamiento simultáneo, en caso de que lo hubiera, la frecuencia del tratamiento y la naturaleza del efecto deseado. No se pretende que los intervalos de dosis eficaces proporcionados a continuación sean limitantes y representan intervalos de dosis ilustrativos. Por tanto, la dosificación se puede adaptar al sujeto individual, tal como entiende y puede determinar un experto en la materia. La dosificación de una vacuna de virus atenuado para un mamífero (p. ej., ser humano) adulto puede ser de aproximadamente 103 a 107 unidades formadoras de placas (UFP), o cualquier intervalo o valor en el mismo. La dosis de vacuna inactivada puede variar de aproximadamente 0,1 a 200, p. ej., 50 |jg de proteína hemaglutinina. Sin embargo, la dosis debería ser una cantidad segura y eficaz determinada por métodos convencionales, usando las vacunas existentes como punto de partida.
C. Suministro intracutáneo
Las vacunas vivas contra la gripe se suministran tradicionalmente por vía intranasal para imitar la vía natural de infección y promover una respuesta inmunitaria similar a la de la infección por virus natural. Como alternativa, se desvelan en el presente documento, pero no se reivindican, métodos de suministro intradérmico que implican el uso de un dispositivo de microagujas novedoso para aprovechar los beneficios inmunológicos del suministro intradérmico. Puede usarse un virus atenuado (p. ej., un mutante vírico M2) en una composición de vacuna para administración intradérmica. Un mutante vírico M2, que no produce virus descendiente infeccioso, puede proporcionarse en una vacuna. Por tanto, prácticamente se elimina cualquier potencial de reordenamiento con virus de la gripe de tipo silvestre en circulación.
El suministro intradérmico (intracutáneo) puede administrar la vacuna en la piel. El suministro intradérmico se puede realizar usando un dispositivo de suministro por microagujas. Como se desvela en el presente documento, el suministro intracutáneo tiene numerosas ventajas. Por ejemplo, la inmunogenicidad de la vacuna aumenta al desencadenar el potencial inmunológico del sistema inmunitario de la piel. La vacuna tiene acceso directo a las potentes células dendríticas presentadoras de antígenos de la piel, es decir, células de Langerhans epidérmicas y células dendríticas dérmicas. Las células cutáneas producen señales proinflamatorias que mejoran la respuesta inmunitaria a los antígenos introducidos a través de la piel. Además, el sistema inmunitario de la piel produce anticuerpos específicos de antígeno y respuestas inmunitarias celulares. El suministro intradérmico permite ahorrar dosis de vacuna, es decir, pueden ser eficaces dosis menores de antígeno, a la luz de los factores anteriores, cuando se suministra por vía intracutánea.
Asimismo, debido a que la vacuna se suministra a la piel a través de la matriz de microagujas del dispositivo, se reduce el riesgo de pinchazos accidentales con la aguja y el suministro de la vacuna intracutánea a través de una matriz de microagujas es relativamente indolora en comparación con las inyecciones intramusculares con aguja y jeringa convencionales.
Se conocen en la técnica dispositivos de microagujas, incluyendo, por ejemplo, los descritos en las solicitudes de patente de los Estados Unidos publicadas 2012/0109066, 2011/0172645, 2011/0172639, 2011/0172638, 2011/0172637 y 2011/0172609. Se pueden elaborar dispositivos de microagujas, por ejemplo, mediante fabricación a partir de láminas de acero inoxidable (p. ej., Trinity Brand Industries, Georgia; SS 304; 50 jm de grosor) mediante grabado húmedo. Las microagujas individuales pueden tener una longitud de entre 500 jm y 1000 jm , p. ej., aproximadamente 750 jm , y una anchura de entre aproximadamente 100 jm y 500 jm , p. ej., aproximadamente 200 jm . A continuación, se puede aplicar la vacuna a las microagujas como recubrimiento. A modo de ejemplo, pero no a modo de limitación, una solución de recubrimiento puede incluir sal sódica de carboximetilcelulosa al 1 % (p/v) (de baja viscosidad, grado USP; Carbo-Mer, San Diego Ca ), Lutrol F-68 NF al 0,5 % (p/v) (BASF, Mt. Olive, NJ) y el antígeno (p. ej., proteína HA soluble a 5 ng/ml; virus atenuado vivo tal como el virus mutante M2 descrito en el presente documento, etc.). Para alcanzar una concentración de vacuna mayor, la solución de recubrimiento se puede evaporar durante 5 a 10 minutos a temperatura ambiente (~23 °C). El recubrimiento se puede realizar mediante un proceso de recubrimiento por inmersión. La cantidad de vacuna por fila de microagujas se puede determinar sumergiendo las microagujas en 200 |jl de solución salina tamponada con fosfato (PBS) durante 5 minutos y analizando el antígeno mediante métodos conocidos en la técnica.
Se puede usar un dispositivo de microagujas que está hecho principalmente de polipropileno y piezas de primer corte de acero inoxidable que encajan entre sí con ajustes por presión sencillos y sellos térmicos. El dispositivo puede ser completamente independiente e incluye la vacuna, un mecanismo de bomba, un mecanismo de activación y una unidad de microagujas. Estos componentes están ocultos dentro de una cubierta de plástico. Con el dispositivo, la infusión de la vacuna se inicia presionando un botón de activación. Al presionar el botón se insertan simultáneamente las microagujas en la piel y se inicia el mecanismo de bombeo que ejerce presión sobre el recipiente principal del fármaco. Cuando un mecanismo de muelle ejerce suficiente presión sobre el depósito de la vacuna, la vacuna comienza a fluir a través de la matriz de microagujas y hacia la piel. El suministro de la dosis de la vacuna puede completarse en aproximadamente 2 minutos después de la activación del dispositivo. Una vez completada la infusión, el dispositivo se retira suavemente de la piel.
Puede proporcionarse un método para la administración intracutánea de una composición inmunogénica (p. ej., una vacuna) usando un dispositivo de microagujas. El dispositivo de microagujas puede comprender un mecanismo de punción y una capa de composición inmunogénica que comprende una pluralidad de microagujas capaces de perforar la piel y permitir la administración intracutánea de una composición inmunogénica. El método puede comprender presionar el mecanismo de punción. La composición inmunogénica (p. ej., vacuna) puede comprender un virus que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína M2 mutante que se expresa o una proteína M2 mutante que no se expresa; en donde la proteína M2 mutante expresada comprende, o consiste en, la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4. La matriz de microagujas puede situarse inicialmente dentro de la carcasa de un dispositivo y, al accionar una palanca, permite que las microagujas se extiendan a través del fondo del dispositivo y se inserten en la piel, permitiendo de este modo la infusión del líquido de vacuna en la piel.
El dispositivo de suministro descrito en el presente documento se puede utilizar para suministrar cualquier sustancia que se pueda desear. La sustancia para suministrar puede ser un fármaco y el dispositivo de suministro es un dispositivo de suministro de fármaco configurado para suministrar el fármaco a un sujeto. Como se usa en el presente documento, se entiende que el término "fármaco" incluye cualquier sustancia suministrada a un sujeto para cualquier fin terapéutico, preventivo o medicinal (p. ej., vacunas, productos farmacéuticos, nutrientes, productos nutracéuticos, etc.). El dispositivo de suministro de fármacos puede ser un dispositivo de suministro de vacunas configurado para suministrar una dosis de vacuna a un sujeto. El dispositivo de suministro puede configurarse para suministrar una vacuna contra la gripe. La materia objeto analizada en el presente documento se refiere principalmente a un dispositivo configurado para suministrar una sustancia por vía transcutánea. El dispositivo se puede configurar para suministrar una sustancia directamente a un órgano distinto de la piel.
Ejemplos
La invención se ilustra ahora mediante los siguientes ejemplos, que, sin embargo, no deberían interpretarse como una limitación de la invención según se reivindica.
Ejemplo 1: Generación de mutantes víricos M2
Los mutantes M2 se construyeron de la siguiente manera.
a) M2-1: ectodominio M2 2 codones de terminación supresión de TM (PR8 segmento M 2 terminaciones (786­ 791) sin 792-842 (TM))
Los genes M de tipo silvestre parciales de PR8 se amplificaron mediante PCR usando el conjunto de oligo 1 y el conjunto de oligo 2 como se muestra a continuación.
Figure imgf000019_0001
A continuación, los productos de PCR se digirieron con BsmBI. También se digirió un vector de expresión (pHH21) con BsmBI y los productos de PCR digeridos se ligaron en el vector usando ADN ligasa T4. Se transformaron células E. coli con el vector y, después de una incubación adecuada, los vectores se aislaron y purificaron mediante métodos conocidos en la técnica. La parte M2 mutante del vector se caracterizó mediante secuenciación de ácido nucleico.
b) M2-2: ectodominio M2 2 terminaciones defecto de corte y empalme (PR8 segmento M 2 terminaciones (786­ 791) defecto de corte y empalme nt 51)
Los genes M de tipo silvestre parciales de PR8 se amplificaron mediante PCR usando el conjunto de cebadores mostrado a continuación.
Figure imgf000020_0003
A continuación, los productos de PCR se digirieron con BsmBI. También se digirió un vector de expresión (pHH21) con BsmBI. A continuación, se preparó un fragmento de ADN bicatenario hibridando los dos nucleótidos mostrados a continuación.
Figure imgf000020_0001
El vector digerido, el producto de PCR y el fragmento bicatenario se ligaron después usando ADN ligasa T4. Se transformaron células E. coli con el vector y, después de una incubación adecuada, los vectores se aislaron y purificaron mediante métodos conocidos en la técnica. La parte M2 mutante del vector se caracterizó mediante secuenciación de ácido nucleico.
c) M2-3: ectodominio M2 2 terminaciones defecto de corte y empalme supresión de TM (PR8 segmento M 2 terminaciones (786-791) sin 792-842 (TM) defecto de corte y empalme nt 51)
El mutante M2-1 parcial (ectodominio M2 2 codones de terminación supresión de TM (PR8 segmento M 2 terminaciones (786-791) sin 792-842 (TM)) se amplificó a partir de PR8 mediante PCR usando los siguientes cebadores:
Figure imgf000020_0004
A continuación, los productos de PCR se digirieron con BsmBI. También se digirió un vector de expresión (pHH21) con BsmBI. A continuación, se preparó un fragmento de ADN bicatenario hibridando los dos nucleótidos mostrados a continuación.
Figure imgf000020_0002
El vector digerido, el producto de PCR y el fragmento bicatenario se ligaron después usando ADN ligasa T4. Se transformaron células E. coli con el vector y, después de una incubación adecuada, los vectores se aislaron y purificaron mediante métodos conocidos en la técnica. La parte M2 mutante del vector se caracterizó mediante secuenciación de ácido nucleico.
La secuencia de cada una de las tres construcciones mutantes M2 se proporciona en las tablas 1-3.
Ejemplo 2: Generación y cultivo del virus mutante M2
Este ejemplo demuestra el cultivo del virus PR8 que comprende la mutación M2KO(AM) (SEQ ID NO: 1). Se generaron virus mutantes como se ha indicado en Neumann et al., Generation of influenza A viruses entirely from clone cDNAs, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:9345-9350 (1999), con algunas modificaciones. En resumen, se transfectaron células 293T con 17 plásmidos: 8 construcciones Poli para 8 segmentos de ARN, uno de los cuales alberga la secuencia M2 mutante y 9 construcciones de expresión de proteínas para 5 proteínas estructurales de la siguiente manera: NP (pCAGGS-WSN-NP0/14); M2 (pEP24c); PB1 (pcDNA774); PB2 (pcDNA762); y PA (pcDNA787) del virus A/Puerto Rico/8/34 (H1N1).
Los plásmidos se mezclaron con reactivo de transfección (2 j l de Trans IT® LT-1 (Mirus, Madison, Wis.) por |jg de ADN), se incubaron a temperatura ambiente durante 15-30 minutos y se añadieron a 1x106 células 293T. Cuarenta y ocho horas después, los virus del sobrenadante se diluyeron en serie y se inocularon en células M2CK. De dos a cuatro días después de la inoculación, se inocularon virus en el sobrenadante del último pocillo de dilución en el que células que mostraban un efecto citopático (ECP) claro en células M2CK para la producción de virus de reserva. Los genes M de los virus generados se secuenciaron para confirmar el gen y la presencia de las mutaciones deseadas y para garantizar que no estuvieran presentes mutaciones no deseadas.
Los virus M2 mutantes se cultivaron y pasaron de la siguiente manera. Se cultivaron células hospedadoras M2CK en presencia de MEM complementado con suero de ternero fetal al 10 %. Las células se infectaron a una MOI de 0,001 lavando con PBS seguido de adsorción del virus a 37 °C. Se añadió medio de crecimiento vírico que contenía tripsina/TPCK y las células se incubaron durante 2-3 días hasta que se observó un efecto citopático.
Ejemplo 3 La replicación de M2KO está restringida en células normales
Se analizó la cinética de crecimiento del virus PR8 con la mutación M2KO(AM) (SEQ ID NO: 1) y PR8 de tipo silvestre tanto en células MDCK normales como en células MDCK que expresan de forma estable la proteína M2 (M2CK). Las células se infectaron con virus a una multiplicidad de infección de 10'5. Los títulos de virus en el sobrenadante celular se determinaron en células MDCK o M2CK. El PR8 de tipo silvestre creció a títulos altos en ambos tipos celulares, mientras que M2KO creció bien solo en las células M2CK y no creció en absoluto en las células MDCK (figura 4).
Ejemplo 4: El virus M2KO produce antígenos víricos, pero no M2, en células normales
Este ejemplo demuestra que el virus PR8 con la mutación M2KO(AM) (SEQ ID NO: 1) produce antígenos víricos, pero no la proteína M2, en células normales. La expresión de la proteína vírica se evaluó infectando células MDCK de tipo silvestre con PR8 o M2KO de tipo silvestre a una multiplicidad de infección (MOI) de 0,5 en medio sin tripsina para garantizar que los virus completen solo un ciclo de vida. Las proteínas víricas en los lisados celulares se separaron en un gel de SDS-PAGE al 4-12 % y se detectaron mediante transferencia de Western usando sueros de ratón infectados con PR8 (panel A) o anticuerpo monoclonal anti-M2 (14C2, Santa Cruz Biotechnology) (panel B). La figura 3A muestra que los antisueros contra PR8 detectan niveles similares de expresión de proteínas tanto para PR8 como para M2KO. Cuando los lisados se exploran con un anticuerpo monoclonal anti-M2 (panel B), la expresión de M2 se detecta solo en células infectadas con PR8, no M2KO. Estos resultados indican que el virus M2KO expresa todas las proteínas víricas, excepto la proteína M2, a niveles similares a los del virus PR8 (figura 5)
Ejemplo 5: Los mutantes M2 están atenuados in vivo
Se realizó un experimento para demostrar que los virus mutantes M2 están atenuados in vivo. Se inocularon ratonas BALB/c de seis semanas de edad (23 por grupo) por vía intranasal con uno de los siguientes mutantes: M2KO(yk) como se describe en J. Virol (2009) 83: 5947-5950; M2-1 (M2KO sup TM también conocido como M2KO(ATM)) y M2-2 (M2KO def corte) (denominados colectivamente "variantes de M2KO"). El mutante se administró a una dosis de 1,2x104 ufp por ratón. A un grupo de control de ratones se le administró PBS. Se observaron los ratones durante 14 días después de la inoculación para detectar cualquier cambio en el peso corporal y síntomas de infección. Adicionalmente, después de 3 días tras la inoculación, se tomaron títulos de virus de los pulmones y cornetes nasales (NT) de 3 ratones en cada grupo.
Como se muestra en la figura 6, los ratones inoculados con las variantes de M2KO y PBS no mostraron ningún síntoma clínico de infección ni perdieron peso corporal durante el periodo de 14 días. El cambio del peso corporal entre los grupos fue comparable durante el periodo de 14 días. Adicionalmente, no se detectó virus en los títulos que se recogieron de los pulmones y NT. En conjunto, la falta de síntomas clínicos, la falta de pérdida de peso corporal y la ausencia de virus indican que los virus mutantes M2 están atenuados y no son patógenos en ratones.
Ejemplo 6: Los mutantes M2 inducen anticuerpos contra el virus de la gripe y protegen a los ratones de la exposición letal al virus
También se realizaron pruebas para determinar los títulos de anticuerpos de los ratones descritos en el ejemplo 5 anterior y su supervivencia después de haberse expuesto con una dosis vírica letal. Se tomaron muestras de suero 3 semanas después de la inoculación y se determinaron los títulos de anticuerpos IgG antivirus de las muestras de suero mediante un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA). La respuesta humoral se muestra en la figura 7, lo que muestra que los tres mutantes M2 aumentaron los anticuerpos contra el virus de la gripe más que el grupo de control de Pb S.
Además, la mitad de los ratones dentro de cada uno de los grupos se reforzaron 28 días después de la inoculación con la misma cantidad de virus mutante M2. A continuación, se recogió suero 6 semanas después de la primera inoculación y se determinaron los títulos de IgG contra el virus. Como se muestra en la figura 7B, los ratones reforzados por virus mutantes M2 tenían un nivel mayor de anticuerpos contra el virus de la gripe que los que no se reforzaron.
49 días después de la primera inoculación (3 semanas después del refuerzo), los ratones se expusieron a una dosis letal del virus PR8 (40 de dosis letal al 50 % de ratones (DLM50)). Como se muestra en la figura 8 y en la figura 9, todos los ratones vacunados con las variantes M2KO sobrevivieron a la exposición y no perdieron peso. Los ratones de control que recibieron solo PBS, sin embargo, perdieron peso corporal y no sobrevivieron 8 días después de la fecha de exposición. El día 3 después de la exposición, se obtuvieron pulmones y NT y se determinaron los títulos de virus en células MDCK mediante ensayo de placa. Como se representa en la tabla 11, los títulos de virus pulmonares en variantes de M2KO fueron al menos un log menores que los títulos en PBS de control sin exposición previa. Asimismo, casi no se detectaron virus en los cornetes nasales en los grupos de variantes de M2KO, pero se detectaron más de 100000 UFP/g en el grupo de PBS de control sin exposición previa, lo que indica que las vacunas mutantes M2 confieren protección y limitan la replicación del virus de exposición.
TABLA 11: Tí l vir I 1 FP n i r n l x i i n
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En otro experimento, seis semanas después de la inmunización, los grupos M2KO(AM) se expusieron a virus de la gripe homosubtípicos o heterosubtípicos. Los ratones se expusieron al virus Aichi (H3N2) y se puntuó su supervivencia durante 14 días. Los resultados de la exposición heterotípica se muestran en la figura 16.
Ejemplo 7: Suministro de vacunas intradérmicas
Se realizó un experimento para demostrar que el suministro de vacunas intradérmicas/inmunización protegerá a un sujeto de la gripe. Se inocularon ratonas BALB/c, de 6-7 semanas de edad (5 por grupo) (Harland Laboratories) por vía intranasal (IN), por vía intramuscular (IM) o por vía intradérmica (ID) con el virus PR8 (3,5x107 ufp) a una concentración de 1,8x101, 1,8x102, 1,8x103 o 1,8x104 ufp (50 pl) por ratón. A los ratones de control también se les proporcionó PBS a través de las tres vías de administración diferentes. El peso corporal y la supervivencia se supervisaron durante 14 días después de la inoculación. Para los experimentos con ratones, se usaron jeringas para alergias con agujas biseladas intradérmicas.
La mayoría de las vacunas se administran mediante inyección intramuscular o subcutánea usando agujas y jeringas convencionales. Sin embargo, estudios recientes demuestran que la administración intradérmica de vacunas logra una mejor inmunogenicidad que la administración intramuscular o subcutánea. La vacunación intradérmica administra el antígeno directamente al sistema inmunitario enriquecido de la piel y se ha mostrado que es eficaz para una serie de vacunas, incluyendo la de la rabia, la hepatitis B y la gripe. El suministro intradérmico también puede proporcionar un ahorro de dosis, logrando la misma respuesta inmunitaria usando menos vacuna que la necesaria con inyección intramuscular. El estado actual de la técnica para suministro intradérmico (usando agujas y jeringas convencionales) es la técnica de Mantoux, que requiere una amplia formación, es difícil de realizar y, con frecuencia, da lugar a una administración mal dirigida (subcutánea) o incompleta. La falta de dispositivos de administración adecuados ha obstaculizado la investigación y el desarrollo de productos de vacunación intradérmica, aunque se han documentado respuestas inmunitarias superiores con esta vía de administración.
Como se muestra en la tabla 12, los ratones inoculados por IN sucumbieron a la infección por gripe a las dosis más altas de 1,8x103y 1,8x104 ufp por ratón, con supervivencia completa solo a la dosis más baja de 1,8x101. Sin embargo, los ratones inoculados por IM e ID a todas las dosis sobrevivieron. La tabla 13 muestra la dosis letal mediana para ratones en el grupo inoculado por IN (DLM50). La figura 10 muestra que los ratones inoculados por IM e ID inoculados con 1,8x104 ufp del virus no presentaron cambios en el peso corporal y muestra la falta de supervivencia para los ratones inoculados por IN inoculados con 1,8x104 ufp de virus.
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Se recogió suero a las 2 semanas (figura 11A) y 7 semanas (figura 11B) después de la inoculación y se evaluó para determinar la presencia de anticuerpo IgG anti-PR8 según lo determinado por un ELISA. "Alta" representa inoculaciones de 1,8x104 ufp y "baja" representa 1,8x101 ufp. Las respuestas de los ratones inoculados por IN, IM e ID en ambos periodos de tiempo son similares. En cada periodo de tiempo, los ratones inoculados por IN presentaron el mayor número de anticuerpos. Solo se identificaron ratones inoculados por IN inoculados con 1,8x101 ufp (es decir, "baja"), debido a que, en este momento, los ratones inoculados por IN inoculados con dosis mayores habían expirado. Los ratones inoculados por IM e ID presentaron niveles menores de anticuerpos que los ratones inoculados por IN, aunque los ratones inoculados a las dosis mayores presentaron mayores cantidades de anticuerpos en comparación con los ratones de control que solo recibieron PBS. Adicionalmente, a lo largo del tiempo, la vía de administración intradérmica produjo más anticuerpos que la vía intramuscular, como lo demuestran los niveles de títulos más altos mostrados en la figura 11B.
En otro experimento, se expusieron grupos de ratones inoculados por IN, IM e ID (5 ratones por grupo, excepto por 4 ratones en el grupo de 1,8x103) 8 semanas después de la vacunación. Específicamente, se expusieron 1,8x101 ratones inoculados por IN, 1,8x103 ratones inoculados por IM, 1,8x104 ratones inoculados por IM, 1,8x103 ratones inoculados por ID y 1,8x104 ratones inoculados por ID. Se sacrificaron los ratones que perdieron más del 25 % de su peso corporal.
Como se muestra en figura 12, 100 % de los ratones inoculados por IM a una dosis de 1,8x103 no sobrevivió 8 días después de la exposición. La tasa de supervivencia de todos los ratones inoculados por ID estuvo entre el 40 % y el 60 %. La tasa de supervivencia de los ratones inoculados por IM en 1,8x104, sin embargo, fue del 100 %. La figura 13 muestra que los grupos de ratones inoculados por ID e inoculados por IM (1,8x104) tenían una pérdida de peso promedio inicial, pero terminaron con una pérdida de peso relativamente baja desde la fecha de exposición.
Una evaluación de los ratones inoculados por ID (1,8x104) mostró que dos ratones (1 y 5 en la figura 14 y la figura 15), indujeron una mejor respuesta inmunitaria que los otros ratones, y además no desarrollaron síntomas de infección por gripe (p. ej., pérdida de peso corporal, pelaje áspero, reposo, etc.). Sin embargo, todos los ratones del grupo inoculado por IM (1,8x104) mostraron algunos síntomas y perdieron al menos un 10 % de peso corporal.
Ejemplo 8: Estabilidad de las variantes M2KO
Para probar la estabilidad del gen M2 de variantes de M2KO en células de tipo silvestre, las variantes de M2KO se pasaron en células MDCK de tipo silvestre, que carece de expresión de la proteína M2, junto con células M2CK que son células MDCK que expresan la proteína M2. Todas las variantes de M2KO fueron pasables en células M2CK sin ninguna mutación hasta al menos el pase 10. Aunque, M2-1 (M2KO sup TM), M2-2 (M2KO def corte) y M2-3 (M2KO sup TM def corte) no se pudieron pasar en células MDCK de tipo silvestre (no se observa ningún efecto citopático (ECP) en las células MDCK de tipo silvestre), M2KO(yk) mostró ECP incluso después del 4° pase en células MDCK. Se extrajeron ARN del segmento M del pase 4 de M2Ko(yk) en MDCK de tipo silvestre y se secuenció el ADNc. Como se muestra en la tabla 14, se editaron dos codones de terminación insertados de M2KO(yk) y el pase 4 de M2KO (yk) en MDCK de tipo silvestre poseía el gen de la proteína M2 de longitud completa.
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Ejemplo 9: Vacunas M2KO
Para demostrar que la vacuna M2KO puede estimular una respuesta inmunitaria similar a una infección natural por gripe, se realizó un experimento de vacuna. La infección natural por gripe fue representada por un inóculo bajo de virus PR8 y la vacuna contra la gripe inactivada convencional estuvo representada por el virus PR8 inactivado (Charles River) suministrado por vía intramuscular convencional y por vía intranasal.
Se inmunizaron por vía intranasal ratones BALB/c de seis a siete semanas de edad con virus vivo (10 ufp de PR8), virus PR8 que comprende M2KO(AM) (104ufp) o 1pg de virus PR8 inactivado, suministrado tanto por vía intranasal como por vía intramuscular. Los ratones a los que se proporcionaron 104 partículas infecciosas de M2KO(ATM) por vía intranasal no perdieron peso y no mostraron signos de infección. Asimismo, los pulmones de los ratones tratados con M2KO(ATM) no contenían partículas infecciosas detectables tres días después de la inoculación. Se obtuvieron sueros de los ratones inmunizados el día 21 y se determinaron los títulos de anticuerpos contra la hemaglutinina mediante un ensayo ELISA convencional. La figura 17 muestra que los títulos de IgG anti-HA fueron mayores en los grupos de virus vivo y M2KO(AM) en relación con los grupos de vacunas inactivadas. El anticuerpo IgA de la mucosa contra la gripe se detectó en sueros solo en los ratones vivos vacunados con PR8 o M2KO.
Seis semanas después de la inmunización, todos los grupos se expusieron a virus de la gripe homosubtípicos (PR8, H1N1) o heterosubtípicos (Aichi, H3N2). Tanto las vacunas M2KO como las inactivadas protegieron a los ratones de la infección por virus homosubtípicos (figura 18). Sin embargo, solo los ratones vacunados con M2KO estaban protegidos de la exposición al virus heterosubtípico (figura 19). Los ratones inmunizados con la vacuna inactivada sucumbieron a una infección similar a la de los ratones sin exposición previa.
Ejemplo 10 El virus M2KO(AM) no se replica en las vías respiratorias ni en otros órganos
Sumario: Este ejemplo demuestra que el virus M2KO(AM) no se replica en las vías respiratorias ni se disemina a otros órganos en el modelo de hurón. El virus M2KO(AM) se administró por vía intranasal a 3 hurones machos a un nivel de dosis de 1x107 DICT50. Como control, se administró a un segundo grupo de 3 hurones machos el virus de la gripe A A/Brisbane/10/2007 (H3N2) por vía intranasal en una dosis de 1x107 DICT50. Después de la inoculación del virus, se observaron los hurones hasta el día 3 después de la inoculación para determinar la mortalidad, con pesos corporales, temperatura corporal y signos clínicos medidos diariamente. Se realizó una necropsia en todos los animales 3 días después de la inoculación. Se recogieron órganos para histopatología y títulos víricos.
El grupo de control que recibió A/Brisbane/10/2007 (H3N2) presentó una reducción transitoria de peso y un aumento de la temperatura corporal 2 días después de la inoculación que no se observó en el grupo M2KO(ATM). Los niveles de actividad también se redujeron en el grupo A/Brisbane/10/2007 y se observaron estornudos en los días 2-3 después de la infección. No se observaron cambios en el nivel de actividad o signos clínicos asociados con la exposición al virus en el grupo M2KO(AM). El análisis histopatológico reveló cambios en los cornetes nasales en animales expuestos a gripe A/Brisbane/10/2007 (H3N2) que no se observaron en hurones expuestos al virus M2KO(AM). La exposición a A/Brisbane/10/2007 dio lugar a atrofia del epitelio respiratorio, infiltrados de neutrófilos y edema en los cornetes nasales. Ningún otro órgano se vio afectado por la inoculación del virus. En las condiciones del experimento, el virus M2KO(AM) no indujo signos clínicos de infección ni dio lugar a cambios histológicos en los órganos analizados.
MATERIALES Y MÉTODOS
A. Material de vacuna y virus de control: El virus M2KO(ATM) es un virus recombinante que posee 6 genes internos de PR8 (nucleoproteína (NP), genes de la polimerasa (PA, PB1, PB2), no estructural (NS), matriz (M)), pero que no expresa la proteína M2 funcional, así como genes HA y NA de gripe A/Uruguay/716/2007 (h3n2) similar a A/Brisbane/10/2007. El virus de tipo silvestre A/Brisbane/10/2007 (H3N2) actuó como virus de control y fue suministrado por IITRI. Los virus se mantuvieron congelados a -65 °C hasta su uso.
B. Artículo de prueba y formulación de dosis de control positivo: La solución de dosificación del virus M2KO(AM) de 1x107 DICTso/ml por cada 316 j l se preparó diluyendo 8 j l de 1x1010 DICTso/ml en 2,528 ml de PbS. El A/Brisbane/10/2007 (H3N2) a un título de 1x107 DICTso/ml por cada 316 j l se usó sin diluir.
C. Animales y cuidado de los animales: Se compraron ocho hurones machos de Triple F Farms y seis de los hurones se pusieron en estudio. Los animales tenían aproximadamente 4 meses de edad en el momento del inicio del estudio. El proveedor certificó que los animales estaban sanos y exentos de anticuerpos contra enfermedades infecciosas. A su llegada, los animales se alojaron individualmente en jaulas de alambre suspendidas con fondos de listones, suspendidas sobre bandejas de residuos revestidas de papel. La habitación de los animales y las jaulas se limpiaron y desinfectaron antes de la recepción de los animales, de acuerdo con las prácticas aceptadas de cuidado de los animales y los procedimientos operativos convencionales relevantes. Se proporcionaron a voluntad dieta certificada para hurones Teklad Global n.° 2072 (Teklad Diets, Madison WI) y agua del grifo de la ciudad de Chicago y se renovaron al menos una vez al día. Se mantuvo iluminación fluorescente en las habitaciones de los animales en un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas. La temperatura y la humedad relativa de las habitaciones de los animales estuvieron dentro de los límites respectivos del protocolo y variaron de 22,0 a 25,0 °C y de 33 a 56 %, respectivamente, durante el estudio.
D. Cuarentena animal y aleatorización: Los hurones se mantuvieron en cuarentena durante cinco días antes de la aleatorización y se observaron diariamente. En función de las observaciones diarias que indican la buena salud general de los animales, los hurones fueron liberados de la cuarentena para la aleatorización y las pruebas. Después de la cuarentena, los hurones se pesaron y se asignaron a grupos de tratamiento usando un procedimiento de aleatorización computarizado basado en pesos corporales que produjeron valores medios de grupos similares [ToxData® versión 2.1.E.11 (PDS Pathology Data Systems, Inc., Basilea, Suiza)]. Dentro de un grupo, todos los pesos corporales estaban en un intervalo del 20 % de su media. Los animales seleccionados para el estudio reciben un número de identificación permanente mediante una etiqueta en la oreja y un transpondedor, y las tarjetas de jaula individuales también identifican a los animales del estudio por números individuales y grupo. Los números de identificación asignados fueron únicos dentro del estudio.
E. Diseño experimental: Todos los procedimientos con animales se realizaron en una instalación de nivel 2 de bioseguridad animal de acuerdo con los protocolos aprobados por el comité de uso y cuidado de los animales del Instituto de Investigación IIT. Se utilizaron para el estudio 6 hurones machos (Triple F Farms, Sayre PA), de 4 meses de edad en el momento del inicio del estudio. Antes de la infección, los hurones se supervisaron durante 3 días para medir el peso corporal y establecer las temperaturas corporales de referencia. Las lecturas de temperatura se registraron diariamente a través de un transpondedor (BioMedic data systems, Seaford, DE) implantado por vía subcutánea en cada hurón. Se extrajo sangre antes del inicio del estudio a través de la vena yugular y se analizó el suero para detectar anticuerpos contra la gripe. Los animales del estudio exentos de anticuerpos contra la gripe se aleatorizaron y se dividieron en dos grupos (3 hurones/grupo) como se muestra en la tabla 15. Se anestesió e inoculó un grupo de 3 hurones por vía intranasal con una única dosis de 316 j l a 1x107 DICT50 del virus M2KO(AM). Un grupo de control (3 hurones) se inoculó con 316 j l a 1x107 DICT50 de A/Brisbane/10/2007 (H3N2). Los hurones se observaron diariamente para supervisar el peso corporal, la temperatura corporal y los síntomas clínicos. El día 3 después de la inoculación, se sacrificaron los hurones (3 hurones por grupo) y se les realizaron necropsias. Se recogieron las siguientes muestras tisulares: cornetes nasales, tráquea, pulmones, riñones, páncreas, bulbos olfatorios, cerebros, hígados, bazos, intestinos delgado y grueso. Una parte de las muestras recogidas se fijó con formalina neutra tamponada para la evaluación histológica y la otra parte de las muestras se almacenó a -65 °C para la titulación de virus.
Tabla 15: Programa de inmunización y recogida de muestras
Grupo Dosis N Recogida de órganos (días después de la infección)
M2KO 1x107 DICT50 3 3
Brisbane/10 1x107 DICT50 3 3
F. Inoculación de virus: Se inocularon hurones con el virus M2KO(ATM) o el virus de la gripe A de tipo silvestre A/Brisbane/10/2007 (H3N2). Se descongeló un vial de reserva congelada y se diluyó a la concentración adecuada en solución salina tamponada con fosfato. Los hurones se anestesiaron con ketamina/xilazina y la dosis de virus se administró por vía intranasal en un volumen de 316 j l para el virus M2KO(ATM) y 316 j l para el virus A/Brisbane/10/2007 (H3N2). Para confirmar el título de inoculación del virus A/Brisbane/10/2007 (H3N2), se realizó un ensayo de DICT50 en IITRI en una parte de la solución de exposición vírica preparada. El ensayo de título vírico se realizó según los procedimientos operativos convencionales del Instituto de Investigación Tecnológica del Instituto de Illinois (IITRI).
G. Observaciones de estado moribundo/mortalidad: Después de la exposición, todos los animales se observaron dos veces al día para determinar la mortalidad o pruebas de estado moribundo. Los animales se observaron durante 3 días después de la exposición. Los animales se sacrificaron mediante sobredosis con pentobarbital sódico 150 mg/kg, administrado por vía intravenosa.
H. Pesos corporales y cambio de peso corporal: Los pesos corporales de los animales se registraron al recibirlos (muestra aleatoria del 10 %), en la aleatorización (día -3 a 0) y diariamente después de la inoculación del virus.
I. Observaciones clínicas: El cambio de temperatura (en grados Celsius) se determinó diariamente para cada hurón. Los signos clínicos de, inapetencia, signos respiratorios tales como disnea, estornudos, tos y rinorrea y el nivel de actividad se evaluaron diariamente. Un sistema de puntuación basado en el descrito por Reuman, et al., "Assessment of signs of influenza illness in the ferret model", J. Virol, Methods 24: 27-34 (1989), se usó para evaluar el nivel de actividad de la siguiente manera: 0, alerta y activo; 1, alerta pero activo sólo cuando se le estimula; 2, alerta pero no activo cuando se le estimula; y 3, ni alerta ni activo cuando se le estimula. Se calculó un índice de inactividad relativa (IIR) como la puntuación media por grupo de hurones por observación (día) durante la duración del estudio.
J. Eutanasia: Los animales del estudio se sacrificaron mediante una dosis intravenosa de pentobarbital sódico 150 mg/kg. La muerte se confirmó por la ausencia de latidos cardíacos y respiración observables. Se realizaron necropsias en todos los animales del estudio.
K. Necropsia: Se recogieron cornetes nasales, tráquea, pulmones, riñones, páncreas, bulbos olfatorios, cerebro, hígado, bazo, intestinos delgado y grueso. Una parte de cada tejido se fijó en formalina y la otra parte se entregó al personal del IITRI para su congelación y almacenamiento. Los tejidos recogidos para títulos son: cornetes nasales derechos, tercio superior de la tráquea, lóbulo pulmonar craneal derecho, riñón derecho, rama derecha del páncreas (cerca del duodeno), bulbo olfatorio derecho, hemisferio cerebral derecho, lóbulo lateral derecho del hígado, mitad derecha del bazo (extremo del bazo que se ve al abrir la cavidad abdominal), intestino delgado e intestino grueso.
L. Análisis histopatológico: Los tejidos se procesaron hasta obtener bloques de parafina, se cortaron a un grosor de aproximadamente 5 micrómetros y se tiñeron con hematoxilina y eosina (H y E).
M. Recogida de suero: Se recogió suero antes de la vacunación (día -3) de todos los hurones. Los hurones se anestesiaron con una mezcla de ketamina (25 mg/kg) y xilacina (2 mg/kg). Se recogió una muestra de sangre (aproximadamente 0,5-1,0 ml) a través de la vena cava de cada hurón y se procesó para obtener suero. La sangre se recogió en tubos de suero gel Z/1.1 (Sarstedt Inc. Newton, NC) y se almacenó a temperatura ambiente durante no más de 1 hora antes de recoger el suero. Los tubos de suero gel Z/1.1 se centrifugaron a 10000 x g durante 3 minutos y se recogió el suero. Se recolectaron muestras individuales de suero antes de la inoculación y se prepararon dos alícuotas de cada muestra. Se analizó una alícuota antes del inicio del estudio para confirmar que los hurones no tenían anticuerpos contra los virus de la gripe A y una alícuota del suero se almacenó a -65 °C.
N. Ensayo de inhibición de la hemaglutinación (IH): Las muestras de suero se trataron con enzima destructora de receptores (RDE) (Denka Seiken, Tokio, Japón) para eliminar los inhibidores de la hemaglutinación inespecífica. RDE se reconstituyó según las instrucciones del fabricante. El suero se diluyó 1:3 en RDE y se incubó de 18 a 20 horas en un baño de agua a 37 °C ± 2 °C. Después de la adición de un volumen igual de citrato de sodio al 2,5 % (v/v), las muestras se incubaron en un baño de agua a 56 ± 2 °C durante 30 ± 5 minutos. Se añadió NaCl al 0,85 % a cada muestra hasta una dilución de suero final de 1:10 después del tratamiento con RDE. Las muestras diluidas se diluyeron después en cuatro diluciones dobles (de 1:10 a 1:80) por duplicado en solución salina tamponada con fosfato (PBS) y después se incubaron con 4 unidades hemaglutinantes del virus de la gripe A A/Brisbane/10/2007 (H3N2). Después de la incubación, se añadieron glóbulos rojos de pollo al 0,5 % a cada muestra y se incubaron. A continuación, se puntuó la presencia o ausencia de hemaglutinación.
O. Títulos de virus: La concentración de virus infeccioso en las muestras de inóculo de virus antes y después de la exposición se determinó mediante DICT50 en células de riñón canino Madin-Darby (MDCK). En resumen, las muestras mantenidas a -65 °C se descongelaron y centrifugaron para eliminar los residuos celulares. El sobrenadante resultante se diluyó 10 veces por triplicado en placas de microtitulación de 96 pocillos en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) (Gibco, Carlsbad, CA, Estados Unidos) que contenía pencilina/estreptomicina, gentamicina al 0,1 %, NaCO3 al 3 %, fracción V de BSA al 0,3 % (Sigma San Luis, MO), de solución de vitamina MEM al 1 % (Sigma) y L-glutamina al 1 % (Mediatech, Manassas, VA, Estados Unidos). Después de realizar diluciones en serie de 10 veces, se transfirieron 100 l a los pocillos respectivos de una placa de 96 pocillos que contenía una monocapa de células MDCK. Las placas se incubaron a 37 °C ± 2 °C en 5 ± 2 % de CO2 a 70 % de humedad. Después de 48 horas, se observaron los pocillos para determinar el efecto citopatógeno (ECP). El sobrenadante de cada pocillo (50 pl) se transfirió a una placa de 96 pocillos y se determinó y registró la actividad de hemaglutinación (HA). La actividad de HA del sobrenadante se evaluó mediante un ensayo de HA con concentrado de eritrocitos de pavo (cRBC) al 0,5%. Los títulos de DICT50 se calcularon usando el método de Reed LJ y Muench H, "A simple method for estimating 50 % endpoints", Am. J. Hygiene 27: 493-497 (1938).
P. Análisis de datos: Se determinaron los pesos corporales y los aumentos (pérdidas) de peso corporal y los cambios de la temperatura corporal para cada animal individual expresados como media y desviaciones típicas de la media para cada grupo de prueba.
RESULTADOS
Después de la inoculación con el virus M2KO(ATM) o el virus de la gripe A A/Brisbane/10/2007 (H3N2), se supervisó la supervivencia de los hurones y los signos clínicos de infección. Los resultados se presentan en la tabla 16A y 16B.
Todos los hurones sobrevivieron a la infección por el virus M2KO(ATM) y A/Brisbane/10/2007 (H3N2). Los hurones inoculados con A/Brisbane/10/2007 presentaron signos respiratorios (estornudos) los días 2 y 3. El índice de inactividad relativa de los hurones inoculados con A/Brisbane/10/2007 fue de 0,67; mientras que los hurones inoculados con M2KO(ATM) no mostraron una reducción del nivel de actividad con un índice de inactividad relativa de 0.0.
Los cambios del peso y la temperatura corporales después de la inoculación del virus se muestran en la figura 20 y la figura 21. Después de la inoculación con A/Brisbane/10/2007 (H3N2), se observó una pérdida de peso corporal del 2-3 % el día 2 después de la inoculación en todos los animales. Se observó una pérdida de peso de mínima a cero en hurones inoculados con el virus M2KO(ATM). Un hurón inoculado con M2KO(ATM) presentó una pérdida de peso el día 2 después de la inoculación del 1 %. Se observaron temperaturas corporales elevadas de 40,3-40,7 °C en hurones inoculados con A/Brisbane 10/2007 el día 2 después de la inoculación. Las temperaturas corporales volvieron a su intervalo normal el día 3. Las temperaturas corporales de los hurones inoculados con M2KO(ATM) se mantuvieron en el intervalo normal durante la duración del estudio. Para determinar si el virus M2KO(ATM) se replicaría en las vías respiratorias u otros órganos e induciría patología, los tejidos de hurones se examinaron histológicamente el día 3 después de la inoculación y se compararon con los de los hurones inoculados con A/Brisbane/10/2007. En hurones inoculados con A/Brisbane/10/2007, se observó patología solo en los cornetes nasales. Se observaron atrofia del epitelio respiratorio, infiltrados de neutrófilos y edema en los cornetes nasales. No se observaron cambios histopatológicos asociados con la infección vírica en hurones inoculados con el virus M2KO(ATM). Las concentraciones de las soluciones de dosificación de virus antes y después de la exposición fueron 1075 DICT50/ml y 10775 DICT50/ml, respectivamente, lo que indica una buena estabilidad del material de exposición a lo largo de la administración.
Tabla 16A: Efecto de la inoculación del virus sobre la supervivencia y los signos clínicos de infección en hurones.
Signos clínicosb
n M T ti *t.ul ,o I 1H1, en Númer ,o
urupo N suero3 TOla ° e Signos respiratorios (día observado Pérdida de
muertos Letargo (Rll)c de aparición) apetito
M2KO 3 <10 0/3 0/3 0/3 0
Brisbane/10 3 <10 0/3 2/3 (2) 0/3 0,67 aTítulos de anticuerpos de inhibición de la hemaglutinación (IH) contra virus homólogos en suero de hurón antes de la inoculación del virus.
bSe observaron signos clínicos durante 3 días después de la inoculación del virus. Excepto por el letargo, los hallazgos de los signos clínicos se proporcionan como n.° de hurones con signo/n.0 total. Los signos respiratorios incluyeron estornudos.
determinado dos veces al día durante 3 días de observación según el sistema de puntuación y se calculó como la puntuación media por grupo de hurones por observación (día) durante el periodo de 3 días. El índice de inactividad relativa antes de la inoculación fue de 0.
Tabla 16B: M2KO ATM no se replica en los ór anos respiratorios de los hurones reco idos el día 3
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CONCLUSION
Este ejemplo muestra que para el día 3 después de la inoculación, el virus M2KO(ATM) no induce signos clínicos de enfermedad ni cambios histopatológicos asociados con la infección del virus de tipo silvestre. Esto muestra que el virus M2KO(ATM) de la presente tecnología es útil para las vacunas intranasales contra la gripe.
Ejemplo 11: Respuesta inmunitaria y efectos protectores del virus M2KO(ATM) con respecto a otras vacunas
Sumario: Este ejemplo demuestra la respuesta inmunitaria inducida por la vacuna M2KO(ATM) y los efectos protectores de la vacuna en el modelo de hurón. El virus M2KO(ATM) se administró por vía intranasal a 12 hurones machos a un nivel de dosis de 1x107 DICT50. Como control, a un segundo grupo de 12 hurones machos se les administró el virus FM#6 por vía intranasal a una dosis de 1x107 DICT50. A un tercer grupo de hurones se le administró OPTI-MEM™ como control de placebo. Para cada grupo de tratamiento se utilizó un régimen de vacunación solo de sensibilización o de sensibilización-refuerzo. A los hurones que recibieron el régimen de vacunación de sensibilizaciónrefuerzo se les administró la vacuna de sensibilización (día 0) y la vacuna de refuerzo 28 días después (día 28). A los hurones que recibieron solo la vacuna de sensibilización se les administró una vacunación individual el mismo día en que se administró la vacuna de refuerzo a los hurones de sensibilización-refuerzo (día 28). Después de cada vacunación, se observó a los hurones durante 14 días tras la inoculación para determinar la mortalidad, con pesos corporales, temperatura corporal y signos clínicos medidos diariamente. Se recogieron lavados nasales de hurones los días 1, 3, 5, 7 y 9 después de la vacunación de sensibilización para detectar la excreción de virus. Se recogieron semanalmente lavados nasales y suero de todos los hurones después de la vacunación para evaluar los niveles de anticuerpos a lo largo del tiempo.
Todos los animales se expusieron por vía intranasal el día 56 a 1x107 DICT50 de A/Brisbane/10/2007 (H3N2). Después de la exposición, los hurones se supervisaron durante 14 días tras la inoculación para determinar la mortalidad, con pesos corporales, temperatura corporal y signos clínicos medidos diariamente. Se recogieron lavados nasales los días 1, 3, 5, 7, 9 y 14 después de la exposición de hurones en cada grupo para los títulos víricos. Adicionalmente, se recogió suero después de la exposición (día 70) de los hurones supervivientes para su análisis. La necropsia se realizó en 3 hurones por grupo 3 días después de la exposición. Se recogieron órganos para histopatología y títulos víricos.
No se observaron acontecimientos adversos relacionados con la vacuna entre los 5 grupos. Después de la exposición, el grupo de control con placebo presentó un aumento de la temperatura corporal 2 días después de la exposición y una reducción del peso. También se observó una reducción del peso en los grupos vacunados con M2KO(ATM) y FM#6; sin embargo, la reducción fue menor que la observada en el grupo de OPTl-MEM™. Los niveles de actividad no se redujeron en ningún grupo; sin embargo, se observaron estornudos en todos los grupos después de la exposición. El análisis histopatológico reveló un aumento de la gravedad de los infiltrados de células mixtas en el pulmón de los hurones vacunados en comparación con los infiltrados pulmonares en el grupo de control de OPTI-MEM™. En los cornetes nasales, los animales que recibieron un régimen de sensibilización o sensibilización más refuerzo de M2KO(ATM) o FM#6 tuvieron una menor gravedad de la atrofia del epitelio respiratorio en comparación con el grupo de control de OPTI-MEM™. La vacunación con el virus M2KO(ATM) pareció proporcionar una protección similar contra la exposición vírica a la del virus FM#6.
MATERIALES Y MÉTODOS
A. Material de la vacuna: El virus M2KO(ATM) es un virus recombinante que posee 6 genes internos de PR8 (nucleoproteína (NP), genes de la polimerasa (PA, PB1, PB2), no estructural (NS), matriz (M)), pero que no expresa la proteína M2 funcional, así como genes HA y NA de gripe A/Uruguay/716/2007 (H3N2) similar a A/Brisbane/10/2007. El virus FM#6 es el clon n.° 6 del virus de la gripe A A/Uruguay/716/2007 (H3N2) de FluMist® (fórmula 2009-2010). El virus M2KO(ATM) y el virus FM#6 se administraron por vía intranasal a los animales en una dosis de 316 pl de 1x107 DICT50 (dosis infecciosas de cultivo tisular al 50 %).
B. Artículo de prueba y formulación de dosis de control positivo: La solución de dosificación del virus M2KO(ATM) de 1x107 DICT50/ml por cada 316 pl se preparó diluyendo 120 pl de 1x109 DICT50/ml en 3,680 ml de PBS. El virus fM#6 a un título de 1x107 DICT50/ml por cada 316 pl se preparó diluyendo 120 pl de 1x109 DICT50/ml en 3,680 ml de PBS.
C. Animales y cuidado de los animales: Se compraron treinta y seis hurones machos de Triple F Farms y 30 de los hurones se pusieron en estudio. Los animales tenían aproximadamente 4 meses de edad en el momento del inicio del estudio. El proveedor certificó que los animales estaban sanos y exentos de anticuerpos contra enfermedades infecciosas. A su llegada, los animales se alojaron individualmente en jaulas de alambre suspendidas con fondos de listones, suspendidas sobre bandejas de residuos revestidas de papel. La habitación de los animales y las jaulas se limpiaron y desinfectaron antes de la recepción de los animales, de acuerdo con las prácticas aceptadas de cuidado de los animales y los procedimientos operativos convencionales relevantes. Se proporcionaron a voluntad dieta certificada para hurones Teklad Global n.° 2072 (Teklad Diets, Madison WI) y agua del grifo de la ciudad de Chicago y se renovaron al menos tres veces a la semana. Se mantuvo iluminación fluorescente en las habitaciones de los animales en un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas. La temperatura y la humedad relativa de las habitaciones de los animales estuvieron dentro de los límites respectivos del protocolo y variaron de 20,0 a 25,0 °C y de 30 a 63 %, respectivamente, durante el estudio.
D. Cuarentena animal y aleatorización: Los hurones se mantuvieron en cuarentena durante siete días antes de la aleatorización y se observaron diariamente. En función de las observaciones diarias que indican la buena salud general de los animales, los hurones fueron liberados de la cuarentena para la aleatorización y las pruebas. Después de la cuarentena, los hurones se pesaron y se asignaron a grupos de tratamiento usando un procedimiento de aleatorización computarizado basado en pesos corporales que produjeron valores medios de grupos similares [ToxData® versión 2.1.E.11 (PDS Pathology Data Systems, Inc., Basilea, Suiza)]. Dentro de un grupo, todos los pesos corporales estaban en un intervalo del 20 % de su media. Los animales seleccionados para el estudio reciben un número de identificación permanente mediante una etiqueta en la oreja y un transpondedor, y las tarjetas de jaula individuales también identifican a los animales del estudio por números individuales y grupo. Los números de identificación asignados fueron únicos dentro del estudio.
E. Diseño experimental: Para evaluar la eficacia de la vacuna M2KO(ATM), los hurones se inmunizaron con el virus M2KO(ATM), virus vivo atenuado adaptado al frío (FM#6) o se inmunizaron de forma simulada con medio (OPTI-MEM™). Se supervisaron el peso corporal, la temperatura corporal y los síntomas clínicos de los animales y se evaluaron las respuestas inmunológicas. Se utilizaron para el estudio 30 hurones machos (Triple F Farms, Sayre PA), de 4 meses de edad en el momento del inicio del estudio. Todos los procedimientos con animales se realizaron en una instalación de nivel 2 de bioseguridad o nivel 3 de bioseguridad animal de acuerdo con los protocolos aprobados por el comité de uso y cuidado de los animales del Instituto de Investigación IIT. Antes de la inoculación, los hurones se supervisaron durante 3 días para medir el peso corporal y establecer las temperaturas corporales de referencia. Las lecturas de temperatura se registraron diariamente a través de un transpondedor (BioMedic data systems, Seaford, DE) implantado por vía subcutánea en cada hurón. Se extrajo sangre antes del inicio del estudio y se analizó el suero para detectar anticuerpos contra la gripe. Solo se consideraron seronegativos y se usaron en este estudio hurones con títulos de HAI (inhibición de la hemaglutinación) 40 para A/Brisbane/10/2007 (H3N2). Los animales del estudio se aleatorizaron y se dividieron en 5 grupos (6 hurones/grupo) como se muestra en la tabla 17. Dos grupos (1 y 3) recibieron el virus M2KO(ATM) y 2 grupos (2 y 4) recibieron el virus FM#6. Un grupo (5) se inmunizó de forma simulada con OPTI-MEM™. Dentro de cada grupo de vacuna, los hurones se dividieron en dos regímenes de vacuna, seis que recibieron solo una vacunación de sensibilización (solo sensibilización) y seis que recibieron una vacunación de sensibilización seguida de una vacuna de refuerzo 28 días después de la vacunación de sensibilización (sensibilización/refuerzo). Grupos de sensibilización/refuerzo: Los hurones se inocularon por vía intranasal con una dosis única de 316 pl de 1x107 DICT50 del virus M2KO(ATM) los días 0 y 28. Los grupos de control se inocularon por vía intranasal con 316 pl de 1x107 DICT50 (misma dosis que M2KO(ATM)) de FM#6 o se inocularon de forma simulada con 316 pl de OPTI-MEm ™ los días 0 y 28. Se supervisaron diariamente las temperaturas corporales, los pesos y los síntomas clínicos de los hurones durante 14 días después de las inoculaciones. Se recogieron lavados nasales de todos los hurones, incluyendo el grupo de control de OPTI-MEM™, los días 1, 3, 5, 7, 9 y 14 después de la vacunación de sensibilización para la titulación de virus en las células y los días 21 y 49 para la titulación de anticuerpos. Las muestras de lavado nasal se mantuvieron a -65 °C. Se extrajo sangre antes de la inoculación (día -3 a -5) y los días 7, 14, 21, 35, 42 y 49 y el suero se mantuvo a -65 °C hasta la medición del título de anticuerpos mediante ELISA y ensayo IH.
Grupos solo con sensibilización: Los hurones se inocularon por vía intranasal con una dosis única de 316 pl de 1x107 DICT50 del virus M2KO(ATM) el día 28. Los grupos de control se inocularon por vía intranasal con 316 pl de 1x107 DICT50 (misma dosis que M2Ko (ATM)) de FM#6 o se inocularon de forma simulada con 316 pl de OPTI-MEM™ el día 28. Se supervisaron diariamente las temperaturas corporales, los pesos y los síntomas clínicos de los hurones durante 14 días después de la inoculación. Se recogieron lavados nasales de todos los hurones los días 29, 31, 33, 35, 37 y 42 para la titulación de virus en las células y el día 49 para la titulación de anticuerpos. Las muestras de lavado nasal se mantuvieron a -65 °C. Se extrajo sangre antes de la inoculación (día 23 a 25) y los días 35, 42 y 49 y el suero se mantuvo a -65 °C hasta la medición del título de anticuerpos mediante ELISA y ensayo IH. Todos los hurones se expusieron a una dosis de 316 pl de 1x107 DICT50 del virus de la gripe A/Brisbane/10/2007 (H3N2) de tipo silvestre el día 56, 4 semanas después de la administración de la vacuna de sensibilización/refuerzo. Se supervisaron el peso corporal, la temperatura corporal y los síntomas clínicos de los hurones durante 14 días después de la exposición y se recogieron lavados nasales y órganos. Se recogieron lavados nasales de hurones expuestos los días 1, 3, 5, 7, 9 y 14 después de la exposición (días 57, 59, 61, 63, 65 y 70) y las muestras se mantuvieron a -65 °C para la titulación de virus en células. El día 3 después de la exposición (día 59), los animales (3 animales por grupo, 15 animales en total) se sacrificaron y se recogieron las siguientes muestras tisulares: cornetes nasales, tráquea y pulmones. Una parte de las muestras recogidas se fijó con formalina neutra tamponada para la evaluación histológica y la otra parte de las muestras se almacenó a -65 °C para la titulación de virus. Se extrajo sangre 14 días después de la exposición (día 70) y todos los animales supervivientes se sacrificaron.
Tabla 17: Programa de vacunación y recogida de muestras
Lavados
Grupo Virus de la N Vacunación posición Lavad
na .os ^
sales Organ ,
.o..s3 , Recogidas vacuna1 (días) nasales2 Ex
... , n = 3 (día)
(días) (día) de suero (días) 1 '
Solo sensibilización
1 M2KO 6 28 29, 31, 33, 35, 56 57, 59, 61,
59 35, 42, 49, 37, 42, 49 63, 65, 70 70
2 FM#6 6 28 29, 31, 33, 35, 56 57, 59, 61, 42, 49,
31,42, 49 63, 65, 70 59 35,
70 Sensibilización/refuerzo
1,3,5, 7, 9, 57, 59, 61, 7, 14,21,
3 M2KO 6 0,28 14, 21, 49 56 63, 65, 70 59 35, 42, 49,
70
,
4 FM#6 6 0,28 1,3,5, 7, 9, 56 57, 59, 61, 7, 14,21
35, 42, 49, 14, 21, 49 63, 65, 70 59
70
14,21, C Vehículo £ 0 0,28 1,3,5, 7, 9, 56 57, 59, 61, 7,
59 35, 42, 49, (control) O 14, 21, 49 63, 65, 70 70
Inoculado por vía intranasal con una dosis de 1x107 DICT50
2Solo se recogen lavados nasales de animales después de la vacunación de sensibilización.
3Órganos (cornetes nasales, tráquea y pulmón) recogidos de 3 hurones por grupo para histología y títulos víricos.
F. Inoculación de virus: Se inocularon hurones con el virus M2KO(ATM) o el virus de la gripe A FM#6. Se descongeló un vial de reserva congelada y se diluyó a la concentración adecuada en solución salina tamponada con fosfato. Los hurones se anestesiaron con ketamina/xilazina y la dosis de virus se administró por vía intranasal en un volumen de 316 |jl para el virus M2KO(ATM) y 316 pl para el virus FM#6. Para confirmar el título de inoculación de los virus M2KO(ATM) y FM#6, se recogieron alícuotas de las soluciones de dosificación antes de la dosificación (predosis) y después de la dosificación (posdosis). Las alícuotas se almacenaron a -65 °C para la titulación del virus.
G. Virus de exposición: Se usó virus de la gripe A, cepa A/Brisbane/10/2007, serotipo H3N2 para exponer a los hurones. El virus se almacenó a aproximadamente -65 °C antes de su uso. El nivel de dosis de virus de exposición usado se preparó a 1x107 DICT50 en un volumen de 316 jl. Se realizó un ensayo cuantitativo de la infecciosidad vírica, ensayo de DICT50, en IITRI en una parte de la solución de exposición vírica preparada. El ensayo de título vírico se realizó según los procedimientos operativos convencionales del IITRI.
H. Observaciones de estado moribundo/mortalidad: Después de la exposición, todos los animales se observaron dos veces al día para determinar la mortalidad o pruebas de estado moribundo. Los animales se observaron durante 14 días después de la inoculación de la vacuna y durante 14 días después de la exposición.
I. Pesos corporales y cambio de peso corporal: Los pesos corporales se registraron en los dos días posteriores a la recepción y en el momento de aleatorización. Todos los animales del estudio se pesaron antes de la inoculación, diariamente durante 14 días después de cada vacunación y se evaluaron diariamente durante 14 días después de la exposición. Antes de la inoculación, los hurones se supervisaron durante 3-5 días para medir la temperatura corporal de referencia establecida. Las lecturas de temperatura se registraron diariamente durante 14 días después de cada vacunación y se registraron diariamente durante 14 días después de la exposición a través de un transpondedor (BioMedic data systems, Seaford, DE) implantado por vía subcutánea en cada hurón. El cambio de temperatura (en grados Celsius) se calculó en cada punto temporal para cada animal.
J. Observaciones clínicas: El cambio de temperatura (en grados Celsius) se determinó diariamente para cada hurón. Los signos clínicos de, inapetencia, signos respiratorios tales como disnea, estornudos, tos y rinorrea y el nivel de actividad se evaluaron diariamente. Un sistema de puntuación basado en el descrito por Reuman, et al., "Assessment of signs of influenza illness in the ferret model", J. Virol, Methods 24: 27-34 (1989), se usó para evaluar el nivel de actividad de la siguiente manera: 0, alerta y activo; 1, alerta pero activo sólo cuando se le estimula; 2, alerta pero no activo cuando se le estimula; y 3, ni alerta ni activo cuando se le estimula. Se calculó un índice de inactividad relativa (IIR) como la puntuación media por grupo de hurones por observación (día) durante la duración del estudio.
K. Controles de supervivencia: Se realizaron dos controles de supervivencia diariamente en todos los animales del estudio a lo largo del estudio. Ambos controles de supervivencia se realizaron simultáneamente con las observaciones clínicas. El segundo control se realizó más tarde el mismo día.
L. Lavados nasales: Los hurones se anestesiaron con una mezcla de ketamina (25 mg/kg) y xilacina (2 mg/kg) y se inyectaron 0,5 ml de PBS estéril que contenía penicilina (100 U/ml), estreptomicina (100 |jg/ml) y gentamicina (50 jg/m l) en cada orificio nasal y se recogieron en un recipiente para muestras cuando el hurón lo expulsó. El lavado nasal se recogió en un criovial y se registró el volumen recuperado.
M. Sacrificio: Los animales del estudio se sacrificaron mediante una dosis intravenosa de pentobarbital sódico 150 mg/kg. La muerte se confirmó por la ausencia de latidos cardíacos y respiración observables.
N. Necropsia: La necropsia fue realizada por Charles River Laboratories, Pathology Associates (PAI). El equipo de PAI estaba compuesto por un patólogo supervisor y dos disectores. Se recogieron los cornetes nasales, la tráquea y los pulmones. Una parte de cada tejido se fijó en formalina y la otra parte se entregó al personal del IITRI para su congelación y almacenamiento. Los tejidos recogidos para títulos son: cornetes nasales derechos, tercio superior de la tráquea y lóbulo pulmonar craneal derecho.
O. Análisis histopatológico: Después de cada necropsia, los tejidos se transportaron a las instalaciones de PAI en Chicago. Tras su recepción, se procesaron tejidos parciales de los 15 hurones hasta obtener bloques de parafina, se cortaron a un grosor de aproximadamente 5 micrómetros y se tiñeron con hematoxilina y eosina (H y E). Todos los portaobjetos de parafina H y E se evaluaron por microscopia.
P. Recogida de suero: Se recogió suero de los hurones antes de la vacunación (días -3 a -5 para los grupos 3, 4 y 5, y días 23 a 25 para los grupos 1 y 2). Después de la inoculación, se recogió suero los días 7, 14, 21, 35, 42, 49 y 70 de los grupos 3, 4 y 5. Se recogió suero los días 35, 42, 49 y 70 de los grupos 1 y 2. Los hurones se anestesiaron con una mezcla de ketamina (25 mg/kg) y xilacina (2 mg/kg). Se recogió una muestra de sangre (aproximadamente 0,5­ 1,0 ml) a través de la vena cava de cada hurón y se procesó para obtener suero. La sangre se recogió en tubos de suero gel Z/1.1 (Sarstedt Inc. Newton, NC) y se almacenó a temperatura ambiente durante no más de 1 hora antes de recoger el suero. Los tubos de suero gel Z/1.1 se centrifugaron a 10000 x g durante 3 minutos y se recogió el suero.
Q. Ensayo de inhibición de la hemaglutinación (IH): Las muestras de suero se trataron con enzima destructora de receptores (RDE) (Denka Seiken, Tokio, Japón) para eliminar los inhibidores de la hemaglutinación inespecífica. RDE se reconstituyó según las instrucciones del fabricante. El suero se diluyó 1:3 en RDE y se incubó de 18 a 20 horas en un baño de agua a 37 °C ± 2 °C. Después de la adición de un volumen igual de citrato de sodio al 2,5 % (v/v), las muestras se incubaron en un baño de agua a 56 ± 2 °C durante 30 ± 5 minutos. Se añadió NaCl al 0,85 % a cada muestra hasta una dilución de suero final de 1:10 después del tratamiento con RDE. Las muestras diluidas se diluyeron después en cuatro diluciones dobles (de 1:10 a 1:80) por duplicado en solución salina tamponada con fosfato (PBS) y después se incubaron con 4 unidades hemaglutinantes del virus de la gripe A A/Brisbane/10/2007 (H3N2). Después de la incubación, se añadieron 0,5 % de glóbulos rojos aviares a cada muestra y se incubaron durante 30 ± 5 minutos. A continuación, se puntuó la presencia o ausencia de hemaglutinación.
R. Títulos de virus: La concentración de virus infeccioso en las muestras de inóculo de virus antes y después de la exposición se determinó mediante ensayo de DICT50 en células de riñón canino Madin-Darby (MDCK). En resumen, las muestras mantenidas a -65 °C se descongelaron y centrifugaron para eliminar los residuos celulares. El sobrenadante resultante se diluyó 10 veces por triplicado en placas de microtitulación de 96 pocillos en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) (Gibco, Carlsbad, CA, Estados Unidos) que contenía pencilina/estreptomicina, gentamicina al 0,1 %, NaCO3 al 3 %, fracción V de BSA al 0,3 % (Sigma San Luis, MO), de solución de vitamina MEM al 1 % (Sigma) y L-glutamina al 1 % (Mediatech, Manassas, VA, Estados Unidos). Después de realizar diluciones en serie de 10 veces, se transfirieron 100 j l a los pocillos respectivos de una placa de 96 pocillos que contenía una monocapa de células MDCK. Las placas se incubaron a 37 °C ± 2 °C en 5 ± 2 % de CO2 a 70 % de humedad. Después de 48 horas, se observaron los pocillos para determinar el efecto citopatógeno (ECP). El sobrenadante de cada pocillo (50 j l ) se transfirió a una placa de 96 pocillos y se determinó y registró la actividad de hemaglutinación (HA). La actividad de HA del sobrenadante se evaluó mediante un ensayo de HA con concentrado de eritrocitos de pavo (tRBC) al 0,5 %. Los títulos de DICT50 se calcularon usando el método de Reed LJ y Muench H, "A simple method for estimating 50 % endpoints", Am. J. Hygiene 27: 493-497 (1938). S.
S. Análisis de datos: Se determinaron los pesos corporales y los aumentos (pérdidas) de peso corporal y los cambios de la temperatura corporal para cada animal individual expresados como media y desviaciones típicas de la media para cada grupo de prueba.
RESULTADOS
Después de la vacunación intranasal con el virus M2KO(ATM) o el virus FM#6, los hurones se supervisaron diariamente para detectar signos clínicos de infección. Se recogieron lavados nasales después de la vacunación de sensibilización para supervisar la excreción vírica y se recogió suero para medir los títulos de anticuerpos en suero. Los resultados se presentan en las tablas 18A, 18B y 18C.
Tabla 18A: Efecto de la vacunación sobre la supervivencia y los signos clínicos de infección en hurones.
Signos clínicos5
~ -r . ■ . M Título IH en Número total p¿rHiHa Grupo Tratamiento N s u e r o a de muertos Signos respiratorios (día de Letargo nohb dsPe nrv /aH do n d Hep» a p n a r ri icr iinó n ^ ) ue f apetito (R l lhl) cc Sensibilización
1 M2KO 6 <10 0/6 2/6 (8) 0/6 0
2 FM#6 6 <10 0/6 0/6 0/6 0
3 M2KO 6 <10 0/6 0/6 0/6 0,07 4 FM#6 6 <10 0/6 0/6 0/6 0,29
5 Vehículo
(control) 6 <10 0/6 0/6 0/6 0
Refuerzo
3 M2KO 6 <10 0/6 0/6 0/6 0
4 FM#6 6 <10 0/6 2/6 (7) 0/6 0
5 Vehículo
(control) 6 <10 0/6 2/6 (4) 0/6 0 aTítulos de anticuerpos de inhibición de la hemaglutinación (IH) contra virus homólogos en suero de hurón antes de la inoculación del virus.
bSe observaron signos clínicos durante 3 días después de la inoculación del virus. Excepto por el letargo, los hallazgos de los signos clínicos se proporcionan como n.° de hurones con signo/n.0 total. Los signos respiratorios incluyeron estornudos.
determinado dos veces al día durante 3 días de observación según el sistema de puntuación y se calculó como la puntuación media por grupo de hurones por observación (día) durante el periodo de 3 días. El índice de inactividad relativa antes de la inoculación fue de 0.
Tabla 18B: Títulos de virus en ór anos res iratorios de hurones des ués de la ex osición
Figure imgf000032_0001
T l 1 : R I A l m n h r n
Figure imgf000033_0001
Todos los hurones sobrevivieron a la vacunación con el virus M2KO(ATM) y el virus FM#6. Después de la vacunación de sensibilización, dos hurones inoculados con el virus M2KO(ATM) presentaron signos respiratorios (estornudos) el día 8. Después de la vacunación de refuerzo, los hurones inoculados con el virus f M#6 presentaron signos respiratorios (estornudos) 7 días después de la vacunación. También se observaron estornudos en los hurones OPTI-MEM™ el día 4 después del refuerzo. Después de la vacunación de sensibilización, el índice de inactividad relativa de los hurones inoculados con el virus M2KO(ATM) y el virus FM#6 fue de 0,07 y 0,27, respectivamente. Esta reducción de la actividad solo se observó en un grupo por virus después de la vacunación de sensibilización. Después de la vacunación de refuerzo no se observó reducción del nivel de actividad. Los cambios del peso y la temperatura corporales después de la inoculación del virus se muestran en la figura 22 y la figura 23. No se observó pérdida de peso después de la vacunación; sin embargo, la vacunación pareció tener efecto sobre el aumento de peso. Después de la vacunación, los pesos corporales de los hurones de control OPTI-MEM™ aumentaron un 20 % durante los 14 días de observación, mientras que el aumento de peso corporal de los hurones vacunados con M2KO(ATM) o FM#6 varió entre el 6 y el 15 % después de la sensibilización y entre el 4 y el 6 % después del refuerzo. No se observó ningún aumento de la temperatura corporal en ningún grupo después de la vacunación. Se muestran cambios del peso corporal y la temperatura después de la exposición en la figura 24 y la figura 25 y los signos clínicos se resumen en la tabla 19.
Tabla 19: Efecto de la exposición del virus sobre la supervivencia y los signos clínicos de infección en hurones.
Signos clínicos3 Numero
Grupo Tratamiento N total de Signos respiratorios (día Pérdida de
muertos observado de aparición) apetito Letargo (Rll)b
1 M2KO 6 0/6 5/6 (2) 0/6 0
2 FM#6 6 0/6 5/6 (1) 0/6 0
3 M2KO 6 0/6 3/6 (2) 0/6 0
4 Vehículo
FM#6 6 0/6 3/6 (2) 0/6 0 5 (Control) 6 0/6 3/6 (3) 0/6 0 aSe observaron signos clínicos durante 3 días después de la inoculación del virus. Excepto por el letargo, los hallazgos de los signos clínicos se proporcionan como n.° de hurones con signo/n.0 total. Los signos respiratorios incluyeron estornudos.
determinado dos veces al día durante 3 días de observación según el sistema de puntuación y se calculó como la puntuación media por grupo de hurones por observación (día) durante el periodo de 3 días. El índice de inactividad relativa antes de la inoculación fue de 0.
Después de la exposición con A/Brisbane/10/2007 (H3N2), se observó una pérdida de peso corporal del 2-4 % el día 2 después de la exposición en todos los animales. A lo largo del periodo de observación de 14 días, los pesos corporales de los animales permanecieron por debajo de su peso inicial. Los hurones OPTI-MEM™ perdieron más peso (8 %). La pérdida de peso entre los hurones vacunados dependió del régimen de vacunación. Los hurones que recibieron el régimen solo de sensibilización de M2KO(ATM) o FM#6 perdieron un máximo de 5 % y 4 % respectivamente. Los hurones que recibieron un refuerzo perdieron un máximo de 3 % para el grupo FM#6 y 2 % para el grupo M2KO(ATM). Se observaron temperaturas corporales elevadas después de la exposición el día 2 en hurones OPTI-MEM™ y en los hurones del día 1 que recibieron los regímenes solo de sensibilización de M2KO(ATM) o FM#6 (figura 25). Las temperaturas corporales de los hurones que recibieron un refuerzo permanecieron dentro del intervalo normal.
Para determinar si la vacunación evitaría la replicación del virus de exposición en las vías respiratorias y reduciría la patología orgánica, se examinaron histológicamente tejidos de hurones expuestos el día 3 después de la inoculación. Los cambios en los pulmones de los animales que recibieron el régimen solo de sensibilización o de sensibilización/refuerzo M2KO(ATM) se asociaron con un aumento de la gravedad de los infiltrados de células mixtas en el pulmón en comparación con el grupo OPTI-MEM™. Se observaron diferencias menores en las incidencias de infiltrado pulmonar entre el grupo de sensibilización M2KO(ATM) y el grupo de sensibilización/refuerzo de M2KO(ATM). También se observó un aumento de la gravedad de los infiltrados de células mixtas en el pulmón en el grupo de sensibilización FM#6 y el grupo de sensibilización/refuerzo FM#6 en comparación con el grupo OPTI-MEM™. Se observó un ligero aumento de la gravedad de los infiltrados de células mixtas pulmonares en el grupo de sensibilización/refuerzo FM#6 sobre el grupo solo con sensibilización FM#6. En los cornetes nasales, los animales que recibieron la sensibilización o sensibilización/refuerzo del virus M2KO(ATM) presentaron una atrofia del epitelio respiratorio de menor gravedad en comparación con el grupo OPTI-MEM™. No hubo diferencias en la atrofia de los cornetes nasales en comparación con los grupos M2KO(ATM) de sensibilización frente a sensibilización/refuerzo. Se observó un ligero aumento de la gravedad de la atrofia del epitelio respiratorio en animales que recibieron el régimen de sensibilización/refuerzo de FM#6 frente a los animales con el régimen solo de sensibilización FM#6; la gravedad de la atrofia del epitelio respiratorio en todos los animales FM#6 fue menor que la observada en el grupo OPTI-MEM™. Hubo una disminución de la incidencia de infiltrados neutrófilos en la cavidad nasal (luz) en los grupos de sensibilización y sensibilización/refuerzo de M2KO(ATM) en comparación con el grupo de OPTI-MEM™. Los infiltrados luminales neutrófilos en el grupo solo de sensibilización de M2KO(ATM) se interpretaron como no diferentes del grupo de OPTIMEM™. Hubo un ligero aumento de la gravedad de los infiltrados neutrófilos luminales en los grupos solo de sensibilización y de sensibilización/refuerzo de FM#6 en comparación con el grupo de OPTI-MEM™. Las concentraciones de las soluciones de dosificación de virus antes y después de la exposición fueron 107,83 DICTso/ml y 107,25 DICTso/ml, respectivamente, lo que indica una buena estabilidad del material de exposición a lo largo de la administración.
La figura 45 muestra la replicación del virus M2KO(ATM) y FluMist® en las vías respiratorias del hurón.
La figura 46 muestra los títulos víricos de M2KO(ATM) y FluMist® en lavados nasales después de la exposición intranasal con el virus A/Brisbane/10/2007 (H3N2).
La figura 47 muestra los títulos de IgG en hurones después de la vacunación con M2KO(ATM) y FluMist®, solo grupo de sensibilización.
La figura 48 muestra los títulos de IgG en hurones después de la vacunación con M2KO(ATM) y FluMist®, grupos de sensibilización-refuerzo.
La figura 49 muestra un sumario de los títulos de IgG de ELISA en sueros de hurón de la vacunación con M2KO(ATM) o FluMist® hasta después de la exposición.
CONCLUSIÓN
Este ejemplo muestra que la administración intranasal del virus M2KO(ATM) no se asoció con ningún acontecimiento adverso relacionado con la vacuna (temperatura corporal elevada, pérdida de peso o signos clínicos). Estos resultados muestran que el virus M2KO(ATM) de la presente tecnología es útil en una vacuna intranasal contra la gripe.
Ejemplo 12: El virus M2KO(ATM) no se transmite en el modelo de hurón
Sumario: este ejemplo demuestra que el virus M2KO(ATM) no se transmite en el modelo de hurón. El virus M2KO(ATM) se administró por vía intranasal a 3 hurones hembras a un nivel de dosis de 1x107 DICT50. Como control, se administró a un segundo grupo de 3 hurones hembras el virus A/Brisbane/10/2007 (H3N2) por vía intranasal en una dosis de 1x107 DICT50. Veinticuatro horas después de la inoculación, cada hurón donante se introdujo en una cámara de transmisión con dos hurones sin exposición previa (un contacto directo y un contacto de aerosol). Después de la inoculación, se observó a los hurones durante 14 días tras la inoculación para determinar la mortalidad, con pesos corporales, temperatura corporal y signos clínicos medidos diariamente. Se recogieron lavados nasales de todos los hurones donantes inoculados los días 1, 3, 5, 7, 9 y de todos los hurones de contacto (directo y en aerosol) los días 2, 4, 6, 8, 10 para buscar la excreción de virus. Se recogieron lavados nasales y suero de todos los hurones en la inoculación del estudio (día 14) para evaluar los niveles de anticuerpos. No se observaron signos clínicos de infección en el grupo M2KO(ATM); sin embargo, los hurones en el grupo A/Brisbane/10/2007 (H3N2) tuvieron pérdida de peso, aumento de la temperatura corporal y estornudos. Después de la inoculación con Brisbane/10, los hurones donantes presentaron un aumento de la temperatura corporal 2 días después de la exposición y una reducción del peso. Los niveles de actividad no se redujeron en ningún grupo. Los hurones en contacto directo con los hurones donantes mostraron un aumento progresivo del peso hasta el día 4 después de la inoculación. Se observó una tendencia similar en los hurones con contacto por aerosoles a partir del día 6 después de la inoculación. La pérdida de peso corporal en los hurones de contacto se correlacionó con un aumento de la temperatura corporal. La inoculación con el virus M2KO(ATM) no induce signos clínicos de infección en animales inoculados. Es poco probable que se propague a hurones de contacto.
MATERIALES Y MÉTODOS
A. Material de la vacuna: El virus M2KO(ATM) es un virus recombinante que posee 6 genes internos de PR8 (nucleoproteína (NP), genes de la polimerasa (PA, PB1, PB2), no estructural (NS), matriz (M)), pero que no expresa la proteína M2 funcional, así como genes HA y NA de gripe A/Uruguay/716/2007 (H3N2) similar a A/Brisbane/10/2007.
El virus M2KO(ATM) se administró por vía intranasal a los animales en una dosis de 316 |jl de 1x107 DICT50 (dosis infecciosas de cultivo tisular al 50 %).
B. Formulación de la dosis del artículo de prueba: La solución de dosificación del virus M2KO(ATM) de 1x107 DICT5o/ml por cada 316 j l se preparó diluyendo 45 de 1x109 DICT50/ml en 1,377 ml de PBS.
C. Animales y cuidado de los animales: Se compraron 22 hurones hembras de Triple F Farms y 18 de los hurones se pusieron en estudio. Los animales tenían aproximadamente 4 meses de edad en el momento del inicio del estudio. El proveedor certificó que los animales estaban sanos y exentos de anticuerpos contra enfermedades infecciosas. A su llegada, los animales se alojaron individualmente en jaulas de alambre suspendidas con fondos de listones, suspendidas sobre bandejas de residuos revestidas de papel. La habitación de los animales y las jaulas se limpiaron y desinfectaron antes de la recepción de los animales, de acuerdo con las prácticas aceptadas de cuidado de los animales y los procedimientos operativos convencionales relevantes. Se proporcionaron a voluntad dieta certificada para hurones Teklad Global n.° 2072 (Teklad Diets, Madison WI) y agua del grifo de la ciudad de Chicago y se renovaron al menos una vez al día. Se mantuvo iluminación fluorescente en las habitaciones de los animales en un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas. La temperatura y la humedad relativa de las habitaciones de los animales estuvieron dentro de los límites respectivos del protocolo y variaron de 23,0 a 25,0 °C y de 36 a 50 %, respectivamente, durante el estudio.
D. Cuarentena animal y aleatorización: Los hurones se mantuvieron en cuarentena durante siete días antes de la aleatorización y se observaron diariamente. En función de las observaciones diarias que indican la buena salud general de los animales, los hurones fueron liberados de la cuarentena para la aleatorización y las pruebas. Después de la cuarentena, los hurones se pesaron y se asignaron a grupos de tratamiento usando un procedimiento de aleatorización computarizado basado en pesos corporales que produjeron valores medios de grupos similares [ToxData® versión 2.1.E.11 (PDS Pathology Data Systems, Inc., Basilea, Suiza)]. Dentro de un grupo, todos los pesos corporales estaban en un intervalo del 20 % de su media. Los animales seleccionados para el estudio reciben un número de identificación permanente mediante una etiqueta en la oreja y un transpondedor, y las tarjetas de jaula individuales también identifican a los animales del estudio por números individuales y grupo. Los números de identificación asignados fueron únicos dentro del estudio.
E. Diseño experimental: Para evaluar la transmisibilidad del virus M2KO(ATM), se inocularon hurones con virus M2KO(ATM) o virus A/Brisbane/10/2007 (H3N2). Se supervisaron el peso corporal, la temperatura corporal, los síntomas clínicos y la excreción de virus de los animales y se evaluaron las respuestas inmunológicas. Se utilizaron para el estudio 18 hurones hembras (Triple F Farms, Sayre PA), de 4 meses de edad en el momento del inicio del estudio. Todos los procedimientos con animales se realizaron en una instalación de nivel 2 o nivel 3 de bioseguridad animal. Antes de la inoculación, los hurones se supervisaron durante 3 días para medir el peso corporal y establecer las temperaturas corporales de referencia. Las lecturas de temperatura se registraron diariamente a través de un transpondedor (BioMedic data systems, Seaford, DE) implantado por vía subcutánea en cada hurón. Se extrajo sangre antes del inicio del estudio y se analizó el suero para detectar anticuerpos contra la gripe. Solo se consideraron seronegativos y se usaron en este estudio hurones con títulos de HI 40 para virus A/Brisbane/10/2007 (H3N2). Los animales del estudio se aleatorizaron y se dividieron en 2 grupos (9 hurones/grupo, 3/cámara de transmisión) como se muestra en la tabla 20. Los hurones del grupo 1 (cámaras A-C) se asignaron para recibir el virus M2KO(ATM). Los hurones del grupo 2 (cámaras A-C) se asignaron para recibir el virus A/Brisbane/10/2007 (H3N2). Dentro de cada grupo, los hurones se dividieron en donantes inoculados o contactos sin exposición previa.
Tabla 20: Diseño del estudio
Lavados
Grupo Cámara Virus N1 Inoculación nasales de Lavados nasales de Recogida de (día)2 contactos (días) suero donantes (días)
1 A M2KO 3 0 1,3, 5, 7, 9, 14 2, 4, 6, 8, 10, 14 14
1 B M2KO 3 0 1,3, 5, 7, 9, 14 2, 4, 6, 8, 10, 14 14
1 C M2KO 3 0 1,3, 5, 7, 9, 14 2, 4, 6, 8, 10, 14 14
2 A Brisbane/10 3 0 1,3, 5, 7, 9, 14 2, 4, 6, 8, 10, 14 14
2 B Brisbane/10 3 0 1,3, 5, 7, 9, 14 2, 4, 6, 8, 10, 14 14
2 C Brisbane/10 3 0 1,3, 5, 7, 9, 14 2, 4, 6, 8, 10, 14 14
1Cada cámara constaba de tres hurones hembras: un hurón donante infectado y 2 hurones de contacto sin exposición previa (1 contacto directo y 1 contacto con aerosol).
inoculado por vía intranasal con una dosis única de 316 pl de 1x107 DICT50 de M2KO 0 1x107 DICT50 del virus A/Brisbane/10/2007 (H3N2).
Cada grupo se alojó en habitaciones separadas y las personas que trabajaban con los animales siguieron un estricto patrón de flujo de trabajo para evitar la contaminación cruzada entre los dos grupos. En cada grupo, se inoculó un hurón donante por vía intranasal con una dosis individual de 316 j l de 1x107 DICT50 de M2KO(ATM) (grupol) o 1x107 DICT50 del virus A/Brisbane/10/2007 (H3N2) (grupo 2). Veinticuatro horas después de la inoculación; cada donante se colocó en la misma jaula con 1 hurón sin exposición previa (contacto directo), con alojamiento doble dentro de una jaula de alambre. Se colocó un hurón adicional (contacto por aerosol) en una jaula de alambre adyacente separada (alojamiento individual) dentro de la cámara de transmisión separada de la jaula del donante por una distancia de 10­ 12 cm. Se supervisaron diariamente las temperaturas corporales, los pesos y los síntomas clínicos de los hurones durante 14 días después de la inoculación. Se recogieron lavados nasales de todos los hurones donantes inoculados los días 1, 3, 5, 7, 9 y de todos los hurones de contacto (directo y en aerosol) los días 2, 4, 6, 8, 10 para determinar la titulación de virus en células. Se recogieron lavados nasales de todos los hurones el día 14 para determinar la titulación de anticuerpos. Las muestras de lavado nasal se mantuvieron a -65 °C.
F. Cámaras de transmisión: Cada cámara de transmisión tenía 2 metros cúbicos. Se usó una unidad de tratamiento de aire computarizada para la filtración HEPA y para supervisar y controlar las condiciones ambientales dentro de las cámaras de transmisión. Para proporcionar un flujo de aire direccional, se aportó aire filtrado por HEPA a través de un orificio de entrada ubicado en un extremo de la cámara, se sacó a través de un orificio de salida en el extremo opuesto de la cámara, se filtró por HEPA y se expulsó a la habitación. La tasa de intercambio de aire fue de 20 cambios de aire completos por hora para cada cámara, el flujo de aire se mantuvo en <0,1 m/s. Las cámaras se mantuvieron a una presión negativa de -373 bar (-0,15 pulgadas de agua). Los hurones se alojaron en jaulas de alambre con fondos de listones que estaban suspendidas sobre bandejas de residuos revestidas de papel. Los hurones se alojaron de dos en dos en jaulas de 32x24x14 o individualmente en jaulas de alambre de 24x24x14 que se colocaron dentro de cada cámara de transmisión con filtro HEPA.
G. Inoculación de virus: Se inocularon hurones con el virus M2KO(ATM). Se descongeló un vial de reserva congelada y se diluyó a la concentración adecuada en solución salina tamponada con fosfato. Los hurones se anestesiaron con ketamina/xilazina y la dosis de virus se administró por vía intranasal en un volumen de 316 j l para el M2KO(ATM). Para confirmar el título de inoculación del virus M2KO(ATM), se recogieron alícuotas de las soluciones de dosificación antes de la dosificación (predosis) y después de la dosificación (posdosis). Las alícuotas se almacenaron a 65 °C para la titulación del virus.
H. Virus de exposición: Se usó virus de la gripe A, cepa A/Brisbane/10/2007, serotipo H3N2 para inocular a los hurones de control. El virus se almacenó a aproximadamente -65 °C antes de su uso. El nivel de dosis de virus de exposición usado se preparó a 1x1 07 DICT50 en un volumen de 316 jl. Un ensayo cuantitativo de la infecciosidad vírica, se realizó ensayo de DICT50 en IITRI en una parte de la solución de exposición vírica preparada. El ensayo de título vírico se realizó según los procedimientos operativos convencionales del IITRI.
I. Observaciones de estado moribundo/mortalidad: Después de la exposición, todos los animales se observaron dos veces al día para determinar la mortalidad o pruebas de estado moribundo. Los animales se observaron durante 14 días después de la inoculación de la vacuna y durante 14 días después de la exposición.
J. Pesos corporales y cambio de peso corporal: Los pesos corporales se registraron en los dos días posteriores a la recepción y en el momento de aleatorización. Todos los animales del estudio se pesaron antes de la inoculación, diariamente durante 14 días después de cada vacunación y se evaluaron diariamente durante 14 días después de la exposición. Antes de la inoculación, los hurones se supervisaron durante 3-5 días para medir la temperatura corporal de referencia establecida. Las lecturas de temperatura se registraron diariamente durante 14 días después de cada vacunación y se registraron diariamente durante 14 días después de la exposición a través de un transpondedor (BioMedic data systems, Seaford, DE) implantado por vía subcutánea en cada hurón. El cambio de temperatura (en grados Celsius) se calculó en cada punto temporal para cada animal.
K. Observaciones clínicas: El cambio de temperatura (en grados Celsius) se determinó diariamente para cada hurón. Los signos clínicos de, inapetencia, signos respiratorios tales como disnea, estornudos, tos y rinorrea y el nivel de actividad se evaluaron diariamente. Un sistema de puntuación basado en el descrito por Reuman, et al., "Assessment of signs of influenza illness in the ferret model", J. Virol, Methods 24: 27-34 (1989), se usó para evaluar el nivel de actividad de la siguiente manera: 0, alerta y activo; 1, alerta pero activo sólo cuando se le estimula; 2, alerta pero no activo cuando se le estimula; y 3, ni alerta ni activo cuando se le estimula. Se calculó un índice de inactividad relativa (IIR) como la puntuación media por grupo de hurones por observación (día) durante la duración del estudio.
L. Controles de supervivencia: Se realizaron dos controles de supervivencia diariamente en todos los animales del estudio a lo largo del estudio. Ambos controles de supervivencia se realizaron simultáneamente con las observaciones clínicas. El segundo control se realizó más tarde el mismo día.
M. Lavados nasales: Los hurones se anestesiaron con una mezcla de ketamina (25 mg/kg) y xilacina (2 mg/kg) y se inyectaron 0,5 ml de PBS estéril que contenía penicilina (100 U/ml), estreptomicina (100) y gentamicina (50) en cada orificio nasal y se recogieron en un recipiente para muestras cuando el hurón lo expulsó.
N. Sacrificio: Los animales del estudio se sacrificaron mediante una dosis intravenosa de pentobarbital sódico 150 mg/kg. La muerte se confirmó por la ausencia de latidos cardíacos y respiración observables. Se realizaron necropsias en todos los animales del estudio.
O. Recogida de suero: Se recogió suero previo a la vacunación (días -3 a -5) y suero posterior a la inoculación (día 14) de todos los hurones. Los hurones se anestesiaron con una mezcla de ketamina (25 mg/kg) y xilacina (2 mg/kg). Se recogió una muestra de sangre (aproximadamente 0,5-1,0 ml) a través de la vena cava de cada hurón y se procesó para obtener suero. La sangre se recogió en tubos de suero gel Z/1.1 (Sarstedt Inc. Newton, NC) y se almacenó a temperatura ambiente durante no más de 1 hora antes de recoger el suero. Los tubos de suero gel Z/1.1 se centrifugaron a 10000 x g durante 3 minutos y se recogió el suero. Se recolectaron muestras individuales de suero antes de la inoculación y se prepararon dos alícuotas de cada muestra. Se analizó una alícuota antes del inicio del estudio para confirmar que los hurones no tenían anticuerpos contra los virus de la gripe A y una alícuota del suero se almacenó a -65 °C.
P. Ensayo de inhibición de la hemaglutinación (IH): Las muestras de suero se trataron con enzima destructora de receptores (RDE) (Denka Seiken, Tokio, Japón) para eliminar los inhibidores de la hemaglutinación inespecífica. RDE se reconstituyó según las instrucciones del fabricante. El suero se diluyó 1:3 en RDE y se incubó de 18 a 20 horas en un baño de agua a 37 °C ± 2 °C. Después de la adición de un volumen igual de citrato de sodio al 2,5 % (v/v), las muestras se incubaron en un baño de agua a 56 ± 2 °C durante 30 ± 5 minutos. Se añadió NaCl al 0,85 % a cada muestra hasta una dilución de suero final de 1:10 después del tratamiento con RDE. Las muestras diluidas se diluyeron después en cuatro diluciones dobles (de 1:10 a 1:80) por duplicado en solución salina tamponada con fosfato (PBS) y después se incubaron con 4 unidades hemaglutinantes del virus de la gripe A A/Brisbane/10/2007 (H3N2). Después de la incubación, se añadieron 0,5 % de glóbulos rojos aviares a cada muestra y se incubaron durante 30 ± 5 minutos. A continuación, se puntuó la presencia o ausencia de hemaglutinación.
Q. Títulos de virus: La concentración de virus infeccioso en las muestras de inóculo de virus antes y después de la exposición se determinó mediante ensayo de DICT50 en células de riñón canino Madin-Darby (MDCK). En resumen, las muestras mantenidas a -65 °C se descongelaron y centrifugaron para eliminar los residuos celulares. El sobrenadante resultante se diluyó 10 veces por triplicado en placas de microtitulación de 96 pocillos en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) (Gibco, Carlsbad, CA, Estados Unidos) que contenía pencilina/estreptomicina, gentamicina al 0,1 %, NaCOa al 3 %, fracción V de BSA al 0,3 % (Sigma San Luis, MO), de solución de vitamina MEM al 1 % (Sigma) y L-glutamina al 1 % (Mediatech, Manassas, VA, Estados Unidos). Después de realizar diluciones en serie de 10 veces, se transfirieron 100 fl a los pocillos respectivos de una placa de 96 pocillos que contenía una monocapa de células MDCK. Las placas se incubaron a 37 °C ± 2 °C en 5 ± 2 % de CO2 a 70 % de humedad. Después de 48 horas, se observaron los pocillos para determinar el efecto citopatógeno (ECP). El sobrenadante de cada pocillo (50 |jl) se transfirió a una placa de 96 pocillos y se determinó y registró la actividad de hemaglutinación (HA). La actividad de HA del sobrenadante se evaluó mediante un ensayo de HA con concentrado de eritrocitos de pavo (tRBC) al 0,5 %. Los títulos de DICT50 se calcularon usando el método de Reed LJ y Muench H, "A simple method for estimating 50 % endpoints", Am. J. Hygiene 27: 493-497 (1938).
R. Análisis de datos: Se determinaron los pesos corporales y los aumentos (pérdidas) de peso corporal y los cambios de la temperatura corporal para cada animal individual expresados como media y desviaciones típicas de la media para cada grupo de prueba.
RESULTADOS
Después de la inoculación de hurones donantes con el virus M2KO(ATM) o el virus de la gripe A A/Brisbane/10/2007 (H3N2), los hurones donantes se introdujeron en cámaras de transmisión que contenían hurones de contacto sin exposición previa. Los hurones se supervisaron diariamente para detectar signos clínicos de infección, se recogieron lavados nasales para supervisar la excreción vírica y se recogió suero para medir los títulos de anticuerpos en suero. Todos los hurones sobrevivieron a la inoculación con el virus M2KO(ATM) y A/Brisbane/10/2007 (Tabla 21). No se observaron signos clínicos de enfermedad en hurones en el grupo M2KO(ATM). Dos de los tres hurones donantes inoculados con el virus A/Brisbane/10/2007 presentaron signos respiratorios (estornudos) los días 6 y 8. Los hurones con contacto directo en todas las cámaras presentaron estornudos el día 8. No se observaron estornudos en los hurones con contacto por aerosol. No se observó una reducción del nivel de actividad.
______________ Tabla 21: Signos clínicos en hurones donantes inoculados y hurones de contacto.______________
Signos clínicosb
Grupo Tratamiento N Título IH en Número total
suero3 de muertos Signos respiratorios (día Pérdida de Letargo observado de aparición) apetito (Rll)c M2KO
Donantes M2KO 3 <10 0/3 0/3 0/3 0 Contactos
directos M2KO 3 <10 0/3 0/3 0/3 0 Contactos
por aerosol M2KO 3 <10 0/3 0/3 0/3 0 (continuación)
Signos clínicosb
Grupo Tratamiento N Título IH en Número total
suero3 de muertos Signos respiratorios (día Pérdida de Letargo observado de aparición) apetito (Rll)c
Brisbane
Donantes Brisbane/10 3 <10 0/3 2/3 (6,8) 0/3 0
Contactos
directos Brisbane/10 3 <10 0/3 3/3 (8,8,8) 0/3 0
Contactos
por aerosol Brisbane/10 3 <10 0/3 0/3 0/3 0 aTítulos de anticuerpos de inhibición de la hemaglutinación (IH) contra virus homólogos en suero de hurón antes de la inoculación del virus.
bSe observaron signos clínicos durante 14 días después de la inoculación del virus. Excepto por el letargo, los hallazgos de los signos clínicos se proporcionan como n.° de hurones con signo/n.0 total. Los signos respiratorios fueron estornudos, día de inicio de cada hurón entre paréntesis.
determinado dos veces al día durante 14 días de observación según el sistema de puntuación y se calculó como la puntuación media por grupo de hurones por observación (día) durante el periodo de 14 días. El índice de inactividad relativa antes de la inoculación fue de 0.
Los cambios del peso y la temperatura corporales después de la inoculación del virus se muestran en la figura 26 y la figura 27. No se observó una pérdida de peso significativa después de la inoculación con el virus M2KO(ATM). Los contactos de aerosol promediaron una pérdida de peso del 1 % en el día; sin embargo, es poco probable que esto se deba a la exposición al virus. El aumento del peso corporal de los hurones en el virus M2Ko (a Tm ) fue del 9 % para los hurones donantes y del 10-11 % para los hurones de contacto durante los 14 días de observación (figura 26A). El aumento de peso corporal del A/Brisbane/10/2007 fue solo del 3 % para los hurones donantes y del 6-8 % para los hurones de contacto, lo que indica una infección vírica (figura 26B). En el grupo M2KO(ATM), la temperatura corporal se mantuvo en niveles normales con la excepción del día 3 después de la infección (figura 27A). Las temperaturas corporales fueron más bajas de lo normal para los hurones con contacto por aerosol. Esto se atribuyó a transpondedores de temperatura defectuosos o deficientes, las temperaturas se registraron dentro del intervalo normal durante el resto del estudio. Se observaron temperaturas corporales elevadas el día 2 en hurones donantes A/Brisbane/10/2007 y el día 7 para los contactos con aerosol (figura 27B). Las concentraciones de solución de dosificación de virus antes y después de la exposición fueron 10750 DICT50/ml y 10725 DICT50/ml, respectivamente, lo que indica una buena estabilidad del material de exposición a lo largo de la administración.
La figura 50 muestra títulos víricos en lavados nasales de hurones en un estudio de transmisión de virus. Los datos muestran que el virus M2KO(ATM) no se transmite (no se detecta virus), mientras que el virus de control Brisb/10 se transmite.
CONCLUSIÓN
Este ejemplo muestra que los hurones inoculados con el virus A/Brisbane/10/2007 presentaron signos clínicos de infección (estornudos, pérdida de peso corporal y una temperatura corporal elevada transitoria), mientras que los hurones inoculados con el virus M2KO(ATM) no mostraron signos clínicos de enfermedad. Por lo tanto, la inoculación de hurones donantes con el M2KO(ATM) no pareció causar una infección o transmitir el virus por contacto o por aerosol. Estos hallazgos muestran que el virus M2KO(ATM) de la presente tecnología es útil para las vacunas intranasales contra la gripe.
Ejemplo 13. El virus M2KO (ATM) induce respuestas inmunitarias tanto humorales como mucosas en ratones.
Este ejemplo demuestra que el virus M2KO(ATM) induce respuestas inmunitarias tanto humorales como mucosas en ratones. La inmunogenicidad de M2KO(ATM) se evaluó en ratones y se comparó con las respuestas inmunitarias generadas por otros modos de vacunación. Se realizó un estudio de inmunogenicidad que contenía los siguientes grupos como se describe en la tabla 22: 1. Virus M2KO(ATM), 2. Virus PR8 (10 ufp), representante de vacuna viva, 3. Virus PR8 inactivado (Charles River Laboratories, Wilmington, MA), 1 pg, intranasal (IN) 4. Virus PR8 inactivado, 1 pg, intramuscular (IM) o PBS solo.
T l 22: r v n n l i nm n ni i
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Para probar la inmunogenicidad del virus M2KO(ATM), los ratones se inocularon por vía intranasal con 1,2x104 ufp de M2KO(ATM), 10 ufp de PR8 de tipo silvestre, 1 pg de PR8 completo inactivado (Charles River Laboratories, Wilmington, MA) o PBS como control, junto con un grupo al que se administró por vía intramuscular 1 pg de PR8 completo inactivado. Tres semanas después de la inmunización, se recogieron lavados de suero y tráquea-pulmón de ratones y se midieron los niveles de inmunoglobulina G (IgG) e IgA anti-PR8 mediante un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA). En resumen, las placas de ELISA se recubrieron con PR8 inactivado completo, se bloquearon mediante albúmina de suero bovino (BSA) y se aplicaron muestras. Los anticuerpos IgG e IgA de ratón se detectaron mediante anticuerpos de cabra anti-IgG e IgA de ratón marcados con peroxidasa de rábano picante (KPL, Inc., Gaithersburg, MD) y sustrato SureBlue TMB (KPL, Inc.).
Como se esperaba, los ratones de los grupos inmunizados mostraron una elevación significativa de anticuerpos anti-PR8 en suero y lavado de tráquea-pulmón en comparación con el grupo solo con PBS (figura 28). Los niveles de IgG anti-PR8 en suero para el virus M2KO(ATM) son mayores que los de los grupos PR8 inactivados y similares a los del virus PR8 vivo. Resulta más importante que los anticuerpos IgA anti-PR8 estaban presentes solo en los ratones inmunizados con PR8 y M2KO(ATM) tanto en los sueros como en los lavados de tráquea-pulmón. Estos datos sugieren que el virus M2KO(ATM) induce una respuesta inmunitaria humoral y mucosa significativa en ratones.
Ejemplo 14 El virus M2KO(ATM) protege a los ratones de la exposición letal homosubtípica y heterosubtípica.
Este ejemplo demuestra que el virus M2KO(ATM) protege a los ratones de la exposición letal homosubtípica y heterosubtípica. La eficacia protectora del virus M2KO(ATM) se evaluó exponiendo los ratones inmunizados a dosis letales del PR8 de tipo silvestre (H1N1; exposición homosubtípica) o gripe adaptada a ratón A/Aichi/2/68 (Aichi; H3N2; exposición heterosubtípica) seis semanas después de la inmunización. Ninguno de los ratones inmunizados con M2KO(ATM) o 10 ufp de PR8 y posteriormente expuestos a PR8 de tipo silvestre mostró ningún síntoma clínico, incluyendo la pérdida de peso (figura 29A). Por el contrario, los ratones con PBS sin exposición previa murieron o fueron sacrificados debido a una pérdida de peso superior al 20% en el día 5. La replicación del virus en las vías respiratorias de los ratones expuestos se determinó el día 3 después de la exposición mediante ensayo DICT50 en células MDCK. Como se muestra en la figura 30A, no se detectó ningún virus (límite de detección 10275DICT50/órgano) en los pulmones de ratones inmunizados con M2KO(ATM) o PR8, lo que indica que M2KO(ATM) proporcionó una inmunidad estéril similar a la infección por PR8. Por el contrario, el virus de exposición se recuperó de los grupos PR8 y PBS inactivados.
Para la exposición heterosubtípica, los ratones se expusieron a Aichi (H3N2). Los ratones inmunizados con M2KO(ATM) y PR8 de tipo silvestre sobrevivieron a la exposición, mientras que los ratones que recibieron PR8 o PBS inactivados sucumbieron a la infección (figura 29). Los títulos de virus en las vías respiratorias de los ratones el día 3 después de la exposición no mostraron una reducción significativa en los ratones vacunados con M2KO(ATM) en comparación con los ratones de otros grupos (figura 30). Estos resultados sugieren que la protección cruzada observada contra la exposición a Aichi puede deberse en parte a respuestas inmunitarias mediadas por linfocitos T inducidas por la vacuna M2KO(ATM). Los anticuerpos de inhibición de la hemaglutinación (IH) contra Aichi no fueron detectables (menos de 1:40) en sueros después de la exposición de ratones expuestos, lo que sugiere que la protección no estaba mediada por anticuerpos neutralizantes.
El virus M2KO(ATM) estimula las respuestas inmunitarias tanto humorales como celulares y confiere inmunidad protectora a los animales contra la exposición letal homo y heterosubtípica como se resume en la tabla 23.
Tabla 23 Protección des ués de la ex osición a ri e homosubtí ica H1N1 heterosubtí ica H3N2)
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Ejemplo 15 Vacuna de M2KO(ATM) en comparación con Fluzone® y FluMist®
Este ejemplo demuestra la eficacia del virus M2KO(ATM) en comparación con el virus vivo atenuado (FluMist®), vacuna inactivada contra la gripe Fluzone®. Los ratones se inmunizaron con el virus M2KO(ATM), virus vivo atenuado adaptado al frío (FluMist®), vacuna inactivada contra la gripe Fluzone® o se inmunizaron de forma simulada mediante PBS. El virus M2KO(ATM)-H3 se construyó insertando las secuencias codificantes de HA y NA de gripe A/Uruguay/716/2007 (H3N2) similar a A/Brisbane/10/2007 en la cadena principal de M2KO(ATM) (SEQ ID NO: 1). FluMist®-H3, genes internos de la cadena principal de A/AA/6/60 adaptada al frío, que contenía los genes HA y NA de gripe A/Uruguay/716/2007 (H3N2) similar a A/Brisbane/10/2007 se purificó en placa a partir de la formulación de vacuna trivalente 2009/2010. Se usó formulación de Fluzone® 2009/2010 directamente como formulación trivalente.
Los sueros se obtuvieron los días 7, 14, 21 después de la inmunización para comparar la cinética de la respuesta de anticuerpos mediante ELISA (figura 31). El virus M2KO(ATM)-H3, un virus deficiente en replicación, desarrolló anticuerpos antes que FluMist®-H3, una vacuna de virus vivo de la gripe que experimenta una replicación de múltiples ciclos de manera atenuada. La vacuna inactivada Fluzone® tuvo los títulos de anticuerpos mayores en el suero, ya que es una presentación concentrada de antígeno.
La presencia de anticuerpos mucosos anti-HA en sueros, lavado pulmonar y cornetes nasales se evaluó mediante ELISA. M2KO(ATM)-H3 y FluMist®, las dos vacunas vivas contra la gripe, tenían mayor IgA en las vías respiratorias que la vacuna inactivada Fluzone®. (Figura 32)
Ejemplo 16: Comparación de la protección y la inmunogenicidad inducidas por virus vivos.
Se anestesiaron ratonas BALB/c de seis semanas de edad con isoflurano, se infectaron por vía intranasal los días 0 y 28 con 106 DICT50/50 pl de M2KO(ATM)-H3 (descrito anteriormente), FluMist® (2009-2010) (H3N2) IVR-147 (PR8xBrisbane/10/2007). IVR-147 es la versión de tipo silvestre del virus M2KO(ATM); es decir, contiene una proteína M2 funcional. Los ratones de control con infección simulada recibieron 50 pl de PBS en lugar de virus. Se recogió suero semanalmente de todos los ratones y se analizó la presencia de anticuerpos anti-HA mediante ELISA. Como se muestra en la figura 33, el virus M2KO(ATM) y el IVR-147 generaron niveles de anticuerpos mayores con cinética rápida en comparación con FluMist®.
Se supervisaron los pesos corporales de los animales durante 14 días después de la infección. Los ratones vacunados no perdieron peso. El día 21 después del refuerzo, se sacrificaron 3 ratones por grupo y se recogieron sus lavados de tráquea-pulmón, lavados nasales y sueros para las determinaciones de títulos de anticuerpos (figura 34). M2KO(ATM) indujo anticuerpos tanto humorales como mucosos a niveles similares a FluMist® e IVR-147 en sueros y las vías respiratorias.
Los ratones se expusieron por vía intranasal a 40 DLM50 del virus A/Aichi/2/68 seis semanas después del refuerzo. Los ratones se observaron para determinar la pérdida de peso corporal y la supervivencia durante 14 días (figura 35).
M2KO(ATM) protegió a los ratones de la exposición letal a Aichi, como lo indica una menor pérdida de peso corporal (panel A) y una supervivencia del 100 % (panel B) en contraste con FluMist®. El día 3 después de la exposición, se sacrificaron 3 ratones por grupo y se recogieron sus pulmones y cornetes nasales para las determinaciones de títulos de virus (tabla 24). M2KO(ATM) controló el virus de exposición mejor que FluMist® como se muestra en la tabla 24.
Tabla 24. Títulos de virus de ex osición en las vías res iratorias
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Ejemplo 17: Generación de una vacuna M2KO(ATM) contra el virus de la gripe aviar H5n1 muy patógeno
Sumario: M2KO (ATM) es un virus de la gripe que carece de expresión de una proteína M2 funcional. La proteína M2 es crucial para el inicio de la infección vírica de la gripe y para la incorporación eficaz del ARN vírico en los viriones descendientes. M2KO(ATM) puede entrar en las células y expresar proteínas víricas, pero no puede producir virus descendientes infecciosos debido a la supresión del gen M2. M2KO(ATM) se produce en células permisivas que expresan la proteína M2 pero no en células de tipo silvestre no permisivas. M2KO(ATM) induce inmunidad tanto mucosa como humoral en ratones y protege de la exposición letal tanto homo como heterosubtípica.
El virus M2KO(ATM) H5N1 contiene los genes HA (avirulento) y NA de A/Vietnam/1203/2004 en la cadena principal de M2KO(ATM). Por "cadena principal de M2KO(ATM)" se entiende la secuencia de PR8 que comprende la mutación M2KO(ATM) (SEQ ID NO: 1). Las secuencias HA (avirulentas) (SEQ ID NO: 24) y NA (SEQ ID NO: 25) de A/Vietnam/1203/2004 usadas se muestran a continuación.
>ORF de HA VN1203 avirulenta PR8 no codificante
AG CAAAAG CAGG GG AAAAT AAAAACAACCAAAAT G G AG AAAAT AGTG CTT CTTTTTGCAAT AGT CAGT CTT GTT AAAAGT
GATCAGATTTGCATTGGTTACCATGCAAACAACTCGACAGAGCAGGTTGACACAATAATGGAAAAGAACGTTACTGTTAC
ACATGCCCAAGACATACTGGAAAAGAAACACAACGGGAAGCTCTGCGATCTAGATGGAGTGAAGCCTCTAATTTTGAGAG
ATTGTAGCGTAGCTGGATGGCTCCTCGGAAACCCAATGTGTGACGAATTCATCAATGTGCCGGAATGGTCTTACATAGTG
GAGAAGGCCAATCCAGTCAATGACCTCTGTTACCCAGGGGATTTCAATGACTATGAAGAATTGAAACACCTATTGAGCAG
AATAAACCATTTTGAGAAAATTCAGATCATCCCCAAAAGTTCTTGGTCCAGTCATGAAGCCTCATTAGGGGTGAGCTCAG
CAT GT CCAT ACCAGGG AAAGT CCT CCTTTTTCAG AAAT GTGGT ATGGCTT AT CAAAAAG AACAGT ACAT ACCCAACAAT A
AAGAGGAGCTACAATAATACCAACCAAGAAGATCTTTTGGTACTGTGGGGGATTCACCATCCTAATGATGCGGCAGAGCA
G ACAAAGCT CT AT CAAAACCCAACCACCT AT ATTT CCGTT G G G ACAT CAACACT AAACCAG AG ATTGGT ACCAAG AAT AG
CTACTAGATCCAAAGTAAACGGGCAAAGTGGAAGGATGGAGTTCTTCTGGACAATTTTAAAGCCGAATGATGCAATCAAC
TTCGAGAGTAATGGAAATTTCATTGCTCCAGAATATGCATACAAAATTGTCAAGAAAGGGGACTCAACAATTATGAAAAG
TGAATTGGAATATGGTAACTGCAACACCAAGTGTCAAACTCCAATGGGGGCGATAAACTCTAGCATGCCATTCCACAATA
TACACCCTCTCACCATTGGGGAATGCCCCAAATATGTGAAATCAAACAGATTAGTCCTTGCGACTGGGCTCAGAAATAGC
CCTCAAAGAGAGACTAGAGGATTATTTGGAGCTATAGCAGGTTTTATAGAGGGAGGATGGCAGGGAATGGTAGATGGTTG
GTATGGGTACCACCATAGCAATGAGCAGGGGAGTGGGTACGCTGCAGACAAAGAATCCACTCAAAAGGCAATAGATGGAG
TCACCAATAAGGTCAACTCGATCATTGACAAAATGAACACTCAGTTTGAGGCCGTTGGAAGGGAATTTAACAACTTAGAA
AGGAGAATAGAGAATTTAAACAAGAAGATGGAAGACGGGTTCCTAGATGTCTGGACTTATAATGCTGAACTTCTGGTTCT
CATGG AAAATG AG AG AACT CT AG ACTTT CAT GACT CAAATGT CAAG AACCTTT ACGACAAGGT CCGACT ACAGCTT AGGG
ATAATGCAAAGGAGCTGGGTAACGGTTGTTTCGAGTTCTATCATAAATGTGATAATGAATGTATGGAAAGTGTAAGAAAT
GGAACGTATGACTACCCGCAGTATTCAGAAGAAGCGAGACTAAAAAGAGAGGAAATAAGTGGAGTAAAATTGGAATCAAT
AGGAATTTACCAAATACTGTCAATTTATTCTACAGTGGCGAGTTCCCTAGCACTGGCAATCATGGTAGCTGGTCTATCCT
TATGG ATGTGCT CCAATGGGT CGTTACAATGCAG AATTTGCATTT AAGATTAGAATTT CAG AG AT AT GAGG AAAAACACC
CTTGTTTCTACT
>ORF de NA VN1203 PR8 no codificante
AGCAAAAGCAGGGGTTTAAAATGAATCCAAATCAGAAGATAATAACCATCGGATCAATCTGTATGGTAACTGGAATAGTT
AG CTT AAT GTT ACAAATTGG G AACAT G AT CT CAAT ATGG GT CAGT CATT CAATT CACACAG GG AAT CAACACCAAT CTG A
ACCAATCAG CAAT ACT AATTTT CTT ACT G AG AAAG CTGT G GCTT CAGT AAAATT AG CG G G CAATT CAT CT CTTT G CCCCA
TTAACGGATGGGCTGTATACAGTAAGGACAACAGTATAAGGATCGGTTCCAAGGGGGATGTGTTTGTTATAAGAGAGCCG
TTCATCTCATGCTCCCACTTGGAATGCAGAACTTTCTTTTTGACTCAGGGAGCCTTGCTGAATGACAAGCACTCCAATGG
GACTGTCAAAGACAGAAGCCCTCACAGAACATTAATGAGTTGTCCTGTGGGTGAGGCTCCCTCCCCATATAACTCAAGGT
TTGAGTCTGTTGCTTGGTCAGCAAGTGCTTGCCATGATGGCACCAGTTGGTTGACGATTGGAATTTCTGGCCCAGACAAT
GGGGCTGTGGCTGTATTGAAATACAATGGCATAATAACAGACACTATCAAGAGTTGGAGGAACAACATACTGAGAACTCA
AGAGTCTGAATGTGCATGTGTAAATGGCTCTTGCTTTACTGTAATGACTGACGGACCAAGTAATGGTCAGGCATCACATA
AG AT CTT C AAA AT G G AA AA AG G G AAAGT G GTT A AAT C AGTCG AATT G G ATG CTCCT AATT ATC ACT ATG AG G A ATG CTCC
TGTTATCCTAATGCCGGAGAAATCACATGTGTGTGCAGGGATAATTGGCATGGCTCAAATCGGCCATGGGTATCTTTCAA
TCAAAATTTGGAGTATCAAATAGGATATATATGCAGTGGAGTTTTCGGAGACAATCCACGCCCCAATGATGGAACAGGTA
GTTGTGGTCCGGTGTCCTCTAACGGGGCATATGGGGTAAAAGGGTTTTCATTTAAATACGGCAATGGTGTCTGGATCGGG
AGAACCAAAAGCACTAATTCCAGGAGCGGCTTTGAAATGATTTGGGATCCAAATGGGTGGACTGAAACGGACAGTAGCTT
TTCAGTGAAACAAGATATCGTAGCAATAACTGATTGGTCAGGATATAGCGGGAGTTTTGTCCAGCATCCAGAACTGACAG
GACTAGATTGCATAAGACCTTGTTTCTGGGTTGAGTTGATCAGAGGGCGGCCCAAAGAGAGCACAATTTGGACTAGTGGG
AGCAGCATATCTTTTTGTGGTGTAAATAGTGACACTGTGGGTTGGTCTTGGCCAGACGGTGCCGAGTTGCCATTCACCAT
T G ACAAGT AGTCTGTT CAAAAAACT CCTT GTTT CT ACT
Generación de H5N1 M2KO(ATM): La HA avirulenta y la NA de A/Vietnam/1203/2004 (H5N1) fueron sintetizados químicamente por síntesis génica GeneArt® en función de las secuencias de CDC para cada gen (CDC ID: 2004706280, números de referencia: EF541467 y EF541403). Las secuencias de las construcciones se confirmaron y subclonaron en vectores adecuados para permitir la generación de virus de siembra usando protocolos convencionales.
El virus M2KO(ATM) VN1203avHA,NA (H5N1 M2KO(ATM)) se amplificó en células M2CK (células MDCK que expresan de forma estable la proteína M2), el sobrenadante se clarificó de residuos celulares y se concentró 100 veces mediante Centricon Plus-70 (Millipore). Este virus se usó como inmunógeno en el estudio con ratones.
Diseño de estudio de ratón: Se inocularon ratones (7-8 semanas de edad, hembras BALB/c) por vía intranasal con H5N1 M2KO(ATM) (106 DICTscj/ratón), M2KO(ATM) CA07HA, NA (106 DICTscj/ratón) o proteína VN1203 (1,5 pg) administrada por vía intramuscular. El peso corporal y los síntomas clínicos se observaron durante 14 días después de la inoculación. Los sueros se recogieron los días 7, 14, 21 después de la inoculación. Los ratones se reforzaron el día 28 con un nuevo grupo solo de sensibilización iniciado al mismo tiempo.
Grupos de inmunización de refuerzo y grupos "solo de sensibilización": El día 28, los ratones previamente inoculados con H5N1 M2KO(ATM) se reforzaron con una segunda inmunización de 106 ufp/ratón. Al mismo tiempo, se administró la primera dosis a los grupos "solo de sensibilización". Se siguió la pérdida de peso para todos los grupos después de la inoculación del día 28. Los ratones que recibieron una dosis de refuerzo de la vacuna M2KO(ATM) perdieron como máximo el 5 % de su peso corporal. El grupo "solo de sensibilización" perdió hasta el 10 % de su peso corporal.
Tabla 25. Gru os de vacunas en el estudio de ratones
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continuación
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H5N1 M2KO(ATM) induce títulos de anticuerpos IgG contra HA: Se obtuvieron sueros de ratones los días 7, 14, 21 después de la inoculación y se analizaron mediante ELISA para determinar los anticuerpos contra la hemaglutinina. M2KO(ATM) generó títulos al menos 100 veces mayores que la proteína H5 HA (figura 36). Los ratones se reforzaron el día 28 y se obtuvieron sueros una semana más tarde (día 35). Los títulos de M2KO(ATM) se reforzaron 130 veces, mientras que la proteína HA solo los reforzaron 13 veces. La muestra de sangre de la primera semana el día 35 para los grupos solo de sensibilización de M2KO(ATM) demostró títulos altos de IgG como la primera semana de los grupos de sensibilización-refuerzo.
Los ratones se expusieron a una dosis letal del virus Vietnam/1203/2004 (20 DLM50). Todos los ratones vacunados con H5N1 M2KO(ATM) (solo sensibilización y sensibilización/refuerzo) sobrevivieron (figuras 54 y 55). La alta tasa de supervivencia de los ratones expuestos 5 meses después de la inmunización sugiere que la vacuna H5N1 M2KO(ATM) prepara las respuestas de memoria. Los ratones expuestos 4 semanas después de la inmunización habían recibido solo una dosis de vacuna, lo que indica que la vacuna M2KO(ATM) estimula una fuerte respuesta inmunitaria. Los ratones inmunizados con H1N1pdm M2Ko (ATM) también sobrevivieron a la exposición a H5N1 después de 5 meses, lo que indica que M2KO(ATM) prepara respuestas inmunitarias de reactividad cruzada que proporcionan protección contra la exposición heteróloga.
Ejemplo 18: H1N1pdm: FluMist® CA07 frente a M2KO(ATM) CA07
Los clones de ADNc de HA y NA de A/California/07/2009 (CA07) (H1N1pdm) se generaron mediante protocolos convencionales de biología molecular. Las secuencias de las construcciones se confirmaron y subclonaron en vectores adecuados para permitir la generación del virus M2KO(ATM) de siembra y del virus M2WTCA07/PR8 usando protocolos convencionales. FluMist® CA07 (H1N1pdm) se purificó en placa en células MDCK de la vacuna FluMist® 2011-2012, lote n.° B11K1802. Las secuencias HA (SEQ ID NO: 26) y NA (SEQ ID NO: 27) de A/California/07/2009 (CA07) usadas se muestran a continuación.
HA A/California/07/2009 (H1N1) en M2KOTMsup
AGCAAAAGCAGGGGAAAACAAAAGCAACAAAAATGAAGGCAATACTAGTAGTTCTGCTATATACATTTGCAACCGCAAAT
GCAGACACATTATGTATAGGTTATCATGCGAACAATTCAACAGACACTGTAGACACAGTACTAGAAAAGAATGTAACAGT
AACACACTCTGTTAACCTTCTAGAAGACAAGCATAACGGGAAACTATGCAAACTAAGAGGGGTAGCCCCATTGCATTTGG
GTAAATGTAACATTGCTGGCTGGATCCTGGGAAATCCAGAGTGTGAATCACTCTCCACAGCAAGCTCATGGTCCTACATT
GTGGAAACACCTAGTTCAGACAATGGAACGTGTTACCCAGGAGATTTCATCGATTATGAGGAGCTAAGAGAGCAATTGAG
CTCAGTGTCATCATTTGAAAGGTTTGAGATATTCCCCAAGACAAGTTCATGGCCCAATCATGACTCGAACAAAGGTGTAA
CGGCAGCATGTCCTCATGCTGGAGCAAAAAGCTTCTACAAAAATTTAATATGGCTAGTTAAAAAAGGAAATTCATACCCA
AAGCTCAGCAAATCCTACATTAATGATAAAGGGAAAGAAGTCCTCGTGCTATGGGGCATTCACCATCCATCTACTAGTGC
TGACCAACAAAGTCTCTATCAGAATGCAGATGCATATGTTTTTGTGGGGTCATCAAGATACAGCAAGAMGTTCAAGCCGG
AAATAGCAATAAGACCCAAAGTGAGGGATCRAGAAGGGAGAATGAACTATTACTGGACACTAGTAGAGCCGGGAGACAAA
ATAACATTCGAAGCAACTGGAAATCTAGTGGTACCGAGATATGCATTCGCAATGGAAAGAAATGCTGGATCTGGTATTAT
CATTTCAGATACACCAGTCCACGATTGCAATACAACTTGTCAAACACCCAAGGGTGCTATAAACACCAGCCTCCCATTTC
AGAATATACATCCGATCACAATTGGAAAATGTCCAAAATATGTAAAAAGCACAAAATTGAGACTGGCCACAGGATTGAGG
AATATCCCGTCTATTCAATCTAGAGGCCTATTTGGGGCCATTGCCGGTTTCATTGAAGGGGGGTGGACAGGGATGGTAGA
TGGATGGTACGGTTATCACCATCAAAATGAGCAGGGGTCAGGATATGCAGCCGACCTGAAGAGCACACAGAATGCCATTG
ACGAGATTACTAACAAAGTAAATTCTGTTATTGAAAAGATGAATACACAGTTCACAGCAGTAGGTAAAGAGTTCAACCAC
CTGGAAAAAAGAATAGAGAATTTAAATAAAAAAGTTGATGATGGTTTCCTGGACATTTGGACTTACAATGCCGAACTGTT
GGTTCTATTGGAAAATGAAAGAACTTTGGACTACCACGATTCAAATGTGAAGAACTTATATGAAAAGGTAAGAAGCCAGC
TAAAAAACAATGCCAAGGAAATTGGAAACGGCTGCTTTGAATTTTACCACAAATGCGATAACACGTGCATGGAAAGTGTC
AAAAATGGGACTTATGACTACCCAAAATACTCAGAGGAAGCAAAATTAAACAGAGAAGAAATAGATGGGGTAAAGCTGGA
ATCAACAAGGATTTACCAGATTTTGGCGATCTATTCAACTGTCGCCAGTTCATTGGTACTGGTAGTCTCCCTGGGGGCAA
TCAGTTTCTGGATGTGCTCTAATGGGTCTCTACAGTGTAGAATATGTATTTAACATTAGGATTTCAGAAGCATGAGAAAA
AA ACACCCTTGTTTCTACT
> NA A/California/07/2009 (H1N1) en M2KOTMsup
AGCAAAAGCAGGAGTTTAAAATGAATCCAAACCAAAAGATAATAACCATTGGTTCGGTCTGTATGACAATTGGAATGGCT
AACTTAATATTACAAATTGGAAACATAATCTCAATATGGATTAGCCACTCAATTCAACTTGGGAATCAAAATCAGATTGA
AACATGCAATCAAAGCGTCATTACTTATGAAAACAACACTTGGGTAAATCAGACATATGTTAACATCAGCAACACCAACT
TTGCTGCTGGACAGTCAGTGGTTTCCGTGAAATTAGCGGGCAATTCCTCTCTCTGCCCTGTTAGTGGATGGGCTATATAC
AGTAAAGACAACAGTGTAAGAATCGGTTCCAAGGGGGATGTGTTTGTCATAAGGGAACCATTCATATCATGCTCCCCCTT
GGAATGCAGAACCTTCTTCTTGACTCAAGGGGCCTTGCTAAATGACAAACATTCCAATGGAACCATTAAAGACAGGAGCC
CATATCGAACCCTAATGAGCTGTCCTATTGGTGAAGTTCCCTCTCCATACAACTCAAGATTTGAGTCAGTCGCTTGGTCA
GCAAGTGCTTGTCATGATGGCATCAATTGGCTAACAATTGGAATTTCTGGCCCAGACAATGGGGCAGTGGCTGTGTTAAA
GTACAACGGCATAATAACAGACACTATCAAGAGTTGGAGAAACAATATATTGAGAACACAAGAGTCTGAATGTGCATGTG
TAAATGGTTCTTGCTTTACTGTAATGACCGATGGACCAAGTAATGGACAGGCCTCATACAAGATCTTCAGAATAGAAAAG
GGAAAGATAGTCAAATCAGTCGAAATGAATGCCCCTAATTATCACTATGAGGAATGCTCCTGTTATCCTGATTCTAGTGA
AATCACATGTGTGTGCAGGGATAACTGGCATGGCTCGAATCGACCGTGGGTGTCTTTCAACCAGAATCTGGAATATCAGA
TAGGATACATATGCAGTGGGATTTTCGGAGACAATCCACGCCCTAATGATAAGACAGGCAGTTGTGGTCCAGTATCGTCT
AATGGAGCAAATGGAGTAAAAGGGTTTTCATTCAAATACGGCAATGGTGTTTGGATAGGGAGAACTAAAAGCATTAGTTC
AAGAAACGGTTTTGAGATGATTTGGGATCCGAACGGATGGACTGGGACAGACAATAACTTCTCAATAAAGCAAGATATCG
TAGGAATAAATGAGTGGTCAGGATATAGCGGGAGTTTTGTTCAGCATCCAGAACTAACAGGGCTGGATTGTATAAGACCT
TGCTTCTGGGTTGAACTAATCAGAGGGCGACCCAAAGAGAACACAATCTGGACTAGCGGGAGCAGCATATCCTTTTGTGG
TGTAAACAGTGACACTGTGGGTTGGTCTTGGCCAGACGGTGCTGAGTTGCCATTTACCATTGACAAGTAATTTGTTCAAA
AA ACT CCTT GTTT CT ACT
Se inocularon ratones (7-8 semanas de edad, hembras BALB/c) por vía intranasal con M2KO(ATM) CA07 (106 DICTso/ratón), M2WT CA07 (106 DICT5o/ratón), FluMist® CA07 (106 DICT50/ratón) u OPTI-MEM™ como control sin exposición previa. El peso corporal y los síntomas clínicos se observaron durante 14 días después de la inoculación. La figura 37 muestra que los ratones vacunados con M2KO(ATM) y FluMist® no perdieron peso mientras que el virus que contiene el M2 TS pierde peso y sucumbe a la infección. Estos resultados demuestran que la supresión del gen M2 atenúa el virus y que se atenúa M2KO(ATM).
Figura 38 Títulos víricos de M2KO(ATM), FluMist® y M2 de tipo silvestre de pulmones y terminaciones nasales. Los pulmones y cornetes nasales se recogieron el día 3 después de la vacunación para la titulación de virus en las células.
No se detectó virus en los pulmones ni en los cornetes nasales en los ratones inmunizados con M2KO(ATM). Por el contrario, FluMist® sí tuvo replicación del virus tanto en el pulmón como en los cornetes nasales, aunque a niveles menores que el virus de tipo silvestre.
Figura 39 Los títulos de M2KO(ATM) y FluMist® en sueros recogidos 7, 14 y 21 días después de la inoculación y los títulos de IgG anti-HA se determinaron mediante ELISA. M2KO(ATM) indujo respuestas mayores que se detectaron antes que las respuestas de FluMist®. El día 21, ambos virus alcanzaron niveles máximos de anticuerpos.
La figura 40 muestra el porcentaje de supervivencia de los ratones expuestos 12 semanas después de la inmunización con 40 DLM50 de virus heterólogo, gripe adaptada a ratones A/Aichi/2/1968 (H3N2). Se observaron cambios de peso corporal y síntomas clínicos durante 14 días después de la exposición. Todos los ratones inmunizados con M2KO(ATM) (H1N1pdm HA, NA) estaban protegidos contra la exposición a Aichi (H3N2) mientras que solo el 80 % de los FluMist® (H1N1pdm HA, NA) estaban protegidos. Los ratones FluMist® supervivientes perdieron cerca del 20 % de su peso corporal, mientras que los ratones M2KO(ATM) perdieron ~10 % de su peso corporal.
La tabla 26 muestra los títulos de virus en los pulmones y cornetes nasales que se recogieron el día 3 después de la exposición. M2KO(ATM) y FluMist® controlaron la replicación del virus de exposición en los pulmones y cornetes nasales a niveles similares, mientras que los ratones sin exposición previa presentaron títulos de virus que fueron un log mayores tanto en el pulmón como en los cornetes nasales.
Tinción intracelular de células en lavado broncoalveolar (BAL). Se recogió BAL 3 días después de la exposición y se tiñó con marcadores de superficie para inmunotinción mediante citometría de flujo para detectar poblaciones celulares CD8+CD4+, CD8+CD4-, CD8-CD4+, CD8-CD4-. Las poblaciones celulares tanto CD4+ como CD8+ fueron mayores en los ratones vacunados que en los ratones sin exposición previa, lo que indica que M2KO(ATM) preparó una respuesta celular similar a FluMist®. Los ratones vacunados con M2KO(ATM) tenían una mayor población de células CD8+CD4- que con FluMist® (49 % frente a 40 %) (figura 41).
T l 2 . Tí l vir n l ví r ir ri r n
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Ejemplo 19 Expresión de ARNm de M2KO(ATM) con respecto a FluMist® y virus de tipo silvestre
El virus M2KO(ATM) se puede producir en células que proporcionan proteína M2 de manera estable en trans lo que da lugar a un virus que tiene proteína M2 funcional en la membrana vírica pero no codifica M2 en su genoma. Por lo tanto, los inventores plantearon la hipótesis de que el virus M2KO(ATM) se comporta de manera similar al virus de tipo silvestre en la infección inicial y el primer ciclo de replicación en células normales. Los inventores sugieren que los niveles de ARNm de los antígenos víricos son similares a los niveles de tipo silvestre en las primeras etapas de la infección y estimulan una potente respuesta inmunitaria antes que las vacunas víricas replicantes atenuadas.
Se infectaron células de carcinoma de pulmón humano (A549) con una multiplicidad de infección de 0,5 con virus M2KO(ATM), FluMist® y de tipo silvestre. El virus no adsorbido se eliminó lavando cinco veces con PBS. Después de la adición de medios de cultivo de virus, las células infectadas se colocaron en la incubadora de CO2 a 35 °C. No se añadió tripsina al medio de cultivo para garantizar la replicación de ciclo único para todos los virus. Se recogieron monocapas de células y se extrajo el ARN a las 4, 9 y 22 horas después de la infección.
Se usó ARN total (100 ng) de células A549 de control e infectadas para el análisis cuantitativo de RT-PCR. El ADNc se sintetizó con cebadores oligo-dT y transcriptasa inversa Superscript II (Invitrogen) y se cuantificó mediante análisis de PCR cuantitativa en tiempo real usando cebadores específicos de genes para un gen temprano de gripe, M1, y un gen tardío de gripe, HA y gen de citocina IP-10. Las reacciones se realizaron usando el reactivo SYBR Green (Invitrogen, Carlsbad) según las instrucciones del fabricante. La eficiencia de la reacción se calculó usando diluciones en serie de 10 veces del gen constitutivo de y-actina y genes de muestra. Las reacciones se llevaron a cabo en un sistema de PCR en tiempo real ABI 7300 (Applied Biosystems, Foster City, CA, Estados Unidos) y el perfil térmico usado fue Etapa 1:50 °C durante 30 min; Etapa 2: 95 °C durante 15 min; Etapa 3: 94 °C durante 15s, 55 °C durante 30 s; y 72 °C durante 30 s, repetido durante 30 ciclos. Todas las cuantificaciones (valores de ciclo umbral [CT]) se normalizaron con respecto a la del gen constitutivo para generar ACT y la diferencia entre el valor de ACT de la muestra y el de la referencia (muestra de tipo silvestre) se calculó como -AACT. El nivel relativo de expresión de ARNm se expresó como 2-AACT.
La expresión de ARNm de HA del virus M2KO(ATM) fue similar a la del virus M2 de tipo silvestre para H3 (tabla 27), PR8 (tabla 28) y H1N1pdm (figura 42) a las 4 horas después de la infección. FluMist® adaptado al frío fue menor que el tipo silvestre y M2KO(ATM) en los primeros puntos temporales debido a una cinética de replicación más lenta. Cuando se probó la expresión de ARNm de M1, un gen de punto temporal temprano, se observaron resultados similares (tabla 27, figura 42). Estos resultados sugieren que M2KO(ATM) genera niveles similares de ARNm en el ciclo de infección temprano para producir antígenos víricos de novo que crean una "señal de peligro" similar al virus de tipo silvestre e inducen una potente respuesta inmunitaria.
T l 27. Ex r i n r l iv ARNm n H HA.
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Tabla 28. Ex resión relativa de ARNm de los enes HA M1 de PR8.
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Ejemplo 20: Generación de células de producción M2 Vero
El gen M2 del virus PR8 se clonó en el vector de expresión pCMV-SC (Stratagene, La Jolla, CA) mediante técnicas moleculares convencionales para generar pCMV-PR8-M2. El plásmido se digirió con EcoRI para confirmar la presencia del gen M2 de 300 pb y el vector de 4,5 Kb como se muestra en la figura 43. La secuencia del plásmido que contiene el inserto del gen M2 se confirmó como se muestra en la figura 44.
Generación de células M2 Vero: El plásmido pCMV-PR8-M2 descrito anteriormente y que contiene un gen resistente a neomicina, se transfectó en células Vero (ATCC CCL-81) usando el reactivo de transfección Trans IT-LT1 (Mirus) según las instrucciones del fabricante. En resumen, el día antes de la transfección, las células Vero se sembraron en placas a 5x105 células/placa de 100 mm. El día 1, se mezclaron 10pg de ADN plasmídico con 20 pg de Trans IT-LT1 en 0,3 ml de OptiMEM (Invitrogen) y se incubaron con estas células a 37 °C en CO2 al 5 % durante una noche. El día 2, la mezcla de transfección se reemplazó con un medio completo que es medio de Eagle modificado (MEM) complementado con suero de ternero neonato al 5 %. El medio también contenía 1 mg/ml de geneticina (Invitrogen), un antibiótico de amplio espectro que se usa para seleccionar células de mamíferos que expresan la proteína neomicina. Las células resistentes (células Vero que expresan de manera estable el gen M2) comenzaron a crecer en el medio de selección, el medio se reemplazó con medio de selección nuevo y los clones resistentes a geneticina se aislaron mediante dilución limitada en placas TC-96. La expresión superficial de la proteína M2 se demostró mediante inmunotinción usando un anticuerpo monoclonal específico de M2, 14C2 (Santa Cruz Biotechnology).

Claims (11)

REIVINDICACIONES
1. Un virus de la gripe A recombinante que comprende un gen M mutante, en donde el gen M mutante comprende dos codones de terminación en una posición correspondiente a los nucleótidos 786-791 de la SEQ ID NO: 28 y una supresión de los nucleótidos correspondientes a los nucleótidos 792-842 de la SEQ ID NO: 28, en donde la secuencia de los dos codones de terminación en nucleótidos correspondientes a los nucleótidos 786-791 de la SEQ ID NO: 28 es TAATAG.
2. Un virus de la gripe A recombinante que comprende un gen M mutante, en donde el gen M mutante comprende dos codones de terminación en una posición correspondiente a los nucleótidos 786-791 de la SEQ ID NO: 28 y una sustitución de G a C en una posición correspondiente al nucleótido 52 de la SEQ ID NO: 28, en donde la secuencia de los dos codones de terminación en nucleótidos correspondientes a los nucleótidos 786-791 de la SEQ ID NO: 28 es TAATAG.
3. Un virus de la gripe A recombinante que comprende un gen M mutante, en donde el gen M mutante comprende dos codones de terminación en una posición correspondiente a los nucleótidos 786-791 de la SEQ ID NO: 28 y una supresión de los nucleótidos correspondientes a los nucleótidos 792-842 de la SEQ ID NO: 28, y una sustitución de G a C en una posición correspondiente al nucleótido 52 de la SEQ ID NO: 28, en donde la secuencia de los dos codones de terminación en nucleótidos correspondientes a los nucleótidos 786-791 de la SEQ ID NO: 28 es TAATAG.
4. El virus de la gripe recombinante de cualquier reivindicación anterior, en donde la mutación del gen M da lugar a que el virus no exprese la proteína M2, o causa que el virus exprese una proteína M2 truncada que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4.
5. El virus de la gripe recombinante de cualquier reivindicación anterior, en donde el gen M mutante no revierte a una secuencia de tipo silvestre o no silvestre que codifica una proteína M2 funcional durante al menos 10 pases en un sistema de célula hospedadora in vitro, en donde la célula hospedadora se modifica para producir una versión de tipo silvestre del gen mutante, proporcionando de este modo el producto génico al virus en trans.
6. El virus recombinante de cualquier reivindicación anterior, en donde el virus no es patógeno en un mamífero infectado con el virus.
7. El virus recombinante de la reivindicación 5, en donde el sistema celular in vitro comprende células de ovario de hámster chino o células Vero.
8. Una composición que comprende el virus de la gripe A recombinante de cualquier reivindicación anterior.
9. La composición de la reivindicación 8, en donde la mutación del gen M da lugar a que el virus no exprese la proteína M2, o causa que el virus exprese una proteína M2 truncada que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4.
10. La composición de la reivindicación 8, en donde la composición no es patógena para un mamífero al que se le administra la composición.1
11. La composición de la reivindicación 8, que comprende adicionalmente un adyuvante.
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Families Citing this family (28)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9474798B2 (en) 2007-06-18 2016-10-25 Wisconsin Alumni Research Foundation Influenza M2 protein mutant viruses as live influenza attenuated vaccines
US9109013B2 (en) 2009-10-26 2015-08-18 Wisconsin Alumni Research Foundation High titer recombinant influenza viruses with enhanced replication in vero cells
US10130697B2 (en) 2010-03-23 2018-11-20 Wisconsin Alumni Research Foundation (Warf) Vaccines comprising mutant attenuated influenza viruses
CN103402516B (zh) 2010-06-17 2018-01-30 富津世生物技术有限公司 用作抗病毒药物的化合物、组合物及使用方法
EP3447131B1 (en) 2011-06-24 2021-08-18 Flugen, Inc. Influenza a virus mutants
CN104056276B (zh) * 2013-03-20 2017-05-10 上海生物制品研究所有限责任公司 一种流感病毒减毒活疫苗及其制备方法
JP2016524915A (ja) 2013-07-15 2016-08-22 ウィスコンシン アルムニ リサーチ ファンデイション Ｍｄｃｋ、ベロ細胞又は卵内で増強された複製を有する高力価の組換えインフルエンザウイルス
EP3119883A4 (en) 2014-03-17 2018-01-10 Flugen, Inc. Influenza virus vectors and uses therefor
WO2015196150A2 (en) 2014-06-20 2015-12-23 Wisconsin Alumni Research Foundation (Warf) Mutations that confer genetic stability to additional genes in influenza viruses
US10633422B2 (en) 2015-06-01 2020-04-28 Wisconsin Alumni Research Foundation (Warf) Influenza virus replication by inhibiting microRNA lec7C binding to influenza viral cRNA and mRNA
US9890363B2 (en) 2015-07-06 2018-02-13 Wisconsin Alumni Research Foundation (Warf) Influenza virus replication for vaccine development
US11197925B2 (en) 2016-02-19 2021-12-14 Wisconsin Alumni Research Foundation (Warf) Influenza B virus replication for vaccine development
CA3054578A1 (en) * 2017-02-27 2018-08-30 Flugen, Inc. Immunogenic compositions against influenza
EP3585884A4 (en) * 2017-02-27 2021-04-07 Flugen, Inc. INFLUENZA B VIRUS MUTANTS AND USES THEREFORE
CN107151659B (zh) * 2017-03-01 2021-04-02 苏州系统医学研究所 一种流感病毒株及其应用
JP2022527235A (ja) 2019-01-23 2022-06-01 義裕 河岡 インフルエンザウイルスにおける付加的遺伝子に遺伝的安定性を付与する突然変異
CN113874496A (zh) 2019-02-08 2021-12-31 威斯康星校友研究基金会(Warf) 人源化细胞系
KR102370100B1 (ko) * 2019-02-15 2022-03-07 아이디바이오 주식회사 이종 인플루엔자 a 바이러스에 대한 면역/치료반응을 형성하는 신규한 재조합 인플루엔자 바이러스 및 이를 포함하는 유전자 전달체 및 치료백신
US11214799B2 (en) * 2019-03-12 2022-01-04 The University Court Of The University Of Edinburg Old College HA-specific influenza virus attenuated vaccine comprising mutations in segment 7, and uses therefor
CN114929269A (zh) 2019-05-01 2022-08-19 威斯康星校友研究基金会(Warf) 用于疫苗开发的改进的流感病毒复制
CN110468130B (zh) * 2019-08-09 2021-08-06 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 流感长链非编码RNA-lnc330及其应用
US11807872B2 (en) 2019-08-27 2023-11-07 Wisconsin Alumni Research Foundation (Warf) Recombinant influenza viruses with stabilized HA for replication in eggs
US20230295582A1 (en) 2020-07-21 2023-09-21 Flugen, Inc. Influenza virus backbone
CN114381439B (zh) * 2022-01-27 2023-12-15 浙江迪福润丝生物科技有限公司 一种同义突变结合删除突变的流感病毒的致弱方法及致弱流感病毒株和应用
CN114381440B (zh) * 2022-01-27 2023-12-15 浙江迪福润丝生物科技有限公司 一组基于同义突变和/或缺失突变的a型流感病毒致弱毒株及其制备方法和应用
CN114438043B (zh) * 2022-01-27 2023-12-15 浙江迪福润丝生物科技有限公司 一种区分感染和免疫的致弱流感病毒疫苗株及疫苗
CN114410681B (zh) * 2022-01-27 2024-02-13 浙江迪福润丝生物科技有限公司 一种基于m基因核苷酸片段删除的流感病毒的致弱方法以及致弱流感病毒株和应用
CN114381438B (zh) * 2022-01-27 2024-02-02 浙江迪福润丝生物科技有限公司 一种流感病毒的致弱方法及流感致弱病毒株和应用

Family Cites Families (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20000069579A (ko) 1996-12-20 2000-11-25 데이비드 엠 모이어 건식 적층 섬유상 구조체 및 일회용 흡수성 제품
GB9815040D0 (en) * 1998-07-10 1998-09-09 Medical Res Council Conditional mutant
WO2001079273A2 (en) 2000-04-14 2001-10-25 Wisconsin Alumni Research Foundation Viruses comprising mutated ion channel protein
EP1364006A2 (en) 2001-02-23 2003-11-26 Wisconsin Alumni Research Foundation Methods to identify mutant cells with altered sialic acid
WO2004094466A2 (en) * 2003-04-23 2004-11-04 Wisconsin Alumni Research Foundation Recombinant influenza viruses holding a mutation in a transmembrane protein gene
WO2004112831A2 (en) * 2003-05-28 2004-12-29 Wisconsin Alumni Research Foundation High titer recombinant influenza viruses for vaccines and gene therapy
CN1810961B (zh) 2006-02-22 2010-05-12 中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所 一种重组流感病毒及其制备方法与应用
US9474798B2 (en) * 2007-06-18 2016-10-25 Wisconsin Alumni Research Foundation Influenza M2 protein mutant viruses as live influenza attenuated vaccines
NZ585500A (en) * 2007-11-12 2012-06-29 Theraclone Sciences Inc Antibodies which bind to an epitope in the extracellular domain of the matrix 2 ectodomain polypeptide of an influenza virus
US8163523B2 (en) 2008-06-11 2012-04-24 Flugen, Inc. Cell-based systems for producing influenza vaccines
US20100061995A1 (en) * 2008-09-08 2010-03-11 Damian Michael Carragher Immunotherapy To Treat Or Prevent Viral Infection
EP2952581A1 (en) * 2009-05-01 2015-12-09 Redbiotec AG Recombinant virus-like particles encoded by multi-gene vector
US20110172638A1 (en) 2010-01-08 2011-07-14 Ratio, Inc. Drug delivery device including multi-functional cover
US20110172645A1 (en) 2010-01-08 2011-07-14 Ratio, Inc. Wearable drug delivery device including integrated pumping and activation elements
US20110172639A1 (en) 2010-01-08 2011-07-14 Ratio, Inc. Device and method for delivery of microneedle to desired depth within the skin
US20110172637A1 (en) 2010-01-08 2011-07-14 Ratio, Inc. Drug delivery device including tissue support structure
US20110172609A1 (en) 2010-01-08 2011-07-14 Ratio, Inc. Microneedle component assembly for drug delivery device
WO2012061556A1 (en) 2010-11-03 2012-05-10 Flugen, Inc. Wearable drug delivery device having spring drive and sliding actuation mechanism
TW201303143A (zh) 2011-03-22 2013-01-16 Exxonmobil Upstream Res Co 低排放渦輪機系統中用於攫取二氧化碳及產生動力的系統與方法
EP3447131B1 (en) 2011-06-24 2021-08-18 Flugen, Inc. Influenza a virus mutants
JP6639334B2 (ja) 2016-06-20 2020-02-05 株式会社日立製作所 業務処理フロー生成システム、生成方法および装置
JP6120237B1 (ja) 2016-06-20 2017-04-26 仁博 平嶋 サービスシステム、アプリケーションプログラム及び決済方法

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Publication number Publication date
AU2018200488B2 (en) 2020-03-19
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CA3103774A1 (en) 2012-12-27
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US9284533B2 (en) 2016-03-15
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NZ620242A (en) 2016-02-26
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KR20210084710A (ko) 2021-07-07
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CN103781901B (zh) 2019-04-12

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