CN108823153A - 人子宫内膜间质细胞的分离及原代培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种人子宫内膜间质细胞的分离及原代培养方法，采用不含EDTA的胰酶消化人子宫内膜组织；消化后组织筛网过滤时拨动过滤组织使其充分过滤；采用1640培养基用于原代子宫内膜间质细胞的培养。相对于现有方法，该法极大提高了原代子宫内膜间质细胞的获取数量和细胞分离培养的成功率，而且更为高效、经济，为子宫内膜疾病的临床研究和药物研发提供了稳定可靠的体外细胞模型。此外，发明人还观察比较了正常内膜间质细胞和异位内膜间质细胞在细胞形态、生长特性和生物学行为等方面的差异。

Description

人子宫内膜间质细胞的分离及原代培养方法

技术领域

本发明属于人细胞分离及培养技术领域，尤其涉及一种人子宫内膜间质细胞的分离及原代培养方法。

背景技术

子宫内膜异位症(Ems)是一种良性且常见的妇科疾病，其中卵巢型内异症频发于妇科临床，严重影响患者的生活质量，为了加强对其病因病机等的基础研究，为临床治疗提供更好的方法，科研人员一直不断探索建立有利于研究该病的体内外实验模型。子宫内膜异位症体外模型包括组织模型和细胞模型。组织模型主要用于观察早期异位组织侵袭、增殖和血管形成过程，但体外培养的来源和条件不同，子宫内膜组织培养时间不宜过长，最长的时间不应超过1周，否则，就会改变组织的生理结构，失去研究意义，因此在某些方面组织模型的研究受限。细胞模型能很好地反映细胞在体内的生物学特性，在一定程度上反映了细胞之间的相互作用，更接近于人体的真实环境，因此细胞模型仍是目前研究Ems发病机制的重要方式。由于一直缺乏稳定可靠的细胞系，原代细胞培养是Ems体外研究的一种重要方法。然而，原代细胞培养技术要求高，成功率低，特别是子宫内膜异位间质细胞的培养成功率不高，最早Ryan等报道子宫内膜异位间质细胞的培养成功率为56％，近几年相关学者报道的成功率也仅为60-70％。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种细胞生长速度快、获取细胞数量多、培养成功率高的人子宫内膜间质细胞的分离及原代培养方法。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

人子宫内膜间质细胞的分离及原代培养方法，采用不含EDTA的胰酶消化人子宫内膜组织；消化后组织筛网过滤时拨动过滤组织使其充分过滤；采用含20％FBS的1640培养基用于原代子宫内膜间质细胞的培养。

上述人子宫内膜间质细胞的分离及原代培养方法，按以下步骤进行操作：

<1>配制含1％双抗的1640培养液及含1％双抗的PBS溶液，4℃预冷备用；

<2>无菌条件下获取在位内膜组织或异位内膜组织，立即放入预冷的含1％双抗的1640培养液；

<3>于超净工作台内用预冷的含1％双抗的PBS溶液冲洗组织后剪碎，加入不含EDTA的胰酶，在37℃水浴箱中消化，终止消化后，1000rpm离心20min弃上清；

<4>加入含1％双抗的1640培养液重悬细胞，并用200目筛网研磨过滤，过滤时须使滤网保持一定的张力，并用无菌镊轻轻拨动过滤组织使其充分过滤，无菌离心管收集滤液即为间质细胞；

<5>用含20％FBS及1％双抗的1640培养液重悬细胞接种于六孔板，次日弃去上清换上新鲜的培养液，此后每2-3d换液一次，细胞汇合度达90％后进行传代培养。

步骤<2>中所述消化为正常子宫内膜消化30-40min、子宫内膜异位囊肿内壁消化120-150min。

步骤<3>中所述加入胰酶溶液的体积为人子宫内膜组织体积的3倍，胰酶浓度为0.25％。

针对人子宫内膜间质细胞难培养、成功率低等问题，发明人对其原代培养的多个环节进行探索改良，建立了本发明的人子宫内膜间质细胞的分离及原代培养方法，采用不含EDTA的胰酶消化人子宫内膜组织；消化后组织筛网过滤时拨动过滤组织使其充分过滤；采用含20％FBS的1640培养基用于原代子宫内膜间质细胞的培养。其中，发明人首次将含20％FBS的1640培养基用于原代子宫内膜间质细胞的培养，大大改善了细胞的生长速度；同时，选用不含EDTA的胰酶消化细胞可减少对细胞的损伤，增加细胞贴壁率，并摸索出正常子宫内膜和子宫内膜异位囊肿内壁的最佳消化时间；另外，筛网过滤过程中的拨动操作也极大提高了原代子宫内膜间质细胞的获取数量和细胞分离培养的成功率。总之，相对于现有方法，本发明更为高效、经济，为子宫内膜疾病的临床研究和药物研发提供了稳定可靠的体外细胞模型。此外，发明人还观察比较了正常内膜间质细胞和异位内膜间质细胞在细胞形态、生长特性和生物学行为等方面的差异。

附图说明

图1是异位内膜间质细胞培养一周的细胞图(10×)。

图2是异位内膜间质细胞培养两周的细胞图(10×)。

图3是异位内膜间质细胞培养四周(10×)。

图4是正常子宫内膜间质细胞培养后48h的细胞图(10×)。

图5是正常子宫内膜间质细胞培养后一周的细胞图(10×)。

图6是正常子宫内膜间质细胞免疫组化鉴定结果图(20×)

图7是异位内膜间质细胞免疫组化鉴定结果图(20×)。

图8是正常子宫内膜间质细胞形态的HE染色结果图，图中：A：10×；B：40×。

图9是异位内膜间质细胞形态的HE染色结果图，图中：A：10×；B：40×。

图10是细胞增殖曲线。

图11是细胞相对增殖率柱状图。

图12是正常子宫内膜间质细胞不同时间细胞凋亡比例柱状图。

图13是异位内膜间质细胞不同时间细胞凋亡比例柱状图。

图14是NSC与ESC不同时间点的细胞凋亡率分析图，图中：A为NSC不同时间点的细胞凋亡率；B为ESC为不同时间点的细胞凋亡率；C为NSC与ESC不同时间点细胞总凋亡率统计比较。

具体实施方式

以下通过实施例说明本发明如何实施，所用试剂和设备如下：

主要试验试剂

主要仪器设备

一、原代子宫内膜间质细胞的分离

1.1溶液配制

完全培养基：1640培养液+20％FBS(体积百分比)+1％双抗。本发明针对异位间质细胞具有类肿瘤的生长特性，首次选用了肿瘤细胞培养常用的1640培养基取代常规文献报道的培养基，并将培养液的血清浓度提高到20％。

鼠抗人波形蛋白单克隆抗体(vimentin)：使用PBS溶液按体积比1∶100稀释后4℃短暂保存备用。

鼠抗人角蛋白单克隆抗体：使用PBS溶液按体积比1∶200稀释后-20℃保存备用。

1.2原代培养子宫内膜间质细胞的分离

(1)于手术室中获取无菌标本，正常子宫内膜经阴道刮宫获取或子宫切除后切开子宫刮取；异位内膜取自子宫内膜异位囊肿即巧克力囊肿内壁。标本获取后立即置于4℃预冷的含有1％双抗(青霉素、链霉素各100IU/ml)的无菌1640培养液中，1小时内送至实验室，在生物安全柜中进行细胞分离(操作前生物安全柜须紫外线消毒30min，开启风机15min，并用75％酒精擦拭超净台)。

组织的取材需要注意避免污染，异位内膜组织要选取病变较新鲜，同时有一定厚度的组织，该部分提示病变活跃，在进展期，较容易获取细胞。

(2)将获得的在位或异位内膜组织在无菌生物安全柜中用含有双抗的PBS溶液或无菌生理盐水清洗数遍，去除血凝块，并尽量剪除结缔组织。

(3)在无菌培养皿中用组织剪和眼科剪将内膜组织剪成体积约1mm³的碎颗粒，再用含1％双抗的PBS溶液清洗组织块至清洗液清亮。静置数分钟，使组织块自然沉淀到管底，弃去上清。然后将剪碎的内膜组织用无菌镊转移至离心管中；加入PBS，1000转离心5分钟，去上清，再次去除血凝块等杂质。

(4)加入0.25％不含EDTA的胰酶(约为组织体积的3倍)，在37℃水浴箱中消化，个性化的组织消化时间非常重要，缓慢消化可获得较多的活细胞。经多次摸索发现，正常子宫内膜最佳消化时长为30-40min；针对不同厚度的异位内膜组织，子宫内膜异位囊肿内壁最佳时长为120-150min，到时间后加入完全培养基终止消化。

针对异位内膜间质细胞不易贴壁的特点，选用不含EDTA的0.25％胰酶消化细胞可减少对细胞的损伤，增加细胞贴壁率。

(5)消化终止后1000rpm离心5min，静置后吸去上清，加入1640培养基(含1％双抗)用吸管反复吹打组织块，使细胞分离，静置，使未分散的组织块下沉。用200目筛网研磨过滤，过滤时须使滤网保持一定的张力，并用无菌镊轻轻拨动过滤组织，使其充分过滤，无菌离心管收集滤液(即为间质细胞)。加入完全培养基，轻轻吹打混匀后将细胞接种至六孔板中，2ml/孔，置于37℃，二氧化碳培养箱中培养。

采用六孔板培养，比培养瓶培养容易在早期形成细胞集落，增加培养成功率及细胞生长速度。待细胞铺满孔板底部时再扩增至培养瓶培养，此时细胞已进入生长旺盛期，细胞会保持旺盛的增殖能力，培养更容易成功。

(6)24h后弃去培养基，去除红细胞等非贴壁悬浮物，加入2ml新的培养基继续培养。此后每2d-3d换液，倒置显微镜下观察间质细胞形态。培养一周后，可见不同形状的贴壁原代细胞群落。

二、原代培养子宫内膜间质细胞的扩增培养

待培养瓶中的细胞生长至汇合度达85％-90％时可进行传代。

(1)吸出培养液，用含双抗的无菌PBS溶液清洗2遍；

(2)加入0.25％的胰蛋白酶1ml，轻轻摇晃，胰酶覆盖细胞，在37℃培养箱中消化3-5min左右，显微镜下观察细胞收缩、变亮、变圆时，加入完全培养基终止消化；重悬细胞，离心管收集细胞悬液，1000r/min离心5min，弃上清，加入完全培养基重悬细胞，按每T25培养瓶1x10⁶个细胞的数量接种，继续置于二氧化碳培养箱中培养。

三、原代培养子宫内膜间质细胞的鉴定

波形蛋白己被证明存在于间质细胞，故波形蛋白可以作为一抗，采用细胞免疫组化法对间质细胞进行鉴定。此染色过程中，用鼠抗人角蛋白单克隆抗体替代第一抗体做阴性对照。具体操作如下：

(1)将无菌盖玻片置于六孔板中；

(2)取对数生长期细胞加入胰酶消化至细胞变圆脱落，1000rpm离心5min收集细胞，重悬细胞并计数，将细胞悬液接种于(1)项下六孔板中，进行细胞玻片培养；

(3)待细胞融合度约70％-80％左右时，取出盖玻片，PBS洗涤3次；以4℃，4％多聚甲醛固定30min，再用PBS洗涤3次；

(4)加入Triton-X-100液(用去离子水配置)通透细胞膜15min，PBS洗涤3次；

(5)使用0.3％双氧水的甲醇溶液封闭内源性过氧化物酶，室温放置20min，PBS洗涤3次；

(6)加入与二抗同宿主的5％正常动物血清于湿盒中室温封闭静置30min；

(7)加入鼠抗人波形蛋白单克隆抗体，37℃孵育2h，转入4℃放置过夜，PBS洗涤3次；

(8)滴加生物素化标记的二抗，室温孵育15min，PBS洗涤3次；

(9)加入过氧化物酶，室温孵育15min，PBS洗涤3次；

(10)加入DBA显色液室温显色10min；

(11)自来水充分洗涤，苏木素复染，中性树胶封片，显微镜下观察。

四、细胞的冻存和复苏

4.1细胞冻存：取对数生长期细胞，用PBS清洗细胞表面两次后加入胰蛋白酶消化3-5min，显微镜下见细胞收缩、变亮、变圆时，用完全培养基终止消化并重悬细胞，1000r/min离心5min，弃上清。加入冻存液(含10％DMSO的FBS溶液)重悬细胞并计数，用冻存液将细胞密度调整为10⁶个/ml后分装至冻存管中，1ml/管，将冻存管置于梯度降温盒中转入-80℃冰箱冷冻保存，次日迅速转移到液氮。

4.2细胞复苏：从液氮中取出冻存管，置于37℃水浴箱迅速化冻，于超净工作台中将细胞悬液转移至完全培养基的培养瓶中，混匀置于37℃，5％C0₂培养箱内进行培养，24h换液。

五、细胞增殖能力测定

(1)细胞接种96孔板：取对数生长期的正常子宫内膜间质细胞和异位内膜间质细胞，加入0.25％胰蛋白酶1ml使其覆盖细胞表面后，消化至细胞变圆脱落，加入全培养液1ml终止消化，吹打成细胞悬液并转移至2ml离心管中，1000rpm离心5min弃去上清，加入检测培养液1ml重悬细胞并计数，用检测培养液将细胞密度调整至1.5×10⁵个/ml后，以100μl/孔加入96孔板中，重复6个复孔。

(2)CCK-8显色：细胞孵育0h、24h、48h、72h、96h后分别加入CCK-8显色液，于37℃，5％C0₂培养箱中孵育60min。

(3)检测：取出96孔板于酶标仪读取各孔OD₄₅₀吸光值，以细胞孵育时间及其对应的吸光值绘制细胞增殖曲线。

六、流式细胞仪检测细胞凋亡情况

(1)取10⁵个细胞，1200rpm离心5min，去上清液。

(2)每管加入50μl 1×Binding Buffer，重悬，按以下分组加入染料：

a：阴性对照：不加任何染料

b：单阳对照：加入5μl FITC Annexin V

c：单阳对照：加入5μl PI

d：样本管：加入5μl FITC Annexin V和5μl的PI

(3)将溶液轻轻地震荡后，室温避光孵育15min。

(4)分别加入400μl 1×Annexin V Binding Buffer，在1小时内上机。

2.7统计学分析：CCK8实验结果利用独立样本t检验方法进行统计细胞相对增殖率，流式细胞检测结果采用单因素方差分析，P＜0.05判定为差异具有统计学意义。

七、结果

7.1原代子宫内膜细胞的分离培养

7.1.1异位内膜间质细胞培养结果

(1)如图1所示，培养一周后，可见不同形态的贴壁原代细胞小群落。

(2)如图2所示，培养两周，细胞状态良好，群落数量有所增加。

(3)如图3所示，培养四周后，可见培养瓶内原代细胞生长状态良好，细胞数量可以进行传代培养。

7.1.2正常子宫内膜间质细胞培养结果

(1)如图4所示，细胞培养48小时，可见较多细胞贴壁，细胞生长状态良好。

(2)如图5所示，培养后1周，细胞生长状态良好，细胞数量可以进行传代培养。

7.1.2正常子宫内膜及异位内膜间质细胞鉴定

如图6和图7所示，细胞免疫化学鉴定法结果显示，ESC波形蛋白染色阳性。

(1)正常子宫内膜间质细胞免疫组化鉴定(图6)。

(2)异位内膜间质细胞免疫组化鉴定(图7)。

7.1.3两种间质细胞生长特点及形态差异

(1)生长特点差异：正常子宫内膜间质细胞贴壁率高，均匀稳定生长，1周左右达到对数生长期。异位内膜间质细胞开始贴壁率低，生长缓慢，呈集落式生长，形成集落后生长迅速，呈肿瘤样旋涡状生长，常伴有中心坏死灶，一般需4周达到对数生长期。

(2)形态差异：倒置相差显微镜显示：正常子宫内膜间质细胞分散生长，呈纺锤状，胞核不易看出，细胞之间无明显界限，大多平行排列。HE染色显示细胞形态均一，见图8。

异位内膜间质细胞像肿瘤样集落抱团生长，胞核大，细胞分裂像多，细胞之间贴近密集生长，生长旺盛时常有局部缺血坏死。HE染色显色细胞形态大小不一，异质性明显，见图9。

异位内膜间质细胞比正常子宫内膜间质细胞的细胞形态明显增大，见图8和图9。

两组间质细胞均可传代8-10代，但是正常子宫内膜间质细胞5代后细胞生长明显减慢，异位内膜间质细胞7代后细胞生长开始减慢，细胞形态改变。

7.1.4 CCK8法测定正常子宫内膜间质细胞(NSC)及子宫内膜异位症异位内膜间质细胞(ESC)的细胞增殖能力，结果ESC比NSC明显增殖增强。

在0h、24h、48h、72h、96h五个时间点行CCK8检测NSC和ESC的OD值(见表1，表2)，结果显示从增殖曲线趋势来看，ESC比NSC增殖旺盛(见图10)，48h时NSC和ESC的细胞相对增殖率之间的显著水平P-value＝0.00013；72h的P-value＝0.00005，差异具有统计学意义(P＜0.05)，其余时间点差异无统计学意义(P＞0.05)，见图11。相对增殖率定义：细胞增殖24小时后相对于前一个时间的增殖情况，如24h的相对增殖率表示为到24h后，相对于0h细胞增殖生长的情况。*，表示差异有统计学意义，为显著差异水平(P＜0.05)。总体来看，ESC比NSC明显增殖增强。

表1正常子宫内膜间质细胞不同时间OD值(平均值)

表2异位内膜间质细胞不同时间OD值(平均值)

7.1.5流式细胞仪检测正常子宫内膜间质细胞(NSC)及子宫内膜异位症异位内膜间质细胞(ESC)凋亡情况：ESC比NSC明显凋亡减少。

(1)在0h、24h、48h、72h、96h五个时间点行流式细胞术NSC凋亡分析结果，见表3，图12。

表3正常子宫内膜间质细胞不同时间细胞凋亡比例

(2)在0h、24h、48h、72h、96h五个时间点行流式细胞术ESC凋亡分析结果，见表4，图13

表4子宫内膜异位症异位内膜间质细胞不同时间细胞凋亡比例

(3)NSC与ESC不同时间点的细胞凋亡率分析

结果：24h的凋亡率统计结果为F＝0.257，t＝39.291，p＝0.000025(***表示p＜0.001)。48h的凋亡率统计结果为F＝1.355，t＝25.662，p＝0.00014(***表示p＜0.001)。72h凋亡率有差异无统计学意义(P＞0.05)。96h的凋亡率统计结果为F＝0.008，t＝23.539，p＝0.000019(***表示p＜0.001)。总体结果NSC比ESC凋亡明显(图14)。

Claims (4)

1.一种人子宫内膜间质细胞的分离及原代培养方法，其特征在于：采用不含EDTA的胰酶消化人子宫内膜组织；消化后组织筛网过滤时拨动过滤组织使其充分过滤；采用含20％FBS的1640培养基用于原代子宫内膜间质细胞的培养。

2.根据权利要求1所述的人子宫内膜间质细胞的分离及原代培养方法，其特征在于按以下步骤进行操作：

<1>配制含1％双抗的1640培养液及含1％双抗的PBS溶液，4℃预冷备用；

<2>无菌条件下获取在位内膜组织或异位内膜组织，立即放入预冷的含1％双抗的1640培养液；

<3>于超净工作台内用预冷的含1％双抗的PBS溶液冲洗组织后剪碎，加入不含EDTA的胰酶，在37℃水浴箱中消化，终止消化后，1000rpm离心20min弃上清；

<4>加入含1％双抗的1640培养液重悬细胞，并用200目筛网研磨过滤，过滤时轻轻拨动过滤组织使其充分过滤，无菌离心管收集滤液即为间质细胞；

<5>用含20％FBS及1％双抗的1640培养液重悬细胞接种于六孔板，次日弃去上清换上新鲜的培养液，此后每2-3d换液一次，细胞汇合度达90％后进行传代培养。

3.根据权利要求1所述的人子宫内膜间质细胞的分离及原代培养方法，其特征在于步骤<2>中所述消化为正常子宫内膜消化30-40min、子宫内膜异位囊肿内壁消化120-150min。

4.根据权利要求1所述的人子宫内膜间质细胞的分离及原代培养方法，其特征在于步骤<3>中所述加入胰酶溶液的体积为人子宫内膜组织体积的3倍，胰酶浓度为0.25％。